CN110066332A - 一种胰高血糖素样肽的捕获方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种胰高血糖素样肽的捕获方法，本发明属于生物医药蛋白质多肽纯化领域。本发明利用柱层析法能使胰高血糖素样肽迅速从不稳定的水相体系中转移至使之稳定的高浓度有机溶剂体系中，减少胰高血糖素样肽的损失，提高了收率，利于进一步精细纯化，操作简便。

Description

一种胰高血糖素样肽的捕获方法

技术领域

本发明涉及生物医药蛋白质多肽纯化领域。具体的，本发明涉及一种胰高血糖素样肽的捕获方法。

背景技术

胰高血糖素样肽是人体下消化道L-细胞分泌的一种肠降血糖素激素，研究表明其可以降低2型糖尿病受试患者的血糖浓度。当血糖浓度超过正常水平时，胰高血糖素样肽可以通过刺激胰岛素分泌从而发挥其降血糖作用，是治疗2型糖尿病的合格药物，当胰高血糖素样肽联合胰岛素用于治疗2型糖尿病时，受试者将会获得更好的疗效，即使经磺酰类药物治疗失败的患者也能发挥疗效，而且无发生严重低血糖症的风险。胰高血糖素样肽能够刺激胰腺β-细胞的生长与增生并能促进导管细胞成为新的胰腺β-细胞。胰高血糖素样肽还可以减低正常体重，消瘦或肥胖受试者的食欲，而且还可以降低2型糖尿病受试者的体重。迄今为止已经开发了胰高血糖素样肽及其类似物、衍生物等一系列的药物。

生理性的胰高血糖素样肽在体内会被二肽基肽酶Ⅳ(DPP-4)迅速灭活，使胰高血糖素样肽的生理半衰期仅为1-2min。利用基因工程技术在大肠或酵母表达体系中表达生产的胰高血糖素样肽同样不稳定，易发生降解，导致相关杂质增多，纯化困难。因此，需要一种基于层析柱的捕获技术，从大体积的含有较低浓度胰高血糖素样肽的体系中迅速捕获胰高血糖素样肽并转移到一种使胰高血糖素样肽能稳定存在的体系中。

现有技术中，CN103954771B公开了一种低成本捕获/释放及检测生物分子的方法，利用蛋白质相转变方法，将溶菌酶固定到无污染表面，在此基础上，再利用生物分子间的特异性结合原理，进一步固定目标生物分子，实现生物分子的特异性捕获，操作简单，可直接从血清、血浆、淋巴、间质液、尿液、渗出液、细胞溶解液、分泌液等中高灵敏度检测目标生物分子，且可实现基材的重复利用，降低了成本，实现了绿色化学。CN103364494B公开了一种血清糖肽组高选择性富集的新方法，选用具有合适孔径大小的功能化纳米材料作为样品吸附剂，利用结合功能基团和尺寸排阻的双重能力对血清中内源性糖基化多肽进行捕获富集。CN 101180317B公开了一种通过离子交换层析纯化免疫球蛋白的方法，使用羧甲基弱离子交换树脂在免疫球蛋白能与与弱阳离子交换材料结合的条件下，使溶液与所述弱阳离子交换材料接触，在具有pH3.0至pH7.0的pH值，缓冲物质具有5mM至100mM之间的浓度范围，单步骤盐梯度洗脱法纯化免疫球蛋白。

发明内容

在现有技术中，没有发现对胰高血糖素样肽捕获方面的应用技术，胰高血糖素样肽捕获技术的目的是要分离、浓缩、稳定胰高血糖素样肽。我们出乎意料地发现，胰高血糖素样肽能稳定地存在于高浓度的有机溶剂体系中，便于进一步精制到极高纯度。因此本发明主要开发了一种基于层析柱的捕获技术，能使胰高血糖素样肽迅速从不稳定的水相体系中转移至使之稳定的高浓度有机溶剂体系中。

