CN103204944B - 用于治疗糖尿病的长效免疫融合蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于治疗糖尿病的长效免疫融合蛋白，所述的免疫蛋白为Exendin-4-IgG4免疫融合蛋白。本发明的Exendin-4-IgG4免疫融合蛋白具有促进胰岛素分泌、抑制β细胞程序性凋亡和刺激β细胞的增殖、降低胰高血糖素的水平、减慢胃排空和降低摄食欲望等功能，从多个途径降低体内血糖且不会导致低血糖症。但效应期长于Exendin-4，长期使用具有一定的减肥作用，可用于II型糖尿病治疗。

Description

用于治疗糖尿病的长效免疫融合蛋白

技术领域

本发明提供了一种用于治疗糖尿病的长效免疫融合蛋白，属于生物医药技术领域。

背景技术  

    随着人们饮食结构和生活方式的改变，以慢性高血糖为特征的代谢紊乱性疾病-糖尿病的发病率迅速上升。2012年5月16日,日内瓦发布的《2012年世界卫生统计》报告，全球十分之一成年人罹患糖尿病（http://www.cmt.com.cn/）。 据统计数据显示，上世纪70年代末，中国糖尿病的患病率还不足1％，而到2012年4月，我国18岁及以上居民糖尿病患病率为9.7%，60岁以上老年人患病率更是高达19.6%，全国约有成年糖尿病患者9700万人，且患病人群的发展正趋于低龄化，积极防治糖尿病已成为我国慢性病防治领域的重要任务之一。 

     糖尿病是患者体内胰岛素分泌绝对或相对不足，导致血糖过高，出现糖尿，进而引起脂肪和蛋白质代谢紊乱的疾病，临床上可出现典型的“三多一少”（多饮、多尿、多食、消瘦）症状，重者容易发生酮症酸中毒等急性并发症或血管、神经等慢性并发症。久病可引起眼、肾、神经、心脏和血管等组织的慢性进行性病变，引起功能缺陷及衰竭，病情严重的或应激时可发生急性代谢紊乱，会有酮症酸中毒、高渗性昏迷等症状。糖尿病通常分为I型和II型两种。I型糖尿病即胰岛素依赖性糖尿病。多种因素诱发机体产生异常自身体液和细胞免疫应答，胰岛β细胞被破坏达80%以上，胰岛素分泌减少，多数患者体内可检出抗胰岛β细胞抗体。目前普遍认为是一种自身免疫性疾病。该型糖尿病约占糖尿病总人数的10％，常发生于儿童和青少年，故又称青年发病型糖尿病。患者需要依靠外源胰岛素存活，一旦中止胰岛素治疗则会威胁生命。II型糖尿病即非胰岛素依赖型糖尿病约占糖尿病总人数的90％，发病年龄多数在35岁以后。 II型糖尿病病人体内产生胰岛素的能力并非完全丧失，有的患者体内胰岛素甚至产生过多，但胰岛素的作用效果却大打折扣，因此患者体内的胰岛素处于一种相对缺乏的状态。可以通过某些口服药物刺激体内胰岛素的分泌。但到后期仍有部分病人需要像Ⅰ型糖尿病那样进行胰岛素治疗。

如果通过饮食和运动不能将血糖维持在正常范围或接近目标水平，通常医生会使用一些降糖药用于糖尿病的治疗。I 型糖尿病的治疗主要是补充胰岛素及或相关代用品。 II型糖尿病应以改善胰岛素抵抗( IR) 和保护胰岛β细胞功能为主，除胰岛素外，临床常用药物有双胍类、磺酰脲类、列奈类、噻唑烷二酮类、α-糖苷酶抑制剂等。以上药物在降低血糖水平方面具良好疗效, 但在糖尿病治疗领域仍存在着未能解决的诸多重要问题, 其中最为显著的问题就是药物在降低高血糖方面不能维持长期疗效、对β胰腺细胞功能衰减这一糖尿病的根本病因缺乏靶向作用以及不良反应显著。约25%的Ⅱ型糖尿病患者从口服降糖药转到胰岛素治疗或联合胰岛素治疗, 但是胰岛素拮抗造成胰岛素作用不敏感, 剂量增加及长期使用可能产生高胰岛素血症, 增加心血管病风险（周琼等：Exendin-4 治疗2 型糖尿病的研究进展. 复旦学报( 医学版) ,2010 Nov, 37( 6):738-741)。

