JP5114392B2 - 細胞傷害性リボヌクレアーゼ変異株 - Google Patents

Description

関連出願の説明
本出願は、２００５年６月１６日に出願された米国特許仮出願第６０／６９０，９７０号の優先権を主張している。

連邦政府が後援した研究又は開発に関する説明
本発明は、政府機関である国立衛生研究所により授与された連邦政府の支援ＣＡ０７３８０８によりなされた。連邦政府は本発明において一定の権利を有する。

リボヌクレアーゼは、ＲＮＡの分解を触媒する酵素である。十分に研究されたリボヌクレアーゼは、ウシのリボヌクレアーゼＡ（ＲＮａｓｅ Ａ）であり、このリボヌクレアーゼＡの生物学的推定機能は、反すう消化器内に蓄積されている大量のＲＮＡを分解することである。ＲＮａｓｅ Ａ・スーパーファミリーは、ＲＮａｓｅ Ａと同族の酵素として分類された一群のリボヌクレアーゼ酵素である。このスーパーファミリーのメンバーの一部は、抗増殖性、細胞傷害性、胚毒性、精子不形成性、及び抗腫瘍性などの諸活性を含む多数の興味深い生物学的特性を有する。このファミリーの１メンバーは、もともと卵母細胞及びノーザンヒョウガエルであるラナ・ピピーンズの初期の胚から単離されたリボヌクレアーゼＡの同族体であり、ノーザンヒョウガエルであるラナ・ピピーンズは、インビトロ及びインビボの両方で抗腫瘍特性を示す分子について使われる名称で、今では、Ｏｎｃｏｎａｓｅ（登録商標）（ＯＮＣ）として知られている。ＲＮＡを分解する特性は、ＯＮＣの細胞傷害性にとって必須である。ＯＮＣは、現在、臨床試験において癌治療薬として評価されている。

化学療法剤としてのＯＮＣの適合性に関する重大な制約は、用量を限定する腎臓毒性である。ＯＮＣは、リボヌクレアーゼ・スーパーファミリーの哺乳類のメンバーよりもはるかに高い濃度で腎臓内に保持される。マウスはＯＮＣに対して抗体を産生するが、リボヌクレアーゼＡに対しては産生しないので、ＯＮＣについてはアレルギーの問題もあるが、ＯＮＣはリボヌクレアーゼＡとはそのアミノ酸の約３０％を共有する。これは、リボヌクレアーゼ・ファミリーの他のメンバーが、ＯＮＣに類似した細胞傷害性を持たせることができるならば、臨床治療薬として評価する場合、適切な候補になりうることを示唆している。

体内では、ＲＮａｓｅ活性のレベルは、リボヌクレアーゼ阻害剤（ＲＩ：ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）により調節され、該阻害剤はすべての哺乳類の細胞の細胞質ゾルに存在する５０ｋＤａのたんぱく質である。ＲＩはロイシンに富むたんぱく質ファミリーのメンバーであり、蹄鉄型分子内に系統的に配置された１５個の交互反復体から構成されている。ＲＩは多数のシスティン残基（ヒトＲＩでは３２）を有し、これは、ＲＩが細胞質ゾルのような還元雰囲気においてのみ、その形状と機能とを保持できることを意味している。ＲＩは、ＲＮａｓｅ・スーパーファミリーのメンバーに、１つのＲＩがＲＮａｓｅの１つの分子に結合するように作用し、そのように結合したときは、酵素の活性部位の立体的な妨害によりリボヌクレアーゼの触媒活性を、ＲＩが完全に阻害する。ＲＮａｓｅに対するＲＩの結合は、非常にタイトな結合であり、非常に高い結合親和性を有する。

ＲＮａｓｅ・スーパーファミリーの一部のメンバー、特にＯＮＣ及びウシの精液リボヌクレアーゼは、ＲＩを避ける特別な能力を有する。ＲＩを避ける特質は、主として、ＯＮＣ及びウシの精液リボヌクレアーゼの細胞傷害性によるものである。天然細胞傷害性ではないＲＮａｓｅ・スーパーファミリーのメンバーは、ＲＩへの結合を阻害するように該メンバーのアミノ酸構成を修飾し、及び特にＲＩとＲＮａｓｅとの間の最も近い相互作用点の一つでより小さなアミノ酸をより大きなアミノ酸で置換することにより細胞傷害性にすることができることも判明している。この方法は、細胞傷害性変異株であるＧ８８ＲＲＮａｓｅ Ａについて説明している米国特許第５，８４０，２９６号に記載されている。Ｇ８８ＲＲＮａｓｅ Ａは、天然のＲＮａｓｅ Ａに比べてＲＩに対する親和性は低いが、天然のＲＮａｓｅ Ａは更にＯＮＣよりも細胞傷害性が１０倍低い。学名Ｇ８８Ｒは、ＲＮａｓｅ Ａ分子が、アミノ酸位置８８のグリシン（Ｇ）残基をアルギニン（Ｒ）残基で置換することにより変質されたことを意味している。

たんぱく質の３次元構造のモデルを作る方法及びツールは、進化を続けている。２つの分子の間、例えば、ＲＮａｓｅ ＡとＲＩとの間の相互作用を分析する場合、２つの分子の間の相互作用の部位を特定する問題は、現在やっと解決可能になりつつある。分子モデルを作るツールが発達したので、その相互作用の分析をより精巧にすることができるようになっている。

本発明は、ＲＮａｓｅの遺伝子操作されたリボヌクレアーゼにより要約される。少なくとも２つのアミノ酸を有するスーパーファミリーは、その天然の配列から変わる。第１の変化は、ウシの膵臓のＲＮａｓｅ Ａのアミノ酸残基８５〜９４の相当する領域におけるアミノ酸置換である。第２の変化は、ウシの膵臓のＲＮａｓｅ Ａの残基３８、３９及び６７に対応するアミノ酸からなる群から選択された位置における変質(alteration)、置換又はアミノ酸交換(swap)である。

本発明の目的は、遺伝子操作された従来のリボヌクレアーゼに比べて改善された細胞傷害特性を有する遺伝子操作されたリボヌクレアーゼＡの意味を明確にすることである。

本発明の他の目的、利点及び特徴は、添付図面に関連して行われた次のような説明から明らかになるであろう。

本発明は、新しいレベルの細胞傷害性を有するように遺伝子操作されたＲＮａｓｅ Ａのスーパーファミリーの変質したリボヌクレアーゼに関する。これは、分子相互作用の新しいモデルを作るツールである、高速原子密度評価（ＦＡＤＥ：Ｆａｓｔ Ａｔｏｍｉｃ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）アルゴリズムを用いて達成することもできる。このアルゴリズムを用いて、ＲＮａｓｅ Ａとリボヌクレアーゼ阻害剤との間の分子接触の位置のモデルを作った。このモデルに基づいて、ＲＮａｓｅ Ａのアミノ酸配列の変異株をデザインし、立体障害によりＲＩを避けることができる新規なＲＮａｓｅ Ａ変異株を創ることができた。これらの変異株は、リボ核酸分解活性及び細胞傷害性についてもテストした。その場合、従来知られているＲＮａｓｅ Ａ変異株よりも細胞傷害性の強い変異株を識別することができる。

