CN101721699B - Vegf受体融合蛋白在制备治疗伴随vegf升高的炎症反应的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种或多种选自VEGF受体融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8的VEGF抑制剂用于治疗伴随VEGF升高的炎症反应，所述炎症反应主要包括但不限于脓毒症、重症脓毒症和脓毒症休克。融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8可与一种或多种其它药物、治疗手段联合用于治疗伴随VEGF升高的炎症反应。

Description

VEGF受体融合蛋白在制备治疗伴随VEGF升高的炎症反应的药物中的应用

技术领域

本发明涉及利用一种或多种选自VEGF受体融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8的VEGF抑制剂用于治疗伴随VEGF升高的炎症反应。

背景技术

机体发生严重的全身性炎症称为全身性炎症反应综合征(SystemicInflammatory Response Syndrome，SIRS)，由明确的病原微生物(如细菌、病毒、真菌、寄生虫等)感染引起的SIRS，统称为脓毒症(Sepsis)，并根据症状的严重程度可以分为脓毒症(Sepsis)、重症脓毒症(Severe Sepsis)、脓毒症休克(Sepsis Shock)等。简言之，脓毒症指有明显感染表现的S IRS；严重脓毒症在脓毒症基础上出现至少1个器官功能不全；脓毒性休克指在严重脓毒症基础上发生血管阻塞，甚至休克等(Bone RCetal.(1992)，Chest，101(6)：1644-1655；Levy MMetal.(2003)，Intensive Care Med.，29：530-538)。

据报道，全球每年脓毒症发病人数超过1800万人，并且每年增长1.5％。在美国，每年约有70万脓毒症患者，其中约有25万人发展为重度脓毒症、脓毒性休克，总体病死率约为50％(Barie PS etal.(2000)，American Journal of Surgery，179(Suppl2A)：2S-7S；Barie PSetal.(2000)，Surgical Infections，1：173-186；Angus DCetal.(2001)，Crit Care Med.，29(7)：1303-1310)。中国每年脓毒症病人超过300万人，死亡人数高达50万人以上。虽然治疗手段不断创新，但脓毒症的发病率和死亡率仍居高不下(Angus DCetal.(2001)，Crit.Care Med.，29(7)：1303-1310)。

抗生素对脓毒症的治疗具有重要作用，但无法解决的问题是：病源微生物感染只是脓毒症最初的触发，抗生素等虽能杀死部分病源微生物，但这些微生物代谢过程中产生的大量内毒素可能导致脓毒症，并引起肾衰、肝衰、脑衰等多种脏器衰竭(Ince C et al.(1999)，Crit Care Med，27(7)：1369-1377)。

2001年至今，美国FDA(Food and Drug Administration)仅批准一种药物用于治疗脓毒症，即除栓素注射剂(Xigris^TM)，为Eli Lilly公司产品。除栓素注射剂的活性成分重组人活化蛋白C(Recombinant Human Activated Protein C，rhAPC，或称Drotrecogin alfa)具有抗血栓、抗炎和纤溶等特性。其III期临床试验证实：治疗脓毒症患者绝对病死率降低仅6.1％(30.8％-24.7％)；只有在APACHE(AcutePhysiology And Chronic Health Evaluation，急性生理学与慢性健康状况)II评分≥25(严重脓毒症，高危死亡)时，患者的病死率降低稍大，约13％(Bernard GRetal.(2001)，N Engl J Med.344(10)：699-709)。可见目前还没有真正攻克脓毒症的药物，迫切需要发现更加有效的药物。

随着研究的不断深入，发现了多种伴随血管内皮生长因子(VascularEndothelial Growth Factor，VEGF)升高的的炎症反应，例如脓毒症、重症脓毒症、脓毒症休克等。近来研究表明，脓毒症发生后，血液循环中的VEGF含量会增加，并且与该病的严重程度正相关(Van Der Flier M et al.(2005)，Shock.，23(1)：35-38；Pickkers P et al.(2005)Shock.，24(6)：508-512；Shapiro NI et al.(2008)，Shock.，29(4)：452-457)。VEGF发挥功能需要其受体介导，VEGF受体(VascularEndothelialGrowth Factor Receptor，VEGFR)有多种，介导VEGF功能的主要受体为VEGFR-1(或称为FLT-1，FMS-like Tyrosine Kinase，FMS样酪氨酸激酶)和VEGFR-2(或称为KDR，Kinase Insert Domain-Containing Receptor，含激酶插入功能域受体，亦或称为FLK-1，Fetal Liver Kinase-1，胎儿肝激酶-1)。VEGFR-1和VEGFR-2的结构分为胞外区、胞内区和跨膜区3个部分，其中胞外区由七个免疫球蛋白样区域(d1-d7)组成，具有与VEGF结合的活性。(Ferrara N et al.(2002)，Nat Rev Cancer，10：795-803；FerraraN et al.(2002)，Semin Oncol，29(6sumppl)：10-14；Ferrara N et al.(2004)，Nat Rev Drug Discov，3(5)：391-400；Ferrara Netal.(2003)，Nat Med，9(6)：669-676)。

