CN102952192A - 一种含有Exendin-4的融合蛋白及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新型的Exendin-4融合蛋白，Exendin-4融合蛋白能够有效增加Exendin-4的血液半衰期，克服其因为半衰期短而无法在临床上使用的现状。本发明的Exendin-4融合蛋白在治疗糖尿病、肥胖症药物领域具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及治疗糖尿病相关的药物技术领域，具体而言，本发明涉及具有延长Exendin-4多肽体内半衰期的重组蛋白，及其制备方法和药物组合物，以及在制备糖尿病药物方面的应用。
背景技术
糖尿病是一种遗传因素和多种环境因素相关联的以慢性高血糖为特征的代谢紊乱综合症。由于糖尿病还伴随着诸多并发症，现已成为仅次于恶性肿瘤和心血管疾病之后的第三大健康杀手。1984 年胰升血糖素肽-1(GLP-1) 类药物被发现，它是一种具有 30 个氨基酸的肠降血糖素。GLP-1作为降血糖药物受到限制的主要原因是GLP-1的体内半衰期仅为3-5分钟。
Exendin-4是一条39个氨基酸组成的直链多肽，最初由南美巨蜥的唾液分离提取获得。它的氨基酸残基与哺乳动物GLP-1序列有52％的同源性，其与GLP-1的最大不同之处在于N端第2位的甘氨酸耐血液中二肽基肽酶（DPP-Ⅳ）的酶切作用，而GLP-1的相同位置则为极易被DPP-Ⅳ切断的丙氨酸，故Exendin-4被吸收入血后的半衰期较长（t1/2=2.4h ）。Exendin-4是一种强效GLP-1受体激动剂，能模拟GLP-1这种内源性多肽的糖调控作用，降低空腹和餐后血糖。Exendin-4的活性主要通过与人体胰脏GLP-1受体结合而介导，由环腺苷酸（cAMP）依赖和β细胞分化机制引发葡萄糖依赖的胰岛素合成和分泌。因为Exendin-4的氨基酸结构及生物活性与GLP-1均具有相关性，故通常它也被视为肠促胰岛素的一种。 由于Exendin-4的降糖作用时间较GLP-1长，延缓胃排空和抑制摄食冲动对肥胖病人体重的有益作用又有别于传统的降糖药物，因此其作为2型糖尿病治疗药物开发的潜力巨大。随着Exendin-4结构为活性单体的药物（英文通用名为Exenatide，［艾塞那肽］；Lily）于2005年在美国上市。Exendin-4 作为 GLP-1 家族中的 一员在治疗糖尿病方面引起广泛的关注。但是，现在上市的Exendin-4药物依然存在着半衰期短的问题，药用的Exenatide为每日注射两次，极大地增加的患者的痛苦。本发明是针对现有技术的不足，采用融合蛋白技术克服了Exendin-4半衰期短的问题。
发明内容
本发明的一个目的是针对Exendin-4在体内的存留时间较短，导致治疗作用较短每天需要多次注射给药的缺限，提供具有通式Ⅰ结构的含有Exendin-4的融合蛋白。
本发明的另一个目的是提供含有通式Ⅰ结构的Exendin-4融合蛋白作为有效成分以及一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的药用组合物，及其在制备糖尿病治疗药物中的应用。
现结合本发明的目的对本发明逐一加以描述。
本发明的通式Ⅰ的GLP-1或类似物融合蛋白如下述所示：
Exendin-4—连接肽－Exendin-4—连接肽－Exendin-4—连接肽—人源蛋白—Exendin-41—连接肽－Exendin-4—连接肽－Exendin-4—连接肽;其中Exendin-4的氨基酸序列为HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS。
其中，连接肽优选为含有 5个氨基酸残基的肽链，序列为GGGGS；
人源蛋白为：人血清白蛋白或IgG Fc部分。
本发明进一步公开了融合蛋白在制备治疗糖尿病、肥胖症药物方面的应用。特别是融合蛋白在制备增加Exendin-4血液半衰期药物方面的应用。
本发明进一步公开了含有的融合蛋白以及药用载体或赋形剂组成的组合物。其中所述的组合物为液体注射剂或冻干注射剂。
本发明的通式I的Exendin-4融合蛋白是通过下述方法制备的：
（1）构建编码本发明的融合蛋白的DNA
本发明中的融合蛋白 可以从各种来源获得野生型白蛋白和免疫球蛋白,例如这些蛋白可以从由表达野生型白蛋白及免疫球蛋白的mRNA的组织或细胞的cDNA文库获得。本发明采用标准的PCR方法对相关的融合蛋白的mRNA进行筛选，通过公开的白蛋白及免疫球蛋白的DNA、蛋白序列设计引物。
