CN100579986C - 一种生产促胰岛素分泌肽glp-1(7-36)及glp-1类似物的方法 - Google Patents
一种生产促胰岛素分泌肽glp-1(7-36)及glp-1类似物的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用基因串联的方法生产促胰岛素分泌肽GLP-1(7-36)或GLP-1类似物的方法以及由该方法生产的多肽。本发明可以使1-32个GLP-1(7-36)基因或GLP-1类似物基因串联表达，并通过后续的融合蛋白裂解及分离纯化等工艺得到目的多肽。本发明大大降低了生产成本，使得大规模生产GLP-1(7-36)及GLP-1类似物成为可能。
Description
技术领域
本发明涉及一种用基因串联的方式生产胰高血糖素类多肽GLP-1(7-36)及GLP-1类似物的方法以及由该方法生产的多肽。GLP-1(7-36)及GLP-1类似物具有促进胰岛素分泌的作用。
发明背景
GLP-1(Glucagon Like Peptide-1)是人体肠道细胞分泌的一种多肽激素，由胰高血糖素原分子经肠道L-细胞蛋白水解酶作用而产生，因而被称为胰高血糖素类多肽。GLP-1具有促进胰岛素分泌的作用。例如，当血糖浓度高于6mmol/L时，极低浓度的GLP-1即可显著促进胰岛素分泌；一旦血糖浓度恢复至正常值，GLP-1则不再继续作用。
人体内的GLP-1有二种形式，一种为GLP-1(7-36)NH2，是由30个氨基酸残基组成的多肽，其C端氨基酸是酰胺化的；另一种为GLP-1(7-37)，是由31个氨基酸残基组成的多肽。GLP-1(7-36)NH2和GLP-1(7-37)都具有较强的促胰岛素分泌作用。就GLP-1(7-36)NH2的促胰岛素分泌作用而言，其C端氨基酸的酰胺化并不是必需的，GLP-1(7-36)OH(以下简称GLP-1(7-36))同样具有促胰岛素分泌作用。
研究表明：在治疗II型糖尿病方面，GLP-1比胰岛素更具优势。因为GLP-1能够增加：(1)胰岛素原(proinsulin)基因的转录与合成，(2)胰岛素的分泌量，(3)C-肽的分泌量，(4)胰岛素受体的敏感性，(5)β细胞的总量。同时，GLP-1能够减少或降低：(1)对胰岛素的抗性，(2)糖化血红蛋白(HbAlc)、果糖胺、血糖(餐后和非进餐时间的血糖)、胰高血糖素和脂肪酸的量。(Nielsen J.H.，et al.，Regulation ofbeta-cell mass by hormones and growth factors，Diabetes，50，suppl.，1：S25-9，2001；Hui H.，et al.，Glucagon-like peptide 1induces differentiation of islet duodenal homeobox-1-positivepancreatic ductal cells into insulin-secreting cells，Diabetes，50(4)：785-96，2001)
值得注意的是，GLP-1能够增加胰岛β细胞的分裂与总量，这是目前其它糖尿病治疗药物所不具备的。此外，GLP-1对于口服磺酰脲类降糖药物失效的患者依然有效。而且，GLP-1在机体血糖浓度恢复正常时，不再促进胰岛素分泌，因此不会引起低血糖休克。大量的临床研究亦证实GLP-1是比较理想的II型糖尿病治疗药物(Rachman J.，et al.，Normalization of insulin response to glucose by overnight infusionof glucagon-like peptide 1(7-36)amide in patients with NIDDM，Diabetes，45(11)：1524-30，1996；Doyle M.E.，et al.，Glucagon-likepeptide-1，Recent Progress in Hormone Research，56：377-99，2001；Daniel J.Drucker，Minireview：The Glucagon-Like Peptides，Endocrinology，142(2)：521-527，2001)。
然而，用化学合成法生产GLP-1成本高昂，试剂级GLP-1的售价为400美元/毫克，昂贵的价格极大地限制了GLP-1用于临床。曾有研究者尝试用基因工程的方法生产GLP-1，但无论是融合型表达还是分泌型表达，GLP-1的成本和产量均不理想，不能大规模低成本地生产GLP-1。
本发明的目的在于研究开发一种新的、通过基因串连的方式高效表达GLP-1(7-36)及GLP-1类似物的方法。使用本发明提供的方法，能够简化工艺、降低成本，适于大批量地生产GLP-1(7-36)及GLP-1类似物。
发明概述
本发明涉及一种生产促胰岛素分泌肽GLP-1(7-36)及GLP-1类似物的方法，包括：
(a)将能形成杂交位点的两个限制性内切酶位点引入GLP-1(7-36)或GLP-1类似物的基因编码序列两端；
(b)酶切后再进行连接，形成杂交位点，从而将n个串连的GLP-1(7-36)基因或GLP-1类似物基因，或交互串连的GLP-1(7-36)基因和GLP-1类似物基因克隆入载体，其中，n为1-32的整数；
(c)将含有串连基因的载体导入宿主细胞；
(d)在宿主细胞中表达包含n个多肽的融合蛋白，其中，n为1-32的整数，所述融合蛋白仅包含GLP-1(7-36)多肽或GLP-1类似物，或者包含GLP-1(7-36)多肽和GLP-1类似物，而不包含载体蛋白；
(e)裂解融合蛋白；
(f)分离纯化GLP-1(7-36)多肽或GLP-1类似物。
本发明生产方法中能形成杂交位点的一对限制性内切酶组合包括但不限于Bgl II和BamH I，Sal I和Xhol I。
本发明生产方法中的载体可以包含n个串连的GLP-1(1-36)基因或GLP-1类似物基因，或交互串连的GLP-1(7-36)和GLP-1类似物基因，其中，n为1-32的整数。优选地，n为8-32的整数；更优选地，n为16或32。
本发明生产方法中的宿主细胞可以表达含有n个多肽的融合蛋白，其中，n为1-32的整数，融合蛋白可以包含n个同样的GLP-1(7-36)多肽或者GLP-1类似物，也可以包含共计n个的GLP-1(7-36)多肽和GLP-1类似物。优选地，n为8-32的整数；更优选地，n为16或者32。
本发明优选原核细胞作为表达GLP-1(7-36)及GLP-1类似物的宿主细胞。
本发明还涉及由上述生产方法得到的GLP-1(7-36)多肽及GLP-1类似物。
按照本发明的生产方法得到的GLP-1(7-36)多肽，具有式一所示的氨基酸残基序列：
7 10 15 20
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-
22 25 30 35 36
Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-OH
(式一)
附图的简要说明
图1为含有1个GLP-1(7-36)基因的质粒构建示意图。
图2显示(1)、(2)、(3)、(4)四个片段连接后产生的能够编码GLP-1(7-36)多肽的碱基序列。
图3显示(1’)、(2’)、(3’)、(4’)四个片段连接后产生的能够编码GLP-1(7-36)多肽的碱基序列。
