JP7237045B2 - 治療用ヌクレアーゼ組成物および方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2009年11月2日に提出された米国仮出願第61/257,458号および2010年8月4日に提出された米国仮出願第61/370,752号の恩典を主張し、これらの開示内容はすべて、目的を問わず、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、米国国立衛生研究所(National Institutes of Health)(助成金AI44257、NS065933およびAR048796)、ループス研究同盟(Alliance for Lupus Research)およびワシントン州ライフサイエンスディスカバリー基金(Washington State Life Science Discovery Fund)(2087750)による支援を受けて行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
本出願は、20XX年X月に作成された、サイズがXバイトであるXXXXXPCT_sequencelisting.txtという名前のテキストファイルとして電子的に提出された配列表を含む。この配列表は参照により組み入れられる。
死細胞および瀕死細胞からの(リボ)核タンパク質粒子の過剰放出は、二通りの機序によってループス病態を引き起こす可能性がある:(i)クロマチン/抗クロマチン複合体の沈着またはインサイチュー形成が腎炎を引き起こし、腎機能の低下を招く;および(ii)核タンパク質が、toll様受容体(TLR)7、8および9ならびにTLR-非依存的経路を介して先天性免疫を活性化する。核タンパク質の放出は、SLEにおける自己抗体の強力な抗原として働いて、抗原受容体およびTLRの共関与(coengagement)を通じてB細胞およびDC活性化の増幅をもたらす可能性がある。したがって、それを必要とする対象において、誘発抗原を除去するため、ならびに/または免疫刺激、免疫増幅、および免疫複合体媒介性疾患を弱めるための手段に対しては、需要が存在する。
本明細書において開示するのは、第1のヌクレアーゼドメインおよびFcドメインを含むハイブリッド型ヌクレアーゼ分子であって、第1のヌクレアーゼドメインがFcドメインと機能的に接続されているハイブリッド型ヌクレアーゼ分子である。いくつかの態様において、ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子は第1のリンカードメインをさらに含み、第1のヌクレアーゼドメインは第1のリンカードメインによってFcドメインと機能的に接続されている。
[本発明1001]
第1のヌクレアーゼドメインおよびFcドメインを含むハイブリッド型ヌクレアーゼ分子であって、第1のヌクレアーゼドメインがFcドメインと機能的に接続されている、ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1002]
ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子がポリペプチドであり、第1のヌクレアーゼドメインのアミノ酸配列がSEQ ID NO:149に記載のヒトの野生型RNaseのアミノ酸配列を含み、Fcドメインのアミノ酸配列がSEQ ID NO:145に記載のヒトの野生型IgG1 Fcドメインのアミノ酸配列を含む、本発明1001のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1003]
SEQ ID NO:163からなるポリペプチドである、本発明1001のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1004]
野生型のヒトIgG1と連結された野生型のヒトDNase1を含む、本発明1001のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1005]
野生型のヒトIgG1と連結されたヒトDNase1 G105R A114Fを含む、本発明1001のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1006]
野生型のヒトDNase1と連結された野生型のヒトIgG1と連結された野生型のヒトRNase1を含む、本発明1001のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1007]
ヒトDNase1 G105R A114Fと連結された野生型のヒトIgG1と連結された野生型のヒトRNase1を含む、本発明1001のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1008]
Fcドメインがヒト細胞上のFc受容体と結合する、本発明1001のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1009]
前記分子の血清中半減期が第1のヌクレアーゼドメインのみの血清中半減期よりも有意に長い、本発明1001のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1010]
前記分子の第1のヌクレアーゼドメインのヌクレアーゼ活性がヌクレアーゼドメインのみと同じかまたはそれよりも高い、本発明1001のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1011]
マウスに対する前記分子の投与が、マウスのループスモデルのアッセイにより測定される該マウスの生存率を高める、本発明1001のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1012]
前記分子が第1のリンカードメインをさらに含み、かつ第1のヌクレアーゼドメインが第1のリンカードメインによってFcドメインと機能的に接続されている、本発明1001のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1013]
ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子がポリペプチドであり、第1のヌクレアーゼドメインのアミノ酸配列がRNaseのアミノ酸配列を含み、第1のリンカードメインが5~32アミノ酸長であり、Fcドメインのアミノ酸配列がヒトのFcドメインのアミノ酸配列を含み、かつ第1のリンカードメインが第1のヌクレアーゼドメインのC末端およびFcドメインのN末端と接続されている、本発明1012のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1014]
ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子がポリペプチドであり、第1のヌクレアーゼドメインのアミノ酸配列がヒトRNaseのアミノ酸配列を含み、第1のリンカードメインが5~32アミノ酸長のNLGペプチドであり、Fcドメインのアミノ酸配列がヒトの野生型Fcドメインのアミノ酸配列を含み、かつ第1のリンカードメインが第1のヌクレアーゼドメインのC末端およびFcドメインのN末端と接続されている、本発明1012のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1015]
リーダー配列をさらに含む、本発明1001のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1016]
ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子がポリペプチドであり、リーダー配列がヒトVK3LPペプチドであり、かつリーダー配列が第1のヌクレアーゼドメインのN末端と接続されている、本発明1015のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1017]
ポリペプチドである、本発明1001のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1018]
ポリヌクレオチドである、本発明1001のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1019]
第1のヌクレアーゼドメインがRNaseを含む、本発明1001のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1020]
RNaseがヒトRNaseである、本発明1019のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1021]
ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子がポリペプチドであり、かつRNaseが、表2に記載のRNaseのアミノ酸配列に対して少なくとも90%類似するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、本発明1019のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1022]
RNaseがヒト膵臓RNase1である、本発明1019のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1023]
第1のヌクレアーゼドメインがDNaseを含む、本発明1001のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1024]
DNaseがヒトDNaseである、本発明1023のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1025]
ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子がポリペプチドであり、かつDNaseが、表2に記載のDNaseのアミノ酸配列に対して少なくとも90%類似するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、本発明1023のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1026]