肠促胰岛素类药物因其在II型糖尿病中的治疗具有独特的特性，受到广泛关注。很久以前人们在动物实验中就发现动物体内“肠- 胰岛轴”的存在，比如存在口服葡萄糖对胰岛素分泌的促进作用明显高于静脉注射的现象，这种现象被称为“肠促胰岛素效应”。后证实该效应是人和动物肠黏膜L细胞分泌一类名为肠促胰岛素的激素，在进食后该类物质分泌进入血液循环系统中，最终作用于胰岛β细胞，促进β细胞胰岛素分泌，并减少胰岛α细胞分泌胰高血糖素(glucagon)，发挥降糖作用。肠促胰岛素类物质主要是胰高血糖样肽-1（ GLP-1）和葡萄糖依赖性胰岛素释放多肽(GIP)组成，其中GLP-1起着更为重要的作用。GLP-1由胰高血糖素原基因表达,在胰岛α细胞中胰高血糖素原基因经特异性剪切主要表达产物是胰高血糖素,而在肠黏膜的L细胞中经前激素转换酶(PC1)将胰高血糖素原基因剪切为其羧基端的肽链,即GLP-1。GLP-1有2种生物活性形式,分别为GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)酰胺,这两者仅有一个氨基酸序列不同,GLP-1约80%的循环活性来自GLP-1(7-36)酰胺（孙会仙等.糖尿病药物治疗进展. 中国医院用药评价与分析,2011,11(1):94-96）。GLP-1受体广泛表达于各种类型的细胞上, 包括胰腺β细胞、胃小凹、小肠黏膜、心肺及中枢神经系统。葡萄糖和脂肪酸能刺激GLP- 1释放入血, 与其特异的GLP- 1受体作用后发挥效应。GLP- 1释放入血后很快被血中的二肽基肽酶-IV( DPP- IV )降解, 并经肝肾清除, 其半哀期仅1-2 m in, 故限制了天然GLP- 1的临床应用。 Exendin- 4与GLP- 1 的生物学效应几乎完全一致。Exendin-4是胰高血糖素样肽1(glueagon-like peptide-1，GLP-I)的类似物， Exendin-4最初发现于美国西南部希拉毒蜥(Heloderma suspectum)的唾液中，是一种含有39个氨基酸的多肽，相对分子质量4186.57（ Eng J, Kleinman WA, Singh G, Raufman JP et al: Isolation and characterization of exendin-4, an exendin-3 analogue, from Heloderma suspectum venom:further evidence for an exendin receptor on dispersed acini from guinea pig pancreas. J Biol Chem，1992 267:7402–7405)。氨基酸序列53%与人GLP-1同源，并且均结合于GLP-1受体（Goke R et al:Exendin-4 is a potent agonist and truncated exendin-(9–39)-amide an antagonist at the GLP-1-(7–36)-amide receptor of insulin- secreting b-cells. J Biol Chem,1993, 268: 19650–19655）。通过核磁共振得到Exendin-4的空间结构， 其N 端是一段不规则卷曲, 第7-28 氨基酸残基构成-α螺旋， Glu16对稳定α-螺旋起重要作用，Leu21 -Pro38残基形成了一个紧密的结构将Trp25 包裹其中, 形成了一个特殊的Trp笼(Trp cage)。其C端氨基酸残基形成不规则的亲水结构。在哺乳动物体内，Exendin-4 与GLP- 1 具有相同的生理功能, 它们作用于同一受体, 即β受体家族的G偶联蛋白。Exendin- 4与受体结合分为3个区域: N 端与受体的胞外环结合；中间- 螺旋与受体的胞外N 端结合, 这是受体与Exendin-4 的主要结合部位; C 端也可与受体N 端结合。Exendin-4 与受体的亲和力比GLP- 1的更高。(毕华,等：Exendin-4的研究进展. 药物分析杂志,2010, 30( 12):2441-2445.)。研究发现，从Hisl开始逐级去掉Exendin-4的N端氨基酸直到Ser8，其活性逐级下降。去掉前2个氨基酸后类似物Ex(3～39)开始产生拮抗作用，去掉3～7位氨基酸后的拮抗活性是Ex(9～39)的4～l0倍，但结合力下降不明显，说明N端氨基酸与激活受体有关。