图4为含有2-32个串连GLP-1(7-36)基因的质粒构建示意图。
图5显示发酵过程中工程菌的生长过程。
图6显示GLP-1(7-36)多肽的HPLC分析结果。
图7显示GLP-1(7-36)多肽的氨基酸组成。
图8显示GLP-1(7-36)多肽的质谱分析结果。
图9显示注射GLP-1(7-36)后，小鼠血清中胰岛素的浓度变化。
图10显示注射GLP-1(7-36)后，小鼠血清中C肽的浓度变化。
图11显示注射GLP-1(7-36)后，小鼠血清中血糖浓度的变化。
发明详述
本发明人经过仔细研究和精心设计，利用能形成杂交位点的限制性核酸内切酶位点将若干个GLP-1(7-36)和/或GLP-1类似物基因串联起来，表达后产生含有若干个GLP-1(7-36)多肽和/或GLP-1类似物的融合蛋白，进而裂解融合蛋白，分离纯化后得到大量GLP-1(7-36)多肽和/或GLP-1类似物。
在本发明中，GLP-1(7-36)的氨基酸序列如上文式一所示。“GLP-1类似物”(GLP-1 Analogs)是指天然的GLP-1(7-37)OH或者如式一所示的GLP-1(7-36)OH的氨基酸序列中，若干个氨基酸残基经改变、取代或修饰后形成的多肽。研究表明，许多GLP-1类似物仍然具有促胰岛素分泌作用。例如，US Patent 5,545,618和WO 01/98331 A2公开了一些GLP-1类似物，这些类似物是天然GLP-1(7-37)OH氨基酸序列中第8，11，12，16，22，23，24，26，27，30，33，34，35位的一个或多个氨基酸残基发生改变后形成的。这些类似物的例子包括但不限于：Gly8-GLP-1(7-36)，Val8-GLP-1(7-36)，Asp11-GLP-1(7-36)，Ala16-GLP-1(7-36)，Glu22-GLP-1(7-36)，His23-GLP-1(7-36)，Glu24-GLP-1(7-36)，Trp26-GLP-1(7-36)，Ala27-GLP-1(7-36)，Glu30-GLP-1(7-36)，Asp33-GLP-1(7-36)，Glu34-GLP-1(7-36)，Thr35-GLP-1(7-36)，Gly8-Glu24-GLP-1(7-36)，Leu8-Ala33-GLP-1(7-36)，Thr36-Arg37-GLP-1(7-37)，Ser36-Arg37-GLP-1(7-37)等等。
优选地，本发明的GLP-1类似物含有“保守取代”的氨基酸，更优选地，GLP-1类似物含有“高度保守取代”的氨基酸。
“保守取代”(conservative substitution)是指一个氨基酸被另一个净电荷与其相同、形状和大小与其几乎相同的氨基酸取代。
“高度保守取代”(highly conservative substitution)是指一个氨基酸被另一个侧链功能基团与其相同、形状和大小与其几乎相同的氨基酸取代。例如，当侧链上碳原子和杂原子总数的差别小于2时，带有脂肪族侧链的氨基酸和带有取代的脂肪族侧链的氨基酸具有几乎相同的大小；当侧链上具有相同数量的分支(branch)时，它们具有几乎相同的形状。高度保守取代的例子包括：缬氨酸(valine)取代亮氨酸(leucine)，苏氨酸(threonine)取代丝氨酸(serine)，天冬氨酸(aspartic acid)取代谷氨酸(glutamic acid)，苯基甘氨酸(phenylglycine)取代苯基丙氨酸(phenylalanine)。非高度保守取代的例子包括丙氨酸(alanine)取代缬氨酸(valine)，丙氨酸(alanine)取代丝氨酸(serine)，天冬氨酸(aspartic acid)取代丝氨酸(serine)。
因此，本发明涉及一种生产促胰岛素分泌肽GLP-1(7-36)及GLP-1类似物的方法，包括：
(a)将能形成杂交位点的两个限制性内切酶位点引入GLP-1(7-36)或GLP-1类似物的基因编码序列两端；
(b)酶切后再进行连接，形成杂交位点，从而将n个串连的GLP-1(7-36)基因或GLP-1类似物基因、或交互串连的GLP-1(7-36)基因和GLP-1类似物基因克隆入载体，其中，n为1-32的整数；
(c)将含有串连基因的载体导入宿主细胞；
(d)在宿主细胞中表达包含n个多肽的融合蛋白，其中，n为1-32的整数，所述融合蛋白仅包含GLP-1(7-36)多肽或GLP-1类似物，或者包含GLP-1(7-36)多肽和GLP-1类似物，而不包含载体蛋白；
(e)裂解融合蛋白；
(f)分离纯化GLP-1(7-36)多肽或GLP-1类似物。
在众多的限制性核酸内切酶中，有若干对内切酶识别的碱基可以形成“杂交位点”。这些酶对包括但不限于Bgl II和BamH I，Sal I和Xhol I。比如Bgl II识别的碱基序列为A|GA TCT，BamH I识别的碱基序列为G|GA TCC，两者产生的互补粘末端连接形成AGA TCC或GGA TCT的序列，Bgl II和BamH I都不再能进行酶切，该序列即称为“杂交位点”。利用杂交位点可以将若干个基因片段串连起来。
本发明涉及的融合蛋白由若干个多肽(GLP-1(7-36)或GLP-1类似物)构成，每两个多肽之间(例如，两个GLP-1(7-36)之间，两个GLP-1类似物之间，一个GLP-1(7-36)和一个GLP-1类似物之间)间隔了若干个氨基酸残基，考虑到融合蛋白的裂解，与每个多肽(GLP-1(7-36)或GLP-1类似物)N端相连的肽键应该是“可专一性裂解的肽键”。
“可专一性裂解的肽键”是指能够被化学试剂、蛋白酶等物质特异性识别并作用的肽键。在特定化学试剂或蛋白酶的作用下，“可专一性裂解的肽键”发生断裂，肽链被裂解。单个氨基酸残基或多个氨基酸残基组成的序列都可能与GLP-1(7-36)或GLP-1类似物的N端氨基酸形成“可专一性裂解的肽键”，这样的若干个氨基酸本文简称作“成键氨基酸”。“成键氨基酸”的代表性例子包括但不限于：能够被溴化氰识别的Met，能够被碱性蛋白酶识别的Arg，能够被肠激酶(Enterokinase)识别的氨基酸残基序列Asp Asp Asp Asp Lys。
用适当的方法从“可专一性裂解的肽键”处切断融合蛋白，融合蛋白即裂解成多个C-末端接上若干个氨基酸的GLP-1(7-36)多肽或GLP-1类似物。
以由GLP-1(7-36)组成的融合蛋白为例，融合蛋白裂解后产生GLP-1(7-36)-Xaa…Xaa，其中，Xaa…Xaa表示若干个氨基酸连接在一起。GLP-1(7-36)的C-末端为精氨酸(Arg)，使用蛋白酶专一性地裂解Arg羧基形成的肽键，即可得到GLP-1(7-36)。此二步裂解可以互换顺序。典型地，在GLP-1(7-36)的N端接上Arg，使用蛋白酶专一性地裂解Arg羧基形成的肽键，可以一步将融合蛋白裂解得到若干个GLP-1(7-36)单体。也可以在GLP-1(7-36)的N端接上Met，先用CNBr裂解Met羧基形成的肽键，再用蛋白酶专一性裂解Arg形成的肽键，从而得到GLP-1(7-36)。还可以在GLP-1(7-36)的N端接上氨基酸序列Asp Asp AspAsp Lys，用肠激酶从GLP-1(7-36)N端裂解融合蛋白，再用蛋白酶专一性裂解Arg形成的肽键，从而得到GLP-1(7-36)。
本发明优选在GLP-1(7-36)或GLP-1类似物的N端接上Arg残基。
