CN102180963A

CN102180963A - 胰高血糖素样肽-1(glp-1)类似物及其应用

Info

Publication number: CN102180963A
Application number: CN2011101016605A
Authority: CN
Inventors: 黄文龙; 钱海; 韩京; 倪帅健; 陈巍; 赵鑫鑫; 杨宝卫; 朱孝云
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2011-04-22
Filing date: 2011-04-22
Publication date: 2011-09-14
Anticipated expiration: 2031-04-22
Also published as: CN102180963B

Abstract

本发明涉及新型长效化胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物及其合成方法。通过对天然的GLP-1的8、23或37位进行改造得到具有更长药理作用时间的GLP-1类似物，其肽链的合成是通过微波促进固相合成方法快速实现，通过半胱氨酸残基与4-羟基香豆素类似物反应得到目标多肽，粗品经纯化，冻干得到GLP-1类似物。

Description

胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物及其应用

技术领域

本发明涉及胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物及其应用。

背景技术

糖尿病是继肿瘤、心血管疾病之后第三大严重威胁人类健康的慢性非传染性疾病。目前，全球约有3亿糖尿病患者，预计到2025年将增加至5亿。2010年，中国有9200万糖尿病患者，中国已经成为仅次于印度的糖尿病第二大国，其中2型糖尿病约占糖尿病患者总人数的90％。现在治疗2型糖尿病最有效的方法是注射胰岛素。在临床上采用胰岛素强化治疗的方法来延缓糖尿病进程，胰岛素治疗在降低血糖的同时可以一定程度上逆转胰岛β-细胞功能损害。但是使用胰岛素会出现低血糖的危险。受到剂量大小、注射部位、注射途径、个体差异或注射后未进食等因素的影响，如果使用胰岛素稍有不慎，就会出现严重的低血糖副作用。

胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是一种葡萄糖依赖性肠降血糖多肽激素，GLP-1刺激胰岛素分泌而不出现低血糖，这种葡萄糖依赖性的促胰岛素分泌特性，避免了糖尿病治疗中常存在的产生低血糖症的危险，这些生理功能使开发GLP-1作为一种2型糖尿病治疗药物具有广阔的前景。

胰高血糖素样肽-1(GLP-1)主要由末端空肠、回肠和结肠的L细胞所分泌的葡萄糖依赖性肠降血糖多肽激素，在体内有多种存在形式。胰高血糖素原基因位于2号染色体长臂，由6个外显子和5个内含子组成，在胰腺和肠道L细胞内表达，生成由160个氨基酸组成的胰高血糖素原(proglucagon，PG)。胰高血糖素原在胰腺和肠道中裂解后转化的产物不同。PG在肠道中主要裂解为：肠高血糖素(Glicentin：PG1～69)，肠高血糖素分子继续裂解为GRPP(PG1～30)和胃泌酸调节素(Oxyntomodulin：PG33～69)；插入肽-2(IP-2：PG111～123)；胰高血糖素样肽-2(GLP-2：PG126～158)；和GLP-1(1～37)-OH(PG 72～108)。GLP-1(1～37)-OH是无活性的肽链，需酶解切除N端6肽，成为具有生理活性的GLP-1(7～37)-OH，其C末端甘氨酸可以作为酰胺化酶的底物，因此GLP-1(7～37)-OH的C末端酰胺化后即生成具有高度活性的GLP-1(7～36)-NH₂，氨基酸序列是HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH₂；GLP-1(7～37)-OH的氨基酸序列是HAEGTFTSDVSSLEGQAAKEFIAWLVKGRG-COOH。GLP-1(7～36)-NH₂是人体内GLP-1主要的天然形式，约占80％，其促进胰岛素分泌的作用在GLP-1肽中最强。另外GLP-1(7～37)-OH约占20％，两者具有相同的生理功能。