我们的前期工作表明，通过蛋白质工程的方法，构建的可溶性VEGF受体融合蛋白可以有效阻断由VEGF介导的信号传递(Ming Zhang et al.(2008)，Molecular Vision，14：37-49.)。我们推测这类融合蛋白可能可以用来治疗多类与VEGF相关的炎症反应相关疾病，例如脓毒症、重症脓毒症、脓毒症休克等。

发明内容

本发明的一个目的是利用融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8中一种或多种作为VEGF抑制剂，用于治疗伴随VEGF升高的炎症反应，FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8如下所述(结构示意图见附图1)：

FP1：由FLT-1的第2免疫球蛋白样区域、KDR的第3免疫球蛋白样区域和人免疫球蛋白Fc组成；

FP2：由KDR的第1免疫球蛋白样区域、FLT-1的第2免疫球蛋白样区域、KDR的第3免疫球蛋白样区域和人免疫球蛋白Fc组成；

FP3：由FLT-1的第2免疫球蛋白样区域、KDR的第3和第4免疫球蛋白样区域和人免疫球蛋白Fc组成；

FP4：由编码FLT-1的第2免疫球蛋白样区域、KDR的第3免疫球蛋白样区域、FLT-1的第4免疫球蛋白样区域和和人免疫球蛋白Fc组成；

FP5：由FLT-1的第2免疫球蛋白样区域、KDR的第3-5免疫球蛋白样区域和和人免疫球蛋白Fc组成；

FP6：由FLT-1的第2免疫球蛋白样区域、KDR的第3免疫球蛋白样区域、FLT-1的第4-5免疫球蛋白样区域和和人免疫球蛋白Fc组成；

FP7：由FLT-1的第2免疫球蛋白样区域、KDR的第3和第4免疫球蛋白样区域组成；

FP8：由FLT-1的第2免疫球蛋白样区域和KDR的第3免疫球蛋白样区域组成。

本发明涉及VEGF受体融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8的相关资料参见同一申请人的中国专利申请CN200510073595.4(WO2005/121176A1，发明名称“抑制血管生成的融合蛋白质及其用途”)和CN200610066257.2(WO2007/112675A1，发明名称“VEGF受体融合蛋白及其应用”)，这两个申请的公开内容作为本申请的一部分全文并入本申请。

融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8可以作为VEGF抑制药物的基础是：融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8具有与VEGF的特异性结合的能力，但亲和力高低有差异，以半效结合浓度(IC₅₀)作为亲和力大小的指标，IC₅₀越小说明亲和力越强。融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8与VEGF的亲和力IC50值位于4.6pM-11.2pM，其中FP3的IC₅₀值最低为4.6pM，因此FP3与VEGF的亲和力最高。(见实施例1)

本发明的一个目的是利用融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8的一种或多种作为VEGF抑制剂，用于治疗伴随VEGF升高的炎症反应，主要包括但不限于脓毒症、重症脓毒症和脓毒症休克等。

融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8适用但不限于如下病因引起的伴随VEGF升高的炎症反应：由各种微生物(如病毒、细菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体、真菌、寄生虫等)感染引起；由各种腹腔内感染(如化脓性胆囊炎、胆炎、化脓性腹膜炎、非感染性胰腺炎、肠道内细菌和内毒素移位等)引起；由各种呼吸系统感染(如化脓性支气管炎、细支气管炎，克雷白杆菌肺炎、吸入性肺炎、肺炎球菌性肺炎、葡萄球菌肺炎、过敏性肺炎、军团病肺炎、病毒性肺炎、放射性肺炎、衣原体肺炎、支原体肺炎、假单胞菌属肺炎、绿脓杆菌肺炎)引起；由泌尿系统感染(如肾盂肾炎、膀胱炎、尿道炎)引起；由产科感染、儿科感染、烧伤后感染、脏器移植后感染、药物中毒等引起。