DNaseがヒトDNaseI、TREX1およびヒトDNase1L3からなる群より選択される、本発明1023のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1027]
FcドメインがヒトFcドメインである、本発明1001のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1028]
Fcドメインが野生型Fcドメインである、本発明1001のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1029]
Fcドメインが突然変異型Fcドメインである、本発明1001のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1030]
FcドメインがヒトIgG1 Fcドメインである、本発明1001のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1031]
ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子がポリペプチドであり、かつFcドメインが、表2に記載のFcドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも90%類似するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、本発明1001のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1032]
ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子がポリペプチドであり、かつ第1のリンカードメインが約1~約50アミノ酸の長さを有する、本発明1012のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1033]
ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子がポリペプチドであり、かつ第1のリンカードメインが約5~約32アミノ酸の長さを有する、本発明1012のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1034]
ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子がポリペプチドであり、かつ第1のリンカードメインが約15~約25アミノ酸の長さを有する、本発明1012のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1035]
ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子がポリペプチドであり、かつ第1のリンカードメインが約20~約32アミノ酸の長さを有する、本発明1012のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1036]
ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子がポリペプチドであり、かつ第1のリンカードメインが約20アミノ酸の長さを有する、本発明1012のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1037]
ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子がポリペプチドであり、かつ第1のリンカードメインが約25アミノ酸の長さを有する、本発明1012のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1038]
ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子がポリペプチドであり、かつ第1のリンカードメインが約18アミノ酸の長さを有する、本発明1012のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1039]
ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子がポリペプチドであり、かつ第1のリンカードメインがgly/serペプチドを含む、本発明1012のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1040]
gly/serペプチドが式(Gly4Ser)nのものであり、式中、nが1、2、3、4、5、6、7、8、9および10からなる群より選択される正の整数である、本発明1039のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1041]
gly/serペプチドが(Gly4Ser)3、(Gly4Ser)4または(Gly4Ser)5を含む、本発明1039のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1042]
ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子がポリペプチドであり、かつ第1のリンカードメインがNLGペプチドを含む、本発明1012のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1043]
ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子がポリペプチドであり、かつ第1のリンカードメインがN結合型グリコシル化部位を含む、本発明1012のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1044]
ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子がポリペプチドであり、かつ第1のヌクレアーゼドメインがFcドメインのN末端と連結されている、本発明1001のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1045]
ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子がポリペプチドであり、かつ第1のヌクレアーゼドメインがFcドメインのC末端と連結されている、本発明1001のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1046]
第2のヌクレアーゼドメインをさらに含む、本発明1001のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1047]
第1および第2のヌクレアーゼドメインが異なるヌクレアーゼドメインである、本発明1046のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1048]
第1および第2のヌクレアーゼドメインが同じヌクレアーゼドメインである、本発明1046のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1049]
ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子がポリペプチドであり、かつ第2のヌクレアーゼドメインがFcドメインのC末端と連結されている、本発明1046のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1050]
ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子がポリペプチドであり、かつ第2のヌクレアーゼドメインがFcドメインのN末端と連結されている、本発明1046のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1051]
ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子がポリペプチドであり、かつ第2のヌクレアーゼドメインが第1のヌクレアーゼドメインのC末端と連結されている、本発明1046のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1052]
ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子がポリペプチドであり、かつ第2のヌクレアーゼドメインが第1のヌクレアーゼドメインのN末端と連結されている、本発明1046のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子。
[本発明1053]
第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドを含む二量体ポリペプチドであって、第1のポリペプチドが第1のヌクレアーゼドメインおよびFcドメインを含み、第1のヌクレアーゼドメインがFcドメインと機能的に接続されている、二量体ポリペプチド。
[本発明1054]
第2のポリペプチドが第2のヌクレアーゼドメインおよび第2のFcドメインを含む第2のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子であり、第2のヌクレアーゼドメインが第2のFcドメインと機能的に接続されている、本発明1053の二量体ポリペプチド。
[本発明1055]
本発明1001~1054のいずれかの少なくとも1つのハイブリッド型ヌクレアーゼ分子および/または少なくとも1つの二量体ポリペプチド、ならびに薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
[本発明1056]
