ES2700149T3 - Proteínas de fusión de UTI - Google Patents

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Abstract

Una proteína de fusión de UTI, que comprende SEQ ID NO:1.

Description

DESCRIPCIÓN
Proteínas de fusión de UTI
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a biología molecular, farmacología y medicina.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El inhibidor de tripsina urinaria (UTI), también conocido como ulinastatina, uristatina, urinastatina, ulistina, inhibidor humano 30 (HI-30), mingina y bikunina, es un inhibidor de proteasa con un peso molecular de alrededor de 40 kD. El UTI está presente en la orina y sangre humanas (hUTI), y presenta una variedad de actividades fisiológicas tales como un efecto inhibidor sobre una familia de serina proteasas, tales como tripsina, a-quimiotripsina, plasmina, catepsina-G, y elastasa leucocitaria. El UTI también tiene un efecto inmunomodulador, y puede hacer descender la liberación de citocinas proinflamatorias, tales como factor a de necrosis tumoral (TNF-a), interleucina-1 (IL-1) e interleucina (IL-6). Además, el UTI también interfiere con la ruta de señalización mediada por dímeros activos PDGF-D (PDGF-DD)/PDGF-BBR, al neutralizar el dímero.
hUTI ha recibido una autorización de comercialización, y se comercializa un producto en Japón bajo la nombre comercial Miraclid, y se aísla de la orina humana. De hecho, el hUTI, aislado de la orina humana, se comercializa actualmente por varios fabricantes para el tratamiento de pancreatitis e insuficiencia circulatoria agua provocada por choque.
UTI se produce primero en seres humanos como una proteína precursora denominada AMBP (precursor de la a1-microglobulina/bikunina), que se codifica en el cromosoma 9 humano. La proteolisis de AMBP produce la UTI libre, que contiene 143 aminoácidos. UTI comprende dos dominios Kunitz que se sabe que inhiben serina proteasas, que están flanqueados por aminoácidos no estructurados en los términos N y C de UTI. Se espera que los dos dominios confieran diferentes especificidades de la inhibición de proteasas, debido a los diferentes aminoácidos involucrados en la unión de proteasas. Por analogía a otros inhibidores de serina proteasas (por ejemplo, BPTI, inhibidor de la tripsina pancreática bovina), podemos estimar que los dos aminoácidos clave para la inhibición de proteasas incluyen Met26 (dominio 1 de Kunitz) y Arg88 (dominio 2 de Kunitz). Poco se sabe sobre la implicación de diferentes porciones de UTI durante la inhibición de diferentes proteasas, pero se ha demostrado que la eliminación del dominio 1 de Kunitz cambia la especificidad de las proteasas, descubriendo nueva actividad inhibidora contra el Factor Xa y la calicreína plasmática. El UTI de longitud completa no muestra inhibición de estas dos proteasas (Morishita et al., Thrombosis Research 1994, vol 73 (3/4) p193-204). UTI también comprende dos azúcares unidos, uno enlazado mediante O en Ser10, y uno enlazado mediante N en Asn45. La semivida de UTI en roedores y seres humanos es 4 a 30 minutos (Fries et al, International Journal of Biochemistry and Cell Biology, 2000, vol 32, p 125-137).
Una proteína de fusión de UTI debería contener una secuencia optimizada de aminoácidos, que incluyen los mejores puntos de inicio y de parada de cualesquiera dominios UTI, y puede estar fusionada a otra proteína para mejorar las propiedades tales como la expresión, purificación, semivida y estabilidad. La secuencia exacta del compañero de fusión necesita una determinación, y puede incluir variaciones en enlazadores, puntos de inicio/parada, y/o mutaciones, que pueden cambiar las propiedades funcionales del compañero de fusión.
Se conocen variantes de ulinastatina obtenidas a partir de la orina; documentos WO199856916, US5792629, US5407915, US5409895, US7019123, y US6583108. El concepto de proteínas de fusión de ulinastatina (y sus variaciones) se ha descrito en los documentos US20080181892, US5541288, y US20080255025. Ciertas proteínas de fusión de UTI se describen en el documento CN 103044554A. Las proteínas de fusión del documento CN 103044554A se refieren a variantes específicas en el dominio Fc, presuntamente para evitar todo efecto farmacológico mediado por Fc (ADCC, CDC). Hemos encontrado sorprendentemente que una UTI-Fc con IgG1 de tipo salvaje es bien tolerada, y proporciona un incremento significativo en la semivida. También, comparadas con las proteínas de fusión de UTI del documento CN 103044554A, las presentes proteínas de fusión de UTI, en particular SEQ ID NO: 1, demuestran mayor estabilidad térmica.
La presente invención proporciona proteínas de fusión de UTI, composiciones farmacéuticas que las comprenden, métodos de preparación, y sus usos.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona proteínas de fusión de UTI, que comprenden un dominio UTI y compañeros de fusión, en las que el dominio UTI está enlazado operativamente al compañero de fusión. La presente invención proporciona proteínas de fusión de UTI, que comprenden un dominio UTI y un dominio Fc, en las que el dominio UTI está enlazado operativamente al dominio Fc. La presente invención también proporciona proteínas de fusión de UTI aisladas, como se describe en la presente.
La presente invención proporciona una proteína de fusión de UTI que comprende SEQ ID NO:1.
De acuerdo con otra realización de la presente invención, la presente invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica las proteínas de fusión de UTI que comprenden las proteínas de fusión de UTI descritas en la presente. Además, la invención proporciona las secuencias de ADN como se exponen en SEQ ID NO:2. En una realización, el ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de UTI comprende además un vector que contienen secuencias de control a las cuales está enlazado operablemente el ácido nucleico. En otra realización, la presente invención proporciona una célula hospedante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de UTI, tal como una célula de mamífero, de insecto, de E. coli o de levadura, y que mantiene la célula hospedante bajo condiciones en la que se expresa la molécula de la proteína de fusión.
En otra realización, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende las proteínas de fusión de UTI descritas en la presente, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
De acuerdo con una realización adicional de la presente invención, se proporciona un método para tratar trastornos relacionados con UTI, que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de una proteína de fusión de UTI descrita en la presente.
Es decir, la presente invención proporciona el uso de una proteína de fusión de UTI como un medicamento, que incluye la elaboración de un medicamento, y el uso de una proteína de fusión de UTI como se describe en la presente para el tratamiento de los trastornos relacionados con el u T i descritos en la presente.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
FIG. 1 Estructura de dominio UTI y sitios de glicosilación.
FIG. 2 Dos constructos de UTI-Fc que demuestran enlazadores alterados.
FIG. 3 Diversos constructos de UTI-Fc de la presente invención.
FIGS. 4 Estrategia de montaje de ADN (SLIC) usada en la construcción de la fusión de UTI.
FIG. 5 Supresión de la actividad de proteasa (tripsina) por UTI y UTI-Fc1, SEQ ID NO:1
FIG. 6 Supresión de la actividad de proteasa (quimiotripsina) por UTI-Fc1, UFC1, SEQ ID NO:1.
FIG. 7 Supresión de la actividad de proteasa (múltiples proteasas) por UTI-Fc1, UFC1, SEQ ID NO:1.
FIG. 8 Supresión de la secreción de citocina (IL-6) UTI y UTI-Fc1, UTI-Fc, SEQ ID NO:1.
FIG. 9 Rendimientos de la purificación de las proteínas de fusión de UTI.
FIG. 10 Efecto de SEQ ID NO:1 sobre C5a inducido por LPS en ratones C3H.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona proteínas de fusión de UTI según SEQ ID NO:1, un dominio UTI y un compañero de fusión, en la que el dominio UTI está enlazado operativamente al compañero de fusión. Las proteínas de fusión de UTI de la presente invención tienen un efecto inhibidor sobre proteasas, incluyendo tripsina.
En algunas realizaciones, el compañero de fusión es un polipéptido Fc humano. Se describe además un compañero de fusión que es un análogo o análogos del polipéptido Fc humano, tal como un fragmento o fragmentos del polipéptido Fc humano. Se describe que el compañero de fusión es un polipéptido Fc de ratón. Se describe que el compañero de fusión es un polipéptido Fc de rata.
En algunas realizaciones, el dominio UTI es UTI humano (hUTI). En algunas realizaciones, el dominio UTI es un análogo de hUTI. En algunas realizaciones, el dominio UTI es un fragmento de hUTI. En algunas realizaciones, la proteína de fusión de UTI comprende un dominio hUTI de tipo salvaje.
En algunas realizaciones, la proteína de fusión de UTI comprende un dominio hUTl de tipo salvaje y un dominio Fc humano. En algunas realizaciones, la proteína de fusión de UTI comprende un dominio hUTI de tipo salvaje, un dominio enlazador y un dominio Fc humano.
En algunas realizaciones, el dominio Fc se une a un receptor de Fc en una célula humana. En algunas realizaciones, la semivida en suero de la molécula es significativamente mayor que la semivida del dominio UTI solo. En algunas realizaciones, la actividad inhibidora de proteasas del dominio UTI de la molécula es la misma o mayor que el dominio UTI solo. En algunas realizaciones, la administración de la molécula a un ratón disminuye las reacciones inflamatorias, incluyendo, pero no se limitan a, la disminución de la activación de las células inmunes, o la disminución de la producción, secreción o actividad de citocinas o quimiocinas.
Se entiende que el dominio UTI puede estar enlazado operativamente al compañero de fusión mediante un dominio enlazador.
La presente invención proporciona una proteína de fusión de UTI, que comprende un dominio UTI fusionado a dominio Fc.
La proteína de fusión de la presente abarca proteínas que tienen formas monoméricas y multiméricas, ya sea que se preparen por una digestión de un anticuerpo intacto o se produzcan por otros medios.
Los términos “multímero” y “multimérico” hacen referencia a proteínas en las que dominios Fc o moléculas que comprenden dominios Fc tienen dos o más cadenas de polipéptidos asociadas en forma covalente, no covalente, o que tienen interacciones tanto covalentes como no covalentes. El término multímero incluye el término dímero.
El término “dímero” hace referencia a proteínas en las que dominios Fc o moléculas que comprenden dominios Fc tienen dos cadenas de polipéptidos asociadas covalentemente, no covalentemente, o que tienen interacciones tanto covalentes como no covalentes. Es decir, el término “dímero” hace referencia a proteínas de fusión de UTI en las que dos dominios Fc se asocian covalentemente, no covalentemente, o que tienen interacciones tanto covalentes como no covalentes. Más específicamente, el término “dímero” hace referencia a proteínas de fusión de UTI en las que dos dominios Fc se asocian covalentemente.
DEFINICIONES DE LOS TÉRMINOS
Los términos usados en esta memoria descriptiva y reivindicaciones se definen como se establece más abajo, a menos que se indique lo contrario.
Como se usa en la presente, los términos “enlazado”, “fusionado” o “fusión” se usan de manera intercambiable.
Estos términos hacen referencia a la unión de dos o más elementos o componentes o dominios, por cualquier medio, incluyendo conjugación química o medios recombinantes. Los métodos de conjugación química se conocen en la técnica.
Una “proteína de fusión” hace referencia a un polipéptido que tiene dos o más porciones enlazadas covalentemente, en el que una o más porciones derivan de proteínas diferentes. Las dos porciones pueden enlazarse directamente mediante un único enlace peptídico (por ejemplo, las porciones enlazadas directamente entre sí), o a través de un enlazador peptídico que contiene uno o más restos de aminoácidos (por ejemplo con un aminoácido interviniente o secuencia de aminoácidos entre las porciones). Por lo general, el ADN que codifica las dos porciones y el enlazador estará en el marco de lectura respecto al otro, y se produce usando técnicas recombinantes.
Un “dominio UTI” es una proteína o péptido que imita la actividad de UTI. Se entiende que el dominio UTI de la presente invención puede alterarse de manera que varíen secuencias de las secuencias de origen natural o nativas de las cuales derivan, mientras retienen la actividad deseada de la secuencia nativa. Preferentemente, el dominio UTI es UTI humano nativo (hUTI), análogos, y sus variantes. Las variantes de hUTI incluyen sustituir o modificar uno o más aminoácidos de hUTI nativo que no son una característica estructural requerida o no proporcionan actividad funcional, incluyendo sustituciones conservativas. Las variantes de hUTI incluyen eliminar o insertar uno o más aminoácidos en hUTI nativo que no son una característica estructural requerida o no proporcionan actividad funcional. Las variantes de hUTI incluyen sustituir o modificar uno o más aminoácidos de hUTI nativo para modificar una o más propiedades o actividades. Las variantes de hUTI incluyen eliminar o insertar uno o más aminoácidos de hUTI nativo para modificar una o más propiedades o actividades de UTI. Las variantes de hUTI incluyen eliminar o alterar sitios de glicosilación en UTI humano nativo. Las variantes de hUTI incluyen eliminar o alterar uno o más dominios de Kunitz. Las variantes de hUTI pueden introducirse por técnicas estándar, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR.