本发明的另一个目的是利用融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8中的一种或多种VEGF抑制剂与其它治疗药物联合使用治疗伴随VEGF升高的炎症反应，这些药物包括但不限于：抗感染药物，除栓素注射剂即重组人活化蛋白C(Recombinant Human Activated Protein C，rhAPC，或称Drotrecogin alfa)，Avastin，Lucentis，VEGF-Trap，Nexavar，Sutent和Zactima等。此外，还可以包括：抗内毒素抗体、抗肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α抗体、白细胞介素(Interleukin，IL)-1受体拮抗剂、高迁移率族蛋白1、巨噬细胞移动抑制因子、补体C5a、补体受体(C5aR)及半胱氨酸蛋白酶阻断剂、细胞凋亡抑制剂、己酮可可碱，氯胺酮，乌司他丁，低分子肝素钙等。

所述的抗感染药物包括但不限于：各种抗生素如①p-内酰胺类包括青霉素类和头孢菌素类；②氨基糖甙类，包括链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、新霉素、核糖霉素、小诺霉素、阿斯霉素等；③四环素类，包括四环素、土霉素、金霉素及强力霉素等；④酰胺醇类(氯霉素类)，包括氯霉素、甲砜霉素等；⑤大环内脂类，包括红霉素、白霉素、无味红霉素、乙酰螺旋霉素、麦迪霉素、交沙霉素等；⑥其它抗生素，如林可霉素、氯林可霉素、万古霉素、杆菌肽等；抗真菌感染的药物，如多烯类(两性霉素B及其衍生物)、三唑类(如氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑等)、嘧啶类(如氟胞嘧啶)、棘白菌素类(如卡泊芬净)、复方磺胺甲口恶唑等；抗病毒类药物，如阿糖腺苷、阿昔洛韦(无环鸟苷)、泛昔洛韦、更昔洛韦、伐昔洛韦、喷昔洛韦；抗支原体药物；抗肿瘤药物如丝裂霉素、放线菌素D、博莱霉素、阿霉素等；具有免疫抑制作用的药物，如环孢霉素。

本发明的另一个目的是利用一种或多种选自VEGF受体融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8中的VEGF抑制剂与其它治疗方法联合用于治疗伴随VEGF升高的炎症反应，其它治疗方法包括治疗肺功能障碍的机械通气，补充体液(见实施例6)等，还包括但不限于：外科引流，针对器官功能衰竭的适当支持护理，例如治疗肾功能衰竭的血液透析，治疗循环衰竭的血液制品输液疗法，肠道补充营养等。

本发明的另一个目的是提供将治疗有效剂量的VEGF抑制剂，即VEGF受体融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8的一种或多种和任选的药物载体给予患者，治疗伴随VEGF升高的炎症反应。本发明的VEGF受体融合蛋白包括它们的纯化合物形式、溶剂化物形式、盐形式或盐的溶剂化物形式。

本发明涉及的融合蛋白制品经过纯化达到药用纯度后，可以根据制剂的需要制备成药物制剂，按药物制剂的常规制法完成，优选溶液制剂或干粉制剂，作为干粉制剂，使用时将干粉溶解，使成为溶液。

本发明所述的融合蛋白制剂，可以加入药物稳定所需的药用载体等，可以是适合的任何形式，优选自：磷酸钠(Sodium Phosphate)、琥珀酸钠(SodiumSuccinate)、组氨酸(Histidine)、甘露醇(Mannitol)、聚山梨醇酯20/80(Polysorbate20/80)、氯化钠(Sodium Chloride)、蔗糖(Sucrose)、三羟甲基氨基甲烷(Trometamol)和乳糖等。

本发明涉及的制剂缓冲液应含有pH缓冲系统如磷酸盐(Phosphate)、柠檬酸盐(Citrate)、乙酸盐(Acetate)、琥珀酸盐(Succinate)、三羟甲基氨基甲烷(Trometamol，又名Tris)或组氨酸(Histidine)等中的一种或多种，pH的范围在3.0至9.0。

