CN108289924A

CN108289924A - 阻断组蛋白识别结构域的小分子

Info

Publication number: CN108289924A
Application number: CN201680057596.6A
Authority: CN
Inventors: A·格罗斯; G·萨雷迪; 黄洪达; C·哈蒙德; D·帕特尔
Original assignee: Koebenhavns University; Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Current assignee: Koebenhavns University; Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Priority date: 2015-10-02
Filing date: 2016-09-30
Publication date: 2018-07-17
Also published as: US10961289B2; US20180282383A1; WO2017054832A1; US20200148732A1; EP3355903A1; AU2016332352A1; JP2018537411A; CA3000275A1; BR112018006263A2; KR20180059922A

Abstract

本发明涉及干扰被组蛋白H4尾所占据的TONSL ARD构象空间的小分子。借助直接竞争或借助变构破坏结合口袋，这些小分子通过阻止或破坏H4尾K12‑R23和TONSL ARD的结合，从而靶向包含H4残基K12‑R23的TONSL结合口袋并且发挥作用。本发明人鉴定并解析了称为ARD(锚蛋白重复结构域)的TONSL组蛋白识别结构域的结构。

Description

阻断组蛋白识别结构域的小分子

技术领域

本发明涉及TONSL蛋白的新型抑制剂，而TONSL蛋白是基因组稳定性所需的。在双链断裂(DSB)的DNA修复中以及在稳定正在复制的DNA中间体当中，通过无错同源重组(HR)，TONSL和MMS22L一起作为专职的异源二聚体而发挥作用。

本发明人已经解析了TONSL ARD在与其组蛋白底物(组蛋白H4尾)形成的复合物中的结构，为小分子、肽或多肽基于结构的合理药物设计提供了基础，所述小分子、肽或多肽能够通过直接竞争或通过变构破坏结合口袋，来阻止或破坏H4尾与TONSL ARD的结合。

背景技术

细胞持续暴露于不同来源的DNA损伤，并面对这种挑战，它们设计了一系列DNA修复策略。DNA双链断裂、复制叉受损的关键修复途径之一以及增殖细胞存活的关键在于同源重组(HR)。

许多癌细胞经历高负荷的复制压力，使其容易发生HR抑制。

癌细胞通常也依赖于该途径来修复常规化学疗法产生的DNA损伤；因此，由于受感染细胞的合成致死性，HR靶向药物在临床上具有吸引力。

HR抑制剂的开发也具有重要的临床意义，因为PARP抑制剂杀死HR缺陷细胞。因此，阻断两种替代途径将产生比单独靶向任一途径更大的影响。此外，一些肿瘤细胞在其它DNA修复途径中有缺陷，因此依赖于HR，这使得它们对HR修复的抑制敏感。

TONSL(Tonsoku样，NFKBIL2)是一种至关重要的HR调节因子，与MMS22L一起以异源二聚体复合物的形式发挥作用，通过HR来促进DSB和受损复制叉的修复。在HR中，提出认为TONSL-MMS22L用于调节Rad51到ssDNA上的加载。MMS22L或TONSL的耗竭导致细胞增殖显著减弱和显著的对拓扑异构酶I毒素喜树碱(CPT)的超敏反应，这最可能是由于不能促进RAD51介导的破损复制叉的修复而引起的。然而，调节DNA修复中TONSL-MMS22L功能的分子机制尚不清楚。

TONSL-MMS22L与组蛋白H3-H4、组蛋白分子伴侣ASF1和依赖于TONSL锚蛋白重复结构域(ARD)的MCM2、4、6、7形成复合物，表明ARD可能对TONSL功能是重要的。

ARD是一种常见的蛋白-蛋白相互作用基序，其由大约33个氨基酸的串联重复模块组成，存在于大量功能多样的蛋白中，包括转录起始因子、细胞周期调节因子、细胞骨架蛋白、离子转运蛋白和信号转导因子。

解析了几种ARD蛋白的晶体结构，包括特异性结合在赖氨酸9的位置甲基化的组蛋白H3的G9a/GLP ARD(Collins等人，Nat Struct Mol Cell Biol15：245，2008)。然而，大多数ARD的特异性仍然未知。

序列相似性方面，TONSL ARD与BARD1 ARD高度相似。BARD1是一种特征明确的HR因子，是BRCA1的专属伴侣，是BRCA1的大多数细胞和肿瘤抑制因子功能所必需的(Westermark等人，Mol Cell Biol 23：7926，2003)。

可获得BARD1 ARD的晶体结构(Fox等人，J Biol Chem 283：21179，2008)，但BARD1ARD的结合特异性是未知的，因此，无法为抑制剂的设计提供基础。

因此，需要鉴定TONSL ARD结合的靶分子，并获得这些蛋白复合物的晶体，以便以原子级别的分辨率解析它们的结构。这为确定该结合对于TONSL-MMS22L功能是否重要提供了基础，因此使其成为有吸引力的药物靶标。此外，结合口袋及其底物的高分辨率的结构可使技术人员(skilled addressee)能够设计干扰TONSL ARD与其靶分子结合的小分子，并随后以快速且可重现的方式验证生物测定中的效果。

发明内容

本发明人已经发现了将TONSL及其伴侣MMS22L募集至复制后染色质的分子机制，其打开了癌症治疗中靶向HR修复途径的道路。该机制依赖于通过TONSL锚蛋白重复结构域(ARD)结构域对K20位置上未修饰的组蛋白H4(H4K20me0)的识别，该结构域作为新型组蛋白识别结构域起作用。

这项发现工作的亮点包括：

1.结构和生物化学数据，其将TONSL ARD鉴定为第一个组蛋白识别因子(reader)，其特异于K20上未甲基化的H4尾(H4K20me0)。H4K20me0特异于在DNA复制期间掺入的新合成组蛋白，对复制后染色质进行标记，直至K20me1得以建立的晚期G2/M。

2.功能和结构数据，其显示通过ARD识别H4K20me0，TONSL结合与MCM2和ASF1形成的复合物中的可溶性新组蛋白，证明了将TONSL-MMS22L递送至复制染色质的方式。

3.通过ARD识别H4K20me0，在复制后染色质中TONSL结合核小体组蛋白的功能性数据，并且证明这是在损伤的复制叉和DNA损伤处积累TONSL-MMS22L所需的。

4.用TONLS ARD突变体蛋白滴定MMS22L使其脱离染色质并对细胞有毒性的功能数据。

5.TONSL ARD突变体蛋白诱导G2/M停滞、复制相关的DNA损伤(53BP1灶)并降低存在和不存在喜树碱(CPT)时的活力。

6.通过从染色质中去除TONSL，TONSL-MMS22L复合物在DNA修复中的功能被禁用。

7.TONSL抑制剂，例如能够与TONSL ARD结合的TONSL抑制剂。

7.组蛋白H4肽或其功能同源物可以作为TONSL的抑制剂起作用。

总之，这表明DNA复制留下了标记，其形式为在H4K20处未修饰的沉积的新组蛋白，其被TONSL-MMS22L HR修复复合物所识别，以区分复制前和复制后的染色质。

此外，这项工作为理解如何通过关键HR因子TONSL来识别复制后染色质的状态提供了突破，其介导了在受损的复制叉和DSB之处加载Rad51。因此，靶向TONSL ARD的小分子抑制剂能够使DSB和受损复制叉的有效HR修复得以失效。

因此，本发明涉及干扰被组蛋白H4尾所占据的TONSL ARD构象空间的小分子。这些小分子靶向TONSL的结合口袋，并通过直接竞争或通过结合口袋的变构破坏来阻止或破坏H4尾K12-R23与TONSL ARD的结合，所述结合口袋包含H4残基K12-R23。

因此，本发明一方面涉及，通过直接竞争或通过结合口袋的变构破坏而阻止或破坏BARD1 ARD结合口袋中底物结合的小分子(通过与TONSL ARD中H4尾K12-R23结合口袋的高度结构相似性进行定义)。

发明的详细描述

本发明人鉴定并解析了称为ARD(锚蛋白重复结构域)的TONSL组蛋白识别结构域的结构。重要的是，本发明人解析了与组蛋白底物(组蛋白H4尾)复合的TONSL ARD的结构，为TONSL抑制剂的基于结构的合理药物设计提供了基础。鉴于DSB的HR和受损复制叉的修复中需要TONSL，TONSL抑制剂可有效地降低HR，并可单独使用或与常规化疗组合使用以杀死癌细胞。因此，本文所述的任何TONSL抑制剂可用于治疗癌症。

本发明的复合物的晶体结构、重组TONSL ARD、表达GFP-TONSL(野生型和组蛋白H4结合突变体)的细胞系，都有助于设计和鉴定干扰H4K20me0的TONSL ARD识别的特异性小分子抑制剂。

此后，本发明人还公开了用于TONSL抑制剂开发的生物化学和基于细胞测定的管线开发。

这些数据和信息对于设计适合作为抗癌治疗剂的新型抑制剂是必不可少的。因此，本发明提供了用于计算机设计并随后进行合成的手段，本发明还提供了测定中的测试，提供了能够抑制TONSL与其组蛋白底物之间结合从而干扰HR的小分子抑制剂，进而产生直接的抗肿瘤作用和/或提高的可用细胞生长抑制化合物的功效。

本发明人使用界面突变体鉴定了H4尾与TONSL结合的关键决定因素。此外，本发明人已经证明，破坏H4尾结合位点的TONSL ARD突变体不再募集到复制后染色质、受损复制叉或DNA损伤(例如，DNA双链断裂)。TONSL ARD突变体蛋白诱导G2/M停滞、复制相关的DNA损伤(53BP1灶)并且降低存在和不存在喜树碱(CPT)时的活力。

如下面更详细描述的，所述TONSL ARD突变体可以模拟TONSL抑制剂的作用，特别是抑制TONSL ARD与组蛋白H4结合的抑制剂的作用。因此，本发明提出，这样的抑制剂可用于诱导G2/M停滞、复制相关的DNA损伤(53BP1灶)和/或降低存在和不存在喜树碱(CPT)时的活力。这使得抑制剂可用于治疗癌症。抑制剂可以是本文所述的任何抑制剂。

本发明人还注意到，在包括肺、皮肤、胃、大肠、胆道、前列腺、子宫内膜、卵巢、胰腺、食道、泌尿道和中枢神经系统的多器官的癌组织中已经鉴定出ARD结构域中的多种TONSL突变体(残基512-692)。(COSMIC，癌症体细胞突变数据库(Catalogue of somaticmutations in cancer)，http：//grch37-cancer.sanger.ac.uk/cosmic/search？q＝ TONSL)。术语TONSL ARD指SEQ ID NO：16的氨基酸512至692。

本发明人已经确定TONSL ARD与结构已发表的BARD1的ARD高度相似，但是由于BARD1 ARD的结合特异性未知，这也不能为抑制剂设计提供依据。

然而，TONSL ARD与H4尾的结合细节预测认为破坏TONSL与组蛋白结合的抑制剂也可能结合BARD1 ARD并破坏与其底物(例如组蛋白)的相互作用。这将是可取的，并且可能增加药物功效，因为BARD1和TONSL在同一DNA修复途径(HR)中以分开的步骤发挥作用。本发明人还注意到，基于TONSL ARD-H4的结构，在乳腺癌中发现的在BARD1中所确立的肿瘤抑制突变靶向预测为组蛋白结合所需的关键残基。

一方面，本发明涉及药物的设计和开发，阻止TONSL(一种HR蛋白)募集到DNA损伤部位的小分子抑制剂。因为TONSL与其伴侣蛋白MMS22L共同是HR所需的，所以单独干扰TONSL募集至DNA损伤部位、或与常规化疗联合治疗，将损害HR修复并杀死癌细胞或依赖于HR修复途径的细胞。

晶体结构

本发明涉及基于结构的药物设计方法来鉴定干扰TONSL和TONSL-MMS22L复合物募集至DNA损伤和DNA复制叉的化合物的用途。

本发明公开与其组蛋白底物(组蛋白H4尾)复合的TONSL ARD的晶体结构。TONSLARD主要通过分子间氢键、静电和范德华相互作用靶向跨越残基Lys12至Arg23的H4尾(图1-9)。

本发明涉及TONSL ARD结合口袋结构的原子细节以及与H4尾肽的分子间相互作用，这种相互作用负责H4尾(K4-R23)和TONSL结合口袋衬底(lining)的残基之间的识别特异性。

在优选的实施方案中，本发明涉及晶体结构，其具有PDB蛋白数据库中可获得的原子坐标(于2016年4月11日保存的编号为PDB ID 5JA4，DOI：10.2210/pdb5ja4/pdb)，或具有这样的结构，在其中相较于PDB蛋白数据库中所示的那些(编号为PDB ID 5JA4，DOI：10.2210/pdb5ja4/pdb)原子坐标在任何方向上的变化小于

本发明的原子坐标的变化应优选小于例如小于例如小于例如小于例如小于例如小于例如小于例如小于例如小于例如小于例如小于或例如小于

在一个实施方案中，本发明涉及PDB蛋白数据库(编号为PDB ID 5JA4，DOI：10.2210/pdb5ja4/pdb)中可获得的至少部分原子坐标数据、或其衍生数据。

在一个实施方案中，本发明涉及晶体，其包含至少部分与其组蛋白底物(组蛋白H4尾)复合的TONSL ARD的晶体结构。

在另一个实施方案中，本发明涉及在PDB蛋白数据库中可获得的晶体结构中原子坐标之间的距离(编号为PDB ID 5JA4，DOI：10.2210/pdb5ja4/pdb)，或者其限定了与组蛋白H4尾残基Lys12-Arg23相互作用的TONSL结合表面的任何变体(图1-9)。

组蛋白H4(K12至R23)肽位于TONSL的锚蛋白重复结构域表面上的通道内。该表面构成酸性片(patch)并且包含针对H4的His18和Lys20侧链的浅结合口袋。此外，H4 R17的侧链夹在Tyr572和Cys608的侧链之间进行排列。因此，任何抑制剂都必须靶向两个浅口袋，并且与结合表面的静电性质相容。

形成晶体结构的方法

在一个实施方案中，本发明涉及以下之间的复合物的三维晶体：

· 多肽，其包含：

○ 由SEQ ID NO：16的氨基酸512至692组成的TONSL ARD或与其共享至少90％序列同一性的功能同源物；以及

○ 任选地，由SEQ ID NO：24的氨基酸61至130组成的MCM2 HBD或与其共享至少90％序列同一性的功能同源物；

· SEQ ID NO：23的组蛋白H4或与其共享至少90％序列同一性的功能同源物；以及

○ 任选地，组蛋白H3或其片段，例如由SEQ ID NO：25的氨基酸57-135组成的组蛋白H3.3Δ56或与其共享至少90％序列同一性的功能同源物。

特别地，所述多肽可以包含通过肽接头连接到所述MCM2 HBD或其功能同源物的所述TONSL ARD或其功能同源物。这种肽接头通常由4至20个氨基酸组成，例如4至12个氨基酸。所述氨基酸可以是Gly，并且因此接头可以由范围4至20个甘氨酸残基组成，例如范围4至12个甘氨酸残基。

通常，复合物包含一种包含TONSL ARD的多肽，而组蛋白H4和任选的组蛋白H3通常作为单独的肽存在。优选地，包含TONSL ARD的多肽还包含MCM2 HBD，其中TONSL ARD可以通过接头例如肽接头与MCM2HBD连接。所述组蛋白H3的片段可以是组蛋白H3.3的片段，例如SEQ ID NO：25的氨基酸57-135。该片段也可以是组蛋白H3.1或组蛋白H3.2的片段，其含有相同的片段。

本发明尤其可以基于对独特的融合蛋白MCM2 HBD-G₄-TONSL ARD(SEQ ID NO：15)的利用，从而允许TONSL ARD-MCM2 HBD-H3-H4四聚体复合物结晶。该融合蛋白由人TONSL锚蛋白重复结构域(ARD，SEQ ID NO：16的残基512-692)和MCM2组蛋白结合结构域(HBD，SEQID NO：24的片段61-130)通过四甘氨酸接头(G₄接头)整合到一个表达盒中共价连接而组成。

本发明可用的分离的多核苷酸或氨基酸序列公开于以下序列数据(SEQUENCEDATA)的列表中，具有至少90％序列同一性，例如91％序列同一性，92％序列同一性，93％序列同一性，94％序列同一性，95％序列同一性，96％序列同一性，97％序列同一性，98％序列同一性，99％序列同一性或100％序列同一性。