本発明1017のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子をコードする核酸分子。
[本発明1057]
本発明1056の核酸分子を含む組換え発現ベクター。
[本発明1058]
本発明1057の組換え発現ベクターによって形質転換された宿主細胞。
[本発明1059]
以下の段階を含む、本発明1001のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子を作製する方法:ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子をコードする核酸配列を含む宿主細胞を用意する段階;およびハイブリッド型ヌクレアーゼ分子が発現される条件下で該宿主細胞を維持する段階。
[本発明1060]
異常な免疫応答と関連のある病状を治療または予防するための方法であって、それを必要とする患者に対して、本発明1001の単離されたハイブリッド型ヌクレアーゼ分子の有効量を投与する段階を含む、方法。
[本発明1061]
病状が自己免疫疾患である、本発明1060の方法。
[本発明1062]
自己免疫疾患が、インスリン依存性真性糖尿病、多発性硬化症、実験的自己免疫性脳脊髄炎、関節リウマチ、実験的自己免疫性関節炎、重症筋無力症、甲状腺炎、実験型ブドウ膜網膜炎、橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、甲状腺中毒症、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アジソン病、早発閉経、男性不妊症、若年型糖尿病、グッドパスチャー症候群、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、交感性眼炎、水晶体起因性ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、特発性白血球減少症、原発性胆汁性肝硬変、活動性慢性肝炎Hbs-ve、特発性肝硬変、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、強皮症、ヴェーゲナー肉芽腫症、多発性筋炎、皮膚筋炎、円板状エリテマトーデス、全身性エリテマトーデス(SLE)および結合組織病からなる群より選択される、本発明1061の方法。
[本発明1063]
自己免疫疾患がSLEである、本発明1061の方法。
特許請求の範囲および本明細書で用いられる用語は、別に指定する場合を除き、以下の記載のように定義される。親の仮特許出願で用いられる用語と相反する場合には、本明細書で用いられる用語が優先するものとする。
ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子
いくつかの態様において、本発明の組成物はハイブリッド型ヌクレアーゼ分子を含む。いくつかの態様において、ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子は、Fcドメインと機能的に連結されたヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの態様において、ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子は、Fcドメインと連結されたヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの態様において、ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子はヌクレアーゼタンパク質である。いくつかの態様において、ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子はヌクレアーゼポリヌクレオチドである。
いくつかの態様において、ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子はFcドメインを含む。本発明のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子を作製するために有用なFcドメインは、いくつかの異なる供給源から得ることができる。好ましい態様において、ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子のFcドメインはヒト免疫グロブリンに由来する。しかし、Fcドメインが、例えば、齧歯動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット)または非ヒト霊長動物(例えば、チンパンジー、マカク)種を含む、別の哺乳動物種の免疫グロブリンに由来してもよいことは理解されよう。さらに、ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子のFcドメインまたはその一部分は、IgM、IgG、IgD、IgAおよびIgEを含む任意の免疫グロブリンクラス、ならびにIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4を含む任意の免疫グロブリンアイソタイプに由来してもよい。1つの好ましい態様においては、ヒトのアイソタイプIgG1を用いる。
ある態様において、本発明のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子で使用されるFcドメインは、例えばアミノ酸突然変異(例えば、付加、欠失または置換)によって改変される。本明細書で用いる場合、「Fcドメイン変異体」という用語は、Fcドメインが由来する野生型Fcと比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を有するFcドメインのことを指す。例えば、FcドメインがヒトIgG1抗体に由来する場合、変異体は、ヒトIgG1 Fc領域の対応する位置に、野生型アミノ酸と比較して少なくとも1つのアミノ酸突然変異(例えば、置換)を含む。
いくつかの態様において、ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子はリンカードメインを含む。いくつかの態様において、ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子は多数のリンカードメインを含む。いくつかの態様において、リンカードメインはポリペプチドリンカーである。ある局面においては、ポリペプチドリンカーを使用して1つまたは複数のFcドメインを1つまたは複数のヌクレアーゼドメインと融合させてハイブリッド型ヌクレアーゼ分子を形成させることが望ましい。
ある局面において、ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子はヌクレアーゼドメインを含む。したがって、本発明のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子は、典型的には、少なくとも1つのヌクレアーゼドメインおよび少なくとも1つの連結したFcドメインを含む。ある局面において、ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子は多数のヌクレアーゼドメインを含む。
本発明のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子は、主として、組換えDNA手法を用いた形質転換宿主細胞において作られる。それを行うためには、そのペプチドをコードする組換えDNA分子を調製する。そのようなDNA分子を調製する方法は当技術分野において周知である。例えば、それらのペプチドをコードする配列を、適した制限酵素を用いてDNAから切り出すことができる。または、ホスホルアミデート法などの化学合成手法を用いてDNA分子を合成することもできる。また、これらの手法の組み合わせを用いることもできる。
ある態様において、ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子は単独で投与される。ある態様において、ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子は、少なくとも1つの他の治療薬の投与の前に投与される。ある態様において、ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子は、少なくとも1つの他の治療薬の投与と同時に投与される。ある態様において、ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子は、少なくとも1つの他の治療薬の投与後に投与される。他の態様において、ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子は、少なくとも1つの他の治療薬の投与の前に投与される。当業者には理解されるであろうが、いくつかの態様においては、ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子を他の薬剤/化合物と組み合わせる。いくつかの態様において、ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子および他の薬剤を同時に投与する。いくつかの態様においては、ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子および他の薬剤を同時には投与せず、ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子を、薬剤を投与する前または後に投与する。いくつかの態様において、対象は、同じ予防期間、障害発生時および/または治療期間中に、ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子および他の薬剤の両方の投与を受ける。
