JP2006508163A - 癌の処置および検出において有用な２４ｐ４ｃ１２と称される、核酸および対応タンパク質 - Google Patents

癌の処置および検出において有用な２４ｐ４ｃ１２と称される、核酸および対応タンパク質 Download PDF

Info

Publication number
JP2006508163A
JP2006508163A JP2004557078A JP2004557078A JP2006508163A JP 2006508163 A JP2006508163 A JP 2006508163A JP 2004557078 A JP2004557078 A JP 2004557078A JP 2004557078 A JP2004557078 A JP 2004557078A JP 2006508163 A JP2006508163 A JP 2006508163A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
protein
cancer
cell
peptide
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2004557078A
Other languages
English (en)
Inventor
アーサー ビー． ライタノ，
カレン ジェイン メーリック モリソン，
ワンマオ ゲ，
ピア エム． シャリタ−イド，
アヤ ジャコヴォヴィツ，
Original Assignee
アジェンシス， インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by アジェンシス， インコーポレイテッド filed Critical アジェンシス， インコーポレイテッド
Publication of JP2006508163A publication Critical patent/JP2006508163A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Abstract

新規遺伝子０２４Ｐ４Ｃ１２（２４Ｐ４Ｃ１２とも称される）およびそのコードタンパク質、ならびにこれらの改変体が、記載され、ここで、２４Ｐ４Ｃ１２は、正常な成人組織中で組織特異的な発現を示し、表Ｉに列挙される癌において異常に発現される。結果として、２４Ｐ４Ｃ１２は、癌に対する、診断標的、予後標的、予防標的および／または治療標的を提供する。２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子またはそのフラグメント、あるいはそのコードタンパク質、またはその改変体、またはそのフラグメントは、体液性免疫応答または細胞性免疫応答を誘発するために使用され得；２４Ｐ４Ｃ１２と反応性である抗体またはＴ細胞は、能動免疫または受動免疫において使用され得る。

Description

（政府の支援による研究に基づいてなされた発明に対する権利の陳述）
適用なし
（発明の分野）
本明細書中に記載の発明は、遺伝子およびそれによってコードされるタンパク質に関し、これは、２４Ｐ４Ｃ１２として称され、特定の癌において発現され、本発明は、２４Ｐ４Ｃ１２を発現する癌の管理において有用である、診断方法および治療方法、ならびに組成物に関する。
（発明の背景）
癌は、冠状動脈疾患（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）に次いで、ヒトの第２位の死因である。全世界では、数百万の人々が、毎年癌により死亡している。米国単独では、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙによって報告されるように、癌は毎年５０万人をはるかに超える人々の死亡を引き起こしており、毎年１２０万あまりの新たな症例が診断されている。心臓疾患による死亡は顕著に減少している一方で、癌に起因する死亡は、一般に増加傾向にある。次世紀の初期には、癌は主な死因になると予測されている。
全世界で、いくつかの癌が主要な死因（ｋｉｌｌｅｒ）として顕著である。特に、肺、前立腺、胸部、結腸、膵臓、および卵巣の癌腫は、癌による主な死因を代表する。これらおよび事実上全ての他の癌腫は、共通の致死的特徴を共有している。ごくわずかな例外はあるが、癌腫が原因の転移性疾患は、致命的である。さらに、初期段階ではその原発性癌を生き延びた癌患者についてすら、その生活が劇的に変化したという共通の経験が示されている。多くの癌患者は、再発または処置の失敗についての可能性を認識することによって駆り立てられる、強い不安を経験する。多くの癌患者は、処置後に肉体的衰弱を経験している。さらに、多くの癌患者は、再発を経験する。
全世界で、前立腺癌は、男性において４番目に最も優勢な癌である。北アメリカおよび北欧では、前立腺癌は、男性において断然最も一般的な癌であり、そして男性における癌による死亡の第２位の原因である。米国単独では、肺癌に次いで、３０，０００人をはるかに超える男性がこの疾患で毎年死亡している。これらの数字の規模にもかかわらず、転移性の前立腺癌に対する有効な処置は未だ存在しない。外科的前立腺切除、放射線療法、ホルモン除去（ｈｏｒｍｏｎｅ ａｂｌａｔｉｏｎ）療法、外科的去勢および化学療法は、主要な処置様式であり続けている。不運にも、これらの処置は、多くの者にとって無効であり、かつしばしば、所望されない結果を伴う。
診断現場において、初期段階の局所腫瘍を正確に検出し得る前立腺腫瘍マーカーが存在しないことは、この疾患の診断および管理における大きな限界を残している。血清の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）アッセイは非常に有用なツールであるが、その特異性および一般的有用性は、いくつかの重大な点が欠如していると広く考えられている。
前立腺癌についてのさらなる特異的マーカーを同定することにおける進歩は、マウスにおいてこの疾患の異なる病期を再現し得る前立腺癌異種移植片の生成により改善されてきた。ＬＡＰＣ（Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ）異種移植片は、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにおける継代を生き延び、かつアンドロゲン依存性からアンドロゲン非依存性への移行を模倣する能力を示した、前立腺癌異種移植片である（Ｋｌｅｉｎら、１９９７、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：４０２）。より近年同定された前立腺癌マーカーとしては、以下が挙げられる：ＰＣＴＡ−１（Ｓｕら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：７２５２）、前立腺特異膜（ＰＳＭ）抗原（Ｐｉｎｔｏら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９６年９月２日（９）：１４４５−５１）、ＳＴＥＡＰ（Ｈｕｂｅｒｔら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９９年１２月７日；９６（２５）：１４５２３−８）および前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）（Ｒｅｉｔｅｒら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１７３５）。
ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＰＣＴＡおよびＰＳＣＡのような以前に同定されたマーカーは、前立腺癌を診断してこれを処置する取り組みを促進したが、診断および治療をさらに改善するために、前立腺癌および関連する癌に対するさらなるマーカーおよび治療標的を同定する必要がある。
腎臓細胞癌腫（ＲＣＣ）は、成人悪性疾患の約３％を占める。一旦、腺腫が直径２〜３ｃｍに到達すると、悪性疾患の潜在性が存在する。成人では、２つの主な悪性腎臓腫瘍は、腎臓細胞の腺腫および腎盂または尿管の移行細胞癌腫である。腎臓細胞腺癌の発生数は、米国で２９，０００症例を超えると見積もられており、そして１９９８年にこの疾患によって１１，６００人を超える患者が死亡した。移行細胞癌腫は、それほど頻繁ではなく、米国において１年あたり約５００症例ほどの発生数である。
手術は、何十年もの間、腎臓細胞腺癌の主な治療法であった。近年まで、転移性疾患は、あらゆる全身性治療に対して難治性であった。全身治療（特に、免疫治療）の近年の開発に伴い、転移性腎臓細胞癌腫は、許容可能な応答の可能性を伴って、適切な患者において積極的にアプローチされ得る。それにもかかわらず、これらの患者に対する有効な治療の必要性が存在し続けている。
米国における癌の全ての新しい症例のうち、膀胱癌は、男性において約５％（最も一般的な新生物の５番目）および女性において３％（最も一般的な新生物の８番目）に相当する。発生数はゆるやかに増加し、高齢人口の増加と一致する。１９９８年には、男性における３９，５００症例および女性における１５，０００症例を含め、推定で５４，５００症例であった。米国における年齢調整された（ａｇｅ−ａｄｊｕｓｔｅｄ）発生率は、男性について１００，０００人当たり３２人、および女性において１００，０００人当たり８人である。３：１の歴史的な男性／女性比は、女性における喫煙パターンに関連して減少し得る。１９９８年に膀胱癌で推定１１，０００人が死亡した（男性７，８００人および女性３，９００人）。膀胱癌発生率および死亡率は、年齢に伴って大きく増加し、そして集団がより高齢化するにつれて問題も増す。
大部分の膀胱癌は、膀胱中で再発する。膀胱癌は、膀胱の経尿道的切除術（ＴＵＲ）と膀胱内化学療法または免疫療法との組み合わせを用いて管理される。膀胱癌の多病巣性の性質および再発性の性質は、ＴＵＲの限界を指摘する。大部分の筋肉侵潤性癌は、ＴＵＲ単独では治癒しない。根治的膀胱切除術および尿再交通（ｕｒｉｎａｒｙ ｄｉｖｅｒｓｉｏｎ）は、癌を切除するための最も効果的な手段であるが、尿の機能および性的機能に対して否定できない影響を保有する。膀胱癌患者に有益な処置様式の顕著な必要性が存在し続けている。
米国で２０００年では、９３，８００症例の結腸癌および３６，４００症例の直腸癌を含め、推定１３０，２００症例の結腸直腸癌が生じた。結腸直腸癌は、男性および女性における三番目に一般的な癌である。発生率は、１９９２年〜１９９６年の間、有意に減少した（１年あたり−２．１％）。調査は、これらの減少が、ポリープが侵襲性癌へと進行するのを予防する、スクリーニングおよびポリープ除去の増加に起因していることを示唆する。２０００年には推定５６，３００人が死亡（４７，７００人は結腸癌、８，６００人は直腸癌による）、米国での癌死亡者全体の約１１％を占めた。
現在、手術が、結腸直腸癌、および広がっていない癌のための最も一般的な治療形態であり、これは頻繁に治癒的である。化学療法または化学療法に加えての放射線照射は、癌が腸壁に深く穿孔しているかまたはリンパ節に広がっている大部分の患者に対して手術前または手術後に提供される。永久的な人工肛門形成（身体の排泄物を排除するための腹部開口部の形成）は、結腸癌について時折必要とされ、そして直腸癌については頻繁に要求される。結腸直腸癌についての効果的な診断様式および処置様式の必要性が存在し続けている。
２０００年には、肺癌および気管支癌の推定１６４，１００の新たな症例が存在し、これは、米国癌診断全体の１４％を占めた。肺癌および気管支癌の発生率は、１９８４年の１００，０００人中８６．５人という高さから１９９６年の７０．０人へと、男性において有意に減少している。１９９０年代、女性の間での増加率は低下し始めた。１９９６年には、女性における発生率は、１００，０００人中４２．３人であった。
肺癌および気管支癌は、２０００年に推定１５６，９００人の死亡者を生じ、これは、癌死亡者全体の２８％を占めた。１９９２年〜１９９６年の間、肺癌による死亡率は、男性の間で有意に減少した（１年当たり−１．７％）一方で、女性についての死亡率は依然として有意に増加している（１年当たり０．９％）。１９８７年以来、より多くの女性が乳癌よりも肺癌によって毎年死亡しており、乳癌は４０年よりも長期にわたって、女性における癌による死亡の主な原因であった。肺癌発生率および死亡率の減少は、過去３０年にわたる喫煙率の減少に起因している可能性が最も高い；しかし、女性の間での喫煙パターンの減少は、男性の減少に遅れている。成体におけるタバコの使用の減少が鈍くなっているが、若者におけるタバコの使用が再度増加していることは、重大である。
肺癌および気管支癌についての処置選択肢は、癌の型および病期によって決定され、選択肢としては、手術、放射線療法および化学療法が挙げられる。多くの局所性の癌については、手術が通常選り抜きの処置である。この疾患は、通常、発見されるときまでに広がっているので、放射線療法および化学治療が、手術と組み合わせてしばしば必要とされる。化学治療単独または放射線療法と組み合わせた化学療法は、小細胞肺癌についての選り抜きの処置であり；このレジメンでは、大きな％の患者が寛解を経験し、これはいくつかの場合において長く持続する。しかし、肺癌および気管支癌についての効果的な処置アプローチおよび診断アプローチの必要性が存在し続けている。
乳癌の推定１８２，８００の新しい侵襲性症例が、２０００年の間に米国の女性の間で生じると予測された。さらに、乳癌の約１，４００の新しい症例が、２０００年に男性において診断されると予測された。１９８０年代における一年当たり約４％の増加後、女性における乳癌発生率は、１９９０年代に１００，０００人当たり約１１０．６症例に頭打ちとなった。
米国単独で、乳癌に起因して、２０００年に推定４１，２００人が死亡した（４０，８００人が女性、４００人が男性）。乳癌は、女性における癌による死亡の２番目に主要なものである。最近のデータによると、死亡率は、１９９２年〜１９９６年の間に有意に減少しており、白人および黒人の両方の若い女性の間で最も大きく減少していた。これらの減少は、おそらく、より早期の検出および処置の改善の結果であった。
医学的環境および患者の好みを考慮にいれると、乳癌の処置は、以下を含み得る：腫瘍摘除（腫瘍の局所的な除去）および脇下リンパ節の除去；乳房切除（乳房の外科的除去）および脇下リンパ節の除去；放射線療法；化学療法；またはホルモン療法。しばしば、２つ以上の方法が組み合わせて使用される。多数の研究が、初期段階の疾患について、腫瘍切除に加えた放射線療法の後の長期生存率が、改変された根本的な乳房切除後の生存率に同様であることを示している。再建技術における顕著な進歩は、乳房切除後の乳房再建についていくつかの選択肢を提供する。近年、このような再建は、乳房切除と同時に行われている。
適切な量の周囲の正常胸部組織を伴うインサイチュの腺管癌腫（ＤＣＩＳ）の局所切除によって、ＤＣＩＳの局所的な再発を防ぎ得る。胸部への放射線照射および／またはタモキシフェンによって、残っている胸部組織におけるＤＣＩＳの発生機会が低減され得る。未処置のままであるとＤＣＩＳは発達して浸潤性乳癌になり得るので、このことは重要である。それにもかかわらず、これらの処置には、深刻な副作用または後遺症が存在する。それゆえ、有効な乳癌処置の必要性が存在する。
２０００年の米国において卵巣癌の推定２３，１００の新症例が存在した。卵巣癌は女性における全ての癌の４％を占め、婦人科癌において第２位に位置付けられている。１９９２年〜１９９６年の間において、卵巣癌の発生率は、有意に低下した。卵巣癌の結果として、２０００年には推定１４，０００人が死亡した。卵巣癌は、女性生殖系の他のいかなる癌よりも多数の死亡者を生じる。
手術、放射線療法、および化学療法は、卵巣癌についての処置選択肢である。外科的手術としては、通常、卵巣の一方または両方の切除、ファローピウス管の切除（卵管卵巣摘出術）、および子宮の切除（子宮摘出術）が挙げられる。いくつかの非常に初期の腫瘍において、子供を持つことを望む若い女性において特に、関与する卵巣のみが除去される。進行した疾患では、腹腔内の疾患全てを除去して化学療法の効果を増強することが試みられる。卵巣癌についての効果的な処置選択肢についての重要な必要性が存在し続ける。
２０００年の米国において膵臓癌の推定２８，３００の新症例が存在した。過去２０年間にわたって、膵臓癌の割合は、男性において減少している。女性の間での割合は、おおよそ一定のままであるが、減少し始めるかもしれない。膵臓癌により、２０００年に米国において推定２８，２００人が死亡した。過去２０年間にわたって、男性における死亡率は僅かであるが有意に減少している（１年間で約−０．９％）が、その一方で、その割合が女性においては僅かに上昇した。
手術、放射線療法、および化学療法は、膵臓癌についての処置選択肢である。これらの処置選択肢は、多くの患者において生存を長期化し得、そして／またはその症状を軽減し得るが、大部分の人に対して治癒を生み出すようではない。膵臓癌についてのさらなる治療選択肢および診断的選択肢に対しての重大な必要性が存在する。
（発明の要旨）
本発明は、２４Ｐ４Ｃ１２と称される遺伝子に関し、この遺伝子は、表Ｉに列挙される癌において過剰発現されることが現在では見出されている。正常組織における２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子発現のノーザンブロット発現分析は、成人組織における制限された発現パターンを示す。２４Ｐ４Ｃ１２のヌクレオチド配列（図２）およびアミノ酸配列（図２および図３）を提供する。正常成人組織における２４Ｐ４Ｃ１２の組織関連プロフィールは、表１で列挙された組織において観察された過剰発現とあわせて、２４Ｐ４Ｃ１２が少なくともいくつかの癌において異常に過剰発現されており、したがって、表Ｉで列挙された組織のような組織の癌について有用な診断標的、予防標的、予後診断標的および／または治療標的として役立つことを示す。
本発明は、以下を提供する：２４Ｐ４Ｃ１２の遺伝子、ｍＲＮＡおよび／またはコード配列（好ましくは単離された形態の）の全部または一部に対応するか、または相補的なポリヌクレオチド（これらとしては、以下が挙げられる：４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２５を超えて連続したアミノ酸の、２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質および２４Ｐ４Ｃ１２関連フラグメントをコードするポリヌクレオチド）；少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、８０、８５、９０、９５、１００または１００を超えて連続したアミノ酸の２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質、ならびにペプチド／タンパク質自体；２４Ｐ４Ｃ１２の遺伝子配列もしくはｍＲＮＡ配列またはそれらの一部に対して相補的であるかまたは少なくとも９０％の相同性を有する、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、および関連分子、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、ならびに２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子、ｍＲＮＡまたは２４Ｐ４Ｃ１２コードポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。２４Ｐ４Ｃ１２をコードするｃＤＮＡおよび遺伝子を単離するための手段もまた提供される。２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ分子、このような分子で形質転換または形質導入された細胞、および２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物の発現のための宿主−ベクター系もまた提供される。本発明はさらに、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質およびそれらのポリペプチドフラグメントに結合する抗体を提供し、これらの抗体としては、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、マウス抗体および他の哺乳動物抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体、ならびに検出可能なマーカーまたは治療剤で標識された抗体が挙げられる。特定の実施形態においては、ただし、図２の核酸配列の全体はコードされず、そして／または図２のアミノ酸配列全体は調製されない。特定の実施形態では、図２の核酸配列全体がコードされ、そして／または図２のアミノ酸配列全体が調製され、これらのいずれかは、それぞれのヒト単位投薬形態である。
本発明は、種々の生物学的サンプル中での２４Ｐ４Ｃ１２のポリヌクレオチドおよびタンパク質の存在および状態を検出するための方法、ならびに２４Ｐ４Ｃ１２を発現する細胞を同定するための方法をさらに提供する。本発明の代表的な実施形態は、癌のような何らかの形態の増殖調節不全を有するかまたはそれらを有する疑いのある組織サンプルまたは血液学的サンプルにおいて、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物をモニタリングするための方法を提供する。
本発明は、種々の免疫原性組成物または治療組成物、および２４Ｐ４Ｃ１２を発現する癌（例えば、表Ｉに列挙された組織の癌）を処置するためのストラテジー（２４Ｐ４Ｃ１２の転写、翻訳、プロセシングまたは機能を阻害することを目的とした治療を含む）ならびに癌ワクチンをさらに提供する。１つの局面において、本発明はヒト被験体において２４Ｐ４Ｃ１２を発現する癌を処置するための組成物、ならびにそれらを含む方法を提供し、ここで、この組成物は、ヒトの用途について適切なキャリアならびに２４Ｐ４Ｃ１２の産生または機能を阻害する１つ以上の薬剤のヒトの単位用量を含む。好ましくは、このキャリアは、特有のヒトキャリアである。本発明の別の局面において、この薬剤は、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質と免疫反応性の部分である。このような部分の非限定的な例としては、抗体（例えば、単鎖、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体またはヒト抗体）、（天然に存在しているかまたは合成された）それらの機能的等価物ならびにそれらの組合せが挙げられるがこれらに限定されない。これらの抗体は、診断的部分または治療的部分に結合体化され得る。別の局面において、この薬剤は、本明細書中で定義されるような低分子である。
別の局面において、この薬剤は、２４Ｐ４Ｃ１２に対するＣＴＬ応答を誘導するためのヒトにおけるＨＬＡクラスＩ分子に結合する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープを含む１以上のペプチドおよび／またはヒトにおいてＨＬＡクラスＩＩ分子に結合してＨＴＬ応答を誘発するヘルパーＴリンパ球（ＨＴＬ）エピトープを含む１以上のペプチドを含む。本発明のペプチドは、同一のものまたは１以上の別個のポリペプチド分子であり得る。本発明のさらなる局面において、この薬剤は、上記のようにＣＴＬ応答またはＨＴＬ応答を刺激するペプチドのうちの１つ以上を発現する１つ以上の核酸分子を含む。本発明のさらに別の局面において、１つ以上の核酸分子は、上記のように２４Ｐ４Ｃ１２と免疫学的に反応する部分を発現し得る。１つ以上の核酸分子はまた、２４Ｐ４Ｃ１２の産生を阻害する分子であり得るか、またはこれをコードし得る。このような分子の非限定的な例としては、２４Ｐ４Ｃ１２の産生にとって必須のヌクレオチド配列に相補的な分子（例えば、アンチセンス配列または２４Ｐ４Ｃ１２産生にとって必須のヌクレオチド二重らせんを有する三重らせんを形成する分子）または２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡを溶解するのに効果的なリボザイムが挙げられるがこれらに限定されない。
親タンパク質（例えば、改変体１，改変体２など）に関して表ＶＩＩＩ−ＸＸＩおよびＸＸＩＩ−ＸＬＩＸ（集合的にＨＬＡペプチド表（ＨＬＡ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔａｂｌｅｓ）とする）に示される任意のペプチドの開始位置を決定するために、以下の３つの因子を参照することに留意すること：特定の改変体、ＨＬＡペプチド表におけるペプチド長、および表ＶＩＩにおける検索ペプチド。一般に、固有の検索ペプチドを使用して、特定の改変体に対する特定のＨＬＡペプチドを得る。そのそれぞれの親分子に対する各検索ペプチドの位置は、表ＶＩＩに列挙される。したがって、検索ペプチドが位置「Ｘ」で開始した場合、これらの親分子におけるＨＬＡペプチドの実際の位置を得るために表ＶＩＩＩ−ＸＸＩおよびＸＸＩＩ−ＸＬＩＸにおける各位置に対して値「Ｘ−１」を加えなければならない。例えば、特定の検索ペプチドがその親分子の１５０位で開始するとき、親分子におけるアミノ酸の位置を計算するために各ＨＬＡペプチドアミノ酸の位置に１５０−１、すなわち１４９を加算しなければならない。
本発明の一つの実施形態は、集合的に表ＶＩＩＩ〜表ＸＸＩおよび表ＸＸＩＩから表ＸＬＩＸにおいて少なくとも２度現れるＨＬＡペプチド、またはＨＬＡペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを包含する。本発明の別の実施形態は、表ＶＩＩＩ〜表ＸＸＩに少なくとも１度現れ、かつ表ＸＸＩＩ〜表ＸＬＩＸに少なくとも１度現れるＨＬＡペプチド、またはそのＨＬＡペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを包含する。
本発明の別の実施形態は、以下の特徴の１つ、２つ、３つ、４つ、あるいは５つ有するペプチド領域を含む抗体エピトープ、あるいはペプチド領域をコードするオリゴヌクレオチドである：
ｉ）図３の特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸のペプチド領域（図３におけるそのタンパク質の全長までの任意の整数増分における）（図５の親水性プロフィールにおいて、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９以上の値を有するかまたは１．０に等しい値を有するアミノ酸位置を含む）；
ｉｉ）図３の特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸のペプチド領域（図３におけるそのタンパク質の全長までの任意の整数増分における）（図６のヒドロパシープロフィールにおいて、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１以下の値を有するかまたは０．０に等しい値を有するアミノ酸位置を含む）；
ｉｉｉ）図３の特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸のペプチド領域（図３におけるそのタンパク質の全長までの任意の整数増分における）（図７の接近可能残基の％（Ｐｅｒｃｅｎｔ Ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ）プロフィールにおいて、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９以上の値を有するかまたは１．０に等しい値を有するアミノ酸位置を含む）；
ｉｖ）図３の特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸のペプチド領域（図３におけるそのタンパク質の全長までの任意の整数増分における）（図８の平均可橈性（Ａｖｅｒａｇｅ Ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）プロフィールにおいて、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９以上の値を有するかまたは１．０に等しい値を有するアミノ酸位置を含む）；あるいは、
ｖ）図３の特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸のペプチド領域（図３におけるそのタンパク質の全長までの任意の整数増分における）（図９のβターンプロフィールにおいて、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９以上の値を有するかまたは１．０に等しい値を有するアミノ酸位置を含む）。
（発明の詳細な説明）
（節の概要）
Ｉ．）定義
ＩＩ．）２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチド
ＩＩ．Ａ．）２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドの使用
ＩＩ．Ａ．１．）遺伝的異常のモニタリング
ＩＩ．Ａ．２．）アンチセンスの実施形態
ＩＩ．Ａ．３．）プライマーおよびプライマー対
ＩＩ．Ａ．４．）２４Ｐ４Ｃ１２コード核酸分子の単離
ＩＩ．Ａ．５．）組換え核酸分子および宿主−ベクター系
ＩＩＩ．）２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質
ＩＩＩ．Ａ．）モチーフ保有タンパク質の実施形態
ＩＩＩ．Ｂ．）２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質の発現
ＩＩＩ．Ｃ．）２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質の改変
ＩＩＩ．Ｄ．）２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質の使用
ＩＶ．）２４Ｐ４Ｃ１２抗体
Ｖ．）２４Ｐ４Ｃ１２細胞免疫応答
ＶＩ．）２４Ｐ４Ｃ１２トランスジェニック動物
ＶＩＩ．）２４Ｐ４Ｃ１２の検出方法
ＶＩＩＩ．）２４Ｐ４Ｃ１２関連遺伝子およびそれらの産物の状態をモニタリングするための方法
ＩＸ．）２４Ｐ４Ｃ１２と相互作用する分子の同定
Ｘ．）治療法および組成物
Ｘ．Ａ．）抗癌ワクチン
Ｘ．Ｂ．）抗体ベースの治療のための標的としての２４Ｐ４Ｃ１２
Ｘ．Ｃ．）細胞免疫応答のための標的としての２４Ｐ４Ｃ１２
Ｘ．Ｃ．１．ミニ遺伝子ワクチン
Ｘ．Ｃ．２．ヘルパーペプチドとＣＴＬペプチドとの組み合わせ
Ｘ．Ｃ．３．Ｔ細胞プライミング剤とＣＴＬペプチドとの組み合わせ
Ｘ．Ｃ．４．ＣＴＬペプチドおよび／またはＨＴＬペプチドでパルスしたＤＣを含むワクチン組成物
Ｘ．Ｄ．）養子免疫療法
Ｘ．Ｅ．）治療目的または予防目的のためのワクチンの投与
ＸＩ．）２４Ｐ４Ｃ１２の診断的実施形態および予後的実施形態
ＸＩＩ．）２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質機能の阻害
ＸＩＩ．Ａ．）細胞内抗体を用いた２４Ｐ４Ｃ１２の阻害
ＸＩＩ．Ｂ．）組換えタンパク質を用いた２４Ｐ４Ｃ１２の阻害
ＸＩＩ．Ｃ．）２４Ｐ４Ｃ１２の転写または翻訳の阻害
ＸＩＩ．Ｄ．）治療的ストラテジーのための一般的考慮
ＸＩＩＩ．）２４Ｐ４Ｃ１２の調節因子の同定、特徴付けおよび使用
ＸＩＶ．）キット／製造物品。
（Ｉ．）定義）
他に規定しない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語、表記、および他の科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって共通して理解される意味を有することが意図される。いくつかの場合において、共通して理解される意味を有する語句は、明確さおよび／または迅速な参照のために本明細書中で定義され、そしてこのような定義の本明細書中への包含は、当該分野において一般に理解されることにわたって実質的な相違を表すとは必ずしも解釈されるべきではない。本明細書中に記載または参照される多くの技術および手順は、一般に、従来の方法論（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載されている、広く利用されている分子クローニングの方法論）を用いて、当業者によって十分に理解されかつ共通して用いられる。適切な場合、市販のキットおよび試薬の使用を含む手順は、他に注記されない限り、一般に、製造業者によって規定されるプロトコルおよび／またはパラメーターに従って実行される。
本明細書中で使用される場合、用語「進行した前立腺癌」、「局所的に進行した前立腺癌」、「進行した疾患」および「局所的に進行した疾患」とは、前立腺被膜を通して伸長した前立腺癌を意味し、そして米国泌尿器学会（ＡＵＡ）システムの下でのステージＣ疾患、Ｗｈｉｔｍｏｒｅ−Ｊｅｗｅｔｔシステムの下でのステージＣ１−Ｃ２疾患、およびＴＮＭ（腫瘍、節、転移）システムの下でのステージＴ３−Ｔ４およびＮ＋疾患を含むことが意味される。一般に、手術は、局所的に進行した疾患を有する患者のためには推奨されず、そしてこれらの患者は、臨床的に局在化している（器官が限定されている）前立腺癌を有する患者と比較して、実質的により好ましくない結果を有する。局所的に進行した疾患は、前立腺の側縁を超える硬化の明白な証拠、または前立腺基部上の非対称もしくは硬化によって臨床的に同定される。局所的に進行した前立腺癌は、腫瘍が前立腺被膜に侵入するかもしくは浸透するか、外科的な境界まで伸長するか、または精嚢に侵入する場合、現在、徹底的な前立腺切除後に生理学的に診断される。
「ネイティブなグリコシル化パターンを改変すること」は、本明細書中の目的のために、ネイティブ配列の２４Ｐ４Ｃ１２において見出される１つ以上の炭水化物部分を除去すること（内在するグリコシル化部位を除去することによってか、または化学的手段および／もしくは酵素的手段によってグリコシル化を除去することによってのいずれかで）、および／あるいはネイティブ配列の２４Ｐ４Ｃ１２に存在しない１つ以上のグリコシル化部位を付加することを意味することを意図する。さらに、この句は、ネイティブタンパク質のグリコシル化の質的な変化を含み、種々の炭水化物部分の存在の性質および比率の変化に関する。
用語「アナログ」は、構造的に類似するか、または別の分子と類似する特性もしくは一致する特性を共有する分子をいう（例えば、２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質）。例えば、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のアナログは、２４Ｐ４Ｃ１２に特異的に結合する抗体またはＴ細胞によって特異的に結合され得る。
用語「抗体」は、最も広範な意味で使用される。従って、「抗体」は、天然に存在し得るか、または従来のハイブリドーマ技術によって産生されるモノクローナル抗体のような人工であり得る。抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体ならびに抗原結合ドメインおよび／またはこれらの抗体の１つ以上の相補的決定領域を含むフラグメントを含む。
「抗体フラグメント」は、標的に結合する免疫グロブリン分子の可変領域の少なくとも一部分（すなわち、抗原結合領域）として定義される。１つの実施形態において、これは、具体的には単一の抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体およびそのクローン（アゴニスト、アンタゴニストおよび中和抗体が挙げられる）ならびにポリエピトープの（ｐｏｌｙｅｐｉｔｏｐｉｃ）特異性を有する抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体組成物を包含する。
用語「コドン最適化配列」は、約２０％未満の使用頻度を有する任意のコドンを置換することによって特定の宿主種について最適化されたヌクレオチド配列をいう。コドン最適化に加えて偽ポリアデニル化配列の除去、エキソン／イントロンスプライシングシグナルの除去、トランスポゾン様反復の除去および／またはＧＣ含量の最適化によって、所定の宿主種における発現について最適化されたヌクレオチド配列は、本明細書中で「発現増強配列」と呼ばれる。
「コンビナトリアルライブラリー」は、試薬のような多数の化学的「基礎単位」を組み合せることによる化学合成または生合成のいずれかによって生成された、多様な化学化合物の集合体である。例えば、直鎖上のコンビナトリアル化学ライブラリー（例えば、ポリペプチド（例えば、ムテイン）ライブラリー）は、所定の化合物の長さ（すなわち、ポリペプチド化合物におけるアミノ酸の数）についての可能なあらゆる方法でアミノ酸と呼ばれる化学的基礎単位を併用することによって形成される。多数の化学化合物が、このような化学基礎単位のコンビナトリアル混合を通して合成される（Ｇａｌｌｏｐら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７（９）：１２３３−１２５１（１９９４））。
コンビナトリアルライブラリーの調製およびスクリーニングは、当業者に周知である。このようなコンビナトリアル化学ライブラリーとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ペプチドライブラリー（例えば、米国特許第５，０１０，１７５号、Ｆｕｒｋａ，Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．３７：４８７−４９３（１９９１），Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８４−８８（１９９１）を参照のこと）、ペプトイド（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１９７３５）、コードペプチド（ＰＣＴ公開ＷＯ ９３／２０２４２）、ランダムバイオ−オリゴマー（ＰＣＴ公開ＷＯ ９２／０００９１）、ベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号）、ディバーソマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒ）（例えば、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチド（Ｈｏｂｂｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６９０９−６９１３（１９９３））、ビニルロゴアス（ｖｉｎｙｌｏｇｏｕｓ）ポリペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：６５６８（１９９２））、β−Ｄ−グルコース骨格を有する非ペプチダルペプチド模倣物（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：９２１７−９２１８（１９９２））、類似の小化合物ライブラリーの有機合成（Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２６６１（１９９４））、オリゴカーボネート（Ｃｈｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３（１９９３））および／またはペプチジルホスホネート（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：６５８（１９９４））。一般的に、Ｇｏｒｄｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１３８５（１９９４）、核酸ライブラリー（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｃｏｒｐ．を参照のこと）、ペプチド核酸ライブラリー（例えば、米国特許第５，５３９，０８３号を参照のこと）、抗体ライブラリー（例えば、Ｖａｕｇｈｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４（３）：３０９−３１４（１９９６）およびＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７を参照のこと）、炭水化物ライブラリー（例えば、Ｌｉａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：１５２０−１５２２（１９９６）および米国特許第５，５９３，８５３号を参照のこと）および有機低分子ライブラリー（例えば、ベンゾジアゼピン、Ｂａｕｍ，Ｃ ＆ ＥＮ，１月１８日，３３頁（１９９３）；イソプレノイド、米国特許第５，５６９，５８８号；チアゾリジノンおよびメタチアザノン、米国特許第５，５４９，９７４号；ピロリジン、米国特許第５，５２５，７３５号および同第５，５１９，１３４号；モルホリノ化合物、米国特許第５，５０６，３３７号；ベンゾジアゼピン、米国特許第５，２８８，５１４号；などを参照のこと。
コンビナトリアルライブラリーの調製のためのデバイスは、市販されている（例えば、３５７ ＮＩＰＳ、３９０ ＮＩＰＳ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍ Ｔｅｃｈ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ ＫＹ；Ｓｙｍｐｈｏｎｙ，Ｒａｉｎｉｎ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ；４３３Ａ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ；９０５０，Ｐｌｕｓ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＮＩＡ）。多数の周知のロボットシステムもまた、液相の化学のために開発されている。これらのシステムとしては、自動化ワークステーション（例えば、Ｔａｋｅｄａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，ＬＴＤ．（Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）によって開発された自動化合成装置）およびロボットアームを利用する多くのロボットシステム（Ｚｙｍａｔｅ Ｈ，Ｚｙｍａｒｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，Ｍａｓｓ．；Ｏｒｃａ，Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）（これは、化学者によって実行される手動合成操作を模倣する））が挙げられる。任意の上記のデバイスは、本発明で使用するのに適切である。本明細書中に記載されるように作動し得るように、これらのデバイスに対する性質および実施の改変（ある場合）は、当業者に理解される。さらに、多数のコンビナトリアルライブラリーは、それら自体が市販されている（例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ；Ａｓｉｎｅｘ，Ｍｏｓｃｏｗ，ＲＵ；Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；ＣｈｅｍＳｔａｒ，Ｌｔｄ，Ｍｏｓｃｏｗ，ＲＵ；３Ｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｅｘｔｏｎ，ＰＡ；Ｍａｒｔｅｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ；など）。
用語「細胞傷害性薬剤」は、細胞の発現活性、細胞の機能を阻害するかまたは防止し、そして／あるいは細胞の破壊を引き起こす物質をいう。この用語は、放射活性同位体化学療法剤および毒素（例えば、低分子毒素または細菌起源、真菌起源、植物起源または動物起源の酵素的活性毒素）（フラグメントおよび／またはその改変体を含む）を含むことが意図される。細胞傷害性薬剤の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アウリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、アウロマイシン（ａｕｒｏｍｙｃｉｎ）、マイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）、イットリウム、ビスマス、リシン、リシンＡ鎖、コンブレスタチン（ｃｏｍｂｒｅｓｔａｔｉｎ）、デゥオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）、ドロスタチン（ｄｏｌｏｓｔａｔｉｎ）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、シスプラチン、ｃｃ１０６５、エチジウムブロマイド、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシン、ジフテリア毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、α−サルシン（ｓａｒｃｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、マイトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レトストリクトシン（ｒｅｔｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン、エノマイシン、クリシン（ｃｕｒｉｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、Ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓインヒビター、およびグルココルチコイド、ならびに他の化学療法剤、ならびに放射性同位元素（例えばＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２またはＢｉ２１３、Ｐ３２およびＬｕの放射性同位体（Ｌｕ１７７を含む））。抗体はまた、活性形態にプロドラッグを変換し得る抗癌プロドラッグ活性化酵素に結合され得る。
「遺伝子産物」は、本明細書中でタンパク質またはｍＲＮＡと称されることもある。例えば、「本発明の遺伝子産物」は、本明細書中で「癌アミノ酸配列」、「癌タンパク質」、「表Ｉに列挙される癌のタンパク質」、「癌ｍＲＮＡ」、「表Ｉに列挙される癌のｍＲＮＡ」などと称されることもある。１つの実施形態において、癌タンパク質は、図２の核酸によってコードされる。癌タンパク質は、フラグメントであり得、あるいは図２の核酸によってコードされるフラグメントに対する全長タンパク質であり得る。１つの実施形態において、配列同一性または配列類似性を決定するために癌アミノ酸配列が使用される。別の実施形態において、配列は、図２の核酸によってコードされるタンパク質の天然に存在する対立遺伝子改変体である。別の実施形態において、配列は、本明細書中にさらに記載されるような配列改変体である。
特定の核酸またはタンパク質産物の存在、非存在、定量化または他の特性についての「高スループットスクリーニング」アッセイは、当業者に周知である。同様に、結合アッセイおよびレポーター遺伝子アッセイは周知である。従って、米国特許第５，５５９，４１０号は、タンパク質の高スループットスクリーニング方法を開示し；米国特許第５，５８５，６３９号は、核酸結合（すなわち、アレイにおいて）についての高スループットスクリーニング方法を開示し；一方、米国特許第５，５７６，２２０号および同第５，５４１，０６１号は、リガンド／抗体結合についての高スループットスクリーニング法を開示する。
さらに、高スループットスクリーニングシステムは、市販されている（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ；Ｚｙｍａｒｋ Ｃｏｒｐ．，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ；Ａｉｒ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｍｅｎｔｏｒ，ＯＨ；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ；Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ；などを参照のこと）。これらのシステムは、代表的には、全てのサンプルおよび試薬をピペッティングする工程、液体を調合する工程、定時インキュベーションの工程および最終的にアッセイに適切な検出器でマイクロプレートを読み取る工程を包含する全体の手順を自動化する。これらの構造化可能なシステムは、高スループットおよび迅速な起動ならびに高度な順応性および特別生産性（ｃｕｓｔｏｍｉｚａｔｉｏｎ）を提供する。このようなシステムの製造は、種々の高スループットシステムについて詳細なプロトコルを提供する。従って、例えば、Ｚｙｍａｒｋ Ｃｏｒｐ．は、遺伝子転写、リガンド結合などの調節を検出するためのスクリーニングシステムを記載する技術的な提示を提供する。
用語「ホモログ」は、別の分子（例えば、対応する位置で同様かまたは類似である化学残基の配列を有する分子）と相同性を示す、分子をいう。
「ヒト白血球抗原」または「ＨＬＡ」は、ヒトのクラスＩまたはクラスＩＩの主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）タンパク質である（例えば、Ｓｔｉｔｅｓら、ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，第８編．，Ｌａｎｇｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ，ＣＡ（１９９４）を参照のこと）。
ポリヌクレオチドの状況で使用される、用語「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）」、「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）」、「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｓ）」などは、従来のハイブリダイゼーション条件（好ましくは、例えば、５０％のホルムアミド／６×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳ／１００μｇ／ｍｌのｓｓＤＮＡ中でのハイブリダイゼーション）をいうことが意味される。ここでは、ハイブリダイゼーションの温度は３７℃を超え、そして０．１×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳ中での洗浄のための温度は５５℃より高い。
句「単離された」または「生物学的に純粋」は、ネイティブな状態で見出されるような物質を通常伴う構成要素を実質的にまたは本質的に含まない物質をいう。従って、本発明に従う単離されたペプチドは、好ましくはインサイチュ環境においてペプチドに通常付随する物質を含まない。例えば、ポリヌクレオチドは、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子以外の遺伝子に対応するかまたは相補的であるか、あるいは２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物またはそのフラグメント以外のポリペプチドをコードする混入物のポリヌクレオチドから実質的に分離される場合、「単離される」と言われる。当業者は、単離された２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドを得るために核酸単離手順を容易に利用し得る。タンパク質は、例えば、物理的方法、機械的方法または化学的方法が、タンパク質に通常付随する細胞の成分から２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質を除去するために利用される場合、「単離された」と言われる。当業者は、単離された２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質を得るために標準的な精製方法を容易に利用し得る。あるいは、単離されたタンパク質は、化学的手段によって調製され得る。
用語「哺乳動物」は、哺乳動物（マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマおよびヒトを含む）に分類される任意の生物をいう。本発明の１つの実施形態において、哺乳動物はマウスである。本発明の別の実施形態において、哺乳動物はヒトである。
用語「転移性の前立腺癌」および「転移性の疾患」は、局所的なリンパ節または離れた部位に拡大した前立腺癌を意味し、そしてＡＵＡシステムのもとでのステージＤの疾患、およびＴＮＭシステムのもとでのステージＴ×Ｎ×Ｍ＋を含むように意味される。局所的に進行した前立腺癌の症例における場合には、外科手術は、一般的には、転移性の疾患を有している患者については意図されず、そしてホルモン（アンドロゲンの切除）治療が、好ましい処置様式である。転移性の前立腺癌を有している患者は、最終的には、処置の開始の１２〜１８ヶ月以内のアンドロゲン治療不応性状態を発症する。これらのアンドロゲン治療不応性の患者のほぼ半分が、その状態の発症後６ヶ月以内に死亡する。前立腺癌の転移の最も一般的な部位は骨である。前立腺癌の骨転移は、しばしば、骨溶解よりもむしろ骨芽細胞性（すなわち、正味の骨の形成を生じる）である。骨転移は、脊椎においてもっとも頻繁に見出され、大腿骨、骨盤、肋骨郭（ｒｉｂ ｃａｇｅ）、頭蓋骨、および上腕骨が続く。他の一般的な転移の部位として、リンパ節、肺、肝臓、および脳が挙げられる。転移性の前立腺癌は、代表的には、開放性骨盤リンパ腺切除または腹腔鏡による骨盤リンパ腺切除、全身の放射性核種スキャン、骨格のレントゲン撮影、および／あるいは骨の病変の生検によって、診断される。
本明細書中で使用する場合、用語「モジュレーター」もしくは「試験化合物」もしくは「薬物候補」またはそれらの同義語（ｇｒａｍｍａｔｉｃａｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ）は、癌の表現型もしくは癌配列の発現（例えば、核酸配列またはタンパク質配列）、または癌配列の影響（例えば、シグナル伝達、遺伝子発現、タンパク質相互作用など）を直接的または間接的に変更する能力について試験される任意の分子（例えば、タンパク質、オリゴペプチド、有機低分子、多糖類、ポリヌクレオチドなど）を意味する。１つの局面において、モジュレーターは、本発明の癌タンパク質の影響を中和する。「中和する」は、タンパク質の活性が、細胞に対する持続的な効果と共に、阻害またはブロックされることを意味する。別の局面において、モジュレーターは、本発明の遺伝子、およびその対応するタンパク質の影響を、そのタンパク質レベルを正常にすることによって、中和する。好ましい実施形態において、モジュレーターは、発現プロフィール、または本明細書中で提供される核酸もしくはタンパク質の発現プロフィール、または下流のエフェクター経路を変更する。１つの実施形態において、モジュレーターは、癌の表現型（例えば、正常な組織フィンガープリントに対する表現型）を抑制する。別の実施形態において、モジュレーターは、癌の表現型を誘導する。一般的に、複数のアッセイ混合物が、異なる試薬濃度で平行に実施され、種々の濃度に対する異なる応答が得られる。代表的には、これらの濃度のうちの１つが、ネガティブコントロール（すなわち、ゼロ濃度または検出レベル以下）として機能する。
モジュレーター、薬物候補、または試験化合物は、多くの化学クラスを含むが、代表的に、それらは、有機分子、好ましくは、１００ダルトンより大きく約２，５００ダルトンよりも小さい分子量を有する小さい有機化合物である。好ましい低分子は、２０００Ｄ未満、または１５００Ｄ未満または１０００Ｄ未満または５００Ｄ未満である。候補因子は、タンパク質との構造的相互作用（特に、水素結合）に必要な官能基を含み、そして代表的には、少なくとも１つのアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基を含み、好ましくは、少なくとも２つの機能的化学基を含む。候補因子は、頻繁に、上記官能基の１つ以上で置換された環炭素もしくは複素環構造および／または芳香族構造もしくは多芳香族構造を含む。モジュレーターはまた、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造的アナログ、またはそれらの組み合わせのような生体分子を含む。ペプチドが特に好ましい。１つのモジュレーターのクラスは、ペプチド、例えば、約５〜約３５アミノ酸のペプチドであり、約５〜約２０アミノ酸が好ましく、約７〜約１５アミノ酸が特に好ましい。好ましくは、癌モジュレータータンパク質は、可溶性であり、非膜貫通領域を含み、そして／または可溶性を補助するＮ末端Ｃｙｓを有する。１つの実施形態において、フラグメントのＣ末端は、遊離酸として維持され、そしてＮ末端は、カップリング（すなわち、システインへのカップリング）を補助するための遊離アミンである。１つの実施形態において、本発明の癌タンパク質は、本明細書中で議論されるような免疫原性因子に結合される。１つの実施形態において、癌タンパク質は、ＢＳＡに結合される。本発明のポリペプチド（例えば、好ましい長さのポリペプチド）は、互いに連結され得るか、または他のアミノ酸に連結され、より長いペプチド／タンパク質を生成し得る。モジュレーターペプチドは、上記で概説されるような、天然に存在するタンパク質の消化産物、ランダムペプチド、または「偏った」ランダムペプチドであり得る。好ましい実施形態において、ペプチド／タンパク質ベースのモジュレーターは、本明細書中で定義されるような抗体およびそのフラグメントである。
癌のモジュレーターは、また、核酸であり得る。核酸調節因子は、天然に存在する核酸、ランダム核酸、または「偏った」ランダム核酸であり得る。例えば、原核生物ゲノムまたは真核生物ゲノムの消化産物は、タンパク質について上述したのと類似のアプローチで使用され得る。
用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体をいう。すなわち、この集団を含む抗体は、天然に存在するあり得る変異（少量で存在する）を除いて同一である）をいう。
２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質の生物学的モチーフとしての「モチーフ」は、タンパク質の一次配列の一部を形成するアミノ酸の任意のパターン（特定の機能（例えば、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−ＤＮＡ相互作用など）、または改変（例えば、リン酸化、グリコシル化、もしくはアミド化）、または局在（例えば、分泌配列、核局在化配列など）に関連する）、あるいは免疫原性（体液性または細胞性のいずれか）と関連する配列をいう。モチーフは、一般的に特定の機能または特性に関連する特定の位置に隣接するか、または整列し得るかのいずれかであり得る。ＨＬＡモチーフの前後関係において、「モチーフ」とは、特定のＨＬＡ分子によって認識される、規定された長さのペプチドにおける残基（通常、クラスＩ ＨＬＡモチーフに対する約８〜約１３のアミノ酸、およびクラスＩＩ ＨＬＡモチーフに対する約６〜約２５のアミノ酸のペプチド）のパターンをいう。ＨＬＡ結合についてのペプチドモチーフは、代表的に、各ヒトＨＬＡ対立遺伝子によってコードされる各タンパク質について異なり、そして一次アンカー残基および二次アンカー残基のパターンにおいて異なる。
「薬学的な賦形剤」とは、アジュバント、キャリア、ｐＨ調整剤および緩衝剤、等張剤、湿潤剤、保存剤などのような物質を含む。
「薬学的に受容可能な」とは、非毒性、不活性および／またはヒトもしくは他の哺乳動物と生理学的に適合する組成物をいう。
用語「ポリヌクレオチド」は、少なくとも１０個の塩基または塩基対の長さのヌクレオチドの多型性の形態（リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのいずれか、あるいはいずれかのヌクレオチドの型の改変された形態）を意味し、そして一本鎖および二本鎖の形態のＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含むことを意味する。当該分野において、この用語は、必要であれば、しばしば「オリゴヌクレオチド」と相互に使用される。ポリヌクレオチドは、本明細書中で開示されたヌクレオチド配列を含み得、ここでチミジン（Ｔ）（例えば、図２に示されるような）はまたウラシル（Ｕ）であり得る；この定義は、ＤＮＡおよびＲＮＡの化学的構造間の違い、特に４つの主な塩基のうち１つがＲＮＡでは、チミジン（Ｔ）の代わりにウラシル（Ｕ）であるという知見に関連する。
用語「ポリペプチド」は、少なくとも約４、５、６、７または８アミノ酸のポリマーを意味する。本明細書を通して、アミノ酸についての標準的な３文字表記または１文字表記が使用される。当該分野において、この用語は、しばしば「ペプチド」または「タンパク質」と相互に使用される。
ＨＬＡの「一次アンカー残基」は、免疫原性ペプチドとＨＬＡ分子との間に接触点を提供することが理解される、ペプチド配列に沿う特定の位置でのアミノ酸である。１〜３つ、通常２つの、規定された長さのペプチド内の一次アンカー残基は、一般的に、免疫原性ペプチドに対する「モチーフ」を規定する。これらの残基は、ＨＬＡ分子のペプチド結合グルーブと、この結合グローブの特異的ポケットに埋め込まれたそれらの側鎖とを密接に接触して適合されることが理解される。１つの実施形態において、例えば、ＨＬＡクラスＩ分子についての一次アンカー残基は、本発明に従って、（アミノ末端位置から）２位、そしてカルボキシ末端位置の残基ペプチドエピトープ８位、９位、１０位、１１位または１２位に局在される。あるいは、別の実施形態において、ＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するペプチドの一次アンカー残基は、ペプチドの末端ではなく、互いに関連して間隔をおいて配置される。ここで、ペプチドは、一般に少なくとも９アミノ酸長である。各モチーフおよびスーパーモチーフ（ｓｕｐｅｒｍｏｔｉｆ）についての一次アンカーの位置は、表ＩＶに示される。例えば、アナログペプチドは、表ＩＶに示される、一次アンカーの位置および／または二次アンカーの位置における特定の残基の存在または非存在を変更することによって作製され得る。このようなアナログは、特定のＨＬＡモチーフまたはスーパーモチーフを含むペプチドの結合親和性および／または集団範囲（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｃｏｖｅｒａｇｅ）を調節するために使用される。
「放射性同位体」としては以下が挙げられるが、これらに限定されない（非限定的な例示的用途もまた示される）：
医療用アイソトープの例：
アイソトープ
使用の説明
アクチニウム−２２５
（ＡＣ−２２５）
トリウム−２２９（Ｔｈ−２２９）参照のこと
アクチニウム−２２７
（ＡＣ−２２７）
癌（すなわち、乳癌および前立腺癌）および癌放射免疫療法から生じる骨格内の転移の処置、に使用するα放射体であるラジウム−２２３（Ｒａ−２２３）の親
ビスマス−２１２
（Ｂｉ−２１２）
トリウム−２２８（Ｔｈ−２２８）参照のこと
ビスマス−２１３
（Ｂｉ−２１３）
トリウム−２２９（Ｔｈ−２２９）参照のこと
カドミウム−１０９
（Ｃｄ−１０９）
癌検出
コバルト−６０
（Ｃｏ−６０）
癌の放射線治療、食品照射、および医薬品の殺菌のための放射線源
銅−６４
（Ｃｕ−６４）
癌治療およびＳＰＥＣＴ画像診断に使用される陽電子放射体
銅−６７
（Ｃｕ−６７）
癌放射免疫療法および診断検査（すなわち、乳癌、結腸癌およびリンパ腫）に用いられるβ／γ放射体
ジスプロシウム−１６６
（Ｄｙ−１６６）
癌放射免疫療法
エルビウム−１６９
（Ｅｒ−１６９）
特に手指および足指と結合している小さな関節についての関節リウマチ治療
ユーロピウム−１５２
（Ｅｕ−１５２）
食品照射、および医薬品の殺菌のための放射線源
ユーロピウム−１５４
（Ｅｕ−１５４）
食品照射、および医薬品の殺菌のための放射線源
ガドリニウム−１５３
（Ｇｄ−１５３）
骨粗鬆症検出および原子力の医学的品質保証デバイス
金−１９８
（Ａｕ−１９８）
移植ならびに卵巣癌、前立腺癌、および脳癌の腔内治療
ホルミウム−１６６
（Ｈｏ−１６６）
標的化された骨治療における多発性骨髄腫治療、癌放射免疫療法、骨髄切断、および関節リウマチ治療
ヨウ素−１２５
（Ｉ−１２５）
骨粗鬆症検出、画像診断、追跡薬物、脳癌治療、放射標識、腫瘍画像診断、脳内の受容体のマッピング、間質放射治療、前立腺癌治療の近接照射療法、糸球体濾過速度（ＧＦＲ）の測定、血漿量の測定、脚の深部静脈血栓の検出
ヨウ素−１３１
（Ｉ−１３１）
甲状腺機能評価、甲状腺疾患の検出、甲状腺癌および別の非悪性甲状腺疾患（すなわち、グレーヴズ疾患、甲状腺腫、および甲状腺機能亢進症）の治療、放射免疫療法を用いた白血病、リンパ腫、および別の癌の形態（例えば、乳癌）の治療
イリジウム−１９２
（Ｉｒ−１９２）
近接照射療法、脳腫瘍および脊髄腫の治療、動脈閉塞（すなわち、動脈硬化症および再狭窄）の治療、ならびに胸部腫瘍および前立腺腫瘍のためのインプラント
ルテチウム−１７７
（Ｌｕ−１７７）
癌放射免疫療法および動脈閉塞の治療（すなわち、動脈硬化症および再狭窄）
モリブデン−９９
（Ｍｏ−９９）
脳、肝臓、肺、心臓、および別の器官の画像診断に使用されるテクネチウム−９９ｍ（Ｔｃ−９９ｍ）の親。現在、Ｔｃ−９９ｍは、脳、心臓、肝臓、肺を含む種々の癌および疾患の画像診断のために使用される；また、脚の深部静脈血栓の検出に使用される放射性同位体のうち最も広く使用されている。
オスミウム−１９４
（Ｏｓ−１９４）
癌放射免疫療法
パラジウム−１０３
（Ｐｄ−１０３）
前立腺癌治療
白金−１９５ｍ
（Ｐｔ−１９５ｍ）
シスプラチン、化学療法薬物の体内分布および代謝の検査
リン−３２
（Ｐ−３２）
真性多血症（血球疾患）および白血病の治療、骨の癌の診断／治療；結腸癌、膵臓癌、および肝臓癌の治療；インビトロ検査のための核酸の放射標識、表面腫瘍の診断、動脈閉塞（すなわち、動脈硬化症および再狭窄）の治療、ならびに体腔内治療
リン−３３
（Ｐ−３３）
白血病治療、骨疾患の診断／治療、放射標識、および動脈閉塞（すなわち、動脈硬化症および再狭窄）の治療
ラジウム−２２３
（Ｒａ−２２３）
アクチニウム−２２７（Ａｃ−２２７）参照
レニウム−１８６
（Ｒｅ−１８６）
骨の癌の疼痛の軽減、関節リウマチ治療、ならびに放射免疫療法を用いたリンパ腫、骨の癌、乳癌、結腸癌、および肝臓癌の診断、および治療
レニウム−１８８
（Ｒｅ−１８８）
放射免疫療法を用いた癌の診断および治療、骨の癌の疼痛の軽減、慢性関節リウマチの治療、および前立腺癌の治療
ロジウム−１０５
（Ｒｈ−１０５）
癌放射免疫療法
サマリウム−１４５
（Ｓｍ−１４５）
眼の癌の治療
サマリウム−１５３
（Ｓｍ−１５３）
癌放射免疫療法および骨の癌の疼痛の軽減
スカンジウム−４７
（Ｓｃ−４７）
癌放射免疫療法および骨の癌の疼痛の軽減
セレニウム−７５
（Ｓｅ−７５）
脳の検査に用いられる放射性トレーサー、γ−シンチグラフィーを用いた副腎皮質の画像診断、ステロイド分泌腫瘍の側方位置、膵臓のスキャンニング、副甲状腺機能亢進症の検出、内因性プールからの胆汁酸減少率の測定
ストロンチウム−８５
（Ｓｒ−８５）
骨の癌の検出および脳のスキャン
ストロンチウム−８９
（Ｓｒ−８９）
骨の癌の疼痛の軽減，多発性骨髄腫治療、および骨芽細胞の治療
テクネチウム−９９ｍ
（Ｔｃ−９９ｍ）
モリブデン−９９（Ｍｏ−９９）参照のこと
トリウム−２２８
（Ｔｈ−２２８）
癌放射免疫療法に用いられるα放射体であるビスマス−２１２（Ｂｉ−２１２）の親
トリウム−２２９
（Ｔｈ−２２９）
癌放射免疫療法に用いられるα放射体であるアクチニウム−２２５（Ａｃ−２２５）の親およびビスマス−２１３（Ｂｉ−２１３）の祖父母
ツリウム−１７０
（Ｔｍ−１７０）
血液照射器のためのγ線源、移植用の医学的デバイスのためのエネルギー源
スズ−１１７ｍ
（Ｓｎ−１１７ｍ）
癌放射免疫療法および骨の癌の疼痛の軽減
タングステン−１８８
（Ｗ−１８８）
癌の診断／治療、骨の癌の疼痛の軽減、慢性関節リウマチ治療、および動脈閉塞（すなわち、動脈硬化症および再狭窄）の治療に使用されるレニウム−１８８（Ｒｅ−１８８）に対する親
キセノン−１２７
（Ｘｅ−１２７）
脳障害の神経画像診断、高解像度ＳＰＥＣＴ検査、肺機能検査、および脳血流検査
イッテルビウム−１７５
（Ｙｂ−１７５）
癌放射免疫療法
イットリウム−９０
（Ｙ−９０）
肝臓癌治療ためのイットリウム−８９（Ｙ−８９）の照射から得られるマイクロ種
イットリウム−９１
（Ｙ−９１）
癌放射免疫療法（すなわち、リンパ腫、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、ならびに手術不能の肝臓癌）に使用されるイットリウム−９０（Ｙ−９０）のγ放射標識
核酸およびタンパク質において本明細書中で適用される、「無作為化（ランダム化）（された）」、またはその文法的に等価なものは、それぞれ、核酸およびペプチドの各々が、本質的に無作為化された、ヌクレオチドおよびアミノ酸からなることを意味する。これらの無作為化されたペプチド（または、本明細書中で議論されるような核酸）は、任意の位置で任意のヌクレオチドまたはアミノ酸を取り込み得る。この合成プロセスは、無作為したタンパク質または核酸を生成して、配列の長さ部分にわたって可能な組合せの全てまたは殆どの形成を可能にし、それによって無作為化された候補生物活性タンパク質性薬剤のライブラリーを形成するように設計され得る。
