KR101360781B1 - 키메라 폴리펩티드 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 특정 DNA 서열에 결합하기 위한 특정 친화성으로 구성된 선택적인 폴리펩티드 영역, DNA 개질 활성으로 구성된 선택적인 폴리펩티드 영역을 함유하는 키메라 분자에 관한 것이고, 이 키메라 분자는 전달 활성을 함유하는 영역의 존재로 인해 생리적 막을 횡단할 수 있다. 또한 본 발명은 그 자체로 전체적이거나 부분적인 폴리펩티드 특성을 지닐 때, 본 발명의 키메라 분자를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 또 다른 구체예에서, DNA 이중가닥 절단의 도입으로 인해 세포 주기 조절 및 세포 체크포인트의 키 포인트를 방해하는 본 발명에 함유된 폴리펩티드의 활성에 기초하여, 본 발명은 생체내에서 세포에 대해 본 발명의 폴리펩티드를 사용하여 세포에 함유된 DNA의 특정 부위에 대한 개질 활성을 제공하는 것을 특징으로 하는 다양한 방법을 함유한다. 또한, 본 발명은 신규한 전달 활성 또는 전달 활성의 조합을 스크리닝하기 위해 본 발명의 키메라 분자를 사용하는 방법을 함유한다. 추가로, 본 발명은 상기 조성물의 항증식제, 항신생물제, 항생제, 항기생충제 또는 항바이러스제로서의 치료적 용도를 제공한다.
Description
본 발명의 기술 분야는 DNA 복구 활성 및 세포 주기를 조절하는 세포계를 연구하기 위한 분자 및 방법에 관한 것이다.
살아있는 유기체의 게놈은 영속하여 자발적인 내인성 화학적 또는 생화학적 손상 또는 외인성 게놈 손상제로의 노출로부터 생성된 화학적 손상에 노출된다.
모든 살아있는 종에 필수불가결한 진화 및 적응에 중요한 게놈 변화를 제공하나 필수적인 정도의 게놈 안정성을 확보하기 위해 DNA-복구 및 DNA-재조합 기관류에 대한 고도로 복잡한 시스템이 세포에서 발달되어 왔다. 게놈 및 분자 다양성 발생의 적합도를 책임지는 두 시스템간의 평형은 정밀도 및 정확도를 조절 메커니즘에 의해 제어된다. 조절 수준은 임의의 살아있는 유기체에서 게놈의 적합도를 확보하는데 기여하는 소위 "체크포인트" 또는 "감시 조절(surveillance control)"에 의해 표시된다. 관련된 메커니즘 및 공지된 유전자 및 명명법에 대해서는 문헌[Zhou B. and S, Elledge, Nature, 2000, 408:433-439]을 참조한다.
최근 몇년간 수많은 분자 툴(tool)이 DNA 복구에 수반되는 메커니즘의 분석을 위해, 보다 구체적으로 상기 메커니즘의 조절 및 제어를 위해 개발되어 왔다. 예를 들어, 미국특허 제 6,307,015호에는 단백질 Chk1을 기재로 한 생성물 및 방법이 기재되어 있고, 이것은 세포의 체크포인트의 조절 및 Chk1 단백질에 의한 DNA 복구에 중요한 메커니즘 및 유전자 생성물을 동정할 수 있다고 제안한다.
더욱이, 세포의 게놈 중에 재조합체를 도입하는 공정이 개발되었다: 예를 들어 문헌[Peitz 등, in Proc. Natl. Acad. Sci., 2002, 99: 4489-4494]에서 50%의 효율로 게놈에 미리 도입된 lox-P 부위를 결합시킬 수 있는 키메라 Cre 재조합효소의 번역을 수득하였다. 추가로, WO 00/46386호는 특이적으로 도입된 SceI 부위에서 메가뉴클레아제 SceI를 발현시키는 벡터와 조합된 염색체 재조합의 도입을 기술하였다.
유전자독성제(genotoxic agent)의 도입 후 DNA 손상의 복구를 분석하는데 있어서의 어려운 점은 상기 모든 DNA 손상제가 상이한 유형의 DNA 병변의 광범한 스펙트럼을 동시에 초래한다는 것이며: 따라서 단일특이적 수단으로 DNA상에 작용하는 시스템의 도입이 관심의 대상이다. 이것은 세포 주기 조절 경로 및 특히 DNA 복구에 수반되는 높은 정확도의 유전자 생성물을 정의할 수 있게 할 것이다. 상기 경로의 효율은 정확한 세포 복제에 필수적이고, 이의 상세한 이해로부터 보다 선택적인 약제 및 보다 규제된 치료적 중재에 대한 스크리닝 시스템을 개발할 수 있다.
넓은 범위의 신체 및 유전적 질병은 DNA 복구 메커니즘 또는 보다 일반적으로 DNA에 의해 엔코딩되는 유전적 정보의 조절에서의 결함과 관련이 있다. 많은 이러한 결함이 종양 병리학의 첫번째 원인이나(예를 들어, p53. ARF, 14-3-3sigma, p16, Rb 등의 유전자의 돌연변이), 또한 이러한 결함들은 병리학까지는 아니지만 단순히 "신체 돌연변이" 또는 "유전적 소인"이라 분류되는 수많은 것들의 원인이 될 수 있다. 이미 하나의 경로에 국한된 돌연변이로서 유전 질병에 대한 유전적 근간을 구성하는 것으로는 모세혈관확장성-조화운동불능(Ataxia-telangiectasia, AT), 및 조화운동불능과 관련된 질환들(모세혈관확장성-조화운동불능-유사 질환 ATLD, Mre11), 네이메겐 파손 증후군(Nijmegen break syndrome, NBS), 판코니 빈혈(Fanconi anemia), 로쓰문드-톰슨 증후군(Rothmund-Thomson syndrome), 비호지킨 림프종(Non Hodgkin lymphomas, NHL), 워너 증후군(Werner syndrome), 블룸스 증후군(Blooms syndrome), DNA 리가아제 IV(LIG4) 증후군, 피부건조증 색소변성(Xeroderma pigmentosa), BRCA1이 있다.
DNA 이중가닥 절단(break)(DSB)은 게놈의 가장 위험한 손상이다. 이것은 예를 들어 이온화 방사선조사, 외인성원 뿐 아니라 예를 들어 세포 스트레스에 의한 내인성 상태로부터 올 수 있는 반응성 산소 종(ROS)에 의해 유도될 수 있다. ROS는 또한 종양 치료에 사용되는 화학치료제, 예를 들어 DNA 삽입성 물질(intercalating agent) 또는 DNA 가교제로부터 유도된다. DSB의 복구는 다른 유형의 DNA 손상의 복구보다 어렵다: DSB 말단의 복구 사건 및 결찰은 유전적 물질의 소실, 증폭 또는 개질로 인한 유전적 불안정성을 초래할 수 있고, 이것은 잠재적으로 종양의 원인이 된다.
상기 사건이 복구 경로 및 이의 세포 조절을 유도한다는 사실로부터, 이것은 바꾸어 말해 치료에서의 유력한 사용을 내포할 수 있는 것이므로 이의 이해는 중요한 관심사이다.
따라서, 본 발명의 목적은 DNA 복구 메커니즘의 결함 또는 유전적 정보의 조절에서의 결함을 치료하기 위한 효과적인 작용제를 제공하는 것이다. 바람직하게는 상기 작용제가 세포, 특히 핵에 전달되어 여기에 이의 활성을 제공한다.
따라서, 본 발명은
a. 특정 뉴클레오티드 서열에 친화성을 나타내는 폴리펩티드
b. DNA 개질 효소
c. 세포내 전달 활성을 지니는 영역을 포함하는 키메라 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 게놈에서 특이적 동종 부위를 나타내는 본 발명의 키메라 분자를 이용하여 DSB를 도입함에 의해 세포의 게놈을 개질시키는 시스템을 제공한다. 본 발명의 키메라 분자의 이점 중 한 가지는 활성의 선형 동력학, 단일특이적 활성, 및 상기 분자가 또한 수용체 독립적인 방식으로 전체 세포-집단을 통과할 수 있다는 것이다. 바람직하게도 키메라 분자에 의해 초래된 상기 사건들은 선택적인 시약에 의한 선택 없이도 유도될 수 있고 이의 사용을 매우 단순화킨다.
본 발명의 제1 구체예는 바람직하게는 클래스 II 제한 효소로부터 유래되고, 특이적 DNA 결합 활성을 함유하며 폴리펩티드인 것이 바람직한 영역, 바람직하게는 엔도뉴클레오라이틱(endonucleolytic) 활성으로 구성되고, 촉매적 DNA 개질 활성을 나타내며 폴리펩티드인 것이 바람직한 영역, 및 세포 및/또는 핵의 막-횡단 전달 활성을 지니는 영역으로 구성된 키메라 분자에 관한 것이다. 상기 기능적인 영역들은 서로에 대해 공유적으로 결합되는 것이 바람직하다.
본 발명의 또다른 중요한 구체예는 본 발명의 키메라 분자가 완전히 또는 부분적으로 폴리펩티드인 경우에 본 발명의 키메라 분자를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명의 다른 구체예에 따라, DNA 이중가닥 절단을 도입시킴으로 인해 세포 주기 조절 및 이들의 체크포인트 조절의 키 포인트를 방해하는 본 발명의 폴리펩티드의 활성으로부터 추론해 볼 때, 본 발명은 세포내에서 본 발명의 키메라 분자의 생체내 사용을 특징으로 하는 다양한 공정을 함유한다. 특히 본 발명에 따른 이러한 공정들은, 조절 활성을 조정할 수 있는 생리적 활성을 지니는 조성물을 선택하기 위한 공정을 포함하여, 세포 주기 및 DNA 복구 조절에 수반되는 생성물을 코딩하는 유전자의 유전적 손상을 평가하기 위한 진단적 공정을 함유한다.
또한 본 발명은 신규한 전달 활성 또는 전달 활성의 조합을 스크리닝하기 위하여 본 발명의 키메라 분자를 사용하는 공정을 포함한다.
추가로 본 발명은 항증식제, 항신생물제, 항생제, 항기생충제 또는 항바이러스제로서의 상기 조성물의 치료적 사용을 제공한다.
본 발명의 다양한 측면은 단일특이적 DNA 이중가닥 절단(DSB)을 생체내에서 세포의 게놈에 도입할 수 있고, 이러한 DSB가 세포 주기 동안 조절 포인트(체크포인트)의 활성화에 대해 충분한 시그날을 나타낼 수 있는 본 발명의 발명자에 의해 제공되는 실험 결과를 기초로 한다. 대부분의 활성화는 사람에서 효모까지의 진화에 걸쳐 보존되고, 상응하는 메커니즘이 또한 원핵 생물 및 시원박테리아에 존재한다.
진핵 생물에서, 이러한 활성화는 ATM(모세혈관확장성 조화운동불능 돌연변이 단백질), ATR(모세혈관확장성 조화운동불능 관련), DNA-PKcs(DNA 의존성 단백질-키나아제 - 촉매적 서브유닛으로부터의 유전자 생성물), 및 이들의 직접적 또는 간접적인 기질, 예를들어 Chk1(체크포인트-키나아제 1), Chk2(체크포인트-키나아제 2), Brca1(유방암 감수성-1), Brca2(유방암 감수성-2), Mre11(감수 재조합 11), Rad50(방사선 50 이중가닥 절단 복구), Bbs1(네이메겐 파손 증후군), Rad51(방사선 51 이중가닥 절단 복구), FANCD2(판코니 빈혈 상보성 D2), 히스톤, 헬리카아제 유사 BLM(블룸스 증후군 돌연변이), WRN(워너스 증후군 돌연변이), p53, 및 예를 들어 p21 및 14-3-3 시그마와 같은 p53의 직접 또는 간접적인 전사 표적의 조정에 의해 매개되며, 상기 목록은 완전한 것이 아니며, 또한 많은 다른 표적이 공지되어 있으며 심지어 아직 발견되지 않았다.
특히, 상기 몇몇 유전자-생성물의 활성화가 DNA 복구, 아폽토시스 또는 세포-주기 차단 동안 완전한 게놈의 항상성의 보존과 관련된다고 제안된다.
본 발명은 세포막을 횡단하여 진핵 세포의 경우에 핵 또는 세포내 기생충에 진입할 수 있으며, DNA 이중가닥에서 특정 부위에 결합하여 DNA를 1차 동역학으로 이상적으로 개질시킬 수 있는 키메라 분자를 제공한다.
명백하게, 이러한 발견 및 이의 사용 방식은 의술용 및 과학적 목적을 위한 수많은 실용적인 적용 방법을 열어 놓았을 뿐 아니라, DNA 복구의 메커니즘, DNA 복구의 조절 및 일반적으로 세포 주기의 연구 및 선택적인 양상으로 임의의 세포의 게놈을 개질시킬 수 있는 생성물에 대한 독특한 방법을 위해 적용된다.
주요 구체예에서, 본 발명의 키메라 분자는 하기 세 개의 기능성 성분을 함유한다:
- 특이적인 DNA 또는 RNA 서열에 친화성을 나타내며 바람직하게는 폴리펩티드로 구성된 영역. 이 영역은 바람직하게는 클래스 II 제한 효소, 이의 서브유닛 또는 기능성 단편이며, DNA에서 회문(palindromic) 서열을 인식할 수 있다:
- DNA 또는 RNA 개질 촉매 활성을 나타내며 바람직하게는 폴리펩티드로 구성된 영역; 상기 활성은 제한이 아닌 예시를 위하여 메틸화 효소, 아세틸화 효소, CAD 억제제(ICAD) 및 활성화제 EndoG를 지니거나 지니지 않는 카스파아제 활성화된 DNase(CAD), RNase, DNA 또는 RNA-리가아제, DNA 또는 RNA 폴리머라아제, 엔도뉴클레아제 및 토포이소머라아제 또는 이들의 서브유닛 또는 기능성 단편을 포함하며, 바람직하게는 효소의 엔도뉴클레오라이틱 활성을 함유하고, 제한 효소인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 클래스 II 제한 효소이다:
- 세포막 및/또는 핵막을 횡단하여 이종성 분자를 세포 및 소기관에 수송할 수 있는 전달 활성을 함유하는 영역; 이 활성은 "전달체(deliverer)"라 불리며, 이는 세포의 생물학적 막 및 또한 진핵 생물의 경우에 세포에 추가하여 핵막 또는 미토콘드리아 또는 색소체를 포함하는 임의의 다른 소기관의 막을 관통할 수 있는 폴리펩티드 또는 펩티드는 물론 지질, 리포솜, 유기 또는 무기 화합물 또는 난(nan)-입자로 구성되는 것이 바람직한 화학적 구조를 의미한다. 핵으로 수송될 수 있는 전달체가 특히 바람직하다.
상기 개요된 기능성 도메인은 바람직하게 공유적으로 결합된다. 본 발명의 키메라 분자는 화학적 합성으로부터 수득되거나, 기능성 영역이 펩티드인 경우, 바람직하게는 재조합 DNA 기술에 의해 합성된다. 본 발명의 구체예에서, 상기 정의된 세 개의 기능성 영역을 함유하는 키메라 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 바람직한 원핵 생물 기원의 숙주 시스템에서 재조합 폴리펩티드의 발현을 위해 제공된다.
본 발명의 키메라 분자가 또한 화학적 또는 재조합 방법에 의한 혼합된 기술로 생성될 수 있는 반면, 하나 이상의 영역은 재조합 DNA 기술에 의해 생성된 두 개의 다른 생성물에 화학적 방법에 의해 커플링된다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 키메라 분자에서, 특이적인 DNA 결합 활성을 지니는 영역은 클래스 II 엔도뉴클레아제로부터 수득된다. 바람직하게는 하기 엔도뉴클레아제로부터 선택된다: EcoRV, PvuII, HinfI, 또는 이들의 서브유닛 또는 기능성 단편. 하기 본 발명에서 천연 효소의 하나 이상의 기능을 함유하는 상기 전체 단백질 중의 하나의 서열로부터 부분적으로 유래된 서열을 아미노산 서열로서 포함하는 폴리펩티드가 기능성 단편으로서 의도된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, DNA 개질 활성에 대한 영역은 클래스 II 제한 엔도뉴클레아제이고, 또한 특이적인 DNA 결합 활성을 함유하며, 특히 EcoRV, PvuII, HinfI 또는 이들의 기능성 서브유닛 또는 단편인 동일한 엔도뉴클레아제로부터 선택된다. 이러한 바람직한 구체예에서, 단일한 동형이량체 단백질에서, DNA 인식 및 DNA 개질 활성이 연관된다.