分析は、ＲＮａｓｅ ＡとＲＩ分子との間の相互作用の研究により開始された。たんぱく質間の界面には、総表面積、非極性表面積、充填密度、及び極性相互作用を含む、錯体の安定性に寄与しうる多くの特性がある。ｐＲＩ・ＲＮａｓｅ Ａ（ＲＮａｓｅ Ａ）錯体形成時に埋もれた溶媒が接近できる２，５５０Ųの表面積は、酵素・阻害剤錯体の場合比較的大きく、プロテアーゼ・阻害剤錯体の場合に典型的な１６００Ųよりもかなり大きい。一般に、たんぱく質の界面は、溶媒に曝されたたんぱく質表面の化学的特性に類似しており、溶媒に曝されたたんぱく質表面は、約５７％の非極性残基、２４％の中性極性の残基、及び１９％の荷電アミノ酸残基から構成されている。しかし、典型的なたんぱく質間の界面は、溶媒に曝されたたんぱく質表面よりも荷電残基の含有量が少なく、中性極性の残基を多く含む。このような傾向とは異なり、ｐＲＩ・ＲＮａｓｅ Ａ界面は、４９％の非極性残基、２７％の中性極性の残基、及び２４％の荷電残基を有し、かなり多く荷電している。実際に、細胞質ｐＨにおいて塩基性ＲＮａｓｅ Ａ（ｐＩ９．３）と酸性ＲＩたんぱく質（ｐＩ４．７）との間で形成された錯体では、静電力が重要な役割を果たしているように思われる。

ｐＲＩ・ＲＮａｓｅ Ａ錯体内では電荷間の相互作用の役割が比較的大きいのに対して、２つの表面の間の形状補完性の度合いが平均値より低い。形状相関統計、Ｓ_c、は、２つの表面の調和の仕方をよく説明し、値が１．０の場合は完璧な適合、０．０の場合は２つの表面が無関係であることを意味している。典型的なプロテアーゼ・阻害剤錯体の場合の値が０．７０−０．７６、典型的な抗体・抗原錯体の場合の値が０．６４−０．６８であるのに比べて、ｐＲＩ・ＲＮａｓｅ Ａ界面は、Ｓ_c値が０．５８と比較的低い。ｐＲＩ・ＲＮａｓｅ Ａ界面における原子の充填も、典型的なたんぱく質の内部又はたんぱく質間の界面よりも緻密さが低い。大量の埋もれた表面積が比較的低い形状補完性を補い、ＲＩとＲＮａｓｅ Ａとの間の非常に安定な相互作用を生じている。

本明細書に記載した研究を行う前は、以前産生された変異株の中で、Ｋ７Ａ／Ｋ４１Ｒ／Ｇ８８ＲＲＮａｓｅ Ａが最もＲＩ回避的であった。やはり、ここで使われた学名の下では、Ｇ８８Ｒは、アミノ酸位置８８においてグリシン（Ｇ）残基をアルギニン残基（Ｒ）が置換することによりＲＮａｓｅ Ａ分子が変質され、Ｋ４７Ａ／Ｋ４１Ｒ／Ｇ８８Ｒの蓄積は、３つすべての置換は同じＲＮａｓｅ Ａ変異株(variant)についてなされたことを意味している。この変異株が、Ｇ８８ＲＲＮａｓｅ ＡのＫ_d値よりほぼ１００倍大きい、４７ｎＭのＫ_d値を有するｐＲＩと錯体を形成した。なお、Ｋ７Ａ／Ｋ４１Ｒ／Ｇ８８ＲＲＮａｓｅ Ａは、その活性部位であるリジンをアルギニンで置換したため生じたリボ核酸分解活性が大幅に１００倍低下したために、強力な細胞毒素ではない。したがって、細胞傷害剤として有効であるためには、変異株は、ＲＮａｓｅとして有効な触媒活性を維持しながら親和性を下げてＲＩに結合しなければならない。

ＦＡＤＥアルゴリズムは、図１及び２に図示され、表１に示された部位特異的突然変異生成により破壊されたためにｐＲＩ・ＲＮａｓｅ Ａ錯体に新しい「つまみ」及び「穴」があることを明らかにした。この研究で創られたＲＮａｓｅ Ａ変異株において、Ｄ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ交換及びＮ６７Ｒ置換がＲＩに対する親和性を最大限に低下させた。これら各々の置換のみにより、ｐＲＩ・ＲＮａｓｅ Ａ錯体の安定性を損なうが、これはＧ８８Ｒ置換の不安定化とほぼ等しい。最も破壊的なＦＡＤＥにより呼び起こされた置換を併用すると、ＲＩ回避性がＫ７Ａ／Ｋ４１Ｒ／Ｇ８８ＲＲＮａｓｅ Ａよりも３０倍高くなるだけでなく、ほぼ野生型の触媒活性も保持されるリボヌクレアーゼが得られた（下の表２を参照のこと）。その上、Ｄ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ／Ｇ８８Ｒ、Ｄ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｒ／Ｇ８８Ｒ、及びＫ３１Ａ／Ｄ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｒ／Ｇ８８Ｒの各変異株は、すべて、ＯＮＣよりもＫ−５６２細胞に対して細胞傷害性が強かった（図３を参照のこと）。

したがって、ＲＮａｓｅ ＡとＲＩとの相互作用にＦＡＤＥアルゴリズムを適用すると、図１及び２に示した２つの分子の構造の間の相互作用のモデルが得られる。この分析は、ウシのＲＮａｓｅ Ａ及びブタのリボヌクレアーゼ阻害剤（ｐＲＩ：ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を用いて行った。これらの図で、ＦＡＤＥ幾何学的補完性マーカーは、固体球として示している。これらの球は原子を表すものではない。代わりに、これらの球は、その近くで局所的補完性が最も重要である分子界面における点を表している。特定の残基内のあらゆる原子の２Å内の補完性マーカーを合計すると、表１に載せたクラスターのサイズを決めることができる。最も多数の補完性マーカーに近接し、ＲＮａｓｅ Ａの酵素活性部位から遠位にあるＲＮａｓｅ Ａの残基が、破壊の標的になった。

興味深い１つの発見は、ＲＮａｓｅ Ａ変異株の一部について認められたブタとヒトのＲＩ同族体の親和性の違いである。一般に、ＲＮａｓｅ Ａ変異株は、ｈＲＩよりはｐＲＩによりタイトに結合された（データは下の表２に提示した）。ＲＮａｓｅ Ａに対するｐＲＩのこのように高い親和性は、平衡解離定数を、ｐＲＩ（Ｋ_d＝６．７×１０^-14Ｍ）及びｈＲＩ（Ｋ_d＝４．４×１０^-14Ｍ）と野生型ＲＮａｓｅ Ａとの錯体について最初に測定した場合は認められなかった。ＲＮａｓｅ Ａと接触する２８のｐＲＩ残基の内、２５はｈＲＩの場合と同一である。ＲＮａｓｅ Ａ結合残基の中で違いのある３つは、ｐＲＩのグルタミン残基によるｐＲＩのＨｉｓ６、アラニンによるＡｓｐ２２８、及びロイシンによるＶａｌ４０５の各置換である。これら３つのｐＲＩ残基は、すべて、ＦＡＤＥにより識別されたＲＮａｓｅ Ａ残基ともっぱら原子間の接触を行う。Ｈｉｓ６はＲＮａｓｅ ＡのＬｙｓ３１と３つの接触を行い、Ａｓｐ２２８はＳｅｒ８９と２つの接触を行い、Ｖａｌ４０５はＡｓｎ６７と３つの接触を行う。これら３つの変化が、ＲＮａｓｅ Ａ変異株に対するｐＲＩとｈＲＩとの親和性の違いに寄与するようである。