マウスRNase1を、ESTライブラリー(Dr. C. Raine, Albert Einstein School of Medicine, Bronx, NYによる。彼は本発明者らの研究室にMTAを交わさずにクローンを送ってきた)から完全長cDNAとして増幅した。用いた配列特異的な5'および3'プライマーは、公開配列によるものとした。クローンの配列を配列解析によって確かめた。Genebankアクセッション番号はNCBI geneID 19752である。完全長ヒトRNase1は、ヒト膵臓全RNA由来のランダムプライマー法およびオリゴdTプライマー法によるcDNA(Ambion/Applied Biosystems, Austin, TX)から単離した。
mribNL5'
30mer(ネイティブなリーダーおよびHindIII+Kozakを有するRNase 5')
27mer(RNase5'成熟配列(リーダーなし、AgeI部位を有する)
mrib3NH2
28mer(mIgG2aとの融合用のXhoI部位を有する、RNase3'末端)。
mrib5X
リンカーaaおよびFcドメインのカルボキシ末端との融合用のXbaI部位を有する、36merのRNase5'末端
mrib3X
2つの終止コドンおよびFcドメインのカルボキシ末端との融合用のXbaI部位を有する、31merのRNase3'末端
H564と命名された抗RNAハイブリドーマを用いて、RNAに特異的なV領域を単離した。採取の前に、H564抗RNAハイブリドーマ細胞を、グルタミン、ピルビン酸、DMEM非必須アミノ酸およびペニシリン-ストレプトマイシンを加えたRPMI 1640培地(Invitrogen/Life Technologies, Gaithersburg, Md.)中で数日間、対数期増殖に保った。遠心によって培地から細胞をペレット化し、2×107個の細胞をRNAの調製に用いた。QIAGEN RNAeasyキット(Valencia、Calif.)全RNA単離用キットおよびQIAGEN QIAshredderをキットに添付の製造元の指示に従って用いて、RNAをハイブリドーマ細胞から単離した。4マイクログラム(4μg)の全RNAを、逆転写によってcDNAを調製するためのテンプレートとして用いた。そのRNA、300ngのランダムプライマーおよび500ngのOligo dT(12-18)および1μlの25mM dNTPを混ぜ合わせ、80℃で5分間変性させ、その後に酵素を添加した。Superscript III逆転写酵素(Invitrogen, Life Technologies)を、酵素とともに提供された第二鎖緩衝液および0.1M DTTの存在下で総容量25μlのRNA+プライマー混合物に添加した。逆転写反応は50℃で1時間進行させた。
ヒトRNase1(SEQ ID NO:113)を、Ambion/Applied Biosystems(Austin, TX)から入手したヒト膵臓全RNAからPCR増幅によって単離した。4マイクログラム(4μg)の全RNAを、逆転写によってcDNAを調製するためのテンプレートとして用いた。そのRNA、300ngのランダムプライマーおよび500ngのOligo dT(12-18)および1ulの25mM dNTPを混ぜ合わせ、80℃で5分間変性させ、その後に酵素を添加した。Superscript III逆転写酵素(Invitrogen, Life Technologies)を、酵素とともに提供された第二鎖緩衝液および0.1M DTTの存在下で総容量25μlのRNA+プライマー混合物に添加した。逆転写反応は50℃で1時間進行させた。反応物をQIAquick PCR精製カラムによってさらに精製し、cDNAを40マイクロリットルのEB緩衝液中に溶出させて、その後にPCR反応に用いた。2マイクロリットルのcDNA溶出液を、ヒトRNase1に特異的な50pmolの5'および3'プライマーを含むPCR反応物に添加し、45マイクロリットルのPCR high fidelity supermix(Invitrogen, Carlsbad, CA)を0.2mlのPCR反応チューブに添加した。PCR反応はC1000サーマルサイクラー(BioRad, Hercules CA)を用いて行った。反応には、95Cでの2分間の初期変性段階、その後に94℃、30秒間の変性、50℃、30秒間のアニーリングおよび68℃、1分間の伸長段階を34サイクル、その後に最終的な72℃での4分間の伸長を含めた。野生型尾部を単離した上で、断片をpCR2.1ベクター中にTOPOクローニングし;QIAGEN spin plasmid miniprepキットを製造元の指示に従って用いてDNAを調製した。ABI Dye Terminator v3.1 ready reaction mixを製造元の指示に従って用いて、プラスミドDNAの配列を決定した。
マウス-Fcドメイン(SEQ ID NO:114)およびヒト-Fcドメイン(SEQ ID NO:110)の単離のために、以下の通りにマウスまたはヒトの組織からRNAを導き出した。マウス脾臓からRPMI培地中の単細胞浮遊液を作製した。または、Lymphocyte Separation Media(LSM)Organon Teknika(Durham, NC)を用いて新鮮な全血からヒトPBMCを単離し、バフィコートを製造元の指示に従って採取して、PBS中で細胞を3回洗浄した後に用いた。遠心によって培地から細胞をペレット化し、2×107個の細胞をRNAの調製に用いた。QIAGEN RNAeasyキット(Valencia, Calif.)全RNA単離キットおよびQIAGEN QIAshredderカラムをキットに添付の製造元の指示に従って用いて、RNAを細胞から単離した。1マイクログラム(4μg)の全RNAを、逆転写によってcDNAを調製するためのテンプレートとして用いた。このRNA、300ngのランダムプライマーおよび500ngのOligo dT(12-18)および1μlの25mM dNTPを混ぜ合わせ、80℃で5分間変性させ、その後に酵素を添加した。Superscript III逆転写酵素(Invitrogen, Life Technologies)を、酵素とともに提供された第二鎖緩衝液および0.1M DTTの存在下で総容量25μlのRNA+プライマー混合物に添加した。逆転写反応は50℃で1時間進行させた。cDNAをQIAquick(QIAGEN)PCR精製カラムを用いて精製し、40マイクロリットルのEB緩衝液中に溶出させた後に、PCR反応に用いた。
とし、一方、3'プライマーはP331AS:
とした。3'サブフラグメントは完全長野生型クローンをテンプレートとして用いて増幅し、ここで5'プライマーはP331S:
とし、一方、3'プライマーはmahIgG1S:
とした。
本実施例は、本明細書に記載の各種の-Ig融合遺伝子の真核細胞株における発現、ならびに 発現された融合タンパク質のSDS-PAGEおよびIgGサンドイッチELISAによる特性決定について例証する。
精製されたRNase-Ig(SEQ ID NO:115)を、SDS-ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によって分析した。融合タンパク質試料をジスルフィド結合の還元を伴うおよび伴わないSDS試料用緩衝液中で煮沸し、SDS 10% Tris-BISゲル(カタログ番号NP0301、Novex, Carlsbad, Calif.)に適用した。各精製タンパク質の5マイクログラムずつをゲル上にローディングした。電気泳動後に、クーマシーブルー染色(Pierce Gel Code Blue Stain Reagent、カタログ番号24590、Pierce, Rockford, Ill.)および蒸留水中での脱染によってタンパク質を可視化した。分子量マーカーを同じゲル上に含めた(Kaleidoscope Prestained Standards, カタログ番号161-0324、Bio-Rad, Hercules, Calif)。他の試料の泳動は以下の通りに行った:サンプリング緩衝液(5% 2-メルカプトエタノールを伴うおよび伴わない、62.5mM Tris-HCl、pH6.8、2% SDS、10%グリセロール、0.01%ブロモフェノールブルー)中のRNase-Ig融合タンパク質を4~12%のプレキャストゲル(Bio-RAD)上にローディングした。色素がゲルを泳動して流出するまで、ゲルの泳動を100ボルトで行った。室温で一晩かけてゲルをGelCode Blue(Thermo scientific)中で染色し、続いて水で洗浄した。
SREDアッセイ
2%アガロースゲルを、蒸留水を用いて調製した。ポリ-IC(Sigma)を蒸留水中に3mg/mlで溶解させて、ゲルプレートを以下の通りに調製した:1.5mlの反応緩衝液(0.2M Tris-HCl pH 7.0、40mM EDTAおよび0.1mg/ml臭化エチジウム)、1mlのポリ-ICおよび0.5mlの水をチューブに入れ、50℃に5分間維持した。3mlのアガロース(50℃に保つ)をチューブに添加した。この混合物を直ちにガラスプレート上に注いだ。ゲルへの穿孔によってサンプリングウェルを作製した。2μlの各血清試料をウェル中にローディングし、湿潤チャンバー内でゲルを37℃で4時間インキュベートした。続いてゲルを、緩衝液(20mM酢酸ナトリウムpH5.2、20mg/ml臭化エチジウム)中にて氷上で30分間インキュベートし、UV下で読み取りを行った。
96ウェルプレート(Nunc、Thermal fisher scientific)を、50μg/mlのポリ-L-リジン(Sigma)により、一晩かけてコーティングした。0.05% Tweenを含むPBSで5回洗浄した後に、プレートをPBS中の10μg/mlの酵母RNAによって4℃で一晩かけてコーティングした。5回洗浄した後に、1% BSAを含むPBSにより、室温で2時間かけてプレートをブロックした。1:50に希釈した血清試料をプレートに添加し、4℃で一晩インキュベートした。ハイブリドーマH564(抗RNA)培地を、1:300からの2倍系列希釈を用いて、標準物質として用いた。検出抗体はアルカリホスファターゼと結合させた抗マウスIgG(Jackson Lab)とし、これをプレートに1:5000で添加して室温で1時間おいた。ホスファターゼ基質(Sigma)を現像用緩衝液(ThermoFisher Scientific)中に溶解させ、プレートに50μl/ウェルで添加した。Spectramax Plusプレートリーダー(Microdevices, Sunnyvale, CA)を用いて、試料の405nmでの読み取りを行った。
