CN103087176A - 长效化胰高血糖素样肽-1(glp-1)类似物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及长效化胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物及其合成方法。通过对天然的GLP-1的34位氨基酸进行替换得到具有更长药理作用时间的GLP-1类似物，目标多肽的合成是通过微波促进固相合成方法快速实现，粗品经纯化，冻干得到GLP-1类似物。

Description

长效化胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物及其应用

技术领域

本发明涉及长效化胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物及其应用。

背景技术

糖尿病是继肿瘤、心血管疾病之后第三大严重威胁人类健康的慢性非传染性疾病。目前，全球约有3亿糖尿病患者，预计到2025年将增加至5亿。2010年，中国有9200万糖尿病患者，中国已经成为仅次于印度的糖尿病第二大国，其中2型糖尿病约占糖尿病患者总人数的90％。现在治疗2型糖尿病最有效的方法是注射胰岛素。在临床上采用胰岛素强化治疗的方法来延缓糖尿病进程，胰岛素治疗在降低血糖的同时可以一定程度上逆转胰岛β-细胞功能损害。但是使用胰岛素会出现低血糖的危险。受到剂量大小、注射部位、注射途径、个体差异或注射后未进食等因素的影响，如果使用胰岛素稍有不慎，就会出现严重的低血糖副作用。

胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是一种葡萄糖依赖性肠降血糖多肽激素，GLP-1刺激胰岛素分泌而不出现低血糖，这种葡萄糖依赖性的促胰岛素分泌特性，避免了糖尿病治疗中常存在的产生低血糖症的危险，这些生理功能使开发GLP-1作为一种2型糖尿病治疗药物具有广阔的前景。

胰高血糖素样肽-1(GLP-1)主要由末端空肠、回肠和结肠的L细胞所分泌的葡萄糖依赖性肠降血糖多肽激素，在体内有多种存在形式。胰高血糖素原基因位于2号染色体长臂，由6个外显子和5个内含子组成，在胰腺和肠道L细胞内表达，生成由160个氨基酸组成的胰高血糖素原(proglucagon，PG)。胰高血糖素原在胰腺和肠道中裂解后转化的产物不同。PG在肠道中主要裂解为：肠高血糖素(Glicentin：PG1～69)，肠高血糖素分子继续裂解为GRPP(PG1～30)和胃泌酸调节素(Oxyntomodulin：PG33～69)；插入肽-2(IP-2：PG111～123)；胰高血糖素样肽-2(GLP-2：PG126～158)；和GLP-1(1～37)-OH(PG 72～108)。GLP-1(1～37)-OH是无活性的肽链，需酶解切除N端6肽，成为具有生理活性的GLP-1(7～37)-OH，其C末端甘氨酸可以作为酰胺化酶的底物，因此GLP-1(7～37)-OH的C末端酰胺化后即生成具有高度活性的GLP-1(7～36)-NH₂，氨基酸序列是HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH₂；GLP-1(7～37)-OH的氨基酸序列是HAEGTFTSDVSSLEGQAAKEFIAWLVKGRG-COOH。GLP-1(7～36)-NH₂是人体内GLP-1主要的天然形式，约占80％，其促进胰岛素分泌的作用在GLP-1肽中最强。另外GLP-1(7～37)-OH约占20％，两者具有相同的生理功能。

GLP-1通过作用于胰岛β-细胞膜上的受体GLP-1受体(GLP-1R)，促进胰岛素的分泌。GLP-1R在胰腺β-细胞膜上高度表达，是由463个氨基酸组成，属于七次跨膜的G-蛋白偶联受体家族，与GLP-1高度特异性结合。GLP-1与其受体结合后可以增加胰岛细胞腺苷酸环化酶的活性，刺激细胞内的第二信使cAMP的增加，导致细胞膜K⁺通道关闭，细胞去极化，诱发电压依赖性的Ca²⁺通道开放，细胞外Ca²⁺内流，细胞浆Ca²⁺浓度升高触发胰岛素的释放。此外cAMP水平升高，又激活cAMP依赖的蛋白激酶A和磷酸化酶，进而刺激β-细胞胰岛素基因的转录和翻译，刺激β-细胞的增值和分化。

