CN110734472B - 一种具有二肽基肽酶-4抑制活性的寡肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有二肽基肽酶‑4抑制活性的寡肽，寡肽的缩写为QGQELGGALNFK，分子量1458.4Da，所述寡肽的氨基酸序列为Gln‑Gly‑Gln‑Glu‑Leu‑Gly‑Gly‑Ala‑Leu‑Asn‑Phe‑Lys，所述寡肽从黑茶茯砖茶中分离得到，具有实现体外降血糖的效果，可应用于保健食品、特殊医学用途配方食品与生物制药领域，改善糖尿病病人的病症，本发明还公布了所述寡肽的制备方法、含有该寡肽的药品组合物、含有该寡肽的保健品和含有该寡肽的食品。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药领域，特别是一种具有二肽基肽酶-4抑制活性的寡肽，本发明还涉及该寡肽的制备方法和应用。
背景技术
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是一种肠促胰岛素，其促进胰岛素分泌作用呈血糖依赖性，可有效维持血糖动态平衡，此外，它还能刺激胰岛B细胞增殖，诱导胰岛B细胞再生，抑制胰岛B细胞凋亡及胰高血糖素的释放，抑制胃肠蠕动，延缓胃排空，降低食欲和食物摄入，增加葡萄糖的利用，改善胰岛素敏感性等，但是GLP-1在体内的半衰期极短，很快就被以二肽基肽酶-4(DPP-4)为主的酶降解，DPP-4抑制剂通过竞争性结合DPP-4的活化部位，降低DPP-4的催化活性，延长体内GLP-1半衰期，从而增加体内GLP-1的量，实现促进胰岛素分泌的目的，DPP-4抑制剂可稳定控制血糖，改善胰岛B细胞功能，而且不会引起患者体质量的增加，并可避免低血糖风险，在用药安全性方面具有显著的优势，被普遍认为是最有希望的治疗2型糖尿病的新药物。
发明内容
本发明旨在提供一种具有二肽基肽酶-4抑制活性的寡肽及其应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种具有二肽基肽酶-4抑制活性的寡肽，所述寡肽的缩写为QGQELGGALNFK，分子量1458.4Da，所述寡肽的氨基酸序列为Gln-Gly-Gln-Glu-Leu-Gly-Gly-Ala-Leu-Asn-Phe-Lys。
所述寡肽从黑茶茯砖茶中分离得到，具体包括如下步骤：
(1)茶蛋白提取：将茯砖茶叶粉碎后过20-40目筛，以料液比为1:5-40的比例混合茶粉和超纯水，于95℃加热浸提10-60min，浸提液过滤后在25℃，8000rpm/min的条件下离心20min，收集上清液，往上清液中加入饱和硫酸铵溶液(上清液:硫酸铵＝1:2-6)，在4℃静置12h，使蛋白质沉淀，然后，于4℃，6000rpm/min条件下离心20min，取沉淀，用超纯水溶解，在室温中透析24小时，以去除硫酸铵等小分子物质，获得茯砖茶粗蛋白；
(2)粗蛋白的酶解：将步骤(1)制得的茯砖茶粗蛋白样品制成2-10mg/mL的溶液，于50℃水浴中保持10min，用浓度为2.0mol/L的氢氧化钠调节PH至8.0，以酶/底物比(E/S)为1-5％(w/w)的比例添加胰蛋白酶，酶解时间为5-10h，酶解过程中用浓度为2.0mol/L的氢氧化钠溶液调节酸碱度，使其保持在pH 8.0，酶解完成后把样品置于95℃下加热20min使酶灭活，并于4℃，8000rpm/min离心10min，弃去沉淀，制得茯砖茶胰蛋白酶酶解组分，冻干备用；
(3)“酶-抑制肽”复合物的制备：取茯砖茶胰蛋白酶酶解组分配成1-5mg/mL样品溶液，取样品溶液100μL与试剂盒中的二肽基肽酶-4(DPP-4)溶液100μL混合，于37℃下，摇床培养15min，使酶与抑制剂样品充分结合；
(4)未与酶结合成分的去除：培养结束后，把步骤(3)制得的混合物加入截留分子量为30kDa的超滤离心管中，并于常温下，10000rpm/min离心25min，去除样品中未与酶结合的成分，用200μL磷酸缓冲洗截留后的滤液3次，并于常温下，5000rpm/min离心5min；