列出的所有序列都是本发明的实施方案。有很多方法可以限定基因、核苷酸或蛋白序列的序列同一性。一种方法是通过直接比较两个比对的序列。这样的比较在技术上是直截了当的。

具体而言，如本文所用的术语“序列同一性”可以指比对之后候选序列和参考序列之间相同的氨基酸或核苷酸的百分比。因此，与参考序列共享80％氨基酸同一性的候选序列要求在比对后，候选序列中80％的氨基酸与参考序列中的相应氨基酸相同。根据本发明的同一性优选借助计算机分析以及其中建议的默认参数而进行确定，例如但不限于ClustalW计算机比对程序(Higgins D.，Thompson J.，Gibson T.，Thompson JD，HigginsDG，Gibson TJ，1994.CLUSTAL W：improving the sensitivity of progressive multiplesequence alignment through sequence weighting，position-specific gap penaltiesand weight matrix choice.Nucleic Acids Res.22：4673-4680)。ClustalW软件可从欧洲生物信息学研究所的ClustalW WWW服务http：//www.ebi.ac.uk/clustalw获得。使用该程序及其默认设置，将候选氨基酸序列和参考氨基酸序列进行比对。计数完全保守的残基数并除以参考序列的长度。因此，优选在参考序列的整个长度上确定序列同一性。ClustalW算法可以类似地用于比对核苷酸序列。序列同一性可以按照与氨基酸序列所示的类似方式计算。如本文所提供的序列同一性是在参考序列的整个长度上计算的。

根据本发明的参考肽或多肽的功能同源物可以是与所述参考肽或多肽共享至少70％，例如至少80％，例如至少90％序列同一性，例如至少95％序列同一性，例如至少98％的序列同一性序列同一性的肽或多肽。

在另一个实施方案中，在低严格条件下，与本发明的任何分离的多核苷酸杂交的序列公开在下面的序列数据(SEQUENCE DATA)列表中，属于本发明的实施方案。

在本文中，在低严格条件下杂交的序列被定义为在杂交溶液(含有0.5M磷酸钠缓冲液，pH7.2，含有7％SDS、1mM EDTA)中于65℃下孵育16小时并在洗涤溶液中(含有0.5×SSC和0.1％SDS)于65℃持续20分钟洗涤二次，与所述例如DNA或所述互补序列特异性杂交的序列。

即使经过广泛的筛选，与H4尾或H3-H4四聚体复合的TONSL ARD的结晶化仍然失败。因为额外的结合蛋白可能有助于稳定整个复合物并有助于结晶，所以测试了与MCM2HBD和H3-H4四聚体复合的TONSL ARD的晶体。

对于该复合物获得了非常小的晶体，但未能给出大且良好的衍射晶体。TONSL ARD与MCM2 HBD和H3-H4四聚体的整个复合物可能由于苛刻的结晶条件而不稳定并形成亚复合物，从而阻碍晶体的优化。

因此，测试了TONSL ARD和MCM2 HBD通过不同长度的甘氨酸接头(G_x接头)在一个盒中的共价连接。尝试了G₁₂、G₁₁、G₁₀、G₉、G₈、G₇、G₆、G₅和G₄接头，并且所有这些盒都可以结晶。

具有G4接头的构建体之一(MCM2 HBD-G4-TONSL ARD盒)在与H3.3(Δ56)-H4复合时产生良好衍射的晶体(参见实施例1)，在此表示为TONSL ARD-MCM2 HBD-H3-H4四聚体复合物(图1)。

因此，本发明涉及组合物，其包含晶体形式的TONSL ARD-MCM2HBD-H3-H4蛋白组装物和/或从该晶体结构分析推导的复合物结构细节。

限定这种晶体的具体数据在表1、实施例1中详细描述。具体而言，本发明的该方面涉及从原子坐标推导得出的TONSL ARD结合口袋结构以及与H4尾肽的分子间相互作用，所述原子坐标限定了TONSL ARD与组蛋白H4尾残基Lys12-Arg23的结合表面(例如，在PDB蛋白数据库中可获得的晶体结构中，编号为PDB ID 5JA4，DOI：10.2210/pdb5ja4/pdb或其变体)。

结合口袋数据

H4的Lys12-Gly13-Gly14-Ala15片段位于TONSL ARD支架的窄表面通道内(图2-4)。提供的关于组蛋白H4的氨基酸编号通常与SEQ ID NO：34的组蛋白H4有关。

跨越H4的Lys12-Gly13-Gly14-Ala15片段的分子间接触包括H4的残基Gly13、Gly14以及Ala15与ARD的残基Asn507、Cys508、Trp641、Tyr645和Leu649之间的疏水相互作用、以及H4 Gly14的主链O和ARD Trp641的Nε1之间、以及H4 Ala15的主链N与ARD Tyr645的Oη之间的氢键(图3、8)。

H4 Lys16的主链O与ARD Asn571的Nδ2形成氢键，而H4 Lys16的侧链与ARD Asn607形成接触，以及与ARD Glu597的侧链静电相互作用(图3)。

H4 Arg17的侧链叠加在ARD Tyr572和Cys608的侧链上，而其Nη1原子与ARDAsn571的主链O和Oδ1形成两个氢键(图3、5)。

H4 H18的侧链穿入由四个严格保守残基(Trp563、Glu568、Asn571和Asp604)形成衬底(lined)的口袋，并位于ARD的His567上。H4 His18的侧链叠加在Trp563和Asn571之间，并与ARD的Glu568和Asp604形成氢键(图3、6)。

H4 Arg19的主链O与Trp563的Nε1形成氢键，其侧链与ARD的Cys561和Gly595形成接触。(图3)。

H4 Lys20残基结合在ARD上的酸性表面口袋内，临近H4 His18结合口袋。H4 Lys20的侧链与Met528的侧链相互作用，并与ARD的Trp563的边缘相接触，而H4 Lys20的主链原子与ARD的Cys561相对(pack against)。H4 Lys20的Nζ原子与ARD的严格保守的残基Glu530、Asp559和Glu568的侧链形成三个强氢键其在规则的三角形样排布(alignment)中围绕H4 Lys20(图3，7)。

跨越H4的Val21-Leu22-Arg23片段的分子间接触包括H4 Val21的侧链与ARD的Tyr560和Cys561之间的接触，而H4 Leu22与ARD的Asp527和Met528相互作用。H4 Arg23的主链N与ARD的Asp527的主链O形成氢键，而侧链与ARD的Tyr560的侧链相对(图3，9)。

根据上述结构描述，明显的是具有延伸的β-链样构象的H4尾(残基12-23)位于TONSL ARD的凹面上的细长通道中。该通道主要为酸性，提供与带正电荷的H4尾的静电互补配合。最重要的是，H4 His18和Lys20的侧链被置于两个相邻的口袋内(图4)。

用更大的Trp残基取代H4 His18完全破坏了与TONSL ARD的结合(图13)，这强调了让His18和口袋相适合的重要性。由于H4 Lys20的Nζ原子在其结合口袋内形成三个强氢键，因此可以预测H4K20上的甲基化应该打断这些关键的相互作用。

等温滴定量热法(ITC)以及重组ARD和来自细胞提取物的全长TONSL的H4尾肽拉下实验(pull-down)证实H4K20me1/2与TONSL结合不相容(图13、14、15、17、18、19)。

此外，用修饰的重构单核小体进行的全长重组TONSL-MMS22L的体外拉下实验显示H4K20me2显着降低TONSL-MMS22L结合(图16)。

本文所用的术语“TONSL ARD的H4尾部结合表面”是指与H4尾结合的TONSL ARD部分。参与H4尾结合的TONSL ARD的氨基酸在本节的上文中详细描述，并且“TONSL ARD的H4尾结合表面”可以包含任何这些氨基酸。具体地，“TONSL ARD的H4尾结合表面”可以包含SEQID NO：16的氨基酸Asp527、Met528、Glu530、Asp559、Tyr560、Cys561、Trp563、Glu568、Asn571、Tyr572、Gly595、Glu597、Asp604、Asn607、Cys608、Trp641、Tyr645和Leu649。

我们的数据证实H4K20的甲基化阻碍了与TONSL ARD的结合。先前的研究发现G9a/GLP甲基转移酶的ARD特异性识别H3K9me1/2，但TONSL ARD显示不与H3K9me1肽结合。

与结构数据一致，组蛋白H4突变H18A和K20A在细胞提取物中破坏了与TONSL的结合(图11)。相反地，无论在体内还是体外，H4 His18和Lys20结合口袋内部6个保守TONSL残基的突变破坏了与H3-H4和MCM2的结合而不影响与MMS22L的结合，先前显示其结合TONSL的C端部分(图10，12)。在体内，这些突变体废除了与可溶性H3-H4的结合，并且因此，失去了与ASF1和MCM2的结合，而不影响MMS22L与TONSL的C端部分的结合(图12)。

总之，这些结果显示TONSL通过ARD识别H4尾而结合至游离的组蛋白和核小体，其中重要的残基His18和Lys20匹配在两个相邻的口袋内。还显示SEQ ID NO：23的氨基酸9至25可以结合TONSL ARD(SEQ ID NO：16的aa512-692)，但在H4尾肽结合中突变体强烈受损。

显然，能够结合His18结合口袋或Lys20结合口袋的分子，以及靶向TONSL ARD上的两个口袋的单一或共价连接的小分子将破坏H4和TONSL之间的相互作用。

药物设计

在最基本的层面，本发明的药物设计涉及单独的小分子或连接的小分子设计，所述小分子在形状上互补并作用于(charge to)本发明的分子靶。本发明还涉及将肽或多肽设计成与靶结合。

本发明的药物设计依赖于本文所示三维结构的知识。除了小分子之外，生物药物是日益重要的一类药物，用于改善这些基于蛋白的治疗剂的亲和性、选择性和稳定性的计算方法也是本发明的实施方案。

优选的，本发明的小分子经设计以避免影响任何其它重要的“脱靶”分子(通常称为抗靶标)，因为药物与脱靶分子的相互作用可能导致不希望的副作用。

如本文所用的术语“小分子”是指分子量低于1000Da，例如低于500Da的任何分子。优选地，“小分子”可以是分子量低于500Da的有机分子。

构成本发明的一个实施方案的另一类小分子是适体，其可以由DNA、RNA或肽单位构成。适体与特定的靶分子结合，并且可以如本文的本部分中所述进行设计。或者，它们可以通过从大的随机序列池中进行选择来产生。因此，适体可以是具有本文所述的结合性质的任何适体。

传统的药物发现方法(称为正向药理学)依赖于在培养的细胞或动物上对化学物质进行试错测试，并将明显的效果匹配至治疗，与传统的药物发现方法不同，合理的药物设计(也称为逆向药理学)开始于特定生物学靶标的调节可能具有治疗价值的假设。

根据本发明，为了选择小分子作为药物靶标，需要必需的一段信息片段，即本发明的小分子对靶标的调节将会改变疾病的证据。该知识来自疾病连锁研究，其显示例如生物靶标的突变和某些疾病状态之间的关联。

小分子的搜索可以从筛选潜在药物化合物的文库开始。这可以通过使用现有的和可用的小分子文库的虚拟筛选来完成。本发明的原子坐标数据或其衍生的数据可用于选择和/或设计能够干扰在TONSL锚蛋白重复的表面上相邻的组蛋白H4H18和H4K20结合口袋的小分子。

因此，一方面，本发明涉及用于选择和/或设计这种小分子的方法，其中例如，该方法涉及使用计算机建模或计算机程序来建构在PDB蛋白数据库中(PDB ID 5JA4，DOI：10.2210/pdb5ja4/pdb)或其衍生数据公开的全部或部分结构，从而基于其可能与建模的结构相互作用的能力来鉴定潜在的小分子，合成或从商业来源获得小分子并进行功能性的体外测试。

在一个实施方案中，本发明涉及基于计算机的方法，其用于鉴定能够干扰TONSL锚蛋白重复表面上相邻的组蛋白H4H18和H4K20结合口袋的小分子，方法包括以下步骤：

a)在计算机上的存储介质中，提供TONSL锚蛋白重复表面上的组蛋白H4H18和H4K20结合口袋的3D结构表征，其中3D结构表征源自PDB蛋白数据库中以编号PDB ID 5JA4，DOI：10.2210/pdb5ja4/pdb可获得的原子坐标或其变体，其中所有重原子x、y和z坐标的r.m.s.偏差小于并且

b)使用计算机将基于结构的药物设计技术应用于结构表征。

在一个实施方案中，基于结构的药物设计包括一个或更多对接(docking)步骤，例如但不限于筛选结构文库成员的对接步骤。

在另一个实施方案中，本发明涉及基于计算机的方法，其用于鉴定能够干扰在TONSL锚蛋白重复表面上相邻的组蛋白H4H18和H4K20结合口袋的小分子，方法包括以下步骤：

b)使用计算机将基于结构的药物设计技术应用于结构表征，以及

c)通过所述基于结构的药物设计技术，提供鉴定的化合物，以及

d)使所述化合物与TONSL锚蛋白重复表面上的结合口袋接触，并分析它们之间的相互作用。

在另一个实施方案中，本发明涉及鉴定小分子或其片段或变体的方法，所述小分子能够干扰TONSL锚蛋白重复表面上的组蛋白H4H18和H4K18结合口袋，所述方法包括以下步骤：

a.使用PDB蛋白数据库中编号PDB ID 5JA4 DOI：10.2210/pdb5ja4/pdb所示的原子坐标或其衍生的或者相较于蛋白骨架原子的均方根偏差不超过的数据，在计算机屏幕上生成口袋的空间结构，

b.在计算机屏幕上生成潜在小分子的空间结构，以及

c.选择能够结合至结合相互作用位点组(set)的至少1个氨基酸残基的小分子。

在另一个实施方案中，本发明涉及用于鉴定小分子或其片段或变体的计算机辅助方法，所述小分子能够干扰TONSL锚蛋白重复表面上的组蛋白H4H18和H4K20结合口袋，所述方法使用包括处理器、数据存储系统、数据输入装置和数据输出装置的编程计算机，包括以下步骤：

a.通过所述输入装置，将数据输入到编程计算机中，数据包括：根据本发明的原子子集的原子坐标，从而生成标准数据集；其中所述原子坐标选自PDB蛋白数据库中编号PDBID 5JA4，DOI：10.2210/pdb5ja4/pdb所示原子坐标、其衍生的或相较于蛋白骨架原子的均方根偏差不超过的数据，

b.使用所述处理器，将所述标准数据集与存储在所述数据存储系统中的低分子量有机化学结构和肽片段的计算机数据库进行比较，以及

c.使用计算机方法，从所述数据库中选择具有与所述标准数据集在结构上互补的部分的化学结构。

在另一个实施方案中，本发明涉及用于鉴定配体的方法，所述方法包括以下步骤：

a.使用原子坐标并结合计算机建模，通过将潜在配体对接至结合相互作用位点的组，通过计算机建模产生所述结合相互作用，并选择能够结合至所述TONSL的结合相互作用位点的组中的至少一个氨基酸的潜在配体，而选择潜在配体，其中所述原子坐标是PDB蛋白数据库中编号PDB ID 5JA4，DOI：10.2210/pdb5ja4/pdb所示原子坐标、其衍生的或相较于蛋白骨架原子的均方根偏差不超过的数据，

b.提供所述潜在配体和所述TONSL，

c.使潜在配体与所述TONSL接触，以及

d.检测所述潜在配体与TONSL的结合。

用于鉴定根据本发明的小分子或抑制剂的方法的非限制性实例在下文的实施例16中提供。

薛定谔(SCHRODINGER)分析

SCHRODINGER的小分子药物发现套件含有一套全面的程序，目的在于为药物发现和优化的每一步提供最先进的支持。这代表了一种用于小分子抑制剂设计的基于结构的对接程序，其它的也可以应用。药物发现的实质在于(1)找到影响或控制其功能的靶蛋白上的关键相邻口袋，以及(2)在已知的数据库中，发现以高亲和性结合至相邻口袋的共价连接的小分子，随后通过添加/删除取代基来反复优化，同时使形状、氢键和静电互补性最大化。

当蛋白-配体复合物的晶体结构已知时，可以最有效地定义结合口袋。在这种情况下，应用高精度GLIDE算法计算网格，随后将其用于商业上可用的小分子的高通量对接。该网格表示关于结合表面的基本组分的三维空间信息，例如所有亲脂性原子，具有表示氢键取向的评分的所有氢键原子，金属原子(如果存在于蛋白中的话)，电荷分布以及范德华原子相互作用。在SCHRODINGER中还通过应用LigPrep程序预先计算了配体构象，LigPrep程序过滤掉了最不可能的构型并考虑了预期配体的各种pH依赖性电离态。

对于这样表示的两个相互作用组分的对接计算是高度精确的，并且可以在蛋白组分中以高比例和不同程度的受控灵活性进行。接下来利用SCHRODINGER套件的对接后(post-docking)Embrace最小化和主要MM GBSA的优势对具有从数据库筛选所得配体的蛋白-配体复合物进行排序。这些程序给出了游离结合能的估计，因此是基于计算的结合亲和性的用于配体排序的合适工具。

当药物-蛋白复合物的晶体结构未知时，如TONSL-H4尾复合物的情况，根据预期的配体的结合应该超出用于相互作用的最关键方面的假设，来计算蛋白结合口袋和相应的网格，所述相互作用例如对于例如组蛋白H4尾上的氨基酸残基H18和K20的相互作用或任何上述列出的相互作用。