마지막 경우에, 바람직한 구체예에서, 제한 효소는 단일 사슬 분자로서 함유되는 것이 유리하며, 효소의 모든 서브유닛은 공유적으로 연결되고 문헌[Simoncsits A. 등, J. Mol. Biol. 2001, 309:89-97]에서 효소 PvuII에 대하여 개시된 대로, 야생형 효소에 견줄만한 결합 및 절단 특성을 유지하면서 단일 사슬 폴리펩티드로서 발현된다.
본 발명자들은 또한 본 발명의 구성에 있어서, 제한 효소가 단일 사슬 단백질로서 함유되고, 개질 활성이 제한 효소의 영역, 서브유닛 또는 촉매 도메인의 점 돌연변이, 결실 또는 다른 구조적 변형으로 인해 변화되거나 상실되며, 동종 DNA 인식 및 결합에 대한 친화성은 천연 효소와 유사(comparability)할 정도로 유지된 키메라 분자를 개발하였다. 특히 바람직한 돌연변이는 핵산에 대한 이의 결합능을 실질적으로 보유하나(또는 심지어 향상됨) 효소(절단) 활성을 상당 부분(예컨대, >50%) 잃거나 대부분(>80%) 잃은 돌연변이체를 포함한다.
본 발명의 마지막 측면은 적어도 형질도입 또는 세포내 전달을 위한 영역 또는 전달체 및 상기 정의된 DNA 결합 영역을 함유하며, 특정 DNA 서열에 대해 친화성을 나타내는 아미노산 서열이 엔도뉴클레오라이틱인 것이 바람직하고 클래스 II 제한 효소와 95% 이상의 서열 상동성을 지님을 특징으로 하는, 키메라 분자를 포함한다. 상기 화학적 분자에서, 효소 활성이 상실되고 이들은 개질 능력을 이용하지 않고, 게놈에서 특이적 DNA 서열을 전달하기 위한 벡터로서 이용된다. 본 발명의 상기 측면의 바람직한 구체예는 문헌[Nastri 등, 1997, J. Biol. Chem. 272:25761-25757]에 개시된 대로 PvuII 효소(SCPVUTAT에서와 유사)의 천연 서열 대신 효소 PvuII의 위치 34에서 치환 돌연변이(Asp34/Gly34)에 의해 수득된 촉매 부위의 돌연변이체 D34G를 이용함에 의해 수득된 키메라 효소를 포함한다. 상기 돌연변이된 효소(SC34)에서 DNA 인식 활성은 야생형 효소에 견줄만 하나 엔도뉴클레오라이틱 활성은 상실된다. 상기 분자는 또한 개질 활성을 나타내는 키메라 분자와 동시에 사용되는 대조군으로서 유용하다.
세포막 및/또는 핵막을 횡단하는 전달체 또는 전달을 위한 영역은 바람직하게 펩티드이다. 이들은 HSV의 단백질 VP22, 안테나페디아(Antennapedia) 단백질의 호메오도메인의 제3 알파-헬릭스, HIV-1의 단백질 Tat 및 Rev 또는 이들의 단편 또는 기능성 돌연변이 중에서 선택되는 것이 바람직하다. 기능성 돌연변이의 예로는 문헌[Ho 등, 2001, Cancer Res., 61: 474-577]에 기재된 것들이 있다. 바람직한 구체예로는 Tat로부터의 펩티드와 펩티드 SYGRKKRRQRRRGGS의 서열 YGRKKRRQRRR(Tat의 영역 47-57에 상응함)를 지니는 기능성 도메인을 함유하는 것들이 있다. 이들 중에서 상기 펩티드의 기능성 돌연변이가 문헌[Ho 등]에 기재된 것과 상호교환적으로 사용된다. 다른 구체예에서, 전달체 서열은 바이러스를 포함하는 임의의 종 및 기생충의 여하한 세포 유형에 특이적일 수 있다. 예를 들어, 서열은 원핵 생물로 키메라 분자의 특이적 수입을 초래하는 세균 전달체 서열로부터 선택된다. 제한이 아니라 예시를 위하여, 세균 전달체는 문헌[Rajarao 등, 2002, FEMS Microbiology Letters; 215: 267-272]에 기재되고 검토된 올리고펩티드 서열로부터 선택될 수 있다. 상기 펩티드는 대장균의 막을 가로질러 전달하기 위해 서열 CFFKDEL 및 이들의 기능성 유도체와 같은 FKDE 모티프를 함유할 수 있다. 예를 들어, S. 아우레우스(S. aureus)에 대하여 VLTNENPFSDP와 같은 모티프를 함유하는 PFS가 사용될 수 있고, B. 서브틸리스(B. subtilis)에 대하여 모티프 YKKSNNPFSD를 함유하는 PFS가 사용될 수 있다. 또다른 구체예에서, S. 세레비지애 알파(S. cerevisiae alpha)의 동족체와 같은 효모를 통과하는 것으로 당 분야에 공지된 서열 및/또는 핵의 수입 서열과 함께 인자를 함유하는 본 발명의 분자가 효모 세포 특이적인 전달에 사용될 수 있다. 다양한 효모 균주로 전달하기 위한 서열의 예로는 문헌[Riezman 등, 1997; Cell 91, 731-738 및 Rajarao 등, 2002, FEMS Microbiology Letters; 215; 267-272]에 개시된 것들이 있고, 특히 PFS-, YQR-, PFR-, PMF- 또는 DCMD 함유 모티프이다.
본 발명의 상기 측면의 바람직한 구체예는 세균막을 횡단하여 이들의 DNA를 표적하고 절단할 수 있는 클래스 II 제한 엔도뉴클레아제의 사용이다. 제한 효소는 원핵 생물 분야에서 가장 효능이 있고 가장 고도로 개발된 자연적으로 진화된 킬러 시스템이다. 효소 뉴클레아제 활성은 DNA 손상 활성의 거대한 증폭과 유사하고, 세균 성장을 소멸시키는데 단지 소량의 효소만이 요구된다. 본 발명의 상기 측면의 바람직한 구체예에서, 이러한 키메라 분자는 항생 활성에 사용될 수 있고, 바람직하게는 매우 선택적인 방식으로 세균 성장을 중단시키는데 사용될 수 있다. 세균 전달체는 사람 세포와 같은 다른 세포 유형에 유입되지 않도록 제안되며, 대조적으로 TAT 서열과 같은 전달체는 세균 세포에 유입되지 않는다.
항생제, 항종양제(예컨대, 세포증식 억제제) 및 다른 추가의 활성제가 본 발명에 따른 작용제에 의해, 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드를 상기 추가의 활성제에 공유 커플링함에 의해 특이적으로 전달될 수 있다.
특히 바람직한 구체예에서, 전달체 또는 세포막 및/또는 핵막 및 소기관 막을 횡단하여 전달하기 위한 영역은 폴리펩티드 또는 화합물인 것이 바람직한 추가의 개질 성분 또는 "보조제"를 함유할 수 있다. 이 도메인은 전달체 서열에 연결될 수 있거나 본 발명의 키메라 분자의 임의의 다른 부분에 위치할 수 있다. 상기 분자의 첨가는 재조합 기술 또는 화학적 커플링과 같은 당 분야에 공지된 기술로 수득될 수 있다. 제한이 아닌 예시를 위하여, 본 발명의 키메라 분자가 세포 유형에 특이적이 되기 위하여, 추가의 보조제 도메인이 세포 유형 특이적인 결합 부위 및 예를 들어, 종양 특이적인 증폭된 수용체를 지닌다. 이들은 예를 들어 Her2, TGFβ RI, 또는 CD20 수용체이다. 이것은 보조제 도메인에 EGF의 결합 단편, 및 TGFβ 또는 Fv 또는 단쇄 Fv(scFv) 면역글로불린 단편을 첨가함에 의해 수득될 수 있다. 특정 구체예에서, 제한 효소는 이의 천연 이량체 형태로 사용되는 한편, 제1 단백질의 N 말단에 기능성 CDRL 영역을 포함하는 특이적 경쇄 면역글로불린 단편을 결찰시키고, 동형이량체의 다른 단백질의 N 말단에 기능성 CDR1-3H 영역을 포함하는 다양한 중쇄 면역글로불린 단백질을 결합시킨다. 이 키메라 단백질은 경쇄 중쇄 이량체화 및 제한 효소 도메인의 이량체화에 의해 이량체화될 수 있다. 따라서, 이것은 특정 세포 유형에 대한 특정 선택적인 결합을 표적화할 수 있고 선택된 세포로의 본 발명의 키메라 단백질의 우선적인 흡수를 강력하게 증가시킬 수 있다. 이러한 보조제 도메인이 다양할 수 있다는 것은 명백하다. 예를 들어, 세포내 특정 표적화에 대한 추가의 서열로서 미토콘드리아 또는 기생충 DNA(즉, 바이러스, 무척추 동물, 및 세균 감염된 세포)와 같은 비-염색체 DNA가 첨가될 수 있다. 또다른 구체예에서 전달체의 증강 엘리먼트가 첨가될 수 있다.
특정 바람직한 구체예에서, 키메라 분자는 클래스 II 제한 효소로 구성되고, 여기에서 PvuII, EcoRV 또는 HinfI는 바람직하게는 둘 이상의 글리신을 함유하고, 보다 바람직하게는 서열 GSGG 또는 GSGGSGSGG를 함유하는 펩티드 링커에 의해 연결된 서브유닛을 지닌다. 또한, 당 분야에 공지된 상응하는 펩티드 링커가 기능적 활성을 유지할 수 있는 동형이량체 서브유닛을 공유적으로 연결할 목적으로 사용될 수 있다.
임의로, 키메라 분자는, 예를 들어, 폴리히스티딘 태그, GST-태그 또는 단백질 A-태그, myc-태그, HA-태그, 비오틴과 같은 당 분야에 널리 공지된 정제에 유용할 수 있는 폴리펩티드 서열을 함유한다.
본 발명의 키메라 분자를 위해 특히 바람직한 구체예는 서열 IDN2에 의해 제시되는데, 여기에서 단쇄 단백질(SCPVU)로서 연결된 두 개의 서브유닛을 지니는 제한 효소 PvuII는 DNA 결합 친화성 및 엔도뉴클레오라이틱 활성에 의한 DNA 개질 활성에 대한 도메인 또는 영역을 나타내고, 또한 Tat의 펩티드 SYGRKKRRQRRRGGS는 세포질간 전달 서브유닛을 함유한다.
본 발명의 키메라 단백질의 바람직한 구체예 중 하나는 또한 혈청의 존재하에 세포 배양 배지에서의 이들의 안정성에 있다. 이 안정성은 당 분야에서 가능한 기술의 구성에서 D 아미노산, 또는 비천연 아미노산을 지니는 L 배열의 아미노산 치환에 의해 최종적으로 증가될 수 있다. 점 돌연변이의 경우에 키메라 단백질의 이러한 변이체는 바람직한 제한 효소와 동일한 효소 활성을 나타내거나, 대조군으로서 사용되는 분자에서 동일한 뉴클레오라이틱 활성을 상실하므로 본 발명의 범위내에 포함된다.
또한 본 발명은 그 자체로 전체적으로 또는 부분적으로 재조합체인 본 발명의 키메라 분자를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 바람직한 구체예가 PvuII 효소의 키메라 단쇄 버전을 코딩하는 서열 IDN1에 의해 표시되고 이에 대한 단백질 전달 영역은 IDN4에 상응하며 뉴클레오티드 서열 IDN3에 의해 엔코딩된다. 바람직한 구체예는 니켈 NTA 친화성 크로마토그래피에 의해 키메라 단백질을 용이하게 정제할 수 있게 하는 폴리히스티딘 태그를 추가로 포함한다.
본 발명은 화학적 분자가 폴리펩티드이고, 예를 들어, 문헌[Sambrook and Maniatis, 1989, CSH ed]에 개시된 대로 당업자에게 익숙한 방법인 재조합 DNA 기술로 수득될 수 있는 임의의 가능한 실체(realization)를 코딩하는 모든 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 함유한다. 상기 방법에 따라서, 또한 예를 들어 다른 제한 효소, 합성 링커로서 사용된 펩티드 또는 친화성 정제를 위해 사용된 펩티드에 대한 기재에서, 당 분야의 이 기술은 본 발명의 실체와 본질적으로 상이하지 않은 실체를 생성할 수 있고, 따라서 이것은 본 발명에 포함된다.
본 발명은 또한 본 발명의 키메라 분자에 대한 특정 바람직한 구체예 및 특히 뉴클레아제 활성은 손상되었으나, DNA 결합 키메라 분자이고, 또한 RNA 결합 키메라 분자인 키메라 분자에 대한 특정한 바람직한 구체예를 포함한다. 이 구체예에서, 키메라 분자의 DNA 또는 RNA 결합 활성은 세포에서 특정 핵산을 표적화하는 분자로서 사용될 수 있다. 이것은 화합물이 세포의 DNA 또는 RNA에 카고(chargo)로서 전달될 수 있게 한다. 이를 위해, 특정 화합물이 재조합 기술 또는 화학적 커플링에 의해 상기 키메라 분자에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합된다. 상기 화합물로는 제한이 아닌 예시를 위해 나노입자, 무기 또는 유기 화합물 및 이들의 조합물이 있고, 예컨대 제한이 아닌 예시를 위해, 방사성 화합물, 화학치료제, 예컨대 독소루비신 블레오마이신, 빈크리스틴, 에토포시드, 시스플라틴, 및 다른 방사성 모방물(mimetic) 및 DSB 유도제, 항체 및 이의 단편, 착색 화합물, 예컨대 형광 분자, 천연 및 비천연 핵산, 펩티드 또는 폴리펩티드 함유 또는 비함유 효소 활성체가 있다. 화학적 커플링은 말레이미드 활성화된 화합물을 키메라 분자의 환원된 시스테인에 커플링하는 것과 같은 당 분야에 공지된 방법에 따라 달성될 수 있다. 예를 들어, PvuII와 같은 천연 시스테인을 함유하지 않는 본 발명의 키메라 분자의 경우에 시스테인이 당 분야에 널리 공지된 재조합 또는 합성 기술에 의해 도입될 수 있다. 추가의 예로서, 유리 아미노기에 대한 브로모-시안 커플링이 사용될 수 있다. 흥미로운 특정 커플링이 단백질 스플라이싱 및 선택된 화합물과의 단백질-결찰에 의해 달성될 수 있다. 또한 분자는 제한이 아닌 예시로서 항체, 항체 단편 또는 구타티온 함유 화합물에 커플링될 수 있게 하는, 예를 들어, 폴리히스티딘 태그, GST-태그 또는 단백질 A 태그, myc 태그, HA-태그, 비오틴과 같이 정제를 위해 단백질에 융합된 다양한 태그에 커플링될 수 있다. 이러한 방식으로 본 발명의 단백질에 결합된 분자는 화학적 시약 또는 UV로 가교되거나 가교되지 않을 수 있다. 제한이 아닌 예시를 위하여, 상기 커플링 공정에 대하여, 키메라 분자의 특히 흥미로운 부위는 N 또는 C 말단부에 의해 제시된다. 또한 단쇄 버전의 경우에, 두 개의 서브유닛 사이에 링커가 바람직하게 사용될 수 있다.
또한 상기 개시된 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 벡터가 포함되며, 특히 대부분의 재조합 단백질의 발현에 일반적으로 보다 적합한 원핵 생물에서의 발현을 위한 벡터가 포함된다.