可以根据GLP-1(7-36)或GLP-1类似物的氨基酸序列，设计合成能够编码GLP-1(7-36)或GLP-1类似物的基因片段，并在其5’端添加编码“成键氨基酸”的密码子，然后在其两端引入基因串连及克隆入载体所需的限制性内切酶位点，改造后形成能够编码GLP-1(7-36)多肽或GLP-1类似物、序列两端具有所需酶切位点的碱基序列，即“可串连基因”。
也可以分离天然GLP-1(7-36)的核酸编码序列，改造后产生可串连基因。本发明优选人工合成的方式。
由于遗传密码子的简并性，同一个氨基酸可以由几组不同的密码子编码，因此，本领域的技术人员能够根据GLP-1(7-36)的氨基酸序列，推知并合成各种核酸编码序列；还能够根据现有技术中已公开的GLP-1类似物，推知并合成相应的核酸编码序列。本发明优选大肠杆菌中使用频率较高的密码子。
可以先合成若干个基因片段，经粘端和/或平端连接后产生目的序列，也可以直接合成能够编码目的多肽的碱基序列。优选合成若干个核酸片段后，经粘端连接产生目的序列的方式。
为基因串连的目的引入的能形成杂交位点的限制性内切酶位点需要经过仔细选择和精心设计，而为基因克隆目的引入的酶切位点可以根据载体上的酶切位点进行设计，因而存在相对多的选择。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明人选择大肠杆菌使用频率较高的密码子，设计合成4个基因片段，连接后的GLP-1(7-36)序列两端具有基因串连所需的粘末端互补的Bgl II和BamH I酶切位点，以及克隆入载体所需的EcoR I和Hind III位点。其中，Bgl II和BamH I酶切位点可以互换。
在本发明的另一个优选实施方案中，本发明人选择大肠杆菌使用频率较高的密码子，设计合成4个基因片段，连接后的GLP-1(7-36)基因两端具有基因串连所需的粘末端互补的Sal I和Xhol I酶切位点，以及克隆入载体所需的EcoR I和Hind III位点。
利用载体上和连接后GLP-1(7-36)基因或GLP-1类似物基因具有的酶切位点，可以将若干个串联的GLP-1(7-36)基因、GLP-1类似物基因、或交互串联的GLP-1(7-36)基因和GLP-1类似物基因克隆入载体，其中，“交互串连”是指若干个GLP-1(7-36)基因和GLP-1类似物基因按任意顺序串连在一起。此处可用的载体包括染色体来源的、非染色体来源的和合成的DNA序列，例如噬菌体DNA，杆状病毒，细菌质粒，酵母质粒，以及由质粒、噬菌体DNA和病毒DNA(如牛痘病毒、腺病毒、家禽痘病毒和假狂犬病病毒)组合衍生的载体。大量适合的载体是本领域技术人员已知的，能够在宿主中复制并稳定存在的任何质粒或载体都可以用于本发明。
作为代表性但非限制性的例子，用于细菌的表达载体可以含有源于市售质粒，如Amersham Pharmacia Biotech公司pKK233-2、pKK223-3、pEZZ18、pUC18、pUC19或pT7的选择性标记和细菌复制起点。
表达载体中的目的基因可操作地与适当的启动子连接，启动于是DNA转录的调节控制序列。启动子的代表性例子包括：大肠杆菌的lac或trp、tac，T7噬菌体启动子、λ噬菌体PL启动子，和已知的在原核或真核细胞或病毒中控制基因表达的其它启动子。特别提到的细菌启动子包括lacI、lacZ、T3、T7、Protein A信号肽、gpt、λPR、PL、和trp。对适当的载体与启动子的选择在本领域技术人员的知识范围内。
此外，优选的表达载体包含一个或多个选择标记基因，以便转入宿主细胞后使宿主细胞具有可筛选的表型特征。选择标记基因的代表性例子有：大肠杆菌中的四环素抗性和氨苄青霉素抗性基因，真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性基因等。
本发明生产方法中的载体可以容纳n个串连的基因，其中，n为1-32的整数。优选地，n为8-32的整数。更优选地，n为16或32。
在本发明的一个优选实施方案中，载体含有1个GLP-1(7-36)基因。
在另一个优选实施方案中，载体含有2个串联的GLP-1(7-36)基因。
在另一个优选实施方案中，载体含有4个串联的GLP-1(7-36)基因。
在另一个优选实施方案中，载体含有8个串联的GLP-1(7-36)基因。
在另一个优选实施方案中，载体含有12个串联的GLP-1(7-36)基因。
在另一个优选实施方案中，载体含有16个串联的GLP-1(7-36)基因。
在另一个优选实施方案中，载体含有32个串联的GLP-1(7-36)基因。
此外，本发明人将这样的一个含有32个串联GLP-1(7-36)基因的载体(pKK223-3重组质粒)保藏在保藏号为CGMCC No.0599的菌株中。
包含本发明串连基因以及适当的启动子或其它调控序列的载体可以转化适当的宿主细胞，使其能够表达融合蛋白。
因此，本发明还涉及可以表达GLP-1(7-36)多肽或GLP-1类似物的宿主细胞。可以通过转导、转化或转染等基因工程的方法(例如氯化钙转化法、DHAE-葡聚糖介导的转染或电穿孔法)有效地将含有本发明串连基因的载体引入宿主细胞，所说的载体可以是质粒、病毒颗粒和/或噬菌体等形式。
可以作为宿主细胞的例子包括但不限于：细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌、鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞，如酵母等。通过本文的阐述，选择适当的宿主细胞在本领域技术人员的知识范围之内。
出于降低成本的考虑，本发明优选原核细胞作为宿主细胞，原核细胞的代表性例子有：大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)JM103、JM109、HB101和DH5α。
宿主细胞携带的载体中含有n个表达GLP-1(7-36)或GLP-1类似物的基因，其中，n为从1到32的整数。相应的，宿主细胞能够表达含有n个多肽的融合蛋白，融合蛋白可以仅由GLP-1(7-36)多肽或GLP-1类似物组成，也可以由GLP-1(7-36)和GLP-1类似物组成，而不包含载体蛋白。其中，n为从1到32的整数。优选地，n为从8到32的整数。更优选地，n为16或32。
在本发明的一个优选实施方案中，将含有1个GLP-1(7-36)基因的质粒转入大肠杆菌JM103细胞，构建的基因工程菌能够表达GLP-1(7-36)多肽。
在另一个优选实施方案中，将含有2个GLP-1(7-36)基因的质粒转入大肠杆菌JM103细胞，构建的基因工程菌能够表达包含2个GLP-1(7-36)多肽的融合蛋白。
在另一个优选实施方案中，将含有4个GLP-1(7-36)基因的质粒转入大肠杆菌JM103细胞，构建的基因工程菌能够表达包含4个GLP-1(7-36)多肽的融合蛋白。
在另一个优选实施方案中，将含有8个GLP-1(7-36)基因的质粒转入大肠杆菌JM103细胞，构建的基因工程菌能够表达包含8个GLP-1(7-36)多肽的融合蛋白
在另一个优选实施方案中，将含有12个GLP-1(7-36)基因的质粒转入大肠杆菌JM103细胞，构建的基因工程菌能够表达包含12个GLP-1(7-36)多肽的融合蛋白。
在另一个优选实施方案中，将含有16个GLP-1(7-36)基因的质粒转入大肠杆菌JM103细胞，构建的基因工程菌能够表达包含16个GLP-1(7-36)多肽的融合蛋白。