したがって、これらの残基は有望な修飾のための標的であった。位置Ｇｌｙ８８における変異株は、米国特許第５，８４０，２９６号に記載されているようにすでに検討されているので、我々は他の変質を、単独又はＧ８８Ｒと併せて考えたことに留意すること。ＲＩ−ＲＮａｓｅ Ａ錯体の破壊は、一般に、ＲＮａｓｅ Ａ中の小さな中性又はアニオン性残基をアルギニンにより置換することにより最高の結果が得られると、我々は判断した。最も極性で２番目に大きいアミノ酸であるアルギニンが、細胞の内面化を高めることが知られている正味の正電荷を高めながら、静電反発及び立体歪みを生じられるか、疑わしいと我々は思っている。更に、我々はＲＮａｓｅ Ａのリジン残基をアラニンで置換し、不完全な中性側鎖を創り、それにより錯体の好ましい相互作用を排除した。

したがって、次のような置換は、研究として有望であることが確認された。

Ｄ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄの交換（図２Ｃ）。Ａｒｇ３９は、ＦＡＤＥアルゴリズムにより、ＲＮａｓｅ Ａのあらゆる残基の補完性マーカーの最大数に近いことが確認された（表１）。ｐＲＩに対して１４の原子間接触を行う、Ａｒｇ３９はＲＮａｓｅ Ａのあらゆる残基よりも多くの接触をＲＩと行う。ただし、やはり１４の接触を行うＧｌｕ１１１という例外がある。ＲＮａｓｅ ＡのＡｓｐ３８及びＡｒｇ３９はともに、それぞれ、ｐＲＩのＡｒｇ４５３及びＧｌｕ３９７、並びに２座形式でＧｌｕ３９７と相互作用するＡｒｇ３９と３つの水素結合を形成する。更に、これら２つのＲＮａｓｅ Ａ残基は、ＲＩのＧｌｕ４２６、Ｖａｌ４２８、Ｔｙｒ４３０、及びＩｌｅ４５５とファンデルワールス接触を行う。ＦＡＤＥ分析では明確に確認できなかったが、Ａｓｐ３８はＡｒｇ３９と入れ替えることにより、ｐＲＩ・ＲＮａｓｅ Ａ界面において３つの好ましい相互作用を同時に壊せると、我々は判断した。その上、Ｄ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄの交換は、局所的アミノ酸含有量を維持するという点において、保存的であった。

β４−β５ループ（図２Ｄ）。ＲＮａｓｅ Ａの４つの表面ループは、ＲＩに接触する２４の残基の内１６の残基に寄与する。残基８７−９６を含むＲＮａｓｅ Ａのβ４−β５ループは、３つのトリプトファン残基、Ｔｒｐ２５７、Ｔｒｐ２５９及びＴｒｐ３１４により画定されたｐＲＩの特に疎水性領域に向かって充填する。このループ内の３つのＲＮａｓｅ Ａ残基である、Ｇｌｙ８８、Ｓｅｒ８９及びＬｙｓ９１は、ＲＩにより形状補完性を仲介する場合に重要であることがＦＡＤＥにより確認された。ＲＩ回避性ＲＮａｓｅ Ａを創るための初期の試みが、アルギニン残基を用いたＧｌｙ８８（ＦＡＤＥクラスター・サイズ５）の置換は、立体的歪み及び静電歪みを導入してｐＲＩ・ＲＮａｓｅ Ａ錯体のＫ_d値をほぼ４桁上げる場合に非常に有効であることを証明した。したがって、残基Ｓｅｒ８９及びＬｙｓ９１は、ＦＡＤＥアルゴリズムにより大きな補完性クラスターに近いことが確認されたが、我々は、この錯体のこの領域はＧ８８Ｒ置換により最大限に破壊されるべきで、このループを更に変質させることはできないと見なした。

Ｎ６７Ｒ置換（図２Ａ）。Ａｓｎ６７は、Ａｒｇ３９及びＲＮａｓｅ Ａのβ４−β５ループの残基に次いで、補完性マーカーの中で３番目に大きなクラスターに近かった。Ａｓｎ６７は、Ｖａｌ４０５の主鎖酸素との水素結合を含む、ｐＲＩの残基である、Ｃｙｓ４０４、Ｖａｌ４０５、Ｇｌｙ４０６及びＴｙｒ４３３と６つの接触を行う。ＲＮａｓｅ ＡのＡｓｎ６７と接触するｐＲＩのＴｙｒ４３３は、どちらのたんぱく質のあらゆる残基の補完性マーカーの最大数に近いことが確認されたことは、注目に値する。したがって、ＲＩのＴｙｒ４３３及びＲＮａｓｅ ＡのＡｓｎ６７は、ｐＲＩ・ＲＮａｓｅ Ａ錯体の「アンカー残基」として他者により確認された。

他のＦＡＤＥにより識別された残基。Ｌｙｓ７（図２Ｂ）は、補完性クラスター・サイズが２でＲＮａｓｅ Ａの内スコアが最低の残基であった。それにも関わらず、Ｌｙｓ７はｐＲＩのＳｅｒ４５６と、いくつかの水素結合を含む、７つの原子間接触を行う。以前の研究によりこの残基が錯体の安定性にかなり寄与していることが証明されていた。我々も、Ａｓｎ２４及びＬｙｓ３１について調べた。これは、それぞれ、５と２に近いクラスター・サイズに位置し、７と４の原子間接触を行う。Ａｓｎ２４は、ＲＩのＡｓｐ８９及びＡｓｐ１１７と７つのファンデルワールス接触及び２つの水素結合を行い、Ｌｙｓ３１はｐＲＩのＨｉｓ６と３つの原子間接触及びＡｓｐ３１と１つの接触を行う。

これら特定のアミノ酸配置が、ウシの膵臓のリボヌクレアーゼＡの特定配列に関連して識別されていれば、酵素のリボヌクレアーゼＡ・スーパーファミリーの中には、この情報が適用できる多数のメンバーがあることは明らかである。今日当業者は、配列アラインメントを行う方法を理解し、更に、このスーパーファミリーのメンバーについて、これに密接に関連したこれらの酵素のファミリーの他のメンバーにおける対応するアミノ酸位置を識別する方法を決める。

我々が想定した目的を成功させるためには、ＲＮａｓｅ Ａ変異株は、ＲＩに対する親和性を下げ、更に、かなりの触媒活性を保持しなければならない。うまくいけば、ＲＩに対する低い親和性と触媒活性を併用すると、変異株を細胞傷害性を有する株にすることになり、おそらく以前のＧ８８ＲＲＮａｓｅ Ａ変異株よりも細胞傷害性が強くなるであろう。そこで、上で識別された位置の各々における酵素の修飾を試み、その結果は下の実施例に提示した。この研究は、これらの変異株の一部が細胞傷害性の増加を示すことを確認した。特に、変異株Ｄ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ／Ｇ８８Ｒ及びＤ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｒ／Ｇ８８Ｒの両方が、ＲＩに対する低い親和性と高レベルの触媒活性とを示し、更に、下の表２及び３に提示されたデータにより実証されたように細胞傷害性が上がっていることが判明した。

我々はＦＡＤＥアルゴリズムを用いて、高度の形状補完性を示すｐＲＩ・ＲＮａｓｅ Ａ錯体内のＲＮａｓｅ Ａ残基を迅速且つ客観的に識別した。ＦＡＤＥアルゴリズムにより識別したいくつかの残基は、ｐＲＩ・ＲＮａｓｅ Ａ錯体に対してかなりの量の結合エネルギーで寄与し、又は突然変異形成による破壊の優れた標的になることが実験的に証明されている。ＦＡＤＥアルゴリズムがこれらの領域の重要性を予測することに成功していることが、このアルゴリズムの有用性の証拠となり、ＦＡＤＥにより識別された追加のＲＮａｓｅ Ａ残基に関する我々のその後の分析を正当化した。類似の残基リストが３次元構造を注意深く調べることにより確認されているが、ＦＡＤＥの利点は高い補完性の領域を迅速に識別できることにある。更に、コンピュータによるアルゴリズムは客観的であり、ヒューマン・エラーや偏りを排除することができる。