在这种情况下，计算TONSL口袋的对接网格，所述TONSL口袋通过并入这两个残基的空腔所定义：单独或者共价连接在一起。在这种情况下，竞争性小分子的评分函数和原始的结合靶标进行比较。在化学合成最有希望的候选物之前，通过引入/删除R基团、以及通过等温滴定量热法计算对其亲和性的最终作用，实现对所鉴定的小分子先导物的优化。

在X射线结构确定和配体优化的反复过程中生成预期的药物候选物，目的是鉴定共价连接的优化配体，其同时靶向在TONSL支架上的H4H18和H4K20口袋。

获得根据本发明的有效化合物的途径是：

1.通过使用计算机模拟结构支架/坐标和计算机模拟标准结合/评分算法，确定对本文公开的TONSL/H4晶体结构具有高结合亲和性的分子，

2.计算机模拟修饰小分子结构(具有R-取代)以代表药物样化合物，

3.通过标准化学合成这样的结构，

4.在本发明的分析中，测试所得的合成结构，

5.选择、修饰和优化最有前途的化合物。

这种方法的替代方法是在分析中筛选现有文库，以及任选地，对这些进行优化以便像所述的那样在空间中结合。

因此，在一个实施方案中，本发明涉及选择或设计小分子的方法，所述小分子能够干扰TONSL锚蛋白重复的表面上组蛋白H4H18和H4K20结合口袋，所述方法包括使用PDB蛋白数据库中编号PDB ID 5JA4，DOI：10.2210/pdb5ja4/pdb所含的至少部分原子坐标或其衍生数据，其中所述方法涉及使用计算机建模软件包或计算机程序来建构与H3(57-135)和H4复合的MCM2 HBD-G4-TONSL ARD的全部或部分结构的模型，从而基于可能在建模的结构中阻止或破坏H4尾与TONSL锚蛋白重复相互作用的能力，来鉴定所述小分子。

在一个实施方案中，本发明涉及融合蛋白MCM2 HBD-G₄-TONSL ARD(SEQ ID NO：15)或其变体(例如，G_x接头＝G₁₂、G₁₁、G₁₀、G₉、G₈、G₇、G₆或G₅)，这对确定TONSL结合小分子抑制剂的结构细节是有帮助的。

在另一实施方案中，本发明涉及通过组蛋白H4破坏TONLS和TONSL ARD之间相互作用的TONSL和H4突变体(图10-13，实施例2-4)。突变体数据鉴定出关键分子间相互作用，所述相互作用有助于复合物形成的特异性和稳定性。验证的TONSL组蛋白结合突变体对于生物化学和生物学分析设计是有帮助的，以便评估筛选的小分子抑制剂阻断TONSL-组蛋白相互作用和TONSL功能的效率。

在一个实施方案中，本发明涉及具有3-[(3-氨基环戊基)羰基]-1H-喹啉-4-酮核心的化合物。这类化合物可以是任何化合物，优选任何包含3-[(3-氨基环戊基)羰基]-1H-喹啉-4-酮的小有机化合物，其中一个或更多位置可以被取代基取代。因此，化合物可以是3-[(3-氨基环戊基)羰基]-1H-喹啉-4-酮，其中一个或更多-H已经被另一个基团取代。

TONSL的肽抑制剂

本发明还提供TONSL抑制剂，特别是这样的抑制剂，其可以抑制TONSL ARD与组蛋白H4的结合。在优选的实施方案中，抑制剂可以是结合TONSL ARD的组蛋白H4尾结合表面的化合物。

在本文其它地方提供鉴定这种抑制剂的方法。

抑制剂可以是任何有用的化合物，例如肽抑制剂或小分子。在本发明的一个实施方案中，抑制剂是肽抑制剂。肽抑制剂可以例如用于治疗癌症。

如本文所用，术语“肽抑制剂”是指包含任选连接至缀合部分的肽或多肽的化合物。肽抑制剂的肽或多肽部分在下文中称为“肽”。

肽抑制剂因此可以是肽，其能够结合DONSL ARD。因此，肽抑制剂可以是下文所述的任何肽，其中所述肽能够结合TONSL ARD(例如由SEQ ID NO：16的氨基酸512至692组成的肽)，其中Kd至多10μM，优选Kd至多5μM，例如Kd至多3μM。所述Kd可以例如按照以下实施例10和15中所述的确定。

在一个实施方案中，肽可以包含序列基序I：Arg-His-Xaa-Lys(SEQ ID NO：26)，其中Xaa可以是任何氨基酸。

在一个实施方案中，肽可以包含序列基序II：Arg-His-Xaa-Lys-Val-Leu(SEQ IDNO：27)，其中Xaa可以是任何氨基酸。

在一个实施方案中，肽可以包含序列基序III：Val-Leu-Arg。

在一个实施方案中，肽可以包含序列基序IV：Arg-His-Xaa-Lys-Val-Leu-Arg(SEQID NO：28)，其中Xaa可以是任何氨基酸。

特别地，肽可以是这样的肽，其由包含序列Arg-His-Xaa-Lys的4至40个氨基酸和/或序列基序I、II、III或IV的一个或更多个组成。肽也可以是这样的肽，其由包含序列Arg-His-Xaa-Lys的4至25个氨基酸，例如4至15个氨基酸，优选7至15个氨基酸，例如7至12个氨基酸，例如4至10个氨基酸，例如6至9个氨基酸，和/或序列基序I、II、III或IV的一个或更多个组成。肽也可以是这样的肽，其由至多25个氨基酸，优选至多15个氨基酸，例如至多12个氨基酸，例如至多9个氨基酸组成，其中所述肽包含序列基序I、II、III或IV的一个或更多个。所述Lys优选未甲基化。所述Xaa可以是任何氨基酸，例如它可以选自Ala和Arg。在本发明的一个实施方案中，Xaa不是Arg。

在一个实施方案中，肽包含或由以下组成：

I.由SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：34的氨基酸12至23组成的序列；或者；

II.由SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：34的氨基酸12至23所示序列组成的功能同源物，其中至多5个氨基酸，例如至多4个氨基酸，例如至多3个氨基酸，例如至多2个氨基酸，例如1个氨基酸可以被取代，并且其中所述肽至少包含SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：34的Arg17、His18和Lys20，

III.由SEQ ID NO：23的氨基酸12至23的序列组成的功能同源物，其中至多6个氨基酸，例如至多5个氨基酸，例如至多4个氨基酸，例如至多3个氨基酸，例如至多2个氨基酸可以被取代，

只要抑制剂不同于SEQ ID NO：23所示组蛋白H4。

在一个实施方案中，肽包含或由以下组成：

IV.由SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：34的氨基酸9至25组成的序列；或者；

V.由SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：34的氨基酸9至25所示序列组成的功能同源物，其中至多5个氨基酸，例如至多4个氨基酸，例如至多3个氨基酸，例如至多2个氨基酸，例如1个氨基酸可以被取代，并且其中所述肽至少包含SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：34的Arg17、His18和Lys20，

VI.由SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：34的氨基酸9至25的序列组成的功能同源物，其中至多6个氨基酸，例如至多5个氨基酸，例如至多4个氨基酸，例如至多3个氨基酸，例如至多2个氨基酸可以被取代，

只要抑制剂不同于SEQ ID NO：23所示组蛋白H4。

在一个实施方案中，肽包含或由以下组成：

VII.由SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：34的氨基酸14至33组成的序列；或者；

VIII.由SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：34的氨基酸14至33所示序列组成的功能同源物，其中至多5个氨基酸，例如至多4个氨基酸，例如至多3个氨基酸，例如至多2个氨基酸，例如1个氨基酸可以被取代，并且其中所述肽至少包含SEQ ID NO：23的Arg17、His18和Lys20，

IX.由SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：34的氨基酸14至33的序列组成的功能同源物，其中至多6个氨基酸，例如至多5个氨基酸，例如至多4个氨基酸，例如至多3个氨基酸，例如至多2个氨基酸可以被取代，

只要抑制剂不同于SEQ ID NO：23所示组蛋白H4。

在本发明的一个实施方案中，其中肽包含本文前述III、VI或IX中所述的功能同源物，优选的：

I.对应着SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：34氨基酸17的氨基酸是带电荷氨基酸，例如带正电荷的氨基酸，例如选自Lys和Arg的氨基酸，

II.对应着SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：34氨基酸18的氨基酸是带电荷氨基酸，例如带正电荷的氨基酸，例如His，

III.对应着SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：34氨基酸20的氨基酸是带电荷氨基酸，例如带正电荷的氨基酸，例如选自Lys和Arg的氨基酸。

在一个实施方案中，基于SEQ ID NO：23所示组蛋白H4的序列或其片段来鉴定肽抑制剂，即通过系统地或随机地用其它氨基酸替换H4肽或H4天然肽的某些部分的一个或更多氨基酸。

通常，肽抑制剂不应该太大。因此，可能优选的是，肽由至多40个氨基酸组成，例如至多25个氨基酸，例如至多20个氨基酸，例如至多15个氨基酸，例如至多12个氨基酸。例如，肽可以包含或由SEQ ID NO：23的4至40个，例如4至25个，例如4至20个，例如4至15个，例如4至12个，例如7至15个氨基酸，例如7至12个氨基酸，例如5至10或例如6至9个连续的氨基酸组成。

在一个实施方案中，肽可以包含或由SEQ ID NO：23的4至40个，例如4至25个，例如4至20个，例如4至15个，例如4至12个，例如7至15个氨基酸，例如7至12个氨基酸，例如5至10或例如6至9个连续的氨基酸组成，其中至多3个，例如至多2个，例如至多一个氨基酸可能已经被另一个氨基酸取代，并且其中所述肽包含序列基序I、II、III或IV的一个或更多个。

所述SEQ ID NO：23的片段的功能同源物优选为包含以上定义的序列的肽，并且能够结合TONSL。

如上所述，肽可以包含一个或更多个Lys残基。优选至少一个Lys残基，例如所有Lys残基未甲基化。特别地，当肽包含SEQ ID NO：23的片段时，优选对应于SEQ ID NO：23的Lys20的氨基酸未甲基化。

在本发明的一些实施方案中，肽的C端被酰胺化，即具有化学结构-C(O)NH₂。

在本发明的一些实施方案中，肽的C端被烷基化，例如被甲基化，即具有化学结构-C(O)OCH₃。

在本发明的一些实施方案中，肽的N端被乙酰化，即具有化学结构CH₃C(O)N(H)-。

在本发明的一些实施方案中，肽的N端被甲酰化，即具有化学结构HC(O)N(H)-。

应理解，由给定序列组成的肽可以具有被酰胺化或烷基化的C端、和/或被乙酰化或甲酰化的N端。

所述肽抑制剂尤其可以是包含或由选自以下的肽组成的肽：

Lys-Gly-Gly-Ala-Lys-Arg-His-Ala-Lys-Val-Leu-Arg-NH₂以及

上述序列中所示“-NH₂”部分(moity)表示肽的C端被酰胺化。然而，本发明还包括未被酰胺化的肽。因此，在一个实施方案中，本发明涉及包含或由至多40个，例如至多25个，例如至多20个，例如至多15个，例如至多12个氨基酸组成的肽抑制剂，其中所述肽包含选自以下的序列：SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33。

在本发明的一些实施方案中，肽是TONSL突变体多肽，例如在本文以下章节“TONSL突变体多肽”中所述TONSL突变体多肽的任何一种。例如，肽可以选自SEQ ID NO：17、SEQ IDNO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22所示多肽。

在本发明的一些实施方案中，抑制剂是TONSL的片段，特别是能够结合组蛋白H4但不能结合TONSL的至少一种其它结合伴侣(例如，不能结合MMS22L)的TONSL片段。所述TONSL片段可以是例如包含TONSL的H4尾结合表面的片段。在一个实施方案中，片段包含或由SEQID NO：16的氨基酸512至692或与其共享至少70％，例如至少80％，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％序列同一性的功能同源物组成。

在一些实施方案中，本文所述的肽与缀合部分连接，例如肽可以共价连接至缀合部分。所述缀合部分可以例如是下文所述部分的任何一个。

在一个实施方案中，缀合部分可以是肽、糖、脂质、聚合物分子或可以共价连接至肽的任何其它化学基团。例如，缀合部分可以改善肽的物理性质，例如其溶解度、稳定性或半衰期。

在一个实施方案中，缀合部分是聚合物分子，例如聚乙二醇(PEG)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。聚合物分子也可以是修饰的PEG，例如NPEG。

验证本发明小分子的分析

根据本发明鉴定的分子在下面列出的生物化学和细胞生物学分析中进行测试。在这些分析中显示出类似于TONSL ARD突变体的抑制TONSL功能活性的分子，在高通量生物分析中并最终在临床前和临床试验中进一步测试杀死癌细胞的功效。

生物化学筛选和生物物理测试(分析)

分析中的关键组成是：

a)重组人TONSL ARD(残基512-692，点1)，

b)重组人TONSL ARD突变体E530A、D559A、W563A、E568A、N571A、D604A(点2)

c)偶联至荧光分子或生物素的含K20me0的在K16处有或没有乙酰化的组蛋白H4肽(覆盖TONSL结合关键残基例如9-25或14-33的H4尾)，

d)偶联至荧光分子或生物素的含K20me2的在K16处有或没有乙酰化的组蛋白H4肽(覆盖TONSL结合关键残基例如9-25或14-33的H4尾)作为不结合TONSL ARD的对照，

e)表达标记的TONSL ARD野生型(WT)或组蛋白结合突变体(例如，本文章节“TONSL突变体多肽”中所述的任何突变体，例如E530A、D559A、W563A、E568A、N571A或D604A中的任一种)的人细胞。针对突变体，我们生成并验证了GFP-融合蛋白的表达构建体，以及针对WT、E568A和N571A的诱导型细胞系。

分析1：在点2中详述的TONSL ARD-H4尾相互作用的小分子依赖性破坏的高通量(HT)测量

一线筛选可基于使用与荧光探针缀合的组蛋白H4肽的荧光各向异性测量。分析条件如下在我们证实的ITC分析(实施例2)中详述，关键标准是观察到ARD结合H4(残基9-25)但不结合H4K20me2(残基9-25，在K20处二甲基化)(图13)。

分析2：小分子抑制剂的ARD结合特性的测量

二线筛选可能涉及等温滴定量热法(ITC)以确定结合亲和性/结合常数(Ka)和表面等离子体共振(SPR)分析以确定速率常数。比未修饰的组蛋白H4肽产生更高TONSL结合亲和性的所得分子(实施例2)被进一步筛选以鉴定具有μM至nM有效范围的那些。

分析3.结晶和优化

可以用TONSL ARD对候选小分子进行结晶(使用我们在第1点、实施例1中概述的所证明的结晶条件)，进一步提供药物优化的可能性。

分析4.基于肽拉下(pulldown)的竞争分析

a.验证所选小分子与重组ARD竞争结合H4K20me0肽的能力(H4K20me2和ARD突变体用作阴性对照，分析条件如实施例3)。

b.验证所选小分子在细胞提取物中与GFP-TONSL-MMS22L竞争结合H4K20me0肽的能力。

培养表达标记的TONSL WT或ARD突变体(作为无组蛋白H4结合的对照)的细胞。根据标准方案制备全细胞提取物(实施例4中记录该分析的条件)。用表面结合的生物素化组蛋白H4肽孵育细胞提取物(例如H4K20me0相对于H4K20me2，作为不与WT TONSL结合的对照)。通过ELISA、western印迹或类似方法，小分子抑制剂的剂量-反应分析测试WT TONSL对H4K20me0肽结合的损失。

用于筛选小分子抑制剂的HT生物分析

本发明人已经证明，TONSL通过ARD识别K20处未甲基化的核小体组蛋白H4尾而结合染色质(图21)。因此，小分子抑制剂的生物学功能是阻止TONSL与组蛋白H4结合，并从染色质中取代TONSL-MMS22L复合物。

本发明人开发了基于高含量显微镜的分析，其被用于药物筛选(实施例5)。

1)内源性TONSL的免疫荧光染色显示，在用RNAi耗竭TONSL时，丧失对复制后染色质的结合(图20)。

2)GFP-TONSL与染色质的结合被ARD突变体所破坏，所述ARD突变体破坏H4结合(图21)。

本发明涉及小分子抑制剂和模拟TONSL ARD突变体，所述小分子抑制剂从复制后染色质取代TONSL和TONSL-MMS22L复合物。

关键组分：

a)在我们的高含量分析(实施例5)中测试的抗TONSL抗体(Sigma，参考号HPA0244679)，

b)去除可溶性TONSL的预提取条件(实施例5)，

c)耗竭TONSL的条件(阴性对照)(实施例5)，

d)GFP-TONSL WT和ARD突变体细胞系。

HT分析的原理：

1.高含量成像用以鉴定从染色质中去除内源性TONSL和TONSL-MMS22L复合物的小分子(图21)，

2.通过使用表达GFP-TONSL WT和ARD突变体(N571A，点2)的细胞，通过高含量成像在用TONSL抑制剂孵育后进行的TONSL与染色质结合的高含量成像分析。