在又一个优选实施方案中，将含有32个GLP-1(7-36)基因的质粒转入大肠杆菌JM103细胞，构建的基因工程菌能够表达包含32个GLP-1(7-36)多肽的融合蛋白。
这样的一个能够表达包含32个GLP-1(7-36)多肽的融合蛋白的工程菌株按照《用于专利程序的国际承认的微生物保藏布达佩斯条约》的规定，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2001年7月11日，保藏号为CGMCC No.0599。保藏物携带的质粒中含有32个串连的GLP-1(7-36)基因。保藏物是为了给本领域的技术人员提供方便，任何制造、使用或者销售保藏物的行为需要经过许可，在此未给予这样的许可。
可以在适宜的培养条件下培养本发明的工程菌株，以产生和积累包含n个多肽的融合蛋白包涵体。培养条件如培养基、温度湿度和pH值等，在本领域技术人员的知识范围内。
在合适的宿主菌株生长至适当的细胞密度之后，典型地经离心收获细胞，经物理或化学方法破碎细胞，保留所形成的粗产物用于进一步的纯化。
可以用任何常规的方法破碎用于表达蛋白质的微生物细胞，包括冻结-解冻循环、超声处理、机械破碎或使用细胞裂解剂，这些方法是本领域技术人员熟知的。
根据本发明提供的方法得到的融合蛋白包含若干个多肽(可以仅包含GLP-1(7-36)或GLP-1类似物，也可以既包含GLP-1(7-36)又包含GLP-1类似物)，每两个多肽之间(例如，两个GLP-1(7-36)之间，两个GLP-1类似物之间，一个GLP-1(7-36)和一个GLP-1类似物之间)间隔了若干个氨基酸残基，其中与GLP-1(7-36)或GLP-1类似物N端毗邻的几个氨基酸为“成键氨基酸”，与每个多肽(GLP-1(7-36)或GLP-1类似物)N端形成“可专一性裂解的肽键”，因此，用适当的物质，在适宜的裂解条件下，融合蛋白从每个多肽(GLP-1(7-36)或GLP-1类似物)的N端发生断裂，融合蛋白被裂解成多个C-末端带有间隔氨基酸的GLP-1(7-36)或GLP-1类似物。例如，包含n个GLP-1(7-36)的融合蛋白裂解后产生GLP-1(7-36)-Xaa…Xaa，其中，Xaa…Xaa表示裂解前两个GLP-1(7-36)之间的间隔氨基酸。进一步地，根据GLP-1(7-36)的C-末端第36位氨基酸为Arg的特征，使用蛋白酶专一性地裂解Arg参与形成的肽键，即可得到GLP-1(7-36)。
作为简化裂解步骤的方案之一，可以选择Arg作为“成键氨基酸”，然后使用蛋白酶专一性地裂解Arg羧基参与形成的肽键，可以一步裂解融合蛋白，得到若干个多肽单体。
在本发明的一个实施方案中，选择Met作为“成键氨基酸”，先用溴化氰断裂Met羧基参与形成的肽键，再用Arg专一性蛋白酶(例如梭菌蛋白酶(Clostripain))断裂Arg羧基参与形成的肽键，得到多个C端精氨酸未酰胺化的GLP-1(7-36)多肽。上述裂解步骤可以交换顺序。
在本发明的一个优选实施方案中，选择Arg为“成键氨基酸”，用梭菌蛋白酶裂解融合蛋白，在该酶作用下，Arg的羧基参与形成的肽键发生断裂，可以一步将融合蛋白裂解为C端Arg未酰胺化的GLP-1(7-36)多肽。
在另一个优选实施方案中，选择Arg为“成键氨基酸”，用胰蛋白酶(Trypsin)裂解融合蛋白，该酶能够断裂赖氨酸Lys或Arg的羧基参与形成的肽键，用酸酐保护Lys，可使该酶专一性裂解精氨酸的羧基形成的肽键。在该酶作用下，融合蛋白裂解为C端Arg未酰胺化的GLP-1(7-36)多肽。
融合蛋白经裂解后，通过色谱等分离纯化工艺可以得到高纯度的目的多肽。色谱模式有离子交换色谱、疏水色谱、体积排阻色谱以及反相色谱等。各种色谱模式相应的分离介质可以通过商业途径从供应商处获得，如Amersham Pharmcia Biotech，Whatman，Merck KGaA(Germany)，Grace Vydac等等。可以使用一种或多种色谱模式，经过一步或多步色谱过程来实现纯化目的。一般地说，可以使用高效液相色谱(HPLC)作为纯化手段。典型地如C18反相柱，使用TFA-CH3CN体系作为流动相。这些方法是本领域技术人员熟知的。
需要特别指出的是，在下述实施例中，虽然仅以GLP-1(7-36)的生产方法为例解释了本发明，但根据本发明公开的信息和有关附图，本领域技术人员能够清楚地得知：本发明的方法可用于生产GLP-1类似物(GLP-1Analogs)，只要其N端和C端氨基酸残基与外接的氨基酸残基之间形成的肽键能够被专一性断裂，而其自身的氨基酸序列在融合蛋白裂解步骤中不会被切断，即可以通过实施本发明的方法生产GLP-1类似物。因此，利用基因串连的方式生产GLP-1类似物的方法在本发明要求保护的范围之内。
典型地，GLP-1类似物C-末端为Arg，N-末端以及肽链中间不含Arg。这些类似物的例子包括但不限于：Gly8-GLP-1(7-36)，Val8-GLP-1(7-36)，Asp11-GLP-1(7-36)，Ala16-GLP-1(7-36)，Glu22-GLP-1(7-36)，His23-GLP-1(7-36)，Glu24-GLP-1(7-36)，Trp26-GLP-1(7-36)，Ala27-GLP-1(7-36)，Glu30-GLP-1(7-36)，Asp33-GLP-1(7-36)，Glu34-GLP-1(7-36)，Thr35-GLP-1(7-36)，Gly8-Glu24-GLP-1(7-36)，Leu8-Ala33-GLP-1(7-36)，Thr36-Arg37-GLP-1(7-37)，Ser36-Arg37-GLP-1(7-37)等等。
与生产GLP-1的其它方法相比，本发明的优点非常明显。因为人工合成GLP-1工序复杂，且成本高昂；用其它生物工程的方法表达GLP-1的效果均不理想。例如，一般可以采用以下方法生产GLP-1：
(1)融合蛋白表达后分离、纯化包涵体，然后一般在70％甲酸溶液中用溴化氰(CNBr)切断融合蛋白。
由于由20-60个氨基酸残基组成的多肽在宿主细胞中易被降解，直接表达一般很难得到目的产物。通过将这样的多肽与其它蛋白融合表达，在细胞内形成不溶性的包涵体，可以使目的蛋白不被降解。但是，GLP-1与载体蛋白融合表达后产量通常只占融合蛋白的1/10左右，并且在切断融合蛋白的同时，载体蛋白也被切成多个多肽片段，给分离纯化目的多肽增加了困难。如果生产GLP-1(7-36)NH2，还要继续进行C-端酰胺化工序。总之，这种工艺产量低、成本高，并且容易造成环境污染。
(2)按照美国专利5512459，5655456，5707826，6037143，6403361描述的方法生产GLP-1。
该方法需要解决的问题包括融合蛋白的裂解及其纯化，合成转肽过程中需要的二肽、三肽底物，并保证GLP-1(7-34)-Ala-Phe-Ala只有Lys34参与转肽，而Lys26不参与。因此，该法工艺复杂且不易控制。
(3)采用信号肽启动子，将GLP-1分泌到细胞外表达。
由该方法得到的GLP-1通常产量较低。
本发明人通过在GLP-1(7-36)基因序列两端巧妙地引入杂交位点，将1-32个GLP-1(7-36)基因串联起来，表达后产生包含多个GLP-1(7-36)的融合蛋白，裂解后产生多个GLP-1(7-36)单体，从而大大提高了GLP-1(7-36)多肽的产量。通过实施本发明的生产方法，可以节约成本、简化工艺，并可以得到高产量的GLP-1(7-36)多肽。本发明使GLP-1(7-36)广泛用于临床成为可能，从而能为II型糖尿病患者的治疗提供了大量廉价实用的治疗药物。