本发明涉及从包含胰高血糖素样肽和至少一种相关杂质的混合物中捕获胰高血糖素样肽的方法，所述方法是采用柱层析法进行胰高血糖素样肽的捕获，特征在于从大体积的混合液中将低浓度的胰高血糖素样肽富集，并迅速转移到有利于胰高血糖素样肽稳定的体系中，捕获的胰高血糖素特别适合进一步精制到极高纯度。

本发明提供一种胰高血糖素样肽的捕获方法，其步骤包括从含有胰高血糖素样肽和至少一种相关杂质的混合物中捕获所述胰高血糖素样肽，相关杂质为来源于化学合成或生物发酵的副产物，所述混合物为澄清或带浊光的溶液，所述捕获方法为柱层析法。

优选的，其中所述胰高血糖素样肽是GLP-1、GLP-1类似物、GLP-1衍生物或GLP-1类似物的衍生物。

优选的，其中所述GLP-1类似物为Arg34-GLP-1(7-37)，其中所述GLP-1的衍生物或GLP-1类似物的衍生物具有赖氨酸残基，其中亲脂取代基可选地经由间隔基连接于所述赖氨酸的-氨基基团，所述亲脂取代基具有8-40个碳原子。

优选的，其中所述相关杂质选自：胰高血糖素样肽的氨基酸截短形式或氨基酸延长形式或修饰形式、与胰高血糖素样肽共表达的标签蛋白或融合蛋白形式，其中所述修饰形式是糖基化形式、氧化形式、脱酰胺形式或消旋造成的形式，所述相关杂质可以是来源于宿主细胞的蛋白质和核酸形式，其中所述宿主细胞是酵母细胞或大肠杆菌细胞。

优选的，其中所述胰高血糖素样肽和至少一种相关杂质在混合物中的总肽浓度为0.01mg/ml～5.00mg/ml，优选的，总肽浓度为0.01mg/ml～1.0mg/ml，优选的，总肽浓度为0.1mg/ml～1.0mg/ml。

优选的，其中所述混合物的体积为层析柱介质体积的10～1000倍，优选的，所述混合物的体积为层析柱介质体积的10～500倍，优选的，所述混合物的体积为层析柱介质体积的50～200倍。

优选的，其中所述混合物的pH范围从pH4至pH10。

优选的，其中所述层析柱是单根的，或两根及以上的以串联或并联方式连接的装填有层析介质的层析柱。

优选的，其中所述层析柱的介质选自阳离子交换层析树脂、阴离子交换层析树脂、金属鳌合亲和层析层析树脂或反相层析树脂。

优选的，其中洗脱溶剂的pH范围从pH4至pH10，所述洗脱溶剂为含浓度为10％～90％的有机溶剂，优选的，所述有机溶剂选自乙醇、甲醇或乙腈。

本发明中的“胰高血糖素样肽”指的是胰高血糖素样肽-1(GLP-1)以及它们的类似物和衍生物。胰高血糖素样肽-1具有下面的序列：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG。

本发明中的“类似物”指的是修饰的肽，其中所述肽的一个或多个氨基酸残基被其它的氨基酸残基替代，和/或其中一个或多个氨基酸残基被从所述肽上删除。例如Arg34-GLP-1(7-37)指一种GLP-1类似物，其中在位置34的天然发生的赖氨酸被精氨酸替代。

本发明中的“衍生物”指的是化学修饰的亲本肽或其类似物，一般的修饰是酰化、聚乙二醇化等。例如Arg34-GLP-1(7-37)衍生物是Arg34-Lys26(Nε-(γ-Glu(Nα-十六酰基)))GLP-1(7-37)。

本发明中的“捕获”指的是将目标物进行分离、浓缩、初步纯化并且对目标物进行稳定化处理。目标物被浓缩和转移到另外一个环境中，可以保存它的活性或效价。

本发明的捕获方法具有如下的积极效果：能使胰高血糖素样肽迅速从不稳定的水相体系中转移至使之稳定的高浓度有机溶剂体系中，减少胰高血糖素样肽的损失，提高了收率，利于进一步精细纯化，操作简便。

