BRPI0714334A2 - mimeticorpos de glp-1 humano aperfeiÇoados, composiÇÕes, mÉtodos e usos - Google Patents

Abstract

MIMETICORPOS DE GLP-1 HUMANO APERFEIÇOADOS,COMPOSIÇÕES, MÉTODOS E USOS. A presente invenção se refere a pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 humano aperfeiçoado ou porção ou variante especificada, incluindo ácidos nucleicos isolados que codificam pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada, mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variantes especificadas, vetores, células hospedeiras, animais ou plantas transgênicas e métodos de fabricação e uso dos mesmos, incluindo composições terapêuticas, métodos e dispositivos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MIMETICOR- POS DE GLP-1 HUMANO APERFEIÇOADOS, COMPOSIÇÕES, MÉTO- DOS E USOS"

Referência Cruzada a Pedidos Relacionados O presente pedido reivindica prioridade dos benefícios do depó-

sito do Pedido Provisório U.S. N3 de Série 60/831.704, depositado em 18 de hulho de 2006. As descrições completas do pedido de patente U.S. relacio- nado antes mencionado são aqui incorporadas por referência para todas as finalidades. Antecedentes da Invenção Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a mimeticorpos de GLP-1 de ma- mífero aperfeiçoados, porções especificadas e variantes específicas para proteínas biologicamente ativas, fragmento ou ligantes, ácidos nucleicos complementares e que codificam mimeticorpo de GLP-1, células hospedei- ras e métodos de fabricação e uso dos mesmos, incluindo formulações tera- pêuticas, administração e dispositivos. Técnica Relacionada

Proteínas recombinantes são uma classe emergente de agentes terapêuticos. Tais produtos terapêuticos recombinantes têm engendrado a- vanços na formulação e modificação química de proteína. Tais modificações podem intensificar potencialmente a utilidade terapêutica de proteínas tera- pêuticas, tal como através de aumento das meias-vidas (por exemplo, atra- vés de bloqueio de sua exposição às enzimas proteolíticas), intensificação da atividade biológica ou redução de efeitos colaterais indesejados. Uma de tais modificações é o uso de fragmentos de imunoglobulina fundidos às pro- teínas de receptor, tal como enteracept. Proteínas terapêuticas também têm sido construídas usando o domínio Fc para tentar proporcionar uma meia- vida mais longa ou incorporar funções tais como ligação ao receptor Fe, Iiga- ção à proteína A e fixação de complemento.

O diabetes é uma epidemia crescente que estima-se que venha a afetar mais de 300 milhões de pessoas por ano em 2025 dependendo de uma cura farmacêutica eficaz. O diabetes do tipo 2 responde por 90-95% de todos os casos. Complicações resultantes de níveis elevados sustentados de glicose no plasma incluem doença cardiovascular, nefropatia, neuropatia e retinopatia. Além disso, a célula β do pâncreas morrem e, portanto, param de secretar insulina durante os últimos estágios de diabetes do tipo 2. Tra- tamentos atuais para o diabetes estão associados a uma variedade de efei- tos colaterais prejudiciais, incluindo hipoglicemia e ganho de peso. Além dis- so, os tratamentos atuais para diabetes do tipo 2 não curam a doença, mas simplesmente prolongam o tempo até que os pacientes venham a requerer terapia com insulina.

Peptídeo-1 semelhante ao glucagon (GLP-1) é um peptídeo de 37 aminoácidos secretado das L-células do intestino após um estímulo com glicose oral. Um subsequente estímulo endógeno entre as 6a e 7a posições produz o peptídeo de GLP-1 biologicamente ativo (7-37). A seqüência do peptídeo de GLP-1 (7-37) pode ser dividida em 2 domínios estruturais. O domínio amino terminal do peptídeo está envolvido em sinalização, enquanto que o restante do peptídeo parece se ligar aos laços extracelulares do re- ceptor de GLP-1 em uma conformação helicoidal. Em resposta à glicose, o GLP-1 ativo se liga ao receptor de GLP-1 sobre o pâncreas e causa um au- mento na secreção de insulina (ação insulinotrópica). Além disso, foi mos- trado que o GLP-1 reduz o esvaziamento gástrico, o qual diminui o bolo de glicose que é liberado na circulação e pode reduzir a ingestão de alimento. Essas ações em combinação diminuem os níveis de glicose no sangue. Também foi mostrado que o GLP-1 inibe a apoptose e aumenta a prolifera- ção de células β no pâncreas. Assim, o GLP-1 é um produto terapêutico a- traente para diminuir a glicose no sangue e preservar as células β do pân- creas em pacientes diabéticos. Além disso, a atividade de GLP-1 é controla- da pelos níveis de glicose no sangue. Quando os níveis de glicose no san- gue caem para um determinado nível de limiar, o GLP-1 não é ativo. Portan- to, não há risco de hipoglicemia associada ao tratamento envolvendo GLP-1.

A viabilidade de terapia com GLP-1 foi demonstrada na clínica. Uma infusão de GLP-1 de seis semanas diminuiu os níveis médios de glico- se no plasma em jejum e 8 horas efetivamente em pacientes com diabetes do tipo 2. Terapia com GLP-1 também resultou em um aperfeiçoamento na função de células β. Exenatida é um análogo de GLP-1 atualmente em expe- rimentos clínicos. Exenatida foi primeiro identificada na saliva do lagarto Gila . 5 Monster e é 53% idêntica ao GLP-1. A exenatida pode se ligar ao receptor de GLP-1 e iniciar a cascata de transdução de sinal responsável pelas nu- merosas atividades que têm sido atribuídas ao GLP-1 (7-37). Até o momen- to, foi mostrado que ela reduz os níveis de HbAIc e os níveis de fructosami- na no soro em pacientes com diabetes do tipo 2. Além disso, ela retardou o

esvaziamento gástrico e inibiu a ingestão de alimento em voluntários saudá- veis.

Contudo, GLP-1 é rapidamente inativado in vivo pela protease dipeptitil-peptidase IV (DPP-IV). Portanto, a utilidade de terapia envolvendo peptídeos de GLP-1 tem sido limitada por sua rápida desobstrução e meias- vidas curtas. Por exemplo, GLP-1 (7-37) tem uma meia-vida no soro de ape- nas 3 a 5 minutos. GLP-1 (7-36) amida tem um tempo de ação de cerca de 50 minutos quando administrado subcutaneamente. Mesmos análogos e derivados que são resistentes à clivagem com protease endógena, mas não tem meias-vidas longas o bastante para evitar administrações repetidas du- rante um período de 24 horas. Por exemplo, exenatida é resistente à DPP- IV, ao mesmo tempo em que requer dosagem pré-prandial duas vezes por dia em virtude da meia-vida curta e variabilidade significativa na farmacoci- nética in vivo. NN2211, outro composto atualmente em experimentos clíni- cos, é um análogo de GLP-1 lipidado. Espera-se que ele seja dosado uma vez ao dia.

Desobstrução rápida de um agente terapêutico é inconveniente em casos onde se desejada manter um alto nível do agente no sangue du- rante um período de tempo prolongado, uma vez que administrações repeti- das, então, serão necessárias. Além disso, um composto de longa ação é particularmente importante para pacientes diabéticos cujo regime de trata- mento no passado tem envolvido ingestão oral de medicação oral. Esses pacientes freqüentemente têm um tempo de transição extremamente difícil para um regime que envolve múltiplas injeções de medicação. Uma terapia com GLP-1 que tem uma meia-vida aumentada teria uma vantagem signifi- cativa com relação a outros peptídeos de GLP-1 e compostos em desenvol- vimento.

Consequentemente, há uma necessidade de proporcionar ver- sões aperfeiçoadas de proteínas terapêuticas de GLP-1 as quais superem um ou mais desses e outros problemas conhecidos na técnica. A tecnologia de mimeticorpo proporciona uma nova plataforma de distribuição para produ- tos terapêuticos peptídicos. Um mimeticorpo de GLP-1 pode proporcionar um meio de distribuição do peptídeo de GLP-1 de uma maneira sustentada, proporcionando um aperfeiçoamento sobre peptídeos de GLP-1 atualmente em desenvolvimento. Além disso, baseado em suas características de estru- tura dimérica e sua distribuição tecidual, um mimeticorpo de GLP-1 teria ca- racterísticas diferenciáveis com relação à secreção de insulina, preservação de células β e ingestão de alimento. Sumário da Invenção

A presente invenção proporciona mimeticorpos de GLP-1 huma- no aperfeiçoados, incluindo imunoglobulinas modificadas, produtos de cliva- gem e outras porções especificadas e variantes dos mesmos, bem como composições de mimeticorpo de GLP-1, ácidos nucleicos de codificação ou complementares, vetores, células hospedeiras, composições, formulações, dispositivos, animais transgênicos, plantas transgênicas e métodos de fabri- cação e uso dos mesmos, conforme descrito e/ou permitido aqui, em combi- nação com aquilo que é conhecido na técnica.

De preferência, tais mimeticorpos de GLP-1 são aperfeiçoados com relação à expressão, purificação e/ou estabilidade através de alteração de sítios de glicosilação O-Iigados (tais como, mas não limitado a, Val-Xaa- Ser) para sítios de glicosilação N-Iigados (tais como, mas não limitado a, Asn-Xaa-Ser ou Gln-Xaa-Ser). A presente invenção proporciona tais aperfei- çoamentos em mimeticorpos de GLP-1 CH1-deletados (por exemplo, alani- na) ou sítios de O-glicosilação tais como, mas não limitado, à seqüência Val- Xaa-Ser, podem ser substituídos por sítios de N-glicosilação, tais como Asn- Xaa-Ser ou Gln-Xaa-Ser, conforme possa ser preferido, por exemplo, mas não limitado a, conforme feito nos seguintes resíduos apresentados na Lis- tagem de Seqüência: Val-Xaa-Ser (sítio de O-glicosilação) muda para o sítio de N-glicosilação Asn-Xaa-Ser na: posição 44 em SEQ ID NOS: 2, 4, 7-14, . 5 posição 64 em SEQ ID NOS: 43, 45, posição 82 em SEQ ID NOS: 44, 46 e 51; posição 88 em SEQ ID NOS: 48 , 50, 53-55, posição 89 em SEQ ID NO: 47, posição 90 em SEQ ID NO: 49; posição 103 e/ou 185 em SEQ ID NOS: 56 e 63; ou posição 39 em SEQ ID NOS: 60 e 61; posição 79 em SEQ ID NO: 64 ou qualquer outra posição adequada, conforme divulgado aqui ou conforme conhecido na técnica).

A presente invenção também proporciona pelo menos um mime- ticorpo de GLP-1 isolado ou porção ou variante especificada conforme des- crito aqui e/ou conforme conhecido na técnica. O mimeticorpo de GLP-1 po- de, opcionalmente, compreender pelo menos uma região CH3 diretamente ligada com pelo menos uma região CH2 diretamente ligada com pelo menos uma porção de pelo menos uma região de dobradiça ou fragmento da mes- ma (H), diretamente ligada com pelo menos uma região variável parcial (V), diretamente ligada com uma seqüência Iigante opcional (L), diretamente li- gada a pelo menos um peptídeo terapêutico de GLP-1 (P). Em uma modalidade preferida, um par de CH3-CH2-dobradiça-

sequência de região V parcial-ligante-sequência de peptídeo terapêutico, o par opcionalmente ligado através de associação ou ligação covalente tal como, mas não limitado a, pelo menos uma ligação de dissulfeto Cys-Cys ou pelo menos uma CH4 ou outra seqüência de imunoglobulina. Em uma moda- lidade, um mimeticorpo de GLP-1 compreende a fórmula: (P(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t),

em que P é pelo menos um peptídeo de GLP-1 bioativo, variante ou deriva- do, L é pelo menos uma seqüência ligante, o qual pode ser um polipeptídeo que proporciona flexibilidade estrutural por permitir que o mimeticorpo tenha orientações e propriedades de ligação alternativas, V é pelo menos uma porção de um C-término de uma região variável de imunoglobulina, H é pelo menos uma porção de uma região de dobradiça variável de imunoglobulina, CH2 é pelo menos uma porção de uma região constante CH2 de imunoglo- bulina, CH3 é pelo menos uma porção de uma região constante CH3 de i- munoglobulina, η é um número inteiro de 1 a 10 e o, p, q, r, s, e t podem ser independentemente um número inteiro de 0 a 10, que imita diferentes tipos . 5 de moléculas de imunoglobulina, por exemplo, mas não limitado a IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgAI1 lgA2, IgM1 IgD1 IgE ou quaisquer subclasses das mesmas e semelhantes ou qualquer combinação das mesmas.

A região variável da seqüência de anticorpo pode ser, mas não está limitado a, pelo menos uma porção de pelo menos um de SEQ ID NOS: 47-55 ou fragmento das mesmas conforme descrito na Tabela 1 ou SEQ ID NOS: 47-64, ainda opcionalmente compreendendo pelo menos uma substi- tuição, inserção ou deleção, conforme ainda descrito nas Figuras 1-9 da pu- blicação PCT WO 05/05604 (PCT US04/19898) depositada em 24 de junho de 2004 e publicada em 20 de janeiro de 2005, com SEQ ID NOS: 1-9 cor- respondentes. A CH2, CH3 e região de dobradiça podem ser, mas não estão limitadas a, pelo menos uma porção de pelo menos um de SEQ ID NOS: 56- 64 ou fragmento das mesmas conforme descrito na Tabela 1, ainda opcio- nalmente compreendendo pelo menos uma substituição, inserção ou dele- ção conforme ainda descrito nas Figuras 32-40 da publicação PCT WO 05/05604 (PCT US04/19898) depositada em 24 de junho de 2004 e publica- da em 20 de janeiro de 2005, com SEQ ID NOS: 32-40 correspondentes.

Assim, um mimeticorpo de GLP-1 da presente invenção imita pelo menos uma porção de um anticorpo ou estrutura ou função de imuno- globulina, com suas propriedades e funções inerentes, ao mesmo tempo em que proporciona um peptídeo terapêutico de GLP-1 e suas propriedades ou atividades inerentes ou adquiridas in vitro , in vivo ou in situ. As várias por- ções do anticorpo e porções de peptídeo terapêutico do mimeticorpo de GLP-1 da presente invenção podem variar, conforme descrito aqui em com- binação com aquilo que é conhecido na técnica. J0 A presente invenção também proporciona pelo menos um mime-

ticorpo de GLP-1 isolado ou porção ou variante especificada que tem pelo menos uma atividade tal como, mas não limitado a, atividades biológicas conhecidas de pelo menos um peptídeo ou polipeptídeo de GLP-1 bioativo correspondendo à porção P de fórmula (I), conforme descrito aqui ou conhe- cido na técnica.

Em um aspecto, a presente invenção proporciona pelo menos . 5 um mimeticorpo de GLP-1 humano isolado compreendendo pelo menos uma seqüência polipeptídica de SEQ ID NO: 1 ou opcionalmente com uma ou mais substituições, deleções ou inserções, conforme descrito aqui ou con- forme conhecido na técnica. Em outro aspecto, pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção especificada ou variante da invenção imita a ligação de pelo menos um peptídeo ou polipeptídeo de GLP-1 correspondendo à por- ção P do mimeticorpo na fórmula (I), a pelo menos um epítopo compreen- dendo pelo menos 1-3, à seqüência de aminoácido toda de pelo menos um ligante, por exemplo, mas não limitado a, um receptor de GLP-1 ou fragmen- to do mesmo, em que o ligante se liga a pelo menos uma porção de SEQ ID NO: 1 ou opcionalmente com uma ou mais substituições, deleções ou inser- ções conforme descrito aqui ou conforme conhecido na técnica. Pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 pode, opcionalmente, se ligar a um receptor de GLP-1 com uma afinidade de pelo menos 10"7, pelo menos 10"8, pelo menos 10"9 M, pelo menos 10"10 M, pelo menos 10"11 M ou pelo menos 10'12 M. Um mimeticorpo de GLP-1 pode, assim, ser selecionado com relação a uma ati- vidade correspondente de acordo com métodos conhecidos tais como, mas não limitado a, atividade de ligação com relação a um receptor ou fragmento do mesmo.

A presente invenção ainda proporciona pelo menos um anticorpo anti-idiotipo a pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 da presente invenção. O anticorpo anti-idiotipo ou fragmento se liga especificamente a pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 da presente invenção. O anticorpo anti-idiotipo inclui qualquer proteína ou peptídeo contendo uma molécula que compreen- de pelo menos uma porção de uma molécula de imunoglobulina tal como, mas não limitado a, pelo menos uma região de determinação de comple- mentaridade (CDR) de uma cadeia pesada ou leve ou uma porção de liga- ção a ligante da mesma, uma região variável de cadeia pesada ou cadeia leve, uma região constante de cadeia pesada ou cadeia leve, uma região de estrutura ou qualquer porção das mesmas, que se liga competitivamente a uma região de ligação de Iigante de GLP-1 de pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 da presente invenção. Tais anticorpos anti-idiotipo da invenção - 5 podem incluir ou ser derivados de qualquer mamífero tal como, mas não limi- tado a, um ser humano, um camundongo, um coelho, um rato, um roedor, um primata e semelhantes.

A presente invenção proporciona, em um aspecto, moléculas isoladas de ácido nucleico compreendendo, complementares, tendo identi- dade significativa ou que se hibridizam a um polinucleotídeo que codifica pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou anticorpo anti-idiotipo de mimeti- corpo de GLP-1 ou porções ou variantes especificadas do mesmo, compre- endendo pelo menos uma seqüência, domínio, porção ou variante especifi- cada do mesmo. A presente invenção ainda proporciona vetores recombi- nantes compreendendo pelo menos uma das referidas moléculas de ácido nucleico que codifica o mimeticorpo de GLP-1 isolado ou anticorpo anti- idiotipo de mimeticorpo de GLP-1, células hospedeiras contendo tais ácidos nucleicos e/ou vetores recombinantes, bem como métodos de fabricação e uso de tais mimeticorpos de GLP-1 ou ácidos nucleicos que codificam anti- corpo anti-idiotipo de mimeticorpo de GLP-1, vetores e/ou células hospedei- ras.

Também proporcionado é um ácido nucleico isolado que codifica pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 de mamífero isolado ou anticorpo anti-idiotipo de mimeticorpo de GLP-1; um vetor de ácido nucleico isolado compreendendo o ácido nucleico isolado e/ou célula hospedeira procariota ou eucariota compreendendo o ácido nucleico isolado. A célula hospedeira pode, opcionalmente, ser pelo menos uma selecionada de COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, células de mieloma ou Iinfoma ou qualquer célula derivada, imortalizada ou transforma- da das mesmas.

A presente invenção também proporciona pelo menos um méto- do para expressão de pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou anticorpo anti-idiotipo de mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada em uma célula hospedeira compreendendo cultura da célula hospedeira confor- me descrito aqui e/ou conforme conhecido na técnica sob condições em que pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou anticorpo anti-idiotipo de mimeti- . 5 corpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada é expressa em quanti- dades detectáveis e/ou recuperáveis. Também proporcionado é um método para a produção de pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou anticorpo anti- idiotipo de mimeticorpo de GLP-1 compreendendo tradução do mimeticorpo de GLP-1 ou anticorpo anti-idiotipo de mimeticorpo de GLP-1 que codifica um ácido nucleico sob condições in vitro, in vivo ou in situ, de modo que o mimeticorpo de GLP-1 ou anticorpo anti-idiotipo de mimeticorpo de GLP-1 é expresso em quantidades detectáveis ou recuperáveis.

Também proporcionado é um método para produção de pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 humano isolado ou anticorpo anti-idiotipo de GLP-1 da presente invenção compreendendo fornecimento de uma célula hospedeira ou animal transgênico ou planta transgênica capaz de expres- são, em quantidades recuperáveis, do mimeticorpo de GLP-1 ou anticorpo anti-idiotipo de GLP-1.

Ainda proporcionado na presente invenção é pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 produzido através dos métodos acima.

A presente invenção também proporciona pelo menos uma composição compreendendo (a) um ácido nucleico que codifica mimeticorpo de GLP-1 isolado ou porção ou variante especificada e/ou mimeticorpo de GLP-1 conforme descrito aqui; e (b) um veículo ou diluente adequado. O veículo ou diluente pode opcionalmente ser farmaceuticamente aceitável, de acordo com métodos conhecidos. A composição pode, opcionalmente, ainda compreender pelo menos um outro composto, proteína ou composição.

Também proporcionada é uma composição compreendendo pe- lo menos um mimeticorpo de GLP-1 humano isolado e pelo menos um veí- culo ou diluente farmaceuticamente aceitável. A composição pode ainda op- cionalmente compreender uma quantidade eficaz de pelo menos um com- posto ou proteína selecionada de pelo menos um de um rótulo detectável ou repórter, um fármaco anti-infectivo, um fármaco relacionado ao diabetes ou metabolismo de insulina, um fármaco para o sistema cardiovascular (CV)1 um fármaco para o sistema nervoso central (CNS), um fármaco para o sis- tema nervoso autonômico (ANS), um fármaco para o trato respiratório, um . 5 fármaco para o trato gastrointestinal (GI)1 um fármaco hormonal, um fármaco para o equilíbrio de fluido ou eletrólito, um fármaco hematológico, um antine- oplásico, um fármaco para imunomodulação, um fármaco oftálmico, ótico ou nasal, um fármaco tópico, um fármaco nutricional, um antagonista de TNF, um antirreumático, um relaxante muscular, um narcótico, um fármaco anti- inflamatório não esteroidal (NTHE), um analgésico, um anestésico, um seda- tivo, um anestésico local, um bloqueador neuromuscular, um antimicrobiano, um antipsoriático, um corticosteróide, um esteróide anabólico, uma eritropoi- etina, uma imunização, uma imunoglobulina, um imunossupressor, um hor- mônio de crescimento, um fármaco de reposição hormonal, um radiofarma- cêutico, um antidepressivo, um antipsicótico, um estimulante, uma medica- ção para asma, um beta agonista, um esteróide inalado, uma epinefrina ou análogo, uma citocina ou um antagonista de citocina.

A presente invenção também proporciona pelo menos uma composição, dispositivo e/ou método de distribuição de uma quantidade te- rapêutica ou profilaticamente eficaz de pelo menos um mimeticorpo de GLP- 1 ou porção ou variante especificada de acordo com a presente invenção.

A presente invenção ainda proporciona pelo menos uma compo- sição, dispositivo e/ou método de distribuição de uma quantidade terapêutica e/ou profilaticamente eficaz de pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada de acordo com a presente invenção.

A presente invenção ainda proporciona pelo menos um método ou composição de mimeticorpo de GLP-1 para administração de uma quan- tidade terapeuticamente eficaz para modular ou tratar pelo menos uma con- dição relacionada a GLP-1 em uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente e/ou antes de, subsequente a ou durante uma condição relacionada, con- forme conhecido na técnica e/ou conforme descrito aqui.

A presente invenção ainda proporciona pelo menos um mimeti- corpo de GLP-1, porção ou variante especificada em um método ou compo- sição, quando administrada em uma quantidade terapeuticamente eficaz, para modulação, para tratamento ou redução dos sintomas de pelo menos uma doença metabólica, imune, cardiovascular, infecciosa, maligna e/ou f 5 neurológica em uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente e/ou, conforme necessário, em muitas condições diferentes tais como, mas não limitado a, antes de, subsequente a ou durante uma doença ou condição relacionada, conforme conhecido na técnica.

A presente invenção ainda proporciona pelo menos um mimeti- corpo de GLP-1, porção ou variante especificada em um método ou compo- sição, quando administrada em uma quantidade terapeuticamente eficaz, para a modulação, para tratamento ou redução dos sintomas de pelo menos um de diabetes ou distúrbio relacionada ao metabolismo de insulina, um dis- túrbio do osso e articulação, distúrbio cardiovascular, distúrbio dental ou oral, um distúrbio dermatológico, um distúrbio no ouvido, nariz ou garganta, um distúrbio endócrino ou metabólico, um distúrbio gastrointestinal, um distúrbio ginecológico, um distúrbio hepático ou biliar, um distúrbio obstétrico, um dis- túrbio hematológico, um distúrbio imunológico ou alérgico, uma doença in- fecciosa, um distúrbio músculo-esquelético, um distúrbio oncológico, um dis- túrbio neurológico, um distúrbio nutricional, um distúrbio oftalmológico, um distúrbio pediátrico, um distúrbio de envenenamento, um distúrbio psiquiátri- co, um distúrbio renal, um distúrbio pulmonar ou qualquer outro distúrbio co- nhecido (veja, por exemplo, The Merck Manual, 17a ed., Merck Research Laboratories, Merck and Co., Whitehouse Station, NJ (1999), totalmente in- corporado aqui por referência), conforme necessário em muitas condições diferentes tais como, mas não limitado a, subsequente a ou durante trata- mento de uma doença ou condição relacionada, conforme conhecido na téc- nica.

A presente invenção também proporciona pelo menos uma composição, dispositivo e/ou método de distribuição para o diagnóstico de condições relacionadas ao GLP-1, de pelo menos um mimeticorpo de GLP- 1, de acordo com a presente invenção. A presente invenção ainda proporciona pelo menos um método ou composição de mimeticorpo de GLP-1 para o diagnóstico de pelo menos uma condição relacionada ao GLP-1 em uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente e/ou antes de, subsequente a ou durante uma condição relaciona- , 5 da, conforme conhecido na técnica e/ou conforme descrito aqui.

Também proporcionado é um método para diagnóstico ou trata- mento de uma condição doentia em uma célula, tecido, órgão ou animal compreendendo: (a) contato ou administração de uma composição compre- endendo uma quantidade eficaz de pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 humano isolado da invenção com ou à célula, tecido, órgão ou animal. O método pode, opcionalmente, ainda compreende uso de uma quantidade eficaz de 0,001-50 mg/quilograma das células, tecido, órgão ou animal du- rante 0-24 horas, 1-7 dias, 1-52 semanas, 1-24 meses, 1-30 anos ou qual- quer faixa ou valor entre esses. O método pode, opcionalmente, ainda com- preender uso de contato ou de administração através de pelo menos um modo selecionado de parenteral, subcutâneo, intramuscular, intravenoso, intra-articular, intrabrônquico, intra-abdominal, intracapsular, intracartilogino- so, intracavitário, intracelial, intracelebelar, intracérebro-ventricular, intracóli- co, intracervical, intragástrico, intra-hepático, intramiocardial, intraosteal, in- trapélvico, intrapericardíaco, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático, in- trapulmonar, intrarretal, intrarrenal, intrarretinal, intraespinhal, intrassinovial, intratorácico, intrauterino, intravesical, bolo, vaginal, retal, bucal, sublingual, intranasal ou transdérmico. O método pode, opcionalmente, ainda compre- ender administração, antes, concorrentemente ou após (a) contato ou admi- nistração de, pelo menos uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de pelo menos um composto ou proteína selecionada de pelo menos um de um rótulo detectável ou repórter, um fármaco anti-infectivo, um fárma- co relacionado ao diabetes ou metabolismo de insulina, um fármaco para o sistema cardiovascular (CV), um fármaco para o sistema nervoso central (CNS), um fármaco para o sistema nervoso autonômico (ANS), um fármaco para o trato respiratório, um fármaco para o trato gastrointestinal (Gl), um fármaco hormonal, um fármaco para o equilíbrio de fluido ou eletrólito, um fármaco hematológico, um antineoplásico, um fármaco para imunomodula- ção, um fármaco oftálmico, ótico ou nasal, um fármaco tópico, um fármaco nutricional, um antagonista de TNF, um antirreumático, um relaxante muscu- lar, um narcótico, um fármaco anti-inflamatório não esteroidal (NSAID), um analgésico, um anestésico, um sedativo, um anestésico local, um bloquea- dor neuromuscular, um antimicrobiano, um antipsoriático, um corticosteróide, um esteróide anabólico, uma eritropoietina, uma imunização, uma imunoglo- bulina, um imunossupressor, um hormônio de crescimento, um fármaco de reposição hormonal, um radiofarmacêutico, um antidepressivo, um antipsicó- tico, um estimulante, uma medicação para asma, um beta agonista, um este- róide inalado, uma epinefrina ou análogo, uma citocina ou um antagonista de citocina.

Também proporcionado é um dispositivo médico compreenden- do pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 humano isolado da invenção, em que o dispositivo é adequado para contato ou administração do pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 através de pelo menos um modo selecionado de parenteral, subcutâneo, intramuscular, intravenoso, intra-articular, intrabrôn- quico, intra-abdominal, intracapsular, intracartiloginoso, intracavitário, intra- celial, intracelebelar, intracérebro-ventricular, intracólico, intracervical, intra- gástrico, intra-hepático, intramiocardial, intraosteal, intrapélvico, intrapericar- díaco, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrarretal, intrarrenal, intrarretinal, intraespinhal, intrassinovial, intratorácico, intrauteri- no, intravesical, bolo, vaginal, retal, bucal, sublingual, intranasal ou trans- dérmico.

Também proporcionado é um artigo de fabricação para uso far-

macêutico ou diagnóstico humano compreendendo material de embalagem e um recipiente compreendendo uma solução ou uma forma Iiofilizada de pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 humano isolado da presente invenção. O artigo de fabricação pode, opcionalmente, compreender o recipiente como um componente de um dispositivo ou sistema de distribuição parenteral, subcutâneo, intramuscular, intravenoso, intra-articular, intrabrônquico, intra- abdominal, intracapsular, intracartiloginoso, intracavitário, intracelial, intrace- lebelar, intracérebro-ventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intra- hepático, intramiocardial, intraosteal, intrapélvico, intrapericardíaco, intraperi- toneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrarretal, intrarrenal, in- trarretinal, intraespinhal, intrassinovial, intratorácico, intrauterino, intravesical, bolo, vaginal, retal, bucal, sublingual, intranasal ou transdérmico.

A presente invenção ainda proporciona qualquer invenção des- crita aqui.

Descrição das Figuras

A Figura 1 ilustra as seqüências de nucleotídeo e peptídeo de MMB de GLP-1 em um base de lgG4 mostrando domínios funcionais impor- tantes da SEQ ID NO: 4.

As Figuras 2A-2C ilustram ensaios de ligação FACS de MMB de GLP-1. A Figura 2A mostra que MMB de GLP-1 se liga àa células HEK293 superexpressando o GLP-1 R. Área cinza: MMB de GLP-1, mas não secun- dário; linha cinza: secundário apenas; linha pontilhada, MMB de controle ne- gativo e secundário; linha preta: MMB de GLP-1 e secundário. A Figura 2B mostra que o MMB de GLP-1 não se liga às células HEK293 de controle. Área cinza: MMB de GLP-1, mas não secundário; linha preta: secundário apenas; linha cinza: MMB de GLP-1 e secundário. A Figura 2C mostra que um análogo de peptídeo de GLP-1 (A2S) é capaz de competir com MMB de GLP-1 pela ligação à células HEK293 superexpressando o GLP-1 R. Área cinza: MMB de GLP-1, mas não secundário; linha preta: MMB de GLP-1 e secundário; linha interrompida: MMB de GLP-1, competidor a 0,2 nM, se- cundário; linha pontilhada: MMB de GLP-1, competidor a 20 nM, secundário; linha cinza: MMB de GLP-1, competidor a 100 nM, secundário).

As Figuras 3A-3E ilustram ensaios de cAMP de MMB de GLP-1. Figura 3A: MMB de GLP-1 do tipo selvagem em base de IgGI; Figura 3B: peptídeo de GLP-1; Figura 3C: MMB de GLP-1 (A2G) em base de lgG4 (A- la/Ala, Ser -> Pro); Figura 3D: MMB de GLP-1 (A2S) em base de lgG4 (A- Ia/Ala, Ser -> Pro); Figura 3E: MMB de GLP-1 do tipo selvagem em base de lgG4 (Ala/Ala, Ser -> Pro).

A Figura 4 ilustra a resistência de MMB de GLP-1 à clivagem por DPP-IV.

A Figura 5 mostra a estabilidade de MMB de GLP-1 no soro.

A Figura 6 demonstra que MMBs de GLP-1 causam secreção de

insulina em células RINm. A Figura 6A mostra que o peptídeo de GLP-1 (7-

36) e peptídeo exendina-4 estimulam a liberação de insulina em células

RINm. A Figura 6B mostra que MMB de GLP-1 (A2S) em uma base de IgGI

ou lgG4 (Ala/Ala, Ser -> Pro) ou MMB de GLP-1 (A2G) em uma base de

lgG4 (Ala/Ala, Ser -> Pro) são ativos ao estimular a secreção de insulina em células RINm.

IO A Figura 7 demonstra que MMB de GLP-1 diminui a glicose (Fi-

gura 7A) de uma maneira dose-dependente (Figura 7B).

A Figura 8 mostra o perfil farmacocinético de quatro MMBs de GLP-1 (A2G, A2S, Ex-cap e tipo selvagem) em macacos cynomolgus.

A Figura 9 mostra os efeitos de MMB de GLP-1 durante um teste de tolerância à glicose oral em camundongos diabéticos.

A Figura 10 mostra os efeitos de MMB de GLP-1 sobre a glicose em jejum no sangue durante dosagem crônica a camundongos diabéticos.

A Figura 11 mostra os efeitos de MMB de GLP-1 quando de um teste de tolerância oral à glicose após dosagem crônica a camundongos dia- béticos.

A Figura 12 mostra os efeitos de MMB de GLP-1 sobre a redu- ção de HbAIc após dosagem crônica a camundongos diabéticos.

A Figura 13 mostra os efeitos de MMB de GLP-1 sobre os níveis de glicose no sangue (Figura 13A) e insulina (Figura 13B) em um teste de tolerância à glicose oral em macacos cynomolgus normais.

A Figura 14 mostra os efeitos de MMB de GLP-1 sobre a colora- ção de insulina em ilhotas de camundongos após uma única dose.

A Figura 15 demonstra que MMB de GLP-1 retarda o esvazia- mento gástrico em cães normais.

A Figura 16 demonstra que MMB de GLP-1 diminui a glicose no sangue após um teste de tolerância à glicose oral em camundongos obesos dieta-induzidos. A Figura 17 demonstra que MMB de GLP-1 diminui o nível de glicose no sangue (Figura 17A) e diminui a insulina (Figura 17B) em um tes- te de tolerância à glicose intraperitoneal em camundongos diabéticos.

A Figura 18A demonstra a resposta de cAMP em células INS-1E • 5 de rato à concentrações crescentes de MMB de GLP-1. Os dados foram a - daptados a uma hipérbole que proporciona uma EC5O de 8,7 nM e uma quantidade máxima de cAMP secretado de 48,3 nM.

A Figura 18B demonstra a resposta de cAMP em células INS-1E de rato às concentrações crescentes de peptídeo de GLP-1. Os dados foram adaptados a uma hipérbole, que proporciona uma EC50 de 0,11 nM e uma quantidade máxima de cAMP secretado de 46,7 nM.

A Figura 19 demonstra a secreção de insulina em células INS- 1E de rato em concentrações crescentes de MMB de GLP-1.

A Figura 20A demonstra os níveis de MMB de GLP-1 no plasma de ratos após uma única administração iv e sc (3 mg/kg).

A Figura 20B demonstra os níveis de MMB de GLP-1 no plasma de macacos após uma única administração iv (1 mg/kg).

A Figura 21A demonstra o ipGTT em camundongos DIO dosa- dos com MMB de GLP-1. A Figura 21B demonstra a área sob a curva calculada (AUC)

para o ipGTT apresentado na Figura 1.

A Figura 21C demonstra os dados da Figura 2, que foram adap- tados a uma hipérbole, proporcionando uma ED50 de 15 μg/kg.

As Figuras 22A e B demonstram a ingestão de alimento cumula- tiva em 24 horas em camundongos do tipo selvagem (A) e GLP-1 R-/- (B) tratados com uma única dose iv de CNT01996 (1 mg/kg), exendina-4 (0,07 mg/kg) e MMB de GLP-1 (1 mg/kg). Os valores representam a média ± SE; *p < 0,05 vs. grupo tratado com CNT01996.

As Figuras 23A, BeC demonstram o teste de glicose oral em camundongos do (A) e GLP-1 R-/- (B) após uma única dose iv de CNT01996 (1 mg/kg), exendina-4 (0,07 mg/kg) e MMB de GLP-1 (1 mg/kg). (C) Área sob a curva para testes de ipGTT em camundongos do tipo selvagem (barra preta) e GLP-1R-/- (barra cinza). Os valores representam a média ± SE; *p < 0,05 vs. grupo tratado com CNT01996.

A Figura 24 demonstra o conteúdo no estômago em camundon- gos do tipo selvagem (barras pretas) e GLP-1R-/- (barras cinzas) tratados com CNT01996 (1 mg/kg), exendina-4 (0,07 mg/kg) e MMB de GLP-1 (1 mg/kg). Os valores representam a média ± SE; *p < 0,05 vs. grupo tratado com CNT01996.

A Figura 25 demonstra o teste de tolerância à glicose em ca- mundongos DIO realizado em vários pontos de tempo após uma única ad- ministração iv de um MMB de GLP-1 (1 mg/kg).

A Figura 26 demonstra a área sob a curva para dados obtidos durante o ipGTT em camundongos DIO (Figura 25).

A Figura 27 demonstra os níveis de MMB de GLP-1 no plasma de camundongos DIO após uma única administração iv (1 mg/kg). A Figura 28 demonstra a área sob a curva para o teste de tole-

rância à glicose após uma única administração iv de um MMB de GLP-1 (1 mg/kg) plotada como uma função da concentração de MMB de GLP-1 no plasma imediatamente após o teste de tolerância à glicose. Descrição da Invenção A presente invenção proporciona mimeticorpos recombinantes

e/ou sintéticos isolados ou porções ou variantes especificadas, bem como composições e moléculas de ácido nucleico de codificação compreendendo pelo menos um polinucleotídeo que codifica pelo menos um mimeticorpo de GLP-1. Tais mimeticorpos ou porções ou variantes especificadas da presen- te invenção compreendem seqüências de mimeticorpo de GLP-1 específi- cas, domínios, fragmentos e variantes especificadas das mesmas e métodos de fabricação e uso dos referidos ácidos nucleicos e mimeticorpos ou por- ções ou variantes especificadas, incluindo composições terapêuticas, méto- dos e dispositivos.

De preferência, tais mimeticorpos de GLP-1 são aperfeiçoados

com relação à expressão, purificação e/ou estabilidade alterando sítios de glicosilação O-Iigados (tal como, mas não limitado a, Val-Xaa-Ser) para sí- tios de glicosilação N-Iigados (tal como, mas não limitado a, Asn-Xaa-Ser ou Gln-Xaa-Ser). A presente invenção proporciona tais aperfeiçoamentos em mimeticorpos de GLP-1 CH1-deletados.

A presente invenção também proporciona pelo menos um mime- ticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada, conforme descrito aqui e/ou conforme conhecido na técnica. O mimeticorpo de GLP-1 pode, opcio- nalmente, compreender pelo menos uma região CH3 diretamente ligada com pelo menos uma região CH2 diretamente ligada com pelo menos uma região de dobradiça ou fragmento da mesma (H), diretamente ligada com pelo me- nos uma região variável parcial (V), diretamente ligada com uma seqüência Iigante opcional (L), diretamente ligada a pelo menos um peptídeo terapêuti- co de GLP-1 (P).

Em uma modalidade preferida, um mimeticorpo de GLP-1 com- preende formula (I): ((P(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t),

onde P é pelo menos um polipeptídeo de GLP-1 bioativo, L é pelo menos uma seqüência ligante, o qual pode ser um polipeptídeo que proporciona flexibilidade estrutural por permitir que o mimeticorpo tenha orientações e propriedades de ligação alternativas, V é pelo menos uma porção de um C- término de uma região variável de imunoglobulina, H é pelo menos uma por- ção de uma região de dobradiça variável de imunoglobulina, CH2 é pelo me- nos uma porção de uma região constante CH2 de imunoglobulina, CH3 é pelo menos uma porção de uma região constante CH3 de imunoglobulina, m, n, o, p, q, r, s e t podem ser, independentemente, um número inteiro entre e incluindo 0 e 10, que imita diferentes tipos de moléculas de imunoglobuli- na, por exemplo, mas não limitado a IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgAI, lgA2, IgM, IgD, IgE ou qualquer subclasse das mesmas e semelhantes ou qual- quer combinação das mesmas.

De preferência, tais mimeticorpos de GLP-1 são aperfeiçoados com relação à expressão, purificação e/ou estabilidade trocando sítios de glicosilação O-Iigados (tal como, mas não limitado a, Val-Xaa-Ser) para sí- tios de glicosilação N-Iigados (tal como, mas não limitado a, Asn-Xaa-Ser ou Gln-Xaa-Ser). A presente invenção proporciona tais aperfeiçoamentos em mimeticorpos de GLP-1 CH1-deletados.

Assim, um mimeticorpo de GLP-1 da presente invenção imita uma estrutura de anticorpo com suas propriedades e funções inerentes, ao mesmo tempo em que proporciona um peptídeo terapêutico e suas proprie- dades ou atividades inerentes ou adquiridas in vitro, in vivo ou in situ. Em uma modalidade preferida, onde t = 1, o monômero CH3-CH2-dobradiça- sequência J parcial-ligante-peptídeo terapêutico pode ser ligado a outros monômeros através de associação ou ligação covalente tal como, mas não limitado a, uma ligação de dissulfeto Cys-Cys. As várias porções do anticor- po e as porções do peptídeo terapêutico GLP-1 de pelo menos um mimeti- corpo de GLP-1 da presente invenção podem variar conforme descrito aqui, em combinação com aquilo que é conhecido na técnica.

A porção CH3-CH2-dobradiça pode ser extensivamente modifi- cada para formar uma variante de acordo com a presente invenção, contanto que ligação ao receptor de salvamento seja mantida. Em tais variantes, po- de-se remover um ou mais sítios nativos que proporcionam características estruturais ou atividade funcional não requeridas pelas moléculas de fusão ^a-presente invenção. Pode-se remover esses sítios, por exemplo, através de substituição ou deleção de resíduos, inserção de resíduos no sítio ou truncamento de porções contendo o sítio. Os resíduos inseridos ou substitu- ídos podem também ser aminoácidos alterados, tais como peptidomiméticos ou D-aminoácidos. Uma variante de CH3-CH2-dobradiça pode carecer de um ou mais sítios nativos ou resíduos que afetam ou estão envolvidos em (1) formação de ligação de dissulfeto, (2) incompatibilidade com uma célula hospedeira selecionada, (3) heterogeneidade quando de expressão em uma célula hospedeira selecionada, (4) glicosilação, (5) interação com comple- mento, (6) ligação a um outro receptor Fc que não um receptor de salvamen- to ou (7) citotoxicidade celular anticorpo-dependente (ADCC). Variantes de CH3-CH2-dobradiça exemplificativas incluem moléculas e seqüências nas quais: 1. Sítios envolvidos na formação de ligação de dissulfeto são removi- dos. Tal remoção pode evitar reação com outras proteínas contendo cisteína presente na célula hospedeira a ser usada para produzir as moléculas da invenção. Para essa finalidade, os resíduos de cisteína podem ser deletados ou substituídos por outros aminoácidos (por exemplo, alanila, serila). Mesmo quando resíduos de cisteína são removidos, os domínios CH3-CH2- dobradiça de cadeia única ainda podem formar um domínio CH3-CH2- dobradiça dimérico que é mantido junto não covalentemente; 2. A região CH3-CH2-dobradiça é modificada para torná-la mais compatível com uma célula hospedeira selecionada. Por exemplo, quando a molécula é expressa recombinantemente em uma célula bacteriana, tal como E. coli, pode-se re- mover a seqüência PA na dobradiça, a qual pode ser reconhecida por uma enzima digestiva em E. coli, tal como iminopeptidase de prolina; 3. Uma por- ção da região de dobradiça é deletada ou substituída por outros aminoácidos para impedir heterogeneidade quando expressa em uma célula hospedeira selecionada; 4. Um ou mais sítios de glicosilação são removidos. Resíduos que são, tipicamente, glicosilados (por exemplo, valina ou asparagina) po- dem conferir resposta citolítica. Tais resíduos podem ser deletados ou subs- tituídos por resíduos não glicosilados (por exemplo, alanina) ou sítios de O- glicosilação tal como, mas não limitado a, a seqüência Val-Xaa-Ser, pode ser substituída por sítios de N-glicosilação, tais como Asn-Xaa-Ser ou Gln- Xaa-Ser, conforme possa ser preferido, por exemplo, conforme feito nos se- guintes resíduos apresentados na Listagem de seqüência: Val-Xaa-Ser (sí- tios de O-glicosilação) muda para o sítio de N-glicosilação Asn-Xaa-Ser na: posição 44 em SEQ ID NOS: 2, 4, 7-14, posição 64 em SEQ ID NOS: 43, 45, posição 82 em SEQ ID NOS: 44, 46 e 51; posição 88 em SEQ ID NOS: 48 , 50, 53-55, posição 89 em SEQ ID NO: 47, posição 90 em SEQ ID NO: 49; posição 103 e/ou 185 em SEQ ID NOS: 56 e 63; ou posição 39 em SEQ ID NOS: 60 e 61; posição 79 em SEQ ID NO: 64 ou qualquer outra posição a- dequada, conforme divulgado aqui ou conhecido na técnica); 5. Sítios envol- vidos em interação com complemento, tal como o sítio de ligação C1q, são removidos. Recrutamento de complemento pode não ser vantajoso para as moléculas da presente invenção e, assim, pode ser evitado com tal variante; 6. Sítios são removidos que afetam a ligação a outros receptores Fc que não um receptor de salvamento. A região CH3-CH2-dobradiça pode ter sítios para interação com determinadas células sangüíneas brancas que não são requeridos para as moléculas de fusão da presente invenção e, assim, po- dem ser removidos; 7. O sítio de ADCC é removido. Sítios de ADCC são • 5 conhecidos na técnica; veja, por exemplo, Molec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992) com relação a sítios de ADCC em IgGI. Esses sítios, também, não são requeridos para as moléculas de fusão da presente invenção e, assim, podem ser removidos.