Exendin-4的螺旋区域主要与受体的N端区域相互作用，形成的H结合力占79％，该区域中的Ser11、Glu15、Ala18、Phe22、Trp25和Leu26 6个保守氨基酸位于α螺旋的同一表面，是与受体作用的主要接触点（Al-Sabah S, et al:A model for receptor-peptide binding at the glucagon- like peptide-1 (GLP-1) receptor through the analysis of truncated ligands and receptors. Br J Pharmacol. 2003,140(2):339-46.）。C端9个氨基酸残基不是Exendin-4与受体结合和其生物活性所必须的，但是依次去除C端9个氨基酸残基产生的Exendin-4类似肽与受体的结合力逐渐降低（Doyle ME,et al: The importance of the nine-amino acid C-terminal sequence of exendin-4 for binding to the GLP-1 receptor and for biological activity. Regul Pept. 2003,114(2-3):153-8）。GLP-1R体内分布广泛，在胰腺中最多，属于7次跨膜的G蛋白耦联β受体家族，主要包括N端区域和中心区域两部分。Exendin- 4或GLP- 1与GLP-1R结合后，能增加胰岛β细胞内cAMP浓度,促进胰岛素分泌， Exendin- 4只有在正常血糖和高血糖条件下, 才刺激胰岛素的分泌; 在低血糖情况下, 无此作用, 这点与传统的其他降糖药不同。这降低了其在临床上发生低血糖的风险 (D A D'Alessio et al: Glucagon-like peptide 1 enhances glucose tolerance both by stimulation of insulin release and by increasing insulin-independent glucose disposal.J Clin Invest, 1994, 93(5): 2263–2266.)。Exendin-4可抑制β细胞程序性凋亡, 刺激β细胞的增值与新生(Chen J, et al: Exenatide inhibits beta-cell apoptosis by decreasing thioredoxin-interacting protein. Biochem Biophys Res Commun. 2006, 346(3):1067-74 )。体内外研究显示（Stoffers DA, et al: Neonatal exendin-4 prevents the development of diabetes in the intrauterine growth retarded rat. Diabetes. 2003,52(3):734-40.）Exendin-4具有诱导β细胞新生、促进β细胞增殖和抑制β细胞凋亡作用，可改善β细胞功能和增加β胰岛细胞质量。Exendin- 4 能降低胰高血糖素的水平（Kolterman OG,et al:Synthetic exendin-4 (exenatide) significantly reduces postprandial and fasting plasma glucose in subjects with type 2 diabetes. J Clin Endocrinol Metab. 2003 Jul;88(7):3082-9.），起到抑制糖原分解和糖异生作用，使血糖明显降低。Exendin-4刺激胰岛素分泌和抑制胰高血糖素分泌, 它比目前已有的药物, 能更好地重建门静脉中胰岛素与胰高血糖素的比值。在Ⅱ型糖尿病的患者中发现, Exendin-4 能减慢胃排空，其机制可能是直接与中枢神经系统( CNS)的GLP- 1R 作用, 调节胃肠动力或间接通过外周的迷走传入通路, 来延缓胃排空（Imeryüz N, et al:Glucagon-like peptide-1 inhibits gastric emptying via vagal afferent-mediated central mechanisms. Am J Physiol. 1997, 273(4 Pt 1):G920-7.）。