본 발명의 바람직한 키메라 분자(여기에서 DNA 개질 효소는 클래스 II 제한 효소이다)의 사용은 주어진 효소에 대한 동종 부위인 회문 서열에서, 바람직하게는 약 6000 bp(EcoRV 및 PvuII) 또는 400-600 bp(HinfI)의 통계적 빈도로 게놈상에 임의로 존재하는 서열 CAG/CTG(PvuII), GAT/ATC(EcoRV) 또는 G/ANTC(HinfI)에 대하여, DNA 이중가닥 절단을 유발하거나, 유도하거나 생성시키기 위한 공정으로 구성되는 본 발명의 주된 측면에서 이의 적용을 가능케 한다.
배양액 중의 세포를 본 발명의 키메라 단백질로 처리한 후 유도되는 효과를 FACS 분석에 의한 세포 주기 분포의 분석에 의해, 또는 서던 블롯팅, TUNEL 분석, 브로모데옥시우리딘 표지(BrdU), 및 특정 항제 또는 녹색-형광 단백질 유도체 및 이들의 색채 유도체를 사용한 면역형광법에 의해 게놈을 간접접으로 분석하여 검출하며, 여기에 적용될 수 있는 모든 방법은 통상적인 것이다. 추가로, 본 발명의 단백질로 처리되는 세포의 클론원성 활성 및 증식 능력의 결정은 증식 조절, 세포 주기 조절 및 DNA 복구의 기능성에 대한 지표가 된다.
예를 들어 TUNEL 검정에 의해 측정된 본 발명의 단백질의 바람직한 구체예에 대한 활성 동력학은 0.001 nM 내지 100 μM의 범위, 바람직하게는 0.1 nM 내지 1 μM 범위, 보다 바람직하게는 1 내지 500 nM 범위에서 선형이다. 이러한 선형성은 단일특이적 활성 및 모든 세포를 통과하는 특성에 더하여, 본 발명의 키메라 분자, 특히 SCPVUTAT의 이점 중 하나이다. 더욱이, 키메라 분자에 의해 야기된 사건은 특정 선택적인 작용제와 함께 선택될 필요가 없고, 바꾸어 말해 특정 선택적인 작용제의 사용을 현저하고 이롭게 단순화시킨다.
본 발명의 키메라 단백질, 및 특히 본 발명의 바람직한 실체로 처리한 후 관찰되는 효과는 하기의 비제한적인 방식으로 재추정된다.
- G0-G1/S-S-G2-G2/M-M과 같은 특정 세포 주기에서 또는 아폽토시스 또는 배수성(polyploidy)에서 세포의 백분율 증가. 상기 변화의 특성은 세포 유형에 특이적이며, 이러한 특이성은 본 발명의 상기 공정의 앞으로의 진단적 실현을 나타내고, 하나 이상의 대조군과 비교하여 공지되지 않은 샘플, 예를 들어 널리 개시된 유전적 결함을 함유하는 세포주 또는 정상적인 세포에서의 변화 및/또는 유전적 돌연변이 또는 후성적/신체 변화를 검출할 수 있게 한다. 예를 들어, 본 발명의 단백질로 p21CIP/WAF1에 대한 유전자에서의 돌연변이체와 같이 G1/S 결정에서 세포 주기의 조절에 대해 특이적 결합을 함유하는 세포를 처리하는 경우, 본 발명의 단백질로 정상 세포 처리시 보여지는 분포에 관하여 G2에서 세포 수가 증가한다. p21CIP/WAF1의 경우, 세포는 G1/S에서 정지하지 않으나, 여전히 부분적으로 기능성인 G2/M 조절 포인트(체크포인트)를 나타내고, 따라서 DNA 함량의 분포가 FACS에 의해 분석되는 실험에서 정상적인 대조군 세포와 비교하여 나타날 수 있는 바와 같이 G2/M기에서 피크의 상대적인 증가를 나타낸다. 유사한 결과가 ATM 및 Nbs와 같이 DNA 복구에 대한 체크포인트 조절에 수반되는 유전자-생성물에 대한 유전자에서의 돌연변이체의 실험으로부터 수득될 수 있다.
상기에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법의 중요성은 대조군 세포에 비한 세포의 분포 비교 또는 거동 비교를 포함한다는 것이다(정상 또는 대조군 세포).
- 세포 주기 및 복구의 조절에 수반되는 키(key)-단백질의 안정기 수준 변화. 단백질의 안정기 수준의 변동은 단백질의 양의 변동으로 측정되고, 예를 들어 이것은 발현 수준의 변동, 또는 mRNA 안정성의 변화, 또는 단백질분해, 인산화, 유비퀴티닐화 또는 다른 번역 후 개질과 같은 단백질 개질의 변화로부터 초래될 수 있다.
- ATM/ATR/DNA-PKcs 조절 경로의 중심인 단백질의 인산화 수준에 대해서는 본 발명의 단백질로 처리 후 변화가 나타난다. 인산화의 변화를 나타내는 단백질은 하기 실험 부분에서 보다 잘 기술되나, 비제한적인 예로서 여기에 기술한다: ATM(모세혈관확장성 조화운동불능 돌연변이된 단백질), ATR(모세혈관확장성 조화운동불능과 관련된 단백질), DNA-PKcs(DNA 의존성 단백질 키나아제 촉매적 서브유닛), 및 이들의 직접적 또는 간접적 기질, 예를들어 Chk1(체크포인트-키나아제 1), Chk2(체크포인트-키나아제 2), Brca1(유방암 감수성-1), Brca2(유방암 감수성-2), Mre11(감수 재조합 단백질 11), Rad50(방사선 50 이중가닥 절단 복구), Nbs(네이메겐 파손 증후군), Rad51(방사선 51 이중가닥 절단 복구 단백질), FANC-A, C, D2, E, F 및 G(판코니 빈혈 상보성 단백질), 히스톤, 헬리카아제, BLM(블룸스 증후군 돌연변이), WRN(워너스 증후군 돌연변이), p53 등. 특히 바람직한 것은 분자 및 생화학적 마커이다: Nbs, Mre11, Rad51, p53, Chk2, Brca1.
특정 바람직한 구체예는 p53, 및 p21CIP/WAF1, 14-3-3 시그마와 같은 p53의 직간접적인 전사적 표적에 대해 유도된 변동에 의해 표시된다. 본 발명의 단백질로 처리 후 상기 단백질의 수준 변화 또는 상기 단백질의 활성 및/또는 인산화 상태의 변화를 분석하는 것은 본 발명의 중요한 측면을 나타내고, 진단을 위해 특히 흥미롭다. 이러한 측정은 당 분야에 널리 공지된 대로, 예를 들어, 항-p53-S15p를 사용하여 검출된 p53의 인산화된 형태의 증가를 위한 경우에서와 같이 단백질의 인산화 형태에 특이적인 항체를 사용한 면역학적 방법(예를 들어 웨스턴 블롯팅)에 의해 적용될 수 있다. 하기 실험 부분에서 보다 상세하게 입증되는 대로, 본 발명의 단백질로 상이한 세포주를 처리하여 p53 단백질 및/또는 인산화 수준을 증가시킨다.
- 세포 주기 대조군 또는 DNA 복구의 스트레스 반응에서 중요한 대조군에 대한 중요한 단백질인 복합체의 세포의 분포 변화. 이러한 변동은 면역학적 방법에 의해 분석된 대로 Rad/Mre11/Nbs 복합체가 Chk2의 Thr68의 인산화, ATM의 인산화, 히스톤 2AX-Ser135의 인산화를 국부화(localisation)시키는(Zhong Q. 등, 1999, Science 285: 747-750) 핵의 초점에서의 세포의 반응으로부터 관찰될 수 있다.
- 대안적으로 본 발명의 단백질 처리에 반응하는 돌연변이체 대 정상적인 세포의 변동을 비교함에 의해 Cdc2/시클린-B1, Cdc25C, p21CIP/WAF1 및 14-3-3시그마 복합체의 세포질/핵 분포의 변동을 추적할 수 있다. 이것은 예를 들어 실시예 12에 기술된 대로 상기 성분들 중의 하나에 특이적인 형광성 표지 및 현미경 분석에 의해 수행될 수 있다;
- 당 분야에 널리 공지된 방법, 예를 들어 FACS 분석, 시토크롬 C 방출 또는 카스파아제 활성에 의해 또는 아넥신 V 특이적 항체로 표지함에 의해 측정될 수 있는 아폽토시스. 아폽토시스의 증가는, 예를 들어 세포를 본 발명의 단백질로 처리한 후 신경모세포종에서의 서브G1 DNA 함량의 증가로서 FACS 분석에 의해 검출될 수 있다.
- 본 발명의 단백질 처리로부터 유도된 효과가 또한 당 분야에 널리 공지된 색채 반응으로 클론원성 활성 또는 증식 능력을 측정함에 의해 분석될 수 있다. 대안적으로 본 발명의 장기 효과는 동물 모델 시스템에서, 예를 들어 종양원성 활성 또는 침습성에 의해 측정될 수 있다.
본 발명의 단백질로부터의 게놈 손상을 조절할 수 있는 조성물의 선택은 자매 염색분체 교환(sister chromatid exchange, SCE), 배수성 분석, 유전적인 증폭, 헤테로자이고시티(heterozygousity)의 상실 및 당 분야에 널리 공지된 다른 분석에 의해 분석될 수 있다.
마지막으로, 본 발명은 필수적으로 본 발명의 단백질을 이용한 처리를 포함하여, 바람직하게는 대조군 세포와 함께, 공지되지 않은 샘플(예를 들어, 생검으로부터)로부터 수득된 세포에서 분석된 종양 또는 유전자독성 민감성(예를 들어, 방사선 또는 삽입성 물질에 대한 민감성)의 발달에 대한 유전적인 소인을 측정하는 방법, 및 면역-효소 방법을 포함하는 특정 분석 시약에 의해 예를 들어 myc, ras와 같은 종양유전자; 또는 예를 들어 ARF, p16, p53, Brca1과 같은 종양 억제 유전자의 발현 또는 활성화 수준의 연속적인 측정 방법에 관한 것이다.
비록, 예를 들어 반응성 산소 종(ROS), 만성적인 염증 인자의 수준 증가일 수 있는 다른 위험 인자들과 결함의 조합이 종양에서 주된 발병률을 결정하나, 세포 주기 조절 시스템(체크포인트)에서 성분들로부터의 돌연변이는 종양 감수성을 증가시키는 반면, DNA 이중가닥 절단 복구에 수반되는 인자를 코딩하는 유전자에서의 유전적 결함은 더 낮은 침투도를 나타낸다.
합성에 있어서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 세포에 사용하는 것을 특징으로 하는 모든 상이한 특정 공정에 관한 것이다. 특히, 본 발명에 따른 공정은 세포 주기 조절 및 DNA 복구에 공동 수반되는 유전적 손상을 평가하기 위한 진단적 공정 및 상기 조절 활성을 조절할 수 있는 생리학적 활성을 지니는 화합물을 선택하기 위한 공정을 포함한다. 본 발명의 몇몇 다양한 측면은 상기 기술된 특이성을 지니는 DNA 이중가닥 절단의 유도가 세포 주기 및 DNA 복구에 대한 조절 경로를 활성화함(체크포인트)에 기인한 본 발명의 키메라 폴리펩티드의 생리학적 활성에 기초한다.
하기 실시예에서 보다 상세하게 관찰되고 기술되는 대로, 단일특이적 DNA 이중가닥 절단의 유도의 결과로서, 본 발명의 폴리펩티드는 치료적 활성을 나타내고, 특히 항증식성 및 항종양원성을 나타낸다. 따라서 이 활성은 추가로 본 발명의 요지를 나타낸다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 개시된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 활성 물질로서 함유하는 약제 조성물을 포함한다. 또한 본 발명은 신생물 질병 또는 이 질병에 대한 소인을 예방, 치료 또는 진단하는 약제를 제조하기 위한 본 발명의 키메라 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드의 용도를 포함한다.
본 발명의 추가의 구체예는 실시예에 상세하게 기술된 종양 병리의 진단 또는 상기 질병에 대한 소인의 진단에서 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 진단적 용도를 포함한다.
본 발명의 단백질로 세포를 처리하는 바람직한 구체예로서, 상기 개시된 대로 적용된 진단에서의 이의 사용은 추정상의 돌연변이를 함유하지 않는 세포주(대조군)와 함께 시험-샘플에 적용된다. 보다 바람직한 검정 구체예에서, 추가의 대조군 처리가, 예를 들어 DNA 복구 경로의 선택된 단계에서 돌연변이를 함유하는 시험 세포주의 사용에 의해 본 발명의 키메라 단백질과 함께 실험에 포함되고 이는 비교에 의해 개개의 유전적 변화의 세밀한 지도화를 가능하게 한다.
본 발명의 단백질을 투여한 지 24시간 후와 같은 보다 긴 기간 후에, 세포가 본 발명의 단백질에 의해 유도된 유전적 손상(DNA 이중 가닥 손상, DSB)을 복구할 수 있거나, 그러한 경우에 세포 주기의 다양한 기에서의 세포 집단의 분포가 정상적으로 회복되었는지 여부에 따라서 차별적인 효과를 검출할 수 있다. ATM을 엔코딩하는 유전자의 돌연변이를 지니는 세포 또는 예를 들어 NHEJ(비상동 말단 연결, Non Homologous End Joining)에 수반되는 생성물을 코딩하는 다른 유전자에서, DNA 복구 경로 아폽토시스는 즉시 관찰될 수 없으나 낮은 발병률의 간접적인 효과를 구성한다. 대조적으로, 신경모세포종 세포 아폽토시스는 직접적인 양상으로 즉시 유도된다. 종합적으로, 본 발명은 추가의 구체예에서 신경세포 기원의 세포, 바람직하게는 신경모세포종에서 아폽토시스를 유도하여 신경세포 기원의 종양을 치료하는 약제를 제조하기 위한 키메라 단백질 및 이 단백질을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드의 용도를 포함한다.
신경모세포종에서의 아폽토시스의 유도는 이중 미닛(minute)(DM) myc-N 종양유전자 증폭과 함께 1p36 결실과 관련된다. 이러한 과민성은 17q15 전위의 존재와는 관련이 없다. DM myc-N 증폭은 myc-N 증폭된 NB의 가장 공격성인 형태로서 공지된 에피솜의 myc-N 클러스터이며, 매우 낮은 예후를 지닌다. 공격성 악성 NB의 대부분은 이러한 유형의 종양유전자 증폭을 나타낸다. 또 다른 특정 구체예에서, 제한이 아닌 예시를 위하여 DM 함유 전립선 또는 유방 종양과 같은 종양유전자의 DM 증폭을 함유하는 다른 종양이 또한 포함된다. 일반적으로 상기 화합물에 커플링된 키메라 분자는 선택된 종양을 치료하기 위한 약제를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 단백질을 이용한 치료에 대한 세포의 반응은 DNA 복구 경로에서 돌연변이를 지니거나 세포 주기 및/또는 복구에 대한 상기 경로의 조절(체크포인트)에 책임이 있는 성분들의 변화를 나타내는 세포와 상이하다. 따라서, 본 발명은 일련의 공정을 포함하고, 이들 모두는 실질적으로 본 발명에 따른 키메라 분자의 바람직한 구체예를 적용하고 우선적으로 가장 가능한 동종 특성의 표준 세포와 시험 샘플의 결과를 비교함으로써 상기 기술된 대로 검정에 대한 반응을 분석함에 의해 시험-세포의 게놈에서 DSB의 유도를 사용하는 것을 특징으로 한다.
세포 주기 및 DNA 복구 메커니즘에 대한 본 발명의 단백질의 효과는 유리 라디칼(ROS) 유도제, 예를 들어 H2O2의 존재하에 상승 작용된다. 이러한 상승작용적 효과는 또한 바람직하게는 10 nM 미만의 SCPVUTAT 단백질 및 10 μM 미만의 H2O2의 키메라 단백질의 매우 낮은 농도에서 관찰된다. 따라서, 본 발명은 게놈에서 DSB를 유도하는 공정을 포함하고, 이것은 본 발명의 단백질을 활성 산소 생성자(ROS), 예를 들어 H2O2와 조합하여 사용하는 것을 특징으로 한다. 이 방법은 또한 길항적 또는 상승작용적 화합물의 선택을 위해 사용될 수 있다.