Polipeptídeo Iigante proporciona flexibilidade estrutural por per- mitir que o mimeticorpo tenha orientações e propriedades de ligação alterna- tivas. Quando presente, sua estrutura química não é crítica. O Iigante é, de preferência, composto de aminoácidos ligados juntos através de ligações peptídicas. Assim, em modalidades preferidas, o Iigante é composto de 1 a aminoácidos ligados através de ligações peptídicas, em que os aminoáci- dos são selecionados dos 20 aminoácidos que ocorrem naturalmente. Al- guns desses aminoácidos podem ser glicosilados, conforme é bem entendi- do por aqueles versados na técnica. Em uma modalidade mais preferida, os 1 a 20 aminoácidos são selecionados de glicina, alanina, serina, prolina, as- paragina, glutamina e lisina. Ainda mais preferivelmente, o Iigante é compos- to de uma maioria de aminoácidos que são estericamente não impedidos, tais como glicina e alanina. Assim, Iigantes preferidos são poli(Gly-Ser), poli- glicinas (particularmente (GIy)4, (GIy)5), poli(Gly-Ala) e polialaninas. Outros exemplos específicos de Iigantes são: (GIy)3Lys(GIy)4 (SEQ ID NO: 65), (GIy)3AsnGIySer(GIy)2 (SEQ ID NO: 66), (GIy)3Cys(GIy)4 (SEQ ID NO: 67) e GIyProAsnGIyGIy (SEQ ID NO: 68).

Para explicar a nomenclatura acima, por exemplo, (GIy)3Lys(GIy)4 significa Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly. Combinações de Gly e Ala também são preferidas. Os Iigantes mostrados aqui são exemplifi- cativos; Iigantes dentro do escopo da presente invenção podem ser muito maiores e podem incluir outros resíduos.

Ligantes não peptídicos também são possíveis. Por exemplo, Iigantes de alquila, tal como -NH-(CH2)S-C(O)-, em que s = 2-20, poderiam ser usados. Esses Iigantes de alquila podem ainda ser substituídos por qual- quer grupo de não-impedimento estérico, tais como alquila inferior (por e- xemplo, Ci - C6), acila inferior, halogênio (por exemplo, Cl, Br), CN, NH2, fenila, etc. Um Iigante não peptídico exemplificativo é um Iigante de PEG o qual tem um peso molecular de 100 a 5000 kD, de preferência 100 a 500 kD. Os Iigantes peptídicos podem ser alterados para formar derivados da mesma maneira conforme descrito acima.

Conforme usado aqui, um "peptídeo de GLP-1" ou "peptídeo, variante ou derivado de GLP-1" pode ser pelo menos um peptídeo de GLP- 1, fragmento de GLP-1, homólogo de GLP-1, análogo de GLP-1 ou derivado de GLP-1. Um peptídeo de GLP-1 tem de cerca de vinte e cinco a cerca de quarenta e cinco aminoácidos que ocorrem naturalmente ou não naturalmen- te que têm homologia suficiente ao GLP-1 (7-37) nativo, de modo que ele exibe atividade insulinotrópica através de ligação ao receptor de GLP-1 so- bre células β no pâncreas. GLP-1 (7-37) tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 15:

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala- Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly.

Um fragmento de GLP-1 é polipeptídeo obtido após truncamento de um ou mais aminoácidos a partir do N-término e/ou C-término de GLP-1 (7-37) ou um análogo ou derivado do mesmo. Um homólogo de GLP-1 é um peptídeo no qual um ou mais aminoácidos foram adicionados ao N-término e/ou C-término do GLP-1 (7-37) ou fragmentos ou análogos do mesmo. Um análogo de GLP-1 é um peptídeo no qual um ou mais aminoácidos de GLP-1 (7-37) foram modificados e/ou substituídos. Um análogo de GLP-1 tem ho- mologia suficiente ao GLP-1 (7-37) ou um fragmento de GLP-1 (7-37), de modo que o análogo tem atividade insulinotrópica. Um derivado de GLP-1 é definido como uma molécula tendo a seqüência de aminoácido de um peptí- deo de GLP-1, um homólogo de GLP-1 ou um análogo de GLP-1 mas, adi- cionalmente, tendo modificação química de um ou mais de seus grupos late- rais de aminoácido, átomos de α-carbono, grupo amino terminal ou grupo ácido carboxílico terminal. Numerosos fragmentos, análogos e derivados ativos de GLP-1 são conhecidos na técnica e qualquer um desses análogos e derivados pode também ser parte do mimeticorpo de GLP-1 da presente invenção. Alguns análogos de GLP-1 e fragmentos de GLP-1 conhecidos na técnica são divul- gados nas Pats. U.S. NsS 5.118.666. 5.977.071 e 5.545.618 e Adelhorst e outros, J. Biol. Chem. 269: 6275 (1994). Exemplos incluem, mas não estão limitados a, GLP-1 (7-34), GLP-1 (7-35), GLP-1 (7-36), Gln9-GLP-1(7-37), D- Gln9-GLP-1(7-37), Thr16-Lys18-GLP-1 (7-37) e Lys18-GLP-1 (7-37).

Um "mimeticorpo de GLP-1", "porção de mimeticorpo de GLP-1" ou "fragmento de mimeticorpo de GLP-1" e/ou "variante de mimeticorpo de GLP-1" e semelhantes tem, imita ou estimula pelo menos uma atividade bio- lógica tal como, mas não limitado a, ligação de ligante, in vitro, in situ e/ou de preferência in vivo, de pelo menos um peptídeo de GLP-1, variante ou deri- vado tal como, mas não limitado a, pelo menos uma de SEQ ID NO: 1. Por exemplo, um mimeticorpo de GLP-1, porção ou variante especificada ade- quada pode também modular, aumentar, modificar, ativar pelo menos uma sinalização a receptor de GLP-1 ou outra atividade mensurável ou detectá- vel.

Mimeticorpos de GLP-1 úteis nos métodos e composições da presente invenção são caracterizados por afinidade de ligação adequada a Iigantes de proteína, por exemplo, receptores de GLP-1 e opcionalmente e, de preferência, tendo baixa toxicidade. Em particular, um mimeticorpo de GLP-1, onde os componentes individuais, tal como a porção de região variá- vel, região constante (sem uma porção CH1) e estrutura ou qualquer porção da mesma (por exemplo, uma porção das regiões J, D ou V da cadeia pesa- da ou leve variável e semelhantes) individual e/ou coletivamente possuem, opcionalmente e de preferência, baixa imunogenicidade, é útil na presente invenção. Os mimeticorpos que podem ser usados na invenção são opcio- nalmente caracterizados por sua capacidade de tratar pacientes durante pe- ríodos prolongados com alívio bom a excelente de sintomas e baixa toxici- dade. Baixa imunogenicidade e/ou alta afinidade, bem como outras proprie- dades indefinidas, podem contribuir para os resultados terapêuticos obtidos. "Baixa imunogenicidade" é definida aqui como estimulando respostas signifi- cativas de HAMA, HACA ou HAHA em menos do que cerca de 75% ou, de preferência, menos do que cerca de 50, 45, 40, 35, 30, 35, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, e/ou 1% dos pacientes tratados e/ou estimulando baixas titu- ' 5 lações nos pacientes tratados (menos de cerca de 300, de preferência me- nos de cerca de 100, medido com um imunoensaio enzimático com antígeno duplo) (veja, por exemplo, Elliott e outros, Lancet 344: 1125-1127 (1994)).

Utilidade. Os ácidos nucleicos isolados da presente invenção podem ser usados para a produção de pelo menos um mimeticorpo de GLP- 1, fragmento ou variante especificada do mesmo, o qual pode ser usado pa- ra, em uma célula, tecido, órgão ou animal (incluindo mamíferos e seres hu- manos), modular, tratar, aliviar, ajudar a prevenir a incidência de ou reduzir os sintomas de pelo menos uma condição relacionada à proteína seleciona- da, mas não limitada a, pelo menos um de um distúrbio relacionado ao dia- betes, um distúrbio relacionado ao metabolismo de insulina, um distúrbio ou doença imune, um distúrbio ou doença cardiovascular, um distúrbio ou do- ença infecciosa, maligna e/ou neurológica, bem como outras condições rela- cionadas à proteína conhecidas ou específicas.

Tal método pode compreender administração de uma quantida- de eficaz de uma composição ou uma composição farmacêutica compreen- dendo pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada a uma célula, tecido, orgão, animal ou paciente que precisa de tal modulação, tratamento, alívio, prevenção ou redução de sintomas, efeitos ou mecanismos. A quantidade eficaz pode compreender uma quantidade de cerca de 0,0001 a 500 mg/kg por administração única ou múltipla ou obter uma concentração no soro de 0,01-5000 μg/ml por administração única ou múltipla ou qualquer faixa ou valor eficaz nos mesmos, conforme feito e de- terminado usando métodos conhecidos, conforme descrito aqui ou conheci- do na técnica relevante. Citações. Todas as publicações ou patentes citadas aqui são

totalmente incorporadas aqui por referência, uma vez que elas mostram o estado na técnica no momento da presente invenção e/ou proporcionam descrição e embasamento para a presente invenção. Publicações se refe- rem a qualquer publicação científica ou de patente ou qualquer outra infor- mação disponível em qualquer formato de meio, incluindo todos os formatos gravados, eletrônicos ou impressos. As referências a seguir são totalmente - 5 incorporadas aqui por referência: Ausubel e outros, ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2003); Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2- Edição, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow e Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan e outros, eds., Current Protocols in Im- munology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2003); Colligan e outros, Cur- rent Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2003). Mimeticorpos da Presente Invenção

O mimeticorpo de GLP-1 pode, opcionalmente, compreender pelo menos uma região CH3 diretamente ligada com pelo menos uma região CH2 diretamente ligada com pelo menos uma porção de pelo menos um fragmento de região de dobradiça (H)1 tal como compreendendo pelo menos uma região de dobradiça central, diretamente ligada com pelo menos uma região variável parcial (V), diretamente ligada com uma seqüência Iigante opcional (L), diretamente ligada a pelo menos um produto terapêutico de GLP-1 de GLP-1 (P). Em uma modalidade preferida, um par de CH3-CH2-H- V-L-P pode ser ligado através de associação ou ligação covalente tal como, mas não limitado a, uma ligação de dissulfeto Cys-Cys. Assim, um mimeti- corpo de GLP-1 da presente invenção imita uma estrutura de anticorpo com suas propriedades e funções inerentes, ao mesmo tempo em que proporcio- na um produto terapêutico peptídico e suas propriedades ou atividades ine- rentes ou adquiridas in vitro, in vivo ou in situ. As várias porções do anticorpo e porções de produto terapêutico peptídico de pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 da presente invenção podem variar, conforme descrito aqui, em combinação com aquilo que é conhecido na técnica. Mimeticorpos da presente invenção, assim, proporcionam pelo

menos uma propriedade adequada quando comparado com proteínas co- nhecidas tal como, mas não limitado a, pelo menos um de meia-vida aumen- tada, atividade aumentada, atividade mais específica, avidez aumentada, taxa aumentada ou diminuída, um subconjunto de atividades selecionado ou mais adequado, menos imunogenicidade, qualidade ou duração aumentada de pelo menos um efeito terapêutico desejado, menos efeitos colaterais e semelhantes.

Fragmentos de mimeticorpos de acordo com a Fórmula (I) po- dem ser produzidos através de clivagem enzimática, técnicas sintéticas ou recombinantes, conforme conhecido na técnica e/ou conforme descrito aqui- Mimeticorpos também podem ser produzidos em uma variedade de formas truncadas usando genes de anticorpo nos quais um ou mais códons termi- nais foram introduzidos a montante do sítio terminal natural. As várias por- ções dos mimeticorpos podem ser unidas juntas quimicamente através de técnicas convencionais ou podem ser preparadas como uma proteína contí- nua usando técnicas de engenharia genética. Por exemplo, um ácido nuclei- co que codifica pelo menos uma das regiões constantes de uma cadeia de anticorpo humano pode ser expresso para produzir uma proteína contínua para uso em mimeticorpos da presente invenção. Veja, por exemplo, Ladner e outros, Patente U.S. Ns 4.946.778 e Bird, R.E. e outros, Science, 242:423- 426 (1988), com relação a anticorpos com cadeia simples. Conforme usado aqui, o termo "mimeticorpo humano" se refere a

um anticorpo no qual espera-se que substancialmente cada parte da proteí- na (por exemplo, peptídeo de GLP-1, domínios Ch (por exemplo, Ch2, Ch3), dobradiça, V) seja substancialmente não imunogênica em seres humanos, com apenas alterações ou variações mínimas de seqüência. Tais alterações ou variações, opcionalmente e de preferência, retêm ou reduzem a imuno- genicidade em seres humanos com relação a anticorpos ou mimeticorpos humanos não modificados da presente invenção. Assim, um anticorpo hu- mano e um mimeticorpo de GLP-1 correspondente da presente invenção é distinto de um anticorpo quimérico ou humanizado. Deve ser destacado que o mimeticorpo de GLP-1 pode ser produzido por um animal não humano ou célula que é capaz de expressar genes de imunoglobulina humana (por e- xemplo, cadeia pesada e/ou cadeia leve). Mimeticorpos humanos que são específicos para pelo menos um Iigante de proteína dos mesmos podem ser criados contra um Iigante apro- priado, tal como um receptor de GLP-1 isolado ou uma porção do mesmo (incluindo moléculas sintéticas, tais como peptídeos sintéticos). Preparo de tais mimeticorpos pode ser realizado usando técnicas conhecidas para iden- tificar e caracterizar regiões de ligação de Iigante ou seqüências de pelo me- nos uma proteína ou porção da mesma.

Em uma modalidade preferida, pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada da presente invenção é produzida por pelo menos uma linhagem de célula, linhagem de célula misturada, célu- la imortalizada ou população clonal de células imortalizadas e/ou clonadas. Células imortalizadas que produzem proteína podem ser produzidas usando métodos adequados. De preferência, pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada é gerada através de fornecimento de áci- do nucleico ou vetores compreendendo DNA derivado ou tendo uma se- qüência substancialmente similar a pelo menos um Iocus de imunoglobulina humana que é funcionalmente reestruturado ou o qual pode sofrer reestrutu- ração funcional e o qual ainda compreende uma estrutura de mimeticorpo conforme descrito aqui, por exemplo, mas não limitado a, Fórmula (I), em que as porções de regiões C-terminais variáveis podem ser usadas para V, regiões de dobradiça para H, CH2 para CH2 e CH3 para CH3, conforme co- nhecido na técnica.

O termo "funcionalmente reestruturado", conforme usado aqui, se refere a um segmento de ácido nucleico de um Iocus de imunoglobulina que sofreu recombinação V(D)J, desse modo, produzindo um gene de imu- noglobulina que codifica uma cadeia de imunoglobulina (por exemplo, cadeia pesada) ou qualquer porção da mesma. Um gene de imunoglobulina funcio- nalmente reestruturado pode ser direta ou indiretamente identificado usando métodos adequados tais como, por exemplo, sequenciamento de nucleotí- deo, hibridização (por exemplo, Southern blotting, Northern blotting) usando sondas que podem se anelar às uniões de codificação entre segmentos de gene ou amplificação enzimática de genes de imunoglobulina (por exemplo, reação em cadeia de polimerase) com primers que podem se anelar às uni- ões de codificação entre segmentos de gene. Se uma célula produz um mi- meticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada compreendendo uma região variável em particular ou uma região variável compreendendo uma seqüência em particular (por exemplo, pelo menos uma seqüência P), também pode ser determinado usando métodos adequados.

Mimeticorpos, porções ou variantes especificadas da presente invenção também podem ser preparados usando pelo menos um ácido nu- cleico que codifica mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada para proporcionar animais ou mamíferos transgênicos, tais como cabras, vacas, cavalos, ovelha e semelhantes, que produzem tais mimeticorpos ou porções ou variantes especificadas em seu leite. Tais animais podem ser proporcionados usando métodos conhecidos, conforme aplicado para se- qüências de codificação de anticorpo. Veja, por exemplo, mas não limitado a, Patentes U.S. NsS 5.827.690; 5.849.992; 4.873.316; 5.849.992; 5.994.616; 5.565.362; 5.304.489 e semelhantes, cada uma das quais totalmente incor- porada aqui por referência.

Mimeticorpos, porções ou variantes especificadas da presente invenção podem, adicionalmente, ser preparados usando pelo menos um ácido nucleico que codifica mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante es- pecificada para proporcionar plantas transgênicas e células de planta culti- vadas (por exemplo, mas não limitado a, tabaco e milho) que produzem tais mimeticorpos, porções ou variantes especificadas em partes de planta ou em células cultivadas das mesmas. Como um exemplo não limitativo, folhas de tabaco transgênico expressando proteínas recombinantes foram usadas com sucesso para proporcionar grandes quantidades de proteínas recombi- nantes, por exemplo, usando um promotor induzível. Veja, por exemplo, Cramer e outros, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 240: 95-118 (1999) e refe- rências citadas no mesmo. Também, milho ou milho verde transgênico tem sido usado para expressar proteínas de mamífero em níveis de produção comerciais, com atividades biológicas equivalentes àquelas produzidas em outros sistemas recombinantes ou purificadas de fontes naturais. Veja, por exemplo, Hood e outros, Adv. Exp. Med. Biol. 464: 127-147 (1999) e refe- rências citadas no mesmo. Anticorpos também têm sido produzidos em grandes quantidades a partir de sementes de planta transgênica, incluindo fragmentos de anticorpo, tais como mimeticorpos com cadeia simples (scFv's), incluindo sementes de tabaco e tubérculos de batata. Veja, por e- xemplo, Conrad e outros, Plant Mol. Biol. 38: 101-109 (1998) e referências citadas no mesmo. Assim, mimeticorpos, porções ou variantes especificadas da presente invenção também podem ser produzidos usando plantas trans- gênicas, de acordo com métodos conhecidos. Veja também, por exemplo, Fischer e outros, Biotechnol. Appl. Biochem. 30: 99-108 (Outubro de 1999), Ma e outros, Trends Biotechnol. 13: 522-7 (1995); Ma e outros, Plant Physi- ol. 109: 341-6 (1995); Whitelam e outros, Biochem. Soe. Trans. 22: 940-944 (1994); e referências citadas nos mesmos. As referências acima são total- mente incorporadas aqui por referência. Os mimeticorpos da invenção podem se ligar a Iigantes de prote-

ína humana com uma ampla faixa de afinidades (Kd). Em uma modalidade preferida, pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 da presente invenção pode, opcionalmente, se ligar a pelo menos um Iigante de proteína com alta afini- dade. Por exemplo, pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 da presente in- venção pode se ligar a pelo menos um Iigante de proteína com uma K0 igual a ou menor do que cerca de 10~7 M ou, mais preferivelmente, com uma K0 igual a ou menor do que cerca de 0,1-9,9 (ou qualquer faixa ou valor nos mesmos) χ 10"7, 10"8, 10~9, 10"10, 10"11, 10"12 ou IO13M ou qualquer faixa ou valor nos mesmos.

A afinidade ou avidez de um mimeticorpo de GLP-1 por pelo

menos um Iigante de proteína pode ser determinada experimentalmente u- sando qualquer método adequado, por exemplo, conforme usado para de- terminação de afinidade ou avidez de ligação de anticorpo-antígeno. (Veja, por exemplo, Berzofsky e outros, "Antibody-Antigen Interactions" em Funda- mental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, NY (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman e Company: New York, NY (1992); e método descritos nos mesmos). A afinidade medida de uma interação Ii- gante-mimeticorpo de GLP-1 em particular pode variar se medida sob dife- rentes condições (por exemplo, concentração de sal, pH). Assim, medições de afinidade e outros parâmetros de ligação a Iigante (por exemplo, K0, Ka, Kd) são, de preferência, feitas com soluções padronizadas de mimeticorpo de GLP-1 e Iigante e um tampão padronizado, tal como o tampão descrito aqui ou conhecido na técnica. Moléculas de Ácido Nucleico

Usando a informação fornecida aqui, tais como as seqüências de nucleotídeo que codificam pelo menos 90-100% dos aminoácidos contí- nuos de pelo menos uma de SEQ ID NOs 1 e 6, bem como pelo menos uma porção de um anticorpo, em que as seqüências acima são inseridas como a seqüência P de Fórmula (I) para proporcionar um mimeticorpo de GLP-1 da presente invenção, ainda compreendendo fragmentos, variantes ou seqüên- cias de consenso especificadas do mesmo ou um vetor depositado compre- endendo pelo menos uma dessas seqüências, uma molécula de ácido nucle- ico da presente invenção que codifica pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada pode ser obtida usando métodos descri- tos aqui ou conforme conhecido na técnica.

As moléculas de ácido nucleico da presente invenção podem estar na forma de RNA, tal como mRNA, hnRNA, tRNA ou qualquer outra forma ou na forma de um DNA incluindo, mas não limitado a, cDNA e DNA genômico obtido através de clonagem ou produzido sinteticamente ou qual- quer combinação dos mesmos. Qualquer porção de pelo menos uma fita do DNA ou RNA pode ser a fita de codificação, também conhecida como a fita senso, ou pode ser a fita de não codificação, também referida como a fita anti-senso.

As moléculas de ácido nucleico isolado da presente invenção podem incluir moléculas de ácido nucleico compreendendo uma rede de lei- tura aberta (ORF), opcionalmente com um ou mais íntrons, moléculas de ácido nucleico compreendendo a seqüência de codificação para um mimeti- corpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada; e moléculas de ácido nucleico as quais compreendem uma seqüência de nucleotídeo substanci- 15

almente diferente daquela descrita acima mas a qual, em virtude de degene- rância do código genético, ainda codifica pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 conforme descrito aqui e/ou conforme conhecido na técnica. Natural- mente, o código genético é bem conhecido na técnica. Assim, será rotina para aqueles versados na técnica gerar tais variantes de ácido nucleico de- generadas que codificam um mimeticorpo de GLP-1 específico ou porções ou variantes especificadas da presente invenção. Veja, por exemplo, Ausub-

el e outros supra, e tais variantes de ácido nucleico estão incluídas na pre- sente invenção.

Conforme indicado aqui, as moléculas de ácido nucleico da pre-

sente invenção as quais compreendem um ácido nucleico que codifica um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada podem incluir, mas não estão limitadas, àquelas que codificam uma seqüência de aminoá- cido de um fragmento de mimeticorpo de GLP-1, em si; a seqüência de codi- ficação para o mimeticorpo de GLP-1 inteiro ou uma porção da mesma; a seqüência de codificação para um mimeticorpo, fragmento ou porção de GLP-1, bem como seqüências adicionais, tal como a seqüência de codifica- ção de pelo menos um peptídeo de fusão ou líder de sinalização, com ou sem as seqüências de codificação adicionais antes mencionadas, tais como pelo menos um íntron, junto com seqüências de não codificação adicionais incluindo, mas não limitado a, seqüências de não codificação 5' e 3', tais como as seqüências transcritas não traduzidas que exercem um papel em transcrição, processamento de mRNA, incluindo splicing e sinais de poliade- nilação (por exemplo, ligação ribossômica e estabilidade do mRNA); uma seqüência de codificação adicional que codifica aminoácidos adicionais, tais como aqueles que proporcionam funcionalidades adicionais. Assim, a se- qüência de codificação de um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada pode ser fundida a uma seqüência marcadora, tal como uma seqüência que codifica um peptídeo que facilita a purificação do mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada fundida compreendendo um fragmento ou porção de mimeticorpo de GLP-1.

Polinucleotídeos os quais se hibridizam seletivamente a um polinucleotíften

20 conforme descrito aqui

A presente invenção proporciona ácidos nucleicos isolados que se hibridizam, sob condições de hibridização seletiva, a um polinucleotídeo divulgado aqui ou outros divulgados aqui, incluindo porções ou variantes es- pecifiçadas dos mesmos. Assim, os polinucleotídeos dessa modalidade po- dem ser usados para isolamento, detecção e/ou quantificação de ácidos nu- cleicos compreendendo tais polinucleotídeos.

Condições de hibridização em estringência baixa ou moderada são, tipicamente, mas não exclusivamente, empregadas como seqüências tendo uma identidade de seqüência reduzida com relação às seqüências complementares. Condições de estringência moderada e alta podem, opcio- nalmente, ser empregadas para seqüências de maior identidade. Condições de baixa estringência permitem hibridização seletiva de seqüências tendo cerca de 40-99% de identidade de seqüência e podem ser empregadas para identificar seqüências ortólogas e parálogas.

Opcionalmente, os polinucleotídeos da presente invenção codifi- carão pelo menos uma porção de um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada codificada pelos polinucleotídeos descritos aqui. Os polinucleotídeos da presente invenção abrangem seqüências de ácido nucle- ico que podem ser empregadas para hibridização seletiva a um polinucleotí- deo que codifica um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especifi- cada da presente invenção. Veja, por exemplo, Ausubel, supra; Colligan, supra, cada um totalmente incorporado aqui por referência. Construção de ácidos nucleicos Os ácidos nucleicos isolados da presente invenção podem ser

feitos usando (a) métodos recombinantes, (b) técnicas sintéticas, (c) técnicas de purificação ou combinações dos mesmos, conforme bem conhecido na técnica.

Os ácidos nucleicos podem, convenientemente, compreender seqüências além de um polinucleotídeo da presente invenção. Por exemplo, um sítio de clonagem múltipla compreendendo um ou mais sítios de restri- ção de endonuclease pode ser inserido no ácido nucleico para auxiliar no isolamento do polinucleotídeo. Também, seqüências passíveis de tradução podem ser inseridas para auxiliar no isolamento do polinucleotídeo traduzido da presente invenção. Por exemplo, uma seqüência marcadora de hexa- histidina proporciona um meio conveniente para purificar as proteínas da presente invenção. O ácido nucleico da presente invenção - excluindo a se- qüência de codificação - é opcionalmente um vetor, adaptador ou Iigante para clonagem e/ou expressão de um polinucleotídeo da presente invenção.

Seqüências extra podem ser adicionadas a tais seqüências de clonagem e/ou expressão para otimizar sua função na clonagem e/ou ex- pressão, para auxiliar no isolamento do polinucleotídeo ou para melhorar a introdução do polinucleotídeo em uma célula. Uso de vetores de clonagem, vetores de expressão, adaptadores e Iigantes é bem conhecido na técnica. Veja, por exemplo, Ausubel, supra; ou Sambrook, supra. Métodos recombinantes para construção de ácidos nucleicos As composições de ácido nucleico isolado da presente invenção,

tais como RNA, cDNA, DNA genômico ou qualquer combinação dos mes- mos, podem ser obtidas a partir de fontes biológicas usando qualquer uma de uma série de metodologias de clonagem conhecidas por aqueles versa- dos na técnica. Em algumas modalidades, sondas de oligonucleotídeo que se hibridizam seletivamente, sob condições de estringência adequadas/aos polinucleotídeos da presente invenção são usadas para identificar a seqüên- cia desejada em uma biblioteca de cDNA ou DNA genômico. O isolamento de RNA e construção de bibliotecas de cDNA e genômicas são bem conhe- cidos por aqueles versados na técnica (veja, por exemplo, Ausubel, supra; ou Sambrook, supra).

Métodos sintéticos para construção de ácidos nucleicos

Os ácidos nucleicos isolados da presente invenção também po- dem ser preparados através de síntese química direta através de métodos conhecidos (veja, por exemplo, Ausubel e outros, supra). Síntese química geralmente produz um oligonucleotídeo de fita única, o qual pode ser con- vertido em DNA de fita dupla através de hibridização com uma seqüência complementar ou através de polimerização com uma DNA polimerase usan- do a fita única como um templato. Aqueles versados na técnica reconhece- rão que, embora síntese química de DNA possa estar limitada às seqüências de cerca de 100 ou mais bases, seqüências mais longas podem ser obtidas através da ligação de seqüências mais curtas.

Cassetes de expressão recombinantes

A presente invenção ainda proporciona cassetes de expressão recombinantes compreendendo um ácido nucleico da presente invenção. Uma seqüência de ácido nucleico da presente invenção, por exemplo, um cDNA ou uma seqüência genômica que codifica um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada da presente invenção pode ser usada para construir um cassete de expressão recombinante que pode ser introdu- zido em pelo menos uma célula hospedeira desejada. Um cassete de ex- pressão recombinante compreenderá, tipicamente, um polinucleotídeo da presente invenção operavelmente ligado a seqüências regulatórias de início de transcrição que direcionarão a transcrição do polinucleotídeo na célula hospedeira pretendida. Promotores heterólogos e não heterólogos (isto é, endógenos) podem ser empregados para direcionar a expressão dos ácidos nucleicos da presente invenção.

Em algumas modalidades, ácidos nucleicos isolados que servem como promotor, intensificador ou outros elementos podem ser introduzidos na posição apropriada (a montante, a jusante ou em um íntron) de uma for- ma não heteróloga de um polinucleotídeo da presente invenção de modo a super- ou sub-regular a expressão de um polinucleotídeo da presente inven- ção. Por exemplo, promotores endógenos podem ser alterados in vivo ou in vitro através de mutação, deleção e/ou substituição, conforme conhecido na técnica. Um polinucleotídeo da presente invenção pode ser expresso na ori- entação senso ou anti-senso, conforme desejado. Será apreciado que con- trole de expressão de gene na orientação senso ou anti-senso pode ter um impacto direto sobre as características observadas. Outro método de su- pressão é supressão senso. Foi mostrado que introdução de um ácido nucle- ico configurado na orientação senso é um meio eficaz através do qual blo- quear a transcrição de genes alvo. Vetores e Células hospedeiras

A presente invenção também se refere a vetores que incluem moléculas de ácido nucleico isoladas da presente invenção, células hospe- deiras que são geneticamente manipuladas com os vetores recombinantes e a produção de pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada através de técnicas recombinantes, conforme é bem conhecido na técnica. Veja, por exemplo, Sambrook e outros, supra; Ausubel e outros, supra, cada um totalmente incorporada aqui por referência.

Os polinucleotídeos podem, opcionalmente, ser unidos a um ve- tor contendo um marcador selecionável para propagação em um hospedeiro. Geralmente, um vetor de plasmídeo é introduzido em uma célula usando métodos conhecidos adequados, tal como eletroporação e semelhantes. Ou- tros métodos incluem o uso do vetor como um precipitado, tal como um pre- cipitado de fosfato de cálcio ou em um complexo com um lipídio carregado. Se o vetor é um vírus, ele pode ser engolfado in vitro usando uma célula de célula de engolfamento apropriada e, então, transduzido em células hospe- deiras.

O inserto de DNA deverá ser operativamente ligado a um promo- tor apropriado. Os construtos de expressão ainda conterão sítios opcional- mente para pelo menos um início de transcrição, término e, na região trans- crita, um sítio de ligação ribossômica para tradução. A porção de codificação dos transcritos maduros expressos pelos construtos incluirá, de preferência, um início de tradução no início e um códon de término (por exemplo, UAA, UGA ou UAG) apropriadamente posicionado no final do mRNA a ser traduzi- da, com UAA e UAG preferidos para expressão em célula de mamífero ou eucariota.

Vetores de expressão incluirão, de preferência, mas opcional- mente, pelo menos um marcador selecionável. Tais marcadores incluem, por exemplo, mas não limitado a, metotrexato (MTX), reductase de dihidrofolato (DHFR, Patentes U.S. Nes 4,399,216; 4,634,665; 4,656,134; 4,956,288; 5,149,636; 5,179,017, resistência à ampicilina, neomicina (G418), ácido mi- cofenólico ou sintetase de glutamina (GS, Patentes US NsS 5.122.464; 5.770.359; 5.827.739) para cultura de célula eucariota e genes de resistên- cia à tetraciclina ou ampicilina para cultura em E. coli e outras bactérias ou procariotas (as patentes acima sendo totalmente incorporadas aqui por refe- rência). Meios de cultura apropriados e condições para as células hospedei- ras acima descritas são conhecidos na técnica. Vetores adequados serão prontamente evidente para aqueles habilitados. Introdução de um construto de vetor na célula hospedeira pode ser realizada através de transfecção com fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrana, transfecção me- diada por lipídio catiônico, eletroporação, transdução, infecção ou outros mé- todos conhecidos. Tais métodos são descritos na técnica, tal como Sambro- ok, supra, Capítulos 1-4 e 16-18; Ausubel, supra, Capítulos 1, 9,13, 15,16.

Pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada da presente invenção pode ser expressa em uma forma modifi- cada, tal como uma proteína de fusão e pode incluir não apenas sinais de secreção, mas também regiões funcionais heterólogas adicionais. Por e- xemplo, uma região de aminoácidos adicionais, particularmente aminoácidos carregados, pode ser adicionada ao N-término de um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada para melhorar a estabilidade e persistên- cia na célula hospedeira, durante purificação ou durante subsequente mani- pulação e armazenamento. Também, porções peptídicas podem ser adicio- nadas a um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada da presente invenção para facilitar a purificação. Tais regiões podem ser remo- vidas antes de preparo final de um mimeticorpo de GLP-1 ou pelo menos um fragmento do mesmo. Tais métodos são descritos em muitos manuais pa- drões de laboratório, tal como Sambrook, supra, Capítulos 17.29-17.42 e 18.1-18.74; Ausubel, supra, Capítulos 16,17 e 18.

Aqueles versados na técnica têm ciência dos numerosos siste- mas de expressão disponíveis para expressão de um ácido nucleico que codifica uma proteína da presente invenção. Ilustrativas de culturas de célula úteis para a produção dos mi-

meticorpos, porção ou variante especificada dos mesmos, são células de mamífero. Sistemas de célula de mamífero freqüentemente estarão na forma monocamadas de células, embora suspensões de célula de mamífero ou biorreatores também possam ser usados. Uma série de linhagens de célula hospedeira adequadas capazes de expressar proteínas glicosiladas intactas foi desenvolvida na técnica e incluem as linhagens de célula COS-1 (por e- xemplo, ATCC CRL 1650), COS-7 (por exemplo, ATCC CRL-1651), HEK293, BHK21 (por exemplo, ATCC CRL-10), CHO (por exemplo, ATCC CRL 1610, DG-44) e BSC-1 (por exemplo, ATCC CRL-26), células hepG2, P3X63Ag8.653, SP2/0-Ag14, células 293, células HeLa e semelhantes, as quais estão prontamente disponíveis, por exemplo, da American Type Cultu- re Collection, Manassas, Va. Células hospedeiras preferidas incluem células de origem linfóide, tais como células de mieloma e linfoma. Células hospe- deiras particularmente preferidas são células P3X63Ag8.653 (acesso a

ATCC Número CRL-1580) e células SP2/0-Ag14 (acesso a ATCC Número CRL-1851).

Vetores de expressão para essas células podem incluir uma ou

mais das seguintes seqüências de controle de expressão tais como, mas não limitado a, uma origem de replicação; um promotor (por exemplo, pro- motores tardio ou precoce de SV40, o promotor de CMV (por exemplo, Pa- tentes US NsS 5.168.062; 5.385.839), um promotor tk de HSV, um promotor pgk (quínase de fosfoglicerato), um promotor EF-1 alfa (por exemplo, Paten- te U.S. Ne 5.266.491), pelo menos um promotor de imunoglobulina humana; um intensificador e/ou sítios de processamento de informação, tais como sítios de ligação ribossômica, sítios de splicing de RNA, sítios de poiiadeni- lação (por exemplo, um sítio de poli A adição de T Ag grande de SV40) e seqüências de término de transcrição. Veja, por exemplo, Ausubel e outros, supra; Sambrook e outros, supra. Outras células úteis para a produção de ácidos nucleicos ou proteínas da presente invenção são conhecidas e/ou estão disponíveis, por exemplo, do American Type Culture Collection Cata- logue of Cell Lines and Hybridomas (www.atcc.org) ou outras fontes conhe- cidas ou comerciais.

Quando células hospedeiras eucariotas são empregadas, se- qüências de poliadenilação ou término de transcrição são, tipicamente, in- corporadas no vetor. Um exemplo de uma seqüência terminadora é a se- qüência de poliadenilação do gene de hormônio do crescimento bovino. Se- qüências para splicing preciso do transcrito também podem ser incluídas. Um exemplo de uma seqüência de splicing é o íntron VP1 de SV40 (Sprague e outros, J. Virol. 45: 773-781 (1983)). Adicionalmente, seqüências genéticas para controlar a replicação na célula hospedeira podem ser incorporadas no vetor, conforme conhecido na técnica.

Purificação de um mimeticoroo de GLP-1 ou porção ou variante especificada do mesmo

Um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada

pode ser recuperada e purificada de culturas de células recombinantes atra- vés de métodos bem conhecidos incluindo, mas não limitado a, purificação em proteína A, precipitação de sulfato de amônio ou etanol, extração de áci- do, cromatografia de troca de ânions ou cátions, cromatografia em fosfocelu- lose, cromatografia por interação hidrofóbica, cromatografia por afinidade, cromatografia em hidroxiapatita e cromatografia em lecitina. Cromatografia de líquido de alto desempenho ("HPLC") também pode ser empregada para purificação. Veja, por exemplo, Colligan, Current Protocols in Immunology ou Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997- 2003), por exemplo, Capítulos 1, 4, 6, 8, 9, 10, cada um totalmente incorpo- rado aqui por referência.

Mimeticorpos ou porções ou variantes especificadas da presente invenção incluem produtos naturalmente purificados, produtos de procedi- mentos sintéticos químicos e produtos produzidos através de técnicas re- combinantes a partir de um hospedeiro eucariota incluindo, por exemplo, células de levedo, planta superior, inseto e mamífero. Dependendo do hos- pedeiro empregado em um procedimento de produção recombinante, o mi- meticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada da presente inven- ção pode ser glicosilada ou pode ser não glicosilada, com glicosilada preferi- da. Tais métodos são descritos em muitos manuais padrões de laboratório, tais como Sambrook, supra, Seções 17.37-17.42; Ausubel, supra, Capítulos 10, 12, 13, 16, 18 e 20, Colligan, Protein Science, supra, Capítulos 12-14, todos totalmente incorporados aqui por referência. Mimeticorpos. fragmentos e/ou variantes especificadas

Os mimeticorpos isolados da presente invenção compreendem um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada codificada por qualquer um dos polinucleotídeos da presente invenção, conforme discutido mais completamente aqui ou qualquer mimeticorpo de GLP-1 isolado ou preparado ou porção ou variante especificada do mesmo.

De preferência, o mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante de ligação a Iigante se liga a pelo menos um Iigante de proteína de GLP-1 e, desse modo, proporciona pelo menos uma atividade biológica do GLP-1 da proteína correspondente ou um fragmento da mesma. Diferentes proteínas terapêutica ou diagnosticamente significativas são bem conhecidas na técni- ca e ensaios adequados ou atividades biológicas de tais proteínas também são bem conhecidos na técnica. Exemplos não Iimitativos de peptídeos, variantes e derivados de

GLP-1 para a presente invenção aparecem como SEQ ID NO: 1: His-Xaa2- Xaa3-Gly-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaal 1 -XaaI 2-Xaa13-Xaa14- Xaa 15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21 -Phe-Xaa23-Xaa24- Xaa25-Xaa26-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Xaa30-Xaa31, em que: Xaa2 é Ala, Gly, Ser, Thr1 Leu, lie, Vai, Glu, Asp ou Lys; Xaa3 é Glu, Asp ou Lys; Xaa5 é Thr, Ala, Gly, Ser, Leu, lie, Vai, Arg, His, Glu, Asp ou Lys; Xaa6 é Phe, His, Trp ou Tyr; Xaa7 é Thr ou Asn; Xaa8 é Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, lie, Vai, Glu, Asp ou Lys; Xaa9 é Asp ou Glu; XaaIO é Vai, Gln, His, Glu ou Lys; Xaal 1 é Ser, Via, Ala, Gly, Thr, Leu, lie, Glu, Asp ou Lys; Xaa12 é Ser, Vai, Ala, Gly, Thr, Leu, He, Glu, Asp ou Lys; Xaa13 é Tyr, Gln, His, Glu ou Lys; Xaa14 é Leu, Gln, His, Glu ou Lys; Xaa15 é Glu, Ala, Thr, Ser, Gly, Gln, Asp ou Lys; Xa- a16 é Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, lie, Vai, Gln, Asn, Arg, Cys, Glu, Asp ou Lys; Xaa17 é Gln, Asn, Arg, His, Glu, Asp ou Lys; Xaa18 é Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, lie, Vai, Arg, Glu, Asp ou Lys; Xaa19 é Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, lie, Vai, Met, Glu, Asp ou Lys; Xaa20 é Lys, Arg, His, Gln, Trp, Phe, Glu ou Asp; Xa- a21 é Glu, Leu, Ala, His, Phe, Tyr, Trp, Arg, Gln, Thr, Ser, Gly, Asp ou Lys; Xaa23 é lie, Ala, Vai, Leu ou Glu; Xaa24 é Ala, Gln, His, Glu ou Lys; Xaa25 é Trp, Phe, Tyr, Glu, Asp ou Lys; Xaa26 é Leu, Gly1 Ala, Ser, Thr, lie, Vai, Glu, Asp ou Lys; Xaa27 é Val1 Gln, His1 Glu ou Lys; Xaa28 é Lys, Asn, Arg, His, Glu ou Asp; Xaa29 é Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, lie, Vai, Arg, Trp, Tyr, Phe, Pro, His, Glu, Asp ou Lys; Xaa30 é Arg1 His, Thr, Ser, Trp, Tyr, Phe, Glu, Asp ou Lys; e Xaa31 é Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, lie, Vai, Arg, Trp, Tyr, Phe, His, Glu, Asp, Lys.

Outro grupo preferido de peptídeos, variantes ou derivados de GLP-1 é exemplificado em SEQ ID NO: 6: His-Xaa2-Xaa3-Gly-Thr-Xaa6- Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa 10-Ser-Xaal 2-Tyr-Xaa14-Glu-Xaa16-Xaa17-Xaa18- Xaa 19-Lys-Xaa21 -Phe-Xaa23-Ala-Trp-Leu-Xaa27-Xaa28-Gly-Xaa30, em que: Xaa2 é Ala, Gly ou Ser; Xaa3 é Glu ou Asp; Xaa6 é Phe ou Tyr; Xaa7 é Thr ou Asn; Xaa8 é Ser, Thr ou Ala; Xaa9 é Asp ou Glu; XaaIO é Vai, Gln1 His, Glu ou Lys; Xaa12 é Ser ou Lys; Xaa14 é Leu, Gln, His, Glu ou Lys; Xa- a16 é Gly, Ala1 Glu ou Asp; Xaa17 é Gln ou Glu; Xaa18 é Ala ou Lys; Xaa19 é Ala1 Val1 lie, Leu ou Met; Xaa21 é Glu ou Leu; Xaa23 é Ile1 Ala1 Val1 Leu ou Glu; Xaa 24 é Ala1 Gln, His1 Glu ou Lys; Xaa27 é Val1 Gln1 His1 Glu ou Lys; Xaa28 é Lys ou Asn; e Xaa30 é Arg ou Glu.

Esses peptídeos podem ser preparados através de métodos di- vulgados e/ou conhecidos na técnica. Os Xaas na seqüência (e por todo ρ presente relatório, a menos que de outro modo especificado em um caso em particular) incluem resíduos de aminoácido especificados, derivados ou ami- noácidos modificados dos mesmos. Em virtude do fato de a enzima dipepti- dil-peptidase IV (DPP-IV) ser responsável pela rápida inativação in vivo ob- servada de GLP-1 administrado, peptídeos de GLP-1, homólogos e deriva- dos que são protegidos contra atividade de DPP-IV, no contexto de mimeti- corpo, são preferidos.

Um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada do mesmo que proporciona, de modo parcial ou, de preferência, substanci- almente pelo menos uma atividade biológica de GLP-1, pode se ligar ao Ii- gante de GLP-1 e, desse modo, proporcionar pelo menos uma atividade que é, de outro modo, mediada através da ligação de GLP-1 a pelo menos um Iigante1 tal como um receptor de GLP-1 ou através de outros mecanismos proteína-dependentes ou mediados. Conforme usado aqui, o termo "ativida- de de mimeticorpo de GLP-1" se refere a um mimeticorpo de GLP-1 que po- de modular ou causar pelo menos uma atividade dependente de GLP-1 em cerca de 20-10.000%, de preferência pelo menos cerca de 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 % ou mais, dependendo do ensaio.

