JP6320973B2 - Ｂ細胞活性化因子の拮抗物質、その調製方法及び利用法 - Google Patents

Description

本発明は遺伝子工学の薬剤の分野に関する。特には、新規なＢ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）の拮抗物質、その調製方法並びに利用法に関する。

リューマチ性関節炎（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、シーグレン症候群、等々の自己免疫疾患には、身体のＢ細胞またはプラズマ細胞の過剰な増殖と過剰な体液性免疫活性化が密接に関与する。

Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）は、ＢＬｙＳ、ＴＡＬＬ−１、ＴＨＡＮＫ、ｚＴＮＦ４またはＴＮＦＳＦ−１３Ｂとしても知られており、１９９９年に発見（非特許文献１）されたＴＮＦ族に属し、下流シグナリング経路を発生し、その同族受容体に結合することでＢ細胞の生存、成熟および分化（非特許文献２）を統制する。ＢＡＦＦおよびその他の３種のリガンド（ＡＰＲＩＬ、ＥＤＡおよびＴＷＥＡＫ）は同じ亜種に属し、類似した機能と構造の特徴を有する（非特許文献３）。膜結合形態および溶解形態を有するＢＡＦＦはＩＩ型の経膜タンパク質である。その溶解形態は１５２個のアミノ酸を含み、プロテアーゼによるＲ１３３とＡ１３４との間の膜結合形態（２８５個のアミノ酸）のタンパク質溶解を経て作製される。このプロセスは刺激レベルと細胞タイプレベルの両方で調整される（非特許文献３）。通常の生理学条件下では、溶解性ＢＡＦＦは三量体として存在し、生物活性を発現する（非特許文献４）。ＢＡＦＦは主として、脾臓およびリンパ節のマクロファージ、単核細胞および樹状細胞を含んだ抹消血単核細胞（ＰＢＭＮＣ）によって作製される（非特許文献５）。

ＢＡＦＦの３種の受容体であるＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）、ＴＡＣＩ（経膜活性化因子およびＣＡＭＬ相互作用化因子）およびＢＡＦＦ−Ｒ（ＢＡＦＦ受容体、Ｂｒ３）は従来技術文献に開示されており、全てがＩＩＩ型の経膜タンパク質である。ＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬは、ＴＡＣＬとＢＣＭＡに高親和性で結合でき、ＢＡＦＦはＢＡＦＦ−Ｒにも結合できる。ＴＮＦ受容体の細胞外ドメイン（領域）は、複数の高システインドメイン（ＣＲＤ）を含み、それぞれのＣＲＤは、６つのシステイン残分によって形成されている３つのジスルフィド結合を含む。ＢＣＭＡは１つのＣＲＤを有しており、ＢＣＭＡと比較してＴＡＣＩは２つの典型的なＣＲＤであるＣＲＤ１およびＣＲＤ２を含む。ここでＣＲＤ２のみがリガンド結合に関与する（ＴＡＣＩ（ａａ．７０−１０４）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８参照）（非特許文献６）。Ｂｒ３は、４つのシステイン残分（Ｂｒ３（ａａ．１８−３５）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９参照）で成る１つだけのＣＲＤを含み、ＢＡＦＦへの結合ドメインは２６個のアミノ酸に減少する（非特許文献７）。

Ｂ細胞生存を促進する機能とは別に、ＢＡＦＦは、胚中心反応、アイソタイプ切り替え、Ｔ細胞活性化、等々の維持において調節の重要な役割を演じる。ＢＡＦＦはＴ細胞活性化に対してその効果を有しており、よって自己免疫疾患の病態形成において重要な役割を演じるであろう。従って、自己免疫疾患の治療のための新規な目標物としてのＢＡＦＦおよびその受容体は大きな関心を集めた。ＢＡＦＦの特定の拮抗物質（溶解性受容体ＴＡＣＩ−Ｆｃ、Ｂｒ３−Ｆｃ、または抗ＢＡＦＦ抗体、等々を含む）はＢＡＦＦの生物活性を抑制することができ、リューマチ性関節炎（ＲＡ）、シーグレン症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、等々である自己免疫疾患の治療において有用な役割を果たす。２０１１年３月にＦＤＡはヒトの抗ＢＡＦＦモノクローン抗体を認可した。ベリムマム（Ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）（ベンリスタ（Ｂｅｎｌｙｓｔａ））は５０年以上にわたってＳＬＥのために狼瘡治療用の最初の新薬となった表示を記載し、ＲＡの治療も臨床試験の第ＩＩＩ
相に入り、ＳＬＥとＲＡを治療する溶解性受容体ＴＡＣＩ−Ｆｃの研究は既に第ＩＩ相／第ＩＩＩ相の臨床試験に入っている。

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発明の開示
本発明によって解決される技術的問題は、自己免疫疾患の予防および治療のための新規で効果的な選択肢を発見することである。特に、ＢＡＦＦに拮抗させることで自己免疫疾患の予防および治療する新規で効果的な選択肢を発見することである。

この技術的問題を解決するため、本発明の技術的解決策は、新規なＢ細胞活性化因子の拮抗物質を提供することである。このＢ細胞活性化因子の拮抗物質は一種のタンパク質である。