GLP-1通过作用于胰岛β-细胞膜上的受体GLP-1受体(GLP-1R)，促进胰岛素的分泌。GLP-1R在胰腺β-细胞膜上高度表达，是由463个氨基酸组成，属于七次跨膜的G-蛋白偶联受体家族，与GLP-1高度特异性结合。GLP-1与其受体结合后可以增加胰岛细胞腺苷酸环化酶的活性，刺激细胞内的第二信使cAMP的增加，导致细胞膜K⁺通道关闭，细胞去极化，诱发电压依赖性的Ca²⁺通道开放，细胞外Ca²⁺内流，细胞浆Ca²⁺浓度升高触发胰岛素的释放。此外cAMP水平升高，又激活cAMP依赖的蛋白激酶A和磷酸化酶，进而刺激β-细胞胰岛素基因的转录和翻译，刺激β-细胞的增值和分化。

胰高血糖素样肽-1(GLP-1)具有多种生物学效应。如下：

1、具有血糖依赖性的肠促胰岛素分泌作用；

2、阻止胰腺β-细胞退化，刺激β-细胞的增值和分化；

3、诱导前胰岛素基因的转录，促进前胰岛素的生物合成；

4、增加胰岛素的敏感性；

5、增加生长抑素分泌，抑制胰高血糖素的产生(此作用也是血糖依赖性)；

6、抑制胃酸分泌，延迟胃排空；

7、通过作用于丘脑下部的中枢抑制食欲，降低食物摄取量等作用。

然而，虽然天然GLP-1在治疗糖尿病上有以上诸多优点，但它在体内却会被二肽基肽酶IV(dipeptidyl peptidase IV，DPPIV)快速降解。二肽基肽酶IV可特异性识别GLP-1N末端第二位丙氨酸(Ala)残基，从肽链N末端第2位丙氨酸(Ala)处切除二肽，使其转变为无活性的形式，其体内半衰期仅5分钟左右。GLP-1分子N端是与GLP-1受体的结合部位，其组氨酸残基丧失，导致GLP-1完全失去生物活性。另外天然的GLP-1会被肾脏快速滤过代谢，所以这需要我们对天然GLP-1进行改造，以期望寻找到能够抵抗DPP-1V降解，避免肾脏快速滤过代谢的GLP-1类似物。

天然产物中的4-羟基香豆素类化合物有比较强的血清蛋白结合率，血清白蛋白结合以后的药物与游离药物在体内产生平衡，缓慢释放实现长效化。同时血清白蛋白结合药物不被肾小球滤过，可以避免肾脏的滤过代谢。所以，我们设计了以4-羟基香豆素为母核的香豆素类化合物，通过半胱氨酸的巯基与肽链相连接。

发明内容

本发明涉及一类胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物。其结构具有以下形式：

His-Xaa1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Xaa2-Xaa3-Tyr-Leu-Glu-Gly-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Phe-Ile-Xaa9-Trp-Leu-Val-Xaa10-Gly-Arg-Xaa11

(SEQ.ID NO：1)

其中：

Xaa1：Ala，Leu，Val，Met，Ile，Tyr，Phe，Arg，Asn，Lys，Thr，Asp，His，Trp，Gln，Glu，Ser或Gly；

Xaa2：化学修饰的Cys或Ser；

Xaa3：化学修饰的Cys或Ser；

Xaa4：化学修饰的Cys或Gln；

Xaa5：化学修饰的Cys或Ala；

Xaa6：化学修饰的Cys或Ala；

Xaa7：化学修饰的Cys或Lys；

Xaa8：化学修饰的Cys或Glu；

Xaa9：化学修饰的Cys或Ala；

Xaa10：化学修饰的Cys或Lys；

Xaa11：化学修饰的Cys或-NH₂；

前提是所述序列不是His-Xaa1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH₂。

其中化学修饰的Cys选自

这里：R₁、R₂相同或不同，分别选自-OH、C1～C8的烷氧基或C1～C8的烷基；R₃选自C1～C8的烷氧基或-OH；R₄选自NH或O；R₅选自C1～C8的烷氧基、C1～C8的烷基、-OH或C1～C8的酰基；R₆选自苯基、C1～C8的烷氧基或-OH；R₇选自-OH、C1～C8的烷氧基或C1～C8的烷基；n选自2～16。