생체내에서 세포의 DSB 유도는 항종양 치료에 종종 이용되는 방사선조사를 이온화함에 의해 유도된 것들과 유사한 세포 및 분자 반응을 활성화하나; 이것과 비교하여 부수적인 효과들을 감소시킨다. 따라서, 본 발명의 추가의 구체예는 항종양 활성을 지니거나 유전적 질병의 치료, 진단 또는 예방을 위한 약제를 제조하기 위한 본 발명의 키메라 폴리펩티드의 용도를 포함하고, 이것은 DNA 복구를 조절하는 메커니즘에 대한 필수적인 유전자 생성물을 포함하여 세포 및 특히 신생물 질병의 증식 활성의 탈조절(deregulation)에 의해 초래되는 질병을 전개시키는 개별적인 소인을 규명한다.
이러한 측면에 기초하여, 본 발명은 항증식성 효과, 바람직하게는 항 종양원성이 요구될 때 필수적으로 상기 정의된 본 발명의 키메라 폴리펩티드를 생체내 또는 생체외 투여하는 것에 기초한 치료 방법을 포함한다.
본 발명의 추가의 구체예는 DNA 복구에서 유전적 또는 신체적 결함 또는 생리적 샘플로부터 수득된 단리된 세포로부터의 세포 주기의 조절 결함의 시험관내 진단 방법을 포함하고, 이는 필수적으로 하기로 구성된다;
a) DNA 복구 경로 또는 세포 주기 경로의 효율 또는 손상을 측정하기 위해 배양액 중의 단리된 세포의 성장.
b) 본 발명의 바람직한 분자와 함께 상기 세포의 배양, 여기에서 개질 효소는 클래스 II 엔도뉴클레아제이고, 보다 바람직하게는 PvuII 효소의 단쇄 버전(SCPVU)이다. 바람직하게는 세포의 처리와 동시에 특이적 DNA 결합 활성을 나타내나, 예를 들어 SC34와 같이 뉴클레아제 활성이 손상된 대조군 폴리펩티드를 이용하여 수행한다. 임의로, 돌연변이되고/거나 DNA 복구, DNA 복구의 조절 및/또는 세포 주기의 조절에 결함이 있는 적당한 세포주를 동시 처리하나, 이들 세포주는 가장 동종 특성인 것이 바람직하다;
c) 세포 반응의 특성화 및 측정;
d) 임의로 대조군 세포주에 대한 비교.
둘 이상의 동종 세포주는 예를 들어 하기 실시예에 기술되고 사용된 대로 MRC-5 및 AT-5; CHO-K1 및 KU70 또는 MO59K 및 MO59J와 같이 가능한 가장 유사한 유전적 배경을 나타내는 것을 의미한다. 표준 대조군 세포주는 또한 세포 주기 및 DNA 복구의 조절 경로에 어떠한 변화도 지니지 않은 정상 세포주이거나 유전적 변화가 널리 알려진 세포주일 수 있고, 이는 시험-샘플과 가장 가능한 한 동종이어야 한다.
본 발명의 공정의 바람직한 구체예에서, 시험 세포 및 대조군 세포를 동일한 조건하에 함께 성장시킨다. 따라서, 이들은 보존되고, 예를 들어 살아있는 세포의 색채를 이용한 증식 능력의 결정에 의해 측정하거나 상기 기술된 것들의 생화학적 마커에 의해 측정된 대로 클론원성 능력, 아폽토시스 또는 휴면의 세포%에 대한 것들과 같은 직접적인 방식의 배양 마커에서의 차이로 비교된다. 이러한 유형의 검정에 대한 예가 문헌[Torrance C. J. 등, 2001, Nature Biotechnology, 19, 940-945]에 기재되어 있다.
c)에 개시된 반응의 특성을 밝히는 바람직한 구체예에서, 당 분야에 널리 공지된 클론원성 활성의 측정이 사용되는데, 이는 예를 들어 배양액에서의 세포 성장 또는 연질-아가에서 성장하는 클론원성 활성의 측정, 또는 DNA 염색 후 FACS 분석에 의한 것들이 있다.
본 발명에 개시된 특정 유용한 구체예는 특히 항신생물 질병의 발달에 대한 유전적 소인, 종양 치료의 민감성, 특히 환자의 방사선- 또는 화학요법적 항종양 치료에 있어서의 내성, 또는 예후의 이유로 건강한 조직과 비교된 종양 조직의 민감성을 측정하기 위한 진단 및/또는 예후에 유용하다.
본 발명은 또한 본 발명의 공정을 수행하기 위한 키트를 포함하고, 따라서 바람직하게는 진단적 키트 또는 연구를 위한 키트를 제공한다.
몇몇 바람직한 키트의 구체예는 하기를 포함한다:
1) 특이적 DNA 결합 단백질을 나타내나 엔도뉴클레아제 활성이 손상된 대조군-폴리펩티드 키메라 단백질 또는 상기 키메라 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터를 함유하는 튜브와 배합된, 키메라 폴리펩티드, 바람직하게는 Tat 전달 펩티드와 융합된 단쇄 버전으로서 EcoRV, PvuII 또는 HinfI로부터 선택된 키메라 엔도뉴클레아제 또는 키메라 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터를 함유하는 튜브. 바람직한 구체예에서, 키트는 키메라 단백질 SCPVUTAT를 함유하는 튜브, 및 바람직하게는 키메라 단백질 SC34를 냉동건조된 형태 또는 수용액 형태로 함유하는 또 다른 튜브로 구성된다;
2) 키트는 임의로 키메라 폴리펩티드의 전부 또는 일부에 대한 항체, 바람직하게는 항-SCPVUTAT 항체를 지니는 튜브를 포함한다;
3) 키트는 임의로 상기 정의된 대조군 세포, 예를 들어 DSB에 과민성인 세포 또는 DNA 손상 및 세포 주기 경로 및 이들의 조절(체크포인트)과 관련된 단백질을 코딩하는 유전자에서 잘 특성규명된 돌연변이를 함유하는 세포를 함유하는 튜브 또는 플라스크를 함유한다. 상기 세포는 수송에 적합된 동결된 원액이거나 플라스크에 함유되어야 한다;
4) 키트는 임의로 삽입성 물질, 방사선유사체, 또는 정성적 및 정량적 효과의 측정 및 비교를 위한 약제를 포함하는 다른 유형의 화학물질과 같은 화학치료적 시약을 함유한다.
바람직한 키메라 폴리펩티드의 활성에 기초한 추가의 중요한 구체예로서, 본 발명은 세포 시스템의 게놈 안정성에 대하여 세포에 근거한 고-처리량 스크린을 사용함에 의해 DNA 복구 활성 및/또는 게놈의 조절을 변화시키지 않거나, 조절하거나, 상승작용적이거나 길항적인 조성물을 선택하기 위한 공정을 포함하며, 이는 필수적으로 하기를 포함한다:
a) 시험 세포를 본 발명의 키메라 단백질과 바람직하게는 적합한 대조군 폴리펩티드(특정 경우, 키메라 폴리펩티드 SC34와 같이 특정 DNA 결합 활성을 함유하나 손상된 엔도뉴클레아제 활성을 나타내는 키메라 분자로 구성된다)의 존재하에, 또한 임의로 예를 들어 H2O2 또는 다른 라디칼 생산자와 같은 상승작용적 물질 및/또는 다른 조절 또는 길항 물질의 존재하에 인큐베이션한다.
b) 임의로 시험 세포에 대해 가능한 한 동종인 다른 대조군 세포, 예를 들어 리포터 유전자를 함유하는 동일한 세포를 함께 인큐베이션한다. 다양한 리포터 유전자가 당 분야에 널리 공지되어 있고, 이들 중에서도 예를 들어 문헌[Torrance 등, 2001, Nature Biotechnology, 19, 940-945]에 개시된 EGFP 단백질 및 이들의 돌연변이체; 또는 검정의 유효한 자동 판독을 가능하게 하는 다른 유형의 리포터가 있다.
c) 잠재적인 활성 또는 활성 없음에 대해 시험될 것을 전제로 하는 조성물, 이들 중에서 예를 들어 단일 분자 또는 화학적 라이브러리 또는 화합물질, 펩티드 등의 수집물 또는 생리적 샘플의 수집물을 첨가한다.
d) 세포 반응의 판독은 자동 방식으로 수행되는 것이 바람직하며, 바람직하게는 고-처리량 스크리닝(HTS)을 이용한다. 이것의 예로는 세포의 생물학적 활성을 나타내는 포지티브 시험 물질 및 대조군 물질에 대한 반응으로서 유도된 형광 시그날과 같이, 형태적 표현형의 변형을 측정하는 것에 기초한 시스템이 있다. 세포 반응은 임의의 세포 시그날 또는 포함된 생화학적 마커로부터의 시그날로 구성될 수 있으며, 또한 자동 검출을 가능하게 하는 시스템에 조합된 칼슘 유출, 라디칼 흐름, 시토크롬 C의 변화와 같은 세포 파라미터의 검출이 있다.
본 발명의 상기 공정 동안에, 단계 b) 및 c)의 순서는 서로 바뀔 수 있다.
상기 검정은 세포 주기의 조절, DNA 복구 경로의 조절, 아폽토시스 유도의 조절, 노화 유도의 조절에 대한 중요한 생리적 활성을 함유하거나, 또는 하나의 경로를 중단시켜 다른 경로의 활성화를 초래하는 조성물을 선택할 수 있게 한다.
또한 선택 주기는 유리하게는 스크린의 제1 라운드로부터 단리된 화합물을 개질시킨 후 적용되어, 최종적으로 약제학적으로 보다 적합한 화합물을 수득하거나, 또한 예를 들어 생체적합성 또는 생성물 안정성과 같은 추가의 유리한 특성들을 바람직하게 선택할 수 있다.
상기 개시된 바에 따른 측면에 더하여, 본 발명은 바람직하게 클래스 II 제한 엔도뉴클레아제로 표시되고, 보다 바람직하게 단쇄 버전이며, 또는 보다 바람직하게 효소 SCPVUTAT인 본 발명의 키메라 분자 뿐만 아니라 이들 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 기초하여, 세포 주기 차단을 유도하거나 대안적으로 신경세포 기원의 세포에서 바람직한 아폽토시스를 유도하거나 대안적으로 단리된 세포에서 DNA 복구를 유도하는 방법을 포함하며, 여기에서 상기 효과는 자유 라디칼 생산자와 같은 조성물의 존재하에 상승작용된다. 상기 방법은 본질적으로 본 발명의 키메라 폴리펩티드에 의해 DNA 이중가닥 절단을 유도하는 원리에 기초한다.
본 발명의 추가의 구체예는 신규한 침투 서열 및 보조 서열을 선택하는 방법을 포함한다. 상기 구체예에서, 침투 또는 보조 서열은 유일한 화합물이 아닌 추정상의 침투 또는 보조 도메인을 선택하기 위해 사용되는 화합물 라이브러리 분자로 구성된다. 이러한 방법은 많은 상이한 샘플을 분석할 수 있는 고 처리량 스크린에 잘 적용될 수 있다. 또한 진단을 위해 본 발명에 개시된 원리들은 기본적으로 임의의 세포형 또는 유기체에 대하여 신규한 침투 서열 및 보조 서열을 발견할 수 있게 하는 스크리닝 공정의 기초가 된다. 자동 및 로봇 장치가 하기 단계들이 고 처리량 능력으로 수행될 수 있게 한다. 이것은 당 분야에 공지된 피펫팅 및 판독 유닛으로 수행될 수 있다. 제한이 아닌 예시를 위하여 특이적 보조 또는 침투 서열에 대한 스크린은 필수적으로 하기 단계로 구성된다:
1. 특이적 보조 서열에 대하여, 침투 서열은 일정하고 본 발명의 키메라 단백질의 라이브러리는 당 분야의 방법으로 구성된다. 예를 들어, 다양한 경쇄 및 기능성 CDRL 단편이 본 발명의 키메라 단백질의 N 말단에 융합된 다음 기능성 CDR1-3H 영역을 포함하는 다양한 중쇄 면역글로불린 단백질에 융합된 본 발명의 동일한 단백질과 혼합된다. 이것은 바람직하게는 대장균에서 두 개의 플라스미드 발현 시스템에서 재조합 기술에 의해 수득된다. 일반적으로, 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 라이브러리, 또는 합성 또는 천연 기원으로 생성된 랜덤 라이브러리 또는 수용체 결합 단백질이 재조합 기술 또는 상기 기술된 다른 커플링 방법에 의해 본 발명의 단백질에 결합될 수 있다. 예시를 위하여, 항체-단편 라이브러리가 본 발명의 분자에 함유된 단백질 A와 결합됨에 의해 본 발명의 단백질에 결합될 수 있다.
2. 침투 서열의 경우에 스크린 라이브러리는 당 분야에 널리 공지된 기술에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어 이러한 라이브러리는 임의의 부류의 화합물을 포함하는 천연 기원 또는 합성 기원으로부터 수득된다. 특정 바람직한 구체예에서, 세균 침투 서열이 동일하거나 상이한 종으로부터의 랜덤 DNA 단편으로부터 스크리닝된다.
3. 세균을 발현시키는 라이브러리 단백질을 성장시키고 단백질 생성을 유도한다. 이러한 단백질은 분비 시스템으로부터 상청액으로 단리될 수 있으나, 또한 세포 용해에 이어, 예를 들어 폴리히스티딘 태그, GST-태그, 단백질 A 태그, myc 태그, HA-태그, 또는 비오틴과 같은 다양한 친화성 태그를 이용하는 키메라 단백질의 고 처리량 친화성에 의해 단리될 수 있다.
4. 이러한 단백질은 라이브러리로부터 제공된 분자의 기능 또는 상이한 기능을 분석하는데 사용된다. 서열이 기능성이면, 키메라 단백질도 기능성이다. 이것은 이들이 세포, 실제로 핵막을 횡단하여 DNA에 결합하고, 때때로 DSB를 도입할 수 있을 때 그러하다. 또는 보조 스크린에 대하여, 기능성이 선택된 세포에서 검출될 수 있다. 검출은 상기 개시된 대로 수행될 수 있다.
5. 시험 세포 또는 조직은 본 발명의 키메라 단백질의 작용이 예를 들어 상기 기술된 방식으로 검출될 수 있을 때 원핵 세포를 포함하는 임의의 기원이 될 수 있다.
6. 특히 유용한 구체예에서, 시험 세포는 용이한 판독을 위해 EGFP(향상된 녹색 형광 단백질)로 안정하게 트랜스펙션된다;
7. 또 다른 특히 유용한 구체예에서, 대조군 세포는 예를 들어 EYFP(향상된 황색 형광 단백질)로 안정하게 차별적으로 트랜스펙션된다;
8. 시험 세포 및 대조군 세포는 별도로 성장되거나, 다중-웰 장치 또는 특정 막에서 혼합된다. 세포는 단 하나의 변화만을 지니며 매우 유사하거나(즉, 동일한 기원의 종양 및 비종양 세포와 같은 보조 서열을 찾기 위해 이용함) 매우 다양할 수 있다(즉, 시험 세포의 전달은 발생하여야 하나 대조군 세포의 전달은 발생해서는 안된다; 이것은 또한 상이한 종의 세포를 포함하고, 예컨대 시험 세포는 세균 세포이고 대조군 세포는 사람 기원이다). 세포의 선택은 임의의 기술적으로 가능한 조합을 허용한다.
9. 단백질을 세포의 상청액에 첨가하여 인큐베이션한다.