当該Ｂ細胞活性化因子の拮抗物質の構造
（１）次の構造ドメインを含んだ融合タンパク質：このドメインは、ＴＡＣＩ受容体のＢＡＦＦに結合するＣＤＲ２ドメインと、Ｂｒ３受容体のＢＡＦＦに結合するＣＤＲドメインの融合によって得られる。または、
（２）（１）で定義される融合タンパク質のアミノ酸配列における少なくとも１個のアミノ酸を置換及び／又は削除及び／又は追加することにより得られ、（１）で定義される融合タンパク質と同一または類似した機能を備えたタンパク質。Ｂ細胞活性化因子の拮抗物質の構造ドメインはＢ細胞活性化因子の結合において重要な役割を果たす。

当該Ｂ細胞活性化因子の拮抗物質
（１）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１として示されるアミノ酸配列を有したタンパク質。または、
（２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１として示されるタンパク質と同一または類似する機能を有したＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１として示されるタンパク質のアミノ酸配列における少なくとも１個のアミノ酸を置換及び／又は削除及び／又は追加することにより得られるタンパク質。

当該Ｂ細胞活性化因子の拮抗物質（追加定義）
（１）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１として示されるアミノ酸配列のＣ末端のヒト免疫グロブリンのＦｃ断片のアミノ酸配列と接続するアミノ酸配列を有したタンパク質。または、
（２）（１）で定義されるタンパク質と同一または類似した機能を有し、（１）で定義されるタンパク質のアミノ酸配列における少なくとも１個のアミノ酸を置換及び／又は削除及び／又は追加することで得られるタンパク質。

さらに、当該Ｂ細胞活性化因子の拮抗物質は、自身のアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２として示されるタンパク質である。または、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２として示されるタンパク質と同一または類似する機能を有したＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２として示されるタンパク質のアミノ酸配列における少なくとも１個のアミノ酸を置換及び／又は削除及び／又は追加することにより得られるタンパク質。

ヒト免疫グロブリンのＦｃ断片を加えることにより、遺伝子工学的手法で調製された融合タンパク質は二量体の形態で存在する。

好適には、当該Ｂ細胞活性化因子の拮抗物質は、Ｎ末端でシグナルペプチドと接続するタンパク質である。

さらに好適には、当該Ｂ細胞活性化因子の拮抗物質は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３として示されるタンパク質である。または、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２として示されるものと同一または類似する機能を有したＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．３として示されるタンパク質のアミノ酸配列における少なくとも１個のアミノ酸を置換及び／又は削除及び／又は追加することにより得られるタンパク質。

本発明は、本質的にはタンパク質である当該Ｂ細胞活性化因子の拮抗物質を提供するだけではなく、当該Ｂ細胞活性化因子の拮抗物質をエンコード（コード化）するヌクレオチド配列をも提供する。

Ｂ細胞活性化因子の拮抗物質をエンコードする当該ヌクレオチド配列
（１）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０として示されるヌクレオチド配列またはその変性配列。または、
（２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０として示されるものをエンコードするヌクレオチド配列と同一または類似する機能を有した（１）として示されるアミノ酸配列における少なくとも１個のヌクレオチドを置換、削除または追加することで得られるヌクレオチド配列。

当該Ｂ細胞活性化因子の拮抗物質をエンコードする当該ヌクレオチド配列
（１）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４として示されるヌクレオチド配列またはその変性配列。または、
（２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４として示されるものをエンコードするヌクレオチド配列と同一または類似する機能を有した（１）として示されるアミノ酸配列における少なくとも１個のヌクレオチドを置換、削除または追加することで得られるヌクレオチド配列。

当該Ｂ細胞活性化因子の拮抗物質をエンコードする当該ヌクレオチド配列
（１）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５として示されるヌクレオチド配列またはその変性配列。ま
たは、
（２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５として示されるものをエンコードするヌクレオチド配列と同一または類似する機能を有した（１）として示されるアミノ酸配列における少なくとも１個のヌクレオチドを置換、削除または追加することで得られるヌクレオチド配列。

本発明は当該ヌクレオチド配列を含んだ遺伝子ベクターも提供する。好適には、当該遺伝子ベクターは、当該ヌクレオチド配列を発現することができる発現ベクターである。

本発明は当該遺伝子ベクターを含んだ宿主細胞も提供する。

さらに、本発明は、自己免疫疾患の治療のための薬剤の製造のための当該Ｂ細胞活性化因子の拮抗物質、当該ヌクレオチド配列あるいは当該遺伝子ベクターの利用法も提供する。

さらに、本発明は、当該Ｂ細胞活性化因子の拮抗物質、当該ヌクレオチド配列または当該遺伝子ベクターが主要活性成分である、自己免疫疾患の予防用または治療用の薬剤も提供する。

当該自己免疫疾患とは、主としてリューマチ性関節炎、全身性エリテマトーデスおよびシーグレン症候群のことである。

本発明のさらに好適な実施形態では、当該Ｂ細胞活性化因子の拮抗物質の調製方法も提供される。この調製方法は次のステップを含む。Ｂ細胞活性化因子の拮抗物質をエンコードする遺伝子を実施可能に発現ベクターにローディングするステップと、発現ベクターを宿主に移すステップと、宿主を増殖させるステップと、宿主及び／又はその培養上澄液を単離および純化するステップとを含み、Ｂ細胞活性化因子の拮抗物質を得る。

当該Ｂ細胞活性化因子の拮抗物質の調製方法における当該発現ベクターは、真核性プラスミド発現ベクター、アデノウィルスベクターまたはアデノ関連ウィルスベクターである。

当該Ｂ細胞活性化因子の拮抗物質の調製方法における当該宿主は真核細胞である。

当該Ｂ細胞活性化因子の拮抗物質の調製方法における当該単離および純化方法は、ＧＥ社が製造するＭａｂ−ＳｅｌｅｃｔゲルカラムおよびＳＰカラムクロマトグラフィーによる宿主の大規模培養上澄液の純化であり、その後にＢ細胞活性化因子の拮抗物質を得る。