优选的R₁、R₂相同或不同，分别选自-OH、C1～C4的烷氧基或C1～C4的直链或支链的烷基；R₃选自C1～C4的烷氧基或-OH；R₄选自NH；R₅选自C1～C4的烷氧基、C1～C4的直链或支链的烷基、-OH或C1～C4的酰基；R₆选自苯基、C1～C4的烷氧基或-OH；R₇选自-OH、C1～C4的烷氧基或C1～C4的直链或支链的烷基；n选自2～8。

其中最优选的化学修饰的Cys结构为

本发明的第二个目的是提供了胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物的制备方法，本发明采用微波促进Fmoc/tBu正交保护固相合成策略高效快速地合成得到胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物的肽链。

胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物的合成是将3，3’-(4-(3-马来酰亚胺基丙酰胺基)苯亚甲基)-二-4-羟基香豆素用Tris缓冲液(pH 7.0)溶解，加入半胱氨酸改变的GLP-1类似物，室温下搅拌反应，反应结束后，反应液浓缩到1mL，直接纯化，冻干得纯品。

本发明的优点在于：

1.提出的一种胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物可以在保留降糖活性的基础上，具有抗肾脏滤过消除和抗DPP-IV酶解作用，生物半率期较GLP-1原型长，提高GLP-1的稳定性，延长作用时间。

2.微波促进固相合成的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物的肽链大大的提高了偶合反应速率，常规固相合成方法充分偶合一个氨基酸到树脂上去，往往需要2小时到20小时不等，甚至更长。而微波促进则平均只需要10分钟左右；常规固相合成方法脱Fmoc保护基，往往需要30分钟到1小时不等，而微波促进则平均只需要5分钟左右，这极大的提高了多肽合成的效率，缩短了合成周期。

3.微波促进固相合成胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物得到肽链的粗品的纯度大于60％，较常规固相合成方法大大提高，这方便了后续的纯化工作。

4.微波促进固相方法合成胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，其成本低，由于偶合效率较高，所需要保护氨基酸平均只需要2倍过量，较常规固相合成方法需要4到5倍过量大为降低。

5.微波促进固相合成胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物的方法易于实现自动化、大规模化，这使其更适合工业化生产。

因此用本发明提供的微波促进固相合成技术制备的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，收率高、合成周期短、粗品纯化容易，生产成本低、易于工业自动化生产。制备得到的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，比天然GLP-1更加稳定，适合作为治疗糖尿病药物的活性成分。