１つの実施形態において、ライブラリーが「完全に無作為化され」、いずれの位置においても、配列の傾向または配列の一定性は存在しない。別の実施形態において、このライブラリーは、「偏って無作為化」されたライブラリーである。すなわち、この配列内のいくつかの場所は、一定となるように保持されるかまたは、限定された確率で選択されるかのいずれかである。例えば、ヌクレオチド残基またはアミノ酸残基は、例えば、核酸結合ドメインの生成、架橋のためシステインの生成、ＳＨ３ドメインのためのプロリン、リン酸化部位などのためのセリン、スレオニン、チロシンまたはヒスチジンなど、あるいはプリンなどに対して、疎水性アミノ酸残基、親水性アミノ酸残基、空間的に偏りをもった（小さいかまたは大きいかのいずれか）の残基である、規定されたクラスの中で無作為化される。
「組換え」ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子は、インビトロでの分子操作に供されるＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である。
低分子の非限定的な例としては、２４Ｐ４Ｃ１２リガンドに結合または相互作用する化合物（ホルモン、神経ペプチド、ケモカイン、臭気剤、リン脂質、および結合し、そして好ましくは２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質機能を阻害するそれらの機能等価物が挙げられる）が挙げられる。このような非限定的な低分子は、好ましくは約１０ｋＤａ未満の分子量、より好ましくは約９ｋＤａ、約８ｋＤａ、約７ｋＤａ、約６ｋＤａ、約５ｋＤａまたは約４ｋＤａ未満の分子量を有する。特定の実施形態において、低分子は、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質と物理的に会合するか、または２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質に結合する；天然に存在する代謝経路において見出されない；そして／または非水溶液よりも水溶液により可溶性である。
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定可能であり、そして一般的には、プローブの長さ、洗浄温度、および塩濃度に依存する経験的な計算である。一般的には、より長いプローブは、適切なアニーリングのためにより高い温度を必要とし、一方、より短いプローブは、より低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは、一般的には、それらの融解温度未満の環境下に相補鎖が存在する場合に、変性された核酸配列が再度アニーリングする能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間で所望される相同性の程度が高ければ高いほど、使用され得る相対的な温度は高くなる。結果として、より高い相対的な温度が、反応条件をよりストリンジェントにする傾向があり、一方、より低い温度はあまりそうではないという結果になる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および説明については、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（１９９５）を参照のこと。
「ストリンジェントな条件」、または「高ストリンジェントな条件」は、本明細書中で定義される場合は、以下によって同定され得るがこれらに限定されない：（１）洗浄のために低いイオン強度および高温（例えば、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム、５０℃）を使用する；（２）変性剤（例えば、ホルムアミド）をハイブリダイゼーションの間に使用する（例えば、０．１％のウシの血清アルブミンを有する５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミド／０．１％のＦｉｃｏｌｌ／０．１％のポリビニルピロリドン／７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを有するｐＨ６．５の５０ｍＭの燐酸ナトリウム緩衝液、４２℃）；または（３）５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理したサケの精子のＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、および１０％のデキストラン硫酸を４２℃で使用し、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中で４２℃で、そして５０％のホルムアミド中で５５℃で洗浄し、続いて５５℃でＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣから構成される高ストリンジェンシーな洗浄を行う。「中程度のストリンジェントな条件」は、限定されないが、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９８９によって記載され、そして上記に記載されているハイブリダイゼーション条件よりもストリンジェントの低い洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度および％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度のストリンジェントの条件の例は、２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％のデキストラン硫酸、および２０ｍｇ／ｍＬの変性された剪断されたサケの精子のＤＮＡを含有している溶液中で３７℃での一晩のインキュベーション、続く１×ＳＳＣ中での約３７℃〜５０℃でのフィルターの洗浄である。当業者は、プローブの長さなどの因子に順応させることが必要とされる場合には、温度、イオン強度などを調節するための方法を認識する。
ＨＬＡの「スーパーモチーフ」は、２つ以上のＨＬＡ対立遺伝子によってコードされるＨＬＡ分子によって共有されるペプチド結合特異的である。様々な人種集団におけるＨＬＡスーパータイプの全表現型の頻度は、表ＩＶ（Ｆ）に示される。種々のスーパータイプの非限定的な構成要素は、以下のとおりである：
Figure 2006508163
 異なるＨＬＡスーパータイプの組み合わせによって得られる計算された集団の適用範囲は、表ＩＶ（Ｇ）に示される。
本明細書中で使用される場合、「処置すること」または「処置的な」および文法的に関連する用語は、疾患の任意の結果（例えば、延長した生存、より少ない罹患率、および／または副作用（代替的な治療形式の副産物；疾患の完全な撲滅が必要とされない）の減少）の任意の改善をいう。
「トランスジェニック動物」（例えば、マウスまたはラット）は、導入遺伝子を含む細胞を有する動物であり、この導入遺伝子は、動物に導入されたか、または出生前（例えば、胚の段階）に動物の先祖に導入された。「導入遺伝子」は、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノム中に組込まれるＤＮＡである。
本明細書中で使用する場合、ＨＬＡまたは細胞性免疫応答「ワクチン」は、本発明の１つ以上のペプチドを含むか、またはコードする組成物をいう。このようなワクチン（例えば１つ以上の別個のペプチド；ポリエピトープペプチドによって含まれる、本発明の１つ以上のペプチド；あるいはこのような別個のペプチドまたはポリエピトープ（例えば、ポリエピトープペプチドをコードするミニ遺伝子）をコードする核酸）の多数の実施形態が存在する。「１つ以上のペプチド」は、１〜１５０またはそれ以上（例えば、本発明の少なくとも、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、または１５０以上のペプチド）の任意の全整数単位が挙げられ得る。ペプチドまたはポリペプチドは、必要に応じて、（例えば、脂質化、標的化配列または他の配列の付加によって）改変され得る。本発明のＨＬＡクラスＩペプチドは、細胞傷害性Ｔリンパ球およびヘルパーＴリンパ球の両方の活性化を促進させるために、ＨＬＡクラスＩＩペプチドと混合または連結され得る。ＨＬＡワクチンはまた、ペプチドパルス抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）を含み得る。
用語「改変体」とは、記載される型または基準（例えば、特に記載されるタンパク質（例えば、図２または図３に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質）の対応部分に、１つ以上の異なるアミノ酸残基を有するタンパク質）からの改変を示す分子をいう。アナログは、改変タンパク質の例である。スプライシングアイソフォームおよび一塩基多型（ＳＮＰ）は、改変体のさらなる例である。
本発明の「２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質」としては、本明細書中で具体的に同定されたタンパク質、ならびに対立遺伝子改変体、（本明細書中に概説される方法または当該分野で用意に利用可能な方法に従って実験を実施することなく、単離／生成され得、そして特徴付けられ得る）保存的置換改変体、アナログおよびホモログが挙げられる。異なる２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質またはそのフラグメントの一部分に結合する融合タンパク質、ならびに２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質および異種ポリペプチドの融合タンパク質もまた、含まれる。このような２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質は、本発明のタンパク質である２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質、または２４Ｐ４Ｃ１２として集合的に称される。用語「２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質」とは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２５より多いアミノ酸；あるいは少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０または６６４以上のアミノ酸の、ポリペプチドフラグメントまたは２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質配列をいう。
（ＩＩ．）２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチド）
本発明の１つの局面は、２４Ｐ４Ｃ１２の遺伝子、ｍＲＮＡおよび／またはコード配列の全てまたは一部に対応するかまたは相補的な、好ましくは単離形態のポリヌクレオチドを提供し、これには、２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびそのフラグメント、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、および関連分子、２４Ｐ４Ｃ１２の遺伝子もしくはｍＲＮＡ配列に相補的なポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドまたはその一部、ならびに２４Ｐ４Ｃ１２の遺伝子、ｍＲＮＡ、または２４Ｐ４Ｃ１２コードポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド（集合的に「２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチド」）が挙げられる。この節において参照される場合、全ての例において、Ｔは、図２において、Ｕでもあり得る。
２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドの実施形態としては、以下が挙げられる：図２に示される配列を有する２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチド、図２に示されるような２４Ｐ４Ｃ１２ヌクレオチド配列（ここで、ＴはＵである）；図２に示されるような配列を有するポリヌクレオチドの少なくとも１０個連続するヌクレオチド；または図２に示される配列を有するポリヌクレオチドの少なくとも１０個連続するヌクレオチド（ここで、ＴはＵである）。例えば、２４Ｐ４Ｃ１２ヌクレオチドの実施形態は、限定ではなく、以下を含む：
（Ｉ）図２に示されるような配列を含むか、実質的にこのような配列からなるか、またはこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＩＩ）図２Ａに示されるような配列の、ヌクレオチド残基番号６〜ヌクレオチド残基番号２１３８（終止コドンを含む）を含むか、実質的にこのような配列からなるか、またはこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＩＩＩ）図２Ｂに示されるような配列の、ヌクレオチド残基番号６〜ヌクレオチド残基番号２１３８（終止コドンを含む）を含むか、実質的にこのような配列からなるか、またはこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＩＶ）図２Ｃに示されるような配列の、ヌクレオチド残基番号６〜ヌクレオチド残基番号２１３８（終止コドンを含む）を含むか、実質的にこのような配列からなるか、またはこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（Ｖ）図２Ｄに示されるような配列の、ヌクレオチド残基番号６〜ヌクレオチド残基番号２１３８（終止コドンを含む）を含むか、実質的にこのような配列からなるか、またはこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＶＩ）図２Ｅに示されるような配列の、ヌクレオチド残基番号６〜ヌクレオチド残基番号２１３８（終止コドンを含む）を含むか、実質的にこのような配列からなるか、またはこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＶＩＩ）図２Ｆに示されるような配列の、ヌクレオチド残基番号６〜ヌクレオチド残基番号２１３８（終止コドンを含む）を含むか、実質的にこのような配列からなるか、またはこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＶＩＩＩ）図２Ｇに示されるような配列の、ヌクレオチド残基番号６〜ヌクレオチド残基番号１８０２（終止コドンを含む）を含むか、実質的にこのような配列からなるか、またはこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＩＸ）図２Ｈに示されるような配列の、ヌクレオチド残基番号６〜ヌクレオチド残基番号２１７４（終止コドンを含む）を含むか、実質的にこのような配列からなるか、またはこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（Ｘ）図２Ｉに示されるような配列の、ヌクレオチド残基番号６〜ヌクレオチド残基番号２１４４（終止コドンを含む）を含むか、実質的にこのような配列からなるか、またはこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＸＩ）図２Ａ〜Ｉに示される全長アミノ酸配列に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％相同な２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＸＩＩ）図２Ａ〜Ｉに示される全長アミノ酸配列に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％同一な２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＸＩＩＩ）表ＶＩＩＩ〜ＸＸＩおよびＸＸＩＩ〜ＸＬＩＸに示される少なくとも１つのペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ＸＩＶ）図５の親水性プロフィールにおいて０．５より大きい値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、図３Ａ〜Ｄのペプチドの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸から、７１０までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードする、ポリヌクレオチド；
（ＸＶ）図６の疎水性プロフィールにおいて０．５より大きい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、図３Ａ〜Ｄのペプチドの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸から、７１０までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードする、ポリヌクレオチド；
（ＸＶＩ）図７の接近可能残基の％プロフィールにおいて０．５より大きい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、図３Ａ〜Ｄのペプチドの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸から、７１０までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードする、ポリヌクレオチド；
（ＸＶＩＩ）図８の平均可撓性プロフィールにおいて０．５より大きい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、図３Ａ〜Ｄのペプチドの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸から、７１０までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードする、ポリヌクレオチド；
（ＸＶＩＩＩ）図９のβ−ターンプロフィールにおいて０．５より大きい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、図３Ａ〜Ｄのペプチドの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸から、７１０までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードする、ポリヌクレオチド；
（ＸＩＸ）図５の親水性プロフィールにおいて０．５より大きい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、図３Ｅのペプチドの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸から、５９８までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードする、ポリヌクレオチド；
（ＸＸ）図６の疎水性プロフィールにおいて０．５より大きい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、図３Ｅのペプチドの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸から、５９８までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードする、ポリヌクレオチド；
（ＸＸＩ）図７の接近可能残基の％プロフィールにおいて０．５より大きい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、図３Ｅのペプチドの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸から、５９８までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードする、ポリヌクレオチド；
（ＸＸＩＩ）図８の平均可撓性プロフィールにおいて０．５より大きい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、図３Ｅのペプチドの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸から、５９８までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードする、ポリヌクレオチド；
（ＸＸＩＩＩ）図９のβ−ターンプロフィールにおいて０．５より大きい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、図３Ｅのペプチドの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸から、５９８までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードする、ポリヌクレオチド；
（ＸＸＩＶ）図５の親水性プロフィールにおいて０．５より大きい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、図３Ｆのペプチドの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸から、７２２までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードする、ポリヌクレオチド；
（ＸＸＶ）図６の疎水性プロフィールにおいて０．５より大きい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、図３Ｆのペプチドの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸から、７２２までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードする、ポリヌクレオチド；
（ＸＸＶＩ）図７の接近可能残基の％プロフィールにおいて０．５より大きい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、図３Ｆのペプチドの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸から、７２２までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードする、ポリヌクレオチド；
（ＸＸＶＩＩ）図８の平均可撓性プロフィールにおいて０．５より大きい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、図３Ｆのペプチドの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸から、７２２までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードする、ポリヌクレオチド；
（ＸＸＶＩＩＩ）図９のβ−ターンプロフィールにおいて０．５より大きい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、図３Ｆのペプチドの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸から、７２２までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードする、ポリヌクレオチド；
（ＸＸＩＸ）図５の親水性プロフィールにおいて０．５より大きい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、図３Ｇのペプチドの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸から、７１２までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードする、ポリヌクレオチド；
（ＸＸＸ）図６の疎水性プロフィールにおいて０．５より大きい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、図３Ｇのペプチドの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸から、７１２までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードする、ポリヌクレオチド；
（ＸＸＸＩ）図７の接近可能残基の％プロフィールにおいて０．５より大きい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、図３Ｇのペプチドの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸から、７１２までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードする、ポリヌクレオチド；
（ＸＸＸＩＩ）図８の平均可撓性プロフィールにおいて０．５より大きい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、図３Ｇのペプチドの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸から、７１２までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードする、ポリヌクレオチド；
（ＸＸＸＩＩＩ）図９のβ−ターンプロフィールにおいて０．５より大きい値を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸位置を含む、図３Ｇのペプチドの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸から、７１２までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードする、ポリヌクレオチド；
（ＸＸＸＩＶ）（Ｉ）〜（ＸＸＸＩＩＩ）のいずれか１つのポリヌクレオチドに完全に相補的なポリヌクレオチド；
（ＸＸＸＶ）（Ｉ）〜（ＸＸＸＩＩＩ）のいずれかによってコードされるペプチド；および
（ＸＸＸＶＩ）薬学的賦形剤と一緒になったか、そして／またはヒトの単位投薬形態中での、（Ｉ）〜（ＸＸＸＩＶ）のうちのいずれかのポリヌクレオチドまたは（ＸＸＸＶ）のペプチドを含む組成物。
（ＸＸＸＶＩＩ）２４Ｐ４Ｃ１２を発現する細胞を調節する方法における（Ｉ）〜（ＸＸＸＩＶ）のうちのいずれかのポリヌクレオチドもしくは（ＸＸＸＶ）のペプチドまたは（ＸＸＸＶＩ）の組成物を使用する方法；
（ＸＸＸＶＩＩＩ）２４Ｐ４Ｃ１２を発現する細胞を有する個体を診断、予防、予後もしくは処置する方法における（Ｉ）〜（ＸＸＸＩＶ）のうちのいずれかのポリヌクレオチドもしくは（ＸＸＸＶ）のペプチドまたは（ＸＸＸＶＩ）の組成物を使用する方法；
（ＸＸＸＩＸ）２４Ｐ４Ｃ１２を発現する細胞（表Ｉに列挙される組織の癌由来の細胞）を有する個体を診断、予防、予後もしくは処置する方法における（Ｉ）〜（ＸＸＸＩＶ）のうちのいずれかのポリヌクレオチドもしくは（ＸＸＸＶ）のペプチドまたは（ＸＸＸＶＩ）の組成物を使用する方法；
（ＸＬ）癌を診断、予防、予後もしくは処置する方法における（Ｉ）〜（ＸＸＸＩＶ）のうちのいずれかのポリヌクレオチドもしくは（ＸＸＸＶ）のペプチドまたは（ＸＸＸＶＩ）の組成物を使用する方法；
（ＸＬＩ）表Ｉに列挙される組織の癌を診断、予防、予後もしくは処置する方法における（Ｉ）〜（ＸＸＸＩＶ）のうちのいずれかのポリヌクレオチドもしくは（ＸＸＸＶ）のペプチドまたは（ＸＸＸＶＩ）の組成物を使用する方法；および
（ＸＬＩＩ）２４Ｐ４Ｃ１２を発現する細胞の調節因子を同定もしくは特徴付ける方法における（Ｉ）〜（ＸＸＸＩＶ）のうちのいずれかのポリヌクレオチドもしくは（ＸＸＸＶ）のペプチドまたは（ＸＸＸＶＩ）の組成物を使用する方法。
本明細書中で使用する場合、ある範囲は、その全単位位置の全てを具体的に開示することが理解される。
本明細書中に開示される発明の代表的な実施形態としては、タンパク質および／またはそのフラグメントをコードするような２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡ配列の特定の部分をコードする２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチド（およびこのような配列に相補的なポリヌクレオチド）が挙げられる（例えば：
（ａ）２４Ｐ４Ｃ１２改変体１の、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７１０個またはそれ以上連続するアミノ酸；他の改変体に対して関連する最長の長さは：改変体３、７１０アミノ酸：改変体５、７１０アミノ酸：改変体６、７１０アミノ酸：改変体７、５９８アミノ酸：改変体８、７２２アミノ酸および改変体９、７１２アミノ酸である。）
例えば、本明細書中に開示される発明の代表的な実施形態としては、以下が挙げられる：図２または図３に示されるカルボキシル末端アミノ酸の末端に約１０アミノ酸を加えた、図２または図３に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の約アミノ酸１〜約アミノ酸１０をコードする、ポリヌクレオチドおよびコードされたペプチド自体、図２または図３に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の約アミノ酸１０〜約アミノ酸２０をコードするポリヌクレオチド、図２または図３に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の約アミノ酸２０〜約アミノ酸３０をコードするポリヌクレオチド、図２または図３に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の約アミノ酸３０〜約アミノ酸４０をコードするポリヌクレオチド、図２または図３に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の約アミノ酸４０〜約アミノ酸５０をコードするポリヌクレオチド、図２または図３に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の約アミノ酸５０〜約アミノ酸６０をコードするポリヌクレオチド、図２または図３に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の約アミノ酸６０〜約アミノ酸７０をコードするポリヌクレオチド、図２または図３に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の約アミノ酸７０〜約アミノ酸８０をコードするポリヌクレオチド、図２または図３に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の約アミノ酸８０〜約アミノ酸９０をコードするポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、図２または図３に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の約アミノ酸９０〜約アミノ酸１００をコードするポリヌクレオチド。従って、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のアミノ酸１００〜カルボキシル末端アミノ酸の（約１０アミノ酸の）アミノ酸配列の部分をコードするポリヌクレオチドは、本発明の実施形態である。ここで、各特定のアミノ酸位置は、±５アミノ酸残基の位置を開示することが理解される。
２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の比較的長い部分をコードするポリヌクレオチドもまた、本発明の範囲内である。例えば、図２または図３に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質またはその「改変体」の、約アミノ酸１（または２０または３０または４０など）〜約アミノ酸２０（または３０または４０または５０など）をコードするポリヌクレオチドは、当該分野で周知の種々の技術によって生成され得る。これらのポリヌクレオチドフラグメントは、図２に示されるような２４Ｐ４Ｃ１２配列の任意の部分を含み得る。
本明細書中に開示される発明のさらなる例示的実施形態としては、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質配列または「改変体」配列内に含まれる１以上の生物学的モチーフをコードする２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドフラグメントが挙げられ、これには、表ＶＩＩＩ〜ＸＸＩおよびＸＸＩＩ〜ＸＬＩＸに示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質または「改変体」の、１以上のモチーフ保有部分配列が挙げられる。別の実施形態において、本発明の代表的なポリヌクレオチドフラグメントは、既知の分子に対する相同性を示す２４Ｐ４Ｃ１２のタンパク質または改変体の、１以上の領域をコードする。本発明の別の実施形態において、代表的なポリヌクレオチドフラグメントは、２４Ｐ４Ｃ１２のタンパク質または改変体のＮ−グリコシル化部位、ｃＡＭＰ依存性およびｃＧＭＰ依存性のプロテインキナーゼリン酸化部位、カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位またはＮ−ミリストイル化部位、ならびにアミド化部位のうち１以上をコードし得る。
その親タンパク質（例えば、改変体１、改変体２など）に対する、表ＶＩＩＩ〜ＸＸＩおよび表ＸＸＩＩ〜ＸＬＩＸ（集合的に、ＨＬＡペプチド表）に示される任意のペプチドのそれぞれの開始位置を決定するために、以下の３つの因子について言及がなされることに留意のこと：特定の改変体、ＨＬＡペプチド表中のペプチドの長さ、表ＬＶＩＩに列挙される検索ペプチド。一般に、独自の検索ペプチドが、特定の改変体についてのＨＬＡペプチドを得るために使用される。そのそれぞれの親分子に関する各検索ペプチドの位置は、表ＶＩＩに列挙される。従って、検索ペプチドが位置「Ｘ」で開始する場合、それらの親分子中のＨＬＡペプチドの実際の位置を得るために、表ＶＩＩＩ〜ＸＸＩおよび表ＸＸＩＩ〜ＩＬ中の各位置に、「Ｘ−１」の値を加算しなければならない。例えば、特定の検索ペプチドがその親分子の位置１５０にて開始する場合、親分子中のアミノ酸の位置を計算するために、１５０−１（すなわち、１４９）を、各ＨＬＡペプチドのアミノ酸位置に加算しなければならない。
（ＩＩ．Ａ．）２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドの用途）
（ＩＩ．Ａ．１．）遺伝子異常のモニタリング）
上記項目のポリヌクレオチドは、多数の異なる特定の用途を有する。ヒト２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子は、「２４Ｐ４Ｃ１２の染色体マッピング」との表題の実施例において示される染色体位置にマッピングされる。例えば、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子は、この染色体にマッピングされるので、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の異なる領域をコードするポリヌクレオチドは、この染色体位置の細胞発生異常（例えば、種々の癌に関連するとして同定された異常）を特徴付けるために使用される。特定の遺伝子において、再編成を含む種々の染色体異常が、多数の異なる癌における頻繁な細胞発生的異常として同定されている（例えば、Ｋｒａｊｉｎｏｖｉｃら、Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．３８２（３−４）：８１−８３（１９９８）；Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら、Ｂｌｏｏｄ ８６（１０）：３９０５−３９１４（１９９５）およびＦｉｎｇｅｒら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．８５（２３）：９１５８−９１６２（１９８８）を参照のこと）。従って、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の特定の領域をコードするポリヌクレオチドは、悪性の表現型に寄与し得る、２４Ｐ４Ｃ１２をコードする染色体領域における細胞発生的異常を説明するために使用され得る、以前に可能であったツールよりもより正確な、新たなツールを提供する。この文脈において、これらのポリヌクレオチドは、より微妙な染色体異常およびあまり一般的でない染色体異常を同定するために、染色体スクリーニングの感受性を拡大することについての、当該分野における必要性を満たす（例えば、Ｅｖａｎｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ １７１（４）：１０５５−１０５７（１９９４）を参照のこと）。
さらに、２４Ｐ４Ｃ１２は、膀胱癌および他の癌において高度に発現されることが示されているので、２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドは、正常組織 対 癌性組織における２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物の状態を評価する方法において使用される。代表的に、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の特定の領域をコードするポリヌクレオチドは、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子の特定の領域（例えば、１以上のモチーフを含む領域）における乱れ（例えば、抗原の喪失などを生じる欠失、挿入、点変異または改変）の存在を評価するために使用される。例示的なアッセイとしては、ＲＴ−ＰＣＲアッセイおよび一本鎖コンホメーション多型（ＳＳＣＰ）分析（例えば、Ｍａｒｒｏｇｉら、Ｊ．Ｃｕｔａｎ．Ｐａｔｈｏｌ．２６（８）：３６９−３７８（１９９９）を参照のこと）の両方が挙げられ、これらは両方とも、タンパク質内のこれらの領域を試験するために、タンパク質内の特定の領域をコードするポリヌクレオチドを利用する。
（ＩＩ．Ａ．２．）アンチセンスの実施形態）
本明細書中に開示される本発明の、他の具体的に企図された核酸に関する実施形態は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、リボザイムおよびアンチセンス分子、ならびに天然供給源由来であるか合成であるかにかかわらない、代替骨格に基づく核酸分子または代替塩基を含む核酸分子であり、そしてこれには、２４Ｐ４Ｃ１２のＲＮＡ発現またはタンパク質発現を阻害し得る分子が含まれる。例えば、アンチセンス分子は、塩基対依存的な様式でＤＮＡまたはＲＮＡに特異的に結合する、ペプチド核酸（ＰＮＡ）または非核酸分子（例えば、ホスホロチオエート誘導体）を含む、ＲＮＡまたは他の分子であり得る。当業者は、本明細書中に開示される２４Ｐ４Ｃ１２のポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド配列を使用して、これらのクラスの核酸分子を容易に獲得し得る。
アンチセンス技術は、細胞内に位置する標的ポリヌクレオチドに結合する外因性オリゴヌクレオチドの投与を伴う。用語「アンチセンス」は、このようなオリゴヌクレオチドが、その細胞内標的（例えば、２４Ｐ４Ｃ１２）に相補的であるという事実をいう。例えば、Ｊａｃｋ Ｃｏｈｅｎ、Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９８９；およびＳｙｎｔｈｅｓｉｓ １：１−５（１９８８）を参照のこと。本発明の２４Ｐ４Ｃ１２アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、誘導体（例えば、Ｓ−オリゴヌクレオチド（ホスホロチオエート誘導体またはＳ−オリゴ、Ｊａｃｋ Ｃｏｈｅｎ（前出）を参照のこと）が挙げられ、これは、増強された癌細胞増殖阻害活性を示す。Ｓ−オリゴ（ヌクレオシドホスホロチオエート）は、リン酸基の非架橋酸素原子が硫黄原子によって置換されている、オリゴヌクレオチド（Ｏ−オリゴ）の等電子アナログである。本発明のＳ−オリゴは、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド（これは、硫黄転移試薬である）での対応するＯ−オリゴの処理によって調製され得る。例えば、Ｉｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５：４６９３−４６９８（１９９０）；およびＩｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：１２５３−１２５４（１９９０）。本発明のさらなる２４Ｐ４Ｃ１２アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、当該分野で公知のモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる（例えば、Ｐａｒｔｒｉｄｇｅら、１９９６、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ６：１６９−１７５を参照のこと）。
本発明の２４Ｐ４Ｃ１２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、代表的に、２４Ｐ４Ｃ１２ゲノム配列または対応するｍＲＮＡの最初の１００個の５’側コドンまたは最後の１００個の３’側コドンに相補的であり、かつこれらと安定にハイブリダイズする、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。完全な相補性は必要ないが、高度な相補性が好ましい。この領域に相補的なオリゴヌクレオチドの使用によって、２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡへの選択的なハイブリダイゼーションは可能になるが、プロテインキナーゼの他の調節サブユニットを指定するｍＲＮＡへの選択的なハイブリダイゼーションは可能にならない。１つの実施形態において、本発明の２４Ｐ４Ｃ１２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡにハイブリダイズする配列を有するアンチセンスＤＮＡ分子の１５〜３０マーのフラグメントである。必要に応じて、２４Ｐ４Ｃ１２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２４Ｐ４Ｃ１２の最初の１０個の５’側コドンまたは最後の１０個の３’側コドン中の領域に相補的な３０マーのオリゴヌクレオチドである。あるいは、このアンチセンス分子は、２４Ｐ４Ｃ１２発現の阻害においてリボザイムを使用するように改変される（例えば、Ｌ．Ａ．Ｃｏｕｔｕｒｅ ＆ Ｄ．Ｔ．Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ；Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ １２：５１０−５１５（１９９６）を参照のこと）。
（ＩＩ．Ａ．３．）プライマーおよびプライマー対）
本発明のこのヌクレオチドのさらに特定の実施形態としては、プライマーおよびプライマー対（これらは、本発明のポリヌクレオチドまたはその任意の特定の部分の特異的増幅を可能にする）、ならびにプローブ（これは、本発明の核酸分子またはその任意の部分に選択的にかまたは特異的にハイブリダイズする）が挙げられる。プローブは、検出可能なマーカー（例えば、放射性同位体、蛍光化合物、生体発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素）で標識され得る。このようなプローブおよびプライマーは、サンプル中の２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドの存在を検出するため、および２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質を発現する細胞を検出するための手段として使用される。
このようなプローブの例としては、図２に示されるヒト２４Ｐ４Ｃ１２ ｃＤＮＡ配列の全てまたは一部を含むポリヌクレオチドが挙げられる。２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡを特異的に増幅し得るプライマー対の例もまた、実施例に記載される。当業者によって理解されるように、非常に多数の異なるプライマーおよびプローブが、本明細書中に提供される配列に基づいて調製され得、そして２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡを増幅および／または検出するために有効に使用され得る。
本発明の２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドは、種々の目的のために有用であり、その用途としては、限定ではなく以下が挙げられる：２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子、ｍＲＮＡもしくはそのフラグメントの増幅および／または検出のためのプローブおよびプライマーとして；前立腺癌および他の癌の診断および／または予後のための試薬として；２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチドの発現を指向し得るコード配列として；２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子の発現および／または２４Ｐ４Ｃ１２転写物の翻訳を調節または阻害するためのツールとして；そして治療剤として。
本発明は、天然に存在する供給源（例えば、ヒトまたは他の哺乳動物）由来の２４Ｐ４Ｃ１２核酸配列または２４Ｐ４Ｃ１２関連核酸配列を同定および単離するための、本明細書中に記載されるような任意のプローブの使用、ならびに単離された核酸配列自体（これは、使用されるプローブ中に見出される配列の全てまたはほとんどを含む）を包含する。
（ＩＩ．Ａ．４．）２４Ｐ４Ｃ１２コード核酸分子の単離）
本明細書中に記載される２４Ｐ４Ｃ１２ ｃＤＮＡ配列は、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物をコードする他のポリヌクレオチドの単離、ならびに２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物ホモログ、選択的スプライシングされたアイソフォーム、対立遺伝子改変体および２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物の変異形態をコードするポリヌクレオチドの単離、ならびに２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質のアナログをコードするポリヌクレオチドの単離を可能にする。２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子をコードする全長ｃＤＮＡを単離するために使用され得る種々の分子クローニング方法が周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第二版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９５を参照のこと）。例えば、λファージクローニング方法論は、市販のクローニングシステム（例えば、Ｌａｍｂｄａ ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、簡便に使用され得る。２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子のｃＤＮＡを含むファージクローンは、標識された２４Ｐ４Ｃ１２ ｃＤＮＡまたはそのフラグメントを用いて探索することによって、同定され得る。例えば、１つの実施形態において、２４Ｐ４Ｃ１２ ｃＤＮＡ（例えば、図２）またはその一部が、合成され得、そして２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子に対する重複および２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子に対応する全長ｃＤＮＡを検索するためのプローブとして使用され得る。２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子自体は、ゲノムＤＮＡライブラリー、細菌人工染色体ライブラリー（ＢＡＣ）、酵母人工染色体ライブラリー（ＹＡＣ）などを、２４Ｐ４Ｃ１２ ＤＮＡのプローブまたはプライマーを用いてスクリーニングすることによって、単離され得る。
（ＩＩ．Ａ．５．）組換え核酸分子および宿主−ベクター系）
本発明はまた、２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチド、そのフラグメント、アナログ、またはホモログを含む組換えＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子（ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ならびに当該分野で周知の種々のウイルスベクターおよび非ウイルスベクターを含むがこれらに限定されない）、およびこのような組換えＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子で形質転換またはトランスフェクトされた細胞を提供する。このような分子を生成する方法は、周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前出を参照のこと）。
本発明はさらに、適切な原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞中に２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチド、そのフラグメント、アナログ、またはホモログを含む組換えＤＮＡ分子を含む、宿主−ベクター系を提供する。適切な真核生物宿主細胞の例としては、酵母細胞、植物細胞、または動物細胞（例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞またはＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞のようなバキュロウイルス感染性細胞）が挙げられる。適切な哺乳動物細胞の例としては、種々の前立腺癌細胞株（例えば、ＤＵ１４５およびＴｓｕＰｒ１）、他のトランスフェクト可能または形質導入可能な前立腺癌細胞株、一次細胞（ＰｒＥＣ）、ならびに組換えタンパク質の発現のために慣用的に使用される多くの哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞）が挙げられる。より詳細には、２４Ｐ４Ｃ１２のコード配列を含むポリヌクレオチド、またはそのフラグメント、アナログ、もしくはホモログは、当該分野で慣用的に使用され、そして広範に知られている任意の数の宿主−ベクター系を用いて、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質またはそのフラグメントを生成するために使用され得る。
２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質またはそのフラグメントの発現に適切な広範な範囲の宿主−ベクター系が利用可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前出；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９５、前出を参照のこと）。哺乳動物での発現に好ましいベクターとしては、ｐｃＤＮＡ３．１ ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ｔａｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびレトロウイルスベクターｐＳＲαｔｋｎｅｏ（Ｍｕｌｌｅｒら、１９９１、ＭＣＢ １１：１７８５）が挙げられるがこれらに限定されない。これらの発現ベクターを用いて、２４Ｐ４Ｃ１２は、いくつかの前立腺癌細胞株および非前立腺細胞株（例えば、２９３、２９３Ｔ、ｒａｔ−１、ＮＩＨ ３Ｔ３、およびＴｓｕＰｒ１を含む）において発現され得る。本発明の宿主−ベクター系は、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質またはそのフラグメントを生成するのに有用である。このような宿主−ベクター系は、２４Ｐ４Ｃ１２および２４Ｐ４Ｃ１２改変体もしくはアナログの機能的特性を研究するために使用され得る。
組換えヒト２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質またはそのアナログもしくはホモログもしくはフラグメントは、２４Ｐ４Ｃ１２関連ヌクレオチドをコードする構築物でトランスフェクトされた哺乳動物細胞により産生され得る。例えば、２９３Ｔ細胞は、２４Ｐ４Ｃ１２またはそのフラグメント、アナログ、もしくはホモログをコードする発現プラスミドでトランスフェクトされ得、２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質が、２９３Ｔ細胞中で発現され、そして組換え２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質が、標準的な精製方法（例えば、抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体を用いるアフィニティー精製）を用いて単離される。別の実施形態において、２４Ｐ４Ｃ１２コード配列は、レトロウイルスベクターｐＳＲαＭＳＶｔｋｎｅｏ中にサブクローニングされ、そして２４Ｐ４Ｃ１２発現細胞株を樹立するために、種々の哺乳動物細胞株（例えば、ＮＩＨ ３Ｔ３、ＴｓｕＰｒ１、２９３、およびｒａｔ−１）を感染するために使用される。当該分野で周知の種々の他の発現系もまた、使用され得る。２４Ｐ４Ｃ１２コード配列にインフレームで連結されたリーダーペプチドをコードする発現構築物は、分泌形態の組換え２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の生成のために使用され得る。
本明細書中で議論されるように、遺伝コードの重複性は、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子配列におけるバリエーションを許容する。詳細には、特定の宿主種は、しばしば、特定のコドン優先性を有することが、当該分野で公知であり、従って、当業者は、開示された配列を、所望の宿主で優先されるよう適合し得る。例えば、優先されるアナログコドン配列は、代表的に、より高頻度のコドンと置きかえられた稀なコドン（すなわち、所望の宿主の公知の配列において約２０％未満の使用頻度を有するコドン）を有する。特定種についてのコドン優先性は、例えば、インターネット上（例えば、ＵＲＬ ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／〜ｎａｋａｍｕｒａ／ｃｏｄｏｎ．ｈｔｍｌ）で利用可能なコドン使用表を用いることによって算出される。
さらなる配列の改変は、細胞性宿主におけるタンパク質発現を増強することが知られている。これらとしては、偽ポリアデニル化シグナルをコードする配列の除去、エキソン／イントロンスプライス部位シグナル、トランスポゾン様反復、および／または遺伝子発現に対して有害な他のこのような十分特徴付けられた配列が挙げられる。配列のＧＣ含量は、所定の細胞性宿主について平均的なレベル（その宿主細胞において発現される公知の遺伝子を参照することによって算出される）に調整される。可能な場合、配列は、予測されるヘアピン二次ｍＲＮＡ構造を回避するよう改変される。他の有用な改変としては、Ｋｏｚａｋ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、９：５０７３−５０８０（１９８９）に記載されるような、オープンリーディングフレームの開始点での翻訳開始コンセンサス配列の追加が挙げられる。当業者は、真核生物リボソームが５’近位のＡＵＧコドンで排他的に翻訳を開始という一般的な役割が、稀な条件下でのみ排除されることを理解する（例えば、Ｋｏｚａｋ ＰＮＡＳ ９２（７）：２６６２−２６６６、（１９９５）およびＫｏｚａｋ ＮＡＲ １５（２０）：８１２５−８１４８（１９８７）を参照のこと）。
（ＩＩＩ．）２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質）
本発明の別の局面は、２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質を提供する。２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の特定の実施形態は、図２または図３に示されるようなヒト２４Ｐ４Ｃ１２のアミノ酸配列の全てまたは一部を有するポリペプチドを包含する。あるいは、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の実施形態は、図２または図３に示される２４Ｐ４Ｃ１２のアミノ酸配列中に変更を有する改変体、ホモログ、またはアナログポリペプチドを包含する。
２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチドの実施形態は、以下を含む：図２に示される配列を有する２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチド、図２に示される２４Ｐ４Ｃ１２のペプチド配列（ここで、ＴはＵ）；図２に示される配列を有するポリペプチドの、少なくとも１０個の連続したヌクレオチド；または図２に示される配列を有するポリペプチドの、少なくとも１０個の連続したペプチド（ここでＴはＵ）。例えば、２４Ｐ４Ｃ１２ペプチドの実施形態は、限定しないが、以下を含む：
（Ｉ）図２Ａ−Ｉまたは図３Ａ−Ｇに示されるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれらのアミノ酸配列からなるかまたは、それらのアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ＩＩ）図２Ａ−Ｉに示されるアミノ酸配列全体と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相同な２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質；
（ＩＩＩ）図２Ａ−Ｉまたは図３Ａ−Ｇに示されるアミノ酸配列全体と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質；
（ＩＶ）表ＶＩＩＩ〜ＸＬＩＸに記載の少なくとも１つのペプチド（ただし、必要に応じて、このタンパク質は、図２のタンパク質全体ではない）を含むタンパク質；
（Ｖ）まとめて、表ＶＩＩＩ〜ＸＸＩに記載の少なくとも１つのペプチドを含むタンパク質であり、このペプチドはまた、まとめて、表ＸＸＩＩ〜ＸＬＩＸに記載され、ただし、このタンパク質は、必要に応じて図２のタンパク質全体ではない；
（ＶＩ）表ＶＩＩＩ〜ＸＬＩＸに記載のペプチドから選択される少なくとも２つのペプチドを含むタンパク質（ただし、必要に応じて、このタンパク質は、図２のタンパク質全体ではない）；
（ＶＩＩ）まとめて、表ＶＩＩＩ〜ＸＬＩＸに記載のペプチドから選択される少なくとも２つのペプチドを含むタンパク質（ただし、このタンパク質は、図２のアミノ酸配列由来の連続配列ではない）；
（ＶＩＩＩ）表ＶＩＩＩ〜ＸＸＩに記載のペプチドから選択される少なくとも１つのペプチドを含むタンパク質；および表ＸＸＩＩ〜ＸＬＩＸに記載のペプチドから選択される少なくとも１つのペプチチドを含むタンパク質であって、ただし、このタンパク質は、図２のアミノ酸配列由来の連続配列ではない；
（ＩＸ）図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ、３Ｆまたは３Ｇ（任意の全数の増加がそれぞれ７１０、７１０、７１０、７１０、５９８、７２２または７１２まで）のタンパク質の、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸を含むポリペプチドであって、このペプチドは、図５の親水性プロフィールにおいて０．５より大きい値を有する少なくとも１，２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のアミノ酸位置を含む；
（Ｘ）図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ、３Ｆまたは３Ｇ（任意の全数の増加がそれぞれ７１０、７１０、７１０、７１０、５９８、７２２または７１２まで）のタンパク質の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５個のアミノ酸を含むポリペプチドであって、このポリペプチドは、図６の疎水性プロフィールにおいて０．５未満の値を有する、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のアミノ酸位置を含む；
（ＸＩ）図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ、３Ｆまたは３Ｇ（任意の全数の増加がそれぞれ７１０、７１０、７１０、７１０、５９８、７２２または７１２まで）のタンパク質の、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸を含むポリペプチドであって、このポリペプチドは、図７の接近可能残基の％プロフィールにおいて０．５より大きい値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のアミノ酸位置を含む；
（ＸＩＩ）図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ、３Ｆまたは３Ｇ（任意の全数の増加がそれぞれ７１０、７１０、７１０、７１０、５９８、７２２または７１２まで）のタンパク質の、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸を含むポリペプチドであって、このポリペプチドは、図８の平均可撓性プロフィールにおいて０．５より大きい値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のアミノ酸位置を含む；
（ＸＩＩＩ）図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ、３Ｆまたは３Ｇ（任意の全数の増加がそれぞれ７１０、７１０、７１０、７１０、５９８、７２２または７１２まで）のタンパク質の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５アミノ酸を含むポリペプチドであって、このポリペプチドは、図９のβターンプロフィールにおいて０．５より大きい値を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５のアミノ酸位置を含む；
（ＸＩＶ）まとめて、表ＶＩＩＩ〜ＸＸＩおよび表ＸＸＩＩ〜ＸＬＩＸ中に少なくとも２回現れるペプチド；
（ＸＶ）まとめて、表ＶＩＩＩ〜ＸＸＩおよび表ＸＸＩＩ〜ＸＬＩＸ中に少なくとも３回現れるペプチド；
（ＸＶＩ）まとめて、表ＶＩＩＩ〜ＸＸＩおよび表ＸＸＩＩ〜ＸＬＩＸ中に少なくとも４回現れるペプチド；
（ＸＶＩＩ）まとめて、表ＶＩＩＩ〜ＸＸＩおよび表ＸＸＩＩ〜ＸＬＩＸ中に少なくとも５回現れるペプチド；
（ＸＶＩＩＩ）表ＶＩＩＩ〜ＸＸＩ中に少なくとも１回、そして表ＸＸＩＩ〜ＸＬＩＸ中に少なくとも１回現れるペプチド；
（ＸＩＸ）表ＶＩＩＩ〜ＸＸＩ中に少なくとも１回、そして表ＸＸＩＩ〜ＸＬＩＸ中に少なくとも２回現れるペプチド；
（ＸＸ）表ＶＩＩＩ〜ＸＸＩ中に少なくとも２回、そして表ＸＸＩＩ〜ＸＬＩＸ中に少なくとも１回現れるペプチド；
（ＸＸＩ）表ＶＩＩＩ〜ＸＸＩ中に少なくとも２回、そして表ＸＸＩＩ〜ＸＬＩＸ中に少なくとも２回現れるペプチド；
（ＸＸＩＩ）以下の特徴の１個、２個、３個、４個、または５個を含むかまたは、そのようなペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを含むペプチド：
ｉ）図３の特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸の領域（図３におけるタンパク質の全長までの任意の全数の増加において）であって、この領域は、図５の親水性プロフィールにおいて、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９と等しいかもしくはこれらの値より大きい値を有するか、または１．０と等しい値を有するアミノ酸位置を含む；
ｉｉ）図３の特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸の領域（図３におけるタンパク質の全長までの任意の全数の増加において）であって、この領域は、図６の疎水性プロフィールにおいて、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１と等しいかもしくはこれらの値より小さい値を有するか、または０．０と等しい値を有するアミノ酸位置を含む；
ｉｉｉ）図３の特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸の領域（図３におけるタンパク質の全長までの任意の全数の増加において）であって、この領域は、図７の接近可能残基の％プロフィールにおいて、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９と等しいかもしくは、これらの値より大きい値を有するか、または１．０と等しい値を有するアミノ酸位置を含む；
ｉｖ）図３の特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸の領域（図３におけるタンパク質の全長までの任意の全数の増加において）であって、この領域は、図８の平均可撓性プロフィールにおいて、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９と等しいかもしくは、これらの値より大きい値を有するか、または１．０と等しい値を有するアミノ酸位置を含む；
ｖ）図３の特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸の領域（図３におけるタンパク質の全長までの任意の全数の増加において）であって、この領域は、図９のβターンプロフィールにおいて、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９と等しいかもしくは、これらの値より大きい値を有するか、または１．０と等しい値を有するアミノ酸位置を含む；
（ＸＸＩＩＩ）薬学的賦形剤と共に、かつ／またはヒト単位容量形態で、（Ｉ）〜（ＸＸＩＩ）のペプチド、または抗体もしくはその結合領域を含む、組成物；
（ＸＸＩＶ）２４Ｐ４Ｃ１２を発現する細胞を調節するための方法における、（Ｉ）〜（ＸＸＩＩ）のペプチド、または抗体もしくはその結合領域または（ＸＸＩＩＩ）の組成物を用いる、方法；
（ＸＸＶ）２４Ｐ４Ｃ１２を発現する細胞を有する個体を診断、予防、予知または処置するための方法における、（Ｉ）〜（ＸＸＩＩ）のペプチド、または抗体もしくはその結合領域、または（ＸＸＩＩＩ）の組成物を用いる、方法；
（ＸＸＶＩ）２４Ｐ４Ｃ１２を発現する細胞（表Ｉに列挙される組織の癌からの前記の細胞）を有する個体の診断、予防、予知、または処置するための方法における、（Ｉ）〜（ＸＸＩＩ）のペプチド、または抗体もしくはその結合領域、あるいは（ＸＸＩＩＩ）の組成物を用いる、方法；
（ＸＸＶＩＩ）癌を診断、予防、予知、または処置するための方法における、（Ｉ）〜（ＸＸＩＩ）のペプチド、または抗体もしくはその結合領域、または（ＸＸＩＩＩ）の組成物を用いる、方法；
（ＸＸＶＩＩＩ）表Ｉに列挙される組織の癌の診断、予防、予知、または処置するための方法における、（Ｉ）〜（ＸＸＩＩ）のペプチド、または抗体もしくはその結合領域、または（ＸＸＩＩＩ）の組成物を用いた、方法；および、
（ＸＸＩＸ）２４Ｐ４Ｃ１２を発現する細胞の調節因子を同定するか、または特徴付けるための方法における、（Ｉ）〜（ＸＸＩＩ）のペプチド、または抗体もしくはその結合領域、または（ＸＸＩＩＩ）の組成物を用いる、方法。