本发明的融合蛋白（白蛋白、免疫球蛋白）优选来源于天然人序列，以减少融合蛋白在人体内潜在的免疫原性危险。本发明中将根据人血清白蛋白的公开序列设计PCR引物，从人血RNA中钓取人血清白蛋白及人免疫球蛋白的mRNA。通过标准的mRNA逆转录技术，将融合的mRNA逆转录为DNA。
（2）构建本发明中Exendin-4融合蛋白载体
利用本领域常规的PCR突变技术制备连接有连接短肽的Exendin-4用以与蛋白表达质粒的连接。连接技术是本领域常规操作，本发明利用PCR将含有连接肽的Exendin-4与蛋白表达质粒通过T4连接酶进行连接，得到本发明中所有融合蛋白的表达载体。一旦产生了编码完整融合蛋白的表达载体，它可以用来传染大肠杆菌，生产融合蛋白。重组DNA载体转化或转染细胞的技术是本领域的常规技术。
（3）用于重组表达本发明的融合蛋白的一般方法
用本发明中的表达载体转染或转化宿主细胞，用于表达融合蛋白。参考本领域常规的蛋白表达技术优化本发明中各种融合蛋白的表达， 用于增加细胞培养物的原则、技术（例如培养基、温度、pH等）可以参见 Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler。本发明中的Exendin-4融合蛋白的表达采用本领域常规的lac启动子大肠杆菌融合蛋白表达技术，使用IPTG启动Exendin-4融合蛋白的产生。
（4）本发明融合蛋白的纯化：
一旦本发明的融合蛋白在适当的宿主细胞中表达，可以通过标准的蛋白分离和纯化技术对本发明中的融合蛋白进行纯化。例如根据融合蛋白表达载体内的标签进行融合蛋白的粗提纯。本发明中，纯化后的融合蛋白可以通过超滤方法将其浓缩至药用浓度，融合蛋白经过紫外线的处理用以增加其药用的安全性。
（5）本发明的融合蛋白的表征：
本发明中，可以用许多方法表征本发明的融合蛋白。这些方法中的一些包括：与蛋白染色偶联的SDS-PAGE或免疫印迹技术。本发明中的融合蛋白通过免疫印迹的鉴定，例如使用Exendin-4的抗体。
本发明的组合物：
本发明所的Exendin-4融合蛋白，可以与一种或多种药学上可接受的辅料共同制成药物组合物，这些辅料包括：水溶性填充剂、PH调节剂、稳定剂、注射用水、滲透压调节剂等等。该药物组合物可以通过肌肉、静脉内、皮下注射途经进行给药，优选的剂型为冻干或溶液注射剂。
本发明所述的水溶性填充剂辅料包括：甘露醇、 低分子右旋糖苷、 山梨醇、 聚乙二醇、葡萄糖、 乳糖、 半乳糖等一种或几种的组合。PH调节剂是枸橼酸、磷酸、盐酸等非挥发性的酸以及氢氧化钾、氢氧化钠、或钾或铵、碳酸钠或钾或铵盐、碳酸氢钠或钾或铵盐等生理可接受的有机或无机酸和碱及盐；稳定剂是EDTA-2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、磷酸氢二钾、碳酸氢钠、碳酸钠、精氨酸、谷氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、十二烷基硫酸钠或三羟甲基氨基甲烷的一种或几种的组合。优选焦亚硫酸钠、磷酸氢二钾、精氨酸、聚乙二醇6000、三羟甲基氨基甲烷的一种或几种的组合；滲透压调节剂，是氯化钠、氯化钾的一种或两种的组合。
所述注射制剂的制备方法包括以下步骤：
(1)冻干剂
取Exendin-4融合蛋白和水溶性填充剂、稳定剂、滲透压剂等，加入注射用水适量，调节PH值至5-8.5使其溶解，加水至刻度，加入0.1-0.5%活性炭，在10-25℃下搅拌10-20分钟，脱碳，采用微孔滤膜过滤除菌，滤液进行分装，采用冷冻干燥法，制得白色疏松块状物，封口即得。
(2) 溶液注射液
取Exendin-4融合蛋白和水溶性填充剂、稳定剂、滲透压剂等，加入注射用水适量，调节PH值至5-8.5使其溶解，加水至刻度，加入0.1-0.5%活性炭，在10-25℃下搅拌10-20分钟，脱碳，采用微孔滤膜过滤除菌，滤液进行分装，封口即得。
本发明所的Exendin-4融合蛋白具有更长的体内存留时间，可作为有效成分制备糖尿病治疗药物。相当宽的剂量范围内是有效的，剂量可由医生根据有关的情况来决定，这些情况包括：被治疗者的身体状态、给药途径、年龄、体重、对药物的个体反应，症状的严重程度等。一般来说，本发明活性成分的有效量1×10-7-20mg/kg/天，可以单剂量给药或成分剂量给药。
本发明所的Exendin-4融合蛋白具有更长的体内存留时间，可作为有效成分制备糖尿病治疗药物。相当宽的剂量范围内是有效的，剂量可由医生根据有关的情况来决定，这些情况包括：被治疗者的身体状态、给药途径、年龄、体重、对药物的个体反应，症状的严重程度等。一般来说，本发明活性成分的有效量1×10-7-20mg/kg/天，可以单剂量给药或成分剂量给药。