胰高血糖素样肽-1(GLP-1)具有多种生物学效应。如下：

1、具有血糖依赖性的肠促胰岛素分泌作用；

2、阻止胰腺β-细胞退化，刺激β-细胞的增值和分化；

3、诱导前胰岛素基因的转录，促进前胰岛素的生物合成；

4、增加胰岛素的敏感性；

5、增加生长抑素分泌，抑制胰高血糖素的产生(此作用也是血糖依赖性)；

6、抑制胃酸分泌，延迟胃排空；

7、通过作用于丘脑下部的中枢抑制食欲，降低食物摄取量等作用。

然而，虽然天然GLP-1在治疗糖尿病上有以上诸多优点，但它在体内却会被二肽基肽酶IV(dipeptidyl peptidase IV，DPP-IV)快速降解。DPP-IV可特异性识别GLP-1的N末端第二位丙氨酸(Ala)残基，从肽链N末端第2位丙氨酸(Ala)处切除二肽，使其转变为无活性的形式，其体内半衰期仅5分钟左右。GLP-1分子N端是与GLP-1受体的结合部位，其组氨酸残基丧失，导致GLP-1完全失去生物活性。另外天然的GLP-1会被肾脏快速滤过代谢，所以这需要我们对天然GLP-1进行改造，以期望寻找到能够抵抗DPP-IV降解，避免肾脏快速滤过代谢的GLP-1类似物。

这里，我们设计了一类GLP-1类似物，通过引入小分子基团，增加肽链与血清白蛋白的结合，避免了GLP-1的肾脏快速滤过和代谢失活，从而显著延长半衰期及体内降糖作用时间。

发明内容

本发明涉及一类胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，其序列为：

其中：

Xaa：Ala，Leu，Val，Met，Ile，Tyr，Phe，Arg，Asn，Lys，Thr，Asp，His，Trp，Gln，Glu，Ser或Gly；

n选自1～20。

在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物：

在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物：

在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物：

在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物：

在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物：

在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的GLP-1类似物：

本发明还提供了一种药物组合物，包括治疗有效量的至少一种上述化合物和其药学上可接受的盐，或药学上可接受的载体或稀释剂。

本发明进一步提供了述化合物和其药学上可接受的盐，或药学上可接受的载体或稀释剂在制备用于糖尿病的药物中的运用。

本发明提供的上述化合物化学性质稳定，不易被体内的二肽基肽酶IV(DPP-IV)降解，所有的化合物血浆半衰期达到了45h以上，较原型GLP-1(半衰期2min)有显著的提高，从而克服了GLP-1必须持续静脉滴注或持续皮下注射才能产生疗效的缺陷。另外，本发明提供的上述化合物或化合物作为有效成分制备的药物组合物用于降低体内血糖浓度时，既有很长的血浆半衰期(45小时以上)，又具有显著的降糖效果。

本发明还提供了上述化合物的制备方法，本发明采用微波促进Fmoc/tBu正交保护固相合成策略高效快速地合成得到上述目标化合物。

以下是本发明中涉及的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物的体内降糖药理实验方法以及结果：

(1)GLP-1及胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物的隔日降血糖实验

正常昆明小鼠，分为8组，每组6只，小鼠饲养在标准化动物房中。实验开始时，提前24h给予GLP-1及GLP-1类似物，对照组注射生理盐水。正常饮食饮水12h，接着禁食12h，在化合物注射24h后，进行小鼠单次腹腔葡萄糖耐量实验。各组按照小鼠体重每千克腹腔注射18mmol的葡萄糖溶液(浓度20％)，注射葡萄糖时定为0min，在0，15，30，45，60，120min用血糖仪测定血糖水平。

表1  GLP-1及胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物隔日降血糖的效应

n＝6， ^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001 vs saline as control

如表1所示，由于修饰后的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物具有抗酶解和抗肾脏滤过作用，其生物半衰期都达到了45h以上，所以在体内代谢24h后，降血糖实验显示其促胰岛素分泌作用仍然维持，而未经改造的天然GLP-1早已失去活性，说明我们的GLP-1类似物体内降糖作用时间显著的延长。