当該方法における発現ベクターは一般的な真核発現ベクターであり、遺伝子工学で通常に使用される種々な宿主細胞である。単離および純化方法は、本発明の比較的に純粋なＢ細胞活性化因子の拮抗物質を得る現存通常方法でよい。Ｂ細胞活性化因子の拮抗物質をエンコードする遺伝子を発現ベクターに実施可能に負荷し、発現ベクターを宿主に移す方法は、ベクターと宿主細胞の様々な遺伝子工学マニュアルおよび特殊インストラクションに沿ったものでよい。

本発明は、ＴＡＣＩ受容体のＢＡＦＦを結合するドメイン２（ＣＲＤ２）と、Ｂｒ受容体のＢＡＦＦを結合するドメイン（ＣＲＤ）（およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０として示されるヌクレオチド配列によってコード化するＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１として示されるアミノ酸配列）の融合によって得られるＢＡＦＦ拮抗断片を設計および構築する。生体内での安定性を増強し、活性半減期を延長するために、当該断片を、新融合タンパク質を得るように免疫グロブリンのＦｃ断片と融合させることができる。例えば、それはＩｇＧ１、
ＩｇＧ２またはＩｇＧ４のＦｃ断片と融合できる。本発明の当該実施例では、それをＩｇＧ１のＦｃ断片と融合し、ＢＡＦＦトラップ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４として示されるヌクレオチド配列によってコード化されたＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２として示されるアミノ酸配列）と称される新融合タンパク質を得る。実験では、それがＢ細胞活性化因子の拮抗物質の機能を有することを示した。もちろん、本発明におけるＢ細胞活性化因子の拮抗物質は一種のタンパク質であり、従って主な調製方法は、発酵の従来技術の遺伝子工学的方法を利用することである。遺伝子工学的に発酵を続けながら、生成物を便利に回収するために、一般的には、ＢＡＦＦトラップのコード化配列のＮ末端は、種々な一般的に使用されるエンコードする分泌シグナルペプチドのヌクレオチド配列と接続される。これらは、例えば、ヌクレオチド配列をエンコードするヒトＩＬ−２シグナルペプチドである（ヒトＩＬ−シグナルペプチドの追加後、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３として示されるそのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５として示されるヌクレオチド配列によってコード化できる）。

本発明では、遺伝子配列の、“少なくとも１つのヌクレオチド誘導配列を置換、削除または追加したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１におけるヌクレオチド配列”と類似した発現とは、一般的に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびその変性配列によってコードされたタンパク質活性ポリペプチドによってコードされたヌクレオチド配列のことである。変性配列とは、１以上のコドンが、同じアミノ酸によってコードされた変性コドンと置換されている配列のことである。コドンの変性によって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の同属物がせいぜい約８９％程度である変性配列もＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として示されるものと同じ配列をコードできる。さらに、“少なくとも１つのヌクレオチド誘導配列を置換、削除または追加したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として示されるヌクレオチド配列”の意味は、少々過酷な条件下、好適には、非常に過酷な条件下でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド配列と雑種化したヌクレオチド配列も含む。この用語は、ヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１の同属性が少なくとも８０％、好適には少なくとも８９％、さらに好適には少なくとも９０％、最も好適には少なくとも９５％であることも含む。本発明において同一機能を有するとは、ＢＡＦＦと結合する機能を有し、ＢＡＦＦの生物活性を拮抗するということである。

“少なくとも１つのヌクレオチド誘導配列を置換、削除または追加したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１におけるヌクレオチド配列”は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１によってエンコードされたタンパク質と同じタンパク質機能を有するタンパク質をエンコードできるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１におけるオープンリーディングフレーム配列の変形も含む。これら別種の形態は、（限定はしないが）いくつかのヌクレオチド（典型的には１から９０、好適には１から６０、さらに好適には１から２０、最も好適には１から１０）の削除、挿入及び／又は置換を含み、いくつかのヌクレオチド（典型的には６０未満、好適には３０未満、さらに好適には１０未満、最も好適には５未満）を５’及び／又は３’末端に追加する。

本発明における用語“当該アミノ酸配列における少なくとも１個のアミノ酸を置換及び／又は削除及び／又は追加により得られるアミノ酸配列”とは（限定はしないが）、いくつかのアミノ酸（通常は１から５０、好適には１から３０、さらに好適には１から２０、最も好適には１から１０）の削除、挿入及び／又は置換し、１個以上のアミノ酸（通常は２０未満、好適には１０未満、さらに好適には５未満）をＣ−末端及び／又はＮ―末端に追加することである。例えば、同様機能のアミノ酸によって置換されると、当該タンパク質の機能は変化できない。別例は、１個以上のアミノ酸をＣ―末端及び／又はＮ―末端に追加すると、タンパク質の機能は変化しない。この用語は、そのタンパク質の活性断片および活性誘導体も含む。本発明における同一機能とは、ＢＡＦＦと結合し、ＢＡＦＦの生物活性を拮抗する機能のことである。

用語“当該アミノ酸配列における少なくとも１個のアミノ酸を置換及び／又は削除及び／又は追加することで得られるアミノ酸配列”とは（限定はしないが）、１０まで（すなわち１以上）のアミノ酸、好適には８までのアミノ酸、さらに好適には５までのアミノ酸を、類似特性のアミノ酸により置換し、ポリペプチド、すなわち、コンサーバティブな変異ポリペプチドを形成することを含む。好適には、これらコンサーバティブ変異ポリペプチドは表１に従って置換される。

