KR20090039787A - 인간 ｇｌｐ-1 모방체, 조성물, 방법 및 용도 - Google Patents

인간 ｇｌｐ-1 모방체, 조성물, 방법 및 용도 Download PDF

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카린 티. 오닐
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센토코 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 생물학적 활성 단백질, 단편 또는 리간드에 대해 특이적인 적어도 하나의 개선된 인간 GLP-1 모방체, 특정 부분 및 변이체, 적어도 하나의 GLP-1 모방체를 코딩하는 분리된 핵산 또는 특정 부분 또는 변이체, GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체, 벡터, 숙주 세포, 트랜스제닉 동물 또는 식물, 및 치료 조성물, 방법 및 장치를 포함하는 이의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.

Description

인간 ＧＬＰ-1 모방체, 조성물, 방법 및 용도{HUMAN GLP-1 MIMETIBODIES, COMPOSITIONS, METHODS AND USES}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2006년 7월 18일자 출원된 미국 가출원 제 60/831,704호의 출원에 대한 우선권을 주장한다. 상기 언급된 관련 미국 특허 출원의 완전한 공개물은 모든 목적을 위하여 본원에 참고로 인용된다.
본 발명은 생물학적 활성 단백질, 단편 또는 리간드에 대해 특이적인 개선된 포유동물 GLP-1 모방체, 특정 부분 및 변이체, GLP-1 모방체를 코딩하는 핵산 및 이에 상보적인 핵산, 숙주 세포, 및 치료적 제제, 투여 및 장치를 포함하는 이의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.
재조합 단백질은 떠오르는 치료제 분야이다. 이러한 재조합 치료는 단백질 제형 및 화학적 변형을 발전시켰다. 이러한 변형은 반감기 증가(예컨대, 단백질 분해 효소에 대한 그들의 노출을 차단), 생물학적 활성 증가, 또는 원치않는 부작용 감소 등에 의해 치료용 단백질의 치료 유용성을 증대시킬 수 있다. 이러한 변형 중 하나는 엔테라셉트(enteracept)와 같은 수용체 단백질에 융합된 면역글로불 린 단편을 사용하는 것이다. 치료용 단백질은 또한 보다 긴 반감기를 제공하거나 Fc 수용체 결합, 단백질 A 결합 및 보체 고착과 같은 기능을 도입하기 위해 Fc 도메인을 이용하여 작제된다.
당뇨병은 2025년까지 효과적인 약제학적 치료를 기다리는 3 억명의 사람들에게 영향을 미칠 것으로 예측되는, 증가하는 유행병이다. 2형 당뇨병이 전체 질병의 90-95%에 해당한다. 지속적으로 상승된 혈당 수준으로부터 야기된 합병증은 심혈관 질환, 신장병, 신경병증 및 망막병증을 포함한다. 또한, 이자의 β-세포가 사멸함으로써, 2형 당뇨병의 말기에는 인슐린 분비가 중지된다. 현재의 당뇨병 치료는 저혈당증 및 체중 증가를 포함하는 다양한 해로운 부작용을 가지고 있다. 더욱이, 2형 당뇨병에 대한 현재의 치료는 질환을 치료하지 못하고, 단지 환자가 인슐린 치료를 필요로 하는 시점을 연장할 뿐이다.
글루카곤 유사 펩티드-1(GLP-1)은 경구 포도당 섭취 후에, 장의 L-세포로부터 분비되는 37-아미노산 펩티드이다. 분비 후에, 6번째 및 7번째 위치 사이의 내부 절단은 생물학적으로 활성인 GLP-1(7-37) 펩티드를 생성한다. GLP-1(7-37) 펩티드 서열은 2개의 구조 도메인으로 나눠질 수 있다. 상기 펩티드의 아미노 말단 도메인은 신호에 관여하고, 상기 펩티드의 나머지 부분은 나선형 형태의 GLP-1 수용체의 세포외 루프에 결합하는 것으로 보인다. 포도당에 반응하여, 활성 GLP-1은 이자 상의 GLP-1 수용체에 결합하여, 인슐린 분비를 증가시킨다(인슐린 분비(insulinotropic) 작용). 또한, GLP-1은 위 배출을 감소시켜, 순환으로 방출되는 포도당의 볼루스를 감소시키고, 음식 섭취를 감소시킬 수 있는 것으로 알려졌 다. 이런 작용은 연계되어 혈당 수준을 감소시킨다. GLP-1는 또한 이자의 β-세포의 세포자멸을 억제하고, 이들의 증식을 증가시키는 것으로 알려졌다. 따라서, GLP-1은 당뇨병 환자에서 혈당을 낮추고, 이자의 β-세포를 보전하기 위해 매력적인 치료제이다. 더욱이, GLP-1 활성은 혈당 수준에 의해 조절된다. 혈당 수준이 특정 역치 수준 밑으로 떨어지면, GLP-1는 활성이 아니다. 그러므로, GLP-1을 포함한 치료와 연관된 저혈당증의 위험은 없다.
GLP-1 치료의 유용성은 임상적으로 밝혀졌다. 6주 GLP-1 주입은 2형 당뇨병 환자에서 공복 및 8 시간 평균 혈당 수준을 효과적으로 낮추었다. GLP-1 치료는 또한 β-세포의 기능을 개선시켰다. 익세나티드(exenatide)는 현재 임상 시험에 있는 GLP-1 유사체이다. 익세나티드는 길라 몬스터 리자드(gila monster lizard)의 침에서 처음으로 동정되었고, GLP-1과 53% 동일하다. 익세나티드는 GLP-1 수용체에 결합하여, GLP-1(7-37)에 기여하는 수많은 활동에 관여하는 신호 전달 케스케이드를 개시할 수 있다. 현재까지, 익세나티드는 2형 당뇨병을 가진 환자에서 HbA1c 수준 및 혈청 프럭토사민 수준을 낮추는 것으로 알려졌다. 또한, 익세나티드는 위 배출을 지연시키고, 건강한 자원자에서 음식 섭취를 억제하였다.
그러나, GLP-1은 프로테아제 디펩티딜-펩티다아제 IV(DPP-IV)에 의해 생체 내에서 빠르게 불활성화된다. 그러므로, GLP-1 펩티드와 관련된 치료의 유용성은 그들의 빠른 제거 및 짧은 반감기에 의해 제한되어 왔다. 예를 들어, GLP-1(7-37)은 단지 3 내지 5 분의 혈청 반감기를 가진다. GLP-1(7-36) 아미드는 피하 투여된 경우에 약 50 분의 시간 작용을 가진다. 심지어 내인성 프로테아제 절단에 대해 저항성이 있는 유사체 및 유도체도 24 시간에 대해 반복 투여를 피하기에 충분한 정도의 반감기를 갖지는 못한다. 예를 들어, 익세나티드는 DPP-IV에 대해 저항성을 가지지만, 생체 내에서 약동학적으로 짧은 반감기 및 상당한 변성으로 인해 하루에 두번 식전 투여를 필요로 한다. 현재 임상 시험 중인 또 다른 화합물인 NN2211은 지질화된 GLP-1 유사체이다. 이것은 하루에 한번 투여되는 것으로 예측된다.
치료제의 빠른 제거는 반복 투여가 필요할 것이기 때문에 연장된 기간에 대해 약제를 높은 혈중 수준으로 유지하는 것이 바람직한 경우에는 불편하다. 더욱이, 과거 치료법이 단지 경구 약제만으로 섭취하는 당뇨병 환자에게는 장기간-작용하는 화합물이 특히 중요하다. 이런 환자들은 대부분 약제의 다수 주입에 관련된 치료법에 적응하는데 상당한 어려움을 겪는다. 증가된 반감기를 가지는 GLP-1 치료는 다른 GLP-1 펩티드 및 개발중인 화합물에 대해 상당한 잇점을 가질 것이다.
따라서, 상기 문제들 중 하나 이상 및 본 분야에 공지인 다른 문제를 극복하는 GLP-1 치료 단백질의 개선된 및/또는 변형된 형태를 제공하는 것이 필요하다. 본 모방체 기술은 펩티드 치료에 대한 신규한 전달 플랫폼을 제공한다. GLP-1 모방체는 GLP-1 펩티드를 지속된 방식으로 전달하는 수단을 제공할 수 있고, 이에 의해 현재 개발 중인 GLP-1 펩티드에 비해 개선된 것을 제공할 수 있다. 더욱이, 이의 다이머 구조 및 이의 조직 분포 성질에 기초하여, GLP-1 모방체는 인슐린 분비, β-세포 보존 및 음식 섭취와 관련하여 구별되는 특성을 가질 수 있다.
발명의 요약
본 발명은 당업계에 공지된 것과 조합하여, 본 명세서에 기술되고/되거나 가능한 GLP-1 모방체 조성물, 코딩 또는 상보적 핵산, 벡터, 숙주 세포, 조성물, 제제, 장치, 트랜스제닉 동물, 트랜스제닉 식물 및 이의 제조방법 및 용도뿐만 아니라 변형된 면역글로불린, 절단 산물 및 다른 특정 부분 및 이의 변이체를 포함하는 개선된 인간 GLP-1 모방체를 제공한다.
바람직하게, 이러한 GLP-1 모방체는 O-링크 글리코실화 부위(이를 테면 이로 제한되는 것은 아니나 Val-Xaa-Ser)를 N-링크 글리코실화 부위(이를 테면 이로 제한되는 것은 아니나 Asn-Xaa-Ser 또는 Gln-Xaa-Ser)로 전환시켜 발현, 정제 및/또는 안정성이 개선된다. 본 발명은 GLP-1 CH1 결실된 모방체(예를 들어, 알라닌)에 개선점을 제공하거나, 또는 Asn-Xaa-Ser 또는 Gln-Xaa-Ser와 같은 N-글리코실화 부위로 치환될 수 있는 O-글리코실화 부위, 이를 테면 이로 제한되는 것은 아니나 Val-Xaa-Ser에 이러한 개선점을 제공하며, 이는 서열 목록에서 나타낸 다음 잔기에서 수행되는 것이 바람직할 수 있다: Val-Xaa-Ser (O-글리코실화 부위)은 N-글리코실화 부위, Asn-Xaa-Ser(서열 번호 2, 4, 7-14의 위치 44, 서열 번호 43, 45의 위치 64, 서열 번호 44, 46 및 51의 위치 82; 서열 번호 48, 50, 53-55의 위치 88, 서열 번호 47의 위치 89, 서열 번호 49의 위치 90; 서열 번호 56 및 63의 위치 103 및/또는 185; 또는 서열 번호 60 및 61의 위치 39; 서열 번호 64의 위치 79 또는 본원에 개시되거나 본 분야에 알려진 임의의 다른 적합한 위치에서)로 전환된다.
또한, 본 발명은 본 명세서에 기술되고/되거나 공지된 바에 따라 적어도 하나의 분리된 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체를 제공한다. GLP-1 모방체는 적어도 하나의 힌지 영역 또는 이의 단편(H)의 적어도 한 부분과 직접 연결된 적어도 하나의 CH2 영역과 직접 연결된 적어도 하나의 CH3 영역을 임의로 포함할 수 있고, 힌지 영역 또는 이의 단편(H)의 적어도 한 부분은 적어도 하나의 부분 가변 영역(V)과 직접 연결되며, 적어도 하나의 부분 가변 영역(V)은 임의의 링커 서열(L)과 직접 연결되고, 임의의 링커 서열(L)은 적어도 하나의 GLP-1 치료 펩티드(P)과 직접 연결된다.
CH3-CH2-힌지-부분 V 영역 서열-링커-치료 펩티드 서열 쌍에 관한 바람직한 구체예에서, 상기 쌍은 연합 또는 공유 결합, 예컨대, 이로 제한되는 것은 아니나 적어도 하나의 Cys-Cys 이황화 결합 또는 적어도 하나의 CH4 또는 다른 면역글로불린 서열에 의해 임의로 연결된다. 한 구체예에서, GLP-1 모방체는 하기 화학식 (I)을 포함한다:
(P(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t),
상기 식에서,
P는 적어도 하나의 생활성 GLP-1 펩티드, 변이체 또는 유도체이고,
L은 적어도 하나의 링커 서열이며, 상기 링커 서열은 상기 모방체가 다른 배향 및 결합 성질을 갖도록 허용함으로써 구조적 유연성을 제공하는 폴리펩티드일 수 있고,
V는 면역글로불린 가변 영역의 C-말단의 적어도 한 부분이며,
H는 면역글로불린 가변 힌지 영역의 적어도 한 부분이고,
CH2는 면역글로불린 CH2 불변 영역의 적어도 한 부분이며,
CH3은 면역글로불린 CH3 불변 영역의 적어도 한 부분이고,
n은 1 내지 10의 정수이며,
o, p, q, r, s, 및 t는 독립적으로 0 내지 10의 정수일 수 있고, 면역글로불린 분자의 다른 유형, 예컨대, 이로 제한되는 것은 아니나 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD, IgE, 또는 이의 임의의 하위분류 등, 또는 이의 임의의 조합을 모방한다.
항체 서열의 가변 영역은 이로 제한되는 것은 아니나 표 1에 기재된 서열 번호 47-55, 또는 서열 번호 47-64 중 적어도 하나의 적어도 한 부분, 또는 이의 단편일 수 있고, 상응하는 서열 번호 1-9와 함께 임의로 2004년 6월 24일 출원되고, 2005년 1월 20일에 공개된 PCT 공보 WO 05/05604(PCT US04/19898)의 도 1-9에 추가로 기재된 바와 같이 적어도 하나의 치환, 삽입 또는 결실을 추가로 포함할 수 있다. CH2, CH3 및 힌지 영역은 이로 제한되는 것은 아니나 표 1에 기재된 서열번호 56-64 중 적어도 하나의 한 부분 또는 이의 단편일 수 있고, 상응하는 서열 번호 32-40과 함께 임의로 2004년 6월 24일 출원되고, 2005년 1월 20일에 공개된 PCT 공보 WO 05/05604(PCT US04/19898)의 도 32-40에 추가로 기재된 바와 같이 적어도 하나의 치환, 삽입 또는 결실을 추가로 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 GLP-1 모방체는, GLP-1 치료 펩티드 및 이의 본래의 또는 획득한 시험관 내, 생체 내 또는 인 시츄(in situ) 성질 또는 활성을 제공하면서, 이의 본래의 성질 및 기능을 가진 항체 또는 면역글로불린 구조 또는 기능의 적어도 한 부분을 모방한다. 본 발명의 GLP-1 모방체의 치료 펩티드 부분 및 항체의 다양한 부분은 본 분야에 알려진 것과 조합하여 본 명세서에 기재된 바와 같이 달라질 수 있다.
본 발명은 또한 이로 제한되는 것은 아니나 공지되거나 본 명세서에 기재된 바와 같이, 화학식 (I)의 P 부분에 대응하는 적어도 하나의 생활성 GLP-1 펩티드 또는 폴리펩티드의 공지된 생물학적 활성과 같은 적어도 하나의 활성을 가지는 적어도 하나의 분리된 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체를 제공한다.
일 측면으로, 본 발명은 서열 번호 1의 적어도 하나의 폴리펩티드 서열을 포함하거나, 공지되거나 본 명세서에 기재된 바와 같이 하나 이상의 치환, 결실 또는 삽입을 임의로 가지는 적어도 하나의 분리된 인간 GLP-1 모방체를 제공한다. 다른 측면으로, 본 발명의 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체는 화학식 (I)의 모방체의 P 부분, 적어도 1-3을 포함하는 적어도 하나의 에피토프, 적어도 하나의 리간드의 완전한 아미노산 서열, 예를 들어 이로 제한되는 것은 아니나, GLP-1 수용체, 또는 이의 단편에 상응하는 적어도 하나의 GLP-1 펩티드 또는 폴리펩티드의 결합을 모방하고, 여기에서 상기 리간드는 서열 번호 1의 적어도 한 부분에 결합하거나, 공지되거나 본 명세서에 기재된 바와 같이 하나 이상의 치환, 결실 또는 삽입을 임의로 가진다. 적어도 하나의 GLP-1 모방체는 임의로 GLP-1 수용체와 적어도 10-7 M,적어도 10-8 M, 적어도 10-9 M, 적어도 10-10 M, 적어도 10-11 M, 또는 적어도 10-12 M의 친화도로 결합한다. 따라서, GLP-1 모방체는 공지된 방법에 따라 이로 제한되는 것은 아니나 수용체 또는 이의 단편에 대한 결합 활성과 같은 상응하는 활성에 대하여 스크리닝될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 적어도 하나의 GLP-1 모방체에 대한 적어도 하나의 항-이디오타입 항체를 제공한다. 항-이디오타입 항체 또는 단편은 본 발명의 적어도 하나의 GLP-1 모방체에 특이적으로 결합한다. 항-이디오타입 항체는 이로 한정되지는 않으나 본 발명에 따른 적어도 하나의 GLP-1 모방체의 GLP-1 리간드 결합 영역과 경쟁적으로 결합하는, 중쇄 또는 경쇄의 적어도 하나의 상보성 결정 영역(complimetarity determing region ; CDR), 또는 이의 리간드 결합 부분의, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 프레임워크 영역, 또는 이의 임의의 부분과 같은 면역글로불린 분자의 적어도 한 부분을 포함하는 분자를 함유하는 임의의 단백질 또는 펩티드를 포함한다. 본 발명의 이러한 이디오타입 항체는 이로 한정되지는 않으나 인간, 마우스, 토끼, 랫트, 설치류, 영장류 등과 같은 임의의 포유동물을 포함하거나 이로부터 유래될 수 있다.
본 발명은 일 측면으로, 적어도 하나의 특정 서열, 이의 도메인, 부분 또는 변이체를 포함하는 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 GLP-1 모방체 항-이디오타입 항체, 또는 이의 특정 부분 또는 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대해 상당한 상동성을 가지거나 이에 혼성화될 수 있는 상보성을 가지는 것을 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 또한 적어도 하나의 상기 분리된 GLP-1 모방체 또는 GLP-1 모방체 항-이디오타입 항체를 코딩하는 핵산 분자를 함유하는 재조합 벡터, 이러한 핵산 및/또는 재조합 벡터를 함유하는 숙주 세포뿐만 아니라 이러한 GLP-1 모방체 또는 GLP-1 모방체 항-이디오타입 항체 핵산, 벡터 및/또는 숙주 세포를 제조하는 방법 및/또는 용도를 제공한다.
또한, 적어도 하나의 분리된 포유동물 GLP-1 모방체 또는 GLP-1 모방체 항-이디오타입 항체를 코딩하는 분리된 핵산; 분리된 핵산을 포함하는 분리된 핵산 벡터, 및/또는 상기 분리된 핵산을 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포가 제공된다. 상기 숙주 세포는 임의로 COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, 골수종, 또는 림프종 세포, 또는 이의 임의의 유도체, 불멸화된 또는 형질전환된 세포로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다.
본 발명은 또한 공지되거나 본 명세서에 기재된 바와 같이 숙주 세포를 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 GLP-1 모방체 항-이디오타입 항체, 또는 특정 부분 또는 변이체가 검출가능 및/또는 회수가능한 양으로 발현되도록하는 조건 하에서 배양하는 것을 포함하여, 숙주 세포에서 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 GLP-1 모방체 항-이디오타입 항체, 또는 특정 부분 또는 변이체를 발현시키는 적어도 하나의 방법을 제공한다. 또한, 시험관 내, 생체 내 또는 인 시츄 조건 하에서 GLP-1 모방체 또는 GLP-1 모방체 항-이디오타입 항체가 검출가능 또는 회수가능한 양으로 발현되도록, GLP-1 모방체 또는 GLP-1 모방체 항-이디오타입 항체를 코딩하는 핵산을 번역하는 것을 포함하여, 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 GLP-1 모방체 항-이디오타입 항체를 제조하는 방법이 제공된다.
또한, GLP-1 모방체 또는 GLP-1 항-이디오타입 항체를 회수 가능한 양으로 발현시킬 수 있는 숙주 세포 또는 트랜스제닉 동물 또는 트랜스제닉 식물을 제공하는 것을 포함하는, 본 발명에 따른 적어도 하나의 분리된 인간 GLP-1 모방체 또는 GLP-1 항-이디오타입 항체를 제조하는 방법이 제공된다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 적어도 하나의 GLP-1 모방체를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 본 명세서에 기재된 분리된 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체를 코딩하는 핵산 및/또는 GLP-1 모방체; 및 (b) 적합한 담체 또는 희석제를 포함하는 적어도 하나의 조성물을 제공한다. 담체 또는 희석제는 공지된 방법에 따라 임의로 약제학적으로 허용될 수 있다. 상기 조성물은 임의로 적어도 하나의 추가 화합물, 단백질 또는 조성물을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 적어도 하나의 분리된 인간 GLP-1 모방체 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물이 제공된다. 상기 조성물은 임의로 검출 가능한 표지 또는 리포터, 항-감염제, 당뇨병 또는 인슐린 대사 관련 약물, 심혈관(CV)계 약물, 중추 신경계(CNS) 약물, 자율 신경계(ANS) 약물, 기도 약물, 위장(GI)관 약물, 호르몬 약물, 체액 또는 전해질 균형 약물, 혈액 약물, 항신생물제(antineoplastics), 면역 조절 약물, 눈, 귀 또는 코 약물, 국소 약물, 영양제, TNF 길항제, 항류마티스제, 근육 이완제, 마약, 비-스테로이드 항-염증 약물(NTHE), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경 근육 차단제, 항미생물제, 건선 치료제, 코르티코스테로이드, 동화대사 스테로이드, 에리쓰로포이에틴, 면역화, 면역글로불린, 면역 억제제, 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 방사성 의약품, 항우울제, 항정신병제, 흥분제, 천식약, 베타 작용제, 흡입 스테로이드, 에피네프린 또는 유사체, 사이토카인, 또는 사이토카인 길항제 중 적어도 하나로부터 선택된 적어도 하나의 화합물 또는 단백질의 유효량을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체의 치료적 또는 예방학적 유효량의 적어도 하나의 조성물, 전달 장치 및/또는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 당업계에 공지된 바와 같고/거나 본 명세서에 기재된 바에 따라 관련 증상의 이전, 이후 또는 중간에 및/또는 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에서 적어도 하나의 GLP-1 관련 증상의 조절 또는 치료를 위하여 치료적 유효량의 투여를 위한 적어도 하나의 GLP-1 모방체 방법 또는 조성물을 추가로 제공한다.
또한, 본 발명은 많은 다른 증상에서 필요한 대로, 이를 테면 이에 제한되는 것은 아니나 본 분야에 알려진 바와 같이 관련 질환 또는 치료 증상 이전, 이후, 또는 중간에, 및/또는 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에서 적어도 하나의 대사, 면역, 심혈관, 감염, 악성, 및/또는 신경 질환의 징후를 조절, 치료 또는 감소시키기 위한 치료적 유효량을 투여하는 방법 또는 조성물에 적어도 하나의 GLP-1 모방체, 특정 부분 또는 변이체를 제공한다.
또한, 본 발명은 많은 다른 증상에서 필요한 대로, 이를 테면 이에 제한되는 것은 아니나 본 분야에 알려진 바와 같이 관련 질환 또는 치료 증상 이전, 이후, 또는 중간에, 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에서 적어도 하나의 당뇨병 또는 인슐린 대사 관련 장애, 뼈 및 관절 장애, 심혈관 장애, 치아 또는 구강 장애, 피부 장애, 귀, 코 또는 인후 장애, 내분비 또는 대사 장애, 위장 장애, 부인과 장애, 간 또는 담 장애, 산과 장애, 혈액 장애, 면역 또는 알레르기 장애, 감염성 질환, 근골격 장애, 종양 장애, 신경 장애, 영양 장애, 안과 장애, 소아과 장애, 중독 장애, 정신 장애, 콩팥 장애, 폐 장애, 또는 임의의 공지된 다른 장애(예컨대, The Merck Manual, 17th ed., Merck Research Laboratories, Merck and Co., Whitehouse Station, NJ (1999)를 참조, 상기 내용이 모두 본 명세서에 참조로 포함됨)의 징후를 조절, 치료 또는 감소시키기 위한 치료적 유효량을 투여하는 방법 또는 조성물에 적어도 하나의 GLP-1 모방체, 특정 부분 또는 변이체를 제공한다.
또한, 본 발명은 GLP-1 관련 증상을 진단하기 위한, 본 발명에 따른 적어도 하나의 GLP-1 모방체의 적어도 하나의 조성물, 전달 장치 및/또는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 당업계에 공지되고/거나 본 명세서에 기재된 바와 같은, 관련된 증상의 이전, 이후, 또는 중간에, 및/또는 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에서 적어도 하나의 GLP-1 관련 증상을 진단하기 위한 적어도 하나의 GLP-1 모방체 방법 또는 조성물을 제공한다.
또한, (a) 본 발명의 적어도 하나의 분리된 인간 GLP-1 모방체의 유효량을 함유하는 조성물을 세포, 조직, 기관 또는 동물에 투여하거나 이와 접촉시키는 것을 포함하는 세포, 조직, 기관 또는 동물에서 질환 상태를 진단하거나 치료하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 임의로 0-24 시간, 1-7일, 1-52주, 1-24개월, 1-30년 또는 상기 범위 내의 임의의 범위 또는 값 당 0.001-50 mg/세포, 조직, 기관 또는 동물의 1 kg을 유효량으로 사용하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 임의로 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복강내, 낭내, 연골내, 강내, 복내, 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 경관내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심장막내, 복막내, 흉막내, 전립샘내, 폐내, 직장내, 콩팥내, 망막내, 척수내, 윤활막내, 흉부내, 자궁내, 방광내, 볼루스, 질, 직장, 볼, 설하, 비강내, 또는 경피로부터 선택된 적어도 하나의 방식에 의해 접촉시키거나 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 방법은 임의로 상기 (a)의 접촉 또는 투여 이전, 중간 또는 이후에, 검출 가능한 표지 또는 리포터, 항-감염제, 당뇨병 또는 인슐린 대사 관련 약물, 심혈관(CV)계 약물, 중추 신경계(CNS) 약물, 자율 신경계(ANS) 약물, 기도 약물, 위장(GI)관 약물, 호르몬 약물, 체액 또는 전해질 균형 약물, 혈액 약물, 항신생물제, 면역 조절 약물, 눈, 귀 또는 코 약물, 국소 약물, 영양제, TNF 길항제, 항류마티스제, 근육 이완제, 마약, 비-스테로이드 항-염증 약물(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경 근육 차단제, 항미생물제, 건선 치료제, 코르티코스테로이드, 동화대사 스테로이드, 에리쓰로포이에틴, 면역화, 면역글로불린, 면역 억제제, 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 방사성 의약품, 항우울제, 항정신병제, 흥분제, 천식약, 베타 작용제, 흡입 스테로이드, 에피네프린 또는 유사체, 사이토카인, 또는 사이토카인 길항제 중의 적어도 하나로부터 선택된 적어도 하나의 화합물 또는 단백질의 유효량을 함유하는 적어도 하나의 조성물을 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복강내, 낭내, 연골내, 강내, 복내, 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 경관내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심장막내, 복막내, 흉막내, 전립샘내, 폐내, 직장내, 콩팥내, 망막내, 척수내, 윤활막내, 흉부내, 자궁내, 방광내, 볼루스, 질, 직장, 볼, 설하, 비강내, 또는 경피로부터 선택된 적어도 방식에 의해 적어도 하나의 GLP-1 모방체를 접촉시키거나 투여하기에 적합한, 본 발명의 적어도 하나의 분리된 GLP-1 모방체를 포함하는 의료 장치가 제공된다.
또한, 포장재 및 본 발명에 따른 적어도 하나의 분리된 GLP-1 모방체의 용액 또는 동결 건조 형태를 함유하는 용기를 포함하는 인간 약제학적 또는 진단 용도를 위한 제품이 제공된다. 상기 제품은 임의로 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복강내, 낭내, 연골내, 강내, 복내, 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 경관내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심장막내, 복막내, 흉막내, 전립샘내, 폐내, 직장내, 콩팥내, 망막내, 척수내, 윤활막내, 흉부내, 자궁내, 방광내, 볼루스, 질, 직장, 볼, 설하, 비강내, 또는 경피 전달 장치 또는 시스템의 성분으로서 용기를 포함할 수 있다.
본 발명은 본원에 기재된 모든 발명을 추가로 제공한다.
도 1은 서열 번호 4의 중요한 기능 도메인을 나타내는 IgG4 스캐폴드 중의 GLP-1 MMB의 뉴클레오티드 및 펩티드 서열을 나타낸다.
도 2A-2C는 GLP-1 MMB의 FACS 결합 분석를 나타낸다. 도 2A는 GLP-1 MMB가 GLP-1R을 과-발현하는 HEK293 세포에 결합하는 것을 나타낸다. 회색 영역: GLP-1 MMB, 2차 없음; 회색 선: 2차 만; 점선, 음성 대조군 MMB 및 2차; 흑색 선: GLP-1 MMB 및 2차. 도 2B는 GLP-1 MMB가 대조군 HEK293 세포에 결합하지 않는 것을 나타낸다. 회색 영역: GLP-1 MMB, 2차 없음; 흑색 선: 2차 만; 회색 선: GLP-1 MMB 및 2차. 도 2C는 GLP-1R을 과-발현하는 HEK293 세포와의 결합에 대해, GLP-1 펩티드 유사체(A2S)가 GLP-1 MMB와 경쟁할 수 있는 것을 나타낸다. 회색 영역: GLP-1 MMB, 2차 없음; 흑색 선: GLP-1 MMB 및 2차; 파선: GLP-1 MMB, 0.2 nM 경쟁자, 2차; 점선: GLP-1 MMB, 20 nM 경쟁자, 2차; 회색 선:GLP-1 MMB, 100 nM 경쟁자, 2차).
도 3A-3E는 GLP-1 MMB의 cAMP 분석를 나타낸다. 도 3A: IgG1 스캐폴드 중의 야생형 GLP-1 MMB; 도 3B: GLP-1 펩티드; 도 3C: IgG4(Ala/Ala, Ser-> Pro) 스캐폴드 중의 GLP-1(A2G) MMB; 도 3D: IgG4(Ala/Ala, Ser-> Pro) 스캐폴드 중의 GLP-1(A2S) MMB; 도 3E: IgG4(Ala/Ala, Ser-> Pro) 스캐폴드 중의 야생형 GLP-1 MMB.
도 4는 DPP-IV 절단에 대한 GLP-1 MMB의 저항을 나타낸다.
도 5는 혈청에서 GLP-1 MMB의 안정성을 나타낸다.
도 6은 GLP-1 MMB가 RINm 세포에서 인슐린 분비를 유발하는 것을 나타낸다. 도 6A는 GLP-1(7-36) 펩티드 및 익센딘(exendin)-4 펩티드가 RINm 세포에서 인슐린 분비를 자극하는 것을 나타낸다. 도 6B는 IgG1 또는 IgG4(Ala/Ala, Ser-> Pro) 스 캐폴드 중의 GLP-1(A2S) MMB, 또는 IgG4(Ala/Ala, Ser-> Pro) 스캐폴드 중의 GLP-1(A2G) MMB가 RINm 세포에서 인슐린 분비를 자극하는데 활성이 있음을 나타낸다.
도 7은 GLP-1 MMB가 용량-의존 방식(도 7B)으로 포도당을 감소(도 7A)시키는 것을 나타낸다.
도 8은 사이노몰거스(cynomolgus) 원숭이에서 4개 GLP-1 MMB(A2G, A2S, Ex-cap 및 야생형)의 약동학적 프로필을 나타낸다.
도 9는 당뇨병 마우스에서의 경구 포도당 저항성 시험 중 GLP-1 MMB의 효과를 나타낸다.
도 10은 당뇨병 마우스에 대한 장기 투여 중 공복 혈당에 대한 GLP-1 MMB의 효과를 나타낸다.
도 11은 당뇨병 마우스에 대한 장기 투여 후에 경구 포도당 저항성 시험에 대한 GLP-1 MMB의 효과를 나타낸다.
도 12는 당뇨병 마우스에 대한 장기 투여 후에 HbA1c 감소에 대한 GLP-1 MMB의 효과를 나타낸다.
도 13은 정상 사이노몰거스 원숭이를 이용한 경구 포도당 저항성 시험에서 혈당(도 13A) 및 인슐린(도 13B) 수준에 대한 GLP-1 MMB의 효과를 나타낸다.
도 14는 단일 투여 후에 당뇨병 마우스의 섬 내의 인슐린 염색에 대한 GLP-1 MMB의 효과를 나타낸다.
도 15는 GLP-1 MMB가 정상 개에서 위 배출을 지연시키는 것을 나타낸다.
도 16은 GLP-1 MMB가 식이 유도된 비만 마우스를 이용한 경구 포도당 저항성 시험 후에 혈당을 감소시키는 것을 나타낸다.
도 17은 당뇨병 마우스를 이용한 복막내 포도당 저항성 시험에서 GLP-1 MMB가 혈당(도 17A) 및 인슐린 수준(도 17B)을 감소시키는 것을 나타낸다.
도 18A는 랫트 INS-1E 세포에서 GLP-1MMB의 농도 증가에 대한 cAMP 반응을 나타낸다. 데이터를 8.7 nM의 EC50 및 48.3 nM의 cAMP의 최대 분비량을 제공하는 쌍곡선으로 피팅(fit)하였다.
도 18B는 랫트 INS-1E 세포에서 GLP-1 펩티드의 농도 증가에 대한 cAMP 반응을 나타낸다. 데이터를 0.11 nM의 EC50 및 46.7 nM의 cAMP의 최대 분비량을 제공하는 쌍곡선으로 피팅하였다.
도 19는 GLP-1MMB 농도가 증가하는 INS-1E 세포에서의 인슐린 분비를 나타낸다.
도 20A는 단일의 정맥내 또는 피하 투여(3㎎/㎏)를 수행한 랫트 혈장에서의 GLP-1MMB 수준을 나타낸다.
도 20B는 단일 정맥내 투여 (1㎎/㎏)를 수행한 원숭이 혈장에서의 GLP-1MMB 수준을 나타낸다.
도 21A는 GLP-1MMB를 투여한 DIO 마우스에서 ipGTT를 나타낸다.
도 21B는 도 1에 나타낸 ipGTT에 대하여 계산된 곡선하 면적(AUC)을 나타낸다.
도 21C는 도 2에서의 데이터가 15 ㎍/㎏의 ED50을 제공하는 쌍곡선에 피팅되 는 것을 나타낸다.
도 22A 및 B는 CNTO1996 (1 mg/kg), 익센딘-4 (0.07 mg/kg) 및 GLP-1 MMB (1 mg/kg)의 단일 정맥내 투여로 처리된 야생형(A) 및 GLP-1R-/- (B) 마우스에서 24 시간 축적 음식물 섭취를 나타낸다. 값은 평균 ± SE로 나타내었다; CNTO1996-처리된 그룹에 대하여 *p<0.05
도 23A, B 및 C는 CNTO1996 (1 mg/kg), 익센딘-4 (0.07 mg/kg) 및 GLP-1 MMB (1 mg/kg)의 단일 정맥내 투여를 수행한 야생형 (A) 및 GLP-1R-/- (B) 마우스에서의 포도당 저항성 시험을 나타낸다. (C) 야생형 (검은색 막대) 및 GLP-1R-/- (회색 막대) 마우스에서 ipGTT 시험에 대한 곡선하 면적. 값은 평균 ± SE로 나타내었다; CNTO1996-처리된 그룹에 대하여 *p<0.05
도 24는 CNTO1996 (1 mg/kg), 익센딘-4 (0.07 mg/kg) 및 GLP-1 MMB (1 mg/kg)러 처리된 야생형 (검은색 막대) 및 GLP-1R-/- (회색 막대) 마우스에서의 위 함량을 나타낸다. 값은 평균 ± SE로 나타내었다; CNTO1996-처리된 그룹에 대하여 *p<0.05
도 25는 GLP-1 MMB (1 mg/kg)의 단일 정맥내 투여를 다양한 시간에 수행한 DIO 마우스에서의 포도당 저항성 시험을 나타낸다.
도 26은 DIO 마우스에서 ipGTT 중 수득된 데이터를 위한 곡선하 면적을 나타낸다(도 25).
도 27은 단일 정맥내 투여 (1 mg/kg)를 수행한 DIO 마우스 혈장에서의 GLP-1 MMB 수준을 나타낸다.
도 28은 포도당 저항성 시험 직후 GLP-1 MMB 혈장 농도의 함수로서 작도된 GLP-1 MMB (1 mg/kg)의 단일 정맥내 투여 후의 포도당 저항성 시험을 위한 곡선하 면적을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 분리, 재조합 및/또는 합성 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체, 뿐만 아니라 조성물 및 적어도 하나의 GLP-1 모방체를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코딩 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 이러한 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체는 특정 GLP-1 모방체 서열, 도메인, 이의 단편 및 특정 변이체를 포함하고, 치료 조성물, 방법 및 장치를 포함하여 상기 핵산 및 모방체, 또는 특정 부분 또는 변이체를 제조하는 방법 및 용도를 포함한다.
바람직하게, 이러한 GLP-1 모방체는 O-링크 글리코실화 부위(이를 테면 이로 제한되는 것은 아니나 Val-Xaa-Ser)를 N-링크 글리코실화 부위(이를 테면 이로 제한되는 것은 아니나 Asn-Xaa-Ser 또는 Gln-Xaa-Ser)로 전환시켜 발현, 정제 및/또는 안정성이 개선된다. 본 발명은 GLP-1 CH1 결실 모방체에 이러한 개선점을 제공한다.
본 발명은 또한 공지되고/거나 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 분리된 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체를 제공한다. GLP-1 모방체는 적어도 하나의 힌지 영역 또는 이의 단편(H)과 직접 연결된 적어도 하나의 CH2 영역과 직접 연결된 적어도 하나의 CH3 영역을 임의로 포함할 수 있고, 힌지 영역 또는 이의 단 편(H)은 적어도 하나의 부분 가변 영역(V)과 직접 연결되며, 적어도 하나의 부분 가변 영역(V)은 임의의 링커 서열(L)과 직접 연결되고, 링커 서열(L)은 적어도 하나의 GLP-1 치료 펩티드(P)와 직접 연결된다.
바람직한 구체예에서, GLP-1 모방체는 하기 화학식 (I)을 포함한다:
(P(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t),
상기 식에서,
P는 적어도 하나의 생활성 GLP-1 펩티드이고,
L은 적어도 하나의 링커 서열이며, 상기 링커 서열은 상기 모방체가 다른 배향 및 결합 성질을 갖도록 허용함으로써 구조적 유연성을 제공하는 폴리펩티드일 수 있고,
V는 면역글로불린 가변 영역의 C-말단의 적어도 한 부분이며,
H는 면역글로불린 가변 힌지 영역의 적어도 한 부분이고,
CH2는 면역글로불린 CH2 불변 영역의 적어도 한 부분이며,
CH3은 면역글로불린 CH3 불변 영역의 적어도 한 부분이고,
m, n, o, p, q, r, s, 및 t는 독립적으로 0 내지 10의 정수일 수 있고, 이는 면역글로불린 분자의 다른 유형, 예컨대, 이로 제한되는 것은 아니나 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD, IgE, 또는 이의 임의의 하위 분류 등, 또는 이의 임의의 조합을 모방한다.
바람직하게, 이러한 GLP-1 모방체는 O-링크 글리코실화 부위(이를 테면 이로 제한되는 것은 아니나 Val-Xaa-Ser)를 N-링크 글리코실화 부위(이를 테면 이로 제 한되는 것은 아니나 Asn-Xaa-Ser 또는 Gln-Xaa-Ser)로 전환시켜 발현, 정제 및/또는 안정성이 개선된다. 본 발명은 GLP-1 CH1 결실 모방체에 이러한 개선점을 제공한다.
따라서, 본 발명의 GLP-1 모방체는, 치료 펩티드 및 이의 본래의 또는 획득한 시험관 내, 생체 내 또는 인 시츄 성질 또는 활성을 제공하면서, 이의 본래의 성질 및 기능을 가진 항체 구조를 모방한다. t=1인 바람직한 구체예에서, 모노머 CH3-CH2-힌지-부분 J 서열-링커-치료 펩티드는 연합 또는 이로 제한되는 것은 아니나 Cys-Cys 이황화 결합과 같은 공유 결합에 의해 다른 모노머에 연결될 수 있다. 항체 및 본 발명의 적어도 하나의 GLP-1 모방체의 GLP-1 치료 펩티드 부분의 다양한 부분이 공지된 것과 조합하여 본 명세서에 기재된 바와 같이 달라질 수 있다.