附图说明

上文对本发明做了一般性描述，下面附图用于说明本发明的具体实施方案。其中：

图1显示的是GLP-1(7～36)-NH₂与DPP IV温孵0h和0.5h的HPLC分析谱图；

图2显示的是GLP-1(7～36)-NH₂与人血浆温孵3h和4h的HPLC分析谱图；

图3显示的是改造后的Gly₈-化学修饰的Cys₂₃-GLP-(7～36)-NH₂与DPP IV温孵4h的HPLC分析谱图；

图4显示的是改造后的Gly₈-化学修饰的Cys₂₆-GLP-(7～36)-NH₂与DPP IV温孵4h的HPLC分析谱图；

具体实施方式

在本说明书全文中采用以下缩写：

Et₃N：三乙胺；NMM：N-甲基吗啉；DIEA：N，N′-二异丙基乙胺；DMF：二甲基甲酰胺；DMSO：二甲亚砜；DCM：二氯甲烷；Fmoc：N-9-芴甲氧羰基；DIC：N，N’-二异丙基碳二亚胺；CDI：N，N’-羰基二咪唑；DMAP：4-二甲氨基吡啶；HOSU：N-羟基琥珀酰亚胺；EDC.HCl：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐；HATU：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯；HBTU：苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯；HCTU：6-氯苯并三氮唑-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯；HOAT：1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑；HOBT：1-羟基-苯并三氮唑；PyBOP：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷；HPLC：高效液相色谱；ESI-MS：电喷雾质谱；Gly：甘氨酸；Ser：丝氨酸；Ala：丙氨酸；Thr：苏氨酸；Val：缬氨酸；Ile：异亮氨酸；Leu：亮氨酸；Tyr：酪氨酸；Phe：苯丙氨酸；His：组氨酸；Pro：脯氨酸；Asp：天门冬氨酸；Met：蛋氨酸；Glu：谷氨酸；Trp：色氨酸；Lys：赖氨酸；Arg：精氨酸。Asn：天冬酰胺；Gln：谷氨酰胺。

本发明是通过下列实施例来进行说明的，但这些实施例不做任何限制本发明的解释。

实施例1

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-化学修饰的Cys-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH₂(SEQ.ID NO：2)

的微波促进固相合成

(1)树脂的溶胀

称取Fmoc-Rink amide-MBHA Resin 50mg(取代量0.4mmol/g)，经7mL DCM溶胀30min，抽滤去DCM，再用10mL NMP溶胀30min，最后分别用NMP，DCM，NMP 7mL冲洗干净。

(2)微波促进Fmoc保护基的脱除

将溶胀好的树脂放入反应器中，加入7mL含0.1M HOBT的25％哌啶/NMP(V/V)溶液，在微波反应器中反应1min，微波功率为15W，反应温度控制在50℃以内，使用空气压缩机压缩空气冷却，反应结束后滤去溶液；再加入7mL含0.1M HOBT的25％哌啶/NMP(V/V)溶液在微波反应器中再反应4min，微波功率为25W，反应温度控制在50℃，使用空气压缩机压缩空气冷却。反应结束后滤去溶液，用NMP洗涤干净。得到脱去初始连接的Fmoc保护基的树脂。

(3)微波促进Fmoc-Arg(Pbf)-Rink amide-MBHA Resin的合成

将Fmoc-Arg(Pbf)-OH(0.04mmol)，HBTU(0.04mmol)，HOBT(0.04mmol)和DIPEA(0.08mmol)溶于10mL NMP中，再将此溶液加入上面的树脂中，在微波反应器中反应7min，微波功率为25W，反应温度控制在50℃，使用空气压缩机压缩空气冷却。反应结束后滤除反应液，用DCM和NMP各7mL洗涤树脂3次。

(4)偶合效率的检测

用茚三酮法或者溴酚兰法定性检测树脂的偶合效率，显色反应为阴性即可进入下一个偶合循环。

茚三酮法：取少量树脂颗粒用乙醇洗涤，放入透明小瓶中加入5％茚三酮乙醇、KCN吡啶溶液(2ml 0.001M KCN稀释于98ml吡啶中)、80％苯酚乙醇溶液各2滴，于100℃加热5分钟，如果树脂显蓝色即为阳性。

溴酚兰法：取少量树脂颗粒用二甲酰乙酰胺洗涤，放入透明小瓶中加入3滴1％的溴酚蓝二甲基乙酰胺溶液，常温下振摇3分钟，如果树脂显蓝色即为阳性。

(5)肽链的延长

按照Gly₈-Cys₂₃-GLP-(7～36)-NH₂的序列，重复上述脱保护和偶合的步骤依次连接上相应的氨基酸，偶合微波促进反应时间5～20min不等。得到连有Gly₈-Cys₂₃-GLP-(7～36)-NH₂的树脂。