A capacidade de um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou varian- te especificada de proporcionar pelo menos uma atividade proteína- dependente é, de preferência, avaliada através de pelo menos um ensaio biológico de proteína adequado, conforme descrito aqui e/ou conforme co- nhecido na técnica. Um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especi- ficada da invenção pode ser similar a qualquer classe (IgG, IgA, IgM, etc.) ou isotipo e pode compreender pelo menos uma porção de uma cadeia leve capa ou lambda. Em uma modalidade, o mimeticorpo de GLP-1 humano ou porção ou variante especificada compreende fragmentos variáveis de cadeia pesada de IgG, da região de dobradiça, CH2 e CH3 de pelo menos um dos isotipos, por exemplo, IgGI, lgG2, lgG3 ou lgG4. Pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante

especificada da invenção se liga a pelo menos um ligante, subunidade, fragmento, porção ou qualquer combinação dos mesmos. Pelo menos um mimeticorpo de GLP-1, variante ou derivado de pelo menos um mimeticorpo de GLP-1, porção ou variante especificada da presente invenção pode, op- cionalmente, se ligar a pelo menos um epítopo especificado do ligante. O epítopo de ligação pode compreender qualquer combinação de pelo menos uma seqüência de aminoácido de pelo menos 1 -3 aminoácidos a porção es- pecificada toda de aminoácidos contínuos das seqüências de um ligante de proteína, tal como um receptor de GLP-1 ou porção do mesmo. Tais mimeticorpos podem ser preparados através de união das

várias porções de Fórmula (I) do mimeticorpo de GLP-1 usando técnicas conhecidas, através de preparo e expressão de pelo menos uma molécula de ácido nucleico que codifica o mimeticorpo de GLP-1, usando técnicas conhecidas de tecnologia de DNA recombinante ou usando qualquer outro método adequado, tal como síntese química.

Mimeticorpos que se ligam a Iigantes de GLP-1 humano, tais como receptores, e que compreendem uma região variável de cadeia pesa- da ou leve definida ou porção da mesma, podem ser preparados usando métodos adequados, tal como phage display (Katsube, Y. e outros, Int J Moi Med, 1(5): 863-868 (1998)) ou métodos que empregam animais transgêni- cos, conforme conhecido na técnica. O mimeticorpo de GLP-1, porção ou variante especificada pode ser expressa usando o ácido nucleico de codifi- cação ou porção do mesmo em uma célula hospedeira adequada.

A invenção também se refere a mimeticorpos, fragmentos de ligação a Iigante e cadeias de imunoglobulina compreendendo aminoácidos em uma seqüência que é substancialmente a mesma que uma seqüência de aminoácido descrita aqui. De preferência, tais mimeticorpos ou fragmentos de ligação a Iigante dos mesmos podem se ligar a Iigantes de GLP-1 huma- no, tais como receptores, com alta afinidade (por exemplo, Kd de menos de ou igual a cerca de 10"7 M). Seqüências de aminoácido que são substanci- almente as mesmas conforme as seqüências descritas aqui incluem se- quências compreendendo substituições conservativas de aminoácido, bem como deleções e/ou inserções de aminoácido. Uma substituição conservati- va de aminoácido se refere à substituição de um primeiro aminoácido por um segundo aminoácido que tem propriedades químicas e/ou físicas (por exem- plo, carga, estrutura, polaridade, hidrofobicidade/hidrofilicidade) que são si- milares àquelas do primeiro aminoácido. Substituições conservativas inclu- em substituição de um aminoácido por outro dentro dos seguintes grupos: Iisina (K), arginina (R) e histidina (H); aspartato (D) e glutamato (E); aspara- gina (N), glutamina (Q), serina (S), treonina (T), tirosina (Υ), K, R, H, D e E; alanina (A), valina (V), Ieucina (L), isoleucina (I), prolina (P), fenilalanina (F), triptofano (W), metionina (M), cisteína (C) e glicina (G); F, W e Y; C, S e T. Códigos de aminoácido

Os aminoácidos que compõem os mimeticorpos ou porção ou variante especificada da presente invenção são, com freqüência, abreviados. As designações de aminoácido podem ser indicadas através de designação do aminoácido por seu código de uma letra, seu código de três letras, nome ou códon(s) de três nucleotídeos, conforme é bem entendido na técnica (ve- ja Alberts, B. e outros, Molecular Biology of The Cell, Terceira Ed., Garland Publishing, Inc., New York, 1994). CÓDIGO DE CÓDIGO DE

UMA LETRA TRÊS LETRAS NOME CÓDON(S) DE TRÊS NUCL

A Ala Alanina GCA, GCC, GCG, GCU C Cys Ciste ína UGC, UGU D Asp Ácido aspártico GAC, GAU E Glu Ácido glutâmico GAA, GAG F Phe Fenilalanina UUC, UUU G Gly Glicina GGA1 GGC, GGG1 GGU H His Histidina CAC, CAU I Ile Isoleucina AUA, AUC, AUU K Lys Lisina AAA, AAG L Leu Leucina UUA, UUG, CUA, CUC, CUG, CUU M Met Metionina AUG N Asn Asparagina AAC, AAU P Pro Prolina CCA, CCC, CCG, CCU Q Gln Glutamina CAA, CAG R Arg Arginina AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGU S Ser Serina AGC, AGU, UCA, UCC1 UCG, UCU T Thr Treonina ACA, ACC, ACG, ACU V Val Valina GUA, GUC1 GUG, GUU W Trp Triptofano UGG Y Tyr Tirosina UAC, UAU

Um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada

da presente invenção pode incluir uma ou mais substituições, deleções ou adições de aminoácido, quer a partir de mutações naturais ou manipulação humana, conforme especificado aqui. Essas e outras seqüências que podem ser usadas na presente invenção incluem, mas não estão limitadas a, as seguintes seqüências apresentadas na Tabela 1, conforme mostrado cor- respondendo às porções especificadas de SEQ ID NOS: 47-64, onde a regi- ão variável parcial da seqüência do anticorpo pode ser, mas não estão limi- tada a, pelo menos uma porção de pelo menos uma de SEQ ID NOS: 47-55 ou fragmento das mesmas conforme descrito na Tabela 1, ainda compreen- dendo opcionalmente pelo menos uma substituição, inserção ou deleção, conforme descrito nas Figuras 1 -9 da publicação PCT WO 05/05604 (PCT US04/19898) depositada em 24 de junho de 2004 e publicada em 20 de ja- neiro de 2005, com SEQ ID NOS: 1-9 correspondentes. As regiões CH2, CH3 e dobradiça podem ser, mas não estão limitadas a, pelo menos uma porção de pelo menos uma de SEQ ID NOS: 56-64 ou um fragmento das mesmas, conforme descrito na Tabela 1, ainda compreendendo opcional- mente pelo menos uma substituição, inserção ou deleção, conforme ainda descrito nas Figuras 32-40 da publicação PCT WO 05/05604 (PCT US04/19898) depositada em 24 de junho de 2004 e publicada em 20 de ja- neiro de 2005, com SEQ ID NOS: 32-40 correspondentes. Naturalmente, o número de substituições de aminoácido que aqueles habilitados poderão fazer depende de muitos fatores, incluindo aqueles descritos acima. De mo- do geral, o número de substituições, inserções ou deleções de aminoácido para pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 não será de mais de 40, 30, 20,19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 aminoácidos, tal como 1 -30 ou qualquer faixa ou valor nos mesmos, conforme especifica- do aqui.

Na fórmula I da presente invenção, ((P(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)- CH3(s))(t), as porções V, H, CH2, CH3 de acordo com a Fórmula I podem ser qualquer seqüência humana adequada ou compatível humana, por e- xemplo, conforme apresentado na Tabela 1, onde a região variável parcial da seqüência do anticorpo pode ser, mas não está limitada a, pelo menos uma porção de pelo menos uma de SEQ ID NOS: 47-55 ou fragmento das mesmas, conforme descrito na Tabela 1, ainda compreendendo, opcional- 10

mente, pelo menos uma substituição, inserção ou deleção, conforme ainda descrito nas Figuras 1-9 da publicação PCT WO 05/05604 (PCT US04/19898) depositada em 24 de junho de 2004 e publicada em 20 de ja- neiro de 2005, com SEQ ID NOS: 1-9 correspondentes; e onde as regiões CH2, CH3 e dobradiça podem ser, mas não estão limitadas a, pelo menos uma porção de pelo menos uma de SEQ ID NOS: 56-64 ou um fragmento das mesmas, conforme descrito na Tabela 1, ainda compreendendo opcio- nalmente pelo menos uma substituição, inserção ou deleção, conforme ain- da descrito nas Figuras 32-40 da publicação PCT WO 05/05604 (PCT US04/19898) depositada em 24 de junho de 2004 e publicada em 20 de ja- neiro de 2005, com SEQ ID NOS: 32-40 correspondentes ou conforme co- nhecido na técnica ou qualquer combinação ou seqüência de consenso das mesmas ou qualquer proteína de fusão das mesmas, de preferência de ori- gem humana ou manipuladas para minimizar a imunogenicidade quando administradas a seres humanos.

A porção P pode compreender pelo menos um produto terapêu- tico de peptídeo de GLP-1 conhecido na técnica ou descrito aqui tal como, mas não limitado a, aqueles apresentados em SEQ ID NO: 1 ou qualquer combinação ou seqüência de consenso da mesma ou qualquer proteína de fusão da mesma. Em uma modalidade preferida, a porção P pode compre- ender pelo menos um peptídeo de GLP-1 tendo a seqüência de pelo menos uma de SEQ ID NO: 6 ou qualquer combinação ou seqüência de consenso da mesma ou qualquer proteína de fusão da mesma.

A seqüência Iigante opcional pode ser qualquer Iigante peptídico

adequado, conforme conhecido na técnica. Seqüências preferidas incluem

qualquer combinação de G e S, por exemplo, X1-X2-X3-X4-...-Xn, onde X

pode ser G ou S e η pode ser 5-30. Exemplos não Iimitativos incluem GS,

GGS, GGGS (SEQ ID NO: 16), GSGGGS (SEQ ID NO: 17), GGSGGGS

(SEQ ID NO: 18), GGSGGGSGG (SEQ ID NO: 19) e GGGSGGGSGG (SEQ ID NO: 20); e semelhantes.

Aminoácidos em um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou varian- te especificada da presente invenção que são essenciais para função podem

20

25 ser identificados através de métodos conhecidos na técnica, tal como muta- gênese sítio-dirigida ou mutagênese por exploração de alanina (por exem- plo, Ausubel, supra, Capítulos 8, 15; Cunningham e Wells, Science 244:1081-1085 (1989)). O último procedimento introduz mutações únicas de alanina em cada resíduo na molécula. As moléculas mutantes resultantes são, então, testadas com relação à atividade biológica tal como, mas não limitado a, pelo menos uma atividade relacionada à proteína, conforme es- pecificado aqui ou conforme conhecido na técnica. Sítios que são críticos para ligação ao mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada também podem ser identificados através de análise estrutural, tal como cris- talização, ressonância magnética nuclear ou rotulação por fotoafinidade (Smith e outros, J. Mol. Biol. 224: 899-904 (1992) e de Vos e outros, Science 255: 306-312 (1992)).

Mimeticorpos ou porções ou variantes especificadas da presente invenção podem compreender, como a porção P de Fórmula (I), por exem- plo, mas não limitado a pelo menos uma porção de pelo menos um de SEQ ID NOS: 1 e 6. Um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especifica- da pode ainda, opcionalmente, compreender pelo menos uma porção fun- cional de pelo menos um polipeptídeo como a porção P de Fórmula (I), pelo menos 90-100% de pelo menos uma de SEQ ID NOS: 1 e 6. Variantes não Iimitativas que podem intensificar ou manter pelo menos uma das atividades listadas acima incluem, mas não estão limitadas a, qualquer um dos polipep- tídeos acima, ainda compreendendo pelo menos uma mutação correspon- dendo a pelo menos uma substituição, inserção ou deleção que não afeta significativamente as atividades biológicas ou funções adequadas do referido mimeticorpo de GLP-1.

Em uma modalidade, a seqüência de P aminoácido ou porção da mesma tem cerca de 90-100% de identidade (isto é, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 ou qualquer faixa ou valor nos mesmos) à seqüência de aminoácido correspondente da porção correspondente de pelo menos uma de SEQ ID NOS: 1 e 6. De preferência, 90-100% de identidade de ami- noácido (isto é, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 ou qualquer faixa ou valor nos mesmos) é determinada usando um algoritmo de computador adequado, conforme conhecido na técnica.

Mimeticorpos ou porções ou variantes especificadas da presente invenção podem compreender qualquer número de resíduos de aminoácido contínuos de um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada da presente invenção, em que esse número é selecionado do grupo de nú- meros inteiros consistindo em 10-100% do número de resíduos contínuos em um mimeticorpo de GLP-1. Opcionalmente, essa subsequência de ami- noácidos contínuos tem pelo menos cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 ou mais aminoácidos de comprimento ou qualquer faixa ou valor nos mesmos. Ainda, o número de tais subsequências pode ser qualquer número inteiro selecionado do grupo consistindo em 1 a 20, tal co- mo pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais.

Conforme aqueles versados na técnica apreciarão, a presente invenção inclui pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 biologicamente ativo ou porção ou variante especificada da presente invenção. Mimeticorpos bio- logicamente ativos ou porções ou variantes especificadas têm uma atividade específica de pelo menos 20%, 30% ou 40% e, de preferência, pelo menos 50%, 60% ou 70% e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 80%, 90% ou 95%-1000% daquela da proteína fundida ou inserida endógena ou relacio- nada e conhecida nativa (não sintética) ou porção ou variante especificada. Métodos de ensaio e medidas de quantificação de atividade enzimática e especificidade de substrato são bem conhecidas por aqueles versados na técnica.

Em outro aspecto, a invenção se refere a mimeticorpos humanos e fragmentos de ligação a ligante, conforme descrito aqui, os quais são mo- dificados através da fixação covalente de uma porção orgânica. Tal modifi- cação pode produzir um mimeticorpo de GLP-1 ou fragmento de ligação a ligante com propriedades farmacocinéticas aperfeiçoadas (por exemplo, meia-vida in vivo no soro aumentada). A porção orgânica pode ser um grupo polimérico hidrofílico linear ou ramificado, um grupo ácido graxo ou um grupo éster de ácido graxo. Em modalidades particulares, o grupo polimérico hidro- fílico pode ter um peso molecular de cerca de 800 a cerca de 120.000 Dál- tons e pode ser um polialcano glicol (por exemplo, polietileno glicol (PEG), polipropileno glicol (PPG)), polímero de carboidrato, polímero de aminoácido ou polivinil pirrolidona e o grupo ácido graxo ou éster de ácido graxo pode compreender de oito a cerca de quarenta átomos de carbono.

Os mimeticorpos modificados e fragmentos de ligação a Iigante da invenção podem compreender uma ou mais porções orgânicas que são covalentemente ligadas, direta ou indiretamente, ao mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada. Cada porção orgânica que é ligada a um mimeticorpo de GLP-1 ou fragmento de ligação a Iigante da invenção pode, independentemente, ser um grupo polimérico hidrofílico, um grupo ácido graxo ou um grupo éster de ácido graxo. Conforme usado aqui, o termo "á- cido graxo" abrange ácidos monocarboxílicos e ácidos di-carboxílicos. Um "grupo polimérico hidrofílico", conforme o termo é usado aqui, se refere a um polímero orgânico que é mais solúvel em água do que em octano. Por e- xemplo, polilisina é mais solúvel em água do que em octano. Assim, um mi- meticorpo de GLP-1 modificado através da fixação covalente de polilisina é abrangido pela invenção. Polímeros hidrofíiicos adequados para a modifica- ção de mimeticorpos da invenção podem ser lineares ou ramificados e inclu- em, por exemplo, polialcano glicóis (por exemplo, PEG, monometóxi- polietileno glicol (mPEG), PPG e semelhantes), carboidratos (por exemplo, dextrana, celulose, oligossacarídeos, polissacarídeos e semelhantes), polí- meros de aminoácidos hidrofíiicos (por exemplo, polilisina, poliarginina, poli- aspartato e semelhantes), óxidos de polialcano (por exemplo, oxido de polie- tileno, oxido de polipropileno e semelhantes) e polivinil pirrolidona. De prefe- rência, o polímero hidrofílico que modifica o mimeticorpo de GLP-1 da inven- ção tem um peso molecular de cerca de 800 a cerca de 150.000 Dáltons como uma entidade molecular distinta. Por exemplo, PEG2500, PEG5000, PEG7500, PEG9000, PEG1OOOo, PEG12500, PEG15ooo e PEG2o.ooo em que o subs- 10

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crito é o peso molecular médio do polímero em Dáltons, podem ser usados.

O grupo polimérico hidrofílico pode ser substituído por um a seis grupos alquil éster de ácido graxo ou ácido graxo. Polímeros hidrofílicos que são substituídos por um grupo ácido graxo ou éster de ácido graxo podem i ser preparados empregando métodos adequados. Por exemplo, um polímero compreendendo um grupo amina pode ser acoplado a um carboxilato do ácido graxo ou éster de ácido graxo e um carboxilato ativado (por exemplo, ativado com Ν,Ν-carbonil diimidazol) sobre um ácido graxo ou éster de ácido graxo pode ser acoplado a um grupo hidroxila sobre um polímero.

Ácidos graxos e ésteres de ácido graxo adequados para modifi- cação de mimeticorpos da invenção podem ser saturados ou conter uma ou mais unidades de insaturação. Ácidos graxos que são adequados para modi- ficação dos mimeticorpos da invenção incluem, por exemplo, n-dodecanoato (C12, laurato), n-tetradecanoato (C14, miristato), n-octadecanoato (C18, estea- rato), n-eicosanoato (C20, araquidato), n-docosanoato (C22, beenato), n- triacontanoato (C30), n-tetracontanoato (C40), c/s-A9-octadecanoato (C18, ole- ato), ali c/s-Δδ,8,11,14-eicosatetraenoato (C20, araquidonato), ácido octano- dióico, ácido tetradecanodióico, ácido octadecanodióico, ácido docosanodi- óico e semelhantes. Ésteres de ácido graxo adequados incluem monoéste- res de ácidos dicarboxílicos que compreendem um grupo alquila inferior li- near ou ramificado. O grupo alquila inferior pode compreender de um a cerca de doze, de preferência um a cerca de seis átomos de carbono.

Os mimeticorpos humanos modificados e fragmentos de ligação a Iigante podem ser preparados usando métodos adequados, tal como atra- vés de reação com um ou mais agentes de modificação. Um "agente de mo- dificação", conforme o termo é usado aqui, se refere a um grupo orgânico adequado (por exemplo, polímero hidrofílico, um ácido graxo, um éster de ácido graxo) que compreende um grupo de ativação. Um "grupo de ativação" é uma porção química ou grupo funcional que pode, sob condições apropri- adas, reagir com um segundo grupo químico, desse modo, formando uma ligação covalente entre o agente de modificação e o segundo grupo químico. Por exemplo, grupos de ativação amina-reativos incluem grupos eletrofílicos, tais como tosilato, mesilato, halo (cloro, bromo, flúor, iodo), N-hidróxi- succinimidil ésteres (NHS) e semelhantes. Grupos de ativação que podem reagir com tióis incluem, por exemplo, maleimida, iodoacetila, acriloíla, dis- sulfetos de piridila, ácido 5-tiol-2-nitrobenzóico, tiol (TNB-tiol) e semelhantes.

Um grupo funcional aldeído pode ser acoplado à moléculas contendo amina ou hidrazida e um grupo azida pode reagir com um grupo fósforo trivalente para formar ligações de fosforamidato ou fosforimida. Métodos adequados para introduzir grupos de ativação em moléculas são conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)). Um grupo de ativação pode ser ligado dire- tamente ao grupo orgânico (por exemplo, polímero hidrofílico, ácido graxo, éster de ácido graxo) ou através de uma porção ligante, por exemplo, um grupo C1-C12 divalente em que um ou mais átomos de carbono podem ser substituídos por um heteroátomo, tal como oxigênio, nitrogênio ou enxofre. Porções Iigantes adequadas incluem, por exemplo, tetraetileno glicol, - (CH2)3-, -NH-(CH2)6-NH-, -(CH2)2-NH- e -Ch2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH- NH-. Agentes de modificação que compreendem uma porção ligante podem ser produzidos, por exemplo, através de reação de uma mono-Boc- alquildiamina (por exemplo, mono-Boc-etilenodiamina, mono-Boc- diaminohexano) com um ácido graxo na presença de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) para formar uma ligação de amida entre a amina livre e o carboxilato de ácido graxo. O grupo de proteção Boc pode ser removido do produto através de tratamento com ácido trifluoroacé- tico (TFA) para expor uma amina primária que pode ser acoplada a outro carboxilato, conforme descrito ou pode ser reagido com anidrido maleico e o produto resultante ciclizado para produzir um derivado de maleimida ativado do ácido graxo (veja, por exemplo, Thompson e outros, WO 92/16221, os ensinamentos todos dos quais são incorporados aqui por referência).

Os mimeticorpos modificados da invenção podem ser produzi- dos através de reação de um mimeticorpo de GLP-1 humano ou fragmento de ligação a ligante com um agente de modificação. Por exemplo, as por- ções orgânicas podem ser ligadas ao mimeticorpo de GLP-1 de uma manei- ra não-sítio específica empregando um agente de modificação amina- reativo, por exemplo, um NHS éster de PEG. Mimeticorpos humanos modifi- cados ou fragmentos de ligação a Iigante também podem ser preparados através de redução de ligações de dissulfeto (por exemplo, ligações de dis- sulfeto intra-cadeia) de um mimeticorpo de GLP-1 ou fragmento de ligação a ligante. O mimeticorpo de GLP-1 reduzido ou fragmento de ligação a Iigante pode, então, ser reagido com um agente de modificação tiol-reativo para produzir o mimeticorpo de GLP-1 modificado da invenção. Mimeticorpos hu- manos modificados e fragmentos de ligação a ligante compreendendo uma porção orgânica que é ligada a sítios específicos de um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada da presente invenção podem ser preparados usando métodos adequados, tais como proteólise reversa (Fisch e outros, Bioconjugate Chem., 3: 147-153 (1992); Werlen e outros, Bioconju- gate Chem., 5: 411-417 (1994); Kumaran e outros, Protein Sei. 6(10): 2233- 2241 (1997); Itoh e outros, Bioorg. Chem., 24(1): 59-68 (1996); Capellas e outros, BiotechnoL Bioeng., 56(4): 456-463 (1997)) e os métodos descritos em Hermanson, G. T., Bioeonjugate Teehniques, Academic Press: San Die- go, CA (1996).

Composições de mimeticorpo de GLP-1 A presente invenção também proporciona uma composição de

pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada compreendendo pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos four, pelo menos cinco, pelo menos seis ou mais mimeticorpos ou porção ou variante especificada dos mesmos, conforme descrito aqui e/ou conforme conhecido na técnica, que são proporcionados em uma composi- ção, mistura ou forma que não ocorre naturalmente. Tais percentuais na composição são em peso, volume, concentração, molaridade ou molalidade como soluções líquidas ou secas, misturas, suspensão, emulsões ou colói- des, conforme conhecido na técnica ou conforme descrito aqui. Tais composições podem compreender 0,00001-99,9999 por

cento em peso, volume, concentração, molaridade ou molalidade como solu- ções líquidas, gasosas ou secas, misturas, suspensão, emulsões ou colói- des, conforme conhecido na técnica ou conforme descrito aqui ou qualquer faixa ou valor entre os mesmos tal como, mas não limitado a 0,00001, 0,00003, 0,00005, 0,00009, 0,0001, 0,0003, 0,0005, 0,0009, 0,001, 0,003, 0,005, 0,009, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4„ 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,3, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8, 99,9 %. Tais composições da presente invenção, assim, incluem, mas não estão limitadas a, 0,00001-100 mg/ml e/ou 0,00001-100 mg/g.

A composição pode, opcionalmente, ainda compreender uma quantidade eficaz de pelo menos um composto ou proteína selecionada de pelo menos um de um fármaco relacionado ao diabetes ou metabolismo de insulina, um fármaco anti-infectivo, um fármaco para o sistema cardiovascu- Iar (CV), um fármaco para o sistema nervoso central (CNS), um fármaco pa- ra o sistema nervoso autonômico (ANS), um fármaco para o trato respirató- rio, um fármaco para o trato gastrointestinal (Gl), um fármaco hormonal, um fármaco para o equilíbrio de fluido ou eletrólito, um fármaco hematológico, um antineoplásico, um fármaco para imunomodulação, um fármaco oftálmi- co, ótico ou nasal, um fármaco tópico, um fármaco nutricional ou semelhan- te. Tais fármacos são bem conhecidos na técnica, incluindo formulações, indicações, dosagem e administração para cada um apresentado aqui (veja, por exemplo, Nursing 2001 Handbook de Drugs, 21a edição, Springhouse Corp., Springhouse, PA, 2001; Health Professional's Drug Guide 2001, ed., Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, lnc, Upper Saddle River, NJ; Pharm- cotherapy Handbook, Wells e outros, ed., Appleton & Lange, Stamford, CT, cada um totalmente incorporado por referência aqui).

O fármaco relacionado ao diabetes pode ser pelo menos um de glitazonas, insulina e derivados, sulfoniluréias, meglitinidas, biguanidas, ini- bidores de alfa-glucosidase, fosfatase-1B de tirosina de proteína, quínase 3 de sintase de glicogênio, inibidores de gliconeogênese, inibidores de quina- 10

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se de dehidrogenase de piruvato (PDH), inibidores de lipólise, inibidores de oxidação de gordura, inibidores de palmitoil transferase de camitina I e/ou Il1 agonistas do beta-3 adrenoceptor, inibidores do cotransportador de sódio e glicose (SGLT) ou compostos que atuam sobre um ou mais de pelo menos um de: supressão autoimune, regulação imune, ativação, proliferação, mi- gração e/ou função de célula supressora de células T, inibição de interação de receptor de células T/peptídeo/MHC-ll, indução de anergia de células T1 deleção de células T autoreativas, redução do tráfego através da bar- reira sangue/cérebro, alteração do equilíbrio de citocinas pró-inflamatórias (Th1) e imunomodulatórias (Th2), inibição de inibidores da metaloprotease da matriz, neuroproteção, redução de gliose, promoção de remielinização.

O fármaco anti-infectivo pode ser pelo menos um selecionado de amebicidas ou antiprotozoários, anti-helmínticos, antifúngicos, antimalaria- nos, anti-tuberculolíticos ou antilepróticos, aminoglicosídeos, penicilinas, ce- falosporinas, tetraciclinas, sulfonamidas, fluoroquinolonas, antivirais, anti- infectivos de macrolídeo e anti-infectivos diversos. O fármaco CV pode ser pelo menos um selecionado de inotrópicos, antiarrítmicos, antianginais, anti- hipertensivos, antilipêmicos e fármacos cardiovasculares diversos. O fárma- co para o CNS pode ser pelo menos um selecionado de analgésicos não narcóticos ou pelo menos um selecionado de anti-piréticos, fármacos anti- inflamatórios não esteroidais, analgésicos narcóticos ou opióides, sedativos- hipnóticos, anticonvulsivos, antidepressivos, fármacos antiansiedade, antip- sicóticos, estimulantes do sistema nervoso central, antiparkinsonianos e fár- macos diversos para o sistema nervoso central. O fármaco para ANS pode ser pelo menos um selecionado de colinérgicos (parassimpatomiméticos), anticolinérgicos, adrenérgicos (simpatomiméticos), bloqueadores adrenérgi- cos (simpatolíticos), relaxantes do músculo esquelético e bloqueadores neu- romusculares. O fármaco para o trato respiratório pode ser pelo menos um selecionado de anti-histaminas, broncodilatadores, expectorantes ou antitus- sígenos e fármacos respiratórios diversos. O fármaco para o trato Gl pode ser pelo menos um selecionado de antiácidos, adsorventes, antiflatulentos, enzimas digestivas, solubilizantes de pedra na vesícula, antidiarreicos, Ia-

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25 xantes, antieméticos e fármacos antiúlcera. O fármaco hormonal pode ser pelo menos um selecionado de corticosteróides, androgênios, esteróides anabólicos, estrogênios, progestinas, gonadotrofinas, fármacos antidiabéti- cos, pelo menos um glucagon, hormônios da tiróide, antagonistas do hormô- nio da tiróide, hormônios da pituitária e fármacos semelhantes à paratireóide. O fármaco para equilíbrio de fluido e eletrólito pode ser pelo menos um sele- cionado de diuréticos, eletrólitos, soluções de reposição, acidificantes e alca- linizantes. O fármaco hematológico pode ser pelo menos um selecionado de hematínicos, anticoagulantes, derivados do sangue e enzimas trombolíticas. Os antineoplásicos podem ser pelo menos um selecionado de fármacos de alquilação, antimetabólitos, antineoplásicos de antibiótico, antineoplásicos que alteram o equilíbrio hormonal e antineoplásicos diversos. O fármaco pa- ra imunomodulação pode ser pelo menos um selecionado de imunossupres- sores, vacinas, toxóides, antitoxinas, antivenenos, soros imunes e modifica- dores da resposta biológica. Os fármacos oftálmico, ótico e nasal podem ser pelo menos um selecionado de anti-infectivos oftálmicos, anti-inflamatórios oftálmicos, mióticos, midriáticos, vasoconstritores oftálmicos e fármacos of- tálmicos, óticos e nasais diversos. O fármaco tópico pode ser pelo menos um selecionado de anti-infectivos locais, escabicidas, pediculicidas e corti- costeróides tóxicos. O fármaco nutricional pode ser pelo menos um selecio- nado de vitaminas, minerais e agentes calóricos. Veja, por exemplo, os con- teúdos de Nursing 2001 Drug Handbook, supra.

Pelo menos um amebicida ou antiprotozoário pode ser pelo me- nos um selecionado de atovaquona, cloridrato de cloroquina, fosfato de clo- roquina, metronidazol, cloridrato de metronidazol e isetionato de pentamidi- na. Pelo menos um anti-helmíntico pode ser pelo menos um selecionado de mebendazol, pamoato de pyrantel e tiabendazol. Pelo menos um antifúngico pode ser pelo menos um selecionado de anfotericina B, complexo de sulfato de colesterila/anfotericina B, complexo de lipídio B/anfotericina, anfotericina B lipossômica, fluconazol, flucitosina, griseofulvina em microtamanho, gri- seofulvina de ultra-microtamanho, itraconazol, cetoconazol, nistatina e clori- drato de terbinafina. Pelo menos um antimalariano pode ser pelo menos um selecionado de cloridrato de cloroquina, fosfato de cloroquina, doxiciclina, sulfato de hidróxicloroquina, cloridrato de mefloquina, fosfato de primaquina, pirimetamina e pirimetamina com sulfadoxina. Pelo menos um anti- tuberculolítico ou antileprótico pode ser pelo menos um selecionado de clo- fazimina, cicloserina, dapsona, cloridrato de etambutol, isoniazid, pirazinami- da, rifabutina, rifampina, rifapentina e sulfato de estreptomicina. Pelo menos um aminoglicosídeo pode ser pelo menos um selecionado de sulfato de ami- cacina, sulfato de gentamicina, sulfato de neomicina, sulfato de estreptomi- cina e sulfato de tobramicina. A pelo menos uma penicilina pode ser pelo menos uma selecionada de amoxicilina/clavulanato de potássio, trihidrato de amoxicilina, ampicilina, ampicilina sódica, trihidrato de ampicilina, ampicilina sódica/sulbactam sódico, cloxacilina sódica, dicloxacilina sódica, mezlocilina sódica, naficilina sódica, oxacilina sódica, penicilina G benzatina, penicilina G potássio, penicilina G procaína, penicilina G sódica, penicilina V potássio, piperacilina sódica, piperacilina sódica/tazobactama sódica, ticarcilina dissó- dica e ticarcilina dissódica/clavulanato de potássio. A pelo menos uma cefa- Iosporina pode ser pelo menos uma selecionada de pelo menos um de cefa- clor, cefadroxila, cefazolina sódica, cefdinir, cloridrato de cefepima, cefixima, cefmetazol sódico, cefonicid sódico, cefoperazona sódica, cefotaxima sódi- ca, cefotetan dissódico, cefoxitina sódica, cefpodoxima proxetila, cefprozila, ceftazidima, ceftibuteno, ceftizoxima sódica, ceftriaxona sódica, cefuroxima axetila, cefuroxima sódica, cloridrato de cefalexina, monohidrato de cefalexi- na, cefradina, loracarbef. Pelo menos uma tetraciclina pode ser pelo menos uma selecionada de cloridrato de demeclociclina, doxiciclina de cálcio, hicla- to de doxiciclina, cloridrato de doxiciclina, monohidrato de doxiciclina, clori- drato de minociclina, cloridrato de tetraciclina. A pelo menos uma sulfonami- da pode ser pelo menos uma selecionada de co-trimoxazol, sulfadiazina, sulfametoxazol, sulfisoxazol, acetil sulfisoxazol. A pelo menos uma fluoro- quinolona pode ser pelo menos uma selecionada de mesilato de alatrofloxa- cina, ciprofloxacina, enoxacina, levofloxacina, cloridrato de lomefloxacina, ácido nalidíxico, norfloxacina, ofloxacina, esparfloxacina, mesilato de trova- floxacina. Pelo menos um antiviral pode ser pelo menos um selecionado de sulfato de abacavir, aciclovir sódico, cloridrato de amantadina, amprenavir, cidofovir, mesilato de delavirdina, didanosina, efavirenz, famciclovir, fomivir- sen sódico, foscarnet sódico, ganciclovir, sulfato de indinavir, lamivudina, lamivudina/zidovudina, mesilato de nelfinavir, nevirapina, oseltamivir fosfato, ribavirina, cloridrato de rimantadina, ritonavir, saquinavir, mesilato de saqui- navir, estavudina, cloridrato de valaciclovir, zalcitabina, zanamivir, zidovudi- na. A pelo menos uma macrolina anti-infectiva pode ser pelo menos uma selecionada de azitromicina, claritromicina, diritromicina, base de eritromici- na, estolato de eritromicina, etil-succinato de eritromicina, Iactobionato de eritromicina, estearato de eritromicina. Pelo menos um anti-infectivo diverso pode ser pelo menos um selecionado de aztreonam, bacitracina, succinato de cloranfenicol sódico, cloridrato de clindamicina, cloridrato de palmitato de clindamicina, fosfato de clindamicina, imipenem e cilastatina sódica, mero- penem, macrocristais de nitrofurantoína, microcristais de nitrofurantoína, quinupristina/dalfopristina, cloridrato de espectinomicina, trimetoprim, clori- drato de vancomicina (veja, por exemplo, páginas 24-214 de Nursing 2001 Drug Handbook).

Pelo menos um inotrópico pode ser pelo menos um selecionado de Iactato de amrinona, digoxina, Iactato de milrinona. Pelo menos um anti- arrítmico pode ser pelo menos um selecionado de adenosina, cloridrato de amiodarona, sulfato de atropina, tosilato de bretílio, cloridrato de diltiazem, disopiramida, disopiramida fosfato, cloridrato de esmolol, acetato de flecaini- da, fumarato de ibutilida, cloridrato de lidocaína, cloridrato de mexiletina, clo- ridrato de moricizina, fenitoína, fenitoína sódica, cloridrato de procainamida, cloridrato de propafenona, cloridrato de propranolol, bissulfato de quinidina, gluconato de quinidina, poligalacturonato de quinidina, sulfato de quinidina, sotalol, cloridrato de tocainida, cloridrato de verapamila. Pelo menos um an- tianginal pode ser pelo menos um selecionado de besilato de amlodipidina, nitrito de amila, cloridrato de bepridila, cloridrato de diltiazem, dinitrato de isosorbeto, mononitrato de isosorbeto, nadolol, cloridrato de nicardipina, ni- fedipina, nitroglicerina, cloridrato de propranolol, verapamila, cloridrato de verapamila. Pelo menos um anti-hipertensivo pode ser pelo menos um sele- cionado de cloridrato de acebutolol, besilato de amlodipina, atenolol, cloridra- to de benazepriia, cloridrato de betaxolol, fumarato de bisoprolol, candesar- tan cilexetila, captopril, cloridrato de carteolol, carvedilol, clonidina, cloridrato de clonidina, diazoxida, cloridrato de diltiazem, mesilato de doxazosina, ena- laprilat, maleato de enalaprila, mesilato de eprosartan, felodipina, mesilato de fenoldopam, fosinoprila sódica, acetato de guanabenz, sulfato de guana- drel, cloridrato de guanfacina, cloridrato de hidralazina, irbesartan, isradipina, cloridrato de labetalol, lisinopril, Iosartano de potássio, metildopa, cloridrato de metildopato, succinato de metoprolol, tartarato de metoprolol, minoxidila, cloridrato de moexiprila, nadolol, cloridrato de nicardipina, nifedipina, nisoldi- pina, nitroprussida sódica, sulfato de penbutolol, perindopril erbumina, mesi- lato de fentolamina, pindolol, cloridrato de prazosina, cloridrato de proprano- Iol1 cloridrato de quinaprila, ramipril, telmisartan, cloridrato de terazosina, ma- leato de timolol, trandolapril, valsartano, cloridrato de verapamila. Pelo me· nos um antilipêmico pode ser pelo menos um selecionado de atorvastatina de cálcio, cerivastatina sódica, colestiramina, cloridrato de colestipol, fenofi- brato (micronized), fluvastatina sódica, gemfibrozila, lovastatina, niacina, pravastatina sódica, simvastatina. Pelo menos um fármaco CV diverso pode ser pelo menos um selecionado de abciximab, alprostadil, cloridrato de arbu- tamina, cilostazol, bissulfato de clopidogrel, dipiridamol, eptifibatida, cloridra- to de midodrina, pentoxifilina, cloridrato de ticlopidina, cloridrato de tirofiban (veja, por exemplo, páginas 215-336 de Nursing 2001 Drug Handbook).

Pelo menos um analgésico não narcótico ou anti-pirético pode ser pelo menos um selecionado de acetaminofeno, aspirina, trissalicilato de magnésio de colina, diflunisal, salicilato de magnésio. Pelo menos um fár- maco anti-inflamatório não esteroidal pode ser pelo menos um selecionado de celecoxib, diclofenaco de potássio, diclofenaco sódio, etodolac, fenopro- fen cálcio, flurbiprofen, ibuprofen, indometacina, trihidrato de sódio de indo- metacina, cetoprofeno, cetorolac trometamina, nabumetona, naproxeno, na- proxeno sódico, oxaprozina, piroxicam, rofecoxib, sulindac. Pelo menos um narcótico ou analgésicos opióides pode ser pelo menos um selecionado de cloridrato de alfentanila, cloridrato de buprenorfina, acetato de butorfanol, fosfato de codeína, sulfato de codeína, citrato de fentanila, sistema trans- dérmico de fentanila, fentanila transmucosal, cloridrato de hidromorfona, clo- ridrato de meperidina, cloridrato de metadona, cloridrato de morfina, sulfato de morfina, tartarato de morfina, cloridrato de nalbufina, cloridrato de oxico- dona, pectinato de oxicodona, cloridrato de oximorfona, cloridrato de penta- zocina, cloridrato de pentazocina e cloridrato de naloxona, Iactato de penta- zocina, cloridrato de propoxifeno, napsilato de propoxifeno, cloridrato de re- mifentanila, citrato de sufentanila, cloridrato de tramadol. Pelo menos um sedativo-hipnótico pode ser pelo menos um selecionado de hidrato de cloral, estazolam, cloridrato de flurazepam, pentobarbital, pentobarbital sódico, fe- nobarbital sódico, secobarbital sódico, temazepam, triazolam, zaleplon, tarta- rato de zolpidem. Pelo menos um anticonvulsivo pode ser pelo menos um selecionado de acetazolamida sódica, carbamazepina, clonazepam, clora- zepato dipotássio, diazepam, divalproex sódico, etosuximida, fosfenitoína sódica, gabapentina, lamotrigina, sulfato de magnésio, fenobarbital, fenobar- bital sódico, fenitoína, fenitoína sódica, fenitoína sódica (estendida), primido- na, cloridrato de tiagabina, topiramato, valproato sódico, ácido valpróico. Pe- lo menos um antidepressivo pode ser pelo menos um selecionado de clori- drato de amitriptilina, pamoato de amitriptilina, amoxapina, cloridrato de bu- propion, cloridrato de citalopram, cloridrato de clomipramina, cloridrato de desipramina, cloridrato de doxepina, cloridrato de fluoxetina, cloridrato de imipramina, pamoato de imipramina, mirtazapina, cloridrato de nefazodona, cloridrato de nortriptilina, cloridrato de paroxetina, sulfato de fenelzina, clori- drato de sertralina, sulfato de tranilcipromina, maleato de trimipramina, clori- drato de venlafaxina. Pelo menos um fármaco antiansiedade pode ser pelo menos um selecionado de alprazolam, cloridrato de buspirona, clordiazóxido, cloridrato de clordiazóxido, clorazepato dipotássio, diazepam, cloridrato de doxepina, embonato de hidroxizina, cloridrato de hidroxizima, pamoato de hidroxizina, lorazepam, mefrobamato, cloridrato de midazolam, oxazepam. Pelo menos um fármaco antipsicótico pode ser pelo menos um selecionado de cloridrato de clorpromazina, clozapina, decanoato de flufenazina, enanta- to de flufenazina, cloridrato de flufenazina, haloperidol, decanoato de halope- ridol, Iactato de haloperidol, cloridrato de loxapina, succinato de loxapina, besilato de mesoridazina, cloridrato de molindona, olanzapina, perfenazina, pimozida, proclorperazina, fumarato de quetiapina, risperidona cloridrato de tioridazina, tiotixeno, cloridrato de tiotixeno, cloridrato de trifluoperazina. Pelo menos um estimulante do sistema nervoso central pode ser pelo menos um selecionado de sulfato de anfetamina, cafeína, sulfato de dextroanfetamina, cloridrato de doxapram, cloridrato de metanfetamina, cloridrato de metilfeni- dato, modafinil, pemolina, cloridrato de fentermina. Pelo menos um antipar- kinsoniano pode ser pelo menos um selecionado de cloridrato de amantadi- na, mesilato de benztropina, cloridrato de biperiden, Iactato de biperiden, mesilato de bromocriptina, carbidopa-levodopa, entacapona, levodopa, mesi- lato de pergolida, dihidrocloreto de pramipexola, cloridrato de ropinirola, clo- ridrato de selegilina, tolcapona, cloridrato de trihexifenidila. Pelo menos um fármaco diverso para o sistema nervoso central pode ser pelo menos um selecionado de cloridrato de bupropion, cloridrato de donepezil, droperidol, maleato de fluvoxamina, carbonato de lítio, citrato de lítio, cloridrato de nara- triptan, nicotina polacrilex, sistema transdérmico de nicotina, propofol, ben- zoato de rizatriptan, monohidrato de cloridrato de sibutramina, succinato de sumatriptan, cloridrato de tacrina, zolmitriptan (veja, por exemplo, páginas 337-530 de Nursing 2001 Drug Handbook).

Pelo menos um colinérgico (por exemplo, parassimpatomiméti- co) pode ser pelo menos um selecionado de cloreto de betanecol, cloreto de edrofônio, brometo de neostigmina, metil-sulfato de neostigmina, salicilato de fisostigmina, brometo de piridostigmina. Pelo menos um anticolinérgico pode ser pelo menos um selecionado de sulfato de atropina, cloridrato de diciclo- mina, glicopirrolato, hiosciamina, sulfato de hiosciamina, brometo de propan- telina, escopolamina, butilbrometo de escopolamina, hidrobrometo de esco- polamina. Pelo menos um adrenérgico (simpatomimético) pode ser pelo me- nos um selecionado de cloridrato de dobutamin, cloridrato de dopamina, bi- tartarato de metaraminol, bitartarato de norepinefrina, cloridrato de fenilefri- na, cloridrato de pseudoefedrina, sulfato de pseudoefedrina. Pelo menos um bloqueador adrenérgico (simpatolítico) pode ser pelo menos um selecionado de mesilato de dihidroergotamina, tartarato de ergotamina, maleato de metil- sergida, cloridrato de propranolol. Pelo menos um relaxante do musuclo es- quelético pode ser pelo menos um selecionado de baclofen, carisoprodol, clorzoxazona, cloridrato de ciclobenzaprina, dantroleno sódico, metocarba- mol, cloridrato de tizanidina. Pelo menos um bloqueador neuromuscular po- de ser pelo menos um selecionado de besilato de atracúrio, besilato de cisa- tracúrio, cloreto de doxacúrio, cloreto de mivacúrio, brometo de pancurônio, brometo de pipecurônio, brometo de rapacurônio, brometo de rocurônio, clo- reto de succinilcolina, cloreto de tubocurarina, brometo de vecurônio (veja, por exemplo, páginas 531 -84 de Nursing 2001 Drug Handbook).