本明細書中で使用する場合、ある範囲は、その全単位位置の全てを具体的に開示することが理解される。
本明細書中に開示される発明の代表的な実施形態としては、２４Ｐ４Ｃ１２のｍＲＮＡ配列の特定の部分をコードする２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチド（およびこのような配列に相補的なポリヌクレオチド）が挙げられる（例えば、（ａ）２４Ｐ４Ｃ１２改変体１の、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７１０またはそれ以上の連続するアミノ酸の、タンパク質および／またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；他の改変体に関する最大長は：改変体３、７１０アミノ酸；改変体５、７１０アミノ酸；改変体６、７１０；改変体７、５９８アミノ酸：改変体８、７２２アミノ酸、および改変体９、７１２アミノ酸である）。
一般的に、ヒト２４Ｐ４Ｃ１２の天然に存在する対立遺伝子改変体は、高い程度の構造的同一性および相同性（例えば、９０％以上の相同性）を共有する。代表的に、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の対立遺伝子改変体は、本明細書中に記載される２４Ｐ４Ｃ１２配列中に保存的アミノ酸置換を含むか、または２４Ｐ４Ｃ１２のホモログにおいて対応する位置からのアミノ酸の置換を含む。２４Ｐ４Ｃ１２対立遺伝子改変体の１つのクラスは、特定の２４Ｐ４Ｃ１２アミノ酸配列の少なくとも小部分と高い程度の相同性を共有するが、その配列由来の根本的な逸脱（例えば、非保存的置換、短縮、挿入、またはフレームシフト）をさらに含むタンパク質である。タンパク質配列の比較において、用語、類似性、同一性、および相同性は、各々、遺伝学分野で理解されるのと別個の意味を有する。さらに、オルソロジーおよびパラロジーは、ある生物における所定のタンパク質ファミリーのメンバーの、他の生物における同じファミリーのメンバーに対する関係を記載する重要な概念であり得る。
アミノ酸略号は、表ＩＩに提供される。保存的アミノ酸置換は、しばしば、そのタンパク質のコンホメーションまたは機能のいずれも変更することなくタンパク質中で起こり得る。本発明のタンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５の保存的置換を含み得る。このような変更としては、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、およびロイシン（Ｌ）のいずれかの、これらの疎水性アミノ酸の他のいずれかでの置換；グルタミン酸（Ｅ）でのアスパラギン酸（Ｄ）の置換およびその逆；アスパラギン（Ｎ）でのグルタミン（Ｑ）の置換およびその逆；ならびにスレオニン（Ｔ）でのセリン（Ｓ）の置換およびその逆が挙げられる。他の置換もまた、特定のアミノ酸の環境およびそのタンパク質の三次元構造におけるその役割に依存して、保存的であるとみなされ得る。例えば、グリシン（Ｇ）およびアラニン（Ａ）は、しばしば、交換可能であり得、アラニン（Ａ）およびバリン（Ｖ）も同様であり得る。比較的疎水性のメチオニン（Ｍ）は、しばしば、ロイシンおよびイソロイシンと交換され得、そして時々、バリンと交換され得る。リジン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）は、しばしば、そのアミノ酸残基の重要な特徴がその電荷であり、これら２つのアミノ酸残基の異なるｐＫが重要でない位置で交換可能である。さらに他の変更は、特定の環境で「保存的」であるとみなされ得る（例えば、本明細書中の表ＩＩＩ；１３〜１５頁「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」第２版、Ｌｕｂｅｒｔ Ｓｔｒｙｅｒ編（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、ＰＮＡＳ １９９２ Ｖｏｌ８９ １０９１５−１０９１９；Ｌｅｉら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９５年５月１９日；２７０（２０）：１１８８２−６を参照のこと）。
本明細書中に開示される発明の実施形態として、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の広範な種々の当該分野で受け入れられる改変体またはアナログ（例えば、アミノ酸の挿入、欠失、および置換を有するポリペプチド）が挙げられる。２４Ｐ４Ｃ１２改変体は、当該分野で公知の方法（例えば、部位特異的変異誘発、アラニンスキャンニング、およびＰＣＲ変異誘発）を用いて作製され得る。部位特異的変異誘発（Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１３：４３３１（１９８６）；Ｚｏｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１０：６４８７（１９８７））、カセット変異誘発（Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ、３４：３１５（１９８５））、制限選択変異誘発（Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ ＳｅｒＡ、３１７：４１５（１９８６））、または他の公知の技術が、２４Ｐ４Ｃ１２改変体ＤＮＡを生成するために、クローニングしたＤＮＡにおいて実施され得る。
スキャンニングアミノ酸分析はまた、特定の生物学的活性（例えば、タンパク質−タンパク質相互作用）に関連する連続配列に沿って１つ以上のアミノ酸を同定するのに使用され得る。比較的小さく、中性のアミノ酸が、好ましいスキャンニングアミノ酸に含まれる。このようなアミノ酸としては、アラニン、グリシン、セリン、およびシステインが挙げられる。アラニンは、代表的に、この群の中で好ましいスキャンニングアミノ酸である。なぜならば、アラニンは、β炭素の後ろの側鎖を排除し、そして改変体の主鎖のコンホメーションを変更する可能性がより低いからである。アラニンはまた、代表的に、それが、最も一般的なアミノ酸であるので好ましい。さらに、アラニンは、しばしば、埋もれた位置および露出した位置の両方において見出される（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．、Ｎ．Ｙ．）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５０：１（１９７６））。アラニン置換が、十分な量の改変体を生じない場合、等比体積のアミノ酸が使用され得る。
本明細書中で規定される場合、２４Ｐ４Ｃ１２改変体、アナログ、またはホモログは、図３のアミノ酸配列を有する２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質と「交叉反応性」である少なくとも１つのエピトープを有するという特徴的な特性を有する。この文で使用される場合、「交叉反応性」は、２４Ｐ４Ｃ１２改変体に特異的に結合する抗体またはＴ細胞がまた、図３に示されるアミノ酸配列を有する２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質に特異的に結合することを意味する。ポリペプチドは、出発２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質に特異的に結合する抗体またはＴ細胞により認識され得るいかなるエピトープも含まない場合、図３に示すタンパク質の改変体でなくなる。当業者は、タンパク質を認識する抗体が、異なる大きさのエピトープに結合し、そして約４または５アミノ酸オーダーの一群（連続していようとしていまいと）が、最小エピトープにおける代表的な数のアミノ酸とみなされることを理解する。例えば、Ｎａｉｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００ １６５（１２）：６９４９−６９５５；Ｈｅｂｂｅｓら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８９）２６（９）：８６５−７３；Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８５）１３５（４）：２５９８−６０８を参照のこと。
他のクラスの２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質改変体は、図３のアミノ酸配列またはそのフラグメントと、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％以上の類似性を共有する。別の特定のクラスの２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質改変体またはアナログは、本明細書中に記載されるかまたは当該分野で現在公知の２４Ｐ４Ｃ１２の生物学的モチーフの１つ以上を含む。従って、最初のフラグメントと比較して変更された機能的（例えば、免疫原性）特性を有する２４Ｐ４Ｃ１２フラグメント（核酸またはアミノ酸）のアナログは、本発明に包含される。現在当該分野の一部であるかまたは当該分野の一部となるモチーフが図２または図３の核酸配列またはアミノ酸配列に適用されることが理解される。
本明細書中で議論されるように、本発明の実施形態は、図２または図３に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の全長未満のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。例えば、本発明の代表的な実施形態は、図２または図３に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の任意の４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上の連続するアミノ酸を有するペプチド／タンパク質を含む。
さらに、本明細書中に開示される本発明の代表的な実施形態は、２４Ｐ４Ｃ１２アミノ酸配列全体を通して、図２または図３に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のアミノ酸約１〜アミノ酸約１０からなるポリペプチド、図２または図３に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のアミノ酸約１０〜アミノ酸約２０からなるポリペプチド、図２または図３に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のアミノ酸約２０〜アミノ酸約３０からなるポリペプチド、図２または図３に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のアミノ酸約３０〜アミノ酸約４０からなるポリペプチド、図２または図３に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のアミノ酸約４０〜アミノ酸約５０からなるポリペプチド、図２または図３に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のアミノ酸約５０〜アミノ酸約６０からなるポリペプチド、図２または図３に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のアミノ酸約６０〜アミノ酸約７０からなるポリペプチド、図２または図３に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のアミノ酸約７０〜アミノ酸約８０からなるポリペプチド、図２または図３に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のアミノ酸約８０〜アミノ酸約９０からなるポリペプチド、図２または図３に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のアミノ酸約９０〜アミノ酸約１００からなるポリペプチドなどを含む。さらに、図２または図３に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のアミノ酸約１（または２０または３０または４０など）〜アミノ酸約２０（または１３０または１４０または１５０など）からなるポリペプチドが、本発明の実施形態である。この段落における開始位置および停止位置は、特定の位置およびその位置プラス５または残基マイナス５残基の位置をいうことが理解されるべきである。
２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質は、標準的なペプチド合成技術を用いてかまたは当該分野で周知の化学切断方法を用いて生成される。あるいは、組み換え方法が、２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質をコードする核酸分子を生成するのに使用され得る。１つの実施形態において、核酸分子は、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質（またはその改変体、ホモログ、またはアナログ）の規定されたフラグメントを生成する手段を提供する。
（ＩＩＩ．Ａ．）モチーフ保有タンパク質の実施形態）
本明細書中に開示される本発明のさらなる例示の実施形態は、図２または図３に示される２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチド配列中に含まれる１つ以上の生物学的モチーフのアミノ酸残基を含む２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチドを包含する。種々のモチーフが当該分野で公知であり、そしてタンパク質は、多くの公に利用可能なインターネットサイト（例えば、ＵＲＬアドレス：ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／；ｓｅａｒｃｈｌａｕｎｃｈｅｒ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ／ｓｅｑ−ｓｅａｒｃｈ／ｓｔｒｕｃ−ｐｒｅｄｉｃｔ．ｈｔｍｌ；ｐｓｏｒｔ．ｉｍｓ．ｕ−ｔｏｋｙｏ．ａｃ．ｊｐ／；ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／；ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ／ｓｃａｎ．ｈｔｍｌ；ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／ｓｃｎｐｓｉｔ１．ｈｔｍｌ；ＥｐｉｍａｔｒｉｘＴＭおよびＥｐｉｍｅｒＴＭ、Ｂｒｏｗｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ｂｒｏｗｎ．ｅｄｕ／Ｒｅｓｅａｒｃｈ／ＴＢ−ＨＩＶ＿Ｌａｂ／ｅｐｉｍａｔｒｉｘ／ｅｐｉｍａｔｒｉｘ．ｈｔｍｌ；およびＢＩＭＡＳ、ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／を参照のこと）により、このようなモチーフの存在について評価され得る。
すべての２４Ｐ４Ｃ１２改変タンパク質の配列を保有するモチーフは、表ＶＩＩＩ〜ＸＸＩおよびＸＸＩＩ〜ＸＬＩＸにおいて示され、そして同定される。
表Ｖは、ｐｆａｍサーチ（ＵＲＬアドレスｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／を参照のこと）に基づくいくつかの頻繁に生じるモチーフを示す。表Ｖのカラムは、（１）モチーフ名の略称、（２）このモチーフファミリーの異なるメンバーの間で見出された同一性（％）、（３）モチーフ名または詳細、および（４）最も一般的な機能を列挙し；位置情報は、そのモチーフが位置に関連性がある場合に含まれる。
先に議論された１つ以上の２４Ｐ４Ｃ１２モチーフを含むポリペプチドは、先に議論された２４Ｐ４Ｃ１２モチーフが増殖調節不全に関連するという観察の観点で、および２４Ｐ４Ｃ１２が特定の癌で過剰発現されるという理由から、悪性の表現型の特異的な特徴を解明するのに有用である（例えば、表Ｉを参照のこと）。カゼインキナーゼＩＩ、ｃＡＭＰおよびｃａｍｐ依存性プロテインキナーゼ、ならびにプロテインキナーゼＣは、例えば、悪性の表現型の発現に関連することが公知である酵素である（例えば、Ｃｈｅｎら、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．、７８（２）：１６５−１７４（１９９８）；Ｇａｉｄｄｏｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６（１０）：４３３１−４３３８（１９９５）；Ｈａｌｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４（６）：１１１９−１１２６（１９９６）；Ｐｅｔｅｒｚｉｅｌら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８（４６）：６３２２−６３２９（１９９９）、およびＯ’Ｂｒｉａｎ、Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．５（２）：３０５−３０９（１９９８）を参照のこと）。さらに、グリコシル化およびミリストイル化の両方は、癌および癌の進行にも関連するタンパク質修飾である（例えば、Ｄｅｎｎｉｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １４７３（１）：２１−３４（１９９９）；Ｒａｊｕら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２３５（１）：１４５−１５４（１９９７）を参照のこと）。アミド化は、癌および癌の進行にも関連する別のタンパク質修飾である（例えば、Ｔｒｅｓｔｏｎら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．Ｍｏｎ
ｏｇｒ．（１３）：１６９−１７５（１９９２）を参照のこと）。
別の実施形態において、本発明のタンパク質は、当該分野で認知された方法に従って同定された１つ以上の免疫反応性エピトープ（例えば、表ＶＩＩＩ〜ＸＸＩおよびＸＸＩＩ〜ＸＬＩＸに示されるペプチド）を含む。ＣＴＬエピトープは、特定のＨＬＡ対立遺伝子に最適に結合し得る２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質中のペプチドを同定するための特定のアルゴリズムを用いて決定され得る（例えば、表ＩＶ：ＥｐｉｍａｔｒｉｘＴＭおよびＥｐｉｍｅｒＴＭ、Ｂｒｏｗｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＵＲＬ ｂｒｏｗｎ．ｅｄｕ／Ｒｅｓｅａｒｃｈ／ＴＢ−ＨＩＶ＿Ｌａｂ／ｅｐｉｍａｔｒｉｘ／ｅｐｉｍａｔｒｉｘ．ｈｔｍｌ；およびＢＩＭＡＳ、ＵＲＬ ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。さらに、ＨＬＡ分子に対して十分な結合親和性を有し、そして免疫原性エピトープであることに関連するペプチドを同定するためのプロセスが当該分野で周知であり、そして過度の実験を行うことなく実施される。さらに、免疫原性エピトープであるペプチドを同定するためのプロセスが、当該分野で周知であり、そしてインビトロまたはインビボのいずれかで、過度の実験を行わずに実施される。
免疫原性を調節するために、このようなエピトープのアナログを作製するための原理もまた、当該分野で公知である。例えば、当業者は、ＣＴＬまたはＨＴＬモチーフ（例えば、表ＩＶのＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩモチーフ／スーパーモチーフを参照のこと）を有するエピトープを用いて開始する。このエピトープは、特定の位置のうちの１つのアミノ酸を置換し、そしてそれをその位置のために特定された別のアミノ酸で置き換えることにより、アナログを作製される。例えば、表ＩＶに規定される残基に基づき、当業者は、任意の他の残基（例えば、優先性の残基）に有利となるように、有害な残基を置換し得る；優先性の低い残基を、優先性の残基で置換するか；または最初から存在する優先性の残基を、別の優先性の残基で置換し得る。置換は、ペプチド中の主要なアンカー位置または他の位置で生じ得る；例えば、表ＩＶを参照のこと。
種々の参考文献は、目的のタンパク質およびそのアナログにおけるエピトープの同定および生成に関する技術を反映している。例えば、Ｃｈｅｓｎｕｔらに対するＷＯ９７／３３６０２；Ｓｅｔｔｅ、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ １９９９ ５０（３−４）：２０１−２１２；Ｓｅｔｔｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１ １６６（２）：１３８９−１３９７；Ｓｉｄｎｅｙら、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７ ５８（１）：１２−２０；Ｋｏｎｄｏら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ １９９７ ４５（４）：２４９−２５８；Ｓｉｄｎｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６ １５７（８）：３４８０−９０；およびＦａｌｋら、Ｎａｔｕｒｅ ３５１：２９０−６（１９９１）；Ｈｕｎｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：１２６１−３（１９９２）；Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３５８０−７（１９９２）；Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１６３−７５（１９９４）；Ｋａｓｔら、１９９４ １５２（８）：３９０４−１２；Ｂｏｒｒａｓ−Ｃｕｅｓｔａら、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００ ６１（３）：２６６−２７８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００ １６４（３）；１６４（３）：１６２５−１６３３；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、ＰＭＩＤ：７８９５１６４、ＵＩ：９５２０２５８２；Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９１ １４７（８）：２６６３−２６６９；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １９９４ １（９）：７５１−７６１、およびＡｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．１９９８ １８（２）：７９−９２を参照のこと。
本発明の関連の実施形態は、表ＶＩに示される異なるモチーフ、ならびに／または表ＶＩＩＩ〜ＸＸＩおよびＸＸＩＩ〜ＸＬＩＸの１つ以上の推定ＣＴＬエピトープ、ならびに／または表ＸＬＶＩ〜ＸＬＩＸの１つ以上の推定ＨＴＬエピトープ、ならびに／または当該分野で公知の１つ以上のＴ細胞結合モチーフの組み合わせを含むポリペプチドを包含する。好ましい実施形態は、このポリペプチドのモチーフ内または介在配列内のいずれにも、挿入、欠失、または置換を含まない。さらに、これらのモチーフのいずれかの側に、多くのＮ末端および／またはＣ末端アミノ酸残基のいずれかを含む実施形態が、望ましくあり得る（例えば、モチーフが位置するポリペプチド構造のより大きな部分を含むために）。代表的に、モチーフのいずれかの側のＮ末端および／またはＣ末端アミノ酸残基の数は、約１〜約１００アミノ酸残基の間、好ましくは、５〜約５０アミノ酸残基の間である。
２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質は、多くの形態、好ましくは、単離された形態で具体化される。精製された２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質分子は、抗体、Ｔ細胞または他のリガンドへの２４Ｐ４Ｃ１２の結合を害する、他のタンパク質または分子を、実質的に含まない。単離および精製の性質および程度は、意図される用途に依存する。２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質の実施形態は、精製された２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質、および機能的な可溶性２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質を含む。１つの実施形態において、機能的な可溶性２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質またはそのフラグメントは、抗体、Ｔ細胞または他のリガンドによって結合される能力を維持する。
本発明はまた、図２または図３に示される２４Ｐ４Ｃ１２アミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメントを含む２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質を提供する。このようなタンパク質は、以下のような出発２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の特性を示す：出発２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質に関連するエピトープに特異的に結合する抗体の産生を誘発する能力；このような抗体に結合される能力；ＨＴＬまたはＣＴＬの活性化を誘発する能力；ならびに／あるいは、この出発タンパク質にもまた特異的に結合するＨＴＬまたはＣＴＬによって認識される能力。
特定の興味深い構造を含む２４Ｐ４Ｃ１２関連ポリペプチドは、当該分野で周知の種々の分析技術（例えば、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、Ｋａｒｐｌｕｓ−ＳｃｈｕｌｔｚまたはＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析の方法が挙げられる）を使用してかまたは免疫原性に基づいて、予測および／または同定され得る。このような構造を含むフラグメントは、サブユニット特異的な抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体またはＴ細胞の作製において、あるいは、２４Ｐ４Ｃ１２に結合する細胞因子の同定において特に有用である。例えば、親水性プロフィールが作製され得、そして免疫原性ペプチドフラグメントは、Ｈｏｐｐ，Ｔ．Ｐ．およびＷｏｏｄｓ，Ｋ．Ｒ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：３８２４−３８２８の方法を使用して、同定され得る。ヒドロパシー（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ）プロフィールが作製され得、そして免疫原性ペプチドフラグメントは、Ｋｙｔｅ，Ｊ．およびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２の方法を使用して、同定され得る。接近可能残基の％のプロフィールが作製され得、そして、免疫原性ペプチドフラグメントは、Ｊａｎｉｎ Ｊ．，１９７９，Ｎａｔｕｒｅ ２７７：４９１−４９２の方法を使用して、同定され得る。平均可撓性プロフィールが作製され得、そしてＢｈａｓｋａｒａｎ Ｒ．，Ｐｏｎｎｕｓｗａｍｙ Ｐ．Ｋ．，１９８８，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３２：２４２−２５５の方法を使用して、免疫原性ペプチドフラグメントが同定され得る。β−ターンプロフィールが作製され得、そして免疫原性ペプチドフラグメントは、Ｄｅｌｅａｇｅ，Ｇ．，Ｒｏｕｘ Ｂ．，１９８７，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １：２８９−２９４の方法を使用して、同定され得る。
ＣＴＬエピトープは、指定されたＨＬＡ対立遺伝子に必要に応じて結合し得る２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質内のポリペプチドを同定するために、特定のアルゴリズムを使用して（例えば、Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ ＵＲＬ ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｂｍｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｃｏｍ／のＳＹＦＰＥＩＴＨＩサイト；表ＩＶ（Ａ）〜（Ｅ）の表；ＥｐｉｍａｔｒｉｘＴＭおよびＥｐｉｍｅｒＴＭ、Ｂｒｏｗｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＵＲＬ（Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ ＵＲＬ ｂｒｏｗｎ．ｅｄｕ／Ｒｅｓｅａｒｃｈ／ＴＢ−ＨＩＶ＿Ｌａｂ／ｅｐｉｍａｔｒｉｘ／ｅｐｉｍａｔｒｉｘ．ｈｔｍｌ）；ならびに、ＢＩＭＡＳ，ＵＲＬ ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／を使用することによって）決定され得る。これを例示すると、ヒトＭＨＣクラスＩ分子の状況において示される２４Ｐ４Ｃ１２由来のペプチドエピトープ（例えば、ＨＬＡ−Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ１１、Ａ２４、Ｂ７およびＢ３５）が、予測された（例えば、表ＶＩＩＩ〜ＸＸＩ、ＸＸＩＩ〜ＸＬＩＸを参照のこと）。具体的には、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の完全なアミノ酸配列および他の改変体の関連部分（すなわち、ＨＬＡクラスＩの予測については、この改変体に対応する点変異またはエキソン接合部のいずれかの側に位置する９隣接残基、およびＨＬＡクラスＩＩの予測については、点変異またはエキソン結合部のいずれかの側に位置する１４隣接残基）を、上記のＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｅｃｔｉｏｎ（ＢＩＭＡＳ）ウェブサイト（ＵＲＬ ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｂｍｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｃｏｍ／のサイトＳＹＦＰＥＩＴＨＩに加えて）において見出されるＨＬＡ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍｏｔｉｆ Ｓｅａｒｃｈアルゴリズムに入力した。
このＨＬＡペプチドモチーフ検索アルゴリズムは、ＨＬＡクラスＩ分子、特に、ＨＬＡ−Ａ２のグルーブにおける特定のペプチド配列の結合に基づいて、Ｄｒ．Ｋｅｎ Ｐａｒｋｅｒによって開発された（例えば、Ｆａｌｋら、Ｎａｔｕｒｅ ３５１：２９０−６（１９９１）；Ｈｕｎｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：１２６１−３（１９９２）；Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３５８０−７（１９９２）；Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１６３−７５（１９９４）を参照のこと）。このアルゴリズムは、ＨＬＡ−Ａ２および他の多くのＨＬＡクラスＩ分子への予測される結合についての完全なタンパク質配列から、８マー、９マー、および１０マーのペプチドを位置決定およびランク付けすることを可能にする。多数のＨＬＡクラスＩ結合ペプチドは、８マー、９マー、１０マーまたは１１マーである。例えば、クラスＩ ＨＬＡ−Ａ２について、エピトープは、好ましくは、２位においてロイシン（Ｌ）またはメチオニン（Ｍ）を含み、そしてＣ末端においてバリン（Ｖ）またはロイシン（Ｌ）を含む（例えば、Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３５８０−７（１９９２）を参照のこと）。２４Ｐ４Ｃ１２予測結合ペプチドの選択結果は、本明細書中の表ＶＩＩＩ〜ＸＸＩおよびＸＸＩＩ〜ＸＬＩＸに示される。表ＶＩＩＩ〜ＸＸＩおよびＸＸＩＩ〜ＸＬＶＩＩにおいて、各ファミリーメンバーに対して選択される候補物である９マーおよび１０マーが、それらの位置、各特定のペプチドのアミノ酸配列、および推定結合スコアとともに示される。表ＸＬＶＩ〜ＸＬＩＸにおいて、各ファミリーメンバーに対して選択される候補物である１５マーが、それらの位置、各特定のペプチドのアミノ酸配列、および推定結合スコアとともに示される。この結合スコアは、３７℃、ｐＨ６．５においてペプチドを含む複合体の解離の推定半減期に対応する。最も高い結合スコアを有するペプチドは、最良の期間にわたって、細胞表面上でＨＬＡクラスＩに最も密接して結合され、そしてＴ細胞認識のための最良の免疫原性標的を示すと予測される。
ＨＬＡ対立遺伝子へのペプチドの実際の結合は、抗原プロセシング欠損細胞株Ｔ２上でのＨＬＡ発現を安定化させることによって評価され得る（例えば、Ｘｕｅら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ３０：７３−８（１９９７）およびＰｅｓｈｗａら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ３６：１２９−３８（１９９８）を参照のこと）。特定のペプチドの免疫原性は、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）の存在下におけるＣＤ＋８細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を刺激することによって、インビトロで評価され得る。
ＢＩＭＡＳサイト、ＥｐｉｍｅｒＴＭサイトおよびＥｐｉｍａｔｒｉｘＴＭサイトによって予測されるか、あるいは当該分野で利用可能であるかまたは表ＩＶに示されるような分野の一部である、ＨＬＡクラスＩモチーフまたはＨＬＡクラスＩＩモチーフによって指定される（あるいは、Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ ｓｉｔｅ ＵＲＬ ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｂｍｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｃｏｍ／またはＢＩＭＡＳ，ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／を使用して決定される）、全てのエピトープは、本発明に従って、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質に「適用」されることが理解される。この文脈において使用される場合、「適用される」とは、例えば、可視によってかまたは当業者によって理解されるような、コンピューターベースのパターン認定方法によって、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質が評価されることを意味する。ＨＬＡクラスＩモチーフを保有する、８、９、１０もしくは１１のアミノ酸残基の２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の全ての部分配列、またはＨＬＡクラスＩＩモチーフを保有する９アミノ酸残基以上の部分配列は、本発明の範囲内である。
（ＩＩＩ．Ｂ．）２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質の発現）
以下の実施例において記載される実施形態において、２４Ｐ４Ｃ１２は、市販の発現ベクター（例えば、Ｃ末端６×ＨｉｓおよびＭＹＣタグ（ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃＨＩＳ，ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎまたはＴａｇ５，ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ ＴＮ）を用いて２４Ｐ４Ｃ１２をコードする、ＣＭＶ駆動発現ベクター）でトランスフェクトした細胞（例えば、２９３Ｔ細胞）中で簡便に発現され得る。Ｔａｇ５ベクターは、ＩｇＧＫ分泌シグナルを提供し、このシグナルを使用して、トランスフェクト細胞中の分泌される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の生成を容易にし得る。培養培地中の分泌されたＨＩＳタグ化２４Ｐ４Ｃ１２は、例えば、標準技術を使用するニッケルカラムを使用して、精製され得る。
（ＩＩＩ．Ｃ．）２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質の改変）
２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質の改変（例えば、共有結合的改変）は、本発明の範囲内に含まれる。共有結合的改変の１つの型は、２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチドの標的化アミノ酸残基を、有機誘導体化因子（これは、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の選択される側鎖残基またはＮ末端もしくはＣ末端の残基と反応し得る）と反応させることを包含する。本発明の範囲内に含まれる２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチドの共有結合的改変の別の型は、本発明のタンパク質のネイティブなグリコシル化パターンを変化させることを包含する。２４Ｐ４Ｃ１２の共有結合的改変の別の型は、２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチドを、種々の非タンパク様ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレン）のうちの１つに、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第号４，７９１，１９２号；または同第４，１７９，３３７号に示される様式で連結させることを包含する。
本発明の２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質はまた、キメラ分子を形成するように改変され得、このキメラ分子は、別の異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列に融合された２４Ｐ４Ｃ１２を含む。このようなキメラ分子は、化学的にかまたは組換え的に、合成され得る。キメラ分子は、別の腫瘍関連抗原またはそのフラグメントに融合された本発明のタンパク質を有し得る。あるいは、本発明に従うタンパク質は、２４Ｐ４Ｃ１２配列のフラグメントの融合体（アミノ酸または核酸）を含み得、その結果、その長さにわたって、図２または図３に示されるアミノ酸配列または核酸配列に直接的に相同でない分子が作製される。このようなキメラ分子は、２４Ｐ４Ｃ１２の複数の同じ部分配列を含み得る。キメラ分子は、２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質の、ポリヒスチジンエピトープタグとの融合体を含み得、これは、固定化されたニッケルが選択的に結合し得るエピトープに、サイトカインまたは増殖因子を提供する。エピトープタグは、一般に、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のアミノ末端またはカルボキシル末端に配置される。代替の実施形態において、キメラ分子は、２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質の、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定の領域との融合体を含み得る。二価の形態のキメラ分子（「免疫接着因子（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）とも呼ばれる」）について、このような融合体は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に対するものであり得る。このＩｇ融合体は、好ましくは、Ｉｇ分子内の少なくとも１つの可変領域に代わる、可溶性（膜貫通ドメインを欠失または不活性化した）形態の２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチドでの置換を含む。好ましい実施形態において、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧＩ分子のヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域、またはヒンジ領域、ＣＨ１領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の産生については、例えば、米国特許第５，４２８，１３０号（１９９５年６月２７日発行）を参照のこと。
（ＩＩＩ．Ｄ．）２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質の用途）
本発明のタンパク質は、多くの異なる特定の用途を有する。２４Ｐ４Ｃ１２が前立腺癌および他の癌において高度に発現される場合、２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質は、癌組織に対して、正常な２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物の状態を評価する方法において使用され、それによって悪性表現型が明らかになる。代表的には、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の特定の領域由来のポリペプチドが、それらの領域（例えば、１つ以上のモチーフを含む領域）における摂動（例えば、欠失、挿入、点変異など）の存在を評価するために使用される。例示的なアッセイは、癌性組織に対して正常な領域の特徴を評価するか、またはエピトープに対する免疫応答を惹起させるために、抗体、または２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチド配列に含まれる１つ以上の生物学的モチーフのアミノ酸残基を含むＴ細胞標的化２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質を用いる。あるいは、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質において１つ以上の生物学的モチーフのアミノ酸残基を含む２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質を使用して、２４Ｐ４Ｃ１２の領域と相互作用する因子についてスクリーニングする。
２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質フラグメント／部分配列は、ドメイン特異的抗体（例えば、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の細胞外エピトープまたは細胞内エピトープを認識する抗体）を作製しそして特徴付ける際に、２４Ｐ４Ｃ１２またはその特定の構造ドメインに結合する薬剤または細胞因子を同定するために、そして種々の治療状況および診断状況（診断アッセイ、癌ワクチンおよびこのようなワクチンを調製する方法が挙げられるがこれらの限定されない）において、特に有用である。
２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子によってコードされるタンパク質、またはそれらのアナログ、ホモログもしくはフラグメントによってコードされるタンパク質は、種々の用途を有し、これらの用途としては、抗体の作製、ならびに２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物に結合する、リガンドおよび他の薬剤および細胞構築物を同定するための方法が挙げられるがこれらに限定されない。２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質またはそのフラグメントに対して惹起される抗体は、診断アッセイおよび予後アッセイ、ならびに２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の発現によって特徴付けられるヒト癌（例えば、表Ｉに列挙されるような癌）の管理における画像化方法に有用である。このような抗体は、細胞内で発現され得、そしてこのような癌を有する患者を処置する方法において使用され得る。２４Ｐ４Ｃ１２関連核酸または２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質はまた、ＨＴＬ応答またはＣＴＬ応答を生じさせる際に使用される。
２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質を検出するために有用な種々の免疫学的アッセイが、使用され、これらのアッセイとしては、種々の型の放射免疫アッセイ、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光アッセイ（ＥＬＩＦＡ）、免疫細胞化学方法などが挙げられるがこれらに限定されない。抗体は、２４Ｐ４Ｃ１２発現細胞を検出し得る免疫学的画像化試薬として（例えば、放射性核種（ｒａｄｉｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｉｃ）画像化方法において）、標識および使用され得る。２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質はまた、本明細書中でさらに記載されるように、癌ワクチンを作製する際に、特に有用である。
（ＩＶ．）２４Ｐ４Ｃ１２抗体）
本発明の別の局面は、２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質に結合する抗体を提供する。好ましい抗体は、２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質に特異的に結合し、そして２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質ではないペプチドまたはタンパク質には結合しない（または弱く結合する）。例えば、２４Ｐ４Ｃ１２に結合する抗体は、２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質（例えば、それらのホモログまたはアナログ）に結合し得る。
本発明の２４Ｐ４Ｃ１２抗体は、癌（例えば、表Ｉを参照のこと）の診断アッセイおよび予後アッセイ、および画像化方法論において、特に有用である。同様に、このような抗体は、２４Ｐ４Ｃ１２がまた、これらの他の癌において発現されるかまたは過剰に発現される程度まで、他の癌を処置、診断および／または予後診断する際に有用である。さらに、細胞内で発現される抗体（例えば、一本鎖抗体）は、２４Ｐ４Ｃ１２の発現が関与する癌（例えば、進行性または転移性の前立腺癌）の処置において、治療学的に有用である。
本発明はまた、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質および変異２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質の検出および定量化のために有用な種々の免疫学的アッセイを提供する。このようなアッセイは、適切な場合、２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質を認識および結合し得る、１種以上の２４Ｐ４Ｃ１２抗体を含み得る。これらのアッセイは、当該分野で周知の種々の免疫学的アッセイ様式の範囲内で実施され得、これらのアッセイとしては、種々の型の放射免疫アッセイ、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光アッセイ（ＥＬＩＦＡ）などが挙げられるがこれらに限定されない。
本発明の免疫学的非抗体アッセイはまた、Ｔ細胞免疫原性アッセイ（阻害性または刺激性）ならびに主要組織適合複合体（ＭＨＣ）結合アッセイも含む。
さらに、２４Ｐ４Ｃ１２を発現する前立腺癌および他の癌を検出し得る免疫学的画像化方法もまた、本発明によって提供され、これらとしては、標識された２４Ｐ４Ｃ１２抗体を使用する、放射性核種画像化方法が挙げられるがこれらに限定されない。このようなアッセイは、２４Ｐ４Ｃ１２を発現する癌（例えば、前立腺癌）の検出、モニタリング、および予後診断において、臨床学的に有用である。
２４Ｐ４Ｃ１２抗体はまた、２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質を精製するための方法、ならびに２４Ｐ４Ｃ１２ホモログおよび２４Ｐ４Ｃ１２関連分子を単離するための方法において使用され得る。例えば、２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質を精製する方法は、以下の工程を包含する：固体マトリクスに結合している２４Ｐ４Ｃ１２抗体を、溶解物または２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質を含有する他の溶液とともに、２４Ｐ４Ｃ１２抗体が２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質に結合することが可能な条件下でインキュベートする工程；この固体マトリクスを洗浄して、不純物を取り除く工程；ならびに、結合している抗体から、２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質を溶出する工程。本発明に従う、２４Ｐ４Ｃ１２抗体の他の用途としては、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質を模倣する抗イディオタイプ抗体を作製することが挙げられる。
抗体を調製するための種々の方法が、当該分野で周知である。例えば、抗体は、２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質、ペプチド、またはフラグメントを使用して、適切な哺乳動物宿主を免疫することによって、単離形態または免疫結合体化形態で、調製され得る（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ，編，Ｈａｒｌｏｗ，ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）；Ｈａｒｌｏｗ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８９））。さらに、２４Ｐ４Ｃ１２ ＧＳＴ融合タンパク質のような２４Ｐ４Ｃ１２融合タンパク質もまた、使用され得る。特定の実施形態において、図２または図３のアミノ酸配列の全てまたは大部分を含むＧＳＴ融合タンパク質が生成され、次いで、これを免疫原として使用して、適切な抗体を作製する。別の実施形態において、２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質が合成され、そして免疫原として使用される。
さらに、当該分野で公知の裸のＤＮＡ免疫技術が使用され（精製された２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質または２４Ｐ４Ｃ１２発現細胞を用いてかまたは用いずに）、そのコードされた免疫原に対する免疫応答を生じる（総説としては、Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、１９９７，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：６１７−６４８を参照のこと）。
図２または図３に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のアミノ酸配列を分析して抗体を作製するための、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の特定の領域を選択し得る。例えば、２４Ｐ４Ｃ１２アミノ酸配列の疎水性分析および親水性分析を使用して、２４Ｐ４Ｃ１２構造における親水性領域を同定する。免疫原構造を示す２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の領域、ならびに他の領域およびドメインは、当該分野で公知の種々の他の方法（例えば、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、Ｋａｒｐｌｕｓ−ＳｃｈｕｌｔｚまたはＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析）を使用して、容易に同定され得る。親水性プロフィールは、Ｈｏｐｐ，Ｔ．Ｐ．およびＷｏｏｄｓ，Ｋ．Ｒ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：３８２４−３８２８の方法を使用して、産生され得る。ヒドロパシープロフィールは、Ｋｙｔｅ，Ｊ．およびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２の方法を使用して、産生され得る。アクセス可能なパーセント（％）残基プロフィールは、Ｊａｎｉｎ Ｊ．，１９７９，Ｎａｔｕｒｅ ２７７：４９１−４９２の方法を使用して、産生され得る。平均可撓性プロフィールは、Ｂｈａｓｋａｒａｎ Ｒ．，Ｐｏｎｎｕｓｗａｍｙ Ｐ．Ｋ．，１９８８，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３２：２４２−２５５の方法を使用して、産生され得る。βターンプロフィールは、Ｄｅｌｅａｇｅ，Ｇ．，Ｒｏｕｘ Ｂ．，１９８７，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １：２８９−２９４の方法を使用して、産生され得る。従って、これらのプログラムまたは方法のいずれかによって同定される各領域は、本発明の範囲内である。２４Ｐ４Ｃ１２抗体を作製するための方法は、本明細書中で提供される実施例によって、さらに例示される。免疫原として使用するためのタンパク質またはポリペプチドを調製するための方法は、当該分野で周知である。キャリア（例えば、ＢＳＫ、ＫＬＨまたは他のキャリアタンパク質）とタンパク質との免疫原性結合体を調製するための方法もまた、当該分野で周知である。いくつかの状況において、例えば、カルボジイミド試薬を使用する直接的結合体化が使用され；他の例においては、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬによって供給される結合試薬が有効である。２４Ｐ４Ｃ１２免疫原の投与は、当該分野で理解されるように、多くの場合、適切な期間にわたって、適切なアジュバントを使用して注射することによって、行われる。免疫スケジュールの間、抗体の力価を収集して、抗体形成の妥当性を決定し得る。
２４Ｐ４Ｃ１２モノクローナル抗体は、当該分野で周知の種々の手段によって生成され得る。例えば、所望のモノクローナル抗体を分泌する不死化細胞株は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの標準的なハイブリドーマ技術、または一般に公知のように、抗体産生Ｂ細胞を不死化する改変を使用して、調製される。所望の抗体を分泌する不死化細胞株は、免疫アッセイによってスクリーニングされる（このアッセイにおいて、抗原は、２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質である）。適切な不死化細胞培養物が同定される場合、この細胞が拡大され得、そしてインビトロ培養物または腹水のいずれかから、抗体が生成され得る。
本発明の抗体またはフラグメントはまた、組換え手段によっても生成され得る。２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の所望の領域に特異的に結合する領域はまた、複数の種起源のキメラ抗体または相補性決定領域（ＣＤＲ）グラフト化（ｇｒａｆｔｅｄ）抗体の状況下で産生され得る。ヒト化２４Ｐ４Ｃ１２抗体またはヒト２４Ｐ４Ｃ１２抗体もまた産生され得、そして治療的状況下での使用のために好ましい。１つ以上の非ヒト抗体ＣＤＲを、対応するヒト抗体配列と置換することによる、マウス抗体および他の非ヒト抗体をヒト化するための方法は、周知である（例えば、Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６を参照のこと）。Ｃａｒｔｅｒら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２８５、およびＳｉｍｓら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６もまた参照のこと。
完全なヒトモノクローナル抗体を産生するための方法としては、ファージディスプレイ方法およびトランスジェニック方法が挙げられる（概要については、Ｖａｕｇｈａｎら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：５３５−５３９を参照のこと）。完全なヒト２４Ｐ４Ｃ１２モノクローナル抗体は、大きいヒトＩｇ遺伝子コンビナトリアルライブラリー（すなわち、ファージディスプレイ）を使用するクローニング技術を使用して生成され得る（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｍａｎ．Ｃｌａｒｋ，Ｍ．編）、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ Ａｃａｄｅｍｉｃ、４５−６４頁（１９９３）のＧｒｉｆｆｉｔｈｓおよびＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｉｍｍｕｎｅ
ｓｙｓｔｅｍ：ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ；ＢｕｒｔｏｎおよびＢａｒｂａｓ、Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ（同書）６５−８２頁）。完全なヒト２４Ｐ４Ｃ１２モノクローナル抗体はまた、１９９７年１２月３日公開のＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／２４８９３（ＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉおよびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓら）に記載されるように、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むように操作されたトランスジェニックマウスを使用して産生され得る（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ、１９９８、Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ ７（４）：６０７−６１４；米国特許第６，１６２，９６３号（２０００年１２月１９日発行）；米国特許第６，１５０，５８４号（２０００年１１月１２日発行）；および米国特許第６，１１４，５９８号（２０００年９月５日発行）もまた参照のこと）。この方法は、ファージディスプレイ技術に必要とされるインビトロ操作を回避し、そして高い親和性の真正ヒト抗体を効率的に産生する。
２４Ｐ４Ｃ１２抗体の２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質との反応性は、多数の周知方法によって確立され得、これらの方法としては、適切な場合、２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質、２４Ｐ４Ｃ１２発現細胞またはそれらの抽出物を使用する、ウェスタンブロット、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ、およびＦＡＣＳ分析が挙げられるがこれらに限定されない。２４Ｐ４Ｃ１２抗体またはそれらのフラグメントは、検出可能なマーカーで標識され得るか、または第二の分子に結合体化され得る。適切な検出可能なマーカーとしては、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素が挙げられるがこれらに限定されない。さらに、２つ以上の２４Ｐ４Ｃ１２エピトープに特異的な二重特異性（ｂｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体が、当該分野で一般に公知の方法を使用して、作製される。ホモダイマー抗体もまた、当該分野で公知の架橋技術によって、作製され得る（例えば、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：２５６０−２５６５）。
（Ｖ．）２４Ｐ４Ｃ１２細胞免疫応答）
Ｔ細胞が抗原を認識する機構は、解明されている。本発明の有効なペプチドエピトープワクチン組成物は、世界中の集団の非常に広範な区分において治療的免疫応答または予防的免疫応答を誘導する。細胞免疫応答を誘導する本発明の組成物の価値および効力の理解のために、免疫学関連技術の簡単な総説を示す。
ＨＬＡ分子とペプチド抗原との複合体は、ＨＬＡ拘束Ｔ細胞によって認識されるリガンドとして作用する（Ｂｕｕｓ，Ｓら、Ｃｅｌｌ ４７：１０７１，１９８６；Ｂａｂｂｉｔｔ，Ｂ．Ｐ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ３１７：３５９，１９８５；Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ａ．およびＢｏｄｍｅｒ，Ｈ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：６０１，１９８９；Ｇｅｒｍａｉｎ，Ｒ．Ｎ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：４０３，１９９３）。単一のアミノ酸が置換された抗原アナログおよび内因性結合した天然でプロセシングされたペプチドの配列決定の研究を通して、ＨＬＡ抗原分子への特異的結合に必要なモチーフに対応する重要な残基が、同定されており、表ＩＶに記載される（例えば、Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３６３，１９９８；Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４１：１７８，１９９５；Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂを介してＵＲＬ １３４．２．９６．２２１／ｓｃｒｉｐｔｓ．ｈｌａｓｅｒｖｅｒ．ｄｌｌ／ｈｏｍｅ．ｈｔｍにアクセスのこと）；Ｓｅｔｔｅ，Ａ．およびＳｉｄｎｅｙ，Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：４７８，１９９８；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ，Ｖ．Ｈ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１３，１９９４；Ｓｅｔｔｅ，Ａ．およびＧｒｅｙ，Ｈ．Ｍ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：７９，１９９２；Ｓｉｎｉｇａｇｌｉａ，Ｆ．およびＨａｍｍｅｒ，Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：５２，１９９４；Ｒｕｐｐｅｒｔら、Ｃｅｌｌ ７４：９２９−９３７，１９９３；Ｋｏｎｄｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：４３０７−４３１２，１９９５；Ｓｉｄｎｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：３４８０−３４９０，１９９６；Ｓｉｄｎｅｙら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：７９−９３，１９９６；Ｓｅｔｔｅ，Ａ．およびＳｉｄｎｅｙ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ １９９９ Ｎｏｖ；５０（３−４）：２０１−１２、総説を参照のこと）。
さらに、ＨＬＡ−ペプチド複合体のＸ線結晶学的分析は、対立遺伝子特異的様式においてペプチドリガンドにより保有される残基を収容するＨＬＡ分子のペプチド結合間隙／溝部内のポケットを明らかにし；次いで、これらの残基は、この残基が存在するペプチドのＨＬＡ結合能を決定する（例えば、Ｍａｄｄｅｎ，Ｄ．Ｒ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：５８７，１９９５；Ｓｍｉｔｈら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４：２０３，１９９６；Ｆｒｅｍｏｎｔら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８：３０５，１９９８；Ｓｔｅｒｎら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：２４５，１９９４；Ｊｏｎｅｓ，Ｅ．Ｙ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：７５，１９９７；Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３６４：３３，１９９３；Ｇｕｏ，Ｈ．Ｃ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：８０５３，１９９３；Ｇｕｏ，Ｈ．Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３６０：３６４，１９９２；Ｓｉｌｖｅｒ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３６０：３６７，１９９２；Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：９２７，１９９２；Ｍａｄｄｅｎら、Ｃｅｌｌ ７０：１０３５，１９９２；Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｄ．Ｈ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：９１９，１９９２；Ｓａｐｅｒ，Ｍ．Ａ，Ｂｊｏｒｋｍａｎ，Ｐ．Ｊ．およびＷｉｌｅｙ，Ｄ．Ｃ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：２７７，１９９１を参照のこと）。
従って、クラスＩおよびクラスＩの対立遺伝子特異的ＨＬＡ結合モチーフ、またはクラスＩもしくはクラスＩＩのスーパーモチーフの定義は、特定のＨＬＡ抗原への結合と関連するタンパク質内の領域の同定を可能にする。
従って、ＨＬＡモチーフの同定プロセスによって、エピトープベースのワクチンの候補が、同定されている；このような候補は、エピトープとその対応するＨＬＡ分子との会合の結合親和性および／または期間を決定するために、ＨＬＡ−ペプチド結合アッセイによりさらに評価され得る。これらのワクチン候補の中から、集団適用範囲および／または免疫原性の観点で好ましい特徴を有するエピトープを選択するために、さらなる確証実験が行われ得る。
種々のストラテジーが、細胞免疫原性を評価するために使用され得、これには以下が挙げられる：
１）正常な個体由来の一次Ｔ細胞培養物の評価（例えば、Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ，Ｐ．Ａ．ら，Ｍｏｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：６０３，１９９５；Ｃｅｌｉｓ，Ｅ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：２１０５，１９９４；Ｔｓａｉ，Ｖ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：１７９６，１９９７；Ｋａｗａｓｈｉｍａ，Ｉ．ら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．５９：１，１９９８を参照のこと）。この手順は、抗原提示細胞の存在下で、インビトロで数週間の期間にわたって、正常な被験体由来の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を試験ペプチドで刺激することを包含する。このペプチドに特異的なＴ細胞は、この時間の間に活性化され、そして例えば、ペプチドで感作された標的細胞を含むリンホカイン放出アッセイまたは５１Ｃｒ放出アッセイを使用して、検出される。