美国礼来公司和Amylin制药公司共同研制的抗糖尿病新药艾塞那肽注射液（Exendin-4，Exenatide，国外商品名Byetta,国内商品名百泌达）为全新类型的Ⅱ型糖尿病治疗药物, 2005 年经美国FDA 批准正式上市，在中国也于2009年8月上市。2012年1月27日，美国食品和药品监督管理局（FDA）批准了艾塞那肽注射液每周一次缓释剂型的上市申请，这是Ⅱ型糖尿病治疗中的首个每周一次治疗药物。但是由于国外Exenatide是全化学合成的, 化学合成法步骤多，成本比较昂贵,成品5μg/支在国内价格约300元，是胰岛素的5倍。以基因工程的方法制备Exendin-4将会大大降低生产成本，国内有不少单位试图用原核表达系统进行表达以降低成本，但由于Exendin-4仅为39氨基酸多肽，在大肠杆菌中表达量较低，下游纯化困难，得率低，因而很难成功。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种用于治疗糖尿病的长效免疫融合蛋白。

    本发明的用于治疗糖尿病的长效免疫融合蛋白，所述的免疫蛋白为Exendin-4-Igγ₄和 Exendin-4-Cκ经二硫键组装成为（Exendin-4-Igγ₄）₂（Exendin-4-Cκ4）₂  4聚体结构的Exendin-4-IgG4免疫融合蛋白，Exendin-4-IgG4免疫融合蛋白的结构如图6所示。其中，Exendin-4-Igγ₄编码基因的核苷酸序列如SEQ NO.1所示，Exendin-4-Igγ₄编码蛋白的氨基酸序列如SEQ NO.2所示，Exendin-4-Cκ编码基因的核苷酸序列如SEQ NO.3所示，Exendin-4-Cκ编码蛋白的氨基酸序列如SEQ NO.4所示。

    所述的Exendin-4-IgG4免疫融合蛋白中的IgG4为人IgG4。

    编码所述的融合蛋白的多核苷酸序列。

    含有编码多核苷酸序列的表达载体，所述的表达载体为谷氨酰胺合成酶表达载体。

    含有编码多核苷酸序列的宿主细胞，所述的宿主细胞为CHO细胞或NS0细胞。

    含有所述的融合蛋白的药物组合物。

    本发明的用于治疗糖尿病的长效免疫融合蛋白的构建方法，所述的方法如下：

1）将Exendin-4的编码基因通过连接肽(GGGGS)₃，分别与编码人抗体重链恒定区Igγ₄基因和轻链恒定区Cκ基因连接，得到Exendin-4-Igγ₄编码基因和Exendin-4-Cκ编码基因，通过限制性内切酶酶切后，分别连接至pBL和pBH表达载体，得到Exendin-4-Igγ₄/pBL载体和Exendin-4-Cκ/pBH载体；

2）将得到的Exendin-4-Igγ₄/pBL载体和Exendin-4-Cκ/pBH载体；再分别经限制性内切酶酶切和T4连接酶连接，构建成能同时表达Exendin-4-Igγ₄和Exendin-4-Cκ的谷氨酰胺合成酶（GS）表达载体；

3）转染CHO细胞后，经L-蛋氨酸砜亚胺筛选得到高表达Exendin-4- IgG4免疫融合蛋白的细胞株，在宿主细胞中表达的Exendin-4-Igγ₄和 Exendin-4-Cκ经二硫键组装成为（Exendin-4-Igγ₄）₂（Exendin-4-Cκ4）₂  4聚体结构的免疫融合蛋白，即为Exendin-4-IgG4免疫融合蛋白。

本发明的Exendin-4-IgG4免疫融合蛋白的分子量达到130 KD。该融合蛋白功能区为位于重链和轻链N端的39个氨基酸的Exendin-4，一个Exendin-4-IgG4免疫融合蛋白有4个Exendin-4功能分子。