Pelo menos uma anti-histamina pode ser pelo menos uma sele- cionada de maleato de bromfeniramina, cloridrato de cetirizina, maleato de clorfeniramina, fumarato de clemastina, cloridrato de ciproheptadina, clori- drato de difenidramina, cloridrato de fexofenadina, loratadina, cloridrato de prometazina, teoclato de prometazina, cloridrato de triprolidina. Pelo menos um broncodilatador pode ser pelo menos um selecionado de albuterol, sulfa- to de albuterol, aminofilina, sulfato de atropina, sulfato de efedrina, epinefri- na, bitartarato de epinefrina, cloridrato de epinefrina, brometo de ipratrópio, isoproterenol, cloridrato de isoproterenol, sulfato de isoproterenol, cloridrato de levalbuterol, sulfato de metaproterenol, oxtrifilina, acetato de pirbuterol, xinafoato de salmeterol, sulfato de terbutalina, teofilina. Pelo menos um ex- pectorante ou antitussígeno pode ser pelo menos um selecionado de benzo- natato, fosfato de codeína, sulfato de codeína, hidrobrometo de dextrametor- fano, cloridrato de difenidramina, guaifenesina, cloridrato de hidromorfona. Pelo menos um fármaco respiratório diverso pode ser pelo menos um sele- cionado de acetilcisteína, dipropionato de beclometasona, beractant, bude- sonida, calfactant, cromolyn sódico, dornase alfa, prostenol sódico, flunisoli- da, propionato de fluticasona, montelukast sódico, nedocromil sódico, palivi- zumab, triamcinolona acetonida, zafirlukast, zileuton (veja, por exemplo, pá- ginas 585-642 de Nursing 2001 Drug Handbook).

Pelo menos um antiácido, adsorvente ou anti-flatulento pode ser pelo menos um selecionado de carbonato de alumínio, hidróxido de alumí- nio, carbonato de cálcio, magaldrato, hidróxido de magnésio, oxido de mag- nésio, simeticona e bicarbonato de sódio. Pelo menos uma enzima digestiva ou solubilizante de pedra na vesícula pode ser pelo menos um selecionado de pancreatina, pancrelipase e ursodiol. Pelo menos um antidiarreico pode ser pelo menos um selecionado de atapulgita, subsalicilato de bismuto, poli- carbófilo de cálcio, cloridrato de difenoxilato ou sulfato de atropina, Ioperami- da, acetato de octreotida, citrato de ópio, tintura de ópio (canforada). Pelo menos um laxante pode ser pelo menos um selecionado de bisocodila, poli- carbófilo de cálcio, cascara sagrada, extrato de fluido aromático de cascara sagrada, extrato de fluido de cascara sagrada, óleo de mamona, docusato cálcio, ducusato sódico, glicerina, lactulose, citrato de magnésio, hidróxido de magnésio, sulfato de magnésio, metilcelulose, óleo mineral, polietileno glicol ou solução de eletrólito, psyllium, senna, fosfatos sódicos. Pelo menos um antiemético pode ser pelo menos um selecionado de cloridrato de clor- promazina, dimenidrinato, mesilato de dolasetron, dronabinol, cloridrato de granisetron, cloridrato de meclizina, cloridrato de metocloproamida, cloridrato de ondansetron, perfenazina, proclorperazina, edisilato de proclorperazina, maleato de proclorperazina, cloridrato de prometazina, escopolamina, ma· Ieato de tietilperazina, cloridrato de trimetobenzamida. Pelo menos um fár- maco antiúlcera pode ser pelo menos um selecionado de cimetidina, clori- drato de cimetidina, famotidina, lansoprazol, misoprostol, nizatidina, omepra- zol, rabeprozola sódica, citrato de bismuto de ranitidina, cloridrato de raniti- dina, sucralfato (veja, por exemplo, páginas 643-95 de Nursing 2001 Drug Handbook).

Pelo menos um corticosteróide pode ser pelo menos um sele-

cionado de betametasona, acetato de betametasona ou fosfato de sódio de betametasona, fosfato de sódio de betametasona, acetato de cortisona, de- xametasona, acetato de dexametasona, fosfato de sódio de dexametasona, acetato de fludrocortisona, hidrocortisona, acetato de hidrocortisona, cipiona- to de hidrocortisona, fosfato de sódio de hidrocortisona, succinato de sódio de hidrocortisona, metilprednisolona, acetato de metilprednisolona, succinato de sódio de metilprednisolona, prednisolona, acetato de prednisolona, fosfa- to de sódio de prednisolona, tebutato de prednisolona, prednisona, triamci- nolona, acetonida de triamcinolona, diacetato de triamcinolona. Pelo menos um androgênio ou esteróide anabólico pode ser pelo menos um selecionado de danazol, fluoximesterona, metiltestosterona, decanoato de nandrolona, fenpropionato de nandrolona, testosterona, cipionato de testosterona, enan- tato de testosterona, propionato de testosterona, sistema transdérmico de testosterona. Pelo menos um estrogênio ou progestina pode ser pelo menos um selecionado de estrogênios esterificados, estradiol, cipionato de estra- diol, sistema transdérmico de estradiol/acetato de noretindrona, valerato de estradiol, estrogênios (conjugados), estropipato, etinil estradiol, etinil estra- diol e desogestrel, etinil estradiol e diacetato de etinodiol, etinil estradiol e desogestrel, etinil estradiol e diacetato de etinodiol, etinil estradiol e Ievonor- gestrel, etinil estradiol e noretindrona, etinil estradiol e acetato de noretindro- na, etinil estradiol e norgestimato, etinil estradiol e norgestrel, etinil estradiol e noretindrona e acetato e fumarato ferroso, levonorgestrel, acetato de me- droxiprogesterona, mestranol e noretindron, noretindrona, acetato de nore- tindrona, norgestrel, progesterona. Pelo menos uma gonadroptropina pode ser pelo menos uma selecionada de acetato de ganirelix, acetato de gonado- relina, acetato de histrelina, menotropinas. Pelo menos um antidiabético ou glucagon pode ser pelo menos um selecionado de acarbose, clorpropamida, glimepirida, glipizida, glucagon, gliburida, insulinas, cloridrato de metformina, miglitol, cloridrato de pioglitazona, repaglinida, maleato de rosiglitazona, tro- glitazona. Pelo menos um hormônio da tiróide pode ser pelo menos um sele- cionado de Ievotiroxina sódica, Iiotironina sódica, liotrix, tiróide. Pelo menos um antagonista de hormônio da tiróide pode ser pelo menos um selecionado de metimazol, iodeto de potássio, iodeto de potássio (solução saturada), propiltiouracila, iodo radioativo (iodeto de sódio 131I), solução de iodo forte. Pelo menos um hormônio da pituitária pode ser pelo menos um selecionado de corticotropina, cosintropina, acetato de desmofressina, acetato de Ieupro- lida, corticotropina repositória, somatrem, somatropina, vasopressina. Pelo menos um fármaco semelhante à paratireóide pode ser pelo menos um se- lecionado de calcifediol, calcitonina (humana), calcitonina (salmão), calcitriol, dihidrotacisterol, etidronato dissódico (veja, por exemplo, páginas 696-796 de Nursing 2001 Drug Handbook).

Pelo menos um diurético pode ser pelo menos um selecionado de acetazolamida, acetazolamida sódica, cloridrato de amilorida, bumetani- da, clortalidona, etacrinato sódico, ácido etacrínico, furosemida, hidrocloroti- azida, indapamida, manitol, metolazona, espironolactona, torsemida, triamte- reno, uréia. Pelo menos um eletrólito ou solução de reposição pode ser pelo menos um selecionado de acetato de cálcio, carbonato de cálcio, cloreto de cálcio, citrato de cálcio, glubionato de cálcio, gluceptato de cálcio, gluconato de cálcio, Iactato de cálcio, fosfato de cálcio (dibásico), fosfato de cálcio (tri- básico), dextrana (elevado peso molecular), dextrana (baixo peso molecu- lar), hetastarch, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio, acetato de potás- sio, bicarbonato de potássio, cloreto de potássio, gluconato de potássio, in- jeção de Ringer, injeção de Ringer (lactada), cloreto de sódio. Pelo menos um acidificante ou alcalinizante pode ser pelo menos um selecionado de bi- carbonato de sódio, Iactato de sódio, trometamina (veja, por exemplo, pági- nas 797-833 de Nursing 2001 Drug Handbook).

Pelo menos um hematínico pode ser pelo menos um seleciona- do de fumarato ferroso, gluconato ferroso, sulfato ferroso, sulfato ferroso (seco), dextrana de ferro, sorbitol de ferro, complexo de polissacarídeo-ferro, complexo de gluconato férrico-sódio. Pelo menos um anticoagulante pode ser pelo menos um selecionado de ardeparina sódica, dalteparina sódica, danaparóide sódico, enoxaparina sódica, heparina de cálcio, heparina sódi- ca, warfarina sódica. Pelo menos um derivado do sangue pode ser pelo me- nos um selecionado de albumina a 5%, albumina a 25%, fator anti- hemofílico, complexo anticoagulante inibidor, antitrombina Ill (humana), fator IX (humano), complexo de fator IX, frações de proteína plasmática. Pelo me- nos uma enzima trombolítica pode ser pelo menos uma selecionada de alte- plase, anistreplase, reteplase (recombinante), estreptoquínase, uroquínase (veja, por exemplo, páginas 834-66 de Nursing 2001 Drug Handbook).

Pelo menos um fármaco de alquilação pode ser pelo menos um selecionado de busulfan, carboplatina, carmustina, clorambucila, cisplatina, ciclofosfamida, ifosfamida, lomustina, cloridrato de mecloretamina, melpha- lan, cloridrato de melphalan, estreptozocina, temozolomida, tiotepa. Pelo menos um antimetabólito pode ser pelo menos um selecionado de capecita- bina, cladribina, citarabina, floxuridina, fosfato de fludarabina, fluorouracila, hidroxiuréia, mercaptopurina, metotrexato, metotrexato sódico. Pelo menos um antineoplásico de antibiótico pode ser pelo menos um selecionado de sulfato de bleomicina, dactinomicina, citrato de daunorrubicina lipossômico, cloridrato de daunorubicina, cloridrato de doxorrubicina, cloridrato de doxor- rubicina lipossômico, cloridrato de epirrubicina, cloridrato de idarrubicina, mitomicina, pentostatina, plicamicina, valrubicina. Pelo menos um antineo- plásico que altera o equilíbrio hormonal pode ser pelo menos um seleciona- do de anastrozol, bicalutamida, fosfato de sódio de estramustina, exemesta- no, flutamida, acetato de goserelina, letrozol, acetato de leuprolida, acetato de megestrol, nilutamida, citrato de tamoxifeno, testolactona, citrato de tore- mifeno. Pelo menos um antineoplásico diverso pode ser pelo menos um se- lecionado de asparaginase, bacillus de Calmette-Guerin (BCG) (vivo intrave- sical), dacarbazina, docetaxel, etoposídeo, fosfato de etoposídeo, cloridrato de gemcitabina, cloridrato de irinotecan, mitotano, cloridrato de mitoxantrona, paclitaxel, pegaspargase, porfímero sódico, cloridrato de procarbazina, ritu- ximab, teniposídeo, cloridrato de topotecan, trastuzumab, tretinoína, sulfato de vinblastina, sulfato de vincristina, tartarato de vinorelbina (veja, por exem- plo, páginas 867-963 de Nursing 2001 Drug Handbook).

Pelo menos um imunossupressor pode ser pelo menos um sele- cionado de azatioprina, basiliximab, ciclosporina, daclizumab, globulina imu- ne de linfócito, muromonab-CD3, micofenolato de mofetila, cloridrato de mi- cofenolato de mofetila, sirolimus, tacrolimus. Pelo menos uma vacina ou to- xóide pode ser pelo menos um selecionado de vacina BCG1 vacina do cóle- ra, difteria e toxóides do tétano (adsorvido), difteria e toxóides do tétano e vacina pertussis acelular adsorvida, difteria e toxóides do tétano e vacina pertussis de célula inteira, vacinas conjugadas de Haemophilius b, vacina contra hepatite A (inativada), vacina contra hepatite B (recombinante), vacina contra o vírus da gripe 1999-2000 trivalente dos tipos A & B (antígeno super- fície-purificado), vacina contra o vírus da gripe 1999-2000 trivalente dos tipos A & B (subvirion ou subvirion purificado), vacina contra o vírus da gripe 1999-2000 trivalente dos tipos A & B (virion inteiro), vacina contra o vírus da encefalite Japonesa (inativada), vacina contra doença de Lyme (OspA re- combinante), vacina contra o vírus do sarampo e catapora e rubéola (viva), vacina contra o vírus do sarampo e catapora e rubéola (viva atenuada), va- cina contra o vírus do sarampo (viva atenuada), vacina de polissacarídeo meningocócico, vacina contra o vírus da catapora (viva), vacina de plague, vacina pneumocócica (polivalente), vacina contra poliovírus (inativada), vaci- na contra poliovírus (viva, oral, trivalente), vacina contra raiva (adsorvida), vacina contra raiva (célula diplóide humana), vacina contra o vírus da rubéo- la e catapora (viva), vacina contra o vírus da rubéola (viva, atenuada), toxói- de do tétano (adsorvido), toxóide do tétano (fluido), vacina tifóide (oral), va- cina tifóide (parenteral), vacina de polissacarídeo tifóide Vi, vacina do vírus da varicela, vacina contra febre amarela. Pelo menos um agente antitoxina ou antiveneno pode ser pelo menos um selecionado de antiveneno de ara- nha da pata preta, antiveneno de Crotalidae (polivalente), antitoxina de difte- ria (eqüina), antiveneno de Micrurus fulvius. Pelo menos um soro imune po- de ser pelo menos um selecionado de globulina imune de citomegalovírus (intravenosa), globulina imune de hepatite B (humana), globulina imune in- tramuscular, globulina imune intravenosa, globulina imune de raiva (huma- na), globulina imune do vírus sincicial respiratório intravenosa (humana), globulina imune Rh0(D) (humana), globulina imune Rh0(D) intravenosa (hu- mana), globulina imune do tétano (humana), globulina imune de varicela- zoster. Pelo menos um modificador de resposta biológica pode ser pelo me- nos um selecionado de aldesleucina, GLP-Ietina alfa, filgrastim, acetato de glatirâmero para injeção, interferon alfacon-1, interferon alfa-2a (recombinan- te), interferon alfa-2b (recombinante), interferon beta-1a, interferon beta-1b (recombinante), interferon gama-1b, cloridrato de levamisola, oprelvequina, sargramostima (veja, por exemplo, páginas 964-1040 de Nursing 2001 Drug Handbook).

Pelo menos um anti-infectivo oftálmico pode ser selecionado de bacitracina, cloranfenicol, cloridrato de ciprofloxacina, eritromicina, sulfato de gentamicina, ofloxacina a 0,3%, sulfato de polimixina B, sulfacetamida sódi- ca a 10%, sulfacetamida sódica a 15%, sulfacetamida sódica a 30%, tobra- micina, vidarabina. Pelo menos um anti-inflamatório oftálmico pode ser pelo menos um selecionado de dexametasona, fosfato de sódio de dexametaso- na, diclofenaco sódico a 0,1%, fluorometolona, fIurbiprofeno sódico, trome- tamina de cetorolac, acetato de prednisolona (suspensão), fosfato de sódio de prednisolona (solução). Pelo menos um miótico pode ser pelo menos um selecionado de cloreto de acetilcolina, carbacol (intra-ocular), carbacol (tópi- co), iodeto de ecotiofato, pilocarpina, cloridrato de pilocarpina, nitrato de pi- locarpina. Pelo menos um midriático pode ser pelo menos um selecionado de sulfato de atropina, cloridrato de ciclopentolato, cloridrato de epinefrina, borato de epinefrila, hidrobrometo de homatropina, cloridrato de fenilefrina, hidrobrometo de escopolamina, tropicamida. Pelo menos um vasoconstritor oftálmico pode ser pelo menos um selecionado de cloridrato de nafazolina, cloridrato de oximetazolina, cloridrato de tetrahidrozolina. Pelo menos um oftálmico diverso pode ser pelo menos um selecionado de cloridrato de a- praclonidina, cloridrato de betaxolol, tartarato de brimonidina, cloridrato de carteolol, cloridrato de dipivefrina, cloridrato de dorzolamida, difumarato de emedastina, fluoresceína sódica, fumarato de cetotifeno, latanoprost, clori- drato de levobunolol, cloridrato de metipranolol, cloreto de sódio (hipertôni- co), maleato de timolol. Pelo menos um agente ótico pode ser pelo menos um selecionado de ácido bórico, peróxido de carbamida, cloranfenicol, con- densado de oleato-polipeptídeo-trietanolamina. Pelo menos um fármaco na- sal pode ser pelo menos um selecionado de dipropionato de beclometasona, budesonida, sulfato de efedrina, cloridrato de epinefrina, flunisolida, propio- nato de fluticasona, cloridrato de nafazolina, cloridrato de oximetazolina, clo- ridrato de fenilefrina, cloridrato de tetrahidrozolina, acetonida de triamcinolo- na, cloridrato de xilometazolina (veja, por exemplo, páginas 1041-97 de Nur- sing 2001 Drug Handbook).

Pelo menos um anti-infectivo local pode ser pelo menos um se- lecionado de aciclovir, anfotericina B, creme de ácido azelaico, bacitracina, nitrato de butoconazol, fosfato de clindamicina, clotrimazol, nitrato de econa- zol, eritromicina, sulfato de gentamicina, cetoconazol, acetato de mafenida, metronidazol (tópica), nitrato de miconazol, mupirocina, cloridrato de naftifi- na, sulfato de neomicina, nitrofurazona, nistatina, sulfadiazina de prata, clori- drato de terbinafina, terconazol, cloridrato de tetraciclina, tioconazol, tolnafta- to. Pelo menos um escabicida ou pediculicida pode ser pelo menos um sele- cionado de crotamiton, lindano, permetrina e piretrinas. Pelo menos um cor- ticosteróide tópico pode ser pelo menos um selecionado de dipropionato de betametasona, valerato de betametasona, propionato de clobetasol, desoni- da, desoximetasona, dexametasona, fosfato de sódio de dexametasona, di- acetato de diflorasona, acetonida de fluocinolona, fluocinonida, flurandrenoli- da, propionato de fluticasona, halcionida, hidrocortisona, acetato de hidrocor- tisona, butirato de hidrocortisona, valerato de hidrocortisona, furoato de mo- metasona, acetonida de triamcinolona (veja, por exemplo, páginas 1098- 1136 de Nursing 2001 Drug Handbook).

Pelo menos uma vitamina ou mineral pode ser pelo menos um selecionado de vitamina A, vitamina do complexo B, cianocobalamina, ácido fólico, hidroxocobalamina, Ieucovorina de cálcio, niacina, niacinamida, clori- drato de piridoxina, riboflavina, cloridrato de tiamina, vitamina C, vitamina D, colecalciferol, ergocalciferol, análogo de vitamina D, doxercalciferol, parical- citol, vitamina E, análogo de vitamina K, fitonadiona, fluoreto de sódio, fluore- to de sódio (tópico), elementos vestigiais, cromo, cobre, iodo, manganês, selênio, zinco. Pelo menos um agente calórico pode ser pelo menos um se- lecionado de infusões de aminoácido (cristalino), infusões de aminoácido em dextrose, infusões de aminoácido com eletrólitos, infusões de aminoácido com eletrólitos em dextrose, infusões de aminoácido para insuficiência hepá- tica, infusões de aminoácido para alto estresse metabólico, infusões de ami- noácido para insuficiência renal, dextrose, emulsões de gordura, triglicerí- deos de cadeia média (veja, por exemplo, páginas 1137-63 de Nursing 2001 Drug Handbook).

A presente invenção também proporciona pelo menos um de qualquer quantidade adequada e/ou eficaz de uma composição ou composi- 10

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ção farmacêutica compreendendo pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada, opcionalmente ainda compreendendo uma quantidade eficaz de pelo menos um outro composto, proteína ou composi- ção selecionada de pelo menos um antagonista de TNF (por exemplo, mas não limitado a, um antagonista de proteína ou químico de TNF, anticorpo monoclonal ou policlonal ao TNF ou fragmento, um receptor de TNF solúvel (por exemplo, p55, p70 ou p85) ou fragmento, polipeptídeos de fusão dos mesmos ou um antagonista de TNF de pequena molécula, por exemplo, pro- teína de ligação a TNF I ou Il (TBP-1 ou TBP-II), nerelimonmab, infliximab, enteracept, CDP-571, CDP-870, afelimomab, Ienercept e semelhantes), um antirreumático (por exemplo, metotrexato, auranofina, aurotioglicose, azatio- prina, etanercept, tiomalato de sódio de ouro, sulfato de hidróxicloroquina, Ieflunomida1 sulfasalzina), um relaxante muscular, um narcótico, um fármaco inflamatório não esteroidal (NSAID), um analgésico, um anestésico, um se- dativo, um anestésico local, um bloqueador neuromuscular, um antimicrobi- ano (por exemplo, aminoglicosídeo, um antifungico, um antiparasítico, um antiviral, um carbapenem, cefalosporina, uma flurorquinolona, um macrolí- deo, uma penicilina, uma sulfonamida, uma tetraciclina, outro antimicrobia- no), um antipsoriático, um corticosteróide, um esteróide anabólico, um agen- te relacionado ao diabetes, um mineral, um nutricional, um agente para tirói- de, uma vitamina, um hormônio relacionado ao cálcio, um antidiarreico, um antitussígeno, um antiemético, um antiúlcera, um laxante, um anticoagulan- te, uma eritropoietina (por exemplo, epoetina alfa), um filgrastim (por exem- plo, G-CSF, Neupogen), um sargramostim (GM-CSF, Leucina), uma imuni- zação, uma imunoglobulina, um imunossupressor (por exemplo, basiliximab, ciclosporina, daclizumab), um hormônio de crescimento, um fármaco de re- posição hormonal, um modulador do receptor de estrogênio, um midriático, um cicloplégico, um agente de alquilação, um antimetabólito, um inibidor mi- tótico, um radiofarmacêutico, um antidepressivo, um agente antimaníaco, um antipsicótico, um anxiolítico, um hipnótico, um simpatomimético, um estimu- lante, donepezil, tacrina, uma medicação para asma, um beta agonista, um esteróide inalado, um inibidor de leucotrieno, uma metilxantina, um cromolin,

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25 uma epinefrina ou análogo, dornase alfa (PuImozyme)1 uma citocina ou um antagonista de citocina. Exemplos não Iimitativos de tais citocinas incluem, mas não estão limitados a, qualquer uma de IL-1 a IL-23. Dosagens ade- quadas são bem conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Wells e outros, eds., Pharmacotherapy Handbook1 2â Edição, Appleton and Lange1 Stam- ford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition1 Tarascon Publishing1 Loma Linda, CA (2000), cada um dos quais são totalmente incorporados aqui por referência.

Tais composições também podem incluir moléculas de toxina que estão associadas, ligadas, coformuladas ou co-administradas com pelo menos um anticorpo ou polipeptídeo da presente invenção. A toxina pode opcionalmente atuar para matar seletivamente a célula ou tecido patológico. A célula patológica pode ser um câncer ou outra célula. Tais toxinas podem ser, mas não estão limitadas a, toxina purificada ou recombinante ou frag- mento de toxina compreendendo pelo menos um domínio citotóxico funcio- nal de toxina, por exemplo, selecionado de pelo menos um de ricina, toxina de difteria, uma toxina de veneno ou uma toxina bacteriana. O termo toxina também inclui endotoxinas e exotoxinas produzidas por qualquer bactéria ou vírus que ocorre naturalmente, mutante ou recombinante os quais podem causar qualquer condição patológica em seres humanos e outros mamíferos, incluindo choque por toxina, a qual pode resultar em morte. Tais toxinas po- dem incluir, mas não estão limitadas a, enterotoxina sensível ao calor ente- rotoxigênica de E. coli (LT), enterotoxina estável ao calor (ST), citotoxina de Shigella, enterotoxinas de Aeromonas, toxina-1 de síndrome de choque tóxi- co (TSST-1), enterotoxina A (SEA)1 B (SEB) ou C (SEC) estafilocócica, ente- rotoxinas estreptocócicas e semelhantes. Tais bactérias incluem, mas não estão limitadas a, cepas de uma espécie de E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli entero-hemorrágica (por exemplo, cepas do sorotipo 0157:H7), espé- cies de Staphylococcus (por exemplo, Staphylococcus aureus, Staphylococ- eus pyogenes), espécies Shigella (por exemplo, Shigella dysenteriae, Shigel- la flexneri, Shigella boydii e Shigella sonnei), espécies Salmonella (por e- xemplo, Salmonella typhi, Salmonella cholera-suis, Salmonella enteritidis), 10

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espécies Clostridium (por exemplo, Clostridium perfringens, Clostridium difi- cile, Clostridium botulinum), espécies Camphlobacter (por exemplo, Camp- hlobacter jejuni, Camphlobacter fetus), espécies Heliobacter (por exemplo, Heliobacter pylori), espécies Aeromonas (por exemplo, Aeromonas sóbria, Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae), Pleisomonas shigelloides, Yer- sina enterocolitica, espécies Vibrios (por exemplo, Vibrios cholerae, Vibrios parahemolyticus), espécies Klebsiella, Pseudomonas aeruginosa e Strepto- cocci. Veja, por exemplo, Stein, ed., INTERNAL MEDICINE, 3ã ed., páginas 1-13, Little, Brown and Co., Boston, (1990); Evans e outros, eds., Bacterial Infections of Humans: Epidemiology and Contrai, Ed., páginas 239-254, Plenum Medicai Book Co., New York (1991); Mandell e outros, Principies and Practice of Infectious Diseases, 3* Ed., Churchill Livingstone, New York (1990); Berkow e outros, eds., The Merck Manual, 16* edição, Merck and Co., Rahway, N.J., 1992; Wood e outros, FEMS Microbiology Immunology, 76: 121-134 (1991); Marrack e outros, Science, 248: 705-711 (1990), os con- teúdos dos quais são incorporados totalmente aqui por referência.

Composições de mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada da presente invenção podem ainda compreender pelo menos um de qualquer auxiliar adequado tal como, mas não limitado a, diluente, aglutinante, estabilizante, tampões, sais, solventes lípofílicos, conservante,' adjuvante ou semelhante. Auxiliares farmaceuticamente aceitáveis são pre- feridos. Exemplos não Iimitativos e métodos de preparo de tais soluções es- téreis são bem conhecidos na técnica tal como, mas não limitado a, Genna- ro, Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a- Edição, Mack Publishing Co. (Easton, PA) 1990. Veículos farmaceuticamente aceitáveis podem ser rotineiramente selecionados os quais são adequados para o modo de admi- nistração, solubilidade e/ou estabilidade da composição de mimeticorpo de GLP-1, conforme bem conhecido na técnica ou conforme descrito aqui.

Excipientes farmacêuticos e aditivos úteis na presente composi- ção incluem, mas não estão limitados a, proteínas, peptídeos, aminoácidos, lipídios e carboidratos (por exemplo, açúcares, incluindo monossacarídeos, di-, tri-, tetra- e oligossacarídeos; açúcares derivatizados, tais como alditóis, ácido aldônico, açúcares esterificados e semelhantes; e polissacarídeos ou polímeros de açúcar), os quais podem estar presentes unicamente ou em combinação, compreendendo, sozinho ou em combinação, 1-99,99% em peso ou volume. Excipientes de proteína exemplificadas incluem albumina do soro, tal como albumina de soro humano (HSA), albumina humana re- combinante (rHA), gelatina, caseína e semelhantes. Componentes represen- tativos de aminoácido/mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especifi- cada os quais também podem funcionar com uma capacidade tampão inclu- em alanina, glicina, arginina, betaína, histidina, ácido glutâmico, ácido aspár- tico, cisteína, lisina, leucina, isoleucina, valina, metionina, fenilalanina, aspar- tame e semelhantes. Um aminoácido preferido é glicina.

Excipientes de carboidrato adequados para uso na invenção in- cluem, por exemplo, monossacarídeos, tais como frutose, maltose, galacto- se, glicose, D-manose, sorbose e semelhantes; dissacarídeos, tais como lactose, sacarose, trealose, celobiose e semelhantes; polissacarídeos, tais como rafinose, melezitose, maltodextrinas, dextranas, amidos e semelhan- tes; e alditóis, tais como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol, sorbitol (gluci- tol), mioinositol e semelhantes. Excipientes de carboidrato preferidos para uso na presente invenção são manitol, trealose e rafinose.

Composições de mimeticorpo de GLP-1 podem também incluir um tampão ou agente para ajuste de pH; tipicamente, o tampão é um sal preparado a partir de um ácido ou base orgânica. Tampões representativos incluem sais de ácido orgânico, tais como sais de ácido cítrico, ácido ascór- bico, ácido glucônico, ácido carbônico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido acético ou ácido itálico; Tris, cloridrato de trometamina ou tampões de fosfa- to. Tampões preferidos para uso nas presentes composições são sais de ácido orgânico, tal como citrato.

Adicionalmente, as composições de mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada da invenção podem incluir excipien- tes/aditivos poliméricos, tais como polivinilpirrolidonas, Ficoll (um açúcar po- limérico), dextratos (por exemplo, ciclodextrinas, tal como 2-hidroxipropil-p- ciclodextrina), polietileno glicóis, agentes de flavorização, agentes antimicro-

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bianos, adoçantes, antioxidantes, agentes antiestática, tensoativos (por e- xemplo, polissorbatos, tais como "TWEEN 20" e "TWEEN 80"), lipídios (por exemplo, fosfolipídios, ácidos graxos), esteróides (por exemplo, colesterol) e agentes de quelação (por exemplo, EDTA).

Esses e excipientes e/ou aditivos extra conhecidos adequados

para uso nas composições de mimeticorpo de GLP-1 de acordo com a in- venção são conhecidos na técnica, por exemplo, conforme listado em "Re- mington: The Science & Practice of Pharmacy", 19· ed., Williams & Williams, (1995) e em "Physician's Desk Reference", 52* ed., Medicai Economics, Montvale, NJ (1998), as descrições dos quais são totalmente incorporadas aqui por referência. Materiais veículo ou excipiente preferidos são carboidra- tos (por exemplo, sacarídeos e alditóis) e tampões (por exemplo, citrato) ou agentes poliméricos. Formulações

Conforme notado acima, a invenção proporciona formulações estáveis as quais podem, de preferência, incluir um tampão adequado com solução salina ou um sal escolhido, bem como soluções e formulações con- servadas opcionais contendo um conservante, bem como formulações con- servadas para uso múltiplo adequadas para uso farmacêutico ou veterinário compreendendo pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou varian- te especificada em uma formulação farmaceuticamente aceitável. Formula- ções conservadas contêm pelo menos um conservante opcionalmente sele- cionado do grupo consistindo em pelo menos um fenol, m-cresol, p-cresol, o- cresol, clorocresol, álcool benzílico, nitrito fenilmercúrico, fenóxietanol, for- maldeído, clorobutanol, cloreto de magnésio (por exemplo, hexahidrato), al- quilparabeno (metil, etil, propil, butil e semelhantes), cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, dehidroacetato de sódio e timerosal ou misturas dos mesmos em um diluente aquoso. Qualquer concentração adequada ou mis- tura pode ser usada, conforme conhecido na técnica, tal como 0,001-5% ou qualquer faixa ou valor entre os mesmos tal como, mas não limitado a, 0,001, 0,003, 0,005, 0,009, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4,, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1,

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25 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,3, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4.9 ou qualquer faixa ou valor nos mesmos. Exemplos não Iimitativos incluem, sem conservante, 0,1-2% de m-cresol (por exemplo, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,9, 1,0%), 0,1-3% de álcool benzílico (por exem- pio, 0,5, 0,9, 1,1„ 1,5, 1,9, 2,0, 2,5%), 0,001-0.5% de timerosal (por exemplo, 0,005, 0,01), 0,001-2,0% de fenol (por exemplo, 0,05, 0,25, 0,28, 0,5, 0,9, 1,0%), 0,0005-1,0% de alquilparabeno(s) (por exemplo, 0,00075, 0,0009, 0,001, 0,002, 0,005, 0,0075, 0,009, 0,01, 0,02, 0,05, 0,075, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,75, 0,9, 1,0%) e semelhantes. Conforme notado acima, a invenção proporciona um artigo de

fabricação compreendendo material de embalagem e pelo menos um frasco compreendendo uma solução de pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada com os tampões e/ou conservantes prescri- tos, opcionalmente em um diluente aquoso, em que o referido material de embalagem compreende um rótulo que indica que tal solução pode ser guardada durante um período de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72 horas ou mais. A invenção ainda compreende um artigo de fabricação compreendendo material de embalagem, um primeiro frasco compreendendo pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou varian- te especificada Iiofilizada e um segundo frasco compreendendo um diluente aquoso de tampão ou conservante prescrito, em que o referido material de embalagem compreende um rótulo que instrui o paciente a reconstituir pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada no di- luente aquoso para formar uma solução que pode ser guardada durante um período de vinte e quatro horas ou mais.

Pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada usada de acordo com a presente invenção pode ser produzido através de meios recombinantes, incluindo a partir de células de mamíferos ou preparados transgênicos ou pode ser purificada de outras fontes biológi- cas, conforme descrito aqui ou conforme conhecido na técnica.

A faixa de quantidades de pelo menos um mimeticorpo de GLP- 1 ou porção ou variante especificada no produto da presente invenção inclui quantidades que rendem, quando de reconstituição, se em um sistema úmi- do/seco, concentrações de cerca de 1,0 μ9/πιΙ a cerca de 1000 mg/ml, em- bora concentrações menores e maiores sejam operáveis e sejam dependen- tes do veículo de distribuição pretendido, por exemplo, formulações em solu- ção diferirão de métodos com emplastro transdérmico, pulmonar, transmu- cosal ou osmótico ou microbomba.

De preferência, o diluente aquoso ainda compreende, opcional- mente, um conservante farmaceuticamente aceitável, conservantes preferi- dos incluem aqueles selecionados do grupo consistindo em fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, álcool benzílico, alquilparabeno (metil, etil, propil, butil e semelhantes), cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, dehidroacetato de sódio timerosal ou misturas dos mesmos. A concentração de conservante usada na formulação é uma concentração suficiente para proporcionar um efeito anti-microbiano. Tais concentrações são dependen- tes do conservante selecionado e são prontamente determinadas por aque- les habilitados.

Outros excipientes, por exemplo, agentes de isotonicidade, tam- pões, antioxidantes, conservantes, intensificadores podem, opcionalmente e de preferência, ser adicionados ao diluente. Um agente de isotonicidade, tal como glicerina, é comumente usado em concentrações conhecidas. Um tampão fisiologicamente tolerado é, de preferência, adicionado para propor- cionar controle aperfeiçoado de pH. As formulações podem abranger uma ampla faixa de pHs, tais como um pH de cerca de 4 a um pH de cerca de 10 e faixas preferidas de um pH de cerca de 5 a um pH de cerca de 9 e uma faixa mais preferida de cerca de 6,0 a cerca de 8,0. De preferência, as for- mulações da presente invenção têm um pH entre cerca de 6,8 e cerca de 7,8. Tampões preferidos incluem tampões de fosfato, mais preferivelmente fosfato de sódio, particularmente solução salina tamponada com fosfato (PBS).

Outros aditivos, tais como solubilizantes farmaceuticamente a-

ceitáveis, tais como Tween 20 (polioxietileno (20) sorbitano monolaurato), Tween 40 (polioxietileno (20) sorbitano monopalmitato), Tween 80 (polioxieti- Ieno (20) sorbitano monooleato), Pluronic F68 (copolímeros em bloco de po- lioxietileno/polioxipropileno) e PEG (polietileno glicol) ou tensoativos não- iônicos, tais como polissorbato 20 ou 80 ou poloxâmero 184 ou 188, polióis Pluronic®, outros copolímeros em bloco e queladores, tais como EDTA e EGTA, podem ser opcionalmente adicionados às formulações ou composi- ções para reduzir a agregação. Esses aditivos são particularmente úteis se uma bomba ou recipiente plástico é usado para administrar a formulação. A presença do tensoativo farmaceuticamente aceitável alivia a propensão da proteína de agregar.

As formulações da presente invenção podem ser preparadas

através de um processo o qual compreende mistura de pelo menos um mi- meticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada e um conservante selecionado do grupo consistindo em fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clo- rocresol, álcool benzílico, alquilparabeno (metila, etila, propila, butila e seme- lhantes), cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, dehidroacetato de sódio e timerosal ou misturas dos mesmos em um diluente aquoso. Mistura do pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especifica- da e conservante em um diluente aquoso é realizada usando procedimentos convencionais de dissolução e mistura. Para preparar uma formulação ade- quada, por exemplo, uma quantidade medida de pelo menos um mimeticor- po de GLP-1 ou porção ou variante especificada em solução tampão é com- binada com o conservante desejado em uma solução tampão em quantida- des suficientes para proporcionar a proteína e conservante nas concentra- ções desejadas. Variações desse processo serão reconhecidas por aqueles versados na técnica. Por exemplo, a ordem na qual os componentes são adicionados, se aditivos extra são usados, a temperatura e pH nos quais a formulação é preparada, são todos fatores que podem ser otimizados para a concentração e meio de administração usado.

As formulações reivindicadas podem ser fornecidas aos pacien- tes como soluções claras ou como frascos duplos compreendendo um frasco de pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especifica- da Iiofilizada que é reconstituído com um segundo frasco contendo água, um 10

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conservante e/ou excipientes, de preferência um tampão de fosfato e/ou so- lução salina e um sal escolhido, em um diluente aquoso. Um único frasco de solução ou um frasco duplo que requer reconstituição pode ser reutilizado múltiplas vezes e pode ser suficiente para um único ou múltiplos ciclos de tratamento do paciente e, assim, proporcionar um regime de tratamento mais conveniente do que atualmente disponível.

Os presentes artigos de fabricação reivindicados são úteis para administração durante um período de imediatamente a vinte e quatro horas ou mais. Consequentemente, os artigos de fabricação presentemente reivin- dicados oferecem vantagens significativas ao paciente. As formulações da invenção podem, opcionalmente, ser seguramente armazenadas em tempe- raturas de cerca de 2 a cerca de 40 X e reter a atividade biológica da prote- ína durante períodos prolongados de tempo, assim, permitindo que um rótulo na embalagem indique que a solução pode ser guardada e/ou usada durante um período de 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72 ou 96 horas ou mais. Se um diluente preservado é usado, tal rótulo pode incluir uso de até pelo menos um de 1- 12 meses, 6 meses, um ano e meio e/ou dois anos.

As soluções de pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada na invenção podem ser preparadas através de um processo que compreende mistura de pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada em um diluente aquoso. Mistura é reali- zada usando procedimentos convencionais de dissolução e mistura. Para preparar um diluente adequado, por exemplo, uma quantidade medida de pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada em água ou tampão é combinada em quantidades suficientes para propor- cionar a proteína e, opcionalmente, um conservante ou tampão nas concen- trações desejadas. Variações desse processo serão reconhecidas por aque- les versados na técnica. Por exemplo, a ordem na qual os componentes são adicionados, se aditivos extra são usados, a temperatura e pH nos quais a formulação é preparada, são todos fatores que podem ser otimizados para a concentração e meio de administração usado.

Os produtos reivindicados podem ser fornecidos aos pacientes

20 como soluções claras ou como frascos duplos compreendendo um frasco de pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada Iiofilizada que é reconstituído com um segundo frasco contendo o diluente aquoso. Um único frasco com solução ou um frasco duplo que requer re- constituição pode ser reutilizado múltiplas vezes e pode ser suficiente para um único ou múltiplos ciclos de tratamento do paciente e, assim, proporcio- nar um regime de tratamento mais conveniente do que atualmente disponí- vel.

Os produtos reivindicados podem ser fornecidos indiretamente aos pacientes através de fornecimento às farmácias, clínicas ou outras de tais instituições e unidades, frascos duplos ou com soluções clara compre- endendo um frasco de pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada Iiofilizada que é reconstituído com um segundo frasco contendo o diluente aquoso. A solução clara, nesse caso, pode ser até um litro ou mesmo mais quanto ao tamanho, proporcionando um grande reser- vatório do qual porções menores da solução de pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada podem ser extraídas uma ou múltiplas vezes para transferência para frascos menores e fornecidos pela farmácia ou clínica a seus clientes e/ou pacientes. Dispositivos reconhecidos compreendendo esses sistemas com

um único frasco incluem aqueles dispositivos de caneta injetora para distri- buição de uma solução, tais como Humaject®· NovoPen®, B-D®Pen, Auto- Pen® e OptiPen®. Dispositivos reconhecidos compreendendo um sistema com frasco duplo incluem aqueles sistemas de caneta injetora para reconsti- tuição de um fármaco Iiofilizado em um cartucho para distribuição da solução reconstituída, tal como HumatroPen®.

Os produtos presentemente reivindicados incluem material de embalagem. O material de embalagem proporciona, além da informação re- querida pelas agências regulatórias, as condições sob as quais o produto pode ser usado. O material de embalagem da presente invenção proporcio- na instruções ao paciente para reconstituir o pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada no diluente aquoso para formar uma solução e usar a solução durante um período de 2-24 horas ou mais, para o produto úmido/seco em dois frascos. Para um produto com um único frasco de solução, o rótulo indica que tal solução pode ser usada durante um período de 2-24 horas ou mais. Os produtos presentemente reivindicados são úteis para uso como um produto farmacêutico para seres humanos.

As formulações da presente invenção podem ser preparadas através de um processo que compreende mistura de pelo menos um mimeti- corpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada e um tampão seleciona- do, de preferência um tampão de fosfato contendo solução salina ou um sal escolhido. Mistura de pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada e tampão em um diluente aquoso é realizada usando procedimentos convencionais de dissolução e mistura. Para preparar uma formulação adequada, por exemplo, uma quantidade medida de pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada em água ou tampão é combinada com o agente de tamponamento desejado em água em quantidades suficientes para proporcionar a proteína e tampão nas concen- trações desejadas. Variações desse processo serão reconhecidas por aque- les versados na técnica. Por exemplo, a ordem em que os componentes são adicionados, se aditivos extra são usados, a temperatura e pH nos quais a formulação é preparada, são todos fatores que podem ser otimizados para a concentração e meio de administração usado.

As formulações estáveis ou preservadas reivindicadas podem ser fornecidas aos pacientes como soluções claras ou como frascos duplos compreendendo um frasco de pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada Iiofilizada que é reconstituído com um se- gundo frasco contendo um conservante ou tampão e excipientes em um di- luente aquoso. Um único frasco com solução ou um frasco duplo que requer reconstituição pode ser reutilizado múltiplas vezes e pode ser suficiente para um único ou múltiplos ciclos de tratamento do paciente e, assim, proporcio- nar um regime de tratamento mais conveniente do que atualmente disponí- vel.

Pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada, quer em formulações ou soluções estáveis ou preservadas descritas aqui, pode ser administrada a um paciente de acordo com a pre- sente invenção através de uma variedade de métodos, incluindo injeção SC ou IM; meios transdérmicos, pulmonares, transmucosais, implante, bomba osmótica, cartucho, microbomba ou outros apreciados por aqueles versados na técnica, conforme bem conhecido na técnica. Aplicações Terapêuticas

A presente invenção para mimeticorpos também proporciona um método para modulação ou tratamento de diabetes, diabetes mellitus do tipo I ou tipo II, incluindo com início na fase adulta ou juvenil, dependente de in- sulina, não dependente de insulina e semelhantes, incluindo os sinais e sin- tomas associados tais como, mas não limitado a, resistência à insulina, hi- perglicemia, hipoglicemia, pancreatite, síndrome de Sushing, acantose nigri- cans, diabetes lipoatrófico, retinopatia, nefropatia, polineuropatia, mononeu- ropatia, neuropatia autonômica, úlceras, úlceras dos pés, problemas de arti- culação, infecções (por exemplo, fúngica ou bacteriana) e semelhantes em uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente.

A presente invenção também proporciona um método para mo- dulação ou tratamento de pelo menos uma doença imune relacionada ao diabetes em uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente incluindo, mas não limitado a, pelo menos um de diabetes mellitus do tipo I ou do tipo II, incluindo com início na fase adulta ou juvenil, dependente de insulina, não dependente de insulina e semelhantes, incluindo os sinais e sintomas asso- ciados tais como, mas não limitado a, resistência à insulina, hiperglicemia, hipoglicemia, pancreatite, síndrome de Sushing, acantose nigricans, diabe- tes lipoatrófico, retinopatia, nefropatia, polineuropatia, mononeuropatia, neu- ropatia autonômica, úlceras, úlceras dos pés, problemas de articulação, in- fecções (por exemplo, fúngica ou bacteriana) e semelhantes. Veja, por e- xemplo, Merck Manual, 12--17â Edições, Merck & Company, Rahway, NJ (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999), Pharmacotherapy Handbook, Wells e outros, eds., Segunda Edição, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (1998, 2001), cada um totalmente incorporado por referência. Tal método pode, opcionalmente, compreender administração uma quantidade eficaz de pelo menos uma composição ou composição far- macêutica compreendendo pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada a uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente que precisa de tal modulação, tratamento ou terapia.

