EA037256B1 - Химерный белок мочевого трипсинового ингибитора (мти), содержащий домен мти и fc-домен igg1 - Google Patents

Химерный белок мочевого трипсинового ингибитора (мти), содержащий домен мти и fc-домен igg1 Download PDF

Info

Publication number
EA037256B1
EA037256B1 EA201691702A EA201691702A EA037256B1 EA 037256 B1 EA037256 B1 EA 037256B1 EA 201691702 A EA201691702 A EA 201691702A EA 201691702 A EA201691702 A EA 201691702A EA 037256 B1 EA037256 B1 EA 037256B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
mit
domain
chimeric
acute
seq
Prior art date
Application number
EA201691702A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201691702A1 (ru
Inventor
Аарон Чэмберлэйн
Цян Лю
Матиас Шмидт
Original Assignee
Такеда Гмбх
Такеда Фармасьютикал Компани Лимитед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Такеда Гмбх, Такеда Фармасьютикал Компани Лимитед filed Critical Такеда Гмбх
Publication of EA201691702A1 publication Critical patent/EA201691702A1/ru
Publication of EA037256B1 publication Critical patent/EA037256B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • C07K14/8114—Kunitz type inhibitors
    • C07K14/8117—Bovine/basic pancreatic trypsin inhibitor (BPTI, aprotinin)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/55—Protease inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/08—Plasma substitutes; Perfusion solutions; Dialytics or haemodialytics; Drugs for electrolytic or acid-base disorders, e.g. hypovolemic shock
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • C07K14/8114—Kunitz type inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/90—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification
    • C07K2319/91—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification containing a motif for glycosylation
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

В изобретении предложены химерные белки МТИ, последовательности ДНК для их получения, фармацевтические композиции и способы их применения.