分析1：染色质结合的内源性TONSL的HT成像

以HT形式(96或384孔板)培养细胞。按照剂量-反应和时间-进程(time-course)设置，用小分子TONSL抑制剂进行孵育。根据标准方案，通过细胞预提取然后细胞固定，来除去可溶性蛋白。用我们记录的用于特异性的市售抗体(Sigma，参考号HPA0244679)检测染色质结合的TONSL(实施例5)。TONSL siRNA用作对照。染色质结合的TONSL可以通过常规方法定量，例如使用标准高含量成像(实施例5)或者通过FACS分析。

分析2：GFP-TONSL的HT成像

以HT的形式(96或384孔板)培养表达GFP-TONSL WT和ARD突变体的细胞(N571A，点2：用于结合的阴性对照)。以剂量-反应和时间-进程的设置，用小分子TONSL抑制剂进行孵育。根据标准方案通过细胞预提取并固定细胞，去除可溶性蛋白。通过标准高含量成像(实施例5)量化染色质上的GFP-TONSL水平(实施例5)。

测量HR抑制的生物学分析

受损复制叉和DNA双链断裂的HR需要TONSL(Duro等，2010 Mol Cell40：619；O’Donnell等，2010 Mol Cel 40：619；O′Connell等，2010 Mol Cell40：645；Piwko等，EMBO J2010 29：4210)。因此，阻止TONSL或MMS22L募集到染色质的小分子抑制剂表型模拟(phenocopy)TONSL或MMS22L的损失。

为了测试小分子抑制剂危及HR的能力，使用公开的用于监测修复蛋白募集的分析(例如，Duro等，2010 Mol Cell 40：619；O′Donnell等，2010 Mol Cel 40：619；O′Connell等，2010 Mol Cell 40：645；Piwko等，EMBO J 2010 29：4210)以及HR报道细胞系(例如Pierce等，Genes Dev 13：2633，1999)。在那些分析中，用小分子TONSL抑制剂以时间和剂量依赖性方式处理细胞，通过高含量显微镜检测分析HR修复效率。

TONSL突变体多肽

在本发明的一个实施方案中涉及TONSL突变体多肽。所述TONSL突变体多肽优选是TONSL突变体多肽，其不能结合组蛋白H4，但保留其它TONSL功能。优选地，所述TONSL突变体多肽能够结合MMS22L，并且其中所述TONSL突变体不结合组蛋白H4。这类TONSL突变体多肽将起显性负(negtive)突变体的作用，因为它们将优选以和野生型TONSL多肽相同或相似的亲和性结合MMS22L和复合物的其它成员，但它们不会以任何显著的程度结合复制后染色质。

在一个实施方案中，TONSL突变体多肽是携带一个或更多突变的SEQ ID NO：16所示多肽，优选在对TONSL ARD的H4尾结合表面有贡献的氨基酸中的一个或更多突变。因此，TONSL突变体多肽可以在TONSL ARD组蛋白H4尾结合表面的氨基酸中包含至少一个突变，其中除了所述突变以外，所述TONSL突变体多肽与SEQ ID NO：16相同或与SEQ ID NO：16共享至少70％的序列同一性，其中所述TONSL突变体多肽能够结合MMS22L，并且其中所述TONSL突变体不结合组蛋白H4。

特别地，所述TONSL突变体多肽可以是在至少一个氨基酸中携带突变的SEQ IDNO：16所示多肽，所述氨基酸选自：SEQ ID NO：16的氨基酸编号527、528、530、559、560、561、563、568、571、572、595、597、604、607、608、641、645和649。

在一个实施方案中，TONSL突变体多肽在选自SEQ ID NO：16的Glu530、Asp559、Trp563、Glu568、Gln571和D604中的一个或更多氨基酸中携带突变。

在一个实施方案中，TONSL突变体多肽包含或甚至由选自以下的序列组成：SEQ IDNO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22。

TONSL突变体多肽可以连接至缀合部分，例如TONSL突变体多肽可以连接至可检测标记物。所述可检测标记物可以是肽或多肽，例如荧光蛋白，如GFP。

用于预测TONSL抑制作用的方法

本发明还提供用于预测TONSL抑制作用的方法。如上文所述，本文所述的TONSL突变体多肽可以是显性负突变体。这样的突变体的表达可表型模拟TONSL/MMS22L的耗竭，因此模拟TONSL与组蛋白H4结合的抑制剂的作用。

因此，在一个实施方案中，本发明涉及预测TONSL抑制作用的方法，所述方法包括步骤：

· 在有机体和/或有机体的细胞中表达TONSL突变体多肽，其中所述多肽任选是条件表达的，

· 确定所述多肽在所述有机体和/或细胞中的作用，

其中在所述有机体和/或细胞中表达所述多肽的所述作用指示着在所述有机体和/或细胞中抑制TONSL的作用。

特别地，所述TONSL突变体多肽可以是“TONSL突变体多肽”章节中上述本文所述的任何TONSL突变体多肽。有机体和/或细胞可以包含编码任何所述TONSL突变体多肽的异源核酸。

因此，显性负TONSL突变体多肽表达之后获得的作用可以模拟在所述有机体和/或细胞中TONSL抑制的作用。因此，如果用TONSL抑制剂，特别是用抑制TONSL ARD和组蛋白H4之间结合的抑制剂处理有机体/细胞，则观察到的作用指示着获得预期作用。

有机体或细胞可代表疾病模型，因此方法可用于预测用抑制剂或TONSL治疗所述疾病的效果，例如抑制TONSL ARD和组蛋白H4之间结合的抑制剂。

有机体可以是任何有机体，例如哺乳动物，例如小鼠、大鼠或兔。有机体可以被遗传修饰以患有特定疾病，例如癌症。因此，有机体可能是被遗传工程改造以致癌的小鼠。

这些细胞还可能代表疾病模型。细胞可以是任何细胞，例如哺乳动物细胞，例如人细胞。细胞可以使用任何常规方法进行培养。例如，可以在更接近于模拟体内条件的3D培养物中培养细胞。

因为TONSL突变体多肽的表达可能对细胞有毒性，所以优选所述TONSL突变体多肽仅条件性表达。因此，TONSL突变体多肽可以仅在所述有机体的特定细胞中表达和/或所述TONSL突变体多肽可以在特定时间被诱导表达。因此，有机体和/或细胞可以包含异源核酸，其编码本文上述“TONSL突变体多肽”章节中所述的任何TONSL突变体多肽，所述多肽有效地与诱导型启动子连接。以此方式，在任何特定时间诱导所述TONSL突变体多肽的表达。诱导型启动子是本领域众所周知的，且技术人员将能够选择有用的启动子。有机体还可以包含异源核酸，其编码有效地连接至启动子的任何所述TONSL突变体多肽，所述启动子仅在某些细胞类型中指导表达。这种启动子也是本领域已知的。

用于测定TONSL抑制性作用的方法

本发明还提供了用于鉴定推定的TONSL抑制剂的TONSL抑制性作用的方法。特别地，所述方法可用于确定化合物是否能够抑制TONSL和组蛋白H4之间的结合。这样的方法可用于筛选TONSL的抑制剂。然而，该方法对于验证推定的抑制剂是否事实上能够抑制TONSL也是有用的。因此，方法可用于确定已知的TONSL抑制剂和相似化合物之间的生物相似性，所述化合物是推定的TONSL抑制剂。该方法也可用于TONSL抑制剂的质量控制。该方法也可用于验证抑制剂的抑制作用，其中所述抑制剂是通过计算机辅助技术使用原子坐标所鉴定的，所述原子坐标提供于PDB蛋白数据库编号PDB ID 5JA4，DOI：10.2210/pdb5ja4/pdb中。

所述方法可以包括以下步骤：

a)提供测试化合物，其是推定的TONSL抑制剂；

b)提供宿主有机体，其表达SEQ ID NO：16所示TONSL、由SEQ ID NO：16的氨基酸512至692组成的TONSL ARD、或与SEQ ID NO：16的氨基酸512至692共享至少90％序列同一性的前述任一项的功能同源物；

c)用所述推定抑制剂接触所述宿主有机体；

d)检测所述宿主有机体中染色质结合的TONSL、TONSL ARD或其功能同源物，

其中染色质结合的TONSL、TONSL ARD或其功能同源物的减少指示着所述测试化合物是TONSL抑制剂。

优选地，所述染色质结合的TONSL、TONSL ARD或其功能同源物的减少是指相较于所述宿主有机体中没有所述抑制剂时所述水平的减少。具体而言，所述减少是减少至所述宿主有机体中没有所述抑制剂时染色质结合的TONSL、TONSL ARD或其功能同源物的小于50％，例如减少至小于30％，例如减少至小于20％，例如减少至小于10％。在一个实施方案中，减少是指不存在可检测的染色质结合的TONSL、TONSL ARD或其功能同源物。

宿主有机体可以是任何有用的宿主有机体，包括细胞，例如维持在组织培养中的哺乳动物细胞。因此，术语“宿主有机体的细胞”可以指多细胞宿主有机体的一部分，或者当宿主有机体为细胞时，它可以指宿主有机体本身。宿主有机体可以内源性表达TONSL，在这种情况下，方法可涉及检测染色质结合的内源性TONSL。内源性TONSL可通过各种方式检测，但通常通过抗体、抗体的结合片段或特异性识别并结合TONSL的其它结合分子检测内源性TONSL。抗体、片段或结合分子可用可检测标签(label)进行直接标记。方法也可涉及结合第一抗体、片段或结合分子的第二抗体、片段或结合分子的使用，其中第二抗体、片段或结合分子用可检测标签进行标记。用于检测抗体、片段或结合分子结合的其它方法也是可用的，并且可以与所述方法一起使用。

可检测标签可以是任何可检测标签，包括但不限于荧光团、生物发光物质、化学发光物质、染料、酶、重金属或放射性化合物。在优选的实施方案中，可检测标签是荧光团，即荧光部分。

本发明内还包括，所述宿主有机体包含编码所述TONSL、TONSL ARD或其功能同源物的异源核酸。在这样的实施方案中，方法可涉及检测染色质结合的异源TONSL、TONSL ARD或其功能同源物。异源TONSL、TONSL ARD或其功能同源物可连接至可检测标签，例如荧光多肽如GFP。因此，检测步骤可以是检测可检测标签的步骤。也可使用用于检测内源性TONSL的相同方法，检测异源TONSL、TONSL ARD或其功能同源物。

使用用于检测特定可检测标记的任何技术手段，检测可检测标签。在本发明的实施方案中，当可检测标签是荧光的，则可通过FACS、荧光显微镜或高含量显微镜的方式检测可检测标签。

方法的步骤d)可包括从所述宿主有机体的细胞中提取可溶性蛋白的步骤。此步骤可确保所有染色质未结合的TONSL、TONSL ARD或其功能同源物从所述宿主有机体的细胞中提取出来。提取可溶性蛋白后，所有剩余的TONSL、TONSL ARD或其功能同源物可被认为是染色质结合的TONSL、TONSL ARD或其功能同源物。

可以以任何常规方式进行可溶性蛋白的提取，例如，通过细胞膜透化，例如通过使用去污剂，任选地随后进行一个或更多洗涤步骤。任何去污剂都可以用于透化，例如，Triton(例如Triton X-100)、NP-40、皂苷、Tween(例如Tween-20)、洋地黄皂苷或Leucoperm。在检测之前，提取后，可固定细胞。固定试剂是本领域众所周知的并且包括例如醛，例如甲醛、多聚甲醛或戊二醛。

在本文实施例5中描述了一种用于确定染色质结合的TONSL、TONSL ARD或其功能同源物的有用方法。用于确定染色质结合的TONSL、TONSL ARD或其功能同源物的其它有用方法描述于章节“用于小分子抑制剂杀死癌细胞功效的高通量(HT)生物分析”中，例如该章节的分析1和2中。

确定TONSL抑制作用的方法也可以是本文“验证本发明小分子的分析”章节中所述方法中的任何一种，例如任何分析1、2、3或4。因此，这些方法不仅可用于验证小分子，通常也可用于确定化合物的TONSL抑制作用。

在一个实施方案方法中，方法包括以下步骤：

a)提供组蛋白H4或其片段，其至少包含SEQ ID NO：23的氨基酸17至20，例如至少氨基酸12至23，例如至少氨基酸9至25，例如至少氨基酸14至33，其中所述组蛋白H4或其片段任选地可连接至可检测标签；

b)提供SEQ ID NO：16的TONSL、由SEQ ID NO：16的氨基酸512至692组成的TONSLARD、或与SEQ ID NO：16的氨基酸512至692共享至少90％序列同一性的前述任一项的功能同源物；

c)在推定的TONSL抑制剂存在的情况下，用所述TONSL、TONSL ARD或其功能同源物孵育所述组蛋白H4或其片段；

d)确定所述组蛋白H4或其片段与所述TONSL、TONSL ARD或其功能同源物之间是否结合；

其中，所述组蛋白H4或其片段与所述TONSL、TONSL ARD或其功能同源物减少的结合指示着所述推定的TONSL抑制剂能够抑制TONSL。

所述结合的减少尤其是减少至不存在所述推定抑制剂时观察到的所述组蛋白H4或其片段与所述TONSL、TONSL ARD或其功能同源物结合的最多50％，例如减少至小于30％，例如减少至小于20％，例如减少至小于10％。在一个实施方案中，减少是在所述组蛋白H4或其片段与所述TONSL、TONSL ARD或其功能同源物之间没有可检测的结合。

用于小分子抑制剂杀死癌细胞功效的高通量(HT)生物分析

TONSL损失导致复制相关DNA损伤的积累并使细胞对喜树碱(CPT)诱导的DNA损伤敏感(Duro等，2010 Mol Cell 40：619；O′Donnell等，2010 Mol Cel 40：619；O′Connell等，2010 Mol Cell 40：645；Piwko等，EMBO J 2010 29：4210)。此外，已经确定，HR的损失会使细胞对PARP抑制敏感。因此，预测TONSL抑制单独或与CPT样药物或PARP抑制剂组合对癌细胞有毒性。

主要成分：

a)癌细胞系和原代细胞的组(panel)，

b)喜树碱、PARP抑制剂、靶向DNA复制的常规化疗药物。

HT分析原理：

i.通过筛选癌细胞系和原代细胞的组，分析TONSL抑制剂的细胞毒性。

ii.在杀死癌细胞方面分析TONSL抑制剂和其它癌症药物(常规化学疗法、CPT和衍生物、PARP抑制剂)的协同作用。

典型的细胞毒性分析：

以任何HT形式(例如96或384板)，以剂量和时间依赖性方式培养细胞，并用小分子抑制剂进行孵育。使用任何适合的可用方法，例如使用比色分析或HT显微镜，分析对细胞增殖和细胞死亡的影响。

用于药物测试的体内模型

TONSL抑制剂的临床前动物测试，目的在于开启临床试验。

本发明的小分子

本发明的小分子可用于破坏同源重组。这些还可以涉及短的线性和环状肽以及肽模拟物，其低分子量允许细胞渗透性。

通过使用现有应用和上述概念分析证明中提供的结构数据，本发明人已经鉴定了药效团靶向分子，包括小分子、共价连接的小分子、肽或环状对应物，其干扰TONSL锚蛋白重复表面上相邻的组蛋白H4H18和H4K20结合口袋。

小分子抑制剂的结构特性

本发明涉及小分子抑制剂，其靶向被组蛋白H4尾所占据的TONSL ARD的构象空间，所述组蛋白H4尾包含残基K12-R23，其中所述抑制剂通过直接竞争或通过变构破坏结合口袋来破坏H4尾K12-R23和TONSL ARD的结合。

在一个实施方案中，本发明涉及一种小分子，其靶向或干扰被组蛋白H4尾所占据的TONSL ARD的构象空间，所述组蛋白H4尾包含残基K12-R23，其中所述小分子通过直接竞争或通过变构破坏结合口袋来阻止或破坏H4尾K12-R23和TONSL ARD的结合。

正如技术人员所知晓，显然结合TONSL ARD上His18结合口袋或Lys20结合口袋或两种口袋的小分子破坏H4和TONSL之间的相互作用。

在一个实施方案中，本发明涉及一种小分子，其通过分子间氢键、静电和/或范德华相互作用而靶向跨越残基Lys12至Arg23的H4尾。

在更优选的实施方案中，本发明涉及一种小分子，其中所述分子靶向跨越H4的Lys12-Gly13-Gly14-Ala15片段的分子间接触。

在另一个优选的实施方案中，本发明涉及一种小分子，其中所述分子靶向H4的残基Gly13、Gly14和Ala15与ARD的残基Asn507、Cys508、Trp641、Tyr645和Leu649之间的疏水相互作用。

在一个实施方案中，本发明涉及一种小分子，其中所述分子靶向H4 Gly14的主链O和ARD Trp641的Nε1之间、以及H4 Ala15的主链N与ARD Tyr645的Oη之间的氢键。

在一个实施方案中，本发明涉及一种小分子，其中所述分子靶向H4 Lys16的主链O与ARD Asn571的Nδ2形成的氢键。

在一个实施方案中，本发明涉及一种小分子，其中所述分子靶向和/或结合被H4Arg17侧链占据的TONSL ARD构象空间，所述侧链叠加在ARD Tyr572和Cys608侧链上，而其Nη1原子与ARD Asn571的主链O和Oδ1形成两个氢键。因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种化合物，例如能够结合ARD Tyr572和Cys608的侧链并与ARD Asn571主链O和Oδ1形成氢键的TONSL抑制剂。