(5)抑制肽的释放、分离与鉴定：离心后往上层(即“酶-抑制肽”复合物层)液体中加入100-400μL 50％乙腈水溶液，混合均匀，静置10min之后，在常温下以10000rpm/min离心10分钟，重复2次，合并滤出液，过0.22μm超滤膜，制得茯砖茶超滤液，进行高效液相谱分离，收集合适的峰，即获得所述具有二肽基肽酶-4抑制活性的寡肽。
所述寡肽也使用固相合成仪合成制得，也就是说，将目标多肽的C-端羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以这个氨基酸的氨基作为起点，与另一分子氨基酸的羧基作用形成肽键，不断重复这一过程，合成反应完成后，去除保护基，将肽链与树脂分离，即得到目标产物。多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序从C端向N端合成。
一种药物组合物，所述药物组合物含有上述的具有二肽基肽酶-4抑制活性的寡肽。
一种保健品，所述保健品含有上述的具有二肽基肽酶-4抑制活性的寡肽。
一种食品，所述食品含有上述的具有二肽基肽酶-4抑制活性的寡肽。
一种制备上述的具有二肽基肽酶-4抑制活性的寡肽的方法，包括如下步骤：
所述寡肽在浓度为4mg/mL时，对二肽基肽酶-4的体外抑制率为58.2％。
所述寡肽在浓度为10mg/mL时，对二肽基肽酶-4的体外抑制率为66.7％。
所述寡肽对二肽基肽酶-4的50％抑制浓度(IC50)为3.89±0.22mg/mL。
本发明的有益效果是：从茯砖茶中提取了一种具有二肽基肽酶-4抑制活性的寡肽，具有实现体外降血糖的效果，可应用于保健食品、特殊医学用途配方食品与生物制药领域，改善糖尿病病人的病症。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1是实施例1所述茯砖茶超滤液的高效液相色谱图；
图2是实施例1所述寡肽的一级质谱图；
图3是实施例1所述寡肽的二级质谱图；
图4是实施例1所述寡肽的离子碎片分析图；
图5是实施例2所述寡肽的高效液相色谱图；
图6是实施例2所述寡肽的质谱图；
图7是本发明所述寡肽与西格列汀的“浓度-抑制率”折线图。
具体实施方式
实施例1：
一种制备上述的具有二肽基肽酶-4抑制活性的寡肽的方法，包括如下步骤：
(1)茶蛋白提取：将茯砖茶叶粉碎后过20目筛，以料液比为1:20的比例混合茶粉和超纯水，于95℃加热浸提30min，浸提液过滤后在25℃，8000rpm/min的条件下离心20min，收集上清液，往上清液中加入饱和硫酸铵溶液(上清液:硫酸铵＝1:4)，在4℃静置12h，使蛋白质沉淀，然后，于4℃，6000rpm/min条件下离心20min，取沉淀，用超纯水溶解，在室温中透析24小时，以去除硫酸铵等小分子物质，获得茯砖茶粗蛋白；
(2)粗蛋白的酶解：将步骤(1)制得的茯砖茶粗蛋白样品制成5mg/mL的溶液，于50℃水浴中保持10min，用浓度为2.0mol/L的氢氧化钠调节PH至8.0，以酶/底物比(E/S)为1.5％(w/w)的比例添加胰蛋白酶，酶解时间为6h，酶解过程中用浓度为2.0mol/L的氢氧化钠溶液调节酸碱度，使其保持在pH 8.0，酶解完成后把样品置于95℃下加热20min使酶灭活，并于4℃，8000rpm/min离心10min，弃去沉淀，制得茯砖茶胰蛋白酶酶解组分，冻干备用；
(3)“酶-抑制肽”复合物的制备：取茯砖茶胰蛋白酶酶解组分配成2mg/mL样品溶液，取样品溶液100μL与试剂盒中的二肽基肽酶-4(DPP-4)溶液100μL混合，于37℃下，摇床培养15min，使酶与抑制剂样品充分结合；