附图说明

图1是胰高血糖素样肽捕获前的RP-HPLC图谱，胰高血糖素样肽的纯度为32％。

图2是胰高血糖素样肽捕获后的RP-HPLC纯度，胰高血糖素样肽纯度为97％。

图3是胰高血糖素样肽精制后的RP-HPLC纯度，胰高血糖素样肽纯度为99.30％。

图4是胰高血糖素样肽精制后的SEC-HPLC纯度，胰高血糖素样肽纯度为99.80％。

具体实施方式

下面结合附图说明和以下实施例来进一步描述本发明的有益效果，实施例仅用于例证的目的，不限制本发明的范围，同时本领域普通技术人员根据本发明所做的显而易见的改变和修饰也包含在本发明范围之内。

实施例1：胰高血糖素样肽的捕获

通过重组DNA技术在酵母中发酵表达分泌Arg³⁴GLP-1(7-37)。通过离心分离获得上清液约1000ml，紫外吸光度法检测Arg³⁴GLP-1(7-37)的肽浓度约为0.5mg/ml，用醋酸调节pH7.5。

准备捕获层析柱，装填20ml source 30RPC反相层析填料，柱高约10cm，用20mMTris-Cl，pH7.5平衡液平衡1个柱体积。

将上清液约1000ml上样该source 30RPC反相层析柱，上样流速约300cm/h，上样完毕，再用20mM Tris-Cl，pH7.5平衡液平衡1个柱体积。

使用含有机溶剂的缓冲液开始阶段式的洗涤和洗脱过程，先用20mM Tris-Cl，pH7.5，20％乙醇洗涤20个柱体积，洗涤完毕，再用20mM Tris-Cl，pH7.5，50％乙醇洗脱，收集洗脱主峰。

在分析液相上使用C18，5μm，4.6×150mm柱进行收集的洗脱主峰的RP-HPLC分析，检测的纯度为98％，计算的收率为92％。

实施例2：胰高血糖素样肽的捕获

通过重组DNA技术在大肠杆菌中发酵表达Arg³⁴GLP-1(7-37)融合肽。包涵体复性后离心分离获得上清液约1000ml，紫外吸光度法检测Arg³⁴GLP-1(7-37)的肽浓度约为0.2mg/ml，用醋酸调节pH7.5。

准备捕获层析柱，装填20ml镍离子亲和层析填料和20ml source 30RPC反相层析填料，柱高各约10cm，用20mM Tris-Cl，pH7.5平衡液平衡1个柱体积。

将上清液约1000ml上样上述串联柱，上样流速约300cm/h，上样完毕，再用20mMTris-Cl，pH7.5平衡液平衡1个柱体积。

使用含有机溶剂的缓冲液开始对source 30RPC反相层析柱进行阶段式的洗涤和洗脱过程，先用20mM Tris-Cl，pH7.5，20％乙醇洗涤20个柱体积，洗涤完毕，再用20mMTris-Cl，pH7.5，50％乙醇洗脱，收集洗脱主峰。

在分析液相上使用C18，5μm，4.6×150mm柱进行收集的洗脱主峰的RP-HPLC分析，检测的纯度为98％，计算的收率为91％。

实施例3：胰高血糖素样肽的捕获

通过多肽合成技术合成Arg³⁴GLP-1(7-37)，获得肽溶液约200ml，紫外吸光度法检测Arg³⁴GLP-1(7-37)的肽浓度约为5mg/ml，用氢氧化钠调节pH8.5。

准备捕获层析柱，装填20ml source 30RPC反相层析填料，柱高约10cm，用20mMTris-Cl，pH8.5平衡液平衡1个柱体积。

将约200ml肽液上样该source 30RPC反相层析柱，上样流速约300cm/h，上样完毕，再用20mM Tris-Cl，pH10.0平衡液平衡1个柱体积。

使用含有机溶剂的缓冲液开始梯度洗脱过程，20～50％乙醇(20mM Tris-Cl，pH10.0)洗脱10个柱体积，收集洗脱主峰。

在分析液相上使用C18，5μm，4.6×150mm柱进行收集的洗脱主峰的RP-HPLC分析，图谱如图2所示，检测的纯度为97％，计算的收率为92％。

实施例4：胰高血糖素样肽的精制

将上述捕获的胰高血糖素粗品，纯度约为97％以上，进行进一步的高压制备液相精制，使纯度达到99％以上，制备液相填料选用菲罗门公司C8，10μm填料，流动相A为0.1％三氟乙酸-水，流动相B为0.1％三氟乙酸-乙腈。