在一个实施方案中，本发明涉及一种小分子，其中所述分子靶向和/或结合被H4H18侧链占据的TONSL ARD构象空间，所述侧链穿入由四个严格保守残基(Trp563、Glu568、Asn571和Asp604)形成衬底(lined)的口袋，并位于ARD的His567上。因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种化合物，例如能够与TONSL ARD的Trp563、Glu568、Asn571、Asp604和His567结合的TONSL抑制剂。

在一个实施方案中，本发明涉及一种小分子，其中所述分子靶向和/或结合被H4His18侧链占据的TONSL ARD构象空间，所述侧链叠加在Trp563和Asn571之间，并与ARD的Glu568和Asp604形成氢键。因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种化合物，例如能够与Trp563和Asn571结合并与TONSL ARD的Glu568和Asp604形成氢键的TONSL抑制剂。

在一个实施方案中，本发明涉及一种小分子，其中所述分子靶向和/或结合被H4Arg19的主链O占据的TONSL ARD构象空间，所述主链O与Trp563的Nε1形成氢键，其侧链与ARD的Cys561和Gly595形成接触。因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种化合物，例如能够与Trp563的Nε1以及TONSL ARD的Cys561和Gly595结合的TONSL抑制剂。

在一个实施方案中，本发明涉及一种小分子，其中所述分子靶向和/或结合被H4Lys20残基占据的TONSL ARD构象空间，所述H4 Lys20残基结合在ARD上临近H4 His18结合口袋的酸性表面口袋内。

在一个实施方案中，本发明涉及一种小分子，其中所述分子靶向和/或结合被H4Lys20侧链占据的TONSL ARD构象空间，所述侧链与Met528的侧链相互作用，并与ARD的Trp563的边缘相接触，而H4 Lys20的主链原子与ARD的Cys561相对。因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种化合物，例如能够结合TONSL ARD的Met528和Trp563和Cys561侧链的TONSL抑制剂。

在一个实施方案中，本发明涉及一种小分子，其中所述分子靶向和/或结合被H4Lys20的Nζ原子占据的TONSL ARD构象空间，所述Nζ原子与ARD严格保守的残基Glu530、Asp559和Glu568的侧链形成三个强氢键其在规则的三角形样排布(alignment)中围绕H4 Lys20。因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种化合物，例如能够与TONSL ARD的Glu530、Asp559和Glu568的侧链形成氢键的TONSL抑制剂。

在一个实施方案中，本发明涉及一种小分子，其中所述分子靶向跨越H4的Val21-Leu22-Arg23片段的分子间接触，所述接触包括H4 Val21的侧链与ARD的Tyr560和Cys561之间的接触，而H4 Leu22与ARD的Asp527和Met528相互作用。

在一个实施方案中，本发明涉及一种小分子，其中所述分子靶向和/或结合被H4Arg23的主链N占据的TONSL ARD构象空间，所述主链N与ARD的Asp527的主链O形成氢键，而侧链与ARD的Tyr560的侧链相对。因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种化合物，例如能够与ARD的Asp527的主链O形成氢键同时与TONSL ARD的Tyr560的侧链结合的TONSL抑制剂。

在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的小分子，其能够阻断蛋白中的组蛋白识别结构域，所述蛋白选自TONSL、BARD1和ANKRD11。

通常，通过SCHRODINGER软件包鉴定并验证这些分子，以鉴定和验证靶向TONSL锚蛋白重复表面上相邻组蛋白H4H18和H4K20结合口袋的共价连接的小分子药物。

与BARD1的关系

包含组蛋白结合表面的TONSL ARD结构域的拓扑结构，与BARD1的ARD高度相似(图23)。BARD1是BRCA1的专属结合伴侣，并且对于BRCA1的大多数细胞和肿瘤抑制功能是必需的。参与组蛋白H4结合的关键残基在BARD1的ARD中是保守的。此外，对于组蛋白H4结合(图10、12)、和将TONSL募集到染色质(图21)、和DNA损伤位点(图22)以及活力(图)所必需的TONSL ARD的N571残基对应于BARD1 N470S癌症突变(图23)。因此，预测针对TONSL ARD的小分子抑制剂也靶向BARD1ARD结构域。鉴于TONSL和BARD1在同一DNA修复途径中发挥作用，根据我们的发明而设计的靶向TONSL和BARD ARD的小分子抑制剂，和仅特异于TONSL ARD的抑制剂相比，将可预测地更有效地抑制HR并显示更有效的抗癌活性。

通常

应当理解的是，与根据本发明的化合物有关的以上讨论的任何特征和/或方面，类似地适用于本文所述的晶体结构和/或方法。

本发明的晶体结构的原子坐标变化，例如至可互换使用。

以下提供的序列数据、结构、图和实施例用于说明本发明。它们旨在说明性的，不应被解释为以任何方式进行限制。

附图说明

图1

TONSL-ARD-MCM2 HBD-H3-H4四聚体复合物的总体结构视图，显示了两种TONSLARD、两种MCM2 HBD和H3-H4四聚体的相对位置。

图2

TONSL ARD由四个ANK重复组成，并使用其延伸的凹面来靶向跨越残基12至23的H4尾。

图3

TONSL ARD和H4尾(12-23)之间的分子间相互作用。

图4

ARD的静电势表面，其显示H4尾的酸性凹面结合位点。

图5

H4 Arg 17与TONSL ARD的分子间相互作用的突出显示。

图6

H4 His18与TONSL ARD的分子间相互作用的突出显示。

图7

H4 Lys20与TONSL ARD的分子间相互作用的突出显示。

图8

TONSL ARD与H4尾区残基12-15相互作用的分子细节。

图9

TONSL ARD与H4尾区残基21-23的相互作用的分子细节。

图10

用重组GST-TONSL ARD野生型或指定的突变体进行的重组组蛋白H3-H4的体外拉下实验。

图11

瞬时转染入GFP-TONSL U-2-OS细胞中的HA-SNAP-H4野生型(WT)和指定的突变体的免疫沉淀。

图12

来自瞬时转染的HeLa S3细胞的GFP-TONSL WT或指定的突变体的免疫沉淀。

图13

TONSL ARD与具有指定修饰的H4尾肽进行结合的ITC分析。

图14

用生物素化的H4尾肽进行的重组TONSL ARD体外拉下实验。

图15

用生物素化的H4尾肽对来自细胞提取物的GFP-TONSL进行体内拉下实验。

图16

用(在K20处未修饰的或二甲基化的)生物素化重组单核小体对重组TONSL-MMS22L异源二聚体进行的体外拉下实验。*表示非特异性条带。(底部)相对于组蛋白定量的TONSL结合。未配对t检验：*，P＜0.05；显示了6个独立实验的平均值；须(whiskers)，异常值。

图17

用生物素化的H4尾肽对来自细胞提取物的GFP-TONSL进行拉下实验。

图18

从GFP-TONSL U-2-OS细胞的可溶染色质中免疫沉淀GFP-TONSL。

图19

从GFP-TONSL U-2-OS细胞的可溶染色质中免疫沉淀GFP-TONSL。

图20

在预提取的U-2-OS成纤维细胞中TONSL的高含量定量成像。图显示用对照或TONSLsiRNA处理的细胞中总TONSL和DAPI强度，证实了TONSL抗体的特异性。点表示测量的单个细胞核的强度。

图21

TONSL募集至染色质需要识别H4K20me0。(a)对于GFP-TONSL WT或N571A条件适合(conditional for)的U-2-OS细胞进行直接固定或预提取以去除可溶性蛋白。比例尺，20μm。(b)(左)通过细胞分级分析GFP-TONSL WT和突变体。(右)相对于总GFP-TONSL通过western印迹对染色质结合的馏分(C)进行定量(误差条，SD；n≥3)。S-可溶馏分，C-染色质结合的馏分。用MemCode(ThermoFisher)进行染色用于控制蛋白的加载。

图22

TONSL募集至DNA损伤需要识别H4K20me0。(上图)对于GFP-TONSL WT或N571A条件适合的U-2-OS细胞经激光照射，并进行53BP1和细胞周期素B共染色以分别标记DNA损伤并鉴定S/G2细胞。全箭头，GFP-TONSL募集；空箭头，没有募集。比例尺10μm。(底部)GFP-TONSL细胞的定量显示募集至激光轨道(误差条，SD；n＝3)。

图23

TONSL ARD和BARD1 ARD的叠加结构。参与TONSL ARD与H4尾相互作用的主要残基与BARD1 ARD的相应残基相比较。两个ARD显示高度相似的拓扑结构和组蛋白结合表面的保守性。

图24

在诱导型细胞系中染色质结合的GFP-TONSL与MCM2(A)和EdU(B)的共定位分析。细胞用EdU进行脉冲(左)或在EdU的连续存在下释放到S期(右)。通过去卷积显微镜分析共定位和单个细胞中皮尔森系数的测量(n＞15，两个独立的实验)。代表性图像。

图25

贯穿整个细胞周期分析GFP-TONSL WT和ARD突变体的染色质结合(2个实验的代表)。

图26

如所示，经CPT(3小时，1μM CPT)处理的预提取诱导型U-2-OS细胞中通过高含量成像来分析GFP-TONSL ARD WT和突变体的染色质结合(3个实验的代表)。

图27

A)用Flag-HA-MCM2 WT或分离自可溶性染色质的MMS22L组蛋白结合突变体(Y81A、Y90A)进行TONSL-MMS22L的免疫共沉淀分析，所述染色质来自HU处理的细胞(2小时，3mM)(代表2个实验)。

B)如所示，通过NCC分析GFPTONSL ARD WT和突变体募集至CPT攻毒的复制叉(CPT，1μM)。(-)，没有生物素-dUTP。

图28和29

在TONSL耗竭的(图28)和对照细胞(图29)中，通过四环素诱导GFP-TONSL表达时的集落形成。如所示，将细胞进行siRNA处理，并通过四环素(tet)诱导以表达siRNA抗性GFP-TONSL ARD WT和突变体，并用CPT(24小时，50nM)处理。通过TONSL耗竭细胞的集落形成效率确定援助(rescue)效率(A)。通过对照siRNA处理的细胞的集落形成效率来确定TONSL ARD突变体的显性负作用(B)。数据点表示按照技术上一式三份进行的两种不同的细胞浓度，其来自两个或四个(28，左图)独立生物学重复。

图30

A)如图4f所示，在TONSL耗竭的和对照细胞中由四环素诱导GFP-TONSL表达时的集落形成，但是包括额外的ARD突变体。按照技术上一式三份进行的两种不同的细胞浓度，其来自两个(E568A、D559A)或四个(WT、N571A)独立的生物学重复。B)代表在包括CPT处理和未处理细胞的单一组(panel)中来自图4f的互补分析。这表明TONSL ARD突变体的毒性与用CPT对表达WT TONSL的细胞进行处理的毒性相当。

图31

按照图29处理细胞，并使用EdU和Dapi(左)和53BP1灶(右)分析细胞周期分布。误差条，平均值和S.D(技术上一式三份的四个(左)或五个(右)生物重复)。

图32

MMS22L的染色质结合。通过western印迹分析染色质结合的馏分(B)并相对于总MMS22L进行定量(A)(未处理：误差条，SD，n＝3；CPT：误差条，均值范围，n＝2)。

图33

用GST-TONSL ARD WT或指定的突变体进行重组组蛋白H3-H4和MCM组蛋白结合结构域(HBD)的拉下实验。

图34

TONSL ARD WT和指定ARD突变体的圆二色性(CD)分析。指定的ARD点突变不会使ARD的整体结构不稳定。

图35

TONSL酸性延伸段和ARD(氨基酸450-692)与H3K9me1(氨基酸1-21)和H4(氨基酸9-25)的ITC分析。

图36

MOF耗竭细胞中的TONSL染色质结合分析。通过预提取细胞的内源性TONSL染色进行高含量成像，对染色质结合的TONSL进行定量。显示平均TONSL强度。A.U.，任意单位。通过western印迹证实敲降效率和对组蛋白修饰的预期作用(2个实验的代表)。

图37

在同步TIG3细胞中通过质谱法测量的H4K20甲基化水平。在释放后用HU(3mM)或CPT(1μM)处理细胞3-6小时或不处理(6小时)(误差条，范围；n＝2)。

具体实施方式

实施例

实施例1-晶体结构

蛋白产生：除非另有说明，本文实施例所述所有蛋白在BL21(DE3)-RIL细胞株(Stratagene)中表达。

将GST标记的TONSL ARD及其突变体(包括E530A、D559A、W563A、E568A、N571A和D604A)克隆到pGEX-6P-1载体(GE Healthcare)。首先使用谷胱甘肽琼脂糖4B纯化表达的蛋白，然后通过凝胶过滤步骤进一步纯化。在一些情况下，在凝胶过滤步骤之前用3C蛋白酶除去GST标签。为了纯化GST-H3尾和GST-H4尾蛋白，将人组蛋白H3片段1-59和H4片段1-31分别克隆到pGEX-6P-1载体中。按照相同方式，表达和纯化蛋白。

为了产生重组全长TONSL-MMS22L异源二聚体，将编码全长MMS22L的序列在5′端融合至MBP标签在3′端融合至10×His标签。编码全长TONSL的序列在5′端融合至GST标签。将MMS22L和TONSL构建体都克隆到pFastBac1载体中。根据制造商的推荐(Invitrogen)，通过共同感染两种重组杆状病毒，在Sf9细胞中表达复合物。从Sf9细胞中提取蛋白并如前面针对Sgs1所描述的那样类似地进行纯化。简而言之，在直链淀粉树脂上纯化复合物，然后用PreScission蛋白酶先后切割MBP和GST标签。然后使用Ni-NTA亲和树脂进一步纯化异源二聚体。用300 mM NaCl缓冲液进行洗涤。

用于结晶：通过四甘氨酸接头(G₄接头)将人TONSL锚蛋白重复结构域(ARD，残基512-692)和MCM2组蛋白结合结构域(HBD，残基61-130)共价连接至单一表达盒(SEQ ID NO：15)。

将MCM2 HBD-G₄-TONSL ARD表达盒与N端His6-SUMO标签一起克隆入经修饰的RSFDuet-1载体(Novagen)中。在BL21(DE3)-RIL细胞株(Stratagene)中，所得质粒与含有人组蛋白基因H3.3(57-135)和H4(1-102)的pETDuet质粒共表达。

大肠杆菌在37℃使用含有50μg/ml卡那霉素、100μg/ml氨苄青霉素和34μg/ml氯霉素的LB培养基进行培养。

当大肠杆菌达到OD₆₀₀约1.0的细胞密度时，将0.5mM IPTG加入LB培养基，将其进一步在20℃过夜孵育。

表达的蛋白复合物首先在HisTrap HP柱(GE Healthcare)上纯化。通过使用Ulp1(SUMO蛋白酶)去除His6-SUMO标签后，在HiLoad 16/600 Superdex 200柱(GE Healthcare)上在20mM Tris pH 7.5和500mM NaCl的缓冲液中进一步纯化蛋白复合物。

纯化的G4接头复合物MCM2 HBD-G₄-TONSL ARD盒-H3.3(57-135)-H4(1-102)复合物(本文称为TONSL ARD-MCM2 HBD-H3-H4四聚体复合物)在20mM Tris pH7.5和1M NaCl的缓冲液中以23mg ml^-1的浓度，在100mM MES pH 5.6-6.6、5-10％异丙醇的条件下，使用悬滴蒸汽扩散方法在20℃结晶。在液氮快速冷冻之前，所有晶体都浸在补充有25％甘油的母液制成的冷冻保护剂中。

在24-ID-C/E NE-CAT(Advanced Photo Source，阿贡国家实验室)以收集TONSL ARD-MCM2 HBD-H3-H4四聚体复合物的数据集。数据使用HKL 2000程序进行处理。用我们以前的MCM2 HBD-H3-H4四聚体复合物的结构作为搜索模型，在PHASE中通过分子置换法解析复合物的初始结构，并手工修正，用Coot进行建立。使用PHENIX将此复合物的最终结构修正到分辨率。表1总结了数据收集和结构修正的统计。