재생(salvage) 수용체에 대한 결합이 유지된다면, CH3-CH2-힌지의 부분이 광범위하게 변형되어 본 발명에 따른 변이체를 형성할 수 있다. 이런 변이체에서, 본 발명의 융합 분자에 요구되지 않는 구조적 특징 또는 기능성 활성을 제공하는 하나 이상의 본래 부위를 제거할 수 있다. 이런 부위는 예를 들어 잔기를 치환하거나, 잔기를 결실시키거나, 잔기를 상기 부위에 삽입하거나, 상기 부위를 함유하는 부분을 절단함으로써 제거될 수 있다. 삽입되거나 치환된 잔기는 또한 펩티도모방체 또는 D-아미노산과 같은 변형된 아미노산일 수 있다. CH3-CH2-힌지의 변이체는 (1) 이황화 결합 형성, (2) 선택된 숙주 세포와의 부적합, (3) 선택된 숙주 세포에서 발현시의 이질성, (4) 글리코실화, (5) 보체와의 상호 작용, (6) 재생 수용체 외의 Fc 수용체와의 결합, 또는 (7) 항체-의존 세포형 세포독성(ADCC)에 영향 을 미치거나 이에 연관된 하나 이상의 본래 부위 또는 잔기가 결실되어 있을 수 있다. 예시적인 CH3-CH2-힌지 변이체는 하기 분자 및 서열을 포함한다: 1. 이황화 결합 형성에 연관된 부위가 제거된다. 이러한 제거는 본 발명에 따른 상기 분자를 제조하기 위해 사용되는 숙주 세포 내에 존재하는 다른 시스테인-함유 단백질과 반응하는 것을 피하게 할 수 있다. 이런 목적으로, 시스테인 잔기는 결실되거나 다른 아미노산(예컨대, 알라닐, 세릴)으로 치환될 수 있다. 시스테인 잔기가 제거된 경우에도, 단쇄 CH3-CH2-힌지 도메인은 여전히 비-공유적으로 함께 묶인 다이머 CH3-CH2-힌지 도메인을 형성할 수 있다; 2. CH3-CH2-힌지 영역이 선택된 숙주 세포와 보다 적합하게 되도록 변형된다. 예를 들어, 상기 분자가 E. coli와 같은 박테리아 세포에서 재조합적으로 발현되는 경우, 힌지에서 PA 서열을 제거할 수 있고, 이것은 프롤린 이미노펩티다아제와 같은 E. coli 내의 소화효소에 의해 인지될 수 있다; 3. 힌지 영역의 부분이 결실되거나, 다른 아미노산으로 치환되어 선택된 숙주 세포에서 발현시 이질성을 방지한다; 4. 하나 이상의 글리코실화 부위가 제거된다. 전형적으로 글리코실화되는 잔기(예컨대, 발린 또는 아스파라긴)가 세포용해 반응을 부여할 수 있다. 이런 잔기는 결실되거나, 비글리코실화된 잔기 (예컨대, 알라닌)로 치환되거나, 또는 이로 제한되는 것은 아니나 서열 Val-Xaa-Ser와 같은 O-글리코실화 부위는 N-글리코실화 부위, 이를 테면 Asn-Xaa-Ser 또는 Gln-Xaa-Ser으로 치환될 수 있으며, 예를 들어, 서열 목록에 나타낸 다음 잔기에서 수행되는 것이 바람직할 수 있다: Val-Xaa-Ser (O-글리코실화 부위)은 N-글리코실화 부위 (서열 번호 2, 4, 7-14의 위치 44, 서열 번호 43, 45의 위치 64, 서열 번호 44, 46 및 51의 위치 82; 서열 번호 48, 50, 53-55의 위치 88, 서열 번호 47의 위치 89, 서열 번호 49의 위치 90; 서열 번호 56 및 63의 위치 103 및/또는 185; 또는 서열 번호 60 및 61의 위치 39; 서열 번호 64의 위치 79 또는 본원에 개시되거나 본 분야에 알려진 임의의 다른 적합한 위치에서 Asn-Xaa-Ser)로 전환된다; 5. C1q 결합 부위와 같은 보체와의 상호 작용에 관여하는 부위가 제거된다. 보체 동원은 본 발명의 분자에 이롭지 않을 수 있으므로, 이러한 변이체에서 회피될 수 있다; 6. 재생 수용체 외의 Fc 수용체와의 결합에 영향을 주는 부위가 제거된다. CH3-CH2-힌지 영역은 본 발명의 융합 단백질에 불필요한, 백혈구 세포와의 상호 작용을 위한 부위를 가질 수 있으므로, 제거될 수 있다; 7. ADCC 부위가 제거된다. ADCC 부위는 공지되어 있다; 예를 들어, IgG1 내의 ADCC 부위와 관련하여 Molec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992)를 참조. 이들 부위는 또한, 본 발명의 융합 단백질에 불필요하므로 제거될 수 있다.
링커 폴리펩티드는 상기 모방체가 다른 배향 및 결합 성질을 갖도록 허용함으로써 구조적 유연성을 제공한다. 링커가 존재하는 경우, 이의 화학적 구조는 중요하지 않다. 링커는 바람직하게는 펩티드 결합으로 함께 연결된 아미노산으로 구성된다. 따라서, 바람직한 구체예에서, 링커는 펩티드 결합으로 연결된 1 내지 20개의 아미노산으로 구성되고, 여기에서 아미노산은 20개의 자연 발생 아미노산으로부터 선택된다. 이들 아미노산 중 일부는 글리코실화될 수 있고, 이는 당업계에 잘 알려져 있다. 보다 바람직한 구체에에서, 1 내지 20개의 아미노산은 글리신, 알라닌, 세린, 프롤린, 아스파라긴, 글루타민, 및 리신으로부터 선택된다. 보다 바람직하게, 링커는 주로 글리신 및 알라닌과 같은 구조적으로 방해받지 않는(unhindered) 아미노산으로 구성된다. 따라서, 바람직한 링커는 폴리(Gly-Ser), 폴리글리신(구체적으로 (Gly)4, (Gly)5), 폴리(Gly-Ala), 및 폴리알라닌이다. 링커의 다른 특정 구체적인 예는: (Gly)3Lys(Gly)4(서열 번호 65), (Gly)3AsnGlySer(Gly)2(서열 번호 66), (Gly)3Cys(Gly)4 (서열 번호 67), 및 GlyProAsnGlyGly(서열 번호 68)이다.
상기 명명을 설명하면, 예를 들어 (Gly)3Lys(Gly)4는 Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly을 의미한다. Gly 및 Ala의 조합이 또한 바람직하다. 본원에 기재된 링커는 예시적이다; 본 발명의 범위에 속하는 링커는 보다 길 수 있고, 다른 잔기를 포함할 수 있다.
비-펩티드 링커가 또한 가능하다. 예를 들어, -NH-(CH2)s-C(O)-와 같은 알킬 링커가 사용될 수 있고, 여기에서 s=2-20이다. 이들 알킬 링커는 저급 알킬(예컨대, C1-C6) 저급 아실, 할로겐(예컨대, Cl, Br), CN, NH2, 페닐 등과 같은 임의의 비-입체 장애 그룹에 의해 추가로 치환될 수 있다. 비-펩티드 링커의 예는 분자량이 100 내지 5000 kD, 바람직하게 100 내지 500 kD인 PEG 링커이다. 펩티드 링커는 본 명세서에 기재된 것과 동일한 방식으로 변형되어 유도체를 형성할 수 있다.
본 명세서에 사용된, "GLP-1 펩티드" 또는 "GLP-1 펩티드, 변이체, 또는 유도체"는 적어도 하나의 GLP-1 펩티드, GLP-1 단편, GLP-1 호몰로그, GLP-1 유사체, 또는 GLP-1 유도체일 수 있다. 이자의 β-세포 상의 GLP-1 수용체에 결합함으로써 인슐린 분비 활성을 나타낼 수 있도록, GLP-1 펩티드는 본래 GLP-1(7-37)에 충분한 상동성을 나타내는 약 25 내지 약 45개의 자연 발생 또는 비-자연 발생 아미노산을 가진다. GLP-1(7-37)는 서열 번호 15의 아미노산 서열을 가진다:
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly.
GLP-1 단편은 GLP-1(7-37) 또는 이의 유사체 또는 유도체의 N-말단 및/또는 C-말단으로부터 하나 이상의 아미노산을 절단하여 얻은 폴리펩티드이다. GLP-1 호몰로그는 GLP-1(7-37), 이의 단편 또는 이의 유사체의 N-말단 및/또는 C-말단에 하나 이상의 아미노산이 첨가된 펩티드이다. GLP-1 유사체는 GLP-1(7-37)의 하나 이상의 아미노산이 변형 및/또는 치환된 펩티드이다. GLP-1 유사체는 GLP-1(7-37) 또는 GLP-1(7-37)의 단편에 충분한 상동성을 가짐으로써, 상기 유사체는 인슐린 분비 활성을 가진다. GLP-1 유도체는 GLP-1 펩티드, GLP-1 호몰로그 또는 GLP-1 유사체의 아미노산 서열을 가진 분자로 정의되지만, 하나 이상의 이의 아미노산 측쇄 그룹, α-탄소 원자, 말단 아미노 그룹, 또는 말단 카복실산 그룹에 화학적 변형을 추가로 가진다.
다수의 활성 GLP-1 단편, 유사체 및 유도체가 당업계에 공지되어 있고, 또한 이들 유사체 및 유도체 중의 어떤 것도 본 발명의 GLP-1 모방체의 일부분일 수 있다. 공지된 일부 GLP-1 유사체 및 GLP-1 단편이 미국 특허 제 5,118,666호, 제 5,977,071호, 및 제 5,545,618호, 및 Adelhorst, et al., J. Biol . Chem. 269:6275 (1994)에 개시되어 있다. 이로 제한되는 것은 아니지만, 이들의 예는 GLP-1(7-34), GLP-1(7-35), GLP-1(7-36), Gln9-GLP-1(7-37), D-Gln9-GLP-1(7-37), Thr16-Lys18-GLP-1(7-37), 및 Lys18-GLP-1(7-37)을 포함한다.
"GLP-1 모방체", "GLP-1 모방체 부분" 또는 "GLP-1 모방체 단편" 및/또는"GLP-1 모방체 변이체" 등은 이로 제한되는 것은 아니지만, 시험관 내, 인 시츄 및/또는 바람직하게는 생체 내에서 이로 제한되는 것은 아니나, 적어도 하나의 서열 번호 1과 같은 적어도 하나의 GLP-1 펩티드, 변이체 또는 유도체의 리간드 결합과 같은 적어도 하나의 생물학적 활성을 가지거나 모방하거나 흉내낸다. 예를 들어, 적합한 GLP-1 모방체, 특정 부분, 또는 변이체는 또한 적어도 하나의 GLP-1 수용체 시그널링 또는 다른 측정할 수 있거나 검출할 수 있는 활성을 조절, 증가, 변형, 활성화시킬 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물에 유용한 GLP-1 모방체는 단백질 리간드(예컨대, GLP-1 수용체)에 대한 적합한 친화도 결합 및 임의로 바람직하게 낮은 독성을 가지는 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 가변 영역 부분, 불변 영역(CH1 부분 없음) 및 프레임워크, 또는 이의 임의의 부분(예컨대, 가변 중쇄 또는 경쇄의 J, D 또는 V 영역의 부분; 적어도 하나의 힌지 영역의 적어도 한 부분, 불변 중쇄 또는 경쇄 등)과 같은 개별 성분이 개별적 및/또는 집합적으로 임의로 및 바람직하게 저 면역원성을 가지는 GLP-1 모방체가 본 발명에 유용하다. 본 발명에 이용될 수 있는 모방체는 임의로 연장된 기간 동안 좋은 내지 뛰어난 증상 완화 및 낮은 독성을 가지고 환자를 치료할 수 있는 이의 능력을 특징으로 한다. 저 면역원성 및/또는 높은 친화도 및 다른 미확인 성질은 얻어지는 치료 결과에 기여할 수 있다. 여기에서 "저 면역원성"은 치료 환자의 약 75% 미만, 또는 바람직하게는 50, 45, 40, 35, 30, 35, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 및/또는 1 % 미만에서, HAMA, HACA 또는 HAHA 반응의 상당한 증가, 및 또는 치료 환자에서 낮은 역가 증가[이중 항원 효소면역분석법(double antigen enzyme immunoassay)으로 측정하여 약 300 미만, 바람직하게는 약 100 미만]로 정의될 수 있다(예컨대, Elliott et al ., Lancet 344: 1125-1127(1994)).
유용성. 본 발명의 분리된 핵산은 세포, 조직, 기관 또는 동물(포유동물 및 인간을 포함)에서 이로 제한되는 것은 아니나 적어도 하나의 당뇨병 관련 질병, 인슐린 대사 관련 질병, 면역 질병 또는 질환, 심혈관 질병 또는 질환, 감염, 악성, 및/또는 신경 질병 또는 질환, 다른 공지 또는 특정 단백질 관련 증상으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질 관련 증상의 징후를 조절, 치료, 완화, 발병 예방을 보조, 또는 감소시키는데 사용될 수 있는 적어도 하나의 GLP-1 모방체, 이의 단편 또는 특정 변이체를 제조하는데 사용될 수 있다.
이런 방법은 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체를 함유하는 유효량의 조성물 또는 약제학적 조성물을 징후, 효과 또는 메카니즘에서 이런 조절, 치료, 경감, 예방 또는 감소가 필요한 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 공지되거나 본 명세서에 기재된 바와 같이, 유효량은 단일 또는 다중 투여 당 약 0.0001 내지 500 mg/kg의 양, 또는 단일 또는 다중 투여당 0.01-5000 ㎍/㎖ 혈청 농도를 얻을 수 있는 양, 또는 공지 방법을 이 용해서 결정된 임의의 유효 범위 또는 그 안의 값을 포함할 수 있다.
인용. 본원에 인용된 모든 문헌 및 특허는 본 발명의 출원시의 종래 기술 및 본 발명의 기재 및 실시 가능성을 제공하는 참조로서 본 명세서에 전체 내용이 포함된다. 문헌은 모든 과학적 또는 특허 문헌, 또는 녹음, 전자 또는 인쇄 형태를 포함하는 임의의 매체 형태로 얻을 수 있는 정보를 지칭한다. 다음의 참고자료는 참고로 본 명세서에 전체 내용이 포함된다: Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2003); Sambrook, et al., Molecular Cloning: Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow and Lane, Antibodies, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2003); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2003).
본 발명의 모방체 . GLP-1 모방체는 적어도 하나의 힌지 영역 단편(H)의 적어도 한 부분(예컨대, 적어도 하나의 코어 힌지 영역을 포함)과 직접 연결된 적어도 하나의 CH2 영역과 직접 연결된 적어도 하나의 CH3 영역을 임의로 포함할 수 있고, 적어도 하나의 힌지 영역 단편(H)은 적어도 하나의 부분 가변 영역(V)과 직접 연결되며, 적어도 하나의 부분 가변 영역(V)은 임의의 링커 서열(L)과 직접 연결되고, 링커 서열(L)은 적어도 하나의 GLP-1 치료 펩티드(P)와 직접 연결된다. 바람 직한 구체예에서, CH3-CH2-H-V-L-P의 쌍은 연합 또는 공유 결합, 예컨대, 이로 제한되는 것은 아니나 적어도 하나의 Cys-Cys 이황화 결합에 의해 연결될 수 있다. 따라서, 본 발명의 GLP-1 모방체는, GLP-1 치료 펩티드 및 이의 본래의 또는 획득된 시험관 내, 생체 내 또는 인 시츄 성질 또는 활성을 제공하면서, 이의 본래의 성질 및 기능을 가진 항체 구조를 모방한다. 본 발명의 적어도 하나의 GLP-1 모방체의 치료 펩티드 부분 및 항체의 다양한 부분은 공지 기술과 조합하여 본 명세서에 기재된 바와 같이 달라질 수 있다.
본 발명의 모방체는 공지 단백질과 비교하여 적어도 하나의 바람직한 성질을 제공하며, 예컨대, 이로 제한되는 것은 아니나 적어도 하나의 증가된 반감기, 증가된 활성, 보다 특이적인 활성, 증가된 화합력(avidity), 증가 또는 감소된 오프 속도(off rate), 활성의 선택적이거나 보다 바람직한 서브세트, 감소된 면역원성, 적어도 하나의 바람직한 치료 효과의 증가된 질 또는 기간, 더 적은 부작용 등을 제공한다.
화학식 (I)에 따른 모방체의 단편은 당업계에 공지 및/또는 본원에 기재된 효소적 절단, 합성 또는 재조합 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 또한, 모방체는 자연상 정지 부위의 업스트림에 하나 이상의 정지 코돈이 도입된 항체 유전자를 이용하여 다양한 절단 형태로 제조될 수 있다. 모방체의 다양한 부분은 통상의 기술을 이용해서 화학적으로 함께 연결되거나, 유전 공학 기술을 이용해서 인접 단백질로 제조될 수 있다. 예컨대, 인간 항체 사슬의 불변 영역의 적어도 하나를 코딩하는 핵산을 발현시켜, 본 발명의 모방체에 사용되는 인접 단백질을 생산할 수 있다. 예컨대, 단쇄 항체에 관하여, Ladner et al., 미국 특허 번호 제 4,946,778호 및 Bird, R. E. et al ., Science, 242: 423-426 (1988)을 참조.
본 명세서에 사용된 용어 "인간 모방체"는 단지 주요하지 않은 서열 변화 또는 변이를 가지며 단백질[예컨대, GLP-1 펩티드, CH 도메인(예컨대, CH2, CH3], 힌지, V)의 실질적 모든 부분이 인간에서 실질적으로 비-면역원성일 것으로 기대되는 항체를 지칭한다. 이런 변화 또는 변이는 임의 및 바람직하게 비-변형된 인간 항체, 또는 본 발명의 모방체에 비하여 상대적으로 인간에서 면역원성을 유지하거나 감소시킨다. 따라서, 인간 항체 및 상응하는 본 발명의 GLP-1 모방체는 키메라 또는 인간화 항체와 다르다. 이는 GLP-1 모방체가 인간 면역글로불린(예컨대, 중쇄 및/또는 경쇄) 유전자를 발현시킬 수 있는 비-인간 동물 또는 세포에 의해 제조될 수 있는 것을 나타낸다.
적어도 하나의 단백질 리간드에 대해 특이적인 인간 모방체가 분리된 GLP-1 수용체 또는 이의 부분(합성 펩티드와 같은 합성 분자를 포함)과 같은 적합한 리간드에 대해 설계될 수 있다. 이런 모방체의 제조는 적어도 하나의 단백질 또는 이의 부분의 리간드 결합 영역 또는 서열을 동정하고 특성화하는 공지의 기술을 이용하여 수행된다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체는 적어도 하나의 세포주, 혼합된 세포주, 불멸화된 세포 또는 불멸화된 및/또는 배양된 세포의 클론 집단에 의해 제조된다. 불멸화된 단백질 생산 세포는 적당한 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 바람직하게, 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체는 기능적으로 재배열되었거나 재배열될 수 있고, 추가로 본원에 기재된 모방체 구조, 예컨대 이로 제한되는 것은 아니나 화학식 (I) 을 추가로 포함하는 적어도 하나의 인간 면역글로불린 로커스로부터 유래되거나 또는 그에 실질적으로 유사한 서열을 가지는 DNA를 포함하는 핵산 또는 벡터를 제공함으로써 제조될 수 있으며, 여기에서 공지된 바와 같이 C-말단 가변 영역 부분은 V로 사용될 수 있고, 힌지 영역은 H로 사용될 수 있으며, CH2는 CH2로, CH3는 CH3로 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "기능적으로 재배열된"은 V(D)J 재조합이 발생한 면역글로불린 로커스 유래의 핵산 세그멘트를 지칭하고, 이에 의해 면역글로불린 사슬(예컨대, 중쇄), 또는 이의 임의의 부분을 코딩하는 면역글로불린 유전자가 생산된다. 기능적으로 재배열된 면역글로불린 유전자는 예컨대, 뉴클레오티드 시퀀싱, 유전자 세그멘트 사이의 코딩 조인트에 어닐링할 수 있는 프로브를 이용한 혼성화(예컨대, 서던 블롯팅, 노던 블롯팅) 또는 유전자 세그멘트 사이의 코딩 조인트에 어닐링할 수 있는 프라이머를 이용한 면역글로불린 유전자의 효소적 증폭(예컨대, 폴리머라제 연쇄 반응)과 같은 적합한 방법을 이용해서 직·간접적으로 확인될 수 있다. 세포가 특정 가변 영역 또는 특정 서열(예컨대, 적어도 하나의 P 서열)을 포함하는 가변 영역을 가지는 GLP-1 모방체 또는 부분 또는 변이체를 생산하는지 여부는 또한 적당한 방법을 이용하여 결정될 수 있다.
본 발명의 모방체, 특정 부분 및 변이체는 또한 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체를 코딩하는 핵산을 이용하여, 젖 중에 이러한 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체를 생산하는 염소, 소, 말, 양 등과 같은 포유 동물 또는 트랜스제닉 동물을 제공함으로써 제조될 수 있다. 이런 동물은 항체 코딩 서열에 대해 적용된 공지 방법을 이용하여 제공될 수 있다. 예컨대, 이로 한정되는 것은 아니나 미국 특허 제 5,827,690호; 제 5,849,992호; 제 4,873,316호; 제 5,849,992호; 제 5,994,616호; 제 5,565,362호; 제 5,304,489호 등을 참조, 각각의 전체 내용이 참고로서 본 명세서에 포함된다.
본 발명의 모방체, 특정 부분 및 변이체는 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체 코딩 핵산을 이용하여, 이런 모방체, 특정 부분 또는 변이체를 식물 부위 또는 그로부터 배양된 세포 내에 제조하는 트랜스제닉 식물 및 배양된 식물 세포(예컨대, 이로 제한되는 것은 아니나 담배 및 옥수수)를 제공함으로써 제조될 수 있다. 비제한적인 예로서, 재조합 단백질을 발현하는 트랜스제닉 담배 잎은 예컨대 유도 프로모터를 이용함으로써 다량의 재조합 단백질을 제공하는데 성공적으로 이용되어 왔다. 예컨대, Cramer et al., Curr. Top. Microbol. Immunol. 240: 95-118 (1999) 및 거기에 인용된 문헌을 참조. 또한 트랜스제닉 옥수수 및 콘(corn)은 다른 재조합 시스템에서 제조되거나 또는 자연원으로부터 정제한 것과 동등한 생물학적 활성을 가지는 포유동물 단백질을 상업적 생산 수준으로 발현시키는데 사용되어 왔다. 예컨대, Hood et al., Adv. Exp. Med. Biol. 464: 127-147 (1999) 및 거기에 인용된 문헌을 참조. 항체는 또한 단쇄 모방체(single chain mimetibodies; scFv's)와 같은 항체 단편을 포함하는 트랜스제닉 식물 종자 (담배 종자 및 감자 덩이줄기를 포함)으로부터 대량으로 제조될 수 있다. 예컨대, Conrad et al., Plant Mol. Biol. 38: 101-109 (1998) 및 거기에 인용된 문헌을 참조. 따라서, 본 발명의 모방체, 특정 부분 및 변이체는 또한 공지된 방법에 따라 트랜스제닉 식물로부터 제조될 수 있다. 예컨대, Fischer et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 30:99-108 (Oct., 1999), Ma et al., Trends Biotechnol. 13:522-7 (1995); Ma et al., Plant Physio. 109:341-6 (1995); Whitelam et al., Biochem. Soc. Trans. 22:940-944 (1994); 및 거기에 인용된 문헌을 참조. 상기 문헌의 전체 내용이 본 명세서에 참고로서 포함된다.
본 발명의 모방체는 인간 단백질 리간드와 넓은 범위의 친화도(KD)를 가지고 결합할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 적어도 하나의 인간 GLP-1 모방체는 임의로 적어도 하나의 단백질 리간드와 높은 친화도로 결합할 수 있다. 예컨대, 적어도 하나의 본 발명의 GLP-1 모방체는 적어도 하나의 단백질 리간드와 약 10-7M 이하의 KD, 보다 바람직하게는 약 0.1-9.9(또는 그안의 임의의 범위 또는 값) X 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12, 또는 10-13M 이하의 KD, 또는 그안의 임의의 범위 또는 값을 가지고 결합할 수 있다.
적어도 하나의 단백질 리간드에 대한 GLP-1 모방체의 친화도 또는 화합력은 예컨대 항체-항원 결합 친화도 또는 화합력을 결정하기 위해 사용되는 임의의 적합한 방법을 이용하여 실험적으로 결정될 수 있다(예컨대, Berzofsky, et al., "Antibody-Antigen Interactions," In Fundanzental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, NY(1984); Kuby, Janis Immuzlology, W. H. Freeman and Company: New York, NY (1992); 및 본원에 기재된 방법을 참조). 특정 GLP-1 모방체-리간드 상호 작용의 측정된 친화도는 다른 조건(예컨대, 염 농도, pH)하에 측정된다면 달라질 수 있다. 따라서, 친화도 및 다른 리간드-결합 파라미터(예컨대, KD, Ka, Kd)의 측정은 바람직하게는 GLP-1 모방체 및 리간드의 표준화된 용액, 및 공지되거나 본 명세서에 기재된 완충액과 같은 표준화된 완충액을 이용하는 것이 바람직하다.
핵산 분자. 적어도 하나의 서열 번호 1 및 6의 인접 아미노산의 적어도 90-100%, 및 항체의 적어도 한 부분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 같은, 본 명세서에 제공된 정보를 이용하고, 여기에서, 상기 서열은 화학식 (I)의 P 서열로 삽입되어 본 발명의 GLP-1 모방체를 제공하고, 추가로 이의 특정 단편, 변이체 또는 공통 서열을 포함하며, 이들 서열 중 적어도 하나를 포함하는 보관된 벡터, 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체를 코딩하는 본 발명의 핵산 분자를 본원에 기재되거나 공지의 방법을 이용해서 얻을 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 mRNA, hnRNA, tRNA 또는 다른 형태와 같은 RNA 형태, 또는 이로 제한되는 것을 아니나 클로닝 또는 합성 또는 이의 임의의 조합에 의해 수득되는 cDNA 및 게놈 DNA를 포함하는 DNA 형태일 수 있다. DNA는 삼중 가닥, 이 중 가닥, 단일 가닥 또는 이의 임의의 조합일 수 있다. DNA 또는 RNA의 적어도 하나의 가닥의 임의의 부분은 센스 가닥으로도 알려진 코딩 가닥이거나, 안티-센스 가닥으로도 언급되는 비-코딩 가닥일 수 있다.
본 발명의 분리된 핵산 분자는 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF), 임의로 하나 이상의 인트론, GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체에 대한 코딩 서열을 함유하는 핵산 분자를 포함하는 핵산 분자; 및 뉴클레오티드 서열이 상술한 것과 실질적으로 다르지만, 이것이 유전자 코드의 퇴보에 기인하여 여전히 공지되고/거나 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 GLP-1 모방체를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 물론, 유전자 코드는 본 분야에 공지이다. 따라서, 당업자에게 있어 본 발명의 특정 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체를 코딩하는 이러한 퇴보 핵산 변이체를 생성하는 것은 루틴할 것이다. 예컨대, Ausubel, et al., supra를 참조, 이러한 핵산 변이체도 본 발명에 포함된다.
본원에 기재된, GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체 코딩 핵산을 포함하는 본 발명의 핵산 분자는 이로 제한되는 것은 아니나 그 자체로 GLP-1 모방체 단편의 아미노산 서열을 코딩하는 것; 전체 GLP-1 모방체 또는 이의 부분에 대한 코딩 서열; GLP-1 모방체, 단편 또는 부분에 대한 코딩 서열, 및 이로 제한되는 것은 아니나 전사, 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호(예컨대-리보솜 결합 및 mRNA의 안정성)을 포함하는 mRNA 처리, 전사에 작용하는 전사, 비-번역 서열과 같은 비-코딩 5' 및 3'서열을 포함하는 추가의 비-코딩 서열과 함께 적어도 하나의 인트론과 같은 전술한 추가의 코딩 서열의 존재 또는 부재하에 적어도 하나의 신호 리더 또 는 융합 펩티드의 코딩 서열과 같은 추가 서열; 추가 기능을 제공하는 것과 같은 추가 아미노산을 코딩하는 추가의 코딩 서열을 포함할 수 있다. 따라서, GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체를 코딩하는 서열은 GLP-1 모방체 단편 또는 부분을 포함하는 융합된 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체의 정제를 촉진시키는 펩티드를 코딩하는 서열과 같은 마커 서열과 융합될 수 있다.
본원에 기재된 폴리뉴클레오티드에 대해 선택적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드. 본 발명은 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 특정 변이체 또는 부분을 포함하는 본원에 개시된 다른 것에 대해 선택적 혼성화 조건하에서 혼성화하는 분리된 핵산을 제공한다. 따라서, 본 구체예의 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 분리, 검출 및/또는 정량하는데 사용될 수 있다.
낮은 또는 보통의 엄격한 혼성화 조건은 전형적으로, 그러나 배타적이지 않게, 상보적 서열에 비하여 감소된 서열 상동성을 가지는 서열을 사용한다. 보통 및 높은 엄격한 조건은 보다 높은 상동성의 서열에 대해 임의로 사용될 수 있다. 낮은 엄격한 조건은 약 40-99% 서열 상동성을 가지는 서열의 선택적 혼성화를 허용하고, 오르토로거스(orthologous) 또는 파라로거스(paralogous) 서열을 동정하는데 사용될 수 있다.
임의로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체의 적어도 한 부분을 코딩할 것이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대한 선택적 혼성화에 사용될 수 있는 핵산 서열을 포함한다. 예컨대, Ausubel, supra; Colligan, supra, 각각은 본원에 참고로 포함되었다.
핵산의 작제 . 본 발명의 분리된 핵산은 (a) 재조합 방법, (b) 합성 기술, (c) 정제 기술, 또는 이들의 조합 및, 공지 기술을 이용해서 제조될 수 있다.
상기 핵산은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 외의 서열을 편의상 포함할 수 있다. 예컨대, 하나 이상의 제한 효소 자리를 포함하는 다중-클로닝 부위가 폴리뉴클레오티드의 분리를 돕기 위해 핵산에 삽입될 수 있다. 또한, 본 발명의 번역된 폴리뉴클레오티드의 분리를 돕기 위해 번역 가능 서열이 삽입될 수 있다. 예컨대, 헥사-히스티딘 마커 서열은 본 발명의 단백질을 정제하는 편리한 수단을 제공한다. 코딩 서열을 제외한 본 발명의 핵산은 임의로 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 클로닝 및/또는 발현을 위한 벡터, 어댑터, 또는 링커이다.
폴리뉴클레오티드의 분리를 돕도록 클로닝 및/또는 발현 기능을 최적화하기 위해, 또는 폴리뉴클레오티드의 세포로의 도입을 개선하기 위해 추가 서열이 클로닝 및/또는 발현 서열에 부가될 수 있다. 클로닝 벡터, 발현 벡터, 어댑터 및 링커의 이용은 당업계에 잘 알려져 있다. 예컨대, Ausubel, supra; 또는 Sambrook, supra를 참조.
핵산 작제를 위한 재조합 방법. RNA, cDNA, 게놈 DNA, 또는 이의 임의의 조합과 같은 본 발명의 분리된 핵산 조성물은 당업자에게 알려진 임의의 클로닝 방법을 이용하여 생물원으로부터 수득될 수 있다. 일부 구체예에서, 적절히 엄격한 조건하에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 선택적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드 프로브는 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리에서 원하는 서열을 동정하는데 사용된다. RNA의 분리 및 cDNA 및 게놈 라이브러리의 작제는 당업자에게 잘 알려져 있다(예컨대, Ausubel, supra; 또는 Sambrook, supra).
핵산 작제를 위한 합성법. 또한, 본 발명의 분리된 핵산은 공지 방법에 의해 직접적 화학 합성으로 제조될 수 있다(예컨대, Ausubel, et al., supra를 참조). 화학적 합성은 일반적으로 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 제조하고, 이것은 상보 서열과의 혼성화, 또는 단일 가닥을 주형으로 이용하는 DNA 중합효소와의 중합에 의해 이중-가닥 DNA으로 전환될 수 있다. 당업자는 DNA의 화학적 합성이 약 100개 또는 그 이상의 염기 서열에 한정되지만, 더 긴 서열이 짧은 서열들의 라이게이션에 의해 얻을 수 있다는 것을 인식할 것이다.
재조합 발현 카세트. 본 발명은 또한 본 발명의 핵산을 포함하는 재조합 발현 카세트를 제공한다. 본 발명의 핵산 서열, 예컨대, 본 발명의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체를 코딩하는 cDNA 또는 게놈 서열은 적어도 하나의 바람직한 숙주 세포로 도입될 수 있는 재조합 발현 카세트를 작제하는데 사용될 수 있 다. 재조합 발현 카세트는 전형적으로 의도된 숙주 세포 내에서 폴리뉴클레오티드의 전사를 지시하는 전사 개시 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이종기원 및 비-이종기원(즉, 내인성) 프로모터가 본 발명의 핵산의 발현을 지시하기 위해 사용될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현을 상향 또는 하향 조절하기 위해, 프로모터, 인핸서, 또는 다른 요소로 작용하는 분리된 핵산이 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 비-이종기원 형태의 적절한 위치(업스트림, 다운스트림 또는 인트론 내)에 도입될 수 있다. 예컨대, 내인성 프로모터는 공지 방법에 따라 돌연변이, 결실 및/또는 치환에 의해 생체 내 또는 시험관 내에서 변경될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 센스 또는 안티-센스 배향으로 발현될 수 있다. 센스 또는 안티-센스 배향에서의 유전자 발현의 조절은 관찰 가능한 특성에 직접 영향을 줄 것으로 예상된다. 억제하는 다른 방법은 센스 억제이다. 센스 배향으로 배열된 핵산의 도입은 표적 유전자의 전사를 차단하는 유효한 수단이다.
벡터 및 숙주 세포. 본 발명은 또한 본 발명의 분리된 핵산 분자를 포함하는 벡터, 재조합 벡터와 함께 유전공학적으로 설계된 숙주 세포, 및 당업계에 공지된 재조합 기술에 의한 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체의 제조에 관한 것이다. 예컨대, Sambrook, et al., supra; Ausubel, et al., supra를 참조, 각각의 전체 내용이 참고로서 본 명세서에 포함된다.
폴리뉴클레오티드는 숙주에서의 증식에 대한 선택적 마커를 함유하는 벡터에 임의로 연결될 수 있다. 일반적으로, 플라스미드 벡터는 일렉트로포레이션(electroporation) 등과 같은 적합한 공지 방법을 이용하여 세포에 도입되며, 다른 공지 방법은 벡터를 칼슘 포스페이트 침전과 같은 침전물로 사용하거나, 대전된 지질과의 복합체로 사용하는 것을 포함한다. 벡터가 바이러스라면, 적당한 패키지 세포주를 이용해서 시험관 내 패키지되어 숙주 세포로 도입될 수 있다.
DNA 삽입물은 적당한 프로모터에 작동가능하게 연결되어야 한다. 발현 작제물은 임의로 적어도 하나의 전사 개시, 정지 및 전사 영역에서 번역을 위한 리보솜 결합 부위를 위한 부위를 추가로 함유할 것이다. 작제물에 의해 발현된 성숙 전사물의 코딩 부분은 바람직하게는 시작에 위치한 번역 개시 코돈 및 번역되는 mRNA의 끝에 적절히 위치한 정지 코돈(예컨대, UAA, UGA 또는 UAG)을 포함할 것이고, UAA 및 UAG가 포유동물 또는 진핵 세포 발현에 대해 바람직하다.
발현 벡터는 바람직하지만 임의로 적어도 하나의 선택 마커를 포함할 것이다. 이러한 마커는, 예컨대, 이로 제한되는 것은 아니나, 메토트렉세이트(methotrexate; MTX), 디하이드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase; DHFR, 미국 특허 번호 제 4,399,216호; 제 4,634,665호; 제 4,656,134호; 제 4,956,288호; 제 5,149,636호; 제 5,179,017호, 앰피실린, 네오마이신(G418), 마이코페놀산, 또는 진핵 세포 배양에 대한 저항성이 있는 글루타민합성효소(glutamine synthetase; GS, 미국 특허 번호 제 5,122,464호; 제 5,770,359호; 제 5,827,739호), 및 E. coli 및 다른 박테리아 또는 원핵생물 배양에 대한 테트라사이클린 또 는 앰피실린 내성 유전자를 포함한다(상기 특허는 참고로 본 명세서에 전체적으로 포함된다). 상술한 숙주 세포를 위한 적절한 배양 배지 및 조건이 당업계에 알려져 있다. 적합한 벡터는 당업자에게 극히 명백할 것이다. 벡터 작제물의 숙주 세포로의 도입은 칼슘 포스페이트 트랜스펙션, DEAE-덱스트란 매개 트랜스펙션, 양이온 지질-매개 트랜스펙션, 일렉트로포레이션, 형질도입, 감염 또는 다른 공지 방법의 의해 달성할 수 있다. 이런 방법은 Sambrook, supra, Chapters 1-4 및 16-18; Ausubel, supra, Chapters 1, 9, 13, 15, 16과 같이 당업계에 알려져 있다.
본 발명의 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체는 융합 단백질과 같은 변형된 형태로 발현될 수 있고, 분비 신호 및 추가의 이종기원 기능 영역을 포함할 수 있다. 예컨대, 추가적 아미노산 영역, 특히, 대전된 아미노산이 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체의 N-말단에 부가되어, 정제 과정, 또는 그 뒤의 취급 및 저장 중에 숙주 세포 내 안정성 및 지속성을 개선시킬 수 있다. 또한, 펩티드 모이어티가 본 발명의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체에 부가되어, 정제를 촉진시킬 수 있다. 이런 영역은 GLP-1 모방체 또는 적어도 하나의 이의 단편의 최종 제조 전에 제거될 수 있다. 이런 방법은 Sambrook, supra, Chapters 17.29-17.42 및 18.1-18.74; Ausubel, supra, Chapters 16, 17 및 18과 같은 많은 표준 실험 메뉴얼에 기재되어 있다.
당업자는 본 발명의 단백질을 코딩하는 핵산을 발현시키기 위해 이용 가능한 수많은 발현 시스템에 대해 알고 있을 것이다.
모방체, 이의 특정 부분 또는 변이체의 제조에 유용한 예시적인 세포 배양은 포유동물 세포이다. 포유동물 세포 시스템은 포유동물 세포 현탁액 또는 생물반응기가 또한 사용될 수 있지만 종종 세포의 단층 형태일 것이다. 온전한 글리코실화 단백질을 발현시킬 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주가 당업계에 개발되어 있고, 이러한 것은 COS-1(예컨대, ATCC CRL 1650), COS-7(예컨대, ATCC CRL-1651), HEK293, BHK21(예컨대, ATCC CRL-10), CHO(예컨대, ATCC CRL 1610, DG-44) 및 BSC-1(예컨대, ATCC CRL-26) 세포주, hepG2 세포, P3X63Ag8.653, SP2/0-Ag14, 293 세포, HeLa세포 등을 포함하고, 예컨대, American Type Culture Collection, Manassas, Va로부터 용이하게 입수할 수 있다. 바람직한 숙주 세포는 골수종 및 림프종 세포와 같은 림프종 유래 세포를 포함한다. 특히 바람직한 숙주 세포는 P3X63Ag8.653 세포(ATCC 수탁 번호 CRL-1580) 및 SP2/0-Ag14 세포(ATCC 수탁 번호 CRL-1851)이다.
이들 세포를 위한 발현 벡터는 이로 제한되는 것은 아니나 복제 원점; 프로모터[예컨대, 후기 또는 초기 SV40 프로모터, CMV 프로모터(예컨대, 미국 특허 번호 제 5,168,062호; 제 5,385,839호), HSV tk 프로모터, pgk(phosphoglycerate kinase, 포스포글리세레이트 키나아제) 프로모터, EF-1 알파 프로모터(예컨대, 미국 특허 번호 제 5,266,491호)], 적어도 하나의 인간 면역글로불린 프로모터; 인핸서, 및/또는 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이싱 부위, 폴리아데닐화 부위(예컨대, SV40 large T Ag 폴리 부가 부위)와 같은 처리 정보 부위, 및 전사 정지 서열과 같은 발현 조절 서열 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 예컨대, Ausubel et al., supra; Sambrook, et al., supra를 참조. 본 발명의 핵산 또는 단백질을 생산하는 데 유용한 다른 세포는 공지되거나/되었고, 예컨대 American Type Culture Collection Catalogue of Cell liness and Hybridomas(www.atcc.org) 또는 다른 공지 또는 시판원으로부터 입수할 수 있다.
진핵 숙주 세포를 사용하는 경우, 폴리아데닐화 또는 전사 정지 서열이 전형적으로 벡터에 도입된다. 정지 서열의 예는 소 성장 호르몬 유전자 유래의 폴리아데닐화 서열이다. 전사물을 정확히 스플라이싱하기 위한 서열이 또한 도입될 수 있다. 스플라이싱 서열의 예는 SV40(Sprague, et al., J. Virol. 45: 773-781(1983)) 유래의 VP1 인트론이다. 추가적으로, 숙주 세포에서 복제를 조절하는 유전자 서열이 당업계에 공지된 바에 따라 벡터에 도입될 수 있다.
GLP -1 모방체 또는 이의 특정 부분 또는 변이체의 정제. GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체는 이로 제한되는 것은 아니나 단백질 A 정제, 암모늄 설페이트 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하는 공지 방법에 의해 재조합 세포로부터 회수 및 정제될 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피(High performance liquid chromatography; "HPLC")가 또한 정제에 사용될 수 있다. 예컨대, Colligan, Current Protocols in Immunology, 또는 Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2003), 예를 들어, Chapters 1, 4, 6, 8, 9, 10을 참조, 각각의 전체는 본 명세서에 참고로서 포 함된다.
본 발명의 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체는 자연적으로 정제된 산물, 화학 합성 방법에 의한 산물, 및 예컨대, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유동물 세포를 포함하는 진핵 숙주로부터 재조합 기술에 의해 제조된 산물을 포함한다. 재조합 제조 방법에 사용되는 숙주에 따라, 본 발명의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체는 글리코실화되거나 비-글리코실화될 수 있지만, 글리코실화되는 것이 바람직하다. 이런 방법은 Sambrook, supra, Sections 17.37-17. 42; Ausubel, supra, Chapters 10, 12 ,13 ,16, 18 및 20, Colligan, Protein Science, supra, Chapters 12-14과 같은 많은 표준 실험 메뉴열에 기재되어 있고, 전체 내용이 본 명세서에 참고로서 포함된다.
모방체 , 특정 단편 및/또는 변이체 . 본 발명의 분리된 모방체는 보다 자세히 논의될 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 어느 하나에 의해 코딩되는 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체, 또는 어느 분리된 또는 제조된 GLP-1 모방체 또는 이의 특정 부분 또는 변이체를 포함한다.