(6)树脂上多肽的裂解

将上述得到的连有Gly₈-Cys₂₃-GLP-(7～36)-NH₂的树脂放入反应瓶中，各加入裂解剂Reagent K(TFA/苯甲硫醚/水/苯酚/EDT，82.5∶5∶5∶5∶2.5，V/V)10mL，先在0℃下振摇30min，再在常温下反应3h。反应结束后抽滤，加少量TFA和DCM洗涤三次，合并滤液。将滤液加入大量的冰乙醚中析出白色絮状沉淀，冷冻离心得到目标多肽的粗品。最终得到Gly₈-Cys₂₃-GLP-(7～36)-NH₂粗品63.2mg，收率为94.3％。

(7)化学修饰基的合成

3-马来酰胺丙酸的合成

将19.6g(0.2mol)马来酸酐溶于40ml冰醋酸中，慢慢加入至40ml冰醋酸溶解的β-丙氨酸17.8g(0.2mol)中，室温反应6h，有白色沉淀生成。过滤除去溶剂，沉淀用30ml冰醋酸洗3次，再用30ml冰水洗3次，粗品用水溶解，冻干，得产物，33.7g，收率90.1％，mp 160℃。

¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)δppm：2.50(t，2H，-CH₂-)，3.36(m，2H，-CH₂-)，6.26(dd，1H，C＝CH-)，6.38(dd，1H，C＝CH-)。

ESI-MS：理论分子量187.1，实验测定分子离子峰186.0(Neg.scan)。

N-羧乙基马来酰亚胺的合成

将3.4g(0.02mol)马来酰胺酸碾成粉末，用100ml甲苯混悬，用分水器回流4h，得棕黄色油状液体。产物用水溶解，乙酸乙酯重结晶，得纯品2.4g，收率70.5％，mp 106℃。

¹H-NMR(300MHz，CD₃OD)δppm：2.48(t，2H，-CH₂-)，3.32(t，2H，-CH₂-)，6.26(s，2H，-CH＝CH-)。

ESI-MS：理论分子量169.1，实验测定分子离子峰168.0(Neg.scan)；170.1，192.1(Pos.scan)。

3，3’-(4-硝基苯亚甲基)-三-4-羟基香豆素的合成

称取3.02g(0.02mol)对硝基苯甲醛，用35ml无水乙醇溶解，超声助溶；后加入6.6g(0.041mol)4-羟基香豆素，补加15ml无水乙醇，超声溶完全。油浴加热，回流反应4h，趁热过滤，滤饼用热乙醇30ml洗3次，得产品8.2g，收率90.0％，mp 227℃。

¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)δppm：6.13(s，H，-CH-)，7.43(m，8H，Ar-H)，7.68(m，2H，Ar-H)，8.18(m，2H，Ar-H)。

ESI-MS：理论分子量459.4，实验测定分子离子峰458.0(Neg.scan)。

3，3’-(4-氨基苯亚甲基)-二-4-羟基香豆素的合成

称取3，3’-(4-硝基苯亚甲基)-二-4-羟基香豆素1.14g(0.0025mol)，用30ml醋酸悬浮，加入0.3g 5％Pd/C，搅拌，氢气三通抽气3次，瓶口涂凡士林，常温氢化，反应过夜，抽滤，滤液蒸去部分溶剂，用丙酮重结晶，得产品0.8g，收率75.1％，mp 220℃。

¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)δppm：6.27(s，H，-CH-)，7.23(m，8H，Ar-H)，7.49(m，2H，Ar-H)，7.81(m，2H，Ar-H)。

ESI-MS：理论分子量429.1，实验测定分子离子峰428.0(Neg.scan)。

3，3’-(4-(3-马来酰亚胺基丙酰胺基)苯亚甲基)-二-4-羟基香豆素的合成

称32mg HOBt用400μL四氢呋喃溶解，称40mg N-羧乙基马来酰亚胺用320μL四氢呋喃溶解，慢慢加入至HOBt溶液中，超声混匀，滴加DIC 40μL，60℃反应1h。将上述溶液慢慢加入至200μL四氢呋喃溶解的49mg 3，3’-(4-硝基苯亚甲基)-二-4-羟基香豆素中，室温反应2h，产物用乙酸乙酯重结晶，得到产物50mg，收率85.7％。

¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)δppm：2.54(t，2H，-CH₂-)，3.68(t，2H，-CH₂-)6.19(s，2H，C＝CH-)，7.01(s，H，-CH-)，7.43(m，8H，Ar-H)，7.49(m，2H，Ar-H)，7.81(m，2H，Ar-H)。

ESI-MS：理论分子量580.2，实验测定分子离子峰579.1(Neg.scan)。

(8)Gly₈-化学修饰的Cys₂₃-GLP-(7～36)-NH₂

将上步得到的3，3’-(4-(3-马来酰亚胺基丙酰胺基)苯亚甲基)-二-4-羟基香豆素5mg用Tris缓冲液(pH 7.0)溶解，配成1mg/mL的溶液，加入35mg(6)步得到的半胱氨酸改变的GLP-1类似物，室温下搅拌反应，使用HPLC监测反应。色谱条件为：C18反相柱(150mm×4.6mm，5μm)；流动相A：0.1％TFA/水(V/V)，流动相B：0.1％TFA/乙腈(V/V)；流动相梯度：流动相B 35％～85％，20min；流速为1mL/min；柱温为40℃；检测波长为214nm。反应结束后，反应液浓缩到1mL，直接进制备液相色谱纯化，色谱条件为：C18反相柱(320mm×28mm，5μm)；流动相A：0.1％TFA/水(V/V)，流动相B：0.1％TFA/乙腈(V/V)；流动相梯度：流动相B 40％～90％，20min；流速为6mL/min检测波长为214nm。收集的溶液冻干得纯品30mg。理论相对分子质量为3836.7。ESI-MS m/z：found[M+4H]⁴⁺960.2，[M+5H]⁵⁺768.3；calu[M+4H]⁴⁺960.2，[M+5H]⁵⁺768.3。

实施例2～6

根据实施例1所述的方法，根据相应的序列合成得到实施例2～6的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，通过电喷雾质谱(ESI-MS)确证各自的分子量。

实施例2

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-化学修饰的Cys-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH₂(SEQ.ID NO：3)；

理论相对分子质量为3850.8。ESI-MS m/z：found[M+4H]⁴⁺963.7，[M+5H]⁵⁺771.2；calu[M+4H]⁴⁺963.7，[M+5H]⁵⁺771.2。

实施例3

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-化学修饰的Cys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH₂(SEQ.ID NO：4)；

理论相对分子质量为3836.8。ESI-MS m/z：found[M+4H]⁴⁺960.2，[M+5H]⁵⁺768.4；calu[M+4H]⁴⁺960.2，[M+5H]⁵⁺768.4。

实施例4

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-化学修饰的Cys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH₂(SEQ.ID NO：5)；

实施例5

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-化学修饰的Cys-NH₂(SEQ.ID NO：6)；

理论相对分子质量为3964.9。ESI-MS m/z：found[M+4H]⁴⁺992.2，[M+5H]⁵⁺794.0；calu[M+4H]⁴⁺992.2，[M+5H]⁵⁺794.0。

实施例6

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-化学修饰的Cys-NH₂(SEQ.ID NO：7)；

理论相对分子质量为3979.0。ESI-MS m/z：found[M+4H]⁴⁺995.7，[M+5H]⁵⁺796.8；calu[M+4H]⁴⁺995.7，[M+5H]⁵⁺796.8。

实施例7

GLP-1及胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物对DPP-IV的稳定性实验

经过纯化后的GLP-1和胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物5nmol和5mU的DPP IV在200μL浓度为50mM的Tris-HCL缓冲溶液中，37℃温孵4h，pH 7.4。最后加入10μL20％的乙腈/水溶液终止反应。分别取0h，4h点的温孵溶液，离心，取上清液，进HPLC分析；柱尾收集降解产物GLP-1(9～36)-NH₂。分析采用C18反相柱(150mm×4.6mm，5μm)；流动相A：0.1％TFA/水(V/V)，流动相B：0.1％TFA/乙腈(V/V)；流动相梯度：流动相B 10％～45％，22min；流速为1mL/min；柱温为40℃；检测波长为214nm。