本発明は請求項記載のタンパク質またはポリペプチド類似体も含む。これら類似体とプロタンパク質の違いはアミノ酸配列における相違であったり、配列に影響を及ぼさない修正形態における相違であったりする。これら両方の場合もある。これらタンパク質には天然または誘導された遺伝子変異体が含まれる。誘導された変異体は、突然変異物質に照射または曝露されることで発生するランダム変異形成のごとき種々な技術によって得られる。また、部位指定特全変異形成または他の知られた分子生物学技術によっても得られる。また類似体には、異なる天然Ｌ−アミノ酸残分（例：Ｄ−アミノ酸）および非天然または合成アミノ酸（例：β、γ−アミノ酸）を含んだ類似体も含まれる。本発明におけるタンパク質またはペプチドは、上例の代表的なタンパク質またはポリペプチドに限定されることはない。

修正（通常は主要構造を変更しない）形態には、アセチレン化またはカルボキシル化のごとき生体内または生体外の化学誘導形態が含まれる。また修正には、ポリペプチド合成とプロセス、あるいは、さらなるプロセスステップにおけるグリコシル化修正によって得られるポリペプチドのごときグリコシル化も含まれる。当該修正は、ポリペプチドを一種のグリコシル化酵素（哺乳類のグリコシル化酵素または脱グリコシル化酵素、等々）に曝露することにより実行できる。この修正形態はさらに、リン酸化アミノ酸残分（例：ホスホチロシン、ホスホセリン、ホスフォトレオニン）を有する配列も含む。さらに、抗タンパク質分解特性を改善できるか、溶解特性を最良化できる修正ポリペプチドも含むことができる。

本明細書で使用される用語“実施可能に接続”とは、線状ＤＮＡ配列の一部が同じ線状ＤＮＡ配列の他の部分の活性に影響を及ぼすことができることを意味する。例えば、もしシグナルペプチドＤＮＡが前駆物質として発現され、ポリペプチドの分泌に関与するなら、そのシグナルペプチド（分泌リーダ配列）ＤＮＡは実施可能にポリペプチドＤＮＡに接続する。もしプロモータ制御配列の転写が開始したら、それはエンコード配列に実施可能に接続される。もしリボソーム結合部位が翻訳可能な位置に配置されると、それはエンコード配列に実施可能に接続される。一般的に“実施可能に接続”とは、隣接するが、分泌リーダ配列のためにはリーディングフレームに隣接することを意味する。

本発明の利点は次のようなものである。すなわち、本発明は、生体内でその安定性を増強し、活性半減期を延長するために、ＴＡＣＩ受容体のＢＡＦＦを結合するドメイン２（ＣＲＤ２）と、Ｂｒ３受容体のＢＡＦＦを結合するドメイン（ＣＲＤ）とを融合することで得られる断片を設計および構築することである。そのことは免疫グロブリンのＦｃ断片と融合できる。例えば、それは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４のＦｃ断片と融合できる。さらに改善された分泌発現を実行するために、シグナルペプチドをＮ−末端に結合することができ、よって一連の融合タンパク質分子を得ることができる。この新タイプのＢ細胞活性化因子の拮抗物質である本発明のＢＡＦＦトラップは、ＢＡＦＦとの組み合わせ効果を大きく改善し、治療投薬量を減少させ、自己免疫疾患の治療効果を高めることができる。それは自己免疫疾患の予防および治療の新規で効果的な選択肢を提供する。

ＢＡＦＦとその受容体の相互作用概略図（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００２年２：４６５−４７５からの抜粋）を示す。 ＢＡＦＦトラップの構造概略図を示す。Ｆｃ断片の追加によって融合タンパク質は二量体の形態で容易に存在する。 ＩｇＧ１ ＦｃのＲＴ−ＰＣＲの結果を示す（１％アガロースゲル電気泳動）。Ｍ：１００ｂｐ ＤＮＡラダー（インビトロゲン）。１：ＲＴ−ＰＣＲ生成物 組み換えプラスミドｐＥＦ−ＢＴの構造の概略図である。 真核生物発現ベクターｐＥＦ１／Ｖ５−ＨｉｓＡのプラスミドプロフィールを示す。 組み換えプラスミドｐＥＦ−ＴＡＣＩ−Ｂｒ３（１％アガロース電気泳動）のＫｐｍ Ｉ／ＢａｍＨ Ｉの二重消化結果を示す。Ｍ：１ｋｂ ＤＮＡラダー（インビトロゲン）。１１、１５、１６、２６、２７は異なるクローンをそれぞれ表す。 組み換えプラスミドｐＥＦ−ＢＴ（１％アガロース）のＫｐｎ Ｉ／Ｐｍｅ Ｉ二重消化結果を示す。Ｍ：１ｋｂ ＤＮＡラダー（インビトロゲン）。１、２、５、６、７、１０は異なるクローンをそれぞれ表す。 純化タンパク質（１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の電気泳動パターンを示す。Ｍ：タンパク質分子量標準。１：非減少条件。２：減少条件 リューマチ性関節炎モデルの体重変化と臨床スコアの変化を示す。Ａは重量変化であり、Ｂは臨床スコア変化である。 図１０は、踝の組織病理学評価（ＨＥ、倍率１０＊４０）と、病理スコア分析を示す。Ａは踝関節部分のＨＥ染色（ａは正常ラット群、ｂはモデル群、ｃはｈＩｇＧ群、ｄはＢＴ群）であり、Ｂは病理スコアである。 図１１は、フローサイトメトリによるＢ２２＋Ｂ細胞の検出結果を示す。Ａは正常群、Ｂはサリン群、ＣはｈＩｇＧ群、ＤはＢＴ群