La secuencia de restos de aminoácidos del dominio hUTI recombinante se establece como SEQ ID NO: 31. Por lo general, el dominio UTI incluye una secuencia al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica al dominio hUTI recombinante que se indica como SEQ ID NO:31.
Un “dominio Fc” es el polipéptido que comprende la región constante de un anticuerpo, excluyendo el primer dominio de inmunoglobulina de región constante y, en algunos casos, parte o toda la bisagra. Así, un dominio Fc hace referencia a la porción que no se une al antígeno de un anticuerpo, ya sea en forma monomérica o multimérica. El anticuerpo del cual surge el dominio Fc tiene preferentemente origen humano, y puede ser cualquiera de las inmunoglobulinas, si bien se prefieren IgG1 e IgG2.
Un dominio Fc incluye la región bisagra de la cadena pesada. Por “bisagra” o “región bisagra” o “región bisagra de anticuerpo” o “región bisagra de inmunoglobulina”, en la presente, se hace referencia al polipéptido flexible que comprende los aminoácidos entre el primer y el segundo dominio constante de un anticuerpo, en dirección 5' del sitio de escisión de papaína. Por consiguiente, para IgG, un dominio Fc comprende dominios inmunoglobulínicos CH2 y CH3 y la región bisagra entre CH1 y CH2. Si bien los límites de la región Fc pueden variar, la región Fc de cadena pesada de IgG humana se define por lo general para que incluya los restos C226 o P230 en su término carboxilo, en el que la numeración se realiza de acuerdo con el índice EU y en Kabat. En algunas realizaciones, como se describirá más completamente a continuación, las modificaciones de aminoácidos se realizan al dominio Fc, por ejemplo para alterar la unión a uno o más receptores FcyR o al receptor FcRn.
Por consiguiente, la expresión “dominio Fc” incluye la región bisagra que puede truncarse, modificarse por sustitución, supresión y/o inserción, y además, la región bisagra modificada o no modificada puede ser el sitio de unión de un domino enlazador.
Un “análogo de un dominio Fc” hace referencia a una molécula o secuencia que está modificada del Fc nativo pero que todavía comprende un sitio de unión para el receptor de rescate. La expresión “análogo de un dominio Fc” incluye una molécula o secuencia que está humanizada a partir de un Fc nativo no humano. La expresión “análogo de un dominio Fc” también incluye una molécula o secuencia que carece, o tiene modificaciones, de uno o más restos Fc nativos que afectan o se ven implicados en la formación de disulfuro, incompatibilidad con una célula hospedante, heterogenicidad N-terminal con la expresión, estabilidad, glicosilación, interacción con un complemento, unión a un receptor de rescate de Fc y/o interacción con un receptor Fcy.
Las expresiones “fragmentos del dominio Fc” o “fragmento del dominio Fc” hacen referencia a un Fc nativo del cual se han eliminado uno o más sitios, en el que el sitio o sitios eliminados no constituyen las características estructurales ni actividad funcional que se requieren por las proteínas de fusión de la presente invención. Los fragmentos del dominio Fc incluyen suprimir restos del Fc nativo, o truncar el Fc nativo, y pueden incluir sustituciones de los restos restantes. Los restos insertados o alterados (por ejemplo, los restos sustituidos) pueden ser aminoácidos naturales o aminoácidos alterados, peptidomiméticos, aminoácidos no naturales o D-aminoácidos.
Por lo general, el dominio Fc incluye una secuencia al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, o IgM, en particular una IgG1 o IgG2 humana.
La expresión “dominio Fc” abarca Fc nativo y análogos de Fc, e incluye formas monoméricas y multiméricas, ya sea que se preparen mediante una digestión de un anticuerpo intacto o se produzcan por otros medios.
Un dominio Fc comprende al menos un dominio bisagra (región bisagra superior, media y/o inferior), un dominio CH2 (o una variante o fragmento del mismo), y un dominio CH3 (o una variante o fragmento del mismo). Un dominio Fc consiste en un dominio bisagra (región bisagra superior, media y/o inferior), un dominio CH2 (o una variante o fragmento del mismo), y un dominio CH3 (o una variante o fragmento del mismo). En otras ciertas realizaciones, un dominio Fc consiste en un dominio bisagra (región bisagra superior, media y/o inferior), un dominio CH2 (o una variante o fragmento del mismo), un dominio CH3 (o una variante o fragmento del mismo), y un dominio CH4 (o una variante o fragmento del mismo). En otra realización, un dominio Fc consiste en un dominio bisagra (región bisagra superior, media y/o inferior) y un dominio CH2. En otra realización, un dominio Fc consiste en un dominio bisagra (región bisagra superior, media y/o inferior) y un dominio CH3 (o una variante o fragmento del mismo). En otra realización, un dominio Fc consiste en un dominio CH2 (o una variante o fragmento del mismo), y un dominio CH3 (o una variante o fragmento del mismo). En otra realización, el dominio Fc consiste en un dominio CH2 completo y un dominio CH3 completo. En otra realización, el dominio Fc consiste en un dominio CH2 completo y un dominio CH3 completo. Un dominio Fc de la invención comprende al menos la porción de la molécula Fc conocida en la técnica como requerida para la unión de FcRn. En otra realización, un dominio Fc de la invención comprende al menos la porción de una molécula Fc conocida en la técnica como requerida para la unión de la Proteína A.
De acuerdo con la presente invención, un dominio Fc hace referencia por lo general a un polipéptido que comprende todo o parte del dominio Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina. Como se explicó anteriormente, esto incluye, pero no se limita a, polipéptidos que comprenden toda la región bisagra, los dominios CH1, CH2, y/o CH3, así como también los fragmentos de dichos péptidos que comprenden, por ejemplo, la bisagra, los dominios CH2 y CH3. El dominio Fc puede derivarse de toda inmunoglobulina de cualquier especie y/o subtipo, incluyendo, pero sin limitarse a, un anticuerpo de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, o IgM humana. Un dominio Fc incluye los dos últimos dominios de inmunoglobulina de región constante de IgA, IgD e IgG, los tres últimos dominios de inmunoglobulina de región constante de IgE e IgM, y la bisagra flexible N-terminal a estos dominios. Para IgA e IgM, Fc puede incluir la cadena J.
Un dominio Fc, como se usa en la presente, abarca moléculas de Fc nativo y variantes de Fc. Al igual que con las variantes de Fc y las proteínas de Fc nativo, la expresión dominio Fc incluye moléculas en forma monomérica y multimérica, ya sea digeridas a partir de un anticuerpo o se produzcan por otro medio.
Como se expone en la presente, se entiende que cualquier dominio Fc puede modificarse de manera que varíe en la secuencia de aminoácidos del dominio Fc nativo de la molécula de inmunoglobulina de origen natural. En ciertas realizaciones ejemplares, el dominio Fc conserva una función efectora, por ejemplo unión a FcyR. En ciertas realizaciones ejemplares, el dominio Fc carece de una función efectora, por ejemplo, unión a FcyR.
Las proteínas de fusión de UTI incluyen un dominio Fc. Los dominios Fc útiles para producir las proteínas de fusión de UTI pueden obtenerse a partir de una cantidad de fuentes diferentes. En realizaciones preferidas, un dominio Fc de las proteínas de fusión de UTI deriva de una inmunoglobulina humana.
Las expresiones “tipo salvaje” o “wt” o “nativo”, como se usan en la presente, hacen referencia a una secuencia de aminoácidos o una secuencia nucleotídica que se encuentra en la naturaleza, incluyendo variaciones alélicas. Una proteína de tipo salvaje, polipéptido, anticuerpo, inmunoglobulina, IgG, polinucleótido, ADN, ARN, y similar, tiene una secuencia de aminoácidos o una secuencia nucleotídica que no se ha modificado intencionadamente.
Se describe que las proteínas de fusión de UTI de la presente invención pueden emplear un dominio enlazador. El dominio enlazador se usa para conectar operacionalmente un dominio UTI a un compañero de fusión.
La expresión “dominio enlazador” hace referencia a enlazadores polipeptídicos, enlazadores no peptídicos, y sus combinaciones. En particular, un dominio enlazador puede ser un polipéptido. Como se usa en la presente, la expresión “dominio enlazador” hace referencia a una secuencia que conecta dos dominios en una secuencia lineal. Tal como se usa en la presente, la expresión “enlazador polipeptídico” hace referencia a una secuencia peptídica o polipeptídica (por ejemplo, una secuencia peptídica o polipeptídica sintética) que conecta dos dominio en una secuencia de aminoácidos lineal de una cadena polipeptídica. Por ejemplo, los enlazadores polipeptídicos pueden usarse para conectar un dominio UTI a un dominio Fc. Preferentemente, dichos enlazadores polipeptídicos pueden proporcionar flexibilidad a la molécula polipeptídica. Una proteína de fusión de UTI de la invención puede comprender un dominio enlazador, incluyendo un enlazador peptídico.
Por ejemplo, un dominio enlazador puede usarse para conectar dos dominios en una secuencia de aminoácidos lineal de un enlazador polipeptídico, tal como el enlazamiento de un dominio UTI con un dominio Fc. En ciertas realizaciones, un dominio enlazador puede usarse para conectar un dominio UTI a un dominio de Fc. El dominio enlazador puede usarse para conectar los dominios en cualquier orden, Por ejemplo, un enlazador conectará un dominio UTI y un dominio Fc con el orden UTI-enlazador-Fc, mientras que, en otras realizaciones, un enlazador conectará un dominio UTI y un dominio Fc con el orden Fc-enlazador-UTI, en el que las regiones polipeptídicas se indican desde el término N al término C. Enlazadores polipeptídicos ejemplares incluyen aquellos que consisten en restos de glicina y serina, los denominados enlazadores polipeptídicos Gly-Ser. Como se usa en la presente, la expresión “enlazador polipeptídico Gly-Ser” hace referencia a un péptido que consiste en restos de glicina y serina. Un enlazador polipeptídico Gly-Ser ejemplar comprende la secuencia de aminoácidos Ser(Gly4Ser)n, en la que n es un número entero 1 a 10, SEQ ID NO: 33-42, respectivamente. Se describe que la proteína de fusión de UTI incluye uno o dos enlazadores polipeptídicos Gly-Ser, en los que n=1. En una realización, la proteína de fusión de UTI incluye uno o dos enlazadores polipeptídicos Gly-Ser, en los que n=2. En una realización, la proteína de fusión de UTI incluye uno o dos enlazadores polipeptídicos Gly-Ser, en los que n=3. Se describe que la proteína de fusión de UTI incluye uno o dos enlazadores polipeptídicos Gly-Ser, en los que n=4. En una realización, la proteína de fusión de UTI incluye uno o dos enlazadores polipeptídicos Gly-Ser, en los que n=5. En realización, la proteína de fusión de UTI incluye uno o dos enlazadores polipeptídicos Gly-Ser, en los que n=6. En una realización, la proteína de fusión de UTI incluye uno o dos enlazadores polipeptídicos Gly-Ser, en los que n=7. Se describe que la proteína de fusión de UTI incluye uno o dos enlazadores polipeptídicos Gly-Ser, en los que n=8. En una realización, la proteína de fusión de UTI incluye uno o dos enlazadores polipeptídicos Gly-Ser, en los que n=9. En una realización, la proteína de fusión de UTI incluye uno o dos enlazadores polipeptídicos Gly-Ser, en los que n=10.
Otro enlazador ejemplar se da en SEQ ID NO:43.
La expresión “que comprende” significa que un compuesto, es decir, proteína de fusión, puede incluir aminoácidos adicionales en uno o en ambos términos N o C. Por supuesto, estos aminoácidos adicionales no deberían interferir significativamente con la actividad del compuesto, es decir, la proteína de fusión.
La expresión “aminoácido” hace referencia a aminoácidos de origen natural o sintéticos, así como también a análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de manera similar a los aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos de origen natural son aquellos codificados por el código genético, así como también aquellos aminoácidos codificados que se modifican posteriormente, por ejemplo hidroxiprolina y fosfoserina. Los análogos de aminoácidos hacen referencia a un compuesto, es decir, proteínas de fusión, que tiene la misma estructura química básica que los aminoácidos de origen natural, es decir, un átomo de carbono unido a un átomo de hidrógeno, grupo carboxilo, un grupo amino, y un grupo R. Los análogos de aminoácidos tienen grupos R modificados, o dan lugar a estructuras polipeptídicas modificadas, pero retienen la misma estructura química básica que los aminoácidos de origen natural.