あらゆる薬剤の重要な特性は該薬剤の治療指数であり、この指数は薬剤の有効用量に対するその毒性用量の比である。ヒトでは、ＯＮＣは癌の化学療法剤として非常に好ましい治療指数を示し、その薬剤のフェーズＩＩＩ臨床試験へ進むことを可能にしている。哺乳類のリボヌクレアーゼはＯＮＣよりも一層大きな治療指数を示すことがある。例えば、Ｈｅｎ−３Ｂ肝臓癌細胞系は、本明細書でテストしたすべてのリボヌクレアーゼの攻撃を最もを受けやすい（表３）。ＯＮＣは、ここでＩＣ₅₀ ^NmuMG／ＩＣ₅₀ ^Hep-3Bとして定義された３１という治療指数（ＴＩ：ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｎｄｅｘ）を有する。対照的に、ＲＮａｓｅ ＡのＤ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｒ／Ｇ８８Ｒ、Ｄ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ／Ｇ８８Ｒ及びＧ８８Ｒ変異株は、それぞれ、＞３２３、＞５００、及び＞１１８のＴＩ値を有する。リボヌクレアーゼ（両生類又は哺乳類）の治療指数に関する生化学的説明をするには更に実験を行う必要がある。

実験プロトコル及び結果
可能性のあるＲＮａｓｅ Ａ変異株のどれが成功する可能性があるかを検討するために、発現ベクターを作り、上で提案された変質の各々についてＲＮａｓｅ Ａ変異株を産生した。その後これらの変異株は、触媒活性、ＲＩに対する親和性、安定性及び細胞傷害性についてテストされた。

触媒活性
リボヌクレアーゼは、細胞傷害性であるためにはその触媒活性を保持しなければならない。したがって、各リボヌクレアーゼの触媒活性は、もしあるならば、アミノ酸置換のどれが、ＲＮＡを分解する酵素の能力を低減することにより細胞傷害性を弱めることができるかを決めるためにアッセイを行った。野性型ＲＮａｓｅ Ａ、その変異株、及びＯＮＣのＫ_cat／Ｋ_Mの値を、この分析の結果をまとめている表２に示す。野生型ＲＮａｓｅ Ａ、Ｇ８８ＲＲＮａｓｅ Ａ、Ｋ７Ａ／Ｇ８８ＲＲＮａｓｅ Ａ、及びＯＮＣのＫ_cat／Ｋ_Mの値は、それぞれ、５．２×１０⁷、７．４×１０⁷、５．３×１０⁶、及び２．２×１０⁵Ｍ^-1ｓ^-1であり、これらは以前に報告された値とよく一致している。ＲＮａｓｅ Ａの交換残基３８と３９とでは酵素による触媒への影響が比較的小さかった。Ｄ３８Ｒ／Ｒ３９ＤＲＮａｓｅ ＡのＫ_cat／Ｋ_Mの値は、１．８×１０⁷Ｍ^-1ｓ^-1であり、これはリボ核酸分解活性が３倍低下したにすぎないことを意味している。同様に、Ｄ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ／Ｇ８８Ｒ変異株でも小さな影響が見られ、３．１×１０⁷Ｍ^-1ｓ^-1のそのＫ_cat／Ｋ_Mの値は、Ｇ８８ＲＲＮａｓｅ Ａの値の２．５倍低かった。興味深いことに、Ｇ８８Ｒ置換との関連で単一のＲ３９Ｄ置換を行った場合は、リボ核酸分解活性に対する影響はより明白で、Ｇ８８ＲＲＮａｓｅ ＡのＫ_cat／Ｋ_Mの値は１７倍低く４．３×１０⁶Ｍ^-1ｓ^-1になる。このような低下は、この領域における負の電荷を上げ、おそらく酵素とそのアニオン性基質との間の生産的衝突数を下げることにより生じるのであろう。

Ｌｙｓ７を含むＲＮａｓｅ ＡのＰ２基質結合部位は、ＲＮａｓｅ Ａによる触媒作用において重要な役割を果たす。以前の結果と一致して、Ｋ７Ａ／Ｇ８８ＲＲＮａｓｅ Ａは、リボ核酸分解活性をほぼ１０倍低下させ、５．３×１０⁶Ｍ^-1ｓ^-1のＫ_cat／Ｋ_Mの値を有する。触媒作用へのこのような逆の寄与は、活性を低下させる他のアミノ酸置換と併用した場合加法的であり、Ｄ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ交換（Ｋ_cat／Ｋ_Mを３倍下げる）は、Ｋ７Ａ置換（Ｋ_cat／Ｋ_Mを１０倍下げる）と併用すると、野生型のＲＮａｓｅ Ａより３０倍低い１．６×１０⁶Ｍ^-1ｓ^-1の活性を有するＫ７Ａ／Ｄ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ変異株を生じた。更に、四重変異株Ｋ７Ａ／Ｄ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ／Ｇ８８ＲＲＮａｓｅ Ａの活性を１．６×１０⁶Ｍ^-1ｓ^-1に下げる、Ｄ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ／Ｇ８８ＲＲＮａｓｅ Ａの活性が１５倍下がる原因はＫ７Ａ置換にあった。

ＦＡＤＥで呼び起こされた大部分の置換は、リボ核酸分解活性に対して大きな影響はなかった。Ｎ６７Ｒ、Ｋ３１Ａ及びＮ２４Ｒ置換は、個別にＧ８８Ｒ置換と併用した場合、Ｇ８８ＲＲＮａｓｅ Ａ自身の触媒活性とほぼ同等の触媒活性を有する酵素を産生した。これら３つの変異株のＫ_cat／Ｋ_Mの値は、それぞれ、９．２×１０⁷、５．２×１０⁷、及び７．８×１０⁷Ｍ^-1ｓ^-1であった。したがって、これら多くの置換（Ｋ３１Ａ／Ｄ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｒ／Ｇ８８ＲＲＮａｓｅ Ａ及びＤ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｒ／Ｇ８８ＲＲＮａｓｅ Ａなど）を併用するＲＮａｓｅ Ａ変異株は、野生型酵素とほぼ同じＫ_cat／Ｋ_Mの値を有した（それぞれ、４．８×１０⁷及び３．８×１０⁷Ｍ^-1ｓ^-1）。要するに、酵素活性はこれらの変異株の制限パラメータであるとは思われない。