RNase-Ig(SEQ ID NO:150)の添加は、SLE患者(J11)からの血清+核抽出物(NE)によって形成された免疫複合体を用いて刺激したヒト末梢血単核細胞からのインターフェロン-αの誘導を消失させた。手短に述べると、ELISAプレートを50マイクロリットルの1:2500捕捉抗体(抗IFNα、PBL 21112-1, Piscataway, NJ)によってコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。プレートをPBS/0.05% Tween 20で洗浄し、PBS/1% BSA中に室温で2時間おいてブロックし、PBS/0.05% Tween-20で洗浄した上で、IFN-αの標準的な希釈物または血清試料の系列希釈物とともに室温で2時間インキュベートした。プレートを洗浄し、PBS/1% BSA中の1:2000検出抗体(PBL 31101-2, Piscataway, NJ)とともにインキュベートした。プレートをPBS/0.05% Tween-20中で洗浄し、PBS/1% BSA中に1:12,000とした50マイクロリットルのロバ抗ウサギHRP(Jackson Immunoresearch, Westgrove, PA)とともにインキュベートした。プレートを5回洗浄し、その後にTMB基質を添加した。1/2容量の2N H2S04の添加によって反応を停止させ、試料の450nmでの読み取りをSpectramax Proプレートリーダー(MicroDevices, Sunnyvale, CA)で行った。その結果は図7に示されており、これはRNase-Igの添加が、SLE患者(J11)からの血清+核抽出物によって形成された免疫複合体を用いて刺激したヒト末梢血単核細胞からのインターフェロン-αの誘導を消失させたことを示している。
本発明者らは、RNaseAを過剰発現するマウス(RNaseTg)を作製した。このヌクレアーゼはRNaseTgマウスにおいて高レベルで発現される(図8参照)。本発明者らは、血清中のRNaseを定量するための一元放射拡散(SRED)法(左のパネル)、およびはるかにより定量的なELISAを開発した(図9参照)。本発明者らは、RNaseA TgをTLR7.1 Tgマウスと交配させて二重Tg(DTg)を作製した。TLR7.1マウスはTLR7のコピーを8~16個有しており、悪性度が非常に高い急速進行性のループス様疾患を発症し、3カ月齢の時点で死亡し始め、生存期間中央値は6カ月である。予備分析において、本発明者らは、DTgマウスが改善の徴候を示すか否かを調べるために、DTgおよび同腹仔対照を3カ月齢まで育てた(bled)。図8に示されているように、DTgマウスは、それらの血清中のRNaseのレベルが非常に高かった(比活性993U/mgの本発明者らの標準物質に基づけば、13U/mlを上回るRNaseに相当)。図9に示されているように、TgおよびDTgマウスにおけるRNaseA濃度をELISAアッセイによっても測定した。RNaseA TgマウスおよびTLR7.1×RNaseA Dtgマウスは、RNaseAの血清中濃度が1~2ng/mlであった。
1.プレートを抗RNaseA Abcam Ab(ab6610)でコーティングする:4C中に2.5~10ug/ml O/N。
2.0.05% Tween/1×PBSでプレートを3回洗浄する。
3.PBS中の1% BSAにより、少なくとも1時間かけてブロックする。
4.0.05% Tween/1×PBSによってプレートを3回洗浄する。
5.試料をローディングする。試料の希釈度は1:50。
6.室温で2時間インキュベートする。
7.0.05% Tween/1×PBSによってプレートを3回洗浄する。
8.ビオチン標識抗RNaseAbの希釈度1:4500(2.2ug/ml)の希釈物を調製する。室温で1時間放置する(Rockland 200-4688:10mg/ml)。
9.プレートを3回洗浄する。
10.StrepAV HRP(Biolegend 405210)を1:2500に希釈する。ホイルで覆い、室温で25~30分間放置する。
11.6回洗浄し、洗浄の間には液体をウェル中で少なくとも30秒間静置する。
12.BD OptEIA基質A+Bを1:1で添加する。色調が5~10分で最大になるまで待つ。一番上のウェルの標準物質が1.0を上回らないようにする。80ulを添加する(カタログ番号:51-2606KC;試薬A、51-2607KC;試薬B)
13.反応を停止させるために1M硫酸40ulを添加する。
RNaseA Ab:ab6610(90mg/ml)
ELISA緩衝液:PBS中の1% BSA
ELISA洗浄用緩衝液:0.05% Tween/1×PBS
抗RNaseAビオチン結合Ab:Rockland:200-4688(10mg/ml)
Strep AV HRP:Biolegend 405210
BD OptEIA試薬AおよびB:51-2606KCおよび51-2607KC
DTgとTLR7.1同腹仔対照との間には、生存に関して高度の有意差が認められた。図10に示されているように、10カ月の時点でTLR7.1マウスの61%が死亡したのに対して、DTgマウスは31%が死亡した。このデータは、RNaseAの過剰発現が強い治療効果を発揮したことを示している。TLR7.1マウスが早発性に死亡した理由は完全には明らかでないが、重症貧血、血小板減少および糸球体腎炎が役割を果たした可能性が考えられる。DTgマウスにおいて、赤血球数および血小板数がRNaseA発現によって良い影響を受けたか否かを明らかにするために、本発明者らは血算を行ったが、TLR7.1マウスとDTgマウスとの間に差は見いだされなかった。対照的に、DTgマウスでは腎臓の組織病理に有意な改善が認められた。本発明者らは、DTgマウスにおいてIgGおよびC3の沈着減少を観察した。メサンギウムにおける炎症を反映するPAS染色も、DTgマウスではTLR7.1同腹仔対照と比較して低下していた。本発明者らが今回、腎臓のマクロファージ浸潤を抗MAC-2(ガレクチン3)抗体(Lyoda et al. Nephrol Dial Transpiat 22: 3451, 2007)を用いて比較したところ、mac-2陽性細胞はDTgマウスの糸球体の方が非常に少なかった。各群当たり5匹ずつのマウスにおいてマウス1匹当たり20個の糸球体で算定したところ、単独TgおよびDTgに関する平均+/-SEはそれぞれ3.8+/-1.1および1.4+/-0.2であり、p=.05であった。加えて、本発明者らは糸球体係蹄サイズも定量し、DTgマウスにおける糸球体係蹄サイズの有意な減少を観察した(単独TgおよびDTgにおいてそれぞれ179+/-41および128+/-16.8um2、p=0.037)。以上を要約すると、TLR7.1×RNaseA DTgマウスはそれらの単独Tg TLR7.1同腹仔よりも長く生存し、かつそれらの腎臓における炎症および傷害はより軽度である。
TLR7.1 TgマウスおよびTLR7.1×RNaseA DTgマウスの脾臓におけるインターフェロン応答遺伝子(IRG)の分析により、DTgマウスにおいてIRF7遺伝子の発現が有意に低いことが示された(p=0.03)。MX1およびVIG1を含む他のいくつかのIRGは、Tgマウスと比較してDTgマウスの方が低値であったが、その差は有意ではなかった。図11参照。定量的PCRを以下の通りに行った:RNeasy miniキット(Qiagen, Valencia, CA, USA)を用いてマウス脾臓から全RNAを単離し、Turbo DNA-free(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を用いてDNaseを処理した上で、RNA-to-cDNAキット(Applied Biosystems)により、ランダムプライマーを用いて第一鎖cDNAを生成させた。単離されたRNAに関して、NanoDrop(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)を用いた測定では、260/280値は1.7~2.0の間であった。cDNAを1ng/ul全RNAに相当するよう希釈し、1つの反応につき8ulを用いた。参照遺伝子(18s)および関心対象の遺伝子(GOI)用のプライマーを合成し(IDT, Coralville, Iowa, USA)、分子グレードの水(molecular grade water)を用いてqPCR用に適切な濃度に希釈した。プライマーのBLASTの結果から、参照遺伝子またはGOIのみに対する特異的な配列相同性が示されている。SensiMix SYBR low-ROX master mix(Bioline, London, UK)に対するテンプレートおよびプライマーの1:1混合物を用いて、ABI Fast7500システムで、2つずつの反応物(20ul)を進行させた。年齢を一致させた野生型B6マウスを各GOIに関する変化倍数を求めるためのベースラインとして用いる2-ddCT法を用いて、相対的定量の算出を行った。反応物に関する解離曲線から、各遺伝子に関して単一の融解ピークが示されている。標準曲線からは、各遺伝子に関して同程度の増幅効率が示され、テンプレート濃度はプライマーセットのそれぞれに関して直線範囲(linear dynamic range)内にあった。
ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子を、単酵素構造または多酵素構造の所望の構造および機能的活性が組み入れられるように、シャトリング(shuttling)およびドメイン交換のための適合性制限酵素部位を有するモジュール式カセットとして設計した。ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子の種々の態様の模式的構造は図12に図示されている。プライマーは表1に示されている。代表的なハイブリッド型ヌクレアーゼ分子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は表2に示されている。