本发明涉及的制剂缓冲液可以含有渗透压调节剂，优选自氯化钠(SodiumChloride)、葡萄糖(Dextrose)等。另外根据需要还可加入防腐剂，助溶剂等辅助成分，可以选自任何适宜的药剂学常规的辅助成分。溶剂选择水或其他等渗溶液，缓冲溶液等。可含有防腐剂如噻汞撒(Thimerosal)、亚硫酸氢钠(Sodium Bisulfite)、苯基乙醇(Benzyl Alcohol)等。对于冻干制剂，可含有赋形剂如甘露醇(Mannitol)等；对于溶液制剂，可含有表面活性剂如聚山梨醇酯(Polysorbate20或80)、十二烷基磺酸钠(SDS)等。在上述制剂中，融合蛋白的浓度范围在0.01mg/ml至1000mg/ml。

本发明融合蛋白的用量根据临床的需要、具体疾病、患者体重、病情、病程、临床医生的经验而定，作为指导，可以按照每次给药0.1mg-3000mg，优选1mg-2000mg，可以每日、每2日、每3日、每4日、每5日、每6日、每周、每两周、每三周等给药一次，或者每日给药一次以上。

本发明涉及的含有抑制血管生成的VEGF抑制剂可以通过多种不同的给药途径给予病人，其中包括(但不限于)静脉给药，皮下注射，腹腔内注射，肌注，局部给药和关节腔内注射等。

下列多项实验结果体现出融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8可以单独使用或与其它药物、治疗手段等联合使用，用于治疗伴随VEGF升高的炎症反应：

(1)对于静脉注射脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)构建的脓毒症大鼠模型，融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8治疗可以提高大鼠存活数量，其中FP3效果最好，并且融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8治疗可以抑制大鼠血浆VEGF水平，其中FP3对VEGF含量抑制最强。(见实施例2)

(2)对于盲肠结扎穿孔(Caecal Ligation Puncture，CLP)构建的脓毒症大鼠模型，分为正常组，假手术组，CLP对照组，FP1治疗组和FP3治疗组，检测不同组织部位的肿瘤坏死因子TNF-α的表达量，TNF-α量越高，说明动物发生的炎症越严重。实验结果显示：CLP造模后动物肝脏、肺脏以及血浆中的TNF-α含量迅速升高，之后缓慢降低；与CLP对照组相比，FP1和FP3治疗可不同程度地降低肝、肺组织和血浆TNF-α水平，并且FP3略优于FP1。因此，融合蛋白FP1和FP3有助于下调TNF-α的过量表达，减轻炎症反应。(见实施例3)

(3)融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8与抗生素联用可以显著提高脓毒症大鼠的生存率，以融合蛋白FP3为例，将盲肠结扎穿孔(CLP)致脓毒症大鼠模型分为未治疗组、抗生素治疗组、融合蛋白FP3治疗组，及FP3与抗生素联合治疗组。结果显示：与未治疗组相比，抗生素治疗组和FP3治疗组均使大鼠存活率显著提高，抗生素治疗组和FP3治疗组无显著差异；而FP3与抗生素联合治疗组存活率提升最为显著，显著高于其他组。(见实施例4)

(4)融合蛋白FP3与抗生素联合使用可以提高重症脓毒症小鼠的存活率，并且与对照组或单独使用抗生素治疗组相比，炎性因子TNF-α和IL-6水平均有所降低。说明融合蛋白FP3与抗生素联合使用对重症脓毒症小鼠有较好的治疗作用，并且优于抗生素的单独使用。(见实施例5)

(5)融合蛋白FP3治疗可以对脓毒症休克犬的肝、肾功能起到保护作用。脓毒症休克犬建模后，其ALT、AST、BUN、Cr等肝、肾指标逐渐升高，FP3治疗时上述指标升高较慢，说明肝、肾功能受损较小。FP3起到了治疗和缓解脓毒症休克的作用。(见实施例6)

附图说明

附图1是融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8结构示意图。它们由不同的FLT-1片段、KDR片段以及免疫球蛋白Fc片段用基因工程方法构建而成。

附图2是融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8与VEGF的亲和力实验。

附图3是融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8对大鼠存活数量的影响。

附图4是融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8对大鼠血浆VEGF含量的影响。

具体实施方式

以下实施例对本发明所涉及的融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8的部分应用作了详细说明。

实施例1融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8与VEGF结合亲和力的实验

本发明用测定游离VEGF的量来确定各种融合蛋白结合VEGF的能力。在这一试验中，将一定量的VEGF(10PM)加入离心管中，然后将含有一定浓度梯度的融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8分别加到含有VEGF的离心管中，混合好后，在37℃的培养箱中保存一个小时。一个小时以后，各个离心管中游离的VEGF由R&D系统公司(R&D systems)提供的检测VEGF量的试剂盒——VEGF检测试剂盒(VEGF assay Kit)测定。以半效结合浓度(theHalfMaximal Inhibitory Concentration，IC₅₀)作为亲和力大小的指标，IC₅₀越小说明亲和力越强。