２）ＨＬＡトランスジェニックマウスの免疫処置（例えば、Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ，Ｐ．Ａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：９７，１９９６；Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ，Ｐ．Ａ．ら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６５１，１９９６；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：４７５３，１９９７を参照のこと）。例えば、このような方法において、不完全フロイントアジュバント中のペプチドが、ＨＬＡトランスジェニックマウスに皮下投与される。免疫処置の数週間後、脾細胞が取り出され、そして試験ペプチドの存在下で、約１週間インビトロで培養される。ペプチド特異的Ｔ細胞は、例えば、ペプチドで感作された標的細胞および内因的に生成された抗原を発現する標的細胞を含む、５１Ｃｒ放出アッセイを使用して、検出される。
３）効果的にワクチン接種された免疫個体および／または慢性的に病気の患者のいずれか由来のリコールＴ細胞応答の証明（例えば、Ｒｅｈｅｒｍａｎｎ，Ｂ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：１０４７，１９９５；Ｄｏｏｌａｎ，Ｄ．Ｌ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ
７：９７，１９９７；Ｂｅｒｔｏｎｉ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：５０３，１９９７；Ｔｈｒｅｌｋｅｌｄ，Ｓ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１６４８，１９９７；Ｄｉｅｐｏｌｄｅｒ，Ｈ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：６０１１，１９９７を参照のこと）。従って、リコール応答は、疾患に起因して抗原に曝露され、従って「自然に」免疫応答を生成した被験体由来のＰＢＬ、または抗原に対してワクチン接種された患者由来のＰＢＬを培養することによって、検出される。被験体由来のＰＢＬは、試験ペプチド＋抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で１〜２週間、インビトロで培養され、「未刺激」Ｔ細胞と比較して「記憶」Ｔ細胞の活性化を可能にする。この培養期間の最後に、Ｔ細胞活性が、ペプチドで感作した標的を含む５１Ｃｒ放出、Ｔ細胞増殖またはリンホカイン放出を含むアッセイを使用して、検出される。
（ＶＩ．）２４Ｐ４Ｃ１２トランスジェニック動物）
２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質をコードする核酸はまた、トランスジェニック動物または「ノックアウト」動物のいずれかを作製するために使用され得、この動物は、次いで、治療的に有用な試薬の開発およびスクリーニングにおいて有用である。確立された技術によって、２４Ｐ４Ｃ１２をコードするｃＤＮＡが、２４Ｐ４Ｃ１２をコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用され得る。次いで、このクローン化されたゲノム配列は、２４Ｐ４Ｃ１２をコードするＤＮＡを発現する細胞を含むトランスジェニック動物を作製するために使用され得る。トランスジェニック動物（特に、マウスまたはラットのような動物）を作製するための方法は、当該分野で慣習的になっており、そして例えば、米国特許第４，７３６，８６６号（１９８８年４月１２日発行）および同第４，８７０，００９号（１９８９年９月２６日発行）において記載されている。代表的には、特定の細胞が、組織特異的エンハンサーを用いる２４Ｐ４Ｃ１２導入遺伝子組込みのために標的化される。
２４Ｐ４Ｃ１２をコードする１コピーの導入遺伝子を含むトランスジェニック動物は、２４Ｐ４Ｃ１２をコードするＤＮＡの発現を増加する効果を試験するために使用され得る。このような動物は、例えば、その過剰発現に関連する病理学的状態からの防御を付与すると考えられる試薬についてのテスター動物として使用され得る。本発明のこの局面によると、動物は、試薬で処置され、そしてこの導入遺伝子を有する未処置の動物と比較して減少した病理学的状態の発生率は、この病理学的状態に対する潜在的な治療的介入を示す。
あるいは、２４Ｐ４Ｃ１２の非ヒトホモログは、２４Ｐ４Ｃ１２「ノックアウト」動物を構築するために使用され得、この２４Ｐ４Ｃ１２「ノックアウト」動物は、２４Ｐ４Ｃ１２をコードする内在性遺伝子と、この動物の胚性細胞に導入された２４Ｐ４Ｃ１２をコードする変化したゲノムＤＮＡとの間の相同組換えの結果として、２４Ｐ４Ｃ１２をコードする欠損遺伝子または変化した遺伝子を有する。例えば、２４Ｐ４Ｃ１２をコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従って、２４Ｐ４Ｃ１２をコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用され得る。２４Ｐ４Ｃ１２をコードするゲノムＤＮＡの一部は、欠失され得るか、または別の遺伝子（例えば、組込みをモニタリングするために使用され得る選択マーカーをコードする遺伝子）で置換され得る。代表的には、数キロベースの変化していない隣接ＤＮＡ（５’末端と３’末端との両方）が、ベクター中に含まれる（例えば、相同組換えベクターの説明については、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ，５１：５０３（１９８７）を参照のこと）。このベクターは、胚性幹細胞株に（例えば、エレクトロポレーションによって）導入され、そしてこの導入されたＤＮＡが内因性ＤＮＡと相同組換えされた細胞が、選択される（例えば、Ｌｉら、Ｃｅｌｌ，６９：９１５（１９９２）を参照のこと）。ついで、この選択された細胞は、動物（例えば、マウスまたはラット）の胚盤胞に注入されて、凝集キメラが形成される（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８７），ｐｐ．１１３−１５２を参照のこと）。キメラ胚は、次いで、適切な偽妊娠雌性代理母動物に移植され得、そしてこの胚は、出産されて、「ノックアウト」動物が作製される。生殖細胞中に相同組換えされたＤＮＡを有する子孫が、標準的な技術によって同定され得、そして全ての細胞が相同組み替えされたＤＮＡを含む動物を育種させるために使用され得る。ノックアウト動物は、例えば、特定の病理学的状態に対して防御する能力について、または２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチドの非存在に起因する病理学的状態の発症について、特徴付けされ得る。
（ＶＩＩ．）２４Ｐ４Ｃ１２の検出方法）
本発明の別の局面は、２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドおよび２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質を検出するための方法、ならびに２４Ｐ４Ｃ１２を発現する細胞を同定するための方法に関する。２４Ｐ４Ｃ１２の発現プロファイルは、２４Ｐ４Ｃ１２を、転移した疾患についての診断マーカーにする。従って、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物の状態は、進行した病期の疾患に対する感受性、進行速度および／または腫瘍の攻撃性を含む種々の因子を推定するために有用な情報を提供する。本明細書中で詳細に議論されるように、患者サンプル中の２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物の状態が、当該分野で周知の種々のプロトコルによって分析され得、このプロトコルとしては、免疫組織化学分析、種々のノーザンブロット技術（インサイチュハイブリダイゼーションを含む）、ＲＴ−ＰＣＲ分析（例えば、レーザー捕捉微小解剖サンプルについて）、ウェスタンブロット分析および組織アレイ分析が挙げられる。
より詳細には、本発明は、生物学的サンプル（例えば、血清、骨、前立腺および他の組織、尿、精液、細胞調製物など）中の２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドの検出のためのアッセイを提供する。検出可能な２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドとしては、例えば、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子またはそのフラグメント、２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡ、選択的スプライス改変体２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡ、および２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子が挙げられる。２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドを増幅し、そして／または２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドの存在を検出するための多数の方法が、当該分野で周知であり、本発明のこの局面の実施において用いられ得る。
一実施形態において、生物学的サンプル中の２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡを検出するための方法は、少なくとも１つのプライマーを使用して、逆転写によりこのサンプルからｃＤＮＡを生成する工程；センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドを使用して、このようにして生成されたｃＤＮＡを増幅して、その中の２４Ｐ４Ｃ１２ ｃＤＮＡを増幅する工程；およびこの増幅された２４Ｐ４Ｃ１２ ｃＤＮＡの存在を検出する工程、を包含する。必要に応じて、この増幅された２４Ｐ４Ｃ１２ ｃＤＮＡの配列が、決定され得る。
別の実施形態において、生物学的サンプル中の２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子を検出する方法は、第１に、このサンプルからゲノムＤＮＡを単離する工程；センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドを使用して、この単離されたゲノムＤＮＡを増幅する工程；およびこの増幅された２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子の存在を検出する工程、を包含する。多数の適切なセンスプローブとアンチセンスプローブとの組合せが、２４Ｐ４Ｃ１２ヌクレオチド配列（例えば、図２を参照のこと）から設計され得、そしてこの目的のために使用され得る。
本発明はまた、組織または他の生物学的サンプル（例えば、血清、精液、骨、前立腺、尿、細胞調製物など）中の２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の存在を検出するためのアッセイを提供する。２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質を検出するための方法もまた、周知であり、これには、例えば、免疫沈降、免疫組織化学分析、ウェスタンブロット分析、分子結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＦＡなどが挙げられる。例えば、生物学的サンプル中の２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質の存在を検出する方法は、第１に、このサンプルと、２４Ｐ４Ｃ１２抗体、その２４Ｐ４Ｃ１２反応性フラグメント、または２４Ｐ４Ｃ１２抗体の抗原結合領域を含む組換えタンパク質とを接触させる工程；次いで、このサンプル中の２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質の結合を検出する工程、を包含する。
２４Ｐ４Ｃ１２を発現する細胞を同定するための方法もまた、本発明の範囲内である。一実施形態において、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子を発現する細胞を同定するためのアッセイは、この細胞中の２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡの存在を検出する工程を包含する。細胞中の特定のｍＲＮＡを検出するための方法は、周知であり、そして例えば、相補的ＤＮＡプローブを使用するハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、標識された２４Ｐ４Ｃ１２リボプローブを使用するインサイチュハイブリダイゼーション、ノーザンブロットおよび関連の技術）、および種々の核酸増幅アッセイ（例えば、２４Ｐ４Ｃ１２に対して特異的な相補的プライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲ、および他の増幅型検出方法（例えば、分枝状ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡなど））が挙げられる。あるいは、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子を発現する細胞を同定するためのアッセイは、この細胞中に存在するか、またはこの細胞により分泌される２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質の存在を検出する工程を包含する。タンパク質の検出のための種々の方法が、当該分野で周知であり、そして２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質の検出のためおよび２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質を発現する細胞の検出のために用いられる。
２４Ｐ４Ｃ１２発現分析はまた、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子発現を調節する因子を同定および評価するための手段として有用である。例えば、２４Ｐ４Ｃ１２発現は、前立腺癌において有意にアップレギュレートされ、そして表Ｉに列挙される組織の癌において発現される。癌細胞における２４Ｐ４Ｃ１２発現または２４Ｐ４Ｃ１２過剰発現を阻害する分子または生物学的因子の同定は、治療的価値を有する。例えば、このような因子は、ＲＴ−ＰＣＲ、核酸ハイブリダイゼーションまたは抗体結合により２４Ｐ４Ｃ１２発現を定量するスクリーニングを使用することによって、同定され得る。
（ＶＩＩＩ．）２４Ｐ４Ｃ１２関連遺伝子およびそれらの産物の状態をモニタリングするための方法）
腫瘍形成は、細胞増殖が次第に調節不全になり、細胞が正常な生理学的状態から前癌状態まで進行し、次いで癌状態まで進行する、多段階プロセスであることが知られている（例えば、Ａｌｅｒｓら、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．７７（５）：４３７−４３８（１９９７）およびＩｓａａｃｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖ．２３：１９−３２（１９９５）を参照のこと）。この状況において、生物学的サンプルを調節不全性の細胞増殖の証拠（例えば、癌における異常な２４Ｐ４Ｃ１２発現）について試験することにより、癌のような病理学的状態が、治療選択肢がより制限される段階まで進行する前、そして／または予後が悪化する前に、このような異常な生理学を早期に検出することが可能になる。このような試験において、目的の生物学的サンプル中の２４Ｐ４Ｃ１２の状態が、例えば、対応する正常なサンプル（例えば、病理により影響を受けていない、この個体または代替の別の個体由来のサンプル）中の２４Ｐ４Ｃ１２の状態と比較され得る。生物学的サンプル中の２４Ｐ４Ｃ１２の状態における（正常なサンプルと比較した場合の）変化は、調節不全性の細胞増殖の証拠を提供する。病理により影響を受けていない生物学的サンプルを正常なサンプルとして使用することに加えて、所定の規範値（例えば、ｍＲＮＡ発現の所定の正常なレベル）（例えば、Ｇｒｅｖｅｒら、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１９９６年１２月９日；３７６（２）：３０６−１４および米国特許第５，８３７，５０１号を参照のこと）もまた、サンプル中の２４Ｐ４Ｃ１２の状態を比較するために使用し得る。
この文脈において、用語「状態」は、当該分野で認められた意味に従って使用され、遺伝子およびその産物の状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）または状態（ｓｔａｔｅ）をいう。代表的には、当業者は、多数のパラメーターを使用して、遺伝子およびその産物の状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）または状態（ｓｔａｔｅ）を評価する。これには、発現された遺伝子産物の位置（２４Ｐ４Ｃ１２発現細胞の位置を含む）、ならびに発現された遺伝子産物（例えば、２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡ、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド）のレベルおよび生物学的活性が挙げられるが、これらに限定されない。代表的には、２４Ｐ４Ｃ１２の状態における変化は、２４Ｐ４Ｃ１２および／または２４Ｐ４Ｃ１２発現細胞の位置における変化、ならびに／あるいは２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡおよび／または２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の発現の増加を含む。
サンプル中の２４Ｐ４Ｃ１２の状態は、当該分野で周知の多数の手段によって分析され得、この手段としては、免疫組織化学分析、インサイチュハイブリダイゼーション、レーザー捕捉微小解剖サンプルに対するＲＴ−ＰＣＲ分析、ウェスタンブロット分析および組織アレイ分析が挙げられるが、これらに限定されない。２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子および遺伝子産物の状態を評価するための代表的なプロトコルは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔｓ ２（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ），４（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ），１５（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）および１８（ＰＣＲ Ａｎａｌｙｓｉｓ）に見出される。従って、生物学的サンプル中の２４Ｐ４Ｃ１２の状態は、当業者により使用される種々の方法によって評価され、これらの方法としては、ゲノムサザン分析（例えば、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子中の摂動（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）を試験するため）、２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡのノーザン分析および／またはＰＣＲ分析（例えば、ポリヌクレオチド配列または２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡの発現レベルにおける変化を試験するため）、ならびにウェスタン分析および／または免疫組織化学分析（例えば、ポリペプチド配列における変更、サンプル内のポリペプチドの局在化における変化、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の発現レベルにおける変化、および／または２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質とポリペプチド結合パートナーとの会合を試験するため）が挙げられるが、これらに限定されない。検出可能な２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドとしては、例えば、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子またはそのフラグメント、２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡ、選択的スプライス改変体、２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡ、および２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ分子または組換えＲＮＡ分子が挙げられる。
２４Ｐ４Ｃ１２の発現プロファイルは、２４Ｐ４Ｃ１２を局所疾患および／または転移性疾患についての診断マーカーとし、そして生物学的サンプルの増殖または腫瘍形成の可能性についての情報を提供する。特に、２４Ｐ４Ｃ１２の状態は、特定の疾患段階、進行および／または腫瘍の攻撃性に対する感受性を推定するために有用な情報を提供する。本発明は、２４Ｐ４Ｃ１２の状態を決定し、２４Ｐ４Ｃ１２を発現する癌（例えば、表Ｉに列挙される組織の癌）を診断するための方法およびアッセイを提供する。例えば、２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡは、正常な前立腺組織と比較して前立腺癌および他の癌において高度に発現されるので、生物学的サンプル中の２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡ転写産物または２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のレベルを評価するアッセイが、２４Ｐ４Ｃ１２の調節不全と関連する疾患を診断するために使用され得、そして適切な治療選択肢を規定する際に有用な予後情報を提供し得る。
２４Ｐ４Ｃ１２の発現状態は、形成異常細胞、前癌状態の細胞および癌細胞の存在、病期および位置を含む、種々の段階の疾患に対する感受性を予測する情報、および／または腫瘍の攻撃性を評価するための情報を提供する。さらに、発現プロファイルは、２４Ｐ４Ｃ１２を、転移性疾患のための画像化試薬として有用にする。結果的に、本発明の局面は、生物学的サンプル（例えば、調節不全性の細胞増殖により特徴付けられる病理（例えば、癌）に罹患している個体由来のサンプル、またはこのような病理に罹患している疑いのある個体由来のサンプル）中の２４Ｐ４Ｃ１２の状態を試験するための種々の分子予後方法および分子診断方法に関する。
上記のように、生物学的サンプル中の２４Ｐ４Ｃ１２の状態は、当該分野で周知の多数の手順によって試験され得る。例えば、身体の特定の位置から採取された生物学的サンプル中の２４Ｐ４Ｃ１２の状態は、このサンプルを、２４Ｐ４Ｃ１２発現細胞（例えば、２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡまたは２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質を発現する細胞）の存在または非存在について評価することによって、試験され得る。この試験は、例えば、２４Ｐ４Ｃ１２発現細胞が、通常ではこのような細胞を含まない生物学的サンプル（例えば、リンパ節）中に見出された場合、調節不全性の細胞増殖の証拠を提供し得る。なぜなら、生物学的サンプル中の２４Ｐ４Ｃ１２の状態におけるこのような変化は、しばしば、調節不全性の細胞増殖に関連するからである。詳細には、調節不全性の細胞増殖の１つの指標は、起源の器官（例えば、前立腺）から身体の異なる領域（例えば、リンパ節）への癌細胞の転移である。この状況において、調節不全性の細胞増殖の証拠は、重要である。なぜなら、例えば、前立腺癌を有する患者のうちのかなりの比率において、潜伏性リンパ節転移が検出され得、そしてこのような転移は、疾患の進行の既知の予測因子と関連するからである（例えば、Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ４２（４）：３１５−３１７（２０００）；Ｓｕら、Ｓｅｍｉｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．１８（１）：１７−２８（２０００）およびＦｒｅｅｍａｎら、Ｊ Ｕｒｏｌ １９９５ Ａｕｇ １５４（２ Ｐｔ １）：４７４−８を参照のこと）。
１つの局面において、本発明は、調節不全性の細胞増殖に関連する疾患（例えば、過形成または癌）を有すると疑われる個体由来の細胞により発現される２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物の状態を決定し、次いでこのように決定した状態を、対応する正常なサンプル中の２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物の状態と比較することによって、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物をモニタリングするための方法を提供する。正常なサンプルと比較して、試験サンプル中の異常な２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物の存在は、個体の細胞内の調節不全性の細胞増殖の存在の指標を提供する。
別の局面において、本発明は、個体における癌の存在を決定する際に有用なアッセイを提供し、このアッセイは、対応する正常な細胞または正常な組織における発現レベルと比較して、試験細胞サンプルまたは試験組織サンプル中の２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現の有意な増加を検出する工程を包含する。例えば、２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡの存在は、表Ｉに列挙される組織サンプルを包含するがそれに限定されない組織において評価され得る。これらの組織のいずれかにおける有意な２４Ｐ４Ｃ１２発現の存在は、癌の発症、存在および／または重篤度を示すために有用である。なぜなら、対応する正常な組織は、２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡを発現しないか、これを低レベルでしか発現しないからである。
関連の実施形態において、２４Ｐ４Ｃ１２の状態は、核酸レベルでよりもむしろタンパク質レベルで決定される。例えば、このような方法は、試験組織サンプル中の細胞により発現される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のレベルを決定し、このように決定されたレベルを、対応する正常なサンプルにおいて発現される２４Ｐ４Ｃ１２のレベルと比較する工程を包含する。一実施形態において、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の存在は、例えば、免疫組織化学方法を使用して、評価される。２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質発現を検出し得る２４Ｐ４Ｃ１２抗体または２４Ｐ４Ｃ１２結合パートナーが、この目的のために、当該分野で周知の種々のアッセイ様式で使用される。
さらなる実施形態において、生物学的サンプル中の２４Ｐ４Ｃ１２ヌクレオチド配列および２４Ｐ４Ｃ１２アミノ酸配列の状態が、これらの分子の構造における変動を同定するために、評価され得る。これらの変動としては、挿入、欠失、置換などが挙げられ得る。このような評価は、有用である。なぜなら、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列における変動は、増殖調節不全性の表現型と関連する多数のタンパク質において観察されるからである（例えば、Ｍａｒｒｏｇｉら、１９９９，Ｊ．Ｃｕｔａｎ．Ｐａｔｈｏｌ．２６（８）：３６９−３７８を参照のこと）。例えば、２４Ｐ４Ｃ１２の配列における変異は、腫瘍の存在または発癌補助作用を示し得る。従って、このようなアッセイは、２４Ｐ４Ｃ１２における変異が潜在的な機能喪失または腫瘍増殖の増加を示す場合、診断的価値および予測的価値を有する。
ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列における変動を観察するための広範な種々のアッセイが、当該分野で周知である。例えば、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物の核酸配列またはアミノ酸配列のサイズおよび構造は、本明細書中で考察されるノーザンプロトコル、サザンプロトコル、ウェスタンプロトコル、ＰＣＲプロトコルおよびＤＮＡ配列決定プロトコルにより観察される。さらに、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列における変動を観察するための他の方法（例えば、単鎖高次構造多型分析）が、当該分野で周知である（例えば、米国特許第５，３８２，５１０号（１９９９年９月７日発行）および同第５，９５２，１７０号（１９９５年１月１７日発行）を参照のこと）。
さらに、生物学的サンプル中の２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子のメチル化状態が試験され得る。遺伝子の５’調節領域中のＣｐＧアイランドの異常な脱メチル化および／または過剰メチル化が、しばしば、不死化細胞および形質転換細胞において生じ、種々の遺伝子の変化した発現を生じ得る。例えば、πクラスのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（正常な前立腺において発現されるタンパク質であり、前立腺癌の９０％より多くにおいては発現されない）のプロモーター過剰メチル化は、この遺伝子の転写を永久的に止めるようであり、最も頻繁に検出される前立腺癌におけるゲノム変化である（Ｄｅ Ｍａｒｚｏら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５５（６）：１９８５−１９９２（１９９９））。さらに、この変化は、高度な前立腺上皮内新形成（ＰＩＮ）の症例のうちの少なくとも７０％において存在する（Ｂｒｏｏｋｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ．，１９９８，７：５３１−５３６）。別の例において、ＬＡＧＥ−Ｉ腫瘍特異的遺伝子の発現（これは、正常な前立腺においては発現されないが、前立腺癌の２０〜５０％において発現される）は、リンパ芽球細胞においてデオキシ−アザシチジンにより誘導され、このことは、腫瘍発現が脱メチル化に起因することを示唆している（Ｌｅｔｈｅら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７６（６）：９０３−９０８（１９９８））。遺伝子のメチル化状態を試験するための種々のアッセイが、当該分野で周知である。例えば、サザンハイブリダイゼーションアプローチにおいて、メチル化されたＣｐＧ部位を含む配列を切断し得ないメチル化感受性制限酵素を使用して、ＣｐＧアイランドのメチル化状態を評価し得る。さらに、ＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）は、所定の遺伝子のＣｐＧアイランド中に存在する全てのＣｐＧ部位のメチル化状態を迅速にプロファイルし得る。この手順は、亜硫酸水素ナトリウム（これはメチル化されていない全てのシトシンをウラシルに変換する）によりまずＤＮＡを改変し、続いてメチル化されていないＤＮＡに対してメチル化されたＤＮＡに特異的なプライマーを使用して増幅することを包含する。メチル化干渉を含むプロトコルはまた、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔ １２，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５において見出され得る。
遺伝子増幅は、２４Ｐ４Ｃ１２の状態を評価するためのさらなる方法である。遺伝子増幅は、本明細書中で提供される配列に基づいて、例えば、適切に標識されたプローブを使用して、ｍＲＮＡの転写を定量するための従来のサザンブロッティングまたはノーザンブロッティング（Ｔｈｏｍａｓ，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：５２０１−５２０５）、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）、またはインサイチュハイブリダイゼーションによってサンプル中で直接測定される。あるいは、特定の二重鎖（ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖またはＤＮＡ−タンパク質二重鎖を含む）を認識する抗体が、使用される。次いで、この抗体は、標識され、そしてアッセイが実施され、このアッセイにおいて、この二重鎖は、表面に結合され、その結果、この表面上で二重鎖が形成されると、この二重鎖に結合した抗体の存在が、検出され得る。
生検組織または末梢血が、例えば、ノーザン分析、ドットブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲ分析を使用して、癌細胞の存在について簡便にアッセイされて、２４Ｐ４Ｃ１２発現が検出され得る。ＲＴ−ＰＣＲ増幅可能な２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡの存在は、癌の存在の指標を提供する。ＲＴ−ＰＣＲアッセイは、当該分野で周知である。末梢血中の腫瘍細胞のためのＲＴ−ＰＣＲ検出アッセイは、多数のヒト固形腫瘍の診断および管理において使用するために、現在評価されている。前立腺癌の分野において、このアッセイには、ＰＳＡおよびＰＳＭを発現する細胞の検出のためのＲＴ−ＰＣＲアッセイが挙げられる（Ｖｅｒｋａｉｋら、１９９７，Ｕｒｏｌ．Ｒｅｓ．２５：３７３−３８４；Ｇｈｏｓｓｅｉｎら，１９９５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１３：１１９５−２０００；Ｈｅｓｔｏｎら，１９９５，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４１：１６８７−１６８８）。
本発明のさらなる局面は、発症中の癌に対して個体が有する感受性の評価である。一実施形態において、癌に対する感受性を予想するための方法は、組織サンプル中の２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡまたは２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質（その存在は、癌に対する感受性を示す）を検出する工程を包含し、ここで、２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡ発現の程度は、感受性の程度と相関する。特定の実施形態において、前立腺または他の組織中の２４Ｐ４Ｃ１２の存在が、試験され、ここで、このサンプル中の２４Ｐ４Ｃ１２の存在は、前立腺癌感受性（または前立腺腫瘍の発症もしくは存在）の指標を提供する。同様に、生物学的サンプル中の２４Ｐ４Ｃ１２ヌクレオチド配列および２４Ｐ４Ｃ１２アミノ酸配列の完全性を評価して、これらの分子の構造における変動（例えば、挿入、欠失、置換など）を同定し得る。サンプル中の２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物の１つ以上の変動の存在は、癌感受性（または腫瘍の発症もしくは存在）の指標である。
本発明はまた、腫瘍の攻撃性を評価するための方法を包含する。一実施形態において、腫瘍の攻撃性を評価するための方法は、腫瘍細胞によって発現される２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡまたは２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のレベルを決定する工程、このように決定したレベルを、同じ個体もしくは正常な組織参照サンプルから採取した対応する正常な組織において発現される２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡまたは２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のレベルと比較する工程を包含し、ここで正常なサンプルに対する腫瘍サンプルにおける２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡまたは２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の発現の程度は、攻撃性の程度を示す。特定の実施形態において、腫瘍の攻撃性は、２４Ｐ４Ｃ１２が腫瘍細胞において発現される程度を決定することによって評価され、ここでより高い発現レベルは、より攻撃性の腫瘍を示す。別の実施形態は、２４Ｐ４Ｃ１２ヌクレオチドおよびアミノ酸の構造における変動（例えば、挿入、欠失、置換など）を同定するための、生物学的サンプル中のこの２４Ｐ４Ｃ１２ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の完全性の評価である。１つ以上の変動の存在は、より攻撃性の腫瘍を示す。
本発明の別の実施形態は、個体における悪性腫瘍の進行を経時的に観察するための方法に関する。一実施形態において、個体における悪性腫瘍の進行を経時的に観察するための方法は、腫瘍のサンプル中の細胞により発現される２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡまたは２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のレベルを決定する工程、このようにして決定されたレベルを、異なる時間に同じ個体から採取した同等な組織サンプルにおいて発現される２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡまたは２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のレベルと比較する工程、を包含し、ここで、経時的な腫瘍サンプルにおける２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡまたは２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の発現の程度は、癌の進行についての情報を提供する。特定の実施形態において、癌の進行は、腫瘍細胞における２４Ｐ４Ｃ１２の発現を経時的に決定することにより評価され、ここで経時的に増加した発現は、癌の進行を示す。また、生物学的サンプル中の２４Ｐ４Ｃ１２ヌクレオチド配列および２４Ｐ４Ｃ１２アミノ酸配列の完全性を評価して、これらの分子の構造における変動（例えば、挿入、欠失、置換など）を同定し得、ここで、１つ以上の変動の存在は、癌の進行を示す。
上記の診断アプローチは、当該分野で公知の広範な種々の予後プロトコルおよび診断プロトコルのいずれか１つと組み合わされ得る。例えば、本発明の別の実施形態は、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子の発現および２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物の発現（または２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子の変動および２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物における変動）と、組織サンプルの状態を診断および予想するための手段としての悪性腫瘍に関連する因子との間の同時発生を観察する方法に関する。悪性腫瘍に関連する広範な種々の因子（例えば、悪性腫瘍に関連する遺伝子（例えば、前立腺癌についてのＰＳＡ、ＰＳＣＡおよびＰＳＭの発現など）、ならびに肉眼で見える細胞学的知見）が、使用され得る（例えば、Ｂｏｃｋｉｎｇら、１９８４，Ａｎａｌ．Ｑｕａｎｔ．Ｃｙｔｏｌ．６（２）：７４−８８；Ｅｐｓｔｅｉｎ，１９９５，Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．２６（２）：２２３−９；Ｔｈｏｒｓｏｎら、１９９８，Ｍｏｄ．Ｐａｔｈｏｌ．１１（６）：５４３−５１；Ｂａｉｓｄｅｎら、１９９９，Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈｏｌ．２３（８）；９１８−２４を参照のこと）。２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子の発現および２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物の発現（または、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子および２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物における変動）と、悪性腫瘍に関連する別の因子との間の同時発生を観察するための方法は、有用である。なぜなら、例えば、疾患と同時に生じる特定の因子のセットの存在は、組織サンプルの状態を診断および予測するために重要な情報を提供するからである。
一実施形態において、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子の発現と２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物の発現（または、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子および２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物における変動）と、悪性腫瘍に関連する別の因子との間の同時発生を観察するための方法は、組織サンプル中の２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡまたは２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の過剰発現を検出すること、組織サンプル中のＰＳＡ ｍＲＮＡまたはＰＳＡタンパク質の過剰発現（またはＰＳＣＡ発現もしくはＰＳＭ発現）を検出すること、および２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡもしくは２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の過剰発現と、ＰＳＡ ｍＲＮＡもしくはＰＳＡタンパク質の過剰発現（またはＰＳＣＡ発現もしくはＰＳＭ発現）との同時発生を観察することを伴う。特定の実施形態において、前立腺組織における２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡおよびＰＳＡ ｍＲＮＡの発現が、試験され、ここで、このサンプル中の２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡ過剰発現とＰＳＡ ｍＲＮＡ過剰発現との同時発生は、前立腺癌の存在、前立腺癌感受性または前立腺腫瘍の発症もしくは状態を示す。
２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を検出および定量するための方法が、本明細書中に記載されており、そして標準核酸およびタンパク質の検出技術および定量技術は、当該分野で周知である。２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡの検出および定量するための標準方法としては、標識２４Ｐ４Ｃ１２リボプローブを使用するインサイチュハイブリダイゼーション、２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドプローブを使用するノーザンブロットおよび関連する技術、２４Ｐ４Ｃ１２に対して特異的なプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲ分析、並びに他の増幅型検出方法（例えば、分枝ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡなど）が挙げられる。特定の実施形態において、半定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して、２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡ発現を検出および定量する。２４Ｐ４Ｃ１２を増幅し得る任意の数のプライマーを、この目的のために使用し得、このプライマーとしては、本明細書中で具体的に記載される種々のプライマーセットが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、野生型２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質と特異的に反応するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を、生検組織の免疫組織化学アッセイにおいて使用し得る。
（ＩＸ．２４Ｐ４Ｃ１２と相互作用する分子の同定）
本明細書中に開示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質および核酸配列は、当業者が、２４Ｐ４Ｃ１２と相互作用するタンパク質、低分子および他の薬剤、ならびに種々の分野で受け入れられたプロトコルのうちのいずれか１つを介して、２４Ｐ４Ｃ１２によって活性化される経路を同定することを可能にする。例えば、いわゆる相互作用トラップ系（「２ハイブリッドアッセイ」とも呼ばれる）のうちの１つを利用し得る。このような系において、分子は、レポーター遺伝子の発現を指向する転写因子と相互作用し、そして再構成し、一方でこのレポーター遺伝子の発現をアッセイする。他の系は、真核生物転写活性化因子の再構築を介して、インビボでタンパク質−タンパク質相互作用を同定する（例えば、１９９９年９月２１日に発行された米国特許第５，９５５，２８０号、１９９９年７月２０日に発行された同第５，９２５，５２３号、１９９８年１２月８日に発行された同第５，８４６，７２２号、および１９９９年１２月２１日に発行された同第６，００４，７４６号を参照のこと）。アルゴリズムもまた、タンパク質機能のゲノムベースの予測のために当該分野で利用可能である（例えば、Ｍａｒｃｏｔｔｅら，Ｎａｔｕｒｅ ４０２：１９９９年１１月４日，８３−８６を参照のこと）。
あるいは、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質配列と相互作用する分子を同定するために、ペプチドライブラリをスクリーニングし得る。このような方法において、２４Ｐ４Ｃ１２に結合するペプチドは、アミノ酸のランダムな収集物または制御された収集物をコードするライブラリーをスクリーニングすることによって同定される。このライブラリーによってコードされたペプチドは、バクテリオファージコートタンパク質の融合タンパク質として発現され、次いで、このバクテリオファージ粒子は、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質に対してスクリーニングされる。
従って、広範な種々の用途（例えば、治療剤、予後剤または診断剤）を有するペプチドは、予想されるリガンド分子またはレセプター分子の構造に関する以前の情報なしで同定される。２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質配列と相互作用する分子を同定するために使用され得る、代表的なペプチドライブラリおよびスクリーニング方法は、例えば、１９９８年３月３日に発行された米国特許第５，７２３，２８６号、および１９９８年３月３１日に発行された同第５，７３３，７３１号で開示される。
あるいは、２４Ｐ４Ｃ１２を発現する細胞株は、２４Ｐ４Ｃ１２によって媒介されるタンパク質−タンパク質相互作用を同定するために使用される。このような相互作用は、免疫沈降技術（例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｂ．Ｊ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ，１９９９，２６１：６４６−５１を参照のこと）を使用して試験され得る。２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質は、抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体を使用する２４Ｐ４Ｃ１２発現細胞株から免疫沈降され得る。あるいは、Ｈｉｓ−ｔａｇに対する抗体は、２４Ｐ４Ｃ１２およびＨｉｓ−ｔａｇ（上記のベクター）の融合物を発現するように操作された細胞株中で使用され得る。この免疫沈降複合体は、ウェスタンブロット、タンパク質の３５Ｓ−メチオニン標識、タンパク質のマイクロシークエンシング、銀染色および２次元ゲル電気泳動のような手順に沿ってタンパク質に関して試験され得る。
２４Ｐ４Ｃ１２と相互作用する低分子およびリガンドは、このようなスクリーニングアッセイの関連する実施形態を介して同定され得る。例えば、低分子（リン酸化および脱リン酸化を媒介し得る２４Ｐ４Ｃ１２の能力に干渉する分子を含む）により、タンパク質機能との干渉が、細胞サイクル、第２メッセンジャーシグナル伝達、または腫瘍形成の調節の指標としてのＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子との相互作用として同定され得る。同様に、２４Ｐ４Ｃ１２関連イオンチャネル、タンパク質ポンプ、または細胞連絡機能を調節する低分子を、２４Ｐ４Ｃ１２を発現する癌を有する患者を処置するために、同定および使用する（例えば、Ｈｉｌｌｅ，Ｂ．，Ｉｏｎｉｃ Ｃｈａｎｎｅｌｓ ｏｆ Ｅｘｃｉｔａｂｌｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ 第２版，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ，１９９２を参照のこと）。さらに、２４Ｐ４Ｃ１２機能を調節するリガンドは、２４Ｐ４Ｃ１２に結合し、そしてレポーター構築物を活性化するためのそれらの能力に基づいて同定され得る。代表的な方法は、例えば、１９９９年７月２７日に発行された米国特許第５，９２８，８６８号において議論されており、そして少なくとも１つのリガンドが低分子である、ハイブリッドリガンドを形成するための方法を含む。例示の実施形態において、２４Ｐ４Ｃ１２の融合タンパク質およびＤＮＡ結合タンパク質を発現するために操作された細胞を使用して、ハイブリッドリガンド／低分子の融合タンパク質およびｃＤＮＡライブラリー転写活性化タンパク質を共発現する。この細胞は、レポーター遺伝子（この発現は、第１融合タンパク質および第２融合タンパク質の互いに隣接して調整される）をさらに含み、この事象は、ハイブリッドリガンドが、両方のハイブリッドタンパク質の標的部位に結合する場合のみ生じる。レポーター遺伝子を発現するこれらの細胞を選択し、そして未知の低分子または未知のリガンドを同定する。この方法は、２４Ｐ４Ｃ１２を活性化または阻害する、調節因子を同定する手段を提供する。
本発明の実施形態は、図２または図３に示される２４Ｐ４Ｃ１２アミノ酸配列と相互作用する分子についてスクリーニングする方法を含み、この方法は、一群の分子と２４Ｐ４Ｃ１２アミノ酸配列とを接触させる工程、上記一群の分子と上記２４Ｐ４Ｃ１２アミノ酸配列とを、相互作用を容易にする条件下で相互作用させる工程、２４Ｐ４Ｃ１２アミノ酸配列と相互作用する分子の存在を決定する工程、次いで、２４Ｐ４Ｃ１２アミノ酸配列と相互作用しない分子を、２４Ｐ４Ｃ１２アミノ酸配列と相互作用する分子から分離する工程を包含する。特定の実施形態において、この方法は、２４Ｐ４Ｃ１２アミノ酸配列と相互作用する分子を精製する工程、特徴付けする工程および同定する工程をさらに包含する。この同定された分子は、２４Ｐ４Ｃ１２によって実施される機能を調節するために使用され得る。好ましい実施形態において、２４Ｐ４Ｃ１２アミノ酸配列は、ペプチドライブラリと接触される。
（Ｘ．治療法および組成物）
限定されたセットの組織において正常に発現されるが、前立腺癌および他の癌においても発現されるタンパク質のような２４Ｐ４Ｃ１２の同定により、多数の治療アプローチをこのような癌の処置に広げる。本明細書において企図されるように、２４Ｐ４Ｃ１２は、腫瘍促進遺伝子を活性化すること、または腫瘍形成をブロックする遺伝子を抑制することに関連する転写因子として機能する。
従って、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の活性を阻害する治療アプローチは、２４Ｐ４Ｃ１２を発現する癌に罹患した患者に有用である。このような治療アプローチは、一般に、２つのクラスに入る。一つのクラスは、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質とその結合パートナーまたは他のタンパク質との結合または会合を阻害するための種々の方法を含む。別のクラスは、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子の転写または２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡの翻訳を阻害するための種々の方法を含む。
（Ｘ．Ａ．抗癌ワクチン）
本発明は、２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質または２４Ｐ４Ｃ１２関連核酸を含む、癌ワクチンを提供する。２４Ｐ４Ｃ１２の発現に関して、癌ワクチンは、非標的組織に対して最小の効果を有するかまたは効果を有さずに、２４Ｐ４Ｃ１２発現癌を予防および／または処置する。抗癌治療として、体液性免疫応答および／または細胞媒介免疫応答を生じるワクチンにおける腫瘍抗原の使用は、当該分野で周知であり、ヒトＰＳＭＡおよびげっ歯ＰＡＰ免疫原を使用して前立腺癌において利用されている（Ｈｏｄｇｅら，１９９５，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６３：２３１−２３７；Ｆｏｎｇら，１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３１１３−３１１７）。
このような方法は、２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質、または２４Ｐ４Ｃ１２コード核酸分子および２４Ｐ４Ｃ１２免疫原（これは、代表的に、多数の抗体またはＴ細胞エピトープを含む）を発現および提示し得る組換えベクターを利用することによって容易に実施され得る。当業者は、免疫反応性エピトープの送達のための広範な種々のワクチン系が当該分野で公知であることを理解する（例えば、Ｈｅｒｙｌｎら，Ａｎｎ Ｍｅｄ １９９９ Ｆｅｂ ３１（１）：６６−７８；Ｍａｒｕｙａｍａら，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ２０００ Ｊｕｎ ４９（３）：１２３−３２を参照のこと）。簡潔には、哺乳動物において、免疫応答（例えば、体液性免疫応答および／または細胞媒介免疫応答）を生じるこのような方法は、以下の工程を包含する：免疫反応性エピトープ（例えば、エピトープは、図３に示される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質、またはそのアナログもしくはホモログ中に存在する）に哺乳動物の免疫系を曝露し、その結果、この哺乳動物に、エピトープに対して特異的な免疫応答を生じさせる（例えば、このエピトープを特異的に認識する抗体を生じさせる）工程。好ましい方法において、２４Ｐ４Ｃ１２免疫原は、生物学的モチーフを含む（例えば、表ＶＩＩＩ〜表ＸＸＩおよび表ＸＸＩＩ〜表ＸＬＩＸ、または図５、図６、図７、図８、および図９に示される２４Ｐ４Ｃ１２由来の一定サイズ範囲のペプチドを参照のこと）。
２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質全体、免疫原性領域またはそれらのエピトープを、種々の手段によって合わせ、そして送達し得る。このようなワクチン組成物としては、例えば、以下が挙げられ得る：リポペプチド（例えば、Ｖｉｔｉｅｌｌｏ，Ａ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：３４１，１９９５）、ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド）（「ＰＬＧ」）ミクロスフェア中にカプセル化されたペプチド組成物（例えば、Ｅｌｄｒｉｄｇｅら，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２８７−２９４，１９９１：Ａｌｏｎｓｏら，Ｖａｃｃｉｎｅ １２：２９９−３０６，１９９４；Ｊｏｎｅｓら，Ｖａｃｃｉｎｅ １３：６７５−６８１，１９９５を参照のこと）、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）に含まれたペプチド組成物（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｎａｔｕｒｅ ３４４：８７３−８７５，１９９０；Ｈｕら，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１３：２３５−２４３，１９９８を参照のこと）、多抗原ペプチド系（ＭＡＰ）（例えば、Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：５４０９−５４１３，１９８８；Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９６：１７−３２，１９９６を参照のこと）、多価ペプチドとして処方されたペプチド、弾道送達系において使用するためのペプチド（代表的に、結晶化したペプチド）、ウイルス送達ベクター（Ｐｅｒｋｕｓ，Ｍ．Ｅ．ら，Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｓ．Ｈ．Ｅ．編，第３７９頁，１９９６；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，Ｓ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ３２０：５３５，１９８６；Ｈｕ，Ｓ．Ｌ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ３２０：５３７，１９８６；Ｋｉｎｅｙ，Ｍ．−Ｐ．ら，ＡＩＤＳ Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：７９０，１９８６；Ｔｏｐ，Ｆ．Ｈ．ら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１２４：１４８，１９７１；Ｃｈａｎｄａ，Ｐ．Ｋ．ら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７５：５３５，１９９０）、ウイルス起源または合成起源の粒子（例えば、Ｋｏｆｌｅｒ，Ｎ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９２：２５，１９９６；Ｅｌｄｒｉｇｅ，Ｊ．Ｈ．ら，Ｓｅｍ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３０：１６，１９９３；Ｆａｌｏ，Ｌ．Ｄ．，Ｊｒ．ら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．７：６４９，１９９５）、アジュバント（Ｗａｒｒｅｎ，Ｈ．Ｓ．，Ｖｏｇｅｌ，Ｆ．Ｒ．およびＣｈｅｄｉｄ，Ｌ．Ａ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：３６９，１９８６；Ｇｕｐｔａ，Ｒ．Ｋ．ら，Ｖａｃｃｉｎｅ １１：２９３，１９９３）、リポソーム（Ｒｅｄｄｙ，Ｒ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５８５，１９９２；Ｒｏｃｋ，Ｋ．Ｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １７：１３１，１９９６）または裸のｃＤＮＡもしくは粒子吸収ｃＤＮＡ（Ｕｌｍｅｒ，Ｊ．Ｂ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５，１９９３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｈ．Ｌ．，Ｈｕｎｔ，Ｌ．Ａ．およびＷｅｂｓｔｅｒ，Ｒ．Ｇ．，Ｖａｃｃｉｎｅ １１：９５７，１９９３；Ｓｈｉｖｅｒ，Ｊ．Ｗ．ら，Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｓ．Ｈ．Ｅ．編，第４２３頁，１９９６；Ｃｅａｓｅ，Ｋ．Ｂ．およびＢｅｒｚｏｆｓｋｙ，Ｊ．Ａ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：９２３，１９９４およびＥｌｄｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｈ．ら，Ｓｅｍ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３０：１６，１９９３）。毒素標的送達技術（レセプター媒介標的化（例えば、Ａｖａｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｅｄｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）としても公知））もまた、使用され得る。
２４Ｐ４Ｃ１２に関連する癌を有する患者において、本発明のワクチン組成物はまた、癌のために使用される他の処置（例えば、外科手術、化学療法、薬物治療、放射線治療など）と合わせて使用され得る（ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦなどのような免疫アジュバントと組み合わせた使用を含む）。
（細胞ワクチン）
ＣＴＬエピトープは、対応するＨＬＡ対立遺伝子に結合する２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質内のペプチドを同定するための特定のアルゴリズムを使用して決定され得る：（例えば表ＩＶ；ＥｐｉｍｅｒＴＭおよびＥｐｉｍａｔｒｉｘＴＭ，Ｂｒｏｗｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＵＲＬ ｂｒｏｗｎ．ｅｄｕ／Ｒｅｓｅａｒｃｈ／ＴＢ−ＨＩＶ＿Ｌａｂ／ｅｐｉｍａｔｒｉｘ／ｅｐｉｍａｔｒｉｘ．ｈｔｍｌ）；およびＢＩＭＡＳ（ＵＲＬ ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／；ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ ａｔ ＵＲＬ ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｂｍｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｃｏｍ／）を参照のこと）。好ましい実施形態において、２４Ｐ４Ｃ１２免疫原は、当該分野で周知の技術を使用して同定された１種以上のアミノ酸配列を含み、これらは、表ＶＩＩＩ〜表ＸＸＩおよび表ＸＸＩＩ〜表ＸＬＩＸに示される配列、またはＨＬＡクラスＩモチーフ／スーパーモチーフ（例えば、表ＩＶ（Ａ）、表ＩＶ（Ｄ）、または表ＩＶ（Ｅ））によって特定された８個、９個、１０個もしくは１１個のアミノ酸のペプチド、および／またはＨＬＡクラスＩＩモチーフ／スーパーモチーフ（例えば、表ＩＶ（Ｂ）、または表ＩＶ（Ｃ））を含む、少なくとも９個のアミノ酸のペプチドである。当該分野で理解されているように、ＨＬＡクラスＩ結合溝は、本質的に、閉鎖的に終結され、その結果、特定のサイズ範囲のみのペプチドが、溝に適合し、かつ、結合され得、一般に、ＨＬＡクラスＩエピトープは、８個、９個、１０個、または１１個のアミノ酸長である。対照的に、ＨＬＡクラスＩＩ結合溝は、本質的に、開放的に終結され、それによって、約９個以上のアミノ酸のペプチドは、ＨＬＡクラスＩＩ分子によって結合され得る。ＨＬＡクラスＩとＨＬＡクラスＩＩとの間の結合溝の差異に起因して、ＨＬＡクラスＩモチーフは、長さ特異的である。すなわち、クラスＩモチーフの２位は、このペプチドのアミノ方向からカルボキシル方向の第２アミノ酸である。クラスＩＩモチーフのアミノ酸位置は、互いに対してのみ相関し、全体のペプチドに対して相関していない。すなわち、さらなるアミノ酸は、モチーフ保有配列のアミノ末端および／またはカルボキシル末端に付着され得る。ＨＬＡクラスＩＩエピトープは、しばしば、９アミノ酸長、１０アミノ酸長、１１アミノ酸長、１２アミノ酸長、１３アミノ酸長、１４アミノ酸長、１５アミノ酸長、１６アミノ酸長、１７アミノ酸長、１８アミノ酸長、１９アミノ酸長、２０アミノ酸長、２１アミノ酸長、２２アミノ酸長、２３アミノ酸長、２４アミノ酸長、または２５アミノ酸長、または２５アミノ酸長よりも長い。
（抗体ベースのワクチン）
哺乳動物において免疫応答を発生するための広範な種々の方法は、（例えば、ハイブリドーマの発生における第１工程として）当該分野で公知である。哺乳動物における免疫応答を発生させる方法は、タンパク質（例えば、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質）上の免疫原性エピトープに哺乳動物の免疫系を曝露し、その結果、免疫応答を発生させる工程を包含する。代表的な実施形態は、十分な量の少なくとも１つの２４Ｐ４Ｃ１２Ｂ細胞もしくは細胞傷害性Ｔ細胞エピトープまたはそれらのアナログを宿主と接触させ；そして少なくとも１回の周期的な間隔の後、２４Ｐ４Ｃ１２Ｂ細胞もしくは細胞傷害性Ｔ細胞エピトープまたはそれらのアナログを宿主と再び接触させることによって、宿主において、２４Ｐ４Ｃ１２に対する免疫応答を発生させるための方法からなる。特定の実施形態は、２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質または人工多エピトープペプチドに対して免疫応答を発生する方法からなり、この方法は、２４Ｐ４Ｃ１２免疫原（例えば、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質またはそのペプチドフラグメント、２４Ｐ４Ｃ１２融合タンパク質またはアナログなど）を、ヒトまたは別の哺乳動物に対してワクチン調製物として投与する工程を包含する。代表的に、このようなワクチン調製物は、適切なアジュバント（例えば、米国特許第６，１４６，６３５号を参照のこと）またはＰＡＤＲＥＴＭペプチドのような汎用ヘルパーエピトープ（Ｅｐｉｍｍｕｎｅ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；例えば、Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００ １６４（３）；１６４（３）：１６２５−１６３３；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １９９４ １（９）：７５１−７６１およびＡｌｅｘａｎｄｅｒら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．１９９８ １８（２）：７９−９２を参照のこと）をさらに含む。代替方法は、２４Ｐ４Ｃ１２免疫原をコードするＤＮＡ配列、ＤＮＡ配列の発現を制御する調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子を、個々の身体の筋肉または皮膚にインビボで投与することによって、２４Ｐ４Ｃ１２免疫原に対して個々の免疫応答を発生させる工程を包含し；ここで、このＤＮＡ分子は、細胞によって取り込まれ、ＤＮＡ配列は、この細胞において発現され、そして免疫応答を、免疫原に対して発生する（例えば、米国特許第５，９６２，４２８号を参照のこと）。必要に応じて、遺伝子ワクチン促進因子（ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）（例えば、アニオン性脂質；サポニン；レクチン；エストロゲン化合物；ヒドロキシル化低級アルキル；ジメチルスルホキシド；および尿素）がまた、投与される。さらに、標的抗原に対して応答を発生させるために、２４Ｐ４Ｃ１２を模倣する抗イディオタイプの抗体が、投与され得る。