바람직하게, GLP-1 모방체 또는 리간드-결합 부분 또는 변이체는 적어도 하나의 GLP-1 단백질 리간드에 결합함으로써, 상응하는 단백질 또는 이의 단편의 적어도 하나의 GLP-1 생물학적 활성을 제공한다. 다른 치료 또는 진단상 중요한 단백질이 당업계에 알려져 있고, 그런 단백질의 적절한 분석법 또는 생물학적 활성이 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명에 따른 적합한 GLP-1 펩티드, 변이체 및 유도체의 비제한적인 예는 서열 번호 1로 예시된다: His-Xaa2-Xaa3-Gly-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-XaalO- Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Phe-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Xaa30-Xaa31, 여기에서: Xaa2는 Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, 또는 Lys이고; Xaa3는 Glu, Asp, 또는 Lys이며; Xaa5는 Thr, Ala, Gly, Ser, Leu, Ile, Val, Arg, His, Glu, Asp, 또는 Lys이고; Xaa6는 Phe, His, Trp, 또는 Tyr이며; Xaa7은 Thr 또는 Asn이고; Xaa8은 Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, 또는 Lys이며; Xaa9는 Asp 또는 Glu이고; Xaa1O은 Val, Gln, His, Glu, 또는 Lys이며; Xaa11은 Ser, Val, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Glu, Asp, 또는 Lys이고; Xaa12는 Ser, Val, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Glu, Asp 또는 Lys이며; Xaa13은 Tyr, Gln, His, Glu, 또는 Lys이고; Xaa14는 Leu, Gln, His, Glu, 또는 Lys이며; Xaa15는 Glu, Ala, Thr, Ser, Gly, Gln, Asp 또는 Lys이고; Xaa16은 Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Gln, Asn, Arg, Cys, Glu, Asp 또는 Lys이며; Xaa17은 Gln, Asn, Arg, His, Glu, Asp 또는 Lys이고; Xaa18은 Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Arg, Glu, Asp 또는 Lys이며; Xaa19는 Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Met, Glu, Asp 또는 Lys이고; Xaa20은 Lys, Arg, His, Gln, Trp, Tyr, Phe, Glu 또는 Asp이며; Xaa21은 Glu, Leu, Ala, His, Phe, Tyr, Trp, Arg, Gln, Thr, Ser, Gly, Asp 또는 Lys이고; Xaa23은 Ile, Ala, Val, Leu 또는 Glu이며; Xaa24는 Ala, Gln, His, Glu, 또는 Lys이고; Xaa25는 Trp, Phe, Tyr, Glu, Asp 또는 Lys이며; Xaa26은 Leu, Gly, Ala, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp 또는 Lys이고; Xaa27은 Val, Gln, His, Glu, 또는 Lys이며; Xaa28은 Lys, Asn, Arg, His, Glu 또는 Asp이고; Xaa29은 Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Arg, Trp, Tyr, Phe, Pro, His, Glu, Asp 또는 Lys이며; Xaa30은 Arg, His, Thr, Ser, Trp, Tyr, Phe, Glu, Asp 또는 Lys이고; Xaa31은 Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Arg, Trp, Tyr, Phe, His, Glu, Asp, Lys이다.
GLP-1 펩티드, 변이체 또는 유도체의 바람직한 다른 그룹은 서열 번호 6으로 예시된다: His-Xaa2-Xaa3-Gly-Thr-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa1O-Ser-Xaa12-Tyr- Xaa14-Glu-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Lys-Xaa21-Phe-Xaa23-Ala-Trp-Leu-Xaa27-Xaa28-Gly-Xaa30, 여기에서: Xaa2는 Ala, Gly, 또는 Ser이고; Xaa3은 Glu 또는 Asp이며; Xaa6은 Phe 또는 Tyr이고; Xaa7은 Thr 또는 Asn이며; Xaa8은 Ser, Thr 또는 Ala이고; Xaa9는 Asp 또는 Glu이며; Xaa1O은 Val, Gln, His, Glu, 또는 Lys이고; Xaa12는 Ser 또는 Lys이며; Xaa14는 Leu, Gln, His, Glu, 또는 Lys이고; Xaa16은 Gly, Ala, Glu 또는 Asp이며; Xaa17은 Gln 또는 Glu이고; Xaa18은 Ala 또는 Lys이며; Xaa19은 Ala, Val, Ile, Leu 또는 Met이고; Xaa21은 Glu 또는 Leu이며; Xaa23은 Ile, Ala, Val, Leu 또는 Glu이고; Xaa24는 Ala, Gln, His, Glu, 또는 Lys이며; Xaa27은 Val, Gln, His, Glu, 또는 Lys이고; Xaa28은 Lys 또는 Asn이며; Xaa30은 Arg 또는 Glu이다.
이러한 펩티드는 공지된 방법 및/또는 본 명세서에 개시된 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 서열 중의 Xaa(본 명세서에서, 특정 예로 지시되지 않는 한)는 특정 아미노산 잔기, 이의 유도체 또는 변형된 아미노산을 포함한다. 효소, 디펩 티딜-펩티다아제 IV(dipeptidyl-peptidase IV; DPP-IV)가 투여된 GLP-1, GLP-1 펩티드, 호몰로그, 유사체 및 유도체에 대해 관찰된 빠른 생체 내 불활성화의 원인일 수 있으므로, 본 명세서에 기재된 모방체를 DPP-IV의 활성으로부터 보호하는 것이 바람직하다.
적어도 하나의 GLP-1 생물학적 활성을 부분적으로 또는 바람직하게는 실질적으로 제공하는 GLP-1 모방체, 또는 이의 특정 부분 또는 변이체는 GLP-1 리간드에 결합함으로써, GLP-1과 적어도 하나의 리간드, 예컨대, GLP-1 수용체의 결합에 의해, 또는 다른 단백질-의존 또는 매개 메카니즘을 통해 매개되는 적어도 하나의 다른 활성을 제공할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "GLP-1 모방체 활성"은 분석에 따라 다르지만 GLP-1 모방체가 적어도 하나의 GLP-1 의존 활성을 약 20-10,000%, 바람직하게는 적어도 약 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000% 이상으로 조절하거나 야기할 수 있는 것을 지칭한다.
적어도 하나의 단백질-의존 활성을 제공하는 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체의 용량(capacity)은 공지된 방법 및/또는 본 명세서에 기재된 방법에 따라 적어도 하나의 적합한 단백질 생물학적 분석에 의해 바람직하게 분석될 수 있다. 본 발명의 인간 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체는 어떤 클래스(IgG, IgA, IgM, 등) 또는 아이소타입과도 유사할 수 있고, 카파 또는 람다 경쇄의 적어도 한 부분을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 인간 GLP-1 모방체 또는 특 정 부분 또는 변이체는 예컨대, 적어도 하나의 아이소타입, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 IgG 중쇄 가변 단편, 힌지 영역, CH2 및 CH3를 포함한다.
본 발명의 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체는 적어도 하나의 리간드, 서브유니트, 단편, 부분 또는 이의 임의의 조합에 결합한다. 본 발명의 적어도 하나의 GLP-1 모방체, 특정 부분 또는 변이체의 적어도 하나의 GLP-1 펩티드, 변이체 또는 유도체는 임의로 상기 리간드의 적어도 하나의 특정 에피토프에 결합할 수 있다. 상기 결합 에피토프는 GLP-1 수용체 또는 이의 부분과 같은 단백질 리간드 인접 아미노산 서열의 적어도 1-3개 아미노산 내지 전체 특정 부분 중의 적어도 하나의 아미노산 서열의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
이런 모방체는 공지의 재조합 DNA 기술을 이용하여 GLP-1 모방체를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 분자를 제조 및 발현시키거나 화학 합성과 같은 다른 임의의 적합한 방법을 이용함으로써, 공지 기술을 사용하여 화학식 (I)의 GLP-1 모방체의 다양한 부분을 함께 연결함으로써 제조될 수 있다.
인간 GLP-1 리간드, 예컨대, 수용체에 결합하고, 정의된 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 또는 이의 부분을 포함하는 모방체는 공지된 바에 따라 파지 디스플레이 (Katsube, Y., et al., Int J Mol . Med, 1(5):863-868 (1998)) 또는 트랜스제닉 동물을 사용하는 방법과 같은 적합한 방법을 사용하여 제조될 수 있다. GLP-1 모방체, 특정 부분 또는 변이체는 적합한 숙주 세포에서 코딩 핵산 또는 이의 부분을 이용하여 발현될 수 있다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 서 열의 아미노산을 포함하는 모방체, 리간드-결합 단편 및 면역글로불린 사슬에 관한 것이다. 바람직하게, 이런 모방체 또는 이의 리간드-결합 단편은 인간 GLP-1 리간드, 예컨대, 수용체와 높은 친화도로 결합할 수 있다(예컨대, 약 10-7 M 이하의 KD). 본 명세서에 기재된 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열은 보존적 아미노산 치환, 및 아미노산 결실 및/또는 삽입을 가지는 서열을 포함한다. 보존적 아미노산 치환은 첫번째 아미노산이 화학적 및/또는 물리적 성질(예컨대, 전하, 구조, 극성, 소수성/친수성)이 첫번째 아미노산과 유사한 두번째 아미노산으로 대체되는 것을 지칭한다. 보존적 치환은 다음 그룹 내에서 한 아미노산이 다른 아미노산으로 대체되는 것을 포함한다: 리신(K), 아르기닌(R) 및 히스티딘(H); 아스파테이트(D) 및 글루타메이트(E); 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 티로신(Y), K, R, H, D 및 E; 알라닌(A), 발린(V), 류신(L), 이소류신(I), 프롤린(P), 페날알라닌(F), 트립토판(W), 메티오닌(M), 시스테인(C) 및 글리신(G); F, W 및 Y; C, S 및 T.
아미노산 코드. 본 발명의 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체를 구성하는 아미노산은 종종 약칭된다. 아미노산 명명은 상기 아미노산을 그의 한글자 코드, 세글자 코드, 명칭, 또는 삼 뉴클레오티드 코돈(들)으로 지정하는 것에 의해 지시될 수 있고, 이는 당업계에 잘 알려져 있다(Alberts, B., et al., Molecular Biology of The Cell, Third Ed., Garland Publishing, Inc., New York, 1994 참 조).
한 글자 코드 세 글자 코드 명칭 세 뉴클레오티드 코돈(들)
A Ala 알라닌 GCA, GCC, GCG, GCU
C Cys 시스테인 UGC, UGU
D Asp 아스파르트산 GAC, GAU
E Glu 글루탐산 GAA, GAG
F Phe 페닐알라닌 UUC, UUU
G Gly 글리신 GGA, GGC, GGG, GGU
H His 히스티딘 CAC, CAU
I Ile 이소류신 AUA, AUC, AUU
K Lys 라이신 AAA, AAG
L Leu 류신 UUA, UUG, CUA, CUC, CUG, CUU
M Met 메티오닌 AUG
N Asn 아스파라긴 AAC, AAU
P Pro 프롤린 CCA, CCC, CCG, CCU
Q Gln 글루타민 CAA, CAG
R Arg 아르기닌 AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGU
S Ser 세린 AGC, AGU, UCA, UCC, UCG, UCU
T Thr 트레오닌 ACA, ACC, ACG, ACU
V Val 발린 GUA, GUC, GUG, GUU
W Trp 트립토판 UGG
Y Tyr 티로신 UAC, UAU
본 발명의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체는 본 명세서에 기재된 바와 같이, 자연 돌연변이 또는 인간 조작에 의해 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 포함할 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 이러한 또는 다른 서열은 제한하는 것은 아니나, 서열 번호 47-64의 특정 부분에 상응하는 표 1에 제시된 다음 서열을 포함하고, 여기에서 상기 항체 서열의 부분 가변 영역은 이로 제한되는 것은 아니나 표 1에 기재된 적어도 하나의 서열 번호 47-55의 적어도 한 부분 또는 이의 단편일 수 있고, 임의로 2004년 6월 24일 출원되고, 2005년 1월 20일에 공개된 PCT 공보 WO 05/05604호(PCT US04/19898)의, 서열 번호 1-9에 상응하는 도 1-9에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 치환, 삽입 또는 결실을 추가로 포함할 수 있다. CH2, CH3 및 힌지 영역은 이로 제한되는 것은 아니나 표 1에 기재된 적어도 하나의 서열번호 56-64의 적어도 한 부분 또는 이의 단편일 수 있고, 임의로 2004년 6월 24일 출원되고, 2005년 1월 20일에 공개된 PCT 공보 WO 05/05604호(PCT US04/19898)의 서열 번호 32-40에 상응하는 도 32-40에 추가로 기재된 바와 같이 적어도 하나의 치환, 삽입 또는 결실을 추가로 포함할 수 있다. 당연히, 당업자가 만드는 아미노산 치환의 수는 상술한 것을 포함하는 많은 인자에 의해 달라질 것이다. 일반적으로, 적어도 하나의 GLP-1 모방체에 대한 아미노산 치환, 삽입 또는 결실의 수는 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 개 아미노산 이하이고, 예컨대 1-30 개 또는 본원에 기재한 바와 같은 임의의 범위 또는 그안의 값이다.
본 발명의 화학식 I, ((P(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)에서, 화학식 I에 따른 V, H, CH2, CH3 부분은 임의의 적합한 인간 또는 인간 적합성 서열일 수 있고, 예컨대, 표 1에 기재된 서열이며, 여기에서 상기 항체 서열의 부분 가변 영역은 이로 제한되는 것은 아니나, 표 1에 기재된 적어도 하나의 서열 번호 47-55의 적어도 한 부분 또는 이의 단편일 수 있고, 임의로 2004년 6월 24일 출원되고, 2005년 1월 20일에 공개된 PCT 공보 WO 05/05604호(PCT US04/19898)의, 서열번호 1-9에 상응하는 도 1-9에 추가로 기재된 바와 같이 적어도 하나의 치환, 삽입 또는 결실을 추가로 포함할 수 있고; 여기에서, CH2, CH3 및 힌지 영역은 이로 제한되는 것은 아니나 표 1에 기재된 적어도 하나의 서열번호 56-64의 적어도 한 부분 또는 이의 단편일 수 있고, 임의로 2004년 6월 24일 출원되고, 2005년 1월 20일에 공개된 PCT 공보 WO 05/05604호(PCT US04/19898)의, 서열번호 32-40에 상응하는 도 32- 40에 추가로 기재된 바와 같이 적어도 하나의 치환, 삽입 또는 결실을 추가로 포함할 수 있거나, 공지의 것이거나, 또는 이의 임의의 조합 또는 공통 서열, 또는 이의 임의의 융합 단백질, 바람직하게는, 인간 기원 또는 인간에게 투여시 면역원성을 최소화시키도록 설계된 것일 수 있다.
P 부분은 이에 제한되는 것은 아니나 서열 번호 1에 기재된 것과 같은 당업계에 알려지거나 또는 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 GLP-1 치료 펩티드, 이의 임의의 조합 또는 이의 공통 서열, 또는 이의 임의의 융합 단백질을 포함할 수 있다. 바람직한 구체적인 예에서, P 부분은 적어도 하나의 서열 번호 6의 서열을 가지는 적어도 하나의 GLP-1 펩티드, 또는 이의 임의의 조합 또는 이의 공통 서열, 또는 이의 임의의 융합 단백질을 포함할 수 있다.
임의의 링커 서열은 당업계에 알려진 임의의 적합한 펩티드 링커일 수 있다. 바람직한 서열은 G 및 S의 임의의 조합을 포함하며, 예컨대, X1-X2-X3-X4-...-Xn, 여기에서 X는 G 또는 S이고, n은 5-30일 수 있다. 비제한적인 예가 GS, GGS, GGGS(서열 번호 16), GSGGGS(서열 번호 17), GGSGGGS(서열 번호 18), GGSGGGSGG(서열 번호 19) 및 GGGSGGGSGG(서열 번호 20) 등을 포함한다.
기능에 필수적인 본 발명의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체의 아미노산은 부위-지정 돌연변이유발(site-directed mutagenesis) 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발(예컨대, Ausubel, supra, Chapters 8,15; Cunningham and Wells, Science 244: 1081-1085 (1989))와 같은 공지 방법에 의해 확인될 수 있다. 후자의 방법은 분자 내의 각 잔기에 단일 알라민 돌연변이를 도입한다. 형성된 돌연변 이 분자를 그 후 이로 제한되는 것은 아니나 본원에 기재되거나 공지된 적어도 하나의 단백질 관련 활성과 같은 생물학적 활성에 대해 시험한다. GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체 결합에 중요한 부위는 결정화, 핵 자기 공명, 또는 광친화성 표지(Smith, et al., J. Mol. Biol. 224: 899-904 (1992) and de Vos, et al., Science 255: 306-312 (1992))와 같은 구조 분석에 의해 또한 확인할 수 있다.
본 발명의 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체는 화학식 (I)의 P 부분으로서 이로 제한되는 것은 아니나 적어도 하나의 서열 번호 1 및 6의 적어도 한 부분을 포함할 수 있다. 임의로 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체는 화학식 (I)의 P 부분으로서 적어도 하나의 폴리펩티드의 적어도 하나의 기능성 부분, 적어도 하나의 서열 번호 1 및 6의 적어도 90-100%를 추가로 포함할 수 있다. 적어도 하나의 상기 활성을 증진시키거나 유지시킬 수 있는 비제한적인 변이체는 이로 제한되는 것은 아니나 임의의 상기 폴리펩티드를 포함하고, 상기 GLP-1 모방체의 적합한 생물학적 활성 또는 기능에 실질적으로 영향을 주지 않은 적어도 하나의 치환, 삽입 또는 결실에 상응하는 적어도 하나의 돌연변이를 추가로 포함한다.
한 구체예에서, P 아미노산 서열, 또는 이의 부분은 적어도 하나의 서열 번호 1 및 6의 상응하는 부분의 상응하는 아미노산 서열에 대해 약 90-100% 상동성(즉, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값)을 가진다. 바람직하게, 90-100% 아미노산 상동성(즉, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값)은 공지된 적합한 컴 퓨터 알고리즘을 이용해서 결정된다.
본 발명의 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체는 본 발명의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체로부터 인접한 아미노산 잔기를 임의의 수로 포함할 수 있고, 여기에서 상기 수는 GLP-1 모방체 내의 인접 잔기 수의 10-100%로 구성된 정수 그룹으로부터 선택된다. 임의로, 인접 아미노산의 서브서열(subsequence)은 길이가 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 이상의 아미노산, 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값이다. 또한, 상기 서브서열의 수는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상과 같이 1 내지 20으로 구성된 그룹으로부터 선택된 임의의 정수일 수 있다.
당업자가 예측할 수 있듯이, 본 발명은 적어도 하나의 생물학적으로 활성인 본 발명의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체를 포함한다. 생물학적으로 활성인 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체는 본래(비-합성), 내인성 또는 관련 및 공지의 삽입된 또는 융합 단백질 또는 특정 부분 또는 변이체의 활성에 비해 적어도 20%, 30%, 또는 40%, 바람직하게는 적어도 50%, 60%, 또는 70% 및 가장 바람직하게는 적어도 80%, 90%, 또는 95%-1000%의 특정 활성을 가진다. 효소 활성 및 기질 특이성을 분석하고 정량 측정하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
다른 측면으로, 본 발명은 본 명세서에 기재한 바와 같이 유기 모이어티의 공유 결합에 의해 변형된 인간 모방체 및 리간드-결합 단편에 관한 것이다. 이런 변형은 개선된 약동학적 성질(예컨대, 증가된 생체 내 혈청 반감기)을 가진 GLP-1 모방체 또는 리간드-결합 단편을 제조할 수 있다. 유기 모이어티는 선형 또는 분지형 친수성 폴리머 그룹, 지방산 그룹 또는 지방산 에스테르 그룹일 수 있다. 특별한 구체예에서, 친수성 폴리머 그룹은 약 800 내지 약 120,000 달톤의 분자량을 가질 수 있고, 폴리알칸 글리콜[예컨대, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜(PPG)], 탄수화물 폴리머, 아미노산 폴리머 또는 폴리비닐 피롤리돈일 수 있으며, 지방산 또는 지방산 에스테르 그룹은 약 8 내지 약 40 개의 탄소 원자를 함유할 수 있다.
본 발명의 변형된 모방체 및 리간드-결합 단편은 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체에 직접 또는 간접적으로 공유 결합된 하나 이상의 유기 모이어티를 포함할 수 있다. 본 발명의 GLP-1 모방체 또는 리간드-결합 단편에 결합된 각 유기 모이어티는 독립적으로 친수성 폴리머 그룹, 지방산 그룹 또는 지방산 에스테르 그룹일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "지방산"은 모노-카복실산 및 디-카복실산을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "친수성 폴리머 그룹"은 옥탄보다 물에 가용성인 유기 폴리머를 지칭한다. 예컨대, 폴리라이신은 옥탄보다 물에 가용성이다. 따라서, 폴리라이신의 공유 결합에 의해 변형된 GLP-1 모방체는 본 발명에 포함된다. 본 발명의 모방체를 변형하는데 적합한 친수성 폴리머는 선형 또는 분지형일 수 있고, 예컨대, 폴리알칸 글리콜[예컨대, PEG, 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜(mPEG), PPG 등], 탄수화물(예컨대, 덱스트란, 셀룰로스, 올리고사카라이드, 폴리사카라이 드 등), 친수성 아미노산의 폴리머(예컨대, 폴리라이신, 폴리아르기닌, 폴리아스파테이트 등), 폴리알칸 옥사이드(예컨대, 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리프로필렌 옥사이드 등) 및 폴리비닐 피롤리돈을 포함한다. 바람직하게, 본 발명의 GLP-1 모방체를 변형시키는 친수성 폴리머는 약 800 내지 약 150,000 달톤의 분자량을 분리된 분자의 실체로서 가진다. 예컨대, PEG2500, PEG5000, PEG7500, PEG9000 , PEG10000, PEG12500, PEG15000, 및 PEG20000이 사용될 수 있으며, 여기에서 하첨자는 달톤으로 표시한 폴리머의 평균 분자량이다.
친수성 폴리머 그룹은 1 내지 약 6개의 알킬, 지방산 또는 지방산 에스테르 그룹으로 치환될 수 있다. 지방산 또는 지방산 에스테르 그룹으로 치환되는 친수성 폴리머는 적합한 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 예컨대, 아민 그룹을 함유하는 폴리머가 지방산 또는 지방산 에스테르의 카복실레이트에 커플링될 수 있고, 지방산 또는 지방산 에스테르 상의 활성화된 카복실레이트(예컨대, N,N-카보닐 디이미다졸로 활성화)는 폴리머 상의 하이드록실 그룹에 커플링될 수 있다.
본 발명의 모방체를 변형시키는데 적합한 지방산 및 지방산 에스테르는 포화될 수 있거나 하나 이상의 불포화 단위를 함유할 수 있다. 본 발명의 모방체를 변형시키는데 적합한 지방산은 예컨대, n-도데카노에이트(C12, 라우레이트), n-테트라데카노에이트(C14, 미리스테이트), n-옥타데카노에이트(C18, 스테아레이트), n-에이코사노에이트(C20, 아라키데이트), n-도코사노에이트(C22, 베헤네이트), n-트리아콘 타노에이트(C30), n-테트라콘타노에이트(C40), 시스-△9-옥타데카노에이트(C18, 올레에이트), 모든 시스-△5,8,11,14-에이코사테트라에노에이트(C20, 아라키도네이트), 옥탄디오익 산, 테트라데칸디오익 산, 옥타데칸디오익 산, 도코산디오익 산 등을 포함한다. 적합한 지방산 에스테르는 선형 또는 분지형 저급 알킬 그룹을 가지는 디카복실산의 모노에스테르를 포함한다. 저급 알킬 그룹은 1 내지 약 12개, 바람직하게는 1 내지 약 6개의 탄소 원자를 포함한다.
변형된 인간 모방체 및 리간드-결합 단편은 하나 이상의 변형제와 반응시키는 것과 같은 적합한 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "변형제"는 활성화 그룹을 포함하는 적합한 유기 그룹(예컨대, 친수성 폴리머, 지방산, 지방산 에스테르)을 지칭한다. "활성화 그룹"은 적당한 조건하에 두번째 화학 그룹과 반응할 수 있는 화학 모이어티 또는 작용기이고, 이에 의해 변형제 및 두번째 화학 그룹 사이에 공유 결합을 형성한다. 예컨대, 아민-반응성 활성화 그룹은 토실레이트, 메실레이트, 할로(클로로, 브로모, 플루오로, 요오도), N-하이드록시숙신이미딜 에스테르(NHS) 등과 같은 친전자성 그룹을 포함한다. 티올과 반응할 수 있는 활성화 그룹은 예컨대, 말레이미드, 요오도아세틸, 아크릴롤릴, 피리딜 디설피드, 5-티올-2-니트로벤조산 티올(TNB-티올) 등을 포함한다. 알데하이드 작용기는 아민- 또는 하이드라지드-함유 분자와 커플링될 수 있고, 아지드 그룹은 3가 포스포러스 그룹과 반응하여 포스포르아미데이트 또는 포스포르이미드 결합을 형성할 수 있다. 활성화 그룹을 분자 내에 도입하는 적합한 방법은 당업계에 알려져 있 다(예컨대, Hermanson, G.T., Bioconjugate Techtaiques, Academic Press: San Diego, CA (1996)). 활성화 그룹은 유기 그룹(예컨대, 친수성 폴리머, 지방산, 지방산 에스테르)에 직접 연결되거나, 예컨대 하나 이상의 탄소 원자가 산소, 질소 또는 황과 같은 헤테로원자에 의해 대체될 수 있는 2가 C1-C12 그룹과 같은 링커 모이어티를 통해 연결될 수 있다. 적합한 링커 모이어티는, 예컨대, 테트라에틸렌 글리콜, -(CH2)3-, -NH-(CH2)6-NH-, -(CH2)2-NH- 및 -CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH-NH-를 포함한다. 링커 모이어티를 포함하는 변형제는 예컨대, 모노-Boc-알킬디아민(예컨대, 모노-Boc-에틸렌디아민, 모노-Boc-디아미노헥산)과 지방산을 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC)의 존재 하에 반응시켜 유리 아민과 지방산 카복실레이트 사이에 아미드 결합을 형성시킴으로써 제조될 수 있다. Boc 보호기는 트리플루오로아세트산(TFA)으로 처리하여 생성물로부터 제거됨으로써, 본 명세서에 기재된 다른 카복실레이트와 커플링되거나, 말레 무수물과 반응할 수 있는 1차 아민을 노출시킬 수 있고, 얻은 생성물은 환화하여 지방산의 활성화된 말레이미도 유도체를 생성한다(예컨대, Thompson, et al., WO 92/16221 참조, 참고로 본원에 전체로서 포함됨).
본 발명의 변형된 모방체는 인간 GLP-1 모방체 또는 리간드-결합 단편을 변형제와 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 예컨대, 유기 모이어티는 PEG의 NHS 에스테르와 같은 아민-반응성 변형제를 이용함으로써 비-위치 특이적 방식으로 GLP-1 모방체에 결합될 수 있다. 변형된 인간 모방체 또는 리간드-결합 단편은 또한 GLP-1 모방체 또는 리간드-결합 단편의 이황화 결합(예컨대, 사슬 내 이황화 결합)을 환원시킴으로써 제조될 수 있다. 환원된 GLP-1 모방체 또는 리간드-결합 단편은 그 후 티올-반응성 변형제와 반응하여 본 발명의 변형된 GLP-1 모방체를 형성할 수 있다. 본 발명의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체의 특정 부위에 결합하는 유기 모이어티를 포함하는 변형된 인간 모방체 및 리간드-결합 단편은 역 단백질 분해(reverse proteolysis)[Fisch et al ., Bioconjugate Chem., 3: 147-153 (1992); Werlen et al ., Bioconjugate Chem., 5: 411-417 (1994); Kumaran et al ., Protein Sci . 6(10): 2233-2241 (1997); Itoh et al ., Bioorg . Clzem., 24(1): 59-68 (1996); Capellas et al ., Biotechnol . Bioeng., 56(4): 456-463 (1997)], 및 문헌 [Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)]에 기재된 방법과 같은 적합한 방법을 이용해서 제조될 수 있다.
GLP -1 모방체 조성물. 본 발명은 또한 본원에 기재 및/또는 공지된 바와 같이 비-자연 발생 조성물, 혼합물 또는 형태로 제공되는 적어도 하나, 적어도 두개, 적어도 세개, 적어도 네개, 적어도 다섯개, 적어도 여섯개 이상의 모방체 또는 이의 특정 부분 또는 변이체를 포함하는 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체 조성물을 제공한다. 상기 조성물 퍼센트는 공지되거나 본원에 기재된 바와 같이 액체 또는 건조 용액, 혼합물, 현탁액, 에멀젼 또는 콜로이드로서 중량, 부피, 농도, 몰 또는 몰랄에 의한 것이다.
상기 조성물은 공지되거나 본원에 기재된 바와 같이 액체, 가스, 또는 건조 용액, 혼합물, 현탁액, 에멀젼 또는 콜로이드로서 중량, 부피, 농도, 몰, 또는 몰랄에 의한 0.00001-99.9999%를 포함할 수 있고, 이로 제한되는 것은 아니나 0.00001, 0.00003, 0.00005, 0.00009, 0.0001, 0.0003, 0.0005, 0.0009, 0.001, 0.003, 0.005, 0.009, 0.01, 0.02, 0.03, 0.05, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.3, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8, 99.9%과 같이 상기 범위의 임의의 범위 또는 값을 가질 수 있다. 따라서, 본 발명의 상기 조성물은 이로 제한되는 것은 아니나, 0.00001-100 mg/㎖ 및/또는 0.00001-100 mg/g을 포함한다.
조성물은 임의로 적어도 하나의 당뇨병 또는 인슐린 대사 관련 약물, 항감염제, 심혈관(CV)계 약물, 중추 신경계(CNS) 약물, 자율 신경계(ANS) 약물, 기도 약물, 위장(GI)관 약물, 호르몬 약물, 체액 또는 전해질 균형 약물, 혈액 약물, 항신생물제, 면역 조절 약물, 눈, 귀 또는 코 약물, 국소 약물, 영양제 등으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물 또는 단백질의 유효량을 추가로 포함한다. 이런 약물은 당업계에 잘 알려져 있고, 각각에 대한 제제, 지시, 용량 및 투여가 본원에 제 시되어 있다(예컨대, Nursing 2001 Handbook of Drugs, 21st edition, Springhouse Corp., Springhouse, PA, 2001; Health Professional's Drug Guide 2001, ed., Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River, NJ; Pharmcotherapy Handbook, Wells et al., ed., Appleton & Lange, Stamford, CT 참조, 각각의 전체 내용이 본 명세서에 참고로서 포함됨).
당뇨병 관련 약물은 적어도 하나의 글리타존, 인슐린 및 유도체, 설포닐우레아, 메글리티니드, 비구아니드, 알파-글루코시다제 억제제, 단백질 티로신 포스파타제-1B, 글리코겐 신타아제 키나아제 3, 글루코네오제네시스 억제제, 피루베이트 데하이드로제나아제 키나아제(PDH) 억제제, 리포라이시스 억제제, 지방 산화 억제제, 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라아제 I 및/또는 II 억제제, 베타-3 아드레노셉터 작용제, 소듐 및 포도당 코트랜스포터(SGLT) 억제제, 또는 다음 중 적어도 하나의 하나 이상에 대해 작용하는 화합물일 수 있다: T-세포의 자가면역 억제, 면역 조절, 활성화, 증식, 이주 및/또는 억제 세포 기능, T 세포 수용체/펩티드/MHC-II 상호작용의 억제, T 세포 아네르기의 유도, 자가반응 T 세포의 결실, 혈액 뇌 장벽을 통한 트래픽킹(trafficking)의 감소, 전-염증(Th1) 및 면역조절(Th2) 사이토카인 밸랜스의 변경, 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제의 억제, 신경보호, 신경아교증의 감소, 재-마이엘린화(myelination)의 촉진.
항감염제는 아메바구제제 또는 항원충제, 구충제, 항진균제, 항말라리아제, 항결핵제 또는 항나병제, 아미노글리코시드, 페니실린, 세팔로스포린, 테트라사이 클린, 설폰아미드, 플루오로퀴놀론, 항바이러스제, 마크로라이드 항-감염제 및 기타 항-감염제로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. CV 약물은 수축 촉진제, 항부정맥약, 항협심증제, 항고혈압제, 항지혈증제 및 기타 심혈관 약물로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. CNS 약물은 비마약 진통제로부터 선택된 적어도 하나이거나, 해열제, 비스테로이드 항-염증 약물, 마약 또는 오피오이드 진통제, 진정-수면제, 항경련제, 항우울제, 항불안제, 항정신병제, 중추 신경계 흥분제, 항파킨슨병약 및 기타 중추신경계 약물로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. ANS 약물은 콜린성 제제(부교감 흥분제), 항콜린성 제제, 아드레날린성 약(교감신경 흥분제), 아드레날린 차단제(부교감 신경 억제제), 골격근 이완제, 신경 근육 차단제로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 기도 약물은 항히스타민제, 기관지 확장제, 거담제 또는 진해제 및 기타 호흡 약물로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. GI 관 약물은 제산제, 흡착제, 고창 방지제, 소화 효소, 담석 가용화제, 지사제, 설사제, 항구토제 및 항궤양제 약물로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 호르몬 약물은 코르티코스테로이드, 안드로겐, 동화대사 스테로이드, 에스트로겐, 프로게스틴, 고나도트로핀, 당뇨병약, 적어도 하나의 글루카곤, 티로이드 호르몬, 티로이드 호르몬 길항제, 뇌하수체 호르몬 및 파라티로이드-유사 약물로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 체액 및 전해질 평형을 위한 약물은 이뇨제, 전해질, 대체 용액, 산성화제 및 알카릴화제로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 혈액 약물은 조혈제, 항응고제, 혈액 유도체, 혈전 효소로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 항신생물제는 알킬화제, 항대사제, 항생 항신생물제, 호르몬 균형을 바꾸는 항신생물제 및 기타 항신생물제로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 면역조절 약물은 면역억제제, 백신, 변성독소, 항독소, 항뱀독소, 면역 혈청 및 생물학적 반응 조절자로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 눈, 귀, 및 코 약물은 눈 항-감염제, 눈 항-염증제, 축동제, 동공확대제, 눈 혈관 수축제 및 기타 눈, 귀, 코 약물로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 국소 약물은 국소 항-감염제, 옴약, 이살충제 및 국소 코르티코스테로이드로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 영양제는 비타민, 미네랄 및 칼로릭스(calorics)로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 예컨대, Nursing 2001 Drug Handbook , supra의 내용을 참조.
적어도 하나의 아메바구제제 또는 항원충제는 아토바쿠온, 클로로퀸 하이드로클로라이드, 클로로퀸 포스페이트, 메트로니다졸, 메트로니다졸 하이드로클로라이드 및 펜타미딘 이세티오네이트로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 구충제는 메벤다졸, 피란텔 파모에이트 및 티아벤다졸로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 항진균제는 암포테리신 B, 암포테리신 B 콜레스테릴 설페이트 복합체, 암포테리신 B 지질 복합체, 암포테리신 B 리포소말, 플루코나졸, 플루시토신, 그리세오풀빈 마이크로사이즈, 그리세오풀빈 울트라마이크로사이즈, 이트라코나졸, 케토코나졸, 니스태틴, 테르비나핀 하이드로클로라이드로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 항말라리아제는 클로로퀸 하이드로클로라이드, 클로로퀸 포스페이트, 독시사이클린, 하이드록시클로로퀸 설페이트, 메플로퀸 하이드로클로라이드, 프리마퀸 포스페이트, 피리메타민 및 설파독신과의 피리메타민으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 항결핵제 또는 항나병약은 클로파지민, 사이클로세린, 다프손, 에탐부톨 하이드로클로라이드, 이소니아지드, 피라지나미드, 리파부틴, 리팜핀, 리파펜틴, 스트렙토마이신 설페이트로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 아미노글리코시드는 아미카신 설페이트, 젠타미신 설페이트, 네오마이신 설페이트, 스트렙토마이신 설페이트, 토브라마이신 설페이트로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 페니실린은 아목실린/클라불라네이트 포타슘, 아목시실린 트리하이드레이트, 앰피실린, 앰피실린 소듐, 앰피실린 트리하이드레이트, 앰피실린 소듐/술박탐 소듐, 클록사실린 소듐, 디클록사실린 소듐, 메즐로실린 소듐, 나프실린 소듐, 옥사실린 소듐, 페니실린 G 벤자틴, 페니실린 G 포타슘, 페니실린 G 프로카인, 페니실린 G 소듐, 페니실린 V 포타슘, 피페라실린 소듐, 피페라실린 소듐/타조박탐 소듐, 티카르실린 디소듐 및 티카르실린 디소듐/클라불라네이트 포타슘으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 세팔로스포린은 적어도 하나의 세파클로르, 세파드록실, 세파졸린 소듐, 세프디니르, 세페핌 하이드로클로라이드, 세픽심, 세프메타졸 소듐, 세포니시드 소듐, 세포페라존 소듐, 세포탁심 소듐, 세포테탄 디소듐, 세폭시틴 소듐, 세프포독심 프로세틸, 세프프로질, 세프타지딤, 세프티부텐, 세프티족심 소듐, 세프트리악손 소듐, 세푸록심 아젝틸, 세푸록심 소듐, 세팔렉신 하이드로클로라이드, 세팔렉신 모노하이드레이트, 세프라딘, 로라카르베프로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 테트라사이클린은 데메클로사이클린 하이드로클로라이드, 독시사이클린 칼슘, 독시사이클린 하이클레이트, 독시사이클린 하이드로클로라이드, 독시사이클린 모노하이드레이트, 미노사이클린 하이드로클로라이 드, 테트라사이클린 하이드로클로라이드로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 설폰아미드는 코-트리목사졸, 설파디아진, 설파메톡사졸, 설피속사졸, 설피속사졸 아세틸로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 플루오로퀴놀론은 알라트로플록사신 메실레이트, 시프로플록사신, 에녹사신, 레포플록사신, 로메플록사신 하이드로클로라이드, 날리딕식 산, 노르플록사신, 오플록사신, 스파르플록사신, 트로바플록사신 메실레이트로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 플루오로퀴놀론은 알라트로플록사신 메실레이트, 시프로플록사신, 에녹사신, 레포플록사신, 로메플록사신 하이드로클로라이드, 날리딕식 산, 노르플록사신, 오플록사신, 스파르플록사신, 트로바플록사신 메실레이트로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 항바이러스제는 아바카비르 설페이트, 아시클로비르 소듐, 아만타딘 하이드로클로라이드, 암프레나비르, 시도포비르, 델라비르딘 메실레이트, 디다노신, 에파비렌즈, 팜시클로비르, 포미비르센 소듐, 포스카르네트 소듐, 간시클로비르, 인디나비르 설페이트, 라미부딘, 라미부딘/지도부딘, 넬피나비르 메실레이트, 네비라핀, 오셀타미비르 포스페이트, 리바비린, 리마타딘 하이드로클로라이드, 리토나비르, 사퀴나비르, 사퀴나비르 메실레이트, 스타부딘, 발라시클로비르 하이드로클로라이드, 잘시타빈, 자나미비르, 지도부딘으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 마크로라인 항-감염제는 아지트로마이신, 클라리트로마이신, 디리트로마이신, 에리쓰로마이신 염기, 에리쓰로마이신 에스톨레이트, 에리쓰로마이신 에틸숙시네이트, 에리쓰로마이신 락토비오네이트, 에리쓰로마이신 스테아레이트로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 기타 항-감염제는 아즈트레오남, 바시트라신, 클로람페니콜 소듐 숙시네이트, 클리다마이신 하이드로클로라이드, 클린다마이신 팔미테이트 하이드로클로라이드, 클리단마이신 포스페이트, 이미페남 및 실라스타틴 소듐, 메로페넴, 니트로푸란토인 마크로크리스탈, 니트로푸란토인 마이크로크리스탈, 퀴누프리스틴/달포프리스틴, 스펙티노마이신 하이드로클로라이드, 트리메토프림, 반코마이신 하이드로클로라이드로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다(예컨대, Nursing 2001 Drug Handbook의 pp. 24-214 참조).
적어도 하나의 수축제는 암리논 락테이트, 디곡신, 밀리논 락테이트로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 항부정맥제는 아데노신, 아미오다론 하이드로클로라이드, 아트로핀 설페이트, 브레틸륨 토실레이트, 딜티아젬 하이드로클로라이드, 디소피라미드, 디소피라미드 포스페이트, 에스몰롤 하이드로클로라이드, 플레카이니드 아세테이트, 이부틸리드 푸마레이트, 리도카인 하이드로클로라이드, 멕실레틴 하이드로클로라이드, 모리시진 하이드로클로라이드, 페니토인, 페니토인 소듐, 프로카인아미드 하이드로클로라이드, 프로파페논 하이드로클로라이드, 프로프라놀롤 하이드로클로라이드, 퀴니딘 비설페이트, 퀴니딘 글루코네이트, 퀴니딘 폴리갈락투로네이트, 퀴니딘 설페이트, 소탈롤, 토카이니드 하이드로클로라이드, 베라파밀 하이드로클로라이드로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 항협심증제는 암로디핀 베실레이트, 아밀 니트리트, 베프리딜 하이드로클로라이드, 딜티아젬 하이드로클로라이드, 이소소르비드 디니트레이트, 이소소르비드 모노니트레이트, 나돌롤, 니카르디핀 하이드로클로라이드, 니페디핀, 니트로글리세 린, 프로프라놀롤 하이드로클로라이드, 베라파밀, 베라파밀 하이드로클로라이드로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 항고혈압제는 아세부톨롤 하이드로클로라이드, 암로디핀 베실레이트, 아테놀롤, 베나제프릴 하이드로클로라이드, 베탁솔롤 하이드로클로라이드, 비소프롤롤 푸마레이트, 칸데사르탄 실레섹틸, 캅토프릴, 카르테올롤 하이드로클로라이드, 카르베딜롤, 클로니딘, 클로니딘 하이드로클로라이드, 디아족사이드, 딜티아젬 하이드로클로라이드, 독사조신 메실레이트, 에날라프릴라트, 에날라프릴 말레이트, 에프로사르탄 메실레이트, 펠로디핀, 페놀도팜 메실레이트, 포시노프릴 소듐, 구아나벤즈 아세테이트, 구아나드렐 설페이트, 구안파신 하이드로클로라이드, 하이드랄라진 하이드로클로라이드, 이르베사르탄, 이스라디핀, 라베탈로 하이드로클로라이드, 리시노프릴, 로사르탄 포타슘, 메틸도파, 메틸도페이트 하이드로클로라이드, 메토프롤롤 숙시네이트, 메토프롤롤 타르트레이트, 미녹시딜, 모엑시프릴 하이드로클로라이드, 나돌롤, 니카르디핀 하이드로클로라이드, 니페디핀, 니솔디핀, 니트로푸르시드 소듐, 펜부톨롤 설페이트, 페린도프릴 에르부민, 펜톨라민 메실레이트, 핀돌롤, 프라조신 하이드로클로라이드, 프로파노익 하이드로클로라이드, 퀴나프릴 하이드로클로라이드, 라미프릴, 텔미사르탄, 테라조신 하이드로클로라이드, 팀몰롤 말레이트, 트란돌라프릴, 발사르탄, 베라파밀 하이드로클로라이드로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 항지혈증제는 아토르바스타틴 칼슘, 세리바스타틴 소듐, 콜레스티라민, 콜레스티폴 하이드로클로라이드, 페노피브레이트(미분화된), 플루바스타틴 소듐, 겜피브로질, 로바스타틴, 니아신, 프라바스타틴 소듐, 심바스타틴으로부터 선택된 적 어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 기타 CV 약물은 아브식시마브, 알프로스타딜, 아르부타민 하이드로클로라이드, 실로스타졸, 클로피도그렐 비설페이트, 디피리다몰, 엡티피바티드, 미도드린 하이드로클로라이드, 펜톡시필린, 티클로피딘 하이드로클로라이드, 티로피반 하이드로클로라이드로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다(예컨대, Nursing 2001 Drug Handbook의 pp. 215-336 참조).