(2)GLP-1及胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物的多次腹腔葡萄糖耐量实验

选取8周龄db/db糖尿病小鼠，随机分组，每组8只，适应性饲养7天后，在实验开始前12小时禁食，只给予饮水。每组小鼠在给予GLP-1及GLP-1类似物之前，测初始血糖值，定为-30min，然后腹腔给予GLP-1类似物，30min后腹腔注射葡萄糖(每千克18mmol)，定为0min，对照组注射相同体积的生理盐水和GLP-1。0，15，30，60，90，120min分别尾部取血，测定血液葡萄糖浓度。并且于180，360，540，720，900，1080，1260min再次注射葡萄糖，继续测定血糖值，一共重复给予8次葡萄糖，检测化合物的长效化降糖活性。

表2  GLP-1及胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物多次腹腔葡萄糖耐量效应

n＝8，

^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001 vs saline as control

如表2所示，GLP-1在第一次腹腔糖耐量实验时已经失去活性，而所有的GLP-1类似物在第八次给予葡萄糖时(此时距给予化合物已经过去22h)，任然维持了较好的降糖活性，说明化合物经过改造后，其长效化降糖作用显著，达到了24h以上。

本发明的优点在于：

1.提出的一种胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物可以在保留降糖活性的基础上，具有抗肾脏滤过消除和抗DPP-IV酶解作用，生物半衰期较GLP-1原型显著延长，都达到了40小时以上，提高了稳定性，延长了降糖作用时间。

2.微波促进固相合成的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物大大的提高了偶合反应速率，常规固相合成方法充分偶合一个氨基酸到树脂上去，往往需要2小时到20小时不等，甚至更长。而微波促进则平均只需要10分钟左右；常规固相合成方法脱Fmoc保护基，往往需要30分钟到1小时不等，而微波促进则平均只需要5分钟左右，这极大的提高了多肽合成的效率，缩短了合成周期。

3.微波促进固相合成胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物的粗品纯度大于80％，较常规固相合成方法大大提高，这方便了后续的纯化工作。

4.微波促进固相方法合成胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，其成本低，由于偶合效率较高，所需要保护氨基酸平均只需要2倍过量，较常规固相合成方法需要4到5倍过量大为降低。

5.微波促进固相合成胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物的方法易于实现自动化、大规模化，这使其更适合工业化生产。

因此用本发明提供的微波促进固相合成技术制备的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，收率高、合成周期短、粗品纯化容易，生产成本低、易于工业自动化生产。制备得到的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，比天然GLP-1更加稳定，降血糖作用时间长，适合作为治疗糖尿病药物的活性成分。

附图说明

上文对本发明做了一般性描述，下面附图用于说明本发明的具体实施方案。其中：

图1显示的是GLP-1(7～36)-NH₂与DPP IV温孵0h的HPLC分析谱图；

图2显示的是GLP-1(7～36)-NH₂与人血浆温孵4h降解成GLP-1(9～36)-NH₂ HPLC分析谱图；

图3显示的是本发明的GLP-1类似物与DPP-IV温孵4h的HPLC分析谱图；

图4显示的是原型GLP-1和本发明的化合物血浆温孵96小时后的降解图；

具体实施方式

在本说明书全文中采用以下缩写：

Et₃N：三乙胺；NMM：N-甲基吗啉；DIEA：N，N′-二异丙基乙胺；DMF：二甲基甲酰胺；DMSO：二甲亚砜；DCM：二氯甲烷；Fmoc：N-9-芴甲氧羰基；DIC：N，N’-二异丙基碳二亚胺；CDI：N，N’-羰基二咪唑；DMAP：4-二甲氨基吡啶；HOSU：N-羟基琥珀酰亚胺；EDC.HCl：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐；HATU：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯；HBTU：苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯；HCTU：6-氯苯并三氮唑-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯；HOAT：1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑；HOBT：1-羟基-苯并三氮唑；PyBOP：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷；HPLC：高效液相色谱；ESI-MS：电喷雾质谱；Gly：甘氨酸；Ser：丝氨酸；Ala：丙氨酸；Thr：苏氨酸；Val：缬氨酸；Ile：异亮氨酸；Leu：亮氨酸；Tyr：酪氨酸；Phe：苯丙氨酸；His：组氨酸；Pro：脯氨酸；Asp：天门冬氨酸；Met：蛋氨酸；Glu：谷氨酸；Trp：色氨酸；Lys：赖氨酸；Arg：精氨酸。Asn：天冬酰胺；Gln：谷氨酰胺。