ＮＤは測定していないことを意味している。
^aＲＮａｓｅ Ａ及びその変異株のＴ_mの値（±２℃）は紫外分光法によりＰＢＳ中で 測定した。
^bＲＮａｓｅ Ａ及びその変異株のＫ_cat／Ｋ_Mの値（±ＳＥ）は、ＮａＣｌ（０．１０ Ｍ）を含むｐＨ６．０における０．１０ＭのＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ＯＶＳフリー）中（ ２３±２）℃における６−ＦＡＭ−ｄＡｒＵ（ｄＡ）₂−６−ＴＡＭＲＡ開裂の触媒作用に 関するものである。ＯＮＣのＫ_cat／Ｋ_Mの値（±ＳＥ）は、ＮａＣｌ（０．０１０Ｍ）を 含むｐＨ６．０における０．０２０ＭのＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ＯＶＳフリー）中（２３ ±２）℃における６−ＦＡＭ−ｄＡｒＵ（ｄＡ）₂−６−ＴＡＭＲＡ開裂の触媒作用に関す るものである。
^cＫ_dの値（±ＳＥ）は、（２３±２）℃におけるｐＲＩとの錯体に関するものである。ＯＮ ＣのＫ_dの値は（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１ ０６８６−１０６９３）からの推定値である。
^dΔΔＧの値は、式：ΔΔＧ＝−ＲＴｌｎ（Ｋ_d ^野生型／Ｋ_d ^変異株）を用いて計算した。
^eＫ_dの値（±ＳＥ）は、（２３±２）℃におけるｈＲＩとの錯体に関するものである。
^f（Ｋ_cat／Ｋ_M）_cytoの値は、式１及びｈＲＩとの錯体に関するＫ_dの値を用いて計算した 。
^gＩＣ₅₀の値（±ＳＥ）は、リボヌクレアーゼに対して露出したＫ−５６２細胞のＤＮＡ内へ の［メチル−³Ｈ］チミジンの組み込みに関するものであり、式３を用いて計算した。
^h（Ｖｉｃｅｎｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２９，８８２７−８８３ ４）から。
ⁱ（Ｌｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ ＳＡ９５，１０４０７−１０４１２）から。
^j（Ａｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０６，１００−１ ０７）から。
^kフルオレセインで標識を付けたＧ８８ＲＲＮａｓｅ Ａに関する。
^l（Ｈａｉｇｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，１１５７ ６−１１５８１）から。
^m（Ｌｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ ＳＡ９５，１０４０７−１０４１２）から及び円偏光二色性分光法により測定した。

リボヌクレアーゼ阻害剤に対する親和性
ｐＲＩ及びｈＲＩのアミノ酸配列はよく似ている（同一性７７％）。その上、ＲＮａｓｅ Ａと接触するｐＲＩ中の２８の残基の内、ｈＲＩでは２つだけが類似していない残基により置換されている。これら２つの阻害剤たんぱく質は、ＲＮａｓｅ Ａ変異株に対して似た親和性を有すると仮定したが、我々はｐＲＩ及びｈＲＩとの錯体のＫ_dの値を測定し、これらのＫ_dの値を上の表２に示す。

たんぱく質間の相互作用にとって重要な残基を識別する場合のＦＡＤＥアルゴリズムの有用性に関する厳密なテストとして、我々はｐＲＩとの錯体中のＦＡＤＥにより呼び起こされた変異株のＫ_d値を測定した。ｐＲＩとの錯体中のＧ８８ＲＲＮａｓｅ Ａ及びＫ７Ａ／Ｇ８８ＲＲＮａｓｅ Ａについて得られた０．５７及び１７ｎＭのＫ_d値は、以前に測定した値とよく一致していた。ＲＮａｓｅ Ａに対するｐＲＩの親和性を低下させない唯一の変化はＮ２４Ｒ置換であった。実際に、０．２７ｎＭのＫ_d値を有するＮ２４Ｒ／Ｇ８８ＲＲＮａｓｅ Ａは、Ｇ８８ＲＲＮａｓｅ Ａよりも、ｐＲＩとわずかにタイトな錯体を形成するように思われた。Ｋ_d値の最も顕著な増加は、Ｄ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ交換及びＮ６７Ｒ置換の場合に認められ、これらの錯体はそれぞれ０．３０及び０．３６ｎＭのＫ_d値を示した。これらのアミノ酸変化は、Ｋ_d値が、それぞれ、４，５００倍及び５，４００倍に増加した原因であった。Ｋ７Ａ／Ｄ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｒ／Ｇ８８Ｒ及びＤ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ／Ｇ８８Ｒ変異株はｐＲＩと錯体を形成し、これらの錯体は、それぞれ、３．５、４５及び８．０ｎＭのＫ_d値を有する。

複数置換を併用すると、ＲＮａｓｅ Ａの最もＲＩ回避的な変異株を産生した。留意すべきは、Ｋ７Ａ／Ｄ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ／Ｇ８８Ｒ及びＤ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｒ／Ｇ８８Ｒ変異株であり、これらは、それぞれ、０．１２及び１．４μＭのＫ_d値を有するｐＲＩとの錯体を形成した。とりわけ、Ｄ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｒ／Ｇ８８ＲＲＮａｓｅ Ａは、ミクロモルのＫ_d値を有するｐＲＩとの錯体を形成することが認められた最初のＲＮａｓｅ Ａ変異株である。ＲＮａｓｅ Ａ中の１２４の残基から４つのみを変えることにより、ｐＲＩ・ＲＮａｓｅ Ａ錯体のＫ_d値は、Ｄ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｒ／Ｇ８８Ｒ変異株の場合、２０００万倍に上がった。

ＲＮａｓｅ Ａ変異株とｐＲＩとの錯体のＫ_d値は、形状補完性マーカーを識別するＦＡＤＥアルゴリズムの能力を評価するのに理想的である。しかし、化学療法剤としては、細胞傷害性リボヌクレアーゼはヒトＲＩを回避することができねばならない。このために、Ｋ_d値は、ＲＮａｓｅ Ａ変異株とｈＲＩ錯体についても測定した。Ｎ６７Ｒ／Ｇ８８ＲＲＮａｓｅ Ａ（Ｋ_d＝４４ｎＭ）という例外はあるが、ｈＲＩ錯体のＫ_d値は、ｐＲＩの場合に得られた値よりも大きく、その差は２倍から２３０倍の範囲にある。ｈＲＩとの錯体の場合に認められた最高のＫ_d値は、２７μＭにおけるＫ７Ａ／Ｄ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ／Ｇ８８ＲＲＮａｓｅ ＡのＫ_d値であり、それはｈＲＩに対する親和性が４億倍に低下することを意味する。

重要なことは、錯体に対するこれらの置換の不安定化作用は完全に加法的ではないことで、これはｐＲＩ・ＲＮａｓｅ Ａ界面が可塑的であることを示している。結合界面の順応性は、ΔΔＧ値を比較すると知ることができる（表２）。例えば、Ｇ８８Ｒ及びＮ６７Ｒの置換は、錯体を各々約５ｋｃａｌ／ｍｏｌだけ不安定化した。しかし、Ｎ６７Ｒ／Ｇ８８Ｒの二重変異株は、これら２つの置換が空間的には分離しているにも関わらず、結合自由エネルギーのロスは８ｋｃａｌ／ｍｏｌに止まった。

安定性
リボヌクレアーゼの立体的安定性は、細胞傷害性を含む生物学的機能にとって必要である。したがって、各ＲＮａｓｅ Ａ変異株のＴ_m値を測定し、表２に示す。Ｎ６７Ｒ置換は最も不安定化する置換であり、野生型ＲＮａｓｅ ＡのＴ_m値を５７℃へ７℃も下げる。立体的安定性のこのようなロスは、Ｎ６７Ｒを含むすべての変異株において認められている追加置換によって回復することはなかった。Ｎ６７Ｒ／Ｇ８８Ｒ及びＤ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｒ／Ｇ８８Ｒの変異株は、それぞれ、５８及び５６ＣのＴ_m値を有する。Ｋ３１Ａ／Ｄ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｒ／Ｇ８８ＲＲＮａｓｅ Ａは、５４℃の最低Ｔ_m値を有し、この温度は野生型酵素のＴ_m値より約１０Ｃ低い。更に、このＴ_m値は生理的温度よりもかなり高い。他のアミノ酸置換には、Ｔ_m値を数度以上下げられるものはない。