A presente invenção também proporciona um método para mo- dulação ou tratamento de pelo menos uma doença cardiovascular em uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente incluindo, mas não limitado a, pelo menos um de síndrome de choque cardíaco, enfarte do miocárdio, insufici- ência cardíaca congestiva, derrame, derrame isquêmico, hemorragia, arteri- osclerose, aterosclerose, doença ateriosclerótica diabética, hipertensão, hi- pertensão arterial, hipertensão renovascular, síncope, choque, sífilis do sis- tema cardiovascular, insuficiência cardíaca, cor pulmonale, hipertensão pul- monar primária, arritmias cardíacas, batimentos ectópicos atriais, flutter atri- al, fibrilação atrial (sustentada ou paroxísmica), taquicardia atrial multifocal ou caótica, taquicardia com estreitamento QRS regular, arritmias específi- cas, fibrilação ventricular, arritmias do feixe His, bloqueio átrio-ventricular, bloqueio de ramos do feixe, distúrbios isquêmicos miocárdicos, doença da artéria coronária, angina pectoris, enfarte do miocárdio, cardiomiopatia, car- diomiopatia congestiva dilatada, cardiomiopatia restritiva, doenças cardíacas vasculares, endocardite, doença pericardial, tumores cardíacos, ancuristas perféricos e aórticos, anatomização aórtica, inflamação da aorta, oclusão da aorta abdominal e de suas ramificações, desordens vasculares periféricas, distúrbios arteriais oclusivos, doença aterosclerótica periférica, tromboangite obliterans, distúrbios arteriais periféricos funcionais, fenômeno e doença de Raynaud, acrocianose, eritromelalgia, doenças venosas, trombose venosa, veias varicosas, fístula arteriovenosa, linfederma, lipedema, angina instável, lesão por reperfusão, síndrome pós-bomba, lesão por isquemia-reperfusão e semelhantes. Tal método pode, opcionalmente, compreender administração de uma quantidade eficaz de uma composição ou composição farmacêutica compreendendo pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou varian- te especificada a uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente que precisa de tal modulação, tratamento ou terapia.

Qualquer método da presente invenção pode compreender a administração de uma quantidade eficaz de uma composição ou composição farmacêutica compreendendo pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou por- ção ou variante especificada a uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente que precisa de tal modulação, tratamento ou terapia. Tal método pode op- cionalmente ainda compreender co-administração ou terapia combinada pa- ra tratamento de tais doenças imunes, em que a administração do referido pelo menos um mimeticorpo de GLP-1, porção ou variante especificada do mesmo ainda compreende administração, antes, concorrentemente e/ou a- pós pelo menos um selecionado de pelo menos um antagonista de TNF (por exemplo, mas não limitado a, um anticorpo ao TNF ou fragmento, um recep- tor de TNF solúvel ou fragmento, proteínas de fusão do mesmo ou um anta- gonista de TNF de pequena molécula), um antirreumático, um relaxante muscular, um narcótico, um fármaco anti-inflamatório não esteroidal (NSAID), um analgésico, um anestésico, um sedativo, um anestésico local, um bloqueador neuromuscular, um antimicrobiano (por exemplo, aminoglico- sídeo, um antifúngico, um antiparasítico, um antiviral, um carbapenem, cefa- losporina, uma flurorquinolona, um macrolídeo, uma penicilina, uma sulfo- namida, uma tetraciclina, outro antimicrobiano), um antipsoriático, um corti- costeróide, um esteróide anabólico, um agente diabetes relacionado, um mineral, um nutricional, um agente para tiróide, uma vitamina, um hormônio relacionado ao cálcio, um antidiarreico, um antitussígeno, um antiemético, um antiúlcera, um laxante, um anticoagulante, uma eritropoietina (por exem- pio, GLP-Ietina alfa), um filgrastim (por exemplo, G-CSF, Neupogen), um sargramostim (GM-CSF, Leucina), uma imunização, uma imunoglobulina, um imunossupressor (por exemplo, basiliximab, ciclosporina, daclizumab), um hormônio de crescimento, um fármaco de reposição hormonal, um modu- Iador do receptor de estrogênio, um midriático, um cicloplégico, um agente de alquilação, um antimetabólito, um inibidor mitótico, um radiofarmacêutico, um antidepressivo, um agente antimaníaco, um antipsicótico, um anxiolítico, um hipnótico, um simpatomimético, um estimulante, donepezil, tacrina, uma medicação para asma, um beta agonista, um esteróide inalado, um inibidor de leucotrieno, uma metilxantina, um cromolyn, uma epinefrina ou análogo, dornase alfa (PuImozyme)1 uma citocina ou um antagonista de citocina. Do- sagens adequadas são bem conhecidas na técnica, veja, por exemplo, Wells e outros, eds., Pharmacotherapy Handbook, 2a Edition, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopo- eia 2000, Deluxe Edition, Taraseon Publishing, Loma Linda, CA (2000), cada um dos quais é totalmente incorporado aqui por referência.

Mimetieorpos também podem ser usados ex vivo, tal como em cultura de medula autóloga. Resumidamente, a medula óssea é removida de um paciente antes de quimioterapia e tratada com TPO e/ou GLP-1, opcio- nalmente em combinação com mimeticorpos, opcionalmente em combinação com uma ou mais citocinas adicionais. A medula tratada é, então, retornada para o paciente após quimioterapia para acelerar a recuperação da medula. Além disso, TPO, sozinha e em combinação com mimeticorpos de GLP-1 e/ou GLP-1, também pode ser usada para a expansão de medula ou células progenitoras de sangue periférico (PBPC). Antes de tratamento por quimiote- rapia, a medula pode ser estimulada com fator de célula-tronco (SCF) ou G- CSF para liberar células progenitoras precoces em circulação periférica. Es- ses progenitores são, opcionalmente, coletados e concentrados a partir de sangue periférico e, então, tratados em cultura com TPO e mimeticorpos, opcionalmente em combinação com uma ou mais citocinas incluindo, mas não limitado a, SCF, G-CSF, IL-3, GM-CSF, IL-6 ou IL-11, para diferenciar e proliferar em culturas de megacariócito de alta densidade as quais são, en- tão, opcionalmente, retornadas para o paciente após quimioterapia em alta dose. Doses de TPO para tratamento ex vivo da medula óssea estarão na faixa de 100 pg/ml a 10 ng/ml, de preferência 500 pg/ml a 3 ng/ml. Doses de mimeticorpos serão equivalentes, quanto à atividade, ao GLP-1, o qual pode ser usado de 0,1 unidade/ml a 20 unidades/ml, de preferência de 0,5 unida- des/ml a 2 unidade/ml ou qualquer faixa ou valor nos mesmos.

Antagonistas de TNF adequados para composições, terapia combinada, co-administração, dispositivos e/ou métodos da presente inven- ção (ainda compreendendo pelo menos um anticorpo, porção especificada e variante do mesmo, da presente invenção) incluem, mas não estão limitados a, anticorpos anti-TNF, fragmentos de ligação de Iigante dos mesmos e mo- léculas de receptor as quais se ligam especificamente ao TNF; compostos os quais impedem e/ou inibem a síntese de TNF, liberação de TNF ou sua ação sobre células-alvo, tais como talidomida, tenidap, inibidores de fosfodi- esterase (por exemplo, pentoxifilina e rolipram), agonistas do receptor de adenosina A2b e intensificadores do receptor de adenosina A2b; compostos os quais impedem e/ou inibem a sinalização ao TNF, tais como inibidores de quínase de proteína mitógeno-ativada (MAP); compostos os quais bloqueiam e/ou inibem a clivagem de TNF na membrana, tais como inibidores de meta- loproteinase; compostos os quais bloqueiam e/ou inibem a atividade de TNF, tais como inibidores da enzima de conversão de angiotensina (ACE) (por exemplo, captopril); e compostos os quais bloqueiam e/ou inibem a produ- ção e/ou síntese de TNF, tais como inibidores de quínase MAP.

Conforme usado aqui, um "anticorpo ao fator de necrose de tu- mor", "anticorpo ao TNF", "anticorpo ao TNFa" ou fragmento e semelhantes diminui, bloqueia, inibe, anula ou interfere com a atividade de TNFa in vitro, in situ e/ou, de preferência, in vivo. Por exemplo, um anticorpo ao TNF hu- mano adequado da presente invenção pode se ligar ao TNF α e inclui anti- corpos anti-TNF, fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos e mutantes especificados ou domínios dos mesmos que se ligam especificamente ao TNFa. Um anticorpo ao TNF adequado ou fragmento também pode diminuir, bloquear, interferir, prevenir e/ou inibir a síntese de RNA, DNA ou proteína de TNF, a liberação de TNF, sinalização ao receptor de TNF, clivagem de TNF na membrana, atividade de TNF, produção e/ou síntese de TNF.

O anticorpo quimérico cA2 consiste na região variável de ligação a antígeno do anticorpo de IgGI anti-TNFa humano de camundongo de neu- tralização de alta afinidade, designado A2 e as regiões constantes de uma imunoglobulina kappa, IgGI humana. A região Fc de IgGI humana melhora a função efetuadora alogeneica do anticorpo, aumenta a meia-vida em circu- lação no soro e diminui a imunogenicidade do anticorpo. A avidez e especifi- cidade de epítopo do anticorpo quimérico cA2 é derivada da região variável do anticorpo A2 de murino. Em uma modalidade particular, uma fonte prefe- rida para ácidos nucleicos que codificam a região variável do anticorpo A2 de murino é a linhagem de célula de hibridoma A2.

A2 quimérico (cA2) neutraliza o efeito citotóxico de TNFa huma-

no natural e recombinante de uma maneira dose-dependente. A partir de ensaios de ligação de anticorpo quimérico cA2 e TNFa humano recombinan- te, a constante de afinidade do anticorpo quimérico cA2 foi calculada como sendo de 1,04 χ 1010M"1. Métodos preferidos para determinação de especifi- cidade e afinidade de anticorpo monoclonal através de inibição competitiva podem ser encontrados em Harlow e outros, Antibodies: A Laboratory Ma- nual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1988; Colligan e outros, eds., Current Protocols In Immunology, Greene Pu- blishing Assoc. and Wiley lnterscience, New York, (1992-2003); Kozbor e outros, Immunoi Todia, 4: 72-79 (1983); Ausubel e outros, eds. Current Pro- tocols in Molecular Biology, Wiley lnterscience, New York (1987-2003); e Muller, Meth. Enzymol., 92: 589-601 (1983), referências as quais são total- mente incorporadas aqui por referência.

Exemplos adicionais de anticorpos monoclonais anti-TNF que podem ser usados na presente invenção são descritos na técnica (veja, por exemplo, Patente U.S. Ns 5.231.024; Mõller, A. e outros, Cytokine 2(3): 162- 169 (1990); Pedido U.S. Ns 07/943.852 (depositado em 11 de Setembro de 1992); Rathjen e outros, Publicação Internacional N2 WO 91/02078 (publica- da em 21 de Fevereiro de 1991); Rubin e outros, Publicação de Patente Ns 0 218 868 (publicada em 22 de Abril de 1987); Yone e outros, Publicação de Patente Ν* 0 288 088 (26 de Outubro de 1988); Liang e outros, Blochem. Biophys. Res. Comm. 137: 847-854 (1986); Meager e outros, Hybridoma 6: 305-311 (1987); Fendly e outros, Hybridoma 6: 359-369 (1987); Bringman e outros, Hybridoma 6: 489-507 (1987); e Hirai e outros, J. Immunol. Meth. 96:

57-62 (1987), referências as quais são totalmente incorporadas aqui por re- ferência).

Moléculas de receptor de TNF Moléculas de receptor de TNF preferidas úteis na presente in- venção são aquelas que se ligam ao TNFa com alta afinidade (veja, por e- xemplo, Feldmann e outros, Publicação Internacional Ns WO 92/07076 (pu- blicada em 30 de Abril de 1992); Schall e outros, Cell 61: 361-370 (1990); e Loetscher e outros, Cell 61: 351-359 (1990), referências as quais são total- mente incorporadas aqui por referência) e possuem, opcionalmente, baixa imunogenicidade. Em particular, os receptores de TNF na superfície celular de 55 kDa (p55 TNF-R) e 75 kDa (p75 TNF-R) são úteis na presente inven- ção. Formas truncadas desses receptores, compreendendo os domínios ex- tracelulares (ECD) dos receptores ou porções funcionais dos mesmos (veja, por exemplo, Corcoran e outros, Eur. J. Biochem. 223: 831-840 (1994)), também são úteis na presente invenção. Formas truncadas dos receptores de TNF1 compreendendo o ECD, foram detectadas em urina e soro como proteínas de ligação inibitórias de TNFa de 30 kDa e 40 kDa (Engelmann, H. e outros, J. BioL Chem. 265: 1531-1536 (1990)). Moléculas multiméricas de receptor de TNF e moléculas de fusão de imunorreceptor de TNF e deriva- dos e fragmentos ou porções das mesmas são exemplos adicionais de mo- léculas de receptor de TNF as quais são úteis na invenção e são caracteri- zadas por sua capacidade de tratar pacientes durante períodos prolongados, com alívio bom a excelente de sintomas e baixa toxicidade. Baixa imunoge- nicidade e/ou alta afinidade, bem como outras propriedades indefinidas, po- dem contribuir para os resultados terapêuticos obtidos.

Moléculas multiméricas de receptor de TNF úteis na presente invenção compreendem todo ou uma porção do ECD de dois ou mais recep- tores de TNF ligados via um ou mais Iigantes polipeptídicos ou outros Iigan- tes não peptídicos, tal como polietileno glicol (PEG). As moléculas multiméri- cas podem ainda compreender um peptídeo sinalizador de uma proteína secretada para dirigir a expressão da molécula multimérica. Essas moléculas multiméricas e métodos para sua produção foram descritos no Pedido U.S. Ns 08/437.533 (depositado em 9 de Maio de 1995), o conteúdo do qual é totalmente incorporado aqui por referência.

Moléculas de fusão de imunorreceptor de TNF úteis nos méto- Γ 86

dos e composições da presente invenção compreendem pelo menos uma porção de uma ou mais moléculas de imunoglobulina e todo ou uma porção funcional de um ou mais receptores de TNF. Essas moléculas de fusão de imunorreceptor podem ser montadas como monômeros ou hetero- ou homo- multímeros. As moléculas de fusão de imunorreceptor também podem ser monovalentes ou multivalentes. Um exemplo de tal molécula de fusão de imunorreceptor de TNF é a proteína de fusão de receptor de TNF/lgG. Molé- culas de fusão de imunorreceptor de TNF e métodos para sua produção fo- ram descritos na técnica (Lesslauer e outros, Eur. J. Immunol. 21: 2883-2886 (1991); Ashkenazi e outros, Proc. Nati Acad. Sei. USA 88: 10535-10539 (1991); Peppel e outros, J. Exp. Med. 174: 1483-1489 (1991); Kolls e outros, Proc. NatL Acad. Sei. USA 91: 215-219 (1994); Butler e outros, Cytokine 6(6): 616-623 (1994); Baker e outros, Eur. J. Immunol. 24: 2040-2048 (1994); Beutler e outros, Patente U.S. N2 5.447.851; e Pedido U.S. Ns 08/442.133 (depositado em 16 de Maio de 1995), cada uma dessas referências é total- mente incorporada aqui por referência). Métodos para a produção de molé- culas de fusão de imunorreceptor também podem ser encontrados em Ca- pon e outros, Patente U.S. Ns 5.116.964; Capon e outros, Patente U.S. Ns 5.225.538; e Capon e outros, Nature 337: 525-531 (1989), referências as quais são totalmente incorporadas aqui por referência.

Um equivalente funcional, derivado, fragmento ou região da mo- lécula de receptor de TNF se refere à porção da molécula de receptor de TNF ou a porção da seqüência da molécula do receptor de TNF a qual codi- fica uma molécula de receptor de TNF que é de tamanho e seqüências sufi- cientes para se assemelhar funcionalmente a moléculas de receptor de TNF que podem ser usadas na presente invenção (por exemplo, se ligar ao TNFa com alta afinidade e possuir menor imunogenicidade). Um equivalente fun- cional de molécula de receptor de TNF também inclui moléculas de receptor de TNF modificadas que se assemelham funcionalmente a moléculas de receptor de TNF que podem ser usadas na presente invenção (por exemplo, se ligar ao TNFa com alta afinidade e possuir baixa imunogenicidade). Por exemplo, um equivalente funcional de molécula de receptor de TNF pode conter um códon "SILENCIOSO" ou uma ou mais substituições, deleções ou adições de aminoácido (por exemplo, substituição de um aminoácido ácido por outro aminoácido ácido; ou substituição de um códon que codifica o mesmo ou um aminoácido hidrofóbico diferente por outro códon que codifica um aminoácido hidrofóbico). Veja Ausubel e outros, Current Protocols in Mo- lecular Biology, Greene Publishing Assoc. e Wiley-lnterscience, New York (1987-2003).

Citocinas incluem, mas não estão limitadas a, todas as citocinas conhecidas. Por exemplo, veja, CopewithCytokines.com. Antagonistas de citocina incluem, mas não estão limitados a, qualquer anticorpo, fragmento ou mimético, qualquer receptor solúvel, fragmento ou mimético, qualquer antagonista de pequena molécula ou qualquer combinação dos mesmos.

Qualquer método da presente invenção pode compreender um método para tratamento de um distúrbio proteína-mediado compreendendo administração de uma quantidade eficaz de uma composição ou composição farmacêutica compreendendo pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou por- ção ou variante especificada a uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente que precisa de tal modulação, tratamento ou terapia. Tal método pode, op- cionalmente, ainda compreender co-administração ou terapia combinada para o tratamento de doenças imunes, em que a administração do referido pelo menos um mimeticorpo de GLP-1, porção ou variante especificada do mesmo, ainda compreende administração, antes de, concorrentemente e/ou após pelo menos um selecionado de pelo menos uma de outras citocinas, tais como IL-3, -6 e -11; fator de células tronco; G-CSF e GM-CSF.

Tipicamente, o tratamento de condições patológicas é realizado através de administração de uma quantidade ou dosagem eficaz de uma composição de pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 que tem, no total, em média ou uma faixa de pelo menos cerca de 0,0001 a 500 miligramas de pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especifica- da/quilograma de paciente por dose e, de preferência, de pelo menos cerca de 0,001 a 100 miligramas de mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada/quilograma de paciente por administração única ou múltipla, dependendo da atividade específica contida na composição. Alternativamen- te, a concentração eficaz no soro pode compreender 0,001-5000 μςι/ml de concentração no soro por administração única ou múltipla. Dosagens ade- quadas são conhecidas pelos profissionais e, naturalmente, dependerão do estado doentio em particular, atividade específica da composição que está sendo administrada e do paciente que está sofrendo tratamento em particu- lar. Em alguns casos, para obter a quantidade terapêutica desejada, pode ser necessário proporcionar administração repetida, isto é, administrações individuais repetidas de uma dose medida ou monitorada em particular, onde as administrações individuais são repetidas até que a dose diária ou efeito desejado seja obtido.

Doses preferidas podem, opcionalmente, incluir 0,0001, 0,0002, 0,0003, 0,0004, 0,0005, 0,0006, 0,0007, 0,0008, 00009, 0,001, 0,002, 0,003, 0,004, 0,005, 0,006, 0,007, 0,008, 0,009, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05. 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 e/ou 30 mg/kg/administração ou qualquer faixa, valor ou fração dos mesmos ou obter uma concentração no soro de 0,0001, 0,0002, 0,0003, 0,0004, 0,0005. 0,0006, 0,0007, 0,0008, 00009, 0,001, 0,002, 0,003, 0,004, 0,005, 0,006, 0,007, 0,008, 0,009, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5, 2,9, 3,0, 3,5, 3,9, 4,0, 4,5, 4,9, 5,0, 5,5, 5,9, 6,0, 6,5, 6,9, 7,0, 7,5, 7,9, 8,0, 8,5, 8,9, 9,0, 9,5, 9,9, 10, 10,5, 10,9, 11, 11,5, 11,9, 20, 12,5, 12,9, 13,0, 13,5, 13,9, 14,0, 14,5, 4,9, 5,0, 5,5,, 5,9, 6,0, 6,5, 6,9, 7,0, 7,5, 7,9, 8,0, 8,5, 8,9, 9,0, 9,5, 9,9, 10, 10,5, 10,9, 11, 11,5, 11,9, 12, 12,5, 12,9, 13,0, 13,5, 13,9, 14, 14,5, 15, 15,5, 15,9, 16, 16,5, 16,9, 17, 17,5, 17,9, 18, 18,5, 18,9, 19, 19,5, 19,9, 20, 20,5, 20,9, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96, 100, 200, 300, 400 e/ou uma concentração no soro de 500 μg/ml por administração única ou múltipla ou qualquer faixa, valor ou fração dos mesmos.

Alternativamente, a dosagem administrada pode variar, depen- dendo de fatores conhecidos, tais como as características farmacodinâmicas do agente em particular e seu modo e via de administração; idade, saúde e peso do recipiente; natureza e extensão dos sintomas, tipo de tratamento concorrente, freqüência do tratamento e o efeito desejado. Usualmente, uma dosagem de ingrediente ativo pode ser cerca de 0,0001 a 100 miligramas por quilograma de peso corporal. Comumente, 0,001 a 10 e, de preferência, 0,001 a 1 miligrama por quilograma por administração ou em uma forma com liberação sustentada é eficaz para obter os resultados desejados.

Como um exemplo não limitativo, o tratamento de seres huma- nos ou animais pode ser fornecido com uma dosagem periódica ou de uma vez de pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especi- ficada da presente invenção 0,0001 a 100 mg/kg, tal como 0,0002, 0,0003, 0,0004, 0,0005. 0,0006, 0,0007, 0,0008, 00009, 0,001, 0,002, 0,003, 0,004, 0,005, 0,006, 0,007, 0,008, 0,009, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05. 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 mg/kg por dia, em pelo menos um do dia 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 ou alternativamente, pelo menos uma da semana 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ou qualquer combinação dos mesmos usando doses únicas, por infusão ou re- petidas.

Formas de dosagem (composição) adequadas para administra1 ção interna geralmente contêm de cerca de 0,0001 miligrama a cerca de 500 miligramas de ingrediente ativo por unidade ou recipiente. Nessas composi- ções farmacêuticas, o ingrediente ativo comumente estará presente em uma quantidade de cerca de 0,5-99,999% em peso, baseado no peso total da composição.

Para administração parenteral, o mimeticorpo de GLP-1 ou por- ção ou variante especificada pode ser formulada como uma solução, sus- pensão, emulsão ou pó Iiofilizado em associação ou separadamente forneci- dos, com um veículo parenteral farmaceuticamente aceitável. Exemplos de tais veículos são água, solução salina, solução de Ringer, solução de dex- trose e albumina de soro humano a 5%. Lipossomas e veículos não aquo- sos, tais como óleos fixos, também podem ser usados. O veículo ou pó Iiofi- Iizado pode conter aditivos que mantêm a isotonicidade (por exemplo, clore- to de sódio, manitol) e estabilidade química (por exemplo, tampões e con- servantes). A formulação é esterilizada através de técnicas conhecidas ou adequadas.

Veículos farmacêuticos adequados são descritos na edição mais recente de Remington1S Pharmaceutical Sciences, A. Osol, um texto de refe- rência padrão nesse campo. Administração terapêutica Muitos modos conhecidos e desenvolvidos podem ser usados

para administração de quantidades farmaceuticamente eficazes de pelo me- nos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada de acordo com a presente invenção. Um mimeticorpo de GLP-1 da presente invenção pode ser distribuído em um veículo, como uma solução, emulsão, colóide ou suspensão ou como um pó, usando qualquer um de uma variedade de dis- positivos e métodos adequados para administração através de inalação ou outros modos descritos aqui dentro ou conhecidos na técnica. Formulações parenterais e administração

Formulações para administração parenteral podem conter, como excipientes comuns, água estéril ou solução salina, polialquileno glicóis, tal como polietileno glicol, óleos de origem vegetal, naftalenos hidrogenados e semelhantes. Suspensões aquosas ou oleosas para injeção podem ser pre- paradas usando um emulsificante ou umidificante e um agente de suspen- são, de acordo com métodos conhecidos. Agentes para injeção podem ser um agente de diluição não tóxico, não oralmente administrável, tal como uma solução ou suspensão aquosa ou uma solução injetável estéril em um solvente. Como o veículo ou solvente utilizável, água, solução de Ringer, solução salina isotônica, etc. são permitidos; como um solvente comum ou solvente de suspensão, um óleo não volátil estéril pode ser usado. Para es- sas finalidades, qualquer tipo de óleo não volátil e ácido graxo pode ser usa- do, incluindo óleos gordurosos naturais ou sintéticos ou semi-sintéticas; mo- no·, di- ou triglicerídeos naturais, sintéticos ou semi-sintéticos. Administração parenteral é conhecida na técnica e inclui, mas não está limitada a, meios convencionais de injeção, um dispositivo de injeção sem agulha pressuriza- do a gás, conforme descrito na Pat. U.S. Ns 5.851.198 e um dispositivo de perfuração a laser, conforme descrito na Pat. U.S. Ns 5.839.466, totalmente incorporadas aqui por referência. Distribuição alternativa

A invenção ainda se refere à administração do pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada através de meios parenterais, subcutâneos, intramusculares, intravenosos, em bolus, vaginais, retais, bucais, sublinguais, intranasais ou transdérmicos. Composições de proteína, mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada podem ser preparadas para uso para administração parenteral (subcutâneo, intra- muscular ou intravenoso), particularmente na forma de soluções ou suspen- sões líquidas; para uso em administração vaginal ou retal, particularmente em formas semi-sólidas, tais como cremes e supositórios; para administra- ção bucal ou sublingual, particularmente na forma de tabletes ou cápsulas; ou intranasalmente, particularmente na forma de pós, gotas nasais ou ae- rossóis ou determinados agentes; ou transdermicamente, particularmente na forma de um gel, unguento, loção, suspensão ou sistema de distribuição por emplastro com intensificadores químicos, tal como sulfóxido de dimetila, pa- ra modificar a estrutura da pele ou aumentar a concentração de fármaco no emplastro transdérmico (Junginger e outros em "Drug Permeation Enhan- cement"; Hsieh, D. S., Eds., páginas 59-90 (Mareei Dekker, Inc. New York 1994, totalmente incorporado aqui por referência) ou com agentes de oxida- ção que permitem a aplicação de formulações contendo proteínas e peptí- deos sobre a pele (WO 98/53847) ou aplicações de campos elétricos para criar vias de transporte transitório, tal como eletroporação ou aumentar a mobilidade de fármacos carregados através da pele, tal como iontoforese ou aplicação de ultra-som, tal como sonoforese (Pats. U.S. NsS 4.309.989 e 4.767.403) (as publicações e patentes acima sendo totalmente incorporadas aqui por referência). Administração pulmonar/nasal Para administração pulmonar, de preferência, a composição de pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada é distribuída em um tamanho de partícula eficaz para atingir as vias aéreas inferiores do pulmão ou sinos. De acordo com a invenção, pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada pode ser distribu- ída através de qualquer um de uma variedade de dispositivos de inalação ou nasais conhecidos na técnica para administração de um agente terapêutico através de inalação. Esses dispositivos capazes de formação de formula- ções de dGLP-1t aerossolizadas na cavidade do sino ou alvéolos de um pa- ciente incluem inaladores de dose medida, nebulizadores, geradores de pó seco, pulverizadores e semelhantes. Outros dispositivos adequados para direcionar a administração de mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada aos pulmões ou cavidades nasais também são conhecidos na técnica. Todos de tais dispositivos podem usar formulações adequadas para a administração para distribuir o mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou varian- te especificada em um aerossol. Tais aerossóis podem ser de soluções comprimidas (aquosas e não aquosas) ou partículas sólidas. Inaladores de dose medida, tal como o inalador de dose medida Ventolin® usam, tipica- mente, um gás propelente e requerem acionamento durante inspiração (veja, por exemplo, WO 94/16970, WO 98/35888). Inaladores de pó seco.tais como os inaladores Turbuhaler™ (Astra), Rotahaler® (Glaxo), Diskus® (Glaxo), Spi- ros™ (Dura), dispositivos comercializados pela Inhale Therapeutics e o ina- lador de pó Spinhaler® (Fisons), usam acionamento pela respiração de um pó misturado (US 4668218 Astra, EP 237507 Astra, WO 97/25086 Glaxo, WO 94/08552 Dura, US 5458135 lnhale, WO 94/06498 Fisons, totalmente incorporados aqui por referência). Nebulizadores tal como o AERx™ Ara- digm, o nebulizador Ultravent® (MaIIinckrodt) e o nebulizador Acorn II® (Mar- quest Medicai Products) (US 5404871 Aradigm, WO 97/22376), as referên- cias acima totalmente incorporadas aqui por referência, produzem aerossóis a partir de soluções, enquanto que inaladores de dose medida, inaladores de pó seco, etc. geram aerossóis em pequenas partículas. Esses exemplos es- pecíficos de dispositivos de inalação comercialmente disponíveis se desti- nam a ser representantes de dispositivos específicos adequados para a prá- tica da presente invenção e não se destinam a ser limitações do escopo da invenção. De preferência, uma composição compreendendo pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada é distribuída atra- vés de um inalador de pó seco ou um pulverizador. Há uma série de caracte- rísticas desejáveis de um dispositivo de inalação para administração de pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada da presente invenção. Por exemplo, a distribuição pelo dispositivo de inalação é, vantajosamente, confiável, reproduzível e precisa. O dispositivo de inala- ção pode, opcionalmente, distribuir pequenas partículas secas, por exemplo, de menos de cerca de 10 μιη, de preferência cerca de 1-5 μηι, para boa res- pirabilidade.

Administração de composições de mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou vari- ante especificada como um sprav Um spray incluindo uma composição de proteína de mimeticorpo

de GLP-1 ou porção ou variante especificada pode ser produzido forçando uma suspensão ou solução de pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada através de um bocal sob pressão. O tama- nho e configuração do bocal, a pressão aplicada e a taxa de alimentação de líquido podem ser escolhidos para ativar a produção e tamanho de partícula desejados. Uma eletropulverização pode ser produzida, por exemplo, atra- vés de um campo elétrico em conexão com uma alimentação por capilar ou bocal. Vantajosamente, partículas de pelo menos uma composição de prote- ína de mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada distribuídas através de um pulverizador têm um tamanho de superfície de menos de cer- ca de 10 μιτι, de preferência na faixa de cerca de 1 μη a cerca de 5 μη e, mais preferivelmente, cerca de 2 μηι a cerca de 3 μιτι.

Formulações de composição de proteína de pelo menos um mi- meticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada adequadas para uso com um pulverizador incluem, tipicamente, a composição de proteína de mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada em uma solução aquosa em uma concentração de cerca de 1 mg a cerca de 20 mg de pelo menos uma composição de proteína de pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada por ml de solução. A formulação pode incluir agentes tais como um excipiente, um tampão, um agente de iso- tonicidade, um conservante, um tensoativo e, de preferência, zinco. A formu- lação também pode incluir um excipiente ou agente para estabilização da composição de proteína de mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada, tal como um tampão, um agente de redução, uma proteína de volume ou um carboidrato. Proteínas de volume úteis na formulação de composições de proteína de mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada incluem albumina, protamina ou semelhante. Carboidratos típi- cos úteis na formulação de composições de proteína de mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada incluem sacarose, manitol, Iacto- se, trealose, glicose ou semelhante. A formulação de composição de proteí- na de mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada também pode incluir um tensoativo, o qual pode reduzir ou prevenir a agregação su- perfície-induzida de composição de proteína de mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada causada por atomização da solução na for- mação de um aerossol. Vários tensoativos convencionais podem ser empre- gados, tais como ésteres de ácido graxo de polioxietileno e álcoois de sorbi- tol ésteres de ácido graxo de polioxietileno. As quantidades geralmente osci- larão entre 0,001 e 14% em peso da formulação. Tensoativos especialmente preferidos para fins da presente invenção são sorbitano monooleato de poli- oxietileno, polissorbato 80, polissorbato 20 ou semelhante. Agentes adicio- nais conhecidos na técnica para formulação de uma proteína, tais como mi- meticorpos ou porções ou variantes especificadas, também podem ser inclu- ídos na formulação.

Administração de composições de mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou vari- ante especificada através de um nebulizador

A composição de proteína de mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada pode ser administrada através de um nebulizador, tal como um nebulizador a jato ou um nebulizador ultra-sônico. Tipicamente, em um nebulizador a jato, uma fonte de ar comprimido é usada para criar um jato de ar em alta velocidade através de um orifício. À medida que o gás ex- pande por trás do bocal, uma região de baixa pressão é criada, a qual extrai uma solução de composição de proteína de mimeticorpo de GLP-1 ou por- ção ou variante especificada através de um tubo capilar conectado a um re- servatório de líquido. A corrente de líquido do tubo capilar é dispersa em fi- lamentos instáveis e gotículas à medida que ela sai do tubo, criando o ae- rossol. Uma faixa de configurações, taxas de fluxo e tipos de defletor pode ser empregada para obter as características de desempenho desejadas de um determinado nebulizador a jato. Em um nebulizador ultra-sônico, energia elétrica de alta freqüência é usada para criar energia mecânica vibracional empregando, tipicamente, um transdutor piezelétrico. Essa energia é trans- mitida à formulação de composição de proteína de mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada, quer diretamente ou através de um fluido de acoplamento, criando um aerossol incluindo a composição de proteína de mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada. Vantajosamente, partículas da composição de proteína de mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada distribuídas através de um nebulizador têm um ta- manho de partícula de menos de cerca de 10 μιη, de preferência na faixa de cerca de 1 μιτι a cerca de 5 μιη e, mais preferivelmente, cerca de 2 μηι a cerca de 3 μιτι.

Formulações de pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou por- ção ou variante especificada adequadas para uso com um nebulizador, quer a jato ou ultra-sônico incluem, tipicamente, uma composição de mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada em uma solução aquosa em uma concentração de cerca de 1 mg a cerca de 20 mg de pelo menos uma proteína de mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada por ml de solução. A formulação pode incluir agentes tais como um excipiente, um tampão, um agente de isotonicidade, um conservante, um tensoativo e, de preferência, zinco. A formulação também pode incluir um excipiente ou a- gente para estabilização de uma composição de proteína de pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada, tal como um tampão, um agente de redução, uma proteína de volume ou um carboidrato. Proteínas de volume úteis em formulação de uma composição de proteína de pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especifica- da incluem albumina, protamina ou semelhante. Carboidratos típicos úteis em formulação de pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou vari- ante especificada incluem sacarose, manitol, lactose, trealose, glicose ou semelhante. A formulação de pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou por- ção ou variante especificada pode também incluir um tensoativo, o qual pode reduzir ou prevenir agregação superfície-induzida do pelo menos um mimeti- corpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada causada por atomização da solução na formação de um aerossol. Vários tensoativos convencionais podem ser empregados, tais como ésteres de ácido graxo de polioxietileno e álcoois e sorbitan ésteres de ácido graxo de polioxietileno. As quantidades geralmente oscilarão entre 0,001 e 4% em peso da formulação. Tensoativos especialmente preferidos para fins da presente invenção são sorbitano mo- nooleato de polioxietileno, polissorbato 80, polissorbato 20 ou semelhante. Agentes adicionais conhecidos na técnica para formulação de uma proteína, tal como proteína de pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada, podem também ser incluídos na formulação. Administração de composições de mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou vari- ante especificada através de um inalador de dose medida

Em um inalador de dose medida (MDI), um propelente, pelo me- nos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada e quais- quer excipientes ou outros aditivos estão contidos em uma lata como uma mistura incluindo um gás comprimido liqüefeito. Acionamento da válvula de medição libera a mistura como um aerossol, de preferência contendo partí- culas na faixa de tamanho de menos de cerca de 10 μπι, de preferência cer- ca de 1 μηι a cerca de 5 μιτι e, mais preferivelmente, cerca de 2 μιτι a cerca de 3 μιτι. O tamanho de partícula de aerossol desejado pode ser obtido em- pregando uma formulação de mimeticorpo de GLP-1 ou composição de por- ção ou variante especificada produzida através de vários métodos conheci- dos por aqueles versados na técnica, incluindo trituração a jato, secagem por pulverização, condensação em ponto crítico ou semelhante. Inaladores de dose medida preferidos incluem aqueles fabricados pela 3M ou Glaxo e empregando um propelente de hidrofluorocarboneto.

Formulações de pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou por- ção ou variante especificadas para uso com um dispositivo inalador de dose medida geralmente incluirão um pó finamente dividido contendo pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada como uma suspensão em um meio não aquoso, por exemplo, suspenso em um prope- lente com o auxílio de um tensoativo. O propelente pode ser qualquer mate- rial convencional empregado para essa finalidade, tal como cloro fluorocar- boneto, um hidrocloro fluorocarboneto, um hidrofluorocarboneto ou um hi- drocarboneto, incluindo tricloro fluorometano, dicloro difluorometano, dicloro tetrafluoroetanol e 1,1,1,2-tetra fluoroetano, HFA-134a (hidrofluroalcano- 134a), HFA-227 (hidrofluroalcano-227) ou semelhante. De preferência, o propelente é um hidrofluorocarboneto. O tensoativo pode ser escolhido para estabilizar o pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada como uma suspensão no propelente, para proteger o agente ativo contra degradação química e semelhantes. Tensoativos adequados incluem trioleato de sorbitan, Iecitina de soja, ácido oleico ou semelhante. Em alguns casos, aerossóis em solução são preferidos usando solventes tal como etanol. Agentes adicionais conhecidos na técnica para formulação de uma proteína, tal como uma proteína, também podem ser incluídos na for- mulação.

Aqueles versados na técnica reconhecerão que os métodos da presente invenção podem ser obtidos através de administração pulmonar de pelo menos uma composição de mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou varian- te especificada via dispositivos não descritos aqui. Formulações mucosais e administração

Para absorção através das superfícies mucosais, composições e métodos de administração de pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou por- ção ou variante especificada incluem uma emulsão compreendendo uma pluralidade de partículas em submícron, uma macromolécula mucoadesiva, um peptídeo bioativo e uma fase contínua aquosa, a qual promove a absor- ção através das superfícies mucosais através de obtenção de mucoadesão das partículas em emulsão (Pat. U.S. Ns 5.514.670). Superfícies mucosais adequadas para aplicação das emulsões da presente invenção podem incluir as vias de administração corneal, conjuntival, bucal, sublingual, nasal, vagi- nal, pulmonar, estomacal, intestinal e retal. Formulações para administração vaginal ou retal, por exemplo, supositórios, podem conter, como excipientes, por exemplo, polialquileno glicóis, vaselina, manteiga de cacau e semelhan- tes. Formulações para administração intranasal podem ser sólidas e conter, como excipientes, por exemplo, Iactose ou podem ser soluções aquosas ou oleosas de gotas nasais. Para administração bucal, excipientes incluem açú- cares, estearato de cálcio, estearato de magnésio, amido pré-gelatinizado e semelhantes (Pat. U.S. Ns 5.849.695). Formulações orais e administração

Formulações para distribuição oral contam com a co- administração de adjuvantes (por exemplo, resorcinóis e tensoativos não- iônicos, tais como polioxietileno oleíla éter e n-hexadecilpolietileno éter) para aumentar artificialmente a permeabilidade das paredes intestinais, bem co- mo a co-administração de inibidores enzimáticos (por exemplo, inibidores de tripsina pancreática, fluorofosfato de di-isopropila (DFF) e trasilol) para inibir a degradação enzimática. O composto constituinte ativo da forma de dosa- gem do tipo sólida para administração oral pode ser misturado com pelo me- nos um aditivo, incluindo sacarose, lactose, celulose, manitol, trealose, rafi- nose, maltitol, dextrana, amidos, Ágar, alginatos, quitinas, quitosanas, pecti- nas, goma tragacanto, goma arábica, gelatina, colágeno, caseína, albumina, polímero sintético ou semi-sintético e glicerídeo. Essas formas de dosagem também podem conter outro(s) tipo(s) de aditivos, por exemplo, agente de diluição inativo, lubrificante, tal como estearato de magnésio, parabeno, a- gente de conservação, tal como ácido sórbico, ácido ascórbico, alfa- tocoferol, antioxidante, tal como cisteína, desintegrante, aglutinante, espes- sante, agente de tamponamento, agente adoçante, agente flavorizante, a- gente aromático, etc.

Tabletes e pílulas podem ser ainda processados em preparados revestidos entéricos. Os preparados líquidos para administração oral incluem preparados de emulsão, xarope, elixir, suspensão e solução que permitem uso médico. Esses preparados podem conter agentes de diluição inativos comumente usados no referido campo, por exemplo, água. Iipossomas tam- bém têm sido descritos como sistemas de distribuição de fármaco para insu- lina e heparina (Pat. U.S. Ns 4.239.754). Mais recentemente, microesferas de polímeros artificiais de aminoácidos misturados (proteinóides) têm sido usadas para distribuir produtos farmacêuticos (Pat. U.S. Ns 4.925.673). Além disso, compostos misturados descritos na Pat. U.S. Ns 5.879.681 e Pat. U.S. Ns 5.871.753 são usados para distribuir agentes biologicamente ativos oral- mente são conhecidos na técnica. Formulações transdérmicas e administração

Para administração transdérmica, pelo menos um mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada é encapsulada em um dispositivo de distribuição, tal como um Iipossoma ou nanopartículas poliméricas, micropartículas, microcápsulas ou microesferas (referidas coletivamente como micropartículas, a menos que de outro modo estabelecido). Uma série de dispositivos adequados são conhecidos, incluindo micropartículas feitas de polímeros sintéticos, tais como polihidróxi ácidos, tais como ácido poliláctico, ácido poliglicólico e copolímeros dos mesmos, poliortoésteres, polianidridos e polifosfazenos e polímeros naturais, tais como colágeno, poliaminoácidos, albumina e outras proteínas, alginato e outros polissacarídeos e combinações dos mesmos (Pat. U.S. N0 5.814.599).

Administração prolongada e formulações

Algumas vezes, pode ser desejável distribuir os compostos da presente invenção ao indivíduo durante períodos prolongados de tempo, por exemplo, durante períodos de uma semana a um ano a partir de uma única administração. Várias formas de dosagem com liberação lenta, dGLP-1t ou implante podem ser utilizadas. Por exemplo, uma forma de dosagem pode conter um sal não tóxico farmaceuticamente aceitável dos compostos que tem um baixo grau de solubilidade em fluidos corporais, por exemplo (a) um sal de adição de ácido com um ácido polibásico, tal como ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido tânico, ácido pamóico, ácido algínico, ácido poliglutâmico, ácidos naftaleno mono- ou di-sulfônico, ácido poligalacturônico e semelhantes; (b) um sal com um cátion de metal polivalente, tal como zinco, cálcio, bismuto, bário, magnésio, alumínio, cobre, cobalto, níquel, cádmio e semelhantes ou com um cátion orgânico formado, por exemplo, Ν,Ν'-dibenzil-etilenodiamina ou etilenodiamina; ou (c) combi- nações de (a) e (b), por exemplo, um sal de tanato de zinco. Adicionalmente, os compostos da presente invenção ou, de preferência, um sal relativamente insolúvel, tais como aqueles já descritos, podem ser formulados em um gel, por exemplo, um gel de monoestearato de alumínio, por exemplo, com óleo de gergelim, adequado para injeção. Sais particularmente preferidos são sais de zinco, sais de tanato de zinco, sais de pamoato e semelhantes. Ou- tro tipo de formulação de dGLP-1t com liberação lenta para injeção conteria o composto ou sal disperso para encapsulação em um polímero de degrada- ção lenta, não tóxico, não antigênico, tal como polímero de ácido polilácti- co/ácido poliglicólico, por exemplo, conforme descrito na Pat. U.S. Ns 3.773.919. Os compostos ou, de preferência, sais relativamente insolúveis, tais como aqueles já descritos acima, também podem ser formulados em pelotas silásticas de matriz de colesterol, particularmente para uso em ani- mais. Formulações com liberação lenta, dGLP-1t ou implante adicionais, por exemplo, Iipossomas gasosos ou líquidos, são conhecidos na literatura (Pat. U.S. N® 5.770.222 e "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Sys- tems", J. R. Robinson ed., Mareei Dekker, Inc., N.Y., 1978). Tendo descrito de modo geral a invenção, a mesma será mais

prontamente compreendida através de referência aos exemplos a seguir, os quais são proporcionados à guisa de ilustração e não se destinam a ser Iimi- tativos.

Exemplo 1: Clonagem e expressão de um mimeticorpo de GLP-1 em células de mamífero

Um vetor de expressão de mamífero típico contém pelo menos um elemento promotor, o qual media o início de transcrição do mRNA, a se- quência de codificação de mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante es- pecificada e sinais requeridos para o término de transcrição e poliadenilação do transcrito. Elementos adicionais incluem intensificadores, seqüências de Kozak e seqüências intervenientes flanqueadas por sítios aceitadores e do- adores para splicing de RNA. Transcrição altamente eficiente pode ser obti- da com os promotores tardio e precoce de SV40, as repetições terminais longas (LTRS) de retrovírus, por exemplo, RSV, HTLVI, HIVI e o promotor precoce do citomegalovírus (CMV). Contudo, elementos celulares também podem ser usados (por exemplo, o promotor de actina humana). Vetores de expressão adequados para uso na prática da presente invenção incluem, por exemplo, vetores tais como pIRESIneo, pRetro-Off, pRetro-On, PLXSN ou pLNCX (Clonetech Labs, Palo Alto, CA), pcDNA3.1 (+/-), pcDNA/Zeo (+/-) ou pcDNA3.1 /Hygro (+/-) (Invitrogen), PSVLe PMSG (Pharmacia, Uppsala, Su- écia), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) e pBC12MI (ATCC 67109). Células hospedeiras de mamífero que poderiam ser usadas incluem células Hela 293, H9 e Jurkat, células NIH3T3 e C127 de camundongo, Cos 1, Cos 7 e CV 1, células QC1-3 de codorna, células L de camundongo e cé- lulas de ovário de hâmster chinês (CHO).