La expresión “sustitución de aminoácidos” hace referencia al reemplazo de al menos un resto de aminoácidos existente en una secuencia de aminoácidos predeterminada o nativa por un aminoácido de “reemplazo” diferente.
La expresión “inserción de aminoácidos” hace referencia a la inserción de uno o más aminoácidos adicionales en una secuencia de aminoácidos pretederminada o nativa. La inserción puede ser uno, dos, tres, cuatro, cinco, o hasta veinte restos de aminoácidos.
La expresión “supresión de aminoácidos” hace referencia a la eliminación de al menos un aminoácido de una secuencia de aminoácidos predeterminada o nativa. La supresión puede ser uno, dos, tres, cuatro, cinco, o hasta veinte restos de aminoácidos.
Los términos “polipéptido”, “péptido” y “proteína” se usan de manera indistinta en la presente, y hacen referencia a un polímero de restos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más aminoácidos son un aminoácido no natural, un aminoácido sintético, o un aminoácido mimético.
La expresión “ácido nucleico” hace referencia a un desoxirribonucleótido o ribonucleótido, y a sus polímeros, ya sea en forma monocatenaria o bicatenaria. La expresión “ácido nucleico” se usa de forma indistinta con gen, nucleótido, polinucleótido, ADNc, ADN y ARNm. A menos que específicamente se encuentre limitada, la expresión abarca ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de unión similares al ácido nucleico natural. A menos que se limite específicamente, una secuencia nucleotídica particular también abarca sus variantes conservativamente modificadas (por ejemplo, aquellas que contienen sustituciones de codones redundantes) y secuencias complementarias, así como también las secuencias descritas específicamente.
Los polinucleótidos de la presente invención pueden estar formados por cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado, o ARN o ADN modificado. Por ejemplo, los polinucleótidos pueden estar formados por regiones monocatenarias o bicatenarias, regiones monocatenarias o bicatenarias combinadas. Además, los polinucleótidos pueden ser regiones tricatenarias que contienen ARN o ADN, o tanto ARN como ADN. Los polinucleótidos modificados incluyen bases modificadas, tales como bases tritiladas, o bases inusuales, tales como inosina. Una variedad de modificaciones pueden realizarse al ARN o al ADN; de este modo, el polinucleótido incluye formas modificadas química, enzimática o metabólicamente.
El término “derivatizado” o “derivado” hace referencia a un compuesto, es decir, proteínas de fusión, que tiene una porción cíclica, por ejemplo reticulada entre restos de cisteinilo, el compuesto, es decir, la proteína de función, está reticulado, uno o más enlaces peptidílicos se sustituyen por un enlace no peptídico, o el término N se sustituye por un NRR1, NRC(O)R-i, NRC(O)OR-i, Nh C(O)NHR-i, NRS(O)2R2, succinamida, u otro grupo, en los que R y R1 se definen en la presente, y/o el término C se sustituye por C(O)R3 o NR4R5 , y el compuesto, es decir, la proteína de fusión, en la que los restos de aminoácidos se modifican por el tratamiento con agentes capaces de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o restos terminales. R se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo de C1-6, R1 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo de C1-6, R2 se selecciona del grupo que consiste en alquilo de C1-6, cicloalquilo de C3-8, y fenilo opcionalmente sustituido; R3 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo de C1-6, y cicloalquilo de C3-8; R4 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo de C1-6; R5 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo de C1-6 y cicloalquilo de C3-8; o R4 y R5 se toman junto con el nitrógeno al cual están unidos para formar un anillo de 4 a 7 miembros, saturado, que tiene opcionalmente 1 heteroátomo anular adicional seleccionado del grupo de N, O y S.
La expresión “alquilo de C1-6” hace referencia a una cadena de alquilo lineal o ramificada de uno a seis átomos de carbono.
La expresión “cicloalquilo de C3-8” hace referencia a un anillo alquílico monocíclico o bicíclico, saturado o parcialmente (pero no completamente) insaturado, de tres a ocho átomos de carbono, e incluye ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, y similares. Se entiende que la expresión incluye ciclopentilo y ciclohexilo benzocondensados.
La expresión “fenilo opcionalmente sustituido” hace referencia a un grupo fenilo opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en halo, alquilo de C1-6, alcoxi de C1-6, ciano, y trifluorometilo.
PREPARACIÓN
Los compuestos, es decir, las proteínas de fusión, de esta invención pueden prepararse por métodos sintéticos estándar, técnicas de ADN recombinante, u otros métodos para preparar péptidos y proteínas de fusión. En un procedimiento ejemplar, un dominio hUTI se enlaza covalentemente a un dominio Fc por la expresión de un constructo de ADN que codifica el dominio UTI y el dominio Fc y cualquier dominio enlazador.
Se prevén maneras alternativas de construir una proteína de fusión de UTI. En algunas realizaciones, la orientación del dominio puede alterarse para construir una molécula Fc-UTI o una molécula UTI-Fc o una molécula UTI-Fc-UTI que retenga la unión al FcR y tenga un dominio UTI activo.
En algunas realizaciones, las proteínas de fusión de UTI incluyen un dominio Fc de tipo salvaje que puede permitir que la proteína de fusión experimente endocitosis tras la unión a FcRn (receptor Fc neonatal). Así, la presente invención proporciona además métodos para producir las proteínas de fusión de UTI descritas. Estos métodos abarcan cultivar una célula hospedante que contiene el o los ácidos nucleicos aislados que codifican las proteínas de fusión de UTI de la invención. Como apreciarán los expertos en la técnica, esto puede realizarse de diversas maneras, dependiendo de la naturaleza de la proteína de fusión de UTI. En algunas realizaciones, la proteína de fusión de UTI de la invención se produce y puede aislarse.
En general, se proporcionan ácidos nucleicos que codifican la proteína de fusión de UTI de la invención. Dichos polinucleótidos codifican un dominio UTI, el compañero de fusión, y cualquier dominio enlazador. La presente invención también contempla fragmentos de oligonucleótidos que derivan de los polinucleótidos descritos, y secuencias de ácidos nucleicos complementarias a estos polinucleótidos.
Los polinucleótidos pueden estar en forma de ARN o ADN. Los polinucleótidos en forma de ADN, ADNc, ADN genómico, análogos de ácidos nucleico, y ADN sintético están dentro del alcance de la presente invención. El ADN puede ser bicatenario o monocatenario, y si es monocatenario, puede ser la cadena codificante (sentido) o la cadena no codificante (antisentido). La secuencia codificante que codifica el polipéptido puede ser idéntica a la secuencia codificante proporcionada en la presente, o puede ser una secuencia codificante diferente, secuencia la cual, como resultado de la redundancia o degeneración del código genético, codifica los mismos polipéptidos que el ADN proporcionado en la presente.
En algunas realizaciones, el o los ácidos nucleicos que codifican las proteínas de fusión de UTI de la invención se incorporan en vectores de expresión, que pueden ser extracromosómicos, o se pueden diseñar para integrarse en el genoma de la célula hospedante en la que se introducen. Los vectores de expresión pueden contener cualquier número de secuencias reguladoras apropiadas (incluyendo, sin limitación, secuencias de control transcripcionales y traduccionales, promotores, sitios de unión al ribosoma, potenciadores, orígenes de replicación, etc.), u otros componentes (genes de selección, etc.), todos los cuales están enlazados operablemente como se sabe bien en la técnica. En algunos casos, se usan dos ácidos nucleicos, y cada uno se pone en un vector de expresión diferente (por ejemplo, cadena pesada en un primer vector de expresión, cadena ligera en un segundo vector de expresión), o como alternativa, se pueden poner en el mismo vector de expresión. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector o de los vectores de expresión, incluyendo la selección de secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedante, el nivel de expresión de proteína deseado, etc.
En general, los ácidos nucleicos y/o la expresión se pueden introducir en una célula hospedante adecuada para crear una célula hospedante recombinante mediante el uso de cualquier método apropiado para la célula hospedante seleccionada (por ejemplo, transformación, transfección, electroporación, infección), de manera que la o las moléculas de ácido nucleico estén enlazadas operablemente a uno o más elementos de control de expresión (por ejemplo, en un vector, en un constructo creado por procesos en la célula, integrados en el genoma de la célula hospedante). La célula hospedante recombinante resultante puede mantenerse bajo condiciones adecuadas para la expresión (por ejemplo, en presencia de un inductor, en un animal no humano adecuado, en un medio de cultivo adecuado complementado con sales apropiadas, factores de crecimiento, antibióticos, complementos nutricionales, etc), con lo cual se producen el o los polipéptidos codificados. En algunos casos, las cadenas pesadas se producen en una célula, y la cadena ligera en otra.
Las líneas celulares de mamíferos disponibles como hospedantes para la expresión son conocidas en la técnica, e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, incluyendo, pero no se limitan a, células de ovario de hámster chino (CHO), células HEK 293, células NSO, células HeLa, células de riñón de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), células del carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, HepG2), y un número de otras líneas celulares. Las células que no pertenecen a mamíferos, que incluyen, pero no se limitan a, células bacterianas, de levaduras, de insectos y de plantas, también pueden usarse para expresar anticuerpos recombinantes. En algunas realizaciones, los anticuerpos pueden producirse en animales transgénicos tales como vacas o pollos.
En una realización, las proteínas de fusión de la invención son codificadas por una secuencia nucleotídica. Las secuencias nucleotídicas de la invención pueden ser útiles para una cantidad de aplicaciones, que incluyen: clonación, terapia génica, expresión y purificación de proteínas, introducción de mutación, vacuna de ADN de un hospedante que lo necesita, generación de anticuerpos para, por ejemplo, inmunización pasiva, PCR, generación de cebadores y sondas, diseño y generación de ARNip, y similares. En una realización, la secuencia nucleotídica de la invención comprende, consiste en, o consiste esencialmente en, una secuencia nucleotídica seleccionada de SEQ ID NO:2.
En una realización, una secuencia nucleotídica incluye una secuencia nucleotídica idéntica a una secuencia nucleotídica expuesta en SEQ ID NO 2. En una realización, una secuencia nucleotídica incluye una secuencia nucleotídica contigua al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a una secuencia nucleotídica contigua expuesta en SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, o 32.
Se describen proteínas de fusión de UTI que comprenden una secuencia (por ejemplo, al menos un dominio Fc) derivada de una secuencia de inmunoglobulina humana. Sin embargo, las secuencias pueden comprender una o más secuencias de otras especies de mamíferos. Por ejemplo, se puede incluir un dominio Fc de primate o un dominio de nucleasa en la secuencia del sujeto. En forma alternativa, pueden estar presentes uno o más aminoácidos murinos en un polipéptido. En algunas realizaciones, las secuencias polipeptídicas de la invención no son inmunogénicas y/o presentan una inmunogenicidad reducida. Las proteínas de fusión de UTI de la invención pueden comprender sustituciones de aminoácidos conservativas en uno o más restos de aminoácidos, por ejemplo, en restos de aminoácidos esenciales o no esenciales. Una “sustitución de aminoácidos conservativa” es aquella en la que el resto de aminoácido se sustituye por un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica, incluyendo cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales ramificadas en beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). De este modo, un resto de aminoácido no esencial en un polipéptido de unión se sustituye preferentemente por otro resto de aminoácido de la misma familia de cadena lateral. En otra realización, una cadena de aminoácidos puede sustituirse por una cadena estructuralmente similar que difiere en orden y/o composición de los miembros de la familia de cadena lateral. En forma alternativa, como se describe en la presente, se pueden introducir mutaciones en forma aleatoria en toda o parte de una secuencia codificante, tal como mediante mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden incorporarse en los polipéptidos de unión de la invención y seleccionarse por su capacidad para unirse a la diana deseada.
USOS
En una realización, la invención proporciona métodos para diagnosticar y tratar afecciones relacionadas con UTI. Como se usan en la presente, los términos “afección”, “trastorno” y “enfermedad” hacen referencia a un estado no saludable o anormal. La expresión “afecciones relacionadas con u T i” incluye afecciones, trastornos y enfermedades en las que UTI proporciona un beneficio terapéutico. La expresión “afecciones relacionadas con UTI” incluye afecciones caracterizadas por un efecto inmunomodulador o inflamatorio. En particular, la expresión afecciones relacionadas con UTI incluye pancreatitis, incluyendo pancreatitis aguda y pancreatitis crónica, el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, insuficiencia circulatoria aguda (por ejemplo, provocada por choque), coagulación intravascular diseminada, y síndrome de disfunción multiorgánica. La expresión afecciones relacionadas con UTI también incluye el uso en pacientes quirúrgicos de alto riesgo. La expresión afecciones relacionadas con UTI también incluye infecciones del pulmón, hígado, corazón o riñón. La expresión afecciones relacionadas con UTI también incluye septicemia grave. La expresión afecciones relacionadas con UTI también incluye lesión pulmonar aguda (ALI) provocada por virus SARS o síndrome de disneico agudo (ARDS).