Description

(54) ХИМЕРНЫЙ БЕЛОК МОЧЕВОГО ТРИПСИНОВОГО ИНГИБИТОРА (МТИ), СОДЕРЖАЩИЙ ДОМЕН МТИ И FC-ДОМЕН IGG1 (31) 61/943,617 (56) CN-A-103044554 (32) 2014.02.24 JP-A-2013253079 (33) US (43) 2017.01.30 (86) PCT/US2015/017152 (87) WO 2015/127391 2015.08.27 (71)(73) Заявитель и патентовладелец:
ТАКЕДА ГМБХ (DE); ТАКЕДА
ФАРМАСЬЮТИКАЛ КОМПАНИ
ЛИМИТЕД (JP) (72) Изобретатель:
Чэмберлэйн Аарон, Лю Цян, Шмидт
Матиас (US) (74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
037256 В1 (57) В изобретении предложены химерные белки МТИ, последовательности ДНК для их получения, фармацевтические композиции и способы их применения.
037256 Bl
Область техники
Изобретение относится к молекулярной биологии, фармакологии и медицине.
Уровень техники
Мочевой трипсиновый ингибитор (МТИ), также известный как улинастатин, уристатин, уринастатин, улистин, человеческий ингибитор 30 (ЧИ-30), мингин и бикунин, представляет собой ингибитор протеазы с молекулярной массой около 40 кДа. МТИ присутствует в человеческой моче и крови (чМТИ) и имеет различные физиологические активности, такие как ингибирующее действие на семейство сериновых протеаз, таких как трипсин, α-химотрипсин, плазмин, катепсин-G и эластазу лейкоцитов. МТИ также имеет иммуномодулирующий эффект и может препятствовать высвобождению провоспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухоли альфа (ФНО-α), интерлейкин-1 (ИЛ-1) и интерлейкин (ИЛ-6). Кроме того, МТИ также препятствует активному димер-опосредованному сигнальному пути PDGF-D (PDGF-DD)/PDGF-BBR путем нейтрализации димера.
чМТИ получил разрешение на медицинское применение, один продукт продается в Японии под торговым названием Мираклид и является выделенным из мочи человека. На самом деле, чМТИ, выделенный из мочи человека, в настоящее время продается несколькими производителями для лечения панкреатита и вызванной шоком острой сердечно-сосудистой недостаточности.
МТИ сначала вырабатывается в организме человека как белок-предшественник под названием AMBP (предшественник а1-микроглобулина/бикунина), который закодирован на человеческой хромосоме 9. Протеолиз AMBP позволяет получить свободный МТИ, содержащий 143 аминокислоты. МТИ содержит два домена Кунитца, которые, как известно, ингибируют сериновые протеазы, фланкированные неструктурированными аминокислотами по N- и C-концам МТИ. Как ожидается, эти два домена предоставляют различные специфичности ингибирования протеазы благодаря различным аминокислотам, участвующим в связывании протеазы. По аналогии с другими ингибиторами сериновых протеаз (например, BPTI - бычий панкреатический ингибитор трипсина) мы можем спрогнозировать, что две ключевые аминокислоты для ингибирования протеазы включают Met26 (домен Кунитца 1) и Arg88 (домен Кунитца 2). Мало что известно об участии различных участков МТИ во время ингибирования различными протеазами, но, как было показано, удаление домена Кунитца 1 меняет специфичность протеаз, раскрывая новую ингибирующую активность в отношении фактора Xa и плазменного калликриена. Полноразмерный МТИ не демонстрирует ингибирования этих двух протеаз (Morishita et al., Thrombosis Research 1994 год, том 73 (3/4) стр. 193-204). МТИ также содержит два присоединенных сахара, один Oсвязанный на Ser10 и один N-связанный на Asn45. Период полувыведения МТИ у грызунов и человека составляет 4-30 мин (Fries et al., International Journal of Biochemistry and Cell Biology, 2000 год, том 32, стр. 125-137).
Химерный белок МТИ должен содержать оптимизированную последовательность аминокислот, в том числе лучшие стартовые и стоп точки любых доменов МТИ, и может быть слит с другим белком для улучшения свойств, таких как экспрессия, очистка, период полувыведения и стабильность. Точная последовательность партнера по слиянию нуждается в определении и может включать изменения в линкерах, стартовых/стоп точках и/или мутации, которые могут изменить функциональные свойства партнера по слиянию.
Известны варианты улинастатина, полученные из мочи, из WO 199856916, US 5792629, US 5407915, US 5409895, US 7019123 и US 6583108. Концепция химерных белков улинастатина (и его вариантов) была раскрыта в US 20080181892, US 5541288 и US 20080255025. Некоторые химерные белки МТИ описаны в CN 103044554A. Химерные белки из CN 103044554A относятся к конкретным вариантам в домене Fc, по-видимому, для избежания каких-либо Fc-опосредованных фармакологических эффектов (АЗКЦ, CDC). Было неожиданно обнаружено, что МТИ-Fc с IgG1 дикого типа хорошо переносится и обеспечивает значительное увеличение периода полувыведения. Кроме того, по сравнению с химерными белками МТИ из CN 103044554A химерные белки МТИ по настоящему изобретению, в частности SEQ ID NO: 1, демонстрируют большую температурную стабильность.
Настоящее изобретение относится к химерным белкам МТИ, фармацевтическим композициям, содержащим их, способам получения и их применению.
Сущность изобретения
Изобретение относится к химерным белкам МТИ, содержащим домен МТИ и партнера по слиянию, причем домен МТИ функционально связан с партнером по слиянию. Настоящее изобретение относится к химерным белкам МТИ, содержащим домен МТИ и домен Fc, причем домен МТИ функционально связан с доменом Fc.
Настоящее изобретение также относится к выделенным химерным белкам МТИ, как описано в настоящем документе.
В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение относится к химерному белку МТИ, содержащему последовательность, включающую SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 и 29. В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к химерному белку МТИ, содержащему SEQ ID NO: 1. В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к химерному белку
- 1 037256
МТИ, содержащему SEQ ID NO: 3. В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к химерному белку МТИ, содержащему SEQ ID NO: 5. В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к химерному белку МТИ, содержащему SEQ ID NO: 7. В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к химерному белку МТИ, содержащему SEQ ID NO: 9. В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к химерному белку МТИ, содержащему SEQ ID NO: 11. В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к химерному белку МТИ, содержащему SEQ ID NO: 13. В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к химерному белку МТИ, содержащему SEQ ID NO: 15. В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к химерному белку МТИ, содержащему SEQ ID NO: 17. В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к химерному белку МТИ, содержащему SEQ ID NO: 19. В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к химерному белку МТИ, содержащему SEQ ID NO: 21. В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к химерному белку МТИ, содержащему SEQ ID NO: 23. В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к химерному белку МТИ, содержащему SEQ ID NO: 25. В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к химерному белку МТИ, содержащему SEQ ID NO: 27. В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к химерному белку МТИ, содержащему SEQ ID NO: 29.
В соответствии с другим вариантом реализации настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей химерные белки МТИ, содержащие химерные белки МТИ, описанные в данном документе. Кроме того, изобретение относится к ДНК-последовательностям, изложенным в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 и 30. В одном варианте реализации изобретения нуклеиновая кислота, кодирующая химерный белок МТИ, дополнительно содержит вектор, содержащий контролирующие последовательности, с которыми нуклеиновая кислота является функционально связанной. В другом варианте реализации настоящее изобретение предлагает клетку-хозяина, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует химерный белок МТИ, такой как у млекопитающих, насекомых, Е.coli или у дрожжевой клетки, а также поддержание клетки-хозяина в условиях, в которых экспрессируется молекула химерного белка.
В другом варианте реализации настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей химерные белки МТИ, описанные в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество. В соответствии с еще одним вариантом реализации изобретения предложен способ лечения расстройств, связанных с МТИ, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества химерного белка МТИ, описанного в данном документе.
Т.е. настоящее изобретение относится к применению химерного белка МТИ в качестве лекарственного средства, в том числе при изготовлении лекарственного средства, а также применению химерного белка МТИ, описанного в данном документе, для лечения расстройств, связанных с МТИ, описанных в данном документе.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1 представлена структура домена МТИ и сайтов гликозилирования;
на фиг. 2 - два конструкта МТИ-Fc, демонстрирующие измененные линкеры;
на фиг. 3 - различные конструкты МТИ-Fc по настоящему изобретению;
на фиг. 4 - стратегия сборки ДНК (SLIC), используемая в химерном конструкте МТИ;
на фиг. 5 - подавление активности протеазы (трипсина) с помощью МТИ и МТИ-FcI, SEQ ID NO: 1;
на фиг. 6 - подавление активности протеазы (химотрипсина) с помощью МТИ-FcI, UFC1, SEQ ID NO: 1;
на фиг. 7 - подавление активности протеазы (множественных протеаз) с помощью МТИ-FcI, UFC1, SEQ ID NO: 1;
на фиг. 8 - подавление секреции цитокинов (IL-6) с помощью МТИ и МТИ-FcI, МТИ-Fc, SEQ ID NO: 1;
на фиг. 9 - очистка полученной продукции химерных белков МТИ;
на фиг. 10 - влияние SEQ ID NO: 1 на индуцированный ЛПС C5a у мышей C3H.
Подробное описание изобретения
Изобретение относится к химерным белкам МТИ, домену МТИ и партнеру по слиянию, причем домен МТИ функционально связан с партнером по слиянию. Химерные белки МТИ по изобретению оказывают ингибирующее действие на протеазы, в том числе на трипсин.
В некоторых вариантах реализации изобретения партнер по слиянию представляет собой полипептид Fc. В некоторых вариантах реализации изобретения партнер по слиянию представляет собой полипептид Fc человека. В некоторых вариантах реализации изобретения партнер по слиянию представляет собой аналог(и) полипептида Fc человека. В некоторых вариантах реализации изобретения партнер по слиянию представляет собой фрагмент(ы) полипептида Fc человека. В других вариантах реализации изобретения партнер по слиянию представляет собой полипептид Fc мыши. В других вариантах реализации изобретения партнер по слиянию представляет собой полипептид Fc крысы.
В некоторых вариантах реализации изобретения партнер по слиянию представляет собой альбумин человека. В некоторых вариантах реализации изобретения партнер по слиянию представляет собой ана- 2 037256 лог альбумина человека. В некоторых вариантах реализации изобретения партнер по слиянию представляет собой модифицированный альбумин человека. В некоторых вариантах реализации изобретения партнер по слиянию представляет собой фрагмент альбумина человека.
В некоторых вариантах реализации изобретения домен МТИ представляет собой МТИ человека (чМТИ). В некоторых вариантах реализации изобретения домен МТИ представляет собой аналог чМТИ. В некоторых вариантах реализации изобретения домен МТИ представляет собой фрагмент чМТИ. В некоторых вариантах реализации изобретения химерный белок МТИ содержит домен чМТИ дикого типа. В некоторых вариантах реализации изобретения химерный белок МТИ содержит домен МТИ дикого типа человека и домен Fc человека. В некоторых вариантах реализации изобретения химерный белок МТИ содержит домен чМТИ дикого типа и линкерный домен, а также домен Fc человека.
В некоторых вариантах реализации изобретения химерный белок МТИ содержит домен МТИ дикого типа человека и альбумин человека или его аналог или его фрагмент. В некоторых вариантах реализации изобретения химерный белок МТИ содержит домен чМТИ дикого типа, линкерный домен и альбумин человека или его аналог или его фрагмент.
В некоторых вариантах реализации изобретения домен Fc связывается с рецептором Fc на клетке человека. В некоторых вариантах реализации изобретения период полувыведения молекулы в сыворотке является значительно больше, чем период полувыведения домена МТИ в одиночку. В некоторых вариантах реализации изобретения ингибирующая протеазу активность домена МТИ молекулы является такой же или большей, чем домена МТИ в одиночку. В некоторых вариантах реализации изобретения введение молекулы мыши уменьшает воспалительные реакции, включая, но не ограничиваясь, снижение активации иммунных клеток или уменьшение производства, секреции или активности цитокинов или хемокинов.
Подразумевается, что домен МТИ может быть функционально связан с партнером по слиянию с помощью линкерного домена.
Настоящее изобретение относится к химерному белку МТИ, содержащему домен МТИ, слитый с полипептидом, выбранным из группы, состоящей из: а) домена Fc, б) аналога домена Fc и в) фрагмента домена Fc, в котором домен МТИ слит с доменом Fc, его аналогом или его фрагментом с помощью линкерного домена. Настоящее изобретение относится к химерному белку МТИ, содержащему домен чМТИ, слитый с полипептидом, выбранным из группы, состоящей из а) домена Fc, б) аналога домена Fc и в) фрагмента домена Fc, в котором домен чМТИ слит с доменом Fc, его аналогом или его фрагментом с помощью линкерного домена.
Настоящие химерные белки включают белки, имеющие мономерные и мультимерные формы, будь то полученные с помощью гидролизата интактного антитела или полученные другими способами.
Термины мультимер и мультимерный относятся к белкам, в которых домены Fc или молекулы, содержащие домены Fc, имеют две или более полипептидные цепи, связанные ковалентно, нековалентно или имеющие как ковалентные, так и нековалентные взаимодействия. Термин мультимер включает термин димер.
Термин димер относится к белкам, в которых домены Fc или молекулы, содержащие домены Fc, имеют две полипептидные цепи, связанные ковалентно, нековалентно или имеющих как ковалентные, так и нековалентные взаимодействия. Т.е. термин димер относится к химерным белкам МТИ, в которых два домена Fc являются связанными ковалентно, нековалентно или имеющими как ковалентные, так и нековалентные взаимодействия. Более конкретно, термин димер относится к химерным белкам МТИ, в которых два домена Fc являются связанными ковалентно.
Настоящее изобретение относится к химерному белку МТИ, содержащему домен МТИ, слитый с полипептидом, выбранным из группы, состоящей из: а) альбумина, б) аналогов альбумина, в) фрагментов альбумина. Настоящее изобретение также относится к химерному белку МТИ, содержащему домен чМТИ, слитый с полипептидом, выбранным из группы, состоящей из: а) альбумина человека, б) аналогов альбумина, в) фрагментов альбумина человека, причем чМТИ является слитым с альбумином, его аналогом или его фрагментом с помощью линкерного домена.
Определение терминов
Термины, применяемые в данном описании и формуле изобретения, определены, как изложено ниже, если не указано иное.
В данном контексте термины связанный, химерный или слияние используются как взаимозаменяемые.
Эти термины относятся к соединению вместе более двух элементов или компонентов или доменов любыми средствами, в том числе химической конъюгацией или средствами на основе рекомбинации. Способы химической конъюгации известны в данной области техники.
Химерный белок относится к полипептиду, имеющему две или более ковалентно связанные друг с другом части, где одна или более частей являются полученными из различных белков. Эти две части могут быть соединены непосредственно с помощью одной пептидной связи (например, участки, связанные непосредственно друг с другом), либо через пептидный линкер, содержащий один или более аминокислотных остатков (например, с промежуточной аминокислотой или аминокислотной последовательностью между частями). Как правило, ДНК, кодирующая две части, и линкер будут в рамке считывания
- 3 037256 друг с другом и получены с применением рекомбинантных технологий.
Домен МТИ представляет собой белок или пептид, который имитирует активность МТИ. Подразумевается, что домен МТИ по настоящему изобретению может быть изменен таким образом, что они будут иметь последовательности, отличные от встречающихся в природе или нативных последовательностей, из которых они были получены, сохраняя при этом желаемую активность нативной последовательности. Предпочтительнее, чтобы домен МТИ представлял собой нативный человеческий МТИ (чМТИ), его аналоги и варианты. Варианты чМТИ включают замены или модификации одной или нескольких аминокислот нативного чМТИ, которые не являются необходимой структурной особенностью или обеспечивают функциональную активность, в том числе консервативные замены. Варианты чМТИ включают удаление или вставку одной или нескольких аминокислот в нативном чМТИ, которые не являются необходимой структурной особенностью или обеспечивают функциональную активность. Варианты чМТИ включают замены или модификации одной или нескольких аминокислот нативного чМТИ с целью изменить одно или более свойств или активностей. Варианты чМТИ включают удаление или вставку одной или нескольких аминокислот в нативном чМТИ с целью изменить одно или более свойств или активностей МТИ. Варианты чМТИ включают удаление или изменение сайтов гликозилирования в нативном человеческом UTI. Варианты чМТИ включают удаление или изменение одного или более доменов Кунитца. Варианты чМТИ могут быть введены с помощью стандартных методик, таких как сайтнаправленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Последовательность аминокислотных остатков рекомбинантного домена чМТИ изложена в SEQ ID NO: 31. Как правило, домен МТИ содержит последовательность, по меньшей мере на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную рекомбинантному домену чМТИ, изложенному в SEQ ID NO: 31.
Домен Fc представляет собой полипептид, содержащий константную область антитела, за исключением первой константной области домена иммуноглобулина и, в некоторых случаях, части или всех шарниров. Таким образом, домен Fc относится к неантигенной части связывания антитела, будь то в мономерной или мультимерной форме. Антитело, из которого происходит домен Fc, является предпочтительно человеческого происхождения и может быть любым из иммуноглобулинов, хотя IgG1 и IgG2 являются предпочтительными.
Домен Fc содержит шарнирную область тяжелой цепи. Под термином шарнир, или шарнирная область, или шарнирная область антитела, или шарнирная область иммуноглобулина в данном описании подразумевается гибкий полипептид, содержащий аминокислоты, между первым и вторым константными доменами антитела, непосредственно выше места расщепления папаином. Соответственно, для IgG Fc-домен содержит домены CH2 и CH3 иммуноглобулина и шарнирную область между CH1 и CH2. Несмотря на то что границы фрагмента Fc могут варьировать, фрагмент Fc тяжелой цепи IgG человека обычно определяется как такой, который содержит остатки C226 или P230 с его карбоксильного конца, причем нумерация произведена согласно индексу EU и в Kabat. В некоторых вариантах реализации изобретения, как более подробно описано ниже, аминокислотные модификации выполнены в домене Fc, например, для изменения связывания с одним или более рецепторами FcyR или с рецептором FcRn. Соответственно, в некоторых вариантах реализации изобретения термин домен Fc содержит шарнирную область, которая может быть укороченной, модифицированной путем замены, делеции и/или вставки и дополнительно модифицированная или немодифицированная шарнирная область может быть местом прикрепления линкерного домена.
Аналог домена Fc относится к молекуле или последовательности, которая модифицирована из нативного Fc, но по-прежнему содержит сайт связывания рецептора реутилизации. Термин аналог домена Fc включает молекулу или последовательность, которая является гуманизированной из нативного не человеческого Fc. Термин аналог домена Fc также включает молекулу или последовательность, в которой отсутствует или есть модификации одного или более нативных остатков Fc, которые влияют или участвуют в формировании дисульфида, несовместимости с клеткой-хозяином, N-концевой гетерогенности при экспрессии, стабильности, гликозилировании, взаимодействии с комплементом, связывании с рецептором реутилизации Fc и/или взаимодействии с рецептором Fcy.