実施例の説明
本発明を添付図面に沿って以下の実施例によりさらに詳細に解説する。以下の実施例では、特に言及がない実験条件は、従来からよく知られているものである（例：サムブルック・Ｊ、ラッセル・ＤＷ、２００１年、分子クローン技術、実験マニュアル（第３版）、スプリングハーバーラボラトリプレス社、または製造業者推奨条件）。

実施例１：ＢＡＦＦトラップエンコード遺伝子の構造及び発現

１．ＢＡＦＦトラップエンコード遺伝子の調製方法

遺伝子全体合成法を使用し、ＴＡＣＩドメイン２とＢｒ３ドメイン（ＣＲＤ）によって融合されたｃＤＮＡ断片を得るものであり、当該断片の５’末端にヒトＩＬ−２シグナルペプチド配列を含むｃＤＮＡ断片を得る。

以下のプライマーを設計し、ＩｇＧ１ Ｆｅ断片ｃＤＮＡを増幅する。

５’プライマー（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６）：５’ＣＧＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＡＣＡ ＡＡＡ ＣＴＣ ＡＣＡ ＣＡＴ ＧＣＣ３’
３’プライマー（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７）：５’ ＡＧＧ ＴＴＴ ＧＴＴ ＴＡＡ
ＡＣＴ ＣＡＴ ＴＴＡ ＣＣＣ ＧＧＡ、ＧＡＣ ＡＧＧ ３’

ＰＣＲ生成物をクローン化ベクターに挿入するため、ＢａｍＨ Ｉ部位は５’プライマーに設計され、Ｐｍｅ Ｉ部位は３’プライマーに設計された。

テンプレートとしてヒトリンパ球の全ＲＮＡであるＲＴ−ＰＣＲはＩｇＧ１ Ｆｃ断片を増幅した。反応条件は以下のごとくであった。

５０℃での３０分間のＲＴ−ＰＣＲ反応混合変性処理後に、反応は以下の条件下で実行された。

逆転写反応：９４℃での３０秒間の変性、５５℃での３０秒間のアニーリング、６８℃での１分間の延展。１０サイクルの反応。

ＰＣＲ反応：９４℃での３０秒間の変性、６０度での３０秒間のアニーリング、６８℃での１分間の延展。２５サイクルの反応。続いて６８℃での１２分間の追加延展。

反応終了後、ＲＴ−ＰＣＲ生成物を１％アガロースゲル電気泳動により検出。図３で示すように、予期したサイズ（〜７００ｂｐ）のＤＮＡ断片が得られた。

全長ＢＡＦＦトラップのヌクレオチドとタンパク質配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５とＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３としてそれぞれ示された。Ｆｃ断片が追加されたため、融合タンパク質は二硫化結合によって二量体の形態で存在する。ＢＡＦＦトラップ構造図は図２で示
されている。

２．ＢＡＦＦトラップエンコード遺伝子を含んだ組み換えプラスミドの構築

上述したように、遺伝子全体合成断片（ＴＡＣＩ−Ｂｒ３）においては、Ｋｐｎ Ｉ規制部位は５’プライマーに設計され、ＢａｍＨ Ｉ規制部位は３’プライマーに設計された。よって、ＴＡＣＩ−Ｂｒ３のｃＤＮＡ断片は、真核生物発現ベクターｐＥＥ１／Ｖ５−ＨｉｓＡ（米国のインビトロゲン社から購入、図５のマップ参照）の多重クローン化部位Ｋｐｎ１／ＢａｍＨに直接的に挿入でき、ＩｇＧ１ Ｆｃ断片は多重クローン化部位ＢａｍＨ Ｉ／Ｐｍｅ Ｉに挿入でき、よって、ＢＡＦＦトラップの融合断片が入手できた。構築プロセスは図４で示されている。

２．１ 組み換えプラスミドｐＥＦ−ＴＡＣＩ−Ｂｒ３の構築

遺伝子全体合成断片ＴＡＣＩ−Ｂｒ３をｐＥＦＩ／Ｖ５−ＨｉｓＡのＫｐｎ Ｉ／ＢａｍＨ Ｉ部位に挿入し、結さく生成物ｐＥＦ−ＴＡＣＩ−Ｂｒ３をＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９に変態させ、ランダムに２８個のクローンを選択し、スクリーニングした。番号が１１、１５、１６、２６および２７のクローンをＫｐｎ Ｉ／ＢａｍＨ Ｉによってバックカットし、標的断片を得た。組み替えプラスミドｐＥＦ−ＴＡＣＩ−Ｂｒの酵素消化結果を図６で示す。配列分析のために番号２６のクローンを選択し、もし配列が正しければ、ＩｇＧ１ Ｆｅとの融合遺伝子をさらに構築する。