En una realización, la invención proporciona métodos para tratar una afección relacionada con UTI, que comprenden administrar a un paciente que lo necesita una cantidad efectiva, por ejemplo una cantidad farmacéuticamente efectiva, de una proteína de fusión de UTI descrita. En ciertas realizaciones, la afección es aquella mencionada especialmente aquí.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se preparan de manera conocida en la técnica farmacéutica, e incluyen como ingrediente activo al menos una de las proteínas de fusión de UTI de la invención. La composición farmacéutica de las proteínas de fusión de UTI usadas de acuerdo con la presente invención se prepara mezclando una proteína de fusión de UTI, que tiene el grado deseado de pureza, con excipientes farmacéuticamente aceptables opcionales. La expresión “excipientes farmacéuticamente aceptable” hace referencia a los usados típicamente en la preparación de composiciones farmacéuticas, y deberían ser farmacéuticamente puros y no tóxicos en las cantidades usadas. Por lo general son materiales sólidos, semisólidos o líquidos que en el agregado pueden servir como un vehículo o medio para el ingrediente activo. Algunos ejemplos de excipientes farmacéuticamente aceptables se encuentran en Remington's Pharmaceutical Sciences y the Handbook of Pharmaceutical Excipients, e incluyen diluyentes, vehículos, portadores, matrices de liberación sostenida, agentes estabilizantes, conservantes, disolventes, agentes de suspensión, amortiguadores, emulsionantes, tintes, propelentes, agentes de recubrimiento, y otros. Por lo general, para la administración intravenosa o por inyección, las proteínas de fusión de UTI de la presente invención se encuentran en forma de formulaciones liofilizadas, o disoluciones acuosas.
Los excipientes farmacéuticamente aceptables no son tóxicos para los sujetos en las cantidades usadas, e incluyen amortiguadores tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos, tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de alrededor de 10 restos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros hidratos de carbono, incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteínas); y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG).
Las composiciones farmacéuticas de la presente también pueden contener más de un compuesto activo, es decir, proteína de fusión, según sea necesario para la indicación particular bajo tratamiento, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no afectan de manera adversa al otro. Dichas moléculas están presentes en forma adecuada en combinación en cantidades que son eficaces para los fines pretendidos.
Las composiciones farmacéuticas a usar para la administración in vivo deberían ser estériles, o casi. Esto se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.
Las proteínas de fusión de UTI de la invención se administran a un sujeto, de acuerdo con métodos conocidos, tal como la administración intravenosa como un bolo o mediante infusión continua durante un período de tiempo, mediante inyección intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial o intratecal o infusión, o por vías tópicas o por inhalación. Se prefiere la administración intravenosa o subcutánea de la proteína de fusión de UTI.
Los términos “tratar”, “tratamiento” y “tratando” incluyen mejorar las afecciones descritas en la presente. Los términos “tratar”, “tratamiento” y “tratando” incluyen todos los procesos que proporcionan una desaceleración, interrupción, detención, control o parada del estado o progresión de las afecciones descritas en la presente, pero no necesariamente indican una eliminación total de todos los síntomas, o una cura de la afección. Los términos “tratar”, “tratamiento” y “tratando” tienen por objeto incluir el tratamiento terapéutico de dichos trastornos. Los términos “tratar”, “tratamiento” y “tratando” tienen por objeto incluir el tratamiento profiláctico de dichos trastornos.
Como se usa en la presente, los términos “paciente” y “sujeto” incluyen seres humanos y animales no humanos, por ejemplo mamíferos, tales como ratones, ratas, cobayas, perros, gatos, conejos, vacas, caballos, ovejas, cabras y cerdos. El término también incluye aves, peces, reptiles, anfibios, y similares. Se entiende que un paciente más particular es un ser humano. También, pacientes y sujetos más particulares son los mamíferos no humanos, tales como ratones, ratas y perros.
Tal como se usa en la presente, la expresión “cantidad eficaz” hace referencia a la cantidad de compuesto, es decir, proteína de fusión, de la invención que trata, tras una administración de dosis única o múltiple, a un paciente que sufre la afección mencionada. Una cantidad efectiva puede ser determinada con facilidad por el especialista en diagnóstico tratante como un profesional médico, tal como un médico o un veterinario como un experto en la técnica, mediante el uso de técnicas conocidas y mediante la observación de los resultados obtenidos en circunstancias análogas. Por ejemplo, un profesional médico podría comenzar las dosis del medicamento empleado en la composición farmacéutica a niveles más bajos que los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado, y gradualmente incrementar la dosis hasta que se logre el efecto deseado.
A la hora de determinar la cantidad efectiva, la dosis, se considera un número de factores por parte del especialista en diagnóstico, incluyendo, pero sin limitarse a: las especies de pacientes, su tamaño, edad y salud general; la afección, trastorno o enfermedad específica involucrada, el grado de o la implicación o la gravedad de la afección, el trastorno, o la enfermedad, la respuesta del paciente individual; el compuesto particular, es decir, la proteína de fusión, administrado; el modo de administración; las características de biodisponibilidad de la preparación administrada; el régimen de dosis seleccionado; el uso de medicamentos concomitantes; y otras circunstancias relevantes. Las cantidades específicas pueden determinarse por el experto en la técnica. Si bien estas dosificaciones se basan en sujetos humanos promedio con una masa de alrededor de 60 kg a alrededor de 70 kg, el médico podrá determinar la dosis apropiada para un paciente (por ejemplo, un lactante), en el que la masa se encuentra fuera de este intervalo de pesos.
Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta deseada. Por ejemplo, se puede administrar un bolo único, se pueden administrar varias dosis divididas en el tiempo, o la dosis puede reducirse o incrementarse proporcionalmente según lo indican las exigencias de la situación terapéutica.
Las composiciones parenterales pueden formularse en una forma unitaria de dosificación para facilitar la adminsitración y uniformidad de la dosificación. La forma unitaria de dosificación como se usa en la presente hace referencia a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos a ser tratados; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo, es decir, proteína de fusión, calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido.
Las presentes composiciones farmacéuticas se formulan preferentemente en una forma de dosificación unitaria, conteniendo cada dosis típicamente de alrededor de 0,5 mg a alrededor de 100 mg de una proteína de fusión de UTI de la invención. La expresión “forma de dosificación unitaria” hace referencia a una unidad físicamente discreta que contiene una cantidad predeterminada de ingrediente activo, en asociación con un excipiente farmacéutico adecuado, mediante el cual se usan una o más a través de los regímenes de dosificación para producir el efecto terapéutico deseado. Pueden tomarse una o más “formas de dosificación unitaria” para afectar la dosis de tratamiento.
Un intervalo no limitante ejemplar para una cantidad efectiva de una proteína de fusión de UTI usada en la presente invención es alrededor de 0,1-100 mg/kg, tal como alrededor de 0,1-50 mg/kg, por ejemplo alrededor de 0,1-20 mg/kg, tal como alrededor de 0,1-10 mg/kg, por ejemplo alrededor de 0,5 mg/kg, tal como alrededor de 0,3 mg/kg, alrededor de 1 mg/kg, o alrededor de 3 mg/kg. En otra realización, la proteína de fusión de UTI se administra en una dosis de 1 mg/kg o más, tal como una dosis de 1 a 20 mg/kg, por ejemplo una dosis de 5 a 20 mg/kg, por ejemplo una dosis de 8 mg/kg. Un intervalo ejemplar no limitante para una cantidad eficaz de una proteína de fusión de UTI usada en la presente invención es alrededor de 1-500 mg/dosis, tal como alrededor de 1-100 mg/dosis, por ejemplo alrededor de 1 -50 mg/dosis, tal como alrededor de 1-10 mg/dosis, por ejemplo alrededor de 1 mg/dosis, o alrededor de 3 mg/dosis, o alrededor de 5 mg/dosis.
En una realización, la proteína de fusión de UTI se administra por infusión en una dosificación cada 3 días o semanalmente de 10 a 500 mg/dosis. Dicha administración puede repetirse según sea necesario para mantener el efecto terapéutico deseado.
Como ejemplos no limitantes, el tratamiento de acuerdo con la presente invención puede proporcionarse como una dosificación de la proteína de fusión de UTI en una cantidad de alrededor de 0,1-100 mg/kg, tal como 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/kg, por día, en al menos uno por día; 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, o 40 mg/kg, o como alternativa, al menos una vez por semana 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 mg/kg después del comienzo del tratamiento, o cualquiera de sus combinaciones. Como ejemplos no limitantes, el tratamiento de acuerdo con la presente invención se puede proporcionar como una dosificación de la proteína de fusión de UTI en una cantidad de alrededor de 1-100 mg/dosificación, tal como 1, 5, 10, 20, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100150, 200, 250, 300, 350, o 400 mg/dosificación. En al menos una vez por día 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, o 40 mg/dosificación después del comienzo del tratamiento, o cualquiera de sus combinaciones. En al menos una por semana 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, o 100 mg/dosificación después del comienzo del tratamiento, o cualquiera de sus combinaciones.
Las proteínas de fusión de UTI de la invención encuentran uso en una variedad de aplicaciones, incluyendo el tratamiento de enfermedades relacionadas con UTI. Las proteínas de fusión de UTI de la invención pueden encontrar uso en el tratamiento de enfermedades con implicación del sistema inmune, enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias, respuestas inflamatorias posoperatorias, enfermedades asociadas con el lisosoma, enfermedades de coagulación, enfermedades relacionadas con proteasas, y como terapia adyuvante durante cirugía. Las proteínas de fusión de UTI de la invención pueden encontrar uso en el tratamiento de pancreatitis (incluyendo pancreatitis inducida por endoscopía y pancreatitis aguda), artritis, SARS, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, insuficiencia circulatoria agua, septicemia, hepatitis, apendicitis, colitis, insuficiencia orgánica, daño orgánico (incluyendo páncreas, riñón, pulmón), lesión por reperfusión, síndrome de Stevens-Johnson, necrólisis epidérmica tóxica, choque, lesiones isquémicas, lesión pulmonar aguda (incluyendo aquella provocada por disección aórtica aguda), asma, inflamación pulmonar, neumonía (incluyendo asociada al ventilador), coagulación intravascular diseminada (DIC), síndrome disneico agudo (ARDS), y síndrome de respuesta inflamatoria sistémica.
Las proteínas de fusión de UTI de la presente invención pueden encontrar uso en a la hora de inhibir proteasas, incluyendo las serina proteasas, incluyendo tripsina, quimiotripsina, trombina, calicreína, plasmina, elastasa, catepsina, lipasa, hialuronidasa, factores IXa, Xa, Xla, y Xlla, y elastasa leucocitaria polimorfonuclear.
Las proteínas de fusión de UTI de la presente invención pueden encontrar uso en la supresión de mediadores proinflamatorios, tales como citocinas, factor alfa de necrosis tumoral, interleucina-1, -1p, -4, -6 y -8, -10, y quimiocinas.
Las proteínas de fusión de UTI de la presente invención pueden encontrar uso en el tratamiento del cáncer, incluyendo la prevención de la invasión tumoral y metástasis, índices alterados de apoptosis, y reducción de la pérdida de la función renal en el tratamiento con cisplatino.
Las proteínas de fusión de UTI de la presente invención encuentran uso para tratar el SIDA, incluyendo como tratamiento adyuvante.
EJEMPLOS
A continuación hay ejemplos de realizaciones específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen con fines ilustrativos solamente, y no pretenden limitar el alcance de la presente invención de ninguna forma. Se han hecho esfuerzos para asegurar la precisión con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.), pero se deberían permitir, por supuesto, algunos errores y desviaciones experimentales. La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, los métodos convencionales de la química de proteínas, bioquímica, técnicas de ADN recombinante y farmacología, dentro de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc.); Sambrook, et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edición, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowlck and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Carey y Sundberg Advanced Organic Chemistry 3a edición (Plenum Press) Vol A y B (1992).
EJEMPLO 1: Construcción de vectores de ADN que codifican proteínas de fusión de UTI.