（核酸ワクチン）
本発明のワクチン組成物は、核酸媒介様式を含む。本発明のタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡは、患者に投与され得る。遺伝子免疫方法は、２４Ｐ４Ｃ１２を発現する癌細胞に対する、予防的または治療的な体液性免疫応答および細胞性免疫応答を発生させるために利用され得る。２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質／免疫原をコードするＤＮＡを含む構成物および適切な調節配列は、個体の筋肉または皮膚に直接注射され得、その結果、筋肉または皮膚の細胞は、この構成物を取り込み、そしてコードされた２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質／免疫原を発現する。あるいは、ワクチンは、２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質を含む。２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質免疫原の発現は、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質を保有する細胞に対する、予防的または治療的な体液性免疫および細胞性免疫の発生を生じる。当該分野で公知の、種々の予防的および治療的な遺伝子免疫技術は、使用され得る（総説については、インターネットアドレスｇｅｎｗｅｂ．ｃｏｍで公開されている情報および参考文献を参照のこと）。核酸ベース送達は、例えば、Ｗｏｌｆｆら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５（１９９０）および米国特許第５，５８０，８５９号；同第５，５８９，４６６号；同第５，８０４，５６６号；同第５，７３９，１１８号；同第５，７３６，５２４号；同第５，６７９，６４７号；ＷＯ ９８／０４７２０に記載されている。ＤＮＡベースの送達技術の例としては、「裸のＤＮＡ」、促進された（ブピバカイン（ｂｕｐｉｖｉｃａｉｎｅ）、ポリマー、ペプチド媒介）送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介送達（「遺伝子銃」）または圧力媒介送達（例えば、米国特許第５，９２２，６８７号を参照のこと）を含む。
治療的または予防的な免疫の目的のために、本発明のタンパク質は、ウイルスベクターまたは細菌ベクターを介して発現され得る。本発明の実施において使用され得る種々のウイルス遺伝子送達系としては、ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス、カナリア痘ウイルス、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、およびシンドビスウイルス（例えば、Ｒｅｓｔｉｆｏ、１９９６、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６５８−６６３；Ｔｓａｎｇら，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８７：９８２−９９０（１９９５）を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。非ウイルス送達系もまた、抗腫瘍応答を誘導するために患者に、２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質をコードする裸のＤＮＡを（例えば筋内または皮内で）患者に導入することにより利用され得る。
ワクチンウイルスは、例えば、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するためのベクターとして使用される。宿主への導入の際に、組換えワクチンウイルスは、タンパク質免疫原性ペプチドを発現し、そしてこれによって、宿主免疫応答を惹起する。免疫プロトコルにおいて有用なワクチンベクターおよび方法は、例えば、米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターは、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ）である。ＢＣＧベクターは、Ｓｔｏｖｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ ３５１：４５６−４６０（１９９１）に記載されている。本発明のペプチドの治療的投与または免疫のための有用な、広範な種々の他のベクター（例えば、アデノウイルスベクターおよびアデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉベクター、無毒化炭疽毒素ベクターなど）は、本明細書の記載から当業者に明らかである。
従って、遺伝子送達系は、２４Ｐ４Ｃ１２関連核酸分子を送達するために使用される。一つの実施形態において、全長ヒト２４Ｐ４Ｃ１２ ｃＤＮＡを使用する。別の実施形態において、特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）および／または抗体エピトープをコードする２４Ｐ４Ｃ１２核酸分子を使用する。
（エキソビボワクチン）
種々のエキソビボストラテジーを利用して、免疫応答もまた発生させ得る。一つのアプローチは、患者の免疫系に対して２４Ｐ４Ｃ１２抗原を提示する樹状細胞（ＤＣ）のような抗原提示細胞（ＡＰＣ）の使用に関する。樹状細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子およびＭＨＣクラスＩＩ分子、Ｂ７補助刺激因子、ならびにＩＬ−１２を発現し、従って、高度に特異的な抗原提示細胞である。前立腺癌において、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）のペプチドによりパルスされる自己樹状細胞が、前立腺癌患者の免疫系を刺激するために、フェーズＩ臨床試験において使用される（Ｔｊｏａら，１９９６，Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２８：６５−６９；Ｍｕｒｐｈｙら，１９９６，Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２９：３７１−３８０）。従って、樹状細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子の内容物中で、２４Ｐ４Ｃ１２ペプチドをＴ細胞に提示するために使用され得る。一つの実施形態において、自己樹状細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子および／またはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し得る２４Ｐ４Ｃ１２ペプチドでパルスされる。別の実施形態において、樹状細胞は、完全２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質でパルスされる。なお別の実施形態は、当該分野で公知の種々の実行ベクターを使用する樹状細胞中で、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子の過剰発現を操作することに関する（例えば、アデノウイルス（Ａｒｔｈｕｒら，１９９７，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：１７−２５）、レトロウイルス（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら，１９９６，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３７６３−３７７０）、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＤＮＡトランスフェクション（Ｒｉｂａｓら，１９９７，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：２８６５−２８６９）、または腫瘍誘導ＲＮＡトランスフェクション（Ａｓｈｌｅｙら，１９９７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１１７７−１１８２））。２４Ｐ４Ｃ１２を発現する細胞はまた、免疫調節因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）を発現するように操作され得、そして免疫剤として使用され得る。
（Ｘ．Ｂ．抗体ベースの治療のための標的としての２４Ｐ４Ｃ１２）
２４Ｐ４Ｃ１２は、抗体ベースの治療ストラテジーのための魅力的な標的である。多数の抗体ストラテジーは、細胞外分子と細胞内分子との両方を標的するために、当該分野で公知である（例えば、相補体およびＡＤＣＣ媒介の死滅および身体内での使用を参照のこと）。２４Ｐ４Ｃ１２は、対応する正常な細胞に対する種々の系統の癌細胞によって発現されるので、免疫活性組成物を非標的器官および組織に結合することによって生じる、毒性効果、非特異的効果および／または非標的効果なしで、優れた感受性を示す、２４Ｐ４Ｃ１２免疫活性組成物の全身投与を調製する。２４Ｐ４Ｃ１２のドメインと特異的に反応する抗体は、トキシンまたは治療剤と組み合わせてか、または細胞増殖または機能を阻害し得る裸の抗体としてのいずれかで、全身的に２４Ｐ４Ｃ１２を発生する癌を処置するために有用である。
２４Ｐ４Ｃ１２抗体は、抗体が２４Ｐ４Ｃ１２に結合し、そして機能（例えば、結合パートナーとの相互作用）を調節し、そして結果として腫瘍細胞の破壊を媒介し、そして／または腫瘍細胞の増殖を阻害するように、患者に導入され得る。このような抗体が治療効果を発揮する機構としては、補体媒介性細胞溶解、抗体依存性細胞性細胞傷害、２４Ｐ４Ｃ１２の生理学的機能を調節すること、リガンド結合またはシグナル伝達経路を阻害すること、腫瘍細胞分化を調節すること、腫瘍脈管形成因子プロフィールを変化させること、および／またはアポトーシスを包含し得る。
当業者は、抗体が、免疫原性分子（例えば、図２または図３に示される２４Ｐ４Ｃ１２配列の免疫原性領域）を特異的に標的および結合するために使用され得ることを理解する。さらに、当業者は、抗体を細胞傷害性薬剤に結合体化することは慣用的であることを理解する（例えば、Ｓｌｅｖｅｒｓら，Ｂｌｏｏｄ ９３：１１ ３６７８−３６８４（１９９９年６月１日）を参照のこと）。細胞傷害性薬剤および／または治療剤が、例えば、この細胞（例えば、２４Ｐ４Ｃ１２）によって発現される分子に対して特異的な抗体にそれらの薬剤を結合体化させることによって、細胞に直接送達される場合、この細胞傷害性薬剤は、それらの細胞上において公知の生物学的効果（例えば、細胞傷害性）を発揮する。
抗体−細胞傷害性薬剤結合体を使用して細胞を死滅させるための広範な種々の組成物および方法が、当該分野で公知である。癌の状況において、代表的な方法は、腫瘍を有する哺乳動物に、生物学的に有効な量の結合体を投与する工程を包含し、この結合体は、発現されたか、結合に接触可能か、または細胞表面上に局在化された、マーカー（例えば、２４Ｐ４Ｃ１２）に結合する標的試薬（例えば、抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体）に連結される、選択された細胞傷害性薬剤および／または治療剤を含む。代表的な実施形態は、細胞傷害性薬剤および／または治療剤を、２４Ｐ４Ｃ１２を発現する細胞に送達する方法であり、この方法は、２４Ｐ４Ｃ１２エピトープに免疫特異的に結合する抗体に細胞傷害性薬剤を結合体化させる工程、および抗体薬剤結合体に細胞を曝露する工程を包含する。別の例示的な実施形態は、転移癌を患ったと疑われる個体を処置する方法であり、この方法は、細胞傷害性薬剤および／または治療剤に結合体化された、治療有効量の抗体を含む薬学的組成物を個体に非経口的に投与する工程を包含する。
抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体を使用する癌免疫治療は、他の型の癌の処置に首尾良く使用される種々のアプローチに従ってなされ、この癌としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：結腸癌（Ａｒｌｅｎら、１９９８、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：１３３〜１３８）、多発性骨髄腫（Ｏｚａｋｉら、１９９７、Ｂｌｏｏｄ ９０：３１７９〜３１８６；Ｔｓｕｎｅｎａｒｉら、１９９７、Ｂｌｏｏｄ ９０：２４３７〜２４４４）、胃癌（Ｋａｓｐｒｚｙｋら、１９９２、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：２７７１〜２７７６）、Ｂ細胞リンパ腫（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉら、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ｅｍｐｈａｓｉｓ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：９３〜１０１）、白血病（Ｚｈｏｎｇら、１９９６、Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．２０：５８１〜５８９）、結腸直腸癌（Ｍｏｕｎら、１９９４、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：６１６０〜６１６６；Ｖｅｌｄｅｒｓら、１９９５、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：４３９８〜４４０３）、および乳癌（Ｓｈｅｐａｒｄら、１９９１、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：１１７〜１２７）。いくつかの治療アプローチは、毒素または放射性同位体への裸の抗体の結合（例えば、抗ＣＤ２０抗体へのＹ９１またはＩ１３１の結合（例えば、ＺｅｖａｌｉｎＴＭ、ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ．、またはＢｅｘｘａｒＴＭ、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ））を含むが、一方他のアプローチは、抗体と他の治療薬剤との（例えば、ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭ（トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）とパクリタキセル（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）との）共投与を含む。この抗体は、治療薬剤に結合体化され得る。前立腺癌の処置のために、例えば、２４Ｐ４Ｃ１２抗体が、照射、化学療法またはホルモン切除と組み合わせて、投与され得る。また、抗体は、カリミアミチン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）（例えば、ＭｙｌｏｔａｒｇＴＭ、Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＮＪ、抗腫瘍抗体カリキアミチンに結合体化された組換えヒト化ＩｇＧ４カッパー抗体）、またはメイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）（例えば、タキサンベースの腫瘍活性化プロドラッグ、ＴＡＰ、プラットフォーム、免疫原、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、また、例えば、米国特許第５，４１６，０６４号を参照のこと）のような毒素に結合体化され得る。
２４Ｐ４Ｃ１２抗体治療は、癌の全てのステージに対して有用であるが、進行癌または転移癌において特に適切であり得る。本発明の抗体治療を用いた処置は、１つ以上の一連の化学療法を受けている患者に示される。あるいは、本発明の抗体療法は、化学療法処置を受けていない患者のために、化学療法レジメンまたは照射レジメンと組み合わせられる。さらに、抗体療法は、減少した投薬量の共化学療法の使用を、特に、その化学療法薬剤の毒性をあまり許容しない患者にとって、可能にし得る。Ｆａｎら（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：４６３７−４６４２、１９９３）、Ｐｒｅｗｅｔｔら（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊ．ｏｆ Ｏｎｃｏ．９：２１７−２２４、１９９６）、およびＨａｎｃｏｃｋら（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：４５７５−４５８０、１９９１）は、化学療法薬剤と共の種々の抗体の使用を記載する。
２４Ｐ４Ｃ１２抗体治療は、癌の全てのステージに対して有用であるが、進行癌または転移癌において特に適切であり得る。本発明の抗体治療を用いた処置は、１つ以上の一連の化学療法を受けている患者に示される。あるいは、本発明の抗体療法は、化学療法処置を受けていない患者のために、化学療法レジメンまたは照射レジメンと組み合わせられる。さらに、抗体療法は、減少した投薬量の共化学療法の使用を、特に、その化学療法薬剤の毒性をあまり許容しない患者にとって、可能にし得る。
癌患者は、好ましくは、腫瘍組織の免疫組織化学的評価、定量的２４Ｐ４Ｃ１２画像化、または２４Ｐ４Ｃ１２発現の存在および程度を確かに示し得る他の技術を使用して、２４Ｐ４Ｃ１２発現の存在およびレベルについて評価され得る。腫瘍生検または外科的標本の免疫組織化学分析が、この目的に好ましい。腫瘍組織の免疫組織化学的分析のための方法は、当該分野で周知である。
前立腺癌および他の癌を処置する抗２４Ｐ４Ｃ１２モノクローナル抗体としては、その腫瘍に対する強力な免疫応答を開始し得る抗体、または直接細胞傷害性であり得る抗体が挙げられる。これに関して、抗２４Ｐ４Ｃ１２モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、補体媒介性細胞傷害または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）のいずれかの機構によって、腫瘍細胞溶解を惹起し得、これらの機構の両方が、補体タンパク質上のエフェクター細胞Ｆｃレセプター部位との相互作用のために、その免疫グロブリン分子のインタクトなＦｃ部分を必要とする。さらに、腫瘍増殖に対して直接の生物学的効果を発揮する抗２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＡｂが、２４Ｐ４Ｃ１２を発現する癌を処置するのに有用である。直接的に細胞傷害性ｍＡｂが作用する機構としては、細胞増殖の阻害、細胞分化の調節、腫瘍脈管形成因子プロフィールの調節、およびアポトーシスの誘導が、挙げられる。特定の抗２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＡｂが抗腫瘍効果を発揮する機構は、当該分野で一般的に知られているように、ＡＤＣＣ、ＡＤＭＭＣ、補体媒介性細胞溶解などの細胞死を評価する、任意の数のインビトロアッセイを使用して、評価される。
何人かの患者において、マウスまたは他の非ヒトのモノクローナル抗体の使用、あるいはヒト／マウスキメラｍＡｂの使用が、非ヒト抗体に対する中程度から強力な免疫応答を誘導し得る。これは、循環からの抗体のクリアランスおよび減少した効力をもたらし得る。最も深刻な場合において、このような免疫応答は、潜在的に腎不全を引き起こし得る、免疫複合体の広範な形成をもたらし得る。従って、本発明の治療法の方法において使用される好ましいモノクローナル抗体は、高い親和性で標的２４Ｐ４Ｃ１２抗原に特異的に結合するが、患者において低い抗原性を示すかまたは全く抗原性を示さない、完全にヒトであるかまたはヒト化されているかのいずれかである抗体である。
本発明の治療法は、単一の抗２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＡｂの投与、ならびに異なるｍＡｂの組み合わせまたはカクテルの投与を意図する。このようなｍＡｂカクテルは、それらが、異なるエピトープを標的とするｍＡｂ含むか、異なるエフェクター機構を使用するか、または免疫エフェクター機能性に依存するｍＡｂと直接細胞傷害性ｍＡｂを組み合わせるので、特定の利点を有し得る。組み合わせたこのようなｍＡｂは、相乗的治療効果を示し得る。さらに、抗２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＡｂは、種々の化学療法薬剤、アンドロゲン遮断薬、免疫調節因子（例えば、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ）、手術または放射線を含むがこれらに限定されない、他の治療薬剤と同時に投与され得る。抗２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＡｂは、その「裸」の形態または非結合形態で投与され得るか、またはそれらに結合した治療薬剤を有し得る。
抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体処方物は、腫瘍細胞に抗体を送達し得る任意の経路を介して投与される。投与の経路としては、静脈内経路、腹腔内経路、筋肉内経路、腫瘍内経路、皮内経路などが挙げられるが、これらに限定されない。処置は一般的に、代表的に、体重１ｋｇあたり約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、または２５ｍｇの範囲の用量で、受容可能な投与経路（例えば、静脈内注射（ＩＶ））を介する、抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体調製物の繰り返し投与を含む。一般に、１週間に１０〜１０００ｍｇ ｍＡｂの範囲の用量が、効果的であり得かつ十分に許容され得る。
転移性乳癌の処置においてＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭ ｍＡｂを用いる臨床実験に基づいて、抗２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＡｂ調製物の約４ｍｇ／ｋｇ患者体重（ＩＶ）の初回負荷用量に引き続いて、約２ｍｇ／ｋｇ（ＩＶ）の毎週の用量が、受容可能な投薬レジメンを示す。好ましくは、この初回負荷用量が、９０分以上の注入として投与される。その初回用量が十分に許容された場合、周期的維持用量が、３０分以上の注入として投与される。当業者が理解するように、種々の因子が、特定の場合における理想的な用量レジメンに影響し得る。このような因子としては、例えば、使用されるＡｂまたはｍＡｂの結合親和性および半減期、患者における２４Ｐ４Ｃ１２発現の程度、循環する放出された（ｓｈｅｄ）２４Ｐ４Ｃ１２抗原の程度、所望される安定状態の抗体濃度レベル、処置の頻度、および本発明の処置方法と組み合わせて使用される化学療法薬剤または他の因子の影響ならびに特定の患者の健康状態が、挙げられる。
必要に応じて、患者は、最も有効な投与レジメンなどの決定を補助するために、所定のサンプル中の２４Ｐ４Ｃ１２のレベル（例えば、循環する２４Ｐ４Ｃ１２抗原および／または２４Ｐ４Ｃ１２発現細胞のレベル）について評価されるべきである。このような評価はまた、治療全体を通じてのモニタリングの目的で使用され、そして他のパラメーター（例えば、膀胱癌治療における尿細胞学および／またはＩｍｍｕｎｏＣｙｔレベル、あるいは、類推されるところによれば、前立腺癌治療における血清ＰＳＡレベル）を評価することと組合せて治療的成功を評価するために有用である。
抗イディオタイプ抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体はまた、抗癌療法において、２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質を発現する細胞に対する免疫応答を惹起するためのワクチンとして使用され得る。詳細には、抗イディオタイプ抗体の生成は、当該分野で周知であり；この方法論は、２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質上のエピトープを模倣する抗イディオタイプ抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体を生成するように容易に適合され得る（例えば、Ｗａｇｎｅｒら、１９９７、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １６：３３〜４０；Ｆｏｏｎら、１９９５、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９６：３３４〜３４２；Ｈｅｒｌｙｎら、１９９６、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４３：６５〜７６を参照のこと）。このような抗イディオタイプ抗体は、癌ワクチンストラテジーにおいて使用され得る。
（Ｘ．Ｃ．細胞免疫応答についての標的としての２４Ｐ４Ｃ１２）
本明細書に記載される、免疫原的に有効量の１つ以上のＨＬＡ結合ペプチドを含むワクチンおよびこのワクチンを調製する方法は、本発明のさらなる実施形態である。さらに、本発明に従うワクチンは、１つ以上の特許請求されるペプチドの組成物を含む。ペプチドは、ワクチンにおいて個々に存在し得る。あるいは、ペプチドは、同じペプチドの複数コピーを含むホモポリマーとして、または種々のペプチドのヘテロポリマーとして存在し得る。ポリマーは、増加した免疫学的反応の利点を有し、そして異なるペプチドエピトープがポリマーを構成するために使用される場合、免疫応答を標的化する病原性生物または腫瘍関連ペプチドの異なる抗原決定基と反応する抗体および／またはＣＴＬを誘導するというさらなる能力を有する。この組成物は、抗原の天然に存在する領域であり得るか、または例えば、組換えもしくは化学合成によって調製され得る。
本発明のワクチンとともに使用され得るキャリアは、当業者に周知であり、そして例えば、サイログロブリン、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）、破傷風トキソイド、ポリアミノ酸（例えば、ポリＬ−リジン、ポリＬ−グルタミン酸）、インフルエンザ、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質などが挙げられる。ワクチンは、生理学的に許容可能（すなわち、受容可能）な希釈剤（例えば、水、または生理食塩水、好ましくは、リン酸緩化衝生理食塩水）を含み得る。ワクチンはまた、代表的に、アジュバントを含む。不完全フロイントアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、またはミョウバンのようなアジュバントは、当該分野で周知の材料の例である。さらに、本明細書中で開示されるように、ＣＴＬ応答は、本発明のペプチドを脂質（例えば、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニルセリル−セリン（Ｐ３ＣＳＳ））に結合体化することによって、初回刺激され得る。さらに、アジュバント（例えば、合成シトシン−ホスホロチオール化グアニン含有（ＣｐＧ）オリゴヌクレオチド）は、ＣＴＬ応答を１０〜１００倍増加することが見出された（例えば、ＤａｖｉｌａおよびＣｅｌｉｓ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：５３９〜５４７（２０００）を参照のこと）。
注射、エアロゾル、経口、経皮、経粘膜、胸内、髄腔内、または他の適切な経路による、本発明に従うペプチド組成物での免疫に際して、宿主の免疫系は、所望の抗原に特異的な、大量のＣＴＬおよび／またはＨＴＬを産生することによってワクチンに応答する。結果として、宿主は、２４Ｐ４Ｃ１２抗原を発現するかまたは過剰発現する細胞の後期発生に少なくとも部分的に免疫されるか、あるいは抗原が腫瘍関連であった場合、少なくともいくつかの治療的利益を導く。
いくつかの実施形態において、クラスＩペプチド成分を、標的抗原に対する中和抗体および／またはヘルパーＴ細胞応答を誘導するかまたは促進する成分と組み合わせることが望ましくあり得る。このような組成物の好ましい実施形態は、本発明に従うクラスＩエピトープおよびクラスＩＩエピトープを含む。このような組成物の代替の実施形態は、交叉反応性ＨＴＬエピトープ（例えば、ＰＡＤＲＥＴＭ（Ｅｐｉｍｍｕｎｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）分子（例えば、米国特許第５，７３６，１４２号に記載される））とともに、本発明に従うクラスＩエピトープおよび／またはクラスＩＩエピトープを含む。
本発明のワクチンはまた、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞（ＤＣ））を、本発明のペプチドを提示するためのビヒクルとして含み得る。樹状細胞を動員（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）し、そして収集し、これによって、樹状細胞の負荷をインビトロで生じさせた後に、ワクチン組成物が、インビトロで作製され得る。例えば、樹状細胞は、例えば、本発明に従うミニ遺伝子でトランスフェクトされるか、またはペプチドでパルスされる。次いで、樹状細胞は、インビボで免疫応答を惹起するために患者に投与され得る。ワクチン組成物（ＤＮＡベースまたはペプチドベースのいずれか）はまた、樹状細胞動員とともにインビボで投与され得、これによって、樹状細胞の負荷がインビボで生じる。
好ましくは、以下の原理が、ワクチンにおける使用のためのポリエピトープ組成物中での封入のために、あるいはワクチンに含まれるべき、そして／または核酸（例えば、ミニ遺伝子）によってコードされるべき別々のエピトープを選択するために、エピトープのアレイを選択する場合に利用される。以下の原理のそれぞれが選択を行うためにバランスをとられることが好ましい。所定のワクチン組成物に組み込まれるマルチエピトープは、エピトープが由来するネイティブ抗原において連続した配列であり得るが、そうである必要はない。
１．）投与のとき、腫瘍クリアランスと相関して観測された免疫応答を模倣するエピトープが選択される。ＨＬＡクラスＩについて、これは、少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に由来する３〜４エピトープを含む。ＨＬＡクラスＩＩについて、類似の原理が使用される；再び、３〜４エピトープは、少なくとも１つのＴＡＡから選択される（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：１４４７〜１４５０を参照のこと）。１つのＴＡＡからのエピトープは、１つ以上のさらなるＴＡＡからのエピトープと組み合わせて使用され、頻繁に発現されるＴＡＡの種々の発現パターンを有する腫瘍を標的化するワクチンを産生し得る。
２．）免疫原性と関連することが確証された必須の結合親和性を有するエピトープが選択される：ＨＬＡクラスＩについて、５００ｎＭ以下（しばしば、２００ｎＭ以下）のＩＣ５０；およびクラスＩＩについて、１０００ｎＭ以下のＩＣ５０。
３．）十分なスーパーモチーフ保有ペプチド、または対立遺伝子特異的モチーフ保有ペプチドの十分なアレイが、広い集団範囲を与えるように選択される。例えば、少なくとも８０％の集団範囲を有することが好ましい。モンテカルロ分析（当該分野で公知の統計的評価）を使用して、集団範囲の幅または重複性を評価し得る。
４．）癌関連抗原由来のエピトープが選択される場合、アナログを選択することがしばしば有用である。なぜなら、患者は、ネイティブのエピトープに対して耐性を発達させている場合があるからである。
５．）「ネスト化エピトープ（ｎｅｓｔｅｄ ｅｐｉｔｏｐｅ）」と呼ばれるエピトープが、特に関連する。ネスト化エピトープは、少なくとも２つのエピトープが所定のペプチド配列で重なる場合に生じる。ネスト化ペプチド配列は、Ｂ細胞エピトープ、ＨＬＡクラスＩエピトープおよび／またはＨＬＡクラスＩＩエピトープを含み得る。ネスト化エピトープを提供する場合、一般的な目的は、配列当たり最も多くの数のエピトープを提供することである。従って、１つの局面は、ペプチド中のアミノ末端エピトープのアミノ末端およびカルボキシル末端エピトープのカルボキシル末端よりもいくらかでも長いペプチドを提供することを避けることである。マルチエピトープ配列（例えば、ネスト化エピトープを含む配列）を提供する場合、病理学的なまたは他の有害な生物学的特性を有さないことを保証するために、配列をスクリーニングすることが一般的に重要である。
６．）ポリエピトープタンパク質を作製する場合、またはミニ遺伝子を作製する場合、目的は、目的のエピトープを含む最小のペプチドを作製することである。この原理は、ネスト化エピトープを含むペプチドを選択する場合に使用される原理と同じでない場合、類似する。しかし、人工ポリエピトープペプチドを用いる場合、サイズ最小化の目的は、ポリエピトープタンパク質中のエピトープ間に任意のスペーサー配列を組み込む必要性に対してバランスがとられる。例えば、スペーサーアミノ酸残基は、接合エピトープ（ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｐｉｔｏｐｅ）（免疫系によって認識され、標的抗原に存在せず、かつエピトープの人工並置によってのみ作製されるエピトープ）を避けるためにか、またはエピトープ間の切断を容易にし、それによって、エピトープ提示を増強するために導入され得る。接合エピトープは、一般的に、避けられるべきである。なぜなら、レシピエントは、その非ネイティブなエピトープに対する免疫応答を生成し得るからである。「優性エピトープ」である接合エピトープに対し、特に関心が高い。優性エピトープは、他のエピトープに対する免疫応答が減少されるかまたは抑制されるような強い（ｚｅａｌｏｕｓ）応答を導き得る。
７．）同じ標的タンパク質の複数の改変体の配列が存在する場合、潜在的なペプチドエピトープはまた、それらの保存性に基づいて選択され得る。例えば、保存性についての基準は、ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドの配列全体またはクラスＩＩ結合ペプチドの９マーのコア全体が、特定のタンパク質抗原について評価される配列の指定された割合で保存されることを規定し得る。
（Ｘ．Ｃ．１．ミニ遺伝子ワクチン）
複数のエピトープの共送達を可能にする多くの異なるアプローチが利用可能である。本発明のペプチドをコードする核酸は、本発明の特に有用な実施形態である。ミニ遺伝子中への封入のためのエピトープは、好ましくは、前の章に記載されるガイドラインに従って選択される。本発明のペプチドをコードする核酸を投与する好ましい手段は、本発明の１つのエピトープまたはマルチエピトープを含むペプチドをコードするミニ遺伝子構築物を使用する。
マルチエピトープミニ遺伝子の使用は、以下およびＩｓｈｉｏｋａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：３９１５〜３９２５、１９９９；Ａｎ，Ｌ．およびＷｈｉｔｔｏｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：２２９２，１９９７；Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｓ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：８２２，１９９６；Ｗｈｉｔｔｏｎ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：３４８，１９９３；Ｈａｎｋｅ，Ｒ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ １６：４２６，１９９８に記載される。例えば、２４Ｐ４Ｃ１２由来のスーパーモチーフ保有エピトープおよび／またはモチーフ保有エピトープをコードするマルチエピトープＤＮＡプラスミド、ＰＡＤＲＥ（登録商標）ユニバーサルヘルパーＴ細胞エピトープまたは２４Ｐ４Ｃ１２由来の複数のＨＴＬエピトープ（例えば、表ＶＩＩＩ〜ＸＸＩおよびＸＸＩＩ〜ＸＬＩＸを参照のこと）、および小胞体トランスロケーションシグナル配列が操作され得る。ワクチンはまた、他のＴＡＡ由来のエピトープを含み得る。
マルチエピトープミニ遺伝子の免疫原性は、試験されるエピトープに対するＣＴＬ誘導応答の大きさを評価するためにトランスジェニックマウスで確認され得る。さらに、インビボのＤＮＡコードエピトープの免疫原性は、ＤＮＡプラスミドでトランスフェクトされた標的細胞に対する特定のＣＴＬ株のインビトロ応答と相関し得る。従って、これらの実験は、ミニ遺伝子が、１）ＣＴＬ応答を生成すること、および２）誘導されたＣＴＬが、コードされたエピトープを発現する細胞を認識することの両方に役立つことを示し得る。
例えば、ヒト細胞における発現のために選択されたエピトープ（ミニ遺伝子）をコードするＤＮＡ配列を作製するために、エピトープのアミノ酸配列は、逆翻訳され得る。ヒトコドン使用頻度表は、各アミノ酸に対するコドン選択の指針のために使用され得る。これらのエピトープコードＤＮＡ配列は、直接隣接し得、その結果、翻訳された場合に、連続したポリペプチド配列が作製される。発現および／または免疫原性を最適化するために、さらなるエレメントが、ミニ遺伝子設計に組み込まれ得る。ミニ遺伝子配列に逆翻訳され得、そして含まれ得るアミノ酸配列の例としては、以下が挙げられる：ＨＬＡクラスＩエピトープ、ＨＬＡクラスＩＩエピトープ、抗体エピトープ、ユビキチン化シグナル配列、および／または小胞体標的化シグナル。さらに、ＣＴＬおよびＨＴＬエピトープのＨＬＡ提示は、ＣＴＬまたはＨＴＬエピトープに隣接する、合成（例えば、ポリ−アラニン）または天然に存在する隣接配列を含むことによって改善され得る；エピトープを含むこれらのより大きなペプチドは、本発明の範囲内である。
ミニ遺伝子配列は、ミニ遺伝子のプラス鎖およびマイナス鎖をコードするオリゴヌクレオチドを組み立てることによってＤＮＡに変換され得る。重複オリゴヌクレオチド（３０〜１００塩基長）は、周知技術を使用して、適切な条件下で、合成され得、リン酸化され得、精製され得、そしてアニールされ得る。オリゴヌクレオチドの末端は、例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して結合され得る。次いで、この合成ミニ遺伝子（エピトープポリペプチドをコードする）は、所望の発現ベクターにクローン化され得る。
当業者に周知の標準的な調節配列は、好ましくは、標的細胞における発現を確実にするためにベクターに含まれる。いくつかのベクターエレメントが、望ましい：ミニ遺伝子挿入のための下流クローニング部位を有するプロモーター；効率的な転写終結のためのポリアデニル化シグナル；Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点；およびＥ．ｃｏｌｉ選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性またはカナマイシン耐性）。多くのプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーター）がこの目的のために使用され得る。他の適切なプロモーター配列について、例えば、米国特許第５，５８０，８５９号および同第５，５８９，４６６号を参照のこと。
さらなるベクター改変は、ミニ遺伝子発現および免疫原性を最適化するために所望され得る。いくつかの場合において、イントロンは、効率的な遺伝子発現に必要とされ、そして１つ以上の合成イントロンまたは天然に存在するイントロンが、ミニ遺伝子の転写領域に組み込まれ得る。ｍＲＮＡ安定化配列および哺乳動物細胞における複製のための配列を含むこともまた、ミニ遺伝子発現を増加するために考慮され得る。
一旦、発現ベクターが選択されると、ミニ遺伝子は、プロモーターの下流のポリリンカー領域にクローン化される。このプラスミドは、適切なＥ．ｃｏｌｉ株に形質転換され、そしてＤＮＡは、標準的な技術を使用して調製される。ミニ遺伝子の方向およびＤＮＡ配列、ならびにベクターに含まれる全ての他のエレメントは、制限マッピングおよびＤＮＡ配列分析を使用して確認される。正しいプラスミドを有する細菌細胞は、マスター細胞バンクおよび作業細胞バンクとして保存され得る。
さらに、免疫刺激配列（ＩＳＳまたはＣｐＧ）は、ＤＮＡワクチンの免疫原性において役割を果たすようである。これらの配列は、免疫原性を増強することが望ましい場合に、ミニ遺伝子コード配列の外側で、ベクターに含まれ得る。
いくつかの実施形態において、ミニ遺伝子コードエピトープおよび第２タンパク質（免疫原性を増強または減少するために含まれる）の両方の産生を可能にするビシストロニック（ｂｉ−ｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）発現ベクターが使用され得る。共発現される場合に免疫応答を有利に増強し得るタンパク質またはポリペプチドの例としては、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ）、サイトカイン誘導分子（例えば、ＬｅＩＦ）、共刺激分子、または、ＨＴＬ応答について、ｐａｎ−ＤＲ結合タンパク質（ＰＡＤＲＥＴＭ、Ｅｐｉｍｍｕｎｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）が挙げられる。ヘルパー（ＨＴＬ）エピトープは、細胞内標的化シグナルに結合され得、そして発現されるＣＴＬエピトープから別々に発現され得る；これは、ＣＴＬエピトープとは異なる細胞区画へのＨＴＬエピトープの方向付けを可能にする。必要とされる場合、これは、ＨＴＬエピトープのＨＬＡクラスＩＩ経路へのより効率的な進入を促進し得、それによって、ＨＴＬ誘導を改善する。ＨＴＬ誘導またはＣＴＬ誘導と対照的に、免疫抑制分子分子（例えば、ＴＧＦ−β）の共発現によって免疫応答を特異的に減少させることは、特定の疾患において有益であり得る。
治療的な量のプラスミドＤＮＡは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発酵、続く精製によって生成され得る。運用中の細胞バンクからのアリコートを使用して、増殖培地に播種し、そして周知技術に従ってシェーカーフラスコまたはバイオリアクターで飽和まで増殖される。プラスミドＤＮＡは、ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって供給される固相アニオン交換樹脂のような標準的な生物分離技術を使用して精製され得る。必要な場合、スーパーコイルＤＮＡは、ゲル電気泳動または他の方法を使用して、開環状形態および線形形態から単離され得る。
精製プラスミドＤＮＡは、種々の処方物を使用して注射のために調製され得る。これらのうち最も簡単なものは、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中での凍結乾燥されたＤＮＡの再構成である。このアプローチ（「裸（ｎａｋｅｄ）のＤＮＡ」として公知である）は、臨床試験における筋肉内（ＩＭ）投与のために現在使用される。ミニ遺伝子ＤＮＡワクチンの免疫治療効果を最大化するために、精製プラスミドＤＮＡを処方するための代替方法が、望ましくあり得る。種々の方法が記載されており、そして新規な技術が利用可能となり得る。カチオン性脂質、糖脂質、および膜融合（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）リポソームもまた、処方物中で使用され得る（例えば、ＷＯ９３／２４６４０；Ｍａｎｎｉｎｏ ＆ Ｇｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６（７）：６８２（１９８８）；米国特許第５，２７９，８３３号；ＷＯ９１／０６３０９；およびＦｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：７４１３（１９８７）による記載を参照のこと）。さらに、保護性の相互作用性非凝縮化合物（ＰＩＮＣ）として総称されるペプチドおよび化合物もまた、安定性、筋肉内分散性、あるいは特定の器官または細胞型への輸送のような変数に影響するように、精製プラスミドＤＮＡに複合化され得る。
標的細胞感作は、ミニ遺伝子コードＣＴＬエピトープの発現およびＨＬＡクラスＩ提示についての機能性アッセイとして使用され得る。例えば、プラスミドＤＮＡは、標準的なＣＴＬクロム放出アッセイのための標的として適切な哺乳動物細胞株に導入される。使用されるトランスフェクション方法は、最終処方物に依存する。エレクトロポレーションは、「裸」のＤＮＡのために使用され得るが、カチオン性脂質は、直接的なインビトロトランスフェクションを可能とする。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するプラスミドは、蛍光細胞活性化細胞分別（ＦＡＣＳ）を使用して、トランスフェクトされた細胞の濃縮を可能にするために共トランスフェクトされ得る。次いで、これらの細胞は、クロム−５１（５１Ｃｒ）標識され、そしてエピトープ特異的ＣＴＬ株に対する標的細胞として使用され；細胞溶解（５１Ｃｒ放出によって検出される）は、ミニ遺伝子コード化ＣＴＬエピトープの産生およびＨＬＡ提示の両方を示す。ＨＴＬエピトープの発現は、ＨＴＬ活性を評価するためのアッセイを使用して、類似の様式で評価され得る。
インビボ免疫原性は、ミニ遺伝子ＤＮＡ処方物の機能試験についての第２のアプローチである。適切なヒトＨＬＡタンパク質を発現するトランスジェニックマウスを、ＤＮＡ産物を用いて免疫する。用量および投与経路は、処方物に依存する（例えば、ＰＢＳ中のＤＮＡについてＩＭ、脂質複合化ＤＮＡについて腹腔内（ｉ．ｐ．））。免疫の２１日後、脾細胞を収集し、そして試験される各エピトープをコードするペプチドの存在下で１週間、再刺激する。その後、ＣＴＬエフェクター細胞について、標準的技術を使用して、ペプチド負荷５１Ｃｒ標識標的細胞の細胞溶解についてのアッセイを行う。ミニ遺伝子コードエピトープに対応するペプチドエピトープを負荷されたＨＬＡによって感作された標的細胞の溶解は、ＣＴＬのインビボ導入についてのＤＮＡワクチン機能を実証する。ＨＴＬエピトープの免疫原性は、類似の方法で、トランスジェニックマウスにおいて確認される。
あるいは、核酸は、例えば、米国特許第５，２０４，２５３号に記載されるように、弾道的（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）送達を使用して投与され得る。この技術を使用して、ＤＮＡのみから構成される粒子が投与される。さらなる代替の実施形態において、ＤＮＡは、粒子（例えば、金粒子）に接着され得る。
ミニ遺伝子はまた、当該分野で周知の他の細菌送達系またはウイルス送達系を使用して送達され得る（例えば、本発明のエピトープをコードする発現構築物が、ワクシニアのようなウイルスベクターに組み込まれ得る）。
（Ｘ．Ｃ．２．）ＣＴＬペプチドとヘルパーペプチドとの組合せ）
本発明のＣＴＬペプチドを含むワクチン組成物は、所望の性状（例えば、改善された血清半減期、広げられた集団適用範囲、または増強された免疫原性）を提供するために改変（例えば、アナログ化）され得る。
例えば、ペプチドがＣＴＬ活性を誘導する能力は、ペプチドを、Ｔヘルパー細胞応答を誘導し得る少なくとも１つのエピトープを含む配列に連結することによって増強され得る。ＣＴＬペプチドは直接Ｔヘルパーペプチドに連結され得るが、しばしば、ＣＴＬエピトープ／ＨＴＬエピトープ結合体は、スペーサー分子によって連結される。スペーサーは、代表的に、比較的小さな中性の分子（例えば、アミノ酸またはアミノ酸模倣物）（これは、生理学的条件下において、実質的に荷電されていない）から構成される。スペーサーは、代表的に、例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、あるいは非極性アミノ酸または中性極性アミノ酸の他の中性スペーサーから選択される。任意に存在するスペーサーが同じ残基から構成される必要はなく、従って、ヘテロオリゴマーまたはホモオリゴマーであり得ることが理解される。存在する場合、スペーサーは、通常、少なくとも１つまたは２つの残基、より通常には、３〜６個の残基、ときどき、１０以上の残基である。ＣＴＬペプチドエピトープは、ＣＴＬペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかにおいて、直接的またはスペーサーを介してのいずれかで、Ｔヘルパーペプチドに連結され得る。免疫原性ペプチドまたはＴヘルパーペプチドのいずれかのアミノ末端は、アシル化され得る。
特定の実施形態において、Ｔヘルパーペプチドは、遺伝的に多様な集団の大部分に存在するＴヘルパー細胞によって認識されるペプチドである。これは、多くの、ほとんどの、または全てのＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するペプチドを選択することによって達成され得る。多くのＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するこのようなアミノ酸の例は、破傷風トキソイドの８３０〜８４３位ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥ（配列番号２９）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍサーカムスポロゾイト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）（ＣＳ）タンパク質の３７８〜３９８位ＤＩＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶＶＮＳ（配列番号３０）、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ １８ｋＤタンパク質の１１６〜１３１位ＧＡＶＤＳＩＬＧＧＶＡＴＹＧＡＡ（配列番号３１）のような抗原由来の配列を含む。他の例としては、ＤＲ １−４−７スーパーモチーフ、またはＤＲ３モチーフのいずれかを有するペプチドを含む。
あるいは、天然に見出されないアミノ酸配列を使用して、緩いＨＬＡ拘束様式（ｌｏｏｓｅｌｙ ＨＬＡ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｆａｓｈｉｏｎ）で、Ｔヘルパーリンパ球を刺激し得る合成ペプチドを調製することが可能である（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９５／０７７０７を参照のこと）。Ｐａｎ−ＤＲ結合エピトープ（例えば、ＰＡＤＲＥＴＭ、Ｅｐｉｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と呼ばれるこれらの合成化合物は、大部分のＨＬＡ−ＤＲ（ヒトＨＬＡクラスＩＩ）分子に最も好ましく結合するように設計される。例えば、式：ＡＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号３２）（ここで、「Ｘ」は、シクロヘキシルアラニン、フェニルアラニン、またはチロシンのいずれかであり、そしてａは、Ｄ−アラニンまたはＬ−アラニンのいずれかである）を有するｐａｎ−ＤＲ結合エピトープペプチドは、大部分のＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子に結合し、そしてそれらのＨＬＡ型に関わりなく、大部分の個体由来のＴヘルパーリンパ球の応答を刺激することが見出された。ｐａｎ−ＤＲ結合エピトープの代替物は、全て「Ｌ」天然アミノ酸を含み、そしてエピトープをコードする核酸の形態で提供され得る。
ＨＴＬペプチドエピトープはまた、それらの生物学的特性を変更するために改変され得る。例えば、これらは、プロテアーゼに対するそれらの耐性を増加し、従って、それらの血清半減期を拡大するためにＤ−アミノ酸を含むように改変され得るか、あるいはこれらは、それらの生物学的活性を増加させるために、脂質、タンパク質、炭水化物などのような他の分子に結合され得る。例えば、Ｔヘルパーペプチドは、アミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかにおいて、１つ以上のパルミチン酸鎖に結合体化され得る。
（Ｘ．Ｃ．３．）ＣＴＬペプチドとＴ細胞プライミング剤との組合せ）
いくつかの実施形態において、本発明の薬学的組成物中に、Ｂリンパ球またはＴリンパ球をプライミングする少なくとも１つの成分を含むことが望ましくあり得る。脂質は、ＣＴＬをインビボでプライミングし得る薬剤として同定されている。例えば、パルミチン酸残基は、リジン残基のε−アミノ基およびα−アミノ基に結合され得、次いで、例えば、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒなどのような１つ以上の連結残基を介して免疫原性ペプチドに連結され得る。次いで、脂質化ペプチドは、ミセルまたは粒子で直接的に投与され得るか、リポソームに組み込まれ得るか、またはアジュバント（例えば、不完全フロイントアジュバント）中で乳化され得るかのいずれかで投与され得る。好ましい実施形態において、特に有効な免疫原性組成物は、Ｌｙｓのε−アミノ基およびα−アミノ基に結合されたパルミチン酸（これは、免疫原性ペプチドのアミノ末端に連結（例えば、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）を介して結合される）を含む。
ＣＴＬ応答の脂質プライミングの別の例として、Ｅ．ｃｏｌｉリポタンパク質（例えば、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニルセリル−セリン（Ｐ３ＣＳＳ））は、適切なペプチドに共有結合される場合、ウイルス特異的ＣＴＬをプライミングするために使用され得る（例えば、Ｄｅｒｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：５６１，１９８９を参照のこと）。本発明のペプチドは、例えば、Ｐ３ＣＳＳに結合され得、そしてこのリポペプチドは、標的抗原に免疫応答を特異的にプライミングするために個体に投与され得る。さらに、中和抗体の導入がまたＰ３ＣＳＳ結合エピトープを用いてプライミングされ得るので、２つのこのような組成物は、体液性応答および細胞媒介応答の両方をより効率的に惹起するように組み合わせられ得る。
（Ｘ．Ｃ．４．）ＣＴＬペプチドおよび／またはＨＴＬペプチドでパルスされたＤＣを含むワクチン組成物）
本発明に従うワクチン組成物の実施形態は、患者血液由来のＰＢＭＣ、またはそれら由来の単離されたＤＣに対する、エピトープ保有ペプチドのカクテルのエキソビボ投与を含む。ＤＣの収集を容易にする薬物（例えば、ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｍｏｎｓａｎｔｏ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４）が使用され得る。ＤＣをペプチドでパルスした後、そして患者に再注入する前に、未結合ペプチドを除去するためにＤＣを洗浄する。この実施形態において、ワクチンは、それらの表面に、ＨＬＡ分子を複合体化した、パルスされたペプチドエピトープを提示するペプチドパルス化ＤＣを含む。
ＤＣは、ペプチドのカクテルを用いてエキソビボでパルスされ得、これらのうちのいくつかは、２４Ｐ４Ｃ１２に対するＣＴＬ応答を刺激する。必要に応じて、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ）ペプチド（例えば、天然または人工の緩い拘束性ＨＬＡクラスＩＩペプチド）は、ＣＴＬ応答を促進するために含まれ得る。従って、本発明に従うワクチンは、２４Ｐ４Ｃ１２を発現するかまたは過剰発現する癌を処置するために使用される。
（Ｘ．Ｄ．）養子免疫療法）
抗原性２４Ｐ４Ｃ１２関連ペプチドは、エキソビボでＣＴＬ応答および／またはＨＴＬ応答もまた惹起するために使用される。得られるＣＴＬ細胞またはＨＴＬ細胞は、他の従来の形式の治療に応答しないか、または本発明に従う治療ワクチンペプチドまたは核酸に応答しない患者の腫瘍を処置するために使用され得る。特定の抗原に対するエキソビボＣＴＬ応答またはＨＴＬ応答は、組織培養物中において、患者のまたは遺伝的に適合性のＣＴＬ前駆細胞またはＨＴＬ前駆細胞を、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞）の供給源および適切な免疫原性ペプチドとともにインキュベートすることによって誘導される。適切なインキュベーション時間（代表的には、約７〜２８日）（ここで、前駆細胞が、活性化され、そして効果細胞へと拡大する）後に、細胞は、患者に注入して戻され、ここで、これらは、特定の標的細胞（例えば、腫瘍細胞）を破壊する（ＣＴＬ）か、または破壊を促進する（ＨＴＬ）。トランスフェクトされた樹状細胞はまた、抗原提示細胞として使用され得る。
（Ｘ．Ｅ．）治療目的または予防目的のためのワクチンの投与）
本発明の薬学的組成物およびワクチン組成物は、代表的に、２４Ｐ４Ｃ１２を発現するかまたは過剰発現する癌を処置および／または予防するために使用される。治療適用において、ペプチド組成物および／または核酸組成物は、抗原に対して有効なＢ細胞応答、ＣＴＬ応答および／またはＨＴＬ応答を誘発し、そして症状および／または合併症を治癒するかあるいは少なくとも部分的に停止または遅延させるのに十分な量で患者に投与される。これを達成するのに適切な量は、「治療的有効用量」として規定される。この使用のための有効量は、例えば、投与される特定の組成物、投与方法、処置される疾患の病期および重篤度、患者の体重および全身状態、ならびに処方する医師の判断に依存する。
薬学的組成物について、本発明の免疫原性ペプチド、またはそれらをコードするＤＮＡは、一般的に、２４Ｐ４Ｃ１２を発現する腫瘍をすでに有する個体に投与される。ペプチドまたはそれらをコードするＤＮＡは、個々に、または１つ以上のペプチド配列の融合物として投与され得る。患者は、適切なように、別々にまたは他の処置（例えば、外科手術）とともに、免疫原性ペプチドを用いて処置され得る。
治療的使用のために、投与は、一般的に、２４Ｐ４Ｃ１２関連癌の第１の診断において開始すべきである。これは、少なくとも症状が実質的に停止するまで、そしてその後の一定期間の間、用量をブーストすることによって続けられる。患者に送達されるワクチン組成物の実施形態（すなわち、ペプチドカクテル、ポリエピトープポリペプチド、ミニ遺伝子、またはＴＡＡ特異的ＣＴＬまたはパルスされた樹状細胞のような実施形態を含むが、これらに限定されない）は、疾患の病期または患者の健康状態に従って、変化し得る。例えば、２４Ｐ４Ｃ１２を発現する腫瘍を有する患者において、２４Ｐ４Ｃ１２特異的ＣＴＬを含むワクチンは、代替の実施形態よりも進行した疾患を有する患者において腫瘍細胞を殺す際に、より有効であり得る。
細胞傷害性Ｔ細胞応答を効率的に刺激するのに十分な投与の様式によって送達されるペプチドエピトープの量を提供することが一般的に重要である；ヘルパーＴ細胞応答を刺激する組成物はまた、本発明のこの実施形態に従って、与えられ得る。
最初の治療的免疫化のための投薬量は、一般的に、下限値が約１μｇ、５μｇ、５０μｇ、５００μｇ、または１，０００μｇであり、かつ上限値が約１０，０００μｇ；２０，０００μｇ；３０，０００μｇ；または５０，０００μｇである単位用量範囲で存在する。ヒトのための投薬量値は、代表的に、７０ｋｇの患者当たり、約５００μｇ〜約５０，０００μｇの範囲である。数週間〜数ヶ月にわたるブーストレジメンに従って、約１．０μｇ〜約５０，０００μｇの間のブースト投薬量のペプチドが、患者の血液から得られたＣＴＬおよびＨＴＬの比活性を測定することによって決定されるような患者の応答および状態に依存して投与され得る。投与は、少なくとも臨床的症状または実験室の試験によって、新生物形成が、排除されるかまたは減少することを示すまで、そしてその後、一定期間続けられるべきである。投薬量、投与の経路、および用量スケジュールは、当該分野に公知の方法論に従って調整される。
特定の実施形態において、本発明のペプチドおよび組成物は、重篤な疾患状態（すなわち、生命を脅かすかまたは潜在的に生命を脅かす状態）で使用される。このような場合、本発明の好ましい組成物では、外来性物質が最小量でありそしてペプチドが比較的非毒性の性質であることの結果として、これらの記載された投薬量と比較してかなり過剰のこれらのペプチド組成物を投与することが可能であり、そして処置する医師によって望ましく感じられら得る。
本発明のワクチン組成物はまた、純粋に予防薬剤として使用され得る。一般的に、初回の予防免疫のための投薬量は一般に、低い値が約１、５、５０、５００または１０００μｇでありかつ高い値が約１０，０００；２０，０００；３０，０００；または５０，０００μｇである単位投薬量範囲で存在する。ヒトのための投薬量の値は、代表的に、７０ｋｇの患者あたりで約５００μｇ〜約５０，０００μｇの範囲である。これに続いて、初回のワクチン投与から約４週間後〜６ヵ月後の規定された間隔で、約１．０μｇ〜約５０，０００μｇの間のペプチドのブースト投薬量が投与される。ワクチンの免疫原性は、患者の血液サンプルから得られるＣＴＬおよびＨＴＬの比活性を測定することによって評価され得る。
治療的処置のための薬学的組成物は、非経口投与、局所的（ｔｏｐｉｃａｌ）投与、経口投与、経鼻投与、クモ膜下腔内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）投与、または局部的（ｌｏｃａｌ）投与（例えば、クリームまたは局所的軟膏として）のために意図される。好ましくは、この薬学的組成物は、非経口的（例えば、静脈内、皮下的、皮内、または筋内）に投与される。従って、本発明は、受容可能なキャリア（好ましくは、水性キャリア）中に溶解または懸濁された免疫原性ペプチドの溶液を含む、非経口投与のための組成物を提供する。
種々の水性キャリア（例えば、水、緩衝化水、０．８％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸など）が使用され得る。これらの組成物は、従来からの周知の滅菌技術によって滅菌され得るか、または濾過滅菌され得る。得られた水溶液は、使用のためにその状態のままでパッケージされ得るか、または凍結乾燥され得る（この凍結乾燥された調製物は、投与前に滅菌溶液と合わせられる）。
この組成物は、必要に応じて、生理的条件に近づけるために、薬学的に受容可能な補助物質（例えば、ｐＨ調整剤および緩衝化剤、張度調整剤、湿潤剤、防腐薬など（例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンなど））を含み得る。
薬学的処方物における本発明のペプチドの濃度は、広範に（すなわち、約０．１重量％未満から、通常は、約２重量％であるかもしくは少なくとも約２重量％から、２０重量％〜５０重量％ほど多くまで、またはそれより多くまで）変動し得、そして選択された特定の投与様式に従って、主に流体容量、粘度などにより選択される。
組成物のヒト単位用量形態は、代表的に、ヒト単位用量の受容可能なキャリア（１つの実施形態では、水性キャリア）を含む薬学的組成物中に含まれ、そしてヒトへのこのような組成物の投与のために使用されることが当業者に公知（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１７版，編者Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，１９８５を参照のこと）の容量／量で投与される。例えば、初回免疫のためのペプチド用量は、７０ｋｇの患者について、約１〜約５０，０００μｇ、一般的には、１００〜５，０００μｇであり得る。例えば、核酸については、初回免疫は、裸の核酸の形態で発現ベクターを使用して実施され得、複数の部位に０．５〜５ｍｇの量でＩＭ（またはＳＣもしくはＩＤ）投与され得る。核酸（０．１〜１０００μｇ）もまた、遺伝子銃を使用して投与され得る。３〜４週間のインキュベーション期間後に、次いで、ブースター用量が投与される。ブースターは、５×１０７〜５×１０９ｐｆｕの用量で投与される組換え鶏痘ウイルスであり得る。
抗体について、処置は一般に、静脈内注射（ＩＶ）のような受容可能な投与経路を介して、代表的には約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量で、抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体調製物を反復投与することを包含する。一般的には、１週間あたり１０〜５００ｍｇ ｍＡｂの範囲の用量が有効であり、かつ十分に許容される。さらに、抗２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＡｂ調製物を、ＩＶで約４ｍｇ／ｋｇ患者体重の初回負荷用量で与え、次いで毎週、ＩＶで約２ｍｇ／ｋｇの用量を与えることは、受容可能な投薬レジメンを表す。当業者に理解されるように、種々の要因が、特定の場合における理想的な用量に影響を及ぼし得る。このような要因としては、例えば、組成物の半減期、Ａｂの結合親和性、物質の免疫原性、患者における２４Ｐ４Ｃ１２の発現程度、循環しているシェッド（ｓｈｅｄ）２４Ｐ４Ｃ１２抗原の程度、所望される定常状態の濃度レベル、処置の頻度、および本発明の処置方法と組み合わせて使用される化学療法剤または他の薬剤の影響、ならびに特定の患者の健康状態が挙げられる。限定ではない好まれるヒト単位の用量は、例えば、５００μｌ〜１ｍｇ、１ｍｇ〜５０ｍｇ、５０ｍｇ〜１００ｍｇ、１００ｍｇ〜２００ｍｇ、２００ｍｇ〜３００ｍｇ、４００ｍｇ〜５００ｍｇ、５００ｍｇ〜６００ｍｇ、６００ｍｇ〜７００ｍｇ、７００ｍｇ〜８００ｍｇ、８００ｍｇ〜９００ｍｇ、９００ｍｇ〜１ｇ、または１ｍｇ〜７００ｍｇである。特定の実施形態においては、用量は、以下の範囲である：２〜５ｍｇ／ｋｇ体重（例えば、毎週１〜３ｍｇ／ｋｇの用量）；０．５ｍｇ、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍｇ／ｋｇ体重（例えば、毎週の用量で２、３または４週間）；０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ体重（例えば、毎週の用量で２、３または４週間）；毎週の２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００ｍｇ ｍ２体表面積；毎週の１〜６００ｍｇ ｍ２体表面積；毎週の２２５〜４００ｍｇ ｍ２体表面積；これらは、２、３、４、５、６、７、８、９、１９、１１、１２またはそれ以上の週の間、毎週の用量によって従われ得る。
１つの実施形態では、ポリヌクレオチドのヒト単位投薬形態は、任意の治療的効果を与える適切な投薬量範囲または有効量を含む。当業者に理解されるように、治療的効果は、ポリヌクレオチドの配列、ポリヌクレオチドの分子量、および投与経路を含む多数の要因に依存する。投薬量は一般的に、症状の重篤度、患者の病歴などのような、当該分野で公知の種々のパラメーターに従って、医師または他の医療専門家により選択される。一般的には、約２０塩基のポリヌクレオチドについて、投薬量範囲は、例えば、約０．１、０．２５、０．５、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００または５００ｍｇ／ｋｇのような独立して選択される下限から、その下限よりも大きな約６０、８０、１００、２００、３００、４００、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００または１０，０００ｍｇ／ｋｇの独立して選択される上限までの中から選択され得る。例えば、用量は、以下のほぼいずれかであり得る：０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ、０．１〜２５ｍｇ／ｋｇ、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、１〜５００ｍｇ／ｋｇ、１００〜４００ｍｇ／ｋｇ、２００〜３００ｍｇ／ｋｇ、１〜１００ｍｇ／ｋｇ、１００〜２００ｍｇ／ｋｇ、３００〜４００ｍｇ／ｋｇ、４００〜５００ｍｇ／ｋｇ、５００〜１０００ｍｇ／ｋｇ、５００〜５０００ｍｇ／ｋｇ、または５００〜１０，０００ｍｇ／ｋｇ。一般的に、非経口的な投与経路は、疾患組織に対するより直接的なポリヌクレオチドの適用（より長いポリヌクレオチドで行う場合）と比較して、より多い用量のポリヌクレオチドを必要とし得る。