参照以下实施例对本发明进行解释，实施例对本发明没有任何限制意义。
实施例1.构建含有1个GLP-1(7-36)基因的工程菌
根据GLP-1(7-36)的氨基酸序列，选择大肠杆菌使用频率较高的密码子，设计4个基因片段。为了实现融合蛋白的裂解，在GLP-1(7-36)基因片段的5’端引入精氨酸(Arg)密码子；为了基因串联的目的，在5’端和3’端分别引入具有互补粘末端的限制性核酸内切酶BglII和BamHI位点。含1个GLP-1(7-36)基因的质粒的构建过程如图1所示。
1.基因片段的合成
采用ABI
DNA合成仪(Applied Biosystems公司产品)，合成(1)、(2)、(3)、(4)四个基因片段。序列如下。(1)片段5’端具有EcoRI位点、Bgl II位点、Arg密码子(CGT)，(2)片段具有与(1)片段互补的序列；(4)片段5’端具有Hind III位点、BamH I酶切位点，(3)片段具有与(4)片段互补的序列。其中，(1)片段中的Bgl II位点AGA TCT和(4)片段中的BamH I位点CGA TCC可以互换。
(1)：5’-AAT TCC AGA TCT ATG CGT CAC GCG GAA GGT ACC TTC ACC
EcoR I Bgl II Arg
AGC GAT GTG AGC AGC TAT CTG -3’
(2)：5’-ACC TTC CAG ATA GCT GCT CAC ATC GCT GGT GAA GGT ACC TTC CGC
GTG ACG CAT AGA TCT GG-3’
(3)：5’-GAA GGT CAG GCG GCG AAA GAA TTT ATC GCG TGG CTG GTG AAA GGT
CGT GGA TCC TAG A-3’
(4)：5’-AG CTT CTA GGA TCC ACG ACC TTT CAC CAG CCA CGC GAT
Hind III BamH I
AAA TTC TTT GGT CGC CGC CTG-3’
2.将基因片段连接成GLP-1(7-36)基因
按照《分子克隆》实验室手册(第二版)(萨姆·布鲁克等著，冷泉港实验室出版)描述的方法进行操作，简述如下。
4个基因片段含量均为A260nm＝5，分别溶于50μl重蒸水中，并置于No.1(A)，No.2(B)，No.3(C)和No.4(D)离心管中。
从No.1和No.2各取1μl溶液，置于一个1.5ml离心管中；No.3和No.4各取1μl溶液置于另一个离心管。两管中分别加入10×聚核苷酸激酶缓冲液1μl，1mM ATP-钠盐1μl和聚核苷酸激酶1μl，37℃保温1小时，水浴加热至90℃，维持5分钟，然后徐徐冷却至室温。
将两个离心管中的内容物混合，加1mM ATP-钠盐1μl，10×T4DNA连接酶缓冲液1μl，T4DNA连接酶1μl，混合物于16℃放置过夜。1％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭显色证明连接完成。
3.将GLP-1(7-36)基因克隆入表达载体
pKK223-3质粒(Amersham Pharmacia Biotech公司)经过EcoR I和Hind III双酶切，加苯酚-氯仿处理，取水层，再用氯仿洗涤2次，60％异丙醇沉淀，室温放置1小时，离心，将沉淀中的有机溶剂蒸发除去。
将连接得到的GLP-1(7-36)基因与经过双酶切的质粒溶液混合，加1mM ATP-钠盐1μl，10×T4DNA连接酶缓冲液1μl，T4连接酶1μl，18℃过夜。
4.转化
取大肠杆菌JM103单菌落，置于50毫升LB培养液，37℃振荡培养至A600nm达0.6。离心，收集菌体，悬浮于冰预冷的10mlCaCl2溶液中(CaCl260mM，甘油15％，10mM PIPES【哌嗪-N，N’-双[2-乙烷磺酸】，pH 7.0，经过灭菌)，3000rpm离心，菌体悬浮于2ml冰预冷CaCl2溶液中，冰浴中保存备用。
取受体细胞50μl，克隆的质粒5μl，混合后42℃维持2分钟，冷却，加LB培养液100μl，37℃，保温1小时。涂琼脂糖板(含氨苄青霉素Ap50μg/ml)，37℃培养过夜，挑取菌落。培养后抽提质粒pG1，用EcoR I和Hind III双酶切，用1％琼脂糖凝胶电泳检测克隆的基因。
5.DNA序列分析
用ABI
310型DNA序列自动分析仪(Applied Biosystems)分析重组载体中GLP-1(7-36)的序列，测得的序列与设计完全符合，如图2所示。
实施例2.构建含有1个GLP-1(7-36)基因的工程菌
将实施例1中片段(1)的Bgl II位点替换为SalI位点，合成片段(1’)；将片段(4)中的BamHI位点替换为XholI位点，合成片段(4’)。片段(2’)与(1’)具有互补的序列。(3’)与(4’)具有互补序列。(1’)和(4’)序列如下：
(1’)：5’-AAT TCC GTC GAC ATG CGT CAC GCG GAA GGT ACC TTC ACC
EcoRI SalI Arg
AGC GAT GTG AGC AGC TAT CTG 3’
(4’)：5’-AG CTT CTA CTC GAG ACG ACC TTT CAC CAG CCA CGC GAT
HindIII XhoI
AAA TTC TTT GGT CGC CGC CTG-3’
按照实施例1的描述进行4个基因片段的连接，载体的酶切，GLP-1(7-36)基因的克隆，重组载体的转化(转入大肠杆菌JM109细胞)及DNA的序列测定。
序列分析表明GLP-1(7-36)的序列与设计相符，如图3所示。
实施例3：构建含有1个GLP-1(7-36)基因的工程菌
将实施例1中片段(1)的Arg密码子替换为Met(甲硫氨酸)密码子，合成片段(1”)，片段(2”)与(1”)具有互补的序列，(3)与(4)不变。(1”)与(2”)如下所示。
(1”)：5’-AAT TCC AGA TCT ATG ATG CAC GCG GAA GGT ACC TTC ACC
EcoR I Bgl II Met
AGC GAT GTG AGC AGC TAT CTG-3’
(2”)：5’-ACC TTC CAG ATA GCT GCT CAC ATC GCT GGT GAA GGT ACC TTC
CGC GTG CAT AGA TCT GG-3’
参照实施例1的描述进行4个基因片段的连接，载体的酶切，GLP-1(7-36)基因的克隆，重组载体的转化(转入大肠杆菌JM103细胞)及DNA的序列测定。
实施例4.构建含有2个GLP-1(7-36)基因的菌株
方法一：
构建过程如图4所示。
取5μl实施例1所得的质粒溶液，置于0.5ml离心管中，再加入10×Bgl II缓冲液1μl，Bgl II和Hind III核酸内切酶各1μl，37℃，保温1小时。然后通过1％琼脂糖凝胶电泳分离GLP-1(7-36)基因片段，回收后备用。
另取1μl实施例1所得的质粒溶液，加入10×BamH I缓冲液1μl，再加BamH I和Hind III各1μl，37℃保温1小时。苯酚-氯仿处理，离心分取水层，用氯仿洗涤2次，离心分取水层。加60％异丙醇溶液沉淀，离心，蒸发，除去沉淀中的有机溶剂，加10μl水溶解。