Los métodos para llevar a cabo biología molecular son conocidos en la técnica, y pueden encontrarse, por ejemplo, en Molecular Cloning: A laboratory Manual 4a edición (Micheal Green and Joseph Sambrook, Cold Spring Harbor Press, 2012).
Se solicitó un gen que codifica UTI-Fc1 usando los servicios de síntesis de genes optimizada por codones GeneArt de Life Technologies (Carlsbad, CA). La secuencia de proteínas es como se enumera en SEQ ID NO: 1 con un péptido de señal, MGWSCIILFLVATATGVHS, añadido para secreción. La Figura 1 muestra las regiones generales de UTI usadas en la fusión. El gen que codifica UTI-Fc1 se ligó en un vector de expresión de mamífero. Los vectores de expresión de mamíferos son conocidos en la técnica, incluyendo los vectores pSecTag2/Hygro A, pcDNA4 y pcDNA6 (Life Technologies, Carlsbad CA). El vector se digirió con las enzimas de restricción, HindIII-HF y EcoRI de New England Biolabs (NEB). Este fragmento se ligó en el vector de expresión, que proporciona resistencia a carbenicilina y se digerido con las mismas dos enzimas de restricción. En la ligación se usó una relación molar de vector:inserto de 1:3. El ADN ligado se transformó en células de E.coli químicamente competentes 10-beta procedentes de NEB, y se colocó en placas de LB con carbenicilina para que crezcan durante toda la noche. Las colonias se hicieron crecer durante toda la noche en LB con carbenicilina, y se preparó ADN miniprep con el kit QIAprep Spin Miniprep de Qiagen (Qiagen, Hilden, Alemania). El ADN se secuenció entonces usando servicios de secuenciación de ADN de Bio Applied Technologies Joint (BATJ, San Diego). La colonia de secuencia verificada se hizo crecer posteriormente en medio LB con carbenicilina para la purificación del ADN con el instrumento BenchPro 2100 y MaxiCard de Life Technologies.
EJEMPLO 2: Construcción de vectores de ADN que codifican las proteínas de fusión de UTI-Fc.
Las SEQ ID NOS: 1-28 enumeran las secuencias de ADN y de proteínas de algunas proteínas de fusión de UTI-Fc. Estas proteínas de fusión de UTI comprenden modificaciones que alteran el isotipo Ig, enlazadores, dominios UTI, y orden de dominio UTI y Fc (N- o C-terminal), especies de UTI, especies de Fc, restos de inicio/parada de UTI, unión a azúcares, sitios sensibles a proteasas, y función efectora de Fc. En las Figuras 2 y 3 se representan algunas proteínas UTI-Fc. Las proteínas de fusión de UTI-Fc que comprenden tres modificaciones de aminoácidos para Ser (IgG1 Fc3Ser, C154S/P172S/P265S) comprenden mutaciones para alterar la formación del enlace de disulfuro y las funciones de FcyR.
Creación de los constructos de expresión de UTI-Fc
Las secuencias nucleotídicas de UTI (por ejemplo, variantes de tipo salvaje, S10A, y K21S K22S) y los dominios Fc3Ser humanos se optimizaron en los codones para la expresión en células CHO, y se sintetizaron por Life Technologies (Carlsbad, CA). Los siguientes constructos se crearon en un vector de expresión CHO ensamblando dominios UTI y Fc3Ser vía un método de clonación independiente de ligación y secuencia (SLIC) (Li y Elledge 2007 Nature Methods 4(3): 251-256): UTI-Fc3Ser, UTI S10A-Fc3Ser, UTI K21S K22S-Fc3Ser, UTI m2-Fc3Ser, UTI Ll-Fc3Ser, UTI L2-Fc3Ser (Figura 4A). El ensamblaje de ADN basado en SLIC se realizó mezclando los vectores linealizados (30 ng), los productos de PCR de UTI (100 ng) y Fc3Ser (100 ng), con secuencias protuberantes apropiadas para la recombinación homologa, y T4 ADN polimerasa (0,5 U) en un volumen de 5 |il que contiene NEBuffer 2 y BSA (New England Biolabs). Después de incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente, la actividad de exonucleasa de T4 ADN polimerasa se paralizó al añadir 2 mM de dCTP. Luego se realizó la recombinación homóloga in vitro mediante gradiente de temperatura de 75C a 37C durante 30 minutos. La mezcla de reacción que contiene ADN ensamblado se transformó químicamente en TOP10 E. coli (Invitrogen), y se colocó en placas de LB-agar que contienen carbenicilina. Los marcos de lectura abiertos para los constructos restantes (UTI ml-Fc3Ser, UTI dl-Fc3Ser, UTI d2-Fc3Ser, UTI L3-Fc3Ser, UTI-Fc IgG2, Fc3Ser-UTI, y UTI de ratón-IgGl de ratón) se optimizaron en cuanto a los codones y se sintetizaron como constructos de fusión Estos constructos se clonaron en el vector de expresión con el método SLIC como se describió anteriormente (Figura 4B). Las secuencias de ADN de los 13 constructos en el vector se verificaron mediante secuenciación de ADN de Sanger.
EJEMPLO 3: Expresión de las fusiones UTI-Fc en células CHO.
Un vector de ADN que codifica UTI-Fc1 se transfectó establemente en células CHO-S usando el reactivo Freestyle MAX de Invitrogen. Los cultivos en masa se cultivaron en matraces T, y se seleccionaron usando CD c Ho suplementado con diversas concentraciones de metionina sulfoximina (MSX) que varían de 50-100 |iM. Una vez que los cultivos se recuperaron de la selección, se expandieron para la producción y crioconservación. Se realizaron múltiples lotes de producción para soportar las pruebas in vitro e in vivo. El proceso de producción es un cultivo por lote alimentado de 10 a 14 días con CD FortiCHO, CD Efficient Feed B, y CD Efficient Feed C, de Invitrogen. Los volúmenes de producción oscilaron de 11 a 3l, y los cultivos se cosecharon por centrifugación a 3500 rpm durante 1 a 2 horas, seguido de la filtración estéril del sobrenadante, y el sobrenadante celular resultante se usó en la purificación.
EJEMPLO 4: Purificación de proteínas de fusión de UTI-Fc.
La purificación de 2 lotes de UTI-Fc1 se realizó aplicando 2,3 litros de medio acondicionado de células CHO con UTI-Fc1 expresada a 30 ml de protein A mAb select 1x (GE healthcare) equilibrada en 25 mM de citrato trisódico pH 8,1, 125 mM de NaCl. La columna se lavó con 2 volúmenes de columna (60 ml) de 25 mM de citrato trisódico pH 8,1, 125 mM de NaCl, y luego con 2 volúmenes de columna (60 ml) 25 mM de citrato trisódico pH 8,1,2000 mM de NaCl. La columna se equilibró luego con 2 volúmenes de columna (60 ml) 25 mM de citrato trisódico pH 8,1, 125 mM de NaCl. UTI-Fc1 se eluyó con gradiente de 7 volúmenes de columna (210 ml) hasta 100% de 25 mM de ácido cítrico pH 2,9, 125 mM de NaCl. La UTI-Fc1 eluyó como dos picos, un pico amplio y flanqueante, a un pH aproximado de 5,5, y un pico más agudo, a un pH aproximado de 3,5. Luego, la UTI-Fc concentrada se sometió a intercambio de amortiguador en un amortiguador final de TBS pH 7,4 (25 mM de tris, 130 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl pH 7,4) usando concentradores centrífugos Amicon Ultra con un corte de peso molecular (M.W.C.O.) de 30K. El rendimiento de la proteína purificada se muestra en la TABLA 1, y la proteína se almacenó a -80°C para su uso posterior.
TABLA 1
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EJEMPLO 5: Expresión y purificación de proteínas de fusión de UTI-Fc adicionales.
En el día de la transfección, las células CHO se contaron y se sembraron a una densidad de 2,2x10A6 células vivas/ml en 90 % del volumen total - 900 ml, y se cultivaron en matraces agitadores a 33°C hasta la transfección. Se descongeló el ADN congelado, y se añadió a PEI (Polietilenimina - un polímero catiónico) y AKT. Se añadió ADN a 0,625 ug/ 1 millón de células. 1l de células requiere 1,25 mg. 90% del ADN total añadido es ADN de interés = 1,125 mg. El restante 10% fue AKT (codifica proteína antiapoptótica) = 0,125 mg. Se añadió PEI a 2,5 ug/ 1 millón de células. Para una transfección de 1l, esto fue 5 mg. La solución de PEI se añadió al ADN diluido, y se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de la adición del complejo de ADN a las células.
Los cultivos se hicieron crecer a 33°C, 5% de CO2 y 125 rpm. 1 a 4 horas posteriores a la transfección, se añadió 0,6 mM de ácido valproico. Para la transfección de 1l, esto fue 2 ml de 300mM de disolución madre. En el día 1, se añadió 1:250 de agente antiaglomerantes, es decir, 4 ml /1l y 15% v/v de CD Efficient Feed C, es decir, 150 ml/1l. En el día 5 y el día 9, se añadió 15% de CD Efficient Feed C.
Las sobrenadantes celulares se cosecharon en el día 14, las células se contaron, y se determinaron los títulos de las proteínas. Las células se centrifugaron por centrifugación a 3000 rpm durante 30 minutos a 4°C. Los sobrenadantes se filtraron a través de un filtro de 0,2 micrómetros, y se almacenaron a 4°C, o se congelaron a -20 °C.
La purificación de las fusiones UTI-Fc se realizó por cromatografía de Proteína A. Se mezclaron 200 ml de sobrenadante de cultivo celular con 2 ml de perlas de sefarosa con proteína A MabSelect Sure, y se agitaron durante toda la noche a 4°C. La mezcla de perlas se centrifugó entonces en tubos de 50 ml a 1200 rpm durante 5 minutos, y se desechó el sobrenadante. Las perlas se añadieron a una columna y se lavaron tres veces con amortiguador de unión (Biorad, Hercules, CA). Las fusiones de UTI se eluyeron con 8 ml de amortiguador de elución MAPS II (Biorad, Hercules, CA). Se añadieron 2 ml de disolución de neutralización (1M Tris-HCl pH 8). Las muestras fueron luego sometidas a intercambio de amortiguador en 25 mM de Citrato, 125 mM de NaCl, pH 5,5, por concentración y dilución repetida con el amortiguador con unidades centrífugas Amicon (30MWCO, 15 ml, Millipore). La Figura 9 enumera los resultados de purificación de diversas proteínas de fusión de UTI.
EJEMPLO 6: Inhibición de proteasas por proteínas de fusión de UTI.
Ensayo enzimático in vitro para la inhibición de tripsina por proteína de fusión de UTI-Fc
Se prepararon disoluciones de UTI-Fc1 a diversas concentraciones (< 200 nM de la concentración final) en 50 mM de HEPe S, 150 mM de NaCl, 20 mM de CaCl2 y 0,01% de Brij L23, pH 7,4. Se realizaron ensayos de actividad en placas de volumen pequeño de 384 pocillos Greiner. Todas las etapas se llevaron a cabo a temperatura ambiente.
Se añadió tripsina pancreática humana (concentración final de 1,5 nM) (Athens Research & Technology, Inc) a las diluciones, luego se preincubó durante 15 minutos con la UTI-Fc de ensayo. A continuación, la reacción se inició con 100 |iM (final) de sustrato hidrocloruro de N-Benzoil-L-arginina-7-amido-4-metilcumarina SIGMA B7260-25MG. El volumen total de la mezcla de reacción fue 20 l. Se determinó la actividad de tripsina mediante fluorescencia. Por ejemplo, la intensidad de fluorescencia se determinó en modo cinético a lo largo de una ventana de 30 a 60 minutos en un BMG PHERAstar FS o PHERAstar plus, usando una longitud de onda de excitación de 370 nm y una longitud de onda de emisión de 470 nm. La actividad de tripsina fue linealmente proporcional al cambio en la fluorescencia observada (final - inicial). El porcentaje de inhibición de Tripsina a una concentración de UTI-Fc dada se definió como:
Porcentaje de inhibición = 100 * (1-((Fi - Fp)/(Fn - Fp)))
en la que:
Fi fue la fluorescencia observada a una concentración dada de UTI-Fc de ensayo.
Fp fue la fluorescencia observada de un control positivo, es decir, el valor promedio de 2 a 6 ensayos en ausencia de Tripsina.
Fn fue la fluorescencia observada de un control negativo, es decir, el valor promedio de 2 a 6 ensayos de Tripsina en presencia del vehículo solo.