２．２ 組み換えプラスミドｐＥＧ−ＢＴの構築

ＰＥＦ−ＴＡＣＩ−Ｂｒ３ Ｎｏ．２６クローンに基づき、ＩｇＧ１Ｆｃ断片をＢａｍＨ Ｉ／Ｐｍｅ Ｉ部位に挿入した。結さく生成物ｐＥＦ−ＢＴをＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９に変態させ、スクリーニングのために１２個のクローンをランダムに選択した。組み換えプラスミドｐＥＦ−ＢＴの酵素消化結果を図７で示す。Ｋｐｎ Ｉ／Ｐｍｅ Ｉによる番号１、２、６、７および１０のクローンをバックカットして標的断片を得て、番号１０のクローンをＤＮＡ配列のために送り出した。ＤＮＡ配列結果は、組み換えプラスミドの標的遺伝子の配列と、設計（ＴＡＣＩ−Ｂｒ３−ＩｇＧ１ Ｆｃ）（すなわち、ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．５）のＢＡＦＦトラップ遺伝子は一貫していることを示した。

４．標的タンパク質の安定発現株−ＣＨＯ−ＢＴのスクリーニングおよび特定

５μｇの組み換えプラスミドｐＥＦ−ＢＴを大量調製によって取得し、リポソームであるリポフェクタミン２０００を使用してＣＨＯ−Ｋ１細胞（米国のＡＴＣＣから購入）を移入し、２日後に１：５の割合で培養し、０．４ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８（米国のインビトロゲン社から購入）をスクリーニングに加えたところ、１０日後にコロニー形成が観察できた。明確に分離された縁部と良好な細胞状態を有する９６個のモノクローンをランダムに消化し、６枚の２４ウェルプレートに接種し、培養した（第１ラウンドスクリーニング）。

２日後に、培養上澄液を採取し、融合タンパク質発現をＥＬＩＳＡによって検出し、２４個のポジティブ発現クローンを選択し、２４ウェルプレートにそれぞれ接種した（第２ラウンドスクリーニング）。２日間の培養後に、ＥＬＩＳＡによって上澄液の融合タンパク質発現を検出し、相対的に高い発現性を有した６個のクローン（１−Ｂ２、１−Ｂ８、１−Ｄ７、１−Ｅ１、２−Ｄ１、２−Ｆ６）をさらに限界希釈法によってスクリーニングのために選択した。

９６ウェルプレートにそれぞれ接種し（１細胞／ウェル／２００μＬ）（第３ラウンドスクリーニング）、細胞合流後（約８日後）にＥＬＩＳＡによって培養上澄液の融合タンパク質発現を検出し、相対的に高い発現性を有する６個のクローンを選択し、２４ウェルプレートに接種した。細胞合流まで、６ウェルプレートに接種され、ＥＬＩＳＡによってそれぞれのクローンの発現が検出された。結果を表２に示す。

培養をスケールアップするために１−Ｂ８−１、１−Ｂ７−７および１−Ｅ１−７の選択された相対的に高い発現は、Ｔ７５の方形ボトル内に膨張され、上澄液は４日後に回収され、Ｐｒ．Ａセファロースにより吸収させ、融合タンパク質の発現を検出した。結果は、純化タンパク質と予想タンパク質の分子量が同じであり、ウエスタンブロット法によって確認された。

１−Ｂ８−１、１−Ｄ７−７、１−Ｅ１−７を採取し、それぞれ９６ウェルプレートに接種した（１細胞／ウェル／２００μＬ）（第４ラウンドスクリーニング）。細胞合流後（約１０日後）、培養上澄液の融合タンパク質発現をＥＬＩＳＡで検出した。３クローンは同種であり、最も高い発現は増幅されて保存され、ＣＨＯ−ＢＴ（１−Ｂ８−１）、ＣＨＯ−ＢＴ（１−Ｄ７−７）、ＣＨＯ−ＢＴ（１−Ｅ１−７）と命名された。次の発現および純化実験にＣＨＯ−ＢＴ（１−Ｅ１−７）が選択された。

５．融合タンパク質ＢＡＦＦとラップ（ＢＴ）の増大した発現および純化

当該スクリーニングされたＣＨＯ−ＢＴ（１−Ｅ１−７）の細胞の大スケール培養後、上澄液は、ＭＡＢ−Ｓｅｌｅｃｔゲル（米国のＧＥ社から購入）によって純化され、ＳＰカラムクロマトグラフィーを通過した。２段階のカラムクロマトグラフィー後のタンパク
質電気泳動パターンが図８で示される。結果は、還元条件下での純化された標的タンパク質の分子量は３８ｋＤａであり、非還元条件下では７６ｋＤａであった。これは二量体の形態で存在し、予想通りであった。純化されたタンパク質の純度は９５％以上が可能であった。

実施例２ 融合タンパクＢＡＦＦトラップ（ＢＴ）の特定および効力実験

１．融合タンパク質ＢＡＦＦトラップ（ＢＴ）およびＢＡＦＦの結合定数の決定
生体外条件下でＢＡＦＦトラップとＢＡＦＦの結合能を検出するためにＢＩＡｃｏｒｅＴ１００を使用し、その結合定数がＢＩＡｃｏｒｅＴ１００評価ソフトによって分析された。また、ＢＡＦＦ Ｒ−ＦｃおよびＴＡＣＩ−Ｆｃの基準が対照物質として使用された。実験ステップは以下のごとくであった。

（１）カップリング：当初にＨＥＰＥＳ標準溶液を使用してＢＡＦＦトラップタンパク質を希釈し、続いて１０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ＝５．０）、２μｇ／ｍｌ、２００μｌに希釈し、カップリングのために４回の注入を実行した。流量と時間は従来通りであった。量的標準のＴＡＣＩ−ＦｅおよびＢｒ３−Ｆｃを酢酸ナトリウム溶液に加え、この最終濃度も２μｇ／ｍｌ、２００μｌに希釈し、同方法を使用してカップリングさせ、チップ上に固定した。