Термины фрагменты домена Fc или фрагмент домена Fc относятся к нативному Fc, из которого один или более сайтов были удалены там, где удаленный сайт(ы) не образует структурные особенности или функциональную активность, которая является необходимой для химерных белков по настоящему изобретению. Фрагменты домена Fc содержат удаление остатков из нативного Fc или укорочение нативного Fc и могут содержать замены остальных остатков. Вставленные или измененные остатки (например, замещенные остатки) могут быть природными аминокислотами или измененными аминокислотами, пептидомиметиками, неприродными аминокислотами или D-аминокислотами.
Как правило, домен Fc содержит последовательность, по меньшей мере на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE или IgM, в частности IgG1 или IgG2 человека.
Термин домен Fc охватывает нативный Fc и аналоги Fc и включает мономерные и мультимерные формы, будь то полученные с помощью гидролизата интактного антитела или полученные другими спо
- 4 037256 собами.
В некоторых вариантах реализации изобретения домен Fc содержит, по меньшей мере, шарнирный домен (верхнюю, среднюю и/или нижнюю шарнирную область), домен CH2 (или его вариант или его фрагмент) и домен CH3 (или его вариант или его фрагмент). В другом варианте реализации изобретения домен Fc состоит из шарнирного домена (верхней, средней и/или нижней шарнирной области), домена CH2 (или его варианта или его фрагмента) и домена CH3 (или его варианта или его фрагмента). В некоторых других вариантах реализации изобретения домен Fc состоит из шарнирного домена (верхней, средней и/или нижней шарнирной области), домена CH2 (или его варианта или его фрагмента), домена CH3 (или его варианта или его фрагмента) и домена CH4 (или его варианта или его фрагмента). В другом варианте реализации изобретения домен Fc состоит из шарнирного домена (верхней, средней и/или нижней шарнирной области) и домена CH2. В другом варианте реализации изобретения домен Fc состоит из шарнирного домена (верхней, средней и/или нижней шарнирной области) и домена CH3 (или его варианта или его фрагмента). В другом варианте реализации изобретения домен Fc состоит из домена CH2 (или его варианта или его фрагмента) и домена CH3 (или его варианта или его фрагмента). В другом варианте реализации изобретения домен Fc состоит из полного домена CH2 и полного домена CH3. В другом варианте реализации изобретения домен Fc состоит из полного домена CH2 и полного домена CH3. В одном варианте реализации изобретения домен Fc изобретения содержит по меньшей мере часть молекулы Fc, известной в данной области техники, которая является необходимой для связывания FcRn. В другом варианте реализации изобретения домен Fc по изобретению содержит по меньшей мере часть молекулы Fc, известной в данной области техники, которая является необходимой для связывания Белка A. В другом варианте реализации изобретения домен Fc по изобретению содержит по меньшей мере часть молекулы Fc, известной в данной области техники, которая является необходимой для связывания Белка G.
Согласно данному изобретению домен Fc, как правило, относится к полипептиду, содержащему весь домен или часть домена Fc тяжелой цепи иммуноглобулина. Как было рассмотрено выше, это включает, но без ограничений, полипептиды, содержащие всю шарнирную область, домены CH1, CH2 и/или CH3, а также фрагменты таких пептидов, содержащих, например, шарнир, домены CH2 и CH3. Домен Fc может быть получен из любого иммуноглобулина любого вида и/или подтипа, в том числе, но не ограничиваясь, человеческого IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE или IgM антитела. Домен Fc содержит последние две константные области доменов иммуноглобулина IgA, IgD и IgG, последние три константные области доменов иммуноглобулина IgE и IgM и гибкий шарнир, N-концевой по отношению к этим доменам. Для IgA и IgM Fc может содержать цепь J.
Домен Fc в данном контексте охватывает нативный Fc и молекулы варианта Fc. Как и в случае вариантов Fc и нативных белков Fc, термин домен Fc включает молекулы в мономерной и мультимерной форме, будь то расщепленные из антитела или полученные другими способами.
Как указано в данном описании, следует понимать, что любой домен Fc может быть модифицирован таким образом, что он может отличаться в аминокислотной последовательности от нативного домена Fc встречающейся в природе молекулы иммуноглобулина. В некоторых примерных вариантах реализации изобретения домен Fc сохраняет эффекторную функцию, например связывание FcyR. В некоторых примерных вариантах реализации изобретения домен Fc утрачивает эффекторную функцию, например, связывание FcyR.
Домен Fc по изобретению может быть получен из различных молекул иммуноглобулинов. Например, домен Fc может содержать домен CH2 и/или CH3, полученный из IgG1, и шарнирную область, полученную из IgG3.
В некоторых вариантах реализации химерные белки МТИ содержат домен Fc. Домены Fc, пригодные для получения химерных белков МТИ по настоящему изобретению, могут быть получены из нескольких различных источников. В предпочтительных вариантах реализации изобретения домен Fc химерных белков МТИ происходит от человеческого иммуноглобулина. Однако предполагается, что домен Fc может быть получен из иммуноглобулина другого вида млекопитающих, в том числе, например, грызунов (например, мыши, крысы, кролика, морской свинки) или нечеловекообразных видов приматов (например, шимпанзе, макаки). Кроме того, домен Fc химерных белков МТИ или его часть может быть получена из любого класса иммуноглобулина.
Термины дикий тип или дт или нативный в данном контексте означают аминокислотную последовательность или нуклеотидную последовательность, которая встречается в природе, включая аллельные варианты. Белок дикого типа, полипептид, антитело, иммуноглобулин, IgG, полинуклеотид, ДНК, РНК и т.п. имеют аминокислотную последовательность или нуклеотидную последовательность, которая не была намеренно модифицированной.
В некоторых вариантах реализации изобретения химерные белки МТИ по настоящему изобретению могут использовать линкерный домен. Линкерный домен используется с целью оперативного соединения домена МТИ с партнером по слиянию. Термин линкерный домен относится к полипептидным линкерам, непептидным линкерам и их комбинациям. В частности, линкерный домен может представлять собой полипептид. В данном контексте термин линкерный домен относится к последовательности, кото
- 5 037256 рая соединяет два домена в линейной последовательности. В данном контексте термин полипептидный линкер относится к последовательности пептида или полипептида (например, синтетического пептида или последовательности полипептида), которая соединяет два домена в линейной последовательности аминокислот полипептидной цепи. Например, полипептидные линкеры могут быть использованы для соединения домена МТИ с доменом Fc. Предпочтительно, такие полипептидные линкеры могут обеспечить гибкость молекулы полипептида. Химерный белок МТИ по настоящему изобретению может содержать линкерный домен, в том числе и пептидный линкер.
Например, линкерный домен может быть использован для соединения двух доменов в линейной аминокислотной последовательности полипептидного линкера, такой как связывающий домен МТИ с доменом Fc. В некоторых вариантах реализации изобретения линкерный домен может быть использован для соединения домена МТИ с доменом Fc. Линкерный домен может быть использован для соединения доменов в любом порядке. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения линкер соединит домен МТИ и домен Fc в порядке МТИ-линкер-Fc, в то время как в других вариантах реализации изобретения линкер соединит домен МТИ и домен Fc в порядке Fc-линкер-МТИ, где полипептидные области обозначены от N-конца к C-концу. Примерные полипептидные линкеры включают те, которые состоят из остатков глицина и серина, так называемые Gly-Ser полипептидные линкеры. В данном контексте термин Gly-Ser полипептидные линкеры относится к пептиду, который состоит из остатков глицина и серина. Примерный Gly-Ser полипептидный линкер содержит аминокислотную последовательность Ser(Gly4Ser)n, где n равен целому числу от 1 до 10, SEQ ID NO: 33-42 соответственно. В одном варианте реализации изобретения химерный белок МТИ содержит один или два Gly-Ser полипептидный(х) линкер(а), в котором n=1. В одном варианте реализации изобретения химерный белок МТИ содержит один или два GlySer полипептидный(х) линкер(а), в котором n=2. В одном варианте реализации изобретения химерный белок МТИ содержит один или два Gly-Ser полипептидный(х) линкер(а), в котором n=3. В одном варианте реализации изобретения химерный белок МТИ содержит один или два Gly-Ser полипептидный(х) линкер(а), в котором n=4. В одном варианте реализации изобретения химерный белок МТИ содержит один или два Gly-Ser полипептидный(х) линкер(а), в котором n=5. В одном варианте реализации изобретения химерный белок МТИ содержит один или два Gly-Ser полипептидный(х) линкер(а), в котором n=6. В одном варианте реализации изобретения химерный белок МТИ содержит один или два Gly-Ser полипептидный(х) линкер(а), в котором n=7. В одном варианте реализации изобретения химерный белок МТИ содержит один или два Gly-Ser полипептидный(х) линкер(а), в котором n=8. В одном варианте реализации изобретения химерный белок МТИ содержит один или два Gly-Ser полипептидный(х) линкер(а), в котором n=9. В одном варианте реализации изобретения химерный белок МТИ содержит один или два Gly-Ser полипептидный(х) линкер(а), в котором n=10.
Другой примерный линкер приведен в SEQ ID NO: 43.
Термин содержащий означает, что соединение, т.е. химерный белок, может содержать дополнительные аминокислоты на одном или обоих N- или C-концах.
Конечно, эти дополнительные аминокислоты не должны оказывать существенного влияния на активность соединения, то есть химерного белка.
Термин аминокислота относится к встречающимся в природе и синтетическим аминокислотам, а также аналогам аминокислот и миметиков аминокислот, которые функционируют в некоторой степени аналогично встречающимся в природе аминокислотам. Встречающиеся в природе аминокислоты представляют собой те аминокислоты, которые кодируются генетическим кодом, а также кодируемые аминокислоты, которые впоследствии модифицированы, например, гидроксипролин и фосфосерин. Аминокислотные аналоги относятся к соединению, т.е. химерным белкам, которые имеют такую же основную химическую структуру, как и встречающиеся в природе аминокислоты, т.е. атом углерода, связанный с атомом водорода, карбоксильной группой, аминогруппой и R-группой. Аминокислотные аналоги имеют модифицированные R-группы или служат основой модифицированным пептидным каркасам, но сохраняют ту же основную химическую структуру, что и встречающиеся в природе аминокислоты.
Термин аминокислотная замена означает замену по меньшей мере одного существующего аминокислотного остатка в предварительно определенной или нативной аминокислотной последовательности другой замещенной аминокислотой.
Термин вставка аминокислоты относится к вставке одной или более дополнительных аминокислот в предварительно определенную или нативную аминокислотную последовательность. Вставка может состоять из одного, двух, трех, четырех, пяти или до двадцати аминокислотных остатков.
Термин делеция аминокислоты относится к удалению по меньшей мере одной аминокислоты из предварительно определенной или нативной аминокислотной последовательности. Делеция может состоять из одного, двух, трех, четырех, пяти или до двадцати аминокислотных остатков.
Термины полипептид, пептид и белок используются равноправно в данном документе и относятся к полимеру аминокислотных остатков. Термины применимы к аминокислотным полимерам, в которых одна или более аминокислота не является природной аминокислотой, синтетической аминокислотой или миметиком аминокислоты.
Термин нуклеиновая кислота относится к дезоксирибонуклеотиду или рибонуклеотиду и их по
- 6 037256 лимерам в любой одноцепочечной или двухцепочечной форме. Термин нуклеиновая кислота используется взаимозаменяемо в отношении гена, нуклеотида, полинуклеотида, кДНК, ДНК и мРНК. Не считая специальные ограничения, термин охватывает нуклеиновые кислоты, содержащие известные аналоги природных нуклеотидов, которые имеют схожие связующие способности, как и натуральная аминокислота. Не считая специальные ограничения, конкретная нуклеотидная последовательность также охватывает ее консервативно модифицированные варианты (например, те, которые содержат замены вырожденных кодонов) и комплементарные последовательности, также как и явно указанную последовательность.
Полинуклеотиды по настоящему изобретению могут состоять из любого полирибонуклеотида или полидезоксирибонуклеотида, которые могут быть немодифицированной РНК или ДНК или модифицированной РНК или ДНК. Например, полинуклеотиды могут состоять из одно- или двухцепочечных областей, смешанных одно- или двухцепочечных областей. Кроме того, полинуклеотиды могут быть трехцепочечными областями, содержащими РНК или ДНК, или как РНК, так и ДНК. Модифицированные полинуклеотиды включают модифицированные основания, такие как тритилированные основания или необычные основания, такие как инозин. Различные модификации могут быть сделаны в РНК и ДНК, таким образом, полинуклеотид включает химически, ферментативно или метаболически модифицированные формы. Термин производный или производное относится к соединению, т.е. химерному белку, которое имеют циклическую часть, например, сшитое между цистеиниловых остатков, соединению, т.е. химерному белку, являющемуся сшитым, одна или более пептидильных связей заменяется непептидной связью, или N-конец заменяется на NRR,. NRC(O)R,. NRC(O)OR,. NHC(O)NHR,. NRS(O)2R2, сукцинамид или другую группу, где R и R1 являются определенными в данном документе, и/или C-конец заменяется на C(O)R3 или NR4R5, и соединению, т.е. химерному белку, в котором аминокислотные компоненты модифицируют путем обработки агентами, способными реагировать с выбранными боковыми цепями или концевыми остатками. R выбран из группы, состоящей из водорода и С1-6алкила, Ri выбран из группы, состоящей из водорода и С1-6алкила, R2 выбран из группы, состоящей из С1-6алкила, C38циклоалкила, и необязательно замещенного фенила; R3 выбран из группы, состоящей из водорода, C1-6 алкила и
С3-8циклоалкила; R4 выбран из группы, состоящей из водорода и С1-6алкила; R5 выбран из группы, состоящей из водорода, С1-6алкила и С3-8циклоалкила; или R4 и R5 взятые вместе с азотом, к которому они присоединены, образуют 4-7-членное насыщенное кольцо, необязательно содержащее 1 дополнительный кольцевой гетероатом, выбранный из группы, включающей N, О и S.
Термин С1-6алкил относится к прямой или разветвленной алкильной цепи от одного до шести атомов углерода.
Термин С3-8циклоалкил относится к моноциклическому или бициклическому, насыщенному или частично (но не полностью) ненасыщенному алкильному кольцу от трех до восьми атомов углерода, и включает циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и тому подобное. Подразумевается, что термин включает бензоконденсированный циклопентил и циклогексил.
Термин необязательно замещенный фенил относится к фенильной группе, необязательно замещенной 1-3 заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из гало, С1-6алкила, С1-6алкокси, циано и трифторметила.
Получение.
Соединения, т.е. химерные белки, по данному изобретению могут быть получены стандартными методами синтеза, технологиями рекомбинантной ДНК или другими способами получения пептидов и химерных белков. В примерном процессе домен чМТИ ковалентно связан с доменом Fc путем экспрессии конструкта ДНК, кодирующего домен МТИ и домен Fc и любой линкерный домен.
Предусмотрены альтернативные способы конструирования химерного белка МТИ. В некоторых вариантах реализации изобретения ориентация домена может быть изменена для конструирования молекулы Fc-МТИ или молекулы МТИ-Fc, или молекулы МТИ-Бс-МТИ, которая сохраняет связывание с FcRn и имеет активный домен МТИ. В некоторых вариантах реализации изобретения химерные белки МТИ содержат домен дикого типа Fc, который может допустить прохождение химерным белком эндоцитоза после связывания с FcRn (неонатальный рецептор Fc). Таким образом, настоящее изобретение также относится к способам получения описанных химерных белков МТИ. Эти способы охватывают культивирование клетки-хозяина, содержащей выделенную нуклеиновую кислоту(ы), кодирующую химерные белки МТИ по изобретению. Как будет понятно специалистам в данной области техники, это может быть осуществлено различными способами в зависимости от природы химерного белка МТИ. В некоторых вариантах реализации химерный белок МТИ по изобретению производится и может быть выделен.
В общем, предоставлены нуклеиновые кислоты, которые кодируют химерный белок МТИ по изобретению. Такие полинуклеотиды кодируют для домена МТИ, партнера по слиянию и любого линкерного домена. Настоящее изобретение также охватывает олигонуклеотидные фрагменты, полученные из описанных полинуклеотидов и последовательностей нуклеиновых кислот, комплементарных этим полинуклеотидам. Полинуклеотиды могут быть в виде РНК или ДНК. Полинуклеотиды в виде ДНК, кДНК, геномной ДНК, аналогов нуклеиновых кислот и синтетических ДНК находятся в пределах настоящего изобретения. ДНК может быть двухцепочечной или одноцепочечной, и в случае одноцепочечной, может
- 7 037256 быть кодирующей (смысловой) цепью или некодирующей (антисмысловой) цепью. Кодирующая последовательность, которая кодирует полипептид, может быть идентична кодирующей последовательности, представленной в данном документе, или может иметь место другая кодирующая последовательность, которая в результате избыточности или дегенерации генетического кода кодирует те же полипептиды, что и ДНК, предоставленная в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота(ы), кодирующая химерные белки МТИ по изобретению, содержится в экспрессирующих векторах, которые могут быть внехромосомными или предназначены для интеграции в геном клетки-хозяина, в которую он введен. Экспрессирующие векторы могут содержать любое количество соответствующих регуляторных последовательностей (в том числе, но без ограничений, транскрипционные и трансляционные управляющие последовательности, промоторы, сайты связывания рибосом, энхансеры, сайты инициации репликации и т.д.) или другие компоненты (гены селекции и т.д.), каждый из которых является функционально связанным, как хорошо известно в данной области техники. В некоторых случаях используются две нуклеиновые кислоты, и каждая помещается в разный экспрессионный вектор (например, тяжелая цепь в первый экспрессионный вектор, легкая цепь во второй экспрессионный вектор) или в качестве альтернативы они могут быть помещены в один и тот же экспрессионный вектор. Специалистам в данной области техники буде понятно, что конструкция экспрессионного вектора(ов), включая выбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина, уровень экспрессии желаемого белка и т.д. В общем, нуклеиновые кислоты и/или экспрессии могут быть введены в подходящую клетку-хозяин для создания рекомбинантной клетки-хозяина с помощью любого способа, подходящего для клетки-хозяина, выбранного (например, трансформации, трансфекции, электропорации, инфицирования) таким образом, что молекула(ы) нуклеиновой кислоты функционально связаны с одним или более элементами, контролирующими экспрессию (например, в векторе, в конструкте, созданном с помощью процессов в клетке, интегрированных в геном клеткихозяина). Полученная рекомбинантная клетка-хозяин может поддерживаться в условиях, подходящих для экспрессии (например, в присутствии индуктора, в подходящем, не являющимся человеком животном, в соответствующей культуральной среде с соответствующими солями, факторами роста, антибиотиками, пищевыми добавками и т.д.), в результате чего производятся кодируемый(е) полипептид(ы). В некоторых случаях тяжелые цепи производятся в одной клетке, а легкие цепи в другой.
Доступные в качестве хозяев клеточные линии млекопитающих известны в данной области техники и включают многие иммортализованные линии клеток, доступные от Американской коллекции типовых культур (ATCC), Манассас Виргиния, включая, но не ограничиваясь ими, клетки яичника китайского хомяка (CHO), клетки HEK 293, клетки NSO, клетки HeLa, клетки почки новорожденного хомяка (BHK), клетки почки обезьяны (COS), клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Hep G2) и большое количество других клеточных линий. Клетки, не относящиеся к млекопитающим, включают, но без ограничений, бактериальные, дрожжевые, клетки насекомых, растений и также могут быть использованы для экспрессии рекомбинантных антител. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела могут быть получены в трансгенных животных, таких как коровы или куры.