細胞傷害性
各リボヌクレアーゼの毒性は、Ｋ−５６２ヒト白血病細胞系を用いて測定した。図３のデータ（１２の細胞傷害性ＲＮａｓｅの場合、ｈ＝１．４３±０．０２）に式３（下で説明している）を適用して導かれたＩＣ₅₀値を用いて、細胞傷害性が大きくなる順番で表２にＲＮａｓｅを示す。ＯＮＣ、Ｇ８８ＲＲＮａｓｅ Ａ、及びＫ７Ａ／Ｇ８８ＲＲＮａｓｅ Ａは、以前に報告された値と類似のＩＣ₅₀値を示した。Ｄ３８Ｒ／Ｒ３９ＤＲＮａｓｅ Ａ（図３Ａ）及びＮ６７ＲＲＮａｓｅ Ａ（図３Ｃ）は、２５μＭの濃度においてさえも細胞傷害活性を示さなかった。後の２つの変異株がＧ８８Ｒ置換との関連で示した細胞傷害性の大きな増加を考えると、これら２つの変異株に細胞傷害性がないことは興味深いことである。

Ｄ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ／Ｇ８８Ｒ変異株内にＫ７Ａ置換を組み込むと、この変異株のｈＲＩに対する親和性が４０倍に低下するが、これはｈＲＩのＣ末端セリン残基とリジン側鎖との間の好ましい相互作用が失われることと一致している。この比較的大きなＫ_d値は触媒活性のロスに伴って起きたもので、ＩＣ₅₀値をＤ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ／Ｇ８８ＲＲＮａｓｅ ＡのＩＣ₅₀値のほぼ２倍にする。Ａｓｐ３８はＦＡＤＥ分析では明確に識別されなかったが、保存的Ｄ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ交換におけるＡｓｐ３８の重要性は、Ｒ３９Ｄ／Ｇ８８ＲＲＮａｓｅ ＡのＩＣ₅₀値（ＩＣ₅₀＝０．６９μＭ）を、Ｄ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ／Ｇ８８ＲＲＮａｓｅ ＡのＩＣ₅₀値（ＩＣ₅₀＝０．２２μＭ）と比較すると明らかである。

この研究で発見されたＲＮａｓｅ Ａの内最も細胞傷害性の強い２つの変異株、Ｄ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ／Ｇ８８Ｒ及びＤ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｒ／Ｇ８８Ｒ、並びにＯＮＣ、野生型ＲＮａｓｅ Ａ、及びＧ８８ＲＲＮａｓｅ Ａは、１０種類の細胞系に対する細胞傷害活性について選別した。これらのリボヌクレアーゼについて得られたＩＣ₅₀値を、表３に示す。すべての細胞系は、マウスの乳房の正常な上皮細胞系であるＮｍｕＭＧを除いてヒトに由来するものである。Ｈｅｐ３Ｂ細胞系は例外であるが、ヒトの白血病のＫ−５６２系のように、すべてのヒト癌細胞系は、新規な抗癌薬を研究している国立癌研究所（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）により選別された６０の細胞系に含まれている。

細胞系を、倍増期間が長くなる順番に表３に示す。倍増期間と以前に報告されたＲＮａｓｅ Ａに対する感度との間には直接的な相関関係はないようである。一般に、ＲＮａｓｅ Ａ変異株の中の細胞傷害性の傾向は、Ｋ−５６２細胞系で見られた傾向を反映し、即ち、Ｄ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｒ／Ｇ８８Ｒ＞Ｄ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ／Ｇ８８Ｒ＞Ｇ８８Ｒ＞野生型ＲＮａｓｅ Ａの順番であり、Ｄ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｒ／Ｇ８８Ｒ変異株は常に最低のＩＣ₅₀値を有する。ＨＣＴ−１１６、Ａ５４９、及びＳＦ２６８細胞系は、すべて、Ｇ８８ＲＲＮａｓｅ Ａよりも野生型ＲＮａｓｅ Ａに対して敏感であったので、この一般的傾向の例外であった。我々が一部の細胞系が野生型ＲＮａｓｅ Ａに対して感受性があることを見出したように、他者も野生型ヒト膵臓リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ １）が一部の細胞系に対して毒性があることを報告している。これら３つの細胞系は、それぞれ、３種類のタイプの組織、即ち、結腸、肺、及びＣＮＳから導かれた。

この研究の目的は、ＯＮＣの細胞傷害性よりも大きいか同等の細胞傷害性を有するＲＮａｓｅ Ａ変異株を識別することであった。この目的は、Ｋ−５６２、Ｄｕ１４５、Ｈｅｐ−３Ｂ、及びＳＦ２６８細胞系において、Ｄ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｒ／Ｇ８８Ｒ変異株により達成された。残りの６つの細胞系では、ＯＮＣはＲＮａｓｅ Ａ変異株よりも３倍から３０倍大きい細胞傷害性を示した。興味深いことに、この選別でテストしたＲＮａｓｅ Ａ誘導変異株の中で、テストした最大濃度において正常な細胞系ＮｍｕＭＧに対して毒性を示したものはなかった。この区別は、正常なマウス細胞系の場合１．６２μＭのＩＣ₅₀値を有したＯＮＣでは認められなかった。

方法及び物質
物質
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞及びｐＥＴ２２ｂ（＋）及びｐＥＴ２７ｂ（＋）プラスミドは、ウィスコンシン州マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）のノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ）から得た。Ｋ−５６２細胞は、バージニア州マナサス（Ｍａｎａｓｓａｓ）のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手した慢性のヒト骨髄性白血病系から連続的に誘導された。細胞培養媒体及び助剤は、カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）のインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から得た。［メチル−³Ｈ］チミジン（６．７Ｃｉ／ｍｍｏｌ）は、マサチューセッツ州ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ）のパーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）から得た。酵素は、ウィスコンシン州マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）のプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）又はマサチューセッツ州ベバーリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）のニューイングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）から得た。リボヌクレアーゼ基質６−ＦＡＭ−ｄＡｒＵｄＡｄＡ−６−ＴＡＭＲＡ及び６−ＦＡＭｄＡｒＵｄＧｄＡ〜６−ＴＡＭＲＡは、アイオワ州コラルビル（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ）のインテグレーテッドＤＮＡテクノロジーズ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から得た。用いた他のすべての化学物質は市販の試薬級又はそれ以上の品質のもので精製せずにそのまま用いた。

テリフィック・ブロス（ＴＢ：Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ）は、１．００Ｌにつき、トリプトン（１２ｇ）、酵母エキス（２４ｇ）、グリセロール（４ｍＬ）、ＫＨ₂ＰＯ₄（２．３１ｇ）、及びＫ₂ＨＰＯ₄（１２．５４ｇ）を含む。ホスフェート緩衝食塩水（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）は、１．００Ｌにつき、ＮａＣｌ（８．０ｇ）、ＫＣｌ（２．０ｇ）、Ｎａ₂ＨＰＯ₄・７Ｈ₂Ｏ（１．１５ｇ）、ＫＨ₂ＰＯ₄（２．０ｇ）、及びＮａＮ₃（０．１０ｇ）を含み、ｐＨ７．４を有する。