（２）結合アッセイ：１８００ｎｍ、６００ｎｍ、２００ｎｍ、６６ｎｍ、および２２ｎｍの１２０μｌ以上のＨＥＰＥＳ溶液を使用してＢＡＦＦ標準物を段々と希釈した（サイクル荷重、接触時間６０秒、分離時間９００秒、流量３０μｌ／分）。

（３）動的分析：ＢＩＡｃｏｒｅＴ１００評価ソフトを使用して、カップリング率（Ｋａ）および分離率（Ｋｄ）を分析（結合定数ＫＤ＝Ｋｄ／Ｋａ）

結果：ＴＡＣＩ−ＦｃおよびＢｒ３−Ｆｃと比べて、ＢＡＦＦトラップは強力なＢＡＦＦ結合能を有しており、ＫＤ値は約１２．７ｎＭであり、ＴＡＣＩ−ＦｃとＢｒ３−ＦｃのＢＡＦＦとの結合定数はそれぞれ１４．８ｎＭと３４ｎＭであった（表３）。

２．生体外の融合タンパク質ＢＡＦＦトラップ（ＢＴ）の細胞結合の同定

ラージ細胞（米国のＡＴＣＣから購入）は高発現ＢＡＦＦ受容体（ＴＡＣＩおよびＢｒ３）のためのヒトＢ細胞ラインであり、ＢＴ競合的拮抗ＢＡＦＦの組み合わせを検出するのに使用される。ラージ細胞は対数増殖期で採取され、異なる濃度のＢＴタンパク質と抗ＴＡＣＩ抗体／抗Ｂｒ３抗体が加えられ、室温で１時間培養され、洗浄後にＦＩＴＣ標識の第２抗体が加えられ、暗所内で３０分間室温にて培養され、洗浄後に上昇流細胞数測定
された。結果は表４にて示される。（ｈＩｇＧは、タンパク質群としてヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片を含有した。）

結果は、ＢＴが、抗体とＢＡＦＦ受容体（ラージ細胞上のＴＡＣＩおよびＢｒ３）の組み合わせを競合的に抑制することを示した。さらにその効果が投与量に依存することを示した。すなわち、生体外の実験では、ＢＴはＢＡＦＦと、その細胞表面受容体の結合を抑制する拮抗剤として使用できることを示している。

３．ラットのリューマチ性関節炎モデルの融合タンパク質ＢＡＦＦトラップ（ＢＴ）の治療効果

ラットのアジュバント誘導関節炎モデル（ＡＩＡ）による生体内におけるＢＴの治療効果の研究

実験方法：生後６週間から８週間の雌Ｌｅｗｉｓラットに、５ｍｇ／ｍｌの不活性化ＢＣＧを含んだ１００μＬの不完全フロイントアジュバントを尻尾の根元から皮下注射した。対照群のラットは無処理であった。開始時ラットは無作為に３治療群（サリン群、ｈＩｇＧ群、融合タンパク質ＢＴ群（ｎ＝１０））に分割され、１００μｇ／１００μｌ／一匹が腹腔内投与された。毎週２度投与されただけであった（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片を含んだｈＩｇＧ群、無関係治療群として利用）。毎日体重を計測し、二重ブラインド法を使用して四肢の臨床スコアをモニターした。毎週一回、軌道静脈から血液を採取し、血清を分離し、−８０℃の冷蔵庫で保管した。

４５日目間治療した後にラットを処分し、その踝を採取し、ＨＥ染色した。リンパ球を脾臓から分離し、脾臓のＢ細胞の内容をフローサイトメトリー（Ｂ２２０抗体検出）によって検出した。

実験結果：それぞれの群のラットの体重の変化と、臨床スコアの変化は図９として示されている。結果：第２日目からラットの体重は減少し始め、１７日目から治療し、短期の継続的体重減少後、約２５日目に最低体重に到達し、その後に体重上昇が開始した。ＢＡＦＦトラップ群の上昇率は、ｈＩｇＧ群やＡＩＡ群よりも大きく、４３日目から統計的に意味のあるものになった（Ｐ＜０．０５）。やがて、モデルラットのリューマチ性関節炎
が徐々に発現し、重症化した。その臨床スコアも上昇し、１７日目に１４±２になった。その後に、臨床スコアは徐々に減少し、ＢＡＦＦトラップ群の減少率は他の２つの群のものより大幅に大きかったが（Ｐ＜０．０５）、３７日目に通常に戻った。このときのＡＩＡ群のスコアは１０±１であり、ｈＩｇＧ群のスコアは６±１であった。

全ての群のＨＥ染色結果は図１０Ａとして示されている。ＡＩＡ群およびｈＩｇＧ群では、リンパ球浸透、骨破壊、および関節滑膜炎（ＡＩＡ群では、骨の線維化とパンヌスも見られた）が確認され、ＢＴ群では滑膜統合、リンパ球償還および損傷骨補修が確認された。これは正常ラットの関節の場合と類似していた。病理スコア結果は図１０Ｂとして示されている。ＡＩＡ群とｈＩｇＧ群の病理スコアは４ポイントまでであり、ＢＴ群では病理スコアは大きく減少し（Ｐ＜０．０５）、正常化した。

フローサイトメトリーによるＢ２２０＋Ｂ細胞の検出結果は図１１で示されている。ＢＴ群では、ラット脾臓細胞のＢ２２０＋Ｂ細胞の割合は１７．６％であり、サリン群合や（３２．６％）ｈＩｇＧ治療群（２７．１％）の場合よりも大幅に小さかった。結果は大きな差（Ｐ＜０．０１）を示し、正常ラットのもの（２１．４％）と調和していた。