10. 상기 예에 개시된 대로 키메라 단백질의 작용을 판독할 것이다. 특정 바람직한 실시예에서, 상기 대로 제조된 녹색 및 황색 세포를 검출한다. 당 분야에 널리 공지된 재조합 및 질량-분광 방법을 이용한 분석 및 백-스크리닝에 의해 녹색 세포 보다 황색 세포를 보다 현저하게 생성하는 단백질이 단일 클론으로서 추가로 단리된다. 바람직한 적용에서, 키메라 분자가 세포에 도입된 후 DNA 손상을 유도하는 경우, 이 검정은 보다 민감하게 이루어질 수 있다. 시험 세포(즉, 종양 세포) 및 대조군 세포(즉, 비종양원성와 유사함)는 유전자 분열 또는 유전자 침묵 또는 작용 돌연변이체의 우세한 네거티브 또는 우세한 획득을 도입함에 의해 DSB 도입에 과민성이 된다. 이것은 siRNA를 이용한 공동트랜스펙션, siRNA를 발현시키는 벡터, 유전자 분열 또는 돌연변이 대한 표적화 벡터, DNA 복구에서 중요한 작용을 억제하고 DSB에 대해 과민성을 나타내는 단백질의 돌연변이 또는 과생성을 발현시키는 벡터, 화학적 억제제 또는 활성화제에 의한 것과 같이 당 분야에 널리 공지된 방법에 의해 수득된다. 이는 저농도에서 보다 빠르고 보다 차별화된 판독을 가능케 한다. 예를 들어, Ku70, Ku80, DNAPKcs, ATM, XRCC4 및 리가아제 IV, Bc12의 siRNA 억제가 있다. 또한, 카페인과 같은 화합물에 의한 ATM의 억제가 있다. p53 또는 다른 아폽토시스 조절 인자가 도입될 수 있다.
11. 추가 스크린으로부터 서열을 다시 최종 확인하기 위하여, 자동화 단계를 사용하는 것이 바람직하다:
- 클론은 순수한 단백질로 확인된다
- 농도는 적정된다;
- 뉴클레아제 불감 버전에서 선택된 서열의 시험;
- 다른 세포의 시험;
- 마우스에서 독성에 대해 시험.
본 발명은 추가로 하기 실시예 및 도면에 의해 기술되나, 이로 제한하려는 것이 아니다.
도 1. 대장균으로부터 SCPVUTAT의 정제
SCPVUTAT의 발현 및 정제.
SCPVUTAT에 대한 발현 플라스미드를 함유하는 대장균 세포가 단백질의 발현을 위해 유도되었고, 실험 부분에 기재된 대로 정제가 이루어졌다. NI 및 I는 각각 유도되지 않거나 유도된 대장균으로부터의 총 세포 추출물을 나타낸다. H1 및 H2는 Hi Trap 킬레이팅 Ni++ 아가로오스 칼럼상에서의 정제로부터 수득된 피크 분획이고; S1 및 S2는 SP-세파로오스 칼럼상에서의 정제로부터 수득된 피크 분획이며; M은 분자 질량 마커를 나타내고(상부에서 바닥까지 kDa로 94, 67, 43, 33, 20, 14); SCPVU는 TAT 서열을 함유하지 않고 유사한 방식으로 정제된 단백질을 나타낸다.
도 2. 단백질 형질도입 후 U2OS 세포로부터의 단백질 추출물의 면역학적 분 석.
분석되는 단백질은 농도를 증가시킨 SCPVUTAT(1, 19, 50, 100, 200 nM; 레인 2-6), SCPVU(200 nM, TAT 서열을 함유하지 않음, 레인 7), SC34(200 nM, 효소 활성을 나타내지 않는 SCPVUTAT 유도체, 레인 8), 대조군(세포에 단백질을 첨가하지 않음, 레인 1)이었다. 세포 배양 상청액에 단백질을 첨가한 지 10분 후에, PBS로 광범한 세척 후에 추출물을 제조하고, SDS-PAGE 상에서 분리하고 PvuII에 대한 단일특이적 항체를 이용한 면역블롯팅에 의해 분석하였다(하부 패널, 수입(IMPORT)). 비교를 위해, 추출 제조물을 분석에 포함시키기 전에 세포 배양액의 상청액의 분취량을 얻었다(상부 패널, 상청액).
도 3. 공초점 현미경에 의한 면역형광성 분석
SCPVUTAT으로 단백질 형질도입한지 30분 후에, 세포를 세척하고, 3% PFA로 고정시키고, PvuII 단일특이적 항체로 마킹하고, 공초점 면역형광성 분석을 위해 FITC 컨주게이션된 이차 항체로 염색하였다(녹색, 하부 패널). 또한 RNAse A 소화 후 프로피듐 J-로 DNA 공동염색(costaining)을 수득하였다(적색, 상부 패널).
도 4. 단일 세포 수준에서 DSB의 검출의 위한 TUNEL 분석
U2OS 세포를 SCPVUTAT로 처리하고, dUTP-FITC의 존재하에(TUNEL) TdT로 표지한 후 DSB를 공초점 면역형광성 형미경으로 분석하였다. 지시된 기간 동안 100 nM의 SCPVUTAT를 처리하였다.
도 5. SCPVUTAT에 의해 유도된 뉴클레아제 의존성 세포 주기의 지연
단백질 형질도입된 세포의 세포 주기의 다양한 기의 분포를 FACS 분석에 의해 분석하였다. 세포 집단의 DNA 함량의 분포를 검출하였다. 2n은 이배수체 DNA 당량(복제되지 않음; G1 기)을 나타내고, 4n은 사배수체 DNA 당량(복제됨; G2/M 기)을 나타낸다. FACS 분석을 위해, 세포를 단일 세포의 DNA 함량을 예측할 수 있는 DDM 방식을 적용시켜 분리하였다. U2OS 세포를 지시된 대로 증가량의 SCPVUTAT(10 nM, 50 nM, 100 nM)의 존재하에 단 하나의 단백질 첨가; 비처리된 세포(대조군); 뉴클레아제 손상된 SCPVUTAT의 유도체(SC34, 100nM)와 함께 24시간(상부 열) 또는 48시간(하부 열) 동안 성장시켰다. 도시된 모든 막대그래프는 상부 오른쪽 패널상에만 표시된 대로 세포 수에 대한 DNA 함량의 측정치를 나타낸다.
도 6. SCPVUTAT에 의해 유도된 키나아제 활성.
기질로서 히스톤 H1, 및 SCPVUTAT(100 nM)로 비처리되거나 처리되거나, 노코다졸(0.2 ㎍/ml)로 30시간 동안 처리된 U2OS 세포를 성장시켜 수득된 단백질 추출물로부터의 시클린 B1 특이적인 면역침전물을 사용한 시클린 B1 키나아제 활성의 측정. 시클린 B1 특이적인 면역침전물을 히스톤 H1과 함께 γ32P-ATP의 존재하에 인큐베이션하고, 반응 혼합물을 SDS-PAGE상에서 분리하고, 자가방사기록(autoradiography)에 의해 분석하였다. 밑에 표시된 숫자는 포스포-이미저 분석에 의해 결정된 상대 활성을 나타낸다.
도 7. SCPVUTAT 처리 후 세포 주기 정지에 대한 생화학적 마커
A) 3'-OH 및 5'-인산염 함유 블런트(blunt) 말단 DSB에 의한 p53의 유도. U2OS 세포(레인 1-7) 및 HCT116(레인 8-14)를 지시된 기간 동안 SCPVUTAT(100 nM, SC) 또는 아드리아마이신(독소루비신, 0.02 ㎍/ml, AD)으로 처리하였다; 비처리된 세포를 대조군으로서 이용하였다(레인 0). 추출물을 제조하고, SDS-PAGE 상에서 분리하고 p53(상부 패널, p53) 또는 PARP(하부 패널, PARP)에 대한 특이적 항체를 이용하여 면역블롯팅에 의해 분석하였다.
B) SCPVUTAT에 대해 모세혈관확장성 조화운동불능 돌연변이된(ATM) 단백질의 복구 반응. p53의 SCPVUTAT 의존성 Ser15 인산화. ATM 포지티브 세포주 MRC5를 지시된 기간 동안 SCPVUTAT(100 nM, SC) 또는 히드록시우레아(1 mM, HU)로 처리하였다; 대조군으로서 비처리된 세포를 사용하였다(0). 추출물을 제조하고, SDS-PAGE 상에서 분리하고 p53 Ser15(상부 패널, Ser15, p53) 또는 액틴(하부 패널, 액틴)에 대한 특이적 항체를 이용하여 면역블롯팅에 의해 분석하였다.
C) SCPVUTAT에 대해 모세혈관확장성 조화운동불능 돌연변이된(ATM) 단백질의 복구 반응.
p53의 SCPVUTAT 의존성 Ser15 인산화의 카페인 민감성. ATM에 대해 네거티브인 AT-5 세포를 카페인(2 mM)의 존재하에 4시간 동안 SCPVUTAT(100 nM, SC) 또는 히드록시우레아(1 mM, HU)로 처리하였다; 대조군으로서 비처리된 세포 및 카페인만으로 처리된 세포를 사용하였다. 추출물을 제조하고, SDS-PAGE 상에서 분리하고 p53, p53 Ser15(상부 패널, Ser15, p53) 또는 액틴(하부 패널, 액틴)에 대한 특이적 항체를 이용하여 면역블롯팅에 의해 분석하였다.
도 8. 돌연변이되지 않은 세포(MRC-5)와 비교하여 ATM에 대해 돌연변이된 세포의 SCPVUTAT에 의한 세포 주기 차단 및 클론원성 활성의 유도.
A) SCPVUTAT(25 nM, 100 nM) 또는 아드리아마이신(0.02 ㎍/ml; 아드리아마이신) 또는 SC34(100 nM) 및 대조군으로서 비처리된 세포로 처리한 지 36시간 후 AT-5 세포의 FACS 분석에 의해 검출된 세포 주기 동안의 DNA 함량 분포. 막대 그래프는 세포 수에 대한 DNA 함량을 나타내고; 오른쪽 패널은 MODFITTM 프로그램-패키지로 산출된 다양한 세포 주기의 상응하는 분포의 백분율을 나타낸다.
B) ATM으로 돌연변이되고 SCPVUTAT에 의해 DNA 손상이 유도된 세포주를 이용한 콜로니 형성 검정. AT-5 또는 MRC-5의 다양한 희석물을 SCPVUTAT(25 nM, 회색 막대; 100 nM, 흑색 막대)로 60분 동안 처리하거나 처리하지 않았다(백색 막대); 세포를 세척한 다음 7 내지 10일 동안 성장시키고, GIEMSA로 염색하고, 콜로니를 계수하였다. 결과의 개요를 막대 그래프로 표시하고, 세 가지 독립적인 실험의 평균을 도시된 대로 10 내지 15%의 평균 오차 범위로 나타낸다. 처리되지 않은 세포가 100%로 설정되었고, AT-5 세포에 대한 흑색 막대는 0%에 근접하여 표시되지 않았다.
도 9. NHEJ 경로에 수반되는 단일 단백질에서 선택된 돌연변이를 지니는 세포의 클론원성 활성의 비교.
SCPVUTAT로 처리된 NHEJ 복구-경로에 수반되는 단백질에 대해 돌연변이된 CHO 세포의 클론원성 검정. 사용된 세포주는 AA8(어버이 주), V3(DNA-RCCS (-/-)), xrss5(KU80(-/-)) 및 XR-1(XRCC4(-/-)), HIS P1.13-11(KU70(-/-)) 및 상응하는 어버이 세포주 CHO-K1이다. 지시된 대로 NHEJ 돌연변이를 함유하는 CHO 세포의 다양한 희석물을 24시간 동안 SCPVUTAT(25 nM, 회색 막대; 100 nM, 흑색 막대)로 처리하거나 처리하지 않았다(백색 막대); 세포를 세척한 다음 7 내지 10일 동안 성장시키고 GIEMSA로 염색하고, 콜로니를 계수하였다. 결과의 개요를 막대 그래프로 표시하고, 세 가지 독립적인 실험의 평균을 도시된 대로 10 내지 15%의 평균 오차 범위로 나타낸다. 처리되지 않은 세포가 100%로 설정되었고, 세포 V3(DNA-RCCS (-/-))에 대한 흑색 막대는 1% 미만이어서 표시되지 않았다.
도 10. SCPVUTAT 처리 후 신경모세포종 세포의 아폽토시스의 차별적인 유도.
SCPVUTAT 처리(10 nM, 패널 C; 100 nM 패널 B) 후 신경모세포종 세포 GI-LIN의 프로피듐 J-로 염색된 DNA 함량의 FACS 분석. 샘플의 처리를 30시간 동안 수행하였다. SC34로 처리되거나(100 nM, 패널 D) 처리되지 않은(패널 A) 샘플을 대조군으로서 사용하였다. 각 패널의 하부에 수득된 세포 주기 분포의 대표적인 백분율을 나타낸다(G1/S/G2-M). (A)는 아폽토시스 세포를 나타낸다.
도 11. 저 농도의 SCPVUTAT 및 준치사 농도의 H2O2의 상승작용적 효과.
U2OS 세포를 SCPVUTAT(10 nM, 패널 B) 또는 H2O2(10 μM, 패널 C), 또는 둘 모두(SCPVUTAT, 10 nM; H2O2, 10 μM; 패널 D)와 함께, 또는 대조군으로서 작용제 없이(패널 A) 인큐베이션하였다. 추가로, 처리 세포를 DNA 함량에 대해 FACS로 분석하였다; 다양한 세포 주기의 백분율을 개개의 막대 그래프로 아래에 표시한다.
도 12. 히스톤 2AXSer-139 인산화 및 PI3/ATM 키나아제 억제제 워트마닌(Wortmanin)에 의한 상기 효과의 억제의 현미경 분석.
U2OS 세포를 SCPVUTAT(100 nM, 중앙 컬럼)로 60분 동안 처리하고, 추가로 워트마닌(50 μM, WM, 오른쪽 칼럼)과 함께, 또는 대조군으로서 작용제 없이(왼쪽 칼럼) 처리를 수행하였다. 처리 후, 세포를 H2AX-Ser-139 인산화된(적색) 또는 히스톤 2B(대조군으로서 기능함, 녹색)에 대한 특이적인 항체로 염색하고, 형광 현미경에 의해 단일 세포 수준에 대해 분석하였다.
도 13. 자동 분석에 의한 DNA 의존성 단백질 키나아제(DNA-PKCS)의 촉매 서브유닛에 대해 돌연변이된 세포의 과민성 측정.
A) 돌연변이된 세포 및 비교되는 정상 세포의 증식 능력을 착색된 세포를 이용하는 베르사독(Versadoc) 4(BioRad) 영상 장치로 측정하였다. 결과의 통계적 분석을 수행하고, 막대 그래프로 표시한다. SCPVUTAT 처리 후 사람 신경모세포종 세포주 MO59J(DNA-PKCS (-/-))의 콜로니 형성을 MO59K 세포(DNA-PKCS (+/+))와 비교하여 검정하였다. 콜로니 형성 검정의 예를 도시한다. 3등급의 순서로 다양한 농도의 세포를 적용하여 검정을 수행하였다(상부 열 내지 하부 열, 1x104, 2x103, 4x102, 8x10). 오른쪽 B)에 대하여, MO59K와 비교하여 세포주 MO59J의 콜로니 형성 검정으로부터의 결과에 대한 막대 그래프를 도시한다. 검정은 도 9에서와 같이 수행되었으나, 베르사독 4(BioRad) 시스템으로 분석하였다. 백색 막대: 처리되지 않은 샘플; 회색 막대: 25 nM SCPVUTAT; 흑색 막대: 10 nM SCPVUTAT.
도 14. SCPVUTAT로 처리 후 세포 주기 조절 단백질의 세포내 분포.
처리되지 않거나, SCPVUTAT(100 nM)로 30시간 동안 처리되거나, 탁솔(0.02 ㎍/ml)로 처리된 HCT116(p53(+/+)) 세포의 현미경 분석. 면역형광성 분석을 시클린 B1에 특이적인 일차 항체 또는 Cdc25C에 특이적인 일차 항체 및 FITC(녹색, 시클린 B1) 또는 TRITC(적색, Cdc25C)의 이차 컨주게이트로 착색된 일차 항체로 수행하였다.