１つの実施形態では、Ｔ細胞のヒト単位投薬形態は、任意の治療的効果を与える適切な投薬量範囲または有効量を含む。当業者に理解されるように、治療的効果は、多数の要因に依存する。投薬量は一般的に、症状の重篤度、患者の病歴などのような、当該分野で公知の種々のパラメーターに従って、医師または他の医療専門家により選択される。用量は、約１０４細胞〜約１０６細胞、約１０６細胞〜約１０８細胞、約１０８細胞〜約１０１１細胞、または約１０８細胞〜約５×１０１０細胞であり得る。用量はまた、約１０６細胞／ｍ２〜約１０１０細胞／ｍ２、または約１０６細胞／ｍ２〜約１０８細胞／ｍ２であり得る。
本発明のタンパク質（１つまたは複数）および／またはそのタンパク質（１つまたは複数）をコードする核酸はまた、リポソームを介して投与され得、それらはまた以下のために役立ち得る：１）リンパ系組織のような特定組織へのタンパク質（１つまたは複数）の標的化；２）疾患細胞に対する選択的な標的化；または、３）ペプチド組成物の半減期の増加。リポソームとしては、エマルジョン、泡沫体（ｆｏａｍ）、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散体、層状層などが挙げられる。これらの調製物において、送達されるペプチドは、単独でかあるいはリンパ系細胞に蔓延しているレセプターに結合する分子（例えば、ＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体）と組み合わせてかまたは他の治療用組成物もしくは免疫原性組成物と組み合わせて、リポソームの部分として組み込まれる。従って、本発明の所望のペプチドを充填しているかまたは施されているかのいずれかであるリポソームは、リンパ系細胞の部位に指向され得、次いで、このリンパ系細胞に、リポソームはペプチド組成物を送達する。本発明に従って使用するためのリポソームは、標準的な小胞形成脂質から形成され、これは一般的に、中性リン脂質および負に荷電したリン脂質、ならびにステロール（例えば、コレステロール）を含む。脂質の選択は一般的に、例えば、リポソームのサイズ、酸不安定性、および血流中でのリポソームの安定性の考慮により導かれる。リポソームを調製するためには、例えば、Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０）ならびに米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号、および同第５，０１９，３６９号に記載されているように、種々の方法が利用可能である。
免疫系の細胞を標的化するために、リポソームに取り込まれるべきリガンドとしては、例えば、所望される免疫系細胞の細胞表面決定基に特異的な抗体またはそのフラグメントが挙げられ得る。ペプチドを含むリポソーム懸濁物は、とりわけ、投与様式、送達されるペプチド、および処置される疾患の病期に従って変動する用量において、静脈内投与、局部的（ｌｏｃａｌｌｙ）投与、局所的（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）投与などによって投与され得る。
固形組成物については、従来の非毒性の固形キャリアが使用され得、これには、例えば、製薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。経口投与のために、薬学的に受容可能な非毒性の組成物は、任意の通常使用される賦形剤（例えば、先に列挙されたキャリアなど）と、一般的に１０〜９５％の活性成分（すなわち、本発明の１つ以上のペプチド）そしてより好ましくは、２５％〜７５％の濃度の活性成分とを組み込むことによって形成される。
エアロゾル投与のために、免疫原性ペプチドは好ましくは、界面活性剤および噴霧剤と共に細かく分割された形態で供給される。ペプチドの代表的なパーセンテージは、約０．０１重量％〜２０重量％、好ましくは、約１％〜１０％である。当然ながら、界面活性剤は非毒性でなければならず、そして好ましくは、噴霧剤に可溶性でなければならない。このような薬剤の代表例は、脂肪族多価アルコールまたはその環状無水物を有する、約６〜２２個の炭素原子を含む脂肪酸（例えば、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリック酸（ｏｌｅｓｔｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、およびオレイン酸）のエステルおよび部分エステルである。混合エステル（例えば、混合グリセリドまたは天然のグリセリド）が使用され得る。界面活性剤は、その組成物の約０．１重量％〜２０重量％、好ましくは、約０．２５〜５％を構成し得る。組成物の残りは通常、噴霧剤である。キャリアもまた、例えば、鼻腔内送達のためのレシチンの場合のように、所望の場合に含まれ得る。
（ＸＩ．）２４Ｐ４Ｃ１２の診断的実施形態および予後的実施形態）
本明細書中で開示されるように、２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチド、２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチド、２４Ｐ４Ｃ１２反応性の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、２４Ｐ４Ｃ１２反応性のヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ）および抗ポリペプチド抗体は、癌のような調節不全性の細胞増殖と関連した状態、特に、表Ｉに列挙された癌（例えば、その組織発現の特異的パターン、ならびに、例えば、「正常組織、および患者検体における２４Ｐ４Ｃ１２の発現分析」と表題を付けられた実施例における例に記載されているような特定の癌におけるその過剰発現の両方を参照のこと）を試験する周知の診断的アッセイ、予後的アッセイ、および治療的アッセイにおいて使用される。
２４Ｐ４Ｃ１２は、前立腺関連抗原であるＰＳＡに類似し得る。ＰＳＡは、前立腺癌の存在を同定およびモニターするために数年間にわたり医療従事者により使用されてきた原型マーカーである（例えば、Ｍｅｒｒｉｌｌら，Ｊ．Ｕｒｏｌ．１６３（２）：５０３−５１２０（２０００）；Ｐｏｌａｓｃｉｋら，Ｊ．Ｕｒｏｌ．Ａｕｇ；１６２（２）：２９３−３０６（１９９９）およびＦｏｒｔｉｅｒら，Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９１（１９）：１６３５−１６４０（１９９９）を参照のこと）。種々の他の診断マーカーもまた、同様の状況下で使用され、これらにはｐ５３およびＫ−ｒａｓが挙げられる（例えば、Ｔｕｌｃｈｉｎｓｋｙら，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ １９９９ Ｊｕｌ ４（１）：９９−１０２およびＭｉｎｉｍｏｔｏら，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔ Ｐｒｅｖ ２０００；２４（１）：１−１２を参照のこと）。従って、２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドおよび２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチド（ならびに、これらの分子の存在を同定するために使用される２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドプローブおよび抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体）ならびにそれらの特性に関する本開示により、当業者は、使用された方法と類似した方法において（例えば、癌に関連した状態を試験することに関する種々の診断アッセイにおいて）これらの分子を利用することが可能となる。
２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチド、２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチド、２４Ｐ４Ｃ１２と反応性のＴ細胞および抗体を利用する診断方法の代表的な実施形態は、例えば、ＰＳＡポリヌクレオチド、ＰＳＡポリペプチドならびにＰＳＡと反応性のＴ細胞および抗体を使用する十分に確立された診断アッセイ由来の方法と類似する。例えば、ＰＳＡの過剰発現または前立腺癌の転移をモニターする方法において、ＰＳＡ ｍＲＮＡの存在および／またはレベルを観察するために、ＰＳＡポリヌクレオチドを、プローブ（例えば、ノーザン分析において（例えば、Ｓｈａｒｉｅｆら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．３３（３）：５６７〜７４（１９９４）を参照のこと））およびプライマー（例えば、ＰＣＲ分析において（例えば、Ｏｋｅｇａｗａら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１６３（４）：１１８９〜１１９０（２０００）を参照のこと））として使用するのとまさしく同じように、本明細書中に記載される２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドは、２４Ｐ４Ｃ１２の過剰発現またはこの遺伝子を発現する前立腺癌および他の癌の転移を検出するために、同じ様式で利用され得る。あるいは、ＰＳＡポリペプチドを使用してＰＳＡに特異的な抗体を生成し、次いで、この抗体を、ＰＳＡタンパク質の過剰発現（例えば、Ｓｔｅｐｈａｎら、Ｕｒｏｌｏｇｙ ５５（４）：５６０〜３（２０００）を参照のこと）または前立腺細胞の転移（例えば、Ａｌａｎｅｎら、Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．１９２（３）：２３３〜７（１９９６）を参照のこと）をモニターする方法においてＰＳＡタンパク質の存在および／またはレベルを観察するために使用するのとまさしく同じように、本明細書中に記載される２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチドは、２４Ｐ４Ｃ１２の過剰発現またはこの遺伝子を発現する前立腺細胞および他の癌細胞の転移の検出する際に使用するための抗体を生成するために使用され得る。
詳細には、転移は、元々の器官（例えば、肺または前立腺など）から身体の異なる領域（例えば、リンパ節）への癌細胞の移動を包含するので、２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドおよび／または２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチドを発現する細胞の存在について生物学的サンプルを試験するアッセイが、転移の証拠を提供するために使用され得る。例えば、２４Ｐ４Ｃ１２発現細胞を通常含まない組織（リンパ節）由来の生物学的サンプルが、ＬＡＰＣ４およびＬＡＰＣ９（それぞれ、リンパ節および骨の転移から単離された異種移植片）に見られる２４Ｐ４Ｃ１２発現のような、２４Ｐ４Ｃ１２発現細胞を含むことが見出される場合、この発見は転移を示す。
あるいは、２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドおよび／または２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチドは、例えば、通常２４Ｐ４Ｃ１２を発現しないかまたは異なるレベルで２４Ｐ４Ｃ１２を発現する生物学的サンプル中の細胞が、２４Ｐ４Ｃ１２を発現するかまたは２４Ｐ４Ｃ１２の増加した発現を有することが見出された場合（例えば、表Ｉに列挙された癌および添付の図面に示される患者サンプルなどにおける２４Ｐ４Ｃ１２の発現を参照のこと）に、癌の証拠を提供するために使用され得る。このようなアッセイにおいて、当業者は、（２４Ｐ４Ｃ１２に加えて）第二の組織制限マーカー（例えば、ＰＳＡ、ＰＳＣＡなど）の存在について生物学的サンプルを試験することによって、転移に関する補足的な証拠を生み出すことをさらに所望し得る（例えば、Ａｌａｎｅｎら、Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．１９２（３）：２３３−２３７（１９９６）を参照のこと）。
ＰＳＡポリヌクレオチドフラグメントおよびＰＳＡポリヌクレオチド改変体が、ＰＳＡをモニターする方法における使用のために当業者によって利用されるのとまさしく同じように、２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドフラグメントおよび２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレチド改変体は、類似の様式で使用される。特に、ＰＳＡをモニターする方法において使用される代表的なＰＳＡポリヌクレオチドは、ＰＳＡ ｃＤＮＡ配列のフラグメントから構成されるプローブまたはプライマーである。これを例にとると、ＰＳＡポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するために使用されるプライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応において機能するように、ＰＳＡ配列全体よりも短い配列を含まなくてはならない。このようなＰＣＲ反応の状況において、当業者は一般に、目的のポリヌクレオチドの異なる部分を増幅するためにかまたは増幅反応を最適化するためにプライマーとして使用され得る、種々の異なるポリヌクレオチドフラグメントを作製する（例えば、Ｃａｅｔａｎｏ−Ａｎｏｌｌｅｓ，Ｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２５（３）：４７２−４７６，４７８−４８０（１９９８）；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：１２１−１５４（１９９８）を参照のこと）。このようなフラグメントの使用のさらなる例示が、「正常組織、および患者試料における２４Ｐ４Ｃ１２の発現分析」と表題を付けられた実施例に提供され、ここで、２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドフラグメントは、癌細胞における２４Ｐ４Ｃ１２ ＲＮＡの発現を示すためのプローブとして使用される。さらに、改変体ポリヌクレオチド配列は、代表的に、ＰＣＲ分析およびノーザン分析において、対応するｍＲＮＡについてのプライマーおよびプローブとして使用される（例えば、Ｓａｗａｉら，Ｆｅｔａｌ Ｄｉａｇｎ．Ｔｈｅｒ．１９９６ Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；１１（６）：４０７−１３およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２，Ｕｎｉｔ ２，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９５を参照のこと）。ポリヌクレオチドフラグメントおよび改変体は、それらが、高ストリンジェンシー条件下で、標的ポリヌクレオチド配列（例えば、図２に示される２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドまたはその改変体）に結合し得る状況下において有用である。
さらに、抗体によって認識され得るエピトープを含むＰＳＡポリペプチドまたはそのエピトープに特異的に結合するＴ細胞が、ＰＳＡをモニターする方法において使用される。２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチドフラグメント、および２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチドアナログまたは改変体もまた、類似の様式で使用され得る。ポリペプチドフラグメントまたはポリペプチド改変体を使用して抗体（例えば、抗ＰＳＡ抗体またはＴ細胞）を生成するこの実施は、開業医によって使用されている融合タンパク質のような広範な種々の系と共に当該分野の技術において代表的である（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２，Ｕｎｉｔ １６，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９５を参照のこと）。この状況において、各エピトープ（単数または複数）は、抗体またはＴ細胞と反応性である構造体を提供するように機能する。代表的に、当業者は、目的のポリペプチドの異なる部分に特異的な免疫応答を生成するために使用され得る種々の異なるポリペプチドフラグメントを生成する（例えば、米国特許第５，８４０，５０１号および米国特許第５，９３９，５３３号を参照のこと）。例えば、本明細書中に考察される２４Ｐ４Ｃ１２の生物学的モチーフまたは当該分野で利用可能なモチーフに基づいて当業者により容易に同定されるモチーフ保有部分配列の１つを含むポリペプチドを利用することが好適であり得る。ポリペプチドのフラグメント、改変体またはアナログは代表的に、これらが標的ポリペプチド配列（例えば、図３に示される２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチド）に特異的な抗体またはＴ細胞を生成し得るエピトープを含む限りにおいて、この状況で有用である。
本明細書中に示されるように、２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドおよび２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチド（ならびに、これらの分子の存在を同定するために使用される２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドプローブおよび抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体またはＴ細胞）は、表Ｉに列挙された癌のような癌を診断するにおいてそれらを有用なものとする特異的特性を示す。前立腺癌のような、本明細書中に記載の疾患状態の存在または発症を評価するために、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物の存在を測定する診断アッセイは、ＰＳＡを用いて非常に首尾よく行われているように、予防的な測定またはさらなるモニタリングのために、患者を同定するのに使用される。さらに、これらの物質は、例えば、前立腺起源の転移の明確な診断がＰＳＡのみについての試験に基づいてなされ得ず（例えば、Ａｌａｎｅｎら、Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．１９２（３）：２３３−２３７（１９９６）を参照のこと）、そしてその結果、２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドおよび２４Ｐ４Ｃ１２ポリペプチド（ならびに、これらの分子の存在を同定するために使用される２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドプローブおよび抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体）のような物質が、前立腺起源の転移を確認するために使用されることが必要である状況において、ＰＳＡに対して類似した特徴または補足的な特徴を有する分子についての当該分野での必要性を満たす。
最後に、診断アッセイにおけるそれらの使用に加えて、本明細書中に開示される２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドは、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子がマッピングされる染色体領域（以下の実施例、表題「２４Ｐ４Ｃ１２の染色体マッピング」を参照のこと）におけるオンコジーン関連染色体異常の同定におけるそれらの使用のような、多くの他の用途を有する。さらに、診断アッセイにおけるそれらの使用に加えて、本明細書中に開示される２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質および２４Ｐ４Ｃ１２関連ポリヌクレオチドは、起源未知の組織の法医学的分析におけるそれらの使用のような他の有用性を有する（例えば、Ｔａｋａｈａｍａ Ｋ Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｓｃｉ Ｉｎｔ １９９６ Ｊｕｎ ２８；８０（１−２）：６３−９を参照のこと）。
さらに、本発明の２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質または２４Ｐ４Ｃ１２関連ポリヌクレオチドを使用して、２４Ｐ４Ｃ１２の過剰発現により特徴付けられる病理学的状態を処置し得る。例えば、図２もしくは図３のアミノ酸配列もしくは核酸配列、またはいずれかのフラグメントを使用して、２４Ｐ４Ｃ１２抗原に対する免疫応答を生成し得る。２４Ｐ４Ｃ１２と反応性の抗体または他の分子を使用して、この分子の機能を調節し得、それにより治療的利益を提供し得る。
（ＸＩＩ．）２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質機能の阻害）
本発明は、２４Ｐ４Ｃ１２のその結合パートナーへの結合を阻害するためまたは他のタンパク質（単数または複数）とのその結合を阻害するための種々の方法および組成物、ならびに、２４Ｐ４Ｃ１２の機能を阻害するための方法を含む。
（ＸＩＩ．Ａ．）細胞内抗体を用いた２４Ｐ４Ｃ１２の阻害）
１つのアプローチにおいて、２４Ｐ４Ｃ１２に特異的に結合する単鎖抗体をコードする組換えベクターが、２４Ｐ４Ｃ１２を発現する細胞へと遺伝子移入技術を介して導入される。それにより、そのコードされた単鎖抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体は細胞内で発現され、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質に結合し、そしてそれによりその機能を阻害する。このような細胞内単鎖抗体を操作するための方法は周知である。このような細胞内抗体（「内部抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）」としても公知）は、その細胞内の特定の区画に特異的に標的化され、その処置の阻害活性が焦点をあわせられる箇所に対する制御を与える。この技術は、当該分野で首尾良く適用されている（概説として、ＲｉｃｈａｒｄｓｏｎおよびＭａｒａｓｃｏ、１９９５、ＴＩＢＴＥＣＨ、第１３巻を参照のこと）。内部抗体は、他の豊富な細胞表面レセプターの発現を実質的に排除することが示されている（例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：３１３７〜３１４１；Ｂｅｅｒｌｉら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９：２３９３１〜２３９３６；Ｄｅｓｈａｎｅら、１９９４、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１：３３２〜３３７を参照のこと）。
単鎖抗体は、可撓性のリンカーポリペプチドにより連結された重鎖および軽鎖の可変ドメインを含み、そして単一のポリペプチドとして発現される。必要に応じて、単鎖抗体は、その軽鎖定常領域に連結された単鎖可変領域フラグメントとして発現される。周知の細胞内輸送シグナルが、内部抗体を所望の細胞内区画に対して正確に標的化するために、このような単鎖抗体をコードする組換えポリヌクレオチドベクター中に操作される。例えば、小胞体（ＥＲ）に標的化された内部抗体は、リーダーペプチドを組み込むように、そして必要に応じて、Ｃ末端ＥＲ保持シグナル（例えば、ＫＤＥＬアミノ酸モチーフ）を組み込むように、操作される。核において活性を発揮することが意図される内部抗体は、核局在化シグナルを含むように操作される。脂質部分が、形質膜の細胞質ゾル側に内部抗体をつなぐために、その内部抗体に連結される。内部抗体はまた、細胞質ゾルにおいて機能を発揮するように標的化され得る。例えば、細胞質ゾル内部抗体を使用して、細胞質ゾル内に因子を隔離し、それによりそれらの因子がその天然での細胞中の目的地に輸送されることを防ぐ。
１つの実施形態では、内部抗体を使用して、核に２４Ｐ４Ｃ１２を捕捉し、それにより核内でその活性を妨げる。核標的化シグナルが、所望の標的化を達成するために、このような２４Ｐ４Ｃ１２内部抗体に操作される。このような２４Ｐ４Ｃ１２内部抗体は、特定の２４Ｐ４Ｃ１２ドメインに特異的に結合するように設計される。別の実施形態において、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質に特異的に結合する細胞質ゾル内部抗体を使用して、２４Ｐ４Ｃ１２が核に近づくことを妨げ、それにより、２４Ｐ４Ｃ１２が、核内においていかなる生物学的活性を発揮することをも妨げる（例えば、２４Ｐ４Ｃ１２が他の因子と転写複合体を形成するのを妨げる）。
このような内部抗体の発現を特定の細胞に特異的に指向するために、その内部抗体の転写は、適切な腫瘍特異的プロモーターおよび／またはエンハンサーの調節制御下に配置される。内部抗体の発現を前立腺に特異的に標的化するために、例えば、ＰＳＡプロモーターおよび／またはプロモーター／エンハンサーが、利用され得る（例えば、１９９９年７月６日付けで発行された、米国特許第５，９１９，６５２号を参照のこと）。
（ＸＩＩ．Ｂ．）組換えタンパク質を用いた２４Ｐ４Ｃ１２の阻害）
別のアプローチにおいて、組換え分子は、２４Ｐ４Ｃ１２に結合し、それにより２４Ｐ４Ｃ１２の機能を妨げる。例えば、このような組換え分子は、２４Ｐ４Ｃ１２が、その結合パートナー（単数または複数）に接近／結合すること、または他のタンパク質（１つまたは複数）と結合することを防止または阻害する。このような組換え分子は、例えば、２４Ｐ４Ｃ１２特異的抗体分子の反応性部分（単数または複数）を含み得る。特定の実施形態において、２４Ｐ４Ｃ１２結合パートナーの２４Ｐ４Ｃ１２結合ドメインは、二量体融合タンパク質へと操作され、これによってこの融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１）のＦｃ部分に連結された２つの２４Ｐ４Ｃ１２リガンド結合ドメインを含む。このようなＩｇＧ部分は、例えば、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインならびにヒンジ領域を含み得るが、ＣＨ１ドメインは含まない。このような二量体融合タンパク質は、２４Ｐ４Ｃ１２の発現と関連する癌に罹患している患者に可溶性形態で投与され、それによりこの二量体融合タンパク質は２４Ｐ４Ｃ１２に特異的に結合し、そして２４Ｐ４Ｃ１２の結合パートナーとの相互作用をブロックする。このような二量体融合タンパク質はさらに、公知の抗体連結技術を使用して、多量体タンパク質へと組み合わされる。
（ＸＩＩ．Ｃ．）２４Ｐ４Ｃ１２の転写または翻訳の阻害）
本発明はまた、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子の転写を阻害するための種々の方法および組成物を含む。同様に、本発明はまた、２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害するための方法および組成物を提供する。
１つのアプローチにおいて、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子の転写を阻害する方法は、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子を２４Ｐ４Ｃ１２アンチセンスポリヌクレオチドと接触させる工程を包含する。別のアプローチにおいて、２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡの翻訳を阻害する方法は、２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡをアンチセンスポリヌクレオチドと接触させる工程を包含する。別のアプローチにおいて、２４Ｐ４Ｃ１２特異的リボザイムが、２４Ｐ４Ｃ１２メッセージを切断し、それにより翻訳を阻害するために使用される。このようなアンチセンスに基づく方法およびリボザイムに基づく方法はまた、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子の調節領域（例えば、２４Ｐ４Ｃ１２プロモーターエレメントおよび／またはエンハンサーエレメント）に関し得る。同様に、２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子転写因子を阻害し得るタンパク質が、２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡの転写を阻害するために使用される。上述の方法において有用な種々のポリヌクレオチドおよび組成物が、上記で記載されている。転写および翻訳を阻害するためのアンチセンス分子およびリボザイム分子の使用は、当該分野で周知である。
２４Ｐ４Ｃ１２の転写活性化を妨害することにより２４Ｐ４Ｃ１２の転写を阻害する他の因子もまた、２４Ｐ４Ｃ１２を発現する癌を処置するために有用である。同様に、２４Ｐ４Ｃ１２のプロセシングに干渉する因子は、２４Ｐ４Ｃ１２を発現する癌を処置するために有用である。このような因子を利用する癌の処置方法もまた、本発明の範囲内である。
（ＸＩＩ．Ｄ．）治療的ストラテジーについての一般的な考慮事項）
遺伝子移入および遺伝子治療の技術が、２４Ｐ４Ｃ１２を合成している腫瘍細胞に、治療用ポリヌクレオチド分子（すなわち、アンチセンス、リボザイム、内部抗体をコードするポリヌクレオチド、および他の２４Ｐ４Ｃ１２阻害分子）を送達するために使用され得る。多数の遺伝子治療アプローチが、当該分野で公知である。２４Ｐ４Ｃ１２アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、２４Ｐ４Ｃ１２の転写に干渉し得る因子などをコードする組換えベクターが、このような遺伝子治療アプローチを使用して標的腫瘍細胞に送達され得る。
上記の治療的アプローチは、広範な種々の外科的レジメン、化学療法的レジメンまたは放射線療法レジメンのいずれか１つと組み合わされ得る。本発明の治療的アプローチは、すべての患者に対して、そして特に、化学療法剤の毒性に十分に耐性ではない患者に対して利点となる、化学療法（または他の療法）の減少した投薬量の使用および／またはより低頻度の投与の使用を可能にし得る。
特定の組成物（例えば、アンチセンス、リボザイム、内部抗体）、またはこのような組成物の組合せの抗腫瘍活性は、種々のインビトロアッセイ系およびインビボアッセイ系を使用して評価され得る。治療的活性を評価するインビトロアッセイとしては、細胞増殖アッセイ、軟寒天アッセイおよび腫瘍促進活性を示す他のアッセイ、治療用組成物が結合パートナーへの２４Ｐ４Ｃ１２の結合を阻害する程度を決定し得る結合アッセイなどが挙げられる。
インビボでは、２４Ｐ４Ｃ１２治療用組成物の効力は、適切な動物モデルにおいて評価され得る。例えば、異種間前立腺癌モデル（ここで、ヒト前立腺癌の外植片または継代された異種移植片組織が、免疫無防備状態の動物（例えば、ヌードマウスまたはＳＣＩＤマウス）に導入される）が使用され得る（Ｋｌｅｉｎら、１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３：４０２〜４０８）。例えば、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／１６６２８および米国特許第６，１０７，５４０号は、原発性腫瘍の発生、微小転移、および疾患の後期段階に特徴的な骨芽細胞性転移の形成を反復し得るヒト前立腺癌の種々の異種移植片モデルを記載する。効力は、腫瘍形成、腫瘍後退または転移などの阻害を測定するアッセイを使用して予測され得る。
アポトーシスの促進を評価するインビボアッセイが、治療用組成物の評価において有用である。１つの実施形態において、治療用組成物で処置された腫瘍保有マウス由来の異種移植片は、アポトーシス性病巣の存在について試験され得、そして未処置のコントロール異種移植片保有マウスと比較され得る。アポトーシス性病巣が処置マウスの腫瘍に見出される度合いが、この組成物の治療的効力の指標を提供する。
前述の方法の実施において使用される治療用組成物は、所望の送達方法に適切なキャリアを含む薬学的組成物に処方され得る。適切なキャリアとしては、治療用組成物と組み合わされる場合に、その治療用組成物の抗腫瘍機能を保持し、かつ患者の免疫系と一般に無反応性である、任意の物質が挙げられる。例としては、任意の多数の標準的な薬学的キャリア（例えば、滅菌リン酸緩衝化生理食塩水溶液、静菌水など）が挙げられるがこれに限定されない（一般には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１６版），Ａ．Ｏｓａｌ．編、１９８０を参照のこと）。
治療用処方物は、可溶化され得、そして腫瘍部位に治療用組成物を送達し得る任意の経路を介して投与され得る。潜在的に有効な投与経路としては、静脈内、非経口、腹腔内、筋内、腫瘍内、皮内、器官内、同所性（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）などが挙げられるがこれらに限定されない。静脈内注射に好ましい処方物は、保存静菌水、滅菌非保存水の溶液中および／または注射用０．９％滅菌塩化ナトリウムを含むポリビニルクロリド製またはポリエチレン製のバッグ（ＵＳＰ）に希釈された治療用組成物を含む。治療用タンパク質調製物は、凍結乾燥され得、そして滅菌粉末として、好ましくは減圧下で保存され得、次いで注射する前に、静菌水（例えば、ベンジルアルコール防腐剤を含む）または滅菌水中で再構築され得る。
前述の方法を使用する癌の処置についての投薬量および投与プロトコルは、方法および標的の癌とともに変動し、そして一般に、当該分野で理解される多数の他の要因に依存する。
（ＸＩＩＩ．）２４Ｐ４Ｃ１２の調節因子の同定、性質決定、および使用）
（同定の方法および調節因子の使用）
１つの実施形態において、特定の発現プロフィールを誘導または抑制する、特定の経路を誘導または抑制する、好ましくは、それによって関連する表現型を生成する、調節因子を同定するためにスクリーニングを行う。別の実施形態において、特定の状態において重要な、差次的に発現する遺伝子を同定する場合；個々の遺伝子の発現を変更する（増大させるかまたは減少させる）調節因子を同定するためにスクリーニングを実行する。別の実施形態において、差次的に発現した遺伝子の発現産物の生物学的機能を変更する調節因子を同定するためにスクリーニングを実施する。再度、特定の状態での遺伝子の重要性を同定する際に、その遺伝子産物に結合し、そして／またはその遺伝子産物の生物学的活性を調節する因子を同定するためにスクリーニングを実施する。
さらに、スクリーニングを、候補薬剤に応答して誘導される遺伝子に対して行う。調節因子（正常な発現パターンを引き起こす癌発現パターンを抑制する調節因子、または正常な組織におけるように、遺伝子の発現を引き起こす癌遺伝子の調節因子）を同定した後、スクリーニングを実施して、薬剤に応答して特異的に調節される遺伝子を同定する。正常な組織と薬剤で処置した癌組織との間の発現プロフィールの比較により、正常な組織でも癌組織でも発現されないが、薬剤で処置した組織において発現される、またはその逆の遺伝子が明らかとなる。これらの薬剤特異的配列は、癌遺伝子または癌タンパク質について本明細書中で記載される方法により、同定および使用される。特に、これらの配列およびこの配列がコードするタンパク質が、薬剤で処置した細胞の作製または同定において使用される。さらに、抗体が、薬剤誘導性タンパク質に対して惹起され、そして新規の治療剤を処置した癌組織サンプルに標的化するために使用される。
（調節因子に関連する同定およびスクリーニングアッセイ）
（遺伝子発現に関連するアッセイ）
本発明のタンパク質、核酸および抗体が、スクリーニングアッセイに使用される。癌関連のタンパク質、抗体、核酸、改変されたタンパク質およびこれらの配列を含む細胞が、スクリーニングアッセイ（例えば、「遺伝子発現プロフィール」、ポリペプチドの発現プロフィールまたは生物学的機能の変更に対する薬物候補の効果の評価）において使用される。一実施形態において、発現プロフィールは、好ましくは、候補薬剤で処置した後の遺伝子を、発現プロフィールについてモニタリングするために、ハイスループットスクリーニング技術と組合せて使用される（例えば、Ｄａｖｉｓ，ＧＦら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｓｃｒｅｅｎ ７：６９（２００２）；Ｚｌｏｋａｒｎｉｋら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：８４−８（１９９８）；Ｈｅｉｄ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ ６：９８６−９４，１９９６）。
癌タンパク質、抗体、核酸、改変されたタンパク質、およびネイティブまたは改変された癌タンパク質または遺伝子を含む細胞が、スクリーニングアッセイにおいて使用される。すなわち、本発明は、本発明の癌タンパク質の癌表現型または生理学的機能を調節する組成物についてスクリーニングするための方法を包含する。これは、遺伝子自体について行われるか、あるいは「遺伝子発現プロフィール」または生物学的機能に対する薬物候補の効果を評価することによって行われる。一実施形態において、発現プロフィールは、好ましくは、候補薬剤で処理した後のモニタリングを可能にするハイスループットスクリーニング技術と組み合わせて使用される。Ｚｌｏｋａｍｉｋ（前出）を参照のこと。
種々のアッセイが、本発明の遺伝子およびタンパク質に対して実施される。個々の核酸またはタンパク質のレベルについて、アッセイが行われる。すなわち、一旦、特定の遺伝子が癌においてアップレギュレートされると同定されると、試験化合物が、遺伝子発現を調節する能力について、または本発明の癌タンパク質への結合についてスクリーニングされる。この状況に置いて、「調節」は、遺伝子発現の増加または減少を含む。調節の好ましい量は、正常な組織 対 癌に罹患した組織における遺伝子発現の本来の変化に基づき、この変化は、少なくとも１０％、好ましくは５０％、より好ましくは１００〜３００％、およびいくつかの実施形態においては３００〜１０００％またはそれ以上である。従って、遺伝子が、正常な組織と比較して、癌組織において４倍の増加を示す場合、約４倍の減少が、しばしば所望され；同様に、遺伝子が、正常な組織と比較して、癌組織において１０倍の減少を示す場合、試験化合物による発現における１０倍の増加の目標値が、しばしば所望される。癌において観察される遺伝子発現の型を悪化する調節因子もまた、例えば、さらなる分析において、上方制御される標的として有用である。
遺伝子発現の量は、核酸プローブおよび遺伝子発現レベルの定量化を使用してモニタリングされるか、あるいは、遺伝子産物自体が、例えば、癌タンパク質に対する抗体および標準的な免疫アッセイを使用することによって、モニタリングされる。
（遺伝子発現を改変する化合物を同定するための発現モニタリング）
一実施形態において、遺伝子発現のモニタリング（すなわち、発現プロフィール）は、多数の実体について同時にモニタリングされる。このようなプロフィールは、代表的に、図２の遺伝子の１つ以上を含む。この実施形態において、例えば、癌核酸プローブは、特定の細胞における癌配列を検出および定量化するために、バイオチップに結合される。あるいは、ＰＣＲが、使用され得る。従って、例えば、一連のマイクロタイタープレートのウェルが、所望のウェルに分配されたプライマーと共に使用され得る。次いで、ＰＣＲ反応が実施され、そして各ウェルについて分析される。
発現モニタリングは、１つ以上の癌関連配列（例えば、図２に記載のポリヌクレオチド配列）の発現を改変する化合物を同定するために実施される。一般に、試験調節因子は、分析の前に、細胞に加えられる。さらに、スクリーンもまた、癌を調節するか、本発明の癌タンパク質を調節するか、本発明の癌タンパク質に結合するか、または本発明の癌タンパク質および抗体もしくは他の結合パートナーの結合を妨害する薬剤を同定するために提供される。
一実施形態において、ハイスループットスクリーニング方法は、多数の潜在的な治療化合物（候補化合物）を含むライブラリーを提供する工程を包含する。次いで、このような「コンビナトリアルケミカルライブラリー」が、１つ以上のアッセイにおいてスクリーニングされて、所望の特徴的な活性を示すライブラリーメンバー（特定の化学種またはサブクラス）が同定される。このように同定された化合物は、従来の「リード化合物」として、スクリーニングのための化合物として、または治療剤として働き得る。
特定の実施形態において、潜在的な調節因子のコンビナトリアルライブラリーは、癌ポリペプチドに結合する能力、または活性を調節する能力についてスクリーニングされる。従来、有用な特性を有する新たな化学実体が、何らかの所望の特性または活性（例えば、阻害活性）を有する化合物（「リード化合物」と呼ばれる）を同定し、このリード化合物の改変体を作製し、そしてこれらの改変体化合物の特性および活性を評価することによって、生成される。しばしば、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）法が、このような分析のために用いられる。
上記のように、遺伝子発現モニタリングは、候補調節因子（例えば、タンパク質、核酸または低分子）を試験するために、都合良く用いられる。候補化合物を加え、そして細胞をある期間インキュベートした後、分析されるべき標的配列を含むサンプルが、例えば、バイオチップに添加される。
所望の場合、標的配列は、公知の技術を使用して調製される。例えば、サンプルは、公知の溶解緩衝液、エレクトロポレーションなどを使用して、細胞を溶解するために処理され、精製および／または増幅（例えば、ＰＣＲ）が、必要に応じて実施される。例えば、ヌクレオチドに供給結合された標識を用いるインビトロ転写が実施される。一般に、これらの核酸は、ビオチン−ＦＩＴＣまたはＰＥで、あるいはｃｙ３またはｃｙ５で標識される。
標的配列は、プローブへの標的配列の特異的結合を検出する手段を提供するために、例えば、蛍光シグナル、化学発光シグナル、化学シグナルまたは放射性シグナルで標識され得る。この標識はまた、酵素（例えば、アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ）であり得、これは、適切な基質が提供された場合、産物を生成し、この産物が検出される。あるいは、この標識は、標識された化合物または低分子（例えば、酵素に結合するが、酵素によって触媒または変更されない酵素インヒビター）である。この標識はまた、部分または化合物（例えば、エピトープタグまたはストレプトアビジンに特異的に結合するビオチン）であり得る。ビオチンの例について、ストレプトアビジンは、上記のようにして標識され、それにより、検出可能なシグナルを結合標的配列に提供する。未結合の標識ストレプトアビジンは、代表的に、分析の前に除去される。
当業者により理解されるように、これらのアッセイは、直接ハイブリダイゼーションアッセイであり得るか、または「サンドイッチアッセイ」を含み得、この「サンドイッチアッセイ」は、多数のプローブの使用を含み、一般に、以下の米国特許に概説される：米国特許第５，６８１，７０２号；同第５，５９７，９０９号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５９４，１１７号；同第５，５９１，５８４号；同第５，５７１，６７０号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５７１，６７０号；同第５，５９１，５８４号；同第５，６２４，８０２号；同第５，６３５，３５２号；同第５，５９４，１１８号；同第５，３５９，１００号；同第５，１２４，２４６号；および同第５，６８１，６９７号。この実施形態において、一般的に、標的核酸は、上で概説されたように調製され、次いで、ハイブリダイゼーション複合体の形成を可能にする条件下で、複数の核酸プローブを含むバイオチップに添加される。
上で概説されるような様々なハイブリダイゼーション条件（高いストリンジェンシー条件、中程度のストリンジェンシー条件および低いストリンジェンシー条件を含む）が、本発明において使用される。これらのアッセイは、一般的に、標的の存在下のみで、標識プローブハイブリダイゼーション複合体の形成を可能にするストリンジェンシー条件下で実施される。ストリンジェンシーは、熱力学的変数である工程パラメーター（温度、ホルムアミドの濃度、塩濃度、カオトロピック塩の濃度、ｐＨ、有機溶媒の濃度などが挙げられるが、これらに限定されない）を変更することによって、制御され得る。これらのパラメーターはまた、米国特許第５，６８１，６９７号に一般的に概説されるように、非特異的結合を制御するために使用され得る。従って、特定の工程を、より高いストリンジェンシー条件で実施して、非特異的結合を減少することが所望され得る。
本明細書中で概説される反応は、種々の様式で達成され得る。これらの反応の成分は、同時にまたは異なる順序で連続的に加えられ得、好ましい実施形態は、以下に概説される。さらに、この反応は、種々の他の試薬を含み得る。これとしては、塩、緩衝液、中性タンパク質（例えば、アルブミン）、界面活性剤などが挙げられ、これらは、最適なハイブリダイゼーションおよび検出を容易にするため、そして／または非特異的相互作用もしくはバックグラウンド相互作用を減少するために使用され得る。他の場合にはアッセイの効率を改善する試薬（例えば、プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗菌剤など）もまた、サンプル調製方法および標的の純度に依存して、必要に応じて使用され得る。アッセイデータが分析されて、個々の遺伝子の発現レベル、および状態間の発現レベルの変化が決定されて、遺伝子発現プロフィールが作製される。
（生物学的活性に関連するアッセイ）
本発明は、本発明の癌関連遺伝子またはタンパク質の活性を調節する化合物を同定またはスクリーニングする方法を提供する。この方法は、上記のような試験化合物を、本発明の癌タンパク質を含む細胞に添加する工程を包含する。これらの細胞は、本発明の癌タンパク質をコードする組換え核酸を含む。別の実施形態において、候補薬剤のライブラリーが、複数の細胞について試験される。
１つの局面において、このアッセイは、生理学的シグナル（例えば、ホルモン、抗体、ペプチド、抗原、サイトカイン、増殖因子、活動電位、化学療法薬を含む薬理学的薬剤、放射線、発癌性または他の細胞（すなわち、細胞−細胞接触））の以前のまたは後の曝露の存在もしくは非存在下または曝露の前もしくは後で評価される。別の例において、この決定は、細胞周期プロセスの異なる段階で行われる。この様式において、本発明の遺伝子またはタンパク質を調節する化合物が、同定される。薬理学的活性を有する化合物は、本発明の癌タンパク質の活性を増大し得るか、本発明の癌タンパク質の活性を干渉し得る。一旦同定されると、類似の構造が、この化合物の重要な構造特性を同定するために評価される。
一実施形態において、癌細胞の分裂を調節（例えば、阻害）する方法が、提供され；この方法は、癌調節因子の投与を包含する。別の実施形態において、癌を調節（例えば、阻害）する方法が提供され；この方法は、癌調節因子の投与を包含する。さらなる実施形態において、癌を有する細胞または個体を処置する方法が提供され；この方法は、癌調節因子の投与を包含する。
一実施形態において、本発明の遺伝子を発現する細胞の状態を調節するための方法が提供される。本明細書中で使用される場合、状態は、細胞の、成長、増殖、生存、機能、アポトーシス、老化、位置、酵素的活性、シグナル伝達などのような当該分野で受け入れられたパラメーターを含む。一実施形態において、癌インヒビターは、上で考察されたような抗体である。別の実施形態において、癌インヒビターは、アンチセンス分子である。種々の細胞成長、増殖、および転移アッセイが、本明細書中に記載されるように、当業者に公知である。
（調節因子を同定するためのハイスループットスクリーニング）
適切な調節因子を同定するためのアッセイは、ハイスループットスクリーニングに受け入れられる。従って、好ましいアッセイは、癌遺伝子の転写の増大または阻害、ポリペプチド発現の阻害または増大、およびポリペプチド活性の阻害または増大を検出する。
一実施形態において、ハイスループットスクリーニング法において評価される調節因子は、タンパク質であり、しばしば、天然に存在するタンパク質、または天然に存在するタンパク質のフラグメントである。従って、例えば、タンパク質を含む細胞抽出物、またはタンパク質性の細胞抽出物のランダム消化物もしくは指向された消化物が、使用される。この様式において、タンパク質のライブラリーが、本発明の方法におけるスクリーニングのために作製される。細菌タンパク質、真菌タンパク質、ウイルスタンパク質および哺乳動物タンパク質のライブラリーが、この実施形態において特に好ましく、後者が、好ましく、そしてヒトタンパク質が、特に好ましい。特に有用な試験化合物は、標的が属するクラスのタンパク質（例えば、酵素に対する基質、またはリガンドおよびレセプター）に指向される。
（調節因子を同定および特徴付けするための軟寒天増殖およびコロニー形成の使用）
正常な細胞は、結合および増殖するために固体支持体を必要とする。細胞が形質転換される場合、これらは、その表現型を失い、そして成長して、この支持体から脱離する。例えば、形質転換細胞は、撹拌懸濁培養液中で増殖し得るか、または半固体培地（例えば、半固体寒天または軟寒天）中に懸濁され得る。この形質転換細胞は、腫瘍抑制遺伝子でトランスフェクトされた場合、正常な表現型を再生し得、そして再び、結合して増殖するために、固体支持体を必要とする。アッセイにおける軟寒天増殖またはコロニー形成は、宿主細胞において発現した場合、異常な細胞増殖および形質転換を阻害する癌配列の調節因子を同定するために使用される。調節因子は、固体または半固体の培地（例えば、寒天）に懸濁された宿主細胞が増殖する能力を低下または排除する。
懸濁アッセイにおける軟寒天増殖またはコロニー形成のための技術は、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（第３版、１９９４）に記載される。Ｇａｒｋａｖｔｓｅｖら（１９９６）（前出）の方法の節もまた参照のこと。
（調節因子を同定および特徴付けするための接触阻害および増殖密度制限の評価）
正常な細胞は、代表的に、細胞培養物中で平らな組織化されたパターンで、この細胞が他の細胞と接触するまで増殖する。この細胞が、別の細胞と接触した場合、これらは、接触阻害され、そして増殖を停止する。しかし、形質転換細胞は、接触阻害されず、そして、組織化されていない病巣において高密度まで増殖し続ける。従って、形質転換細胞は、対応する正常な細胞よりも高い飽和密度まで増殖する。これは、細胞の方向付けされていない単層の形成または病巣における細胞によって、形態学的に検出される。あるいは、飽和密度における（３Ｈ）−チミジンでの標識指数が、増殖の密度制限を測定するために使用され、同様に、ＭＴＴアッセイまたはＡｌａｍａｒブルーアッセイが、細胞の増殖能および調節因子がこの細胞の増殖能に影響する能力を明らかにする。Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）（前出）を参照のこと。形質転換細胞は、腫瘍抑制因子でトランスフェクトされた場合、正常な表現型を再生し得、そして接触阻害されて、低密度まで増殖する。
このアッセイにおいて、飽和密度における（３Ｈ）−チミジンでの標識指数は、増殖の密度制限を測定する好ましい方法である。形質転換宿主細胞は、癌関連配列でトランスフェクトされ、そして非制限培地条件で、飽和密度で２４時間増殖される。（３Ｈ）−チミジンでの細胞標識の割合は、組み込まれたｃｐｍによって決定される。
接触非依存性増殖は、異常な細胞増殖および形質転換を生じた癌配列の調節因子を同定するために使用される。調節因子は、接触非依存性増殖を減少または排除し、そして細胞を正常な表現型に戻す。
（調節因子を同定および特徴付けするための増殖因子または血清依存性の評価）
形質転換細胞は、その正常な対応物よりも低い血清依存性を有する（例えば、Ｔｅｍｉｎ，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．３７：１６７−１７５（１９６６）；Ｅａｇｌｅら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ １３１：８３６−８７９（１９７０）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，（前出）を参照のこと）。このことは、形質転換細胞による種々の増殖因子の放出に起因する。形質転換宿主細胞の増殖因子または血清依存性の程度は、制御下にあるものと比較され得る。例えば、細胞の増殖因子または血清依存性は、本発明の癌関連配列を調節する化合物を同定および特徴付けするための方法においてモニタリングされる。
（調節因子を同定しそして特徴付けるための、腫瘍特異的マーカーレベルの使用）
腫瘍細胞は、それらの正常な対応物より増加した量の特定の因子（本明細書中以下において「腫瘍特異的マーカー」）を放出する。例えば、プラスミノゲンアクチベーター（ＰＡ）は、正常な脳細胞からより高レベルで、ヒト神経膠腫から放出される（例えば、Ｇｕｌｌｉｎｏ，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｔｕｍｏｒ Ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｗｉｔｈ Ｔｕｍｏｒ Ｇｒｏｗｔｈ，ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ，１７８−１８４頁（Ｍｉｈｉｃｈ（編）１９８５）を参照のこと）。同様に、腫瘍脈管形成因子（ＴＡＦ）は、正常な対応物より高レベルで、腫瘍細胞において放出される。例えば、Ｆｏｌｋｍａｎ，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｓｅｍ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．（１９９２））を参照のこと。一方で、ｂＦＧＦは、内皮細胞腫瘍から放出される（Ｅｎｓｏｌｉ，Ｂら）。
これらの因子の放出を測定する、種々の技術が、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ （１９９４）（前出）に記載されている。Ｕｎｋｌｅｓｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４９：４２９５〜４３０５（１９７４）；Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ ＆ Ｂｅｅｒｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１：５６９４〜５７０２（１９７６）；Ｗｈｕｒら，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４２：３０５ ３１２（１９８０）；Ｇｕｌｌｉｎｏ，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｔｕｍｏｒ Ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｗｉｔｈ Ｔｕｍｏｒ Ｇｒｏｗｔｈ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ，１７８〜１８４頁（Ｍｉｈｉｃｈ（編）１９８５）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５：１１１−１３０（１９８５）もまた参照のこと。例えば、腫瘍特異的マーカーレベルは、本発明の癌関連配列を調節する化合物を同定および特徴付けるための方法でモニターされる。
（調節因子を同定しそして特徴付けるための、マトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）への侵襲性）
マトリゲルまたは細胞外マトリックス成分への侵襲性の程度は、癌関連配列を調節する化合物を同定および特徴付けするためのアッセイとして使用され得る。腫瘍細胞は、悪性と、マトリゲル内または何らかの他の細胞外マトリックス成分内への細胞の侵襲性との間のポジティブな相関を示す。このアッセイにおいて、腫瘍形成性の細胞が、代表的に、宿主細胞として使用される。これらの宿主細胞中での腫瘍抑制因子の発現は、宿主細胞の侵襲性を減少させる。Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９９；５９：６０１０；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）（前出）に記載される技術が使用され得る。簡単にいえば、宿主細胞の侵襲のレベルは、マトリゲルまたは何らかの他の細胞外マトリックス成分でコーティングされたフィルターを使用することによって、測定される。ゲル内への浸透、またはフィルターの遠位側を通しての浸透は、侵襲性と定格され、そして細胞の数および移動した距離によってか、または細胞を１２５Ｉで予め標識し、そしてフィルターの遠位側またはディッシュの底部の放射能を計数することによって、組織学的に定格される。例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９８４）（前出）を参照のこと。
（調節因子を同定しそして特徴付けるための、インビボでの腫瘍増殖の評価）
細胞増殖に対する癌関連配列の影響は、トランスジェニック生物または免疫抑制された生物において試験される。トランスジェニック生物は、当該分野で認容された種々の様式で調製される。例えば、癌遺伝子が破壊されたかまたは癌遺伝子が挿入された、ノックアウトトランスジェニック生物（例えば、マウスのような哺乳動物）が作製される。ノックアウトトランスジェニックマウスは、マーカー遺伝子または他の異種遺伝子を、相同組換えを介して、マウスゲノムにおける内因性癌遺伝子部位に挿入することによって、作製される。このようなマウスはまた、内因性癌遺伝子を変異バージョンの癌遺伝子で置き換えることによって、または内因性癌遺伝子を、例えば発癌物質に曝露することによって変異させることによって、作製され得る。
トランスジェニックキメラ動物（例えば、マウス）を調製するためには、ＤＮＡ構築物が、胚幹細胞の核に導入される。新たに操作された遺伝的損傷を含む細胞が、宿主マウス胚に注入され、これが、レシピエントの雌性に再移植される。これらの胚のいくつかは、いくつかの生殖細胞が変異体細胞株由来であるキメラマウスに発育する。従って、このキメラマウスを繁殖させることによって、導入された遺伝的損傷を含む新たな株のマウスを得ることが可能である（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８（１９８９）を参照のこと）。キメラマウスは、２００２年４月２日に発行された米国特許第６，３６５，７９７号；２０００年８月２２日に発行された米国特許第６，１０７，５４０号；Ｈｏｇａｎら，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）およびＴｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，編，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，（１９８７）に従って、誘導され得る。
あるいは、種々の免疫抑制宿主動物または免疫不全宿主動物が、使用され得る。例えば、遺伝的に無胸腺の「ヌード」マウス（例えば、Ｇｉｏｖａｎｅｌｌａら，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．５２：９２１（１９７４）を参照のこと）、ＳＣＩＤマウス、胸腺切除されたマウス、または照射されたマウス（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙら，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ３８：２６３（１９７８）；Ｓｅｌｂｙら，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４１：５２（１９８０）を参照のこと）が、宿主として使用され得る。同系の宿主に注入された、移植可能な腫瘍細胞（代表的に、約１０６個の細胞）は、高い割合の場合において、侵襲性の腫瘍を産生し、一方で、類似の起源の正常細胞は、侵襲性の腫瘍を産生しない。侵襲性の腫瘍を発達させた宿主において、癌関連配列を発現する細胞が、皮下注射または正常位で注射される。次いで、マウスが、コントロール群および処理実験群（例えば、調節因子で処理された）を含む群に分離される。適切な長さの時間（好ましくは、４〜８週間）の後に、腫瘍増殖が測定され（例えば、体積またはその２つの最大寸法、もしくは重量によって）、そしてコントロールと比較される。統計学的に有意な減少を有する腫瘍（例えば、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用する）は、阻害された増殖を有するといわれる。
（調節因子を同定しそして特徴付けるためのインビトロアッセイ）
調節活性を有する化合物を同定するためのアッセイは、インビトロで実施され得る。例えば、癌ポリペプチドがまず潜在的な調節因子と接触され、そして適切な量の時間（例えば、０．５〜４８時間）にわたってインキュベートされる。１つの実施形態において、癌ポリペプチドのレベルは、タンパク質またはｍＲＮＡのレベルを測定することによって、インビトロで決定される。タンパク質のレベルは、癌ポリペプチドまたはそのフラグメントに選択的に結合する抗体を用いる、免疫アッセイ（例えば、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡなど）を使用して測定される。ｍＲＮＡの測定のためには、増幅（例えば、ＰＣＲ、ＬＣＲ、またはハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ＲＮＡｓｅ保護、ドットブロッティング））が好ましい。タンパク質またはｍＲＮＡのレベルは、直接的にかまたは間接的に標識された検出試薬（例えば、本明細書中に記載されるような、蛍光標識または放射活性標識された核酸、放射活性的にまたは酵素的に標識した抗体など）を使用して、検出される。
あるいは、レポーター遺伝子系が、レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、ＣＡＴ、またはＰ−ｇａｌ）に作動可能に連結された癌タンパク質プロモーターを使用して発明（ｄｅｖｉｓｅ）され得る。レポーター構築物は、代表的に、細胞内にトランスフェクトされる。潜在的な調節因子での処理後、レポーター遺伝子の転写、翻訳、または活性の量が、当業者に公知である標準的な技術に従って測定される（Ｄａｖｉｓ ＧＦ，前出；Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｊ．＆ Ｎｅｇｕｌｅｓｃｕ，Ｐ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８：９：６２４）。
上で概説されたように、インビトロスクリーニングは、個々の遺伝子および遺伝子産物に対してなされる。すなわち、特定の差次的に発現される遺伝子が特定の状態において重要であると同定されると、この遺伝子または遺伝子産物自体の発現の調節因子のスクリーニングが実施される。
１つの実施形態において、特定の遺伝子の発現の調節因子についてのスクリーニングが実施される。代表的に、ほんの１つまたは少数の遺伝子の発現が、評価される。別の実施形態において、スクリーニングは、差次的に発現されるタンパク質に結合する化合物をまず発見するように、設計される。次いで、これらの化合物が、差次的に発現される活性を調節する能力について評価される。さらに、一旦、最初の候補化合物が同定されると、構造と活性の関係をよりよく評価するために、改変体が、さらにスクリーニングされ得る。
（調節因子を同定しそして特徴付けるための、結合アッセイ）
本発明に従う結合アッセイにおいて、精製されたかまたは単離された本発明の遺伝子産物が、一般に使用される。例えば、抗体が、本発明のタンパク質に対して生成され、そして免疫アッセイが実施されて、タンパク質の量および／または位置を決定する。あるいは、癌タンパク質を含む細胞が、アッセイにおいて使用される。
従って、これらの方法は、本発明の癌タンパク質を、リガンドのような候補化合物と混合する工程、および本発明の癌タンパク質に対する、この化合物の結合を決定する工程を包含する。好ましい実施形態は、ヒト癌タンパク質を利用する；ヒト疾患の動物モデルもまた、開発および使用され得る。また、他の類似の哺乳動物タンパク質もまた、当業者によって理解されるように、使用され得る。さらに、いくつかの実施形態において、改変体または誘導癌タンパク質が、使用される。
一般に、本発明の癌タンパク質またはリガンドは、不溶性支持体に拡散不可能に結合される。この支持体は、例えば、単離されたサンプルを受容する領域を有するもの（マイクロタイタープレート、アレイなど）であり得る。不溶性の支持体は、組成物が結合され得る任意の組成物から作製され得、可溶性材料から容易に分離され、そしてスクリーニングの方法全体とその他の点で適合性である。このような支持体の表面は、中実または多孔性であり得、そして任意の好都合な形状であり得る。
適切な不溶性の支持体の例としては、マイクロタイタープレート、アレイ、膜およびビーズが挙げられる。これらは代表的に、ガラス、プラスチック（例えば、ポリスチレン）、多糖、ナイロン、ニトロセルロース、またはＴｅｆｌｏｎ（登録商標）などで作製される。マイクロタイタープレートおよびアレイは、特に好都合である。なぜなら、少量の試薬およびサンプルを使用して、多数のアッセイが同時に実施され得るからである。組成物を支持体に結合させる特定の様式は、試薬および本発明の方法全体と適合性であり、組成物の活性を維持し、そして拡散不可能である限り、重要ではない。結合の好ましい方法としては、タンパク質を支持体に付着させる場合に（「粘着」支持体またはイオン性支持体への直接結合、化学架橋、表面上でのタンパク質または薬剤の合成など）、リガンド結合部位も活性化配列も立体的にブロックしない抗体の使用が挙げられる。タンパク質またはリガンド／結合剤の、支持体への結合に続いて、過剰の未結合物質が、洗浄によって除去される。次いで、サンプル受容領域は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼインまたは他の無害なタンパク質もしくは他の部分と共にインキュベーションすることによって、ブロックされ得る。
一旦、本発明の癌タンパク質が支持体に結合すると、試験化合物がアッセイに添加される。あるいは、候補結合剤が支持体に結合され、次いで、本発明の癌タンパク質が添加される。結合剤としては、特異的抗体、化学ライブラリーのスクリーニングによって同定された非天然結合剤、ペプチドアナログなどが挙げられる。
ヒト細胞に対して低い毒性を有する薬剤を同定するためのアッセイが、特に興味深い。広範な種々のアッセイが、この目的で使用され得、このアッセイとしては、増殖アッセイ、ｃＡＭＰアッセイ、標識されたインビトロでのタンパク質−タンパク質結合アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、タンパク質結合についての免疫アッセイ、機能的アッセイ（リン酸化アッセイなど）などが挙げられる。
試験化合物（リガンド、結合剤、調節因子など）の、本発明の癌タンパク質への結合の決定は、多数の様式でなされ得る。試験化合物が標識され得、そして結合が、例えば、本発明の癌タンパク質のすべてまたは一部を固体支持体に付着させ、標識された候補化合物（例えば、蛍光標識）を添加し、過剰の試薬を洗浄除去し、そして標識が固体支持体上に存在するか否かを決定することによって、直接決定され得る。種々のブロック工程および洗浄工程が、適切なように利用され得る。
特定の実施形態において、成分の１つのみが標識される。例えば、本発明のタンパク質またはリガンドが標識される。あるいは、１つより多い成分が、異なる標識で標識される（例えば、タンパク質に対してＩ１２５、および化合物に対して発蛍光団）。近接試薬（例えば、クエンチング剤またはエネルギー移動剤）もまた、有用である。
（調節因子を同定しそして特徴付けるための、競合結合）
１つの実施形態において、「試験化合物」の結合は、「競合物質」を用いる競合結合アッセイによって決定される。競合物質とは、標的分子（例えば、本発明の癌タンパク質）に結合する結合部分である。競合物質としては、抗体、ペプチド、結合パートナー、リガンドなどのような化合物が挙げられる。特定の状況下では、試験化合物と競合物質との間の競合結合は、試験化合物に取って代わる。１つの実施形態において、試験化合物が標識される。試験化合物、競合物質のいずれか、または両方が、結合を可能にするために十分な時間にわたって、タンパク質に添加される。インキュベーションが、最適な活性を容易にする温度（代表的に、４℃と４０℃との間）で実施される。インキュベーション時間は、代表的に、例えば、スクリーニングの迅速なハイスループットを容易にするように、最適化される；代表的に、０時間と１時間との間で十分である。過剰の試薬が、一般に、除去または洗浄除去される。次いで、第二の成分が添加され、そして標識された成分の存在または非存在が、結合を示すために追跡される。