    本发明的Exendin-4-IgG4免疫融合蛋白具有如下技术效果：IgG4免疫球蛋白在体内的半衰期可达23天，采用该结构可有效地延长药物半衰期；IgG4结构与Protein A有较高的亲和性易于纯化；为进一步降低该类免疫融合蛋白可能具有与效应细胞（T淋巴细胞、中性粒细胞和单核细胞）FcγR的结合能力和提高IgG4的稳定性，对IgG4铰链区和CH2恒定区的氨基酸残基S228P,L235E（Fc氨基酸残基编号按Kabat数据库）进行了突变，在序列号为SEQ NO.2的氨基酸序列中，突变位置为S187P和L194E。在IgG四种亚类中本发明之所以选择IgG4是由于IgG4与C1q的结合能力最弱，无经典途径激活补体和产生补体介导的细胞毒作用（CDC效应），也不能结合单核巨噬细胞，不能介导抗体依赖的细胞毒作用（ADCC效应）（Reddy MP, et al:Elimination of Fc receptor-dependent effector functions of a modified IgG4 monoclonal antibody to human CD4. J Immunol. 2000 ,164(4):1925-33.）。但IgG4分子的缺点是形成的聚体不够稳定以及有一定的结合中性粒细胞FcγR的能力，本发明中通过铰链区和CH2恒定区氨基酸的突变的可以克服IgG4分子的上述缺陷。此外，Exendin-4-IgG4免疫融合蛋白采用CHO细胞系统进行表达，表达产物更接近人体蛋白，通过哺乳动物细胞大规模表达技术可进行批量生产，可有效降低生产成本，降低价格使患者易于接受。

附图说明

图1 表达载体酶切鉴定结果图；其中，1，Exendin-4-Cκ/pBH；2，分子量标准；3，Exendin-4-Igγ₄/pBL；

图2为表达载体酶切鉴定结果图；其中，1，Marker；2,1号克隆；3，1号克隆；4，Exendin-4-Cκ/pBH；5，Exendin-4-Igγ₄/pBL；6，3号克隆；7，4号克隆；

图3为Exendin-4-IgG4免疫融合蛋白表达载体结构图；

图4为纯化的非还原SDS-PAGE电泳图，其中，1， 蛋白分子量标准；2，Exendin-4-IgG4免疫融合蛋白；3，Exendin-4-IgG4免疫融合蛋白

图5 为纯化的还原SDS-PAGE电泳图，其中，1，Exendin-4-IgG4免疫融合蛋白；2，蛋白分子量标准；

图6为Exendin-4-IgG4免疫融合蛋白的结构图；

图7为正常Bal b/c小鼠的降糖效果对照图；

图8为db/db糖尿病小鼠的降糖效果对照图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1

一、Exendin-4-IgG4免疫融合蛋白基因的克隆

1. 基因的合成

委托上海捷瑞生物工程有限公司将Exendin-4的编码基因通过连接肽(GGGGS)₃，与编码人抗体重链恒定区IgG4基因连接，合成编码Exendin-4-Igγ₄基因序列，其核苷酸序列如SEQ No.1所示，通过Hind III和EcoRI限制性内切酶酶切后，连接至pBL表达载体，得到Exendin-4-Igγ₄/pBL载体，其中AAGCTT和GAATTC分别为Hind III和EcoRI的酶切位点。

Exendin-4-Igγ₄编码蛋白的氨基酸序列如SEQ No.2所示，氨基酸序列中包括信号肽序列、Exendin-4和IgG4恒定区，其中METDTLLLWVLLLWVPGSTG为信号肽序列。

同样，委托上海捷瑞生物工程有限公司将Exendin-4的编码基因通过连接肽(GGGGS)3，与轻链恒定区Cκ基因连接，合成Exendin-4-Cκ编码基因序列，其核苷酸序列如SEQ No.3所示，通过Hind III和EcoRI限制性内切酶酶切后，连接至pBH表达载体，得到Exendin-4-Cκ/pBH载体，其中AAGCTTC和GAATTC分别为Hind III和EcoRI的酶切位点。