실시예 1
재조합 단백질의 발현을 위한 벡터 작제
하기 실시예에 기술된 실험들에서, 하기 재조합 단백질은 당 분야의 기술자에게 널리 공지된 방법을 사용하여 생성된다: SCPVU, 동형이량체 엔도뉴클레아제 효소 PvuII의 단쇄 변이체 [Simoncsits 등 (2001)에 이미 기술됨]. 이 구성물의 C-말단에 HIV Tat 단백질의 GSYGRKKRRQRRRGGSHHHHHH 함유 부분을 코딩하는 서열을 첨가하고, 6개의 히스티딘 태그를 첨가한다. 이렇게 수득된 재조합 융합 단백질이 SCPVUTAT이다. 이것은 효소 Pvu11의 아미노산 1-157, 이에 후속된 효소 PvuII의 제2 서브유닛에 제1 서브유닛을 연결시킨 서열 -GSGG를 지니는 링커(aa 2-157), 그리고 이에 후속된 서열 GSYGRKKRRQRRRGGS-HHHHHH(tat-펩티드 + 6 히스티딘-태그)로 구성된 폴리펩티드를 생성한다. 추가로, 엔도뉴클레아제 PvuII의 변이체 SC34(Simoncsits 등, 2001)을 단쇄 폴리펩티드로서 생성한다. 이 유도체는 PvuII의 특정 DNA 결합 활성을 나타내나, PvuII 효소의 서브유닛 둘 모두의 위치 34에서 돌연변이로 인해(Asp34/Gly34) 엔도뉴클레아제 활성이 손상된다.
실시예 2
재조합 단백질의 발현 및 이들의 정제.
SCPVUTAT의 발현은 대장균 균주 XL1 MRF'에서 수행되었고(Simoncsits 등, 2001) 단백질은 먼저 HiTrap 킬레이팅 친화성 컬럼(5 ml, Amersham Pharmacia Biotech)상에서 정제한 다음, 추가로 SP 세파로오스(5 ml, HiTrap SP HP, Amersham Pharmacia Biotech)상에서 정제하였다. SP-세파로오스상에서, 단백질을 0.63 M 내지 0.67 M의 NaCl로 용리시켰다. 1.5 ℓ의 배지로로부터 약 10 mg의 정제된 단백질을 수득하였다. TAT 서열에 융합된 천연 PvuII 단백질(단쇄 버전이 아님)을 유사한 방식으로 제조하였다. 이 경우, SP-세파로오스로부터의 용리는 0.81 M 내지 0.85 M의 NaCl이었다. 모든 발현된 단백질을 15% SDS-PAGE 상에서의 겔-전기영동 및 API 150 EX를 이용한 질량 분광계(Perkin Elmer)에 의해 판단시 균질하게 정제하였고 이론적 질량을 확인하였다. 수득된 엔도뉴클레아제 유도체의 효소 활성은 기질로서 λ DNA를 이용하여 분석한 대로 천연 효소에 견줄만 하였다.
실시예 3
항체의 생성 및 면역학적 분석.
재조합 단백질에 대한 항체를 생성하고, 예를들어 하기 문헌에 기술된 대로 표준 방법에 사용하였다: "Using Antibodies: A Laboratory Manual", Ed Harlow, and David Lane; CSH press New York, 1999, ISBN 0-87969-544-7, "Cells: A Laboratory Manual", David L Spector, RobertD, Goldman; Leslie A. Leinwand; CSH press New York, 1998, ISBN 0-87969-521-8. 뉴질랜드 화이트 래빗을 적당한 항원으로 면역화시켜 항체를 수득하고, 혈청을 BrCN-세파로오스에 고정된 상응하는 항원에 대해 정제하였다(Amersham Pharmacia Biotech). 면역블롯팅에 대한 세포 추출물을, 세포를 예를 들어 20 μM TPCK, 20 μM TLCK의 프로테아제 억제제, 60 mM 4-니트로페닐 포스페이트의 포스파타아제 억제제를 함유하는 20 mM 트리스 HCl pH 8.0, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl에서 용해시키거나, SDS 샘플 로딩 완충액에서 직접 용해시킴에 의해 수득하였다. 세포를 3% 파라포름알데히드에 고정시키거나 아세톤 및 메탄올의 1:1의 혼합물에 고정시킨 후 당 분야에 공지된 방법에 의해 면역형광성 분석을 수행하였다. LSM510 공초점 유닛에 부착된 제이스 악시오버트(Zeiss Axiovert) 100 M 현미경을 사용하여 항체-염색 후 분석을 수행하였다.
실시예 4
키메라 단백질의 진핵 세포주로의 단백질 형질도입.
실시예 4-11에 하기 세포주를 이용하였다: NHEJ 복구 경로에서 결함이 있는 세포주: CHO 주: Xrss5(KU80(-/-)), Xr-1(XRCC4(-/-)), V3(DNA-PKcs(-/-)) 및 상응하는 어버이 세포주 AA8(ATCC CRL1859) 및 또한 세포주: HIS P1.13-11(KU70(-/-)) 및 상응하는 어버이 세포주 CHO-K1(ATCC CCL61). 이들 세포주를 10% 우태아 혈청(FCS)을 함유하는 DMEM 배지에서 성장시켰다. 추가로, 10% FCS를 지니는 DMEM/NUT.MIX-F12 1:1 배지에서 성장된 사람 신경교종 세포주 MO59J(DNA-PKcs(-/-)) 및 상응하는 어버이 세포주 MO59K(DNA-PKcs에 대한 야생형)를 이용하였다(Lees-Miller SP 등, Science 1995, 267 (5201): 1183-5).
세포주 AT-5가 결함이 있는 ATM(모세혈관확장성 조화운동불능 돌연변이된 단백질)을 지니는 개개로부터 유도되고 상응하는 어버이 세포주 MRC-5를 사용하였으며(Raj K 등, Nature. 2001, 412 (6850): 914-7) 둘 모두를 10% FCS를 함유하는 DMEM에서 배양하였다.
신경모세포종 세포주 IMR32(ATCC CCL-127), GI-LIN 및 LAN-5(Panarello C. 등, Cancer Genet. Cytogenet., 2000, 116: 124-132)를 필수 아미노산 및 10% FCS를 함유하는 RPMI 배지 +헤르페스 25 mM에서 성장시켰다.
사람 골육종 세포주 U2OS(ATCC HTB96); 일차 섬유모세포 IMR90(초기 계대(passage))을 10% FCS를 함유하는 DMEM 배지에서 성장시켰다.
결장 암종 세포주 HCT-116(미스매치 복구 유전자 사람 MLH1 단백질에 대해 결함이 있음(Raj K. 등, Nature. 2001, 412 (6850): 914-7))을 10% FCS를 함유하는 맥코이 배지에서 성장시켰다.
키메라 단백질의 형질도입 능력을 U2OS 골육종 세포 및 IMR90 일차 섬유모세포에서 분석하였다. 세포를 10% FCS를 함유하는 DMEM에서 성장시키고, 동일한 배지에서 일반적으로 항생제의 존재하에 본 발명의 단백질로 처리하였다. 증가량의 융합 단백질 SCPVUTAT(1, 10, 50, 100, 200 nM) 및 단백질 SCPVU(TAT가 없는 단쇄 PvuII) 및 대조군으로서 SC34(효소 PvuII이 위치 34에서 돌연변이를 함유하는 것을 제외하고 SCPVUTAT에 대해 기술된 대로 제조됨)와 함께 세포를 인큐베이션한 지 10분 후, 세포 추출물을 제조하고, SDS-PAGE 상에서 분리하고, PvuII에 대한 단일특이적 항체로 면역블롯팅 검정에 의해 분석하였다. 추가로, 인큐베이션한 지 30분 후 PvuII 특이적 항체 및 요오드화 프로피듐으로 공동염색된 핵을 사용한 면역-형광성 분석에 의해 흡수를 분석하였다. 데이터는 단백질 SCPVUTAT가 세포 및 특히 핵에서 부화되고, 흡수가 도 2에 도시된 대로 분석된 세포의 거의 100%에서 이루어졌음을 증명한다. 대조적으로, tat 서열을 함유하지 않는 융합 단백질(SCPVU)은 수입되지 않는다. 이러한 부화는 사용된 단백질이 가용성이고 천연, 비변성 조건하에서 제조되므로, 단백질의 변성에 대해 독립적이었다. 사실상, 개시된 방법에 의해 천연 조건하에 생성된 단백질은 단백질 형질도입에서 보다 효과적이었고, 다우디(Dowdy)의 미국특허 제 6,221,335호에서 다른 단백질에 대해 최근 개시된 변성 방법보다 양호하였다.
실시예 5
생체내에서 본 발명의 재조합 단백질로 처리한 후 TUNEL 검정에 의한 DSB 유도의 확인
SCPVUTAT로 세포를 간단히 처리한 후, 단백질의 기능을 생체내에서 DSB를 마킹하는 TUNEL 반응에서 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제(TdT) dUTP-FITC로 검정하였다(인 시츄(In Situ) 세포 치사 검출 키트, Roche Diagnostic, Mannheim Germany). 검정을 PBS, 0.1% 트리톤 중의 4% 파라포름알데히드에 세포를 고정한 후 수행하였다. TUNEL 반응 후, 세포를 프로피듐 J-로 대조염색하였다. 네거티브 대조군으로서 구성물 SC34와 같이 뉴클레아제 활성이 손상된 유도체를 사용하여 배경 활성을 추정할 수 있다. 융합 단백질 SCPVUTAT로 처리한 지 10분 후, 시험된 모든 세포는 TUNEL 포지티브 반응을 나타내었다(90-100%). 시험된 세포 중에서, 사람 또는 설치류 세포주는 상피 세포(미스매치 복구 유전자 hMLH1에 결함을 나타내는 HEK-293, MCF-7, HCT116 결장 암종 세포주), 일차 섬유모세포(WI83, IMR90, 마우스 배아 섬유모세포, MEF)를 포함한다. 이것은 세포의 핵으로의 본 발명의 융합 단백질의 효과적인 전달 이외에 분석된 모든 유형의 세포까지 생체내에서 엔도뉴클레오라이틱 활성을 나타냄을 확인시켜 준다. 사실상, 수 분의 SCPVUTAT 처리 및 10 nM로 낮은 세포 배양 상청액 중의 단백질 농도는 대부분의 세포에서 현저한 TUNEL 활성을 생성하므로, 생체내에서 키메라 단백질의 직접적이고 신속한 기능성이 입증된다. 이 측면으로부터 본 발명에 개시된 시스템이 전사 유닛으로부터 유도된 엔도뉴클레아제 또는 일렉트로포레이션, 또는 인산 칼슘 또는 리비드-유도체와의 침전물, 즉 리포펙틴과 같은 다른 유형의 임의의 단백질 트랜스펙션과 비교하여 훨씬 더 효과적이 된다. 이 활성은 세포 주기에 의존적이고, 대부분의 세포가 아폽토시스에 대한 포지티브 마커를 상실함에 의해 입증되는 대로 아폽토시스와 관련이 없다(즉, 시토크롬 C 방출 또는 포지티브 아넥신 V 염색).
도 4에서 SCPVUTAT 또는 SC34로 처리한 지 30분 후 USOS 세포로부터 TUNEL 검정에 의해 수득된 결과가 도시되며, 이러한 유형의 검정은 SCPVUTAT 구성물의 기능성을 입증한다.
실시예 6
세포 주기에 대한 본 발명의 단백질 처리의 효과 측정
마지막으로, 생체내에서 생성된 DSB가 세포 주기의 동요를 유도하는지를 확인하기 위해, 세포 주기의 다양한 기에서의 DNA 함량을 본 발명의 단백질로 형질도입 후 형광성 활성화된 세포 분류(FACS)에 의해 분석하였다. 다양한 농도의 여러 가지 단백질로 처리한 후 상이한 시점에, 세포를 70% 에탄올에 고정하고, RNAse A로 처리하고, 프로피듐 J-로 염색하였다.
FACSCaliburTM(Becton Dickinson) 장치를 이용하여 FACS 분석을 수행하였다. 수득된 데이터를 CellQuestTM 소프트웨어 프로그램 패키지로 평가하였다. 모든 샘플에 대한 3x104 이상의 단일 사건을 DDM 방식으로 분석하였다. MODFIT LTTM 소프트웨어 프로그램 패키지를 이용하여 세포 주기 동안 DNA 함량 분포의 통계적 분석을 수행하였다. 2N 배수체 DNA 함량은 세포 주기의 G1 기의 세포에 상응하고, 4N은 상대적인 4배수체 DNA 함량을 나타내며 세포 주기의 G2 및/또는 M 기에 상응한다. 중간 DNA 함량은 세포 주기 동안 DNA를 활발하게 복제하는 집단에 상응하는 S 기를 나타내고 배수체 2N 미만인 함량은 아폽토시스 세포를 나타낸다.
도 5는 10 nM의 단백질 SCPVUTAT와 함께 24시간 동안 인큐베이션하는 것이 U2OS 세포의 4배수체 집단의 증가를 유도하는데 충분함을 도시한다. SCPVUTAT 단백질의 신선한 배지를 이용한 희석은 24시간 동안 정상적인 주기 집단으로의 세포의 재진입을 야기하는 반면, SCPVUTAT의 연속적인 첨가(매 12시간 마다)는 임의의 아폽토시스의 유도 없이 분석되었던 대부분의 세포에서 안정하게 유도된 세포 주기의 지연을 초래한다. 단백질 SC34 및 SCPVU(TAT 도메인이 없음)를 이용한 유사한 처리는 세포 주기 분포에서 어떠한 변화도 나타내지 않는다.
다른 방법들이 FACS 분석에서 4배수체(4N)로서 검출된 집단의 G2 및 M 기를 최종적으로 구별하는 것을 도울 수 있다; 즉, 100 nM SCPVUTAT로 처리된 4N DNA 함유 HCT116 및 U2OS 세포에서, 핵은 거대하게 남아있고, 임의의 유사분열 구조를 나타나지 않거나 핵의 외피가 파손되지 않아서 세포가 G2로 남아 있음을 나타내고, 세포 주기의 M 기로의 여하한 진행을 나타내지 않으므로 G2 세포 주기 차단을 나타낸다. 추가로, 생화학적 분석이 Cdc2-시클린 B 복합체의 키나아제 활성을 입증하기 위해 적용될 수 있다. 더욱이, 유사분열의 개시, 즉 미세관 차단제 노코다졸 또는 탁솔로 유도된 유사분열의 개시가 Cdc2 키나아제의 핵 활성 및 또한 Cdc25C의 핵 국부화에 의해 검출될 수 있다. 이러한 검정은 SCPVUTAT 처리 후 세포 주기 방해의 정확한 지점을 조사할 수 있게 하고, 추가로 포지티브 대조군에 비하여 세포 주기의 상기 기에서 장애를 검출할 수 있게 한다. 유사한 실험이 세포 주기의 다른 기에 대하여 당 분야에 널리 공지되어 있다. 이 검정은 도 7a에 도시되며 도 14에 도시된 면역형광성 분석은 이러한 유형의 실험에 대한 실시예를 나타낸다. 도시된 시험은 융합 단백질 SCPVUTAT로 처리된 세포주 HCT116에서, DSB 및 후속하여 늦은 S/G2에 상응하는 세포 주기의 기에서 가역적인 차단이 유도되었음을 나타낸다.
실시예 7
ATM/ATR에 돌연변이를 지니는 세포에 대한 단백질의 효과.
모세혈관확장성 조화운동불능 돌연변이된 단백질(ATM) 및 모세혈관확장성 조화운동불능 관련 돌연변이된 단백질(ATR)은 DNA 손상에 대한 반응에서 체크포인트 활성화 동안 중심 시그날링 엘리먼트를 나타낸다. 이러한 경로는 세포 주기의 진행 및 DNA 복구 기관과 조화된다. 이러한 조절은 세포가 손상되는 경우에 사건의 적합한 순서를 보증하고, 즉 세포가 DNA가 복구되기 이전에 세포 주기의 연속하는 상으로 진행되지 않는다. 이것은 세포 주기 키나아제의 억제 및 동반되는 네거티브 조절제, 이들 중에서도 p53과 같은 종양 억제제 및 이들의 공지된 전사 표적(즉, p21, 14-3-3 시그마), 바꾸어 말해 DNA 복구에 책임이 있는 효과기 단백질의 정확한 기능 또는 정밀한 적합도에 중요한 세포 주기 차단을 유도하는 단백질의 유도에 의해 세포 주기 기관을 조절한다. 많은 상기 조절성 단백질의 돌연변이가 암에 강한 질병소인을 나타냄을 주목하는 것이 중요하다.