Alternativamente, o gene pode ser expresso em linhagens de célula estáveis que contêm o gene integrado em um cromossoma. A co- transfecção com um marcador selecionável, tal como dhfr, gpt, neomicina ou higromicina, permite a identificação e isolamento das células transfectadas.

O gene transfectado também pode ser amplificado para expres- sar grandes quantidades do mimeticorpo de GLP-1 codificado ou porção ou variante especificada. O marcador DHFR (reductase de dihidrofolato) é útil para desenvolver linhagens de célula que trazem várias centenas ou mesmo vários milhares de cópias do gene de interesse. Outro marcador de seleção útil é a enzima sintase de glutamina e (GS) (Murphy e outros, Biochem. J. 227: 277-279 (1991); Bebbington e outros, Bio/Technology 10: 169-175 (1992)). Usando esses marcadores, as células de mamífero são crescidas em meio seletivo e as células com a maior resistência são selecionadas. Es- sas linhagens de célula contêm o(s) gene(s) amplificado(s) integrado(s) em um cromossoma. Células de ovário de hâmster chinês (CHO) e NSO são, com freqüência, usadas para a produção do mimeticorpo de GLP-1 ou por- ções ou variantes especificadas.

Os vetores de expressão pC1 e pC4 contêm o promotor forte (LTR) do Vírus Sarcoma de Rous (Cullen e outros, Molec. Cell. Biol. 5: 438- 447 (1985)) mais um fragmento do intensificador de CMV (Boshart e outros, Cell 41: 521-530 (1985)). Múltiplos sítios de clonagem, por exemplo, com os sítios de clivagem por enzima de restrição BamHI, Xbal e Asp7l8, facilitam a clonagem do gene de interesse. Os vetores contêm, além do íntron 3', o si- nal de poliadenilação e término do gene de pré-pró-insulina de rato. Clonagem e Expressão em células CHO

O vetor pC4 é usado para a expressão do mimeticorpo de GLP-1 ou porção ou variante especificada. O plasmídeo pC4 é um derivado do plasmídeo pSV2-dhfr (Acesso a ATCC Ns 37146). O plasmídeo contém o gene de DHFR de camundongo sob o controle do promotor precoce de SV40. Células de ovário de hâmster chinês ou outras carecendo de atividade de dihidrofolato que são transfectadas com esses plasmídeos podem ser selecionadas através de crescimento das células em um meio seletivo (por exemplo, alfa minus MEM, Life Technologies, Gaithersburg, MD) suplemen- tado com o agente quimioterapêutico metotrexato. A amplificação dos genes de DHFR em células resistentes ao metotrexato (MTX) tem sido bem docu- mentada (veja, por exemplo, F. W. Alt e outros, J. Biol. Chem. 253: 1357- 1370 (1978); J. L. Hamlin e C. Ma, Biochem. et Biophys. Acta 1097: 107-143 (1990); e M. J. Page e M. A. Sydenham, Biotechnology 9: 64-68 (1991)). Cé- lulas crescidas em concentrações crescentes de MTX desenvolvem resis- tência ao fármaco através de super-produção da enzima alvo, DHFR, como um resultado de amplificação do gene de DHFR. Se um segundo gene é ligado ao gene de DHFR, usualmente ele é co-amplificado e superexpresso. Sabe-se na técnica que essa abordagem pode ser usada para desenvolver linhagens de célula trazendo mais de 1.000 cópias do(s) gene(s) amplifica- do(s). Subseqüentemente, quando o metotrexato é retirado, são obtidas li- nhagens de célula que contêm o gene amplificado integrado em um ou mais cromossomas da célula hospedeira.

O plasmídeo pC4 contém, para expressão do gene de interesse, o promotor forte da repetição terminal longa (LTR) do Vírus Sarcoma de Rous (Cullen e outros, Molec. Cell. Biol. 5: 438-447 (1985)) mais um frag- mento isolado do intensificador do gene precoce imediato do citomegalovírus humano (CMV) (Boshart e outros, Cell 41: 521-530 (1985)). A jusante do promotor estão sítios de clivagem por enzima de restrição BamHI, Xbal e Asp718 que permitem integração dos genes. Além desses sítios de clona- gem, o plasmídeo contém o íntron 3' e o sítio de poliadenilação do gene de pré-pró-insulina de rato. Outros promotores de alta eficiência também podem ser usados para a expressão, por exemplo, o promotor de β-actina humana, os promotores tardio ou precoce de SV40 ou as repetições terminais longas de outros retrovírus, por exemplo, HIV e HTLVI. Os sistemas de expressão de gene Tet-Off e Tet-On da Clontech e sistemas similares podem ser usa- dos para expressar o GLP-1 de uma forma regulada em células de mamífero (M. Gossen e H. Bujard, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 5547-5551 (1992)). Para a poliadenilação do mRNA, outros sinais, por exemplo, dos genes de hormônio de crescimento humano ou de globina, podem ser usados tam- bém. Linhagens de célula estáveis trazendo um gene de interesse integrado nos cromossomas também podem ser selecionadas quando de co- transfecção com um marcador selecionável, tal como gpt, G418 ou higromi- cina. É vantajoso usar mais de um marcador selecionável no início, por e- xemplo, G418 mais metotrexato.

O plasmídeo pC4 é digerido com enzimas de restrição e, então, desfosforilado usando fosfatase intestinal de bezerro através de procedimen- tos conhecidos na técnica. O vetor é, então, isolado de um gel de agarose a 1%.

A seqüência de DNA que codifica o mimeticorpo de GLP-1 com- pleto ou porção ou variante específica é usado, correspondendo às regiões variáveis de HC e LC de um mimeticorpo de GLP-1 da presente invenção, de acordo com etapas de método conhecidas. Ácido nucleico isolado que codifica uma região constante humana adequada (isto é, regiões HC e LC) também é usado nesse construto.

O DNA que codifica a região constante e variável isolada e o vetor desfosforilado são, então, ligados com DNA Iigase T4. Células de E. coli HB101 ou XL-1 Blue são, então, transformadas e são identificadas bac- térias que contêm o fragmento inserido no plasmídeo pC4 usando, por e- xemplo, análise com enzima de restrição.

Células de ovário de hâmster chinês (CHO) carecendo do gene de DHFR ativo são usadas para transfecção. 5 μg do plasmídeo de expres- são pC4 é co-transfectado com 0,5 μg do plasmídeo pSV2-neo usando Iipo- fectina. O plasmídeo pSV2neo contém um marcador selecionável dominan- te, o gene neo de Tn5 que codifica uma enzima que confere resistência a um grupo de antibióticos, incluindo G418. As células são cultivadas em alfa mi- nus MEM suplementado com 1 μg /ml de G418. Após 2 dias, as células são tripsinizadas e cultivadas em lâminas de clonagem de hibridoma (Greiner, Alemanha) em alfa minus MEM suplementado com 10, 25 ou 50 ng/ml de metotrexato mais 1 μg /ml de G418. Após cerca de 10-14 dias, clones únicos são tripsinizados e, então, cultivados em discos de Petri com 6 cavidades ou frascos de 10 ml usando diferentes concentrações de metotrexato (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM). Clones que cresceram nas maiores con- centrações de metotrexato são, então, transferidos para novas lâminas com 6 cavidades contendo concentrações ainda maiores de metotrexato (1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM). O mesmo procedimento é repetido até que se- jam obtidos clones que crescem em uma concentração de 100 - 200 mM. Expressão do produto genético desejado é analisada, por exemplo, através de SDS-PAGE e Western blot ou através de análise por HPLC de fase re- versa.

Exemplo 2: Exemplo não Iimitativo de um mimeticorpo de GLP-1 da inven- ção

GLP-1 é um peptídeo de 37 aminoácidos secretado das células L do intestino após um estímulo com glicose oral. Espera-se que um constru- to de mimeticorpo incorporando um peptídeo de GLP-1 (7-37) biologicamen- te ativo, variante ou derivado prolongue a vida útil in vivo do peptídeo e pro- porcione uma nova terapia para diminuição da glicose no sangue em pacien- tes com diabetes do tipo 2. Peptídeos que codificam o peptídeo de GLP-1 (7- 37) nativo ou um análogo resistente à DPP-IV podem ser incorporados na base do mimeticorpo. Várias dessas moléculas foram feitas e os mimeticor- pos resultantes demonstraram atividade funcional em ensaios baseados em célula in vitro. Deve ser notado que diferentes ensaios in vitro e modelos in vivo podem ser usados nesses estudos e as potências podem não ser com- paráveis umas com as outras ou com os resultados apresentados aqui.

Para gerar variantes de mimeticorpo de GLP-1, o peptídeo de GLP-1, o ligante, a dobradiça ou as seqüências CH2 e CH3 no mimeticorpo poderiam ser deletadas, adicionadas, substituídas, sofrer mutação ou ser modificadas para melhorar a expressão, potência, estabilidade ou funções efetuadoras.

A seqüência de GLP-1 do tipo selvagem (GLP-1 MMB de SEQ ID NO: 4A), bem como variantes de GLP-1 resistentes à DPP-IV, tal como MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4C (A2S) ou MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4B (A2G), podem ser incorporadas a uma base de mimeticorpo. Mutações do peptídeo poderiam ser feitas para melhorar as propriedades de um mimeti- corpo de GLP-1. Por exemplo, mutações nos resíduos amino terminais po- dem melhorar a sinalização, enquanto que mutações no domínio helicoidal podem estabilizar a hélice e, desse modo, melhorar a ligação ao receptor e/ou estabilidade do mimeticorpo.

O comprimento e a composição do ligante poderiam ter sofrido mutação para variar a flexibilidade ou estabilidade da fixação entre o peptí- deo de GLP-1 e a região Fc. Diferentes isotipos poderiam ser incorporados na região de dobradiça da molécula. Além disso, mutações poderiam ser feitas dentro da região de dobradiça do mimeticorpo para estabilizar a molé- cula. Por exemplo, a dobradiça de lgG4 humana poderia sofrer mutação pa- ra fazer a variante Ser228->Pro, para estabilizar as ligações dissulfeto inter- cadeia no mimeticorpo. Variações dentro da porção Fc do mimeticorpo pode- riam ser feitas para melhorar a estabilidade da molécula e alterar funções efetuadoras, tal como ligação a FcR. Por exemplo, se poderia usar isotipos humanos ou de murino (ou variações dessas moléculas), tal como lgG4 com mutações Ala/Ala.

Mimeticorpo de GLP-1 da presente invenção

Um exemplo não Iimitativo específico da presente invenção é o construto de mimeticorpo de GLP-1 (SEQ ID NO: 2) de acordo com a Fórmu- la (I):

((P(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t), onde P é uma única cópia do peptídeo de GLP-1 bioativo (7-36), L é uma repetição aleatória de Iigante flexível Gly-Ser ou Gly-Gly-Gly-Ser, V é o Ο- ΙΟ término da seqüência VH, isto é, a região J de uma IgG que ocorre natural- mente, H é a região de dobradiça de lgG4 completa e CH2 & CH3 são a subclasse de isotipo de lgG4. Espera-se que a meia-vida desse construto possa ser muitas vezes aquela do peptídeo de GLP-1 sozinho ou sua varian- te ou derivado e similar àquela de uma IgG. Além da estrutura básica descrita acima, variantes com caracte-

rísticas biológicas potencialmente favoráveis são descritas. Essas incluem construtos que podem ter uma tendência diminuída a auto-associar, funções efetuadoras imunes reduzidas ou imunogenicidade diminuída. Outras modifi- cações que conferem características desejadas, tais como conformação a- perfeiçoada do peptídeo biologicamente ativo e transferência através da bar- reira sangue/cérebro, são consideradas. As variantes e modificações pro- postas podem ser combinadas de qualquer modo para proporcionar constru- tos com atividades desejadas.

Usando métodos de DNA recombinante, o peptídeo de GLP-1 foi inserido em um vetor intermediário entre um peptídeo sinalizador de imuno- globulina e uma seqüência J humana. Isso foi feito usando oligonucleotídeos sintéticos complementares com extremidades compatíveis com os sítios de restrição presentes no vetor. Esses oligonucleotídeos compreendiam se- qüências de codificação para o peptídeo de GLP-1 e um Iigante flexível composto de duas repetições GGGS. Um fragmento de restrição contendo os elementos funcionais mencionados acima foi, então, transferido para um vetor de expressão. Esse vetor continha o promotor e o intensificador de i- munoglobulina anti-CD4 e a seqüência de codificação para a seqüência de dobradiça de lgG4 humana, região constante de 2 (CH2) e região constante 3 (CH3) de HC, bem como os elementos necessários para replicação de plasmídeo e seleção em bactérias e seleção por expressantes estáveis em células de mamífero.

Esse plasmídeo foi introduzido nas células HEK293E e expres- são do MMB de GLP-1 do tipo selvagem foi obtida em células transitoria- mente transfectadas. Purificação de MMB de GLP-1 foi realizada através de cromatografia por afinidade em proteína A e Superose 12 padrão, proporcio- nando aproximadamente 1,5 mg/L de células transfectadas. Essa proteína foi o material de iniciação para os experimentos descritos abaixo.

A seqüência de aminoácido de um mimeticorpo de GLP-1 é mostrada na Figura 1. Domínios funcionais são anotados acima da seqüên- cia de codificação peptídica. Acredita-se que a seqüência J proporcionará ainda mais flexibilidade ao permitir que o segmento de GLP-1 assuma a con- formação apropriada e permite que os peptídeos se projetem da estrutura globular da imunoglobulina, possibilitando uma orientação apropriada para ligação ao receptor de GLP-1. As regiões CH2 e CH3 constituem o grosso da proteína. Uma das razões pelas quais acredita-se que imunoglobulinas tenham uma meia-vida longa no soro é sua capacidade de se ligar ao FcRn1 que prolonga a meia-vida no soro retornando à imunoglobulina que sofreu pinocitose de volta para o espaço extracelular. O sítio de ligação do FcRn se sobrepõe à junção das regiões CH2 e CH3 (Sheilds e outros, 2001, J. Biol. Chem., vol. 276 (9), 6591-6604). É bem sabido que duas cadeias pesadas de IgG são montadas

durante processamento celular via ligações de dissulfeto entre cisteínas lo- calizadas na região de dobradiça para formar um homodímero. Espera-se que isso também ocorra entre os peptídeos modificados para formar o cons- truto de mimeticorpo de GLP-1 montado. A estrutura esperada de um mime- ticorpo de GLP-1 contém dois peptídeos de GLP-1.

Experimentos similares foram repetidos para o MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4 e resultados similares foram obtidos. Exemplo 3: Ensaio de ligação FACS

A atividade de um mimeticorpo de GLP-1 foi testada em um en- saio de ligação FACS in vitro. Para determinar se o MMB de GLP-1 se liga ao GLP-1 R, células HEK293 (1 χ 106 células) superexpressando o GLP-1 R foram incubadas com MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4A (20 nM) durante 2 horas a 4°C. As células foram lavadas e um anticorpo de detecção secundá- rio fluorescentemente rotulado (1 μg/mL de anti-lgG humana de cabra, Fc gama-específico) foi adicionado durante 30 minutos a 4°C. A intensidade de fluorescência das células foi monitorada via citometria de fluxo. A Figura 2A mostra que o MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4A se liga à células HEK293 superexpressando o GLP-1 R (cinza, MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4A, mas não secundário; preto, secundário apenas; vermelho, MMB de controle negativo e secundário; azul, MMB de GLP-1 e secundário). A Figura 2B mostra que o MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4A não se liga à células HEK293 de controle (cinza, MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4A, mas não secundário; preto, secundário apenas; azul, MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4A e secundário). A Figura 2C mostra que um análogo de peptídeo de GLP- 1 (A2S) é capaz de competir com o MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4A pela ligação à células HEK293 superexpressando o GLP-1 R (cinza, MMB de GLP-1- de SEQ ID NO: 4A, mas não secundário; preto, MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4A e secundário; laranja, MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4A, competidor a 0,2 nM, secundário; azul, MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4A, competidor a 20 nM, secundário; vermelho, MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4A, competidor a 100 nM, secundário). Experimentos similares foram repetidos para o MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4 e resultados similares foram obtidos. Exemplo 4: Ensaio de cAMP

GLP-1 se liga a seu receptor, um receptor proteína G-acoplado, resultando em um aumento dose-dependente na molécula de sinalização, AMP 3',5'-cíclico (cAMP). cAMP pode ser medido com um ensaio in vitro em células expressando GLP-1 R (Applied Biosystems). Resumidamente, células Rinm (100.000 células) foram incubadas com concentrações crescentes de peptídeo de GLP-1 (0-30 nM) ou um MMB de GLP-1 (0-100 nM). As células foram submetidas à Iise e a quantidade de cAMP foi determinada usando um ensaio competitivo que emprega um conjugado de cAMP rotulado com fosfa- tase alcalina e um substrato quimioluminescente (Tropix® CDPD®). A ativi- dade de cAMP concentração-dependente para o MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4A do tipo selvagem (Figura 3A) é comparável com o peptídeo de GLP- 1 (Figura 3B) (EC50 = 11 nM vs. 0,4 nM, respectivamente). Em um experi- mento similar, MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4B (A2G) em uma base de lgG4 (Figura 3C) e MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4B (A2S) em uma base de lgG4 (Figura 3D) aumentaram ambos os níveis de cAMP em células Rinm para um nível significativamente maior do que o MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4A do tipo selvagem em uma base de lgG4. Experimentos similares foram repetidos para o MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4 e resultados similares foram obtidos. Exemplo 5: Atividade in vitro de MMB de GLP-1, conforme medido através de

Um ensaio de cAMP LANCE™ foi usado para medir a atividade funcional de MMB de GLP-1 em células INS-1E, uma linhagem de célula de insulinoma de rato que expressa o receptor de GLP-1. Materiais/Métodos: Células INS-1E foram cultivadas em RPMI

1640/FBS a 10%/L-glutamina a 1%/piruvato de sódio a 1%/aminoácidos não essenciais a 1 %/p-Mercaptoetanol a 50 μΜ e mantidas a 37°C em uma incu- badora umidificada com 5% de CO2. Kits LANCE cAMP foram adquiridos da Perkin Elmer (Boston, MA). O peptídeo de GLP-1 foi adquirido da Sigma (St Louis, MO). Os dados foram analisados no GraphPad PRISM, versão 4.03.

Ensaio de cAMP: Células INS-1E foram colocadas a 100.000 células/cavidade em lâminas com 96 cavidades (Costar 3610) e deixadas se recuperar 4 dias em meio de crescimento normal. O meio foi aspirado das cavidades e 24 μΙ de anticorpo anti-cAMP Alexa Fluor 647 (LANCE cAMP Kit, Perkin Elmer, Boston, MA) foram adicionados, seguido por 24 μΙ de MMB de GLP-1 de SEQ ID NO 4 (em PBS/BSA a 0,5%/IBMX a 0,5 mM). As célu- las foram estimuladas em temperatura ambiente durante 7 minutos e subme- tidas à lise, conforme o protocolo do fabricante. As lâminas foram incubadas em temperatura ambiente durante 1 hora e a intensidade de fluorescência foi medida a 665 nm. As concentrações de cAMP foram determinadas usando uma curva padrão.

Resultados: A concentração de cAMP foi plotada contra a concentração de MMB de GLP-1 de SEQ ID NO 4 (nM) e os pontos foram adaptados a uma hipérbole, proporcionando uma EC5O de 8,7 nM (Figura 18A). Os dados obti- dos com peptídeo de GLP-1 foram plotados da mesma maneira, proporcio- nando uma EC5O de 0,11 nM (Figura 18B). Exemplo 6: Ensaio de clivaqem de DPP-IV

Uma vez que o GLP-1 é rapidamente inativado pela DPP-IV1 um ensaio in vitro foi estabelecido para quantificar o MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4A intacto (isto é, não clivado). Resumidamente, MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4A ou peptídeo (1,2 nM) foi incubado em temperatura ambiente com DPP-IV (1 μς/ηιί, R&D Systems). Após vários tempos (0, 5, 10, 15, 20, 30, 40 minutos), um inibidor de DPP-IV (100 μΜ, Linco) foi adicionado para resfriar rapidamente a reação. A quantidade de MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4A intacto ou peptídeo foi medida usando o GLP-1 Active ELISA (Linco) e o MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4A ou peptídeos para as respectivas curvas padrões. A Figura 4 mostra que o MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4A era significativamente mais resistente à clivagem por DPP-IV, com relação ao peptídeo de GLP-1.

Experimentos similares foram repetidos para o MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4 e resultados similares foram obtidos. Exemplo 7: Ensaio de estabilidade em soro humano

A estabilidade do MMB de GLP-1 no soro também foi medida para assegurar que outras proteases no soro não eram capazes de clivar e inativar o MMB de GLP-1. Resumidamente, peptídeo de GLP-1 ou o MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4C (30 nM) foi incubado em soro humano a 37°C. Após vários tempos, as reações foram resfriada bruscamente com um inibi- dor de DPP-IV (100 μΜ, Linco) e as amostras foram analisadas usando o ELISA de GLP-1 Active da Linco. A Figura 5 mostra que o MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4C é estável no soro humano durante 24 horas, enquanto que o peptídeo decai rapidamente.

Experimentos similares foram repetidos para o MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4 e resultados similares foram obtidos.

Exemplo 8: MMB de GLP-1 causa secrecão de insulina em células RINm

Para testar o efeito de MMB de GLP-1 na secreção de insulina, células RINm foram tratadas com concentrações crescentes de peptídeo de GLP-1 (7-36) (0-5 nM), peptídeo de exendina-4 (0-5 nM) ou vários mimeti- corpos de GLP-1 (5 ou 50 nM) e a quantidade de insulina secretada foi me- dida via ELISA. Todos os MMBs de GLP-1 testados tinham atividades ao estimular a secreção de insulina em células RINm (Figura 6). A 50 nM, os MMBs tinham atividades comparáveis àquelas do peptídeo de GLP-1 (7-36) do tipo selvagem.

Exemplo 9: Atividade in vitro de MMB de GLP-1. conforme medido através da secreção de insulina

Um outro ensaio de secreção de insulina foi desenvolvido para medir a atividade funcional in vitro do MMB de GLP-1 de SEQ ID NO 4.,

Cultura de células: Células INS-1E foram cultivadas em RPMI 1640/FBS a 10%/L-glutamina a 1%/piruvato de sódio a 1%/aminoácidos não essenciais a 1%/p-Mercaptoetanol a 50 μΜ e mantidas a 37SC em uma incu- badora umidificada com 5% de CO2. Os dados foram analisados no Graph- Pad PRISM, versão 4.03.

Ensaio de secrecão de insulina: Células INS-1E foram colocadas a 100.000 células/cavidade em lâminas com 96 cavidades (Costar 3610) e deixadas se recuperar 4 dias em meio de crescimento normal. As células foram lavadas duas vezes e 0,1 ml de tampão de KRBH/glicose a 3 mM foi adicionado. As células foram deixadas equilibrar nesse tampão durante 2 horas. O meio foi removido e 0,12 ml de MMB de GLP-1 de SEQ ID NO 4 em KRBH com glicose a 6,5 mM foram adicionados por cavidade. Vinte mi- crolitros de sobrenadante foram removidos por cavidade para o ponto de tempo T = 0. As células foram incubadas durante duas horas a 37°C a 5% de CO2 e vinte microlitros de sobrenadante foram removidos por cavidade. 15

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Os sobrenadantes foram congelados a -20*C até que o ELISA de insulina fosse realizado. As concentrações de insulina foram determinadas usando um kit Ultra Sensitive Rat Insulin ELISA (Crystal Chem).

Resultados: Os dados foram plotados como a quantidade de in- sulina secretada em cada concentração de MMB de GLP-1 de SEQ ID NO 4

(Figura 19). MMB de GLP-1 de SEO In Mn a /opl

«1-r- I ue itu IU NO 4 (25 nM) aumentou significati- vamente a quantidade de insulina secretada no sobrenadante

Exemplo 10: MMB d. ΠΙ P-1 diminui η n.Ve, d. -------η,Γηηη_

db/db

Camundongos db/db de seis semanas de idade foram submeti-

dos a jejum durante duas horas e, então, intravenosamente dosados com veiculo, peptídeo de GLP-1 ou MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4C (A2S) A glicose no sangue foi monitorada 0,5, 1, 2, 3 e 4 horas pós-dosagem O pep- tídeo de GLP-1 diminuiu a glicose no sangue em 30 minutos mas, em 60 minutos, a glicose no sangue começa a aumentar novamente provavelmente em virtude da meia-vida curta do peptídeo de GLP-1. Em comparação o MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4C (A2S), em uma dose 100 vezes menor do que a dose de peptídeo de GLP-1, induziu a uma diminuição na glicose no sangue por todo o período de 4 horas (Figura 7A). Além disso, a diminui- -çao de glicose no sangue foi dose-dependente (Figura 7B).

Experimentos similares foram repetidos para o MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4 e resultados similares foram obtidos. ,Exemplo 11: Farmacocinétioa dP MMB de G. P.ic ^ Camijnriftnfinc am macacos cynnmnlr|i

Para medir a farmacocinética de quatro mimeticorpos de GLP-1 (A2G, A2S, exedina-cap e tipo selvagem) (SEQ ID NO: 4B, SEQ ID NO- 4C SEQ ID NO: 4D e SEQ ID NO: 4A, respectivamente), camundongos C57/BI6 foram intravenosamente dosados com 1 mg/kg dos MMBs. Plasma foi obtido via punção cardíaca após sacrifício dos camundongos em diferentes pontos de tempo. Vários ELISAs foram usados para medir Fe, MMB total, MMB ati- vo e peptídeo ativo, conforme eles eram metabolizados no animal. MMB ati- vo reflete o N-término intacto do peptídeo ainda preso à região Fc do mime- 10

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ticorpo. Substituição do segundo aminoácido no peptídeo (alanina) por uma

serina ou uma glicina prolongou a vida útil do MMB ativo em circulação.

Macacos cynomolgus foram injetados intravenosamente com 1,0

mg/kg de quatro construtos de MMB de GLP-1 diferentes e amostras de soro

foram tomadas em diferentes pontos de tempo, de 10 minutos a 5 dias após

dosagem. As amostras de soro foram avaliadas através de ELISA para

quantificar o MMB intacto. Conforme ilustrado na Figura 8, todos os quatro

MMBs exibiram uma fase de distribuição rápida, seguido por uma fase de

desobstrução mais lenta. As constante de farmacocinética foram calculadas

para cada um dos construtos para indicar uma TV2 de aproximadamente 3

dias, com exposição similar determinada através da AUC de T = 0 a T = 120 horas.

Experimentos similares foram repetidos para o MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4 e resultados similares foram obtidos.

Exemplo 12: caracterização farmacocinética de MMB cie GLP-1 em ratns ρ macacos

MMB de GLP-1 foi manipulado para manter a bioatividade de GLP-1 enquanto se estendia seu perfil farmacocinético (PK).

Farmacocinética em ratos: Ratos Sprague-Dawley-derivados foram tratados com uma única dose subcutânea ou intravenosa de MMB de GLP-1 de SEQ ID NO 4 (3,0 mg/kg, lote #8833173) (1). Aproximadamente 300 μΙ de sangue foram coletados em vários tempos após dosagem em ci- trato de sódio (3,8%) contendo inibidores de protease (Roche Complete ED- TA free, Roche Applied Science, Indianápolis, IN) e inibidores de DPP4 (Lin- co, St. Charles, MO). Plasma foi isolado e armazenado a -80° até que as amostras pudessem ser analisadas. A concentração do MMB de GLP-1 de SEQ ID NO 4 intacto foi medida usando a tecnologia Mesoscale Discovery (MSD) [3-7]. Resumidamente, amostras de plasma foram serialmente diluí- das através de BioMek Fx durante um total de 4 diluições, puras, 1:8, 1:64 e 1:512. Curvas padrão idênticas em plasma puro foram incluídas em cada lâmina. MMB de GLP-1 de SEQ ID NO 4 foi capturado sobre lâminas MSD pelo anticorpo monoclonal biotinilado (CNT01626) criado para detectar o N- término intacto do MMB de GLP-1 de SEQ ID NO 4. Anticorpo monoclonal rotulado com rutênio que reconhece a região Iigante sobre o MMB de GLP-1 de SEQ ID NO 4 (CNT0712) foi adicionado para detecção e as respostas de luminescência foram determinadas usando o leitor Sector Imager 6000 para MSD. O nível de MMB de GLP-1 de SEQ ID NO 4 foi calculado usando a curva de dose-resposta sigmoidal (GraphPad PRISM).

Farmacocinética em macacos: Macacos cynomolgus foram do- sados intravenosamente com MMB de GLP-1 de SEQ ID NO 4 (1,0 mg/kg, lote #8833013) no Diabetes Research lnstitute, University of Miami (2). Os macacos foram quimicamente restringidos com HCI.cetamina (100 mg/mL, mg/kg) antes de dosagem e coletas de sangue. MMB de GLP-1 de SEQ ID NO 4 foi administrado em um volume de dose de 2,2 mL/kg em uma taxa de 1 mLVminuto. Aproximadamente 2 mL de sangue foram coletados em vá- rios pontos de tempo após dosagem em citrato de sódio (3,8%) contendo inibidores de protease (Roche Complete EDTA Free, Roche Applied Scien- ce, Indianápolis, IN) e inibidores de DPP4 (Linco, St. Charles, MO). Plasma foi isolado e armazenado a -80° até que as amostras pudessem ser analisa- das. As concentrações de MMB de GLP-1 de SEQ ID NO 4 no plasma foram medidas conforme descrito acima. Análise de dados: Análise não-compartimental (NCA) foi empre-

gada para calcular os parâmetros farmacocinéticos de MMB de GLP-1 de SEQ ID NO 4 (WinNonlin, Versão 5.1, Pharsight Corporation, Mountain View, CA). A concentração máxima no soro, Cmax e o tempo para atingir a Cmax (Tmax), foram obtidos a partir de inspeção dos perfis de concentração no soro vs. tempo. A área sob a curva de concentração (AUC) do tempo 0 para o último ponto de tempo com níveis quantificáveis de MMB de GLP-1 de SEQ ID NO 4 foi calculada (AUC (0-7d) para rato, AUC (0-21 d) para maca- co), bem como a AUC do tempo 0 até infinito. Os valores de AUC foram ob- tidos através de integração trapezoidal linear. A constante de taxa terminal (λζ) foi determinada através de análise por regressão de mínimos quadrados da porção Iog-Iinear da fase terminal. A meia-vida terminal, t1/2, foi calculada a partir da proporção de 0,693 e λζ. Resultados:

10

Farmacocinética em ratos: O perfil farmacocinético de MMB de

GLP-1 de SEQ ID NO 4 no plasma em ratos após uma única administração sc

e iv é mostrado (Figura 20A). A análise farmacocinética completa a partir dos

dados com ratos é resumida na Tabela 1. A meia-vida terminal de MMB de

GLP-1 de SEQ ID NO 4 foi modelada como sendo de 1,5 dias após dosagem

iv e 1,7 dias após dosagem sc. A biodisponibilidade de MMB de GLP-1 de

SEQ ID NO 4 após administração sc foi de aproximadamente 22%.

Tabela 2. Características farmacocinéticas de MMB de GLP-1 de SEQ ID

NO 4 em ratos SD após uma única administração sc e iv (3 mg/kg). Estudo com CNTO 3649 P-2007-043 - 3 mg/kg IV ou SC a ratos

Cmax Tma X AUC(0- 7d) AUCinf Cl Vss t1/2 F Material (via) ug/mL dia di- di- m L/d ia/k mL/kg dia % a*ug/mL a*ug/mL g GLP- média 53,91 na 23,61 23,86 125,90 110,0 1,48 na 1MMB (iv) 7 Of SEQ ID sd 5,03 na 1,11 1,06 5,59 7,32 0,49 na NO 4 %CV 9,3 na 4,7 4,4 4,4 6,7 33,0 na GLP- média 2,29 0,83 5,04 5,20 na na 1,73 #### 1MMB (sc) of SEQ ID sd 0,10 0,29 0,20 0,30 na na 1,10 1,85 NO 4 %CV 4,5 34,6 4,0 5,7 na na 63,7 8,5 R07A012 média 94,67 na 56,52 56,75 52,94 52,35 0,89 na (IV) sd 5,33 na 2,66 2,60 2,48 2,24 0,04 na %CV 5,6 na 4,7 4,6 4,7 4,3 4,9 na R07A013 média 109,82 na 67,07 67,39 44,62 42,92 0,93 na (IV) sd 6,03 na 3,99 4,00 2,58 2,71 0,03 na %CV 5,5 na 5,9 5,9 5,8 6,3 2,8 na Farmacocinética em macacos: O perfil farmacocinético de MMB de GLP-1

no plasma de macacos após uma única administração iv é mostrado (Figura

20B). A análise farmacocinética completa é resumida na Tabela 2. A meia-

«da terminal de MMB de GLP-1 em macacos foi modelada como sendo de 2,9 dias.

lãbejaa Características farmacocinéticas de MMB de GLP-1 de SEQ ID

Γ2^^1^^ iv η mq/k,

Parâmetros PK Omax AUC(0-21) AUCinf Cl Vss Vz 1/2

ug/mL dia*ug/mL dia*ug/mL mL/dia/kg mL/kg mLVkg dia

Cone, média (ug/mL) sd

4ÕÕ9 " ^8

41,92 10,25

42,05 10,29

24.81 6>38

50,18 1907

05,40 3492

2,93 O37

%CV 23,1

24.4

24.5 25,7

38.0

33.1 12,7

Efeitos de MMB de GLP-1 durante um teste de tolerância à g.i- cose oral em camundongos diabéticos

Camundongos diabéticos db/db de oito semanas de idade foram submetidos a jejum durante 6 horas antes de uma injeção subeutânea do MMB de GLP-, de SEQ ID NO: 4C (0,02 a 2 mg/Kg). Após dosagem, os ca- mundongos foram submetidos a jejum durante mais seis horas e uma medi- ção de glicose em jejum no sangue de linha de base foi medida A t = 0 aos camundongos foi fornecida uma ingestão oral forçada de 1,0 mg/0 de glicose e a glicose no sangue foi medida em vários tempos. Os resultados mostra- dos na Rgura 9 indicam que o MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4C foi eficaz

ao diminuir a excursão de glicose durante um teste de tolerância à glicose oral em todas as doses testadas.

Experimentos similares foram repetidos para o MMB de GLP-1

de SEQ ID NO: 4 e resultados similares foram obtidos.

Exemplo 14: Efeitos rte MMp He GLP-1 cnhra ani-

,V"VID ^lp-I sohre a glicose Pm jejum no sangnp

durante dosagem crânio a ^munriongnc Hia^tirn,.

Camundongos diabéticos db/db de dez semanas de idade foram subeutaneamente dosados diariamente com veículo ou MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4C (1 mg/kg) durante seis semanas. A glicose em jejum no sangue foi medida duas vezes por semana durante o curso do estudo. A gli- cose em jejum no sangue foi reduzida nos animais tratados com relação aos controles por todo o estudo (Figura 10) e, em seis semanas, a diferença foi mais de 200 mg/dL (466 vs 221 mg/dl_, animais com controle e tratados, respectivamente).

Experimentos similares foram repetidos para o MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4 e resultados similares foram obtidos. Exemplo 15: Efeitos de MMB de GLP-1 quando de um teste de tolerância à glicose oral após dosagem crônica a camundonqos diabéticos

Conforme no Exemplo 11, camundongos diabéticos db/db de dez semanas de idade foram dosados diariamente com veículo ou MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4C (1 mg/kg) durante seis semanas. Após 40 dias de dosagem, aos camundongos foi fornecido um teste de tolerância à glicose oral. Resumidamente, a t = 0, foi fornecida aos camundongos uma ingestão oral forçada de 1,0 mg/g de glicose e a glicose no sangue foi medida em vá- rios tempos. Os resultados mostrados na Figura 11 indicam que o MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4C foi eficaz ao diminuir a excursão de glicose duran- te um teste de tolerância à glicose oral, sugerindo que camundongos trata- dos cronicamente com MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4C são capazes de dispor de uma carga de glicose mais eficientemente com relação aos ani- mais de controle.

Experimentos similares foram repetidos para o MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4 e resultados similares foram obtidos. Exemplo 16: Efeitos de MMB de GLP-1 sobre a redução de HbAIc após do- sagem crônica a camundonqos diabéticos

Conforme nos Exemplos 11 e 12, camundongos diabéticos db/db de dez semanas de idade foram dosados diariamente com veículo ou MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4C (1 mg/kg) durante seis semanas. Antes e após seis semanas de dosagem, amostras de sangue íntegro foram toma- das e analisadas com relação ao percentual de HbA1c. Conforme mostrado na Figura 12, a HbAIC dos animais tratados com GLP-1 aumento em 109 por cento durante o período de seis semanas enquanto que, nos animais tratados com controle, aumentou em 142 por cento. Esses dados sugerem que os animais tratados são mais capazes de regular sua glicose no sangue durante um período crônico com relação aos controles.

Experimentos similares foram repetidos para o MMB de GLP-1

de SEQ ID NO: 4 e resultados similares foram obtidos. Exemplo 17: Efeitos de MMB de GLP-1 guando de um teste de tolerância à glicose oral em macacos cvnomolqus normais

Um teste de tolerância à glicose oral (OGTT) foi feito em maca- cos cynomolgus normais antes de e após seis dias depois de uma única do- se do MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4C (1 mg/kg). Resumidamente, a t = O, foi fornecida aos macacos uma ingestão oral forçada de 2,0 mg/g de gli- cose e a glicose no sangue foi medida em vários pontos de tempo. Os níveis de glicose no sangue foram significativamente reduzidos no OGTT feito seis dias após dosagem (Figura 13A) e os níveis de insulina foram significativa- mente aumentados (Figura 13B). Isso sugere que o MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4C está causando secreção de insulina do pâncreas em concentra- ções elevadas de glicose.

Experimentos similares foram repetidos para o MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4 e resultados similares foram obtidos.

Exemplo 18: Efeitos de MMB de GLP-1 sobre a coloração de insulina em ilhotas de camundongos diabéticos (db/db) após uma única dose

Camundongos diabéticos (db/db) de doze semanas de idade foram tratados com uma única dose subcutânea do MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4C (1,5 mg/kg) e os pancreatas foram coletados quatro semanas de- pois. Os pancreatas foram seccionados e manchados com relação à presen- ça de insulina. Conforme mostrado na Figura 14, havia significativamente mais coloração de insulina nos animais tratados com relação aos animais de controle.

Experimentos similares foram repetidos para o MMB de GLP-1

de SEQ ID NO: 4 e resultados similares foram obtidos. Exemplo 19: MMB de GLP-1 retarda o esvaziamento gástrico em cães nor- mais

Uma cânula gástrica foi cirurgicamente implantada em cães be- agle fêmeas (10-15 kg) sob anestesia geral e os mesmos deixados se recu- perar durante pelo menos 2 semanas. Os cães foram submetidos a jejum durante 24 horas, após o que água estava livremente disponível. A cânula gástrica foi aberta e o suco gástrico e restos de alimento foram removidos com 40-50 ml de água morna. Grupos de seis cães foram dosados subcuta- neamente com lidamidina, um alfa2 agonista (0,63 mg/kg), 60 minutos antes da refeição, um controle positivo para retardo de esvaziamento gástrico. Cães dosados com o controle de veículo ou MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4b (0,1 mg/kg) foram dosados intravenosamente na veia cefálica 15 minutos antes da refeição. Cinco minutos após a refeição, a cânula gástrica foi aberta para determinar a quantidade de fluido presente no estômago para o valor de linha de base e o fluido foi prontamente introduzido. Então, uma refeição de teste consistindo em 250 ml de uma solução de glicose (5 g/l) foi adminis- trada via a cânula e deixada permanecer no estômago durante 30 minutos. Os conteúdos gástricos foram drenados do estômago para medir o volume total após 30 minutos. Um ml dos conteúdos gástricos foi retido para análise e o volume restante foi re-introduzido no estômago via a cânula. Avaliação do volume de conteúdo gástrico e recuperação de amostras foram repetidas a 60, 90 e 120 minutos. As concentrações de glicose foram avaliadas para as amostras coletadas e usadas para determinar a quantidade absoluta de glicose restante no estômago em cada ponto de tempo. O percentual de gli- cose retida no estômago foi determinado a partir do valor inicial e a concen- tração de glicose em cada ponto de tempo e plotado como uma função do tempo. O tempo no qual 50% dos conteúdos gástricos foram retidos foi de- terminado através de adaptação das curvas a um único exponencial. Con- forme mostrado na Figura 15, 50% dos conteúdos gástricos foram esvazia- dos em cães dosados com veículo nos 12,35 ± 3,69 seguintes, enquanto que cães dosados com controle positivo de lidamidina e MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4b mostraram um retardo significativo no esvaziamento gástrico (30,60 ± 6,47 e 59,23 ± 14,46, respectivamente). Experimentos similares foram repetidos para o MMB de GLP-1 de SEQ ID NO 4 e resultados similares foram obtidos. Exemplo 20: MMB de GLP-1 diminui a glicose no sangue após um teste de tolerância à glicose oral (OGTT) em camundonoos obesos dieta-induzidos Para desenvolver um modelo com murinos de obesidade dieta-

induzida, os camundongos foram mantidos sob uma dieta com elevado teor de gordura durante pelo menos 27 semanas. Os camundongos se tornaram obesos e foram determinados como sendo diabéticos quando os valores de glicose em jejum no sangue excediam a 120 mg/dl. Para avaliar o efeito de terapia com MMB de GLP-1 sobre os níveis pós-prandiais de glicose no sangue, camundongos obesos dieta-induzidos foram submetidos a jejum durante a noite e dosados subcutaneamente com 0,02, 0,2 ou 2 mg/kg de MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4c ou controle de veículo. Seis horas após dosagem aos camundongos foi fornecida uma ingestão gástrica forçada de 1,5 mg/g de glicose. Os níveis de glicose no sangue foram determinados antes de dosagem de MMB, a t = 0, 15, 30, 60, 90, 120, 150 e 180 minutos usando sangue da veia caudal. Conforme mostrado na Figura 16, uma dimi- nuição dose-dependente de MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4c nos valores de glicose no sangue em jejum foi observada a t = 0 e todos os pontos de tempo subsequentes. As áreas sob a curva foram calculadas entre t = 0 e t = 180, demonstrando uma diminuição significativa na glicose disponível ofer- tada em todas as doses.

Experimentos similares foram repetidos para o MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4 e resultados similares foram obtidos. Exemplo 21: MMB de GLP-1 diminui a glicose no sangue em um teste de tolerância à glicose intraperitoneal (IPGTT) em camundongos db/db

Camundongos machos db/db de aproximadamente 13-15 sema- nas de idade foram aleatoriamente distribuídos em grupos de tratamento de seis camundongos baseado nos níveis de glicose em jejum no sangue. Os camundongos foram dosados com 0,02 mg/kg ou 0,1 mg/kg de MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4c ou 0,1 mg/kg de MMB de controle negativo seis horas antes do teste de tolerância à glicose. Cinco minutos antes do teste de tolerância à glicose, uma medição de glicose foi tomada com um glicômetro manual de sangue da veia caudal. Os camundongos foram, então, dosados intraperitonealmente com 1 mg/g de D-glicose e os níveis de glicose no san- gue foram monitorados a 10 min, 20 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 150 min e 180 min. Conforme ilustrado na Figura 17A, os níveis de glicose no sangue eram significativamente menores em ambos os grupos tratados com MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4c durante todo o curso de tempo. Gru- pos adicionais de animais tratados da mesma maneira foram sacrificados para medição dos níveis de insulina a t = 10 minutos. Há um aumento dose- dependente na quantidade de insulina liberada 10 minutos após dosagem com MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4c.

Experimentos similares foram repetidos para o MMB de GLP-1 de SEQ ID NO: 4 e resultados similares foram obtidos. Exemplo 22: Estudo farmacodinâmico agudo com MMB de GLP-1 Para demonstrar a atividade biológica de um MMB de GLP-1 de

SEQ ID NO 4, um teste de tolerância à glicose intraperitoneal (ipGTT) foi realizado em camundongos obesos dieta-induzidos (DIO).

Materiais/Métodos: D-glicose foi adquirida da Sigma. Os estudos descritos abaixo usaram camundongos C57BI/6J obesos dieta-induzidos (DIO) que foram iniciados com uma dieta contendo 60,9% de gordura (Puri- na TestDiets 58126) a 4 semanas de idade. Os valores de glicose no sangue em jejum diabético para todos os animais foram obtidos durante três sema- nas consecutivas (>120 mg/dL) antes de sua inclusão no estudo.

ipGTT: Trinta e cinco camundongos foram submetidos a jejum durante a noite (16 horas) e foram aleatoriamente distribuídos a 7 grupos (n = 5) baseado em suas concentrações de glicose em jejum. Dez minutos an- tes do teste de tolerância à glicose, os camundongos foram dosados i.v. com PBS ou MMB de GLP-1 de SEQ ID NO 4 (0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3 e 1,0 mg/kg). Cinco minutos antes do teste de tolerância à glicose, uma medição de glicose em jejum foi feita a partir de sangue da veia caudal. AT = O min, os camundongos foram dosados i.p. com D-glicose (1,0 mg/g). Os níveis de glicose no sangue foram medidos a 15, 30, 60, 90, 120, 150 e 180 min u- sando sangue da veia caudal.