表1.数据收集和修正统计

^a最高分辨率层(shell)如括号中所示。

^b在PHENIX中使用MolProbity进行计算。

在下面的附件1中描述获得的结构数据。

各蛋白MCM2 HBD-TONSL ARD盒、H3和H4的一个分子存在于不对称单元中。晶体学对称操作重构H3-H4的四聚体，因此得到了利用两个拷贝MCM2 HBD-TONSL ARD盒与H3-H4四聚体形成的完整复合物(命名为TONSL ARD-MCM2 HBD-H3-H4四聚体复合物)，这与我们先前的发现一致，即MCM2 HBD在生理条件下结合H3-H4四聚体并稳定H3-H4四聚体。TONSL ARD-MCM2 HBD-H3-H4四聚体复合物与我们先前的MCM2HBD-H3-H4复合物结构高度相似，其中一对MCM2 HBD包裹在H3-H4四聚体的外表面，而两个TONSL ARD与每个H4尾相互作用。TONSLARD不与MCM2 HBD形成分子间相互作用，这与H3-H4四聚体在细胞中桥接TONSL和MCM2之间相互作用是一致的。TONSL ARD与H4尾(残基12-23)的片段形成广泛接触，但与H3-H4四聚体的核仅显示最小程度的接触。TONSL ARD可以被建模为在核小体没有空间位阻(clash)的情况下结合H4尾，并且保守的正电片与核小体DNA相互作用，表明了TONSL ARD和H4尾之间的广泛相互作用可以解释TONSL连同MCM2一起与可溶性非核小体组蛋白H3-H4的结合，也可以与核小体中的H3-H4结合。

锚蛋白(ANK)重复折叠包含两个反平行螺旋，分别命名为内螺旋和外螺旋，其后是命名为指的发夹环。TONSL ARD由四个ANK重复组成，其中三个采用规范的ANK重复折叠(ANK1-3)，而剩余的一个是非典型的封端(capping)重复(ANK4)。除了内指1-3之外，TONSLARD在ANK1之前还包含一个额外的环，命名为指0。TONSL ARD使用其延伸的凹面(由内螺旋(αA1、αB1、αC1和αD1)和指0-4组成)与伸展的H4尾β-股样构象形成广泛的分子间接触。值得注意的是，构成TONSL ARD的H4尾结合表面的18个残基中有15个是高度保守的。TONSL ARD主要通过分子间氢键、静电和范德华相互作用而靶向跨越残基Lys12至Arg23的H4尾。

实施例2-通过等温滴定量热法(ITC)确定TONSL ARD与组蛋白H4肽的结合

在25℃于微型ITC 200量热计上进行所有ITC滴定。组蛋白H4(残基9-25)的肽及其修饰肽K16ac(在Lys16上乙酰化)、H18W(His18突变为Trp18)、H4K20me1(在Lys20上单甲基化)和H4K20me2(在Lys20上的二甲基化)和组蛋白H3(1-19)K9me1肽(Lys9上的单甲基化)全部在塔夫茨大学核心机构(Tufts University Core Facility)上合成。通过将17次连续的2.2μl肽(1.41mM，在20mM Tris pH7.5和0.5M NaCl缓冲液中)注射到200μl TONSL ARD溶液(相同缓冲液中145μM)中测量反应的放热，间隔为150秒。用Microcal Origin软件处理数据，曲线拟合为单一大小的结合模型。

实施例3-体外分析重组TONSL ARD与组蛋白H4肽的结合

于-80℃，将纯化的重组TONSL ARD(残基512-692)以400μM浓度保存于1M NaCl、20mM Tris HCl pH 7.5。对于每次拉下实验，将400 pmol ARD原液(1μl，400μM)用99μl结合缓冲液(150mM NaCl、50mM Tris HCl pH 7.5、5％甘油、0.25％NP-40、0.2 mM EDTA、0.5mMDTT、0.2mM PMSF、1mM亮抑蛋白酶肽、1mM胃蛋白酶抑制剂)进行稀释。将ARD输入材料按比例调节以适应所进行的拉下实验的数目。对于每个拉下实验，具有C端生物素酰-赖氨酸残基或生物素(2.5μl，400μM)的跨越残基14-33的组蛋白H4肽(JPT Peptide TechnologiesGmbH)(2.5μl，250μM)加入到1.1ml含有100μl ARD输入材料的结合缓冲液，在4℃旋转过夜孵育混合物。第二天，对于每个拉下实验，在结合缓冲液(3×500μl)中洗涤25μl MyOne链霉亲和素C1珠(Life Technologies)，除去珠的最终洗涤物。将ARD/肽或ARD/生物素混合物加入等份的预洗MyOne链霉亲和素C1珠中，并在4℃旋转孵育3小时。最后，洗涤珠(2×300μl和1×200μl的300mM NaCl、50mM Tris HCl pH 7.5、5％甘油、0.25％NP-40、0.2mM EDTA、0.5mM DTT、0.2mM PMSF、1mM亮抑蛋白酶肽、1mM胃蛋白酶抑制剂)，在NuPAGE 4-12％凝胶上SDS PAGE分离蛋白后，通过考马斯染色观察拉下的材料。

实施例4-在细胞提取物中测量GFP-TONSL与组蛋白H4K20me0肽的结合

对于去污剂-可溶提取物(NP40/NaCl)，用冷PBS洗涤表达GFP-TONSL WT或ARD突变体的U-2-OS细胞，刮下，并在冰上在补充有曲古霉素A(TSA)和蛋白酶和磷酸酶抑制剂的HS缓冲液(5mM氟化钠、10mM μ-甘油磷酸盐、0.2mM钒酸钠、10μg/ml亮抑蛋白酶肽、10μg/ml胃蛋白酶抑制剂、0.1mM PMSF，Sigma)中孵育15分钟。在4℃以16.000g离心15分钟后，收集上清液。为了从细胞提取物拉下，将MyOne T1珠在高盐(HS；300mM NaCl、0.5％NP40、TrisHCl、EDTA、5％甘油)缓冲液中与1μg生物素化组蛋白肽进行O/N孵育，随后用PBS洗涤2次。将1mg来自GFP-TONSL U-2-OS细胞的NP40/NaCl提取物加入珠中，并在4℃旋转孵育2小时。然后用HS缓冲液洗涤珠5次，在4℃下旋转2分钟。洗涤后，将珠重悬于1XLSB并煮沸10分钟。将洗脱的蛋白上样于4-12％Bis-Tris NuPage凝胶(LifeTechnologies)。然后，以20V通过O/N湿转移将蛋白转移到0.2μm硝化纤维素膜上，并通过western印迹检测。

实施例5-通过HT显微镜对人细胞中染色质结合的TONSL进行定量

在6孔板上培养U-2-OS和TIG3细胞(分析前1天接种1×10⁵个细胞/孔)。为了仅分析与染色质结合的TONSL，用CSK缓冲液0.5％Triton(CSK缓冲液：10mM PIPES pH 7、100mMNaCl、300mM蔗糖、3mM MgCl2加上蛋白酶和磷酸酶抑制剂、1mM DTT、10μg/ml亮抑蛋白酶肽、10μg/ml胃蛋白酶抑制剂、0.1mM PMSF、0.2mM钒酸钠、5mM氟化钠、10mMβ-甘油磷酸酯)在冰上孵育5分钟来移除(预提取)可溶性蛋白。然后用CSK和PBS冲洗细胞，然后在4％甲醛中固定10分钟并用TONSL抗体染色。

为了检测，用含有5％BSA和0.1％Tween20的PBS封闭细胞1小时，并与TONSL抗体(Sigma，参考号HPA0244679)在4℃过夜孵育(在封闭缓冲液中为1∶400)。用含有5％BSA和0.1％Tween 20的PBS洗涤3次后，应用抗兔-Alexa488(LifeTechnologies 1∶1000，在封闭缓冲液中)，孵育30分钟。细胞洗涤3次，用DAPI(Sigma)复染DNA。在ScanR高含量成像系统(Olympus)上采集图像并使用ScanR软件分析。使用特定siRNA(O′Donnell等，2010 Mol Cel40：619，由Sigma合成)，以100nM浓度，持续30小时，相对于针对TONSL耗竭的细胞来定量TONSL相对荧光强度。

实施例6

鉴于TONSL-MMS22L在与ASF1和MCM2的预沉积(pre-deposition)复合物中和组蛋白结合，TONSL-MMS22L与新组蛋白一起上样到复制中的DNA。本文显示，在新生染色质中，在H4K20处新组蛋白完全未甲基化(98％H4K20me0)，而旧的循环组蛋白在H4K20处几乎完全甲基化(me1，7％；me2，88％；me3，2％)。在G2/M晚期，新组蛋白被甲基化，使G1染色质缺乏H4K20me0。这将新组蛋白上的H4K20me0鉴定为复制后染色质的标记(signature)，意味着TONSL-MMS22L可以在复制叉和姐妹染色单体上结合新组蛋白上的H4尾，直到G2/M晚期。确认这一预测，S期染色质上积累的TONSL在G2细胞的群体中保持和染色质的结合，并在G1中从染色质排除(图20)。为了区分复制前和复制后染色质，我们用EdU标记正在复制的DNA(脉冲以标记正在进行的复制，连续标记以鉴定复制后染色质)，并用MCM2标记复制前染色质，并分析了与TONSL的共定位。TONSL染色与MCM2相互排斥(图24A)，但在极早期S期与EdU脉冲标记共定位，并在整个S期与复制的DNA(连续EdU标记)共定位(图24B)。TONSL存在于整个S期正在进行的DNA复制的位点，但共定位程度在中/晚S期下降(图24B，左图)，这与TONSL与复制后染色质的结合一致，也晚于叉通过(图24B，右图)。TONSL ARD的突变废除了TONSL至染色质的募集，包括DNA复制位点(图25)。总之，这表明TONSL通过ARD识别新组蛋白上的H4K20me0被募集到复制叉和复制后染色质上。TONSL ARD识别H4尾是结合复制后染色质以及募集受损叉和DNA损伤所需的。

在复制毒物如喜树碱(CPT)和羟基脲(HU)存在下，TONSL ARD的突变也消除了染色质结合(图26)和募集至复制叉(图27A和B)。此外，ARD突变阻止TONSL在位点特异性DSB(图28)和微激光产生的DNA损伤中的积累。如所预期的，与细胞周期标记物的共染色证实TONSL仅在S和G2细胞中募集到DNA修复位点。H4K20me0结合是TONSL在受损叉和复制后染色质的DNA损伤处积累所需的。然而，这不是由于H4K20me0的增加，这表明在染色质分解和/或与修复因子相互作用时暴露H4尾有助于修复位点处TONSL-MMS22L的累积。与后者一致，MMS22L与Rad51的相互作用可以稳定攻毒叉上的复合物(P.Cejka和M.Peter，私人交流)。我们的数据认为，这在H4K20结合之后(图26至28)。在互补分析中，存在和不存在CPT的情况下，TONSLWT部分挽救了TONSL耗竭细胞的活力(图28、图30A和B)，而TONSL ARD突变体是高度毒性的(图28、图30A和B)。在对照细胞中，TONSL ARD突变体也降低了活力并引起G2/M停滞，并伴有复制相关DNA损伤(图29和图31)。此外，TONSL ARD突变体滴定使MMS22L远离染色质，这解释了模拟TONSL-MMS22L耗竭的显性负表型(图32A和B)。总的来说，这表明识别H4K20me0是TONSL-MMS22L在保护基因组稳定性中发挥功能的核心。

通过克隆形成分析法，在存在或不存在CPT的情况下，使用表达siRNA抗性GFP-TONSL WT或ARD突变体(D559A、E568A、N571A)的诱导型U2OS细胞，来分析细胞活力(参见下文实施例8来了解关于分析的细节)。上述结果表明GFP-TONSL WT可部分补偿TONSL耗竭细胞的生长缺陷和CPT敏感性，而GFP-TONSL ARD突变体的表达进一步损害细胞活力和CPT存活。此外，表明GFP-TONSL ARD突变体在对照细胞中的表达对细胞生长具有显著负面影响。

在表达GFP-TONSL ARD突变体的细胞中，确定了基因组不稳定性标记物53BP1的积聚和G2/M中的细胞周期停滞。诱导型U2OS细胞经24小时诱导而表达抗性GFP-TONSL WT或ARD突变体(D559A、E568A、N571A)，然后固定，并在额外24小时后进行53BP1和EdU染色。通过高通量显微镜获取图像。这表明TONSL ARD突变体的表达表型模拟了TONSL/MMS22L的耗竭。因此，这些突变体可用于测试TONSL抑制剂在各种疾病模型中的作用。在CPT缺失和存在的情况下，在表达GFP-TONSL ARD突变体的细胞中，已证实的MMS20L远离染色质的滴定，可解释为何TONSL ARD的表达能够表型模拟TONSL/MMS22L的耗竭。

已显示，复制后染色质具有区别性的组蛋白修饰标记(signature)，称为TONSL-MMS22L效应蛋白。这为了解DNA修复和其它染色体处理如何直接关联基因组座的复制状态开辟了新的途径。有趣的是，是新组蛋白使得复制后染色质变得与众不同。据所述，通过与MCM2和ASF1形成预沉积复合物，TONSL-MMS22L被递送至具有新组蛋白的新生染色质。因此TONSL可能具有组蛋白分子伴侣和组蛋白识别因子的双重功能。该结构工作提出，TONSL通过隔离H4尾以阻止在H3-H4沉积期间与DNA的假接触而在组蛋白分子伴侣样能力中起作用。此外，TONSL ARD可以通过阻止H4尾与相邻核小体上H2A-H2B酸性片(patch)的结合来抵消染色质压实(compaction)。因此，TONSL通过结合可溶性组蛋白和核小体组蛋白改变了我们对组蛋白伴侣的感知。在作为组蛋白识别因子(reader)的功能当中，TONSL通过H4K20me0将MMS22L定位于复制后染色质，并允许TONSL-MMS22L在受损叉和DNA损伤处积累。我们设想H4K20me0作为亲和性的阱而发挥作用，使得TONSL-MMS22L随时可用于支持HR期间的Rad51加载。这为了解H4K20在DNA修复中的作用提供了新的角度，补充了H4K20me1/2在募集53BP1来促进NHEJ竞争BRCA1-BARD1中众所周知的作用。在复制后染色质中，旧组蛋白上的H4K20me1/2将支持53BP1募集。新组蛋白上的H4K20me0是否也影响DNA修复途径的选择将是未来研究的兴趣所在。值得注意的是，TONSL ARD的结构(包括组蛋白结合表面)与BARD1ARD高度相似，BARD1 ARD是BRCA1肿瘤抑制功能和HR所需的。报道了在癌症中TONSL ARD中的多重突变(C608G、COSM4879909；P557S、COSM4565032；E597K、COSM3382163)，并且对H4结合至关重要的N571残基对应于BARD1 N470S癌症突变。这突出表明，H4K20me0识别的肿瘤抑制功能及其为靶向癌症治疗带来的可能性，应在未来探索。

TONSL ARD WT或突变体稳定性的圆二色性分析(图34)显示，所示的ARD点突变不会使ARD的整体结构不稳定。TONSL酸性延伸和ARD(450-692)以及H4尾(9-25)和H3K9me1(1-21)肽的ITC分析(图35)显示TONSL(450-692)不结合H3K9me1，但识别H4肽。

用于免疫荧光、显微镜和激光微辐射的方法在下面实施例7中描述。

实施例7

免疫荧光、显微镜和激光微辐射

U-2-OS、HeLa S3和TIG-3细胞培养于含有10％FBS(Hyclone)和1％青霉素/链霉素以及用于筛选的药物的DMEM(Gibco)中。描述了用于siRNA抗性GFP-TONSL的构建体(O′Donnell等人，Mol Cell 40，619-631(2010))，通过定点诱变在该构建体中引入ARD突变。根据制造商的方案，通过用Lipofectamine 2000转染pcDNA5/FRT/TO-GFP-TONSL质粒，在Flp-In T-Rex U-2-OS细胞(Invitrogen)中产生GFP-TONSL WT和ARD突变体的诱导型细胞，并用潮霉素(200μg/ml)进行筛选。通过western印迹和免疫荧光进行所有细胞系的鉴定。通过加入1μg/ml四环素24小时诱导GFP-TONSL的表达。通过胸腺嘧啶核苷单阻断法(singlethymidine block)(2mM)使U-2-OS和TIG3细胞同步，并在24□M dCTP存在时释放到S期。为了瞬时表达GFP-TONSL，根据制造商的方案，通过用Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染引入表达质粒，并在转染后24小时收获细胞。根据制造商的方案，用RNAiMax试剂(Invitrogen)进行siRNA转染。

siRNA序列：siSET8#1：5’-GUACGGAGCGCCAUGAAGU-3’；siSET8#2：5’-ACUUCAUGGCGCUCCGUACUU-3’；siMOF#1：5’-GUGAUCCAGUCUCGAGUGA-3’；siMOF#2：5’-GUGAUCCAGUCUCGAGUGA-3’；siTONSL：5’-GAGCUGGACUUAAGCAUGA-3’。本研究中使用的所有细胞系均检测为支原体污染阴性。条件适合GFP-TONSL的U-2-OS细胞生长在玻璃盖玻片上，在4％多聚甲醛(PAF)中直接固定10分钟或在CSK中洗涤，用CSK/0.5％Triton X-100预提取5分钟，用CSK和PBS冲洗，然后在4％PAF中固定10分钟。将盖玻片包埋在含有DAPI的Mowiol包埋剂(Sigma Aldrich)的玻片上。使用40×或60×油浸物镜在DeltaVision系统上收集荧光图像。对于去卷积(deconvolution)显微镜，获取z-叠层(z-stacks)(步长0.2□m)，去卷积，并用SoftWoRX 5.0.0分析。使用SoftWoRX 5.0.0在单个细胞上进行皮尔森系数相关分析。使用Adobe Photoshop CS6调整亮度和对比度。对于高含量定量分析，使用Olympus ScanR高含量显微镜获取荧光图像，并在ScanR分析软件上处理。每个样品分析超过5000个细胞。使用TIBCO Spotfire软件生成图形。对于微辐射实验，在玻璃盖玻片上生长的细胞在4％甲醛中固定15分钟，用含有0.2％Triton X-100的PBS透化5分钟，并在室温下与用DMEM稀释的一抗孵育1小时。用二抗(Alexa Fluor 488、568和647；Life Technologies)染色30分钟后，在含有核染剂DAPI的Vectashield包埋剂(Vector Laboratories)中将盖玻片包埋至玻片上。为了检测DNA复制期间的核苷酸掺入，根据制造商的说明使用EdU-Plus标记试剂盒(Life Technologies)。在配有Plan-Neofluar 40x/1.3油浸物镜的Zeiss-AxioObserverZ1上所安装的LSM-780(卡尔蔡司)上，获取共焦图像。采用LSM-ZEN软件进行图像采集和分析。基本上如所述，进行细胞的激光微辐射。