用平衡液(20mM Tris-Cl，pH8.5，10％乙腈)平衡约2CV，流速为229cm/h，上样载量为2mg/ml填料，上样流速为229cm/h。

流动相A与B梯度混合洗脱，45-53％梯度洗脱7.5CV，洗脱流速为229cm/h，具体的梯度洗脱条件如下表表1所示：

表1

时间(min)	A(％)	B(％)
			0	100	0
2	55	45
			52	47	53
52.1	10	90
			56	10	90
56.1	90	10
			60	90	10

收集主峰，检测的RP-HPLC纯度为99.30％，图谱如图3所示，SEC-HPLC纯度为99.80％，图谱如图4所示，IEC-HPLC纯度为99.84％，计算的收率为90％。

经本发明所述的胰高血糖素样肽捕获方法获得的胰高血糖素样肽特别适合于进一步的精制，经进一步精制的胰高血糖素样肽的检测结果如下表表2所示，各项质量指标完全符合要求。

表2

Claims (10)

1.一种胰高血糖素样肽的捕获方法，其特征在于：从含有胰高血糖素样肽和至少一种相关杂质的混合物中捕获所述胰高血糖素样肽，相关杂质为来源于化学合成或生物发酵的副产物，所述混合物为澄清或带浊光的溶液，所述捕获方法为柱层析法。

2.根据权利要求1的方法，其中所述胰高血糖素样肽是GLP-1、GLP-1类似物、GLP-1衍生物或GLP-1类似物的衍生物。

3.根据权利要求2的方法，其中所述GLP-1类似物为Arg34-GLP-1(7-37)，其中所述GLP-1的衍生物或GLP-1类似物的衍生物具有赖氨酸残基，其中亲脂取代基可选地经由间隔基连接于所述赖氨酸的-氨基基团，所述亲脂取代基具有8-40个碳原子。

4.根据权利要求1的方法，其中所述相关杂质选自：胰高血糖素样肽的氨基酸截短形式或氨基酸延长形式或修饰形式、与胰高血糖素样肽共表达的标签蛋白或融合蛋白形式，其中所述修饰形式是糖基化形式、氧化形式、脱酰胺形式或消旋造成的形式；所述相关杂质也可以是来源于宿主细胞的蛋白质和核酸形式，其中所述宿主细胞是酵母细胞或大肠杆菌细胞。

5.根据权利要求1的方法，其中所述胰高血糖素样肽和至少一种相关杂质在混合物中的总肽浓度为0.01mg/ml～5.00mg/ml，优选的，总肽浓度为0.01mg/ml～1.0mg/ml，优选的，总肽浓度为0.1mg/ml～1.0mg/ml。

6.根据权利要求1的方法，其中所述混合物的体积为层析柱介质体积的10～1000倍，优选的，所述混合物的体积为层析柱介质体积的10～500倍，优选的，所述混合物的体积为层析柱介质体积的50～200倍。

7.根据权利要求1的方法，其中所述混合物的pH范围从pH4至pH10。

8.根据权利要求1的方法，其中所述层析柱是单根的，或两根及以上的以串联或并联方式连接的装填有层析介质的层析柱。

9.根据权利要求1的方法，其中所述层析柱的介质选自阳离子交换层析树脂、阴离子交换层析树脂、金属鳌合亲和层析层析树脂或反相层析树脂。

10.根据权利要求8-9任一项所述的方法，其中洗脱溶剂的pH范围从pH4至pH10；所述洗脱溶剂为含浓度为10％～90％的有机溶剂；优选的，所述有机溶剂选自乙醇、甲醇或乙腈。