１つの実施形態において、競合物質がまず添加され、次いで試験化合物が添加される。競合物質の置き換えは、試験化合物が癌タンパク質に結合することの指標であり、従って、癌タンパク質に結合し得、そして癌タンパク質の活性を潜在的に調節し得る。この実施形態において、いずれかの成分が標識され得る。従って、例えば、競合物質が標識される場合、試験後化合物洗浄溶液中の標識の存在が、試験化合物による置き換えを示す。あるいは、試験化合物が標識される場合、支持体上の標識の存在が、置き換えの指標である。
代替の実施形態において、試験化合物がまず添加され、インキュベーションおよび洗浄され、次いで、競合物質が添加される。競合物質による結合の非存在は、試験化合物が、競合物質より高い親和性で、癌タンパク質に結合することを示す。従って、試験化合物が標識される場合、支持体上の標識の存在（競合物質の結合の欠如と組み合わせられる）が、試験化合物が本発明の癌タンパク質に結合し、従って潜在的に調節することの指標である。
従って、競合結合方法は、本発明の癌タンパク質の活性を調節し得る薬剤を同定するための、差次的スクリーニングを包含する。この実施形態において、この方法は、癌タンパク質および競合物質を、第一のサンプル中で混合する工程を包含する。第二のサンプルは、試験化合物、癌タンパク質、および競合物質を含有する。競合物質の結合が、両方のサンプルについて決定され、そしてこれら２つのサンプル間での結合の変化、または差異が、癌タンパク質に結合し得、そしてその活性を潜在的に調節し得る薬剤の存在を示す。すなわち、競合物質の結合が、第一のサンプルに対して第二のサンプルにおいて異なる場合、この薬剤は、癌タンパク質に結合し得る。
あるいは、差次的スクリーニングが、ネイティブの癌タンパク質に結合するが改変癌タンパク質に結合し得ない薬物候補を同定するために用いられる。例えば、癌タンパク質の構造はモデル化されて、合理的薬物設計において、その部位と相互作用する因子、すなわち部位改変タンパク質（ｓｉｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）に一般的に結合しない因子を合成するために用いられる。さらに、ネイティブの癌タンパク質の活性に影響するような薬物候補はまた、そのようなタンパク質の活性の増強または減少のいずれかをする能力について薬物をスクリーニングすることによって同定される。
陽性コントロールおよび陰性コントロールが、このアッセイにおいて用いられ得る。好ましくは、コントロールおよび試験サンプルは、統計的に有意な結果を得るために少なくとも三連で実施される。全てのサンプルのインキュベーションは、タンパク質へのこの因子の結合を可能にするのに十分な時間、行われる。インキュベーションに続いて、サンプルを洗浄して非特異的結合物質を含まないようにし、そして結合した、遺伝的に標識した因子の量を決定する。例えば、放射標識を用いる場合、これらのサンプルをシンチレーションカウンターを用いて計数して、結合した化合物の量を決定し得る。
種々の他の試薬がこのスクリーニングアッセイに関与し得る。これらの試薬としては、最適なタンパク質−タンパク質結合を容易にし、そして／または非特異的相互作用もしくはバックグラウンド相互作用を減少するために用いられる塩、中性タンパク質（例えば、アルブミン）界面活性剤などのような試薬が挙げられる。このアッセイの効率を他の方法で改善する試薬（例えば、プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗菌剤など）もまた用いられ得る。成分の混合物が、必須の結合を提供する順番で添加される。
（本発明のタンパク質をダウンレギュレートまたは阻害するためのポリヌクレオチドの使用）
癌のポリヌクレオチド調節因子が、ＷＯ ９１／０４７５３に記載されるように、リガンド結合分子との結合体の形成によって、標的ヌクレオチド配列を含む細胞へと導入され得る。適切なリガンド結合分子としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：細胞表面レセプター、増殖因子、他のサイトカイン、または細胞表面レセプターに結合する他のリガンド。好ましくは、リガンド結合分子の結合体は、リガンド結合分子がその対応する分子またはレセプターに結合する能力を十分には干渉しないか、あるいは、細胞へのセンスオリゴヌクレオチドもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその結合体バージョンの進入を十分にはブロックしない。あるいは、癌のポリヌクレオチド調節因子が、例えば、ＷＯ ９０／１０４４８に記載されるように、ポリヌクレオチド−脂質複合体の形成によって標的核酸配列を含む細胞内に導入され得る。アンチセンス分子またはノックアウトモデルおよびノックインモデルの使用もまた、処理方法に加えて、上で議論されるようなスクリーニングアッセイにおいて用いられ得ることが理解される。
（阻害およびアンチセンスヌクレオチド）
特定の実施形態において、癌関連タンパク質の活性が、アンチセンスポリヌクレオチドまたは阻害性小核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）（すなわちコードｍＲＮＡ核酸配列（例えば、本発明の癌タンパク質、ｍＲＮＡ、またはそれらの部分配列）に相補的であり、そして好ましくは、これらに特異的にハイブリダイズし得る核酸）の使用により、ダウンレギュレートされるか、または完全に阻害される。ｍＲＮＡへのアンチセンスポリヌクレオチドの結合は、ｍＲＮＡの翻訳および／または安定性を減少させる。
本発明の文脈において、アンチセンスポリヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチド、または天然に存在するサブユニットもしくはこれらの近縁のホモログから形成される合成種を含み得る。アンチセンスポリヌクレオチドはまた、変化した糖部分または糖間の連結を有し得る。当該分野において使用されることが公知のホスホロチオエートおよび他の硫黄含有種が、例示的にこれらの中に含まれる。アナログは、これらが本発明のヌクレオチドとハイブリダイズするように有効に機能する限り本発明に含まれる。例えば、Ｉｓｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ；Ｓｅｑｕｉｔｏｒ、Ｉｎｃ．、Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡを参照のこと。
そのようなアンチセンスポリヌクレオチドは、組換え手段を用いて容易に合成され得るか、またはインビトロで合成され得る。そのような合成についての装置は、種々の販売者（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓが挙げられる）から販売されている。他のオリゴヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体）の調製もまた、当業者に周知である。
本明細書中で使用される場合、アンチセンス分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはセンスオリゴヌクレオチドを含む。センスオリゴヌクレオチドは、例えば、アンチセンス鎖への結合により転写をブロックするために用いられ得る。このアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびセンスオリゴヌクレオチドは、癌分子についての標的ｍＲＮＡ（センス）配列または標的ＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合し得る一本鎖核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか）を含む。本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはセンスオリゴヌクレオチドは、一般的に、少なくとも約１２ヌクレオチド、好ましくは、約１２ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチドのフラグメントを含む。所定のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づくアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはセンスオリゴヌクレオチドを誘導する能力は、例えば、Ｓｔｅｉｎ＆Ｃｏｈｅｎ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８：２６５９（１９８８）およびｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌら、（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８（１９８８）に記載されている。
（リボザイム）
アンチセンスポリヌクレオチドに加えて、リボザイムが、癌関連ヌクレオチド配列の転写を標的化または阻害するために用いられ得る。リボザイムは、他のＲＮＡ分子を触媒的に切断するＲＮＡ分子である。種々の種類のリボザイムが記載されている。これらのリボザイムとしては、グループＩリボザイム、ハンマーヘッドリボザイム、ヘアピンリボザイム、ＲＮａｓｅ Ｐ、およびアックスヘッドリボザイムが挙げられる（例えば、種々のリボザイムの特性の一般的な概説についてはＣａｓｔａｎｏｔｔｏら、Ａｄｖ．ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２５：２８９〜３１７（１９９４）を参照のこと）。
ヘアピンリボザイムの遺伝的特徴は、例えば、Ｈａｍｐｅｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１８：２９９〜３０４（１９９０）；欧州特許出願番号０３６０２５７；米国特許第５，２５４，６７８号に記載されている。調製方法は、当業者に周知である（例えば、ＷＯ ９４／２６８７７；Ｏｊｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６３４０〜６３４４（１９９３）；Ｙａｍａｄａら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：３９〜４５（１９９４）；Ｌｅａｖｉｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：６９９〜７０３（１９９５）；Ｌｅａｖｉｔｔら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：１１５１〜１２０（１９９４）；およびＹａｍａｄａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０５：１２１〜１２６（１９９４）を参照のこと）。
（表現型スクリーニングにおける調節因子の使用）
１つの実施形態において、試験化合物が、関連する癌発現プロフィールを有する癌細胞の集団に投与される。本明細書において「投与する」または「接触させる」とは、調節因子を、取り込み作用および細胞内作用によってか、または細胞表面での作用によって、細胞に対して作用させるような様式で、この調節因子をその細胞に添加することを意味する。いくつかの実施形態において、タンパク質様因子（すなわち、ペプチド）をコードする核酸がウイルス構築物（例えば、アデノウイルス構築物またはレトロウイルス構築物）へと付加され、そして細胞へと添加されてこのペプチド因子の発現が達成される（例えば、ＰＣＴ ＵＳ９７／０１０１９）。調節可能な遺伝子治療系もまた、用いられ得る。一旦、調節因子を細胞に投与した後、これらの細胞を、所望の場合洗浄し、そして好ましい生理学的条件下で、いくらかの期間インキュベートする。次いで、これらの細胞を、収集し、そして新しい遺伝子発現プロフィールを作製する。従って、例えば、癌組織を、癌の表現型を調節（例えば、誘導または抑制）する因子についてスクリーニングする。発現プロフィールの少なくとも１つの遺伝子、好ましくは多くの遺伝子における変化は、この因子が、癌の活性に対して効果を有することを示す。同様に、生物学的機能またはシグナル伝達経路を変化させることは、調節因子の活性を示す。癌の表現型についてのそのようなシグネチャーを規定することにより、表現型を変化させる新規の薬物についてのスクリーニングが考案される。このアプローチにおいて、薬物標的は既知である必要はなく、元の遺伝子／タンパク質発現スクリーニングプラットフォームにおいて表されている必要もなく、標的タンパク質に対する転写物のレベルが変化する必要もない。機能を阻害する調節因子は、代理マーカーとしての役割を果たす。
上で概説したとおり、遺伝子または遺伝子産物を評価するために、スクリーニングを実施する。すなわち、特定の差次的に発現された遺伝子を、特定の状態において重要であると同定する工程、遺伝子または遺伝子産物自体の発現のいずれかの調節因子をスクリーニングする工程を実施する。
（本発明のペプチドに影響する調節因子の使用）
癌ポリペプチドの活性、または癌表現型の測定を、種々のアッセイを用いて実施する。例えば、癌ポリペプチドの機能に対する調節因子の効果を、上記のパラメーターを試験することにより測定する。活性に影響する生理学的変化が、本発明のポリペプチドに対する試験化合物の影響を評価するために用いられる。インタクトな細胞または動物を用いて機能的結果が決定される場合、種々の効果が、（例えば、固形腫瘍、腫瘍増殖、腫瘍転移、新生血管形成、ホルモン放出、（例えば、ノーザンプロットによる）既知の遺伝マーカーおよび特徴付けられていない遺伝マーカーの両方に対する転写の変化に関連する癌の場合、細胞代謝における変化（例えば、細胞増殖またはｐＨ変化）および細胞内二次的メッセンジャー（例えば、ｃＧＮＩＰ）の変化の場合に）評価され得る。
（癌関連配列を同定、特徴付けする方法）
種々の遺伝子配列の発現が、癌に関連する。従って、変異体癌遺伝子または改変体癌遺伝子に基づく障害を決定する。１つの実施形態において、本発明は、改変体癌遺伝子を含む細胞を同定する（例えば、細胞内の少なくとも１つの内因性癌遺伝子の配列の全てまたは一部の存在を決定する）ための方法を提供する。これは、任意の配列決定技術を用いて達成される。本発明は、個体の癌の遺伝子型を同定する（例えば、個体における少なくとも１つの本発明の遺伝子の配列の全てまたは一部を決定する）方法を包含する。これは、一般的に、個体の少なくとも１つの組織（例えば、表Ｉに示される組織）において行われ、そして多数の組織または同じ組織の異なるサンプルの評価を含み得る。この方法は、配列決定した遺伝子の配列を、既知の癌遺伝子（すなわち、野生型遺伝子）の配列と比較して、ファミリーメンバー、ホモログ、変異体、または改変体の存在を決定する工程を包含し得る。次いで、この遺伝子の全てまたは一部の配列を、既知の癌遺伝子の配列と比較して、任意の差異が存在するか否かを決定し得る。これは、任意の既知の相同性プログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、Ｂｅｓｔｆｉｔなど）を用いて行われる。患者の癌遺伝子と既知の癌遺伝子との間の配列の差異の存在は、本明細書中で概説されるように、疾患状態または疾患状態についての傾向に関連する。
好ましい実施形態において、これらの癌遺伝子は、ゲノム中の癌遺伝子のコピー数を決定するためのプローブとして用いられる。これらの癌遺伝子は、癌遺伝子の染色体位置を決定するためのプローブとして用いられる。染色体位置のような情報は、特に、染色体異常（例えば、転座など）が癌遺伝子座において同定された場合、診断または予後診断の提供における使用を見出す。
（ＸＩＶ．）キット／製造の物品）
本明細書中に記載される診断適用および治療適用における使用のために、キットもまた、本発明の範囲内である。そのようなキットは、キャリア、パッケージまたは１つ以上の容器（例えば、バイアル、チューブなど）を受容するように区画に分けられた容器を備え得、これらの容器の各々は、この方法において用いられる１つの別個のエレメントを含む。例えば、容器は、検出可能に標識されているかまたは標識され得るプローブを含み得る。そのようなプローブは、それぞれ、図２に関連するタンパク質もしくは図２の遺伝子またはメッセージに特異的な抗体またはポリヌクレオチドであり得る。この方法が、標的核酸を検出するための核酸ハイブリダイゼーションを使用する場合、このキットはまた、標的核酸配列を増幅するためのヌクレオチドを含む容器および／またはレポーター手段（例えば、レポーター分子（例えば、酵素標識、蛍光標識、または放射標識）に結合したビオチン結合タンパク質（例えば、アビジンまたはストレプトアビジン））を含む容器も有し得る。このキットは、図２または図３におけるアミノ酸配列の全てもしくは一部またはこれらのアナログ、あるいはそのようなアミノ酸配列をコードする核酸分子を含み得る。
本発明のキットは、代表的に、上記の容器および商業的立場およびの使用者の立場から所望される物質（緩衝液、希釈液、ろ紙、針、シリンジ；キャリア、パッケージ、容器、バイアルおよび／またはチューブ、内容物を列挙したラベル、および／または使用のための指示書、ならびに使用のための指示書を有するパッケージ挿入物が挙げられる）を含む１つ以上の他の容器を含む。
ラベルは、容器上に存在して、この組成物が特定の治療または非治療適用（例えば、診断適用または研究適用）に用いられることを示し得、そしてインビボまたはインビトロでの使用（例えば、本明細書中に記載される使用）のための指示を示し得る。指示および／または他の情報はまた、このキットと共にかまたはこのキット上に備えられた挿入物またはラベル上に含まれ得る。
用語「キット」および「製造の物品」は、類義語として用いられ得る。
本発明の別の実施形態において、組成物（例えば、アミノ酸配列、低分子、核酸配列、および／または抗体（例えば、表Ｉに示されるような組織の新形成の診断、予後診断、予防および／または処置のために有用な物質）を備える製造の物品が提供される。製造の物品は、代表的に、少なくとも１つの容器および少なくとも１つのラベルを備える。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管が挙げられる。これらの容器は、種々の材料（例えば、ガラスまたはプラスチック）から形成され得る。この容器は、アミノ酸配列、低分子、核酸配列、および／または抗体を保持し得、１つの実施形態において、この容器は、細胞のｍＲＮＡ発現プロフィールの試験において用いるためのポリヌクレオチドを、この目的のために用いられる試薬とともに保持し得る。
この容器は、代替的に、状態を処置、診断、予後診断または予防するために有効な組成物を含み得、そして滅菌アクセスポートを備え得る（例えば、この容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針により貫通可能なストッパーを有するバイアルであり得る）。この組成物中の活性因子は、２４Ｐ４Ｃ１２を特異的に結合し得、かつ２４Ｐ４Ｃ１２の機能を調節し得る抗体であり得る。
このラベルは、容器上にあるか、または容器に添えられ得る。このラベルを形成する文字、番号または他の特徴が容器自体に形成されているかまたはエッチングされている場合、ラベルは、容器上にあり得；それがこの容器をまた保持する容器（ｒｅｃｅｐｔａｃｌｅ）またはキャリアの中に存在する場合（例えば、パッケージ挿入物）、ラベルは、容器に添えられ得る。このラベルは、この組成物が、ある状態（例えば、表Ｉに示す組織の新形成）を診断、処置、予防または予後診断するために用いられることを示し得る。製造の物品は、さらに、第二の容器を備え得、この第二の容器は、薬学的に受容可能な緩衝液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水、リンガー溶液、および／またはデキストロース溶液）を含む。その容器は、商業的立場および使用者の立場から所望される他の物質（他の緩衝液、希釈液、ろ紙、攪拌子、針、シリンジ、ならびに／または指示を有するパッケージ挿入物および／もしくは使用のための指示書が挙げられる）さらに備える。
本発明の種々の局面を、以下の複数の実施例によりさらに記載および例証する。これらの実施例のいずれも、本発明の範囲に限定することを意図しない。
（実施例１：２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子のｃＤＮＡフラグメントのＳＳＨにより得られる単離）
抑制サブトラクティブハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）を使用して、前立腺癌において差次的に発現され得る遺伝子に対応するｃＤＮＡを同定する。このＳＳＨ反応は、ＬＡＰＣ−９ ＡＤ前立腺癌異種移植物に由来するｃＤＮＡを利用した。この２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子を、ＬＡＰＣ−９ ＡＤマウス−前立腺過形成実験から誘導した。
１６０ｂｐの２４Ｐ４Ｃ１２ ＳＳＨ ｃＤＮＡを、図１に挙げる。この全長２４Ｐ４Ｃ１２ ｃＤＮＡおよびＯＲＦを、図３に挙げたこのタンパク質配列と共に図２に記載する。
（材料および方法）
（ヒト組織）
患者の癌組織および正常組織を、異なる供給源（例えばＮＤＲＩ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡ））から購入した。いくつかの正常組織についてのｍＲＮＡを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡから購入した。
（ＲＮＡの単離）
組織を、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）中で、１０ｍｌ／ｇの組織単離物をホモジナイズして、総ＲＮＡを単離した。ポリＡ ＲＮＡを、ＱｉａｇｅｎのＯｌｉｇｏｔｅｘ ｍＲＮＡ ＭｉｎｉおよびＭｉｄｉキットを使用して、総ＲＮＡから精製した。総ＲＮＡおよびｍＲＮＡを、分光光度分析（Ｏ．Ｄ．２６０／２８０ｎｍ）によって定量し、そしてゲル電気泳動によって分析した。
（オリゴヌクレオチド）
以下のＨＰＬＣ精製したオリゴヌクレオチドを、使用した。
（ＤＰＮＣＤＮ（ｃＤＮＡ合成プライマー））
５’ＴＴＴＴＧＡＴＣＡＡＧＣＴＴ３０３’（配列番号３３）
（アダプター１）
５’ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＧ３’（配列番号３４）
３’ＧＧＣＣＣＧＴＣＣＴＡＧ５’（配列番号３５）
（アダプター２）
５’ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＣＧＣＧＧＣＣＧＡＧ３’（配列番号３６）
３’ＣＧＧＣＴＣＣＴＡＧ５’（配列番号３７）
（ＰＣＲプライマー１）
５’ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ３’（配列番号３８）
（ネステッドプライマー（ＮＰ）１）
５’ＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＧＧＡ３’（配列番号３９）
（ネステッドプライマー（ＮＰ）２）
５’ＡＧＣＧＴＧＧＴＣＧＣＧＧＣＣＧＡＧＧＡ３’（配列番号４０）
（抑制サブトラクティブハイブリダイゼーション）
抑制サブトラクティブハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）を使用して、前立腺癌において差次的に発現し得る遺伝子に対応するｃＤＮＡを同定した。このＳＳＨ反応は、前立腺癌組織および正常組織に由来するｃＤＮＡを利用した。
２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子の配列は、ＬＡＰＣ−４ＡＤ前立腺癌異種移植片−良性前立腺過形成のｃＤＮＡサブトラクションから誘導した。このＳＳＨのｃＤＮＡ配列（図１）を、同定した。
正常組織および良性前立腺増殖症のプールに由来するｃＤＮＡを、「ドライバー」ｃＤＮＡの供給源として使用し、一方ＬＡＰＣ−４ＡＤ異種移植に由来するｃＤＮＡを、「テスター」ｃＤＮＡの供給源として使用した。テスターｃＤＮＡに対応する二本鎖ｃＤＮＡおよびドライバーｃＤＮＡに対応する二本鎖ｃＤＮＡを、上に記載したような、関連する異種移植組織から、ＣＬＯＮＴＥＣＨのＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ ｃＤＮＡ Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して単離した２μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡおよびプライマーとして１ｎｇのオリゴヌクレオチドＤＰＮＣＤＮから合成した。第１鎖合成および第２鎖合成を、キットの使用者マニュアルプロトコル（ＣＬＯＮＴＥＣＨプロトコル番号ＰＴ１１１７−１、カタログ番号Ｋ１８０４−１）に記載されるようにして行った。得られたｃＤＮＡを、３７℃で３時間、ＤｐｎＩＩで消化した。消化されたｃＤＮＡを、フェノール／クロロホルム（１：１）で抽出し、そしてエタノールで沈殿させた。
ドライバーのｃＤＮＡを、１：１の比率で、関連する組織供給源（上を参照）に由来するＤｐｎＩＩで消化したｃＤＮＡと、９つの正常組織（胃、骨格筋、肺、脳、肝臓、腎臓、脾臓、小腸、および心臓）に由来する消化したｃＤＮＡの混合物とを組み合わせることにより作製した。
関連の組織供給源（上記を参照のこと）（４００ｎｇ）由来の、ＤｐｎＩＩで消化したｃＤＮＡ（１μｌ）を、５μｌの水中に希釈することによって、テスターｃＤＮＡを作製した。次いで、この希釈したｃＤＮＡ（２μｌ、１６０ｎｇ）を、４００ｕのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を使用して、別個のライゲーション反応で、１０μｌの全容量で、１６℃で一晩、２μｌのＡｄａｐｔｏｒ １およびＡｄａｐｔｏｒ ２（１０μＭ）にライゲーションした。１μｌの０．２Ｍ ＥＤＴＡを用いて、７２℃で５分間加熱して、ライゲーションを終了させた。
第１のハイブリダイゼーションを、ドライバーｃＤＮＡ（１．５μｌ、６００ｎｇ）を、１．５μｌ（２０ｎｇ）のＡｄａｐｔｏｒ １連結テスターｃＤＮＡおよびＡｄａｐｔｏｒ ２連結テスターｃＤＮＡを含む２つのチューブのそれぞれに添加することによって実施した。４μｌの最終容量で、これらのサンプルを鉱油で覆い、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈサーマルサイクラーで、９８℃で１．５分間変性し、次いで６８℃で８時間ハイブリダイズさせた。次いで、２つのハイブリダイゼーション産物を、追加の新たな変性ドライバーｃＤＮＡ（１μｌ）と混合し、そして６８℃で一晩ハイブリダイズさせた。次いで、この第２のハイブリダイゼーション産物を、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ（２００μｌ）中で希釈し、７０℃で７分間加熱し、そして−２０℃で貯蔵した。
（ＳＳＨから作製した遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅、クローニングおよび配列決定）
ＳＳＨ反応から得られた遺伝子フラグメントを増幅するために、２回のＰＣＲ増幅を行った。第１のＰＣＲ反応において、希釈した最終ハイブリダイゼーション混合物（１μｌ）を、１μｌのＰＣＲプライマー１（１０μＭ）、０．５μｌのｄＮＴＰ混合物（１０μＭ）、２．５μｌの１０×反応緩衝液（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）および０．５μｌの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ ｃＤＮＡポリメラーゼ混合物（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）に、最終容量２５μｌで添加した。ＰＣＲ１を、以下の条件を使用して実施した：７５℃で５分間、９４℃で２５秒間、次いで２７サイクルの９４℃で１０秒間、６６℃で３０秒間、７２℃で１．５分間。５つの別個の第１のＰＣＲ反応を、各実験について実施した。その生成物をプールし、そして水で１：１０に希釈した。第二のＰＣＲ反応のために、プールしたものから１μｌおよび希釈した最初のＰＣＲ反応物を、プライマーＮＰ１およびＮＰ２（１０μＭ）をＰＣＲ１プライマーの代わりに使用することを除いて、ＰＣＲ１に使用したとのと同一の反応混合物へ添加した。ＰＣＲ２を、１０〜１２サイクルの９４℃で１０秒間、６８℃で３０秒間および７２℃で１．５分間を使用して実施した。このＰＣＲ生成物を、２％アガロースゲル電気泳動を使用して分析した。
このＰＣＲ生成物を、Ｔ／Ａベクタークローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ｐＣＲ２．１に挿入した。形質転換したＥ．ｃｏｌｉを、青／白選別およびアンピシリン選別に供した。白色コロニーを、選択して採取し、そして９６ウェルプレートに配置し、そして液体培養液中で一晩増殖させた。挿入物を同定するために、ＰＣＲ増幅を、ＰＣＲ１の条件を使用し、ＮＰ１およびＮＰ２をプライマーとして使用して、細菌培養液１μｌについて実施した。ＰＣＲ生成物を、２％アガロースゲル電気泳動を使用して分析した。
細菌クローンを、９６ウェル様式で、２０％グリセロール中で貯蔵した。プラスミドＤＮＡを、調製し、配列を決定し、そしてＧｅｎＢａｎｋデータベース、ｄＢｅｓｔデータベース、およびＮＣＩ−ＣＧＡＰデータベースの核酸相同性検索にかけた。
（ＲＴ−ＰＣＲの発現分析）
Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎシステムを使用するオリゴ（ｄＴ）１２−１８のプライミングを用いて、第１の鎖ｃＤＮＡを、１μｇのｍＲＮＡから作製し得る。逆転写酵素と共に４２℃で５０分間インキュベートし、次いで、３７℃で２０分間、ＲＮＡｓｅ Ｈ処理を行うことを含む製造者のプロトコルを使用した。この反応が完了した後、その容量を、正規化の前に、水で２００μｌまで増やし得た。１６の異なる正常なヒト組織由来の第１の鎖ｃＤＮＡを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手し得る。
複数の組織由来の第１の鎖ｃＤＮＡの正規化を、プライマー５’ａｔａｔｃｇｃｃｇｃｇｃｔｃｇｔｃｇｔｃｇａｃａａ３’（配列番号４１）および５’ａｇｃｃａｃａｃｇｃａｇｃｔｃａｔｔｇｔａｇａａｇｇ ３’（配列番号４２）を使用して、β−アクチンを増幅することにより、実施した。第１の鎖ｃＤＮＡ（５μｌ）を、５０μｌの総容量（０．４μＭのプライマー、各々０．２μＭのｄＮＴＰ、１×ＰＣＲ緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ８．３）および１×Ｋｌｅｎｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含む）で増幅した。５μｌのＰＣＲ反応物を、１８サイクル、２０サイクルおよび２２サイクルで取り出し、そしてアガロースゲル電気泳動に使用し得る。ＰＣＲを、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈサーマルサイクラーを使用して、以下の条件下で実施した：最初の変性工程が、９４℃で１５秒間、続いて、１８サイクル、２０サイクルおよび２２サイクルの９４℃で１５分間、６５℃で２分間、７２℃で５秒間であり得る。７２℃での最後の伸長工程を、２分間行った。アガロースゲル電気泳動の後、複数の組織由来の２８３ｂ．ｐ．のβ−アクチンのバンドのバンド強度を、目視検査により比較した。第１の鎖ｃＤＮＡの希釈率を、計算して、２２サイクルのＰＣＲ後に、全ての組織において等しいβ−アクチンバンド強度を得た。２２サイクルのＰＣＲ後に、全ての組織において等しいバンド強度を達成するために、３回の正規化が必要であり得る。
２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子の発現レベルを決定するために、５μｌの正規化した第１の鎖ｃＤＮＡを、２６サイクルおよび３０サイクルの増幅を使用するＰＣＲによって分析した。半定量的発現分析を、軽いバンド強度を与えるサイクル数において、ＰＣＲ産物を比較することによって達成し得る。ＲＴ−ＰＣＲに使用するプライマーを、２４Ｐ４Ｃ１２ ＳＳＨ配列を使用して設計した。それを以下に挙げる：
（２４Ｐ４Ｃ１２．１）
５’−ＡＧＡＴＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＡＡＡＧＧＴＧ−３’（配列番号４３）
（２４Ｐ４Ｃ１２．２）
５’−ＡＣＴＧＣＴＧＧＧＡＧＧＡＧＴＡＣＣＧＡＧＴＧ−３’（配列番号４４）
（実施例２：全長２４Ｐ４Ｃ１２をコードするｃＤＮＡの単離）
２４Ｐ４Ｃ１２ ＳＳＨ ｃＤＮＡの配列は、ＬＡＰＣ−４ＡＤ異種移植片から良性前立腺過形成症を差し引いたものよりなるサブトラクションから誘導した。このＳＳＨ ｃＤＮＡの配列（図１）を、２４Ｐ４Ｃ１２と命名した。
１６０ｂｐの単離した遺伝子フラグメントは、５３アミノ酸の推定されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードし、そして結腸癌のライブラリーに由来するＥＳＴに対し顕著な相同性を示す。より大きな二つのｃＤＮＡクローンを、遺伝子トラッパー実験により得た（ＧＴＥ９およびＧＴＦ８）。このＯＲＦは、マウスのＮＧ２２遺伝子およびＣ．ｅｌｅｇａｎｓのＣＥＥＳＢ８２Ｆ遺伝子に対する顕著な相同性を示した。ＮＧ２２は近年、ゲノムＢＡＣクローン内の多数のＯＲＦの内の一つとして同定された。このゲノムＢＡＣクローンは、マウスのゲノムにおけるＭＨＣクラスＩＩＩを含む。ＮＧ２２およびＣＥＥＳＢ８２Ｆの両者は、１２個の膜貫通ドメインを含む遺伝子であるようである。これは、２４Ｐ４Ｃ１２をコードする遺伝子が、１２個の膜貫通ドメインを含み、そしてマウスのＮＧ２２およびＣ．ｅｌｅｇａｎｓのＣＥＥＳＢ８２Ｆのヒトホモログであることを示唆する。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおける機能的研究が、これらホモログの生物学的な役割を示し得る。２４Ｐ４Ｃ１２が、細胞表面マーカーである場合、前立腺癌における潜在的な画像化剤および／または治療的標的としての用途を有し得る。
２５８７ｂｐの２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．１は、７１０アミノ酸のタンパク質をコードする（図２および図３）。２４Ｐ４Ｃ１２の他の改変体をまた、同定した。これらを図２および図３に列挙する。２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．１タンパク質、２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．２タンパク質、２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．３タンパク質、２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．５タンパク質、２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．６タンパク質は、７１０アミノ酸の長さであり、図１１に示すように一アミノ酸だけ互いと異なる。２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．２および２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．４は、２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．１と同一のタンパク質をコードする。２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．７、２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．８および２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．９は、選択的スプライス改変体でありかつそれぞれ５９８アミノ酸、７２２アミノ酸および７１２アミノ酸の長さのタンパク質をコードする。
（実施例３：２４Ｐ４Ｃ１２の染色体マッピング）
染色体の位置決定は、疾患の病因に遺伝子を関連付け得る。いくつかの染色体マッピングアプローチが利用可能であり、これには、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ヒト／ハムスター放射線ハイブリッド（ＲＨ）パネル（Ｗａｌｔｅｒら、１９９４；Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：２２；Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ ＡＩ）、ヒト−げっ歯類体細胞ハイブリッドパネル（例えば、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃａｍｄｅｎ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）から入手可能なようなもの）、および配列決定されそしてマッピングされたゲノムクローンに対するＢＬＡＳＴ相同性を使用するゲノムビュアー（ＮＣＢＩ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）が挙げられる。２４Ｐ４Ｃ１２は、２４Ｐ４Ｃ１２配列およびＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴツール（ワールドワイドウェブ（．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ／ｓｅｑ／ｐａｇｅ．ｃｇｉ？Ｆ＝ＨｓＢｌａｓｔ．ｈｔｍｌ＆＆ＯＲＧ＝Ｈｓ）にある）を使用して、染色体６ｑ２１．３にマッピングされる。
（実施例４：２４Ｐ４Ｃ１２の発現分析）
ＲＴ−ＰＣＲによる発現分析は、２４Ｐ４Ｃ１２が、前立腺癌患者および卵巣癌患者の標本において強く発現することを示した（図１４）。第１の鎖ｃＤＮＡを、生体プール１（腎臓、肝臓および肺）、生体プール２（結腸、脾臓および胃）、前立腺癌異種移植片のプール（ＬＡＰＣ−４ＡＤ、ＬＡＰＣ−４ＡＩ、ＬＡＰＣ−９ＡＤおよびＬＡＰＣ−９ＡＩ）、前立腺癌のプール、膀胱癌のプール、腎臓癌のプール、結腸癌のプール、卵巣癌のプール、乳癌のプール、ならびに癌転移のプールから作製した。正規化をアクチンに対するプライマーを使用するＰＣＲによって、実施した。２４Ｐ４Ｃ１２に対するプライマーを使用する半定量的ＰＣＲを、２６サイクルおよび３０サイクルの増幅で行った。結果は、前立腺癌のプールおよび卵巣癌のプールにおいて２４Ｐ４Ｃ１２の強い発現を示す。発現を、前立腺癌異種移植片、膀胱癌のプール、腎臓癌のプール、結腸癌のプール、乳癌のプール、癌転移のプール、生体プール１ならびに生体プール２においても検出した。
複数のヒト正常組織における２４Ｐ４Ｃ１２の広範なノーザンブロット分析を、図１５に示す。共に１レーンあたり２μｇのｍＲＮＡを用いる二つの複数組織ノーザンブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、２４Ｐ４Ｃ１２のＳＳＨの配列を用いてプロービングした。２４Ｐ４Ｃ１２の発現を、前立腺、腎臓、および結腸において検出した。より低い発現を、試験した１６個の全ての正常組織の内の膵臓、肺、および胎盤において検出した。
２４Ｐ４Ｃ１２の発現を、前立腺異種移植片および細胞株において試験した。ＲＮＡを、細胞株ならびに前立腺癌異種移植片群（ＰｒＥＣ，ＬＡＰＣ−４ＡＤ，ＬＡＰＣ−４ＡＩ，ＬＡＰＣ−９ＡＤ，ＬＡＰＣ−９ＡＩ，ＬＮＣａＰ，ＰＣ−３，ＤＵ１４５，ＴｓｕＰｒ，およびＬＡＰＣ−４ＣＬ）から抽出した。１レーンあたり１０μｇの総ＲＮＡを用いるノーザンブロットを、２４Ｐ４Ｃ１２ ＳＳＨ配列を用いてプロービングした。キロベース（ｋｂ）単位のサイズ標準物を、端に示す。２４Ｐ４Ｃ１２転写物を、ＬＡＰＣ−４ＡＤ，ＬＡＰＣ−４ＡＩ，ＬＡＰＣ−９ＡＤ，ＬＡＰＣ−９ＡＩ，ＬＮＣａＰ，およびＬＡＰＣ−４ ＣＬに検出した。
患者の癌標本およびヒト正常組織における２４Ｐ４Ｃ１２の発現を、図１６に示す。ＲＮＡを、前立腺癌の標本、膀胱癌の標本、結腸癌の標本、卵巣癌の標本、乳癌の標本、および癌転移の標本のプール、ならびに正常前立腺（ＮＰ），正常膀胱（ＮＢ）、正常腎臓（ＮＫ）、および正常結腸（ＮＣ）から抽出した。１レーンあたり１０μｇの総ＲＮＡを用いるノーザンブロットを、２４Ｐ４Ｃ１２ ＳＳＨ配列を用いてプロービングした。キロベース（ｋｂ）単位のサイズ標準物を、端に示す。２４Ｐ４Ｃ１２転写物の強い発現を、患者の癌のプール標本および正常な前立腺において検出したが、試験した他の正常組織においては、検出しなかった。
２４Ｐ４Ｃ１２の発現を、個々の前立腺癌患者の標本においても検出した（図１７）。ＲＮＡを、正常前立腺（Ｎ）、前立腺癌患者の腫瘍（Ｔ）およびその適合する隣接する正常組織（Ｎａｔ）から抽出した。１０μｇの総ＲＮＡを用いたノーザンブロットを、２４Ｐ４Ｃ１２ ＳＳＨフラグメントを用いてプロービングした。キロベース（ｋｂ）単位のサイズ標準物を、端に示す。結果は、正常前立腺および試験した全ての前立腺患者腫瘍における２４Ｐ４Ｃ１２の発現を示す。
結腸癌患者の標本における２４Ｐ４Ｃ１２の発現を、図１８に示す。ＲＮＡを、結腸癌細胞株（ＣＬ：Ｃｏｌｏ ２０５，ＬｏＶｏ，およびＳＫ−ＣＯ−）、正常結腸（Ｎ）、結腸癌患者の腫瘍（Ｔ）ならびにこれらの適合する隣接する正常組織（Ｎａｔ）から抽出した。１０μｇの総ＲＮＡを用いたノーザンブロットを、２４Ｐ４Ｃ１２ ＳＳＨフラグメントを用いてプロービングした。キロベース（ｋｂ）単位あたりの標準物を、端に示す。結果は、正常結腸および調べた全ての結腸患者腫瘍において２４Ｐ４Ｃ１２の発現を示した。発現を、細胞株Ｃｏｌｏ ２０５およびＳＫ−ＣＯ−において検出したが、ＬｏＶｏにおいては検出しなかった。
図２０は、肺癌患者の標本における２４Ｐ４Ｃ１２の結果を示す。ＲＮＡを、肺癌細胞株（ＣＬ：ＣＡＬＵ−１，Ａ４２７，ＮＣＩ−Ｈ８２，ＮＣＩ−Ｈ１４６）、正常肺（Ｎ）、肺癌患者の腫瘍（Ｔ）ならびにこれらの適合する隣接する正常組織（Ｎａｔ）から抽出した。１０μｇの総ＲＮＡを用いたノーザンブロットを、２４Ｐ４Ｃ１２ ＳＳＨフラグメントを用いて精査した。キロベース（ｋｂ）単位の標準物を、端に示す。結果は、試験した肺患者腫瘍において２４Ｐ４Ｃ１２の発現を示したが、正常肺においては発現を示さなかった。発現を、ＣＡＬＵ−１においても検出したが、他の細胞株（Ａ４２７，ＮＯＩ−Ｈ８２，およびＮＣＩ−Ｈ１４６）においては検出しなかった。
２４Ｐ４Ｃ１２を、ＲＮＡドットブロットにおいて、一群のヒト胃癌および乳癌（Ｔ）ならびにこれらそれぞれの適合する正常組織（Ｎ）においてアッセイした。２４Ｐ４Ｃ１２の発現を、胃癌および乳癌において観察した。この発現を、正常隣接組織（疾患組織から単離された）において検出したが、正常組織（健康なドナーから単離した）においては検出しなかった。これは、これらの正常隣接組織が、完全には正常ではなく、そして２４Ｐ４Ｃ１２が、初期腫瘍において発現し得ることを示し得る。
２４Ｐ４Ｃ１２の発現レベルを、一群の患者の癌組織において分析し、定量した。第一の鎖ｃＤＮＡを、一群の卵巣癌患者標本（Ａ）、子宮癌患者標本（Ｂ）、前立腺癌標本（Ｃ）、膀胱癌患者標本（Ｄ）、肺癌患者標本（Ｅ）、膵臓癌患者標本（Ｆ）、結腸癌標本（Ｇ）、および腎臓癌標本（Ｈ）から調製した。正規化を、アクチンに対するプライマーを使用するＰＣＲによって実施した。２４Ｐ４Ｃ１２に対するプライマーを使用する半定量的ＰＣＲを、２６サイクルおよび３０サイクルの増幅で行った。サンプルをアガロースゲル上で電気泳動し、そしてＰＣＲ産物を、Ａｌｐｈａｌｍａｇｅｒソフトウェアを使用して定量化した。発現を、非存在、低い、中程度、または強いとして記録した。結果は、試験した患者癌標本の大部分において２４Ｐ４Ｃ１２の発現を示し、７３．３％の卵巣癌患者標本、８３．３％の子宮癌患者標本、９５．０％の前立腺癌標本、６１．１％の膀胱癌患者標本、８０．６％の肺癌患者標本、８７．５％の脾臓癌患者標本、８７．５％の結腸癌標本、６８．４％の明細胞腎癌、１００％の乳頭状腎臓細胞癌において、２４Ｐ４Ｃ１２の発現を示す。
正常組織における２４Ｐ４Ｃ１２の制限された発現、ならびに前立腺癌、卵巣癌、膀胱癌、結腸癌、肺癌、膵臓癌、子宮癌、腎臓癌、胃癌および乳房癌において検出される発現は、２４Ｐ４Ｃ１２が、ヒト癌についての潜在的な治療標的および診断マーカーであることを示唆する。
（実施例５：２４Ｐ４Ｃ１２の転写改変体）
転写改変体は、選択的転写または選択的スプライシングにより生じる同一遺伝子からの成熟ｍＲＮＡの改変体である。選択的転写産物は、同一遺伝子からの転写産物であるが、異なる点で転写を開始する。スプライシング改変体は、同一転写産物から差示的にスプライシングされたｍＲＮＡ改変体である。真核生物において、複数のエキソンを有する遺伝子（ｍｕｌｔｉ−ｅｘｏｎ ｇｅｎｅ）が、ゲノムＤＮＡから転写される場合、最初のＲＮＡがスプライシングされて、エキソンのみを有しかつアミノ酸配列への翻訳に使用される機能的ｍＲＮＡを産生する。従って、所定の遺伝子は、０個〜多くの選択的転写産物を有し得、そして各転写産物は、０個〜多くのスプライシング改変体を有し得る。各転写改変体は、独特のエキソン構成（ｍａｋｅｕｐ）を有し、そしてオリジナルの転写産物由来の異なるコード部分および／または非コード部分（５’末端または３’末端）を有し得る。転写改変体は、同一または同様の機能を有する同様または異なるタンパク質をコードしても、異なる機能を有するタンパク質をコードしてもよく、そして同一の時点で同一組織に発現しても、同一の時点で異なる組織に発現しても、異なる時点で同一の組織に発現しても、異なる時点で異なる組織に発現してもよい。転写改変体によりコードされるタンパク質は、同様または異なる細胞内局在または細胞外局在（例えば、分泌型対細胞内）を有し得る。
転写改変体は、当該分野において受容された種々の方法によって同定される。例えば、選択的転写産物およびスプライシング改変体は、全長クローニング実験によって、または全長転写産物およびＥＳＴ配列の使用によって、同定される。第１に、全てのヒトＥＳＴを、互いと直接的または間接的に同一性を示すクラスターにグループ化した。第２に、同一クラスター中のＥＳＴをさらに、サブクラスターにグループ化し、そしてコンセンサス配列に集合させた。オリジナルの遺伝子配列を、コンセンサス配列または他の全長配列と比較する。各コンセンサス配列は、その遺伝子についての潜在的なスプライシング改変体である。全長クローンではない改変体が同定された場合でさえ、その改変体のその部分は、当該分野において公知の技術を使用する抗原生成および全長スプライシング改変体のさらなるクローニングに非常に有用である。
さらに、ゲノム配列に基づいて転写改変体を同定するコンピュータープログラムが当該分野において利用可能である。ゲノムベースの転写改変体同定プログラムとしては、ＦｇｅｎｅｓＨ（Ａ．ＳａｌａｍｏｖおよびＶ．Ｓｏｌｏｖｙｅｖ，「Ａｂ ｉｎｉｔｉｏ ｇｅｎｅ ｆｉｎｄｉｎｇ ｉｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ，」Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０００ Ａｐｒｉｌ；１０（４）：５１６−２２）；Ｇｒａｉｌ（ＵＲＬ ｃｏｍｐｂｉｏ．ｏｍｌ．ｇｏｖ／Ｇｒａｉｌ−ｂｉｎ／ＥｍｐｔｙＧｒａｉｌＦｏｒｍ）およびＧｅｎＳｃａｎ（ＵＲＬ ｇｅｎｅｓ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ＧＥＮＳＣＡＮ．ｈｔｍｌ）が挙げられる。スプライシング改変体同定プロトコルの一般的議論については、例えば、以下を参照のこと：Ｓｏｕｔｈａｎ，Ｃ．，Ａ ｇｅｎｏｍｉｃ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２００１ Ｊｕｎ ８；４９８（２−３）：２１４−８；ｄｅ Ｓｏｕｚａ，Ｓ．Ｊ．ら，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ２２ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗｉｔｈ ＯＲＦ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０００ Ｎｏｖ ７；９７（２３）：１２６９０−３。
転写改変体のパラメーターをさらに確認するために、種々の技術（例えば、全長クローニング、プロテオーム確認（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）、ＰＣＲベースの確認、および５’ＲＡＣＥ確認など）が当該分野において利用可能である（例えば、プロテオーム確認：Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｓ．Ｏ．ら，Ａｌｂｕｍｉｎ ｂａｎｋｓ ｐｅｎｉｎｓｕｌａ：ａ ｎｅｗ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｖａｒｉａｎｔ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９９９ Ａｕｇ １７；１４３３（１−２）：３２１−６；Ｆｅｒｒａｎｔｉ Ｐら，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｏｆ ｐｒｅ−ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｍａｔｕｒｅ ｃａｐｒｉｎｅ ａｌｐｈａ（ｓ１）−ｃａｓｅｉｎ，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９７ Ｏｃｔ １；２４９（１）：１〜７を、ＰＣＲベースの確認については：Ｗｅｌｌｍａｎｎ Ｓら，Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ＰＣＲ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ） ｓｐｌｉｃｅ ｖａｒｉａｎｔｓ ｂｙ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．２００１ Ａｐｒ；４７（４）：６５４−６０；Ｊｉａ，Ｈ．Ｐ．ら，Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｎｅｗ ｈｕｍａｎ ｂｅｔａ−ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｇｅｎｏｍｉｃｓ−ｂａｓｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｇｅｎｅ．２００１ Ｊａｎ ２４；２６３（１−２）：２１１〜８を、ＰＣＲベースの確認および５’ＲＡＣＥ確認については：Ｂｒｉｇｌｅ，Ｋ．Ｅ．ら，Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ ｒｅｄｕｃｅｄ ｆｏｌａｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｒｉａｎｔ ｓｐｌｉｃｅ ｆｏｒｍｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９９７ Ａｕｇ ７；１３５３（２）：１９１−８を参照のこと）。
ゲノム領域が癌において調節されることは、当該分野において公知である。遺伝子がマッピングされるゲノム領域が特定の癌において調節される場合、その遺伝子の選択的な転写産物またはスプライシング改変体もまた調節される。２４Ｐ４Ｃ１２は癌に関連する特定の発現プロフィールを有するということが、本明細書中に開示される。２４Ｐ４Ｃ１２の選択的な転写産物およびスプライシング改変体はまた、同一または異なる組織における癌に関与し得、従って腫瘍関連マーカー／抗原として役立つ。
オリジナルの転写産物のエキソン組成物（２４Ｐ４Ｃ１２ｖ．１と指名する）を、表Ｌ１に示す。全長遺伝子およびＥＳＴ配列を使用して、３つの転写改変体が、同定され、２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．７、２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．８、および２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．９と名付けられた。２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．１と比較して、転写改変体２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．７は、図１２に示すように、改変体２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．１から、エキソン１０およびエキソン１１がスプライシングした。改変体２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．８は、改変体２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．１の位置１９３１と１９３２との間に３６ｂｐを挿入し、そして改変体２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．９は、改変体２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．１のセグメント１１３６〜１１６３を３６ｂｐと置換した。理論的には、空間的順序において、エキソンの各々の異なる組合せ（例えば、エキソン２およびエキソン３）は、潜在的なスプライシング改変体である。図１２は、４つの転写物改変体のエキソンの模式的なアライメントを示す。
表ＬＩＩ〜ＬＸＩＩＩは、改変体ごとに示される。表ＬＩＩ、表ＬＶＩおよび表ＬＸは、転写改変体のヌクレオチド配列を示す。表ＬＩＩＩ、表ＬＶＩＩおよび表ＬＸＩは、転写改変体と２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．１の核酸配列とのアライメントを示す。表ＬＩＶ、表ＬＶＩＩＩおよび表ＬＶＸＩＩは、同定されたリーディングフレーム方向について転写改変体のアミノ酸翻訳を説明する。表ＬＶ、表ＬＩＸおよび表ＬＶＩＩＩは、スプライシング改変体によってコードされるアミノ酸配列と２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．１のアミノ酸配列とのアライメントを示す。
（実施例６：２４Ｐ４Ｃ１２の単一ヌクレオチド多型）
単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は、ヌクレオチド配列中の任意の所定の位置での単一塩基対改変である。ゲノムの特定の点で、可能性のある４つのヌクレオチド塩基対（Ａ／Ｔ、Ｃ／Ｇ、Ｇ／ＣおよびＴ／Ａ）が存在する。遺伝子型とは、個体のゲノム中の１つ以上の位置の特定の塩基対配列をいう。ハプロタイプとは、しばしば、１つの遺伝子の文脈またはいくつかの密接に連結する遺伝子の文脈で、同一のＤＮＡ分子（または高等生物における同一の染色体）上の１つより多い位置の塩基対配列をいう。ｃＤＮＡ上に生じるＳＮＰは、ｃＳＮＰと呼ばれる。これらのｃＳＮＰは、その遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸を変化し得、従ってそのタンパク質の機能を変化し得る。いくつかのＳＮＰは、遺伝的疾患を生じ、他は、個体間の表現型および環境因子（食餌および薬物を含む）に対する応答における定量的バリエーションに寄与する。従って、ＳＮＰおよび／または対立遺伝子の組合わせ（ハプロタイプと呼ばれる）は、多くの適用（遺伝的疾患の診断、薬物反応および投薬量の決定、疾患の原因である遺伝子の同定、および個体間での遺伝的関係の分析を含む）を有する（Ｐ．Ｎｏｗｏｔｎｙ，Ｊ．Ｍ．ＫｗｏｎおよびＡ．Ｍ．Ｇｏａｔｅ，「ＳＮＰ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏ ｄｉｓｓｅｃｔ ｈｕｍａｎ ｔｒａｉｔｓ」Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２００１ Ｏｃｔ；１１（５）：６３７−６４１；Ｍ．ＰｉｒｍｏｈａｍｅｄおよびＢ．Ｋ．Ｐａｒｋ，「Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ａｄｖｅｒｓｅ ｄｒｕｇ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ」Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２００１ Ｊｕｎ；２２（６）：２９８−３０５；Ｊ．Ｈ．Ｒｉｌｅｙ，Ｃ．Ｊ．Ａｌｌａｎ，Ｅ．ＬａｉおよびＡ．Ｒｏｓｅｓ，「Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｉｎ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ ｇｅｎｅｓ」Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０００ Ｆｅｂ；１（１）：３９−４７；Ｒ．Ｊｕｄｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．ＳｔｅｐｈｅｎｓおよびＡ．Ｗｉｎｄｅｍｕｔｈ，「Ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｐｏｗｅｒ ｏｆ ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ」Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０００ ｆｅｂ；１（１）： １５−２６）。
ＳＮＰは、当該分野において受容された種々の方法によって同定される（Ｐ．Ｂｅａｎ，「Ｔｈｅ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ｖｏｙａｇｅ ｏｆ ＳＮＰ ｔａｒｇｅｔ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」Ａｍ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．２００１ Ｏｃｔ−Ｎｏｖ；２０（９）：１８−２０；Ｋ．Ｍ．Ｗｅｉｓｓ，「Ｉｎ ｓｅａｒｃｈ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｖａｒｉａｔｉｏｎ」Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１９９８ Ｊｕｌ；８（７）：６９１−６９７：Ｍ．Ｍ．Ｓｈｅ，「Ｅｎａｂｌｉｎｇ ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ｂｙ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ」Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２００１ Ｆｅｂ；４７（２）：１６４−１７２）。例えば、ＳＮＰは、ゲルベースの方法（例えば、制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）および変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ））によって多型を示すＤＮＡフラグメントを配列決定することによって同定される。これらはまた、異なる個体からプールされたＤＮＡサンプルの直接配列決定によってか、または異なるＤＮＡサンプルからの配列を比較することによって、見出され得る。公的データベースおよび私的データベースにおける配列データの迅速な蓄積を用いて、コンピュータープログラム（Ｚ．Ｇｕ，Ｌ．ＨｉｌｌｉｅｒおよびＰ．Ｙ．Ｋｗｏｋ，「Ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｈｕｎｔｉｎｇ ｉｎ ｃｙｂｅｒｓｐａｃｅ」Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．１９９８；１２（４）：２２１−２２５）を使用して配列を比較することによって、ＳＮＰが見出され得る。ＳＮＰが確認され得、そして個体の遺伝型またはハプロタイプは、直接配列決定およびハイスループットマイクロアレイを含む種々の方法によって決定され得る（Ｐ．Ｙ．Ｋｗｏｋ，「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ」Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２００１；２：２３５−２５８；Ｍ．Ｋｏｋｏｒｉｓ，Ｋ．Ｄｉｘ，Ｋ．Ｍｏｙｎｉｈａｎ，Ｊ．Ｍａｔｈｉｓ，Ｂ．Ｅｒｗｉｎ，Ｐ．Ｇｒａｓｓ，Ｂ．ＨｉｎｅｓおよびＡ．Ｄｕｅｓｔｅｒｈｏｅｆｔ，「Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ＳＮＰ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｍａｓｓｃｏｄｅ ｓｙｓｔｅｍ」Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．２０００ Ｄｅｃ；５（４）：３２９−３４０）。上記の方法を使用して、５つのＳＮＰを、元の転写物２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．１において、位置５４２（Ｇ／Ａ）、５６４（Ｇ／Ａ）、８１８（Ｃ／Ｔ）、９８１（Ａ／Ｇ）および１３１２（Ａ／Ｃ）において同定した。代替的対立遺伝子を有する転写物またはタンパク質は、それぞれ、２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．２、２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．３、２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．４、２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．５および２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．６として指名した。図１０は、ＳＮＰ改変体の概略的アライメントを示す。図１１は、ヌクレオチド改変体に対応する、タンパク質改変体の概略的アライメントを示す。改変体１と同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列改変体は、図１１に示されない。ここでは、別に示されているが、ＳＮＰのこれらの対立遺伝子は、異なる組合せ（ハプト型）で、そして転写改変体のいずれか１つ（例えば、２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．７）（ＳＮＰの配列の内容を含む）で、生じ得る。
（実施例７：原核生物系における組換え２４Ｐ４Ｃ１２改変体の産生）
原核生物細胞において組換え２４Ｐ４Ｃ１２および２４Ｐ４Ｃ１２改変体を発現させるために、全長または部分長の２４Ｐ４Ｃ１２ ｃＤＮＡ配列および２４Ｐ４Ｃ１２改変体ｃＤＮＡ配列を、当該分野において公知の種々の発現ベクターのいずれか１つ中にクローニングする。全長ｃＤＮＡ、あるいは２４Ｐ４Ｃ１２、その改変体もしくはアナログ由来の任意の８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、またはそれより多く連続するアミノ酸を、使用する。
（Ａ．インビトロ転写構築物およびインビトロ翻訳構築物）
ｐＣＲＩＩ：ＲＮＡインサイチュ研究のための２４Ｐ４Ｃ１２センスＲＮＡプローブおよび２４Ｐ４Ｃ１２アンチセンスＲＮＡプローブを作製するために、ｐＣＲＩＩ構築物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）を作製する（これは、２４Ｐ４Ｃ１２ ｃＤＮＡの全体またはフラグメントのいずれかをコードする）。ｐＣＲＩＩベクターは、ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション実験におけるプローブとして使用するための２４Ｐ４Ｃ１２ ＲＮＡの転写を駆動するために、挿入物に隣接するＳｐ６プロモーターおよびＴ７プロモーターを有する。これらのプローブは、ＲＮＡレベルでの２４Ｐ４Ｃ１２の細胞発現および組織発現を分析するために用いられる。２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子のｃＤＮＡアミノ酸コード領域を表す、転写された２４Ｐ４Ｃ１２ ＲＮＡを、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質を合成するためにＴｎＴＴＭ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のようなインビトロで翻訳系において用いる。
（Ｂ．細菌構築物）
ｐＧＥＸ構築物：細菌において組換え２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質（これは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タンパク質に融合される）を産生するために、２４Ｐ４Ｃ１２ ｃＤＮＡもしくは改変体の全てまたは一部を、ｐＧＥＸファミリーのＧＳＴ−融合ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）中にクローニングする。これらの構築物は、アミノ末端で融合したＧＳＴおよびカルボキシル末端の６つのヒスチジンエピトープ（６×Ｈｉｓ）を有する組換え２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質配列の制御された発現を可能にする。このＧＳＴおよび６×Ｈｉｓタグは、適切なアフィニティーマトリクスを用いる、誘導された細菌からのその組換え融合タンパク質の精製を可能にし、そして抗ＧＳＴ抗体および抗Ｈｉｓ抗体を用いるその融合タンパク質の認識を可能にする。６×Ｈｉｓタグは、例えば、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の３’末端のクローニングプライマーへ６つのヒスチジンコドンを付加することにより作製される。タンパク質切断部位（例えば、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１中のＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎＴＭ認識部位）を、２４Ｐ４Ｃ１２関連タンパク質からのＧＳＴタグの切断を可能にするように使用し得る。アンピシリン耐性遺伝子およびｐＢＲ３２２起点は、Ｅ．ｃｏｌｉ中でのｐＧＥＸプラスミドの選択および維持を可能にする。
ｐＭＡＬ構築物：細菌において、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）に融合される組換え２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質を産生するために、２４Ｐ４Ｃ１２ ｃＤＮＡタンパク質コード配列の全てまたは一部は、ｐＭＡＬ−ｃ２ＸベクターおよびｐＭＡＬ−ｐ２Ｘベクター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）へとクローニングすることによりＭＢＰ遺伝子に融合される。これらの構築物は、アミノ末端で融合したＭＢＰおよびカルボキシル末端の６×Ｈｉｓエピトープタグを有する組換え２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質配列の制御された発現を可能にする。このＭＢＰおよび６×Ｈｉｓタグは、適切なアフィニティーマトリクスを用いる、誘導された細菌からのその組換え融合タンパク質の精製を可能にし、そして抗ＭＢＰ抗体および抗Ｈｉｓ抗体を用いるその融合タンパク質の認識を可能にする。６×Ｈｉｓエピトープタグは、３’クローニングプライマーへの６つのヒスチジンコドンの付加により作製される。Ｘａ因子認識部位は、２４Ｐ４Ｃ１２からのｐＭＡＬタグの切断を可能にする。ｐＭＡＬ−ｃ２ＸベクターおよびｐＭＡＬ−ｐ２Ｘベクターは、それぞれ、細胞質または周辺質において組換えタンパク質を発現するように最適化される。周辺質発現は、ジスルフィド結合を有するタンパク質の折畳みを増大させる。