La IC50 (la concentración molar del compuesto, es decir, proteína de fusión, que produce una inhibición del 50 %) de un compuesto de ensayo, es decir, proteína de fusión, se calculó por ajuste de la curva de mínimos cuadrados no lineal de la ecuación porcentaje de inhibición = Pie ((Cima-Pie) / (1 ((lC50 / [UTI-Fc]) A Hill))). Hubo un control positivo incluido en el panel de UTI-Fc. Como se muestra en la Figura 5, UTI humano tuvo una IC50 de ~3 nM.
La medida de las inhibiciones de otras proteasas por UTI-Fc1 también se midió en Reaction Biology Corporation (Malvern, PA). La Figura 6 demuestra una inhibición de UTI-Fc1 de quimiotripsina. La Figura 7 enumera las constantes inhibidoras de UTI-Fc1 para una variedad de proteasas. La UTI-Fc1 inhibe la quimiotripsina y plasmina moderadamente, y muestra una débil inhibición de caspasa-1, catepsina C, y papaína.
EJEMPLO 7: Efectos celulares del tratamiento con proteínas de fusión de UTI.
La inhibición mediante UTI-Fc1 de la liberación de citocina se midió en un ensayo basado en células. Células BEAS2B se sembraron a la densidad de 20.000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos, y se cultivaron con un BEGM Bullet Kit (Lonza) completo en incubadora de CO2. Después de 24 horas, el medio de cultivo se sustituyó por DMEM puro para la inanición celular, y las células se cultivaron toda la noche. Después, las células se incubaron con DMEM puro nuevo, que contiene 100 nM de tripsina, con diversas concentraciones de UTI de orina humana o proteínas UTI-Fc1 recombinantes. Tras 8 horas, los sobrenadantes del cultivo se recogieron, y se evaluaron los niveles de proteína IL-6 usando DuoSet (R&D Systems) para IL-6 humana.
Los resultados demuestran que tanto UTI como UTI-Fc disminuyeron la producción de IL-6 inducida por tripsina en células BEAS2B. Como se muestra en la Figura 8, la inhibición dependió de la dosis con valores de IC50 de 0,40 y 0,41 |ig/ml, respectivamente.
EJEMPLO 8
Medidas de estabilidad de las moléculas de UTI-Fc - Desnaturalización térmica
Se realizaron ensayos para medir la estabilidad térmica y la estabilidad en tiempo real. Todas las moléculas demostraron actividad en la inhibición de tripsina. Se midió la estabilidad térmica por calorimetría de barrido diferencial en un calorímetro Microcal VP-DSC. Las muestras se prepararon a 1 mg/ml, y se amortiguaron en 0,25 mM de Tris pH7,4, 0,13M de NaCl y 0,0027M de KCl. Las muestras se calentaron desde 25°C hasta 110°C a una velocidad de 200°C por hora. UTI-Fc1 se comparó con la Publicación de Solicitud número CN 103044554 A, SEQ IDs 2 y 6, que comprende un dominio Fc IgG2 o IgG1, respectivamente. Los resultados se presentan en la Tabla 8.
TABLA 8
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EJEMPLO 9
Medidas de estabilidad en tiempo real
Se realizaron las medidas de estabilidad en tiempo real incubando SEQ ID NO:1 (UTI-Fcl) o CN 103044554 A, SEQ IDS 2 o 6 a 2-8°C, y 40°C durante 0,2 y 4 semanas en amortiguador de TBS, pH 7,4. La formación de especies con pesos moleculares superiores o inferiores se determinó mediante cromatografía por exclusión de tamaños (SEC), y se visualizó con electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE). La concentración de cada UTI-Fc también se monitorizó determinando la absorbancia de la disolución a 280 nm (A280), usando coeficientes de extinción determinados mediante la composición de proteínas. Las moléculas de UTI-Fc producen dos picos parcialmente superpuestos, cuando se analizan mediante SEC. El área del pico porcentual en cada muestra de UTI-Fc medida por SEC se da a conocer en la Tabla 9 en los tiempos = 0 semanas, 2 semanas y 4 semanas. También se muestra el cambio porcentual en la concentración medido mediante A280 (% A (mg/ml)) en los tiempos = 2 semanas y 4 semanas. La concentración inicial T0 de cada muestra fue UTI-Fc1 = 33,5 mg/ml, CN 103044554 A SEQ ID 2 = 8,5 mg/ml, y CN 103044554 A SEQ ID 6 = 5,6 mg/ml. Una variabilidad de 3% es típica para SEC, y 15% para las medidas de UV individuales. El análisis mediante PAGE mostró que cada molécula de UTI-Fc mostró el patrón de bandas esperado para UTI-Fc de longitud completa.
TABLA 9.
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EJEMPLO 10
Ensayos in vivo de la inhibición del complemento.
Se midieron in vivo los efectos de UTI-Fc1 (SEQ ID NO:1) sobre el sistema del complemento. Se adquirieron ratones hembra C3h/HeJ a Jackson Laboratories. A los animales se les dosificó de acuerdo con el diseño experimental de la Tabla 10. A los animales se les inyectó i.p. (100 ul/ratón) 15 minutos tras la dosis con LPS en el tiempo cero. Los animales se sometieron a eutanasia 2 y 4 horas después de la inyección de LPS mediante sobredosis de CO2, y se recogió la sangre mediante punción cardíaca. La sangre se transfirió a microtubos separadores de suero y se dejó coagular a temperatura ambiente durante 30 minutos. Posteriormente, los microtubos se centrifugaron a 12.000 rpm durante 5 minutos, y el suero se retiró y se fraccionó en una placa de 96 pocillos. Se usó ácido rosmarínico como un control positivo, y se usó como 3 mg/ml en disolución salina. La placa de 96 pocillos se congeló a -20°C. Las muestras de suero se analizaron para determinar el contenido de C5a mediante Duoset. Se determinó la significancia estadística usando software de generación de gráficos Prism, y los efectos se consideraron estadísticamente significativos si p < 0,05. Como se muestra en la Figura 10, SEQ ID NO:1 (UTI-Fcl) redujo significativamente C5a a 20, 50 y 100 mg/kg a 4 horas después de la dosis de LPS.
TABLA 4: Diseño experimental (UTI-Fc1 es SEQ ID:1)
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LISTADO DE SECUENCIAS SEQ ID N° 1 Secuencia de la proteína UTI-Fc 1
AVLPQEEEGSGGGQLVTEVTKKEDSCQLGYSAGPCMGMTSRYFYNGTSMACETFQ
YGGCMGNGNNFVTEKECLQTCRTVAACNLPTVRGPCRAFTQLWAFDAVKGKCVLFP
YGGCQGNGNKFYSEKECREYCGVPGDGDEELLGSGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGP
SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE
QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK.EYK.CKVSNK.ALPAPIEK.T1SKAKGQPREPQVYT
LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS
KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQRSLSLSPG SEQ ID N° 2 Secuencia de ADN de UTI-Fc 1
GCTGTGCTGCCTCAGGAAGAGGAAGGCTCTGGCGGAGGCCAGCTCGTGACCGAA
GTGACCAAGAAAGAGGACTCCTGCCAGCTGGGCTACTCTGCCGGCCCTTGTATGG
GCATGACCTCCCGGTACTTCTACAACGGCACCTCCATGGCCTGCGAGACATTCCA
GTACGGCGGCTGCATGGGCAACGGCAACAACTTTGTGACAGAGAAAGAGTGCCT
GCAGACCTGCAGAACCGTGGCCGCCTGTAACCTGCCTATCGTGCGGGGACCCTGT
CGGGCCTTTATCCAGCTGTGGGCCTTCGACGCCGTGAAGGGCAAATGCGTGCTGT
TCCCCTATGGCGGCTGCCAGGGAAATGGAAACAAGTTCTACTCCGAGAAAGAAT
GCCGCGAGTACTGTGGCGTGCCAGGCGACGGGGATGAGGAACTGCTGGGATCAG
GCGGCGGAGGCGACAAGACCCATACCTGTCCACCTTGCCCTGCCCCCGAGCTGCT
GGGAGGACCTTCTGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATC
TCCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGATCCCG
AAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCA
AGCCCAGAGAGGAACAGTACAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCG
TGCT GC ACC AGGATT GGCTGAACGGCA AAGAGTAC AAGT GC AAGGT GTCC AAC A
AGGCCCTGCCTGCCCCCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCC
GGGAACCCCAGGTGTACACACTGCCCCCTAGCCGGGAAGAGATGACAAAGAACC
AGGTGTCCCTGACCTGTCTCGTGAAGGGATTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGA
ATGGGAGTCCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCT
GGACTCCGACGGCTCATTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCCCGG
TGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACC
ACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCCCGGC SEQ ID N° 3 Secuencia de la proteína UTI-Fc IgG1 3Ser
avlpqcccgsgggqlvtcvtkkcdscqlgysagpcmgmtsryfyngtsmacctfqyggcmgngnnfvtckcclqtcrtvaacn lpivrgpcrafiqlwafdavkgkcvlfpyggcqgngnkfysekecreycgvpgdgdeellrepkssdkditcppcpapellggss vflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykck vsnkalpasiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflys kit vdksrwqqgn vises vmhealhnhytqkslslspg
SEQ ID N° 4 Secuencia del ADN de UTI-Fc IgG1 3Ser
gctgtgctgcctcaggaagaggaaggctctggcggaggccagctcgtgaccgaagtgaccaagaaagaggactcctgccagctgg gctactctgccggcccttgtatgggcatgacclcccggtacttctacaacggcacctccatggcctgcgagacattccagtacggcgg ctgcatgggcaacggcaacaactttgtgacagagaaagagtgcctgcagacctgcagaaccgtggccgcctgtaacctgcctatcgt gcggggaccctgtcgggcctttatccagctgtgggccttcgacgccgtgaagggcaaatgcgtgctgttcccctatggcggctgcca gggaaatggaaacaagttctactccgagaaagaatgccgcgagtactgtggcgtgccaggcgacggggatgaggaactgctgcgg gagcccaaatcttccgacaagacccatacctgtccaccttgccctgcccccgagctgctgggaggatcctctgtgttcctgttcccccc aaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggatcccgaagtgaa gttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagtacaactccacctaccgggtg gtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgcctcc atcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagccccgggaaccccaggtgtacacactgccccctagccgggaagagatgaca aagaaccaggtgtccctgacctgtctcgtgaagggattctacccctccgatatcgccgtggaatgggagtccaacggccagcctgag aacaactacaagaccaccccccctgtgctggactccgacggctcattcttcctgtactccaagctgacagtggacaagtcccggtggc agcagggcaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctgagccccggc SEQ ID N° 5 Secuencia de la proteína UTI-Fc IgG2 Ser
avlpqcccgsgggqlvtcvtkkcdscqlgysagpcmgmtsryfyngtsmacctfqyggcmgngnnfvtckcclqtcrtvaacn lpivrgpcrafiqlwafdavkgkcvlfpyggcqgngnkfysekecreycgvpgdgdedlrkscvecppcpappvagpsvflfp pkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgmevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsn kglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflysklt vdksrwqqgnvfscsvmlieallmhytqkslslspgk
SEQ ID N° 6 Secuencia del ADN de UTI-Fc IgG2 Ser
gctgtgctgcctcaggaagaggaaggctctggcggaggccagctcgtgaccgaagtgaccaagaaagaggactcctgccagctgg gctactctgccggcccttgtatgggcatgacctcccggtacttctacaacggcacctccatggcctgcgagacattccagtacggcgg ctgcatgggcaacggcaacaactttgtgacagagaaagagtgcctgcagacctgcagaaccgtggccgcctgtaacctgcctatcgt gcggggaccctgtcgggcctttatccagctgtgggccttcgacgccgtgaagggcaaatgcgtgctgttcccctatggcggctgcca gggaaatggaaacaagttctactccgagaaagaatgccgcgagtactgtggcgtgccaggcgacggggatgaggaactgctgcgg aaatcctgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccc tcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtgg acggcatggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgtc gtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctc caaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcct gacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagacc acacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtc ttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggtaaa
SEQ ID N° 7 Secuencia de la proteína UTI-Fc IgG2