装置
Ｋ−５６２ゲノムＤＮＡ中への［メチル−³Ｈ］チミジンの組み込みは、マサチューセッツ州ウエルズリー（Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ）のパーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）のミクロベータ・トリルックス（Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘ）液体シンチレーション及びルミネッセンス計数器を用いたシンチレーション計数により定量した。各たんぱく質変異株の質量は、カリフォルニア州フォスターシティー（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）のアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のボイジャー・ド・プロ・バイオスペクトロメトリ・ワークステーション（Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ−ＰＲＯ Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ）を用いたマルディトフ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分光法により確認した。蛍光測定は、ニュージャージー州サウス・ブルンスウイック（Ｓｏｕｔｈ Ｂｒｕｎｔｈｗｉｃｋ）のフォトン・テクノロジー・インターナショナル（Ｐｈｏｔｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）の試料撹拌付きクアンタマスター１（ＱｕａｎｔａＭａｓｔｅｒ１）光子計数蛍光計を用いて行った。熱変性データは、カリフォルニア州パロアルト（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）のバリアン（Ｖａｒｉａｎ）のケアリー（Ｃａｒｙ）温度調節器を備えたケアリー３ダブルビーム分光光度計を用いて得た。

リボヌクレアーゼＡ変異株のデザイン
高速原子密度評価装置（ＦＡＤＥ）プログラムにより、複雑な界面におけるたんぱく質の形状補完性マーカーを計算する。原子密度は、以前に説明した方法に基づいてフーリエ変換アルゴリズムを用いて測定する。結晶性ｐＲＩ・ＲＮａｓｅ Ａ錯体の構造を用いて（ＰＤＢ入口１ＤＦＪ）、形状補完性マーカーの大きなクラスターに近接している必須のＲＮａｓｅ Ａ残基を識別し、上の表１に示す。最大の静電又は立体的矛盾を創り、好ましいクーロン又は短距離の相互作用を排除するように、アミノ酸置換を選択した。

この研究を開始した時に公知であったＲＮａｓｅ Ａの内最も細胞傷害性の強い変異株はＫ７Ａ／Ｇ８８ＲＲＮａｓｅ Ａであった。ＦＡＤＥ分析により呼び起こされたその後のアミノ酸置換は、回避性に寄与するものが何か追加されることを期待して、最初は確立されたこれらの変化を背景にして作られた。ここで論議したように、Ｋ７Ａ置換に伴って起きる酵素活性のロスが妥協して細胞傷害性の問題を解決し、このため、後者の置換はＧ８８Ｒ置換のみを背景にしてなされたことを我々は見出した。Ｇ８８Ｒの背景が細胞傷害性及びＲＩ回避の基準をうまく特徴づけ、これらのことから我々は自身が確立した試験法を用いて改善を識別することができる。Ｇ８８Ｒを背景にして成功した置換は、ＲＩ及び細胞傷害性の回避に対するこれら個々の寄与を評価するためにのみなされた。

リボヌクレアーゼの産生
ＲＮａｓｅ Ａ変異株を符号化するｃＤＮＡ分子は、ｐＥＴ２２ｂ（＋）又はｐＥＴ２７ｂ（＋）プラスミドを用いてオリゴヌクレオチドが仲介した部位特異的突然変異生成により創られ、該プラスミドは、それぞれ、野生型ＲＮａｓｅ Ａ又はそのＧ８８Ｒ変異株を符号化するｃＤＮＡを含む。ＯＮＣ、野生型ＲＮａｓｅ Ａ、及びＲＮａｓｅ Ａ変異株は、次のような例外があるが、ハイジスら（Ｈａｉｇｉｓ ｅｔ ａｌ．），（２００２）ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ）２７７，１１５７６−１１５８１において以前に記載されたとおりに産生された。大腸菌からの封入体は、グアニジン−ＨＣｌ（７Ｍ）、ＤＴＴ（０．１Ｍ）、及びＥＤＴＡ（１０ｍＭ）を含む、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液中ｐＨ８．０において、完全に溶解するまで撹拌した。リボヌクレアーゼは、ＮａＣｌ（０．１Ｍ）、還元グルタチオン（１．０ｍＭ）、及び酸化グルタチオン（０．２ｍＭ）を含む、０．１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液中に、ｐＨ８．０において、ゆっくりと希釈した後室温で１晩再び放置した。精製後、たんぱく質はＰＢＳに対して透析し、生化学アッセイで使用する前に０．２μｍシリンジを用いてろ過した。たんぱく質濃度は、ＲＮａｓｅ Ａ及びその変異株についてはε₂₇₈＝０．７２ｍｇ・ｍｌ^-1ｃｍ^-1、ＯＮＣについてはε₂₈₀＝０．８７ｍｇ・ｍｌ^-1ｃｍ^-1の吸収係数を用いて紫外分光法により測定した。

リボヌクレアーゼ阻害剤の産生
ブタのリボヌクレアーゼ阻害剤（ｐＲＩ）は、クリンクら（Ｋｌｉｎｋ ｅｔ ａｌ．），（２００１）プロテイン・イクスプレッション・アンド・ピュリフィケーション（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．）２２，１７４−１７９に記載されたとおりに調製した。新たに調製したｐＲＩは、野生型のＲＮａｓｅ Ａのリボ核酸分解活性を上げる能力により１００％活性であることを確認した。

ヒトのリボヌクレアーゼ阻害剤（ｈＲＩ）は、ｈＲＩのＮｄｅＩとＳａｌＩ部位との間でｈＲＩを符号化するｃＤＮＡを含むｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドを用いて変換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞中で産生した。ＴＢの培養液（１．０Ｌ）に、１晩おいた培養液から６００ｎｍにおけるＯＤが０．００５になるように３７Ｃで植菌した。この培養液を、６００ｎｍにおけるＯＤが１．８−２．０になるように増殖させた。最終濃度が０．５ｍＭになるようにＩＰＴＧを加え、１８Ｃで１晩誘導させた。可溶性たんぱく質のその後の精製及びｈＲＩの活性測定は、ｐＲＩの場合と同様に行った。両ＲＩの純度及びサイズは、電気泳動及び質量分光法により確認した。

リボヌクレアーゼ阻害剤の結合アッセイ
ｐＲＩ及びｈＲＩ両方のＲＮａｓｅ Ａ変異株への親和性をアベルら（Ａｂｅｌ ｅｔ ａｌ．），（２００２）アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）３０６，１００−１０７において以前に報告された競合アッセイを少し変えた方法を用いて測定した。要するに、フルオレセインで標識を付けたＧ８８ＲＲＮａｓｅ Ａ（最終濃度：５０ｎＭ）及び標識をつけていない種々の濃度のリボヌクレアーゼの両方を、ＤＴＴ（５ｍＭ）を含む２．０ｍｌのＰＢＳに加えた。（２３±２）℃で１５分培養後、光から保護し、フルオレセインで標識を付けた結合していないＧ８８ＲＲＮａｓｅ Ａの最初の蛍光強度を３分間監視した（励起：４９３ｎｍ，発光：５１５ｎｍ）。次いで、ｐＲＩを加え（最終濃度は５０ｎＭで、これは標識を付けない競合者がない場合は、フルオレセインで標識を付けたＧ８８ＲＲＮａｓｅ Ａの９０％を結合するのに十分な濃度である）、最終蛍光強度を測定した。競合アッセイはｈＲＩの場合と同様に行った。ただし、ｈＲＩの場合は、親和性が低いので、フルオレセインで標識を付けたＧ８８ＲＲＮａｓｅ Ａの９０％を結合するには、ｐＲＩの場合より多くのｈＲＩを必要とした（最終濃度１１５ｎＭ）。フルオレセインで標識を付けたＧ８８ＲＲＮａｓｅ Ａに対するｈＲＩの親和性は、ｈＲＩの量を０．５−１０００ｎＭの範囲で変えて、フルオレセインで標識を付けたＧ８８ＲＲＮａｓｅ Ａを５０ｎＭに上げ、結合して低下した蛍光を記録して測定した。Ｋ_d値は７．８ｎＭであることが判明した。