적어도 하나의 비마약 진통제 또는 해열제는 아세트아미노펜, 아스피린, 콜린 마그네슘 트리살리실레이트, 디플루니살, 마그네슘 살리실레이트로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 비스테로이드 항-염증 약물은 셀레콕시브, 디클로페낙 포타슘, 디클로페낙 소듐, 에토돌락, 페노프로펜 칼슘, 플루비프로펜, 이부프로펜, 인도메타신, 인도메타신 소듐 트리하이드레이트, 케토프로펜, 케토로락 트로메타민, 나부메톤, 나프록센, 나프록센 소듐, 옥사프로진, 피록시캄, 로페콕시브, 설린닥으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 마약 또는 오피오이드 진통제는 알펜타닐 하이드로클로라이드, 부프레노르핀 하이드로클로라이드, 부토르파놀 타르트레이트, 코데인 포스페이트, 코데인 설페이트, 펜타닐 시트레이트, 펜타닐 경피 시스템, 펜타닐 경점막, 하이드로모르폰 하이드로클로라이드, 메페리딘 하이드로클로라이드, 메타돈 하이드로클로라이드, 모르핀 하이드로클로라이드, 모르핀 설페이트, 모르핀 타르트레이트, 날부핀 하이드로클로라이드, 옥시코돈 하이드로클로라이드, 옥시코돈 펙티네이트, 옥시모르폰 하이드로클로라이드, 펜타조신 하이드로클로라이드, 펜타조신 하이드로클로라이드 및 날록손 하이드로클로라이드, 펜타조신 락테이트, 프로폭시펜 하이드로클로라이드, 프로폭시펜 납 실레이트, 레미펜타닐 하이드로클로라이드, 수펜타닐 시트레이트, 트라마돌 하이드로클로라이드로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 진정-수면제는 클로랄 하이드레이트, 에스타졸람, 플루라제팜 하이드로클로라이드, 펜토바르비탈, 펜토바르비탈 소듐, 페노바르비탈 소듐, 세코바르비탈 소듐, 테마제팜, 트리아졸람, 잘레플론, 졸피뎀 타르트레이트로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 항경련제는 아세트아졸아미드 소듐, 카르밤아제핀, 클로나제팜, 클로라제페이트 디포타슘, 디아제팜, 디발프로엑스 소듐, 에토숙시미드, 포스페니토인 소듐, 가바펜틴, 라모트리진, 마그네슘 설페이트, 페노바르비탈, 페노바르비탈 소듐, 페니토인, 페니토인 소듐, 페니토인 소듐(익스텐디드), 프리미돈, 티아가빈 하이드로클로라이드, 토피라메이트, 발프로에이트 소듐, 발프로익 산으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 항우울제는 아미트립틸린 하이드로클로라이드, 아미트립틸린 파모에이트, 아목사핀, 부프로피온 하이드로클로라이드, 시탈로프람 하이드로브로마이드, 클로미프라민 하이드로클로라이드, 데시프라민 하이드로클로라이드, 독세핀 하이드로클로라이드, 플루옥세틴 하이드로클로라이드, 이미프라민 하이드로클로라이드, 이미프라민 파모에이트, 미르타자핀, 네파조돈 하이드로클로라이드, 노르트립틸린 하이드로클로라이드, 파록세틴 하이드로클로라이드, 페넬진 설페이트, 세르트랄린 하이드로클로라이드, 트라닐시프로민 설페이트, 트리미프라민 말레이트, 벤라팍신 하이드로클로라이드로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 항불안제는 알프라졸람, 부스피론 하이드로클로라이드, 클로르디아즈GLP-1시드, 클로르디아즈GLP-1시드 하이드로클로라이드, 클로르아제페이트 디포 타슘, 디아제팜, 독세핀 하이드로클로라이드, 하이드록시진 엠보네이트, 하이드록시진 하이드로클로라이드, 하이드록시진 파모에이트, 로라제팜, 메프로바메이트, 미다졸람 하이드로클로라이드, 옥사제팜으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 항정신병제 약물은 클로르프로마진 하이드로클로라이드, 클로자핀, 플루페나진 데카노에이트, 플루에페나진 에난테이트, 플루페나진 하이드로클로라이드, 할로페리돌, 할로페리돌 데카노에이트, 할로페리돌 락테이트, 록사핀 하이드로클로라이드, 록사핀 숙시네이트, 메소리다진 베실레이트, 몰린돈 하이드로클로라이드, 올란자핀, 퍼페나진, 피모지드, 프로클로페라진, 쿠에티아핀 푸마레이트, 리스페리돈, 티오리다진 하이드로클로라이드, 티오틱센, 티오틱센 하이드로클로라이드, 트리플루오페라진 하이드로클로라이드로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 중추 신경계 흥분제는 암페타민 설페이트, 카페인, 덱스트로암페타민 설페이트, 독사프람 하이드로클로라이드, 메탐페타민 하이드로클로라이드, 메틸페니데이트 하이드로클로라이드, 모다피닐, 페몰린, 펜테르민 하이드로클로라이드로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 항파킨슨병약은 아만타딘 하이드로클로라이드, 벤즈트로핀 메실레이트, 비페리덴 하이드로클로라이드, 비페리덴 락테이트, 브로모크립틴 메실레이트, 카르비도파-레보도파, 엔타카폰, 레보도파, 페르골리드 메실레이트, 프라미펙솔 디하이드로클로라이드, 로피니롤 하이드로클로라이드, 셀레길린 하이드로클로라이드, 톨카폰, 트리헥시페니딜 하이드로클로라이드로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 기타 중추 신경계 약물은 부푸로피온 하이드로클로라이드, 도네페질 하이드로클로라이드, 드로페리돌, 플루 복사민 말레이트, 리튬 카보네이트, 리튬 시트레이트, 나라트립탄 하이드로클로라이드, 니코틴 폴라크릴렉스, 니코틴 경피 시스템, 프로포폴, 리자트립탄 벤조에이트, 시부트라민 하이드로클로라이드 모노하이드레이트, 수마트립탄 숙시네이트, 타크린 하이드로클로라이드, 졸미트립탄으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다(예컨대, Nursing 2001 Drug Handbook의 pp. 337-530 참조).
적어도 하나의 콜린성 약물(예를 들어, 부교감흥분제)은 베타네콜 클로라이드, 에드로포늄 클로라이드, 네오스티그민 브로마이드, 네오스티그민 메틸설페이트, 피소스티그민 살리실레이트, 피리도스티그민 브로마이드로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 항 콜린성 약물은 아트로핀 설페이트, 디시클로민 하이드로클로라이드, 글리코피롤레이트, 히오시아민, 히오시아민 설페이트, 프로판텔린 브로마이드, 스코폴라민, 스코폴라민 부틸브로마이드, 스코폴라민 하이드로브로마이드로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 아드레날린성 약물(교감 신경 흥분제)은 도부타민 하이드로클로라이드, 도파민 하이드로클로라이드, 메타라미놀 비타르트레이트, 노르에피네프린 비타르트레이트, 페닐에프린 하이드로클로라이드, 수도에페드린 하이드로클로라이드, 수도에페드린 설페이트로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 아드레날린성 차단제(교감 신경 차단제)는 디하이드로에르고타민 메실레이트, 에르고타민 타르트레이트, 메티세르기드 말레이트, 프로프라놀롤 하이드로클로라이드로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 골격근 이완제는 바클로펜, 카리소프로돌, 클로르족사존, 시클로벤자프린 하이드로클로라이드, 단트롤렌 소듐, 메토카르바몰, 티자니딘 하이드로 클로라이드로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 신경근 차단제는 아트라쿠리움 베실레이트, 시사트라쿠리움(cisatracurium) 베실레이트, 독사쿠리움 클로라이드, 미바쿠리움 클로라이드, 판쿠로니움 브로마이드, 피페쿠로니움 브로마이드, 라파쿠로니움 브로마이드, 로쿠로니움 브로마이드, 숙시닐콜린 클로라이드, 튜보쿠라린 클로라이드, 베쿠로니움 브로마이드로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다(예컨대, Nursing 2001 Drug Handbook의 pp. 531-84 참조).
적어도 하나의 항 히스타민제는 브롬페니라민 말레이트, 세티리진 하이드로클로라이드, 클로르페니라민 말레이트, 클레마스틴 퓨마레이트, 시프로헵타딘 하이드로클로라이드, 디펜히드라민 하이드로클로라이드, 펙소페나딘 하이드로클로라이드, 로라타딘, 프로메타진 하이드로클로라이드, 프로메타진 테오클레이트, 트리프롤리딘 하이드로클로라이드로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 기관지 확장제는 알부테롤, 알부테롤 설페이트, 아미노필린, 아트로핀 설페이트, 에페드린 설페이트, 에피네프린, 에피네프린 비타르트레이트, 에피네프린 하이드로클로라이드, 이프라트로피움 브로마이드, 이소프로테레놀, 이소프로테레놀 하이드로클로라이드, 이소프로테레놀 설페이트, 레발부테롤 하이드로클로라이드, 메타프로테레놀 설페이트, 옥스트리필린, 피르부테롤 아세테이트, 살메테롤 시나포에이트, 테르부탈린 설페이트, 테오필린으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 거담제 또는 진해제는 벤조나테이트, 코데인 포스페이트, 코데인 설페이트, 덱스트라메토르판 하이드로브로마이드, 디펜하이드라민 하이드로클로라이드, 구아이페네신, 하이드로모르폰 하이드로클로라이드로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 기타 호흡기 약물은 아세틸시스테인, 베클로메타손 디프로피오네이트, 베락탄트, 부데소니드, 칼팍탄트(calfactant), 크로몰린 소듐, 도르나세 알파, GLP-1프로스테놀 소듐, 플루니솔리드, 플루티카손 프로피오네이트, 몬테루카스트 소듐, 네도크로밀 소듐, 팔리비주마브, 트리암시놀론, 아세토니드, 자피루카스트, 질류톤으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다(예컨대, Nursing 2001 Drug Handbook의 pp. 585-642 참조).
적어도 하나의 제산제, 흡착제, 항고창제는 알루미늄 카르보네이트, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 카르보네이트, 마갈드레이트, 마그네슘 히드록사이드, 마그네슘 옥사이드, 시메티콘, 소듐 디카르보네이트로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 소화 효소 또는 담석 가용화제는 판크레아틴, 판크레리파아제 및 우르소디올로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 지사제는 에타풀자이트, 비스무스 서브살리실레이트, 칼슘 폴리카르보필, 디페녹실레이트 하이드로클로라이드 또는 아트로핀 설페이트, 로페라미드, 옥트레오타이드 아세테이트, 오피움 틴크튜어, 오피움 틴크튜어(캄포레이트화)로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 설사제는 비소코딜, 칼슘 폴리카르보필, 카스카라 사그라다, 카스카라 사그라다 아로마틱 플루이덱스트랙트, 카스토르 오일, 도쿠세이트 칼슘, 도쿠세이트 소듐, 글리세린, 락툴로오스, 마그네슘 시트레이트, 마그네슘 히드록시드, 마그네슘 설페이트, 메틸셀룰로오스, 미네랄 오일, 폴리에틸렌 글리콜 또는 전해 용액, 살리움, 센나, 소듐 포스페이트로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 항구토제는 클로르프로마진 하이드로클로라이드, 디멘히드리네이트, 돌라세트론 메실레이트, 드로나비놀, 그라니세트론 하이드로클로라이드, 메크리진 하이드로클로라이드, 메토클로프로아미드 하이드로클로라이드, 온단세트론 하이드로클로라이드, 페르페나진, 프로클로르페라진, 프로클로르페라진 에디실레이트, 프로클로르페라진 말레이트, 프로메타진 하이드로클로라이드, 스코폴아민, 티에틸페라진 말레이트, 트리메토벤자미드 하이드로클로라이드로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 항궤양제 약물은 시메티딘, 시메티딘 하이드로클로라이드, 파모티딘, 란소프라졸, 미소프로스톨, 니자티딘, 오메프라졸, 라베프로졸 소듐, 란티딘 비스무스 시트레이트, 라니티딘 하이드로클로라이드, 수크랄페이트로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다(예컨대, Nursing 2001 Drug Handbook의 pp. 643-95 참조). 적어도 하나의 코르티코스테로이드는 베타메타손, 베타메타손 아세테이트 또는 베타메타손 소듐 포스페이트, 베타메타손 소듐 포스페이트, 코르티손 아세테이트, 덱사메타손, 덱사메타손 아세테이트, 덱사메타손 소듐 포스페이트, 플루드로코르티손 아세테이트, 하이드로코르티손, 하이드로코르티손 아세테이트, 하이드로코르티손 시피오네이트, 하이드로크로티손 소듐 포스페이트, 하이드로코르티손 소듐 숙시네이트, 메틸프레드니솔론, 메틸프레드니솔론 아세테이트, 메틸프레드니솔론 소듐 숙시네이트, 프레드니솔론, 프레드니솔론 아세테이트, 프레드니솔론 소듐 포스페이트, 프레드니솔론 테부테이트, 프레드니손, 트리암시놀론, 트리암시놀론 아세토니드, 트리암시놀론 디아세테이트로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 안드로겐 또는 아나볼릭 스테로이드는 다나졸, 플루옥시메스테론, 메틸테스토스테론, 난드롤론 데카노에이트, 난드롤론 펜프로피오네이트, 테스토스 테론, 테스토스테론 시피오네이트, 테스토스테론 에난테이트, 테스토스테론 프로티오네이트, 테스토스테론 경피 시스템으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 에스트로겐 또는 프로게스틴은 에스테르화된 에스트로겐, 에스트라디올, 에스트라디올 시피오네이트, 에스트라디올/노르에틴드론 아세테이트 경피 시스템, 에스트라디올 발레레이트, 에스트로겐(접합), 에스트로피페이트, 에티닐 에스트라디올, 에티닐 에스트라디올 및 데소게스트렐, 에티닐 에스트라디올 및 에티노디올 디아세테이트, 에티닐 에스트라디올 및 데소게스트렐, 에티닐 에스트라디올 및 에티노디올 디아세테이트, 에티닐 에스트라디올 및 레보노르게스트렐, 에티닐 에스트라디올 및 노르에틴드론, 에티닐 에스트라디올 및 노르에틴드론 아세테이트, 에티닐 에스트라디올 및 노르게스티메이트, 에티닐 에스타르디올 및 노르게스트렐, 에티닐 에스트라디올 및 노르에틴드론 및 아세테이트 및 페러스 푸마레이트, 레보노르게스트렐, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 메스트라놀 및 노르에틴드론, 노르에틴드론, 노르에틴드론 아세테이트, 노르게스트렐, 프로게스트론으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 고나도트로핀(gonadroptropin)은 가니렐릭스 아세테이트, 고나도렐린 아세테이트, 히스트렐린 아세테이트, 메노트로핀으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 항당뇨제 또는 글루카곤은 아카르보스, 클로르프로파미드, 글리메피리드, 글리피지드, 글루카곤, 글리부리드, 인슐린, 메트포르민 하이드로클로라이드, 미글리톨, 피오글리타존 하이드로클로라이드, 레파글리나이드, 로시글리타존 말레이트, 트로글리타존으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 티로이드 호르몬은 레보티록신 소듐, 리오티로 닌 소듐, 리오트릭스, 티로이드로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 티로이드 호르몬 길항제는 메티마졸, 포타슘 요오다이드, 포타슘 요오다이드(포화 용액), 프로필티오우라실, 방사성 요오드(소듐요오드 131I), 강한 요오드 용액으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 뇌하수체 호르몬은 코르티코트로핀, 코신트로핀, 데스모프레신 아세테이트, 류프로리드 아세테이트, rGLP-1시토리 크로티코트로핀, 소마트렘, 소마트로핀, 바소프레신으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 부갑상선-유사 약물은 칼시페디올, 칼시토닌(인간), 칼시토닌(연어), 칼시트리올, 디하이드로타키스테롤, 에티드로네이트 디소듐으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다(예를 들어, Nursing 2001 Drug Handbook의 pp.696-796 참조).
적어도 하나의 이뇨제는 아세타졸아미드, 아세타졸아미드 소듐, 아밀로리드 하이드로클로라이드, 부메타니드, 클로르탈리돈, 에타크리네이트 소듐, 에타크린 산, 퓨로세미드, 하이드로클로로티아지드, 인다파미드, 만니톨, 메톨라존, 스피로노락톤, 토르세미드, 트리암테렌, 우레아로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 전해 또는 대체 용액은 칼슘 아세테이트, 칼슘 카르보네이트, 칼슘 클로라이드, 칼슘 시트레이트, 칼슘 글루비오네이트, 칼슘 글루셉테이트, 칼슘 글루코네이트, 칼슘 락테이트, 칼슘 포스페이트(디베이직), 칼슘 포스페이트(트리베이직), 덱스트란(고분자량), 덱스트란(저분자량), 헤타스타치, 마그네슘 클로라이드, 마그네슘 설페이트, 포타슘 아세테이트, 포타슘 비카르보네이트, 포타슘 클로 라이드, 포타슘 글루코네이트, 린겔 주사, 린겔 주사(락테이트), 소듐 클로라이드로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 산화제 또는 알칼리화제는 소듐 비카르보네이트, 소듐 락테이트, 트로메타민으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다(예를 들어, Nursing 2001 Drug Handbook의 pp.797-833 참조).
적어도 하나의 조혈제는 페러스 푸마레이트, 페러스 글루코네이트, 페러스 설페이트, 페러스 설페이트(건조), 철 덱스트란, 철 솔비톨, 다당-철 복합체, 소듐 페릭 글루코네이트 복합체로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 혈액 응고 방지제는 아르데파린 소듐, 달테파린 소듐, 다나파로이드 소듐, 에녹사파린 소듐, 헤파린 칼슘, 헤파린 소듐, 와파린 소듐으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 혈액 유도체는 알부민 5%, 알부민 25%, 항헤모필릭 인자, 항 억제제 항응고 복합체, 항트롬빈 Ⅲ(인간), 인자 Ⅸ(인간), 인자 Ⅸ 복합체, 플라즈마 단백질 분획으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 혈전용해 효소는 알테플라세, 아니스트레플라세, 레테플라세(재조합), 스트렙토키나아제, 유로키나아제로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다(예를 들어, Nursing 2001 Drug Handbook의 pp. 834-66 참조).
적어도 하나의 알킬화제는 부설판, 카르보플라틴, 카르무스틴, 클로람부실, 시스플라틴, 시클로포스파미드, 이포스파미드, 로무스틴, 메클로레타민 하이드로클로라이드, 멜파란, 멜파란 하이드로클로라이드, 스트렙토조신, 테모졸로미드, 티오테파로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 항대사제는 카페시타빈, 클라드리빈, 시타라빈, 플록스우리딘, 플루다라빈 포스페이트, 플루오로우라 실, 하이드록시우레아, 머캅토퓨린, 메토트렉세이트, 메토트렉세이트 소듐, 티오구아닌으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 항생 항신생물제는 블레오마이신 설페이트, 닥티노마이신, 다우노루비신 시트레이트 리포조멀, 다우노루비신 하이드로클로라이드, 독소루비신 하이드로클로라이드, 독소루비신 하이드로클로라이드 리포소멀, 에피루비신 하이드로클로라이드, 이다루비신 하이드로클로라이드, 미토마이신, 펜토스타틴, 플리카마이신, 발루비신으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 호르몬 균형을 바꾸는 적어도 하나의 항신생물제는 아나스트로졸, 비칼루타미드, 에스트라뮤스틴 포르페이트 소듐, 엑세메스탄, 플루타미드, 고세렐린 아세테이트, 레트로졸, 류프롤리드 아세테이트, 메게스트롤 아세테이트, 닐루타미드, 타목시펜 시트레이트, 테스토락톤, 토레미펜 시트레이트로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 기타 항신생물제는 아스파라기나아제, 바실러스 칼메테-구에린(bacillus Calmette-Guerin; BCG)(생 방광), 다카르바진, 도세탁셀, 에토포시드, 에토포시드 포스페이트, 젬시타빈 하이드로클로라이드, 이리노테칸 하이드로클로라이드, 미토탄, 미톡산트론 하이드로클로라이드, 파클리탁셀, 페가스파르가아제, 포르피머 소듐, 프로카르바진 하이드로클로라이드, 리툭시마브, 테니포시드, 토포테칸 하이드로클로라이드, 트라스트주마브, 트레티노인, 빈블라스틴 설페이트, 빈크리스틴 설페이트, 비노렐빈 타르트레이트로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다(예를 들어, Nursing 2001 Drug Handbook의 867-963 참조).
적어도 하나의 면역 억제제는 아자티오프린, 바실릭시마브, 시클로스포린, 다클리주마브, 림프구 면역 글로블린, 뮤로모나브-CD3, 미코페놀레이트 모페틸, 미 코페놀레이트 모페틸 하이드로클로라이드, 시롤리무스, 타크롤리무스로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 백신 또는 변성독소는 BCG 백신, 콜레라 백신, 디프테리아 및 테타누스 변성독소(흡수), 디프테리아 및 테타누스 변성독소 및 흡수된 무세포 백일해 백신, 디프테리아 및 테타누스 변성독소 및 전세포 백일헤 백신, 헤모필루스 b 접합 백신, A형 간염 백신(불활성), B형 간염 백신(재조합), 인플루엔자 바이러스 백신 1999-2000 3가형 A&B(정제된 표면 항원), 인플루엔자 바이러스 백신 1999-2000 3가형 A&B(서브비리온 또는 정제된 서브비리온), 인플루엔자 바이러스 백신 1999-2000 3가형 A&B(전체 비리온), 일본 뇌염 바이러스 백신(불활성화된), 라임병 백신(재조합 OspA), 홍역 및 볼거리 및 풍진 바이러스 백신(살아있는), 홍역 및 볼거리 및 풍진 바이러스 백신(약화되어 살아있는), 홍역 바이러스 백신(약화되어 살아있는), 수막구균 폴리사카라이드 백신, 볼거리 바이러스 백신(살아있는), 플라그 백신, 폐렴구균 백신(다가), 폴리오바이러스 백신(불활성화된), 폴리오바이러스 백신(살아있는, 경구, 3가), 광견병 백신(흡착된), 광견병 백신(인간 이배체 세포), 풍진 및 볼거리 바이러스 백신(살아있는), 풍진 바이러스 백신(약화되어 살아있는), 파상풍 변성독소(흡착된), 파상풍 변성독소(액체), 장티푸스 백신(경구), 장티푸스 백신(비경구), 장티푸스 Vi 폴리사카라이드 백신, 수두 바이러스 백신, 황열병 백신으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 항독소 또는 항뱀독소는 검은 과부 거미 항뱀독소, 크로탈리데 안티베놈(Crotalidae antivenom)(다가), 디프테리아 항독소(말), 미크루루스 풀비우스(Micrurus fulvius , 항사독소) 항뱀독소로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 면역 혈청은 사이토메갈로바이러스 면역 글로블린(정맥내), B형 간염 면역 글로블린(인간), 근육내 면역 글로블린, 정맥내 면역 글로블린, 광견병 면역 글로블린(인간), 정맥내 호흡기 합포체 바이러스 면역 글로블린(인간), Rh0(D) 면역 글로블린(인간), 정맥내 Rh0(D) 면역 글로블린(인간), 파상풍 면역 글로블린(인간), 수두-대상포진 면역 글로블린으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 생물학적 반응 조절자는 아델스류킨, GLP-1에틴 알파, 필그라스팀(filgrastim), 주사용 글라티라머 아세테이트, 인터페론 알파콘-1, 인터페론 알파-2a(재조합), 인터페론 알파-2b(재조합), 인터페론 베타-1a, 인터페론 베타-1b(재조합), 인터페론 감마-1b, 레바미솔 하이드로클로라이드, 오프렐베킨, 사르그라모스팀으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다(예를 들어, Nursing 2001 Drug Handbook의 pp. 964-1040 참조).
적어도 하나의 눈 항 감염제는 바시트라신, 클로람페니콜, 시프로플록사신 하이드로클로라이드, 에리쓰로마이신, 젠타마이신 설페이트, 오플록사신 0.3%, 폴리믹신 B 설페이트, 설파세타미드 소듐 10%, 설파세타미드 소듐 15%, 설파세타미드 소듐 30%, 토브라마이신, 비다라민으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 눈 항염증제는 덱사메타손, 덱사메타손 소듐 포스페이트, 디클로페낙 소듐 0.1%, 플루오로메톨론, 플루르비프로펜 소듐, 케토롤락 트로메타민, 프레드니솔론 아세테이트(현탁액) 프레드니솔론 소듐 포스페이트(용액)로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 축동제는 아세틸콜린 클로라이드, 카르바콜(안구 내), 카르바콜(국소), 에코티오페이트 요오다이드, 필로카르핀, 필로카르핀 하이드로클로라이드, 필로카르핀 니트레이트로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 산동제는 아트로핀 설페이트, 시클로펜톨레이트 하이드로클로라이드, 에피네트린 하이드로클로라이드, 에피네프릴 보레이트, 호마트로핀 하이드로브로마이드, 페닐에프린 하이드로클로라이드, 스코폴라민 하이드로브로마이드, 트로피카미드로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 눈 혈관 수축 신경제는 나파졸린 하이드로클로라이드, 옥시메타졸린 하이드로클로라이드, 테트라하이드로졸린 하이드로클로라이드로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 기타 눈 약물은 아프라클로니딘 하이드로클로라이드, 베탁솔롤 하이드로클로라이드, 브리모니딘 타르트레이트, 카르테올롤 하이드로클로라이드, 디피베프린 하이드로클로라이드, 도르졸아미드 하이드로클로라이드, 에메다스틴 디푸마레이트, 플루오레세인 소듐, 케토티펜 푸마레이트, 라타노프로스트, 레보부놀롤 하이드로클로라이드, 메티프라놀롤 하이드로클로라이드, 소듐 클로라이드(하이퍼토닉), 티몰롤 말레이트로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 귀 약제는 붕산, 카르바미드 퍼옥사이드, 클로람페니콜, 트리에탄올아민 폴리펩티드 올레이트-콘덴세이트로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 코 약제는 베클로메타손 디프로피오네이트, 부데소니드, 에페드린 설페이트, 에피네프린 하이드로클로라이드, 플루니솔리드, 플루티카손 프로피오네이트, 나파졸린 하이드로클로라이드, 옥시메타졸린 하이드로클로라이드, 페닐에프린 하이드로클로라이드, 테트라히드로졸린 하이드로클로라이드, 트리암시놀론 아세토니드, 자일로메타졸린 하이드로클로라 이드로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다(예를 들어, Nursing 2001 Drug Handbook의 pp. 1041-97 참조).
적어도 하나의 국소 항-감염제는 아시클로비어, 암포테리신 B, 아제라익산 크림, 바시트라신, 부토코나졸 니트레이트, 클린다마이신 포스페이트, 클로트리마졸, 에코나졸 니트레이트, 에리쓰로마이신, 젠타마이신 설페이트, 케토코나졸, 마페니드 아세테이트, 메트로니다졸(국소), 미코나졸 니트레이트, 뮤피로신, 나프티핀 하이드로클로라이드, 네오마이신 설페이트, 니트로푸라존, 니스타틴, 실버 설파디아진, 테르비나핀 하이드로클로라이드, 테르코나졸, 테트라사이클린 하이드로클로라이드, 티오코나졸, 톨나프테이트로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 옴약 또는 이살충제는 크로타미톤, 린단, 퍼메트린, 피레쓰린스로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 국소 코르티코스테로이드는 베타메타손 디프로피오네이트, 베타메타손 발레레이트, 클로베타솔 프로피오네이트, 데소니드, 데속시메타손, 덱사메타손, 덱사메타손 소듐 포스페이트, 디플로라손 디아세테이트, 플루오시놀론 아세토니드, 플루오시노니드, 플루란드레놀리드, 플루티카손 프로피오네이트, 할시오니드, 하이드로코르티손, 하이드로코르티손 아세테이트, 하이드로코르티손 부티레이트, 하이드로코리손 발레레이트, 모메타손 푸로에이트, 트리암시놀론 아세토니드로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다(예를 들어, Nursing 2001 Drug Handbook의 pp. 1098-1136 참조).
적어도 하나의 비타민 또는 미네랄은 비타민 A, 비타민 B 복합체, 시아노코발아민, 폴릭산, 하이드록소코발아민, 류코보린 칼슘, 니아신, 니아신아미드, 피리 독신 하이드로클로라이드, 리보플라빈, 티아민 하이드로클로라이드, 비타민 C, 비타민 D, 콜레칼시페롤, 에르고칼시페롤, 비타민 D 유사체, 독세르칼시페롤, 파리칼시톨, 비타민 E, 비타민 K 유사체, 피톤아디온, 소듐 플루오라이드, 소듐 플루오라이드(국소), 미량 원소, 크롬, 구리, 요오드, 망간, 셀레늄, 아연으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 칼로릭은 아미노산 인퓨전(결정), 덱스트로스 내의 아미노산 인퓨전, 전해질과의 아미노산 인퓨전, 덱스트로스 내의 전해질과의 아미노산 인퓨전, 간 기능 이상을 위한 아미노산 인퓨전, 높은 대사 스트레스에 대한 아미노산 인퓨전, 신장 이상에 대한 아미노산 인퓨전, 덱스트로스, 지방 에멀전, 중간 사슬 트리글리세리드로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다(예를 들어, Nursing 2001 Drug Handbook의 pp.1137-63 참조).
또한, 본 발명은 적어도 하나의 GLP-1 모방체, 특정 부분 또는 변이체를 포함하는 임의의 적절한 및/또는 유효량의 조성물 또는 약제학적 조성물을 제공하고, 임의로 상기 조성물은 적어도 하나의 TNF 길항제[예컨대, TNF 케미칼 또는 단백질 길항제, TNF 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 또는 단편, 가용성 TNF 수용체(예컨대, p55, p70 또는 p85) 또는 단편, 그들의 융합 폴리펩티드, 또는 소분자 TNF 길항제, 예컨대, TNF 결합 단백질 I 또는 II(TBP-1 또는 TBP-II), 네레리몬마브, 인플릭시마브, 엔테라셉트, CDP-571, CDP-870, 아펠리모마브, 레네르셉트 등, 그러나 이로 한정되지는 않는다], 항류마티스제(예컨대, 메토트렉세이트, 아우라노핀, 아우로티오글루코오스, 아자티오프린, 에타네르셉트, 골드 소듐 티오말레이트, 하이드록시클로로퀸 설페이트, 레플루노미드, 설파살진), 근육 이완제, 마약, 비-스테 로이드 염증성 약물 (non-steroid inflammatory drug; NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경 근육 차단제, 항미생물제(예컨대, 아미노글리코시드, 항진균제, 항기생충제, 항바이러스제, 카르바페넴, 세팔로스포린, 플루오르퀴놀론, 마크롤라이드, 페니실린, 설폰아미드, 테트라시클린, 다른 항미생물제), 건선 치료제, 코르티코스테로이드, 동화대사 스테로이드, 당뇨병 관련 제제, 미네랄, 영양, 티로이드 제제, 비타민, 칼슘 관련 호르몬, 지사제, 진해제, 항구토제, 항궤양제, 설사제, 항응고제, 에리쓰로포이에틴(예컨대, 에포에틴 알파), 필그라스팀(예컨대, G-CSF, 뉴포젠), 사그라모스팀(GM-CSF, 류킨), 면역화, 면역글로불린, 면역 억제제(예컨대, 바실릭시마브, 사이클로스포린, 다클리주마브), 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 에스트로겐 수용체 조절자, 동공 확대제, 조절 마비제, 알킬화제, 항대사제, 축동 억제제, 방사성 의약품, 항우울제, 항조증제, 항정신병제, 항불안제, 수면제, 교감신경흥분제, 흥분제, 도네페질, 타크린, 천식 약, 베타 작용제, 흡입 스테로이드, 류코트리엔 억제제, 메틸잔틴, 크로몰린, 에피네프린 또는 유사체, 도르나세 알파(풀모자임), 사이토카인 또는 사이토카인 길항제를 더 포함한다. 사이토카인은 IL-1에서 IL-23을 포함하지만 이로 한정되지는 않는다. 적절한 투여량은 당업계에 잘 알려져 있다. 예컨대, Wells et al., eds.,Pharmacotherapy Handbook,2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000) 참조, 이들 문헌의 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함된다.
그러한 조성물은 또한 본 발명의 적어도 하나의 항체 또는 폴리펩티드와 관련되거나, 결합되거나 공-제제화되거나, 공-투여되는 독소 분자를 포함할 수 있다. 독소는 임의로 병적 세포 또는 조직을 선택적으로 죽이는 작용을 할 수 있다. 병적 세포는 암 또는 다른 세포일 수 있다. 이러한 독소는 예를 들어, 적어도 하나의 리신, 디프테리아 독소, 뱀 독소, 또는 박테리아 독소로부터 선택된 독소의 적어도 하나의 기능성 세포독성 도메인을 포함하는 정제 또는 재조합 독소 또는 독소 단편일 수 있으나, 이로 한정되지는 않는다. 독소라는 용어는 죽음을 초래할 수 있는 독소 쇼크를 포함하는 인간 또는 다른 포유류에 병적 환경을 유발할 수 있는 자연 발생, 돌연 변이 또는 재조합 박테리아 또는 바이러스에 의하여 만들어질 수 있는 엔도톡신 또는 엑소톡신을 포함할 수 있다. 이러한 독소는 엔테로톡시제닉 E. coli 열민감 엔테로톡신(LT), 열안정 엔테로톡신(ST), 시겔라 세포독소, 에어로조나스 엔테로톡신, 독성 쇼크 신드롬 톡신-1(TSST-1), 스타필로코컬 엔테로톡신 A(SEA), B(SEB), 또는 C(SEC), 스트렙토코컬 엔테로톡신 등을 포함할 수 있으나 이로 한정되지 않는다. 그러한 박테리아는 엔테로톡시제닉 E. coli(ETEC), 엔테로헤모라직 E. coli(예컨대, 세로타입 0157: H7의 균주), 스타필로코커스 종[예컨대, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코쿠스 피로젠스(Staphylococcus pyogenes)], 시겔라 종[예컨대, 시겔라 디센테리에(Shigella dysenteriae), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 시겔라 보이디(Shigella boydii), 및 시겔라 손네이(Shigella sonnei)], 살모넬라 종[예컨대, 살모넬라 티 피(Salmonella typhi), 살모넬라 콜레라-수이스(Salmonella cholera - suis), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis)], 클로스트리디움 종[예컨대, 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens), 클로스트리디움 디피실(Clostridium dificile), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)], 캄플로박터 종 [예컨대, 캄플로박터 제주니(Camphlobacter jejuni), 캄플로박터 페투스(Camphlobacter fetus)], 헬리코박터 종[예컨대, 헬리코박터 파일로리(Heliobacter pylori)], 에어로모나스 종[예컨대, 에어로모나스 소브리아(Aeromonas sobria), 에어로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 에어로모나스 카비에(Aeromonas caviae)], 플레이소모나스 시겔로이데스(Pleisomonas shigelloides), 예르시나 엔테로콜리티카(Yersina enterocolitica), 비브리오스 종[예컨대, 비브리오스 콜레라(Vibrios cholerae), 비브리오스 파라헤몰리티쿠스(Vibrios parahemolyticus)], 클레브시엘라 종, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 및 스트렙토코키 종의 균주를 포함하나 이로 한정되지 않는다. 예컨대, Stein, ed., INTERNAL MEDICINE, 3rd ed., pp 1-13, Little, Brown and Co., Boston, (1990); Evans et al.,eds., Bacterial Infection of humans: Epidemiology and Control, 2d. Ed., pp 239-254, Plenum Medical Book Co., New York (1991); Mandell et al, Principles and Practice of Infectious diseases, 3d. Ed., Churchill Livingstone, New York (1990); Berkow et al, eds., The Merck Manual,16th edition, Merck and Co., Rahway, N.J., 1992; Wood et al, FEMS Microbiology Immunology, 76: 121-134 (1991); Marrack et al, Science,248: 705-711 (1990) 참조, 문헌의 전체 내용은 본 명세서에 참고로서 포함된다.
본 발명의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체 조성물은 이로 한정되는 것은 아니나, 희석제, 결합제, 안정화제, 완충액, 염, 친유성 용매, 보존제, 어쥬번트(adjuvant) 등과 같은 적어도 하나의 적합한 보조제를 추가로 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 보조제가 선호된다. 이러한 멸균 용액의 비제한적인 예 및 이의 제조방법은 이로 제한되지는 않지만, Gennaro, Ed., Remington's Phamrnaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Co. (Easton, PA) 1990와 같이 당업계에 잘 알려져 있다. 약제학적으로 허용되는 담체들은 GLP-1 모방체 조성물의 투여 방법, 용해성 및 /또는 안정성에 적합한 약제학적으로 허용되는 담체가 본 명세서의 기재 또는 당업계에 공지된 것과 같이 루틴하게 선택될 수 있다.
본 조성물에 유용한 약제학적 부형제 및 첨가제는 단백질, 펩티드, 아미노산, 지질, 및 탄수화물(예컨대, 단당류, 이-, 삼-, 사-, 및 올리고당을 포함하는 당; 알디톨, 알도닉산, 에스테르화된 당 등과 같은 유도체화된 당; 및 다당류 또는 당 폴리머)를 포함하나 이로 한정되지는 않고, 상기 조성물은 중량 또는 부피를 기준으로 1-99.99%를 혼합 또는 단독으로 포함하는 단일 또는 배합물로 존재할 수 있다. 예시적인 단백질 부형제는 인간 혈청 알부민(human serum albumin; HSA)과 같은 혈청 알부민, 재조합 인간 알부민(recombinant human albumin; rHA), 젤라틴, 카제인 등과 같은 혈청 알부민을 포함한다. 완충 작용을 할 수 있는 대표적인 아 미노산/GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체 성분은 알라닌, 글리신, 아르기닌, 베타인, 히스티딘, 글루탐산, 아스파트산, 시스테인, 라이신, 류신, 이소류신, 발린, 메티오닌, 페닐알라닌, 아스파탐 등을 포함한다. 바람직한 아미노산은 글리신이다.
본 발명의 사용에 적절한 탄수화물 부형제는 예를 들어, 프럭토오스, 말토오스, 갈락토오스, 포도당, D-만노오스, 소르보오스 등과 같은 단당류; 락토오스, 슈크로오스, 트레할로스, 셀로비오스 등과 같은 이당류; 라피노오스, 멜레지토오스, 말토덱스트린, 덱스트란, 전분 등과 같은 다당류; 및 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 자일리톨 솔비톨(글루시톨), 미오이노시톨 등과 같은 알디톨을 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위한 바람직한 탄수화물 부형제는 만니톨, 트레할로오스, 및 라피노오스이다.
GLP-1 모방체 조성물은 또한 완충액 또는 pH 조정제를 포함할 수도 있고; 전형적으로 완충액은 유기산 또는 염기로부터 제조된 염이다. 대표적인 완충액은 시트르산, 아스코르브산, 글루콘산, 탄산, 타르타르산, 숙신산, 아세트산, 또는 프탈산의 염과 같은 유기산염; 트리스, 트로메타민 하이드로클로라이드 또는 포스페이트 완충액을 포함한다. 본 조성물에 사용되는 바람직한 완충액은 시트레이트와 같은 유기산염이다.
부가적으로, 본 발명의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체 조성물은 폴리비닐피롤리돈, 피콜(폴리머 당), 덱스트레이트(예를 들어, 2-히드록시프로필-베타-사이클로덱스트린과 같은 사이클로덱스트린), 폴리에틸렌 글리콜, 향미제, 항 균제, 감미료, 항산화제, 대전방지제, 계면 활성제(예를 들어, "Tween 20" 및"Tween 80"과 같은 폴리솔베이트), 지질(예를 들어, 인지질, 지방산), 스테로이드(예를 들어, 콜레스테롤) 및 킬레이트제(예를 들어, EDTA)와 같은 중합 부형제/첨가제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 GLP-1 모방체 조성물에 사용하기에 적합한 이들 및 부가적인 공지의 약제학적 부형제 및/또는 첨가제는 예를 들어, "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19th ed., Williams & Williams, (1995), "Physician's Desk Reference",52nded., Medical Economics, Montvale, NJ (1998)에 공지되어 있으며, 전체 내용이 본 명세서에 참고로 포함된다. 바람직한 담체 또는 부형제는 탄수화물(예컨대, 당류 및 알디톨) 및 완충액(예컨대, 시트레이트) 또는 중합제제를 포함한다.