QIAgen RNAeasyキット(Valencia, CA)および細胞溶解物を均質化するためのQIAshredderキット(Qiagen, Valencia, CA)を用いて、ヒト膵臓RNA(Ambion)または正常ヒト末梢血リンパ球(およそ5×10e6個)由来のヒトPBMC RNAからヒトcDNAを単離した。ヒトPBMCは、D-PBS中に1:1に希釈したヘパリン添加ヒト血液から単離し、LSM Lymphocyte Separation Medium(MP Biomedicals, Irvine, CA)のFicoll勾配上に重層させた。
COS-7細胞に対して、ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子遺伝子のインサートを含む発現ベクターpDGを一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの前日に、細胞を、4ml DMEM(ThermoFisher/Mediatech cell gro)+10% FBS組織培地中にて、60mmディッシュ当たり4×10e5個で播種した。DMEM基本培地に4.5g/Lのグルコース、ピルビン酸ナトリウム、L-グルタミン4mM、および非必須アミノ酸を加えた。ウシ胎仔血清(Hyclone, Logan, UT ThermoFisher Scientific)を、最終容量比10%となるように培地に添加した。細胞を37℃、5% CO2にて一晩インキュベートしたところ、トランスフェクションの日の集密度はおよそ40~80%となった。Qiagen(Valencia, CA)QIAprep miniprepキットを製造元の指示に従って用いてプラスミドDNAを調製し、50ulのEB緩衝液中に溶出させた。Nanodrop 1000(ThermoFisher Scientific, Wilmington DE)分光光度計を用いてDNA濃度を測定した。プラスミドDNAは、Polyfect(Qiagen, Valencia, CA)トランスフェクション試薬を製造元の指示に従って用い、60mmディッシュ当たり2.5ugのプラスミドDNA、および150ulの無血清DMEMトランスフェクション用カクテル中の15ulのpolyfect試薬を用いてトランスフェクトした。複合体の形成後に、反応物を血清およびすべての添加物を含む1mlの細胞増殖培地中に希釈して、3mlの新たなDMEM完全培地を含むプレートに滴下した。一過性トランスフェクション物を48~72時間インキュベートした後、さらなる分析のために培養上清を採取した。
ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子の安定した産生は、CMVプロモーターの制御下にあるヌクレアーゼ-Ig cDNAを含む選択可能かつ増幅可能なプラスミドpDGの、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞内へのエレクトロポレーションによって達成された。このpDGベクターは、プラスミドに対する選択圧を高めるために減弱化されたプロモーターを有する、DHFR選択マーカーをコードするpcDNA3の改変された型である。Qiagen maxiprepキットを用いてプラスミドDNAを調製し、精製されたプラスミドを唯一のAscI部位で線状化した後に、フェノール抽出およびエタノール沈殿を行った。サケ精子DNA(Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo.)を担体DNAとして添加し、100μgずつのプラスミドおよび担体DNAを用いて、107個のCHO DG44細胞にエレクトロポレーションによってトランスフェクトした。本明細書中で以後「Excell 302完全」培地と称する、グルタミン(4mM)、ピルビン酸、組換えインスリン、ペニシリン-ストレプトマイシンおよび2×DMEM非必須アミノ酸(すべてLife Technologies, Gaithersburg, Md.から)を含むExcell 302培地(JRH Biosciences)中で、細胞を対数期になるまで増殖させた。トランスフェクトされていない細胞用の培地にも、HT(ヒポキサンチンおよびチミジンの100×溶液から希釈)(Invitrogen/Life Technologies)を含めた。選択下でのトランスフェクション用の培地には、50nMから1μMまでの範囲にわたるさまざまなレベルのメトトレキサート(Sigma-Aldrich)を選択剤として含めた。エレクトロポレーションは280ボルト、950マイクロファラッドで行った。トランスフェクトされた細胞を非選択培地中に一晩おいて回復させた後に、96ウェル平底プレート(Costar)中への選択的プレーティングを、細胞125個/ウェルから細胞2000個/ウェルまでのさまざまな系列希釈で行った。細胞クローニング用の培地は、50nMメトトレキサートを含むExcell 302完全培地とした。クローン増殖が十分になったところで、マスターウェルからの培養上清の系列希釈物を、-IgGサンドイッチELISAを用いることによってハイブリッド型ヌクレアーゼ分子の発現に関してスクリーニングした。手短に述べると、NUNC immulon IIプレートを、PBS中の7.5マイクログラム/mlのF(ab'2)ヤギ抗マウスIgG(KPL Labs, Gaithersburg, MD)または2ug/mlのヤギ抗ヒトもしくは抗マウスIgG(Jackson Immunoresearch, WestGrove PA)により、4℃で一晩かけてコーティングした。プレートをPBS/2~3% BSA中でブロックし、培養上清の系列希釈物を室温で2~3時間インキュベートした。プレートをPBS/0.05% Tween 20中で3回洗浄して、それぞれPBS/1.0% BSA中に1:3500とした西洋ワサビペルオキシダーゼ結合F(ab'2)ヤギ抗マウスIgG2a(Southern Biotechnologies)およびヤギ抗マウスIgG(KPL)を混合したものとともに、または1:2500とした西洋ワサビペルオキシダーゼ結合F(ab')2ヤギ抗ヒトIgG1(Jackson Immunoresearch, WestGrove, PA)中にて、室温で1~2時間インキュベートした。プレートをPBS/0.05% Tween 20中で4回洗浄し、SureBlue Reserve、TMB基質(KPL Labs, Gaithersburg, MD)によって結合を検出した。等容量の1N HClの添加によって反応を停止させ、プレートの450nMでの読み取りをSpectramax Proプレートリーダー(Microdevices, Sunnyvale CA)で行った。融合タンパク質の産生が最も高度であったクローンをT25フラスコ内で、続いてT75フラスコ内で増やして、凍結のため、および融合タンパク質の産生規模拡大のために十分な数の細胞を得た。優れた上位4つのクローンからの培養物における産生レベルを、メトトレキサート含有培地中での累進増幅によってさらに高めた。DHFRプラスミドが増幅された細胞のみが生存しうるように、細胞の連続継代のたびに、Excell 302完全培地に含めるメトトレキサートの濃度を徐々に高めた。
ヌクレアーゼ分子に関して実施例12に記載した通りに、ランダムプライマー法によるcDNAおよびPCR増幅によって、ヒト膵臓RNAからヒトRNase1配列を単離した。PCRプライマーの表に列記されたプライマーセットからの以下のプライマーを、1つの反応につき50pmolで用いた。
野生型または突然変異型Fc含有分子のFcRを介した結合を評価するために、プロテインAにより精製したハイブリッド型ヌクレアーゼ分子であるhRNase1-hIgG1-WTを、ヒト単球細胞株THP-1またはU937とともにインキュベートした。図14は、これらの2つの細胞株に対するhRNase1-WT-hIgG1-WT(SEQ ID NO:161)の結合パターンを示している。細胞をPBS/2% FBS中の5ug/mlの精製融合タンパク質とともに氷上で45分間インキュベートし、PBS/2% FBS中で3回洗浄して、1:200のFITC-ヤギ抗ヒトIgG(Fc特異的)(Jackson Immunoresearch, WestGrove, PA)とともに氷上で45分間インキュベートした。細胞をPBS/2% FBS中で2回洗浄し、FACS Canto(BD, Franklin Lakes, NJ)フローサイトメーターおよびFlowJoソフトウエア(TreeStar, Ashland, OR)を用いるフローサイトメトリーによって分析した。
THP-1細胞またはU937細胞を、96ウェルプレートのウェル全体にわたって10mg/mlから出発して10倍系列希釈を行ったIVIgとともにあらかじめインキュベートした。細胞(ウェル1個当たりおよそ1×10e6個)は氷上で45分インキュベートした。あらかじめ結合した細胞を2回洗浄し、各ウェルに対してAF750結合hRNase1-WT-hIgG1-WT(SEQ ID NO:161)をおよそ5ug/mlで添加した。結合反応物を氷上で45分間インキュベートし、PBS/2% FBS中で2回洗浄して、上記の通りにフローサイトメトリーによって分析した。IVIgは標識ヌクレアーゼ融合タンパク質の結合を部分的に遮断することができたが、10mg/mlでも、バックグラウンドを上回る残留結合が依然として検出可能であった。図15は、hRNase1-WT-hIgG1-WT(SEQ ID NO:161)によるU937細胞およびTHP-1細胞との結合に対するヒトIVIgの遮断活性を示している。