(4)未与酶结合成分的去除：培养结束后，把步骤(3)制得的混合物加入截留分子量为30kDa的超滤离心管中，并于常温下，10000rpm/min离心25min，去除样品中未与酶结合的成分，用200μL磷酸缓冲洗截留后的滤液3次，并于常温下，5000rpm/min离心5min；
(5)抑制肽的释放、分离与鉴定：离心后往上层(即“酶-抑制肽”复合物层)液体中加入200μL 50％乙腈水溶液，混合均匀，静置10min之后，在常温下以10000rpm/min离心10分钟，重复2次，合并滤出液，过0.22μm超滤膜，制得茯砖茶超滤液，进行高效液相谱分离。
所用的高效液相色谱仪为Angilent 1100，相关参数设置：A相为水，B相为乙腈，0-2min为85％水，15％乙腈；6-9.5min为15％水，85％乙腈；10-12min为85％水，15％乙腈，流速为0.2mL/min。高效液相色谱分离结果如图1所示，收集第5个峰即获得所述具有二肽基肽酶-4抑制活性的寡肽。
质谱参数设置：ESI离子源，扫描范围50m/z-3000m/z，阳离子模式，端板偏移-500V，电压变化2000V，正离子谱测定，分子量测定范围在500-3000KD。质谱鉴定如图2至图3所示。
实施例2：
采用固相合成仪合成所述具有二肽基肽酶-4抑制活性的寡肽，具体操作为：
(1)通过树脂的筛选合成所述寡肽，选用高分子树脂(王氏树脂，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，按照氨基酸序列Gln-Gln-Gly-Gln-Glu-Leu-Gly-Gly-Ala-Leu-Asn-Phe-Lys的特征，先将Gln的羧基以共价键的形式与一个树脂的连接位点相连，然后Gly的氨基和Gln的羧基缩水反应，处理后，再添加Glu，Gln的氨基和Glu的羧基反应，依次从右到左添加氨基酸，加好最后一个Lys氨基酸后，再切除树脂，即得到目标多肽；
(2)采用高效液相色谱进行纯化，色谱柱型号为Phenomenex C18，尺寸4.6*150mm，流动相A：含有0.1％三氟乙酸(TFA)的乙腈；流动相B：含有0.1％TFA的水；25min内B相由95.0％下降到30.0％，流速1.0mL/min，检测波长214nm；
(3)液氮速冻，冷冻干燥，即制得所述具有二肽基肽酶-4抑制活性的寡肽，该成品纯度为95.89％，分子质量为1261.4Da，高效液相色谱分离结果如图5所示，质谱鉴定如图6所示。
对二肽基肽酶-4的体外抑制活性实验：
选取实施例2制得的寡肽分别配成浓度为0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、4mg/mL和10mg/mL的寡肽溶液，以二肽基肽酶-4为研究对象，测定寡肽的体外抑制活性。
在黑色96孔板中均加入50μL二肽基肽酶-4酶液，不同的96孔板分别加入各个浓度的25μL寡肽溶液，混合后于37℃摇床反应10min，后加入25μL底物溶液，于37℃摇床反应。
对照组用25μL缓冲液代替25μL寡肽溶液，背景组用50μL缓冲液代替50μL二肽基肽酶-4酶液，阳性对照组分别为25μL相同浓度(即0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、4mg/mL和10mg/mL)的西格列汀溶液代替寡肽溶液，其余操作与上述相同。
连续测定加入底物溶液后每个孔15min-30min期间的荧光值(lex＝360/lem＝460nm)，每分钟测定一次。
二肽基肽酶-4的抑制率的计算公式如下：
其中，SlopeEC是对照组的斜率，SlopeSM是实验组的斜率；FLU1和FLU2是曲线上任意两点的荧光值；T1和T2是两点所对应的时间。
对每个孔的数据作“浓度-抑制率”图的线性图象，如图7所示，由图可知所述寡肽对二肽基肽酶-4的50％抑制浓度(IC50)为3.89±0.22mg/mL，同时本发明的寡肽对二肽基肽酶-4的抑制率低于西格列汀，但是对于2型糖尿病的治疗仍有指导意义，可应用于保健食品、特殊医学用途配方食品与生物制药领域，改善糖尿病病人的病症。