本发明是通过下列实施例来进行说明的，但这些实施例不做任何限制本发明的解释。

实施例1

的微波促进固相合成

(1)侧链改构的半胱氨酸合成

称取Fmoc-Cys-OH 0.21g，溶于DCM中，加入0.37g 3，3’-(4-(3-马来酰亚胺基丙酰胺基)苯亚甲基)-二-4-羟基香豆素，5ul DIEA作为催化剂，室温下搅拌反应5小时，薄层板监测反应完毕后，反应液减压浓缩，柱层析分离得产物0.4g，收率83％。

MS(70eV)m/z：944.3([M+Na]⁺)。

(2)树脂的溶胀

称取Fmoc-Rink amide-MBHA Resin 50mg(取代量0.4mmol/g)，经7mL DCM溶胀30min，抽滤去DCM，再用10mLNMP溶胀30min，最后分别用NMP，DCM，NMP 7mL冲洗干净。

(3)微波促进Fmoc保护基的脱除

将溶胀好的树脂放入反应器中，加入7mL含0.1M HOBT的25％哌啶/NMP(V/V)溶液，在微波反应器中反应1min，微波功率为15W，反应温度控制在50℃以内，使用空气压缩机压缩空气冷却，反应结束后滤去溶液；再加入7mL含0.1M HOBT的25％哌啶/NMP(V/V)溶液在微波反应器中再反应4min，微波功率为25W，反应温度控制在50℃，使用空气压缩机压缩空气冷却。反应结束后滤去溶液，用NMP洗涤干净。得到脱去初始连接的Fmoc保护基的树脂。

(4)微波促进Fmoc-Arg(Pbf)-Rink amide-MBHA Resin的合成

将Fmoc-Arg(Pbf)-OH(0.04mmol)，HBTU(0.04mmol)，HOBT(0.04mmol)和DIPEA(0.08mmol)溶于10mL NMP中，再将此溶液加入上面的树脂中，在微波反应器中反应7min，微波功率为25W，反应温度控制在50℃，使用空气压缩机压缩空气冷却。反应结束后滤除反应液，用DCM和NMP各7mL洗涤树脂3次。

(5)偶合效率的检测

用茚三酮法或者溴酚兰法定性检测树脂的偶合效率，显色反应为阴性即可进入下一个偶合循环。

茚三酮法：取少量树脂颗粒用乙醇洗涤，放入透明小瓶中加入5％茚三酮乙醇、KCN吡啶溶液(2ml 0.001M KCN稀释于98ml吡啶中)、80％苯酚乙醇溶液各2滴，于100℃加热5分钟，如果树脂显蓝色即为阳性。

溴酚兰法：取少量树脂颗粒用二甲酰乙酰胺洗涤，放入透明小瓶中加入3滴1％的溴酚蓝二甲基乙酰胺溶液，常温下振摇3分钟，如果树脂显蓝色即为阳性。

(6)肽链的延长

按照肽链的序列，重复上述脱保护和偶合的步骤依次连接上相应的氨基酸，合成到肽链26位时，加入侧链改构的半胱氨酸，偶合45min，然后继续重复脱保护和偶合的步骤依次连接上相应的氨基酸直至肽链合成完毕，得到连有化合物的树脂。

(7)树脂上多肽的裂解

将上述得到的连有化合物的树脂放入反应瓶中，各加入裂解剂Reagent K(TFA/苯甲硫醚/水/苯酚/EDT，82.5∶5∶5∶5∶2.5，V/V)10mL，先在0℃下振摇30min，再在常温下反应3h。反应结束后抽滤，加少量TFA和DCM洗涤三次，合并滤液。将滤液加入大量的冰乙醚中析出白色絮状沉淀，冷冻离心得到目标多肽的粗品。最终得到化合物的粗品63.2mg，收率为94.3％。

(7)多肽的纯化

将粗品多肽溶于50％的乙腈/水中，使用制备液相色谱纯化，色谱条件为：C18反相柱(320mm×28mm，5μm)；流动相A：0.1％TFA/水(V/V)，流动相B：0.1％TFA/乙腈(V/V)；流动相梯度：流动相B 40％～90％，20min；流速为6mL/min检测波长为214nm。收集的溶液冻干得纯品30mg。理论相对分子质量为3851.7。ESI-MS m/z：found[M+4H]⁴⁺963.9，[M+5H]⁵⁺771.3；calu[M+4H]⁴⁺963.2，[M+5H]⁵⁺770.8。