COS-7細胞に対して、Trex1-Igをコードするハイブリッド型ヌクレアーゼ分子を含むプラスミドを、以下の通りに一過性にトランスフェクトした:これらの遺伝子は、ヒトVK3リーダーペプチドを、COOH末端が72アミノ酸短縮したマウスTrex1(核膜標的指向性配列を除去するため)と融合させ、それを(gly4ser)4または(gly4ser)5リンカーと融合させ、それをBalb/c IgG2aアレルのIgGc配列に比していくつかの変化を組み入れたマウスIgG2a/cアレルと融合させたものを組み入れている。COS上清を72時間後に採取し、0.5~1.0mlの試料(実験による)を、100ulのプロテインA-アガロースビーズにより、4℃で一晩かけて免疫沈降させた。プロテインAビーズを遠心し、PBS中で2回洗浄した後に、還元性SDS-PAGEローディング緩衝液中に再懸濁させた。試料を100Cで5分間熱処理し、プロテインAビーズを遠心してペレット化させて、試料用緩衝液を10% SDS-PAGEゲル上にローディングした。試料の電気泳動を150ボルトで1.5~2時間行い、ニトロセルロースメンブレンへのゲルのブロッティングを30mAmpで1時間行った。ウエスタンブロットをTBS/5%脱脂乳中に一晩おいてブロックした。ブロットを1:2500のHRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ)結合ヤギ抗マウスIgG2a/c(Fc特異的、KPL)とともに室温で1.5時間インキュベートし、PBS/0.5% Tween20中で5回またはそれ以上の回数洗浄した上で、ECL試薬を用いてブロットの現像を行った。図17は、mTrex1-(g4s)4(SEQ ID NO:166)または(g4s)5-mIgG2a-c(SEQ ID NO:167)融合タンパク質を発現するCOS7培養上清からの免疫沈降物のウエスタンブロットを示している。
DNase1L3を、そのネイティブなリーダーペプチド配列を含むmDNase1L3をクローニングするための以下のプライマー対を用いて、マウス脾臓cDNAからクローニングした。
図19は、DNase1L3Ig融合タンパク質(SEQ ID NO:183または185)を発現するCOS上清から得たエキソヌクレアーゼ消化パターンのタイトレーション分析を示している。核DNA分解アッセイを以下の通りに行った:HeLa細胞をDMEM培地中で培養し、NP-40溶解を用いて10e5個の細胞から核を単離した。10mM Hepes(pH 7.0)、50mM NaCl、2mM MgCl2、2mM CaCl2および40mM b-グリセロリン酸を含む200ulの反応緩衝液中に核を希釈させた。DNase1L3をトランスフェクトしたCOS細胞からの図に表記された培養上清の容量中で、核を37℃で3時間インキュベートした。QiAmp blood DNA minikitを用いて核DNAを単離した。DNAを1.5%アガロースゲル電気泳動によって分析した。対照反応物に関しては、ヌクレアーゼ活性を阻害するためにヘパリンを250i.u./mlで用いた。
ヒトDNase1分子またはDNase1様分子の天然のアレルが報告されている。A114F突然変異が、ヒトDNase1様酵素の天然変異体に存在すること、およびこの配列変化を含む酵素のアクチン耐性をもたらすことが以前に報告されている。Pan, CQ, Dodge TH, Baker DL, Prince WE, Sinicropi DV, and Lazarus RA. J Biol Chem 273: 18374-18381, (1998);Zhen A, Parmelee D, Hyaw H, Coleman TA, Su K, Zhang J, Gentz R, Ruben S, Rosen C, and Li Y. Biochem and Biophys Res Comm 231: 499-504 (1997);およびRodriguez AM, Rodin D, Nomura H, Morton CC, Weremowicz S, and Schneider MC. Genomics 42: 507-513 (1997)を参照のこと、これらはすべて参照により本明細書に組み入れられる。
図21は、hDNase1IgおよびhRNase1-Ig-hDNase1融合タンパク質を発現する採取したCOS上清に対する、SREDによるRNase活性アッセイ(SRED)分析の結果を示している。
早期ループスによる死亡は通常、腎炎、または腎炎を治療するための免疫抑制に起因する感染が原因である。このため、あらゆる新たな治療法にとって極めて重要なアウトカムは、腎炎の改善である。ヒトでの試験はタンパク尿およびクレアチニンの定量に限られるが、マウスでは組織学的検査および免疫細胞化学検査によって腎臓の炎症および損傷の正確な評価を得ることができる。本発明者らは、TLR7.1×RNase二重トランスジェニック(DTg)マウスで、抗RNA抗体がより少なく、B細胞活性化がより低下しており、免疫沈着物がより少なく、かつPASで陽性染色される糸球体がより少ないことを報告している。本発明者らはさらに、抗Mac-2(ガレクチン3)抗体を用いて腎臓のマクロファージ浸潤を比較した(Iyoda et al. Nephrol Dial Transplant 22: 3451, 2007)。単独Tgまたは二重Tgから入手した腎臓からの凍結切片を、記載の通りに(Iyoda et al)、Mac-2陽性マクロファージの数ならびに糸球体サイズに関して検討した。無作為に選択した20個の糸球体(腎臓の外側から内側に)を陽性細胞に関して算定した。DTgにおける糸球体内のmac-2陽性染色細胞は、単独Tgマウスと比較してはるかに少なかった(データ非提示)。各群でn=4~5であるパイロット試験においてマウス1匹当たり20個の糸球体を算定した結果により、平均+/-SEは単独TgおよびDTgに関してそれぞれ3.8+/-1.1および1.4+/-0.2であり、p=0.05であることが明らかになった。加えて、本発明者らは糸球体係蹄サイズも定量し、DTgマウスにおける糸球体係蹄サイズの有意な減少を観察した(単独TgおよびDTgにおいてそれぞれ179.4+/-41および128+/-16.8um2、p=0.037)。
二価RNase-Ig融合タンパク質(SEQ ID NO:150)の機能的特徴をさらに明確にするために、本発明者らはミカエリス定数Kmの決定を行った。図23に示されているように、この酵素は高い親和性を有し、暫定的Kmは280nMである(これと比較して、ポリCを基質として用いた場合のRNaseAのKmは34nMである(delCardayre et al, Prot Eng 8:261, 1995))。図23は、RNase Alert Substrate(Ambion/IDT)を用いてアッセイし、Spectramax M2マイクロプレートリーダーによって定量した酵素反応速度を示している。データはSoftmax Proソフトウエア(Molecular Devices)を用いて解析した。種々の基質濃度での反応速度を測定し、そのデータをラインウィーバー・バークプロットとして示している。容量に関して補正した見かけのKmは280nMである。
564 Igi Tgマウス:Dr. Imanishi-Karaは、H564ハイブリドーマ由来のVDJ遺伝子を内因性のIgh遺伝子座およびIgk遺伝子座の中で再編成させて、B6をバックグラウンドとする564Igiマウスを作製した。これらのマウス由来の血清は固定細胞の細胞質および核小体を染色し、このことは際立った抗RNA特異性を指し示している。この知見に一致し、かつ本特許出願に特に関連することとして、これらのマウスをTRL7欠損性にすると抗体産生は抑制され、このことは抗体産生を刺激するものがまさにRNAであることを指し示している。このマウス系統は遅発性糸球体腎炎を発症する。本発明者らは、H564に関してトランスジェニック性であるマウス、さらには564Ig導入遺伝子およびRNase導入遺伝子を共発現する二重トランスジェニックマウスにおける抗RNA抗体の発現を分析した。図24は、これらのトランスジェニックマウスの加齢に伴う継続的間隔でのマウス血清中の抗RNA抗体のレベルを比較している。
1つまたは複数のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子を、例えば、上記の実施例に以前に記載したように、アフィニティークロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーによって精製する。ある場合には、ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子はポリペプチドである。ある場合には、ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子は、表2からの1つまたは複数の配列を含む。ある場合には、分子はSEQ ID NO:161、162または163である。ある場合には、分子はSEQ ID NO:145およびSEQ ID NO:149を含む。ある場合には、分子はSEQ ID NO:151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、166、167、169、170、171、173、175、177、179、181、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205または207である。ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子は、本明細書に開示されたもののいずれか、および、例えば、ヌクレアーゼドメインを選び、それをFcドメインと連結すること;または例えば、ヌクレアーゼドメインを選び、それをリンカードメインとともにFcドメインと連結することによって、本明細書に開示された配列(表2参照)から構築することができる任意のものでありうる。さまざまなリンカードメイン(例えば、本明細書に記載されたもの)を、Fcドメインおよび/またはヌクレアーゼドメインを連結するために用いることができる。例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40またはそれ以上のアミノ酸の長さであるリンカードメインを用いることができる。分子を、それらが所望のヌクレアーゼ機能を有することを確かめるための定性的アッセイを用いて、インビトロでのヌクレアーゼ比活性に関してアッセイする。続いて一般には、RNaseまたはDNase Alert Kit試薬などの基質、および時間の関数として読み取りを行うように設定された蛍光プレートリーダーを利用する蛍光に基づく速度論的アッセイによって、比活性が決定される。加えて、一般には、タンパク質溶液を、検出限界が0.06EU/mlである、Cape Cod,Inc.(E. Palmouth, MA)のPyrotellカブトガニアメーバ様細胞溶解物(Limulus Amebocyte Lysate)(LAL)キットなどの市販のキットを用いて、溶液をエンドトキシン混入に関して検査する。続いて分子を、生物活性に関する種々のインビトロアッセイを用いてアッセイする。