제제. 상술한 바와 같이 본 발명은 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체를 약제학적으로 허용되는 제제 내에 포함하고, 바람직하게는 염수 또는 선택된 염과의 적절한 완충액을 포함할 수 있는 안정한 제제, 및 보존제 및 약제학적 또는 수의학적 용도에 적합한 다용도 보존 제제를 함유하는 임의의 보존된 용액 및 제제를 제공한다. 보존된 제제는 적어도 하나의 공지된 보존제를 포함하거나, 임의로 적어도 하나의 페놀, m-크레솔, p-크레솔, o-크레솔, 클로로크레솔, 벤질 알콜, 페닐머큐릭 니트레이트, 페녹시에탄올, 포름알데하이드, 클로로부 탄올, 마그네슘 클로라이드(예를 들어, 헥사하이드레이트), 알킬파라벤(메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등), 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 소듐 데하이드로아세테이트 및 티메로잘, 또는 수용성 희석제에서의 그들의 혼합물을 포함하는 그룹으로부터 부가적으로 선택된 것을 포함할 수 있다. 임의의 적절한 농도 또는 혼합물이 0.001-5% 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값으로, 이를 테면 0.001, 0.003, 0.005, 0.009, 0.01, 0.02, 0.03, 0.05, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.3, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 또는 그 안의 어떠한 범위 또는 값으로 당업계에서 알려진 것과 같이 사용될 수 있다. 비제한적인 예는 보존제가 없는 것, 0.1-2% m-크레솔(예컨대, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.9, 1.0%), 0.1-3% 벤질 알콜(예컨대, 0.5, 0.9, 1.1, 1.5, 1.9, 2.0, 2.5%), 0.001-0.5% 티메로살(예컨대, 0.005, 0.01), 0.001-2.0% 페놀(예컨대, 0.05, 0.25, 0.28, 0.5, 0.9, 1.0%), 0.0005-1.0% 알킬파라벤(들)(예컨대, 0.00075, 0.0009, 0.001, 0.002, 0.005, 0.0075, 0.009, 0.01, 0.02, 0.05, 0.075, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.75, 0.9, 1.0%) 등을 포함한다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 임의로 수성 희석제 중에서, 전술한 완충액 및/또는 보존제를 갖는 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체의 용액을 포함하는 적어도 하나의 바이알 및 포장재를 포함하는 제품을 제공하며, 상기 포장재는 상기 용액이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72 시간 이상에 걸쳐 지속될 수 있음을 표지한 라벨을 포함한다. 본 발명은 또한 포장재, 동결건조된 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체를 포함하는 제 1 바이알 및 전술한 완충액 또는 보존제의 수성 희석제를 포함하는 제 2 바이알을 포함하는 제품을 제공하며, 상기 포장재는 환자에게 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체를 수성 희석제 중에 재구성하여 24 시간 이상 지속될 수 있는 용액을 형성하도록 지시하는 라벨을 포함한다.
본 발명에 따라 사용되는 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체는 본 명세서에 기술되었거나 당업계에 공지된 방법에 따라 포유동물 세포 또는 트랜스제닉 표본으로부터 재조합 기술에 의해 형성되거나 다른 생물원으로부터 정제될 수 있다.
농도의 고저는 조작가능하고, 목적하는 전달 비히클에 따라 달라지며, 예컨대, 용제는 경피 패취, 폐, 경점막, 또는 삼투압 또는 마이크로 펌프 방법에 따라 달라지지만, 본 발명에 따른 생성물 중의 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체 양의 범위는 재구성시 수득되는 양(습식/건식 시스템인 경우) 약 1.0 ㎍/㎖ 내지 약 1000 ㎎/㎖의 농도를 포함한다.
바람직하게는, 수성 희석제는 임의로 약제학적으로 허용되는 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 보존제는 페놀, m-크레솔, p-크레솔, o-크레솔, 클로로크레솔, 벤질 알콜, 알킬파라벤(메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등), 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 소듐 데하이드로아세테이트 및 티메로잘, 또는 그들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택된 것을 포함한다. 제제에 사용되는 보 존제의 농도는 항-미생물 효과를 나타내는데 충분한 농도이다. 이러한 농도는 선택된 보존제의 종류에 따라 달라지며, 당업자에 의하여 용이하게 결정된다.
다른 부형제, 예를 들어, 등장성 제제, 완충액, 항산화제, 보존 강화제는 임의로 그리고 바람직하게 희석제에 첨가될 수 있다. 글리세린과 같은 등장성 제제는 공지된 농도로 흔히 사용된다. 생리적으로 허용된 완충액이 바람직하게는 첨가되어 pH 조절능을 향상시킨다. 제제는 약 pH 4에서 약 pH 10, 바람직하게는 약 pH 5에서 약 pH 9, 더욱 바람직하게는 약 6.0에서 약 8.0과 같은 넓은 범위의 pH를 커버할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 제제는 약 6.8에서 약 7.8사이의 pH를 가진다. 바람직한 완충액은 인산 완충액이고, 가장 바람직하게는 인산 나트륨이며, 특히 인산 완충 염수(PBS)를 포함한다.
Tween 20(폴리옥시에틸렌 (20) 솔비탄 모노라우레이트), Tween 40(폴리옥시에틸렌 (20) 솔비탄 모노팔미테이트), Tween 80(폴리옥시에틸렌 (20) 솔비탄 모노올레이트), 플루로릭 F68(폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 블록 코폴리머), 및 PEG(폴리에틸렌 글리콜), 또는 폴리소르베이트 20 또는 80 또는 폴록사머 184 또는 188과 같은 비이온 계면활성제, Pluronic® 폴릴스, 다른 블록 코폴리머, 및 EDTA 및 EGTA와 같은 킬레이터와 같은 약제학적으로 허용되는 가용화제와 같은 다른 첨가제들이 응집을 줄이기 위하여 제제 또는 조성물에 임으로 첨가될 수 있다. 이들 첨가제는 제제를 투여하기 위하여 펌프 또는 플라스틱 용기가 이용될 경우에 특히 유용하다. 약제학적으로 허용되는 계면 활성제의 존재는 단백질이 응집하려는 성 질을 완화시킨다.
본 발명의 제제는 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체와 페놀, m-크레솔, p-크레솔, o-크레솔, 클로로크레솔, 벤질 알콜, 알킬파라벤(메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등), 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 소듐 데하이드로아세테이트 및 티메로잘 또는 수용성 희석액에서의 그들의 혼합액으로 구성된 그룹으로부터 선택된 보존제를 혼합하는 것을 포함하는 방법에 의하여 제조될 수 있다. 수성 희석제에서, 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체를 보존제와 혼합하는 것은 통상의 용해 및 혼합 과정을 사용하여 수행된다. 적절한 제형을 제조하기 위하여, 예컨대 완충 용액 중의 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체의 측정된 양이 단백질과 보존제를 바람직한 농도로 제공하는데 충분한 양의 완충 용액 중의 바람직한 보존제와 혼합된다. 이 방법의 변형은 당업자에 의하여 인식될 것이다. 예컨데, 구성 물질이 첨가되는 순서, 부가적인 첨가제의 사용 여부, 제제가 제조되는 온도 및 pH는 사용되는 투여 수단 및 농도에 대해 최적화될 수 있는 모든 인자이다.
청구된 제제는 수성 희석제 중에서 물, 보존제 및/또는 부형제, 바람직하게는 인산 완충액 및/또는 염수 및 선택된 염을 포함하는 제 2 바이알과 함께 재구성되는 동결건조된 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체의 바이알을 포함하는 이중 바이알 또는 투명한 용액으로 환자에게 제공될 수 있다. 단일 용액 바이알 또는 재구성을 요하는 이중 바이알은 여러번 재사용될 수 있고, 환자 치료에 단일 또는 복수의 주기 동안 사용될 수 있으므로, 현재 사용되는 것보다 편 리한 치료법을 제공한다.
본 발명에서 청구된 제품은 바로 내지 24 시간 이상의 기간 동안 투여할 수 있다. 따라서, 본원에서 청구된 제품은 환자에게 현저히 유리한 점을 제공한다. 본 발명의 제제는 약 2 내지 약 40℃의 온도에서 안전하게 보존될 수 있고 연장된 기간 동안 단백질의 생물학적 활성을 유지하므로, 용액이 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72 또는 96 시간 이상의 기간 동안 유지되고 사용될 수 있다는 것을 나타내는 포장 라벨을 허용한다. 보존된 희석제가 사용된다면, 그러한 라벨은 최대 적어도 1-12개월, 반년, 일년반, 및/또는 2년까지 사용하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명에서 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체의 용액은 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체를 수성 희석제에서 혼합하는 것을 포함하는 방법에 의하여 제조될 수 있다. 혼합은 통상의 용해 및 혼합 과정을 사용하여 수행된다. 적절한 희석액을 만들기 위하여, 예컨대 물 또는 완충액 중의 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체의 측정된 양이, 바람직한 농도로 단백질 및 임의로 보존제 또는 완충액을 제공하는데 충분한 양과 혼합된다. 이 방법의 변형은 당업자에 의하여 인식될 것이다. 예컨대, 성분이 첨가되는 순서, 부가적인 첨가제의 사용 여부, 제제가 제조되는 온도 및 pH는 사용되는 투여 수단 및 농도에 대해 최적화될 수 있는 모든 인자이다.
청구된 생성물은 수성 희석제를 포함하는 제 2 바이알과 함께 재구성되는 동결건조된 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체의 바이알을 포함하는 이중 바이알 또는 투명한 용액으로 환자에게 제공될 수 있다. 단일 용액 바이알 또는 재구성을 요하는 이중 바이알은 여러번 재사용될 수 있고, 환자 치료에 단일 또는 복수의 주기 동안 사용될 수 있으므로, 현재 사용되는 것보다 편리한 치료법을 제공한다.
청구된 생성물은 약국, 진료소 또는 이러한 다른 시설 및 기관에 투명한 용액 또는 수성 희석제를 함유하는 제 2 바이알과 함께 재구성되는 동결건조된 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체의 바이알을 포함하는 이중 바이알을 제공함으로써, 환자에게 간접적으로 제공될 수 있다. 이 경우, 투명한 용액은 크기가 1 리터 이상일 수 있으므로, 소량의 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체 용액을 보다 작은 바이알로 옮기기 위해 한번 또는 여러번 회수할 수 있는 큰 용기가 제공되고, 약국 또는 진료소에 의해 고객 및/또는 환자에게 제공된다.
이들 단일 바이알 시스템을 포함하는 용인된 장치에는 Humaject®, NovoPen®, B-D® Pen, AutoPen®, 및 OptiPen®과 같은 용액 전달용 펜-주입기 장치가 포함되고, 이중 바이알 시스템을 포함하는 용인된 장치에는 HumatroPen®과 같이 재구성 용액 전달용 카트리지에서 동결건조된 약물을 재구성하는 펜-주입기 시스템이 포함된다.
본 발명에 청구된 제품은 포장재를 포함한다. 포장재는 관리기관이 요구하는 정보 이외에, 생성물이 사용될 수 있는 조건을 제공한다. 본 발명의 포장재는 환자에게 수성 희석제 중에서 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변 이체를 재구성하여 용액을 형성하도록 하고, 상기 용액을 2 개의 바이알, 습식/건식, 생성물에 대해 2-24 시간 이상의 기간에 사용하도록 하는 설명서를 제공한다. 단일 바이알 용액 생성물의 경우, 라벨은 상기 용액이 2-24 시간 이상에 걸쳐 사용될 수 있음을 나타낸다. 본 발명에 청구된 생성물은 인간의 약제학적 생성물 사용에 유용하다.
본 발명의 제제는 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체를 선택된 완충액, 바람직하게는 염수 또는 선택된 염을 포함하는 인산 완충액과 혼합하는 것을 포함하는 방법에 의하여 만들어질 수 있다. 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체를 완충액과 수성 희석제 중에서 혼합하는 것은 통상의 용해 및 혼합 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 적합한 제제를 제조하기 위해, 예를 들어, 물 또는 완충액 중의 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체의 측정량을 목적하는 농도의 단백질 및 완충액을 제공하는데 충분한 양으로 수중에서 목적하는 완충액과 혼합한다. 이 방법의 변형은 당업자에 의하여 인식될 것이다. 예컨대, 성분이 첨가되는 순서, 부가적인 첨가제의 사용 여부, 제제가 제조되는 온도 및 pH는 사용되는 투여 수단 및 농도에 대해 최적화될 수 있는 모든 인자이다.
청구되는 안정 또는 보존 제제는 투명 용액으로서, 또는 수성 희석제중의 보존제 및 완충액 또는 부형제를 함유하는 제 2 바이알과 함께 재구되는 동결건조된 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체의 바이알을 포함하는 이중 바이알로서 환자에게 제공될 수 있다. 단일 용액 바이알이나 재구성을 요하는 이중 바이알은 다수회 재사용될 수 있고, 환자 치료에 단일 또는 복수의 주기동안 사용될 수 있으므로, 통상적으로 이용가능한 것보다 더욱 편리한 치료법을 제공할 수 있다.
본원에서 기술된 안정 또는 보존 제제 또는 용액 중의 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체는 SC 또는 IM 주사; 경피, 폐, 경점막, 이식, 삼투 펌프, 카트리지, 마이크로 펌프, 또는 당업계에 알려진 것과 같이 당업자에 의하여 예측되는 다른 수단을 포함하는 각종 전달 방법을 통해 본 발명에 따라 환자에게 투여될 수 있다.
치료상의 적용. 모방체에 대한 본 발명은 또한 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자에서, 성인 또는 소아, 인슐린 의존, 비-인슐린 의존 등, 이로 제한되지는 않지만, 인슐린 저항성, 고혈당증, 저혈당증, 췌장염, 수슁 증후군, 흑색 가시 세포증, 리포아트로픽(lipoatrrophic) 당뇨병, 망막병증, 콩팥병증, 다발 신경병증, 단발 신경병증, 자율 신경병증, 궤양, 발 궤양, 관절 문제, 감염(예컨대, 진균 또는 박테리아) 등과 같은 관련 징후 및 증후군을 포함하는 당뇨병, I형 또는 II형 당뇨병을 조절하거나 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자에서, 성인 또는 소아, 인슐린 의존, 비-인슐린 의존 등을 포함하며, 이로 제한되는 것은 아니나, 인슐린 저항성, 고혈당증, 저혈당증, 췌장염, 수슁 증후군, 흑색 가시 세포증, 리포아트로픽(lipoatrrophic) 당뇨병, 망막병증, 콩팥병증, 다발 신경병증, 단발 신경병증, 자율 신경병증, 궤양, 발 궤양, 관절 문제, 감염(예컨대, 진균 또는 박테리아) 등과 같은 관련 징후 및 증상을 포함하는 적어도 하나의 I형 또는 II형 당뇨병을 포함하는 적어도 하나의 당뇨병과 연관된 면역 관련 질환을 조절하거나 치료하는 방법을 제공한다. 예컨대, the Merck Manual,12th-17th Editions, Merck & Company, Rahway, NJ (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999), Pharmacotherapy Handbook, Wells et al., eds., Second Edition, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (1998, 2001)을 참조할 있으며, 각각의 전체 내용은 본 명세서에 참고로서 포함된다.
이러한 방법은 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체를 함유하는 적어도 하나의 조성물 또는 약제학적 조성물의 유효량을 조절, 처리 또는 치료가 필요한 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에 투여하는 것을 임의로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 이로 제한되는 것은 아니나 적어도 하나의 심장 스턴(stun) 신드롬, 심근경색증, 울혈성 심장 기능상실, 뇌졸증(stroke), 허혈 발작, 출혈, 동맥경화증, 죽상동맥경화증, 당뇨병 죽상경화(ateriosclerutic) 질환, 고혈압, 동맥(성) 고혈압, 콩팥혈관 고혈압, 실신, 쇼크, 심혈관 시스템의 매독, 심장기능상실, 폐심장, 일차 폐 고혈압, 심장 부정맥, 심방 이소성 박동(atrial ectopic beat), 심방조동, 심방세동(지속 또는 발작), 카오틱(chaotic) 또는 다소성 심방 빈맥, 레귤라 내로우(regular narrow) QRS 빈맥, 특정 부정맥, 심실세동, His 번들 부정맥, 방실차단, 다발 갈래차단, 심근허혈 질병, 심장동맥 질환, 협심증, 심근경 색증, 심근병증, 확장 울혈심장근육병증, 제한 심장근육병증, 판막심장 질환, 심내막염, 심장막 질환, 심장종양, 대동맥 및 말초동맥류, 대동맥박리, 대동맥 염증, 복부 대동맥 및 이의 가지 폐색, 말초혈관 질병, 동맥 폐색 질병, 말초 죽상경화(peripheral atherlosclerotic) 질환, 폐쇄성 혈전혈관염, 기능성 말초 동맥(functional peripheral arterial) 질병, 레이노 현상 및 질환, 말단 청색증, 홍색사지통증, 정맥 질환, 정맥 혈전증, 정맥류 성정맥, 동정맥루, 림프부종, 지방부종, 불안정 협심증, 재관류 손상, 포스트 펌프 신드롬(post pump syndrome), 허혈-재관류 손상 등을 포함하는 적어도 하나의 심혈관 질병을 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자에서 조절하거나 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 임의로 적어도 하나의 GLP-1 모방체, 또는 특정 부분 또는 변이체를 포함하는 조성물 또는 약제학적 조성물의 유효량을 이러한 조질, 처리 또는 치료를 필요로 하는 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에 투여하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 임의의 방법은 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체를 함유하는 조성물 또는 약제학적 조성물의 유효량을, 이러한 조절, 처리 또는 치료가 필요한 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 임의로 상기 면역 질병을 치료하기 위한 공-투여 또는 병용 치료를 추가로 포함할 수 있고, 여기에서 상기 적어도 하나의 GLP-1 모방체, 이의 특정 부분 또는 변이체의 투여는 적어도 하나의 TNF 길항제(예컨대, 이로 제한되는 것은 아니나 TNF 항체 또는 단편, 가용성 TNF 수용체 또는 단편, 이의 융합 단백질, 또는 소분자 TNF 길항제), 항류마티스제, 근육 이완제, 마약, 비-스테로이드 항-염증 약물(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경 근육 차단제, 항미생물제(예컨대, 아미노글리코시드, 항진균제, 항기생충제, 항바이러스제, 카르바페넴, 세팔로스포린, 플루오르퀴놀론, 마크롤라이드, 페니실린, 설폰아미드, 테트라사이클린, 다른 항미생물제), 건선 치료제, 코르티코스테로이드, 동화대사 스테로이드, 당뇨병 관련 약제, 미네랄, 영양, 티로이드제, 비타민, 칼슘 관련 호르몬, 설사약, 진해제, 항구토제, 항궤양제, 설사제, 항응고제, 에리쓰로포이에틴(예컨대, GLP-1에틴 알파), 과립구집락자극인자(예컨대, G-CSF, 뉴포젠), 사르그라모스팀(sargramostim, GM-CSF, 류킨), 면역화, 면역글로불린, 면역 억제제(예컨대, 바실릭시마브, 사이클로스포린, 다클리주마브), 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 에스트로겐 수용체 조절자, 동공확대제, 조절마비제, 알킬화제, 항대사물질, 축동 억제제, 방사성 의약품, 항우울제, 항조증 약제, 항정신병제, 항불안제, 수면제, 교감신경흥분제, 흥분제, 도네페질, 타크린, 천식 약, 베타 작용제, 흡입 스테로이드, 류코트리엔 억제제, 메틸잔틴, 크로몰린, 에피네프린 또는 유사체, 도르나세 알파(Pulmozyme), 사이토카인 또는 사이토카인 길항제로부터 선택된 적어도 하나를 이전, 도중 및/또는 이후에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 바람직한 투여량은 당업계에 잘 알려져 있다. 예컨대, Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000)를 참조할 수 있으며, 각각의 전체내용은 본 명 세서에 참고로서 포함된다.
모방체는 또한 자가골수 배양에서와 같이 생체 외에서 사용될 수 있다. 요약하면, 화학요법 이전에 환자로부터 골수를 빼내어 임의로 모방체와 병용하여, 임의로 하나 이상의 추가의 사이토카인과 병용하여, TPO 및/또는 GLP-1로 처리한다. 그 후, 처리한 골수를 화학요법 후 환자에게 되돌려 골수의 회복을 촉진한다. 더욱이, TPO는 단독으로, 및 GLP-1 모방체 및/또는 GLP-1과 병용하여, 골수 또는 말초혈액 전구체(peripheral blood progenitor; PBPC) 세포의 생체 외 확장에 또한 사용될 수 있다. 말초순환으로 전구세포를 조기에 방출하도록, 골수는 화학요법 처리 전에 줄기세포인자(stem cell factor; SCF) 또는 G-CSF에 의해 자극될 수 있다. 이들 전구세포는 말초혈액으로부터 임의로 수집되어 농축된 다음, 임의로 SCF, G-CSF, IL-3, GM-CSF, IL-6 또는 IL-11을 포함하나 이로 한정되지 않는 하나 이상의 다른 사이토카인과 병용하여 TPO 및 모방체로 배양 중에 처리되어, 고밀도 거대핵세포 배양물로 분화 및 증식된 다음, 임의로 고용량 화학요법 이후에 환자에게 다시 돌려보내진다. 골수의 생체 외 처리를 위한 TPO의 용량은 100 pg/㎖ 내지 10 ng/㎖, 바람직하게는 500 pg/㎖ 내지 3 ng/㎖의 범위일 것이다. 모방체의 용량은 0.1 유니트/㎖ 내지 20 유니트/㎖, 바람직하게는 0.5 유니트/㎖ 내지 2 유니트/㎖, 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값으로 사용될 수 있는 GLP-1에 대한 활성과 동등량일 것이다.
(본 발명에 따른 적어도 하나의 항체, 이의 특정 부분 및 이의 변이체를 추가로 포함하는) 본 발명에 따른 조성물, 병용 요법, 공투여, 장치 및/또는 방법에 적합한 TNF 길항제는 항-TNF 항체, 이의 리간드-결합 단편, 및 TNF에 특이적으로 결합하는 수용체 분자; TNF 합성, TNF 방출 또는 표적 세포에 대한 이의 작용을 방해 및/또는 억제하는 화합물, 예컨대 탈리도마이드, 테니답, 포스포디에스테라제 억제제(예컨대, 펜톡시필린 및 롤리프람), A2b 아데노신 수용체 작용제 및 A2b 아데노신 수용체 인핸서; TNF 수용체 시그널링을 방해 및/또는 억제하는 화합물, 예컨대 미토겐 활성 단백질(mitogen activated protein; MAP) 키나아제 억제제; 막 TNF 절단을 차단 및/또는 억제하는 화합물, 예컨대 금속단백분해효소 억제제; TNF 활성을 차단 및/또는 억제하는 화합물, 예컨대 안지오텐신 전환 효소(ACE) 억제제(예컨대, 캅토프릴); 및 TNF 생성 및/또는 합성을 차단 및/또는 억제하는 화합물, 예컨대 MAP 키나아제 억제제가 포함되나 이들에 한정되지 않는다.
본원에 사용된, "종양 괴사 인자 항체", "TNF 항체", "TNFα 항체" 또는 단편 등은 시험관 내, 인 시츄 및/또는 바람직하게는 생체 내에서 TNFα활성을 감소, 차단, 억제, 폐지 또는 방해한다. 예를 들어, 본 발명의 적합한 TNF 인간 항체는 TNFα와 결합할 수 있고, 항-TNF 항체, 이의 항원-결합 단편 및 TNFα에 특이적으로 결합하는 이의 특정 돌연변이 또는 도메인을 포함하지만, 이로 제한되는 것은 아니다. 적합한 TNF 항체 또는 단편은 또한 TNF RNA, DNA 또는 단백질 합성, TNF 방출, TNF 수용체 시그널링, 막 TNF 절단, TNF 활성, TNF 생성 및/또는 합성을 감소, 차단, 폐지, 방해, 방지 및/또는 억제할 수 있다.
키메라 항체 cA2는 고친화도로 중화하는 마우스 항-인간 TNFαIgG1 항체의 항원 결합 가변 영역 A2 및 인간 IgG1의 불변 영역인 카파 면역글로불린으로 구성 된다. 인간 IgG1 Fc 영역은 동종이형 항체 작동 기능을 향상시키고, 순환 혈청 반감기를 증가시키고 항체의 면역원성을 감소시킨다. 키메라 항체 cA2의 화합력 및 에피토프 특이성은 뮤린 항체 A2의 가변 영역으로부터 유래된다. 특정 구체예에서, 뮤린 항체 A2의 가변 영역을 코딩하는 핵산에 대한 바람직한 소스는 A2 하이브리도마 세포주이다.
키메라 A2(Chimeric A2; cA2)는 천연 및 재조합 인간 TNFα의 세포독성 효과를 모두 용량 의존 방식으로 중화한다. 키메라 항체 cA2 및 재조합 인간 TNFα의 결합 분석으로부터, 키메라 항체 cA2의 친화도 상수는 1.04×1010 M-1인 것으로 계산되었다. 경쟁적 억제에 의해 모노클로날 항체 특이성 및 친화도를 결정하는 바람직한 방법은 문헌 Harlow, et al ., Antibodies : Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1988; Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, New York, (1992-2003); Kozbor et al ., Immunol . Today, 4:72-79 (1983); Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York (1987-2003); 및 Muller, Meth . Eneymol., 92: 589-601 (1983)에서 찾아볼 수 있으며, 이들 참고문헌은 모두 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 발명에 사용될 수 있는 모노클로날 항-TNF 항체의 추가 예가 문헌에 개시되어 있다[참조 예: 미국 특허 제 5,231,024호; Moeller, A. et al ., Cytokine 2 (3): 162-169 (1990); 미국출원 제 07/943,852호(1992년 9월 11일 출원); Rathjen et al ., 국제출원공개 WO 91/02078(1991년 2월 21일 공개); Rubin et al., EPO 특허 공개 제 0 218 868호(1987년 4월 22일 공개); Yone et al., EPO 특허 공개 제 0 288 088호(1988년 10월 26일 공개); Liang, et al ., Biochem . Biophys . Res . Comm. 137: 847-854 (1986); Meager, et al ., Hybridoma 6: 305-311 (1987); Fendly et al., Hybridoma 6: 359-369 (1987); Bringman, et al., Hybridoma 6: 489-507 (1987); 및 Hirai, et al ., J. Immunol . Meth. 96: 57-62 (1987), 이들 문헌은 모두 참고로서 본 명세서에 포함된다].
TNF 수용체 분자. 본 발명에 유용한 바람직한 TNF 수용체 분자는 TNFα와 높은 친화도로 결합하는 것들이고[참조 예: Feldmann et al., 국제출원공개 WO 92/07076(1992년 4월 30일 공개); Schall et al., Cell 61: 361-370 (1990); 및 Loetscher et al ., Cell 61: 351-359 (1990), 이들 참고문헌은 모두 본 명세서에 참고로서 포함된다], 임의로 낮은 면역원성을 지닌다. 특히, 55 kDa(p55 TNF-R) 및 75 kDa(p75 TNF-R) TNF 세포 표면 수용체가 본 발명에 유용하다. 수용체의 세포 외 도메인(extracellular domains; ECD) 또는 이의 기능성 부분을 포함하는 이들 수용체의 절단된 형태[참조 예: Corcoran et al ., Eur .J. Biochem . 223: 831-840 (1994)]이 또한 본 발명에 유용하다. ECD를 포함하는 TNF 수용체의 절단된 형태는 소변 및 혈청에서 30 kDa 및 40 kDa TNFα 억제 결합 단백질로서 검출된다(Engelmann, H. et al ., J. Biol . Chem. 265: 1531-1536 (1990)). TNF 수용체 멀 티머 분자 및 TNF 면역수용체 융합 분자 및 이의 유도체 및 단편 또는 부분이 본 발명의 방법 및 조성물에 유용한 TNF 수용체 분자의 추가적인 예이다. 본 발명에 사용될 수 있는 TNF 수용체 분자는 징후의 훌륭한 내지 뛰어난 완화 및 저독성으로 연장된 기간 동안 환자를 치료하는 이의 능력에 의해 특징지워진다. 낮은 면역원성 및/또는 고친화도 및 다른 정의되지 않은 특성이 달성될 치료 결과에 기여할 수 있다.
본 발명에 유용한 TNF 수용체 멀티머 분자는 하나 이상의 폴리펩티드 링커 또는 다른 비펩티드 링커, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 통해 연결된 둘 이상의 TNF 수용체의 ECD의 전체 또는 기능성 부분을 포함한다. 멀티머 분자는 멀티머 분자의 발현을 지시하는 분비 단백질의 신호 펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 이들 멀티머 분자 및 이의 제조방법이 미국 특허출원 제 08/437,533호(1995년 5월 9일 출원)에 개시되어 있고, 상기 출원의 내용은 본 명세서에 참고로서 포함된다.
본 발명의 방법 및 조성물에 유용한 TNF 면역 수용체 융합 분자는 하나 이상의 TNF 수용체의 전체 또는 기능성 부분, 및 하나 이상의 면역글로불린 분자의 적어도 한 부분을 포함한다. 이들 면역 수용체 융합 분자는 모노머, 또는 헤테로- 또는 호모-멀티머로서 조합될 수 있다. 면역 수용체 융합 분자는 또한 일가 또는 다가일 수 있다. 이러한 TNF 면역수용체 융합 분자의 예는 TNF 수용체/IgG 융합 단백질이다. TNF 면역 수용체 융합 분자 및 이의 제조방법이 문헌에 개시되어 있다[Lesslauer et al ., Eur .J. Immunol. 21: 2883-2886 (1991); Ashkenazi et al ., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 88: 10535-10539 (1991); Peppel et al ., J. Exp . Med . 174: 1483-1489 (1991); Kolls et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 91: 215-219 (1994); Butler et al ., Cytokine 6(6): 616-623 (1994); Baker et al ., Eur.J.Immunol. 24:2040-2048 (1994); Beutler et al., 미국 특허 제5,447, 851호; 및 미국 특허출원 제08/442,133호(1995년 5월 16일 출원), 이들 참고문헌은 모두 본명세서에 참고로서 포함된다]. 면역 수용체 융합 분자의 제조방법을 문헌 Capon et al., 미국 특허 제 5,116,964호; Capon et al., 미국 특허 제 5,225,538호; 및 Capon et al., Nature 337: 525-531 (1989)에서 찾아볼 수 있으며, 이들 참고문헌은 모두 참고로서 본 명세서에 포함된다.
TNF 수용체 분자의 기능성 동등물, 유도체, 단편 또는 영역은 TNF 수용체 분자의 부분, 또는 TNF 수용체 분자를 코딩하는 TNF 수용체 분자 서열의 부분, 즉 본 발명에 사용될 수 있는 TNF 수용체 분자를 기능적으로 닮은 충분한 크기 및 서열의 부분을 의미한다(예: TNFα와 고친화도로 결합하고 낮은 면역원성을 가짐). TNF 수용체 분자의 기능성 동등물은 또한 본 발명에 사용될 수 있는 TNF 수용체 분자와 기능적으로 유사한 변형 TNF 수용체 분자가 포함된다(예: TNFα와 고친화도로 결합하고 낮은 면역원성을 가짐). 예를 들어, TNF 수용체 분자의 기능성 동등물은 "SILENT" 코돈 또는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 가질 수 있다(예, 한 산성 아미노산을 다른 산성 아미노산으로 치환; 또는 소수성 아미노산을 코딩하는 한 코돈에 대한 동일 또는 상이한 소수성 아미노산을 코딩하는 하나의 코돈의 치환). Ausubel et al ., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience, New York (1987-2003)을 참조할 수 있 다.
사이토카인은 모든 공지된 사이토카인을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. CopewithCytokines.com을 참조할 수 있다. 사이토카인 길항제는 임의의 항체, 단편 또는 모방체, 임의의 가용성 수용체, 단편 또는 모방체, 임의의 소분자 길항제, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 임의의 방법은 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체를 포함하는 유효량의 조성물 또는 약제학적 조성물을 조절, 처리 또는 치료가 필요한 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 단백질 매개 질환을 치료하는 방법을 포함할 수 있다. 이 방법은 임의로 면역 질환을 치료하기 위한 공투여 또는 병용 요법을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체의 투여는 IL-3, -6 및 -11; 줄기 세포 인자; G-CSF 및 GM-CSF와 같은 적어도 하나의 다른 사이토카인 중으로부터 선택된 적어도 하나를 이전, 도중 및/또는 이후에 투여하는 것을 추가로 포함한다.
전형적으로, 병리학적 증상의 치료는 유효량 또는 투여량의 적어도 하나의 GLP-1 모방체 조성물을 투여하는 것에 의해 달성되며, 그 유효량 또는 투여량은 총, 평균적으로 적어도 약 0.0001 내지 500 밀리그램의 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체/투여량당 환자의 킬로그램, 및 바람직하게는 적어도 약 0.001 내지 100 밀리그램의 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체/단일 또는 다중 투여당 환자의 킬로그램이며, 이것은 조성물 중에 함유 되는 특정 활성에 따라 다르다. 다르게는, 효과적인 혈청 농도는 단일 또는 다중 투여량당 0.001-5000 ㎍/㎖ 혈청농도를 포함할 수 있다. 적합한 용량이 의사들에게 공지되어 있으며, 물론 특정 질환 상태, 투여되는 조성물의 특정 활성 및 치료중인 특정 환자에 따라 달라질 것이다. 어떤 경우, 목적하는 치료적 양을 달성하기 위해, 반복 투여하는 것, 즉 특정의 모니터링 또는 계량 용량을 목적하는 일일 용량 또는 효과가 달성될 때까지 개별적인 투여를 반복하는 것이 필요할 수 있다.
바람직한 용량은 임의로 0.0001, 0.0002, 0.0003, 0.0004, 0.0005, 0.0006, 0.0007, 0.0008, 0.0009, 0.001, 0.002, 0.003, 0.004, 0.005, 0.006, 0.007, 0.008, 0.009, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 및/또는 30 mg/kg/투여, 또는 이의 임의의 범위, 값 또는 부분을 포함할 수 있거나, 단일 또는 다중 투여당 혈청 농도 0.0001, 0.0002, 0.0003, 0.0004, 0.0005, 0.0006, 0.0007, 0.0008, 0.0009, 0.001, 0.002, 0.003, 0.004, 0.005, 0.006, 0.007, 0.008, 0.009, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.5, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.5, 1.9, 2.0, 2.5, 2.9, 3.0, 3.5, 3.9, 4.0, 4.5, 4.9, 5.0, 5.5, 5.9, 6.0, 6.5, 6.9, 7.0, 7.5, 7.9, 8.0, 8.5, 8.9, 9.0, 9.5, 9.9, 10, 10.5, 10.9, 11, 11.5, 11.9, 20, 12.5, 12.9, 13.0, 13.5, 13.9, 14.0, 14.5, 4.9, 5.0, 5.5, 5.9, 6.0, 6.5, 6.9, 7.0, 7.5, 7.9, 8.0, 8.5, 8.9, 9.0, 9.5, 9.9, 10, 10.5, 10.9, 11, 11.5, 11.9, 12, 12.5, 12.9, 13.0, 13.5, 13.9, 14, 14.5, 15, 15.5, 15.9, 16, 16.5, 16.9, 17, 17.5, 17.9, 18, 18.5, 18.9, 19, 19.5, 19.9, 20, 20.5, 20.9, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96, 100, 200, 300, 400 및/또는 500 ㎍/㎖, 또는 이의 임의의 범위, 값 또는 부분의 혈청 농도를 달성하도록 포함할 수 있다.
별도로, 투여되는 용량은 공지된 인자, 예컨대 특정 제제의 약역학적 성질 및 이의 투여 모드 및 경로; 환자의 연령, 건강 및 체중; 증상의 성질 및 정도, 동시 치료의 종류, 치료의 빈도, 및 목적하는 효과에 따라 달라질 수 있다. 통상, 활성 성분의 용량은 체중 1 킬로그램당 약 0.0001 내지 100 밀리그램일 수 있다. 대체로, 0.001 내지 10, 바람직하게는 0.001 내지 1 밀리그램/킬로그램/투여 또는 서방형이 목적하는 결과를 얻는데 효과적이다.
비제한적인 예로서, 인간 또는 동물의 치료는 본 발명의 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체의 일회 또는 기간 투여로서, 0.0001 내지 100 mg/kg, 이를 테면 일일 0.0002, 0.0003, 0.0004, 0.0005, 0.0006, 0.0007, 0.0008, 0.0009, 0.001, 0.002, 0.003, 0.004, 0.005, 0.006, 0.007, 0.008, 0.009, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.9, 1.0, 1.1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 mg/kg을 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40일 중 적어도 하루, 또는 다르게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20주 중 적어도 한주, 또는 이의 임의의 조합으로 단일, 융합 또는 반복 용량을 사용하여 제공될 수 있다.
체내 투여에 적합한 제형(조성물)은 일반적으로 유니트 또는 용기당 약 0.0001 밀리그램 내지 약 500 밀리그램의 활성 성분을 함유한다. 이들 약제학적 조성물에서, 활성 성분은 대체로 조성물의 총 중량을 기준으로 하여 약 0.5 내지 99.999 중량%의 양으로 존재할 것이다.
비경구 투여의 경우, GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체는 약제학적으로 허용되는 비경구 비히클과 함께 또는 별도로, 제공되는 동결건조 분말, 에멀젼, 현탁액 또는 용액으로서 제제화될 수 있다. 이러한 비히클의 예는 물, 염수, 링겔액, 덱스트로스 용액, 및 5% 인간 혈청 알부민이 있다. 리포좀 및 비수성 비히클, 예컨대 고정유가 또한 사용될 수 있다. 비히클 또는 동결건조 분말은 등장성(예, 염화나트륨, 만니톨) 및 화학적 안정성(예, 완충액 및 보존제)을 유지시키는 첨가제를 함유할 수 있다. 제제는 공지되거나 적합한 기술에 의해 멸균된다.
적합한 약제학적 담체가 이 분야에 있어서 표준 참고서인 레밍톤(Remington)의 Pharmaceutical Sciences, A. Osol의 최신판에 개시되어 있다.
치료적 투여. 많은 공지되고 개발된 방식이 본 발명에 따른 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체의 약제학적 유효량을 투여하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 GLP-1 모방체는 흡입 또는 본원에서 기재되거나 당업계에 공지된 다른 방식에 따라 투여에 적합한 다양한 장치 및 방법 중 임의의 것을 이용하 여, 용액, 에멀젼, 콜로이드 또는 현탁액으로서 담체 중에 운반될 수 있다.
비경구 제제 및 투여. 비경구 투여를 위한 제제는 통상의 부형제로서 멸균수 또는 염수, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리알킬렌 글리콜, 식물성 오일, 수소화된 나프탈렌 등을 함유할 수 있다. 주사를 위한 수성 또는 유성 현탁액은 공지된 방법에 따라 적당한 유화제 또는 습윤화제 및 현탁제제를 이용하여 제조될 수 있다. 주사를 위한 제제는 용매 중의 수용액 또는 멸균 주사용액 또는 현탁액과 같은 비-독성, 비-경구적으로 투여가능한 희석제일 수 있다. 사용할 수 있는 담체 또는 용매로서, 물, 링겔액, 등장성 염수 등이 허용되며; 일반적인 용매 또는 현탁 용매로서, 멸균 비휘발성 오일이 이용될 수 있다. 이 목적을 위해 천연 또는 합성 또는 반합성 지방 오일 또는 지방산; 천연 또는 합성 또는 반합성의 모노- 또는 디- 또는 트리-글리세리드를 포함하는 비휘발성 오일 및 지방산의 임의의 종류가 사용될 수 있다. 비경구 투여는 당업계에 공지되어 있으며, 이로 제한되는 것은 아니나, 본원에서 전체 내용이 본 명세서에 참고로서 포함된, 미국 특허 제5,851,198호에 기술된 가스 압력 무-바늘 주사 장치, 및 미국 특허 제 5,839,446호에 기술된 레이저 천공 장치를 포함한다.
별도의 전달. 본 발명은 추가로, 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 볼루스, 질, 직장, 볼, 설하, 비강내, 또는 경피 수단에 의한 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체의 투여에 관한 것이다. 단백질, GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체 조성물은 비경구(피하, 근육내 또는 정맥내) 투여를 위해 특히 액제 또는 현탁액의 형태로; 질 또는 직장 투여에서의 사용을 위해 특히 크림제 및 좌제와 같은 반고체 형태로; 볼, 또는 설하 투여를 위해 특히 정제 또는 캡슐제의 형태로; 또는 비강내 사용을 위해 특히 분말, 또는 비점적제 또는 에어로졸 또는 특정 제제의 형태로; 또는 경피적 사용을 위해 특히 겔, 연고, 로션, 현탁액 또는 피부 구조를 변경시키거나 경피 패치에서의 약물 농도를 증가시키기 위한 디메틸 설폭사이드와 같은 화학적 인핸서를 갖거나(Junginger, et al. In "Drug Permeation Enhancement"; Hsieh, D.S., Eds., pp. 59-90(Marcel Dekker, Inc. New York 1994, 본원에 전체내용이 참고로서 포함됨), 또는 단백질 및 펩티드를 함유하는 제제의 피부로의 적용을 가능하게 하는 산화 제제를 갖거나(WO 98/53847), 또는 일렉트로포레이션과 같은 일시적 운송 경로를 형성하는 전기장의 적용을 갖거나, 또는 이온 영동법과 같이 피부를 통해 대전된 약물의 움직임을 증가시키거나, 또는 초음파 치료와 같은 초음파의 적용을 갖는(미국 특허 제 4,309,989호 및 제 4,767,402호)(상기 문헌 및 특허는 본원에서 참고문헌으로서 전체로서 포함됨) 패치 전달 시스템의 형태로 제조될 수 있다.