В варианте реализации химерные белки по изобретению кодируются нуклеотидной последовательностью. Нуклеотидные последовательности по изобретению могут быть полезны для ряда применений, в том числе: клонирования, генной терапии, экспрессии и очистки белка, внесения мутации, ДНКвакцинации хозяина, нуждающегося в этом, генерации антител для, например пассивной иммунизации, ПНР, генерации праймеров и зондов, конструирования и генерации миРНК и тому подобного. В варианте реализации нуклеотидная последовательность изобретения содержит, состоит или по существу состоит из нуклеиновой последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 или 32.
В варианте реализации изобретения нуклеотидная последовательность включает нуклеотидную последовательность по меньшей мере на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную нуклеотидной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 или 32. В варианте реализации изобретения нуклеотидная последовательность включает непрерывную нуклеотидную последовательность по меньшей мере на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную непрерывной нуклеотидной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 или 32.
Предпочтительные химерные белки МТИ по данному изобретению содержат последовательность (например, по меньшей мере один домен Fc), полученную из последовательности иммуноглобулина человека. Однако последовательности могут содержать одну или более последовательностей из других видов млекопитающих. Например, домен Fc примата или домен нуклеазы могут быть включены в последовательность субъекта. В альтернативном варианте одна или более мышиных аминокислот могут присутствовать в полипептиде. В некоторых вариантах реализации полипептидные последовательности изобретения не являются иммуногенными и/или имеющими пониженную иммуногенность. Химерные белки МТИ по изобретению могут содержать консервативные аминокислотные замены в одном или более аминокислотных остатках, например, в незаменимых или заменимых аминокислотных остатках. Консервативная аминокислотная замена представляет собой замену, при которой аминокислотный остаток заме
- 8 037256 щается аминокислотным остатком с аналогичной боковой цепью. В данной области техники определены семейства аминокислотных остатков с аналогичными боковыми цепями, включая основные боковые цепи (например, лизин, аргинин, гистидин), кислые боковые цепи (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), полярные незаряженные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), β-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Следовательно, остаток заменимой аминокислоты в связывающем полипептиде предпочтительно замещается другим аминокислотным остатком с боковой цепью того же семейства. В другом варианте реализации изобретения цепочка аминокислот может быть замещена структурно аналогичной цепочкой, отличающейся порядком и/или составом представителей одного семейства боковых цепей. В качестве альтернативы, в другом варианте реализации изобретения мутации могут быть введены случайным образом вдоль всей кодирующей последовательности или ее части, например, путем насыщающего мутагенеза, и полученные таким образом мутанты могут быть введены в связывающие полипептиды изобретения и скринированы на их способность связываться с желаемой целью.
Применение.
В одном варианте реализации настоящее изобретение предлагает способы диагностики и лечения состояний, связанных с МТИ. Используемые в данном контексте термины состояние, расстройство и заболевание относятся к любому нездоровому или ненормальному состоянию. Термин связанные с МТИ состояния включает условия, расстройства и заболевания, в которых МТИ обеспечивает терапевтический эффект. Термин связанные с МТИ состояния включает условия, характеризующиеся иммуномодулирующим или воспалительным действием. В частности, термин связанные с МТИ состояния включает панкреатит, включая острый панкреатит и хронический панкреатит, синдром системного воспалительного ответа, острую недостаточность кровообращения (например, вызванную шоком), диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови и синдром полиорганной недостаточности. Термин связанные с МТИ состояния включает применение для пациентов, нуждающихся в хирургической помощи с высоким риском. Термин связанные с МТИ состояния включает инфекции легких, печени, сердца или почек. Термин связанные с МТИ состояния также включает тяжелый сепсис. Термин связанные с МТИ состояния также включает острое повреждение легких (ОПЛ), вызванное вирусами атипичной пневмонии или острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС).
В одном варианте реализации изобретение предлагает способы лечения состояний, связанных с МТИ, включающие введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества, например, фармацевтически эффективного количества, раскрытого химерного белка МТИ. В некоторых вариантах реализации изобретения состояние особо упоминается в настоящем документе.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению получены способом, хорошо известным в данной фармацевтической области техники, и содержат по меньшей мере один химерный белок МТИ согласно изобретению в качестве активного компонента. Фармацевтическую композицию химерных белков МТИ, применяемых в соответствии с настоящим изобретением, получают путем смешивания химерного белка МТИ, имеющего желаемую степень чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами. Термин фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество относится к тем веществам, которые, как правило, используются в приготовлении фармацевтических композиций и должны быть фармацевтически чистыми и нетоксичными в используемых количествах. Как правило, они представляют собой твердый, полутвердый или жидкий материал, который в совокупности может служить в качестве наполнителя или среды для активного ингредиента. Некоторые примеры фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ можно найти в Remington's Pharmaceutical Sciences and the Handbook of Pharmaceutical Excipients, включая разбавители, наполнители, носители, матрицы с замедленным высвобождением, стабилизирующие агенты, консерванты, растворители, суспендирующие агенты, буферы, эмульгаторы, красители, пропелленты, покрывающие агенты и другие. В общем, для инъекции или внутривенного введения химерные белки МТИ по настоящему изобретению находятся в виде лиофилизированных составов или водных растворов.
Фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества являются нетоксичными для субъектов в используемых количествах и включают буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония, хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); полипептиды с низкой молекулярной массой (приблизительно менее 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например,
- 9 037256 комплексы Zn-белка); и/или неионные поверхностно-активные вещества, например TWEEN™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (ПЭГ). Фармацевтические композиции, описанные в данном документе, также могут содержать более одного активного соединения, т.е. химерного белка, требуемого при конкретном показании, подлежащем лечению, предпочтительно с дополняющими видами активности, которые не оказывают негативного влияния друг на друга. Такие молекулы присутствуют в надлежащей комбинации в количествах, которые эффективны для использования по назначению.
Фармацевтические композиции, которые будут использоваться для введения in vivo, должны быть стерильными или почти стерильными. Это легко достигается путем фильтрации через мембраны для стерильной фильтрации.
Химерные белки МТИ по изобретению вводятся субъекту в соответствии с известными способами, такими как внутривенное введение в виде болюса или путем непрерывной инфузии в течение определенного периода времени, внутримышечной, внутрибрюшинной, внутрицереброспинальной, подкожной, внутрисиновиальной, внутрисуставной или интратекальной инъекцией или инфузией или посредством местных или ингаляционных путей введения. Внутривенное или подкожное введение химерного белка МТИ является предпочтительным.
Термины лечить, лечение и воздействие включают улучшение условий, описанных в данном документе. Термины лечить, лечение и воздействие включают все процессы, обеспечивающие замедление, прерывание, задержку, контролирование или прекращение состояния, или прогрессирование условий, описанных в данном документе, но не обязательно указывает на полное устранение всех симптомов или излечение данного состояния. В данном контексте термины лечить, лечение и воздействие предполагают включение терапевтического лечения таких расстройств. В данном контексте термины лечить, лечение и воздействие предполагают включение профилактического лечения таких расстройств.
В данном контексте, термины пациент и субъект включают людей и животных, не являющихся человеком, например млекопитающих, таких как мыши, крысы, морские свинки, собаки, кошки, кролики, коровы, лошади, овцы, козы и свиньи. Данный термин также включает птиц, рыб, рептилий, амфибий и подобных. Понятно, что более конкретный пациент представляет собой человека. Кроме того, более конкретные пациенты и субъекты представляют собой не относящихся к человеку млекопитающих, таких как мыши, крысы и собаки.
Используемый в данном описании термин эффективное количество относится к количеству соединения, т.е. химерного белка по изобретению, который при однократном или многократном введении дозы лечит пациента, страдающего от указанного состояния. Эффективное количество может быть легко определено практикующим диагностом в виде медицинского специалиста, такого как врач или ветеринар, специалистом в данной области техники, с применением известных методов и путем наблюдения результатов, полученных в аналогичных обстоятельствах. Например, медицинский специалист может начать с доз лекарственного средства, используемого в фармацевтической композиции, уровень которых ниже, чем требуется для достижения желательного терапевтического эффекта, и постепенно увеличивать дозу до достижения желательного эффекта.
При определении эффективного количества дозы практикующим диагностом рассматривается ряд факторов, в том числе, но без ограничений: вид больного; его размер, возраст и общее состояние здоровья; конкретное состояние, расстройство или заболевание; степень или поражение или тяжесть состояния, расстройства или заболевания, реакцию отдельного пациента; конкретное вводимое соединение, т.е. химерный белок; способ введения; характеристики биодоступности вводимого лекарственного средства; выбранную схему приема; применение сопутствующих медикаментов; а также другие обстоятельства, имеющие значение. Конкретные количества могут быть определены специалистом в данной области. Несмотря на то что эти дозы основаны на среднем человеческим субъекте, имеющим массу от около 60 кг до около 70 кг, врач сможет определить соответствующую дозу для пациента (например, ребенка), где масса выходит за пределы этого диапазона веса.
Схемы дозирования подобраны для обеспечения желаемого ответа. Так, например, может быть введена одноразовая доза, в динамике могут быть введены несколько раздельных доз, или доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена, как указывается остротой терапевтической ситуации.
Парентеральные композиции могут быть сформулированы в разовой дозированной форме для простоты введения и однородности дозы. Разовая дозированная форма в данном контексте относится к физически дискретным единицам, пригодным в качестве однократных доз для субъектов, подлежащих лечению; каждая единица содержит определенное количество активного соединения, т.е. химерного белка, рассчитанное для обеспечения заданного терапевтического эффекта, в сочетании с заданным фармацевтическим носителем.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению предпочтительно формулируют в виде разовой дозированной формы, каждая доза, как правило, содержит от 0,5 мг до около 100 мг химерного белка МТИ по изобретению. Термин разовая дозированная форма относится к физически дискретной единице, содержащей определенное количество активного ингредиента в сочетании с подходящим фар- 10 037256 мацевтическим вспомогательным веществом, с помощью которого одна или более форма используется на протяжении всего режима дозирования для получения желаемого терапевтического эффекта. Одна или более разовая дозированная форма могут быть приняты, чтобы повлиять на дозировку лечения.
Примерный, не ограничивающий диапазон для эффективного количества химерного белка МТИ, используемого в настоящем изобретении, составляет около 0,1-100 мг/кг, например около 0,1-50 мг/кг, например около 0,1-20 мг/кг, например около 0,1-10 мг/кг, например около 0,5 мг/кг, например около 0,3 мг/кг, около 1 мг/кг или около 3 мг/кг. В другом варианте реализации изобретения химерный белок МТИ вводится в дозе 1 мг/кг или более, например в дозе от 1 до 20 мг/кг, например в дозе от 5 до 20 мг/кг, например в дозе 8 мг/кг. Примерный, не ограничивающий диапазон для эффективного количества химерного белка МТИ, используемого в настоящем изобретении, составляет около 1-500 мг/доза, например около 1-100 мг/доза, например около 1-50 мг/доза, например около 1-10 мг/доза, например около 1 мг/доза, или около 3 мг/доза, или около 5 мг/доза.
В одном варианте реализации изобретения химерный белок МТИ вводится путем инфузии каждые 3 дня или еженедельной дозой от 10 до 500 мг/дозу. Такое введение может быть повторено по мере необходимости для поддержания желаемого терапевтического эффекта.
В качестве неограничивающих примеров лечение в соответствии с настоящим изобретением может быть обеспечено дозировкой химерного белка МТИ в количестве около 0,1-100 мг/кг, например 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 мг/кг в день, по крайней мере один из дней; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 мг/кг, или в качестве альтернативы по меньшей мере один раз в неделю 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 мг/кг после начала лечения или в любой их комбинации. В качестве неограничивающих примеров лечение в соответствии с изобретением может быть обеспечено дозировкой химерного белка МТИ в количестве около 1-100 мг/доза, например 1, 5, 10, 20, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 150, 200, 250, 300, 350 или 400 мг/доза. По крайней мере один раз в день 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 мг/доза после начала лечения, или в любой их комбинации. По крайней мере в одной из недель 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 мг/доза после начала лечения или в любой их комбинации.
Химерные белки МТИ по изобретению находят применение в различных областях использования, включая лечение заболеваний, связанных с МТИ. Химерные белки МТИ по изобретению могут найти применение при лечении заболеваний с вовлечением иммунной системы, аутоиммунных заболеваний, воспалительных заболеваний, послеоперационных воспалительных реакций, ассоциированных с лизосомой заболеваний, заболеваний свертываемости крови, заболеваний, связанных с протеазами и в качестве вспомогательной терапии во время операции.
Химерные белки МТИ по изобретению могут найти применение при лечении панкреатита (включая индуцированный эндоскопией панкреатит и острый панкреатит), артрита, атипичной пневмонии, синдрома системного воспалительного ответа, острой недостаточности кровообращения, сепсиса, гепатита, аппендицита, колита, отказа органа, повреждения органа (в том числе поджелудочной железы, почек, легких), реперфузионного повреждения, синдрома Стивенса-Джонсона, токсического эпидермального некролиза, шока, ишемической травмы, острого повреждения легких (в том числе, вызванного острым расслоением аорты), астмы, воспаления легких, пневмонии (в том числе пневмонии, спровоцированной искусственной вентиляцией легких), диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС), острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС) и синдрома системного воспалительного ответа.
Химерные белки МТИ по настоящему изобретению могут найти применение при ингибировании протеаз, в том числе сериновых протеаз, в том числе трипсина, химотрипсина, тромбина, калликреина, плазмина, эластазы, катепсина, липазы, гиалуронидазы, факторов IXa, Xa, XIa и XIIa, и эластазы полиморфноядерных лейкоцитов. Химерные белки МТИ по настоящему изобретению могут найти применение в подавлении провоспалительных медиаторов, таких как цитокины, α-фактор некроза опухоли, интерлейкин-1, -1β, -4, -6 и -8, -10 и хемокины.
Химерные белки МТИ по настоящему изобретению могут найти применение в лечении рака, в том числе предотвращении инвазии опухоли и метастазировании, изменении темпов апоптоза, а также снижении потери функции почек при лечении цисплатином.
Химерные белки МТИ по настоящему изобретению могут найти применение для лечения СПИДа, в том числе и в качестве дополнительного лечения.
Примеры
Ниже приведены примеры конкретных вариантов реализации настоящего изобретения. Примеры представлены только с иллюстративными целями и никоим образом не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения. Были предприняты усилия, чтобы обеспечить точность в отношении используемых чисел (например, количества, температуры и т.д.), но, конечно, некоторые экспериментальные ошибки и отклонения должны допускаться. При практической реализации настоящего изобретения применяют, если не указано иное, традиционные методы химии белков, биохимии, технологии
- 11 037256 рекомбинантной ДНК и фармакологии, соответствующих данной области техники. Такие технологии подробно описаны в литературе. См., например, T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993 год); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Инк.); Sambrook, с соавт., Molecular Cloning: A Laboratory J\1anual (2-е изд., 1989 год); Methods In Enzymology (S. Colowlck and N. Kaplan ред., Academic Press, Инк.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18-е издание (Истон, Пенсильвания: Mack Publishing Company, 1990 год); Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3-е изд. (Plenum Press) Vols A and B (1992 год).
Пример 1. Конструирование векторов ДНК, кодирующих химерные белки МТИ. Методы осуществления молекулярной биологии известны в данной области техники и их можно найти, например, в Molecular Cloning: A laboratory Manual 4-е издание (Micheal Green and Joseph Sambrook, Cold Spring Harbor Press, 2012 год). Ген, кодирующий МТИ-FcI, был заказан с использованием сервиса генного синтеза GeneArt с оптимизированными кодонами из компании Лайф Технолоджис (Карлсбад, Калифорния). Последовательность белка, как указано в SEQ ID NO: 1 с сигнальным пептидом, MGWSCIILFLVATATGVHS, добавленным для секреции. Фиг. 1 иллюстрирует общие области МТИ, используемые в слиянии. Ген, кодирующий МТИ-FcI, лигировался в экспрессионный вектор млекопитающих. Экспрессионные векторы млекопитающих известны в данной области техники, включая векторы pSecTag2/Hygro A, pcDNA4 и pcDNA6 (Лайф Текнолоджис, Карлсбад, штат Калифорния). Вектор расщепляли ферментами рестрикции Hind III-HF и EcoRI от Нью Инглэнд Биолабс (NEB). Этот фрагмент лигировался в вектор экспрессии, который обеспечивает стойкость к карбенициллину, и был расщеплен теми же двумя ферментами рестрикции. Вектор: в лигировании было использовано молярное соотношение 1:3. Лигированная ДНК трансформировалась в 10-β химически компетентные клетки Е.coli из NEB, и высевалась на планшетах ЛБ-карбенициллин для роста в течение ночи. Колонии выращиваются в течение ночи на ЛБ с карбенициллином, и минипрепаративная ДНК получается с использованием набора Qiagen's QIAprep Spin Miniprep (Кайаген, Хильден, Германия). Затем ДНК секвенируется с использованием сервиса по секвенированию ДНК от Bio Applied Technologies Joint (BATJ, Сан-Диего). Колония с проверенной последовательностью проверялась, затем выращивались в ЛБ среде с карбенициллином для очистки ДНК с инструментом BenchPro 2100 и MaxiCard от Лайф Текнолоджис.
Пример 2. Конструирование векторов ДНК, кодирующих варианты химерных белков МТИ-Fc.