融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8都能有效地与VEGF亲和结合，其IC₅₀值见附图2，各融合蛋白亲和力IC₅₀值位于4.6pM-11.2pM，其中FP3的IC₅₀值最低为4.6pM，因此FP3与VEGF的亲和力最高。

实施例2融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8对LPS脓毒症大鼠生存率和血浆VEGF的影响

本实验采用静脉注射脂多糖(LPS)法构建脓毒症大鼠模型(参考Schultz M J etal.(2002)，Ann Med，34：573-581)。清洁级雄性大鼠270只，体重200g-240g，各给予静脉注射脂多糖(LPS)30mg/kg，随机分为9组，各30只。其中一组为对照组，其余依次为融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8治疗组。对照组静脉注射等体积生理盐水，融合蛋白治疗组分别给予静脉注射相应融合蛋白各10mg/kg。于完成后0-96小时记录大鼠存活的数量。

将实验中死亡的大鼠立即心脏取血，或于96小时后处死再心脏取血，将血液样品保存于-20℃备用。VEGF检测采用双抗夹心ELISA法试剂盒，先用抗大鼠VEGF单抗包被酶标板，大鼠血浆样品中的VEGF会与单抗结合，加入生物素化的抗大鼠VEGF(二抗)，将与结合在单抗上的大鼠VEGF结合而形成免疫复合物，它将与结合在单抗上的大鼠VEGF结合而形成免疫复合物。加入辣根过氧化物酶标记的Streptavidin将与二抗的生物素结合，最后加入TMB显色。VEGF浓度与OD(450nm)成正比。结果以平均值±标准差表示，并作统计学分析。

大鼠存活数量的结果见附图3：与对照组相比，融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8治疗组均提高了大鼠96小时后的存活数量，其中FP3组的存活数量最高。

大鼠血浆VEGF含量的检测结果见附图4，LPS脓毒症大鼠模型建立后，大鼠血浆VEGF含量迅速升高。与对照组(即图3和图4中的control组)相比，融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8治疗组大鼠血浆VEGF含量均显著降低，均为P<0.05，其中FP3组VEGF含量最低。

实施例3融合蛋白FP1和FP3对CLP脓毒症大鼠TNF-α水平影响

清洁级雄性大鼠，体重230g～260g，用于制备盲肠结扎穿孔(CLP)脓毒症大鼠模型(参考ChaudryIHetal.(1979)，Surgery，85：205—211)。112只动物随机分组。1，正常组8只；2，假手术组8只；3，对照组32只：分别于术后2小时、8小时、24小时、48小时处死(各8只)；4，FP1给药组32只：术后静脉给予FP16mg/kg，分别于2、8、24、48小时处死(各8只)；5，FP3给药组32只：术后静脉给予FP36mg/kg，分别于2、8、24、48小时处死(各8只)。实验动物处死方式为麻醉后活杀，采集腹主动脉血，分离血清，分装后-80℃保存；另外取肝脏、肺脏，液氮保存。

TNF-α的检测：将肝、肺组织称重后匀浆，离心后取上清液。组织样本适当稀释用于检测，血清样本复融后直接检测，采用大鼠TNF-αELISA检测试剂盒，结果以平均值±标准差表示，并作统计学分析。

结果见表1：CLP造模4小时后，动物肝、肺组织、血浆中TNF-α水平迅速升高，之后缓慢降低。与对照组相比，FP1和FP3治疗可不同程度地抑制肝、肺组织和血浆中的TNF-α水平，24小时时FP1组和FP3组均与同时间点对照组有显著差异，P<0.05，并且FP3组略优于FP1组。因此，融合蛋白FP1和FP3有助于下调TNF-α的过量表达，从而减轻机体发生的严重炎症反应。

表1：FP3和FP4对CLP脓毒症大鼠TNF-α水平的影响(平均值±标准差)

实施例4融合蛋白FP3与抗生素联用对脓毒症大鼠保护作用

清洁级雄性大鼠构建盲肠结扎穿孔(CLP)脓毒症大鼠模型。将120只大鼠随机分为模型未治疗组(n＝30)、抗生素治疗组(n＝30)、融合蛋白FP3治疗组(n＝30)和联合治疗组(n＝30)。各治疗组给药方式：FP3治疗组经尾静脉注射FP310mg/kg；抗生素治疗组分别经肌肉注射氨苄青霉素100mg/kg、庆大霉素20mg/kg；联合治疗组分别肌肉注射氨苄青霉素100mg/kg、庆大霉素20mg/kg，以及尾静脉注射FP310mg/kg。模型未治疗组同法注射等量生理盐水作为对照。观察记录5天存活率，并作统计学分析。