如图1，图2所示，结果显示未经改造的天然GLP-1在与DPP IV温孵4h后，基本上皆被水解为无活性的GLP-1(9～36)-NH₂，完整的肽链小于10％。而图3和图4显示胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物与DPP IV温孵4h后基本上都仍保持原型，未见有降解，完整的肽链大于90％。结果表明通过对GLP-1易被DPP IV水解的部位改造，可以使胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物抵抗DPP IV的酶解作用，从而能保持肽链的完整性。

实施例8

GLP-1及胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物的体内降血糖活性

同时给予葡萄糖、受试化合物：10周龄雄性昆明小鼠，随机分组，每组6只。只给饮水，禁食过夜。一组按照小鼠体重每千克腹腔注射18mmol的葡萄糖溶液(浓度20％)和生理盐水；其他组按照小鼠体重每千克腹腔注射18mmol的葡萄糖溶液和25nmol的GLP-1类化合物溶液(10μmol/L)。在0，15，30，45，60min用血糖仪测定血糖水平。

如表1所示，由于修饰后的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物具有抗酶解和抗肾脏滤过作用，其生物半衰期大大延长，所以体内降血糖实验显示其促胰岛素分泌作用不仅未被减弱，还比未经改造的天然GLP-1更强。

表1GLP-1及胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物降血糖的效应

n＝6，

*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001vs saline as control

Claims

1.一种含有式I(SEQ.ID NO：1)结构的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物；其特征在于其结构具有以下形式：

(SEQ.ID NO：1)

其中：

Xaa2：化学修饰的Cys或Ser；

Xaa3：化学修饰的Cys或Ser；

Xaa4：化学修饰的Cys或Gln；

Xaa5：化学修饰的Cys或Ala；

Xaa6：化学修饰的Cys或Ala；

Xaa7：化学修饰的Cys或Lys；

Xaa8：化学修饰的Cys或Glu；

Xaa9：化学修饰的Cys或Ala；

Xaa10：化学修饰的Cys或Lys；

Xaa11：化学修饰的Cys-NH₂或-NH₂；

2.根据权利要求1所述的肽，其中化学修饰的Cys选自

3.根据权利要求2所述的化合物，其中R₁、R₂相同或不同，分别选自-OH、C1～C4的烷氧基或C1～C4的直链或支链的烷基；R₃选自C1～C4的烷氧基或-OH；R₄选自NH；R₅选自C1～C4的烷氧基、C1～C4的直链或支链的烷基、-OH或C1～C4的酰基；R₆选自苯基、C1～C4的烷氧基或-OH；R₇选自-OH、C1～C4的烷氧基或C1～C4的直链或支链的烷基；n选自2～8。

4.根据权利要求1-3所述的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，其中优选的化学修饰的Cys结构为

5.根据权利要求1-3所述的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，具有以下序列：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-化学修饰的Cys-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH₂(SEQ.ID NO：2)；

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-化学修饰的Cys-NH₂(SEQ.ID NO：7)。

6.一种药物组合物，包括治疗有效量的权利要求1中所述的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物或者其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体或稀释剂。

7.权利要求1中所述的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物或者其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体或稀释剂在制备用于糖尿病的药物中的运用。

8.权利要求1中所述的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物的制备方法，包括生物表达、液相合成和固相合成制备方法。

9.一种胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物的合成方法，其特征是将3，3’-(4-(3-马来酰亚胺基丙酰胺基)苯亚甲基)-二-4-羟基香豆素用Tris缓冲液(pH 7.0)溶解，加入半胱氨酸改变的GLP-1类似物，室温下搅拌反应，反应结束后，反应液浓缩到1mL，直接纯化，冻干得纯品。