Список SEQ ID NO: 1-28 ДНК и белковых последовательностей некоторых химерных белков МТИFc. Такие химерные белки МТИ содержат модификации, которые изменяют изотип Ig, линкеры, домен МТИ, порядок домена МТИ и Fc (N- или C-концевой), виды МТИ, виды Fc, старт/стоп остатки МТИ, присоединение сахара, сайты чувствительности к протеазе и эффекторную функцию Fc. Некоторые белки МТИ-Fc изображены на фиг. 2 и 3. Химерные белки МТИ-Fc, содержащие три аминокислотные модификации в Ser (IgG1 Fc3Ser, O54S/P172S/P265S) содержат мутации, меняющие образование дисульфидной связи и функции FcyR.
Создание экспрессирующих конструкций МТИ-Fc.
Нуклеотидные последовательности МТИ (например, дикого типа, S10A и варианты K21S K22S) и человеческие домены Fc3Ser были кодон-оптимизированы для экспрессии клетками CHO и синтезированы с помощью Лайф Технолоджис (Карлсбад, Калифорния). Следующие конструкции были созданы в экспрессионном векторе CHO путем сборки доменов МТИ и Fc3Ser с помощью способа клонирования без лигазы и последовательности (sequence and ligation-independent cloning (SLIC)) (Li и Elledge 2007 год Nature Methods 4(3): ст. 251-256): МТИ-Fc3Ser, МТИ S10A-Fc3Ser, МТИ K21S K22S-Fc3Ser, МТИ m2Fc3Ser, МТИ L1-Fc3Ser, МТИ L2-Fc3Ser (фиг. 4А). Сборка ДНК на основе SLIC была осуществлена путем смешивания продуктов ПЦР линеаризованного вектора (30 нг), МТИ (100 нг) и Fc3Ser (100 нг) с соответствующими липкими последовательностями для гомологичной рекомбинации и T4 ДНКполимеразой (0,5 U) в объеме 5 мкл содержащий NEBuffer 2 и БСА (Нью Инглэнд Биолабс). После 30минутной инкубации при комнатной температуре, экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы T4 прекращалась добавлением 2 мМ дЦТФ. Затем была сделана гомологичная рекомбинация in vitro с помощью температурного перепада от 75 до 37°С в течение 30 мин. Реакционная смесь, содержащая собранную ДНК, была химически преобразована в TOP10 Е.coli (Инвитроген) и высеяна на ЛБ-агар, содержащий карбенициллин. Открытые рамки считывания для остальных конструкций (МТИ m1-Fc3Ser, МТИ d1-Fc3Ser, МТИ d2-Fc3Ser, МТИ L3-Fc3Ser, МТИ-Fc IgG2, Fc3Ser-МТИ и мышиных МТИ-мышь IgG1) были кодон-оптимизированы и синтезированы в виде химерных конструкций. Эти конструкции были клонированы в экспрессионном векторе с использованием метода SLIC, как описано выше (фиг. 4Б). Последовательности ДНК всех 13 конструкций в векторе были проверены секвенированием ДНК по Сэнгеру.
Пример 3. Экспрессия слияний МТИ-Fc в клетках CHO.
ДНК-вектор, кодирующий МТИ-FcI, стабильно трансфицировался в клетки CHO-S с использованием Инвитроген Freestyle MAX Reagent. Смешанные культуры высевались в Т-колбы и отбирались с использованием CD CHO, дополненных различными концентрациями метионин сульфоксимина (MSX) в диапазоне от 50-100 мкМ. После того как культуры были восстановлены после отбора, они были размножены для производства и криоконсервации. Многочисленные партии продукции были сделаны для
- 12 037256 поддержания тестирования in vitro и in vivo. Производственный процесс составляет 10-14 дней подпитываемой культуры с использованием CD FortiCHO, CD Efficient Feed B и CD Efficient Feed C от Инвитроген. Объемы производства варьировались от 1 до 3 л и культуры собирались центрифугированием при
3500 об/мин в течение 1-2 ч с последующей стерильной фильтрацией супернатанта и полученный клеточный супернатант использовался в очистке.
Пример 4. Очистка химерных белков МТИ-Fc.
Очистка 2 партий МТИ-FcI была сделана путем использования 2,3 л кондиционированной среды клеток CHO с экспрессированным МТИ-FcI с 30 мл мАт белка A выбранным 1х (ДжиИ Хэлскеа), уравновешенной в 25 мМ тринатрийцитрата pH 8,1, 125 мМ NaCl. Колонку промывали 2 объемами колонки (60 мл) 25 мМ тринатрийцитрата pH 8,1, 125 мМ NaCl, а затем 2 объемами колонки (60 мл) 25 мМ тринатрийцитрата pH 8,1, 2000 мМ NaCl. Затем колонка уравновешивалась 2 объемами колонки (60 мл) 25 мМ тринатрийцитрата pH 8,1, 125 мМ NaCl. МТИ-FcI элюировался 7 объемами колонки (210 мл) градиентом до 100% pH 25 мМ лимонной кислоты pH 2,9, 125 мМ NaCl. МТИ-FcI элюировался в виде двух пиков, широкого, фланкирующего пика при приблизительном pH 5,5 и более резкого пика при приблизительном pH 3,5. Затем концентрированный МТИ-Fc был заменен буфером в конечный буфер TBS, pH 7,4 (25 мМ Трис, 130 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, pH 7,4) с использованием концентрирующих центрифуг Амикон Ультра с 30K M.W.C.O. Очищенные выходы белка показаны в табл. 1, белок хранится при -80°C для дальнейшего использования.
Таблица 1
Название пика Объем пика (мл) Конечный продукт КОНЦ, (мг/мл) Конечный продукт Выход (мг) Колонка Белка А Выход (%) % от полной загрузки белка
Пик 1-й партии 40 10 110 59 52
Пик 2-й партии 40 И 150 72 68
Пример 5. Экспрессия и очистка дополнительных химерных белков МТИ-Fc. В день трансфекции CHO клетки были подсчитаны и высеяны с плотностью 2,2х10Л6 живых клеток/мл в 90% от общего объема - 900 мл и выращены во встряхиваемых колбах при температуре 33°C до трансфекции. Замороженная ДНК размораживалась и добавлялась к ПЭИ (Полиэтиленимин - катионный полимер) и АКТ. ДНК добавлялась на уровне 0,625 мкг/1 млн клеток. Для 1 л клеток необходимо 1,25 мг.
90% от общей добавленной ДНК представляет собой интересующую ДНК = 1,125 мг. Оставшиеся 10% составлял АКТ (кодирует антиапоптозный белок) = 0,125 мг. ПЭИ добавляется на уровне 2,5 мкг/1 миллион клеток. Для 1 л трансфекции это составляло 5 мг. Раствор ПЭИ добавляется к разбавленной ДНК и инкубируется при комнатной температуре в течение 15 мин перед добавлением комплекса ДНК в клетки. Культуры выращиваются при 33°C, 5% CO2 и 125 об/мин. От 1 до 4 ч после трансфекции добавляется 0,6 мМ вальпроевой кислоты. Для трансфекции 1 л это составляло 2 мл 300 мМ стока. На 1-й день добавлялось 1:250 антиагрегационного агента, т.е. 4 мл /1 л и 15% об./об. CD Efficient Feed С, т.е. 150 мл/1 л. На 5-й день и 9-й день добавлялось 15% CD Efficient Feed С.
Супернатанты клеток собирались на 14-й день, клетки подсчитывались и определялись белковые титры. Клетки осаждались центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин при температуре 4°C. Супернатанты фильтровались через 0,2 мкм фильтр и сохранялись при 4°C или в замороженном состоянии при -20°C. Очистка химерных МТИ-Fc была сделана с помощью хроматографии Белка A. 200 мл супернатанта культуры клеток смешивались с 2 мл из гранул сефарозы с MabSelect Sure Белком A и встряхивались в течение ночи при температуре 4°C. Смесь гранул затем центрифугировалась в пробирках на 50 мл при 1200 об/мин в течение 5 мин, и супернатант удалялся. Гранулы помещают в колонку и промывают трижды буфером для связывания (Био Рад, Геркулес, Калифорния). Слияния МТИ элюировались с 8 мл MAPS II буфера для элюции (Био Рад, Геркулес, Калифорния). Добавлялись 2 мл раствора нейтрализации (1М Трис-HCl, pH 8). Затем образцы были заменены буфером на 25 мМ цитрат, 125 мМ NaCl, pH 5,5 путем многократного концентрирования и разбавления буфера с использованием форм Амикон Центрифужал (30MWCO, 15 мл, Millipore). На фиг. 9 приведены результаты очисток различных химерных белков МТИ.
Пример 6. Ингибирование протеаз с помощью химерных белков МТИ.
In vitro ферментативный анализ на ингибирование трипсина с помощью химерного белка МТИ-Fc.
Растворы МТИ-Fd при различных концентрациях (< 200 нМ конечная концентрация) готовятся в 50 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 20 мМ CaCl2 и 0,01% Brij L23, pH 7,4. Анализы активности проводятся в 384-луночных планшетах Greiner с ячейками уменьшенного объема. Все этапы проводятся при температуре окружающей среды. Человеческий панкреатический трипсин (конечная концентрация 1,5 нМ)
- 13 037256 (Афенс Ресерч энд Текнолоджи, Инк) добавлялся к растворам, затем предварительно инкубировался с тестируемым МТИ-Fc в течение 15 мин. Далее инициировалась реакция с 100 мкМ (конечная) субстрата
N-бензоил-L-аргинин-7-амидо-4-метилкумарин гидрохлорида SIGMA B7260-25MG. Общий объем реакционной смеси составлял 20 л.
Активность трипсина определялась с помощью флуоресценции. Например, интенсивность флуоресценции определялась в кинетическом режиме над окном от 30 до 60 мин на BMG PHERAstar FS или PHERAstar plus с использованием длины волны возбуждения 370 нм и длины волны эмиссии 470 нм. Активность трипсина являлась линейно пропорциональной к изменению наблюдаемой флуоресценции (конечная - начальная).
Процент ингибирования трипсина при данной концентрации МТИ-Fc был определен следующим образом:
Процент ингибирования = 100 · (1-((Fi - Fp)/(Fn - Fp))) где Fi представляет собой наблюдаемую флуоресценцию при данной концентрации тестируемого МТИ-Fc;
Fp представляет собой наблюдаемую флуоресценцию положительного контроля, т.е. среднее значение от 2 до 6 анализов при отсутствии Трипсина.
Fn представляет собой наблюдаемую флуоресценцию отрицательного контроля, т.е. среднее значение от 2 до 6 анализов Трипсина в присутствии только наполнителя.
ИК50 (молярная концентрация соединения, т.е. химерный белок, который вызывает 50%-ное ингибирование) испытуемого соединения, т.е. химерного белка, рассчитывалась с помощью уравнения нелинейной аппроксимации кривой по методу наименьших квадратов
Процент ингибирования = Низ+((Верх-Низ)/(1+((ИК50/[МТИ-Fc])ΛХолм))).
Внутри панели МТИ-Fc был включен один положительный контроль. Как показано на фиг. 5, человеческий МТИ имеет ИК50 ~3 нМ.
Измерение ингибирования других протеаз с помощью МТИ-Fcl также измерялось в Реакшн Байолоджи Корпорейшн (Малверн, Пенсильвания). Фиг. 6 иллюстрирует МТИ-Fcl ингибирование химотрипсина. На фиг. 7 приведены ингибирующие константы МТИ-Fcl для различных протеаз. МТИ-Fcl умеренно ингибирует химотрипсин и плазмин и демонстрирует слабое ингибирование каспазы-1, катепсина С и папаина.
Пример 7. Клеточные эффекты лечения химерными белками МТИ.
Ингибирование МТИ-Fcl высвобождения цитокинов измерялось в клеточном анализе. Клетки BEAS2B высеивались с плотностью 20,000 клеток/лунка в 96-луночный планшет и культивировались с использованием набора BEGM Bullet (Лонза) в СО2-инкубаторе. Через 24 ч культуральная среда заменялась обычной средой DMEM для голодания и клетки культивировались в течение ночи. Затем клетки инкубировались в свежей плоской DMEM, содержащей l00 нМ трипсина с различными концентрациями МТИ мочи человека или рекомбинантных МТИ-Fcl белков. Через 8 ч собирались культуральные супернатанты, и уровни белка ИЛ-6 оценивались с использованием человеческого ИЛ-6 DuoSet (Ар энд Ди Системс).
Результаты показывают, что оба МТИ и МТИ-Fc уменьшали трипсин-индуцированную выработку ИЛ-6 в клетках BEAS2B. Как проиллюстрировано на фиг. 8, ингибирование было дозозависимым от значений ИК50 0,40 и 0,41 мкг/мл соответственно.
Пример 8. Измерения стабильности молекул МТИ-Fc - тепловая денатурация.
Эксперименты проводились с целью определения термостабильности и стабильности в режиме реального времени. Все молекулы демонстрировали активность в ингибировании трипсина. Термостабильность измерялась с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии на калориметре Microcal VP-DSC. Образцы готовились в концентрации l мг/мл и буферизировались в 0,25 мМ Трис pH 7,4, 0,13м NaCl и 0,0027М KCl. Образцы нагревались от 25 до 110°C со скоростью 200°C в час. МТИ-Fcl сравнивались с номером публикации заявки CN 103044554 A, SEQ ID 2 и 6, который содержит IgG2 или домен Fc IgGl соответственно. Результаты представлены в табл. 8.
Таблица 8
Белок ДСК Tml (oC) ДСК Tm2 (oC)
МТИ-Fcl (SEQIDNO:1) 70,86 85,79
CN 103044554 A SEQ ID 6 68,72 86,38
CN 103044554 A SEQ ID 2 68,47 79,22
Пример 9. Измерение стабильности в режиме реального времени.
Измерение стабильности в реальном времени проводилось путем инкубирования SEQ ID NO: l (МТИ-Fcl) или CN 103044554 A, SEQ IDS 2 или 6 при температуре 2-8°C и 40°C в течение 0, 2 и 4 недель в буфере TBS, pH 7,4. Формирование высокомолекулярных и низкомолекулярных соединений определялось с помощью вытеснительной хроматографии (SEC) и визуализировалось с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ). Концентрация каждого МТИ-Fc также контролировалась путем опре- l4 037256 деления оптической плотности раствора при 280 нм (A280) с использованием коэффициентов экстинкции определяемых составом белка. При анализе с помощью SEC молекулы МТИ-F c производят два частично перекрывающихся пика. Площадь пика в процентах в каждом образце МТИ-Fc, измеренная с помощью SEC, приведена в табл. 9 в момент времени = 0, 2 и 4 недели. Также показано процентное изменение концентрации, измеренное при A280 (% A (мг/мл)) в момент времени = 2 и 4 недели. Начальная концентрация T0 каждого образца составляла МТИ-FcI = 33,5 мг/мл, CN 103044554 SEQ ID NO: 2 = 8,5 мг/мл и CN 103044554 SEQ ID NO: 6 = 5,6 мг/мл. Изменчивость 3% является характерной для SEC и 15% для отдельных измерений УФ. Анализ ПААГ показал, что каждая молекула МТИ-Fc демонстрирует спектр компонентов, ожидаемый для полноразмерного МТИ-Fc.
Таблица 9
Белок SEC 0 недель SEC 2 недели SEC 4 недели %А (мг/мл) 2 недели %А (мг/мл) 4 недели
МТИ-Fc 1 (SEQ ID NO:1) МТИ-Fc 1 (SEQ ID NO:1) при 2-8°C МТИ-Fc 1 (SEQ ID NO:1) при 40°C CN 103044554 A SEQ ID 2 CN 103044554 A SEQ ID 2 при 2-8°C CN 103044554 A SEQ ID 2 при 40°C CN 103044554 A SEQ ID 6 Пик1 35,7 % Пик2 64,3 % Нет данных Нет данных Пик1 30,6 % Пик2 69,4 % Нет данных Нет данных Пик 1 36,6 % Пик 2 63,4 % Нет данных Пик1 36,2 % Пик2 63,8 % Пик1 37,1 % Пик2 62,9 % Нет данных Пик1 29,0 % Пик2 71,0 % Пик1 28,2 % Пик2 71,8 % Нет данных Пик1 36,1 % Пик2 63,9 % Пик1 36,8 % Пик2 63,2 % Нет данных Пик1 31,5 % Пик2 68,5 % Пик1 30,3 % Пик2 69,7 % Нет данных Нет данных 9,2 % 0,2 % Нет данных 0,2 % 1,6% Нет данных Нет данных 1,2% 11,9% Нет данных 2,7 % 3,5 % Нет данных
CN 103044554 A SEQ ID 6 при 2-8°C Нет данных Пик1 34,8 % Пик2 65,2 % Пик! 36,4 % Пик2 63,6 % 7,8 % 9,5 %
CN 103044554 A SEQ ID 6 при 40°C Нет данных Пик1 33,9 % Пик2 66,1 % Пик! 34,5 % Пик2 65,5 % 3,6 % 6,0 %
Пример 10. Тестирование ингибирования комплемента in vivo.
Воздействие МТИ-FcI (SEQ ID NO: 1) на систему комплемента было измерено in vivo. Самки мы
- 15 037256 шей C3h/HeJ были приобретены у компании Jackson Laboratories. Животным вводили дозу в соответствии со схемой опыта табл. 10. Животным делалась в/б инъекция (100 мкл/мышь) по истечении 15 мин после введения дозы с ЛПС в нулевой момент времени. Животные были умерщвлены передозировкой CO2 по истечении 2 и 4 ч после инъекции ЛПС, кровь собиралась путем пункции сердца. Кровь переносилась в микропробирку для отделения сыворотки и оставлялась для свертывания при комнатной температуре в течение 30 мин. Впоследствии микропробирки центрифугировались при 12000 об/мин в течение 5 мин, сыворотка удалялась и аликвотировалась в 96-луночный планшет. В качестве позитивного контроля использовалось 3 мг/мл розмариновой кислоты в физиологическом растворе. 96-луночный планшет замораживался при -20°C. Образцы сыворотки анализировались на содержание С5a с помощью duoset. Статистическая значимость определялась с использованием графического программного обеспечения Prism, воздействия считались статистически значимыми при p < 0,05. Как проиллюстрировано на фиг. 10, SEQ ID NO: 1 (МТИ-FcI) значительно снижает C5a при дозе 20, 50 и 100 мг/кг через 4 ч после введения ЛПС.
Таблица 10. Схема опыта (МТИ-FcI представляет собой SEQ ID: 1)
Группа Описание Доза (мг/кг) Конц. (мг/мл) Объем (мл/кг)Способ Стимулирование ЛПС (в/б) ЛПС КОНЦ. Животные
введения (мг/мл)
1 интактный 8
2 Veh -2 ч - - 10 в/в 30 мкг 0,3 8
МТИ-Fc 1 -2 ч 50 5,0 10 в/в 30 мкг о,з 8
4 Ros_2 ч_30мг/кг массы тела 30 з,о 10 п/к 30 мкг о,з 8
5 Veh - 4 ч - - 10 в/в 30 мкг о,з 8
6 МТИ-Fc 1 -4 ч_5 мг/кг массы тела 5 0,5 10 в/в 30 мкг о,з 8
7 МТИ-Fc 1 -4 ч_20мг/кг массы тела 20 2,0 10 в/в 30 мкг о,з 8
8 МТИ-Fc 1 -4 ч_50мг/кг массы тела 50 5,0 10 в/в 30 мкг о,з 8
9 МТИ-Fc 1 -4 ч_100мг/кг массы тела 100 10,0 10 в/в 30 мкг о,з 8
10 Ros_4 ч_30мг/кг массы тела 30 з,о 10 п/к 30 мкг о,з 8
Перечень последовательностей
SEQ ID NO:1 МТИ-Fc 1 Последовательность Белка
AVLPQEEEGSGGGQLVTEVTKKEDSCQLGYSAGPCMGMTSRYFYNGTSMACETFQYG GCMGNGNNFVTEKECLQTCRTVAACNLPIVRGPCRAFIQLWAFDAVKGKCVLFPYGGC QGNGNKFYSEKECREYCGVPGDGDEELLGSGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG N VF S С S VMHE ALHNH YTQK SL SL SPG
SEQ ID NO:2 МТИ-Fc 1 Последовательность ДНК
GCTGTGCTGCCTCAGGAAGAGGAAGGCTCTGGCGGAGGCCAGCTCGTGACCGAAGT GACCAAGAAAGAGGACTCCTGCCAGCTGGGCTACTCTGCCGGCCCTTGTATGGGCA
- 16 037256
TGACCTCCCGGTACTTCTACAACGGCACCTCCATGGCCTGCGAGACATTCCAGTACG GCGGCTGCATGGGCAACGGCAACAACTTTGTGACAGAGAAAGAGTGCCTGCAGACC TGCAGAACCGTGGCCGCCTGTAACCTGCCTATCGTGCGGGGACCCTGTCGGGCCTTT ATCCAGCTGTGGGCCTTCGACGCCGTGAAGGGCAAATGCGTGCTGTTCCCCTATGGC GGCTGCCAGGGAAATGGAAACAAGTTCTACTCCGAGAAAGAATGCCGCGAGTACTG TGGCGTGCCAGGCGACGGGGATGAGGAACTGCTGGGATCAGGCGGCGGAGGCGAC AAGACCCATACCTGTCCACCTTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGACCTTCTGTG TTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTG ACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGATCCCGAAGTGAAGTTCAATTGGTAC GTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTACA ACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACG GCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCATCGAAAAG ACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGGGAACCCCAGGTGTACACACTGCCCCC TAGCCGGGAAGAGATGACAAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTCGTGAAGGGAT TCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGTCCAACGGCCAGCCTGAGAACAAC TACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCATTCTTCCTGTACTCCAAG CTGACAGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATG CACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCCCGGC
SEQ ID NO:3 МТИ-Fc IgGl 3Ser Последовательность белка avlpqeeegsgggqlvtevtkkedscqlgysagpcmgmtsryfyngtsmacetfqyggcmgngnnfvtekeclqtcrtvaacnlpi vrgpcrafiqlwafdavkgkcvlfpyggcqgngnkfysekecreycgvpgdgdeellrepkssdkthtcppcpapellggssvflfpp kpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpa siektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwq qgnvfscsvmhealhnhytqksl si spg
SEQ ID NO:4 МТИ-Fc IgGl 3Ser Последовательность ДНК gctgtgctgcctcaggaagaggaaggctctggcggaggccagctcgtgaccgaagtgaccaagaaagaggactcctgccagctgggct actctgccggcccttgtatgggcatgacctcccggtacttctacaacggcacctccatggcctgcgagacattccagtacggcggctgcatg ggcaacggcaacaactttgtgacagagaaagagtgcctgcagacctgcagaaccgtggccgcctgtaacctgcctatcgtgcggggacc ctgtcgggcctttatccagctgtgggccttcgacgccgtgaagggcaaatgcgtgctgttcccctatggcggctgccagggaaatggaaac aagttctactccgagaaagaatgccgcgagtactgtggcgtgccaggcgacggggatgaggaactgctgcgggagcccaaatcttccga caagacccatacctgtccaccttgccctgcccccgagctgctgggaggatcctctgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctga tgatctcccggacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggatcccgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgt ggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagtacaactccacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccag gattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgcctccatcgaaaagaccatctccaaggccaaggg
- 17 037256 ccagccccgggaaccccaggtgtacacactgccccctagccgggaagagatgacaaagaaccaggtgtccctgacctgtctcgtgaagg gattctacccctccgatatcgccgtggaatgggagtccaacggccagcctgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggactccg acggctcattcttcctgtactccaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggcc ctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctgagccccggc
SEQ ID NO:5 МТИ-Fc IgG2 Ser Последовательность белка avlpqeeegsgggqlvtevtkkedscqlgysagpcmgmtsryfyngtsmacetfqyggcmgngnnfvtekeclqtcrtvaacnlpi vrgpcrafiqlwafdavkgkcvlfpyggcqgngnkfysekecreycgvpgdgdeellrkscvecppcpappvagpsvflfppkpkd tlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgmevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiekt isktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnv fscsvmhealhnhytqksl si spgk
SEQ ID NO:6 МТИ-Fc IgG2 Ser Последовательность ДНК gctgtgctgcctcaggaagaggaaggctctggcggaggccagctcgtgaccgaagtgaccaagaaagaggactcctgccagctgggct actctgccggcccttgtatgggcatgacctcccggtacttctacaacggcacctccatggcctgcgagacattccagtacggcggctgcatg ggcaacggcaacaactttgtgacagagaaagagtgcctgcagacctgcagaaccgtggccgcctgtaacctgcctatcgtgcggggacc ctgtcgggcctttatccagctgtgggccttcgacgccgtgaagggcaaatgcgtgctgttcccctatggcggctgccagggaaatggaaac aagttctactccgagaaagaatgccgcgagtactgtggcgtgccaggcgacggggatgaggaactgctgcggaaatcctgtgtcgagtgc ccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctg aggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcatggaggtgcataatgcc aagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcgtgcaccaggactggctgaacggcaa ggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaacca caggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcga catcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcct ctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccacta cacacagaagagcctctccctgtctccgggtaaa