实施例3：
一种药物组合物，含有具有二肽基肽酶-4抑制活性的寡肽和药学上可接受的载体或赋形剂，所述寡肽的缩写为QGQELGGALNFK，，氨基酸序列为Gln-Gly-Gln-Glu-Leu-Gly-Gly-Ala-Leu-Asn-Phe-Lys，分子量1458.4Da，所述寡肽从黑茶茯砖茶中分离得到。本实施例为注射剂，主要成分为所述寡肽，其他成分均为制药领域注射剂的常规辅料。
实施例4：
一种保健品，含有具有二肽基肽酶-4抑制活性的寡肽，所述寡肽的缩写为QGQELGGALNFK，分子量1458.4Da，氨基酸序列为Gln-Gly-Gln-Glu-Leu-Gly-Gly-Ala-Leu-Asn-Phe-Lys，所述寡肽从黑茶茯砖茶中分离得到，其他成分均为保健品领域的常规添加材料。
实施例5：
一种食品，含有具有二肽基肽酶-4抑制活性的寡肽，所述寡肽的缩写为QGQELGGALNFK，分子量1458.4Da，氨基酸序列为Gln-Gly-Gln-Glu-Leu-Gly-Gly-Ala-Leu-Asn-Phe-Lys，所述寡肽从黑茶茯砖茶中分离得到，其他成分均是根据食品类型进行添加制作。
以上的实施方式不能限定本发明创造的保护范围，专业技术领域的人员在不脱离本发明创造整体构思的情况下，所做的均等修饰与变化，均仍属于本发明创造涵盖的范围之内。
Claims (6)
1.一种具有二肽基肽酶-4抑制活性的寡肽，其特征在于所述寡肽的缩写为QGQELGGALNFK，所述寡肽的氨基酸序列为Gln-Gly-Gln-Glu-Leu-Gly-Gly-Ala-Leu-Asn-Phe-Lys；
所述寡肽从黑茶茯砖茶中分离得到；
所述寡肽的制备步骤如下：
(1)茶蛋白提取：从茯砖茶叶中提取茯砖茶粗蛋白；
(2)粗蛋白的酶解：将步骤(1)制得的茯砖茶粗蛋白酶解，制得茯砖茶胰蛋白酶酶解组分，冻干备用；
(3)“酶-抑制肽”复合物的制备：取所述茯砖茶胰蛋白酶酶解组分配成1-5mg/mL样品溶液，取样品溶液100μL与试剂盒中的二肽基肽酶-4(DPP-4)溶液100μL混合，于37℃下，摇床培养15min，使酶与抑制剂样品充分结合；
(4)未与酶结合成分的去除：培养结束后，把步骤(3)制得的混合物加入截留分子量为30kDa的超滤离心管中，并于常温下，10000rpm/min离心25min，去除样品中未与酶结合的成分，用200μL磷酸缓冲洗截留后的滤液3次，并于常温下，5000rpm/min离心5min；
(5)抑制肽的释放、分离与鉴定：离心后往上层的“酶-抑制肽”复合物层液体中加入100-400μL 50％乙腈水溶液，混合均匀，静置10min之后，在常温下以10000rpm/min离心10分钟，重复2次，合并滤出液，过0.22μm超滤膜，制得茯砖茶超滤液，进行高效液相谱分离，收集合适的峰，即获得所述具有二肽基肽酶-4抑制活性的寡肽。
2.一种药物组合物，其特征在于所述药物组合物含有权利要求1所述的具有二肽基肽酶-4抑制活性的寡肽。
3.根据权利要求1所述的具有二肽基肽酶-4抑制活性的寡肽，其特征在于所述寡肽使用固相合成仪合成制得。
4.根据权利要求1所述的具有二肽基肽酶-4抑制活性的寡肽，其特征在于所述寡肽在浓度为4mg/mL时，对二肽基肽酶-4的体外抑制率为58.2％。
5.根据权利要求1所述的具有二肽基肽酶-4抑制活性的寡肽，其特征在于所述寡肽在浓度为10mg/mL时，对二肽基肽酶-4的体外抑制率为66.7％。
6.根据权利要求1所述的具有二肽基肽酶-4抑制活性的寡肽，其特征在于所述寡肽对二肽基肽酶-4的50％抑制浓度(IC50)为3.89±0.22mg/mL。
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| GR01 | Patent grant | ||
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