폐/비강 투여. 폐 투여에 대해, 바람직하게는 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체 조성물은 폐 또는 공동의 더 작은 기도에 도달하기에 효과적인 입자 크기로 전달된다. 본 발명에 따라, 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체는 흡입에 의한 치료적 제제의 투여를 위해 당업계에 공 지된 다양한 흡입 또는 비강용 장치 중 임의의 것에 의해 전달될 수 있다. 환자의 공강 또는 꽈리 내에 에어로졸화된 제제 dGLP-1을 두는 것이 가능한 이러한 장치는 계량 투여 흡입기, 분무기, 건조 분말 생성기, 스프레이 등을 포함한다. GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체의 폐 또는 비강용 투여를 지시하는 적합한 다른 장치가 당업계에 공지되어 있다. 그러한 모든 장치는 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체를 에어로졸로 분산시켜 투여하기에 적합한 제제를 이용할 수 있다. 그러한 에어로졸은 용액(수성 및 비수성 모두) 또는 고체 입자로 구성될 수 있다. Ventolin® 계량 투여 흡입기와 같은 계량 투여 흡입기는 일반적으로 추진 가스를 이용하며, 흡기 동안의 발동을 요구한다(예컨대, WO 94/16970, WO 98/35888 참조). TurbuhalerTM(Astra), Rotahaler®(Glaxo), Diskus®(Glaxo), SpirosTM 흡입기(Dura), Inhale Therapuetics에 의해 판매되는 장치, 및 Spinhaler® 분말 흡입기(Fisons)와 같은 건조 분말 흡입기는 혼합 분말의 호흡-발동을 이용한다(US 4668218 Astra, EP 237507 Astra, WO 97/25086 Glaxo, WO 94/08552 Dura, US 5458135 Inhale, WO 94/06498 Fisons, 본원에 전체 내용이 참고로서 포함됨). AERxTM Aradigm, Ultravent® 분무기(Mallinckrodt), 및 AcornII® 분무기(Marquest Medical Products)(US 5404871 Aradigm, WO 97/22376)와 같은 분무기는 용액으로부터 에어로졸을 만들어지만, 계량 투여 흡입기, 건조 분말 흡입기 등은 소입자 에어로졸을 생성하며, 상기 참고 문헌의 전체 내용이 본원에 참고로서 포함된다. 상업적으로 이용가능한 흡입 장치의 특정 예는 본 발명의 실시를 위해 적합한 특정 장치에 대해 대표적인 것을 나타내며, 본 발명의 범위가 이로 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체를 포함하는 조성물은 건조분말 흡입기 또는 스프레이에 의해 전달된다. 본 발명의 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체를 투여하기 위한 흡입 장치에는 여러가지 바람직한 특성이 있다. 예를 들어, 흡입 장치에 의한 전달은 이롭게는 신뢰가능하고, 재생산가능하고 정확하다. 흡입 장치는 좋은 흡입성을 위해 예컨대, 약 10 ㎛ 미만, 바람직하게는 약 1-5 ㎛ 미만의 소 건조 입자를 임의로 전달할 수 있다.
스프레이로서 GLP -1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체 조성물의 투여. GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체 조성물 단백질을 포함하는 스프레이는 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체의 현탁액 또는 용액을 압력하에서 노즐을 통해 밀어냄으로써 생성될 수 있다. 노즐 크기 및 구조, 적용 압력 및 액체 공급 속도는 원하는 결과 및 입자 크기를 달성하기 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 일렉트로스프레이는 모세관 또는 노즐 공급과 연결된 전기장에 의해 생산될 수 있다. 이롭게는, 스프레이에 의해 전달되는 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체 조성물 단백질의 입자는 약 10 ㎛ 이하, 바람직하게는 약 1 ㎛ 내지 약 5 ㎛, 그리고 가장 바람직하게는 약 2 ㎛ 내지 약 3 ㎛의 범위의 입자 크기를 갖는다.
스프레이와 함께 사용하기에 적합한 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체 조성물 단백질의 제제는 일반적으로 용액 ㎖ 당 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체 조성물 단백질을 약 1 mg 내지 약 20 mg의 농도로, 수용액 중에 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체 조성물 단백질을 포함한다. 제제는 부형제, 완충액, 등장성 제제, 보존제, 계면 활성제 및 바람직하게는 아연과 같은 약제를 포함할 수 있다. 제제는 또한 완충액, 환원제, 벌크 단백질, 또는 탄수화물과 같은, GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체 조성물 단백질의 안정화를 위한 부형제 또는 약제를 포함할 수 있다. GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체 조성물 단백질을 제제화하는데 사용되는 벌크 단백질은 알부민, 프로타민 등을 포함한다. GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체 조성물 단백질을 제제화하는데 사용되는 전형적인 탄수화물은 수크로오스, 만니톨, 락토오스, 트레할로스, 포도당 등을 포함한다. GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체 조성물 단백질 제제는 또한 에어로졸을 형성함에 있어서 용액의 원자화에 의해 야기되는 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체 조성물 단백질의 표면-유도된 응집을 감소하거나 예방할 수 있는 계면활성제를 포함할 수 있다. 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르 및 알콜, 그리고 폴리옥시에틸렌 소르비톨 지방산 에스테르와 같은 다양한 통상의 계면활성제가 사용될 수 있다. 양은 일반적으로 제제 중량에 대해 0.001 내지 14%의 범위일 것이다. 본 발명의 목적을 위해 특히 바람직한 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20 등이다. 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체와 같 은 단백질의 제제화를 위해 당업계에 공지된 추가적인 약제가 또한 제제 중에 포함될 수 있다.
분무기에 의한 GLP -1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체 조성물의 투여. GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체 조성물 단백질은 분출 분무기 또는 초음파 분무기와 같은 분무기에 의해 투여될 수 있다. 일반적으로, 분출 분무기에서는, 압축된 공기원이 구멍을 통해 고속 공기 분출을 형성하기 위해 이용된다. 노즐 너머로 가스가 확장됨에 따라, 저압력 영역이 형성되고, 이는 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체 조성물 단백질 용액을 액체 저장소와 연결된 모세관을 통해 끌어낸다. 모세관으로부터의 액체 흐름은 관을 나가면서, 불안정한 필라멘트 및 소적으로 잘려 에어로졸을 형성한다. 배열, 유속 및 조절 장치 유형의 범위는 주어진 분출 분무기로부터 원하는 수행 특성을 달성하기 위해 사용될 수 있다. 초음파 분무기에서는, 고주파 전기에너지가 일반적으로 압전 변환기를 사용하여, 진동성, 기계적 에너지를 형성하기 위해 이용된다. 이 에너지는 직접 또는 커플링된 용액을 통해 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체 조성물 단백질의 제제로 전달되어, GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체 조성물 단백질을 포함하는 에어로졸을 형성한다. 이롭게는 분무기에 의해 전달되는 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체 조성물 단백질의 입자는 약 10 ㎛ 이하, 바람직하게는 약 1 ㎛ 내지 약 5 ㎛, 가장 바람직하게는 약 2 ㎛ 내지 약 3 ㎛의 입자 크기를 갖는다.
분출 또는 초음파 분무기와 함께 사용하기에 적합한 적어도 하나의 GLP-1 모 방체 또는 특정 부분 또는 변이체의 제제는, 일반적으로 용액 ㎖ 당 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체 단백질을 약 1 mg 내지 약 20 mg의 농도로, 수용액 중에 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체 조성물 단백질을 포함한다. 제제는 부형제와 같은 제제, 완충액, 등장성 제제, 보존제, 계면활성제 및 바람직하게는 아연을 포함할 수 있다. 제제는 또한 완충액, 환원제, 벌크 단백질, 또는 탄수화물과 같은, 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체 조성물 단백질의 안정화를 위한 부형제 또는 제제를 포함할 수 있다. 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체 조성물 단백질을 제제화하는데 사용되는 벌크 단백질은 알부민, 프로타민 등을 포함한다. 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체를 제제화하는데 사용되는 전형적인 탄수화물은 수크로오스, 만니톨, 락토오스, 트레할로스, 포도당 등을 포함한다. 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체 제제는 또한 에어로졸을 형성함에 있어서 용액의 원자화에 의해 야기되는 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체의 표면-유도된 응집을 감소시키거나 예방할 수 있는 계면활성제를 포함할 수 있다. 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르 및 알콜, 그리고 폴리옥시에틸렌 소르비톨 지방산 에스테르와 같은 다양한 통상의 계면활성제가 사용될 수 있다. 양은 일반적으로 제제의 0.001 내지 4 중량%의 범위일 것이다. 본 발명의 목적을 위해 특히 바람직한 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20 등이다. 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체 단백질과 같은 단백질의 제제화를 위해 당업계에 공지된 추가적인 시약이 또한 제제 중에 포함될 수 있다.
계량 투여 흡입기에 의한 GLP -1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체 조성물의 투여. 계량 투여 흡입기(metered dose inhaler; MDI)에서는, 추진제, 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체, 및 임의의 부형제 또는 기타 첨가제가 액화 압축 가스를 포함하는 혼합물로서 캐니스터 내에 함유된다. 계량 밸브의 작동은 바람직하게는, 약 10 ㎛ 이하, 바람직하게는 약 1 ㎛ 내지 약 5 ㎛, 가장 바람직하게는 약 2 ㎛ 내지 약 3 ㎛의 크기 범위의 입자를 함유하는 에어로졸로서 혼합물을 방출한다. 바람직한 에어로졸 입자 크기는 분출-연마, 스프레이 건조, 임계점 응축 등을 포함하는, 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 생산된 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체 조성물 단백질의 제제를 사용하여 얻을 수 있다. 바람직한 계량 투여 흡입기는 3 M 또는 Glaxo에 의해 제작된 것을 포함하고, 하이드로플루오로카본 추진제를 사용한다.
계량-투여 흡입기 장치와 함께 사용되는 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체의 제제는 일반적으로 비수성 매질 중의 현탁액, 예를 들어, 계면 활성제의 도움으로 추진제 중에 현탁됨으로서 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체를 함유하는 미세하게 분할된 분말을 포함할 것이다. 추진제는 트리클로로플루오로메탄, 디클로로디플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄올 및 1,1,1,2-테트라플루오로에탄, HFA-134a(하이드로플루오로알칸-134a), HFA-227(하이드로플루오로알칸-227) 등을 포함하는 클로로플루오로카본, 하이드로 클로로플루오로카본, 하이드로플루오로카본, 또는 하이드로카본과 같은 본 목적을 위해 사용되는 임의의 통상적인 물질일 수 있다. 바람직하게는 추진제는 하이드로플루오로카본이다. 계면활성제는 화학적 분해 등으로부터 활성 제제를 보호하기 위해, 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체를 추진제 중에 현탁액으로서 안정화시키기 위해 선택될 수 있다. 적합한 계면활성제는 소르비탄 트리올레이트, 소야 레시틴, 올레산 등을 포함한다. 일부 경우에서, 용액 에어로졸은 에탄올과 같은 용매를 이용하는 것이 바람직하다. 단백질과 같은 단백질의 제제화를 위해 당업계에 공지된 추가적인 제제가 또한 제제 중에 포함될 수 있다.
당업자는 본 발명의 방법이 본원에서 기술되지 않은 장치를 통하여 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체 조성물의 폐 투여에 의해 달성될 수 있음을 인지할 것이다.
점막용 제제 및 투여. 점막 표면을 통한 흡착을 위해, 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체의 조성물 및 투여 방법은 다수의 미크론 이하 입자, 점막부착성 마크로분자, 생활성 펩티드, 및 수성 연속상을 포함하는 에멀젼을 포함하고, 이들은 에멀젼 입자를 점막부착시켜 점막 표면을 통한 흡착을 촉진시킨다(미국 특허 제 5,514,670호). 본 발명의 에멀젼을 적용하기에 적합한 점막 표면은 각막, 결막, 볼, 설하, 코, 질, 폐, 위, 장, 및 직장 투여 경로를 포함할 수 있다. 질 또는 직장 투여를 위한 제형, 예컨대 좌약은 부형제로서, 예를 들어, 폴리알킬렌글리콜, 바셀린, 코코아버터 등을 포함할 수 있다. 비강내 투여를 위한 제형은 고체일 수 있고, 부형제로서, 예를 들어 락토오스를 포함하거나, 비점적을 위한 수성 또는 유성 용액일 수 있다. 볼 투여를 위한 부형제는 당, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 프리젤리네이틴화 전분(pregelinatined starch) 등을 포함한다(미국 특허 제 5,849,695호).
경구 제제 및 투여. 경구용 제제는 장벽 투과성을 인공적으로 증가시키기 위한 어쥬번트(예컨대, 레소르시놀, 및 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르와 n-헥사데실폴리에틸렌 에테르와 같은 비이온 계면활성제)의 공-투여 및 효소 분해를 억제하기 위한 효소 억제제[예컨대, 이자 트립신 억제제, 디이소프로필플루오로포스페이트 (DFF) 및 트라실롤]의 공-투여에 달려있다. 경구 투여를 위한 고형 투여형의 활성 구성 화합물은 수크로오스, 락토오스, 셀룰로스, 만니톨, 트레할로스, 라피노스, 말티톨, 덱스트란, 전분, 아가, 아르기네이트, 키틴, 키토산, 펙틴, 트라가칸스 검, 아라비아 검, 젤라틴, 콜라겐, 카세인, 알부민, 합성 또는 반합성 폴리머, 및 글리세리드를 포함하는 적어도 하나의 첨가제와 혼합될 수 있다. 상기 투여형은 또한 다른 유형(들)의 첨가제, 예컨대, 불활성 희석제, 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제, 파라벤, 소르브산과 같은 보존제, 아소코브산, 알파-토코페롤, 시스테인과 같은 항산화제, 붕해제, 결합제, 농후제, 완충액, 감미제, 향미제, 방향제 등을 함유할 수 있다.
정제 및 환제는 추가로 장용 코팅된 제제로 가공될 수 있다. 경구 투여용 액체 제제는 의학적 용도가 허용되는 에멀젼, 시럽, 엘릭시르, 현탁액 및 용액 제 제를 포함한다. 이러한 제제는 상기 분야에서 통상적으로 사용되는 불활성 희석 제제, 예컨대 물을 함유할 수 있다. 리포좀은 또한 인슐린 및 헤파린에 대한 약물 전달 시스템으로서 기술된 바 있다(미국 특허 제 4,239,754호). 보다 최근에는, 혼합된 아미노산(프로테노이드)의 인공 폴리머의 마이크로스피어가 약물을 전달하기 위해 사용된 바 있다(미국 특허 제 4,925,673호). 또한, 미국 특허 제5,879,681호 및 미국 특허 제 5,871,753호에서 기술된 생물학적 활성 제제를 경구적으로 전달하기 위해 사용되는 담체 화합물이 당업계에 공지되어 있다.
경피 제제 및 투여. 경피 투여를 위해, 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체는 리포좀 또는 폴리머 나노입자, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 또는 마이크로스피어(다르게 언급하지 않는 한 마이크로입자와 같이 집합적인 것을 말함)와 같은 전달 장치 중에 캡슐화된다. 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 이의 공중합체와 같은 폴리하이드록시산, 폴리오르토에스테르, 폴리언하이드라이드, 및 폴리포스파진과 같은 합성 폴리머, 및 콜라겐, 폴리아미노산, 알부민 및 기타 단백질, 아르기네이트와 같은 천연 폴리머 및 기타 폴리사카라이드, 및 이의 조합으로 만들어진 마이크로입자를 포함하는 많은 수의 적합한 장치가 공지되어 있다(미국 특허 번호 제 5,814,599호).
장기 투여 및 제형. 장기 기간 동안, 예를 들어, 단일 투여로부터 1 주 내지 1년의 기간에 걸쳐 대상에게 본 발명의 화합물을 전달하는 것이 종종 필요할 수 있다. 다양한 서방제, dGLP-1t, 임플란트 투여형이 이용될 수 있다. 예를 들어, 투여형은 예를 들어, (a) 인산, 황산, 시트르산, 타르타르산, 탄닌산, 파모산, 알긴산, 폴리글루탐산, 나프탈렌 모노- 또는 디- 설폰산, 폴리갈락투론산 등과 같은 폴리염기산과의 산 부가염; (b) 아연, 칼슘, 비스무트, 바륨, 마그네슘, 알루미늄, 구리, 코발트, 니켈, 카드뮴 등과 같은 다가 금속 양이온을 갖거나, 예컨대, N,N'-디벤질-에틸렌디아민 또는 에틸렌디아민으로부터 형성된 유기 양이온을 갖는 염; 또는 (c) 예컨대, 아연 탄네이트 염과 같은 (a) 및 (b)의 결합과 같은 체액 중에서 낮은 용해도를 가지는 화합물의 약제학적으로 허용되는 무독성염을 함유할 수 있다. 추가적으로, 본 발명의 화합물, 또는 바람직하게는 상기 기술된 것과 같은 상대적으로 불용성인 염은 주사에 적합한 것, 예컨대, 참깨유와 함께 겔, 예컨대, 알루미늄 모노스테아레이트 겔로 제제화될 수 있다. 특히 바람직한 염은 아연 염, 아연 탄네이트 염, 파모에이트 염 등이다. 주사용 서방성 dGLP-1t 제제의 다른 형태는 예를 들어 미국 특허 제 3,773,919호에서 기술된 폴리락트산/폴리글리콜산 폴리머와 같은 느리게 분해되는, 무독성, 비항원성 폴리머 중에 캡슐화되는 분산된 화합물 또는 염을 함유할 것이다. 본 발명의 화합물, 또는 바람직하게는 상술한 것과 같은 상대적으로 불용성인 염은 또한 특히 동물에 사용하기 위해 콜레스테롤 기질 실라스틱(silastic) 펠렛 중에 제형화될 수 있다. 추가적인 서방제, dGLP-1t 또는 임플란트 제제, 예컨대, 가스 또는 액체 리포좀이 문헌에 공지되어 있다(미국 특허 제 5,770,222호 및 "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", J.R.Robinsoned., Marcel Dekker, Inc., N.Y., 1978).
일반적으로 기재된 본 발명은 하기 실시예를 참조함으로써 보다 쉽게 이해될 수 있으나, 하기 실시예는 설명의 한 방편으로서, 본 발명을 제한하려는 의도는 아니다.
실시예 1: 포유동물 세포에서 GLP -1 모방체의 클로닝 및 발현. 일반적인 포유동물 발현 벡터는 mRNA의 전사 개시를 매개하는 적어도 하나의 프로모터 요소, GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체를 코딩하는 서열, 및 전사의 정지 및 전사물의 폴리아데닐화에 필요한 신호를 함유한다. 추가 요소는 인핸서, Kozak 서열 및 RNA 스플라이싱에 대한 공여자 및 수여자 부위로 프랭킹되는, 끼어드는 서열을 포함한다. 고 효율 전사는 SV40에서 유래한 초기 및 후기 프로모터, 레트로바이러스 (예컨대, RSV, HTLⅥ, HIⅥ)에서 유래한 긴 말단 반복(long terminal repeats; LTRS), 및 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus; CMV)의 초기 프로모터에 의해 달성될 수 있다. 그러나, 세포 요소가 또한 이용될 수 있다(예컨대, 인간 액틴 프로모터). 본 발명을 실시하는데 사용되는 적합한 발현 벡터는 예를 들어, pIRES1neo, pRetro-Off, pRetro-On, PLXSN, 또는 pLNCx(Clonetech Labs, Palo Alto, CA), pcDNA3.1(+/-), pcDNA/Zeo(+/-) 또는 pcDNA3.1/Hygro (+/-)(Invitrogen), PSVL 및 PMSG(Pharmacia, Uppsala, Sweden), pRSVcat(ATCC 37152), pSV2dhfr(ATCC 37146) 및 pBC12MI(ATCC 67109)과 같은 벡터를 포함한다. 사용될 수 있는 포유동물 숙주 세포는 인간 Hela 293, H9 및 Jurkat 세포, 마우스 NIH3T3 및 C127 세포, Cos 1, Cos 7 및 CV 1, 메추라기 QC1-3 세포, 마우스 L 세포 및 차이니스 햄스터 난소(Chinese hamster ovary; CHO) 세포를 포함한다.
별도로, 유전자는 염색체로 통합된 유전자를 함유하는 안정한 세포주 내에서 발현될 수 있다. dhfr, gpt, 네오마이신, 또는 히그로마이신과 같은 선택적 마커와의 공-트랜스펙션은 트랜스펙션된 세포의 동정 및 분리를 허용한다.
트랜스펙션된 유전자는 또한 증폭되어 코딩된 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체가 다량 발현될 수 있다. DHFR(디하이드로폴레이트 환원효소) 마커는 관심 유전자를 수백 또는 수천 카피 운반하는 세포주 개발에 유용하다. 다른 유용한 선택 마커는 효소 글루타민 합성효소이다(GS)[Murphy, et al., Biochem. J. 227: 277-279(1991); Bebbington, et al., Bio/Technology 10: 169-175 (1992)]. 이들 마커를 이용하여, 포유동물 세포를 선택 배지 내에서 배양하고, 가장 높은 내성을 가진 세포를 선택한다. 이들 세포주는 염색체 내로 통합되는 증폭된 유전자(들)를 포함한다. 차이니스 햄스터 난소(CHO) 및 NSO 세포가 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체의 생산에 종종 이용된다.
발현 벡터 pC1 및 pC4는 로우스 사르코마 바이러스(Rous Sarcoma Virus, Cullen, et al., Molec. Cell. Biol. 5: 438-447 (1985))의 강력한 프로모터(strong promoter; LTR)와 CMV-인핸서의 단편(Boshart, et al., Cell 41: 521-530 (1985))을 함유한다. 예컨대, 제한 효소 절단 부위 BamHI, XbaI 및 Asp718를 갖는 다중 클로닝 부위는 대상 유전자의 클로닝을 용이하게 한다. 벡터는 추가로 3' 인트론, 랫트의 프리프로인슐린 유전자의 폴리아데닐화 및 정지 신호를 함유한 다.
CHO 세포에서의 클로닝 및 발현. 벡터 pC4가 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체의 발현을 위해 사용되었다. 플라스미드 pC4는 플라스미드 pSV2-dhfr(ATCC 수탁 번호 37146)의 유도체이다. 상기 플라스미드는 SV40 초기 프로모터의 조절하에 있는 마우스 DHFR 유전자를 함유한다. 이러한 플라스미드로 트랜스펙션된 디하이드로폴레이트 활성 결실 차이니스 햄스터 난소- 또는 다른 세포는 화학치료적 제제 메토트렉세이트가 보충된 선택 배지 중에서 세포를 배양함으로써 선택될 수 있다(예컨대, 알파 마이너스 MEM, Life Technologies, Gaithersburg, MD). 메토트렉세이트(methotrexate; MTX)에 내성을 갖는 세포 내의 DHFR 유전자 증폭은 잘 보고되어 있다[예컨대, F. W. Alt, et al., J. Biol. Chem. 253: 1357-1370 (1978); J. L. Hamlin and C. Ma, Biochem.et Biophys. Acta 1097: 107-143(1990); and M. J. Page and M. A. Sydenham, Biotechnology 9: 64-68 (1991) 참조]. MTX가 증가하는 농도 중에서 배양된 세포는 DHFR 유전자 증폭의 결과로서 표적 효소, DHFR을 과잉생산함으로써 약물에 대한 내성을 발생시킨다. 만일 제 2 유전자가 DHFR 유전자에 연결된다면, 이는 대개 공-증폭되고 과-발현된다. 이러한 접근이 1,000 카피 이상의 증폭된 유전자(들)를 운반하는 세포주를 개발하기 위해 이용될 수 있음이 당업계에 공지되어 있다. 따라서, 메토트렉세이트가 회수되면, 숙주 세포의 하나 이상의 염색체(들) 내로 통합되는 증폭된 유전자를 함유하는 세포주가 얻어진다.
관심 유전자를 발현시키기 위해, 플라스미드 pC4는 로우스 사르코마 바이러스의 긴 말단 반복(LTR)의 강한 프로모터[Cullen, et al., Molec.Cell.Biol. 5: 438-447 (1985)]와 인간 사이토메갈로바이러스(CMV)의 초기 유전자의 인핸서로부터 분리된 단편[Boshart, et al., cell 41: 521-530 (1985)]을 함유한다. 프로모터의 다운스트림은 유전자의 통합을 허용하는 BamHI, XbaI, 및 Asp718 제한 효소 절단 부위이다. 이들 클로닝 부위 외에, 플라스미드는 랫트의 프리프로인슐린 유전자의 3' 인트론 및 폴리아데닐화 부위를 함유한다. 예컨대, 인간 b-액틴 프로모터, SV40 초기 또는 후기 프로모터 또는 다른 레트로바이러스, 예컨대, HIV 및 HTL Ⅵ에서 유래된 긴 말단 반복과 같은 다른 고효율 프로모터가 또한 발현을 위해 이용될 수 있다. 클론테크사의 Tet-Off 및 Tet-On 유전자 발현 시스템 및 유사한 시스템이 포유동물 세포에서의 조절된 방식으로 GLP-1를 발현시키기 위해 사용될 수 있다[M.Gossen, and H.Bujard, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89: 5547-5551(1992)]. mRNA의 폴리아데닐화를 위해 예컨대, 인간 성장 호르몬 또는 글로빈 유전자로부터의 다른 신호가 또한 잘 이용될 수 있다. 염색체 내로 통합된 관심 유전자를 운반하는 안정한 세포주는 또한 gpt, G418 또는 히그로마이신과 같은 선택 마커와 공-트랜스펙션되어 선택될 수 있다. 하나 보다 많은 선택 마커, 예컨대, G418과 메토트렉세이트를 초기에 사용하는 것이 유리하다.
플라스미드 pC4는 제한효소로 소화시킨 후, 당업계에 공지된 방법에 따라 송아지 장 포스파타제를 이용하여 상기 제한효소를 탈인산화시켰다. 그 후, 벡터를 1% 아가로스 겔에서 분리하였다.
본 발명의 GLP-1 모방체의 HC 및 LC 가변 영역에 상응하는 완전한 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변이체를 코딩하는 DNA 서열을 공지의 방법에 따라 이용하였다. 적합한 인간 불변 영역(즉, HC 및 LC 영역)을 코딩하는 분리된 핵산이 또한 이 작제물에 이용되었다.
분리된 가변 및 불변 영역을 코딩하는 DNA 및 탈인산화된 벡터는 이후 T4 DNA 리가아제로 결찰된다. E.coli HB101 또는 XL-1 블루 세포가 이후 혈질 전환되며, 예를 들어, 제한 효소 분석을 이용하여 플라스미드 pC4 내로 삽입된 단편을 함유하는 박테리아가 동정된다.
활성 DHFR 유전자가 결실된 차이니스 햄스터 난소(CHO) 세포를 트랜스펙션에 사용하였다. 5 ㎍의 발현 플라스미드 pC4를 리포펙틴을 이용하여 0.5 ㎍의 플라스미드 pSV2-neo와 함께 공-트랜스펙션시켰다. 플라스미드 pSV2neo는 우세한 선택 마커, G418를 포함하는 항생물질 그룹에 대해 내성을 부여하는 효소를 코딩하는 유전자를 코딩하는 Tn5에서 유래된 neo 유전자를 함유한다. 세포는 1 ㎍/㎖ G418로 보충된 알파 마이너스 MEM 중에 접종된다. 2일 후, 세포를 트립신 처리하고, 10, 25, 또는 50 ng/㎖의 메토트렉세이트에 더해진 1 ㎍/㎖ G418로 보충된 알파 마이너스 MEM 중에서 하이브리도마 클로닝 플레이트(Greiner, Germany) 중에 세포를 접종하였다. 약 10-14일 후, 단일 클론을 트립신 처리한 뒤, 상이한 농도의 메토트렉세이트(50 nM, 100nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM)를 이용하여 6-웰 페트리디쉬 또는 10 ㎖ 플라스크 내에 접종하였다. 이후 메토트렉세이트의 고농도에서 자란 클론을 보다 더 높은 농도의 메토트렉세이트(1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM)를 함유하는 6-웰 플레이트로 옮겼다. 100-200 mM의 농도에서 자라는 클론을 얻을 때까지 동일한 과정을 반복했다. 예를 들어, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 또는 역상 HPLC 분석에 의해, 원하는 유전자 산물의 발현을 분석했다.
실시예 2: 본 발명의 GLP -1 모방체의 비제한적인 예. GLP-1은 경구 포도당 투여 후에 장의 L-세포로부터 분비되는 37-아미노산 펩티드이다. 생물학적으로 활성인 GLP-1(7-37) 펩티드, 변이체 또는 유도체를 포함하는 모방체 작제물은 상기 펩티드의 생체 내 수명을 증가시키고, 2형 당뇨병 환자에서 혈당을 낮추는 새로운 치료법을 제공할 것으로 예측된다. 본래 GLP-1(7-37) 펩티드 또는 DPP-IV 저항성 유사체를 코딩하는 펩티드는 모방체 스캐폴드에 포함될 수 있다. 다수의 이런 분자들이 작제되어 왔고, 형성된 모방체는 시험관 내 세포-기초의 분석에서 기능적으로 활성을 나타내었다. 그러나, 서로 다른 시험관 내 분석 및 생체 내 모델이 이들 실험에 사용되었으므로, 이들의 효능을 서로 비교하거나 본 명세서에 기재된 결과와 비교하는 것이 부적절할 수 있다는 것을 유념해야 한다.
GLP-1 모방체 변이체를 생성하기 위해, 상기 모방체 내의 GLP-1 펩티드, 링커, 힌지, 또는 CH2 및 CH3 서열은 발현, 효능, 안정성 또는 작용기 기능을 개선하기 위해 결실, 부가, 치환, 돌연변이 또는 수정될 수 있다.
야생형 GLP-1 서열(서열 번호 4a의 GLP-1 MMB) 및 DPP-IV 저항성 GLP-1 변이체, 예컨대, 서열 번호 4c의 GLP-1 MMB(A2S) 또는 서열 번호 4b의 GLP-1MMB(A2G)이 모방체 스캐폴드로 통합될 수 있다. 상기 펩티드의 돌연변이가 GLP-1 모방체의 성 질을 개선시키기 위해 만들어질 수 있다. 예를 들어, 아미노 말단 잔기의 돌연변이는 시그널링을 개선할 수 있고, 헬리칼 도메인 내의 돌연변이는 나선을 안정화시켜, 수용체에 대한 결합 및/또는 상기 모방체의 안정성을 개선시킬 수 있다.
상기 링커의 길이 및 조성물은 GLP-1 펩티드 및 Fc 영역 사이의 유연성 또는 결합 안정성을 변화시키기 위해 돌연변이될 수 있다. 상이한 아이소타입이 상기 분자의 힌지 영역에 도입될 수 있다. 또한, 상기 분자를 안정화시키기 위해, 상기 모방체의 힌지 영역 내에 돌연변이를 만들 수 있다. 예를 들어, 상기 모방체 내의 사슬 사이 이황화 결합을 안정화시키기 위해, 인간 IgG4 힌지를 돌연변이시켜 Ser228->Pro 변이체를 제조할 수 있다. 상기 모방체의 Fc 부분 내의 변이가 분자의 안정성을 개선시키고, FcR 결합과 같은 작용기 기능을 변화시키기 위해 만들어질 수 있다. 예를 들어, Ala/Ala 돌연변이를 가진 IgG4와 같은 인간 또는 뮤린 아이소타입(또는 이들 분자의 변이체)을 사용할 수 있다.
본 발명의 GLP -1 모방체 . 본 발명의 특이적, 비제한적 예는 화학식 (I)에 따른 GLP-1 모방체 작제물(서열 번호 2)이다:
((P(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t),
상기 식에서,
P는 생활성 GLP-1 펩티드(7-36)의 단일 카피이고,
L은 Gly-Ser 또는 Gly-Gly-Gly-Ser 유연한 링커의 연쇄 반복(tandem repeat) 이고,
V는 VH 서열의 C-말단, 즉, 자연 발생 IgG의 J 영역이며,
H는 완전한 IgG4 힌지 영역이며,
CH2 및 CH3은 IgG4 아이소타입 서브클래스의 것이다.
이 작제물의 반감기는 GLP-1 펩티드 단독 또는 이의 변이체 또는 유도체의 반감기보다 길 것이며, IgG의 반감기와는 유사할 것이라고 예상된다.
상술한 기본 구조 외에, 효능명에서 이로운 생물학적 특성을 갖는 변이체가 기술된다. 이들은 감소된 경향의 자가-연합, 감소된 면역 작동자 기능 또는 감소된 면역원성을 가지는 작제물을 포함할 수 있다. 생물학적으로 활성인 펩티드의 개선된 형태와 같은 원하는 특성을 제공하고, 혈액-뇌 장벽을 통과시키는 다른 변형이 계획된다. 제시된 변이체 및 변형은 원하는 활성을 갖는 작제물을 획득하기 위해 임의의 방식으로 결합될 수 있다.
재조합 DNA 방법을 이용하여, GLP-1 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 및 인간 J 서열 사이의 매개 벡터로 삽입되었다. 이는 벡터 중에 존재하는 제한 부위와 호환되는 말단을 갖는 상보적 합성 올리고뉴클레오티드를 이용하여 행해졌다. 이들 올리고뉴클레오티드는 GLP-1 펩티드 및 두개의 GGGS 반복으로 구성된 유연한 링커에 대한 코딩 서열로 구성된다. 상술한 기능 요소를 함유하는 제한 단편은 그 후 발현벡터로 옮겨진다. 이 벡터는 항-CD4 면역글로불린 프로모터 및 인핸서, 인간 IgG4 힌지 서열에 대한 코딩 서열, HC 불변 영역 2(CH2) 및 불변 영역 3(CH3) 및 박테리아에서 플라스미드의 복제와 선택, 및 포유동물 세포에서의 안정적인 발현자를 선택하기 위해 필요한 요소를 포함하고 있다.
이 플라스미드를 HEK293E 세포에 도입하고, 일시적으로 트랜스펙션된 세포에서 야생형 GLP-1 MMB의 발현을 성취하였다. GLP-1 MMB는 표준 단백질 A 및 수퍼로오스 12 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제하였고, 약 1.5 mg/L의 트랜스펙션된 세포를 얻었다. 상기 단백질을 후술하는 실험의 출발물질로 하였다.
GLP-1 모방체의 아미노산 서열을 도 1에 나타냈다. 기능성 도메인은 상기 주석을 단 펩티드 코딩 서열이다. J 서열은 유연성을 더 제공하여, GLP-1 분절이 더 적합한 형태가 되도록 하고, 펩티드가 면역글로불린의 구형 구조로부터 돌출하여 GLP-1 수용체에 대한 결합을 위한 적절한 배향을 가능하게 할 것이다. CH2 및 CH3 영역은 단백질의 벌크를 구성한다. 면역글로불린이 긴 혈청 반감기를 가지는 이유 중 하나는 음작용(pinocytosed) 면역글로불린을 세포외 공간으로 돌려보냄으로써 혈청 반감기를 증가시키는 FcRn에 결합하는 능력으로 생각된다. FcRn의 결합 부위는 CH2 및 CH3 영역의 접합점과 오버랩된다[Sheilds et al,2001, J.Biol.Chem., vol. 276 (9), 6591-6604].
세포 내 가공 중, 두개의 IgG 중쇄가 힌지 영역에 위치한 시스테인 간의 이황화 결합을 통해 호모다이머를 형성한다는 것이 잘 알려져 있다. 이러한 것은 또한 변형된 펩디드 사이에도 발생하여 어셈블된(assembled) GLP-1 모방체 작제물을 형성할 것으로 예측된다. GLP-1 모방체의 예측된 구조는 두개의 GLP-1 펩티드를 포함한다.
서열 번호 4의 GLP-1 MMB에 대하여 유사한 실험을 반복하였고, 유사한 결과를 수득하였다.
실시예 3: FACS 결합 분석. GLP-1 모방체의 활성을 시험관 내 FACS 결합 분석으로 시험하였다. GLP-1 MMB가 GLP-1R에 결합하는지를 결정하기 위해, GLP-1R을 과발현하는 HEK293 세포(1x106 세포)를 서열 번호 4a의 GLP-1 MMB(20 nM)와 함께 4 ℃에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 세포를 세척하고, 형광표지된 2차 검출 항체(1 μg/mL 염소 항-인간 IgG, Fc 감마 특이적)를 4 ℃에서 30 분 동안 첨가하였다. 상기 세포의 형광 세기를 유세포 측정기로 모니터링하였다. 도 2A는 서열 번호 4a의 GLP-1 MMB가 GLP-1R을 과발현하는 HEK293 세포에 결합하는 것을 나타낸다(회색, 서열 번호 4a의 GLP-1 MMB, 2차 없음; 흑색, 2차만; 적색, 음성 대조군 MMB 및 2차; 청색, GLP-1 MMB 및 2차). 도 2b는 서열 번호 4a의 GLP-1 MMB가 대조군 HEK293 세포에 결합하지 않는 것을 나타낸다(회색, 서열 번호 4a의 GLP-1 MMB, 2차 없음; 흑색, 2차만; 청색, 서열 번호 4a의 GLP-1 MMB 및 2차). 도 2c는 GLP-1R을 과발현하는 HEK293 세포에 대한 결합에 대해, GLP-1 펩티드 유사체(A2S)가 서열 번호 4a의 GLP-1 MMB와 경쟁할 수 있다는 것을 나타낸다(회색, 서열 번호 4a의 GLP-1 MMB, 2차 없음; 흑색, 서열 번호 4a의 GLP-1 MMB 및 2차; 오렌지 색, 서열 번호 4a의 GLP-1 MMB, 0.2 nM 경쟁자, 2차; 청색, 서열 번호 4a의 GLP-1 MMB, 20 nM 경쟁자, 2차; 적색, 서열 번호 4a의 GLP-1 MMB, 100 nM 경쟁자, 2차).
서열 번호 4의 GLP-1 MMB에 대하여 유사한 실험을 반복하였고, 유사한 결과를 수득하였다.
실시예 4: cAMP 분석. GLP-1는 이의 수용체(G-단백질 커플된 수용체)에 결합하고, 신호 분자[3',5'-사이클릭 AMP(cAMP)]를 용량-의존 방식으로 증가시킨다. cAMP는 GLP-1R을 발현하는 세포에서 시험관 내 분석로 측정할 수 있다(Applied Biosystems). 요약하면, Rinm 세포(100,000 세포)를 증가하는 농도의 GLP-1 펩티드(0-30 nM) 또는 GLP-1 MMB(0-100 nM)와 함께 인큐베이션한다. 상기 세포를 용해시키고, 알칼린-포스파타제 표지된 cAMP 컨쥬게이트 및 화학발광 기질(Tropix®CDPD®)을 사용하는 경쟁적 분석를 이용하여 cAMP의 양을 결정하였다. 서열 번호 4a의 야생형 GLP-1 MMB(도 3a)에 대한 농도 의존 cAMP 활성은 GLP-1 펩티드(도 3b)에 필적된다(각각, EC50=1 nM 및 0.4 nM). 유사한 실험에서, IgG4 스캐폴드 내의 서열 번호 4b의 GLP-1(A2G) MMB(도 3c), 및 IgG4 스캐폴드 내의 서열 번호 4c의 GLP-1(A2S) MMB(도 3d)는 모두 Rinm 세포에서 cAMP 수준을 IgG4 스캐폴드 내의 서열 번호 4a의 야생형 GLP-1 MMB 보다 상당히 높은 수준으로 증가시켰다.
서열 번호 4의 GLP-1 MMB에 대하여 유사한 실험을 반복하였고, 유사한 결과를 수득하였다.
실시예 5: cAMP 에 의해 측정된 GLP -1 MMB 의 시험관내 활성:
LANCE™ cAMP 분석을 사용하여 랫트 GLP-1 수용체를 발현하는 랫트 인슐리노마(insulinoma) 세포주, INS-1E 세포에서 GLP-1MMB의 기능적 활성을 측정하였다.
재료/방법: INS-1E 세포를 5% CO2와 함께 습윤화된 배양기에서 37 ℃로 유지하고, RPMI 1640/10% FBS/1 % L-글루타민/1% 소듐 피루베이트/ 1% 비필수 아미노산/50 μM β-머캅토에탄올 중에 배양하였다. LANCE cAMP 키트를 Perkin Elmer (Boston, MA)에서 구입하였다. GLP-1 펩티드를 Sigma (St Louis, MO)에서 구입하였다. 데이터를 GraphPad PRISM, 버전 4.03로 분석하였다.
cAMP 분석: INS-1E 세포를 96-웰 플레이트 (Costar 3610) 중에서 100,000 세포/웰로 플레이팅하고, 정상 배양 배지에서 4일 동안 회복되도록 하였다. 웰에서 배지를 흡입하여 제거하고, 24 ㎕의 Alexa Fluor 647 항-cAMP 항체 (LANCE cAMP Kit, Perkin Elmer, Boston, MA)를 첨가한 다음, 서열 번호 4의 GLP-1MMB (PBS/0.5% BSA/0.5 mM IBMX 중) 24 ㎕을 첨가하였다. 실온에서 7 분 동안 세포를 자극하고, 제조자의 프로토콜에 따라 용해하였다. 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하고, 665 nm에서 형광 세기를 측정하였다. 표준 곡선을 사용하여 cAMP 농도를 결정하였다.
결과: cAMP의 농도를 서열 번호 4의 GLP-1MMB의 농도(nM)에 대하여 작도하 고, 8.7 nM의 EC50을 제공하는 쌍곡선에 점을 피팅하였다(도 18A). 0.11 nM의 EC50을 제공하는 GLP-1 펩티드로 수득된 데이터를 동일한 방식으로 작도하였다(도 18 B).