Exendin-4-Cκ编码蛋白的氨基酸序列如SEQ No.4所示，氨基酸序列中包括信号肽序列、Exendin-4和Cκ恒定区，其中METDTLLLWVLLLWVPGSTG为信号肽序列。

2. 表达载体的构建

材料：Exendin-4-Cκ/pBH载体，Exendin-4-Igγ₄/pBL载体

方法：将载体Exendin-4-Cκ/pBH载体，Exendin-4-Igγ₄/pBL载体分别经NotI和SalI双酶切后，回收酶切产物较长片段，在T4连接酶的作用下室温连接4小时后，转化大肠杆菌DH5α。12小时后挑取转化菌落，提取质粒。HindⅢ和EcoRI双酶切鉴定重组子。

结果：

1) Exendin-4-Cκ/pBH载体和Exendin-4-Igγ₄/pBL载体双酶切鉴定

Exendin-4-Cκ/pBH载体和Exendin-4-Igγ₄/pBL载体分别经HindⅢ和

EcoRI双酶切，可以切出560 bp 和1260 bp大小的条带，表达载体酶切鉴定结果如图1所示，与理论预测完全一致。 

2) Exendin-4-IgG4免疫融合蛋白表达载体的构建

Exendin-4-Cκ/pBH载体和Exendin-4-Igγ₄/pBL载体分别经NotI和SalI双酶切后，经T4连接酶连接成，挑取4个克隆经HindⅢ和EcoRI双酶切鉴定，2、3和4号克隆均可切出包括560 bp 和1260 bp在内的4条带，1号克隆未切出560 bp条带，表达载体酶切鉴定结果如图2所示。说明2、3和4号克隆构建成功，为可表达Exendin-4-IgG4免疫融合蛋白的载体，即能同时表达Exendin-4-Igγ₄和Exendin-4-Cκ的谷氨酰胺合成酶（GS）表达载体。载体结构图如图3所示。 

二、Exendin-4-IgG4免疫融合蛋白表达细胞的筛选

包括以下步骤：

1、DG44细胞在10% D-FBS，含1×HT，4mM谷氨酰胺的CD OptiCHO (Invitrogen 产品)中适应并贴壁生长；

2、胰酶消化后调节细胞浓度，加入96孔细胞培养板中，细胞数大约为1.5×10⁴/孔；

3、24小时后，按Lipofectin 2000 操作说明转染96孔板。

1）用无血清无抗生素的IMDM培养基洗2次，每次加入IMDM 100μl/孔。

2）取质粒与IMDM培养基混均，取Lipofectin 2000 CD 与IMDM培养基混均。静置5分钟后，将Lipofectin 2000 CD和质粒混匀。室温静置15分钟后，按每孔50μl加入已含50μl/孔IMDM的96孔板中。

3）5小时后，换成完全培养基（10%透析血清，含环丙沙星(+)，1×HT，4mM谷氨酰胺的CD OptiCHO）。

4、转染48小时后换液，用含L-蛋氨酸砜亚胺（L-Methionine sulfoximine，MSX）25 μM但不含谷氨酰胺的的CD OptiCHO培养基进行筛选，

5、长出克隆后，取50μl样品双抗体夹心法ELISA方法半定量检测培养液中蛋白含量，筛选出蛋白表达量相对较高克隆。

三、Exendin-4-IgG4免疫融合蛋白的表达和纯化

将高表达细胞置无血清的CD OptiCHO中培养，一定时间后收集培养上清。用pH 7.4的PBS溶液平衡 HiTrap MabSelect SuRe 1ml 柱(GE Healthcare Life Sciences产品, Cat. No：11-0034-93)10个床体积，流速为0.5ml/min；培养上清液用0.45μm滤膜过滤上样，流速为0.5ml/min。用pH 7.4的PBS溶液再洗5-10个床体积，流速为0.5ml/min；用100mM柠檬酸缓冲液（pH 4.0）洗脱，流速为0.5ml/min，收集洗脱峰。