avlpqcccgsgggqlvtcvtkkcdscqlgysagpcmgmtsryfyngtsmacctfqyggcmgngnnfvtckcclqtcrtvaacn lpivrgpcrafiqlwafdavkgkcvlfpyggcqgngnkfysekecreycgvpgdgdeellrkccvecppcpappvagpsvflfp pkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgmevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsn kglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflysklt vdksrwqqgnvfscsvmlicallmhytqkslslspgk
SEQ ID N° 8 Secuencia del ADN de UTI-Fc IgG2
gctgtgctgcctcaggaagaggaaggctctggcggaggccagctcgtgaccgaagtgaccaagaaagaggactcctgccagctgg gctactctgccggcccttgtatgggcatgacctcccggtacttctacaacggcacctccatggcctgcgagacattccagtacggcgg ctgcatgggcaacggcaacaactttgtgacagagaaagagtgcctgcagacctgcagaaccgtggccgcctgtaacctgcctatcgt gcggggaccctgtcgggcctttatccagctgtgggccttcgacgccgtgaagggcaaatgcgtgctgttcccctatggcggctgcca gggaaatggaaacaagttctactcc gagaaagaatgccgcgagtactgtggcgtgccaggcgac ggggatgaggaactgctgc gg aaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccc tcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtgg acggcatggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgtc gtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctc caaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcct gacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagacc acacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtc ttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggtaaa
SEQ ID N° 9 Secuencia de la proteína UTI-Fc IgG1 3Ser S10A
avlpqcccgagggqlvtcvtkkcdscqlgysagpcmgmtsryfyngtsmacctfqyggcmgngnnfvtckcclqtcrtvaacn lpivrgpcrafíqlwafdavkgkcvlfpyggcqgngnkfysekecreycgvpgdgdeellrepkssdkthtcppcpapellggss vflfppkpkdtlmisrtpcvtcvvvdvshcdpcvkfnwyvdgvcvhnaktkprccqynstyrwsvltvlhqdwlngkcykck vsnkalpasiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflys kit vdksrwqqgn vises vmhcalhnhytqkslslspg
SEQ ID N° 10 Secuencia del ADN de UTI-Fc IgG1 3Ser S10A
gctgtgctgcctcaggaagaggaaggcgcaggcggaggccagctcgtgaccgaagtgaccaagaaagaggactcctgccagctg ggctactctgccggcccttgtatgggcatgacctcccggtacttctacaacggcacctccatggcctgcgagacattccagtacggcg gctgcatgggcaacggcaacaactttgtgacagagaaagagtgcctgcagacctgcagaaccgtggccgcctgtaacctgcctatcg tgcggggaccctgtcgggcctttatccagctgtgggccttcgacgccgtgaagggcaaatgcgtgctgttcccctatggcggctgcca gggaaatggaaacaagttctactccgagaaagaatgccgcgagtactgtggcgtgccaggcgacggggatgaggaactgctgcgg gagcccaaatcttccgacaagacccatacctgtccaccttgccctgcccccgagctgctgggaggatcctctgtgttcctgttcccccc aaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggatcccgaagtgaa gttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagtacaactccacctaccgggtg gtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgcctcc atcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagccccgggaaccccaggtgtacacactgccccctagccgggaagagatgaca aagaaccaggtgtccctgacctgtctcgtgaagggattctacccctccgatatcgccgtggaatgggagtccaacggccagcctgag aacaactacaagaccaccccccctgtgctggactccgacggctcattcttcctgtactccaagctgacagtggacaagtcccggtggc agcagggcaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctgagccccggc SEQ ID N° 11 Secuencia de la proteína UTI-Fc IgG1 3Ser m2
cdscqlgysagpcmgmtsryfyngtsmacctfqyggcmgngnnfvtckcclqtcrtvaacnlpivrgpcrafíqlwafdavkg kcvlfpyggcqgngnkfysekecreycgvpgdgdeellrepkssdktktcppcpapellggssvflfppkpkdtlmisrtpevtc vvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpasiektiskakgqp repqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdíavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsv mhealhnhytqkslslspg
SEQ ID N° 12 Secuencia del ADN de UTI-Fc IgG1 3Ser m2
gaggactcctgccagctgggctactctgccggcccttgtatgggcatgacctcccggtacttctacaacggcacctccatggcctgcg agacattccagtacggcggctgcatgggcaacggcaacaactttgtgacagagaaagagtgcctgcagacctgcagaaccgtggcc gcctgtaacctgcctatcgtgcggggaccctgtcgggcctttatccagctgtgggccttcgacgccgtgaagggcaaatgcgtgctgtt cccctatggcggctgccagggaaatggaaacaagttctactccgagaaagaatgccgcgagtactgtggcgtgccaggcgacggg gatgaggaactgctgcgggagcccaaatcttccgacaagacccatacctgtccaccttgccctgcccccgagctgctgggaggatcc tctgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtccca cgaggatcccgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagtac aactccacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaac aaggccctgcctgcctccatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagccccgggaaccccaggtgtacacactgcccccta gccgggaagagatgacaaagaaccaggtgtccctgacctgtctcgtgaagggattctacccctccgatatcgccgtggaatgggagt ccaacggccagcctgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggactccgacggctcattcttcctgtactccaagctgacagt ggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccct gtccctgagccccggc
SEQ ID N° 13 Secuencia de la proteína UTI-Fc IgG1 3Ser ml
avlpqeeegsgggqlvtevtkkepkssdkthtcppcpapellggssvflfppkpkdtlmisrtpevtcvwdvshedpevkfnw yvdgvevhnaktkpreeqynstyrwsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpasiektiskakgqprepqvytlppsreemtkn qvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg SEQ ID N° 14 Secuencia del ADN de UTI-Fc IgG1 3Ser ml
gctgtgctgcctcaggaagaggaaggctctggcggaggccagctcgtgaccgaagtgaccaagaaagagcccaaatcttccgaca agacccatacctgtccaccttgccctgcccccgagctgctgggaggatcctctgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctg atgatctcccggacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggatcccgaagtgaagttcaattggtacgtggacg gcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagtacaactccacclaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgct gcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgcctccatcgaaaagaccatctcca aggccaagggccagccccgggaaccccaggtgtacacactgccccctagccgggaagagatgacaaagaaccaggtgtccctga cctgtctcgtgaagggaltctacccctccgatatcgccgtggaatgggagtccaacggccagcctgagaacaactacaagaccaccc cccctgtgctggactccgacggctcattcttcctgtactccaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttctcc tgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctgagccccggc
SEQ ID N° 15 Secuencia de la proteína UTI-Fc IgG1 3Ser enlazador3
avlpqcccgsgggqlvtcvtkkcdscqlgysagpcmgmtsiyfyngtsmacctfqyggcmgiignnfvtckcclqtcrtvaacn Ipivrgpcrafiqlwafdavkgkcvlfpyggcqgngnkfysekecreycgvpgdgdeellggggsggggsepkssdktlitcppc papenggssvflíppkpkdtlmísrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdw Ingkeykckvsnkalpasiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvl dsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhcalhnhytqkslslspg
SEQ ID N°: 16 Secuencia del ADN de UT1-Fc IgGl 3Ser enlazador
gctgtgctgcctcaggaagaggaaggctctggcggaggccagctcgtgaccgaagtgaccaagaaagaggactcctgccagctgg gctactctgccggcccttgtatgggcatgacctcccggtacttctacaacggcacctccatggcctgcgagacattccagtacggcgg ctgcatgggcaacggcaacaactttgtgacagagaaagagtgcctgcagacctgcagaaccgtggccgcctgtaacctgcctatcgt gcggggaccctgtcgggcctttatccagctgtgggccttcgacgccgtgaagggcaaatgcgtgctgttcccctatggcggctgcca gggaaatggaaacaagttctactccgagaaagaatgccgcgagtactgtggcgtgccaggcgacggggalgaggaactgctggga ggtggtggatcaggtggcggaggatcagagcccaaatcttccgacaagacccatacctgtccaccttgccctgcccccgagctgctg ggaggatcctctgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccctgaagtgacctgcglggtggtgg atgtgtcccacgaggatcccgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagag gaacagtacaactccacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaag gtgtccaacaaggccctgcctgcctccatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagccccgggaaccccaggtgtacacact gccccctagccgggaagagatgacaaagaaccaggtgtccctgacctgtctcgtgaagggattctacccctccgatatcgccgtgga atgggagtccaacggccagcctgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggactccgacggctcattcttcctgtactccaag ctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacaccca gaagtccctgtccctgagccccggc
SEQ ID N° 17 Secuencia de la proteína UTI-Fc IgG1 3Ser enlazador2
avlpqcccgsgggqlvtcvtkkcdscqlgysagpcmgmtsryfyngtsmacctfqyggcmgngnnfVtckcclqtci+vaacn Ipi vrgpcrafíq I wafdavkgkc v I fpyggcqgngn k fysckccrcycgvpgdgdec 11 rcppcpapc I Iggss v fl fppkpkd tlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpasi ektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrw qqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg
SEQ ID N° 18 Secuencia del ADN de UTI-Fc IgG1 3Ser enlazador2
gctgtgctgcctcaggaagaggaaggctctggcggaggccagctcgtgaccgaagtgaccaagaaagaggactcctgccagctgg gctactctgccggcccttgtatgggcatgacctcccggtacttctacaacggcacctccatggcctgcgagacattccagtacggcgg ctgcatgggcaacggcaacaactttgtgacagagaaagagtgcctgcagacctgcagaaccgtggccgcctgtaacctgcctatcgt gcggggaccctgtcgggcctttatccagctgtgggccttcgacgccgtgaagggcaaatgcgtgctgttcccctatggcggctgcca gggaaatggaaacaagttctactccgagaaagaatgccgcgagtactgtggcgtgccaggcgacggggatgaggaactgctgcgg tgtccaccttgccctgcccccgagctgctgggaggatcctctgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatctcccg gacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggatcccgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagt gcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagtacaactccacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggatt ggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgcctccatcgaaaagaccatctccaaggccaaggg ccagccccgggaaccccaggtgtacacactgccccctagccgggaagagatgacaaagaaccaggtgtccct gacel gtctcgtga agggattctacccctccgatatcgccgtggaatgggagtccaacggccagcctgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctgg actccgacggctcattcttcctgtactccaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttctcctgctccgtgatg cacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctgagccccggc
SEQ ID N° 19 Secuencia de la proteína UTI-Fc IgG1 3Ser enlazadorl
avlpqcccgsgggqlvtcvtkkcdscqlgysagpcmgmtsryfyngtsmacctfqyggcmgngnnfvtckcclqtcrtvaacn lpivrgpcrafiqlwafdavkgkcvlfpyggcqgngukfysekecreycgvssvflfppkpkdtlmisrtpevtcwvdvshedp evkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdvvlngkeykckvsnkalpasiektiskakgqprepqvytlppsr eemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytq kslslspg
SEQ ID N° 20 Secuencia del ADN de UTI-Fc IgG1 3Ser enlazadorl
gctgtgctgcctcaggaagaggaaggctctggcggaggccagctcgtgaccgaagtgaccaagaaagaggactcctgccagctgg gclactctgccggcccttgtatgggcatgacctcccggtacltctacaacggcacctccatggcctgcgagacattccagtacggcgg ctgcatgggcaacggcaacaactttgtgacagagaaagagtgcctgcagacctgcagaaccgtggccgcctgtaacctgcctatcgt gcggggaccctgtcgggcctttatccagctgtgggccttcgacgccgtgaagggcaaatgcgtgctgttcccctatggcggctgcca gggaaatggaaacaagttctactccgagaaagaatgccgcgagtactgtggcgtgtcctctgtgttcctgttccccccaaagcccaag gacaccctgatgatctcccggacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggatcccgaagtgaagttcaattggt acgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagtacaactccacctaccgggtggtgtccgtgct gaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgcctccatcgaaaaga ccatctccaaggccaagggccagccccgggaaccccaggtgtacacactgccccctagccgggaagagatgacaaagaaccagg tgtccctgacctgtctcgtgaagggattctacccctccgatatcgccgtggaatgggagtccaacggccagcctgagaacaactacaa gaccaccccccctgtgctggactccgacggctcattcttcctgtactccaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaa cgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctgagccccggc
SEQ ID N° 21 Secuencia de la proteína UTI-Fc IgG1 3Ser K21S K22S
avlpqcccgsgggqlvtcvtsscdscqlgysagpcmgmtsryfyngftmacctfqyggcmgngnnfvtckcclqtcrtvaacnl pivrgpci’afiqlwafdavkgkcvlfpyggcqgngnkíysekecreycgvpgdgdeellrepkssdkthtcppcpapellggssv flfppkpkdtlmisrtpevtcwvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckv snkalpasiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpemiykttppvldsdgsfflysk ltvdksrwqqgnvfscsvmliealhnhytqkslslspg