上記の実施例は、本発明がＢＡＦＦ受容体の拮抗物質として利用可能な融合タンパク質ＢＡＦＦトラップ（ＢＴ）を成功裏に製造したことを示している。それはラットＡＩＡモデルに対して優れた治療効果を有し、自己免疫疾患の治療のための新規で効果的な選択肢を提供する。

参照
１．Moore PA， Belvedere 0， Orr A， et al. BLyS: member of the tumor necrosis factor family and B lymphocyte stimulator. Science, 1999; 285: 260-263
２．Mackay F, Ambrose C: The TNF family members BAFF and APRIL: the growing complexity. Cy tokine Growth Factor Rev 2003, 14(3-4):311-324
３．Schneider P, MacKay F, Steiner V, Hofmann K, Bodmer JL, Holler N, Ambrose C,
Lawton P, Bi xler S, Acha-Orbea H et al: BAFF, a novel ligand of the tumor necrosis factor family, stimulates B cell growth. J Exp Med 1999, 189(11): 1747-1756.
４．Sutherland AP, Mackay F, Mackay CR: Targeting BAFF: immunomodulation for autoimmune disea ses and lymphomas. Pharmacol Ther 2006, 112(3):774-786.
５．Scapini P， Nardelli B， Nadali G， et al. G-CSF-stimulated neutrophils are a prominent source of fu nctional BLyS. J Exp Med, 2003; 197: 297-302.
６．Hymowitz SG， Patel DR， Wallweber HJ， et al. Structures of APRIL-receptor complexes: like BCM A， TACI employs only a single cysteine-rich domain for high
affinity ligand binding. J Biol Chem， 2005; 280: 7218-7227.
７．Kim HM， Yu KS， Lee ME， et al. Crystal structure of the BAFF-BAFF-R complex and its implica tions for receptor activation. Nat Struct Biol， 2003; 10: 342-348

Claims (19)

1. 以下の構造的ドメインを含んだ融合タンパク質であって、該構造的ドメインは、ＴＡＣＩ受容体のＢＡＦＦに結合するＣＲＤ２ドメインと、Ｂｒ３受容体のＢＡＦＦに結合するＣＲＤドメインとが直接融合した融合タンパク質であり、且つ前記構造的ドメインはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１のアミノ酸配列を有する、Ｂ細胞活性化因子の拮抗物質。
2. 前記Ｂ細胞活性化因子の拮抗物質は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１のアミノ酸配列のＣ−末端においてヒト免疫グロブリンのＦｃ断片のアミノ酸配列と接続したアミノ酸配列を有するタンパク質である、請求項１記載の拮抗物質。
3. 前記Ｂ細胞活性化因子の拮抗物質は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２のアミノ酸配列のタンパク質である、請求項２記載の拮抗物質。
4. 前記Ｂ細胞活性化因子の拮抗物質は、Ｎ−末端のシグナルペプチドと接続するタンパク質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の拮抗物質。
5. 前記Ｂ細胞活性化因子の拮抗物質は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３のアミノ酸配列のタンパク質である、請求項４記載の拮抗物質。
6. 前記Ｂ細胞活性化因子拮抗物質は、ヒト免疫グロブリンのＦｃ断片による二量体タンパク質の形態である、請求項２〜５のいずれか１項に記載の拮抗物質。
7. 請求項１〜５のいずれか１項に記載のＢ細胞活性化因子の拮抗物質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸。
8. 前記ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０のヌクレオチド配列若しくはその縮重配列である、請求項７記載の核酸。
9. 前記ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４のヌクレオチド配列若しくはその縮重配列である、請求項８記載の核酸。
10. 前記ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５のヌクレオチド配列若しくはその縮重配列である、請求項９記載の核酸。
11. 請求項７〜１０のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列を含む遺伝子ベクター。
12. 請求項１１記載の遺伝子ベクターを含む宿主細胞。
13. 自己免疫疾患の治療薬を製造するための、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＢ細胞活性化因子の拮抗物質、請求項７〜１０のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列を有する核酸、請求項１１記載の遺伝子ベクター、又は請求項１２記載の宿主細胞の利用。
14. 前記自己免疫疾患は、リューマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、又はシーグレン症候群である、請求項１３記載の利用。
15. 請求項１〜６のいずれか１項に記載のＢ細胞活性化因子の拮抗物質、請求項７〜１０のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列を有する核酸、又は請求項１１記載の遺伝子ベクターが主要な活性成分である自己免疫疾患の治療薬。
16. 前記自己免疫疾患は、リューマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、又はシーグレン症候群である、請求項１５記載の自己免疫疾患の治療薬。
17. 請求項１〜６のいずれか１項に記載のＢ細胞活性化因子の拮抗物質をコードする遺伝子を発現ベクターにローディングするステップと、該発現ベクターを宿主に移行させるステップと、該宿主を培養して増殖させるステップと、該宿主及び／又はその培養上澄液の単離及び純化によってＢ細胞活性化因子の拮抗物質を得るステップと、を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＢ細胞活性化因子の拮抗物質の調製方法。
18. 前記発現ベクターは、真核プラスミド発現ベクター、アデノウイルスベクター、又はアデノ関連ウイルスベクターである請求項１７記載の調製方法。
19. 前記宿主は真核細胞である、請求項１８記載の調製方法。