실시예 6: DPP - IV 절단 분석. GLP-1가 DPP-IV에 의해 빠르게 불활성화되기 때문에, 시험관 내 분석이 무손상(intact; 즉, 절단되지 않은) 서열 번호 4a의 GLP-1 MMB를 정량하기 위해 확립되었다. 요약하면, 서열 번호 4a의 GLP-1 MMB 또는 펩티드(1.2 nM)를 실온에서 DPP-IV(1 μg/mL, R&D 시스템)와 함께 인큐베이션시켰다. 다양한 시간(0, 5, 10, 15, 20, 30, 40 분) 뒤에, DPP-IV 억제제(100 μM, Linco)를 첨가하여 반응을 퀀칭(quenching)시켰다. 서열 번호 4a의 무손상 GLP-1 MMB 또는 펩티드의 양을 Linco로부터의 GLP-1 활성 ELISA를 이용하여 측정하고, 서열 번호 4a의 GLP-1 MMB 또는 펩티드를 각각의 표준 곡선에 대해 구하였다. 도 4는 서열 번호 4a의 GLP-1 MMB가 GLP-1 펩티드와 비교하여 DPP-IV에 의한 절단에 대하여 상당한 저항성이 있음을 나타낸다.
유사한 실험을 서열 번호 4의 GLP-1 MMB에 대하여 반복하고 유사한 결과를 수득하였다.
실시예 7: 인간 혈청 안정성 분석. 다른 혈청 프로테아제가 GLP-1 MMB를 절단 및 불활성화시키지 않는다는 것을 확인하기 위해, 혈청에서의 GLP-1 MMB의 안정 성을 또한 측정하였다. 요약하면, 37 ℃에서 GLP1 펩티드 또는 서열 번호 4c의GLP1 MMB(30 nM)를 인간 혈청 중에 배양하였다. 다양한 시간 후에, 반응을 DPP-IV 억제제(100 μM, Linco)로 퀀칭시키고, 샘플을 Linco로부터의 GLP-1 활성 ELISA를 이용하여 분석하였다. 도 5는 펩티드가 빠르게 분해되는 반면, 서열 번호 4c의 GLP-1 MMB는 인간 혈청에서 24 시간 동안 안정한 것을 나타낸다.
유사한 실험을 서열 번호 4의 GLP-1 MMB에 대하여 반복하고 유사한 결과를 수득하였다.
실시예 8: GLP -1 MMB 는 RINm 세포에서 인슐린 분비를 유발한다. 인슐린 분비에 대한 GLP-1 MMB의 효과를 시험하기 위해, RINm 세포를 증가하는 농도의 GLP-1(7-36) 펩티드(0-5 nM), 익센딘-4 펩티드(0-5 nM), 또는 다양한 GLP-1 모방체(5 또는 50 nM)로 처리하고, 분비된 인슐린의 양을 ELISA로 측정하였다. 시험된 모든 GLP-1 MMB가 RINm 세포에서 인슐린 분비를 자극하는 활성을 가졌다(도 6). 50 nM에서, MMB는 야생형 GLP-1(7-36) 펩티드에 필적하는 활성을 가졌다.
실시예 9: 인슐린 분비로 측정된 GLP -1 MMB 의 시험관내 활성
추가의 인슐린 분비 분석을 개발하여, 서열 번호 4의 GLP-1MMB의 시험관 내 기능 활성을 측정하였다.
세포 배양: INS-1E 세포를 5% CO2와 함께 습윤화된 배양기에서 37 ℃로 유지하고, RPMI 1640/10% FBS/1 % L-글루타민/1% 소듐 피루베이트/ 1% 비필수 아미노산/50 μM β-머캅토에탄올 중에 배양하였다. 데이터를 GraphPad PRISM, 버전 4.03로 분석하였다.
인슐린 분비 분석: INS-1E 세포를 96-웰 플레이트 (Costar 3610) 중에서 100,000 세포/웰로 플레이팅하고, 정상 배양 배지에서 4일 동안 회복되도록 하였다. 세포를 2회 세척하고, 0.1 ㎖의 KRBH 완충액/3 mM 포도당을 첨가하였다. 이 완충액에서 세포가 평형화되도록 2시간 동안 놔두었다. 배지를 제거하고, 각 웰 마다 6.5 mM 포도당과 함께 KRBH 중의 서열 번호 4의 GLP-1MMB 0.12 ㎖을 첨가하였다. 각 웰에서 20 마이크로리터의 상층액을 제거하고, T=0 시간 점으로 삼았다. 세포를 37 ℃, 5% CO2에서 2 시간 동안 인큐베이션하고, 각 웰에서 20 마이크로리터의 상층액을 제거하였다. 인슐린 ELISA를 수행할 때까지 상층액을 -20 ℃에서 냉각시켰다. Ultra Sensitive Rat Insulin ELISA 키트(Crystal Chem)를 사용하여 인슐린 농도를 결정하였다.
결과: 서열 번호 4의 GLP-1MMB 각 농도에서 분비된 인슐린의 양으로 데이터를 작도하였다(도 19). 서열 번호 4의 GLP-1 MMB (25 nM)에서 상층액으로 분비되는 인슐린의 양이 상당히 증가하였다.
실시예 10: GLP -1 MMB 는 db / db 마우스에서 포도당 수준을 감소시킨다. 6주령 db/db 마우스를 2 시간 금식시킨 뒤, 비히클, GLP-1 펩티드, 또는 서열 번호 4c의 GLP-1(A2S) MMB를 정맥 내 투여하였다. 혈당을 투여 후 0.5, 1, 2, 3, 및 4 시간에 모니터링하였다. GLP-1 펩티드는 30분에 혈당을 낮췄지만, 60분까지만이었고, 혈당은 아마도 GLP-1 펩티드의 짧은 반감기로 인해 다시 증가하기 시작하였다. 대조적으로, GLP-1 펩티드 투여량보다 100-배 낮은 투여량에서 서열 번호 4c의 GLP-1(A2S) MMB는 총 4 시간 동안 혈당 감소를 유도하였다(도 7A). 또한, 혈당의 감소는 용량 의존적이었다(도 7B).
유사한 실험을 서열 번호 4의 GLP-1 MMB에 대하여 반복하고 유사한 결과를 수득하였다.
실시예 11: 마우스 및 사이노몰거스 원숭이에서 GLP -1 MMB 의 약동학. 4개 GLP-1 모방체[A2G, A2S, 익세딘-캡(exedin-cap), 및 야생형](각각 서열 번호 4b, 서열 번호 4c, 서열 번호 4d 및 서열 번호 4a)의 약동학을 측정하기 위해, C57/B16 마우스에 대해 1 mg/kg의 MMB를 정맥 내 투여하였다. 다른 시점에서 마우스를 희생시킨 뒤, 심장 천공에 의해 혈장을 얻었다. 다양한 ELISA를 사용하여 Fc, 총 MMB, 활성 MMB, 및 동물에서 대사된 활성 펩티드를 측정하였다. 활성 MMB는 상기 펩티드의 무손상 N-말단이 여전히 상기 모방체의 Fc 영역에 결합되어 있다는 것을 나타냈다. 상기 펩티드의 두번째 아미노산(알라닌)을 세린 또는 글리신으로 치환 함으로써 순환에서 활성 MMB의 수명이 증가되었다.
사이노몰거스 원숭이에 대해 1.0 mg/kg의 4가지 다른 GLP-1 MMB 작제물을 정맥 내 주입하고, 투여 후 10 분 내지 5 일 중 다른 시점에서 혈청 샘플을 취하였다. 혈청 샘플을 ELISA로 평가하여 무손상 MMB를 정량하였다. 도 8에 도시한 바와 같이, 4가지 MMB는 모두 보다 빠른 분포 페이스를 나타낸 뒤, 보다 느린 제거 페이스를 나타냈다. 각 작제물에 대해 계산된 약동학적 상수는 T = 0 내지 T = 120 시간에 AUC에 의해 결정된 노출과 유사한 약 3일의 T1/2를 나타냈다.
유사한 실험을 서열 번호 4의 GLP-1 MMB에 대하여 반복하고 유사한 결과를 수득하였다.
실시예 12: 랫트 및 원숭이에서 GLP -1 MMB 의 약동학 특성. 그의 약동학적 (PK) 프로필을 연장하면서 GLP-1의 생활성을 유지하도록 GLP-1MMB를 설계하였다.
랫트에서의 약동학: 서열 번호 4의 GLP-1MMB(3.0 mg/kg, lot #8833173) (1)의 단일 피하 또는 정맥내 투여로 Sprague-Dawley-계의 랫트를 처리하였다. 프로테아제 억제제 (Roche Complete EDTA free, Roche Applied Science, Indianapolis, IN) 및 DPP4 억제제 (Linco, St. Charles, MO)를 함유하는 소듐 시트레이트 (3.8%) 중에서 투여한 후 다양한 시간에 대략 300 ㎕의 혈액을 수집하였다. 혈장을 분리하고, 샘플을 분석할 수 있을 때까지 -80 ℃에 보관하였다. MSD(Mesoscale Discovery) 기술을 사용하여 서열 번호 4의 무손상 GLP-1MMB의 농도를 측정하였 다[3-7]. 간단하게, 혈장 샘플을 BioMek Fx에 의하여 총 4개의 희석물, 순수한 것, 1:8, 1:64 및 1:512로 연속 희석하였다. 순수한 혈장에서의 동일한 표준 곡선이 각 플레이트에 포함된다. 서열 번호 4의 GLP-1MMB의 무손상 N-말단을 검출하기 위하여 설계된 비오티닐화 모노클로날 항체 (CNTO 1626)로 서열 번호 4의 GLP-1MMB를 MSD 플레이트 상에서 캡쳐하였다. 검출하기 위하여 서열 번호 4의 GLP-1MMB 상에서 링커 영역을 인지하는 류테늄 표지된 모노클로날 항체(CNTO712)를 첨가하고, MSD sector imager 6000 리더를 사용하여 발광 반응을 결정하였다. 서열 번호 4의 GLP-1MMB 수준을 시그모이달(sigmoidal) 용량-반응 곡선 (GraphPad PRISM)를 사용하여 계산하였다.
원숭이에서의 약동학: Diabetes Research Institute, University of Miami (2)에서 사이노몰거스 원숭이에 서열 번호 4의 GLP-1MMB(1.0 mg/kg, lot #8833013)를 정맥내 투여하였다. 투여 및 혈액 수집 전에 케타민 HCl (100 mg/mL, 10 mg/kg)를 사용하여 원숭이를 화학적으로 구속하였다. 1 ㎖/분의 속도에서 2.2 ㎖/kg의 투여 부피로 서열 번호 4의 GLP-1MMB를 투여하였다. 프로테아제 억제제 (Roche Complete EDTA free, Roche Applied Science, Indianapolis, IN) 및 DPP4 억제제 (Linco, St. Charles, MO)를 함유하는 소듐 시트레이트 (3.8%) 중에서 투여한 후 다양한 시간에 대략 2 ㎖의 혈액을 수집하였다. 혈장을 분리하고, 샘플을 분석할 수 있을 때까지 -80 ℃에 보관하였다. 혈장 중에서 서열 번호 4의 GLP-1MMB 농도를 상기 기술된 바와 같이 측정하였다.
데이터 분석: 비-구획 분석 (NCA)을 사용하여 서열 번호 4의 GLP-1MMB의 약동학적 변수를 측정하였다(WinNonlin, Version 5.1, Pharsight Corporation, Mountain View, CA). 혈청 농도 대 시간 프로필을 검사하여 최대 혈청 농도, Cmax 및 Cmax에 도달하는 시간 (Tmax)을 수득하였다. 시간 0에서 무한대의 AUC 뿐만 아니라, 시간 0에서 정량화할 수 있는 수준의 서열 번호 4의 GLP-1MMB가 있는 마지막 시간 점까지의 농도 곡선하 면적 (AUC)를 계산하였다(랫트에 대하여 AUC (0-7일), 원숭이에 대하여 AUC (0-21일)). UAC 값을 선형 사다리꼴 적분(linear trapezoidal integration)으로 수득하였다. 말기 상의 로그-선형 부분의 최소-제곱 회귀 분석으로 말기 속도 상수 (λz)를 결정하였다. 말기 반감기인 t1/2을 0.693 대 λz의 비로부터 계산하였다.
결과: 랫트에서의 약동학 : 단일 피하 및 정맥내 투여한 후 랫트에서 서열 번호 4의 GLP-1MMB의 혈장 약동학 프로필을 나타냈다 (도 20 A). 랫트 데이터로부터 전체 약동학 분석을 표 2에 요약하였다. 서열 번호 4의 GLP-1MMB의 말기 반감기가 정맥내 투여 후 1.5일 및 피하 투여 후 1.7일이도록 설계하였다. 피하 투여 후 서열 번호 4의 GLP-1MMB의 생체이용률은 대략 22%였다.
표 2. 단일 피하 및 정맥내 투여(3mg/kg) 후 SD 랫트에서 서열 번호 4의 GLP-1MMB의 약동학적 특성
Figure 112009009348445-PCT00001
Figure 112009009348445-PCT00002
원숭이에서의 약동학: 단일 정맥내 투여한 후 원숭이에서 GLP-1MMB의 혈장 약동학 프로필을 나타냈다 (도 20 B). 전체 약동학적 분석을 표 3에 요약하였다. 원숭이에서의 GLP-1MMB의 말기 반감기가 2.9일이도록 설계하였다.
표 3. 단일 정맥내 투여(1mg/kg) 후 사이노몰거스 원숭이에서 서열 번호 4의 GLP-1MMB의 약동학적 특성
Figure 112009009348445-PCT00003
실시예 13: 당뇨병 마우스의 경구 포도당 저항성 시험 중 GLP -1 MMB 의 효과. 8주령 당뇨병 db/db 마우스를 6 시간 금식시킨 뒤, 서열 번호 4c의 GLP-1 MMB(0.02 내지 2 mg/kg)를 피하 주입하였다. 투여 후, 마우스를 추가로 6 시간 금식시키고, 기준선 공복 혈당을 측정하였다. t = 0에서, 1.0 mg/g 포도당의 경구 영양물을 마우스에 제공하고, 다양한 시간대에 혈당을 측정하였다. 도 9에 나타낸 결과는 시험된 모든 투여량에서 경구 포도당 저항성 시험에서 포도당 회유(excursion)를 감소시키는데 효과적이라는 것을 나타낸다.
유사한 실험을 서열 번호 4의 GLP-1 MMB에 대하여 반복하고 유사한 결과를 수득하였다.
실시예 14: 당뇨병 마우스에 대한 장기 투여 중, 공복 혈당에 대한 GLP -1 MMB의 효과. 10주령 당뇨병 db/db 마우스에게 6 주간 매일 비히클 또는 서열 번호 4c의 GLP-1 MMB(1 mg/kg)를 피하 주입하였다. 시험 기간 동안 일주일에 두번 씩 공복 혈당을 측정하였다. 시험 기간 동안, 대조군과 비교하여 처리된 동물에서 공 복 혈당이 감소되었고(도 10), 6 주까지 200 mg/dL 이상의 차이가 생겼다(각각, 대조군 및 처리된 동물에서 466 및 221 mg/dL).
유사한 실험을 서열 번호 4의 GLP-1 MMB에 대하여 반복하고 유사한 결과를 수득하였다.
실시예 15: 당뇨병 마우스에 대한 장기 투여 후의 경구 포도당 저항성 시험에 대한 GLP -1 MMB 에 대한 효과. 실시예 11에서와 같이, 10주령 당뇨병 db/db 마우스에게 6 주간 매일 비히클 또는 서열 번호 4c의 GLP-1 MMB(1 mg/kg)를 투여하였다. 투여 40일 후, 마우스에 대해 경구 포도당 저항성 시험을 하였다. 요약하면, t = 0에, 1.0 mg/g 포도당의 경구 영양물을 마우스에게 제공하고, 혈당을 다양한 시간에 측정하였다. 도 11에 나타낸 결과는 서열 번호 4c의 GLP-1 MMB가 경구 포도당 저항성 시험에서 포도당 회유를 감소시키는데 효과적인 것을 나타내며, 이는 서열 번호 4c의 GLP-1 MMB로 장기간 처리된 마우스가 대조군 동물과 비교하여 더 효과적으로 포도당 부하를 처리할 수 있는 것을 나타낸다.
유사한 실험을 서열 번호 4의 GLP-1 MMB에 대하여 반복하고 유사한 결과를 수득하였다.
실시예 16: 당뇨병 마우스에 대한 장기 투여 후, HbA1c 감소에 대한 GLP -1 MMB의 효과. 실시예 11 및 12에서와 같이, 10주령 당뇨병 db/db 마우스에게 6 주간 매일 비히클 또는 서열 번호 4c의 GLP-1 MMB(1 mg/kg)를 투여하였다. 투여 6주 전 및 후에, 전혈 샘플을 채취하고, HbA1c 퍼센트를 분석하였다. 도 12에 나타낸 바와 같이, GLP-1 처리된 동물의 HbA1C는 6 주간 109 퍼센트 증가한 반면, 대조군으로 처리된 동물은 142 퍼센트 증가했다. 이러한 데이타는 처리된 동물이 대조군과 비교하여 장기간 동안 그들의 혈당을 더욱 잘 조절할 수 있는 것을 제시한다.
유사한 실험을 서열 번호 4의 GLP-1 MMB에 대하여 반복하고 유사한 결과를 수득하였다.
실시예 17: 정상 사이노몰거스 원숭이의 경구 포도당 저항성 시험에 대한 GLP-1 MMB의 효과. 서열 번호 4c의 GLP-1 MMB(1 mg/kg)의 단일 투여 전 및 투여 6일 뒤에, 정상 사이노몰거스 원숭이에 대해 경구 포도당 저항성 시험(OGTT)을 수행했다. 요약하면, t = 0에서, 2.0 mg/g 포도당의 경구 영양물을 원숭이에게 제공하고, 혈당을 다양한 시간에 측정하였다. 혈당 수준은 투여 6일 뒤에 수행한 OGTT에서 유의적으로 감소하였고(도 13A), 인슐린 수준이 유의적으로 증가하였다(도 13B). 이는 서열 번호 4c의 GLP-1 MMB가 증가된 포도당 농도에서 이자로부터 인슐린 분비를 야기한다는 것을 제시한다.
유사한 실험을 서열 번호 4의 GLP-1 MMB에 대하여 반복하고 유사한 결과를 수득하였다.
실시예 18: 단일 투여 후에 당뇨병 마우스( db / db )의 섬( islets )에서 인슐린 염색에 대한 GLP -1 MMB 의 효과. 12주령 당뇨병 마우스(db/db)에 서열 번호 4c의 GLP-1 MMB(1.5mg/kg)를 단일 피하 투여하고, 4주 후에 이자를 채취하였다. 이자를 절개하고, 인슐린 존재를 확인하기 위해 염색하였다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 대조군 동물과 비교하여 처리된 동물에서 유의적으로 인슐린 염색이 더 많이 존재하였다.
유사한 실험을 서열 번호 4의 GLP-1 MMB에 대하여 반복하고 유사한 결과를 수득하였다.
실시예 19: GLP -1 MMB 는 정상 개에서 위 배출을 지연시킨다. 위 삽관을 암컷 비글 개(10-15 kg)에 통상의 마취 하에 외과적으로 삽입하고, 적어도 2주간 회복시켰다. 물을 자유롭게 공급한 뒤, 24 시간 동안 개를 금식시켰다. 위 삽관을 개방하고, 위액 및 음식 잔류물을 40-50 ㎖의 미온수로 제거하였다. 여섯 마리의 개 그룹들에 대해 급식 60 분 전에 위 배출 지연에 대한 양성 대조군으로서, 알파 2 작용제인 리다미딘(0.63 mg/kg)을 피하 투여하였다. 비히클 대조군 또는 서열 번호 4b의 GLP-1 MMB (0.1 mg/kg)으로 처리된 개들은 급식 15 분 전에 두부 정맥을 통해 정맥으로 투여하였다. 급식 5 분 전, 위 삽관을 개방하여, 기저 값을 위하여 위 내에 존재하는 유체의 양을 측정하고, 유체를 즉시 되돌려보냈다. 그 후, 250 ㎖의 포도당 용액(5 g/l)으로 구성된 시험 음식을 삽관을 통해서 투여하고, 위 내에 30 분간 남아있도록 하였다. 30 분 뒤에 위 내용물을 위로부터 끄집어내, 총 부피를 측정하였다. 1 ㎖의 위 내용물을 분석을 위해 회수하고, 잔류 부피를 삽관을 통해 위에 다시 넣었다. 위 내용물 부피의 평가 및 샘플의 회수를 60, 90, 및 120 분에 반복하였다. 포도당 농도를 수집된 샘플에 대해 평가하여, 각 시점에 위에 잔류하는 포도당의 절대량을 결정하는데 사용하였다. 위에 남아있는 포도당의 퍼센트는 각 시점의 출발 값 및 포도당 농도로부터 결정하였고, 시간의 함수로 도시하였다. 남은 위 내용물이 50%가 되는 시점은 상기 곡선을 단일 지수에 맞춤으로써 결정하였다. 도 15에 나타낸 바와 같이, 50%의 위 내용물은 비히클이 투여된 개에서 12.35±3.69 분에 배출되었지만, 리다미딘 양성 대조군 및 서열 번호 4b의 GLP-1 MMB가 투여된 개는 상당한 위 배출 지연을 나타냈다(각각, 30.60±6.47 및 59.23±14.46).
유사한 실험을 서열 번호 4의 GLP-1 MMB에 대하여 반복하고 유사한 결과를 수득하였다.
실시예 20: GLP -1 MMB 는 식이 유도된 비만 마우스에서의 경구 포도당 저항성 시험( OGTT ) 후에 혈당을 낮춘다. 식이 유도된 비만의 뮤린 모델을 만들기 위해, 마우스를 적어도 27주간 고지방 다이어트로 유지하였다. 마우스는 비만이 되었고, 공복 혈당 수치가 120 mg/dl를 초과하는 경우, 당뇨인 것으로 결정하였다. 식후 혈당 수준에 대한 GLP-1 MMB 치료 효과를 평가하기 위해, 식이 유도된 비만 마우스를 밤새 금식시키고, 0.02, 0.2 또는 2 mg/kg 서열 번호 4c의 GLP-1 MMB 또는 비히클 대조군을 피하 투여하였다. 투여 6 시간 후, 마우스에게 1.5 mg/g의 포도당 위 영양물을 제공하였다. 혈당 수준을 MMB 투여 전, t = 0, 15, 30, 60, 90, 120, 150, 및 180 분에 꼬리 상처 피를 이용하여 결정하였다. 도 16에 나타낸 바와 같 이, t=0 및 모든 이후 시점에서 공복 혈당 수치에서 서열 번호 4c의 GLP-1 MMB의 용량 의존적 감소가 관찰되었다. 곡선하 면적은 t = 0 및 t = 180 사이에 대해 계산되었고, 이는 모든 용량에서 포도당 처리가 유의적으로 감소되는 것을 나타낸다.
유사한 실험을 서열 번호 4의 GLP-1 MMB에 대하여 반복하고 유사한 결과를 수득하였다.
실시예 21: GLP -1 MMB 는 db / db 마우스의 복막내 포도당 저항성 시험 (IPGTT)에서 혈당을 낮춘다. 약 13-15 주령의 수컷 db/db 마우스를 공복 혈당 수준에 기초하여 6개의 마우스 처리 그룹으로 무작위 분류하였다. 포도당 저항성 시험 6 시간 전에, 0.02 mg/kg 또는 0.1 mg/kg의 서열 번호 4c의 GLP-1 MMB 또는 0.1 mg/kg의 음성 대조군 MMB를 마우스에 투여하였다. 포도당 저항성 시험 5 분 전, 휴대용 글루코미터로 꼬리 상처 피로부터 포도당 값을 측정하였다. 그 후, 1 mg/g의 D-포도당을 마우스에 복막내 투여하고, 혈당 수준을 10 분, 20 분, 30 분, 60 분, 90 분, 120 분, 150 분 및 180 분에 측정하였다. 도 17A에 나타낸 바와 같이, 혈당 수준은 전 시간 동안 서열 번호 4c의 GLP-1 MMB로 처리된 그룹 모두에서 유의적으로 낮았다. t = 10 분의 인슐린 수준을 측정하기 위해, 동일한 방식으로 처리된 추가의 동물 그룹을 희생시켰다. 서열 번호 4c의 GLP-1 MMB 투여 10 분 뒤에 방출된 인슐린의 양은 용량에 의존하여 증가하였다.
유사한 실험을 서열 번호 4의 GLP-1 MMB에 대하여 반복하고 유사한 결과를 수득하였다.
실시예 22: GLP -1 MMB 의 급속 약역학 연구. 서열 번호 4의 GLP-1 MMB의 생물학적 활성을 나타내기 위하여, 복막내 포도당 저항성 시험 (ipGTT)을 식이-유도 비만 (DIO) 마우스에서 수행하였다.
재료/방법: D-포도당을 Sigma에서 구입하였다. 하기에 기술된 연구에서는 4주령일 때 60.9% 지방 함유 식이 (Purina Test Diets 58126)를 시작한 식이-유도된 비만 (DIO) C57B1/6J 마우스를 사용하였다. 본 실험에 포함시키기 전에 모든 동물은 연속 3주의 당뇨성 공복 혈당 수치 (>120 mg/dL)를 나타내었다. ipGTT: 35마리 마우스를 밤새 굶기고 (16 시간) 그들의 공복 포도당 농도에 기초하여 무작위로 7개의 그룹 (n=5)으로 나누었다. 포도당 저항성 시험 10 분 전에, 마우스에 PBS 또는 서열 번호 4의 GLP-1 MMB (0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 및 1.0 mg/kg)를 정맥내 투여하였다. 포도당 저항성 시험 5 분 전에, 꼬리 상처 혈액에서 공복 포도당 측정을 수행하였다. T=0에, 마우스에 D-포도당 (1.0 mg/g)를 복막내 투여하였다. 꼬리 상처 혈액을 사용하여 15, 30, 60, 90, 120, 150 및 180 분에 혈당 수준을 측정하였다.
결과: 포도당 저항성 시험 중 측정된 혈당 수준을 시간의 함수로서 작도하였다 (도 21A). 곡선하 면적을 계산하였으며, PBS-처리된 그룹에 비하여 서열 번호 4의 GLP-1 MMB (0.01 , 0.03, 0.1 , 0.3, 1 mg/kg)로 처리된 5개의 그룹에서 용량 의존적 방식으로 상당히 감소하였다(도 21B). AUC 대 서열 번호 4의 GLP-1 MMB 농도를 14 ㎍/kg의 ED50을 제공하는 쌍곡선에 대하여 피팅시켰다 (도 21C). 데이터를 작도하고 GraphPad PRISM, 버전 4.03에서 분석하였다.
실시예 23. GLP -1R-/- 및 야생형 마우스의 음식물 섭취, 글리세믹 조절 및 위 배출에서 GLP -1 MMB 의 영향. 본 연구의 목적은 GLP-1 MMB가 GLP-1 수용체-의존적 방식으로 음식물 섭취, 글리세믹 조절 및 위 배출에 영향을 주는지를 평가하려는 것이다. 서열 번호 4의 GLP-1 MMB의 단일 정맥내 (iv) 투여로, 야생형에서 포도당 저항성이 개선되고, 음식물 섭취가 감소되며, 위 배출이 억제되었으나, GLP-1 수용체 낙아웃(knock out) 마우스에서는 그렇지 않았다. 상기한 결과는 포도당 및 에너지 대사에서의 서열 번호 4의 GLP-1 MMB의 효과가 GLP-1 수용체를 통하여 매개되는 것을 나타낸다.
재료/방법: 동물: 수컷 GLP-1R-/- 및 연령을 맞춘 야생형 마우스를 체중 및 공복 혈당에 기초하여 3개의 처리군 (n=5)으로 무작위로 나누었다.
음식물 섭취: 마우스를 밤새 굶기고 서열 번호 4의 GLP-1 MMB (1 mg/kg), CNTO 1996 (1 mg/kg)을 단일 정맥내 (iv) 용량으로 주사하였다 (CNTO1996은 GLP-1 펩티드 및 등몰 용량의 익센딘-4 (0.07mg/kg, Sigma에서 구입)이 결여되어 있기 때문에 본 연구에서 음성 대조군으로 사용하였다). 음식물 및 물 섭취를 투여 후 4, 6, 24 및 48 시간에 측정하였다.
포도당 저항성 시험 ( ipGTT ): 마우스를 밤새 굶기고, 상기 기술된 바와 같이 정맥내로 투여하였다. 공복 포도당을 휴대용 글루코메터(LifeScan)를 사용하여 꼬리 스닙(snip)을 통해 측정하였다. t = 0 분에, 마우스에 D-포도당 (1.0 mg/g, Sigma)를 복막내 투여하고, 꼬리 상처 혈액을 사용하여 15, 30, 60, 90 및 120 분 후에 혈당을 측정하였다.
위 배출: 마우스를 밤새 굶겼다. 다음날 아침 마우스에 1 시간 동안 식이를 공급하고, 음식물 섭취를 기록하고, 나머지 연구 기간 동안 마우스에 음식물을 제공하지 않았다. 상기 기술된 바와 같이 마우스에 정맥내 투여하였다. 투여 후 2 시간에 마우스를 안락사시켰다. 개복술로 위를 노출시키고, 두 유문에서 결찰시키고 분문을 제거하였다. 위 내용물 습윤 중량을 측정하였다. 식 1을 사용하여 위에 남아있는 음식물의 백분율을 계산하였다.
(위 내용물 습윤 중량 (g)/음식물 섭취 (g)) * 100 식 ( 1 )
결과 및 고찰
음식물 섭취: 약물 투여 후 24 시간의 기간에 걸친 야생형 및 GLP-1R-/- 마우스에 대한 누적 음식물 섭취를 작도하였다 (도 22). 서열 번호 4의 GLP-1 MMB (1 mg/kg) 및 익센딘-4의 등몰 용량 (0.07 mg/kg)은 둘다 통계적으로 대조군, CNTO 1996과 비교하여 야생형 동물에서 음식물 섭취를 상당히 감소시켰다(도 22A). 서열 번호 4의 GLP-1 MMB 및 익센딘-4는 GLP-1R-/- 마우스에서 음식물 섭취에 영향을 주지 않았다(도 22B).
포도당 저항성 시험: 야생형 및 GLP-1R-/- 마우스에서 ipGTT 중 수득된 데이터를 혈당 농도 대 시간으로 작도하였다(도 23A 및 23B). 곡선하 면적 (AUC)을각각의 ipGTT 곡선에 대하여 계산하였다 (도 23C). 서열 번호 4의 GLP-1 MMB 및 익센딘-4의 단일 투여로 야생형에서 AUC가 통계적으로 상당히 감소되었으며, GLP-1R-/- 동물에서는 그렇지 않았다.
위 배출: 야생형 및 GLP-1R-/- 마우스에서 투여 2 시간 후 위에 남아있는 음식물의 백분율을 작도하였다 (도 24). 서열 번호 4의 GLP-1 MMB (1 mg/kg) 및 익센딘-4의 등몰 용량 (0.07 mg/kg)은 대조군인 CNTO 1996과 비교하여 야생형 마우스에서 위 함량을 통계적으로 상당히 증가시켰다. 상기한 데이터는 서열 번호 4의 GLP-1 MMB 및 익센딘-4가 야생형 동물에서의 위 배출을 억제시키는 것을 나타낸다. 서열 번호 4의 GLP-1 MMB 및 익센딘-4는 GLP-1R-/- 마우스의 위 배출에 영향이 없었다.
실시예 24. DIO 마우스에서 GLP -1 MMB 의 약역학적 활성과 그의 약동학적 프로필의 상관관계. 본 연구의 목적은 식이-유도된 비만 (DIO) 마우스에서 포도당 저항성을 조절하는 데에서 그의 약동학적 프로필과 함께 GLP-1 MMB의 영향을 상호 관련시키는 것이다. 동물에 서열 번호 4의 GLP-1 MMB (1 mg/kg)를 투여하고(정맥 내), 포도당 저항성 시험을 투여 후 다양한 시간에서 수행하였다. 동시에, 혈액 샘플을 수집하여, 서열 번호 4의 GLP-1 MMB 수준을 평가하였다. DIO 마우스에서 서열 번호 4의 GLP-1 MMB는 대략 370 ng/ml의 ED50으로 포도당 저항성을 개선시켰다.
재료/방법. 동물/처리: C57B1/6J 마우스가 4주령일 때 60.9% 지방 함유 식이 (Purina Test Diets 58126)를 시작하였다. 실험을 시작할 때, 모든 동물은 연속 3주의 당뇨성 공복 혈당 수치 (>120 mg/dL)를 나타내었다. DIO 마우스를 공복 혈당에 기초하여 무작위로 처리군으로 나누고, 서열 번호 4의 GLP-1 MMB (1mg/kg, lot#8833173), 또는 PBS를 투여하였다. 투여-후 다양한 시간에, 포도당 저항성 시험을 수행하고, 혈액 샘플을 수집하여, 하기 기술된 바와 같이 서열 번호 4의 GLP-1 MMB 혈장 수준을 측정하였다.
포도당 저항성 시험( ipGTT ): 시험 전에 마우스를 밤새 굶겼다 (16 시간). 아침에 공복 포도당을 휴대용 글루코메터(LifeScan)를 사용하여 꼬리 스닙(snip)을 통해 측정하였다. T = 0 분에, 마우스에 D-포도당 (1.0 mg/g, Sigma)를 복막내 투여하였다. 꼬리 상처 혈액을 사용하여 15, 30, 60, 90 및 120 분 후에 혈당을 측정하였다.
GLP -1 MMB 혈장 수준: 심장 천공을 통하여 ipGTT 후에 혈액 샘플을 수집하였다. 프로테아제 억제제 (Roche Complete EDTA free, Roche Applied Science, Indianapolis, IN) 및 DPP4 억제제 (Linco, St. Charles, MO)를 함유하는 소듐 시트레이트 (3.8%) 중에 대략 300 ㎕의 혈액을 수집하였다. 서열 번호 4의 무손상 GLP-1 MMB의 농도를 MSD(Mesoscale Discovery) 기술을 사용하여 측정하였다[2-5]. 간단하게, 혈장 샘플을 1:8, 1:64 및 1:512의 총 4개의 희석액으로, BioMek Fx를 사용하여 단계적으로 희석하였다. 혈장을 사용하여 동일한 방식으로 희석된 표준 곡선을 각 플레이트에 포함시켰다. 모방체의 무손상 N-말단을 검출하기 위하여 설계된 비오티닐화 모노클로날 항체 (CNTO 1626)로 MSD 플레이트 상에서 GLP-1 MMB를 캡쳐하였다. 모방체의 링커 영역을 인지하는 루테늄 표지된 모노클로날 항체 (CNTO712)를 검출을 위해 첨가하고, MSD sector imager 6000 리더를 사용하여 형광 반응을 결정하였다. 시그모이달 용량-반응 곡선 (GraphPad PRISM)을 사용하여 서열 번호 4의 GLP-1 MMB 수준을 계산하였다.
결과 및 고찰. GLP -1 MMB 의 약역학 : 각 시간점으로부터의 ipGTT 데이터를 혈당 농도 대 시간으로 작도하였다 (도 25). 각각의 ipGTT 곡선에 대하여 곡선하 면적 (AUC)를 계산하였다 (도 26). 서열 번호 4의 GLP-1 MMB의 단일 투여로, 투여 후 최대 6일에 음성 대조군과 비교하여 통계적으로 AUC를 상당히 감소시켰다.
GLP -1 MMB 의 약동학: 각각의 포도당 저항성 시험 후 DIO 마우스에서 서열 번호 4의 GLP-1 MMB의 혈장 농도를 작도하였다 (도 27).
GLP -1 MMB 의 약역학적 활성과 그의 혈장 수준의 상관 관계:
모든 ipGTT 데이터에 대한 AUC를 각각의 포도당 저항성 시험 후 서열 번호 4의 GLP-1 MMB 혈장 수준에 대하여 작도하였다 (도 28). 데이터를 쌍곡선에 피팅시켜 ED50을 수득하였다 (370 ng/ml).
GLP -1 모방체의 잇점 : 2형 당뇨병을 치료하기 위한 치료제로서의 본 발명의 신규 분자의 용도는 다른 GLP-1 유사체와 비교하여 여러 잇점을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 GLP-1 펩티드의 반감기를 연장시킬 것이다. 또한, 모방체 스캐폴드 내의 야생형 GLP-1 펩티드는 프로테아제(특히 DDP-IV) 분해에 대해 저항성을 가진다. 이러한 것은 돌연변이 펩티드 보다 야생형 GLP-1 펩티드로 치료하는 것을 허용할 수 있다. GLP-1이 천연 펩티드이므로, 돌연변이된 GLP-1 유사체로 처리된 환자에 비해 GLP-1 모방체로 처리된 환자는 면역반응을 덜 나타낼 것이다. 또한, 모방체의 커다란 크기는 모방체가 혈액 뇌 장벽을 통과하는 것을 차단할 것이다. 이는 욕지기 및 불안이 뇌의 GLP-1R에 관여하는 GLP-1 관련과 연관되어 있으므로, 잇점을 제공할 수 있다. 더욱이, 상기 모방체 플랫폼은 각 모방체 분자 상에 두개 펩티드의 발현을 야기한다. 이는 GLP-1 펩티드가 서로 상호 작용하도록 하여, 세포 표면 GLP-1 수용체와의 친화성을 증가시킬 수 있는 다이머 리간드가 형성되도록 할 수 있다.
상기 발명의 상세한 설명 및 실시예에서 특정하게 기술된 바 이외에 다른 방 식으로 본 발명을 실시할 수 있음은 명백할 것이다.
상기 교시에 의해 본 발명의 수많은 변형 및 변이가 가능하므로, 이러한 변형 및 변이는 본 발명의 범위에 속한다.