U2OS 세포의 2 mM 카페인, 메틸크산틴 유도체(IC50 < 1 mM)의 처리는 세포 주기의 G1 기에서 알맞은 지연을 유도하며, 또한 이러한 억제 효과는 DNA 손상에 대해 세포를 민감하게 한다(Sarkaria 등, 1999). 카페인이 포스포-이노시톨 3(PI3) 키나아제 부류의 적어도 3 구성원의 촉매 활성을 억제하며, 이들 모두는 상동인 세린/트레오닌 키나아제 영역(PIKK), ATM, ATR 및 TOR을 함유하는 것으로 나타났다. 2 mM의 카페인과 함께 100 nM의 SCPVUTAT를 지니는 배지에서 30시간 동안 성장시킨 U2OS 세포는 SCPVUTAT의 특징적인 세포 주기 중지를 나타내지 않으나, 적당한 G1 지연을 유도한다. 이것은 카페인이 생체내에서 SCPVUTAT의 효과에 대한 길항제임을 입증한다. 최종 실험은 카페인이 시험관내에서 이의 SCPVUTAT를 억제하지 않고 단백질의 형질도입 능력에도 영향을 미치지 않는 것을 입증한다. 상기 실험에 사용된 동일한 이론은 "생체내"에서 활성인 SCPVUTAT에 대한 길항 조성물을 선택하고, ATM 및/또는 ATM/ATR 경로의 억제제로서 활성인 일반적인 조성물을 구성하거나 화합물을 생성하는 것이다. ATM/ATR에 대한 특이성 또는 이 경로에 수반되는 임의의 다른 단백질에 대한 특이성이 최종적으로 적당한 돌연변이 세포주를 이용함에 의해 분석될 수 있다. 직접적으로 잘 특성화된 단일특이적 활성의 SCPVUTAT로 인해, 상기 분자들은 이 검정에서 바람직하게 사용될 수 있다. 본 발명의 용이한 사용은 대규모의 상기 유형의 검정에, 예컨대 화학 및/또는 분자 생물학의 조합적인 적용과 함께 바람직하게 높은 처리량으로 사용될 수 있게 한다.
또 다른 구체예에서, SCPVUTAT는 ATM/ATR의 활성에 따른 사건을 모니터링하는데 사용된다. 많은 기질에 대해 세린/트레오닌 키나아제로서 ATM 기능은 DNA 손상에 의해 활성화된 체크포인트에 수반된다. 기질의 인산화는 체크포인트 반응의 활성화에 영향을 미치거나 미칠 수 없다. 생체내에서 공지된 ATM의 기질 또는 ATM 의존성 키나아제는 하기를 포함한다: Nbs1, SMC1(크로모좀의 구조적 유지), MDC1(DNA 손상의 매개체), H2AX(히스톤 2Ax), p53.
SCPVUTAT에 반응하는 p53-Ser15의 기질에 대한 ATM/ATR의 생체내 유도를 분석하였다. Ser15에 대한 p53의 인산화는 p53의 단백질 안정성 및 전사 활성을 조절하므로, p53의 전사적 반응에 필수적이다.
SCPVUTAT 처리에 반응하는 Ser15에 대한 p53 인산화를 ATM 포지티브 또는 네거티브 세포주(각각 MRC-5 및 AT-5)에서 분석하였다. 동시에 비교를 위하여, 히드록시우레아(HU)를 이용한 실험을 수행하였다. HU는 리보뉴클레오티딜-환원효소의 억제제로서 기능하고, S 기 동안 DNA 복제 포크(fork)의 스탈링(stalling)을 초래하며 DSB를 초래한다. 이를 위해, 특이적 검출을 위해 P53에서 인산화된 Ser15에 대한 특이적 항체를 이용함에 의해 처리 후 추출물을 이용하여 면역블롯팅 실험이 수행되었다. 도 7에 도시된 대로, p53-Ser15의 특이적 인산화가 ATM 플러스 세포주 MRC-5(도 7B) 뿐 아니라 ATM 마이너스 세포주 AT-5에서 SCPVUTAT로 처리 후 수득된다. 일관되게 높은 양상과 유사하면서, p53-Ser15 인산화를 유도하는 HU를 이용한 처리와 동일한 결과가 얻어졌다. 이러한 생체내 인산화는 ATM/ATR 억제제 카페인; 2 mM 카페인과 함께 인큐베이션된 AT-5 세포에 민감하고, SCPVUTAT 또는 HU로 처리시 현저한 p53-Ser15 인산화를 나타내지 않는다(도 7c). 본 발명의 목적물에 반응하는 ATM 기질의 인산화의 또 다른 실시예로서, 히스톤 H2AX Ser139 인산화를 분석하였다. DNA 손상에 대한 즉각적 반응으로서 ATM 인산화물 히스톤 H2AX Ser139를 세포 주기의 S 및 G2 기 동안 방사선에 의해 유도하였다. U2OS 세포를 SCPVUTAT로 60분 동안 처리하고, 고정하고, 히스톤 H2AX Ser139 인산화에 대하여 분석하였다. 세포를 히스톤 H2AX 상에서 포스포-Ser139에 대해 특이적인 항혈청으로 분석하고, 단일 세포 기재상에서 현미경으로 분석하였다. 대조군으로서 히스톤 2B를 분석하였다. 이 결과는 SCPVUTAT를 이용한 처리가 신속하게 히스톤 H2AX Ser139 인산화를 유도함을 입증하고, 이 활성은 처리된 세포의 핵에 특이적 국부화로 검출될 수 있으나 비처리된 세포는 그러하지 않다(도 12). 더욱이 ATM 키나아제 억제제 워트마닌(50 μM)은 상기 반응의 길항제이다. 사용된 워트마닌의 농도는 ATM에 특이적이나 ATR을 억제하지 않으므로, 상기 두 키나아제를 구별하는 단순한 검정을 나타낸다. ATM 경로의 기질을 분석할 때 이러한 유형의 실험은 SCPVUTAT에 의해 유도된 DSB에 의해 유도된 생화학적 및 분자적 표적을 규정하는데 도움을 준다. 본 발명으로 처리된 세포 또는 세포 추출물에서 웨스턴-블롯팅, 면역형광성 분석, 또는 효소 검정에 의해 ATM 키나아제의 기질을 생화학적 및/또는 면역적으로 분석하는 것은 개개 경로의 정상적인 유도와 비교하여 특정 세포에서 생체내 체크포인트 반응의 상태를 설명하는데 유용하다.
더욱이, 이러한 검정들은 자동 스크린에서 본 발명에 바람직하게 이용될 수 있다. 본 발명에 의해 DNA에 유도된 손상의 정확하고 널리 규정된 특성이 유사한 유형의 검정에 종래에 사용된 임의의 다른 화합물과 관련하여 우수하게 제시되도록 한다. 단일 검정 또는 고-처리량-스크린에 본 발명을 사용하는 것은 복합 스크린의 성공을 위한 필수적인 선행조건인 이차적이거나 부수적인 효과를 거의 고려할 필요가 없다. 이러한 유형의 실험에서 수득된 데이터를 DSB에 의해 유도된 효과가 동등한 것으로 고려할 수 있다. 더욱이, SC34와 같은 뉴클레아제 활성을 나타내지 않는 돌연변이된 단백질 유도체의 이용가능성은 상기 검정에 대한 중요한 조절을 보장한다.
실시예 8
ATM 및 p53으로부터 SCPVUTAT 유도된 효과의 의존성.
일반적으로, DNA 손상의 경우에, 상응하는 조절 메커니즘(체크포인트)의 성분들에서의 돌연변이는 세포 주기의 저지-특성에서 변화를 나타내고, 많은 이러한 돌연변이는 암의 질병소인을 결정한다.
대조적으로, DNA 복구에 일반적으로 효과기 분자로서 포함되는 단백질은 세포 주기의 정상적인 저지 특성을 나타내고, 체크포인트 성분들에서의 결함과 조합해서만 주로 종양의 발달을 유도하며, 종종 종양에 대한 질병소인에 상승작용을 한다. 효과기 분자의 돌연변이는 특히 DSB에 대한 과민성, 체크포인트 돌연변이의 경우에 현저하게 덜 뚜렷한 특징을 나타낸다. 본 발명의 단백질이 단일특이적이라는 사실로 인해, DSB에 대한 민감성 및 유도된 손상의 간단한 결과로서 세포 주기에 대한 효과를 설명할 수 있다. 사실상, 결함이 조절 메커니즘(체크포인트)의 성분들 또는 복구 기관에 있는 경우, 이를 평가할 수 있다.
SCPVUTAT 처리에 의해 유도된 DSB에 대한 세포 주기 반응을 p53 포지티브 또는 네거티브 세포에서 분석하였다. p53에 대해 포지티브인 세포가 낮은 S 기 수치를 지니며 G1 및 G2에서 저지 거동을 나타내나, p53에 대해 네거티브인 세포는 세포 주기의 저지 특성을 나타내지 않는다. 더욱이, 이러한 유형의 결과가 또한 p53 마이너스 세포와 유사한 거동을 나타내는 p21에서 돌연변이된 p53 다운스트림 엘리먼트에 대해 수득되었으며, 14-3-3 시그마에서의 돌연변이는 G1 저지를 나타내며, 이는 상기 단백질이 p53과 부분적으로 중첩되고 세포 주기의 G2 기의 조절에서만 그 역할을 한다는 것을 증명한다. 마지막으로 도 8a에서 입증되는 대로, 돌연변이 AT-5를 SCPVUTAT로 처리 후 분석하였다. SCPVUTAT를 이용하여 ATM(AT-5)에 대해 돌연변이된 세포주를 36시간 동안 인큐베이션하여 세포 주기의 일시적인 지연을 초래하고, 이것을 DNA 함량 FACS 분석에 의해 결정하였다. AT-5 세포는 4N G2 DNA 함량에서 강한 증가를 나타내고, 임의의 G1 지연을 나타내지 않으며, 이것은 G1 체크포인트에서의 복잡한 결함을 나타낸다(도 8). 중요하게, G2에서의 지연은 해제되지 않으며, 세포 주기로의 재진입은 ATM 포지티브 세포주와 대조적으로 24시간 후에 관찰되지 않는다(참조 도 5). 60분 동안 AT-5 세포로의 SCPVUTAT의 단일 첨가는 24시간 후 세포 주기 정지를 유도하고(도 8a) 최종적으로 세포 치사를 유도하기에 충분하며, 이것은 DNA를 정확히 결찰시키지 않음으로부터 수득되며, SCPVUTAT의 단일 처리한 지 60분 후 클론원성 활성은 AT-5 세포에 대하여 0.02% 미만이었다. 상기 검정에서, ATM 포지티브 대조군 세포주 MRC-5는 SCPVUTAT 처리에 대해 덜 민감하였다(도 8b). 또한, 세포를 대조군으로서 아드리아마이신과 함께 인큐베이션하였다. 이 효과는 SCPVUTAT의 엔도뉴클레아제 활성에 기인하였으며, 콜로니가 돌연변이된 뉴클레아제 버전으로 처리시 처리되지 않은 것과 유사한 유효성으로 형성되기 때문이다. 이러한 실시예는, 다양한 돌연변이된 세포가 SCPVUTAT 처리에 반응하여 별개의 세포 주기 프로파일을 나타내고, 이러한 특성이 DSB에 대하여 세포 주기 결함을 진단하는데 이용될 수 있음을 입증한다.
실시예 9
NHEJ(비상동 말단 연결, Non-homologous End-Joining) 복구 경로에서 세포 결함에 대한 단백질 SCPVUTAT의 진단 능력의 측정
NHEJ는 상동 재조합에 의한 복구가 더 많이 존재하는 하등 진핵 생물과 대조적으로 고등 진핵 생물에서 이중가닥 DNA 절단 복구에 대한 중요한 메커니즘을 나타낸다. 이 시스템에 포함된 단백질이 또한 V(D)J 면역글로불린 재조합의 최종 기에 포함된다. 본 발명의 단백질이 특정 물질로 NHEJ의 효소를 활성화하는지를 확인하기 위하여, 이 경로의 필수적인 인자 중의 하나에서 개개의 돌연변이를 함유하는 설치류 세포주를 분석하였다.
도 9 및 도 13에 요약된 콜로니 형성 검정은 본 발명의 단백질 SCPVUTAT를 이용한 단일 처리가 분석된 모든 NHEJ 돌연변이된 세포주에서 콜로니 형성 활성을 강하게 감소시키는데 충분하다는 것을 입증한다.
본 발명의 DSB 복구의 특이성을 입증하기 위해, DSB에 대한 NHEJ 복구에 수반되는 필수 인자 중의 하나에 기능 돌연변이의 동질 접합체 손실을 함유하는 설치류 세포를 이용하였다: DNA 의존성 단백질 키나아제의 조절 서브유닛(DNA-PKcs; V3 세포주, 어버이 세포주 AA8에 상응함), DNA 의존성 단백질 키나아제 Ku70의 조절 서브유닛(HIS P1. 13-11; 어버이 세포주 CHO-K1에 상응함), 서브유닛 Ku80(xrss5; 어버이 세포주 AA8에 상응함), 및 DNA 리가아제IV 조절 서브유닛 XRCC4(XR-1 세포주; 어버이 세포주 AA8에 상응함)를 함유하는 PIKK 서브유닛 촉매 도메인. 이러한 세포주를 생체내에서 SCPVUTAT를 이용하여 뉴클레아제 활성 검정으로 분석하고, 지시된 어버이 세포주와 비교하였다. 또한 이러한 NHEJ 돌연변이 세포를 클론원성의 SCPVUTAT로 처리하였으며, 10 nM(회색 막대) 또는 75 nM(흑색 막대) 농도의 SCPVUTAT를 12시간 동안 단일 첨가하거나 단백질 처리를 하지 않고(비처리됨, 백색 막대) 콜로니 성장 검정으로 분석하였다. 첨가한 지 7일 내지 10일 후에, 세포 성장을 GIEMSA-블루로 염색하고 다양한 세포 농도를 정량함으로써 분석하였다. 대표적 실험으로부터 수득된 결과는 도 9에 요약되어 있다. DNA 리가아제IV의 서브유닛 XRCC4에 대한 돌연변이체인 세포는 SCPVUTAT에 의해 유도된 평활 말단 DSB에 대해 과민성이고, 더욱 흥미롭게도 촉매 서브유닛의 돌연변이를 포함하는 DNA-PK 검정된 것들 중 돌연변이체를 함유하는 모든 세포는 콜로니 형성 검정에서 급격한 감소를 또한 나타낸다. 모세포와 대조적으로, hMLH1 단백질을 코딩하는 유전자에서 동형접합성 돌연변이를 나타내는 HCT116과 같은 미스-매치 복구 경로에서 공지된 결함을 함유하는 세포는 유사한 검정에서 SCPVUTAT에 의한 처리에 대한 감수성의 임의의 증가를 나타내지 않는다. 또 다른 예에서, DNA-PKcs가 결여된 인간 아교모세포종 세포주(MO059J)를 SCPVUTAT로 처리하고, 모세포주 MO59K와 비교하였다. 유사하게, 세포 성장은 12시간 동안 SCPVUTAT에 의한 1회 처리 후에 정량하였다(10 nM, 회색 막대; 75 nM, 흑색 막대; 비처리, 백색 막대). 또 다시, 인간 DNA-PKcs 돌연변이 세포는 또한 SCPVUTAT 처리에 반응하여 감수성의 현저한 차별적 증가를 나타낸다(도 13a, b). 이러한 세포를 다양한 농도로 멀티웰-마이크로타이터-플레이트내로 플레이팅하고, 지시된 바와 같이 SCPVUTAT로 처리하고, GIEMSA-블루로 염색하였다. 멀티웰-마이크로타이터-플레이트(예를 들어, 도 13a 참조)를 VersaDOCR(BioRad) 이미징 시스템을 사용하여 스캐닝하고, 성장을 마이크로타이터-플레이트 분석용 소프트웨어 패키지 퀀티파이 원(Quantify OneR)(마이크로타이터-플레이트 스캐닝 소프트웨어)으로 자동 정량하였다. 수득된 데이터를 도 13에 개략된 바와 같이 막대그래프로 추가로 요약하였다. DNA-PKcs에 대해 돌연변이된 설치류 세포주로부터 수득된 결과와 일치하게, 인간 세포주는 또한 SCPVUTAT 처리시에 과민성을 나타내었고, 이는 DSB의 도입에 대한 SCPVUTAT의 높은 특이성을 확인해준다. 이러한 실험은 반자동 또는 전자동 검정에서의 적용을 포함하는 사용된 시스템의 실행가능성을 입증한다.