附图说明
图1为融合蛋白中相关片段的免疫印迹图；其中1：融合蛋白的Exendin-4免疫印迹；2：融合蛋白的HSA免疫印迹；
图2为融合蛋白的降血糖作用；显示了融合蛋白对小鼠耐糖能力的影响；
图3为融合蛋白的克隆载体构建图。
具体实施方式
下列实施利用以帮助描述如何实施本发明的各种实施方案。这些实施例是为了举例说明，而不是以任何方式限定本发明的范围；其中所用试剂均有市售。
实施例1
人血清白蛋白编码DNA的构建
本发明中将根据人血清白蛋白的公开序列设计PCR引物（SEQ ID NO 1及SEQ ID NO 2），从人血RNA中钓取人血清白蛋白的mRNA。在进行人血清白蛋白mRNA逆转录实验中，设计PCR引物使人血清白蛋白的编码DNA末端含有适合与载体连接的酶切位点（KpnI—HSA—NotI）。通过标准的mRNA逆转录技术，将融合的mRNA逆转录为DNA。
SEQ ID NO 1: 5TTATA GGT ACC AAG TGG GTA ACC TTT ATT TCC CTT3
SEQ ID NO 2: 5AATTAT GCG GCC GC TAA GCC TAA GGC AGC TTG ACT3
将PCR产物进行KpnI / NotI双酶切，产物进行纯化以去除内切酶。
实施例2
“Exendin-4—GGGGS－Exendin-4—GGGGS－Exendin-4—GGGGS—”编码DNA的构建
本专利采用全基因合成方法制备编码“Exendin-4—GGGGS－Exendin-4—GGGGS－Exendin-4—GGGGS—”的双链DNA，基因序列为SEQ ID NO 3。本实施例中合成的编码DNA具有以下特征：1、5’端具有NdeI酶切位点，其用于与表达载体pET15b连接；2、3’端具有KpnI酶切酶切位点，其用于与HSA的5’端连接。
SEQ ID NO 3：
5TATATCATATGCATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCCGCCATCGGGCGGCGGCGGCTCCCATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCCGCCATCGGGCGGCGGCGGCTCCCATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCCGCCATCGGGCGGCGGCGGCTCCGGTACCATATT3
将产物进行（NdeI／KpnI）双酶切，并进行纯化。纯化后的DNA与实例例1中的HSA（KpnI/NotI 酶切后）利用T4连接酶进行连接，由此构建完毕Exendin-4—GGGGS－Exendin-4—GGGGS－Exendin-4—GGGGS—HSA。
实施例3
“—GGGGS－Exendin-4—GGGGS－Exendin-4—GGGGS—Exendin-4”编码DNA的构建
本专利采用全基因合成方法制备编码“—GGGGS—Exendin-4—GGGGS－Exendin-4—GGGGS－Exendin-4”的双链DNA，基因序列为SEQ ID NO 4。本实施例中合成的编码DNA具有以下特征：1、5’ 端具有NotI酶切酶切位点，其用于与HSA的3’端连接端；2、3’具有BamHI酶切位点，其用于与表达载体pET15b连接。
SEQ ID NO 4：
5TAATTTAGCGGCCGCGGCGGCGGCGGCTCCCATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCCGCCATCGGGCGGCGGCGGCTCCCATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCCGCCATCGGGCGGCGGCGGCTCCCATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCCGCCATCGTAATAAGGATCCATTGATT3
将产物进行（NotI／BamHI）双酶切，并进行纯化。纯化后的DNA与实施例2中的Exendin-4—GGGGS－Exendin-4—GGGGS－Exendin-4—GGGGS—HSA利用T4连接酶进行连接。由此 “Exendin-4—GGG－Exendin-4—GGGGS－Exendin-4—GGGGS—HSA—GGGGS－Exendin-4—GGGGS－Exendin-4—GGGGS—Exendin-4”构建完毕。
实施例4