纯化Exendin-4-IgG4免疫融合蛋白非还原SDS-PAGE电泳和还原SDS-PAGE电泳见图4和图5，非还原电泳Exendin-4-IgG4免疫融合蛋白表观分子量大约150kDa，但结合还原SDS-PAGE电泳结果其实际分子量应该为130 kDa；还原SDS-PAGE电泳重链约50kDa，轻链15kDa，左右与理论预期一致。 Exendin-4-IgG4免疫融合蛋白的结构如图6所示。 

四、Exendin-4-IgG4免疫融合蛋白生物活性分析

(一) 正常鼠中的降糖效应

方法：

1. 6周龄BAL B/c小鼠随即分实验和对照两组，每组6只；

2. 实验前用Accu-Chek Performa Nano（罗氏卓越纤巧型）血糖仪测基础血糖；

3. 按10mg/kg体重皮下注射本发明融合蛋白150 μl，对照组皮下注射等体积

缓冲液；

4. 1h后, 在不同时间段1h ,2, 3, 4, 6h 取小鼠尾血，测血糖。

结果：动物实验证实本发明的融合蛋白具有良好的降糖效果。如图7所示，对照组血糖基本平稳在5.4-7.8 mmol/L间波动；本发明的免疫球蛋白注射1小时后血糖显著下降，4小时后最低降至3.3 mmol/L，然后维持一个平稳状态，并未出现较低血糖现象。

二) db/db糖尿病小鼠的降糖效应

方法：

1. 小鼠18只小鼠，随即分3组，适应性饲养1周；

2. 禁食3h后测基础血糖；

3. 皮下注射Exendin-4（1μg/只），Exendin-4-IgG4免疫融合蛋白（10mg/kg）

和缓冲液各200μL；

4. 1h后, 在1, 3，6，9和24h时间段取小鼠尾血，测血糖。（实验期间小鼠

禁食，不禁水）；

结果：db/db糖尿病小鼠实验中Exendin-4和Exendin-4-IgG4免疫融合蛋白均具有良好的降糖效果。如图8所示，对照组血糖基本平稳在8.8-19.4  mmol/L间波动；Exendin-4在3小时内血糖降到7mmol/L的最低值，而后逐渐上升，在9小时后血糖浓度恢复至糖尿病水平甚至超过对照组达到14.05 mmol/L，24小时后超过对照组，血糖均值达19.4 mmol/L ；本发明的免疫球蛋白注射1小时后血糖显著下降，而后血糖维持在一个相对平稳期，最低值3.5mmol/L，未出现较低血糖现象，降糖效应期远远长于Exendin-4。

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<110> OrganizationName : 江苏健德生物药业有限公司

 

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gtacgtggac ggcgtggagg tgcacaacgc caagaccaag cctcgcgagg agcagttcaa     780

ctccacctac cgcgtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa     840

ggagtacaag tgcaaggtgt ccaacaaggg cctgccttcc tccatcgaga agaccatctc     900

caaggccaag ggccagcctc gcgagcctca ggtgtacacc ctgcctcctt cccaggagga     960

gatgaccaag aaccaggtgt ccctgacctg cctggtgaag ggcttctacc cttccgacat    1020

cgccgtggag tgggagtcca acggccagcc tgagaacaac tacaagacca cccctcctgt    1080

gctggactcc gacggctcct tcttcctgta ctcccgcctg accgtggaca agtcccgctg    1140

gcaggagggc aacgtgttct cctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac    1200

ccagaagtcc ctgtccctgt ccctgggcaa gtaagaattc                          1240

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METDTLLLWV LLLWVPGSTG HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPPSG      60

GGGSGGGGSG GGGSVTVSTA STKGPSVFPL APCSRSTSES TAALGCLVKD YFPEPVTVSW     120

NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTKTY TCNVDHKPSN TKVDKRVESK     180

YGPPCPPCPA PEFEGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSQEDP EVQFNWYVDG     240