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SEQUENCE LISTING <110> O'Neil, Karyn; Picha, Kristen <120> IMPROVED HUMAN GLP-1 MIMETIBODIES, COMPOSITIONS, METHODS AND USES <130> CEN{INSERT <140> <141> <160> 68 <210> 1 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp or Lys. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is Glu, Asp or Lys. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Arg, His, Glu, Asp or Lys. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is Phe, His, Trp or Tyr. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is Thr or Asn. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp or Lys. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is Glu or Asp. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is Val, Gln, His, Glu, or Lys. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa is Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp or Lys. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp or Lys. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is Tyr, Gln, His, Glu, or Lys. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa is Leu, Gln, His, Glu, or Lys. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa is Ala, Gly, Ser, Gln, Glu, Asp or Lys. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa is Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Gln, Asn, Arg, Cys, Glu, Asp or Lys. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa is Gln, Asn, Arg, His, Glu, Asp or Lys. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa is Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp or Lys. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa is Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp or Lys. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa is Lys, Arg, His, Gln, Trp, Tyr, Phe, Glu, or Asp. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa is Glu, Leu, Ala, His, Phe, Tyr, Trp, Arg, Gln, Thr, Ser, Gly, Asp or Lys. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa is Ala, Val, Leu, or Glu. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa is Ala, Gln, His, Glu, or Lys. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Xaa is Trp, Phe, Tyr, Glu, Asp or Lys. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> Xaa is Leu, Gly, Ala, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp, or Lys. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa is Val, Gln, His, Glu, or Lys. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Lys, Asn, Arg, His, Glu, or Asp. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa is Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Arg, Trp, Tyr, Phe, Pro, His, Glu, Asp or Lys. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa is Arg, His, Thr, Ser, Trp, Tyr, Phe, Glu, Asp or Lys. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa is Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Arg, Trp, Tyr, Phe, Pro, His, Glu, Asp or Lys. <400> 1 His Xaa Xaa Gly Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Tyr Xaa Glu Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Phe Xaa Ala Trp Leu Xaa Xaa Gly Xaa Xaa 20 25 30 <210> 2 <211> 278 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is Gln, Glu, Lys, His or Ala. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is Gln, Glu, Lys, His or Ala. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa is Gln, Glu, Lys, His or Ala. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa is Gln, Glu, Lys, or Ala. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa is Gln, Glu, Lys, His or Ala. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(44) <223> Xaa is Asn or Gln. <400> 2 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Xaa Ser Xaa Xaa Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Xaa Lys Glu Phe Ile Xaa Trp Leu Xaa Lys Gly Arg Gly Gly 20 25 30 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Xaa Ser Ser Glu Pro 35 40 45 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 50 55 60 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 65 70 75 80 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 85 90 95 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 100 105 110 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 115 120 125 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 130 135 140 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 145 150 155 160 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 165 170 175 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 180 185 190 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 195 200 205 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 210 215 220 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 225 230 235 240 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 245 250 255 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 260 265 270 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 275 <210> 3 <211> 837 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(30) <223> nnn is any codon encoding Gln, Glu, Lys, His or Ala. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (37)..(39) <223> nnn is any codon encoding Gln, Glu, Lys, His or Ala. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(42) <223> nnn is any codon encoding Gln, Glu, Lys, His or Ala. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (70)..(72) <223> nnn is any codon encoding Gln, Glu, Lys, His or Ala. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (79)..(81) <223> nnn is any codon encoding Gln, Glu, Lys, His or Ala. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (130)..(132) <223> nnn is any codon encoding Asn or Gln. <400> 3 catgctgaag ggacctttac tagtgatnnn agttctnnnn nngaaggcca agctgccaag 60 gaattcattn nntggctgnn naaaggccga ggaggtggat ccggtggagg ctccggtacc 120 ttagtcaccn nntcctcaga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacgtg cccaccgtgc 180 ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 240 accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 300 gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 360 aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgggtgg tcagcgtcct caccgtcctg 420 caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 480 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 540 accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 600 aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 660 aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 720 ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 780 gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatga 837 <210> 4 <211> 275 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Gly 20 25 30 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Asn Ser Ser Glu Ser 35 40 45 Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 50 55 60 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 65 70 75 80 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 85 90 95 Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 100 105 110 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr 115 120 125 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 130 135 140 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile 145 150 155 160 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 165 170 175 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 180 185 190 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 195 200 205 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 210 215 220 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val 225 230 235 240 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 245 250 255 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 260 265 270 Leu Gly Lys 275 210> 4 <211> 275 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Gly 20 25 30 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Asn Ser Ser Glu Ser 35 40 45 Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 50 55 60 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 65 70 75 80 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 85 90 95 Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 100 105 110 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr 115 120 125 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 130 135 140 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile 145 150 155 160 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 165 170 175 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 180 185 190 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 195 200 205 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 210 215 220 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val 225 230 235 240 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 245 250 255 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 260 265 270 Leu Gly Lys 275 210> 4a <211> 275 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4a His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Gly 20 25 30 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser 35 40 45 Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 50 55 60 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 65 70 75 80 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 85 90 95 Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 100 105 110 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr 115 120 125 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 130 135 140 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile 145 150 155 160 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 165 170 175 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 180 185 190 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 195 200 205 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 210 215 220 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val 225 230 235 240 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 245 250 255 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 260 265 270 Leu Gly Lys 275 210> 4b <211> 275 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4b His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Gly 20 25 30 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser 35 40 45 Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 50 55 60 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 65 70 75 80 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 85 90 95 Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 100 105 110 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr 115 120 125 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 130 135 140 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile 145 150 155 160 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 165 170 175 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 180 185 190 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 195 200 205 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 210 215 220 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val 225 230 235 240 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 245 250 255 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 260 265 270 Leu Gly Lys 275 210> 4c <211> 275 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4c His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Gly 20 25 30 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser 35 40 45 Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 50 55 60 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 65 70 75 80 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 85 90 95 Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 100 105 110 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr 115 120 125 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 130 135 140 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile 145 150 155 160 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 165 170 175 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 180 185 190 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 195 200 205 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 210 215 220 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val 225 230 235 240 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 245 250 255 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 260 265 270 Leu Gly Lys 275 210> 4d <211> 284 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4d His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly 35 40 45 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro 50 55 60 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 65 70 75 80 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 85 90 95 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe 100 105 110 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 115 120 125 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 130 135 140 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 145 150 155 160 Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 165 170 175 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln 180 185 190 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 195 200 205 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 210 215 220 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 225 230 235 240 Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu 245 250 255 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 260 265 270 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 275 280 284 <210> 5 <211> 828 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 catgctgaag ggacctttac tagtgatgta agttcttatt tggaaggcca agctgccaag 60 gaattcattg aatggctggt gaaaggccga ggaggtggat ccggtggagg ctccggtacc 120 ttagtcacca actcctcaga gtccaaatat ggtcccccat gcccaccatg cccggcgcct 180 gaggccgccg ggggaccatc agtcttcctg ttccccccaa aacccaagga cactctcatg 240 atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg gtggtggacg tgagccagga agaccccgag 300 gtccagttca actggtacgt ggatggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 360 gaggagcagt tcaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 420 tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aaggcctccc gtcctccatc 480 gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag cctcgagagc cacaggtgta caccctgccc 540 ccatcccagg aggagatgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 600 taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 660 accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcag gctaaccgtg 720 gacaagagca ggtggcagga ggggaatgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 780 cacaaccact acacacagaa aagcttgtcc ctgtctctgg gtaaatga 828 <210> 6 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is Ala, Gly, Ser. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is Glu, Asp. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is Phe, His, Trp or Tyr. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is Thr or Asn. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is Ala, Ser, Thr. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is Glu or Asp. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is Val, Gln, His, Glu, or Lys. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is Ser or Lys. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is Tyr, Gln, His, Glu, or Lys. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa is Leu, Gln, His, Glu, or Lys. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa is Gly, Ala, Glu, or Asp. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa is Gln, or Glu. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa is Ala or Lys. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa is Ala, Leu, Ile, Val, or Met. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa is Glu or Leu. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa is Ala, Val, Ile, Leu, or Glu. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa is Ala, Gln, His, Glu, or Lys. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa is Val, Gln, His, Glu, or Lys. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Lys or Asn. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa is Arg or Glu. <400> 6 His Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Glu Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Phe Xaa Xaa Trp Leu Xaa Xaa Gly Xaa 20 25 30 <210> 7 <211> 63 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Gly 20 25 30 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Asn Ser Ser Glu Ser 35 40 45 Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 50 55 60 <210> 8 <211> 63 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Gly 20 25 30 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Asn Ser Ser Glu Ser 35 40 45 Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 50 55 60 <210> 9 <211> 63 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 His Asp Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Gly 20 25 30 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Asn Ser Ser Glu Ser 35 40 45 Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 50 55 60 <210> 10 <211> 63 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 His Thr Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Gly 20 25 30 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Asn Ser Ser Glu Ser 35 40 45 Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 50 55 60 <210> 11 <211> 63 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Gly 20 25 30 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Asn Ser Ser Glu Ser 35 40 45 Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 50 55 60 <210> 12 <211> 52 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Val Lys Gly Arg Thr Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala 35 40 45 Pro Glu Ala Ala 50 <210> 13 <211> 43 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Val Lys Gly Arg Thr Gly 20 25 30 Ser Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Asn 35 40 <210> 14 <211> 72 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Val Lys Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly 35 40 45 Thr Leu Val Thr Asn Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro 50 55 60 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 65 70 <210> 15 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 16 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 17 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 <210> 21 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 <210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Gly Thr Leu Val Ala Val Ser Ser 1 5 <210> 23 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser 1 5 <210> 24 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Thr Val Ser Ser 1 <210> 25 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Ala Val Ser Ser 1 <210> 26 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 20 <210> 27 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Leu Gly Gly Pro 20 <210> 28 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala 1 5 10 15 Ala Gly Gly Pro 20 SEQ ID NO:29 <210> 29 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro 20 <210> 30 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Ala Gly Gly Pro 20 <210> 31 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Ala Leu Gly Gly Pro 20 <210> 32 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Glu Gly Gly Pro 20 <210> 33 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro 20 <210> 34 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Ala Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 20 <210> 35 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Ala His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 20 <210> 36 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 20 <210> 37 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 1 5 10 15 Gly Gly Pro <210> 38 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 1 5 10 15 <210> 39 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Ala 1 5 10 15 Ala Gly Gly Pro 20 <210> 40 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 1 5 10 15 Leu Gly Gly Pro 20 <210> 41 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 1 5 10 <210> 42 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro 1 5 10 <210> 43 <211> 102 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 1 5 10 15 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 20 25 30 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 35 40 45 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Asn 50 55 60 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 65 70 75 80 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 85 90 95 Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 <210> 44 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Asn Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 100 105 <210> 45 <211> 102 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 1 5 10 15 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp 20 25 30 Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 35 40 45 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Asn 50 55 60 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 65 70 75 80 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys 85 90 95 Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 <210> 46 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu 1 5 10 15 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly 65 70 75 80 Asn Asn Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 100 105 <210> 47 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(125) <223> Vh1 heavy chain variable region <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(31) <223> framework 1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> X is any amino acid. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(46) <223> framework 2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (47)..(47) <223> X is any amino acid. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (48)..(79) <223> framework 3 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (80)..(80) <223> X is any amino acid. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (81)..(125) <223> framework 4 <400> 47 Gln Val Gln Leu Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Xaa 20 25 30 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Xaa Arg 35 40 45 Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu 50 55 60 Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa 65 70 75 80 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Asn Ser Ser Gly Ser Thr Lys Gly 85 90 95 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 100 105 110 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 115 120 125 <210> 48 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(124) <223> Vh2 heavy chain variable region <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(30) <223> framework 1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa is any amino acid. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(45) <223> framework 2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (46)..(46) <223> Xaa is any amino acids. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (47)..(78) <223> framework 3 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (79)..(79) <223> Xaa is any amino acids. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (80)..(124) <223> framework 4 <400> 48 Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Xaa Trp 20 25 30 Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala Xaa Arg Leu 35 40 45 Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr Met Thr 50 55 60 Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Trp 65 70 75 80 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Asn Ser Ser Ala Ser Pro Thr Ser Pro 85 90 95 Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 100 105 110 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 115 120 <210> 49 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(100) <223> Vh3a heavy chain variable region <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(31) <223> framework 1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> complementarity determinng region 1 (CDR1), Xaa is any amino acids. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(46) <223> framework 2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (47)..(47) <223> complementarity determinng region 2 (CDR2), Xaa is 10-30 (18) of any amino acids. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (48)..(79) <223> framework 3 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (80)..(80) <223> complementarity determinng region 3 (CDR3), Xaa is 20-40 (31) of any amino acids. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (81)..(100) <223> framework 4 <400> 49 Glu Val Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Xaa 20 25 30 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Xaa Arg 35 40 45 Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met 50 55 60 Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa 65 70 75 80 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Asn Ser Ser Gly Ser Thr Lys Ala 85 90 95 Pro Ser Val Phe 100 <210> 50 <211> 102 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(102) <223> Vh3b heavy chain variable region <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(30) <223> framework 1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> complementarity determinng region 1 (CDR1), Xaa is 3-20 (5) of any amino acids. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(45) <223> framework 2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (46)..(46) <223> complementarity determinng region 2 (CDR2), Xaa is 5-25 (11) of any amino acids. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (47)..(78) <223> framework 3 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (79)..(79) <223> complementarity determinng region 3 (CDR3), Xaa is 15-40 (23) of any amino acids. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (80)..(102) <223> framework 4 <400> 50 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Xaa Trp 20 25 30 Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Xaa Arg Phe 35 40 45 Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn 50 55 60 Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Thr Xaa Trp 65 70 75 80 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Asn Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 85 90 95 Ser Val Phe Pro Leu Ala 100 <210> 51 <211> 101 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(101) <223> Vh3c heavy chain variable region <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(30) <223> framework 1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> complementarity determinng region 1 (CDR1), Xaa is 3-20 (5) of any amino acids. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(45) <223> framework 2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (46)..(46) <223> complementarity determinng region 2 (CDR2), Xaa is 10-30 (19) of any amino acids. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (47)..(79) <223> framework 3 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (80)..(80) <223> complementarity determinng region 3 (CDR3), Xaa is 15-40 (25) of any amino acids. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (81)..(101) <223> framework 4 <400> 51 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Xaa Trp 20 25 30 Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Xaa Arg Phe 35 40 45 Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile Ala Tyr Leu Gln Met Asn 50 55 60 Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Asn Xaa 65 70 75 80 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Asn Ser Ser Gly Ser Thr Lys Gly 85 90 95 Pro Ser Val Leu Pro 100 <210> 52 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(108) <223> Vh4 heavy chain variable region <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(33) <223> framework 1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> complementarity determinng region 1 (CDR1), Xaa is 3-20 (7) of any amino acids. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(48) <223> framework 2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49) <223> complementarity determinng region 2 (CDR2), Xaa is 10-30 (16) of any amino acids. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(81) <223> framework 3 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (82)..(82) <223> complementarity determinng region 3 (CDR3), Xaa is 20-45 (32) of any amino acids. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (83)..(108) <223> framework 4 <400> 52 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ser Ile Ser Ser 20 25 30 Ser Xaa Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Xaa Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 50 55 60 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 65 70 75 80 Arg Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Asn Ser Ser Ala Pro Thr 85 90 95 Lys Ala Pro Asp Val Phe Pro Ile Ile Ser Gly Cys 100 105 <210> 53 <211> 132 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(132) <223> Vh5 heavy chain variable region <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(31) <223> MISC_FEATURE <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> complementarity determinng region 1 (CDR1), Xaa is 3-20 (5) of any amino acids. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(46) <223> framework 2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (47)..(47) <223> complementarity determinng region 2 (CDR2), Xaa is 10-30 (17) of any amino acids. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (48)..(79) <223> framework 3 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (80)..(80) <223> complementarity determinng region 3 (CDR3), Xaa is 15-40 (23) of any amino acids. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (81)..(132) <223> framework 4 <400> 53 Glu Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 1 5 10 15 Glu 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(CDR2), Xaa is 10-30 (18) of any amino acids. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (47)..(78) <223> framework 3 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (79)..(79) <223> complementarity determinng region 3 (CDR3), Xaa is 5-30 (13) of any amino acids. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (80)..(125) <223> framework 4 <400> 54 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Xaa Trp 20 25 30 Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu Gly Xaa Arg Ile 35 40 45 Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn 50 55 60 Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Trp 65 70 75 80 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Asn Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro 85 90 95 Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn Ser Pro Ser Asp Thr Ser 100 105 110 Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp Phe Leu Pro 115 120 125 <210> 55 <211> 91 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(91) <223> Vh7 heavy chain variable region <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(30) <223> framework 1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> complementarity determinng region 1 (CDR1), Xaa is 3-20 (5) of any amino acids. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(45) <223> framework 2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (46)..(46) <223> complementarity determinng region 2 (CDR2), Xaa is 10-30 (17) of any amino acids. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (47)..(78) <223> framework 3 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (79)..(79) <223> complementarity determinng region 3 (CDR3), Xaa is 5-30 (13) of any amino acids. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (80)..(91) <223> framework 4 <400> 55 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Xaa Trp 20 25 30 Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Xaa Arg Phe 35 40 45 Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser 50 55 60 Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 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constant region <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(98) <223> CH1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (99)..(115) <223> hinge 1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (116)..(130) <223> hinge 2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (131)..(145) <223> hinge 3 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (146)..(160) <223> hinge 4 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (161)..(270) <223> CH2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (271)..(377) <223> CH3 <400> 62 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro 100 105 110 Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg 115 120 125 Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys 130 135 140 Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 145 150 155 160 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 165 170 175 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 180 185 190 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr 195 200 205 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 210 215 220 Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Asn Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 225 230 235 240 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 245 250 255 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln 260 265 270 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 275 280 285 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 290 295 300 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn 305 310 315 320 Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 325 330 335 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile 340 345 350 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln 355 360 365 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 370 375 <210> 63 <211> 327 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(327) <223> IgG4 heavy chain constant region <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(98) <223> CH1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (99)..(110) <223> hinge <220> <221> MISC_FEATURE <222> (111)..(220) <223> CH2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (221)..(327) <223> CH3 <400> 63 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Asn Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 64 <211> 476 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(476) <223> IgM heavy chain constant region <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(104) <223> CH1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (105)..(217) <223> CH2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (218)..(323) <223> CH3 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (324)..(476) <223> CH4 <400> 64 Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn 1 5 10 15 Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp 20 25 30 Phe Leu Pro Asp Ser Ile Thr Phe Ser Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser 35 40 45 Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys 50 55 60 Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val Met Gln 65 70 75 80 Gly Thr Asp Glu His Val Val Cys Lys Val Gln His Pro Asn Gly Asn 85 90 95 Lys Glu Lys Asn Val Pro Leu Pro Val Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys 100 105 110 Val Ser Val Phe Val Pro Pro Arg Asp Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg 115 120 125 Ser Lys Ser Lys Leu Ile Cys Gln Ala Thr Gly Phe Ser Pro Arg Gln 130 135 140 Ile Gln Val Ser Trp Leu Arg Glu Gly Lys Gln Asn Gly Ser Gly Val 145 150 155 160 Thr Thr Asp Gln Val Gln Ala Glu Ala Lys Glu Ser Gly Pro Thr Thr 165 170 175 Tyr Lys Val Thr Ser Thr Leu Thr Ile Lys Glu Ser Asp Trp Leu Ser 180 185 190 Gln Ser Met Phe Thr Cys Arg Val Asp His Arg Gly Leu Thr Phe Gln 195 200 205 Gln Asn Ala Ser Ser Met Cys Val Pro Asp Gln Asp Thr Ala Ile Arg 210 215 220 Val Phe Ala Ile Pro Pro Ser Phe Ala Ser Ile Phe Leu Thr Lys Ser 225 230 235 240 Thr Lys Leu Thr Cys Leu Val Thr Asp Leu Thr Thr Tyr Asp Ser Val 245 250 255 Thr Ile Ser Trp Thr Arg Gln Asn Gly Glu Ala Val Lys Thr His Thr 260 265 270 Asn Ile Ser Glu Ser His Pro Asn Ala Thr Phe Ser Ala Val Gly Glu 275 280 285 Ala Ser Ile Cys Glu Asp Asp Trp Asn Ser Gly Glu Arg Phe Thr Cys 290 295 300 Thr Val Thr His Thr Asp Leu Pro Ser Pro Leu Lys Gln Thr Ile Ser 305 310 315 320 Arg Pro Lys Gly Val Ala Leu His Arg Pro Asp Val Tyr Leu Leu Pro 325 330 335 Pro Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu Arg Glu Ser Ala Thr Ile Thr Cys 340 345 350 Leu Val Thr Gly Phe Ser Pro Ala Asp Val Phe Val Gln Trp Gln Met 355 360 365 Gln Arg Gly Gln Pro Leu Ser Pro Glu Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro 370 375 380 Met Pro Glu Pro Gln Ala Pro Gly Arg Tyr Phe Ala His Ser Ile Leu 385 390 395 400 Thr Val Ser Glu Glu Glu Trp Asn Thr Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val 405 410 415 Val Ala His Glu Ala Leu Pro Asn Arg Val Thr Glu Arg Thr Val Asp 420 425 430 Lys Ser Thr Gly Lys Pro Thr Ser Ala Asp Glu Glu Gly Phe Glu Asn 435 440 445 Leu Trp Ala Thr Ala Ser Thr Phe Ile Val Leu Tyr Asn Val Ser Leu 450 455 460 Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr Cys Tyr Val Lys 465 470 475 <210> 65 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Gly Gly Gly Lys Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 66 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Gly Gly Gly Asn Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 67 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 68 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Gly Pro Asn Gly Gly 1 5

Claims (38)

  1. 서열 번호 2 또는 4의 아미노산 서열을 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드, 또는 그에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 GLP-1 CH1 결실 모방체 핵산으로서, 상기 GLP-1 CH1 결실 모방체는 시험관 내 또는 생체 내에서 적어도 하나의 GLP-1 생물학적 활성을 가지며, 적어도 하나의 N-링크 글리코실화 부위를 추가로 포함하는 적어도 하나의 GLP-1 CH1 결실 모방체 핵산.
  2. 서열 번호 2, 4, 6 또는 7 내지 14로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드, 또는 그에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 GLP-1 CH1 결실 모방체 핵산으로서, 상기 GLP-1 CH1 결실 모방체는 시험관 내 또는 생체 내에서 적어도 하나의 GLP-1 생물학적 활성을 가지며, 적어도 하나의 N-링크 글리코실화 부위를 추가로 포함하는 적어도 하나의 GLP-1 CH1 결실 모방체 핵산.
  3. 제 2항에 있어서, 서열 번호 2 또는 4의 아미노산 서열을 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드, 또는 그에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하고, GLP-1 CH1 결실 모방체는 시험관 내 또는 생체 내에서 적어도 하나의 GLP-1 생물학적 활성을 가지며, 적어도 하나의 N-링크 글리코실화 부위를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 적어도 하나의 GLP-1 CH1 결실 모방체 핵산.
  4. 하기 화학식 (I)에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 적어도 하나의 GLP-1 CH1 결실 모방체 핵산:
    (Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t),
    상기 식에서,
    P는 서열 번호 1 또는 6에서 선택된 적어도 하나의 생활성 GLP-1 펩티드를 포함하고,
    L은 Ser 및 Gly를 포함하는 적어도 하나의 링커 서열이며,
    V는 면역글로불린 가변 영역의 C-말단의 적어도 한 부분이며,
    H는 면역글로불린 가변 힌지 영역의 적어도 한 부분이고,
    CH2는 면역글로불린 CH2 불변 영역의 적어도 한 부분이며,
    CH3은 면역글로불린 CH3 불변 영역의 적어도 한 부분이고,
    n은 1 내지 10의 정수이며,
    o, p, q, r, s, 및 t는 독립적으로 0 내지 10의 정수일 수 있고,
    상기 GLP-1 CH1 결실 모방체는 시험관 내 또는 생체 내에서 적어도 하나의 GLP-1 생물학적 활성을 가지며, 적어도 하나의 N-링크 글리코실화 부위를 추가로 포함한다.
  5. 서열 번호 2 또는 4의 인접 아미노산을 모두 포함하며, 시험관 내 또는 생체 내에서 적어도 하나의 GLP-1 생물학적 활성을 가지며, 적어도 하나의 N-링크 글리 코실화 부위를 추가로 포함하는 적어도 하나의 GLP-1 CH1 결실 모방체 폴리펩티드.
  6. 적어도 하나의 서열 번호 7 내지 14의 인접 아미노산을 모두 포함하며, 시험관 내 또는 생체 내에서 적어도 하나의 GLP-1 생물학적 활성을 가지며, 적어도 하나의 N-링크 글리코실화 부위를 추가로 포함하는 적어도 하나의 GLP-1 CH1 결실 모방체 폴리펩티드.
  7. 하기 화학식 (I)에 따른 폴리펩티드를 포함하는 적어도 하나의 GLP-1 CH1 결실 모방체 폴리펩티드:
    (Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t),
    상기 식에서,
    P는 서열 번호 1 및 6으로부터 선택되는 적어도 하나의 생활성 GLP-1 펩티드이고,
    L은 GS, GGS, GGGS(서열번호 16), GSGGGS(서열번호 17), GGSGGGS(서열번호 18), GGSGGGSGG(서열번호 19) 및 GGGSGGGSGG(서열번호 20)로부터 선택되며;
    V는 GTLVTVSS(서열번호 21), GTLVAVSS(서열번호 22), GTAVTVSS(서열번호 23), TVSS(서열번호 24), 및 AVSS(서열번호 25)로부터 선택되고;
    H는 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP(서열번호 26)이며,
    CH2는 SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK(서열번호 43)이며,
    CH3는 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 44)이며,
    n은 1 내지 10의 정수이고,
    o, p, q, r, s, 및 t는 독립적으로 0 내지 10의 정수일 수 있으며,
    상기 GLP-1 CH1 결실 모방체는 시험관 내 또는 생체 내에서 적어도 하나의 GLP-1 생물학적 활성을 가지며, 적어도 하나의 N-링크 글리코실화 부위를 추가로 포함한다.
  8. 하기 화학식 (I)에 따른 폴리펩티드를 포함하는 적어도 하나의 GLP-1 CH1 결실 모방체 폴리펩티드:
    (Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t),
    상기 식에서,
    P는 서열 번호 6의 적어도 하나의 생활성 GLP-1 펩티드이고,
    L은 GS, GGS, GGGS(서열번호 16), GSGGGS(서열번호 17), GGSGGGS(서열번호 18), GGSGGGSGG(서열번호 19) 및 GGGSGGGSGG(서열번호 20)으로부터 선택되며;
    V는 GTLVTVSS(서열번호 21), GTLVAVSS(서열번호 22), GTAVTVSS(서열번호 23), TVSS(서열번호 24), 및 AVSS(서열번호 25)으로부터 선택되며;
    H는 ESKYGPPCPSCPAPEFLGGP(서열번호 27)이고,
    CH2는 SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK(서열번호 45)이고,
    CH3는 GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(서열번호 46)이고,
    n은 1 내지 10의 정수이고,
    o, p, q, r, s, 및 t는 독립적으로 0 내지 10의 정수일 수 있으며,
    상기 GLP-1 CH1 결실 모방체는 시험관 내 또는 생체 내에서 적어도 하나의 GLP-1 생물학적 활성을 가지며, 적어도 하나의 N-링크 글리코실화 부위를 추가로 포함한다.
  9. 하기 화학식 (I)에 따른 폴리펩티드를 포함하는 적어도 하나의 GLP-1 CH1 결실 모방체 폴리펩티드:
    (Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t),
    상기 식에서,
    P는 서열 번호 6의 적어도 하나의 생활성 GLP-1 펩티드이고,
    L은 GS, GGS, GGGS(서열번호 16), GSGGGS(서열번호 17), GGSGGGS(서열번호 18), GGSGGGSGG(서열번호 19) 및 GGGSGGGSGG(서열번호 20)으로부터 선택되며;
    V는 GTLVTVSS(서열번호 21), GTLVAVSS(서열번호 22), GTAVTVSS(서열번호 23), TVSS(서열번호 24), 및 AVSS(서열번호 25)으로부터 선택되며;
    H는 ESKYGPPCPPCPAPEAAGGP(서열번호 28)이고,
    CH2는 SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK(서열번호 45)이고,
    CH3는 GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(서열번호 46)이고,
    n은 1 내지 10의 정수이고,
    o, p, q, r, s, 및 t는 독립적으로 0 내지 10의 정수일 수 있으며,
    상기 GLP-1 CH1 결실 모방체는 시험관 내 또는 생체 내에서 적어도 하나의 GLP-1 생물학적 활성을 가지며, 적어도 하나의 N-링크 글리코실화 부위를 추가로 포함한다.
  10. 하기 화학식 (I)에 따른 폴리펩티드를 포함하는 적어도 하나의 GLP-1 CH1 결실 모방체 폴리펩티드:
    (Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t),
    상기 식에서,
    P는 적어도 하나의 생활성 GLP-1 펩티드, 변이체 또는 유도체이고,
    L은 상기 모방체가 다른 배향 및 결합 성질을 갖도록 허용함으로써 구조적 유연성을 제공하는 폴리펩티드일 수 있는 적어도 하나의 링커 서열이며,
    V는 면역글로불린 가변 영역의 C-말단의 적어도 한 부분이며,
    H는 면역글로불린 가변 힌지 영역의 적어도 한 부분이고,
    CH2는 SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK(서열번호 43)이고,
    CH3은 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 44)이고,
    n은 1 내지 10의 정수이고,
    o, p, q, r, s, 및 t는 독립적으로 0 내지 10의 정수일 수 있으며,
    상기 GLP-1 CH1 결실 모방체는 시험관 내 또는 생체 내에서 적어도 하나의 GLP-1 생물학적 활성을 가지며, 적어도 하나의 N-링크 글리코실화 부위를 추가로 포함한다.
  11. 하기 화학식 (I)에 따른 폴리펩티드를 포함하는 적어도 하나의 GLP-1 CH1 결실 모방체 폴리펩티드:
    (Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t),
    상기 식에서,
    P는 적어도 하나의 생활성 GLP-1 펩티드, 변이체 또는 유도체이고,
    L은 상기 모방체가 다른 배향 및 결합 성질을 갖도록 허용함으로써 구조적 유연성을 제공하는 폴리펩티드일 수 있는 적어도 하나의 링커 서열이며,
    V는 면역글로불린 가변 영역의 C-말단의 적어도 한 부분이며,
    H는 면역글로불린 가변 힌지 영역의 적어도 한 부분이고,
    CH2는 SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK(서열번호 45)이고,
    CH3은 GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(서열번호 46)이고,
    n은 1 내지 10의 정수이고,
    o, p, q, r, s, 및 t는 독립적으로 0 내지 10의 정수일 수 있으며,
    상기 GLP-1 CH1 결실 모방체는 시험관 내 또는 생체 내에서 적어도 하나의 GLP-1 생물학적 활성을 가지며, 적어도 하나의 N-링크 글리코실화 부위를 추가로 포함한다.
  12. 하기 화학식 (I)에 따른 폴리펩티드를 포함하는 적어도 하나의 GLP-1 CH1 결실 모방체 폴리펩티드:
    (Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t),
    상기 식에서,
    P는 서열 번호 6의 적어도 하나의 생활성 GLP-1 펩티드이고,
    L은 상기 모방체가 다른 배향 및 결합 성질을 갖도록 허용함으로써 구조적 유연성을 제공하는 폴리펩티드일 수 있는 적어도 하나의 링커 서열이며,
    V는 면역글로불린 가변 영역의 C-말단의 적어도 한 부분이며,
    H는 면역글로불린 가변 힌지 영역의 적어도 한 부분이고,
    CH2는 면역글로불린 CH2 불변 영역의 적어도 한 부분이며,
    CH3은 면역글로불린 CH3 불변 영역의 적어도 한 부분이고,
    n은 1 내지 10의 정수이고,
    o, p, q, r, s, 및 t는 독립적으로 0 내지 10의 정수일 수 있으며,
    상기 GLP-1 CH1 결실 모방체는 시험관 내 또는 생체 내에서 적어도 하나의 GLP-1 생물학적 활성을 가지며, 적어도 하나의 N-링크 글리코실화 부위를 추가로 포함한다.
  13. 하기 화학식 (I)에 따른 폴리펩티드를 포함하는 적어도 하나의 GLP-1 CH1 결실 모방체 폴리펩티드:
    (Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t),
    상기 식에서,
    P는 적어도 하나의 생활성 GLP-1 펩티드, 변이체 또는 유도체이고,
    L은 GS, GGS, GGGS(서열번호 16), GSGGGS(서열번호 17), GGSGGGS(서열번호 18), GGSGGGSGG(서열번호 19) 및 GGGSGGGSGG(서열번호 20)으로부터 선택되며;
    V는 면역글로불린 가변 영역의 C-말단의 적어도 한 부분이고,
    H는 면역글로불린 가변 힌지 영역의 적어도 한 부분이며,
    CH2는 면역글로불린 CH2 불변 영역의 적어도 한 부분이고,
    CH3은 면역글로불린 CH3 불변 영역의 적어도 한 부분이며,
    n은 1 내지 10의 정수이고,
    o, p, q, r, s, 및 t는 독립적으로 0 내지 10의 정수일 수 있으며,
    상기 GLP-1 CH1 결실 모방체는 시험관 내 또는 생체 내에서 적어도 하나의 GLP-1 생물학적 활성을 가지며, 적어도 하나의 N-링크 글리코실화 부위를 추가로 포함한다.
  14. 하기 화학식 (I)에 따른 폴리펩티드를 포함하는 적어도 하나의 GLP-1 CH1 결실 모방체 폴리펩티드:
    (Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t),
    상기 식에서,
    P는 적어도 하나의 생활성 GLP-1 펩티드, 변이체 또는 유도체이고;
    L은 상기 모방체가 다른 배향 및 결합 성질을 갖도록 허용함으로써 구조적 유연성을 제공하는 폴리펩티드일 수 있는 적어도 하나의 링커 서열이며;
    V는 GTLVTVSS(서열번호 21), GTLVAVSS(서열번호 22), GTAVTVSS(서열번호 23), TVSS(서열번호 24), 및 AVSS(서열번호 25)으로부터 선택되며;
    H는 면역글로불린 가변 힌지 영역의 적어도 한 부분이고;
    CH2는 면역글로불린 CH2 불변 영역의 적어도 한 부분이며;
    CH3은 면역글로불린 CH3 불변 영역의 적어도 한 부분이고;
    n은 1 내지 10의 정수이며,
    o, p, q, r, s, 및 t는 독립적으로 0 내지 10의 정수일 수 있으며,
    상기 GLP-1 CH1 결실 모방체는 시험관 내 또는 생체 내에서 적어도 하나의 GLP-1 생물학적 활성을 가지며, 적어도 하나의 N-링크 글리코실화 부위를 추가로 포함한다.
  15. 하기 화학식 (I)에 따른 폴리펩티드를 포함하는, 적어도 하나의 GLP-1 CH1 결실 모방체 폴리펩티드:
    (Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t),
    상기 식에서,
    P는 적어도 하나의 생활성 GLP-1 펩티드, 변이체 또는 유도체이고,
    L은 상기 모방체가 다른 배향 및 결합 성질을 갖도록 허용함으로써 구조적 유연성을 제공하는 폴리펩티드일 수 있는 적어도 하나의 링커 서열이며,
    V는 면역글로불린 가변 영역의 C-말단의 적어도 한 부분이며,
    H는 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP(서열번호 26), ESKYGPPCPSCPAPEFLGGP(서열번호 27), 및 ESKYGPPCPPCPAPEAAGGP(서열번호 28)으로부터 선택되고,
    CH2는 면역글로불린 CH2 불변 영역의 적어도 한 부분이고,
    CH3은 면역글로불린 CH3 불변 영역의 적어도 한 부분이며,
    n은 1 내지 10의 정수이고,
    o, p, q, r, s, 및 t는 독립적으로 0 내지 10의 정수일 수 있으며,
    상기 GLP-1 CH1 결실 모방체는 시험관 내 또는 생체 내에서 적어도 하나의 GLP-1 생물학적 활성을 가지며, 적어도 하나의 N-링크 글리코실화 부위를 추가로 포함한다.
  16. 하기 화학식 (I)에 따른 폴리펩티드를 포함하는 적어도 하나의 GLP-1 CH1 결실 모방체 폴리펩티드:
    (Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t),
    상기 식에서,
    P는 적어도 하나의 생활성 GLP-1 펩티드, 변이체 또는 유도체이고,
    L은 상기 모방체가 다른 배향 및 결합 성질을 갖도록 허용함으로써 구조적 유연성을 제공하는 폴리펩티드일 수 있는 적어도 하나의 링커 서열이며,
    V는 면역글로불린 가변 영역의 C-말단의 적어도 한 부분이며,
    H는 EPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGP(서열번호 29), EPKSADKTHTCPPCPAPELAGGP(서열번호 30), EPKSADKTHTCPPCPAPEALGGP(서열번호 31), EPKSADKTHTCPPCPAPELEGGP(서열번호 32), EPKSSDKTHTCPPCPAPEFLGGP(서열번호 33), EPKSADKTHACPPCPAPELLGGP(서열번호 34), EPKSADKAHTCPPCPAPELLGGP(서열번호 35), EPKSADKTHTCPPCPAPELLGGP(서열번호 36), ADKTHTCPPCPAPELLGGP(서열번호 37), THTCPPCPAPELLGGP(서열번호 38), ESKYGPPCPSCPAPEAAGGP(서열번호 39), ESKYGPPCPPCPAPELLGGP(서열번호 40), CPPCPAPELLGGP(서열번호 41), 및 CPPCPAPEAAGGP(서열번호 42)으로부터 선택되고,
    CH2는 면역글로불린 CH2 불변 영역의 적어도 한 부분이고,
    CH3은 면역글로불린 CH3 불변 영역의 적어도 한 부분이며,
    n은 1 내지 10의 정수이고,
    o, p, q, r, s, 및 t는 독립적으로 0 내지 10의 정수일 수 있으며,
    상기 GLP-1 CH1 결실 모방체는 시험관 내 또는 생체 내에서 적어도 하나의 GLP-1 생물학적 활성을 가지며, 적어도 하나의 N-링크 글리코실화 부위를 추가로 포함한다.
  17. 하기 화학식 (I)에 따른 폴리펩티드를 포함하는 적어도 하나의 GLP-1 CH1 결 실 모방체 폴리펩티드:
    (Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t),
    상기 식에서,
    P는 적어도 하나의 생활성 GLP-1 펩티드, 변이체 또는 유도체이고,
    L은 상기 모방체가 다른 배향 및 결합 성질을 갖도록 허용함으로써 구조적 유연성을 제공하는 폴리펩티드일 수 있는 적어도 하나의 링커 서열이며,
    V는 면역글로불린 가변 영역의 C-말단의 적어도 한 부분이며,
    H는 면역글로불린 가변 힌지 영역의 적어도 한 부분이고,
    CH2는 면역글로불린 CH2 불변 영역의 적어도 한 부분이며,
    CH3은 면역글로불린 CH3 불변 영역의 적어도 한 부분이고,
    n은 1 내지 10의 정수이며,
    o, p, q, r, s, 및 t는 독립적으로 0 내지 10의 정수일 수 있으며,
    상기 GLP-1 CH1 결실 모방체는 시험관 내 또는 생체 내에서 적어도 하나의 GLP-1 생물학적 활성을 가지며, 적어도 하나의 N-링크 글리코실화 부위를 추가로 포함한다.
  18. 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 따른 GLP-1 CH1 결실 모방체 핵산 또는 GLP-1 CH1 결실 모방체 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는 적어도 하나의 P 폴리펩티드의 적어도 하나의 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 GLP-1 CH1 결실 모방체 핵산 또는 GLP-1 CH1 결실 모방체 폴리펩티드.
  19. 제 4항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 GLP-1 CH1 결실 모방체 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는, 항-이디오타입 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 융합 단백질, 또는 이의 단편.
  20. 제 4항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 GLP-1 CH1 결실 모방체 폴리펩티드 또는 GLP-1 CH1 결실 모방체 항체를 코딩하거나, 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 GLP-1 CH1 결실 모방체 핵산 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드.
  21. 제 20항에 따른 적어도 하나의 분리된 핵산을 포함하는 GLP-1 CH1 결실 모방체 벡터.
  22. 제 20항에 따른 분리된 핵산을 포함하는 GLP-1 CH1 결실 모방체 숙주 세포.
  23. 제 21항에 있어서, COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, NSO, DG44 CHO, CHO K1, HeLa, 골수종, 또는 림프종 세포, 또는 이의 임의의 유도체, 불멸화 세포 또는 형질 전환된 세포로부터 선택된 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 GLP-1 CH1 결실 모방체 숙주 세포.
  24. GLP-1 CH1 결실 모방체 또는 항체가 검출 가능하거나 회수 가능한 양으로 발현되도록, 시험관 내, 생체 내 또는 인 시츄(in situ) 조건 하에서 제 20항에 따른 핵산을 번역하는 것을 포함하여, 적어도 하나의 GLP-1 CH1 결실 모방체 폴리펩티드 또는 GLP-1 CH1 결실 모방체 항체를 제조하는 방법.
  25. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 GLP-1 CH1 결실 모방체 핵산, GLP-1 CH1 결실 모방체 폴리펩티드, 또는 GLP-1 CH1 결실 모방체 항체를 포함하는 조성물.
  26. 제 25항에 있어서, 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  27. 제 25항에 있어서, 당뇨병 또는 인슐린 대사 관련 약물, 검출 가능한 표지 또는 리포터, TNF 길항제, 항-감염제, 심혈관(CV)계 약물, 중추 신경계(CNS) 약물, 자율 신경계(ANS) 약물, 기도 약물, 위장(GI)관 약물, 호르몬 약물, 체액 또는 전해질 균형 약물, 혈액 약물, 항신생물제, 면역 조절 약물, 눈, 귀 또는 코 약물, 국소 약물, 영양제, 사이토카인, 또는 사이토카인 길항제 중 적어도 하나로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물, 조성물 또는 폴리펩티드의 치료적 유효량을 포함하는 적어도 하나의 조성물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  28. 제 25항에 있어서, 액체, 가스, 또는 건조, 용액, 혼합물, 현탁액, 에멀젼 또는 콜로이드, 동결건조된 제제, 또는 분말로부터 선택된 적어도 하나의 형태인 것을 특징으로 하는 조성물.
  29. (a) 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 GLP-1 CH1 결실 모방체 핵산, 폴리펩티드 또는 항체의 유효량을 포함하는 조성물을 세포, 조직, 기관 또는 동물과 접촉시키거나 이들에게 투여하는 것을 포함하여, 세포, 조직, 기관 또는 동물에서 GLP-1 관련 증상을 진단하거나 치료하는 방법.
  30. 제 29항에 있어서, GLP-1 관련 증상이 당뇨병 또는 울혈성 심장 기능상실인 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 29항에 있어서, 유효량이 세포, 조직, 기관 또는 동물의 1 킬로그램 당 0.0001 내지 50 mg의 GLP-1 CH1 결실 모방체 항체; 0.1 내지 500 mg의 GLP-1 CH1 결실 모방체; 또는 0.0001 내지 100 ㎍의 GLP-1 CH1 결실 모방체 핵산인 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 29항에 있어서, 접촉 또는 투여가 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복강내, 낭내, 연골내, 강내, 복내, 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 경관내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심장막내, 복막내, 흉막내, 전립샘내, 폐 내, 직장내, 콩팥내, 망막내, 척수내, 윤활막내, 흉부내, 자궁내, 방광내, 병변내, 볼루스, 질, 직장, 볼, 설하, 비강내, 또는 경피로부터 선택된 적어도 하나의 방식에 의한 것임을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 29항에 있어서, (a)의 접촉 또는 투여 전, 그와 동시에 또는 그 후에 당뇨병 또는 인슐린 대사 관련 약물, 검출 가능한 표지 또는 리포터, TNF 길항제, 항-감염제, 심혈관(CV)계 약물, 중추 신경계(CNS) 약물, 자율 신경계(ANS) 약물, 기도 약물, 위장(GI)관 약물, 호르몬 약물, 체액 또는 전해질 균형 약물, 혈액 약물, 항신생물제, 면역 조절 약물, 눈, 귀 또는 코 약물, 국소 약물, 영양제, 사이토카인, 또는 사이토카인 길항제 중 적어도 하나로부터 선택된 적어도 하나의 화합물 또는 폴리펩티드의 유효량을 포함하는 적어도 하나의 조성물을 투여하는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복강내, 낭내, 연골내, 강내, 복내, 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 경관내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심장막내, 복막내, 흉막내, 전립샘내, 폐내, 직장내, 콩팥내, 망막내, 척수내, 윤활막내, 흉부내, 자궁내, 방광내, 병변내, 볼루스, 질, 직장, 볼, 설하, 비강내, 또는 경피로부터 선택된 적어도 하나의 방식에 의해 적어도 하나의 GLP-1 CH1 결실 모방체 폴리펩티드, 항체 또는 핵산을 접촉시키거나 투여하는데 적합한, 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 분리된 GLP-1 CH1 결실 모방체 폴 리펩티드, 항체 또는 핵산을 포함하는 장치.
  35. 포장재와 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 분리된 GLP-1 CH1 결실 모방체 폴리펩티드, 항체 또는 핵산을 포함하는 용기를 포함하는, 인간에 대한 약제학적 또는 진단 용도를 위한 제품.
  36. 제 35항에 있어서, 용기가 경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복강내, 낭내, 연골내, 강내, 복내, 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 경관내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심장막내, 복막내, 흉막내, 전립샘내, 폐내, 직장내, 콩팥내, 망막내, 척수내, 윤활막내, 흉부내, 자궁내, 방광내, 병변내, 볼루스, 질, 직장, 볼, 설하, 비강내, 또는 경피 전달 장치 또는 시스템의 요소인 것을 특징으로 하는 제품.
  37. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 분리된 GLP-1 CH1 결실 모방체 폴리펩티드, 항체 또는 핵산을 검출 가능하거나 회수 가능한 양으로 발현할 수 있는 적어도 하나의 숙주 세포, 트랜스제닉 동물, 트랜스제닉 식물, 식물 세포를 제공하는 것을 포함하여, 상기 적어도 하나의 분리된 GLP-1 CH1 결실 모방체 폴리펩티드, 항체 또는 핵산을 제조하는 방법.
  38. 제 37항의 방법에 따라 제조된, 적어도 하나의 GLP-1 CH1 결실 모방체 폴리 펩티드, 항체 또는 핵산.
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