SEQ ID NO:7 МТИ-Fc IgG2 Последовательность белка avlpqeeegsgggqlvtevtkkedscqlgysagpcmgmtsryfyngtsmacetfqyggcmgngnnfvtekeclqtcrtvaacnlpi vrgpcrafiqlwafdavkgkcvlfpyggcqgngnkfysekecreycgvpgdgdeellrkccvecppcpappvagpsvflfppkpkd tlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgmevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiekt isktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnv fscsvmhealhnhytqksl si spgk
SEQ ID NO:8 МТИ UTI-Fc IgG2 Последовательность ДНК gctgtgctgcctcaggaagaggaaggctctggcggaggccagctcgtgaccgaagtgaccaagaaagaggactcctgccagctgggct actctgccggcccttgtatgggcatgacctcccggtacttctacaacggcacctccatggcctgcgagacattccagtacggcggctgcatg
- 18 037256 ggcaacggcaacaactttgtgacagagaaagagtgcctgcagacctgcagaaccgtggccgcctgtaacctgcctatcgtgcggggacc ctgtcgggcctttatccagctgtgggccttcgacgccgtgaagggcaaatgcgtgctgttcccctatggcggctgccagggaaatggaaac aagttctactccgagaaagaatgccgcgagtactgtggcgtgccaggcgacggggatgaggaactgctgcggaaatgttgtgtcgagtgc ccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctg aggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcatggaggtgcataatgcc aagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcgtgcaccaggactggctgaacggcaa ggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaacca caggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcga catcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcct ctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccacta cacacagaagagcctctccctgtctccgggtaaa
SEQ ID NO:9 МТИ-Fc IgGl 3Ser S10A Последовательность белка avlpqeeegagggqlvtevtkkedscqlgysagpcmgmtsryfyngtsmacetfqyggcmgngnnfvtekeclqtcrtvaacnlpi vrgpcrafiqlwafdavkgkcvlfpyggcqgngnkfysekecreycgvpgdgdeellrepkssdkthtcppcpapellggssvflfpp kpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpa siektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwq qgnvfscsvmhealhnhytqksl si spg
SEQ ID NO: 10 МТИ-Fc IgGl 3Ser S10A Последовательность ДНК gctgtgctgcctcaggaagaggaaggcgcaggcggaggccagctcgtgaccgaagtgaccaagaaagaggactcctgccagctgggc tactctgccggcccttgtatgggcatgacctcccggtacttctacaacggcacctccatggcctgcgagacattccagtacggcggctgcat gggcaacggcaacaactttgtgacagagaaagagtgcctgcagacctgcagaaccgtggccgcctgtaacctgcctatcgtgcggggac cctgtcgggcctttatccagctgtgggccttcgacgccgtgaagggcaaatgcgtgctgttcccctatggcggctgccagggaaatggaaa caagttctactccgagaaagaatgccgcgagtactgtggcgtgccaggcgacggggatgaggaactgctgcgggagcccaaatcttccg acaagacccatacctgtccaccttgccctgcccccgagctgctgggaggatcctctgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctg atgatctcccggacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggatcccgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcg tggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagtacaactccacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccag gattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgcctccatcgaaaagaccatctccaaggccaaggg ccagccccgggaaccccaggtgtacacactgccccctagccgggaagagatgacaaagaaccaggtgtccctgacctgtctcgtgaagg gattctacccctccgatatcgccgtggaatgggagtccaacggccagcctgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggactccg acggctcattcttcctgtactccaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggcc ctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctgagccccggc
SEQ ID NO: 11 МТИ-Fc IgGl 3Ser m2 Последовательность белка
- 19 037256 edscqlgysagpcmgmtsryfyngtsmacetfqyggcmgngnnfvtekeclqtcrtvaacnlpivrgpcrafiqlwafdavkgkcvl fpyggcqgngnkfysekecreycgvpgdgdeellrepkssdkthtcppcpapellggssvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsh edpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpasiektiskakgqprepqvytlpps reemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqksl slspg
SEQ ID NO: 12 МТИ-Fc IgGl 3Ser m2 Последовательность ДНК gaggactcctgccagctgggctactctgccggcccttgtatgggcatgacctcccggtacttctacaacggcacctccatggcctgcgaga cattccagtacggcggctgcatgggcaacggcaacaactttgtgacagagaaagagtgcctgcagacctgcagaaccgtggccgcctgta acctgcctatcgtgcggggaccctgtcgggcctttatccagctgtgggccttcgacgccgtgaagggcaaatgcgtgctgttcccctatggc ggctgccagggaaatggaaacaagttctactccgagaaagaatgccgcgagtactgtggcgtgccaggcgacggggatgaggaactgct gcgggagcccaaatcttccgacaagacccatacctgtccaccttgccctgcccccgagctgctgggaggatcctctgtgttcctgttccccc caaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggatcccgaagtgaagt tcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagtacaactccacctaccgggtggtgtcc gtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgcctccatcgaaaag accatctccaaggccaagggccagccccgggaaccccaggtgtacacactgccccctagccgggaagagatgacaaagaaccaggtgt ccctgacctgtctcgtgaagggattctacccctccgatatcgccgtggaatgggagtccaacggccagcctgagaacaactacaagaccac cccccctgtgctggactccgacggctcattcttcctgtactccaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttctcct gctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctgagccccggc
SEQ ID NO: 13 МТИ-Fc IgGl 3Ser ml Последовательность белка avlpqeeegsgggqlvtevtkkepkssdkthtcppcpapellggssvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvd gvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpasiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltcl vkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg
SEQ ID NO: 14 МТИ-Fc IgGl 3Ser ml Последовательность ДНК gctgtgctgcctcaggaagaggaaggctctggcggaggccagctcgtgaccgaagtgaccaagaaagagcccaaatcttccgacaaga cccatacctgtccaccttgccctgcccccgagctgctgggaggatcctctgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatct cccggacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggatcccgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaag tgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagtacaactccacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattgg ctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgcctccatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagcc ccgggaaccccaggtgtacacactgccccctagccgggaagagatgacaaagaaccaggtgtccctgacctgtctcgtgaagggattcta cccctccgatatcgccgtggaatgggagtccaacggccagcctgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggactccgacggct cattcttcctgtactccaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcac aaccactacacccagaagtccctgtccctgagccccggc
SEQ ID NO: 15 МТИ-Fc IgGl 3Ser link3 Последовательность белка
- 20 037256 avlpqeeegsgggqlvtevtkkedscqlgysagpcmgmtsryfyngtsmacetfqyggcmgngnnfvtekeclqtcrtvaacnlpi vrgpcrafiqlwafdavkgkcvlfpyggcqgngnkfysekecreycgvpgdgdeellggggsggggsepkssdkthtcppcpapel Iggssvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeyk ckvsnkalpasiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflys kltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqksl si spg
SEQ ID NO: 16 МТИ-Fc IgGl 3Ser link3 Последовательность ДНК gctgtgctgcctcaggaagaggaaggctctggcggaggccagctcgtgaccgaagtgaccaagaaagaggactcctgccagctgggct actctgccggcccttgtatgggcatgacctcccggtacttctacaacggcacctccatggcctgcgagacattccagtacggcggctgcatg ggcaacggcaacaactttgtgacagagaaagagtgcctgcagacctgcagaaccgtggccgcctgtaacctgcctatcgtgcggggacc ctgtcgggcctttatccagctgtgggccttcgacgccgtgaagggcaaatgcgtgctgttcccctatggcggctgccagggaaatggaaac aagttctactccgagaaagaatgccgcgagtactgtggcgtgccaggcgacggggatgaggaactgctgggaggtggtggatcaggtgg cggaggatcagagcccaaatcttccgacaagacccatacctgtccaccttgccctgcccccgagctgctgggaggatcctctgtgttcctgt tccccccaaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggatcccgaag tgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagtacaactccacctaccgggtg gtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgcctccatc gaaaagaccatctccaaggccaagggccagccccgggaaccccaggtgtacacactgccccctagccgggaagagatgacaaagaac caggtgtccctgacctgtctcgtgaagggattctacccctccgatatcgccgtggaatgggagtccaacggccagcctgagaacaactaca agaccaccccccctgtgctggactccgacggctcattcttcctgtactccaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgt gttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctgagccccggc
SEQ ID NO: 17 МТИ-Fc IgGl 3Ser link2 Последовательность белка avlpqeeegsgggqlvtevtkkedscqlgysagpcmgmtsryfyngtsmacetfqyggcmgngnnfvtekeclqtcrtvaacnlpi vrgpcrafiqlwafdavkgkcvlfpyggcqgngnkfysekecreycgvpgdgdeellrcppcpapellggssvflfppkpkdtlmisr tpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpasiektiskakg qprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvm healhnhytqksl si spg
SEQ ID NO: 18 МТИ-Fc IgGl 3Ser link2 Последовательность ДНК gctgtgctgcctcaggaagaggaaggctctggcggaggccagctcgtgaccgaagtgaccaagaaagaggactcctgccagctgggct actctgccggcccttgtatgggcatgacctcccggtacttctacaacggcacctccatggcctgcgagacattccagtacggcggctgcatg ggcaacggcaacaactttgtgacagagaaagagtgcctgcagacctgcagaaccgtggccgcctgtaacctgcctatcgtgcggggacc ctgtcgggcctttatccagctgtgggccttcgacgccgtgaagggcaaatgcgtgctgttcccctatggcggctgccagggaaatggaaac aagttctactccgagaaagaatgccgcgagtactgtggcgtgccaggcgacggggatgaggaactgctgcggtgtccaccttgccctgcc cccgagctgctgggaggatcctctgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccctgaagtgacctgcgt ggtggtggatgtgtcccacgaggatcccgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagccca gagaggaacagtacaactccacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgc
- 21 037256 aaggtgtccaacaaggccctgcctgcctccatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagccccgggaaccccaggtgtacacact gccccctagccgggaagagatgacaaagaaccaggtgtccctgacctgtctcgtgaagggattctacccctccgatatcgccgtggaatg ggagtccaacggccagcctgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggactccgacggctcattcttcctgtactccaagctgaca gtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctg tccctgagccccggc
SEQ ID NO: 19 МТИ-Fc IgGl 3Ser linkl Последовательность белка avlpqeeegsgggqlvtevtkkedscqlgysagpcmgmtsryfyngtsmacetfqyggcmgngnnfvtekeclqtcrtvaacnlpi vrgpcrafiqlwafdavkgkcvlfpyggcqgngnkfysekecreycgvssvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfn wyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpasiektiskakgqprepqvytlppsreemtknq vsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg SEQ ID NO:20 МТИ-Fc IgGl 3Ser linkl Последовательность ДНК gctgtgctgcctcaggaagaggaaggctctggcggaggccagctcgtgaccgaagtgaccaagaaagaggactcctgccagctgggct actctgccggcccttgtatgggcatgacctcccggtacttctacaacggcacctccatggcctgcgagacattccagtacggcggctgcatg ggcaacggcaacaactttgtgacagagaaagagtgcctgcagacctgcagaaccgtggccgcctgtaacctgcctatcgtgcggggacc ctgtcgggcctttatccagctgtgggccttcgacgccgtgaagggcaaatgcgtgctgttcccctatggcggctgccagggaaatggaaac aagttctactccgagaaagaatgccgcgagtactgtggcgtgtcctctgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatctcc cggacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggatcccgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtg cacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagtacaactccacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggct gaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgcctccatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagccc cgggaaccccaggtgtacacactgccccctagccgggaagagatgacaaagaaccaggtgtccctgacctgtctcgtgaagggattctac ccctccgatatcgccgtggaatgggagtccaacggccagcctgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggactccgacggctc attcttcctgtactccaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcaca accactacacccagaagtccctgtccctgagccccggc
SEQ ID NO:21 МТИ-Fc IgGl 3Ser K21S K22S Последовательность белка avlpqeeegsgggqlvtevtssedscqlgysagpcmgmtsryfyngtsmacetfqyggcmgngnnfvtekeclqtcrtvaacnlpiv rgpcrafiqlwafdavkgkcvlfpyggcqgngnkfysekecreycgvpgdgdeellrepkssdkthtcppcpapellggssvflfppk pkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpasi ektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqg nvfscsvmhealhnhy tqksl si spg
SEQ ID NO:22 МТИ-Fc IgGl 3Ser K21S K22S Последовательность ДНК gctgtgctgcctcaggaagaggaaggctctggcggaggccagctcgtgaccgaagtgacctcctccgaggactcctgccagctgggcta ctctgccggcccttgtatgggcatgacctcccggtacttctacaacggcacctccatggcctgcgagacattccagtacggcggctgcatgg gcaacggcaacaactttgtgacagagaaagagtgcctgcagacctgcagaaccgtggccgcctgtaacctgcctatcgtgcggggaccct
- 22 037256 gtcgggcctttatccagctgtgggccttcgacgccgtgaagggcaaatgcgtgctgttcccctatggcggctgccagggaaatggaaacaa gttctactccgagaaagaatgccgcgagtactgtggcgtgccaggcgacggggatgaggaactgctgcgggagcccaaatcttccgaca agacccatacctgtccaccttgccctgcccccgagctgctgggaggatcctctgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatg atctcccggacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggatcccgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtgg aagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagtacaactccacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggat tggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgcctccatcgaaaagaccatctccaaggccaagggcca gccccgggaaccccaggtgtacacactgccccctagccgggaagagatgacaaagaaccaggtgtccctgacctgtctcgtgaagggat tctacccctccgatatcgccgtggaatgggagtccaacggccagcctgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggactccgacg gctcattcttcctgtactccaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctg cacaaccactacacccagaagtccctgtccctgagccccggc
SEQ ID NO:23 МТИ-Fc IgGl 3Ser d2 Последовательность белка avlpqeeegsgggqlvtevtkktvaacnlpivrgpcrafiqlwafdavkgkcvlfpyggcqgngnkfysekecreycgvpgdgdeell repkssdkthtcppcpapellggssvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyr vvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpasiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpe nnykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg
SEQ ID NO:24 МТИ-Fc IgGl 3Ser d2 Последовательность ДНК gctgtgctgcctcaggaagaggaaggctctggcggaggccagctcgtgaccgaagtgaccaagaaaaccgtggccgcctgtaacctgc ctatcgtgcggggaccctgtcgggcctttatccagctgtgggccttcgacgccgtgaagggcaaatgcgtgctgttcccctatggcggctgc cagggaaatggaaacaagttctactccgagaaagaatgccgcgagtactgtggcgtgccaggcgacggggatgaggaactgctgcggg agcccaaatcttccgacaagacccatacctgtccaccttgccctgcccccgagctgctgggaggatcctctgtgttcctgttccccccaaagc ccaaggacaccctgatgatctcccggacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggatcccgaagtgaagttcaattg gtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagtacaactccacctaccgggtggtgtccgtgctg accgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgcctccatcgaaaagaccatc tccaaggccaagggccagccccgggaaccccaggtgtacacactgccccctagccgggaagagatgacaaagaaccaggtgtccctga cctgtctcgtgaagggattctacccctccgatatcgccgtggaatgggagtccaacggccagcctgagaacaactacaagaccacccccc ctgtgctggactccgacggctcattcttcctgtactccaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttctcctgctcc gtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctgagccccggc
SEQ ID NO:25 МТИ-Fc IgGl 3Ser dl Последовательность белка avlpqeeegsgggqlvtevtkkedscqlgysagpcmgmtsryfyngtsmacetfqyggcmgngnnfvtekeclqtcrepkssdkth tcppcpapellggssvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhq dwlngkeykckvsnkalpasiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvl dsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg
SEQ ID NO:26 МТИ-Fc IgGl 3Ser dl Последовательность ДНК
- 23 037256 gctgtgctgcctcaggaagaggaaggctctggcggaggccagctcgtgaccgaagtgaccaagaaagaggactcctgccagctgggct actctgccggcccttgtatgggcatgacctcccggtacttctacaacggcacctccatggcctgcgagacattccagtacggcggctgcatg ggcaacggcaacaactttgtgacagagaaagagtgcctgcagacctgcagagagcccaaatcttccgacaagacccatacctgtccacct tgccctgcccccgagctgctgggaggatcctctgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccctgaagt gacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggatcccgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagac caagcccagagaggaacagtacaactccacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagt acaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgcctccatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagccccgggaaccccaggt gtacacactgccccctagccgggaagagatgacaaagaaccaggtgtccctgacctgtctcgtgaagggattctacccctccgatatcgcc gtggaatgggagtccaacggccagcctgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggactccgacggctcattcttcctgtactcca agctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccag aagtccctgtccctgagccccggc
SEQ ID NO:27 шМТИ-mFc mlgGl Последовательность белка avlpqesegsgteplitgtlkkedscqlnysegpclgmqeryyyngasmacetfqyggclgngnnfisekdclqtcrtiaacnlpivqg pcrafiklwafdaaqgkciqfhyggckgngnkfysekeckeycgvpgdgyeelirskivprdcgckpcictvpevssvfifppkpkd vltitltpkvtcvvvdiskddpevqfswfvddvevhtaqtqpreeqfnstfrsvselpimhqdwlngkefkcrvnsaafpapiektiskt kgrpkapqvytipppkeqmakdkvsltcmitdffpeditvewqwngqpaenykntqpimdtdgsyfvysklnvqksnweagntf tcsvlheglhnhhtekslshspgk
SEQ ID NO:28 шМТИ-mFc mlgGl Последовательность ДНК gcagtgctgccccaagagagtgaggggtcagggactgagccactaataactgggaccctcaagaaagaagactcctgccagctcaatta ctcagaaggcccctgcctagggatgcaagagaggtattactacaacggcgcttccatggcctgcgagacctttcaatatgggggttgccta ggcaacggcaacaacttcatctctgagaaggactgtctgcagacatgtcggaccatagcggcctgcaatctccccatagtccaaggcccct gccgagccttcataaagctctgggcatttgatgcagcacaagggaagtgcatccaattccactacgggggctgcaaaggcaacggcaaca aattctactctgagaaggaatgcaaagagtactgtggagtccctggtgatgggtacgaggaactaatacgcagtaaaatcgtgcctcggga ctgcggctgcaagccctgcatctgcaccgtgcccgaggtgtcctccgtgttcatcttcccacccaagcccaaggacgtgctgaccatcacc ctgacccccaaagtgacctgcgtggtggtggacatctccaaggacgaccccgaggtgcagttcagttggttcgtggacgacgtggaagtg cacaccgcccagacccagcccagagaggaacagttcaactccaccttcagatccgtgtccgagctgcccatcatgcaccaggactggctg aacggcaaagagttcaagtgcagagtgaactccgccgccttcccagcccccatcgaaaagaccatctccaagaccaagggcagacccaa ggccccccaggtgtacaccatccccccacccaaagaacagatggccaaggacaaggtgtccctgacctgcatgatcaccgatttcttccca gaggacatcaccgtggaatggcagtggaacggccagcccgccgagaactacaagaacacccagcccatcatggacaccgacggctcct acttcgtgtactccaagctgaacgtgcagaagtccaactgggaggccggcaacaccttcacctgtagcgtgctgcacgagggcctgcaca accaccacaccgagaagtccctgtcccactcccccggcaag
SEQ ID NO:29 Fc IgGl 3Ser МТИ Последовательность белка
- 24 037256 epkssdkthtcppcpapellggssvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrv vsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpasiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpen nykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkggggsggggsggggsavlpqeeegsggg qlvtevtkkedscqlgysagpcmgmtsryfyngtsmacetfqyggcmgngnnfvtekeclqtcrtvaacnlpivrgpcrafiqlwafd avkgkcvlfpyggcqgngnkfysekecreycgvpgdgdeellr
SEQ ID NO:30 Fc IgGl 3Ser МТИ Последовательность ДНК gagcccaaatcttccgacaagacccatacctgtccaccttgccctgcccccgagctgctgggaggatcctctgtgttcctgttccccccaaa gcccaaggacaccctgatgatctcccggacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggatcccgaagtgaagttcaat tggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagtacaactccacctaccgggtggtgtccgtgct gaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgcctccatcgaaaagaccat ctccaaggccaagggccagccccgggaaccccaggtgtacacactgccccctagccgggaagagatgacaaagaaccaggtgtccctg acctgtctcgtgaagggattctacccctccgatatcgccgtggaatgggagtccaacggccagcctgagaacaactacaagaccaccccc cctgtgctggactccgacggctcattcttcctgtactccaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttctcctgctc cgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctgagccccggcaagggaggtggtggatcaggaggtgga ggttccggtggcggaggatcagctgtgctgcctcaggaagaggaaggctctggcggaggccagctcgtgaccgaagtgaccaagaaag aggactcctgccagctgggctactctgccggcccttgtatgggcatgacctcccggtacttctacaacggcacctccatggcctgcgagac attccagtacggcggctgcatgggcaacggcaacaactttgtgacagagaaagagtgcctgcagacctgcagaaccgtggccgcctgtaa cctgcctatcgtgcggggaccctgtcgggcctttatccagctgtgggccttcgacgccgtgaagggcaaatgcgtgctgttcccctatggcg gctgccagggaaatggaaacaagttctactccgagaaagaatgccgcgagtactgtggcgtgccaggcgacggggatgaggaactgctg egg
SEQ ID N0:31 чМТИ последовательность белка avlpq eeegsgggql vtevtkkeds cqlgysagpc mgmtsryfyn gtsmacetfq yggcmgngnn fvtekeclqt crtvaacnlp ivrgperafi qlwafdavkg kevlfpygge qgngnkfyse kecreycgvp gdgdeellrf sn
SEQ ID NO:32 AMBP последовательность препробелка mrslgallll Isaclavsag pvptppdniq vqenfnisri ygkwynlaig stcpwlkkim drmtvstlvl gegateaeis mtstrwrkgv ceetsgayek tdtdgkflyh kskwnitmes yvvhtnydey aifltkkfsr hhgptitakl ygrapqlret llqdfrvvaq gvgipedsif tmadrgecvp geqepepili prvrravlpq eeegsgggql vtevtkkeds cqlgysagpc mgmtsryfyn gtsmacetfq yggcmgngnn fvtekeclqt crtvaacnlp ivrgperafi qlwafdavkg kevlfpygge qgngnkfyse kecreycgvp gdgdeellrf sn
SEQIDNO:33
SGGGGS
SEQ ID NO:34
- 25 037256
SGGGGSGGGGS
SEQIDNO: 35
SGGGGSGGGGSGGGGS
SEQIDNO:36
SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQIDNO:37
SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:38
SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQIDNO:39
SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO :40
SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:41 SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO :42
SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO :43
GSGGGSGGGGSGGGGS