将BamH I和Hind III双酶解的质粒，与BglII和HindIII双酶解的GLP-1(7-36)基因片段混合，加10×T4DNA连接酶缓冲液1μl，1mM ATP钠盐1μl，T4DNA连接酶2μl，18℃保温过夜，完成连接。
按照实施例1的方法转化受体菌JM103，菌液涂布于含50μg/ml Ap的琼脂糖板上，37℃培养过夜，挑选菌落进行培养。抽取质粒，经EcoRI和HindIII双酶切，通过1％琼脂糖凝胶电泳筛选含有由2个GLP-1(7-36)基因组成的二聚体的质粒，保存含有这种质粒的菌株。
方法二：
将方法一中的内切酶Bgl II和BamH I分别替换为Sal I和Xho I，其他操作参照方法一的描述，构建含有2个GLP-1(7-36)基因的工程菌。
方法三：
取实施例3所得的质粒进行操作，其余步骤参照方法一的描述，可以构建含有2个GLP-1(7-36)基因的工程菌。
实施例5.构建含有4个GLP-1(7-36)基因的菌株
按照实施例4描述的方法，重复进行GLP-1(7-36)基因串联，将含有4个GLP-1(7-36)基因串连的质粒转化入受体菌，筛选含有4个GLP-1(7-36)基因串联的菌株。
实施例6.构建含有8个GLP-1(7-36)基因的菌株
按照实施例4描述的方法，重复进行GLP-1(7-36)基因串联，将含有8个GLP-1(7-36)基因串连的质粒转化入受体菌，筛选含有8个GLP-1(7-36)基因串联的菌株。
实施例7.构建含有12个GLP-1(7-36)基因的菌株
按照实施例4描述的方法，取含有4个GLP-1(7-36)基因串连的质粒，另取含有8个GLP-1(7-36)基因串连的质粒，分别进行双酶切之后，再进行连接，得到含有12个GLP-1(7-36)基因串连的质粒。将该质粒转化入受体菌，筛选含有12个GLP-1(7-36)基因串联的菌株。
实施例8.构建含有16个GLP-1(7-36)基因的菌株
按照实施例4描述的方法，重复进行GLP-1(7-36)基因串联，将含有16个GLP-1(7-36)基因串连的质粒转化入受体菌，筛选含有16个GLP-1(7-36)基因串联的菌株。
实施例9.构建含有32个GLP-1(7-36)基因的菌株
按照实施例4描述的方法，重复进行GLP-1(7-36)基因串联，将含有32个GLP-1(7-36)基因串连的质粒转化入受体菌，筛选含有32个GLP-1(7-36)基因串联的菌株。
实施例10.含有GLP-1(7-36)基因的工程菌的发酵
按照巫爱珍等在《基因工程大肠杆菌发酵的研究》(生物工程学报，1996，12卷增刊，53-57页)中的描述，进行基因工程菌的发酵。
1.摇瓶种子培养
种子培养液含蛋白胨10g/L，酵母抽提粉(Difen，Sigma，Oxoid)5g/L，pH7.0，0.2mol/L磷酸缓冲液20ml，微量CaCl2，Ni(NO4)3，CoCl3，MgSO4，FeCl3浓度各为1mg，120℃灭菌20分钟，冷却至37℃后，加氨苄青霉素50mg，泡敌和种子培养液20ml，加20％葡萄糖5ml，用2mol/LNaOH和2mol/L HCl调节pH至6.8-7.2，进行发酵。
2.发酵
在5L、15L、150L发酵罐(B.Braun Biostat)中进行发酵。发酵条件为温度37℃，PL30→42℃，搅拌500rpm，pH6.8-7.2，通气量分别为5L/min、15L/min、150L/min，DO2 50％。
3.细菌浓度测定
大约每间隔1小时各取1ml发酵液，置于2个塑料离心管中，8000rpm离心10分钟，除去上清液，称取菌体的湿重。也可以测定菌体在600nm的光密度(O.D)。
结果如图5所示，经过12-16小时，菌体密度达到约150克湿菌体/升，达到静止期，发酵过程完成。
实施例11.包涵体的抽提
发酵完毕，4000rpm离心，收集菌体，50MPa二次高压匀浆破碎细胞，经6000rpm离心除去上清液，再经10,000rpm离心收集包涵体，以20mM pH7.0磷酸缓冲液(含10mM EDTA，1％NaCl)洗涤2次，8M尿素溶解后，以Sephadex G100分离GLP-1包涵体，以1,000截留分子量超滤膜除去尿素后。离心即得GLP-1包涵体。
实施例12：包涵体的裂解
一步裂解法：
按照实施例4-10中方法一或方法二的描述得到的基因工程菌，经发酵培养后产生的融合蛋白包涵体，可以用下述方法裂解。
I：用梭菌蛋白酶裂解包涵体
梭菌蛋白酶(Clostripain)能够专一性断裂精氨酸(Arg)的羧基参与形成的肽键。
将实施例11所得的GLP-1包涵体悬浮于20mM pH7.5的磷酸缓冲液中，按照蛋白质干重/水解酶约1000/1的比例，添加梭菌蛋白酶(一种蛋白水解酶)，37℃保温，不同时间取样进行HPLC监测，直至包涵体完全裂解。经过10,000截留分子量超滤除去大分子杂质，再用制备规模HPLC分离纯化，最后冷冻干燥得到纯度＞99％的GLP-1(7-36)。
II：用胰蛋白酶裂解包涵体
胰蛋白酶(Trypsin)能够断裂赖氨酸Lys或精氨酸Arg的羧基参与形成的肽键，用酸酐保护Lys，可以使胰蛋白酶专一性裂解Arg羧基形成的肽键。
将实施例11所得的GLP-1包涵体200g(湿重)溶于5升20mM NaHCO3溶液中，加1g柠康酰酐(Citraconyl anhydride)酰化，于pH8.0反应2小时后，用10,000截留分子量滤膜超滤除去小分子，然后按蛋白质干重/蛋白酶约1000/1的比例，加入胰蛋白酶，37℃保温裂解，以HPLC跟踪监测直至包涵体完全裂解，再用制备规模HPLC分离纯化，最后冷冻干燥得到纯度＞99％的GLP-1(7-36)。
两步裂解法：
按照实施例4-10中方法三的描述，得到的基因工程菌经发酵培养后产生的融合蛋白包涵体，可以用下述方法裂解。
融合蛋白溶于70％甲酸或8M尿素中，浓度约2-100mg/mL(干重)，按物质的量融合蛋白∶溴化氰＝1∶100加入溴化氰，避光搅拌反应8-24小时，该条件下CNBr专一性裂解Met羧基形成的肽键，完成第一步裂解。
裂解液经1,000截留分子量滤膜滤除小分子，然后按实施例11描述的方法，用蛋白酶专一性裂解Arg羧基形成的肽键，完成第二步裂解，从而得到GLP-1(7-36)多肽。
用制备规模HPLC分离纯化，最后冷冻干燥得到纯度＞99％的GLP-1(7-36)。
实施例13：GLP-1(7-36)的化学结构分析
1.纯度分析
使用Agilent 1100高效液相色谱仪，Zorbax SB C18色谱柱，柱内径4.6mm，柱长150mm。流动相A液为0.1％TFA(三氟乙酸)，B液为0.1％TFA/80％CH3CN，在20分钟内形成从10％至80％的B液梯度。速度：1ml/min。
取纯度＞99％的GLP-1(7-36)冻干粉1mg，溶于1ml 0.1％TFA中，进样10μl。
结果如图6所示。
2.氨基酸组成分析
取100μg GLP-1(7-36)蛋白，加5.7N HCl(重蒸2次)0.5ml，密封后于110℃保温20小时，减压蒸发除去HCl，再加重蒸水蒸发2次后，定容取样，用
cLC Protein Sequencing System(AppliedBiosystems产品)进行氨基酸序列分析。
结果如图7所示，氨基酸组成的实测值与理论值完全一致。
3.质谱分析
取少量GLP-1(7-36)蛋白，用HPLC-MS联用分析仪(API 2000LC/MS/MS System，Applied Biosystems产品)进行分析。
结果如图8所示，实施本发明所得多肽的分子量为3297.12，在误差范围内与GLP-1(7-36)的理论分子量3298.68相符合。