哺乳動物(例えば、マウス、ラット、齧歯動物、ヒト、モルモット)を試験に用いる。哺乳動物に対して、表2からの1つもしくは複数の配列を含む1つもしくは複数のハイブリッド型ヌクレアーゼ分子、または対照を、(例えば、静脈内に)投与する。ある場合には、分子は SEQ ID NO:161、162または163である。ある場合には、分子はSEQ ID NO:145およびSEQ ID NO:149を含む。ある場合には、分子はSEQ ID NO:151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、166、167、169、170、171、173、175、177、179、181、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205または207である。ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子は、本明細書に開示されたもののいずれか、および、例えば、ヌクレアーゼドメインを選び、それをFcドメインと連結すること;または例えば、ヌクレアーゼドメインを選び、それをリンカードメインとともにFcドメインと連結することによって、本明細書に開示された配列(表2参照)から構築することができる任意のものでありうる。さまざまなリンカードメイン(例えば、本明細書に記載されたもの)を、Fcドメインおよび/またはヌクレアーゼドメインを連結するために用いることができる。例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40またはそれ以上のアミノ酸の長さであるリンカードメインを用いることができる。ある場合には、ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子を薬学的に許容される担体と製剤化する。ある場合には、分子を、上記の薬学的組成物の項に記載したように、薬学的組成物として製剤化する。ハイブリッド型ヌクレアーゼ分子は、RNaseおよび/またはDNaseを標的とする。
Claims (20)
- RNAまたはRNAおよびDNAを含有する細胞外免疫複合体を消化するための医薬の製造におけるポリペプチド含有組成物の使用であって、
該組成物が、RNAまたはRNAおよびDNAを含有する免疫複合体を消化するのに有効な量で製剤化されており、かつ該組成物が、薬学的に許容される担体と、RNaseおよびFcドメイン変異体を含むポリペプチドとを含み、該RNaseが該Fcドメイン変異体に直接的にもしくはポリペプチドリンカーを介して接続されているか、化学的にコンジュゲートされているか、または遺伝的に融合されており、該Fcドメイン変異体が、1個、2個または3個のアミノ酸置換を含むCH2ドメインを含み、該置換が、Fcγ受容体もしくは補体タンパク質またはその両方に対する結合性を野生型ヒトIgG1 Fcドメインと比較して低下させるものであり、かつ該Fcドメイン変異体が抗体全体を含まない、
前記使用。 - シェーグレン症候群を治療するための医薬の製造におけるポリペプチド含有組成物の使用であって、
該組成物が、RNAまたはRNAおよびDNAを含有する免疫複合体を消化するのに有効な量で製剤化されており、かつ該組成物が、薬学的に許容される担体と、RNaseおよびFcドメイン変異体を含むポリペプチドとを含み、該RNaseが該Fcドメイン変異体に直接的にもしくはポリペプチドリンカーを介して接続されているか、化学的にコンジュゲートされているか、または遺伝的に融合されており、該Fcドメイン変異体が、1個、2個または3個のアミノ酸置換を含むCH2ドメインを含み、該置換が、Fcγ受容体もしくは補体タンパク質またはその両方に対する結合性を野生型ヒトIgG1 Fcドメインと比較して低下させるものであり、かつ該Fcドメイン変異体が抗体全体を含まない、
前記使用。 - ループス腎炎を治療するための医薬の製造におけるポリペプチド含有組成物の使用であって、
該組成物が、RNAまたはRNAおよびDNAを含有する免疫複合体を消化するのに有効な量で製剤化されており、かつ該組成物が、薬学的に許容される担体と、RNaseおよびFcドメイン変異体を含むポリペプチドとを含み、該RNaseが該Fcドメイン変異体に直接的にもしくはポリペプチドリンカーを介して接続されているか、化学的にコンジュゲートされているか、または遺伝的に融合されており、該Fcドメイン変異体が、1個、2個または3個のアミノ酸置換を含むCH2ドメインを含み、該置換が、Fcγ受容体もしくは補体タンパク質またはその両方に対する結合性を野生型ヒトIgG1 Fcドメインと比較して低下させるものであり、かつ該Fcドメイン変異体が抗体全体を含まない、
前記使用。 - ポリペプチドが、オプソニン作用、食作用、および補体依存性細胞傷害作用からなる群より選択される、野生型ヒトIgG1 Fc領域を含むポリペプチドと比較して低下したエフェクター機能を有する、請求項1~3のいずれか一項記載のポリペプチド含有組成物の使用。
- 以下である、請求項1~4のいずれか一項記載のポリペプチド含有組成物の使用:
(a) RNaseがヒトRNase Iである;ならびに/または
(b) Fcドメイン変異体がヒンジドメイン、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含む。 - 以下である、請求項1~5のいずれか一項記載のポリペプチド含有組成物の使用:
Fcドメイン変異体が、少なくとも1つの置換を含む改変されたヒンジドメインを含む。 - 改変されたヒンジドメインが、少なくとも1つのシステイン置換を含む、請求項6記載のポリペプチド含有組成物の使用。
- 置換が、P238S、P331S、N297S、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1~7のいずれか一項記載のポリペプチド含有組成物の使用。
- 以下である、請求項1~8のいずれか一項記載のポリペプチド含有組成物の使用:
(a) RNaseが、配列表の配列番号149に記載のアミノ酸配列を、リーダー配列を伴ってもしくは伴わずに含むか、または配列表の配列番号149に記載のアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む;および/または
(b) Fcドメイン変異体が、配列表の配列番号145に記載のアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含み、かつP238S、P331S、N297S、またはそれらの組み合わせより選択される1つまたは複数のFc突然変異を含む。 - ポリペプチドが、
配列表の配列番号163に記載のアミノ酸配列を、リーダー配列を伴ってもしくは伴わずに含むか、または配列表の配列番号163に記載のアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む;または
配列表の配列番号161に記載のアミノ酸配列を、リーダー配列を伴ってもしくは伴わずに含むか、または配列表の配列番号161に記載のアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む;または
配列表の配列番号153に記載のアミノ酸配列を、リーダー配列を伴ってもしくは伴わずに含むか、または配列表の配列番号153に記載のアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み、
および
Fcドメイン変異体が、P238S、P331S、N297S、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも1つの置換を含む改変されたCH2ドメインを含む、
請求項1~3のいずれか一項記載のポリペプチド含有組成物の使用。 - 以下である、請求項1~10のいずれか一項記載のポリペプチド含有組成物の使用:
RNaseが第1のリンカードメインを介してFcドメイン変異体のN末端に接続されている;または
RNaseが第1のリンカードメインを介してFcドメイン変異体のC末端に接続されている;または
RNaseがFcドメイン変異体のN末端に直接的に接続されている;または
RNaseがFcドメイン変異体のC末端に直接的に接続されている。 - 第1のリンカードメインがポリペプチドリンカーである、請求項11記載のポリペプチド含有組成物の使用。
- ポリペプチドリンカーがgly-serリンカーである、請求項12記載のポリペプチド含有組成物の使用。
- ポリペプチドが、第2のリンカードメインを伴ってまたは伴わずにFcドメイン変異体に接続されている第2のヌクレアーゼドメインをさらに含む、請求項1~13のいずれか一項記載のポリペプチド含有組成物の使用。
- 第2のリンカーがポリペプチドリンカーである、請求項14記載のポリペプチド含有組成物の使用。
- ポリペプチドリンカーが配列表の配列番号168に記載されている、請求項15記載のポリペプチド含有組成物の使用。
- 第2のヌクレアーゼドメインが、配列表の配列番号139、配列表の配列番号143、もしくは配列表の配列番号142に記載のアミノ酸配列を含むか、または配列表の配列番号139、配列表の配列番号143、もしくは配列表の配列番号142に記載のアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む、請求項14記載のポリペプチド含有組成物の使用。
- 第2のヌクレアーゼドメインがDNaseを含み、該DNaseがヒトDNase I型、ヒトDNase1L3、またはヒトTREX1からなる群より選択される、請求項14記載のポリペプチド含有組成物の使用。
- ポリペプチドが二量体ポリペプチドである、請求項1~18のいずれか一項記載のポリペプチド含有組成物の使用。
- 二量体ポリペプチドがホモ二量体である、請求項19記載の使用。
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