构建本发明中Exendin-4融合蛋白表达载体及融合蛋白的纯化
将表达质粒pET15b进行双酶切（NdeI／BamHI），然后与实施例４中的产物通过NdeI／BamHI酶切位点进行连接。一旦产生了编码完整融合蛋白的表达载体，它可以用来传染大肠杆菌，生产融合蛋白。重组DNA载体转化或转染细胞的技术是本领域的常规技术。将构建完毕的pET15b [Exendin-4—GGGGS－Exendin-4—GGGGS－Exendin-4—GGGGS—HSA—GGGGS－Exendin-4—GGGGS－Exendin-4—GGGGS—
Exendin-4]（命名为pET15b6 Exendin-4HSA）以热击转化的方法转入BL21（DE3）感受态细胞，热击转化方法为本领域常规的技术。将转化后的融合蛋白表达载体在含有氨苄青霉素抗生素的LB培养平皿上培养筛选具有氨苄青霉素抗性的细胞。将得到的具有氨苄青霉素抗性的细菌细胞扩大培养后，进行质粒提取及纯化，质粒进行序列鉴定完全正确。将过夜的菌液1：100比例以LB新鲜培养基稀释，37℃培养菌液直至OD600达到0.6，使用IPTG启动融合蛋白的表达，并将体系温度降至25℃。融合蛋白表达16h后，将菌液离心，收集后，超声波破碎菌体，操作程序为：10 cycles，15秒/cycle。将破碎后的菌液高速离心，上清液被注入镍柱。用镍柱去捕获含6×HIS标签的融合蛋白，并利用咪唑的浓度梯度对融合蛋白进行洗脱。将洗脱的蛋白收集，利用具有10 kDa半透膜的离心管对收集的蛋白进行透析及浓缩。凝血酶处理纯化后的融合蛋白用来切除N末端的6×HIS标签，凝血酶的酶切技术参考Invitrogen公司的实验手册。利用Gel Filtration S-200蛋白纯化柱进行反应混合物的分离，同时对目标融合蛋白进行精纯。上述纯化后的融合蛋白经10K过滤膜过滤浓缩后，紫外线灭菌处理。
实施例5
Exendin-4融合蛋白的免疫印迹鉴定
用含1% SDS和2 mg溴酚蓝的PBS稀释纯化后的融合蛋白。煮沸变性后，取20μl样品置SDS-PAGA胶上，电泳后，将蛋白转至硝酸纤维膜上。用5%脱脂奶粉温室封闭2小时，加入鼠抗人Exendin-4的单抗（SantaCruz, USA）室温下孵育1小时,然后用HRP标记的兔抗鼠的多抗进行二抗结合，用ECL试剂盒发光显色（Amersham Pharmacia Biotech,USA)。结果如图1所示本发明的融合蛋白得到了较好的表达。
实施例6
取实施例5的融合蛋白10mg，稳定剂精氨酸0.2g，聚乙二醇6000 0.05g置于容器中，加注射用水80ml，搅拌使溶解，再加入甘露醇8g、山梨醇2g，搅拌使溶解，以0.1mol/L的氢氧化钠调节PH至6.0－8.0，补加水至100ml。 加入0.3g活性碳，在10-25℃下搅拌20分钟，脱碳，采用微孔滤膜过滤除菌，滤液按每支1ml进行分装。预冻2小时后，冷冻下减压干燥18小时, 至样品温度到15-20℃后，再干燥5小时，制得白色疏松块状物，封口即得白色冻干粉针, 规格100ug/支。
实施例7
取实施例5的融合蛋白25mg，加稳定剂磷酸氢二钾0.05g，氯化钠0.9g，置于容器中，加注射用水70ml搅拌使溶解，再加甘露醇12g，乳糖7g搅拌使溶解，用0.1mol/L的氢氧化钠调节PH至6.5－8.5，补加水至100ml， 加入0.25g活性碳，在10-20℃下搅拌20分钟，脱碳，采用微孔滤膜过滤除菌，滤液按每支2ml进行分装，预冻2小时后，冷冻下减压干燥15小时, 至样品温度到15-20℃后，再干燥5小时，制得白色疏松块状物，封口即得白色冻干粉针，规格500ug/支。
实施例8
取实施例5的融合蛋白50mg，加入稳定剂三羟甲基氨基甲烷0.2g，焦亚硫酸钠0.1g、氯化钠0.9g至容器中，加注射用水80ml中搅拌溶解，加入碳酸氢钠调节PH为6－8，补加水至100ml，加入0.2g活性炭，在10-25℃搅拌吸附20分钟，除炭，采用微孔滤膜过滤除菌，以每支2ml灌封，即得融合蛋白注射液，规格1000ug/支。
实施例9
取实施例 5的融合蛋白5mg，稳定剂谷氨酸0.01g、氯化钾0.09g至容器中，加注射用水70ml搅拌使溶解，加入葡萄糖2g、半乳糖1g搅拌溶解。加氢氧化钠调节PH为7.0－8.5，补加水至100ml，加入0.05g活性炭，在10-25℃搅拌吸附20分钟，除炭，采用微孔滤膜过滤除菌,以每支1ml灌封、即得融合蛋白注射液，规格50ug/支。
实施例10
融合蛋白的体内药代动力学
给大鼠注射Exendin-4及其融合蛋白（折合含Exendin-4为0.5 mg/kg）,分别于注射前及注射后0.5、1、3、6、9、12、24、36和48小时后于眼丛静脉取血约0.2ml，制备血清备用。