触媒活性アッセイ
ＲＮａｓｅ Ａ及びその変異株のリボ核酸分解活性は、過敏な蛍光発生基質６−ＦＡＭ〜ｄＡｒＵｄＡｄＡ〜６−ＴＡＭＲＡ（５０ｎＭ）を開裂させるこれらの能力をアッセイして測定した。該基質は開裂すると蛍光（励起：４９３ｎｍ，発光：５１５ｎｍ）を１８０倍に上げる。アッセイは、ＮａＣｌ（０．１０Ｍ）を含むｐＨ６．０における２．０ｍｌの０．１０ＭのＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液中（２３±２）℃にて行った。この緩衝液の調製に用いたＭＥＳは、微量のオリゴマー性ビニルスルホン酸を除去するためにアニオン交換クロマトグラフィにより精製した。該スルホン酸は、市販の緩衝液を合成する際の副産物であり、ＲＮａｓｅ Ａの強力な阻害剤であることが分かっている。Ｋ_cat／Ｋ_Mの値は次式により得られた。

式中、ΔＩ／Δｔは、液体試料保存容器にＲＮａｓｅを加えた時に６−ＦＡＭ−ｄＡｒＵｄＡｄＡ−６−ＴＡＭＲＡ基質の開裂により生じた初期反応速度を表し、Ｉ_o及びＩ_maxは、それぞれ、酵素添加前及び過剰の野生型ＲＮａｓｅ Ａによる基質の完全開裂後の蛍光強度である。ＯＮＣの活性値は、基質６−ＦＡＭ〜ｄＡｒＵｄＧｄＡ〜６−ＴＡＭＲＡ（５０ｎＭ）を用いてＮａＣｌ（０．０１０Ｍ）を含むｐＨ６．０における２．０ｍｌのＯＶＳフリーの２０ｍＭのＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液中（２３±２）℃において測定した。

細胞傷害性アッセイ
ＲＮａｓｅ Ａ、その変異株及びＯＮＣのＩＣ₅₀値は、リボヌクレアーゼの存在下でＫ−５６２細胞の細胞ＤＮＡ内への［メチル−³Ｈ］チミジンの組み込みを測定して決めた。細胞傷害性アッセイはすべて、三重に少なくとも３度繰り返した。各データ点は、３又はそれ以上の実験値の平均（±ＳＥ）を表す。ＩＣ₅₀値は、非線形回帰を用いた曲線を次式に用いたシグモイド用量反応曲線へ合致させて計算した。

式３では、ｙは４−ｈ［メチル−³Ｈ］チミジン・パルスに続くＤＮＡの総合成であり、ｈは曲線の勾配である。

Ｋ−５６２細胞を用いて行われたもの以外の細胞傷害性アッセイは、ケック（Ｋｅｃｋ）−ＵＷＣＣＣ小分子選別設備で行われた。これらのアッセイは、広い範囲の組織からの１０の細胞系を用いた。リボヌクレアーゼを用いた７２時間の培養後、ＩＣ₅₀値は、オレゴン州ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ）のモレキュラープローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）の蛍光プローブ寄りのカルセインＡＭの生細胞におけるカルセインへの酵素変換を測定して決めた。変動係数及びＺ値は、内部対照としてドキソルビシンを用いて各細胞系について決めた。すべての細胞傷害性アッセイは、三重に３度行った。ＩＣ₅₀値は、次式を用いて計算した。

式中、低い％及び高い％は、阻害率５０％をひとくくりにしている、２つの濃度［リボヌクレアーゼ］_低い及び［リボヌクレアーゼ］_高いによる阻害率を指している。

前述の発明は、明確に理解するために説明図及び実施例によりかなり詳細に説明されているが、本発明の特定の適応は当業者にとって通常の最適化の問題であり、本発明の意図又は添付された特許請求の範囲から逸脱することなく実行することができることは明らかである。

リボヌクレアーゼＡ及びリボヌクレアーゼ阻害剤の３次元構造を表した図である。 リボヌクレアーゼＡを修飾する場合の標的部位を示している、リボヌクレアーゼＡ及びリボヌクレアーゼ阻害剤の３次元構造の間の相互作用を表した図である。 Ｋ−５６２細胞の増殖に対するリボヌクレアーゼの効果を示している上の実施例からのグラフのデータを示した図である。これらのデータ点は、各々が３通りに行われた少なくとも３つの実験の平均値である。これらの曲線は、各々が、ＲＮａｓｅ Ａの対応する変異株で標識を付けられている。

Claims (13)

1. リボヌクレアーゼの天然のアミノ酸配列から少なくとも２つのアミノ酸変化を有するＲＮアーゼＡスーパーファミリーの遺伝子操作されたリボヌクレアーゼであって、前記第１の変化は、ウシの膵臓のＲＮアーゼＡのアミノ酸残基８５〜９４に対応する領域におけるアミノ酸置換であり、前記第２の変化は、ウシの膵臓のＲＮアーゼＡの残基３８、３９及び６７に対応するアミノ酸からなる群から選択された位置における置換又はアミノ酸交換であり、前記遺伝子操作されたリボヌクレアーゼは、アミノ酸残基８５〜９４に対応する前記領域においてのみ修飾を有する対応する遺伝子操作されたリボヌクレアーゼと比較して高い細胞傷害活性を有する前記遺伝子操作されたリボヌクレアーゼ。
2. 前記第２の変化が、残基３８のアスパラギン酸と残基３９のアルギニンとを交換することである、請求項１に記載の遺伝子操作されたリボヌクレアーゼ。
3. 前記第２の変化が、残基６７におけるアスパラギンをアルギニンで置換することである、請求項１に記載の遺伝子操作されたリボヌクレアーゼ。
4. 前記第１の変化が、残基８８におけるグリシンをアルギニンで置換することである、請求項１に記載の遺伝子操作されたリボヌクレアーゼ。
5. 遺伝子操作されたウシの膵臓のリボヌクレアーゼＡであるＤ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ／Ｇ８８Ｒ。
6. 遺伝子操作されたウシの膵臓のリボヌクレアーゼＡであるＤ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｒ／Ｇ８８Ｒ。
7. 請求項１〜６のいずれか1項記載の遺伝子操作されたリボヌクレアーゼを符号化するＤＮＡを発現可能に有するＤＮＡ構成体。
8. 請求項７のＤＮＡ構成体の宿主を務める細胞。
9. 請求項１〜６のいずれか1項に記載の遺伝子操作されたリボヌクレアーゼをin vitroで前記細胞に供給する工程を含む、細胞傷害活性を細胞に供給する方法。
10. ヒト又は動物体の治療方法に使用される請求項１〜６のいずれか1項記載の遺伝子操作されたリボヌクレアーゼ。
11. 細胞への細胞傷害活性の供給に使用される請求項１０記載の遺伝子操作されたリボヌクレアーゼ。
12. 結腸癌、肺癌、肺腺癌、乳腺癌、前立腺癌、ＣＮＳグリア芽腫、卵巣腺癌、及び肝臓癌からなる群から選択される癌の治療用薬剤の調製における請求項１〜６、１０及び１１のいずれか1項記載の遺伝子操作されたリボヌクレアーゼの使用。
13. 結腸癌、肺癌、肺腺癌、乳腺癌、前立腺癌、ＣＮＳグリア芽腫、卵巣腺癌、及び肝臓癌からなる群から選択される癌の治療に使用される薬剤であって、請求項１〜６、１０及び１１のいずれか1項記載の遺伝子操作されたリボヌクレアーゼを含むことを特徴とする薬剤。

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