실시예 10
DSB에 의해 유도된 스트레스에 대한 상승작용제 또는 길항제로서의 후보 화합물의 스크리닝을 위한 검정
U20S 세포를 단독 또는 조합 형태의 10nM SCPVUTAT 및 10μM H2O2와 인큐베이션시키고, 세포 주기 프로파일을 FACS에 의해 분석하였다. 세포를 두 가지 화합물과 동시에 인큐베이션시키면 상응하는 G2 기 피크가 20%에서 45%로 급격히 증가하는 세포 주기 프로파일의 차별적인 매우 증가된 변화을 야기시켰는데(도 11a, 도 11d와 비교됨), 이는 10μM H2O2 단독의 경우 G2의 증가가 없는 것(도 11c) 및 10nM SCPVUTAT 단독의 경우에 G2에서 20%에서 28%로 약간 증가한 것(도 11a, 도 11b와 비교됨)과 비교된다. 단일 성분과의 인큐베이션으로부터의 결과를 기초로 하여, 둘 모두의 성분과의 인큐베이션은 세포 주기의 교란을 위한 상승 효과를 동시에 명백히 나타낸다.
연속적인 유사한 실험에서, SCPVUTAT 단백질을 아피디콜린(DNA 삽입성 물질 및 토포이소머라아제 II 억제제)와 함께 인큐베이션한 경우, 상승 효과는 관찰되지 않았고, 둘 모두의 성분은 단지 부가적 거동을 나타낸다. 또 다시, 본 실시예는 본 발명의 단백질로부터의 평활 말단 DSB에 의해 유도되는 세포 스트레스에 대한 상승작용 또는 길항작용의 검출을 위해 사용될 수 있는 검정의 단순성을 입증한다. 상기 약술된 바와 같이, 검정의 이점은 유도된 단일특이적 DNA 상해, 뉴클레아제 손상된 단백질 SC34를 사용한 시스템의 백그라운드를 측정할 수 있는 가능성 및 실질적으로 임의의 세포 및 세포 주기의 임의의 시기에서의 검정의 용이한 사용으로부터 유래된다. 이는 생체내에서 DSB를 유도시킬 수 있는 그 밖의 임의의 시약에 대해 앞서 기술된 적이 없었다. 따라서, 라디칼 및 카페인에 대해 제시된 이러한 유형의 검정(도 7c)은 DNA 복구 경로 및 이의 조절을 간섭하는 조성물에 대한 모든 유형의 스크린을 위해 사용될 수 있다.
실시예 11
SCPVUTAT에 의한 처리로부터의 신경모세포종에서 아폽토시스의 유도
중간엽 기원 뿐만 아니라 상피 기원의 분석된 세포 중 다수가 SCPVUTAT에 의한 처리시에 아폽토시스를 나타내지 않았지만, 몇몇 신경모세포종 세포주(IMR32, LAN5, GI-LIN) 뿐만 아니라 병원으로부터의 다양한 1차 신경모세포종 세포 단리물에서는 상당량의 아폽토시스가 유도되었다. 도 10은 이러한 세포에서 본 발명의 단백질에 의한 아폽토시스의 유도의 예를 도시한다. 분석을 위해, DNA 함량을 세포를 프로피듐 J-로 염색시킨 후에 FACS로 검정하였다. 아폽토시스 세포(A)는 2N 미만의 DNA 함량을 나타내는 세포로서 검출되었다. 계산된 영역은 상응하는 면적에 대해 화살표에 의해 각각의 막대그래프의 상부에 표시되어 있다. 10nM의 SCPVUTAT가 30시간내에 18% 아폽토시스 세포를 신속히 유도시키고(도 10b), 100nM의 SCPVUTAT의 첨가가 동일한 시간내에 29%가 넘는 아폽토시스 세포를 유도시킨(도 10c) 반면, 뉴클레아제 손상된 변형체 SC34는 이러한 효과를 유도시키지 않았다. 이러한 실험은 신경모세포종 세포에서 아폽토시스의 고도로 특이적인 유도를 입증하며, 본 발명의 단백질은 이러한 유형의 종양의 치료적 처리를 위한 주요 후보체로서 적용된다.
더욱이, 조직 특이적 전달 시스템과 함께, 본 발명의 목적인 서열은 신경모세포종의 치료를 위한 후보 물질로서 충분한 특이성을 함유할 수 있다. 실제로, 이는 본 발명이 조직 특이적 전달 서열에 대한 스크린을 위한 플랫폼 기술로서 적용된다는 확실한 암시가 된다.
또한, 이전 실시예(실시예 8)에서 이미 예견된 바와 같이, 본 발명은 또한 특이적인 차별적 아폽토시스를, 표적 세포, 유리하게는 종양으로부터의 악성 세포에서는 유도할 수 있지만 동일한 집단의 정상 세포에서는 유도하지 않거나 훨씬 적은 정도로 유도하는 분자들의 특정 조합 또는 특정 선도 화합물을 검색하는데 사용될 수 있다.
실시예 12
면역-현미경적 분석에 의한 SCPVUTAT를 사용한 처리 후의 세포 주기 단백질의 세포 국부화.
처리되지 않거나 SCPVUTAT(100nM)로 30시간 동안 처리되거나 탁솔(0.2㎍/ml)로 처리된 HCT116(p53(+/+))를 3% PFA로 고정시키고, 시클린 B1 또는 Cd-c25C에 대한 특이적 항체로 처리하였다. FITC 표지된 2차 항체에 컨쥬게이션된 시클린 B1에 대한 특이적 1차 항체(녹색) 또는 TRITC 표지된 2차 항체에 컨쥬게이션된 Cdc25C에 대해 특이적인 1차 항체(적색)를 사용하여 현미경에 의해 면역형광을 분석하였다(도 14 참조). SCPVUTAT로 처리한 후에 4N DNA 함량을 지닌 세포로부터 수득된 세포 주기 마커 Cdc25C 및 시클린 B의 세포질 분포는 G2 기 정지를 나타내며, 처리된 세포는 세포 주기의 M 기로 진행하지 않음을 나타낸다.
이러한 결과는 유력한 핵 국부화가 세포 주기의 M 기에서의 정지를 나타내는 탁솔을 사용하여 수득된 결과와 상이하다.
두 가지 마커 단백질의 특유한 분포의 변화(즉, 활성 시클린 B 키나아제에 상응하는 핵 국부화와 대조적인, 비활성 시클린 B 키나아제에 상응하는 세포질 국부화 및 세포 주기의 후기로의 후속 진행) 및 포스파타아제 Cdc25C에 의한 탈인산화에 의한 cdc2/시클린 B 키나아제의 연속 활성화(Cdc25C로부터의 14-3-3 단백질의 방출 및 포스파타아제의 후속 활성화 후)는 G2/M 전이에 대한 특징을 구성한다. 실제로, 이러한 경로는 세포 주기의 이러한 시기에서 속도 제한 단계를 대신한다.
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<120> chimeric polypeptides and their use
<130> 3916
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<211> 1020
<212> DNA
<213> Proteus vulgaris
<220>
<221> CDS
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952...999: TAT 1000...1017: 6 his
<400> 1
atg agc cac cca gat cta aat aaa tta tta gag ctt tgg ccg cat ata 48
Met Ser His Pro Asp Leu Asn Lys Leu Leu Glu Leu Trp Pro His Ile
1 5 10 15
cag gaa tat caa gac tta gca tta aaa cat gga ata aat gat att ttt 96
Gln Glu Tyr Gln Asp Leu Ala Leu Lys His Gly Ile Asn Asp Ile Phe
20 25 30
caa gat aat ggt gga aag ttg ctt caa gtc ctt cta att aca gga tta 144
Gln Asp Asn Gly Gly Lys Leu Leu Gln Val Leu Leu Ile Thr Gly Leu
35 40 45
aca gta cta cca gga cga gaa ggt aat gat gct gta gat aac gca gga 192
Thr Val Leu Pro Gly Arg Glu Gly Asn Asp Ala Val Asp Asn Ala Gly
50 55 60
caa gaa tac gag tta aaa tca ata aac ata gac ctc act aaa ggt ttt 240
Gln Glu Tyr Glu Leu Lys Ser Ile Asn Ile Asp Leu Thr Lys Gly Phe
65 70 75 80
tca act cac cac cac atg aat cct gta att att gca aaa tat aga caa 288
Ser Thr His His His Met Asn Pro Val Ile Ile Ala Lys Tyr Arg Gln
85 90 95
gta cct tgg att ttt gcc ata tac cgt ggt atc gca ata gaa gct ata 336
Val Pro Trp Ile Phe Ala Ile Tyr Arg Gly Ile Ala Ile Glu Ala Ile
100 105 110
tac aga tta gag cca aaa gat cta gaa ttt tac tat gat aaa tgg gaa 384
Tyr Arg Leu Glu Pro Lys Asp Leu Glu Phe Tyr Tyr Asp Lys Trp Glu
115 120 125
agg aaa tgg tat tca gat ggg cat aaa gat att aac aac cct aaa ata 432
Arg Lys Trp Tyr Ser Asp Gly His Lys Asp Ile Asn Asn Pro Lys Ile
130 135 140
cct gta aaa tat gta atg gaa cat ggg aca aag att tac gga tcc gga 480
Pro Val Lys Tyr Val Met Glu His Gly Thr Lys Ile Tyr Gly Ser Gly
145 150 155 160
gga agt cac cca gat cta aat aaa tta tta gag ctt tgg ccg cat ata 528
Gly Ser His Pro Asp Leu Asn Lys Leu Leu Glu Leu Trp Pro His Ile
165 170 175
cag gaa tat caa gac tta gca tta aaa cat gga ata aat gat att ttt 576
Gln Glu Tyr Gln Asp Leu Ala Leu Lys His Gly Ile Asn Asp Ile Phe
180 185 190
caa gat aat ggt gga aag ttg ctt caa gtc ctt cta att aca gga tta 624
Gln Asp Asn Gly Gly Lys Leu Leu Gln Val Leu Leu Ile Thr Gly Leu
195 200 205
aca gta cta cca gga cga gaa ggt aat gat gct gta gat aac gca gga 672
Thr Val Leu Pro Gly Arg Glu Gly Asn Asp Ala Val Asp Asn Ala Gly
210 215 220
caa gaa tac gag tta aaa tca ata aac ata gac ctc act aaa ggt ttt 720
Gln Glu Tyr Glu Leu Lys Ser Ile Asn Ile Asp Leu Thr Lys Gly Phe
225 230 235 240
tca act cac cac cac atg aat cct gta att att gca aaa tat aga caa 768
Ser Thr His His His Met Asn Pro Val Ile Ile Ala Lys Tyr Arg Gln
245 250 255
gta cct tgg att ttt gcc ata tac cgt ggt atc gca ata gaa gct ata 816
Val Pro Trp Ile Phe Ala Ile Tyr Arg Gly Ile Ala Ile Glu Ala Ile
260 265 270
tac aga tta gag cca aaa gat cta gaa ttt tac tat gat aaa tgg gaa 864
Tyr Arg Leu Glu Pro Lys Asp Leu Glu Phe Tyr Tyr Asp Lys Trp Glu
275 280 285
agg aaa tgg tat tca gat ggg cat aaa gat att aac aac cct aaa ata 912
Arg Lys Trp Tyr Ser Asp Gly His Lys Asp Ile Asn Asn Pro Lys Ile
290 295 300
cct gta aaa tat gta atg gaa cat ggg aca aag att tac gga tct tac 960
Pro Val Lys Tyr Val Met Glu His Gly Thr Lys Ile Tyr Gly Ser Tyr
305 310 315 320
ggc cgc aag aaa cgt cgc cag cgt cgc cgt ggt gga tca cac cat cat 1008
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cat cac cac taa 1020
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290 295 300
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<213> Human immunodeficiency virus
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protein Tat
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Gly Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly Ser
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<210> 4
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<212> PRT
<213> Human immunodeficiency virus
<400> 4
Gly Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly Ser
1 5 10 15
Claims (37)
- 삭제
- a) 특정 뉴클레오티드 서열에 친화성을 나타내는 폴리펩티드,b) DNA 개질 효소, 및c) 세포내 전달 활성을 지니는 영역을 포함하는 키메라 폴리펩티드로서,상기 DNA 개질 효소가 PVUII 클래스 II 제한 엔도뉴클레아제이고, 상기 영역 a), b) 및 c)가 서로에 대해 공유적으로 결합됨을 특징으로 하는, 키메라 폴리펩티드.
- 제 2항에 있어서, 상기 세포내 전달 활성을 지니는 영역이 펩티드, 폴리펩티드, 지질 및 탄수화물로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는, 키메라 폴리펩티드.
- a) 특정 뉴클레오티드 서열에 친화성을 나타내는 폴리펩티드,b) DNA 개질 효소, 및c) 세포내 전달 활성을 지니는 영역을 포함하는 키메라 폴리펩티드로서,상기 DNA 개질 효소가 PVUII 클래스 II 제한 엔도뉴클레아제이고, 상기 폴리펩티드 a) 및 폴리펩티드 b)의 활성이 동일한 폴리펩티드 내에 함유되어 있음을 특징으로 하는, 키메라 폴리펩티드.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- a) 특정 뉴클레오티드 서열에 친화성을 나타내는 폴리펩티드,b) DNA 개질 효소, 및c) 세포내 전달 활성을 지니는 영역을 포함하는 키메라 폴리펩티드로서,상기 DNA 개질 효소가 PVUII 클래스 II 제한 엔도뉴클레아제이고, 상기 세포내 전달 영역이 헤르페스 단순포진 바이러스의 VP22, HIV-1의 Tat, HIV-1의 Rev, 및 안테나페디아 호메오도메인(Antennapedia homeodomain)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 펩티드를 포함함을 특징으로 하는, 키메라 폴리펩티드.
- 제 8항에 있어서, 펩티드 YGRKKRRQRRR를 포함하는 HIV-1 Tat 단백질로부터 유래됨을 특징으로 하는, 키메라 폴리펩티드.
- a) 특정 뉴클레오티드 서열에 친화성을 나타내는 폴리펩티드,b) DNA 개질 효소, 및c) 세포내 전달 활성을 지니는 영역을 포함하는 키메라 폴리펩티드로서,상기 DNA 개질 효소가 PVUII 클래스 II 제한 엔도뉴클레아제이고, 상기 특정 뉴클레오티드 결합 친화성을 지니는 폴리펩티드 및 상기 DNA 개질 효소가 PvuII 클래스 II 제한 엔도뉴클레아제를 코딩하는 단일 폴리펩티드이며, 상기 세포내 전달 작용기가 HIV-1 Tat의 아미노산 서열에 포함된 펩티드임을 특징으로 하는, 키메라 폴리펩티드.
- 제 10항에 있어서, 상기 PvuII 클래스 II 제한 엔도뉴클레아제의 서브유닛들이 단쇄 단백질로서 공유적으로 연결됨을 특징으로 하는, 키메라 폴리펩티드.
- 삭제
- a) 특정 뉴클레오티드 서열에 친화성을 나타내는 폴리펩티드,b) DNA 개질 효소, 및c) 세포내 전달 활성을 지니는 영역을 포함하는 키메라 폴리펩티드로서,상기 DNA 개질 효소가 PVUII 클래스 II 제한 엔도뉴클레아제이고, 상기 키메라 폴리펩티드는 비천연 아미노산을 포함함을 특징으로 하는, 키메라 폴리펩티드.
- 제 2항 내지 제 4항, 제 8항 내지 제 11항 및 제 13항 중 어느 한 항에 포함된 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
- 삭제
- 제 14항에 따른 폴리뉴클레오티드의 핵산 서열을 포함하는 벡터.
- 제 16항에 따른 벡터로 형질전환된 세포.
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