SEQ ID N° 22 Secuencia del ADN de UTI-Fc IgG1 3Ser K21S K22S
gctgtgctgcctcaggaagaggaaggctctggcggaggccagctcgtgaccgaagtgacctcctccgaggactcctgccagctggg ctactctgccggcccttgtatgggcatgacctcccggtacttctacaacggcacctccatggcctgcgagacattccagtacggcggct gcatgggcaacggcaacaactttgtgacagagaaagaglgcctgcagacctgcagaaccgtggccgcctgtaacctgcctatcgtgc ggggaccctgtcgggcctttatccagctgtgggccttcgacgccgtgaagggcaaatgcgtgctgttcccctatggcggctgccagg gaaatggaaacaagttctactccgagaaagaatgccgcgagtactgtggcgtgccaggcgacggggatgaggaactgctgcggga gcccaaatcttccgacaagacccatacctgtccaccttgccctgcccccgagctgctgggaggatcctctgtgttcctgttccccccaaa gcccaaggacaccctgatgatctcccggacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggatcccgaagtgaagtt caattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagtacaactccacctaccgggtggtg tccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgcctccatc gaaaagaccatctccaaggccaagggccagccccgggaaccccaggtgtacacactgccccctagccgggaagagatgacaaag aaccaggtgtccctgacctgtctcgtgaagggattctacccctccgatatcgccgtggaatgggagtccaacggccagcctgagaaca actacaagaccaccccccctgtgctggactccgacggctcattcttcctgtactccaagctgacagtggacaagtcccggtggcagca gggcaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctgagccccggc SEQ ID N° 23 Secuencia de la proteína UTI-Fc IgG1 3Ser d2
avlpqeeegsgggqlvtevtkktvaacnlpivrgpcrafíqlwafdavkgkcvlfpyggcqgngnkfysekecreycgvpgdgd eellrepkssdkthtcppcpapellggssvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeq ynstyrwsvltvlhqdwlngkcykckvsnkalpasicktiskakgqprcpqvytlppíirccmtknqvsltclvkgfypsdiavc wesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg
SEQ ID N° 24 Secuencia del ADN de UTI-Fc IgG1 3Ser d2
gctgtgctgcctcaggaagaggaaggctctggcggaggccagctcgtgaccgaagtgaccaagaaaaccgtggccgcctgtaacc tgcctatcgtgcggggaccctgtcgggcctttatccagctgtgggccttcgacgccgtgaagggcaaatgcgtgctgttcccctatggc ggctgccagggaaatggaaacaagttctactccgagaaagaatgccgcgagtactgtggcgtgccaggcgacggggatgaggaac tgctgcgggagcccaaatcttccgacaagacccatacctgtccaccttgccctgcccccgagctgctgggaggatcctctgtgttcctg ttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggatccc gaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagtacaactccaccta ccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgc ctgcctccatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagccccgggaaccccaggtgtacacactgccccctagccgggaaga gatgacaaagaaccaggtgtccctgacctgtctcgtgaagggattctacccctccgatatcgccgtggaatgggagtccaacggcca gcctgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggactccgacggctcattcttcctgtactccaagctgacagtggacaagtcc cggtggcagcagggcaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctgagc cccggc
SEQ ID N° 25 Secuencia de la proteína UTI-Fc IgG1 3Ser d i avlpqeeegsgggqlvtevtkkedscqlgysagpcmgmtsryfyngtsmacetfqyggcmgngnnfvtekeclqtcrepkssd kthtcppcpapellggssvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvishedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyiistyrvvsv ltvlhqdwlngkeykckvsnkalpasiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpen nykttppvldsdgsftlysklrvdksrwqqgnvfscsvmticíillinliyiqkslslspg
SEQ ID N° 26 Secuencia del ADN de UTI-Fc IgGi 3Ser d i
gctgtgctgcctcaggaagaggaaggctctggcggaggccagctcgtgaccgaagtgaccaagaaagaggactcctgccagctgg gctactctgccggcccttgtatgggcatgacctcccggtacttctacaacggcacctccatggcctgcgagacattccagtacggcgg ctgcatgggcaacggcaacaactttgígacagagaaagagtgcctgcagacctgcagagagcccaaatcttccgacaagacccata cctgtccaccttgccctgcccccgagctgctgggaggatcctctgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatctcc cggacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggatcccgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaa gtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagtacaactccacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccagg attggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgcctccatcgaaaagaccatctccaaggccaag ggccagccccgggaaccccaggtgtacacactgccccctagccgggaagagatgacaaagaaccaggtgtccctgacctgtctcgt gaagggattctacccctccgatatcgccgtggaatgggagtccaacggccagcctgagaacaactacaagaccaccccccctgtgct ggactccgacggctcattcttcctgtactccaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttctcctgctccgtga tgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctgagccccggc
SEQ ID N° 27 Secuencia de la proteína mUTI-mFc mIgGI avlpqcscgsgtcplitgtlkkcdscqlnyscgpclgmqcryyyngasmacctfqyggdgngnnfisckdclqtcrtiaacnlpiv qgpcrafiklwafdaaqgkciqfhyggckgngnkíysekeckeycgvpgdgyeelirskivprdcgckpcictvpevssvñfp pkpkdvltitltpkvtcwvdiskddpcvqfswfvddvcvhtaqtqprccqfnstfrsvsclpimhqdwlngkcfkcrvnsaafp apiektisktkgrpkapqvytipppkeqmakdkvsltcmitdffpeditvewqwngqpaenykntqpimdtdgsyfvysklnv qksnwcagntftcsvlhcglhnhhtckslshspgk
SEQ ID N° 28 Secuencia del ADN de mUTI-mFc mIgGI gcagtgctgccccaagagagtgaggggtcagggactgagccactaataactgggaccctcaagaaagaagactcctgccagctcaa ttactcagaaggcccctgcctagggatgcaagagaggtatlactacaacggcgcttccatggcctgcgagacctttcaatatgggggtt gcctaggcaacggcaacaacttcatctctgagaaggactgtctgcagacatgtcggaccatagcggcctgcaatctccccatagtcca aggcccctgccgagccttcataaagctctgggcatttgatgcagcacaagggaagtgcatccaattccactacgggggctgcaaagg caacggcaacaaattctactctgagaaggaatgcaaagagtactgtggagtccctggtgatgggtacgaggaactaatacgcagtaaa atcgtgcctcgggactgcggctgcaagccctgcatctgcaccgtgcccgaggtgtcctccgtgttcatcttcccacccaagcccaagg acgtgctgaccatcaccctgacccccaaagtgacctgcgtggtggtggacatctccaaggacgaccccgaggtgcagttcagttggtt cgtggacgacgtggaagtgcacaccgcccagacccagcccagagaggaacagttcaactccaccttcagatccgtgtccgagctgc ccatcatgcaccaggactggctgaacggcaaagagttcaagtgcagagtgaactccgccgccttcccagcccccatcgaaaagacc atctccaagaccaagggcagacccaaggccccccaggtgtacaccatccccccacccaaagaacagatggccaaggacaaggtgt ccctgacctgcatgatcaccgatttcttcccagaggacatcaccgtggaatggcagtggaacggccagcccgccgagaactacaaga acacccagcccatcatggacaccgacggctcctacttcgtgtactccaagctgaacgtgcagaagtccaactgggaggccggcaac accttcacctgtagcgtgctgcacgagggcctgcacaaccaccacaccgagaagtccctgtcccactcccccggcaag SEQ ID N° 29 Secuencia de la proteína Fc IgG1 3Ser UTI epkssdkthtcppcpapellggssvflfppkpkdtlmisrtpevtcvwdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynst yrwsvltvlhqdwlngkcykckvsnkalpasicktiskakgqprcpqvytlppsrccmtknqvsltclvkgfypsdiavcwcsn gqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmheallinhytqkslslspgkggggsggggsggggsavlpq eeegsgggqlvtevtkkedscqlgysagpcmgmtsryfyngtsmacetfqyggcmgngnnfvtekeclqtcrtvaacnlpivrg pcrafiqlwafdavkgkcvlfpyggcqgngnkfysekecreycgvpgdgdeellr
SEQ ID N° 30 Secuencia del ADN de Fc IgG1 3Ser UTI
gagcccaaatcttccgacaagacccatacctgtccaccttgccctgcccccgagctgctgggaggatcctctgtgttcctgttcccccc aaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggatcccgaagtgaa gttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagtacaactccacctaccgggtg gtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgcctcc atcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagccccgggaaccccaggtgtacacactgccccctagccgggaagagatgaca aagaaccaggtgtccctgacctgtctcgtgaagggattctacccctccgatatcgccgtggaatgggagtccaacggccagcctgag aacaactacaagaccaccccccctgtgctggactccgacggctcattcttcctgtactccaagctgacagtggacaagtcccggtggc agcagggcaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctgagccccggca agggaggtggtggatcaggaggtggaggttccggtggcggaggatcagctgtgctgcctcaggaagaggaaggctctggcggag gccagctcgtgaccgaagtgaccaagaaagaggactcctgccagctgggctactctgccggcccttgtatgggcatgacctcccggt acttctacaacggcacctccatggcctgcgagacattccagtacggcggctgcatgggcaacggcaacaactttgtgacagagaaag agtgcctgcagacctgcagaaccgtggccgcctgtaacctgcctatcgtgcggggaccctgtcgggcctttatccagctgtgggcctt cgacgccgtgaagggcaaatgcgtgctgttcccctatggcggctgccagggaaatggaaacaagttctactccgagaaagaatgcc gcgagtactgtggcgtgccaggcgacggggatgaggaactgctgcgg
SEQ ID N° 31 Secuencia de la proteína hUTI
avlpq eeegsgggql vtevtkkeds cqlgysagpc
mgmtsryfyn gtsmacetfq yggcmgngnn fvtekeclqt crtvaacnlp ivrgpcrafi qlwafdavkg kcvlfpyggc qgngnkfyse kecreycgvp gdgdeellrf sn SEQ ID N° 32 Secuencia de la preproteína AMBP
mrslgallll Isaclavsag pvptppdniq vqenfmsn ygkwynlaig stcpwlkkim drmtvstlvl gegateaeis mtstrwrkgv ceetsgayek tdtdgkflyh kskwnitmes yvvhtnydey aifltkkfsr hhgptitakl ygrapqlret llqdfrvvaq gvgipedsif tmadrgecvp geqepepili prvrravlpq eeegsgggql vtevtkkeds cqlgysagpc mgmtsryfyn gtsmacetfq yggcmgngnn fvtekeclqt crtvaacnlp ivrgpcrafi qlwafdavkg kcvlfpyggc qgngnkfyse kecreycgvp gdgdeellrf sn SEQ ID N° 33
SGGGGS SEQ ID N° 34
SGGGGSGGGGS SEQ ID N° 35
SGGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID N° 36
SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID N° 37
SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID N° 38
SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID N° 39
SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID N° 40
SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID N° 41

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína de fusión de UTI, que comprende SEQ ID NO:1.
2. Una proteína de fusión de UTI aislada, que comprende SEQ ID NO:1.
3. Una proteína de fusión de UTI como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, cen la que la proteína de fusión es un dímero, y comprende los dominios Fc que están asociados covalentemente.
4. Una composición farmacéutica, que comprende una proteína de fusión de UTI como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 3, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
5. Una proteína de fusión de UTI como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 3, para uso como medicamento.
6. Una proteína de fusión de UTI como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 ,2 y 3, para uso en el tratamiento de pancreatitis, incluyendo pancreatitis inducida por endoscopía y pancreatitis aguda; artritis, SARS, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, insuficiencia circulatoria agua, septicemia, hepatitis, apendicitis, colitis, insuficiencia orgánica, daño orgánico, incluyendo daño al páncreas, riñón, o pulmón; lesión por reperfusión, síndrome de Stevens-Johnson, necrólisis epidérmica tóxica, choque, lesiones isquémicas, lesión pulmonar aguda, incluyendo lesión pulmonar provocada por disección aórtica aguda; asma, inflamación pulmonar, neumonía, incluyendo neumonía asociada al ventilador; coagulación intravascular diseminada, o síndrome disneico agudo.
7. Un ácido nucleico que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica SEQ ID NO:1.
8. Un vector de expresión, que comprende un ácido nucleico como se define en la reivindicación 7.
9. Una célula hospedante recombinante, que comprende un vector de expresión como se define en la reivindicación 8.
10. Un método para producir una proteína de fusión de UTI, que comprende: colocar una célula hospedante recombinante como se define en la reivindicación 9 en un medio de cultivo, de manera que se exprese una proteína de fusión recombinante, y aislar la proteína de fusión recombinante de la célula o del medio de cultivo.
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