实施例8

克隆形成分析

用siRNA转染针对GFP-TONSL ARD WT和突变体可诱导的U-2-OS，24小时后用胰蛋白酶消化，并在存在或缺少四环素时以技术上一式三份接种1000或3000细胞。24小时后，洗涤细胞并在新鲜介质中放置12-15天，然后固定并用MeOH/结晶紫染色。通过人工集落计数或通过ImageJ软件定量结晶紫染色并归一化至未诱导的对照，来确定集落形成效率。

实施例9

新生染色质捕获(NCC)

针对贴壁的U-2-OS细胞，调整来自(Alabert等人，Nat Cell Biol 16，281-293(2014))的NCC方案。在b-dUTP标记前5分钟加入CPT(1μM)，并包括在所有步骤中直至固定。将细胞在含有生物素-dUTP的低渗缓冲液(50mM KCl、10mM Hepes)中孵育5分钟，并重新悬浮于新鲜的细胞培养基中持续15分钟。将细胞在1％甲醛中固定15分钟，在PBS中冲洗两次，并在冷室中刮擦收集。在蔗糖缓冲液(0.3M蔗糖、pH 7.9的10mM HEPES-NaOH、1％Triton X-100和2mM MgOAc)中机械分离细胞核。进行28个30秒ON、90秒OFF的循环，在超声缓冲液(10mM HEPES-NaOH pH7.9、100mM NaCl、2mM EDTA pH 8、1mM EGTA pH 8、0.2％SDS、0.1％肌氨酸钠和1mM苯甲磺酰氟)中使用Bioruptor在4℃溶解染色质。通过使用用生物素预孵育的链霉亲和素包被磁珠(MyC1链霉亲和素珠)，预澄清溶解的染色质。接下来，使用链霉亲和素包被的磁珠在4℃过夜纯化b-dUTP标记的染色质。在洗涤缓冲液(10mM HEPES-NaOH pH7.9；200mM NaCl；2mM EDTA pH 8；1mM EGTA pH 8；0.1％SDS；1mM PMSF)中将珠洗涤5次，持续2分钟。在LSB 1X(50mM Tris-HCl pH 6.8，100mM DTT，2％SDS，8％甘油，溴酚蓝)中，将总染色质(输入)和分离的新生染色质在珠上煮沸40分钟，并通过SDS-PAGE分离，以便用于western印记。可用于代替NCC的替代方法是iPOND(Sirbu等人，Nat Protoc 3，559-605(2012))。

实施例10

蛋白-肽复合物的天然MS分析

获得各种肽，包括实施例11、12、13、14和15中描述的肽。如果肽为三氟乙酸盐(TFA盐)的形式，则将其在多聚弱阳离子交换吸附剂(Strata X-CW，Phenomenex，法国萨尔特鲁维尔)上脱盐：干的肽(1-3μmol)溶解于200μL纯水(Sigma-Aldrich，法国里昂)。通过加入1mM氢氧化铵水溶液(由20％浓缩氢氧化铵新鲜制备的溶液)将溶液的pH调节至7-7.5。用1mL甲醇(Sigma-Aldrich，法国里昂)随后用1mL水条件化交换柱。注入溶液，并用500μL纯水将柱子洗涤两次。最后，用2次500μL的20∶80∶5乙腈/水/甲酸混合物通过重力，对肽进行洗脱。通过质谱鉴定含有预期肽的洗脱馏分。将不含TFA的溶液冷冻干燥成白色固体。将固体溶解在300μL纯水中，并将溶液进行第二次冷冻干燥。

通过将300μL纯水加入到所得固体中制备肽的储备溶液，并且通过波长为205nm的UV测量溶液的浓度。使用Nick Anthis在线蛋白参数计算器脚本(http：//nickanthis.com/tools/a205.html)计算相应肽序列的消光系数。在天然条件下以低加速电压(Vc 25V)输注蛋白-肽混合物，通过质谱确认TFA加合物的缺失。

通过使用NAP 5柱(NAP^TM-5，GE Healthcare)，将纯化的TONSL ARD(即SEQ ID NO：16所示TONSL的氨基酸512-692)对500mM NH₄OAc pH7.5进行缓冲液交换。在缓冲液交换的蛋白上进行Bradford蛋白定量。将蛋白在水中稀释至最终浓度为10μM，并保持在冰上，直到进行天然MS分析。

在配有基于自动芯片的nanoESI装置(Triversa Nanomate，Advion Biosciences，NY伊萨卡)的电喷飞行时间质谱仪(LCT，Waters，UK曼彻斯特)上进行质谱(MS)分析。通过使用(稀释于用0.5％(v/v)甲酸酸化的水/乙腈50/50混合物中的)0.4μM马心肌肌红蛋白溶液产生的多电荷离子，在m/z 200-6000的质量范围以正离子模式进行外部校准。首先，将蛋白在0.5％(v/v)甲酸酸化的50/50水/乙腈混合物中稀释至1μM，在变性条件下检查TONSL-ARD的均一性和纯度。质量测量主要显示存在分子量为20747.18±0.34Da的种类。在50mMNH₄OAc pH7.5中，保持5％EtOH量(v/v)恒定，表征肽在天然条件与TONSL-ARD的结合。蛋白浓度设定为10μM，加入1至5摩尔当量的不同肽浓度。在室温下进行15分钟孵育。使用对应着精细调节的仪器设置的减小的锥电压(Vc＝50V)和升高的界面压力(Pi＝5毫巴)记录质谱，所述设置提供足够的离子去溶剂化，同时保持气相中弱非共价复合物的完整性。使用Micromass MassLynx 4.1进行数据采集和处理。通过10μM TONSL-ARD和若干肽浓度(10、20、30、40、50μM)的孵育，尝试蛋白-肽复合物的天然MS分析。

为了在天然条件下进行数据处理，根据游离和结合的TONSL-ARD的9+和8+电荷状态的峰高，估计蛋白-肽复合物丰度(％PL)，假定化合物结合不改变蛋白响应因子。按照下式计算1∶1化学计量复合物的比例：

为了估计肽对TONSL-ARD的结合亲和性(Kd)，以恒定的肽与蛋白比例，随着蛋白浓度的降低，直至达到最低检测限，来分析蛋白/肽的混合物。为了在天然条件下进行数据处理，根据游离和结合的TONSL-ARD的9+和8+电荷状态的峰高，估计蛋白-肽复合物丰度(％PL)。这种蛋白比例用于计算结合的蛋白、游离的蛋白和游离肽的浓度。通过使用下式来计算各蛋白/肽浓度的Kd。各肽的最终Kd是不同蛋白/肽比例时Kd的平均值。

测试化合物

实施例11

(组蛋白H4肽)

从德国柏林JPT Peptide Technologies GmbH购买。

以下的肽获自丹麦哥本哈根Schafer-N Aps，并在氯三苯甲基树脂上通过Fmoc-化学得以制备，其是一种本领域技术人员已知的方法。

实施例12 Ala-Lys-Arg-His-Arg-Lys-Val-Leu-Arg-NH₂

实施例13 Lys-Gly-Gly-Ala-Lys-Arg-His-Arg-Lys-Val-Leu-Arg-NH₂

实施例14 Lys-Gly-Gly-Ala-Lys-Arg-His-Ala-Lys-Val-Leu-Arg-NH₂

实施例15 Lys-Gly-Gly-Ala-Ala-Arg-His-Arg-Lys-Val-Leu-Arg-NH₂

通过使用实施例10中所述的分析法，获得以下值。

实施例	％P1L1	表观K_d(μM)	滴定K_d(μM)
				11			0.077
12	62.6	2.2	1.95
				13	89.9	0.1	0.31
14	73.3	1.0	0.96
				15	81.4	0.4	未确定*

*Kd值不能通过滴定测量。

实施例16

基于结构的小分子和肽抑制剂设计：

通过使用本发明的结构信息，我们对世界范围内直接与配体药物发现应用相关的可用筛选化合物(小分子和肽)供应商化学文库的集合库进行大规模虚拟筛选，其中所述化合物可以开发成强大且有效的TONSL抑制剂。以下描述(计算机)筛选的化学文库和虚拟筛选方案。

化学供应商文库：

ZINC数据库的“库存”子集含有12,782,590个生物学相关筛选分子，所述分子去除了反荷离子(counter ion)和指定的互变异构体、质子化状态、电荷和3D构象，该子集获自：http：//zinc.docking.org，以SDF文件储存。

制备TONSL结构用于对接：

a.从TONSL ARD复合物结构中除去组蛋白H4尾(K12-D24)和结晶学水分子(参见实施例1)。

b.使用ICM(Molsoft L.L.C.，San Diego，CA，美国)构建和优化所有氢原子。

c.以E530、D559、E568和D604为中心的相互作用网格框使用ICM(Molsoft L.L.C.，San Diego，CA，USA)对接工具计算。

d.使用ICM(Molsoft L.L.C.，San Diego，CA，USA)进行12,782,590筛选分子(默认参数)的完全灵活的“配体”对接。

e.手动(manually)评估前0.001％得分的化合物的化学结构和预测的结合构象，其中MW＜500 Da，0.2＜药物样分数＜1，clogP＜5，可旋转键数目＜12，化合物张力(strain)＜10。

f.最初，获得总计49个高评分化合物，其中27个使用标准天然MS结合实验测试TONSL ARD结合。实施例10中概述MS结合实验的方案。

在初级结合筛选中发现TONSL-ARD命中

在与未修饰组蛋白H4肽尾(SEQ ID NO)的竞争性结合实验中所测试的化合物当中，基于“3-[(3-氨基环戊基)羰基]-1H-喹啉-4-酮”支架，对于至少一种化学类型，观察到与TONSL ARD(SEQ ID NO：16的氨基酸512-692)的弱结合。在这首次结合实验中，结合最好的化合物是AG100021(MW 317)，其在20μM时形成约20％的复合物。

结构数据

附录1-TONSL-GFP的结构数据

包括“人TONSL和MCM2 HBDS与组蛋白H3-H4四聚体结合的晶体结构”坐标的结构数据在PDB数据库中以PDB ID 5JA4的编号提供。如本文所使用的，术语“PDB ID 5JA4”是指在2016年4月11日保存在PDB中的PDB ID 5JA4。PDB ID 5JA4具有DOI：10.2210/pdb5ja4/pdb，并且可以在http：//www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do？structureId＝5JA4获得。包括与PDB ID 5JA4相同坐标的结构数据也在丹麦专利申请PA 2015 00605附录1以及美国专利申请62/324,257附录1中提供。

序列数据

SEQ ID NO：1-TONSL WT/GFP

SEQ ID NO：2-TONSL WT

SEQ ID NO：3-TONSL E530A

SEQ ID NO：4-TONSL E530A/GFP

SEQ ID NO：5-TONSL D559A

SEQ ID NO：6-TONSL D559A/GFP

SEQ ID NO：7-TONSL W563A

SEQ ID NO：8-TONSL W563A/GFP

SEQ ID NO：9-TONSL E568A

SEQ ID NO：10-TONSL E568A/GFP

SEQ ID NO：11-TONSL N571A

SEQ ID NO：12-TONSL N571A/GFP

SEQ ID NO：13-TONSL D604A

SEQ ID NO：14-TONSL D604A/GFP

SEQ ID NO：15-TONSL融合蛋白(MCM2 HBD-TONSL ARD)

SEQ ID NO：16-TONSL野生型(突出显示单突变体中突变的氨基酸)

＞gi|187608777|ref|NP_038460.4|tonsoku-样蛋白[人(Homo sapiens)]

SEQ ID NO：17-TONSL E530A单突变体的蛋白序列(突出显示突变的丙氨酸)

SEQ ID NO：18-TONSL D559A的蛋白序列

SEQ ID NO：19-TONSL W563A的蛋白序列

SEQ ID NO：20-TONSL E568A的蛋白序列

SEQ ID NO：21-TONSL N571A的蛋白序列

SEQ ID NO：22-TONSL D604A的蛋白序列

SEQ ID NO：23-组蛋白H4的蛋白序列

＞sp|P62805|H4_HUMAN组蛋白H4 OS＝智人(Homo sapiens)

SEQ ID NO：24-MCM2的蛋白序列

＞sp|P49736|MCM2_HUMAN DNA复制准许因子MCM2 OS＝智人(Homo sapiens)

SEQ ID NO：25-组蛋白H3.3的蛋白序列

＞sp|P84243|H33_HUMAN组蛋白H3.3 OS＝智人(Homo sapiens)

SEQ ID NO：26

SEQ ID NO：27

SEQ ID NO：28

SEQ ID NO：29

SEQ ID NO：30

SEQ ID NO：31

SEQ ID NO：32

SEQ ID NO：33

SEQ ID NO：34-组蛋白H4的蛋白序列

发明项目

本发明的一些方面可以进一步通过以下项目限定：

1.一种小分子，其靶向被组蛋白H4尾所占据的TONSL ARD的构象空间，所述组蛋白H4尾包含残基K12-R23，并且所述小分子通过直接竞争或通过变构破坏结合口袋而发挥作用以阻止或破坏H4尾K12-R23和TONSL ARD的结合。

2.根据项目1所述的小分子，其通过分子间氢键、静电和/或范德华相互作用而靶向跨越残基Lys12至Arg23的H4尾。

3.根据项目1-2任一项所述的小分子，其中所述分子靶向H4的跨越Lys12-Gly13-Gly14-Ala15片段的分子间接触。

4.根据项目1-3任一项所述的小分子，其中所述分子靶向H4的残基Gly13、Gly14和Ala15与ARD的残基Asn507、Cys508、Trp641、Tyr645和Leu649之间的疏水相互作用。

5.根据项目1-4任一项所述的小分子，其中所述分子靶向H4 Gly14的主链O和ARDTrp641的Nε1之间、以及H4 Ala15的主链N与ARD Tyr645的Oη之间的氢键。

6.根据项目1-5任一项所述的小分子，其中所述分子靶向H4 Lys16的主链O与ARDAsn571的Nδ2形成的氢键。

7.根据项目1-6任一项所述的小分子，其中所述分子靶向H4 Arg17的侧链，所述H4Arg17的侧链叠加在ARD Tyr572和Cys608的侧链上，而其Nη1原子与ARD Asn571的主链O和Oδ1形成两个氢键。

8.根据项目1-7任一项所述的小分子，其中所述分子靶向H4 H18的侧链，所述H4H18的侧链穿入由四个严格保守残基(Trp563、Glu568、Asn571和Asp604)形成衬底的口袋，并位于ARD的His567上。

9.根据项目1-8任一项所述的小分子，其中所述分子靶向H4 His18的侧链，所述H4His18的侧链叠加在Trp563和Asn571之间，并与ARD的Glu568和Asp604形成氢键。

10.根据项目1-9任一项所述的小分子，其中所述分子靶向H4 Arg19的主链O，所述H4Arg19的主链O与Trp563的Nε1形成氢键，其侧链与ARD的Cys561和Gly595形成接触。

11.根据项目1-10任一项所述的小分子，其中所述分子靶向H4 Lys20残基，所述H4Lys20残基结合在ARD上的酸性表面口袋内，临近H4 His18结合口袋。

12.根据项目1-11任一项所述的小分子，其中所述分子靶向H4 Lys20的侧链，所述H4 Lys20的侧链与Met528的侧链相互作用，并与ARD的Trp563的边缘相接触，而H4 Lys20的主链原子与ARD的Cys561相对。

13.根据项目1-12任一项所述的小分子，其中所述分子靶向H4 Lys20的Nζ原子，所述H4 Lys20的Nζ原子与ARD的严格保守的残基Glu530、Asp559和Glu568的侧链形成三个强氢键其在规则的三角形样排布中围绕H4 Lys20。

14.根据项目1-13任一项所述的小分子，其中所述分子靶向跨越H4的Val21-Leu22-Arg23片段的分子间接触，所述接触包括H4 Val21的侧链与ARD的Tyr560和Cys561之间的接触，而H4 Leu22与ARD的Asp527和Met528相互作用。