结果见表2：与模型未治疗组相比，其余各组均使脓毒症大鼠存活率显著提升(P<0.05)，联合治疗组存活率显著高于其他组(P<0.05)，抗生素治疗组和FP3治疗组无显著差异。

表2：融合蛋白FP3与抗生素联用对脓毒症大鼠存活率的影响

实施例5融合蛋白FP3与抗生素联用对重症脓毒症小鼠细胞因子的影响

将健康昆明系小鼠，体重20g-22g，用于制备重症脓毒症小鼠模型(参考Jackson J et al.(1979)，J Endotoxin，1996，3：201-218)。将重症脓毒症小鼠模型90只，随机分为生理盐水对照组(n＝30)，抗生素治疗组(n＝30)，融合蛋白FP3与抗生素联合治疗组(n＝30)。抗生素尼泰欣和FP3给药方式均为腹腔注射，FP3为3mg/kg，尼泰欣为0.04g/kg，均为每日1次，连用3天。生理盐水对照组注射等量生理盐水。

检测指标：给药3天后处死小鼠取肺脏，若试验小鼠死亡则立即取肺脏，匀浆后离心分离上清，置-80℃冰箱保存。肿瘤坏死因子α(TNF-α)测定采用放射免疫分析法，单位用mg/kg表示，白细胞介素6(IL-6)测定采用抗原竞争放射免疫方法，单位为μg/kg，结果以平均值±标准差表示，并作统计学分析。

实验结果见表3，给药3天后，联合治疗组小鼠存活数量最高，并且炎性因子TNF-α和IL-6水平较其它两组均有明显降低(P值均小于0.05)。说明融合蛋白FP3与抗生素联合使用对重症脓毒症小鼠有较好的治疗作用，并且优于抗生素的单独使用。

表3：抗生素尼泰欣、融合蛋白FP3治疗重症脓毒症小鼠(平均值±标准差)

实施例6融合蛋白FP3对脓毒症休克犬肝、肾的保护作用

采用健康雄性犬，体重15kg-17kg，构建脓毒症休克犬模型(FinkMPetal.(1990)，Shock.J Surg Res，49：186)。将脓毒症休克犬随机分为两组，实验中，对照组(n＝20)接受10ml/(kg·h)林格氏液(RLS)。FP3治疗组(n＝20)10min内给予首剂FP35mg/kg，然后持续泵入5mg/(kg·h)，FP3溶于林格氏液，保证液体量相同。模型建立前及建立后的0小时、12小时、24小时分别取血10ml，分离出血清放置于-80℃冰箱储存，集中进行测定。肝、肾检测指标：血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)水平、血清尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)水平等，采用自动生化分析仪测定。

脓毒症休克犬的肝、肾指标检测结果分别见表4-1和表4-2，结果显示：脓毒症休克建模后，犬的ALT、AST、BUN、Cr水平逐渐升高，其中24小时后与建模前相比差异显著(P<0.05)。与对照组相比，FP3治疗组各种指标升高较慢，其中12小时-24小时时，与对照组差异显著(P<0.05)。说明FP3起到了治疗和缓解脓毒症休克的作用。

表4-1：脓毒症休克犬肝功能指标比较(平均值±标准差)

表4-2：脓毒症休克犬肾功能指标比较(平均值±标准差)

序列表

<110>成都康弘生物科技有限公司

<120>VEGF受体融合蛋白在制备治疗伴随VEGF升高的炎症反应的药物中的应用

<130>无

<160>4

<170>PatentIn version3.5

<210>1

<211>455

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

<210>2

<211>552

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

<210>3

<211>308

<212>PRT

<213>人工序列

<400>3

<210>4

<211>214

<212>PRT

<213>人工序列

<400>4

Claims (3)

1.融合蛋白FP3与氨苄青霉素和庆大霉素在制备治疗脓毒症的药物中的应用，其中所述融合蛋白FP3的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.融合蛋白FP3与尼泰欣在制备治疗脓毒症的药物中的应用，其中所述融合蛋白FP3的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的脓毒症为重症脓毒症或脓毒症休克。

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