Claims (16)

1. Выделенный химерный белок мочевого трипсинового ингибитора (МТИ), содержащий домен МТИ и Fc-домен IgG1, причем указанный химерный белок содержит SEQ ID NO: 1.
2. Димер, содержащий два выделенных химерных белка по п.1, где Fc-домены ковалентно связаны.
3. Фармацевтическая композиция для лечения состояния, связанного с МТИ, содержащая химерный белок по п.1, или димер по п.2, и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
4. Применение химерного белка по п.1, или димера по п.2, в качестве лекарственного средства для лечения состояния, связанного с МТИ.
5. Способ лечения состояния, связанного с МТИ, включающий введение пациенту эффективного количества химерного белка по п.1, или димера по п.2.
6. Способ по п.5, в котором состояние, связанное с МТИ, выбрано из индуцированного эндоскопией панкреатита, острого панкреатита, артрита, атипичной пневмонии, синдрома системного воспалительного ответа, острой недостаточности кровообращения, сепсиса, гепатита, аппендицита, колита, органной недостаточности, поражения поджелудочной железы, почек, легких, реперфузионного повреждения, синдрома Стивенса-Джонсона, токсического эпидермального некролиза, шока, ишемических повреждений, острого повреждения легких, повреждения легких, вызванного острым расслоением аорты, астмы, пневмонии, пневмонии, связанной с искусственной вентиляцией легких, диссеминированного внутрисосудистого свертывания и острого респираторного дистресс-синдрома.
7. Нуклеиновая кислота, кодирующая химерный белок по п.1.
8. Нуклеиновая кислота, кодирующая димер по п.2.
9. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по п.7 или 8.
10. Рекомбинантная клетка-хозяин для продукции химерного белка по п.1, содержащая вектор экспрессии по п.9.
11. Рекомбинантная клетка-хозяин по п.10, выбранная из клетки млекопитающего, клетки насекомого, E.coli, дрожжевой клетки и клетки растения.
- 26 037256
12. Рекомбинантная клетка-хозяин по и. 11, представляющая собой клетку млекопитающего, выбранную из клетки яичника китайского хомяка (СНО), клетки НЕК 293, клетки NSO, клетки HeLa, клетки почки новорожденного хомяка (ВНК), клетки почки обезьяны (COS) и клетки гепатоцеллюлярного рака человека.
13. Способ получения химерного белка по п.1, включающий культивирование рекомбинантной клетки-хозяина по любому из пи. 10-12 в среде для роста и выделение химерного белка из клетки или среды для роста.
14. Применение слитого белка по п.1 в качестве лекарственного средства для лечения состояния, связанного с МТИ, выбранного из индуцированного эндоскопией панкреатита и острого панкреатита; артрита, атипичной пневмонии, синдрома системного воспалительного ответа, острой недостаточности кровообращения, сепсиса, гепатита, аппендицита, колита, органной недостаточности, поражения органов, в том числе поражение поджелудочной железы, почек, легких; реперфузионного повреждения, синдрома Стивенса-Джонсона, токсического эпидермального некролиза, шока, ишемических повреждений, острого повреждения легких, в том числе вызванного острым расслоением аорты; астмы, пневмонии, в том числе пневмонии, связанной с искусственной вентиляцией легких, диссеминированного внутрисосудистого свертывания и острого респираторного дистресс-сиидрома.
15. Применение димера по п.2 в качестве лекарственного средства для лечения состояния, связанного с МТИ, выбранного из индуцированного эндоскопией панкреатита и острого панкреатита; артрита, атипичной пневмонии, синдрома системного воспалительного ответа, острой недостаточности кровообращения, сепсиса, гепатита, аппендицита, колита, органной недостаточности, поражения органов, в том числе поражения поджелудочной железы, почек, легких; реперфузионного повреждения, синдрома Стивенса-Джонсона, токсического эпидермального некролиза, шока, ишемических повреждений, острого повреждения легких, в том числе вызванного острым расслоением аорты; астмы, пневмонии, в том числе пневмонии, связанной с искусственной вентиляцией легких, диссеминированного внутрисосудистого свертывания и острого респираторного дистресс-сиидрома.
16. Применение по п.14 или 15, причем состояние, связанное с МТИ, выбрано из панкреатита, индуцированного эндоскопией панкреатита и острого панкреатита.
EA201691702A 2014-02-24 2015-02-23 Химерный белок мочевого трипсинового ингибитора (мти), содержащий домен мти и fc-домен igg1 EA037256B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461943617P 2014-02-24 2014-02-24
PCT/US2015/017152 WO2015127391A1 (en) 2014-02-24 2015-02-23 Uti fusion proteins