实施例2～6

根据实施例1所述的方法，根据相应的序列合成得到实施例2～6的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，通过电喷雾质谱(ESI-MS)确证各自的分子量。

实施例2

理论相对分子质量为3836.7。ESI-MS m/z：found[M+4H]⁴⁺960.2，[M+5H]⁵⁺768.3；calu[M+4H]⁴⁺959.6，[M+5H]⁵⁺767.8

实施例3

理论相对分子质量为3893.8。ESI-MS m/z：found[M+4H]⁴⁺974.4，[M+5H]⁵⁺779.7；calu[M+4H]⁴⁺974.1，[M+5H]⁵⁺779.3。

实施例4

理论相对分子质量为3878.8。ESI-MS m/z：found[M+4H]⁴⁺970.7，[M+5H]⁵⁺776.7；calu[M+4H]⁴⁺970.1，[M+5H]⁵⁺776.2。

实施例5

理论相对分子质量为3977.8。ESI-MS m/z：found[M+4H]⁴⁺995.4，[M+5H]⁵⁺796.5；calu[M+4H]⁴⁺995.1，[M+5H]⁵⁺796.1。

实施例6

理论相对分子质量为3962.9。ESI-MS m/z：found[M+4H]⁴⁺991.7，[M+5H]⁵⁺793.6；calu[M+4H]⁴⁺991.2，[M+5H]⁵⁺793.1。

实施例7

GLP-1及胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物对DPP-IV的稳定性实验

经过纯化后的GLP-1和胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物5nmol和5mU的DPP-IV在200μL浓度为50mM的Tris-HCL缓冲溶液中，37℃温孵4h，pH 7.4。最后加入10μL20％的乙腈/水溶液终止反应。分别取0h，4h点的温孵溶液，离心，取上清液，进HPLC分析；柱尾收集降解产物GLP-1(9～36)-NH₂。分析采用C18反相柱(150mm×4.6mm，5μm)；流动相A：0.1％TFA/水(V/V)，流动相B：0.1％TFA/乙腈(V/V)；流动相梯度：流动相B 10％～45％，22min；流速为1mL/min；柱温为40℃；检测波长为214nm。

如图1，图2所示，结果显示未经改造的天然GLP-1在与DPP-IV温孵4h后，基本上皆被水解为无活性的GLP-1(9～36)-NH₂，完整的肽链小于10％。而图3显示胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物与DPP-IV温孵4h后仍保持原型，未见有降解，完整的肽链大于95％。结果表明我们设计的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物具有抵抗DPP-IV的酶解作用。

实施例8

GLP-1及胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物的血浆半衰期测定实验

大鼠眼球取血，血液装入含有肝素的离心管中，3000rpm离心10分钟，取上清血浆作为温孵血浆，利用LC-MS来检测化合物的响应信号。100ul的GLP-1和GLP-1类似物溶液与100ul的血浆，涡旋混合后置入37℃水浴中，温孵96小时，在0，0.5，1，2，4，8，12，24，36，48，72，96h时间点取10ul，加入20ul乙腈沉淀，14000rpm离心，取上清液进LC-MS，计算各个时间点的峰面积，做出衰减曲线，计算半衰期。如图4所示，没有经过改造的原型GLP-1半衰期只有15min，而GLP-1类似物的半衰期全部在40小时以上，最长的半衰期已经达到51小时。

Claims (7)

1.一种含有式I(SEQ.ID NO：1)结构的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，其序列为：

其中：

Xaa：Ala，Leu，Val，Met，Ile，Tyr，Phe，Arg，Asn，Lys，Thr，Asp，His，Trp，Gln，Glu，Ser或Gly；

n选自1～20。

2.根据权利要求1所述的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，优选的序列为：

3.一种药物组合物，包括治疗有效量的至少一种权利要求1中所述的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物和其药学上可接受的盐。

4.一种药物组合物，包括治疗有效量的至少一种权利要求1中所述的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物和药学上可接受的载体或稀释剂。

5.权利要求1中所述的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物和其药学上可接受的盐在制备用于糖尿病的药物中的运用。

6.权利要求1中所述的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物和药学上可接受的载体或稀释剂在制备用于糖尿病的药物中的运用。

7.权利要求1中所述的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物的制备方法，包括生物表达、液相合成和固相合成制备方法。

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