Resultados: Os níveis de glicose no sangue medidos durante o teste de tolerância à glicose foram plotados como uma função do tempo (Fi- gura 21 A). A área sob a curva foi calculada e estava significativamente redu- zida, de uma maneira dose-dependente, em cinco dos grupos tratados com MMB de GLP-1 de SEQ ID NO 4 (0,01, 0,03, 0,1, 0.3, 1 mg/kg) com relação ao grupo tratado com PBS (Figura 21 Β). A AUC vs concentração de MMB de GLP-1 de SEQ ID NO 4 foi adaptada a uma hipérbole, que proporciona uma ED50 de 14 μg/kg (Figura 21C). Os dados foram plotados e analisados no GraphPad PRISM, versão 4.03.

Exemplo 23. Efeito de um MMB de GLP-1 sobre a ingestão de alimento, con- trole glicêmico e esvaziamento gástrico em camundongos GLP-1 R-/- e do tipo selvagem

A finalidade desse estudo foi avaliar se um MMB de GLP-1 afeta o controle glicêmico, ingestão de alimento e esvaziamento gástrico de uma maneira receptora de GLP-1-dependente. Uma única administração intrave- nosa (iv) de um MMB de GLP-1 de SEQ ID NO 4 melhorou a tolerância à glicose, reduziu a ingestão de alimento e inibiu o esvaziamento gástrico em camundongos do tipo selvagem, mas não em camundongos nulos knockout para o receptor de GLP-1. Os resultados demonstram que o efeito de um MMB de GLP-1 de SEQ ID NO 4 sobre o metabolismo de glicose e energia são mediados via o receptor de GLP-1. Materiais/Métodos

Animais: Camundongos machos GLP-1 R-/- e do tipo selvagem com idade equivalente foram aleatoriamente distribuídos em três grupos de tratamento (n = 5) baseado no peso corporal e glicose no sangue em jejum.

Ingestão de alimento: Os camundongos foram submetidos a je- jum durante a noite e injetados com uma única dose intravenosa (iv) de um MMB de GLP-1 de SEQ ID NO 4 (1 mg/kg), CNTO 1996 (1 mg/kg) (CN- T01996 foi usado no estudo como um controle negativo, uma vez que ele carece do peptídeo de GLP-1) e uma equimolar de exendina-4 (0,07 mg/kg, adquirida da Sigma). A ingestão de alimento e água foi medida 4, 6, 24 e 48h pós-dosagem.

Teste de tolerância à glicose (ioGTT): Os camundongos foram submetidos a jejum durante a noite e dosados intravenosamente, conforme discutido acima. A glicose em jejum foi medida via cortes na cauda usando um glicômetro manual (LifeScan). At = O min, os camundongos foram dosa- dos i.p. com D-glicose (1,0 mg/g, Sigma) e a glicose no sangue foi medida após 15, 30, 60, 90 e 120 min usando sangue da veia caudal.

Esvaziamento gástrico: Os camundongos foram submetidos a jejum durante a noite. Na manhã seguinte, os camundongos foram realimen- tados durante 1h, a ingestão de alimento foi registrada e os camundongos foram privados de alimento durante o resto do estudo. Os camundongos fo- ram dosados intravenosamente, conforme discutido acima. Em duas horas pós-dosagem, os camundongos foram sacrificados. O estômago foi exposto através de laparotomia, ligado no piloro e cárdia e removido. O peso úmido do conteúdo do estômago foi medido. A Equação 1 foi usada para calcular o percentual de alimento restante no estômago:

(Peso úmido do contendo estomacal (g)/lngestão de alimento (g))*100 E- quação (1)

Resultados e Discussão Ingestão de alimento: A ingestão de alimento cumulativa para

camundongos do tipo selvagem e GLP-1R-/- durante um período de 24 ho- ras pós-administração de fármaco foi plotada (Figura 22). O MMB de GLP-1 de SEQ ID NO 4 (1 mg/kg) e uma dose equimolar de exendina-4 (0,07 mg/kg) resultaram em uma redução estatisticamente significativa na ingestão de alimento em animais do tipo selvagem comparado com o grupo de con- trole, CNT01996 (Figura 22A). O MMB de GLP-1 de SEQ ID NO 4 e exendi- na-4 não tiveram efeito sobre a ingestão de alimento em camundongos GLP- 1R-/- (Figura 22B).

Teste de tolerância à glicose: Os dados obtidos durante o ipGTT em camundongos do tipo selvagem e GLP-1 R-/- foram plotados como a concentração de glicose no sangue versus o tempo (Figuras 23A e 23B). A área sob a curva (AUC) foi calculada para cada curva de ipGTT individual (Figura 23C). Uma única administração de um MMB de GLP-1 de SEQ ID NO 4 e exendina-4 resultou em uma redução estatisticamente significativa na AUC em animais do tipo selvagem, mas não em GLP-1 R-/-.

Esvaziamento gástrico: O percentual de alimento restante no estômago 2h após dosagem em camundongos do tipo selvagem e GLP-1 R- /- foi plotado (Figura 24). O MMB de GLP-1 de SEQ ID NO 4 (1 mg/kg) e uma dose equimolar de exendina-4 (0,07 mg/kg) resultaram em um aumento estatisticamente significativo no conteúdo estomacal nos camundongos do tipo selvagem comparado com o controle, CNT01996. Os dados demons- tram que o MMB de GLP-1 de SEQ ID NO 4 e exendina-4 inibem o esvazia- mento gástrico em animais do tipo selvagem. O MMB de GLP-1 de SEQ ID

NO 4 e exendina-4 não tiveram efeito sobre o esvaziamento gástrico nos camundongos GLP-1 R-/-.

Exemplo 24. Correlação da atividade farmanodinâmica de um MMB de GLP- .1 com seu perfil farmacocinético em camundongos DlO

A finalidade desse estudo foi correlacionar o efeito de um MMB de GLP-1 na regulação de tolerância à glicose com seu perfil farmacocinéti- co em camundongos obesos dieta-induzidos (DIO). Os animais foram dosa- dos (iv) com um MMB de GLP-1 de SEQ ID NO 4 (1 mg/kg) e testes de tole- rância à glicose foram realizados em vários tempos pós-dosagem. Simulta- neamente, amostras de sangue foram coletadas para avaliar os níveis de MMB de GLP-1 de SEQ ID NO 4. O MMB de GLP-1 de SEQ ID NO 4 melho- rou a tolerância à glicose em camundongos DIO, com uma ED50 de aproxi- madamente 370 ng/ml.

Materiais/Métodos

Animais/Tratamentos: Camundongos C57B1/6J foram iniciados, a 4 semanas de idade, com uma dieta contendo 60,9% de gordura (Purina TestDiets 58126). No momento de início do estudo, os valores de glicose no sangue em jejum diabético para todos os animais foram obtidos durante três semanas consecutivas (>120 mg/dL). Camundongos DIO foram aleatoria- mente distribuídos a grupos de tratamento baseado na glicose em jejum no sangue e foram dosados (iv) com MMB de GLP-1 de SEQ ID NO 4 (1 mg/kg,

20

30 lote #8833173) ) ou PBS. Em vários tempos pós-dosagem, testes de tole- rância à glicose foram realizados e amostras de sangue foram coletadas pa- ra medir os níveis de MMB de GLP-1 de SEQ ID NO 4 no plasma, conforme descrito abaixo.

Teste de tolerância à glicose üdGTT): Camundongos foram

submetidos a jejum durante a noite (16 horas) antes do teste. Pela manhã, a glicose em jejum foi medida via cortes na cauda usando um glicômetro ma- nual (LifeScan). AT = O min, os camundongos foram dosados i.p. com D- glicose (1,0 mg/g, Sigma). A glicose no sangue foi medida após 15, 30, 60, 90 e 120 min usando sangue da veia caudal.

Níveis de MMB de GLP-1 no plasma: Amostras de sangue foram coletadas após o ipGTT via punção cardíaca. Aproximadamente 300 μΙ de sangue foram coletados em citrato de sódio (3,8%) contendo inibidores de protease (Roche Complete EDTA Free, Roche Applied Science, Indianápo- lis, IN) e inibidores de DPP4 (Linco, St. Charles, MO). A concentração de MMB de GLP-1 de SEQ ID NO 4 intacto foi medida usando a tecnologia Me- soscale Discovery (MSD) [2-5]. Resumidamente, amostras de plasma foram serialmente diluídas através de um BioMek Fx durante um total de 4 dilui- ções, puras, 1:8, 1:64 e 1:512. Curvas padrões diluídas da mesma maneira com plasma foram incluídas em cada lâmina. MMB de GLP-1 foi capturado sobre as lâminas de MSD por um anticorpo monoclonal biotinilado (CN- T01626) criado para detectar o N-término intacto do mimeticorpo. Um anti- corpo monoclonal rotulado com rutênio que reconhece a região de Iigante do mimeticorpo (CNT0712) foi adicionado para detecção e as respostas de Iu- minescência foram determinadas usando o leitor Sector Imager 6000 para MSD. O nível de MMB de GLP-1 de SEQ ID NO 4 foi calculado usando a curva de dose-resposta sigmoidal (GraphPad PRISM). Resultados e Discussão

Farmacodinâmica de um MMB de GLP-1: Os dados de ipGTT de cada ponto de tempo foram plotados como a concentração de glicose no sangue versus o tempo (Figura 25). A área sob a curva (AUC) foi calculada para cada curva de ipGTT individual (Figura 26). Uma única administração do MMB de GLP-1 de SEQ ID NO 4 resultou em uma redução estatistica- mente significativa na AUC até 6 dias pós-injeção com relação ao controle negativo.

Farmacocinética de MMB de GLP-1: A concentração no plasma do MMB de GLP-1 de SEQ ID NO 4 em camundongos DIO após cada teste de tolerância à glicose foi plotada (Figura 27).

Correlação de atividade farmacodinâmica de MMB de GLP-1 com seus ní- veis no plasma: A AUC para todos os dados de ipGTT foi plotada versus os níveis de MMB de GLP-1 de SEQ ID NO 4 no plasma após cada teste de tolerância à glicose (Figura 28). Os dados foram adaptados a uma hipérbole para obter a ED50 (370 ng/ml).

Vantagens do mimeticorpo de Gl Ρ-1· o uso dessa nova molécula como um produto terapêutico para tratar diabetes do tipo 2 proporciona várias vanta- gens com relação a outros análogos de GLP-1. Por exemplo, provavelmente, ela prolonga a meia-vida do peptídeo de GLP-1. Também, o peptídeo de GLP-1 do tipo selvagem na base do mimeticorpo é resistente à degradação por protease, especificamente DPP-IV. Isso pode permitir tratamento com o peptídeo de GLP-1 do tipo selvagem ao invés de um peptídeo mutante. Uma vez que o GLP-1 é um peptídeo nativo, há menos resposta imune em paci- entes tratados com um mimeticorpo de GLP-1 do que em pacientes tratados com um análogo de GLP-1 com mutação. Além disso, o grande tamanho do mimeticorpo pode impedi-lo de cruzar a barreira sangue/cérebro. Isso pode oferecer uma vantagem, uma vez que náusea e ansiedade têm sido associ- adas à ligação do GLP-1 com GLP-1 R no cérebro. Além disso, a plataforma de mimeticorpo resulta em expressão de dois peptídeos sobre cada molécu- la de mimeticorpo. Isso pode permitir que os peptídeos de mimeticorpo inte- rajam uns com os outros, formando um Iigante dimérico que poderia aumen- tar a afinidade pelo receptor de GLP-1 na superfície celular. Está claro que a invenção pode ser praticada de outro modo que não con- forme particularmente descrito na descrição e exemplos precedentes.

Numerosas modificações e variações da presente invenção são possíveis à luz dos ensinamentos acima e, portanto, estão dentro do escopo da presente invenção. Tabela 1

SEQ ID NO Ns REGIÕES TO- FR1 FR4 TAL DE 47 Vh 1 125 1-31 81-125 48 Vh2 97 1-30 80-97 49 Região Vh3a 102 1-30 80-102 50 variável Vh3b 102 1-30 80-102 51 de ca- Vh3c 94 1-30 80-94 52 deia pe- Vh4 106 1-30 80-106 53 sada Vh5 97 1-30 80-97 54 Vh6 91 1-30 80-91 55 Vh7 91 1-30 80-91 REGIÕES CH4 319-497 324-476 CH3 223-354 210-340 268-384 211-318 224-339 220-326 271-377 221-327 218-323 CH2 123-222 109-209 160-267 104-210 122-223 118-219 169-270 111-220 105-217 dobradiça4 146-168 dobradiça3 131-145 dobradi- ça2 319-497 324-476 dobradi- ça1 103-122 103-108 102-135 99-121 99-117 99-115 99-110 < O < ζ ττ ω CO o "t CO CO CO h- cr> Tt CD CO CO CO CVJ CO CO CVl CO CO Tt < O) CVJ < O) IgD Ul O) O O) CVJ O D) CO O O) Tt U _g> IgM Região constan- te de cadeia pesada σ _ UJ 0 ο ω 9 -ζ. CO IO IO CO IO Oi IO O CO S CVI CO CO CO Tt CO Seqüência de Listagem

<11Q> 0'Nell, Karyn; Picha, Kristen

<120> MIMETICORPOS DE GLP-I HUMANO APERFEIÇOADOS, COMPOSIÇÕES, MÉTODOS E USOS

<130> CEN{INSERT

<140> <141>

<160> 68

<210> 1

<211> 31

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<22 0>

<221> M X SC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa is Ala, Gl y, Ser, Thr, Leu, lie. Vai, Glu, Asp or Lys.

<220>

<221> MISC FEATURE

<222> (3).7(3)

<223> Xaa is Glu, Asp or Lya.

<22Q>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> Xaa Ia Ala, GI y, Ser, Thr, Leu, Ilet Vai, Arg, Híe, Glu, Asp or Lys <220>

<221> MISC FEATURE

<222> (6>.7(6)

<223> Xaa is Phe, His, Trp or Tyr, <220>

<221> MISCJFEATURE

<222> (7) . .(7)

<223> Xaa Ls Thr or Aan,

<221> MISC FEATURE

<222> i 6> . . <8)

<223> Xaa is Ala, Gl y, Ser, Thr, Leu, lie, Vai, Glu, Asp or Lys. <220>

<221> MISCJFEATURE

<222> <9>..<9>

<223> Xaa ia Glu or Asp.

<220>

<221> MI SC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> Xaa is Vai, Gln, His, Glu, or Lys. <220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (11).. (11) <223> Xaa is Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, lie, Vai, Glu, Asp or Lys.

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (12).. (12)

<223> Xaa ia Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, lie, Vai, Glu, Asp or Lys. <220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (13).. (13)

<223> Xaa is Tyr, Gln, His, Glu, or Lys. <220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (14).. (14)

<223> Xaa ia Leu, Gln, Hia, Glu, or Lys. <220>

<221> MISCJFEATURE

<222> (15)..(15)

<223> Xaa is Ala, Gly, Ser, Gln, Glu, Asp or Lys. <220>

<221> MISC FEATURE

<222> (16)7.(16)

<223> Xaa ia Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, lie. Vai, Gln, Asn, Arg, Cys, Glu, Asp or Lys.

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (Π) . . (Π)

<223> Xaa is Gin, Asn, Arg, His, G.lu, Asp «i ;.ys. <220>

<221> MISC FEATURE

<222> (18)7.(18)

<223> Xaa is Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, lie. Vai, Glu, Asp or Lys.

<221> MISCJFEATURE

<222> (19) . . (19)

<223> Xaa ís Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, 'lie, Va., Gli:, Asp or Lys;. <22 Q>

<221> KISC FEATURE

<222> (20)'.. (20)

<223> Xaa is Lys, Arg, His, Gln, Trp, Tyr, Phe, Glu, or Asp. <220>

<221> MlSC_FEATURE

<222> (21).. (21)

<223> Xaa is Glu, Leu, Ala, His, Phe, Tyr, Trp, Axg, Gln, Thr, Ser, Gly, Asp or Lys.

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (23)..(23)

<223> Xaa is Ala, Vai, Leu, or Glu.

<220>

<221> MISC FEATURE <222> <223> (24).. (24) Xaa is Ala, Glnj . His, , Glu , or Lys. <220> <221> <222> <223> MISC FEATURE (25)..(25) Xaa ia Trp, Phe, Tyr, Glu, Asp or Dys. <220> <221> <222> <223> MISC FEATURE (26).. (26) Xaa is Leu, Gly, ÂJ» â $ Ser, Thr, lle. Vai, <220> <221> <222> <223> MISC FEATURE (27)7. (27) Xaa is Vai, Gln, His, Glu, or Lys. <220> <221> <222> <223> MISC FEATURE (28)..(28) Xaa is Lys, Asa, Arg, His, Glu, or Asp. <220> <221> MXSC FEATURE <222> (29).. (29) <223> Xaa is Gly, Ala, His, Glu, Asp or Lys. Ser, Thr, Leu, lle. Vai,

<22 0>

<221> MISCJFEATURE

<222> (30)..(30)

<223> Xaa is Arg, Hxs, Thr, Ser, Trp, Tyr, Phe, Glu, Asp or Ly3.

<22 0>

<221> MISC_FEATURE

<222> (31).. (31)

His^Giu^Asp oí^*' 50ϊ' L6U' lle' TrP' ^r, Phe, Pro,

<4Q0> 1

aa Glu Xaa 15

Xaa Xaa Xaa Ly3 Xaa Phe Xaa Ala Trp Leu Xaa Xaa Gly Xaa Xaa

25 30

<210> 2

<211> 278

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)., (10)

<223> Xaa is Gln, Glu, Lys, His or Ala.

<220>

<221> MISC_FEATÜRE

<222> (13)..(13)

ais Aaa

1

<ãã Glv

Thr Xaa Xaa

5

Aaa 10

Ser Xaa Tyr <223> Xaa is Glnf Glu, Lys, His or Ala.

<220>

<221> MI SC_FEATURE

<222> (14)..(14)

<223> Xaa ia Gln, Glu, Lys, His or Ala. <22 0>

<221> MISC_FEATURE

<222> (24).. (24)

<223> Xaa is Gln, Glu, Lys, or Ala.

<22 0>

<221> MISC_FEATURE

<222> (27)..(27)

<223> Xaa is Gln, Glu, Lys, His or Ala. <220>

<221> HISC_FEATURE

<222> (44).. (44)

<223> Xaa is Asn or Gln.

<400> 2

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser

1 5

Gln Ala Xaa Lys Glu Phe Ile Xaa

20

Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr 40

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 50 55

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

65 70

Asp Xaa Ser Xaa Xaa Leu Glu Gly 15

Trp Leu Xaa Lys Gly Arg Gly Gly

30

Leu Val Thr Xaa Ser Ser Glu Pro 45

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 60

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 75 80

Vai Ser His Glu Asp Fro Glu Val

íoo

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 115 120

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 130 135

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 145 150

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 165

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 180

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

Lya Hic /isn 'Irp Tyr Val Asp Giy 105 110

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 125

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 140

Lys Val ser Asn Lys Ala Leu Pro 155 160

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 170 175

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 185 190

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 195

200

205

Ala Val Glu Trp Glu Ser Aan Gly Gln Pro Glu Mn Asn Tyr Lys Thr 210 215 220

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Aap Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 225 230 235 240

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 245 250 255

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 260 265 270

Ser Leu Ser Pro Gly Lys 275

<210> 3

<211> 837

<212> DNA

<213> Horao eapiene

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (28)7.(30)

<223> nnn is any codon encoding Gln, Glu, Lys, His or Ala. <220>

<2 2]> MISC_FEATURE <222> (3~)..(39)

<223> nnn is any codon encoding Gln, Glu, Lys, His or Ala. <220>

<221> MISC FEATURE <222> (40)7.(42)

<223> nnn is any codon encoding Gln, Glu, Lys, His or Ala.

<220>

<221> MJSC_FEATURE

<223> xmr. is any codon encoding Gln, Glu, Lys, His or Ala. <22 Q>

<221> MISC_FEATURE <222> (79).. (81)

<223> nnn is any codon encoding Gln, Glu, Lys, His or Ala. <220>

<221> MISC_FEATURE <222> (130)..(132)

<223> nnn is any codon encoding Asn or Gln. <400> 3

catgctgaag ggacctttac tagtgatnnn agttctnnnn nngaaggcca agctgccaag 60

gaattcattn nntggctgnn naaaggccga ggaggtggat ccggtggagg ctccggtacc 120 ttagtcaccn nntcctcaga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacgtg cccaccgtgc 180 ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 240 accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 300 gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 360 aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgggtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcecggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatga

420 480 540 600 660 720 760 837

<210> 4

<211> 275

<212> PRT

<213> Horao sapiens

<400> 4

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Gly

25 30

Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Asn Ser Ser Glu Ser

40 45

Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

50 55 60

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 65 70 75 80

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 85 90 95

Glu Agp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 130 135 140

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile 145 150 155 160

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

165 170 175

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 180 185 190

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 195 200 205

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 210 215 220

Val Leu Asp Ser Aap Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Axg Leu Thr Val

100

105

110

η Fne hsi\ Ser 'Ihr 'Iy

ϊ 25 225 230 235 240

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 245 250 255

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 260 265 270

Leu Gly Lys 275

210> 4

<211> 275

<212> PRT

<213> Horao sapiens

<400> 4

His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Gly

25 30

Gly Sar Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Asn Ser Ser Glu Ser 40 45

Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

50 55 60

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 65 70 75 80

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 85 90 S5

Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

100 105 110

Kis Asn Ale* S.ys Thr Lys rio Arg Giu Glu Gin [=Iie As:. Ser 'Ihr Tyr 115 120 125

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 130 135 140

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Aan Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile 145 150 155 160

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

165 170 175

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 180 185 190

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 195 200 205

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 210 215 220

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val 225 230 235 240

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 245 250 255

His Glu Ala Leu Hia Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 260 265 270

Leu Gly Lys 275

210> 4a

<211> 275

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4a

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Gly 25 30

Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser 40 45

Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

50 55 60

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 65 70 75 80

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 85 90 95

Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyt Va1 Asp Gly Val Glu Val

100 105 13 0

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Giu Giri Fhe Asn Ser 'Ihr Tyr

:I.15 J 20 i 2 5

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 130 135 140

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile 145 150 155 160

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 165 170 175

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 160 185 190

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu 195 200 205

Trp Glu ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 210 215 220 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val 225 230 235 240

Asp Lys ser Arg Trp Gln Glu Gly Aan Val Phe ser cys ser vai Met 245 250 255

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 260 265 2"70

Leu Gly Lys 275

210> 4b

<2U> 275

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4b

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Gly 25 30

Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser

40 45

Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 50 55 60

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 65 70 75 80

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Aap Val Ser Gln 85 90 95

Giu Asp Pro Giu Val GIn Phe As.-. Trp Tyr Val Asp Gly VeI Glu Val 100 IOb 11Ü

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Gly Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr 115 120 125

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 130 135 140

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile 145 150 155 160

Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 165 170 175

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

180 185 190

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 195 200 205

Trp Glu Sez Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

210 215 220 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val

225 230 235 240

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 245 250 255

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

260 265 210

Leu Gly Lys 275

210> 4c

<211> 275

<212> PRT

<213> Horao sapiens

<400> 4c

His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Gly

25 30

Gly Ser Gly Gly Gly Ser Giy Thr l.eu va l Ihr Val Ser Ser 3".u Ser 40 45

Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 50 55 60

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lya Pro Lys Asp Thr Leu Met

€5 70 75 80

Ile Ser Arc Thr Pro Glu VaI Thr Cvp vai VaI Val Asp Val Ser GIn

p.c. C

Glu Asp Pro GJu VaI GIn Phe Asn Iip Tyi Val Asp Glv Val Giu Val 100 105 110

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr 115 120 125

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 130 135 140

Lya Glu Tyr Lya Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile 145 150 155 160

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

165 170 175

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 180 185 190

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

195 200 205 Trp Glu ser Asn Qly Gln Pro Glu Asn Asη Tyr Lys Thr Thr Pr0 Pro 210 215 220

vai Leu Aap Ser Asp Gly ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg leu Thr Val

230

235

240

Asp Ly3 Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Sex Cys Ser Val Met 245 250 255

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 260 265 270

Leu Gly Lys 275

210> 4d <211> 284 <212> PRT <213> Homo sapiens <40O> 4d

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Aap Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Pro Ser

25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly

40 45

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro 50 55 60

Pro Cy3 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 70 75 80

Pro Fro Lyt Pro Lys Asp Ser Arc Thr Prr> Chl

85 90 " 95

Xhr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe lt}0 105 no

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 115 120 125

Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 130 135 140

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Aan Gly Lye Glu Tyr Lys Cyi Lys Val

150 155 160

Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 165 170 175

Ly3 Gly Gln Pro Arg Glu Pr0 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln 180 185 I90

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 195 200 205

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 210 215 220

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 225 230 235 240

Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu 245 250 255

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 260 265 270

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 275 280 284

<210> 5 <211> 828 <212> DNA <213> Homo <400> 5

catgctgaag ggacctttac tagtgatgta agttcttatt tggaaggcca agctgccaag 60

gaattcattg aatggctggt gaaaggccga ggaggtggat ccggtggagg ctccggtacc 120

ttagtcacca actcctcaga gtccaaatat ggtcccccat gcccaccatg cccggcgcct 180

gaggccgccg ggggaccatc agtcttcctg ttccccccaa aacccaagga cactctcatg 240

etetcccgga eccctgaggt, cacgtgcgtg ytggtyyacy tgagccagga agaccccgag 300

gtccagttca actggtacgt ggatggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 360

gaggagcagt tcaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 420

tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aaggcctccc gtcctccatc 480

gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag cctcgagagc cacaggtgta caccctgccc 540

ccatcccagg aggagatgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 600

taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 660

accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcag gctaaccgtg 720

gacaagagca ggtggcagga ggggaatgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 780

cacaaccact acacacagaa aagcttgtcc ctgtctctgg gtaaatga 828

<210> 6

<211> 30

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<2 21 > MI SCJFEATURE

<222> (2).. (2)

<223> Xaa is Ala, Gly, Ser.

<220>

<2 21 > MISCJFEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa is Glu, Asp.

<220>

<221> MISC_FEATUR£

<222> (6)..(6)

<223> Xaa is Phe, His, Trp or Tyr. <22 0>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7).. (7)

<223> Xaa is Wir or Asn.

<220>

<221> WIISC FEATURE

<222> (β).7(8)

<223> Xaa is Ala, Ser, Thr.

<22 0>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> Xaa is Glu or Asp.

<220>

<2 21> MISC_FEATURE

<222> (10)7.(10)

<22 3> Xaa is Vai, Gln, His, Glu, or Lys. <220>

<221> MISCJFEATURE

<222> (12).. (12)

<223> Xaa is Ser or Lys.

<22 Q>

<221> MISC_FEATURE

<222> (13)7.(13)

<223> Xaa is Tyxi Gln, His, Glu, or Lys. <220>

<221> MISCJFEMiURE

<222> (14)..(14)

<223> Xaa is Leu, Gln, His, Glu, or Lys. <220?

<221> MISCmFEATURE

<222> (16)7.(16)

<?.23> Xsa Í3 GIyi Ala, Giuf cr P.sp, <22 0>

<221> M1SC_FEATURE

<222> (17).. (17)

<223> Xaa is Gln, or Glu.

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (18).. (18)

<223> Xaa is Ala or Lys.

<220>

<2 21> MISC_FEATURE

<222> (19).. (19)

<223> Xaa is Ala, Leu, lie. Vai, or Met.

<22 0>

<221> MISC_FEATURE

<222> (21).. (21)

<223> Xaa is Glu or Leu.

<220> <221> MISC_FEATURE

<222> (23),.(23)

<223> Xaa ia Ala, Vai, lie, Leu, or Glu.

<22 0>

<2 21> MISC_FEATURE

<222> (24>..(24)

<223> Xaa is Ala, Gln, His, Glu, or Lys.

<22 0>

<221> MISC_FEATURE

<222> (27)..(27)

<223> xaa Is Vai, Gln, His, Glu, or Lys. <22 0>

<221> MISC FEATURE

<222> (28)7.(28) <223> Xaa is Lys or Asn.

<22 0>

<221> MISCJFEATURE

<222> (30).. (30)

<223> Xaa is Arg or Glu.

<400> 6

His Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Glu Xaa

10 15

Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Phe Xaa Xaa Trp Leu Xaa Xaa Gly Xaa

25 30

<210> 7

<2ll> 63

<212> PRT

<213> Horao sapiens

<4C0> 7

His Ser Qln Gly Thr Phe Thr Ser Asp VaJ Ssr Ser Tyr Leu Giu Giy 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glw Trp Leu Val Ly5 Gly Arg Gly Gly

25 30

Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Asn Ser Ser Glu Ser 40 45

Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 50 55 60

<21Q> 8

<211> 63

<212> PRT

<213> Honio sapiens

<4Q0> 8 His Gly Glw Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Gly 25 30

Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Asn Ser Ser Glu Ser 40 45

Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ma Pro Glu Ala Ala

50 55 60

<210» 9

<211> 63

<212> PRT

<213> Horao sapiens

<400> 9

His Asp Glu Gly Thr Phe Thr Sex Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Gly 25 30

Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Asn Ser Ser Glu Ser

40 45

Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 50 ~ 55 60

<210> 10

<2U> 63

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4Q0> 10

"'· - r.·" Gly Thr Phe Thr Sei /--f Ser Tyr Leu Glv Siy

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Iifi Glii Trp Leu Val Lys Giv Arg Gly Gly 25 30

Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Asn Ser Ser Glu Ser 40 45

Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cya Pro Ala Pro Glu Ala Ala 50 55 60

<210> 11

<211> 63

<212> PRT

<213> Honio sapiens

<400> 11

His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly ι 5 10 15

Gln Ala Ala Lya Glu Phe lie Glu Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Gly 25 30

Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Aan Ser Ser Glu Ser 40 45

Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 50 55 SO

<210> 12

<211> 52

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

His Ser Glu Gly Thr Phe Thx Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Val Lys Gly Arg Thr Gly

25 30

Gly Gly Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala 40 45

Pro Glu Ala Ala

50

<210> 13

<211> 43

<212> PRT

<2l3> Homo sapiens

<400> 13

His Ser Glu Glv Thr Phe Thr Ser Asp VaI Ser Ser Tyr Leu Glu Gl;

Gln Ala Als Lys Glu Phe Ile Glu Trr- ι v,f] Lys Gly Arg Thr Gl; 2C 2b 30

Ser Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Asn 40

<210> 14

<211> 72

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Val Lys Gly Gly Pro ser

25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly 40 45

Thr Leu Val Thr Aan ser ser Glu ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro 50 55 60

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 65 70

<210> 15

<2U> 31

<212> PRT

<213> Homo sapiena

<400> 15

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly i 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 25 30

<210> 16

<211> 4

<212> PRT

<213> Horao sapiens

<400> 16 Gly Gly Gly Ser 1

<210> 17

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapieris

<400> 17

Giy Sbt Gly Giv Giy S©r 1 5

<210> 18

<211> 7

<212> PRT

<213> Horao sapiens

<400> 18

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5

<210> 19

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens <4G0> 19

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly 1 5

<210> 20

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 20

Gly Gly Gly Sex Gly Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10

<210> 21

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 21

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5

<210> 22

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo aapiens

<400> 22

Gly Thr Leu Val Ala Val Ser Ser

1 5

<210> 23

<211> 8

<2 1 .?> PRT

<2 i 3> Horao sapieris

<40O> 23

Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser 1 5

<210> 24

<211> 4

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 24

Thr Val Ser Ser

1

<210> 25 <211> 4

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 25 Ala Val Ser Ser 1

<210> 26

<211> 23

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 26

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 20

<210> 27

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 27

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Ρεο Ala Pto Glu Phe 10 15

Leu Gly Gly Pro 20

<210> 28 <211> 20 <212> PRT <213> Horao sapiens

<4C0> 28

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Prc Pro Cys Pro Ala Pro Glu Aia 10 15

Ala Gly Gly Pro 20

SEQ ID NO:29

<210> 29

<211> 23

<212> PRT

<213> Horao sapiens

<400> 29

Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 10 15

Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro 20

<210> 30

<211> 23

<212> PRT

<213> Ηοιαο sapiens

<400> 30

Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 10 15

Pro Glu Leu Ala Gly Gly Pro 20

<210> 31

<211> 23

<212> PRT

<213> Ηοπιο sapiens

<400> 31

Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Ala Leu Gly Gly Pro 20

<210> 32

<211> 23

<212> PRT

<213> Horao sapiens

<400 > 3:.

GJu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His "Dir- Cys Pro Pro Cys E^ro Ala ί * 5 : C 15

Pro Glu Leu Glu Gly Gly Pro 20

<210> 33

<211> 23

<212> PRT

<213> Ηοπιο sapiens

<400> 33

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cy3 Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15

Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro 20

<210> 34 <211> 23

<212> PRT

<213> Hoao sapiens

<400> 34

Glu Pro Lya Ser Ala Asp Lys Thr His Ala Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 20

<210> 35

<211> 23

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 35

Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Ala His !Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 20

<210> 36

^s X 2 & ·$

<212> PRT

<213> Horao sapiens

<400> 36

Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

<2 1 0> 37

<211> 19

<212> PRT

<213> Ηοπιο sapiens

<40Ο> 37

Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 10 15

Gly Gly Pro

<210> 38

<211> 16

<212> PRT

<213> Horao sapiens

<400> 38

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 15

<210> 39

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 39

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Ala 1 5 10 15

Ala Gly Gly Pro 20

<210> 40

<211> 20

<212> PRT

<213> Hcwio sapiens

<400> 40

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 10 15

Leu Gly Gly Pro

20

<210> 41

C211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 41

Cys Pro Pro CyS Pro Ala Pro GXu Leu I.eu G" y GIy Pro

<210> 42

<211> 13

<212> PRT

<2ΐ3> Horao sapien®

<400> 42

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro 10

<210> 43

<211> 102

<212> PRT

<213> Ηοπιο sapiens

<400> 43

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 10 15

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Hls Glu Asp 25 30

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Aap Gly Val Glu Val His Asn 40 45

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Giu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Asn 50 55 60

Val Ser Val Leu Thr Val Leu Hls Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 65 70 75 80

Tyr Lys Cys Lya Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 85 90 95

Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100

<210> 44

<211> 106

<212> PRT

<213> Honio sapiens

<400> 44

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

1 5

Glu Leu Thr Lya Asn Gln Val Ser

20

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 40

Agn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

50 55

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 65 70

Asn Asn Phe Ser Cys Ser Val Met 85

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 100

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

IG 15

Leu Thr Cys Leu Val Lya Gly Phe 30

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 45

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

60

Asp Lys Ser Arg Trp Glri GIn Gly 75 BO

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 90 95

Pro Gly 105

<210> 45

<211> 102

<212> PRT

<213> Honio sapiens

<400> 45

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser 1 5 10 15

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp 25 30 Pro Glu Val Glri Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 40 45

Ala Lys Thr Lya Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn ser Thr Tyr Arg Asn 50 55 60

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Aan Gly Lys Glu 65 70 75 80

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys 85 90 95

Thr Ile ser Lys Ala Lys 100

<210> 46

<211> 107

<212> PRT

<213> larao sapiens

<400> 46

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu 10 15

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile AIe Val Gly Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thx Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly 65 70 75 80

Asn Asn Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

85 90 55

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

100 i 0

<210> 47

<211> 125

<212> PRT

<213> Horao sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1) . . (125)

<223> VhI heavy chain vaxiable region <220>

<221> MISC_FEATUR£

<222> (1)..(31!

<223> framework 1

<220> <2 21> MISC_FEATURE

<222> (32).. (32)

<223> X is any amino acid.

<2 20>

<221> MISC_FEATURE

<222> (33)..(46)

<223> framework 2

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (47).. (47)

<223> X Is any amino acid.

<220>

<221> MISC FEATURE

<222> (48)7.(79)

<223> framework 3

<220>

<221> MISC_FEATUR£

<222> (Θ0).. (80)

<223> X is any amino acid.

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (81).. (125)

<223> franieworlí 4

<4 0 0> 4 7

Gln Val Gln Leu Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 10 15

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Xaa

25 30

Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu 50 55 60

Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa

65 70 75 80

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Asn Ser Ser Gly Ser Thr Lys Gly 85 90 95

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 100 105 110

Thr Ala AIa Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 115 120 125 <210> 48

<211> 124

<212> PRT

<213> Homo aapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> <1).. (124)

<223> Vh2 heavy chain variable regiori <220>

<2 21> MISC_FEATURE

<222;» (1) . . (30)

<22 3> fraraework 1

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (31)..(31)

<223> Xaa Ls any araino acid.

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (32).. (45)

<223> fraraework 2

<220>

< 221> MISC FEATORE

<222> (46).. (46)

<223> Xaa is any araino acids.

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (47).. (78)

<223> fraraework 3

<220>

r _ i· - ι11-1--, ι ..Cil

ei „ amirto acros .

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (80).. (124)

<223> fraraework 4

<400> 48

Gln Ue Thr Leu Lys Glu ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Xaa Trp 25 30

Ile Arg Gln Fro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala Xaa Arg Leu 40 45 Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr Met Thr 50 55 60

Asn Met Asp Fro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Trp 65 70 75 80

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Asn Ser Ser Ala Ser Pro Thr Ser Pro 85 90 95

Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 100 105 110

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 115 120

<210> 49

<211> 100

<212> PRT

<213> Honio sapiens

<220>

<221> MISCJFEATURE

<222> O).. (100)

<223> Vh3a heavy chain variablé region <22 0>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1),7(31)

<223> framework 1

<220>

<221> MISCJFEATURE

<2 22> (32).. (32)

<2?3> ccn;p 1 erner. Ly r:i y rifít. err ■ r.ng reçioíi ; ÍCJ>K1>, Xss it any ^rriinc1 ècí <22 0>

<221> MISC_FEATURE

<222> (33)..(46)

<223> framework 2

<22 0>

<221> MISCJFEATURE

<222> (47).. (47)

<223> complementarity determinng region 2 (CDR2), Xaa Is 10-30 (18) of any amino aclds.

<22 0>

<221> MISC_FEATURE

<222> (48).. (79)

<223> framework 3

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (80).. (80) <223> coraplementarity determinng region 3 (CDR3), Xaa is 20-40 (31) of any amino acids.

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (81)..(100) <223> fraraework 4

<400> 49

Glu Val Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Xaa 25 30

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Xaa Arg 40 45

Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lya Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met 50 55 60

Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa 65 70 75 80

frp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thx Asn Ker iier Giy Ser Thr Lys Aia 85 90 95

Pro Ser Val Phe 100

<210> 50

<2 Π > 3.02

<?].?> PRT

<213> Hoxno

sapieris

<220>

<221> MISCJFEATURE

<222> (1)..(102)

<223> Vh3b heavy chain variable region

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(30)

<223> fraraework 1

<220>

<2 21 > MI SC_FEATURE

<222> (31).. (31)

<223> complementar!ty determinng region 1 (CDR1), Xaa is 3-20 (5) of any amino acids.

<220> <221 > MI SC_FEATURE

<222> (32)..(45)

<223> framework 2

<22 0>

<221> MISC_FEATURE

<222> (46).. (46)

<223> coraplementarity determinng region 2 (CDR2), Xaa is 5-25 (11) of anj a rol no acids.

<220>

<221> MISC_FEATUR£

<222> (47).. (78)

<223> framework 3

<220>

<2 21> MISC_FEATURE

<222> (79)..(79)

<223> coraplementarity determinng region 3 (CDR3), Xaa is 15-40 (23) of any amino acids.

<220>

<2 21> MISC_FEATURE

<222> (80)..(102)

<223> framework 4

<400> 50

Glu Val Glη Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

I 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Xaa Trp

25 30

Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Xaa Arg Phe 40 45

Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn

50 55 GO

Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Thr Xaa Trp 65 70 75 80

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Asn Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 85 90 95

Ser Val Phe Pro Leu Ala 100

<210> 51

<211> 101

<212> PRT

<213> Homo aapiens <22 0>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(101)

<223> Vh3c heavy chain variable region <220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(30)

<223> fraraework 1

<2 20>

<2 21> MISC_FEATURE

<222> (31).. (31)

<223> complementarity determinng region 1 (CDR1), Xaa is 3-20 (5) of any araino acids.

<22 0>

<221> NISC_FEATURE

<222> (32).. (45)

<223> fraraework 2

<220>

<221> MISC FEATURE

<222> (46)7.(46)

<223> complementarity determinng region 2 (CDR2), Xaa is 10-30 (19) of any amino acids.

<220>

<2 21> MISCJFEATURE

<222> (47).. (79)

<223> fraraework 3

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (80).. (80)

<223> complementarity determinng region 3 (CDR3), Xaa is 15-40 (25) of any amino acids.

<220>

<221> MISC_FEATURE

<22'S> fraraework 4

<4 00> 51

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Xaa Trp 25 30

Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Xaa Arg Phe 40 45

Thr Ile ser Arg Asp Asp ser Lys ser Ile Ala Tyr Leu Gln Met Asn 50 55 60 Ser 65

Leu Lys Thr Glu Asp Thr 70

Ala Val Tyr Tyr Cys 75

Thr Arg Asn Xaa 80

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 85

Thr Asn Ser Ser Gly 90

Sex Thr Lys Gly 95

Pro Ser Val Leu Pro 100

<210> 52

<211> 108

<212> PRT

<213> Hoino sapiens

<220>

<221> M1SC_FEATURE

<222> (1) . . (108)

<223> Vh4 heavy chain variafale region <220>

<221> MISC FEATURE

<222> (1).7(33)

<223> framework 1

<220>

<221> MISC_FEATUR£

<222> (34).. (34)

<223> complementarity deterrainng region 1 (CDRl) , Xaa as 3-20 (7) of any amino acids.

<220>

<2 21 > MISC_FEATURE

<222> (35)..(48)

<223> framework 2

<220>

<2 21> M1SC_FEATURE

H^) . . <49)

ccnipietTitsntarity cietcrrr.ir.nq rcçion - (CBR2), Xaif. IO 30 dó) cí any amino acids.

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (50)..(81)

<223> framework 3

<220>

<221> MISCmFEATURE

<222> (82)7.(82)

<223> complementarity determinng region 3 (CDR3), Xaa is 20-45 (32) o£

any amino acids.

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (83).. (108) <223> framework 4 <4 00> 52

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro ser Glu 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cya Thx Val Ser Gly Gly Ser Ser Ile Ser Ser 25 30

Ser Xaa Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 40 45

Xaa Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 50 55 60

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 65 70 75 80

Arg Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Asn Ser Ser Ala Pro Thr 85 90 95

Lys Ala Pro Asp Val Phe Pro Ile Ile Ser Gly Cys 100 105

<210> 53

<211> 132

<212> PRT

<213> Horao sapiens

<220>

<221> MISCJFEATURE

<222> (I).. (132)

<2?3> VhS heavy Chairi variable regiori •;22Q>

<221> KISC FEATURE

<222> U)/. (31)

<22 3 > MISC_FEATURE

<22 0>

<221> MISC_FEATUR£

<222> (32).. (32)

<223> complementarity determinng region 1 (CDR1), Xaa Is 3-20 (5) of any araino aclda.

<220>

<2 21 > MI SC_FEATURE

<222> (33)..(46)

<223> framework 2

<220>

<221> MI SC_FEATURE

<222> (47)..(47) <223> complementarity detemiinng region 2 (CDR2), Xaa is 10-30 (17) of any amino acids.

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (48)..(79)

<223> fraraework 3

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (80)..(80)

<223> coraplementaritydeterrainng region, 3 (CDR3), Xaa is 15-40 (23) of any amino acids.

<220>

<2 21> MI SC_FEATURE

<222> (81).. (132)

<223> frarnework 4

<400> 53

Glu Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 10 15

Glu Sar Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Xaa 25 30

Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lye Gly Leu Glu Trp Met Gly Xaa Gln

4 0 4 5

Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp 50 55 60

Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa 65 70 75 80

ί rp Giy

ílr/fcly ' Jiirv Lt 85

'Jhr

Tisr

90

95

Pro Ser Val Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn Ser Pro Ser Asp Thr 100 105 110

Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp Phe Leu Pro Asp Ser 115 120 125

Ile Thr Phe Ser 130

<210> 54

<211> 125

<212> PRT

<213> Homo sapiens <220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(125)

<223> Vh6 heavy chain variable region <220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1) .. (30)

<223> framework 1

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (31).. (31)

<223> complementaráty deterrainng region 1 (CDRl), Xaa is 3-20 (7) of any araino acids.

<220>

<221> MISCJFEATURE

<222> (32)..(45)

<223> framework 2

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (46)..(46)

<223> complementar!ty deterrainng region 2 (CDR2), Xaa is 10-30 (18) of any amino acids.