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201691702A1 EA201691702A1 (ru) 2017-01-30
EA037256B1 true EA037256B1 (ru) 2021-02-26

Family

ID=52629709

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201691702A EA037256B1 (ru) 2014-02-24 2015-02-23 Химерный белок мочевого трипсинового ингибитора (мти), содержащий домен мти и fc-домен igg1
EA202091567A EA202091567A1 (ru) 2014-02-24 2015-02-23 Химерные белки мти

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA202091567A EA202091567A1 (ru) 2014-02-24 2015-02-23 Химерные белки мти

Country Status (37)

Country Link
US (4) US9856310B2 (ru)
EP (2) EP3110434B1 (ru)
JP (4) JP6574431B2 (ru)
KR (2) KR102461210B1 (ru)
CN (2) CN106232135B (ru)
AR (1) AR101597A1 (ru)
AU (4) AU2015218704B2 (ru)
BR (1) BR112016019390B1 (ru)
CA (2) CA2939639C (ru)
CL (1) CL2016002136A1 (ru)
CR (1) CR20160444A (ru)
CY (1) CY1120997T1 (ru)
DK (1) DK3110434T3 (ru)
DO (1) DOP2016000202A (ru)
EA (2) EA037256B1 (ru)
EC (1) ECSP16076535A (ru)
ES (1) ES2700149T3 (ru)
GE (1) GEP20196970B (ru)
HR (1) HRP20182029T1 (ru)
IL (1) IL247321B (ru)
JO (1) JO3729B1 (ru)
LT (1) LT3110434T (ru)
MA (1) MA39347B2 (ru)
MX (2) MX2016010950A (ru)
MY (1) MY178774A (ru)
NZ (3) NZ760008A (ru)
PE (1) PE20170257A1 (ru)
PH (1) PH12016501629A1 (ru)
PL (1) PL3110434T3 (ru)
PT (1) PT3110434T (ru)
RS (1) RS58285B1 (ru)
SG (2) SG11201606691QA (ru)
SI (1) SI3110434T1 (ru)
TW (1) TWI694084B (ru)
UA (1) UA118866C2 (ru)
WO (1) WO2015127391A1 (ru)
ZA (1) ZA201606327B (ru)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK3110434T3 (en) * 2014-02-24 2019-01-14 Takeda Gmbh UTI FUSION PROTEINS
US20200165632A1 (en) * 2017-06-07 2020-05-28 Spark Therapeutics, Inc. ENHANCING AGENTS FOR IMPROVED CELL TRANSFECTION AND/OR rAAV VECTOR PRODUCTION
WO2020106881A1 (en) * 2018-11-20 2020-05-28 Diamedica Inc. Modified ulinastatin polypeptides
JP2021050161A (ja) 2019-09-25 2021-04-01 武田薬品工業株式会社 複素環化合物及びその用途
JP2021080177A (ja) 2019-11-14 2021-05-27 武田薬品工業株式会社 複素環化合物及びその用途
WO2021178843A1 (en) * 2020-03-05 2021-09-10 DiaMedica USA Inc. Ulinastatin polypeptides

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103044554A (zh) * 2012-05-14 2013-04-17 旭华（上海）生物研发中心有限公司 重组二聚化人尿胰蛋白酶抑制剂、其制备方法及其应用
JP2013253079A (ja) * 2012-05-14 2013-12-19 Xuhua (Shanghai) Biological Research & Development Center Co Ltd 生物学的に活性なヒト尿中トリプシンインヒビターのＦｃ融合タンパク質並びにその調製および使用

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5663143A (en) * 1988-09-02 1997-09-02 Dyax Corp. Engineered human-derived kunitz domains that inhibit human neutrophil elastase
DK0401508T3 (da) 1989-05-13 1995-05-15 Bayer Ag Proteaseinhibitorer, fremgangsmåde til deres fremstilling samt lægemidler med indhold deraf
US5409895A (en) 1990-11-13 1995-04-25 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. Protease inhibitory polypeptides derived from urinary trypsin inhibitor and compositions thereof
JP2769083B2 (ja) 1993-02-22 1998-06-25 日清食品株式会社 エラスターゼ阻害活性を有する新規ペプチドおよびその製造方法
BR9708021A (pt) 1996-03-11 1999-07-27 Bayer Ag Proteína substancialmente purificada composição farmacêutica sequência de ácido nucleico isolada vetor de express o de protéina auto-replicante e processos para inibir a atividade de protéinas de serina tratar uma condição e preparar um medicamento de uma proteína
DE19725014A1 (de) 1997-06-13 1998-12-17 Bayer Ag Aprotininvarianten mit verbesserten Eigenschaften und Bikunine von Aprotininvarianten
RU2429245C2 (ru) * 2004-03-30 2011-09-20 Глаксо Груп Лимитед Иммуноглобулины
EP1791866A2 (en) 2004-08-11 2007-06-06 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain fusion proteins
CN101189334B (zh) * 2005-06-03 2013-11-06 持田制药株式会社 抗cd14抗体融合蛋白质
CA2635589C (en) 2005-12-29 2017-01-17 Dyax Corp. Protease inhibition
DK2334705T3 (en) * 2008-09-26 2017-03-27 Ucb Biopharma Sprl BIOLOGICAL PRODUCTS
CN101721699B (zh) * 2008-10-13 2012-11-07 成都康弘生物科技有限公司 Vegf受体融合蛋白在制备治疗伴随vegf升高的炎症反应的药物中的应用
CN102580085B (zh) * 2008-10-13 2013-09-18 成都康弘生物科技有限公司 Vegf受体融合蛋白在制备治疗脓毒症药物中的应用
US20120052069A1 (en) * 2009-05-05 2012-03-01 Amgen Inc Fgf21 mutants and uses thereof
KR102428875B1 (ko) * 2011-04-29 2022-08-05 유니버시티 오브 워싱톤 스루 이츠 센터 포 커머셜리제이션 치료적 뉴클레아제 조성물 및 방법
US8619331B2 (en) 2011-07-19 2013-12-31 Xerox Corporation Simulated paper texture using clear toner and glossmark on texture-less stock
CA2857168C (en) * 2011-12-01 2020-10-27 Protevobio, Inc. Protein inhibitors to complement and vegf pathways and methods of use thereof
BR112014026162A2 (pt) * 2012-04-23 2017-10-03 Nrl Pharma Inc Proteína de fusão ou variante da mesma, molécula de ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, animal não humano geneticamente modificado, planta geneticamente modificada, agente terapêutico para doenças melhoradas por lactoferrina, composição farmacêutica, e, método para preparar a proteína de fusão ou variante da mesma
DK3110434T3 (en) * 2014-02-24 2019-01-14 Takeda Gmbh UTI FUSION PROTEINS

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103044554A (zh) * 2012-05-14 2013-04-17 旭华（上海）生物研发中心有限公司 重组二聚化人尿胰蛋白酶抑制剂、其制备方法及其应用
JP2013253079A (ja) * 2012-05-14 2013-12-19 Xuhua (Shanghai) Biological Research & Development Center Co Ltd 生物学的に活性なヒト尿中トリプシンインヒビターのＦｃ融合タンパク質並びにその調製および使用

Also Published As

Publication number Publication date
SG10201708400QA (en) 2017-11-29
PE20170257A1 (es) 2017-03-30
MX2019013124A (es) 2020-08-31
SG11201606691QA (en) 2016-09-29
EA201691702A1 (ru) 2017-01-30
CA3178241A1 (en) 2015-08-27
EP3110434B1 (en) 2018-09-19
AU2021225156A1 (en) 2021-09-30
CN110092837A (zh) 2019-08-06
US10351618B2 (en) 2019-07-16
PT3110434T (pt) 2018-12-19
ECSP16076535A (es) 2017-08-31
TWI694084B (zh) 2020-05-21
KR20220151005A (ko) 2022-11-11
US20160362475A1 (en) 2016-12-15
CL2016002136A1 (es) 2017-08-11
JP2023123763A (ja) 2023-09-05
AU2021225156B2 (en) 2022-11-24
PL3110434T3 (pl) 2019-01-31
NZ760789A (en) 2023-03-31
CR20160444A (es) 2017-04-21
TW201630931A (zh) 2016-09-01
IL247321B (en) 2020-06-30
PH12016501629A1 (en) 2017-02-06
KR20160141718A (ko) 2016-12-09
EP3110434A1 (en) 2017-01-04
US20200040062A1 (en) 2020-02-06
CA2939639A1 (en) 2015-08-27
CN106232135B (zh) 2019-12-10
AU2023200875A1 (en) 2023-04-27
CN110092837B (zh) 2024-01-02
JP2022002513A (ja) 2022-01-11
MY178774A (en) 2020-10-20
AU2019204448B2 (en) 2021-06-10
DOP2016000202A (es) 2016-12-15
SI3110434T1 (sl) 2019-02-28
JP6938565B2 (ja) 2021-09-22
KR102461210B1 (ko) 2022-10-31
AU2015218704A1 (en) 2016-09-22
CA2939639C (en) 2023-01-24
NZ724196A (en) 2022-01-28
JP6574431B2 (ja) 2019-09-11
AU2019204448A1 (en) 2019-07-11
EP3443978A1 (en) 2019-02-20
JO3729B1 (ar) 2021-01-31
MX2016010950A (es) 2017-04-25
US20220127334A1 (en) 2022-04-28
AU2015218704B2 (en) 2019-05-02
BR112016019390B1 (pt) 2023-11-14
NZ760008A (en) 2023-03-31
AR101597A1 (es) 2016-12-28
US20180072795A1 (en) 2018-03-15
UA118866C2 (uk) 2019-03-25
MA39347B2 (fr) 2020-05-29
EA202091567A1 (ru) 2021-07-30
LT3110434T (lt) 2018-12-27
BR112016019390A2 (pt) 2017-10-24
DK3110434T3 (en) 2019-01-14
JP2017512058A (ja) 2017-05-18
MA39347A1 (fr) 2018-06-29
HRP20182029T1 (hr) 2019-02-08
IL247321A0 (en) 2016-09-29
RS58285B1 (sr) 2019-03-29
US9856310B2 (en) 2018-01-02
ES2700149T3 (es) 2019-02-14
JP2019187427A (ja) 2019-10-31
WO2015127391A1 (en) 2015-08-27
CY1120997T1 (el) 2019-12-11
ZA201606327B (en) 2019-01-30
CN106232135A (zh) 2016-12-14
GEP20196970B (en) 2019-04-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220127334A1 (en) Uti fusion proteins
JP6063450B2 (ja) 治療用ヌクレアーゼ組成物および方法
EP3060235B1 (en) Endoglin peptides to treat fibrotic diseases
JP2022540918A (ja) ＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質及びその医薬組成物並びに用途
JP2013253079A (ja) 生物学的に活性なヒト尿中トリプシンインヒビターのＦｃ融合タンパク質並びにその調製および使用
US11485781B2 (en) Multiple specificity binders of CXC chemokines
JP2013529900A (ja) Ｂ細胞活性化因子の拮抗物質、その調製方法及び利用法
BR122023015739B1 (pt) Proteínas de fusão uti, seus usos,composição farmacêutica compreendendo a referida proteína e método de produção de uma proteína de fusão uti