VEVHNAKTKP REEQFNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKGLPSS IEKTISKAKG     300

QPREPQVYTL PPSQEEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD     360

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aagcttcgcc accatggaga ccgacacact gctgctgtgg gtcctgctgc tgtgggtgcc      60

aggctccacc ggccacggcg agggcacctt cacctccgac ctgtccaagc agatggagga     120

agaggccgtg aggctgttca tcgagtggct gaagaacggc ggaccctcct ctggcgcacc     180

acccccatct ggcgggggag ggagcggcgg agggggatcc ggaggaggcg gatccaccgt     240

ggccgccccc agcgtgttca tcttccctcc cagcgacgag cagctgaagt ctggcaccgc     300

cagcgtggtg tgcctgctga acaacttcta cccccgcgag gccaaggtgc agtggaaggt     360

ggacaacgcc ctgcagagcg gcaacagcca ggagagcgtg accgagcagg actccaagga     420

cagcacctac agcctgagca gcaccctgac cctgagcaag gccgactacg agaagcacaa     480

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gggsggggsg gggstvaaps vfifppsdeq lksgtasvvc llnnfyprea kvqwkvdnal     120

qsgnsqesvt eqdskdstys lsstltlska dyekhkvyac evthqglssp vtksfnrgec     180

 

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Claims (7)

1.用于治疗糖尿病的长效免疫融合蛋白，其特征在于，所述的免疫蛋白为Exendin-4-Igγ₄和 Exendin-4-Cκ经二硫键组装成为（Exendin-4-Igγ₄）₂（Exendin-4-Cκ4）₂  4聚体结构的Exendin-4-IgG4免疫融合蛋白，其中，Exendin-4-Igγ₄编码基因的核苷酸序列如SEQ NO.1所示，Exendin-4-Igγ₄编码蛋白的氨基酸序列如SEQ NO.2所示，Exendin-4-Cκ编码基因的核苷酸序列如SEQ NO.3所示，Exendin-4-Cκ编码蛋白的氨基酸序列如SEQ NO.4所示。

2.根据权利要求1所述的用于治疗糖尿病的长效免疫融合蛋白，其特征在于，所述的Exendin-4-IgG4免疫融合蛋白中的IgG4为人IgG4。

3.编码如权利要求1-2中任一项所述的融合蛋白的多核苷酸序列。

4.含有如权利要求3所述的编码多核苷酸序列的表达载体，其特征在于，所述的表达载体为谷氨酰胺合成酶表达载体。

5.含有如权利要求3所述的编码多核苷酸序列的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为CHO细胞或NS0细胞。

6.含有如权利要求1-2中任一项所述的融合蛋白的药物组合物。

7.如权利要求1所述的用于治疗糖尿病的长效免疫融合蛋白的构建方法，其特征在于，所述的方法如下：

1）将Exendin-4的编码基因通过连接肽(GGGGS)₃，分别与编码人抗体重链恒定区Igγ₄基因和轻链恒定区Cκ基因连接，得到Exendin-4-Igγ₄编码基因和Exendin-4-Cκ编码基因，通过限制性内切酶酶切后，分别连接至pBL和pBH表达载体，得到Exendin-4-Igγ₄/pBL载体和Exendin-4-Cκ/pBH载体；

2）将得到的Exendin-4-Igγ₄/pBL载体和Exendin-4-Cκ/pBH载体；再分别经限制性内切酶酶切和T4连接酶连接，构建成能同时表达Exendin-4-Igγ₄和Exendin-4-Cκ的谷氨酰胺合成酶表达载体；

3）转染CHO细胞后，经L-蛋氨酸砜亚胺筛选得到高表达Exendin-4- IgG4免疫融合蛋白的细胞株，在宿主细胞中表达的Exendin-4-Igγ₄和 Exendin-4-Cκ经二硫键组装成为（Exendin-4-Igγ₄）₂（Exendin-4-Cκ4）₂  4聚体结构的免疫融合蛋白，即为Exendin-4-IgG4免疫融合蛋白。

 

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