4.氨基酸序列分析
利用
cLC蛋白序列自动分析仪(Applied Biosystems产品)从N-端开始分析GLP-1(7-36)蛋白的氨基酸序列。
测序结果表明，N-端15个氨基酸序列与理论值完全一致(数据由北京大学生命科学院提供)。
实施例14：GLP-1(7-36)的促胰岛素分泌作用
健康C57/BL/6J小鼠购于中国科学院上海动物中心。
将C57/BL/6J小鼠分成三组，每组6只。首先用刻度毛细管(先以1mg/mL肝素润洗毛细管内壁并晾干)从眼底静脉丛取血50微升。然后空白对照组小鼠腹腔注射200微升生理盐水，试验组小鼠腹腔注射10微克GLP-1(7-36)，阳性对照组小鼠腹腔注射10微克GLP-1(7-36)NH2(Sigma公司产品)，并记此时为零时刻。然后分别于5，15，30，60分钟按同样操作取血。取血后各血样立刻加入盛有50微升生理盐水的离心管中，混匀，3000转/分离心除去红血球，血清用于测定胰岛素浓度。
使用放射免疫胰岛素测定试剂盒(中国卫生部上海生物制品所产品)，测定血清中胰岛素，以检验GLP-1(7-36)的促胰岛素分泌作用。
实验结果如图9所示。对照组小鼠胰岛素浓度无显著变化；而试验组和阳性对照组小鼠胰岛素浓度均显著升高。说明注射GLP-1(7-36)、GLP-1(7-36)NH2后促进了小鼠体内胰岛素的分泌。由此可证明GLP-1(7-36)具有与GLP-1(7-36)NH2相似的促胰岛素分泌作用。
实施例15：GLP-1(7-36)的促C-肽分泌作用
按实施例14的方法，将C57/BL/6J小鼠分成两组，空白对照组小鼠腹腔注射200微升生理盐水，试验组小鼠腹腔注射10微克GLP-1(7-36)，使用放射免疫C-肽测定试剂盒(中国卫生部上海生物制品所产品)测定血清中C-肽浓度，以检验GLP-1(7-36)的促C-肽分泌作用。
实验结果如图10所示。对照组小鼠C-肽浓度无显著变化；而试验组小鼠C-肽浓度显著升高。说明注射GLP-1(7-36)后促进了小鼠体内C-肽的分泌。由此可证明GLP-1(7-36)具有促C-肽分泌作用。
实施例16：GLP-1(7-36)的降糖作用
健康C57/BL/6J小鼠购于中国科学院上海动物中心。
将C57/BL/6J小鼠分为四组，每组6只。每组小鼠禁食过夜后进行腹腔注射。空白对照组小鼠注射40％葡萄糖溶液200μl，试验组小鼠注射200μl 40％葡萄糖溶液+10μg GLP-1(7-36)，阳性对照组(I)小鼠注射葡萄糖溶液+10μgGLP-1(7-36)NH2(Sigma公司产品)，阳性对照组(II)小鼠注射葡萄糖溶液+10μg GLP-1(7-37)(Sigma公司)。记此时为零时刻，立刻用刻度毛细管(注射前以肝素处理)从小鼠眼窦取血20μl，置于300μl生理盐水中混匀，3,000rpm离心除去红血球，血清用于血糖浓度测定。
分别于30，60，120分钟按上述操作取血，分离血清进行测定。
使用血糖测定试剂盒(中国卫生部上海生物制品所产品)，按照试剂盒的说明，测定血清样品的血糖浓度。
结果如图11所示，只注射葡萄糖的小鼠血糖浓度大幅升高后，逐渐回落到正常水平；而试验组和阳性对照组小鼠血糖浓度未出现显著升高，一直保持在正常水平附近。说明注射GLP-1(7-36)、GLP-1(7-36)NH2和GLP-1(7-37)后促进了小鼠体内胰岛素的分泌，从而避免了血糖浓度的大幅波动。由此可证明GLP-1(7-36)具有与GLP-1(7-36)NH2和GLP-1(7-37)OH相似的降血糖作用。
根据本文的描述和有关附图，本领域的技术人员可以做出各种改变。这些改变应视作显而易见的，功能上等同的方法和物质已包含在本发明的范围内。
关于生物材料保藏的单独说明
1.进行保藏的保藏单位的名称和地址：
名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)
地址：中国北京中关村
2.在该单位保藏生物材料的日期：2001年7月11日
3.该单位对保藏物给予的入藏号：CGMCC NO.0599
4.请求保藏人的名称和地址：
名称：上海华谊生物技术有限公司
地址：中国上海市漕宝路36号
Claims (18)
1.一种生产促胰岛素分泌肽GLP-1(7-36)及GLP-1类似物的方法，包括：
(a)在GLP-1(7-36)基因或GLP-1类似物基因的编码序列两端引入能形成杂交位点的两个限制性内切酶位点；
(b)酶切后再进行连接，形成杂交位点，从而将n个串连的GLP-1(7-36)基因或GLP-1类似物基因、或交互串连的GLP-1(7-36)基因和GLP-1类似物基因克隆入载体，其中，n为2-32的整数；
(c)将含有串连基因的载体导入宿主细胞；
(d)在宿主细胞中表达包含n个多肽的融合蛋白，其中，n为2-32的整数，所述融合蛋白仅包含GLP-1(7-36)多肽或GLP-1类似物、或者包含GLP-1(7-36)多肽和GLP-1类似物，而不包含载体蛋白；
(e)裂解融合蛋白；
(f)分离纯化GLP-1(7-36)多肽或GLP-1类似物；
其中，所述的GLP-1类似物是指天然的GLP-1(7-37)OH或者选自于如下一组物质中：
Gly8-GLP-1(7-36)， Val8-GLP-1(7-36)， Asp11-GLP-1(7-36)，
Ala16-GLP-1(7-36)， Glu22-GLP-1(7-36)， His23-GLP-1(7-36)，
Glu24-GLP-1(7-36)， Trp26-GLP-1(7-36)， Ala27-GLP-1(7-36)，
Glu30-GLP-1(7-36)， Asp33-GLP-1(7-36)， Glu34-GLP-1(7-36)，
Thr35-GLP-1(7-36)， Gly8-Glu24-GLP-1(7-36)，
Leu8-Ala33-GLP-1(7-36)， Thr36-Arg37-GLP-1(7-37)
和Ser36-Arg37-GLP-1(7-37)。
2.如权利要求1所述的方法，其中步骤(a)中的GLP-1(7-36)基因或GLP-1类似物基因是人工合成的GLP-1(7-36)单体基因或GLP-1类似物单体基因。
3.如权利要求1所述的方法，其中该方法在步骤(e)裂解融合蛋白之前，还包括对所述的GLP-1(7-36)多肽或GLP-1类似物中的肽键进行保护的步骤，所述的肽键保护是通过用酸酐保护赖氨酸的羧基所参与形成的肽键而实现的。
4.如权利要求1-3之一所述的方法，其中能形成杂交位点的两个限制性内切酶是Bgl II和BamH I。
5.如权利要求1-3之一所述的方法，其中能形成杂交位点的两个限制性内切酶是Sal I和Xhol I。
6.如权利要求1-3之一所述的方法，其中所述载体包含n个串连基因，其中，n为4-32的整数。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述载体包含n个串连基因，其中，n为8-32的整数。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述载体包含n个串连基因，其中，n为16。
9.如权利要求7所述的方法，其中所述载体包含n个串连基因，其中，n为8。
10.如权利要求6所述的方法，其中所述包含n个串连基因的载体为保藏物CGMCC No.0599中携带的质粒，其中n为32。