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (47).. (78)

<223> framework 3

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (79).. (79)

<223> complementarity deterrainng region 3 (CDR3), Xaa is 5-30 (13) of any amino acids.

<220>

<22 J> M3SC_?EATIJRF.

<223> framework 4

<400> 54

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cya Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Xaa Trp 25 30

Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu Gly Xaa Arg Ile 40 45

Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn 50 55 60 Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Trp 65 70 75 80

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Aan Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro 85 90 95

Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn Ser Pro Ser Asp Thr Ser 100 105 110

Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp Phe Leu Pro 115 120 125

<210> 55

<211> 91

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISCJFEATURE

<222> (1).. (91)

<223> Vh7 heavy chair» variable region

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1) . .(30)

<223> framework 1

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (31).. (31)

<223> complementarity determinng region 1 (CDRl)# Xaa is 3-20 (5) of any araino acids.

<220>

<2 2 J >

<223>

KJsr^fiATUHB- framevork 2

<220>

<22l> MISCJFEATURE

<222> (46).. (46)

<223> complementarity determinng region 2 (CDR2), Xaa is 10-30 (17) of any araino acids.

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (47).'. (78)

<223> framework 3

<220>

<221> MISCJFEATURE

<222> (79)..(79)

<223> complementarity determinng region 3 (CDR3), Xaa is 5-30 (13) of any ainino acids. <220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (80)..(91)

<223> framework 4

<400> 55

Gl π Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ssi Glu Leu Lys Lys Pjto Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Xaa Trp

25 30

Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Xaa Arg Phe 40 45

Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser 50 55 60

Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Trp 65 70 75 80

Cly Gln Gly Thr Leu Val Thr Asn Ser ser ser 85 SC

<210> 56

<211> 354

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<.?ΓΌ>

<2 21> MlSC_íEAiURt

<22?> (1) . . (354)

<223> IgAl heavy chain constant region <220>

<221> MI SC_FEATURE

<222> (1).. (102)

<223> CHl

<220>

<221> M1SC_FEATURE

<222> (103).. (121)

<223> hinge

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (122).. (222)

<223> CH2

<220>

<2 21 > MI SC_FEATURE

<222> (223).. (354) <223> CH3 <400> 56

Ala Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Cys Ser Thr 10 15

Gln Pro Asp Gly Asn Val Val Ile Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe

25 30

Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Gly Val 40 45

Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Sar Gly Asp Leu Tyr 50 55 60

Thr Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Leu Ala Gly 65 70 75 80

Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Pro Ser Gln Asp 85 90 95

Val Thr Val Pro Cys Pro Asn Pro Ser Thr Pro Pro Thr Ptc Ser Pro 100 105 110

Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Cys Cys His Pro Arg Leu Ser

115 120 125

Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser Glu Ala Asn

130 135 HO ________

Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp AIa Ser Giy Val Thr Phe 145 150 155 160

Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly Pro Pro Glu 165 170 175

Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Asn Ser Ser Val Leu Pro Gly Cys 180 185 190

Ala Glu Pro Trp Asn His Gly Lys Thr Phe Thr Cys Thr Ala Ala Tyr 195 200 205

Pro Glu Ser Lys Thr Pro Leu Thr Ala Thr Leu Ser Lys Ser Gly Asn 210 215 220

Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser Glx Glu Glu 225

230

235

240

Leu Ala Lêu Asn Glu Leu vai Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg Gly Phe 245 250 255

Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu Leu 260 265 270

Pro Axg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro Ser Gln 275 280 285

Gly Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala Ala Glu 290 295 300

Asp Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His Glu Ala 305 310 315 320

Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Leu Ala Gly Ly3

325 330 335

Pro Thr His Val Asn Val Ser Va] Vi.1 340 345

a GÍ'

Asp 350

VJ -y

Thr

Cys Tyr

<210> 57 <211> 340

<2 13> Homo sapíens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1) . , (340)

<223> IgA2 heavy chain conetant region <220>

<221> MISCJFEATURE

<222> (1)..(102)

<223> CHl

<22 0>

<221> MISC_FEATURE

<222> (103),.(108)

<223> hinge

<220>

<22] > MISCJFEATtmE

<222> (109)..(209)

<223> CH2 <220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (210)..(340)

<223> CH3

<400> 57

Ala Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Asp Ser Thr 10 15

Pro Gln Asp Gly Asn Val Val Val Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe

25 30

Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Asn Val 40 45

Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr 50 55 60

Thr Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Pro Asp Gly 65 70 75 80

Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Pro Ser Gln Asp

85 90 95

Val Thr Val Pro Cys Pro Val Pro Pro Pro Pro Pro Cys Cys His Pro 100 105 110

Arg Leu Ser Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser

115 120 125

Glu Ala Asr, Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly

:30 135 14 0

Ala Thr Phe Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly 145 150 155 160

Pro Pro Glu Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu 165 170 175

Pro Gly Cys Ala Gln Pro Trp Asn His Gly Glu Thr Phe Thr Cys Thr 180 185 190

Ala Ala His Pro Glu Leu Lys Thr Pro Leu Thr Ala Asn Ile Thr Lys 195 200 205

Ser Gly Asn Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser 210 215 220 Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg 225 230 235 240

Gly Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln

245 250 255

Glu Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro 260 265 270

Ser Gln Gly Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala

275 280 285

Ala Glu Asp Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His 290 295 300

Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Leu Ala 305 310 315 320

Gly Lys Pro Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp 325 330 335

Gly Thr Cys Tyr

340

<21Q> 58

c211> 384

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222 > U)

<220>

<221> MI$C_FEATURE

<222> <1>.. (101)

<223> CHl

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (102).. (135)

<223> hinge 1

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (136)..(159)

<223> hinge 2

<220> <221> MISC_FEATURE <222> (160).. (267) <223> CH2

<22 0>

<221> MISC_FEATURE

<222> (268).. (384)

<223> CH3

<400> 58

Ala Pro Thr Lys Ala Pro Asp Val Phe Pro Ile Ile Ser Gly Cys Arg 10 15

His Pro Lys Aap Aan Ser Pro Val Val Leu Ala Cys Leu Ile Thr Gly 25 30

Tyr His Pro Thr Ser Val Thr Val Thr Trp Tyr Met Gly Thr Gln Ser 40 45

Gln Pro Gln Arg Thr Phe Pro Glu Ile Gln Arg Arg Asp Ser Tyr Tyr 50 55 60

Met Thr Ser Ser Gln Leu Ser Thr Pro Leu Gln Gln Trp Arg Gln Gly

65 70 75 80

Glu Tyr Lys Cys Val Val Gln His Thr Ala Ser Lys Ser Lys Lys Glu 85 90 95

Ile Phe Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro 100 105 110

Glr.

J1 5

Gly

'"Hr Th

Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys 130 135 140

Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu

145 150 155 160

Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala 165 170 175

Val Gln Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val 180 185 190

Val Gly Ser Asp I^eu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly 195 200 205 Lys Val Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser 210 215 220

Asn Gly Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu 225 230 235 240

Trp Asn Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu 245 250 255

Pro Pro Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro 260 265 270

Val Lys Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala 275 280 285

Ala Ser Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile 290 295 300

Leu Leu Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe 305 310 315 320

Ala Pro Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Arg Ser Thr Thr Phe Trp Ala

325 3"C 335

Trp Ser Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr 340 345 350

Tyr Thr Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala

355 360 365

/1J-TC] bC Γ i.;'.":'J

370

ii ie.: ivr 37 5

380

<210> 59

<211> 497

<212> PRT

<213> Homo sapíens

<2 20>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1) .. (497)

<223> IgE heavy chain constant region

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1).. (103)

<223> CHl <220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (104)..(210)

<223> CH2

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (211)..(318)

<223> CH3

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (319)..(497)

<223> CH4

<400> 59

Ala Ser Thr Gln Ser Pro Ser Val Phe Pro Leu Thr Arg Cys Cys Lys 10 15

Asn Ile Pro Ser Asn Ala Thr Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Ala Thr 25 30

Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Met Val Thr Trp Asp Thr Gly Ser Leu 40 45

Asn Gly Thr Thr Met Thr Leu Pro Ala Thr Thr Leu Thr Leu Ser Gly 50 55 60

His Tyr Ala Thr Ile Ser Leu Leu Thr Val Ser Gly Ala Trp Ala Lys 65 70 75 80

Gl η Mel Phe Thr CyK Ary Va; Al,a His Thr Pro Ser Ser Thr Asp Trp 85 9C S5

Val Asp Asn Lys Thr Phe Ser Val Cys Ser Arg Asp Phe Thr Pro Pro 100 105 110

Thr Val Lys Ile Leu Gln Ser Ser Cys Asp Gly Gly Gly His Phe Pro 115 120 125

Pro Thr Ile Gln Leu Leu Cys Leu Val Ser Gly Tyr Thr Pro Gly Thr 130 135 140

Ile Asn Ile Thr Trp Leu Glu Asp Gly Gln Val Met Asp Val Asp Leu 145 150 155 160

Ser Thr Ala ser Thr Thr Gln Glu Gly Glu Leu Ala ser Thr Gln Ser

165 170 175 Glu Leu Thr Leu Ser Gln Lys His Trp Leu Ser Asp Arg Thr Tyr Thr 180 185 190

Cys Glrx Val Thr Tyr Gln Gly His Thr Phe Glu Asp Ser Thr Lys Lys 195 200 205

Cys Ala Asp Ser Asn Pro Arg Gly Val Ser Ala Tyr Leu Ser Arg Pro 210 215 220

Ser Pro Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro Thr Ile Thr Cys Leu 225 230 235 240

Val Val Asp Leu Ala Pro Ser Lys Gly Thr Val Asn Leu Thr Trp Ser 245 250 255

Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val Asn His Ser Thr Arg Lys Glu Glu Lys

260 265 270

Gln Arg Asn Gly Thr Lau Thr Val Thx Ser Thr Leu Pro Val Gly Thr 275 280 285

Arg Asp Trp Ile Glu Gly Glu Thr Tyr GIn Cys Arg Val Thr His Pro 290 255 300

His Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Thr Ser Gly Pro 305 310 315 320

Val Gly Pro Arg Ala Ala Pro Glu Val Tyr Ala Phe Ala Thr Pro Glu

325 330 335

Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg Thr Leu â_»

Cys Leu Ile Gln Asn

Phe Met Pro Glu Asp Ile Ser Val Gln Trp Leu His Asn Glu Val Gln 355 360 365

Leu Pro Asp Ala Arg His Ser Thr Thr Gln Pro Arg Lys Thr Lys Gly 370 375 380

Ser Gly Phe Phe Val Phe Ser Arg Leu Glu Val Thr Arg Ala Glu Trp 385 390 395 400

Glu Gln Lys Asp Glu Phe Ile Cys Arg Ala Val His Glu Ala Ala Ser 405 410 415 Pro Ser Gln Thr Val Gln Arg Ala Val Ser Val Asn Pro Gly Lys Asp 420 425 430

Val Cys Val Glu Glu Ala Glu Gly Glu Ala Pro Trp Thr Trp Thr Gly 435 440 445

Leu Cys Ile Phe Ala Ala Leu Phe Leu Leu Ser Val Ser Tyr Ser Ala 450 455 460

Ala Leu Thr Leu Leu Met Val Gln Arg Phe Leu Ser Ala Thr Arg Gln 465 470 475 480

Gly Arg Pro Gln Thr Ser Leu Asp Tyr Thr Asn Val Leu Gln Pro His 485 490 495

Ala

<210> 60

<211> 339

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (I).. (339)

<223> IgGl heavy chain constant region <220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (])..(98)

<2 2 3> CHl

<2 2 0>

<221> M1SC_FEATURE

<222> (99).. (113)

<223> hinge

<220>

<221> MI SC_FEATURE

<222> (114).. (223)

<223> CH2

<220>

<221> MI SC_FEATURE

<222> (224)..(339)

<223> CH3

<400> 60

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 10 15 Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

230 235 240

Leu Pro Ala ？ro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly

215 220

Pro Ser Val

Phe Leu

125

Phe Pro Pro

Pro Ala Pro Glu Leu Leu 115

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

245

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 250 255

Lys Pro Lys hsp Thr Leu Met I Ie 5er Arq Thr Pro Glu Va3 Thr Cys 130 135 J40 ‘

Val Val Val Aap Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160

Tyr VaI Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala hyB Thr Lys Pro Arg Glu

165 UQ 175

Clu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg A-n V3I Ser Val Leu Thr Val Leu

180 „KS I^O

His Gln Aap Trp Leu A3n Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Xhr Val ser Trp Asn ser Gly Ala Leu Thr Ser 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80

Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 8S 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 205 110

η S 1 2 G 2

Gly Gly 120

Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asx Asn Gly Gln

Pro Glu sapiens

FEATURE Γ(326)

heavy chain constant region

<210> C211> <212> <213>

<220> <221> <222> <223>

<220>

<221> MISCmFEATURE

<222> (1).7(98)

<223> CHl

<;2 2 0>

<2 21 > MI SC_FF.AtURE

〈二二 “ {) . · (1上0)

<223> hinge <220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (lll7..(219)

<223> CH2

<220>

<2 21> MISC—FEATURE

<222> (22θΤ. .(326)

<223> CH3

<400> 61

Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 15

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 1 5

260

265

270

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 275 280 285

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 290 295 300

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 305 310 315 320

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Thr His Thr Cys Pro 325 330 335

Pro Cys Pro

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu

Gly Cys Leu Val Lys Asp

Tyr ser Asn Gly Gln Pro Glu Asri Asn Tyr Lys Thr

265 270

Ser Asn Lys Gly Leu Pro 205

Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lye Gly Gln Pro Arg Glu

210 215 220

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie 245 250 255

20

25

30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80

Tyr Thr Cys Aan Val A3p His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95

Ihr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110

Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Ly3 Asp 115 120 125

Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

130 335 140

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

165 170 175

Ser Thr Phe Arg As π Val Se r Va 1 Lej ,'iir Vdl Va 1 Hi. S Gln Asp 'Xrp

180 :fc ；90

ν

GlU

rp

GlU T . 260

Ala Va <210> 62

<211> 377

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (1).7(377)

<223> IgG3 heavy chain constant region

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> ⑴.：(98)

<223> CHl

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (99)7.(115)

<223> hinge 1

<22 0>

<22]> 卜Π SO—FEATURR

<222> (1】6T.·(i30)

<223> hinge 2

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> {1317..(145)

<223> hinge 3

<220>

<221> MISC—FEATURE

<222> (146T. .(160)

<223> hinge 4

<220>

<221> MISC—FEATURE

<222> (16lT. . (270)

<223> CH2

<220>

<221> MISC FEATURE

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

275 280 285

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Aan Val Phe Ser Cys 290 295 300

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320

Pro Gly Ly；

325

Ser Leu Se Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg 115 120 125

Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp ？hr Pro Pro Pro Cvs Pro Arg Cys

'30 135 HO

Pro Glu Fro Lys Ser Cys Asp Thr i-'ic i-ro L'ro Cys Pro Axg Cys Fro 145 150 155 160

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 165 170 175

Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cya Val 180 185 190

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr

195 200 205

<222> (271).. (377) <223> CH3

<400> 62

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 10

Pro Cys Ser Arg 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

25

30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly AIa Leu Thr Ser

40

45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50

55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65

70 75

80

Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85

90

95

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 210 215 220 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asm 355 360

Lys Ser Leu Sex Leu Ser Pro Gly Lys

3"C 3^5 ‘

<210> 63

<211> 327

<212> PRT

<213> Horao sapiens

<22 0>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1> .7(327)

<223> IgG4 heavy chain constant region <220>

<221> MISC^FEATURE

<222> (1),7(98)

<223> CHl

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (99)7.(110)

<223> hinge

Tyr Ser Lys Leu Tht Val Asp Lys Ser Arg Trp 340 345

Leu Asp

Ser Asp 330

Gly Ser Phe

Phe Leu

335

Tvr Asn

Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg A^n Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

225

230

235

240

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

245

250

255

Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Gln

260 265

210

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

275 280

285

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

290 295

300

Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn

305 310

315

320

Gin Gln Gly Asn 350 Arg Asn Val Ser Val 185

Leu Thr Val Leu

His 190

Gln Asp

Asn Ser

<220> <221> <222> <223>

<220> <221> <222> <223>

MISC_FEATURE

(lll"T.. (220)

CH2

MISC FEATURE (22lT.,(327) CH3

<400> 63

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys A3p Tyr

25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55

60

Leu Sei Ser Val Val Thr Va: Pro Kt r Ser G】y Thί I ys Thr

65 70

75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Aep His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85

90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Sex Cys Pro Ala Pro

100 ；05

110

Gl u Phe i.e\: Gl y Gl y Pro Ser Vel i -ri： Pro Pro Lys- Pro ϊ,γα

115 丄20

125

Asp Thr Leu Met lie Ser Axg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130

135

140

Asp Vai Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145

150

155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thz Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165

170 175

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

Lys Gly Leu Met His Glu Ala Leu His Asn His Tvr Thr Gln Lys Ser 310 315 ‘ 320

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu 230 235

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325

<210> 64

<211> 476

<r I2> PR*T

<21 3> Horno sapiens

<220>

<221> MISC一FEATURE

<222> (1).7(476»

<223> IgM heavy chain constant region <220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1) .7(104)

<223> CHl

<220>

<221> MISC FEATURE

<222> (IOST..(217)

<223> CH2

<22 0>

<221> MISC—FEAT舰

<222> (2187..(323)

<223> CH3

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255

lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Aan Aan Tyr Lys 260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 260 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asrv Val Phe Ser 290 295 300

195

200

205

Pro Ser Ser lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220

Ser Va

S 5 y O C 3

t Thr Lys 240

U S

1 2 G 2 Val Ser Val Phe Val Pro Pro Arg Asp Gly Phe 115 120

Ser Lys Ser Lys Leu lie Cy$ Gln Ala Thr Gly Phe Ser Pre Arg Gin

：30 135 “ 1^10

lie Gln Val Ser Trp Lsu Axg Glu Gly Lya G_ri Asn Giy Ser Giy Va 1 145 150 155 ^ 160

Thr Thr Asp Gln Val Gln Ala Glu Ala Lys Glu Ser Gly Pro Thr Thr 165 170 175

Tyr Lys Val Thr Ser Thr Leu Thr lie Lys Glu Ser ABp Trp Leu Ser 180 185 190

Gln Ser Met Phe Thr Cys Arg Val Asp His Arg Gly Leu Thr Phe Gln 195 200 205

Gly Thr Asp Glu His Val Val Cys Lys Val GXn His Pro Asn Gly Asn

85 90 95

Lys Glu Lys Aan Val Pro Leu Pro Val lie Ala Gla Leu Pro Pro Lys 100 105 110

<22 0>

<2 21> MISC—FEATURE

<222> <32^7.-(476)

<223> CH4

<400> 64

Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu VaI Ser Cys Glu Asn 1 5 10 15

Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp

25 30

Phe Leu Pro Aap Ser lie Thr Phe Ser Trp Lys Tyr Lys Aan Asn Ser 40 45

Gln Asri AIa Ser Ser Met Cys Val 210 215

Pro Asp Gln Asp Thr Ala lie Arg

220 Val Phe Ala lie Pro Pro Ser Phe Ala Ser lie Phe Leu Thr Lys Ser 225 230 235 240

Thr Lys Leu Thr Cya Leu Val Thr Aap Leu Thr Thr Tyr Aap Ser Val 245 250 255

Thr lie Ser Trp Thr Arg Gln Asn Gly Glu Ala Val Lys Thr His Thr 260 265 270

Asn lie Ser Glu Ser His Pro Asn Ala Thr Phe Ser AIa Val Gly Glu 275 280 285

Ala Ser lie Cys Glu Asp Asp Trp Asn Ser Gly Glu Arg Phe Thr Cys 290 295 300

Thr Val Thr His Thr Asp Leu Pro Ser Pro Leu Lys Gln Thr lie Ser 305 310 315 320

Arg Pro Lys Gly Val Ala Leu His Arg Pro Asp Val Tyr Leu Leu Pro 325 330 335

Pro A.1 a Arg Glu G.In Leu Asn Leu Arg Glu Ser AI a Thr ； Ie Thr Cys 340 345 350

Leu Vai Thr Gly Phe Ser Pro Ala Asp Val Phe Val Gln Trp Gin Met 355 360 365

Gln Arg Gly Gln Pro Leu Sex Pro Glu Lys Tyr Vai Thr Ser Ala Pro

370 375 380

Met Pro Glu Pro Gln Aia Pro Gly Arg Tyr Phe AIa His Ser lie Leu

385 39C 395 400

Thr Val Ser Glu Glu Glu Trp Asn Thr Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val 405 410 415

Val Ala His Glu Ala Leu Pro Aari Arg Val Thr Glu Arg Thr Val Asp 420 425 430

Lys Ser Thr Gly Lys Pro Thr Ser Ala Asp Glu Glu Gly Phe Glu Asn 435 440 445

Leu Trp Ala 450

Thr Ala Ser Thr 455

Phe lie Val Leu Tyr Asn Val Ser Leu 460 Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr Cys Tyr Val Lys 465 470 475

<210> 65

<211> θ

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 65

Gly Gly Gly Lys Gly Gly Gly Gly 1 5

<210> 66

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 66

Gly Gly Gly Asn Gly Ser Gly Gly 1 5

<210> 67

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 67

Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly

I 5

<210> 68

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 66 Gly Pro Asn

Gly Gly 5

Claims (38)

1. Pelo menos um ácido nucleico mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado compreendendo pelo menos um polinucleotídeo que codifica a se- qüência de aminoácido de SEQ ID NOS:2 ou 4 ou um polinucleotídeo com- plementar ao mesmo, o referido ácido nucleico mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado tendo pelo menos uma atividade biológica de GLP-1 in vitro ou in vivo e ainda compreendendo pelo menos um sítio de glicosilação N-ligado.

2. Pelo menos um ácido nucleico mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado compreendendo pelo menos um polinucleotídeo que codifica a se- quência de aminoácido compreendendo pelo menos um selecionado de SEQ ID NOS:2, 4, 6 ou 7-14 ou um polinucleotídeo complementar ao mes- mo, em que o referido ácido nucleico mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado tem pelo menos uma atividade biológica de GLP-1 in vitro ou in vivo e ainda compreendendo pelo menos um sítio de glicosilação N-ligado.

3. Pelo menos um ácido nucleico mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado de acordo com a reivindicação 2, compreendendo pelo menos um polinucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácido de SEQ ID NOS:2 ou 4 ou um polinucleotídeo complementar ao mesmo, em que o referido áci- do nucleico mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado tem pelo menos uma ativi- dade biológica de GLP-1 in vitro ou in vivo e ainda compreendendo pelo me- nos um sítio de glicosilação N-ligado.

4. Pelo menos um ácido nucleico mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado compreendendo pelo menos um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de acordo com a Fórmula (I): (Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t), em que P compreende pelo menos um peptídeo de GLP-1 bioativo selecio- nado de SEQ ID NOS:1 ou 6, L é pelo menos uma seqüência Iigante com- preendendo Ser e Gly1 V é pelo menos uma porção de um C-término de uma região variável de imunoglobulina, H é pelo menos uma porção de uma regi- ão de dobradiça variável de imunoglobulina, CH2 é pelo menos uma porção de uma região constante CH2 de imunoglobulina, CH3 é pelo menos uma porção de uma região constante CH3 de imunoglobulina, η é um número inteiro de 1 a 10 e o, ρ, q, r, s, e t podem ser independentemente um número inteiro de 0 a 10, em que o referido ácido nucleico mimeticorpo CH1 de GLP- -1 deletado tem pelo menos uma atividade biológica de GLP-1 in vitro ou in vivo e ainda compreendendo pelo menos um sítio de glicosilação N-ligado.

5. Pelo menos um polipeptídeo de mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado, compreendendo todos os aminoácidos contínuos de SEQ ID NOS:2 ou 4, em que o referido polipeptídeo de mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado tem pelo menos uma atividade biológica de GLP-1 in vitro ou in vivo e ainda compreendendo pelo menos um sítio de glicosilação N-ligado.

6. Pelo menos um polipeptídeo de mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado, compreendendo todos os aminoácidos contínuos de pelo menos um de SEQ ID NOS:7-14, em que o referido polipeptídeo de mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado tem pelo menos uma atividade biológica de GLP-1 in vitro ou in vivo e ainda compreendendo pelo menos um sítio de glicosila- ção N-ligado.

7. Pelo menos um polipeptídeo de mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado, compreendendo um polipeptídeo de acordo com a Fórmula (I): (Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t), em que P é pelo menos um peptídeo de GLP-1 bioativo selecionado de SEQ ID NO:1 e 6, L é selecionado de GS, GGS1 GGGS (SEQ ID NO:16), GSGGGS (SEQ ID NO:17), GGSGGGS (SEQ ID NO:18), GGSGGGSGG (SEQ ID NO:19) e GGGSGGGSGG (SEQ ID N0:20); V é selecionado de GTLVTVSS (SEQ ID NO:21), GTLVAVSS (SEQ ID NO:22), GTAVTVSS (SEQ ID NO:23), TVSS (SEQ ID NO:24) e AVSS (SEQ ID NO:25); H é EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP (SEQ ID NO:26), CH2 é SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAK (SEQ ID NO:43), CH3 é GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:44), η é um número inteiro de 1 a -10 e o, p, q, r, s e t podem ser independentemente um número inteiro de 0 a -10, em que o referido mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado tem pelo menos uma atividade biológica de GLP-1 in vitro ou in vivo e ainda compreendendo pelo menos um sítio de glicosilação N-ligado.

8. Pelo menos um polipeptídeo de mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado, compreendendo um polipeptídeo de acordo com a Fórmula (I): (Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t), em que P é pelo menos um peptídeo de GLP-1 bioativo de SEQ ID NO:6, L é selecionado de GS1 GGS, GGGS (SEQ ID NO:16), GSGGGS (SEQ ID NO:17), GGSGGGS (SEQ ID NO:18), GGSGGGSGG (SEQ ID NO:19) e GGGSGGGSGG (SEQ ID N0:20); V é selecionado de GTLVTVSS (SEQ ID NO:21), GTLVAVSS (SEQ ID NO:22), GTAVTVSS (SEQ ID NO:23), TVSS (SEQ ID NO:24) e AVSS (SEQ ID NO:25); H é ESKYGPPCPSCPAPE- FLGGP (SEQ ID NO:27), CH2 é SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKA K (SEQ ID NO:45), CH3 é GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSLGK (SEQ ID NO:46), η é um número inteiro de 1 a 10 e o, p, q, r, s e t podem ser independentemente um número inteiro de 0 a 10, em que o refe- rido mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado tem pelo menos uma atividade biológica de GLP-1 in vitro ou in vivo e ainda compreendendo pelo menos um sítio de glicosilação N-ligado.

9. Pelo menos um polipeptídeo de mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado, compreendendo um polipeptídeo de acordo com a Fórmula (I): (Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t), em que P é pelo menos um peptídeo de GLP-1 bioativo de SEQ ID NO:6, L é selecionado de GS, GGS, GGGS (SEQ ID NO:16), GSGGGS (SEQ ID NO:17), GGSGGGS (SEQ ID ΝΟ.Ί8), GGSGGGSGG (SEQ ID NO:19) e GGGSGGGSGG (SEQ ID N0:20); V é selecionado de GTLVTVSS (SEQ ID NO:21), GTLVAVSS (SEQ ID NO:22), GTAVTVSS (SEQ ID NO:23), TVSS (SEQ ID NO:24) e AVSS (SEQ ID NO:25); H é ESKYGPPCPPCPAPEA- AGGP (SEQ ID NO:28), CH2 é SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDG VEVHNAK TKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKA K (SEQ ID NO:45), CH3 é GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSLGK (SEQ ID NO:46), η é um número inteiro de 1 a 10 e o, p, q, r, s e t podem ser independentemente um número inteiro de 0 a 10, em que o refe- rido mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado tem pelo menos uma atividade biológica de GLP-1 in vitro ou in vivo e ainda compreendendo pelo menos um sítio de glicosilação N-ligado.

10. Pelo menos um polipeptídeo de mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado, compreendendo um polipeptídeo de acordo com a Fórmula (I): (Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t), em que P é pelo menos um peptídeo de GLP-1 bioativo, variante ou deriva- do, L é pelo menos uma seqüência ligante, o qual pode ser um polipeptídeo que proporciona flexibilidade estrutural por permitir que o mimeticorpo tenha orientações e propriedades de ligação alternativas, V é pelo menos uma porção de um C-término de uma região variável de imunoglobulina, H é pelo menos uma porção de uma região de dobradiça variável de imunoglobulina, CH2 é SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAK (SEQ ID NO:43), CH3 é GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:44), η é um número inteiro de 1 a 10 e o, p, q, r, s e t podem ser independentemente um número inteiro de 0 a 10, em que o referido mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado tem pelo menos uma atividade biológica de GLP-1 in vitro ou in vivo e ainda compreendendo pelo menos um sítio de glicosilação N-ligado.

11. Pelo menos um polipeptídeo de mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado, compreendendo um polipeptídeo de acordo com a Fórmula (I): (Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t), em que P é pelo menos um peptídeo de GLP-1 bioativo, variante ou deriva- do, L é pelo menos uma seqüência ligante, o qual pode ser um polipeptídeo que proporciona flexibilidade estrutural por permitir que o mimeticorpo tenha orientações e propriedades de ligação alternativas, V é pelo menos uma porção de um C-término de uma região variável de imunoglobulina, H é pelo menos uma porção de uma região de dobradiça variável de imunoglobulina, CH2 é SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKA K (SEQ ID NO:45), CH3 é GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSLGK (SEQ ID NO:46), η é um número inteiro de 1 a 10 e o, p, q, r, s e t podem ser independentemente um número inteiro de 0 a 10, em que o refe- rido mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado tem pelo menos uma atividade biológica de GLP-1 in vitro ou in vivo e ainda compreendendo pelo menos um sítio de glicosilação N-ligado.

12. Pelo menos um polipeptídeo de mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado, compreendendo um polipeptídeo de acordo com a Fórmula (I): (Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t), em que P é pelo menos um peptídeo de GLP-1 bioativo de SEQ ID NO:6, L é pelo menos uma seqüência ligante, o qual pode ser um polipeptídeo que proporciona flexibilidade estrutural por permitir que o mimeticorpo tenha ori- entações e propriedades de ligação alternativas, V é pelo menos uma por- ção de um C-término de uma região variável de imunoglobulina, H é pelo menos uma porção de uma região de dobradiça variável de imunoglobulina, CH2 é pelo menos uma porção de uma região constante CH2 de imunoglo- bulina, CH3 é pelo menos uma porção de uma região constante CH3 de i- munoglobulina, η é um número inteiro de 1 a 10 e o, p, q, r, s, e t podem ser independentemente um número inteiro de 0 a 10, em que o referido mimeti- corpo CH1 de GLP-1 deletado tem pelo menos uma atividade biológica de GLP-1 in vitro ou in vivo e ainda compreendendo pelo menos um sítio de glicosilação N-ligado.

13. Pelo menos um polipeptídeo de mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado, compreendendo um polipeptídeo de acordo com a Fórmula (I): (Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t), em que P é pelo menos um peptídeo de GLP-1 bioativo, variante ou deriva- do, L é selecionado de GS, GGS1 GGGS (SEQ ID NO:16), GSGGGS (SEQ ID NO:17), GGSGGGS (SEQ ID NO:18), GGSGGGSGG (SEQ ID NO:19) e GGGSGGGSGG (SEQ ID N0:20); V é pelo menos uma porção de um C- término de uma região variável de imunoglobulina, H é pelo menos uma por- ção de uma região de dobradiça variável de imunoglobulina, CH2 é pelo me- nos uma porção de uma região constante CH2 de imunoglobulina, CH3 é pelo menos uma porção de uma região constante CH3 de imunoglobulina, η é um número inteiro de 1 a 10 e o, p, q, r, s, e t podem ser independente- mente um número inteiro de 0 a 10, em que o referido mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado tem pelo menos uma atividade biológica de GLP-1 in vitro ou in vivo e ainda compreendendo pelo menos um sítio de glicosilação N- ligado.

14. Pelo menos um polipeptídeo de mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado, compreendendo um polipeptídeo de acordo com a Fórmula (I): (Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t), em que P é pelo menos um peptídeo de GLP-1 bioativo, variante ou deriva- do; L é pelo menos uma seqüência ligante, o qual pode ser um polipeptídeo que proporciona flexibilidade estrutural por permitir que o mimeticorpo tenha orientações e propriedades de ligação alternativas; V é selecionado de G- TLVTVSS (SEQ ID NO:21), GTLVAVSS (SEQ ID NO:22), GTAVTVSS (SEQ ID NO:23), TVSS (SEQ ID NO:24) e AVSS (SEQ ID NO:25); H é pelo menos uma porção de uma região de dobradiça variável de imunoglobulina; CH2 é pelo menos uma porção de uma região constante CH2 de imunoglobulina; CH3 é pelo menos uma porção de uma região constante CH3 de imunoglo- bulina; η é um número inteiro de 1 a 10 e o, p, q, r, s, e t podem ser inde- pendentemente um número inteiro de 0 a 10, em que o referido mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado tem pelo menos uma atividade biológica de GLP-1 in vitro ou in vivo e ainda compreendendo pelo menos um sítio de glicosila- ção N-ligado.

15. Pelo menos um polipeptídeo de mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado, compreendendo um polipeptídeo de acordo com a Fórmula (I): (Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t), em que P é pelo menos um peptídeo de GLP-1 bioativo, variante ou deriva- do, L é pelo menos uma seqüência ligante, o qual pode ser um polipeptídeo que proporciona flexibilidade estrutural por permitir que o mimeticorpo tenha orientações e propriedades de ligação alternativas, V é pelo menos uma porção de um C-término de uma região variável de imunoglobulina, H é se- lecionado de EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP (SEQ ID NO:26), ESKYGPPCPSCPAPEFLGGP (SEQ ID NO:27) e ESKYGPPCPPCPAPEA- AGGP (SEQ ID NO:28), CH2 é pelo menos uma porção de uma região cons- tante CH2 de imunoglobulina, CH3 é pelo menos uma porção de uma região constante CH3 de imunoglobulina, η é um número inteiro de 1 a 10 e o, p, q, r, s, e t podem ser independentemente um número inteiro de 0 a 10, em que o referido mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado tem pelo menos uma ativida- de biológica de GLP-1 in vitro ou in vivo e ainda compreendendo pelo menos um sítio de glicosilação N-ligado.

16. Pelo menos um polipeptídeo de mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado, compreendendo um polipeptídeo de acordo com a Fórmula (I): (Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t), em que P é pelo menos um peptídeo de GLP-1 bioativo, variante ou deriva- do, L é pelo menos uma seqüência ligante, o qual pode ser um polipeptídeo que proporciona flexibilidade estrutural por permitir que o mimeticorpo tenha orientações e propriedades de ligação alternativas, V é pelo menos uma porção de um C-término de uma região variável de imunoglobulina, H é se- lecionado de EPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGP (SEQ ID NO:29), EPK- SADKTHTCPPCPAPELAGGP (SEQ ID N0:30), EPKSADKTHTCPPCPA- PEALGGP (SEQ ID NO:31), EPKSADKTHTCPPCPAPELEGGP (SEQ ID NO:32), EPKSSDKTHTCPPCPAPEFLGGP (SEQ ID ΝΟ:33), EPKSADK- THACPPCPAPELLGGP (SEQ ID NO:34), EPKSADKAHTCPPCPAPEL- LGGP (SEQ ID NO:35) e EPKSADKTHTCPPCPAPELLGGP (SEQ ID NO:36), ADKTHTCPPCPAPELLGGP (SEQ ID NO:37), THTCPPCPAPEL- LGGP (SEQ ID NO:38), ESKYGPPCPSCPAPEAAGGP (SEQ ID NO:39), ESKYGPPCPPCPAPELLGGP (SEQ ID N0:40), CPPCPAPELLGGP (SEQ ID NO:41) e CPPCPAPEAAGGP (SEQ ID NO:42), CH2 é pelo menos uma porção de uma região constante CH2 de imunoglobulina, CH3 é pelo menos uma porção de uma região constante CH3 de imunoglobulina, η é um núme- ro inteiro de 1 a 10 e o, p, q, r, s, e t podem ser independentemente um nú- mero inteiro de 0 a 10, em que o referido mimeticorpo CH1 de GLP-1 deleta- do tem pelo menos uma atividade biológica de GLP-1 in vitro ou in vivo e ainda compreendendo pelo menos um sítio de glicosilação N-ligado.

17. Pelo menos um polipeptídeo de mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado de acordo com a Fórmula (I): (Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t), em que P é pelo menos um peptídeo de GLP-1 bioativo, variante ou deriva- do, L é pelo menos uma seqüência ligante, o qual pode ser um polipeptídeo que proporciona flexibilidade estrutural por permitir que o mimeticorpo tenha orientações e propriedades de ligação alternativas, V é pelo menos uma porção de um C-término de uma região variável de imunoglobulina, H é pelo menos uma porção de uma região de dobradiça variável de imunoglobulina, CH2 é pelo menos uma porção de uma região constante CH2 de imunoglo- bulina, CH3 é pelo menos uma porção de uma região constante CH3 de i- munoglobulina, η é um número inteiro de 1 a 10 e o, p, q, r, s, e t podem ser independentemente um número inteiro de 0 a 10, em que o referido mimeti- corpo CH1 de GLP-1 deletado tem pelo menos uma atividade biológica de GLP-1 in vitro ou in vivo e ainda compreendendo pelo menos um sítio de glicosilação N-ligado.

18. Ácido nucleico mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado ou poli- peptídeo de mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-17 em que o referido polipeptídeo tem pelo menos uma atividade de pelo menos um polipeptídeo P.

19. Anticorpo monoclonal ou policlonal anti-idiotipo, proteína de fusão ou fragmento do mesmo, que se liga especificamente a pelo menos um polipeptídeo de mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado como definido em qualquer uma das reivindicações 4-17.

20. Ácido nucleico mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado de a - cordo com qualquer uma das reivindicações 1-3 ou que codifica pelo menos um polipeptídeo de mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado ou anticorpo com ácido nucleico mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado como definido em qual- quer uma das reivindicações 4-17 ou um polinucleotídeo complementar ao mesmo.

21. Vetor de mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado compreendendo pelo menos um ácido nucleico isolado como definido na reivindicação 20.

22. Célula hospedeira com mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado compreendendo um ácido nucleico isolado como definido na reivindicação 20.

23. Célula hospedeira com mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado de acordo com a reivindicação 21, em que a referida célula hospedeira é pelo menos uma selecionada de células COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, NSO1 DG44 CHO, CHO K1, HeLa1 de mieloma ou Iinfoma ou qualquer célula derivada, imortalizada ou trans- formada das mesmas.

24. Método para a produção de pelo menos um polipeptídeo de mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado ou anticorpo com mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado compreendendo tradução de um ácido nucleico como defi- nido na reivindicação 20 sob condições in vitro, in vivo ou in situ, de modo que o mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado ou anticorpo é expresso em quantidades detectáveis ou recuperáveis.

25. Composição compreendendo pelo menos um ácido nucleico mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado, polipeptídeo de ácido nucleico mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado ou anticorpo com ácido nucleico mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 -20.

26. Composição de acordo com a reivindicação 25, em que a referida composição ainda compreende pelo menos um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

27. Composição de acordo com a reivindicação 25, ainda com- preendendo pelo menos uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um composto, composição ou poli- peptídeo selecionado de pelo menos um de um fármaco relacionado ao dia- betes ou metabolismo de insulina± um rótulo detectável ou repórter, um an- tagonista de TNF, um fármaco anti-infectivo, um fármaco para o sistema cardiovascular (CV), um fármaco para o sistema nervoso central (CNS), um fármaco para o sistema nervoso autonômico (ANS), um fármaco para o trato respiratório, um fármaco para o trato gastrointestinal (Gl), um fármaco hor- monal, um fármaco para o equilíbrio de fluido ou eletrólito, um fármaco he- matológico, um antineoplásico, um fármaco para imunomodulação, um fár- maco oftálmico, ótico ou nasal, um fármaco tópico, um fármaco nutricional, uma citocina ou um antagonista de citocina.

28. Composição de acordo com a reivindicação 25, na forma de pelo menos um selecionado de um líquido, gás ou solução seca, mistura, suspensão, emulsão ou colóide, um preparado Iiofilizado ou um pó.

29. Método para diagnóstico ou tratamento de uma condição rela- cionada a GLP-1 em uma célula, tecido, órgão ou animal, compreendendo: (a) contato ou administração de uma composição compreenden- do uma quantidade eficaz de pelo menos um ácido nucleico mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado, polipeptídeo ou anticorpo como definido em qual- quer uma das reivindicações 1-19, com ou na referida célula, tecido, órgão ou animal.

30. Método de acordo com a reivindicação 29, em que a condi- ção relacionada a GLP-1 é diabetes ou insuficiência cardíaca congestiva.

31. Método de acordo com a reivindicação 29, em que a referida quantidade eficaz é 0,0001-50 mg de mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado anticorpo; 0,1-500 mg do referido mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado; ou -0,0001-100 μ9 do referido ácido nucleico mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado por quilograma das referidas células, tecido, órgão ou animal.

32. Método de acordo com a reivindicação 29, em que o referido contato ou a referida administração é através de pelo menos um modo sele- cionado de parenteral, subcutâneo, intramuscular, intravenoso, intra- articular, intrabrônquico, intra-abdominal, intracapsular, intracartiloginoso, intracavitário, intracelial, intracelebelar, intracérebro-ventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intra-hepático, intramiocardial, intraosteal, intra- pélvico, intrapericardíaco, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático, intra- pulmonar, intrarretal, intrarrenal, intrarretinal, intraespinhal, intrassinovial, intratorácico, intrauterino, intravesical, intralesional, bolo, vaginal, retal, bu- cal, sublingual, intranasal ou transdérmico.

33. Método de acordo com a reivindicação 29, ainda compreen- dendo administração, antes, concorrentemente ou após o referido (a) conta- to ou administração de pelo menos uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de pelo menos um composto ou polipeptídeo selecionado de pelo menos um de um fármaco relacionado ao diabetes ou metabolismo de insulina4 um rótulo detectável ou repórter, um antagonista de TNF, um fármaco anti-infectivo, um fármaco para o sistema cardiovascular (CV), um fármaco para o sistema nervoso central (CNS), um fármaco para o sistema nervoso autonômico (ANS), um fármaco para o trato respiratório, um fárma- co para o trato gastrointestinal (Gl), um fármaco hormonal, um fármaco para o equilíbrio de fluido ou eletrólito, um fármaco hematológico, um antineoplá- sico, um fármaco para imunomodulação, um fármaco oftálmico, ótico ou na- sal, um fármaco tópico, um fármaco nutricional, uma citocina ou um antago- nista de citocina.

34. Dispositivo compreendendo pelo menos um polipeptídeo de mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado isolado, anticorpo ou ácido nucleico como definido em qualquer uma das reivindicações 1-20, em que o referido dispositivo é adequado para contato ou administração do referido pelo me- nos um do referido polipeptídeo de mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado, anticorpo ou ácido nucleico, através de pelo menos um modo selecionado de parenteral, subcutâneo, intramuscular, intravenoso, intra-articular, intrabrôn- quico, intra-abdominal, intracapsular, intracartiloginoso, intracavitário, intra- celial, intracelebelar, intracérebro-ventricular, intracólico, intracervical, intra- gástrico, intra-hepático, intramiocardial, intraosteal, intrapélvico, intrapericar- díaco, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrarretal, intrarrenal, intrarretinal, intraespinhal, intrassinovial, intratorácico, intrauteri- no, intravesical, intralesional, bolus, vaginal, retal, bucal, sublingual, intrana- sal ou transdérmico.

35. Artigo de fabricação para uso farmacêutico ou diagnóstico humano compreendendo material de embalagem e um recipiente compreen- dendo pelo menos um polipeptídeo de mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado isolado, anticorpo ou ácido nucleico como definido em qualquer uma das reivindicações 1-20.

36. Artigo de fabricação de acordo com a reivindicação 35, em que o referido recipiente é um componente de um dispositivo ou sistema pa- ra distribuição parenteral, subcutânea, intramuscular, intravenosa, intra- articular, intrabrônquica, intra-abdominal, intracapsular, intracartiloginosa, intracavitária, intracelial, intracelebelar, intracérebro-ventricular, intracólica, intracervical, intragástrica, intra-hepática, intramiocardial, intraosteal, intra- pélvica, intrapericardíaca, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intra- pulmonar, intrarretal, intrarrenal, intrarretinal, intraespinhal, intrassinovial, intratorácica, intrauterina, intravesical, intralesional, bolus, vaginal, retal, bu- cal, sublingual, intranasal ou transdérmica.

37. Método para a produção de pelo menos um polipeptídeo de mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado isolado, anticorpo ou ácido nucleico como definido em qualquer uma das reivindicações 1-20, compreendendo fornecimento de pelo menos um célula hospedeira, animal transgênico, plan- ta transgênica, célula de planta capaz de expressar, em quantidades detec- táveis ou recuperáveis, o referido polipeptídeo, anticorpo ou ácido nucleico.

38. Pelo menos um polipeptídeo de mimeticorpo CH1 de GLP-1 deletado, anticorpo ou ácido nucleico produzido através de um método como definida na reivindicação 37.