Exendin-4浓度测定方法：采用酶联免疫吸附方法（ELISA）检测小鼠血清中融合蛋白的浓度，操作如下：4 oC离心分离血浆。用羊抗鼠的Exendin-4浓度测定试剂盒（R&D System Co.,Ltd）对鼠血浆中的Exendin-4融合蛋白的浓度进行测定。将1：1稀释后的鼠血浆样品加入96孔板，加入同体积的Exendin-4抗体后，37℃孵育1小时。使用洗液清洗96孔板3次，加入HRP后孵育30分钟。同样的方法对96孔板进行清洗，然后加入50l底物A及底物B，37℃孵育10分钟。用硫酸中止反应后测定450-570nm值，并与标准浓度的Exendin-4进行比对及根据ELISA结果计算药代动力学参数。
融合蛋白的体内药代动力学结果见表１，结果显示本发明的融合蛋白在体内的半衰期较单独的Exendin-4明显延长，具有长效特性。
表１ 融合蛋白在大鼠体内的末相半衰期
| 样品来源 | 半衰期（小时） |
| Exendin-4 | 2.4 |
| Exendin-4融合蛋白 | 22.8 |
实施例11
融合蛋白的降血糖实验
给小鼠分别注射Exendin-4及融合蛋白（折合含Exendin-4为100g/kg）,分别于给药后0.5、1、3、6、9、12、24、36和48小时注射葡萄糖并于尾端测定血糖含量，结果显示Exendin-4在0.5小时后基本丧失其降血糖功能，但是融合蛋白药物却在给药２４小时后依然存在降血糖功能,详见图2。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津拓飞生物科技有限公司
<120> 一种含有Exendin-4的融合蛋白及其用途
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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<212> DNA
<213> 基因序列
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<210> 2
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<213> 基因序列
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<212> DNA
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aggcagtgcg gttatttatt gagtggctta agaacggagg accaagtagc ggggcacctc 120
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aagaacggag gaccaagtag cggggcacct ccgccatcgg gcggcggcgg ctcccatggt 300
gaaggaacat ttaccagtga cttgtcaaaa cagatggaag aggaggcagt gcggttattt 360
attgagtggc ttaagaacgg aggaccaagt agcggggcac ctccgccatc gtaataagga 420
tccattgatt 430
Claims (7)
1. 一种含有Exendin-4的融合蛋白,具有如下的结构：
Exendin-4—连接肽－Exendin-4—连接肽－Exendin-4—连接肽—人源蛋白—Exendin-41—连接肽－Exendin-4—连接肽－Exendin-4—连接肽;其中Exendin-4的氨基酸序列为HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS。
2.权利要求1所述融合蛋白中连接肽为：GGGGS。
3.权利要求１所述融合蛋白中的人源蛋白为：HSA或IgG 的Fc片断。
4.权利要求1所述融合蛋白在制备治疗糖尿病、肥胖症药物方面的应用。
5.权利要求1所述融合蛋白在制备增加Exendin-4血液半衰期药物方面的应用。
6.一种药物组合物，含有权利要求1-3任一项所述的融合蛋白以及药用载体或赋形剂。
7.权利要求5所述的药物组合物，其中所述的组合物为液体注射剂或冻干注射剂。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130306 |