11.如权利要求1-3之一所述的方法，其中所述宿主细胞能够表达含有n个多肽的融合蛋白，其中，n为4-32的整数。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述宿主细胞能够表达含有n个多肽的融合蛋白，其中，n为8-32的整数。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述宿主细胞能够表达含有n个多肽的融合蛋白，其中，n为16。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述宿主细胞能够表达含有n个多肽的融合蛋白，其中，n为8。
15.如权利要求1-3之一所述的方法，其中所述宿主细胞是原核细胞。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌JM103、JM109、HB101或DH5α。
17.如权利要求11所述的方法，其中所述包含n个多肽的融合蛋白的宿主细胞为保藏物CGMCC No.0599中的细胞，其中n为32。
18.如权利要求1-3之一所述的方法，其中所述的裂解酶是梭菌蛋白酶或胰蛋白酶。
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| WO2006030492A1 (ja) * | 2004-09-14 | 2006-03-23 | Nippon Paper Industries Co.,Ltd. | Ｇｌｐ−１誘導体が集積された植物及び植物貯蔵器官とその生産方法 |
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| CN101220088B (zh) * | 2007-09-24 | 2012-01-25 | 中国人民解放军第四军医大学 | 人胰高血糖素样肽-1类似物的融合蛋白及其应用 |
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| CN102242127B (zh) * | 2011-05-20 | 2012-12-12 | 严杰 | 串联抗菌肽Alloferon-1的制备方法及rAlloferon-1-K的应用 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0378078A1 (en) | 1989-01-06 | 1990-07-18 | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co., Ltd. | Motilin-like polypeptide and use thereof |
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| JPH0722517B2 (ja) * | 1989-08-24 | 1995-03-15 | 株式会社三和化学研究所 | モチリン様ポリペプチドの製法並びにそのための組換えｄｎａ及び発現用プラスミド |
| US5545618A (en) * | 1990-01-24 | 1996-08-13 | Buckley; Douglas I. | GLP-1 analogs useful for diabetes treatment |
| US5595887A (en) * | 1990-07-16 | 1997-01-21 | Bionebraska, Inc. | Purification directed cloning of peptides using carbonic anhydrase as the affinity binding segment |
| PT101031B (pt) * | 1991-11-05 | 2002-07-31 | Transkaryotic Therapies Inc | Processo para o fornecimento de proteinas por terapia genetica |
| JPH06306100A (ja) * | 1993-04-26 | 1994-11-01 | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd | Ｖｉｐアナログ調製用融合蛋白、ｖｉｐアナログの製法並びにそのための遺伝子組換えプラスミド及び形質転換微生物 |
| US5512459A (en) * | 1993-07-20 | 1996-04-30 | Bionebraska, Inc. | Enzymatic method for modification or recombinant polypeptides |
| DK144093D0 (zh) * | 1993-12-23 | 1993-12-23 | Novo Nordisk As | |
| CA2243718A1 (en) * | 1996-02-06 | 1997-08-14 | Eli Lilly And Company | Diabetes therapy |
| US6006753A (en) | 1996-08-30 | 1999-12-28 | Eli Lilly And Company | Use of GLP-1 or analogs to abolish catabolic changes after surgery |
| US5912327A (en) * | 1996-09-30 | 1999-06-15 | Human Genome Sciences, Inc. | Method of purifying chemokines from inclusion bodies |
| US6395965B1 (en) * | 1997-03-21 | 2002-05-28 | Restoragen, Inc. | Plant containing a gene construct comprising a chlorella virus promoter and a lac operator |
| US5846774A (en) * | 1997-03-21 | 1998-12-08 | Bionebraska, Inc. | Chlorella virus promoters |
| JPH11178574A (ja) * | 1997-12-22 | 1999-07-06 | Toyota Central Res & Dev Lab Inc | 新規コラーゲン様タンパク質 |
| JP2002504518A (ja) * | 1998-02-27 | 2002-02-12 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | 部分的に構造化されたミセルー様凝集体を形成する、２５％を超えるヘリックス−含有率を有するｇｌｐ−１誘導体 |
| EP1056774A1 (en) * | 1998-02-27 | 2000-12-06 | Novo Nordisk A/S | N-terminally truncated glp-1 derivatives |
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