15.根据项目1-14任一项所述的小分子，其中所述分子靶向H4 Arg23的主链N，所述H4 Arg23的主链N与ARD的Asp527的主链O形成氢键，而侧链与ARD的Tyr560的侧链相对。

16.根据项目1-15任一项所述的小分子，能够阻断蛋白中的组蛋白识别结构域，所述蛋白选自TONSL、BARD1和ANKRD11。

17.根据项目1-16任一项所述的小分子，其用作药物。

18.根据项目1-17任一项所述的小分子，其用于治疗癌症。

19.一种选择或设计小分子的方法，所述小分子能够干扰TONSL锚蛋白重复的表面上的组蛋白H4H18和H4K20结合口袋，所述方法包括使用至少部分PDB ID 5JA4中所包含的原子坐标数据或其衍生数据，其中所述方法涉及使用计算机建模软件包或计算机程序来建构与H3(57-135)和H4复合的MCM2 HBD-G4-TONSL ARD的全部或部分结构的模型；从而基于可能和建模的结构相互作用的能力，通过分子的设计或选择，来鉴定所述小分子。

20.一种分离的多核苷酸或氨基酸序列，其与SEQ ID NO 1至22中任一项具有至少90％序列同一性。

21.一种晶体，其包含与H3(57-135)和H4复合的共价连接的MCM2HBD-G₄-TONSLARD(衍射至分辨率)。

22.一种晶体结构，其具有PDB ID 5JA4中所示的原子坐标或其子集，或者具有这样的结构，在其中相较于此处所示的那些，原子坐标在任何方向上的变化小于

Claims

1.一种TONSL抑制剂，其中所述抑制剂抑制TONSL ARD和组蛋白H4的结合。

2.根据权利要求2所述的TONSL抑制剂，其中所述抑制剂结合被组蛋白H4尾所占据的TONSL ARD的构象空间，所述组蛋白H4尾包含残基K12-R23，其中所述抑制剂通过直接竞争或通过变构破坏结合口袋来阻止和/或破坏组蛋白H4和TONSL ARD的结合。

3.根据前述权利要求任一项所述的抑制剂，其中所述抑制剂结合TONSL ARD的组蛋白H4尾结合表面。

4.一种小分子，其靶向被组蛋白H4尾所占据的TONSL ARD的构象空间，所述组蛋白H4尾包含残基K12-R23，并且所述小分子通过直接竞争或通过变构破坏结合口袋而发挥作用以阻止或破坏组蛋白H4尾K12-R23和TONSL ARD的结合。

5.根据权利要求4所述的小分子或根据权利要求1至3任一项所述的抑制剂，其通过分子间氢键、静电和/或范德华相互作用而靶向TONSL ARD与跨越残基Lys12至Arg23的组蛋白H4尾之间的相互作用。

6.根据权利要求4至5任一项所述的小分子或根据权利要求1至3任一项所述的抑制剂，其中所述分子靶向TONSL ARD和组蛋白H4的Lys12-Gly13-Gly14-Ala15片段之间的分子间接触。

7.根据权利要求4至6任一项所述的小分子或根据权利要求1至3任一项所述的抑制剂，其中所述分子靶向组蛋白H4的残基Gly13、Gly14和Ala15与TONSL ARD的残基Asn507、Cys508、Trp641、Tyr645和Leu649之间的疏水相互作用。

8.根据权利要求4至7任一项所述的小分子或根据权利要求1至3任一项所述的抑制剂，其中所述分子靶向H4 Gly14的主链O和TONSL ARD Trp641的Nε1之间、以及H4 Ala15的主链N与TONSL ARD Tyr645的Oη之间的氢键。

9.根据权利要求4至8任一项所述的小分子或根据权利要求1至3任一项所述的抑制剂，其中所述分子靶向组蛋白H4 Lys16的主链O与TONSL ARD Asn571的N82形成的氢键。

10.根据权利要求4至9任一项所述的小分子或根据权利要求1至3任一项所述的抑制剂，其能够阻断蛋白中的组蛋白识别结构域，所述蛋白选自TONSL、BARD1和ANKRD11。

11.根据权利要求1至3和5至10任一项所述的抑制剂，其中所述抑制剂是肽或多肽，其任选地连接至缀合部分。

12.根据权利要求11所述的抑制剂，其中所述抑制剂是包含序列Arg-His-Xaa-Lys的肽，其中所述Xaa是任何氨基酸。

13.根据权利要求11所述的抑制剂，其中所述抑制剂是包含序列Arg-His-Xaa-Lys-Val-Leu的肽。

14.根据权利要求11至13任一项所述的抑制剂，其中所述抑制剂是包含序列Val-Leu-Arg的肽。

15.根据权利要求11至14任一项所述的抑制剂，其中所述抑制剂是包含序列Arg-His-Xaa-Lys-Val-Leu-Arg的肽。

16.根据权利要求11至15任一项所述的抑制剂，其中所述肽或多肽包含或由以下组成：

I.由SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：34的氨基酸12至23组成的序列；或

II.由SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：34的氨基酸12至23的序列组成的功能同源物，其中至多5个氨基酸是取代的，并且其中所述肽至少包含SEQ ID NO：34的Arg17、His18和Lys20；

III.由SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：34的氨基酸12至23的序列组成的功能同源物，其中至多6个氨基酸是取代的；

条件是所述抑制剂不同于SEQ ID NO：23所示的组蛋白H4。

17.根据权利要求11至13任一项所述的抑制剂，其中所述肽或多肽包含或由以下组成：

·由SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：34的氨基酸9至25组成的序列；或

·由SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：34的氨基酸9至25的序列组成的功能同源物，其中至多5个氨基酸是取代的，并且其中所述肽至少包含SEQ ID NO：34的Arg17、His18和Lys20；

·由SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：34的氨基酸9至25的序列组成的功能同源物，其中至多6个氨基酸是取代的；

条件是所述抑制剂不同于SEQ ID NO：23所示的组蛋白H4。

18.根据权利要求11至14任一项所述的抑制剂，其中所述肽或多肽包含或由以下组成：

·由SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：34的氨基酸14至33组成的序列；或

·由SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：34的氨基酸14至33的序列组成的功能同源物，其中至多5个氨基酸是取代的，并且其中所述肽至少包含SEQ ID NO：34的Arg17、His18和Lys20；

·由SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：34的氨基酸14至33的序列组成的功能同源物，其中至多6个氨基酸是取代的；

条件是所述抑制剂不同于SEQ ID NO：23所示的组蛋白H4。

19.根据权利要求16至18任一项所述的抑制剂，其中在所述功能同源物中至多4个，优选至多3个，例如至多2个，例如至多一个氨基酸是取代的。

20.根据权利要求11所述的抑制剂，其中所述抑制剂包含肽或由肽组成，所述肽选自SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33。

21.根据权利要求11至20任一项所述的抑制剂，其中所述肽由至多40个氨基酸组成，例如至多25个氨基酸，例如至多20个氨基酸。

22.根据权利要求11至16和21任一项所述的抑制剂，其中所述肽由至多15个氨基酸组成，例如至多12个氨基酸。

23.根据权利要求11至22任一项所述的抑制剂，其中所述肽包含或由SEQ ID NO：23的4至40个连续的氨基酸组成。

24.根据权利要求11至23任一项所述的抑制剂，其中对应SEQ ID NO：23的Lys20的氨基酸是未甲基化的。

25.根据权利要求11所述的抑制剂，其中所述肽包含或由SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22组成。

26.根据权利要求11所述的抑制剂，其中所述肽包含或由SEQ ID NO：16的氨基酸512至692组成。

27.根据权利要求11至26任一项所述的抑制剂，其中所述肽的C端是酰胺化的或烷基化的。

28.根据权利要求11至27任一项所述的抑制剂，其中所述肽的N端是乙酰化的或甲酰基化的。

29.根据权利要求11至28任一项所述的抑制剂，其中所述缀合部分是聚合物分子，例如聚乙二醇(PEG)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。

30.根据权利要求1至3任一项所述的抑制剂或根据权利要求4至10任一项所述的小分子，其中所述抑制剂或所述小分子是具有3-[(3-氨基环戊基)羰基]-1H-喹啉-4-酮核心的化合物。

31.根据前述权利要求任一项所述的抑制剂，其中所述TONSL ARD定义为SEQ ID NO：16所示TONSL的氨基酸512至692。

32.根据前述权利要求任一项所述的抑制剂，其中组蛋白H4是SEQ ID NO：23所示组蛋白H4或者SEQ ID NO：34所示组蛋白H4。

33.根据权利要求2至32任一项所述的抑制剂，其中组蛋白H4尾的K12-R23对应着SEQID NO：34的氨基酸12至23。

34.根据权利要求4至10任一项所述的小分子或权利要求1至3和5至33任一项所述的抑制剂，其用作药物。

35.根据权利要求4至10任一项所述的小分子或权利要求1至3和5至34任一项所述的抑制剂，其用于治疗癌症。

36.权利要求4至10任一项所述的小分子或权利要求1至3和5至33任一项所述的抑制剂在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

37.以下之间的复合物的三维晶体：

·多肽，其包含：

ο由SEQ ID NO：16的氨基酸512至692组成的TONSL ARD或与其共享至少90％序列同一性的功能同源物；以及

ο任选地，由SEQ ID NO：24的氨基酸61至130组成的MCM2 HBD或与其共享至少90％序列同一性的功能同源物；

·SEQ ID NO：23所示的组蛋白H4或与其共享至少90％序列同一性的功能同源物；以及

·任选地，由SEQ ID NO：25的氨基酸57至135组成的组蛋白H3.3Δ56或与其共享至少90％序列同一性的功能同源物。

38.根据权利要求37所述的晶体，其中所述多肽包含或由通过接头连接至MCM2 HBD的TONSL ARD组成，所述TONSL ARD由SEQ ID NO：16的氨基酸512至692组成，所述MCM2 HBD由SEQ ID NO：24的氨基酸61至130组成，所述接头是4至20个Gly残基，例如4至12个Gly残基。

39.根据权利要求37至38任一项所述的晶体，其中所述晶体具有空间群P3 2 1。

40.根据权利要求37至39任一项所述的晶体，其中所述晶胞参数是α＝β＝90°±2°以及γ＝120°±2°。

41.根据权利要求27至40任一项所述的晶体，其中所述晶胞参数是a＝b＝139.5、c＝72.9、α＝β＝90°以及γ＝120°。

42.一种选择或设计小分子的方法，所述小分子能够干扰TONSL锚蛋白重复的表面上的组蛋白H4R17、H4H18和H4K20结合口袋，所述方法包括使用至少部分PDB ID 5JA4中所包含的原子坐标数据或其衍生数据，其中所述方法涉及使用计算机建模软件包或计算机程序来建构与H3(57-135)和H4复合的MCM2 HBD-G4-TONSL ARD的全部或部分结构的模型；在建模的结构中基于可能阻止或破坏H4尾和TONSL锚蛋白重复的能力来鉴定所述小分子。

43.一种鉴定TONSL抑制剂的方法，所述抑制剂抑制TONSL ARD与组蛋白H4的结合，其中所述方法包括步骤：

a)获得根据权利要求37至41中任一项的晶体；

b)使用步骤a)所得晶体来获得x-射线衍射图谱；

c)根据步骤b)所得衍射图谱解析晶体的三维结构，从而获得复合物的三维结构；

d)基于所得三维结构，鉴定一种或更多种结合至TONSL ARD的H4尾结合表面的化合物。

44.一种基于计算机的鉴定TONSL抑制剂的方法，所述TONSL抑制剂抑制TONSL ARD与组蛋白H4的结合，其中所述方法包括步骤：

a)基于PDB ID 5JA4提供的原子坐标、或相较于PDB ID 5JA4中所示三维结构在蛋白骨架原子上偏离均方根偏差不超过优选不超过的三维结构原子坐标，在计算机中生成TONSL ARD的组蛋白H4尾结合表面的空间结构，

b)在计算机中生成潜在抑制剂的空间结构，

c)选择具有这样结构的潜在抑制剂，即结合TONSL ARD的组蛋白H4尾结合表面的至少1个氨基酸残基。

45.根据权利要求44所述的方法，其中所述潜在抑制剂具有这样的结构，其结合TONSLARD的组蛋白H4尾结合表面的至少2个、优选至少3个、例如至少5个、例如至少10个氨基酸。

46.根据权利要求44至45所述的方法，其中所述TONSL ARD的组蛋白H4尾结合表面至少包含氨基酸Asp527、Met528、Glu530、Asp559、Tyr560、Cys561、Trp563、Glu568、Asn571、Tyr572、Gly595、Glu597、Asp604、Asn607、Cys608、Trp641、Tyr645和Leu649。

47.一种分离的多核苷酸或氨基酸序列，其与SEQ ID NO 1至22中任一项具有至少90％序列同一性。

48.一种TONSL突变体多肽，其在TONSL ARD的组蛋白H4尾结合表面的氨基酸中包含至少一个突变，其中除了所述突变之外所述TONSL突变体多肽和SEQ ID NO：16一致，或者和SEQ ID NO：16共享至少70％的序列同一性，其中所述TONSL突变体多肽能够结合MMS22L，并且其中所述TONSL突变体不结合组蛋白H4。

49.根据权利要求48所述的多肽，其中所述TONSL突变体多肽在一个或更多个氨基酸上存在突变，所述氨基酸选自：Glu530、Asp559、Trp563、Glu568、Gln571和D604。

50.根据权利要求48至49任一项所述的多肽，其中所述多肽包含或由序列组成，所述序列选自SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21和SEQID NO：22。

51.一种预测TONSL抑制作用的方法，所述方法包括步骤：

·在有机体和/或有机体的细胞中表达权利要求11至33和48至50任一项所述的多肽，其中所述多肽任选地是条件表达的，

·确定所述多肽在所述有机体和/或细胞中的作用，

其中在所述有机体和/或细胞中表达所述多肽的所述作用指示在所述有机体和/或细胞中抑制TONSL的作用。

52.根据权利要求51所述的方法，其中所述作用指示TONSL抑制剂抑制TONSL的作用，其中所述抑制剂抑制TONSL ARD与组蛋白H4的结合，例如根据权利要求1至21任一项所述的抑制剂。

53.根据权利要求51至52任一项所述的方法，其中所述有机体或所述细胞代表疾病模型。

54.根据权利要求51至53任一项所述的方法，其中所述有机体是小鼠，例如遗传工程化而患有癌症的小鼠。

55.根据权利要求51至53任一项所述的方法，其中所述细胞培养在3D培养中。

56.一种鉴定TONSL抑制剂和/或确定推定的TONSL抑制剂的抑制作用的方法，所述方法包括步骤：

a)提供测试化合物，其是推定的TONSL抑制剂；

b)提供宿主有机体，其表达SEQ ID NO：16所示TONSL、由SEQ ID NO：16的氨基酸512至692组成的TONSL ARD或与SEQ ID NO：16的氨基酸512至692共享至少90％序列同一性的前述任一项的功能同源物；

c)用所述推定抑制剂接触所述宿主有机体；

其中染色质结合的TONSL、TONSL ARD或其功能同源物的减少指示所述测试化合物是TONSL抑制剂。

57.根据权利要求56所述的方法，其中所述测试化合物是权利要求48至50任一项所述的TONSL突变体多肽。

58.根据权利要求56所述的方法，其中所述测试化合物是权利要求11至33任一项所述的肽。

59.根据权利要求56至58任一项所述的方法，其中所述宿主有机体包含编码所述TONSL、TONSL ARD或其功能同源物的异源核酸。

60.根据权利要求56至59任一项所述的方法，其中所述TONSL、TONSL ARD或其功能同源物连接至可检测的接头，例如荧光多肽。

61.根据权利要求56至60任一项所述的方法，其中步骤d)包括步骤：

d.1)从所述宿主有机体的细胞中提取可溶性蛋白；

d.2)检测所述宿主有机体的细胞中的TONSL、TONSL ARD或其功能同源物，从而检测染色质结合的TONSL、TONSL ARD或其功能同源物。

62.一种确定推定的TONSL抑制剂的抑制作用的方法，所述方法包括步骤：

e)提供组蛋白H4或其片段，其至少包含SEQ ID NO：23的氨基酸17至20；

f)提供SEQ ID NO：16所示TONSL、由SEQ ID NO：16的氨基酸512至692组成的TONSL ARD或与SEQ ID NO：16的氨基酸512至692共享至少90％序列同一性的前述任一项的功能同源物；

g)在推定的TONSL抑制剂存在时，用所述TONSL、TONSL ARD或其功能同源物孵育所述组蛋白H4或其片段；

h)确定所述组蛋白H4或其片段与所述TONSL、TONSL ARD或其功能同源物之间是否结合，

其中，所述组蛋白H4或其片段与所述TONSL、TONSL ARD或其功能同源物减少的结合指示所述推定的TONSL抑制剂能够抑制TONSL。

63.根据权利要求62所述的方法，其中所述抑制剂是权利要求1至33任一项所述的抑制剂或小分子。