ｐＥＴ構築物：細菌細胞において２４Ｐ４Ｃ１２を発現させるために、２４Ｐ４Ｃ１２ｃＤＮＡタンパク質コード配列の全てまたは一部は、ｐＥＴファミリーのベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）へとクローニングされる。これらのベクターは、可溶性を増大させるタンパク質（例えば、ＮｕｓＡおよびチオレドキシン（Ｔｒｘ））、および組換えタンパク質の精製および検出を補助するエピトープタグ（例えば、６×ＨｉｓおよびＳ−ＴａｇＴＭ）への融合を用いておよび用いずに、細菌における組換え２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の緊密に制御された発現を可能にする。例えば、構築物を、ｐＥＴ ＮｕｓＡ融合系４３．１を利用して作製して、その結果、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の領域が、ＮｕｓＡへのアミノ末端融合物として発現される。
（Ｃ．酵母構築物）
ｐＥＳＣ構築物：組換えタンパク質の作製および機能の研究のために、酵母種Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて２４Ｐ４Ｃ１２を発現させるために、２４Ｐ４Ｃ１２ ｃＤＮＡタンパク質コード配列の全てまたは一部を、ｐＥＳＣファミリーのベクター（これらの各々は、ＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、およびＵＲＡ３という４つの選択マーカーの内１つを含む）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）中にクローニングする。これらのベクターは同じプラスミドからの、同じ酵母細胞中にＦｌａｇＴＭまたはＭｙｃエピトープタグのいずれかを含む２つまでの異なる遺伝子またはクローニングされた配列の、制御された発現を可能にする。この系は、２４Ｐ４Ｃ１２のタンパク質−タンパク質相互作用を確認するために有用である。さらに、酵母における発現は、真核生物細胞において発現される場合に見出される類似した翻訳後修飾（例えば、グリコシル化およびリン酸化）を生じる。
ｐＥＳＰ構築物：酵母種Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅにおいて２４Ｐ４Ｃ１２を発現させるために、２４Ｐ４Ｃ１２ ｃＤＮＡタンパク質コード配列の全てまたは一部を、ｐＥＳＰファミリーのベクターにクローニングする。これらのベクターは、アミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかにおいて、組換えタンパク質の精製を補助するＧＳＴへ融合される、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質配列の制御された高レベル発現を可能にする。ＦｌａｇＴＭエピトープタグは、抗ＦｌａｇＴＭ抗体を用いる組換えタンパク質の検出を可能にする。
（実施例８：高等真核生物系における組換え２４Ｐ４Ｃ１２の産生）
（Ａ．哺乳動物構築物）
真核生物細胞において組換え２４Ｐ４Ｃ１２を発現させるために、２４Ｐ４Ｃ１２ ｃＤＮＡ配列の全長または部分長を、当該分野で公知の種々の発現ベクターのいずれか１つの中にクローニングし得る。２４Ｐ４Ｃ１２の以下の領域の１つ以上が、これらの構築物において発現される：２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．１〜２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．６に由来するアミノ酸１〜７１０；または任意の８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個以上の連続するアミノ酸；２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．７由来するアミノ酸１〜５９８；または任意の８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個以上の連続するアミノ酸；２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．８に由来するアミノ酸１〜７２２；または任意の８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個以上の連続するアミノ酸；２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．９、改変体、またはその類似体に由来するアミノ酸１〜７１２；または任意の８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個以上連続するアミノ酸。
これらの構築物を、２９３Ｔ細胞のような広範な種々の哺乳動物細胞のいずれか１つの中にトランスフェクトし得る。トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞溶解物を、本明細書中に記載される抗２４Ｐ４Ｃ１２ポリクローナル血清を用いてプロービングし得る。
ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ構築物：哺乳動物細胞において２４Ｐ４Ｃ１２を発現させるために、コンセンサスＫｏｚａｋ翻訳開始部位を有する２４Ｐ４Ｃ１２の、２４Ｐ４Ｃ１２ ＯＲＦまたはその一部を、ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ Ｖｅｒｓｉｏｎ Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中にクローニングした。タンパク質発現は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターから駆動される。この組換えタンパク質は、そのカルボキシル末端に融合されたｍｙｃエピトープおよび６×Ｈｉｓエピトープを有する。ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓベクターはまた、ラージＴ抗原を発現する細胞株におけるエピソーム複製および単純なベクターレスキューのためのＳＶ４０起点と共に、ｍＲＮＡ安定性を増大するための、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列を含む。ネオマイシン耐性遺伝子を用い得る。なぜならば、ネオマイシン耐性遺伝子は、そのタンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１起点は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるそのプラスミドの選択および維持を可能にするからである。図２４は、一過性トランスフェクトした２９３Ｔ細胞におけるｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ構築物からの２４Ｐ４Ｃ１２の発現を示す。
ｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘ構築物：哺乳動物細胞において２４Ｐ４Ｃ１２を発現させるために、２４Ｐ４Ｃ１２の、２４Ｐ４Ｃ１２ ＯＲＦまたはその一部を、ｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘ Ｖｅｒｓｉｏｎ Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中にクローニングする。タンパク質発現は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびＳＰ１６翻訳エンハンサーから駆動される。この組換えタンパク質は、そのアミノ末端に融合されたＸｐｒｅｓｓＴＭおよび６×Ｈｉｓエピトープを有する。ｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘベクターはまた、ラージＴ抗原を発現する細胞株におけるエピソーム複製および単純なベクターレスキューのためのＳＶ４０起点と共に、ｍＲＮＡ安定性を増大するための、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列を含む。ゼオシン耐性遺伝子は、そのタンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１起点は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるそのプラスミドの選択および維持を可能にする。
ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯ構築物：哺乳動物細胞において２４Ｐ４Ｃ１２を発現させるために、そして蛍光を用いるその組換えタンパク質の検出を可能にするために、コンセンサスＫｏｚａｋ翻訳開始部位を有する２４Ｐ４Ｃ１２のＯＲＦ、またはその一部を、ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）へクローニングする。タンパク質発現は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターから駆動される。組換えタンパク質は、非侵襲的なインビボでの検出および細胞生物学研究を容易にする、カルボキシル末端に融合された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を有する。ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯベクターはまた、ラージＴ抗原を発現する細胞株におけるエピソーム複製および単純なベクターレスキューのためのＳＶ４０起点と共に、ｍＲＮＡ安定性を増大するための、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列を含む。ネオマイシン耐性遺伝子は、そのタンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１起源は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるそのプラスミドの選択および維持を可能にする。アミノ末端ＧＦＰ融合物を有するさらなる構築物を、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の全体の長さにわたってｐｃＤＮＡ３．１／ＮＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯ中に作製する。
ｐＴａｇ５：２４Ｐ４Ｃ１２ ＯＲＦまたはその一部を、ｐＴａｇ−５中にクローニングした。このベクターは、ｐＡＰｔａｇに類似するが、アルカリホスファターゼ融合物を含まない。この構築物は、アミノ末端ＩｇＧκシグナル配列、ならびに検出およびアフィニティー精製を容易にするカルボキシル末端のｍｙｃおよび６×Ｈｉｓエピトープタグを有する、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質を産生する。得られた組換え２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質を、トランスフェクトした哺乳動物細胞の培地への分泌のために最適化した。そしてそれを免疫原またはリガンドとして使用して、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質と相互作用するリガンドまたはレセプターのようなタンパク質を同定する。タンパク質発現は、ＣＭＶプロモーターから駆動される。ベクター中に存在するゼオシン耐性遺伝子は、そのタンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ中のそのプラスミドの選択を可能にする。図２６は、二つの異なるｐＴａｇ５構築物からの２４Ｐ４Ｃ１２の発現を示す。
ＰＡＰｔａｇ：２４Ｐ４Ｃ１２ ＯＲＦまたはその一部を、ｐＡＰｔａｇ（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐ．Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮ）へクローニングする。この構築物は、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のカルボキシル末端でのアルカリホスファターゼ融合物（これは、一方で、アミノ末端にＩｇＧκシグナル配列を融合している）を生成する。アミノ末端ＩｇＧκシグナル配列を有するアルカリホスファターゼが２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のアミノ末端に融合されている構築物もまた作製する。得られた組換え２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質を、トランスフェクトされた哺乳動物細胞の培地への分泌のために最適化し、そしてそれを使用して２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質と相互作用するリガンドまたはレセプターのようなタンパク質を同定し得る。タンパク質発現は、ＣＭＶプロモーターから駆動され、そして組換えタンパク質はまた、検出および精製を容易にするカルボキシル末端で融合されたｍｙｃおよび６×Ｈｉｓエピトープを含む。ベクター中に存在するゼオシン耐性遺伝子は、その組換えタンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ中のそのプラスミドの選択を可能にする。
ＰｓｅｃＦｃ：２４Ｐ４Ｃ１２ ＯＲＦまたはその一部をまた、ｐｓｅｃＦｃ中にクローニングする。このｐｓｅｃＦｃベクターを、ヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ）Ｆｃ（ヒンジ領域、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域）をｐＳｅｃＴａｇ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）中にクローニングすることにより、アセンブリした。この構築物は、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質のカルボキシル末端のＩｇＧ１ Ｆｃ融合物を生成し、同時にＮ−末端にＩｇＧＫシグナル配列を融合する。マウスＩｇＧ１ Ｆｃ領域を利用する２４Ｐ４Ｃ１２融合物もまた、使用される。得られた組換え２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質を、トランスフェクトした哺乳動物細胞の培地へ分泌のために最適化し、そして免疫原としてか、または２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質と相互作用するリガンドまたはレセプターのようなタンパク質を同定するために、用い得る。タンパク質発現は、ＣＭＶプロモーターから駆動される。ベクター中に存在するハイグロマイシン耐性遺伝子は、組換えタンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ中のプラスミドの選択を可能にする。
ｐＳＲα構築物：２４Ｐ４Ｃ１２を構成的に発現する哺乳動物細胞株を、作製するために、２４Ｐ４Ｃ１２の２４Ｐ４Ｃ１２ ＯＲＦまたはその一部を、ｐＳＲα構築物中にクローニングした。両栄養性レトロウイルスおよび環境栄養性レトロウイルスを、それぞれ、２９３Ｔ−１０Ａ１パッケージング株中へのｐＳＲα構築物のトランスフェクション、またはｐＳＲαおよびヘルパープラスミド（欠失したパッケージング配列を含む）の２９３細胞中への共トランスフェクションにより、作製した。このレトロウイルスを用いて、種々の哺乳動物細胞株に感染させ、クローニングされた遺伝子である２４Ｐ４Ｃ１２の宿主細胞株への組みこみを生じさせる。タンパク質発現は、長末端反復配列（ＬＴＲ）から駆動される。ベクター中に存在するネオマイシン耐性遺伝子は、タンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１起点は、Ｅ．ｃｏｌｉ中のプラスミドの選択および維持を可能にする。その後、このレトロウイルスベクターを、例えば、ＰＣ３細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、ＴｓｕＰｒ１細胞、２９３細胞またはｒａｔ−１細胞のような種々の細胞株の感染および産生のために用いた。図２３は、安定してトランスフェクトされたＰＣ３細胞、３Ｔ３細胞、および３００．１９細胞内における２４Ｐ４Ｃ１２．ｐＳＲａ構築物から駆動される２４Ｐ４Ｃ１２のＲＮＡの発現を示す。図２５は、２４Ｐ４Ｃ１２．ｐＳＲａ構築物を用いて安定に形質導入されたＰＣ３細胞における２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の発現を示す。
さらなるｐＳＲα構築物を作製した。これらは、ＦＬＡＧＴＭタグのようなエピトープタグを２４Ｐ４Ｃ１２配列のカルボキシル末端に融合しており、抗Ｆｌａｇ抗体を使用する検出を可能とする。例えば、ＦＬＡＧＴＭ配列の５’ｇａｔ ｔａｃ ａａｇ ｇａｔ ｇａｃ ｇａｃ ｇａｔ ａａｇ ３’（配列番号４５）を、ＯＲＦの３’末端のクローニングプライマーに加える。さらなるｐＳＲα構築物を作製し、全長２４Ｐ４Ｃ１２のアミノ末端のＧＦＰ融合タンパク質ならびにカルボキシル末端のＧＦＰおよびｍｙｃ／６×Ｈｉｓ融合タンパク質の両者を産生する。
さらなるウイルスベクター：さらなる構築物を、ウイルス媒介送達および２４Ｐ４Ｃ１２の発現のために作製する。２４Ｐ４Ｃ１２の高レベル発現につながる高ウイルス力価は、アデノウイルスベクターおよびヘルペスアンプリコンベクターのようなウイルス送達系において達成される。２４Ｐ４Ｃ１２コード配列またはそのフラグメントは、ＰＣＲにより増幅され、そしてＡｄＥａｓｙシャトルベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）へとサブクローニングされる。組換えおよびウイルスパッケージングを、アデノウイルスベクターを作製するための製造業者の指示書に従って実施する。あるいは、２４Ｐ４Ｃ１２コード配列またはそのフラグメントを、ＨＳＶ−Ｉベクター（Ｉｍｇｅｎｅｘ）へとクローニングして、ヘルペスウイルスベクターを作製する。その後、このウイルスベクターを、ＰＣ３細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、２９３細胞またはｒａｔ−１細胞のような種々の細胞株の感染のために用いる。
調節された発現系：哺乳動物細胞における２４Ｐ４Ｃ１２の発現を制御するために、２４Ｐ４Ｃ１２のコード配列またはその一部を、Ｔ−Ｒｅｘ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｔｉｇｈｔｌｙ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｅｃｄｙｓｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のような調節された哺乳動物発現系中にクローニングする。これらの系は、組換え２４Ｐ４Ｃ１２の時間依存的効果および濃度依存的効果の研究を可能にする。その後、これらのベクターは、ＰＣ３細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、２９３細胞、またはｒａｔ−１細胞のような種々の細胞株における２４Ｐ４Ｃ１２の発現を制御するために用いられる。
（Ｂ．バキュロウイルス発現系）
バキュロウイルス発現系において組換え２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質を産生するために、２４Ｐ４Ｃ１２ ＯＲＦ、またはその一部を、バキュロウイルス移入ベクターであるｐＢｌｕｅＢａｃ ４．５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（これは、Ｎ末端にＨｉｓタグを提供する）中にクローニングする。具体的には、ｐＢｌｕｅＢａｃ−２４Ｐ４Ｃ１２は、ヘルパープラスミドｐＢａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに、ＳＦ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）昆虫細胞へと共トランスフェクトされて、組換えバキュロウイルスを作製する（詳細については、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの指示マニュアルを参照のこと）。次いで、バキュロウイルスを、細胞上清から収集し、そしてプラークアッセイにより精製する。
次いで、組換え２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質を、精製したバキュロウイルスを用いるＨｉｇｈＦｉｖｅ昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の感染により、作製する。組換え２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質を、抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体または抗Ｈｉｓタグ抗体を用いて検出し得る。２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質を、精製し、そして種々の細胞ベースのアッセイにおいて、または２４Ｐ４Ｃ１２に特異的なポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製するための免疫原として、用い得る。
（実施例９ 抗原性プロフィールおよび二次構造）
図５〜図９は、２４Ｐ４Ｃ１２改変体アミノ酸配列の５つのアミノ酸プロフィール（各評価は、ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバのＰｒｏｔＳｃａｌｅウェブサイト（．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｐｌ）にあるワールドワイドウェブに位置する）にアクセスすることにより利用可能な評価である）を図示する。
これらのプロフィール：図５、親水性、（Ｈｏｐｐ Ｔ．Ｐ．，Ｗｏｏｄｓ Ｋ．Ｒ．，１９８１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：３８２４−３８２８）；図６、ヒドロパシー、（Ｋｙｔｅ Ｊ．，Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ Ｒ．Ｆ．，１９８２．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２）；図７、接触可能残基の％、（Ｊａｎｉｎ Ｊ．，１９７９ Ｎａｔｕｒｅ ２７７：４９１−４９２）；図８、平均可撓性、（Ｂｈａｓｋａｒａｎ Ｒ．，およびＰｏｎｎｕｓｗａｍｙ Ｐ．Ｋ．１９８８．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３２：２４２−２５５）；図９、βターン（Ｄｅｌｅａｇｅ，Ｇ．，Ｒｏｕｘ Ｂ．１９８７ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １：２８９−２９４）；および、必要に応じて、例えば、ＰｒｏｔＳｃａｌｅウェブサイトにあるような、当該分野で利用可能な他のプロフィールを用いて、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の抗原性領域を同定した。２４Ｐ４Ｃ１２の上記のアミノ酸プロフィールの各々を、分析のために以下のＰｒｏｔＳｃａｌｅパラメーターを用いて作製した：１）ウィンドウサイズ９；２）ウィンドウセンターと比較したウィンドウエッジの１００％ウェイト；および３）０と１との間にあるように正規化されたアミノ酸プロフィール値。
疎水性プロフィール（図５）、ヒドロパシープロフィール（図６）および接触可能残基の％のプロフィール（図７）を使用して、疎水性アミノ酸（すなわち、ヒドロパシープロフィールおよび接触可能残基の％のプロフィールにて値が０．５より大きく、ヒドロパシープロフィールにて値が０．５より小さい）のストレッチを決定した。そのような領域は、水性環境に曝される可能性があり、タンパク質表面上に存在する可能性があり、したがって、（例えば、抗体による）免疫認識に利用可能である。
平均可撓性プロフィール（図８）およびβターンプロフィール（図９）は、二次構造（例えば、βシートおよびαヘリックス）に拘束されていないアミノ酸（すなわち、βターンプロフィールおよび平均可撓性プロフィールにて値が０．５より大きい）のストレッチを決定する。そのような領域はまた、そのタンパク質上に露出した部分である可能性が高く、従って、（例えば、抗体による）免疫認識に利用可能である。
例えば、図５、図６、図７、図８、および／または図９に示されるプロフィールにより示される、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質およびその改変体タンパク質の抗原性配列を使用して、免疫原（ペプチド、またはそのペプチドをコードする核酸のいずれか）を調製して、治療用および診断用の抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体を生成する。その免疫原は、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、または５０個より長く連続する、図２および図３に挙げた２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質改変体由来の任意のアミノ酸、またはそれをコードする対応核酸であり得る。特に、本発明のペプチド免疫原は、以下を含み得る：図５の疎水性プロフィールにおいて０．５を超える値を有するアミノ酸位置を含む、任意の整数の増分における図２および図３の少なくとも５個のアミノ酸のペプチド領域；図６のヒドロパシープロフィールにおいて０．５未満の値を有するアミノ酸位置を含む、任意の整数の増分における図２および図３の少なくとも５個のアミノ酸のペプチド領域；図７の接触可能残基の％のプロフィールにおいて０．５を超える値を有するアミノ酸位置を含む、任意の整数の増分における図２および図３の少なくとも５個のアミノ酸のペプチド領域；図８の平均可撓性プロフィールにおいて０．５を超える値を有するアミノ酸位置を含む、任意の整数の増分における図２および図３の少なくとも５個のアミノ酸のペプチド領域；および図９のβ−ターンプロフィールにおいて０．５を超える値を有するアミノ酸位置を含む、任意の整数の増分における図２および図３の少なくとも５個のアミノ酸のペプチド領域。本発明のペプチド免疫原はまた、上記のいずれかをコードする核酸を含み得る。
本発明の免疫原、ペプチド、または核酸はすべて、ヒト単位用量形態で実施され得るか、またはヒトの生理に適合する薬学的賦形剤を含む組成物により含有され得る。
２４Ｐ４Ｃ１２の改変体１の二次構造（すなわち、αヘリックス、伸長鎖、およびランダムコイルの推定される存在および位置）は、ＨＮＮ−Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ法（Ｇｕｅｒｍｅｕｒ，１９９７，ｈｔｔｐ：／／ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ．ｐｌ？ｐａｇｅ＝ｎｐｓａ＿ｎｎ．ｈｔｍｌ）（ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／）からアクセスされる）を使用して、個々の一次アミノ酸配列から推定される。この分析は、２４Ｐ４Ｃ１２改変体１が、５３．９４％のαヘリックス、９．４４％の伸長鎖、および３６．６２％のランダムコイルから構成されることを示す（図１３ａ）。
２４Ｐ４Ｃ１２改変体中の膜貫通ドメインの存在可能性についての分析を、ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／）からアクセスされる種々の膜貫通推定アルゴリズムを使用して実行した。ＴＭｐｒｅｄプログラム（図１３ｂ）およびＴＭＨＭＭプログラム（図１３ｃ）を使用して１０回膜貫通型ドメインの存在および位置を示す改変体１の分析の結果を図示する。各プログラムの結果は、つまり膜貫通ドメインをコードするアミノ酸を、表Ｌに要約する。
（実施例１０：２４Ｐ４Ｃ１２ポリクローナル抗体の生成）
ポリクローナル抗体を、例えば、免疫因子および（所望される場合は）アジュバントの１回以上の注射によって、哺乳動物において惹起し得る。代表的には、その免疫因子および／またはアジュバントを、複数回の皮下注射または腹腔内注射によって、その哺乳動物中に注射する。全長２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質で免疫することに加えて、アミノ酸配列分析に基づいて、抗原性でありかつ免疫される宿主の免疫系による認識に利用可能である特性を備える免疫原の設計において、コンピューターアルゴリズムが使用される（「抗原性プロファイル」と題する実施例を参照のこと）。そのような領域は、親水性であり、可撓性であり、β−ターン立体構造の状態であり、そしてそのタンパク質の表面上に露出されていると推定される（例えば、２４Ｐ４Ｃ１２およびその改変体のそのような領域を示すアミノ酸プロファイルについて、図５、図６、図７、図８、または図９を参照のこと）。
例えば、２４Ｐ４Ｃ１２改変体タンパク質の親水性、可撓性、β−ターン領域を含む、２４Ｐ４Ｃ１２細菌組換え融合タンパク質または２４Ｐ４Ｃ１２細菌組換え融合ペプチドを、Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ白色ウサギにおいてポリクローナル抗体を生成するための抗原として使用する。例えば、そのような領域には、２４Ｐ４Ｃ１２改変体１のアミノ酸１〜３４、アミノ酸１１８〜１３５、アミノ酸１９４〜２２４、アミノ酸２８０〜２９０、アミノ酸６９０〜７１０が挙げられるが、これらに限定されない。免疫される哺乳動物において免疫原性であることが既知のタンパク質に、その免疫因子を結合体化することが有用である。そのような免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、およびダイズトリプシンインヒビターが挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、２４Ｐ４Ｃ１２改変体１のアミノ酸１〜１４をコードするペプチドを、ＫＬＨに結合体化し、ウサギを免疫するために使用した。この抗血清は、そのペプチド（＞１０，０００）に対して高い力価を示し、トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞中の２４Ｐ４Ｃ１２を、ウェスタンブロットおよびフローサイトメトリー（図２４）により、そして安定な組み換えＰＣ３細胞中の２４Ｐ４Ｃ１２を、ウェスタンブロットおよび免疫組織化学（図２５）により認識した。あるいは、その免疫因子は、２４Ｐ４Ｃ１２改変体タンパク質、そのアナログまたは融合タンパク質のすべてもしくは一部を含み得る。例えば、２４Ｐ４Ｃ１２改変体１のアミノ酸配列を、当該分野で周知の種々の融合タンパク質パートナー（例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ化融合タンパク質およびＨＩＳタグ化融合タンパク質）の任意の１つに、組換えＤＮＡ技術を使用して融合し得る。そのような融合タンパク質を、適切な親和性マトリックスを使用して誘導した細菌から精製する。
１つの実施形態において、改変体１の推定される第３の細胞外ループを含むアミノ酸３７９〜４５３をコードするＧＳＴ−融合タンパク質を、生成し、精製し、そして免疫原として使用する。使用し得る他の組換え細菌融合タンパク質としては、マルトース結合タンパク質、ＬａｃＺ、チオレドキシン、ＮｕｓＡ、または免疫グロブリン定常領域が挙げられる（「原核生物系における２４Ｐ４Ｃ１２の生成」と題する節、ならびにＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２，Ｕｎｉｔ １６，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｕｌら編、１９９５；Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｐ．Ｓ．，Ｂｒａｄｙ，Ｗ．，Ｕｒｎｅｓ，Ｍ．，Ｇｒｏｓｍａｉｒｅ，Ｌ．，Ｄａｍｌｅ，Ｎ．，およびＬｅｄｂｅｔｔｅｒ，Ｌ．（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４，５６１〜５６６を参照のこと）。
細菌由来融合タンパク質に加えて、哺乳動物により発現されるタンパク質抗原もまた、使用される。これらの抗原を、哺乳動物発現ベクター（例えば、Ｔａｇ５融合ベクターおよびＦｃ融合ベクター）から発現させる（「真核生物系における組換え２４Ｐ４Ｃ１２の生成」と題する実施例を参照のこと）。これらの抗原は、ネイティブタンパク質で見出される翻訳後修飾（例えば、グリコシル化）を保持する。二つの実施形態において、改変体１の、推定される第１の細胞外ループおよび第３の細胞外ループ（それぞれ、アミノ酸５９〜２２７、アミノ酸３７９〜４５３）を、各々Ｔａｇ５哺乳動物分泌ベクター中にクローニングし、２９３Ｔ細胞において発現させた（図２６）。その後、各々の組み換えタンパク質を、組織培養上清および／またはその組み換えベクターを安定に発現する２９３Ｔ細胞の溶解産物から、金属キレートクロマトグラフィーによって精製する。その後、その精製されたＴａｇ５ ２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質を、免疫原として使用する。
その免疫プロトコールの間、宿主動物の免疫応答を高めるアジュバント中の抗原を混合または乳状にすることは有用である。アジュバントの例には、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）およびＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成トレハロースジコリノミコレート）が挙げられるが、これらに限定されない。
代表的プロトコルにおいて、ウサギに、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中に混合したＫＬＨに結合体化した、２００μｇまで（代表的には、１００〜２００μｇ）の融合タンパク質または融合ペプチドを、まず皮下免疫する。その後、ウサギに、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中の２００μｇまで（代表的には、１００〜２００μｇ）の免疫原を、２週間ごとに皮下注射する。各免疫の約７〜１０日後に、試験採血を採取し、そしてＥＬＩＳＡにより抗血清の力価をモニターするために使用する。
免疫血清（例えば、改変体１のアミノ酸１〜１４をコードするＫＬＨ結合体化ペプチドによる免疫処置由来のウサギ血清）の反応性および特異性を試験するために、全長２４Ｐ４Ｃ１２改変体１ ｃＤＮＡを、ｐＣＤＮＡ３．１ ｍｙｃ−ｈｉｓ発現ベクターまたはレトロウイルス発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングする（「真核生物系における組換え２４Ｐ４Ｃ１２の生成」と題する実施例を参照のこと）。２９３Ｔ細胞中にその構築物をトランスフェクションするか、または２４Ｐ４Ｃ１２レトロウイルスを用いてＰＣ３を形質導入した後、細胞溶解物を、抗２４Ｐ４Ｃ１２血清および抗Ｈｉｓ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）でプローブし、ウェスタンブロット技術を使用して変性２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質に対する特異的反応性を決定する。図２４および図２５に示されるように、その抗血清は、２９３Ｔ細胞およびＰＣ３細胞における２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質を特異的に認識する。さらに、その免疫血清を、蛍光顕微鏡、フローサイトメトリーならびに免疫組織化学（図２５）および２９３Ｔ細胞ならびに他の組換え２４Ｐ４Ｃ１２発現細胞に対する免疫沈降により試験し、ネイティブタンパク質の特異的な認識を決定する。２４Ｐ４Ｃ１２を内因性に発現する細胞を使用して、ウェスタンブロット、免疫沈降、蛍光顕微鏡、免疫組織化学、およびフローサイトメトリー技術を実施して、反応性および特異性を試験する。
２４Ｐ４Ｃ１２改変体融合タンパク質（例えば、ＧＳＴ融合タンパク質およびＭＢＰ融合タンパク質）で免疫されたウサギ由来の抗血清を、融合パートナーを単独でかまたは不適切な融合タンパク質の状況で含む親和性カラムを通すことにより、融合パートナー配列に対して反応性である抗体を除去することによって精製する。例えば、改変体１のアミノ酸３７９−４５３をコードする、ＧＳＴ−２４Ｐ４Ｃ１２融合タンパク質由来の抗血清は、まずＡｆｆｉＧｅｌマトリックス（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．）に共有結合したＧＳＴタンパク質のカラムの通過により精製する。その後、抗血清を、Ａｆｆｉｇｅｌマトリックスに共有結合したアミノ酸３７９〜４５３を同様にコードするＭＢＰ融合タンパク質から構成されるカラムの通過により、親和性精製する。その後、さらにその血清を、プロテインＧ親和性クロマトグラフィーにより精製して、ＩｇＧ画分を単離する。他のＨｉｓタグ化抗原およびペプチドで免疫したウサギ由来の血清、ならびに融合パートナー除去血清を、もとのタンパク質免疫原または遊離ペプチドから構成されるカラムマトリックスを通すことによって親和性精製する。
（実施例１１：２４Ｐ４Ｃ１２モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の生成）
１つの実施形態において、２４Ｐ４Ｃ１２改変体に対する治療ｍＡｂは、各々の改変体タンパク質に特異的なエピトープあるいは２４Ｐ４Ｃ１２改変体の生物学的機能を破壊または調節する改変体（例えば、リガンドおよび基質との相互作用を破壊する改変体もしくは生物学的活性を破壊する改変体）の間で共通の配列に特異的なエピトープと反応するｍＡｂ、例えば、リガンドおよび基質との相互作用を崩壊するか、または関与するリガンドもしくはタンパク質との相互作用を破壊するタンパク質エピトープと反応するｍＡｂを包含する。そのようなｍＡｂの生成のための免疫原としては、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質改変体配列全体をコードするかもしくは含むように設計された免疫原、またはアミノ酸配列のコンピューター分析から抗原性であると推定される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質改変体領域をコードするかもしくは含むように設計された免疫原が挙げられる（例えば、図５、図６、図７、図８、または図９、および「抗原性プロファイル」と題する実施例を参照のこと）。免疫原としては、ペプチド、組換え細菌タンパク質、ならびに哺乳動物で発現されるＴａｇ５タンパク質、ならびにヒトＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質およびマウスＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質が挙げられる。さらに、高レベルの各々の２４Ｐ４Ｃ１２改変体を発現するように遺伝子操作された細胞（例えば、２９３Ｔ−２４Ｐ４Ｃ１２改変体１または３００，１９−２４Ｐ４Ｃ１２改変体１のマウスプレＢ細胞）を使用して、マウスを免疫する。
２４Ｐ４Ｃ１２改変体に対するｍＡｂを生成するために、マウスに、代表的には、完全フロイントアジュバント中に混合した１０〜５０μｇのタンパク質免疫原または１０７個の２４Ｐ４Ｃ１２発現細胞を、まず腹腔内（ＩＰ）免疫する。その後、マウスに、代表的には、不完全フロイントアジュバント中に混合した１０〜５０μｇのタンパク質免疫原または１０７個の細胞を、２〜４週間ごとに腹腔内（ＩＰ）免疫する。あるいは、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバントを、免疫に使用する。一つの実施形態では、マウスを上記のように完全フロイントアジュバント中の３００．１９−２４Ｐ４Ｃ１２細胞およびその後不完全フロイントアジュバント中の３００．１９−２４Ｐ４Ｃ１２細胞で免疫した。その後、そのマウスを屠殺し、脾臓を採取し、融合およびハイブリドーマの産生に用いた。図２７に観察され得るように、フローサイトメトリーにより２９３Ｔ細胞において発現される２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質を抗体が特異的に認識する、２つのハイブリドーマを生成した。
上記のタンパク質ベースの免疫ストラテジーおよび細胞ベースの免疫ストラテジーに加えて、２４Ｐ４Ｃ１２改変体配列をコードする哺乳動物発現ベクターを使用してプラスミドＤＮＡの直接注射によりマウスを免疫する、ＤＮＡベースの免疫プロトコルを使用する。一つの実施形態では、改変体１の配列のアミノ酸５９〜２２７（図２６）をコードするＴａｇ５哺乳動物分泌ベクターを使用して、マウスを免疫した。次いで、後のブースター免疫処置を、その精製タンパク質を用いて実施する。別の例において、同一のアミノ酸を、Ｆｃ−融合分泌ベクター中にクローニングする。そのベクターにおいて、２４Ｐ４Ｃ１２改変体１配列がアミノ末端でＩｇＫリーダー配列に融合しており、カルボキシ末端でヒトＩｇＧ Ｆｃ領域またはマウスＩｇＧ Ｆｃ領域のコード配列に融合している。その後、この組換えベクターを免疫原として使用する。プラスミド免疫プロトコルを、上記の精製タンパク質および各々の２４Ｐ４Ｃ１２改変体を発現する細胞と組み合わせて使用する。
その免疫プロトコルの間に、試験採血を、注射の７〜１０日後に行って、その免疫応答の力価および特異性をモニターする。一旦適切な反応性および特異性を、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、蛍光顕微鏡、免疫組織化学、およびフローサイトメトリー分析により決定して得ると、融合物およびハイブリドーマの生成を、当該分野で周知の確立された手順（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８を参照のこと）を用いて実行する。
２４Ｐ４Ｃ１２改変体８特異的モノクローナル抗体を生成するための１つの実施形態において、２４Ｐ４Ｃ１２改変体８のアミノ酸６４３〜６５４（ＲＮＰＩＴＰＴＧＨＶＦＱ）（配列番号４６）をコードするペプチドを合成し、ＫＬＨに共役させ、免疫原として使用する。Ｂａｌｂ Ｃマウスに、最初、完全フロイントアジュバント中に混合した２５μｇのＫＬＨ−２４Ｐ４Ｃ１２改変体８ペプチドで腹腔内免疫する。その後、マウスに、合計３回の免疫にわたって、不完全フロイントアジュバント中に混合した２５μｇの抗原で２週間ごとに免疫する。遊離ペプチドを使用するＥＬＩＳＡによって、免疫したマウス由来の血清の反応性を決定する。全長２４Ｐ４Ｃ１２改変体８タンパク質に対する血清の反応性および特異性を、２４Ｐ４Ｃ１２改変体８ ｃＤＮＡをコードする発現ベクターでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を使用して、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、およびフローサイトメトリーによってモニターし、他の２４Ｐ４Ｃ１２改変体でトランスフェクトした細胞と比較する（例えば、「真核生物系における組換え２４Ｐ４Ｃ１２の生成」と題する実施例を参照のこと）。他の組換え２４Ｐ４Ｃ１２改変体８発現細胞または２４Ｐ４Ｃ１２改変体８を内因性に発現する細胞もまた、使用する。２４Ｐ４Ｃ１２改変体８に対して最強の特異的反応性を示すマウスを、休止させ、そしてＰＢＳ中の抗原で最終注射し、そして４日後に屠殺する。屠殺したマウスの脾臓を採取し、そして標準的手順（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８）を使用してＳＰＯ／２ミエローマ細胞に融合させる。ＨＡＴ選択した増殖ウェル由来の上清を、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫沈降、蛍光顕微鏡、およびフローサイトメトリーによってスクリーニングして、２４Ｐ４Ｃ１２改変体８特異的抗体生成クローンを同定する。アミノ酸３７９〜３８８（ＰＬＰＴＱＰＡＴＬＧ）（配列番号４７）を含むペプチドを用いた同様の戦略をまた使って、２４Ｐ４Ｃ１２改変体９特異的抗体を得る。
２４Ｐ４Ｃ１２モノクローナル抗体の結合親和性を、標準的技術を使用して決定する。親和性測定によって、エピトープ結合に対する抗体の強度を定量し、そしてその親和性測定を使用して、どの２４Ｐ４Ｃ１２モノクローナル抗体が、当業者により認識されるような診断用途または治療用途のために好ましいかを規定するのを補助する。ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）は、結合親和性を決定するために好ましい方法である。このＢＩＡｃｏｒｅシステムは、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ，Ｗｅｌｆｏｒｄ Ｋ．１９９１，Ｏｐｔ．Ｑｕａｎｔ．Ｅｌｅｃｔ．２３：１；ＭｏｒｔｏｎおよびＭｙｓｚｋａ，１９９８，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２９５：２６８）を使用して、リアルタイムで生体分子相互作用をモニターする。ＢＩＡｃｏｒｅ分析は、便利よく、結合速度定数、解離速度定数、平衡解離定数、および親和性定数をもたらす。
（実施例１２：ＨＬＡクラスＩ結合アッセイおよびＨＬＡクラスＩＩ結合アッセイ）
精製ＨＬＡ分子を使用するＨＬＡクラスＩ結合アッセイおよびＨＬＡクラスＩＩ結合アッセイを、開示されたプロトコル（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／２０１２７およびＷＯ９４／０３２０５；Ｓｉｄｎｅｙら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８．３．１（１９９８）；Ｓｉｄｎｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：２４７（１９９５）；Ｓｅｔｔｅら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：８１３（１９９４））に従って、実施する。簡単に述べると、記載されるように、精製ＭＨＣ分子（５〜５００ｎＭ）を、種々の非標識ペプチドインヒビターおよび１〜１０ｎＭの１２５Ｉ放射標識プローブペプチドとともにインキュベートする。インキュベーション後、ＭＨＣ−ペプチド複合体を、ゲル濾過により遊離ペプチドから分離し、そして結合ペプチドの画分を、測定する。代表的には、予備実験において、各ＭＨＣ調製物を、一定量の放射標識ペプチドの存在下で力価決定して、全放射能のうちの１０〜２０％を結合するのに必要なＨＬＡ分子の濃度を決定する。その後のすべての阻害アッセイおよび直接結合アッセイを、これらのＨＬＡ濃度を使用して実施する。
これらの条件下では［標識］＜［ＨＬＡ］かつＩＣ５０≧［ＨＬＡ］であるので、測定したＩＣ５０値は、真のＫＤ値の妥当な近似である。ペプチドインヒビターを、代表的には、１２０μｇ／ｍｌ〜１．２ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で試験し、そして完全に独立した２つ〜４つの実験において試験する。種々の実験において得られたデータの比較を可能にするために、相対的結合数を、各ペプチドについて計算する。この計算は、阻害についてのポジティブコントロールのＩＣ５０を、試験した各ペプチドについてのＩＣ５０（代表的には、放射標識プローブペプチドの非標識バージョン）で除算することによる。データベース目的のため、そして実験間比較のために、相対的結合値を集計する。これらの値を、その後、ＩＣ５０ｎＭ値へと変換して戻し得る。この変換は、阻害についてのポジティブコントロールのＩＣ５０ｎＭを、目的のペプチドの相対的結合によって除算することによる。このデータ集計方法は、正確であり、そして異なる日に試験したペプチドまたは異なるロットの精製ＭＨＣを用いて試験したペプチドの比較について、一貫性がある。
上記に概説したような結合アッセイを使用して、ＨＬＡスーパーモチーフ保有ペプチドおよび／またはＨＬＡモチーフ保有ペプチドを分析し得る（表ＩＶを参照のこと）。
（実施例１３：ＨＬＡスーパーモチーフ保有ＣＴＬ候補エピトープおよびＨＬＡモチーフ保有ＣＴＬ候補エピトープの同定）
本発明のＨＬＡワクチン組成物は、複数のエピトープを含み得る。それらの複数のエピトープは、広範な集団範囲を達成するように、複数のＨＬＡスーパーモチーフまたはＨＬＡモチーフを含み得る。本実施例は、そのようなワクチン組成物中に含めるための、スーパーモチーフ保有エピトープおよびモチーフ保有エピトープの同定および確認を示す。集団範囲の計算を、下記のストラテジーを使用して実施する。
（スーパーモチーフ保有エピトープおよび／またはモチーフ保有エピトープの同定のためのコンピューター検索およびアルゴリズム）
「抗原性プロフィール」と題する実施例ならびに表ＶＩＩＩ−ＸＸＩおよび表ＸＸＩＩ−ＸＬＩＸにおいてモチーフ保有ペプチド配列を同定するために実施する検索は、図２および図３に示される２４Ｐ４Ｃ１２の遺伝子産物からのタンパク質配列データを使用する。その表を生み出すために用いられた特異的検索ペプチドを、表ＶＩＩに記載する。
ＨＬＡクラスＩスーパーモチーフもしくはＨＬＡクラスＩモチーフまたはＨＬＡクラスＩＩスーパーモチーフもしくはＨＬＡクラスＩＩモチーフを保有するエピトープについてのコンピューター検索を、以下のように実施する。翻訳される全ての２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質配列を、文字列検索ソフトウェアプログラムを使用して分析して、適切なＨＬＡ結合モチーフを含む可能性のあるペプチド配列を同定する；そのようなプログラムは、公知のモチーフ／スーパーモチーフの開示を考慮して、当該分野における情報に従って容易に作成される。さらに、そのような計算は、頭でなし得る。
同定したＡ２スーパーモチーフ配列、Ａ３スーパーモチーフ配列、およびＤＲスーパーモチーフ配列を、多項アルゴリズムを使用してスコア付けして、それらのモチーフが、特定のＨＬＡ−クラスＩ分子またはＨＬＡ−クラスＩＩ分子に結合する能力を推測する。これらの多項アルゴリズムは、種々の位置にある異なるアミノ酸の影響を考慮する。これらの多項アルゴリズムは、ペプチド−ＨＬＡ分子相互作用の全親和性（またはΔＧ）は、
「ΔＧ」＝ａ１ｉ×ａ２ｉ×ａ３ｉ．．．×ａｎｉ
の型の線形多項関数として近似され得るという前提に本質的に基づき、ここで、ａｊｉは、ｎアミノ酸のペプチド配列に沿った所定の位置（ｉ）における所定のアミノ酸（ｊ）の存在の効果を示す係数である。この方法の重大な仮定は、各位置での効果は、互いに本質的に独立している（すなわち、個々の側鎖の独立した結合である）ということである。残基ｊが、そのペプチド中の位置ｉに存在する場合、そのペプチドの残りの配列とは関係なく、そのペプチドの結合の自由エネルギーに一定量ｊｉで寄与すると仮定する。
特定のアルゴリズム係数の誘導方法は、Ｇｕｌｕｋｏｔａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６７：１２５８〜１２６，１９９７に記載されている（Ｓｉｄｎｅｙら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：７９〜９３，１９９６；およびＳｏｕｔｈｗｏｏｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３６３〜３３７３，１９９８もまた参照のこと）。簡単に述べると、全てのｉ位置について、アンカーおよび非アンカーも同様に、ｊを保有する全てのペプチドの平均相対結合（ＡＲＢ）の相乗平均を、その群の残りに対して計算し、そしてｊｉの推定値として使用する。クラスＩＩペプチドについて、複数のアライメントが可能である場合、反復手順に従って、最高スコアリングアライメントのみを利用する。試験セット中の所定のペプチドのアルゴリズムスコアを計算するために、そのペプチドの配列に対応するＡＲＢ値を乗算する。この積が、選択した閾値を超える場合、そのペプチドは結合すると推定される。適切な閾値を、望ましい推定のストリンジェンシーの程度の関数として選択する。
（ＨＬＡ−Ａ２スーパータイプ交叉反応性ペプチドの選択）
２４Ｐ４Ｃ１２由来のタンパク質配列を、モチーフ同定ソフトウェアを利用してスキャンして、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ主要アンカー特異性を含む、８マー配列、９マー配列、１０マー配列、および１１マー配列を同定する。代表的には、次いで、これらの配列を、上記のプロトコルを使用してスコア付けし、そして正のスコアを持つ配列に対応するペプチドを合成し、これらのインビトロでの精製ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子を結合する能力について試験する（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１は、プロトタイプＡ２スーパータイプ分子とみなされる）。
次いで、これらのペプチドを、さらなるＡ２スーパータイプ分子（Ａ＊０２０２、Ａ＊０２０３、Ａ＊０２０６、およびＡ＊６８０２）に結合する能力について試験する。試験した５つのＡ２スーパータイプ対立遺伝子のうちの少なくとも３つに結合するペプチドを、代表的には、Ａ２スーパータイプ交叉反応性の結合するものと見なす。好ましいペプチドは、３つ以上のＨＬＡ−Ａ２スーパータイプ分子に５００ｎＭ以下の親和性で結合する。
（ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ保有エピトープの選択）
上記でスキャンする２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質配列を、ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ主要アンカーを有するペプチドの存在についても試験する。次いで、ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ保有配列に対応するペプチドを合成し、そしてＨＬＡ−Ａ＊０３０１分子およびＨＬＡ−Ａ＊１１０１分子（最も有力な２つのＡ３スーパータイプ対立遺伝子によりコードされる分子）への結合について試験する。次いで、≦５００ｎＭ、しばしば≦２００ｎＭの結合親和性でその２つの対立遺伝子のうちの少なくとも１つに結合するペプチドを、他の一般的なＡ３スーパータイプ対立遺伝子（例えば、Ａ＊３１０１、Ａ＊３３０１およびＡ＊６８０１）に対する結合交叉反応性について試験して、試験する５つのＨＬＡ−Ａ３スーパータイプ分子のうちの少なくとも３つに結合し得る分子を同定する。
（ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフ保有エピトープの選択）
上記でスキャンする２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質を、ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフを含む、８マーペプチド、９マーペプチド、１０マーペプチド、または１１マーペプチドの存在についても分析する。対応するペプチドを合成し、そしてＨＬＡ−Ｂ＊０７０２（最も一般的なＢ７スーパータイプ対立遺伝子（すなわち、プロトタイプＢ７スーパータイプ対立遺伝子）によりコードされる分子）への結合について試験する。ＩＣ５０≦５００ｎＭでＢ＊０７０２を結合するペプチドを、標準的方法を使用して同定する。次いで、これらのペプチドを、他の一般的なＢ７スーパータイプ分子（例えば、Ｂ＊３５０１、Ｂ＊５１０１、Ｂ＊５３０１およびＢ＊５４０１）への結合について試験する。それによって、試験する５つのＢ７スーパータイプ対立遺伝子のうちの３つ以上に結合し得るぺプチドを、同定する。
（Ａ１モチーフ保有エピトープおよびＡ２４モチーフ保有エピトープの選択）
集団範囲をさらに増大するために、ＨＬＡ−Ａ１エピトープおよびＨＬＡ−Ａ２４エピトープをまた、ワクチン組成物中に組み込み得る。２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の分析もまた、ＨＬＡ−Ａ１モチーフ含有配列およびＨＬＡ−Ａ２４モチーフ含有配列を同定するために実施し得る。
他のモチーフおよび／またはスーパーモチーフを保有する、高親和性結合エピトープおよび／または交叉反応性結合エピトープを、類似する方法論を使用して同定する。
（実施例１４：免疫原性の確認）
本明細書中に記載されるように同定される交叉反応性候補ＣＴＬ Ａ２スーパーモチーフ保有ペプチドを、インビトロでの免疫原性を確認するために選択する。以下の方法論を使用して確認を実施する。
（細胞スクリーニングのための標的細胞株）
ＨＬＡ−Ａ２．１遺伝子を、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃヌル変異体ヒトＢリンパ芽球細胞株である７２１．２２１に移入することによって生成した２２１Ａ２．１細胞株を、ＨＬＡ−Ａ２．１拘束ＣＴＬの活性を測定するためのペプチド負荷標的として使用する。この細胞株を、抗生物質、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、および１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で増殖させる。目的の抗原を発現する細胞、または目的の抗原をコードする遺伝子を含むトランスフェクタントを、ペプチド特異的ＣＴＬが内因性抗原を認識する能力を確認するための標的細胞として使用し得る。
（一次ＣＴＬ誘導培養）
（樹状細胞（ＤＣ）の産生） ＰＢＭＣを、３０μｇ／ｍｌのＤＮＡｓｅを含むＲＰＭＩ中で解凍し、完全培地（ＲＰＭＩ−１６４０＋５％ ＡＢヒト血清、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシン）で２回洗浄し、この完全培地中に再懸濁する。その単球を、６ウェルプレート中に１０×１０６ＰＢＭＣ／ウェルでプレートすることによって精製する。３７℃にて２時間後、そのプレートを穏やかに振盪し、その上清を吸引することによって、非接着細胞を除去する。ウェルを、３ｍｌのＲＰＭＩで合計３回洗浄して、非接着細胞および緩く接着する細胞のほとんどを除去する。その後、５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦおよび１，０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４を含む３ｍｌの完全培地を、各ウェルに添加する。６日目に、７５ｎｇ／ｍｌにてＴＮＦαを、ＤＣに添加し、７日目に、その細胞を、ＣＴＬ誘導培養に使用する。
（ＤＣおよびペプチドを用いてのＣＴＬの誘導） ＣＤ８＋Ｔ細胞を、Ｄｙｎａｌ免疫磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−４５０）およびｄｅｔａｃｈａ−ｂｅａｄ（登録商標）試薬を用いるポジティブ選択によって単離する。代表的には、約２００×１０６個〜２５０×１０６個のＰＢＭＣを、２４×１０６個のＣＤ８＋Ｔ細胞（４８ウェルプレート培養のために十分である）を得るために処理する。簡単に述べると、ＰＢＭＣを、３０μｇ／ｍｌのＤＮＡｓｅを含むＲＰＭＩ中で解凍し、そして１％ヒトＡＢ血清を含むＰＢＳで１回洗浄し、そしてＰＢＳ／１％ＡＢ血清中に、濃度２０×１０６細胞／ｍｌで再懸濁する。磁気ビーズを、ＰＢＳ／ＡＢ血清を用いて３回洗浄し、細胞（１４０μｌビーズ／２０×１０６細胞）に添加し、そして継続して混合しながら４℃で１時間インキュベートする。そのビーズおよび細胞を、ＰＢＳ／ＡＢ血清を用いて４回洗浄して、非接着細胞を除去し、そして１００μｌ／ｍｌ ｄｅｔａｃｈａ−ｂｅａｄ（登録商標）試薬および３０μｇ／ｍｌ ＤＮＡｓｅを含むＰＢＳ／ＡＢ血清中に、１００×１０６細胞／ｍｌ（もとの細胞数に基づく）で懸濁する。その混合物を、継続して混合しながら室温にて１時間インキュベートする。そのビーズを、ＰＢＳ／ＡＢ／ＤＮＡｓｅで再び洗浄し、ＣＤ８＋Ｔ細胞を収集する。ＤＣを収集し、そして１３００ｒｐｍにて５〜７分間遠心分離し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１回洗浄し、計数し、そして３μｇ／ｍｌのβ２−ミクログロブリンの存在下で、２０℃で４時間、細胞濃度１×１０６〜２×１０６／ｍｌで、４０μｇ／ｍｌのペプチドを用いてパルスする。その後、そのＤＣを照射（４，２００ｒａｄ）し、培地で１回洗浄し、そして再び計数する。
（誘導培養の設定） ０．２５ｍｌのサイトカイン産生ＤＣ（１×１０５細胞／ｍｌ）を、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７の存在下で、４８ウェルプレートの各ウェル中で０．２５ｍｌのＣＤ８＋Ｔ細胞（２×１０６細胞／ｍｌ）とともに共培養する。翌日、組換えヒトＩＬ−１０を、最終濃度１０ｎｇ／ｍｌで添加し、４８時間後に、ｒヒトＩＬ−２を、１０ＩＵ／ｍｌで添加する。
（ペプチドでパルスした接着細胞を用いる、誘導培養物の再刺激） 一次誘導の７日後および１４日後に、その細胞を、ペプチドでパルスした接着細胞を用いて再刺激する。そのＰＢＭＣを解凍し、ＲＰＭＩおよびＤＮＡｓｅで２回洗浄する。その細胞を、５×１０６細胞／ｍｌで再懸濁し、そして約４２００ｒａｄで照射する。ＰＢＭＣを、１ウェルあたり０．５ｍｌ完全培地中２×１０６にてプレートし、３７℃で２時間インキュベートする。そのプレートを穏やかにタッピングすることによってＲＰＭＩで２回洗浄して非接着細胞を除去し、０．２５ｍｌのＲＰＭＩ／５％ＡＢ／ウェル中３μｇ／ｍｌのβ２ミクログロブリンの存在下で１０μｇ／ｍｌのペプチドで接着細胞を、３７℃で２時間パルスする。各ウェルからペプチド溶液を吸引し、そのウェルを、ＲＰＭＩで１回洗浄する。その培地のほとんどを、誘導培養物（ＣＤ８＋細胞）から吸引し、そして新鮮な培地で０．５ｍｌにする。その後、その細胞を、ペプチドでパルスした接着細胞を含むウェルへと移す。２４時間後に、組換えヒトＩＬ−１０を、最終濃度１０ｎｇ／ｍｌで添加し、そして翌日および２〜３日後に再度、組換えヒトＩＬ２を、５０ＩＵ／ｍｌで添加する（Ｔｓａｉら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８（１〜２）：６５〜７５，１９９８）。７日後に、その培養物を、５１Ｃｒ放出アッセイにおいてＣＴＬ活性についてアッセイする。いくつかの実験において、その培養物を、２回目の再刺激の際にインサイチュＩＦＮγ ＥＬＩＳＡにおけるペプチド特異的認識についてアッセイし、７日後に、内因的認識のアッセイを行う。増殖後、並列比較のために両方のアッセイにおいて活性を測定する。
（５１Ｃｒ放出によるＣＴＬ溶解活性の測定）
２回目の再刺激の７日後、単一のＥ：Ｔにて個々のウェルをアッセイすることによって、標準的（５時間）５１Ｃｒ放出アッセイにおいて細胞傷害性を測定する。細胞を１０μｇ／ｍｌペプチドとともに３７℃で一晩インキュベートすることによって、ペプチドでパルスした標的を調製する。
接着標的細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて培養フラスコから除去する。標的細胞を、２００μＣｉの５１Ｃｒクロム酸ナトリウム（Ｄｕｐｏｎｔ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）を用いて３７℃で１時間標識する。標識した標的細胞を、１ｍｌあたり１０６で再懸濁し、濃度３．３×１０６／ｍｌのＫ５６２細胞（非特異的溶解を減少するために使用されるＮＫ感受性赤芽球株）を用いて１：１０希釈する。標的細胞（１００μｌ）およびエフェクター（１００μｌ）を、９６ウェル丸底プレート中にプレートし、そして３７℃で５時間インキュベートする。その時、１００μｌの上清を各ウェルから収集し、そして式：
［（試験サンプルのｃｐｍ−自然発生５１Ｃｒ放出サンプルのｃｐｍ）／（最大５１Ｃｒ放出サンプルのｃｐｍ−自然発生５１Ｃｒ放出サンプルのｃｐｍ）］×１００
に従って、溶解パーセントを決定する。
最大放出および自然発生放出を、それぞれ、標識標的を、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および培地単独とともにインキュベートすることによって、決定する。特異性溶解（サンプル−バックグラウンド）が個々のウェルの場合１０％以上であり、増殖した培養物をアッセイする場合には最高の２つのＥ：Ｔ比にて１５％以上である培養物として、ポジティブ培養物を規定する。
（ペプチド特異的かつ内因性認識の指標としてのヒトＩＦＮγ産生のインサイチュ測定）
Ｉｍｍｕｌｏｎ２プレートを、マウス抗ヒトＩＦＮγモノクローナル抗体（４μｇ／ｍｌ ０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．２）を使用して、４℃にて一晩コーティングする。このプレートをＣａ２＋、Ｍｇ２＋非含有ＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、ＰＢＳ／１０％ ＦＣＳを使用して２時間ブロッキングし、その後、ＣＴＬ（１００μｌ／ウェル）および標的（１００μｌ／ウェル）を各ウェルに添加し、標準物質およびブランクのためのウェルは、（培地のみを入れ）空にしておく。標的細胞（ペプチドパルスまたは内因性標的のいずれか）を１×１０６細胞／ｍｌの濃度にて使用する。プレートを、５％ ＣＯ２の存在下で３７℃にて４８時間インキュベートする。
組換えヒトＩＦＮ−γを、４００ｐｇ／１００μｌ／ウェルまたは１２００ｐｇ／１００μｌ／ウェルにて開始して標準ウェルに添加し、プレートを３７℃にて２時間インキュベートする。プレートを洗浄し、１００μｌのビオチン化マウス抗ヒトＩＦＮ−γモノクローナル抗体（ＰＢＳ／３％ＦＣＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中に２μｇ／ｍｌ）を添加し、室温にて２時間インキュベートする。再び洗浄した後、１００μｌのＨＲＰ−ストレプトアビジン（１：４０００）を添加し、プレートを室温にて１時間インキュベートする。次いで、このプレートを洗浄緩衝液で６回洗浄し、１００μｌ／ウェルの発色溶液（ＴＭＢ １：１）を添加し、プレートを５〜１５分間、発色させる。５０μｌ／ウェル １Ｍ Ｈ３ＰＯ４を使用して反応を停止し、ＯＤ４５０にて読み取る。少なくとも５０ｐｇのＩＦＮ−γ／ウェルが、バックグラウンドより上で測定されかつ発現のバックグラウンドレベルの２倍である場合、培養をポジティブとみなす。
（ＣＴＬ増殖）
ペプチドパルスした標的および／または腫瘍標的に対する特異的溶解活性を示す培養物を、抗ＣＤ３とともに２週間にわたり増殖させる。簡潔には、５×１０４ ＣＤ８＋細胞を、以下を含むＴ２５フラスコに添加する：ＲＰＭＩ−１６４０（１０％（ｖ／ｖ）ヒトＡＢ血清、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、２５μＭ ２−メルカプトエタノール、Ｌ−グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含有する）１ｍｌ中、１×１０６照射（４，２００ｒａｄ）ＰＢＭＣ（自己または同種異系）／ｍｌ、２×１０５照射（８，０００ｒａｄ）ＥＢＶ形質転換細胞／ｍｌ、および３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３（抗ＣＤ３）。組換えヒトＩＬ２を２００ＩＵ／ｍｌの最終濃度にて２４時間後に添加し、その後３日間毎に、５０ＩＵ／ｍｌにて新たな培地を加える。細胞濃度が１×１０６／ｍｌを超えたら細胞を分け、培養物を、５１Ｃｒ放出アッセイにて３０：１、１０：１、３：１および１：１のＥ：Ｔ比で１３〜１５日の間にアッセイするか、または増殖前と同じ標的を使用してインサイチュＩＦＮγアッセイにて１×１０６／ｍｌでアッセイする。
培養物を、以下の通り、抗ＣＤ３＋の非存在下で増殖させる。ペプチドおよび内因性標的に対する特異的溶解活性を示す培養物を選択し、５×１０４ ＣＤ８＋細胞を、以下を含むＴ２５フラスコに添加する：ＲＰＭＩ−１６４０（１０％（ｖ／ｖ）ヒトＡＢ血清、非必須ＡＡ、ピルビン酸ナトリウム、２５ｍＭ ２−ＭＥ、Ｌ−グルタミンおよびゲンタマイシンを含有する）１ｍｌ中、１×１０６自己ＰＢＭＣ／ｍｌ（１０μｇ／ｍｌ ペプチドを用いて３７℃にて２時間ペプチドパルスし、かつ照射（４，２００ｒａｄ）した）；２×１０５照射（８，０００ｒａｄ）ＥＢＶ形質転換細胞／ｍｌ。
（Ａ２スーパーモチーフ保有ペプチドの免疫原性）
Ａ２スーパーモチーフ交叉反応性結合ペプチドを、正常個体におけるペプチド特異的ＣＴＬを誘導する能力について細胞アッセイにて試験する。この分析において、ペプチドは、代表的には、少なくとも個体におけるペプチド特異的ＣＴＬを誘導し、好ましくは、内因性に発現されたペプチドもまた認識する場合、エピトープであると考えられる。
２４Ｐ４Ｃ１２を発現する腫瘍を保有する患者から単離されたＰＢＭＣを使用して、免疫原性もまた確認し得る。簡潔には、ＰＢＭＣを患者から単離し、ペプチドパルスした単球を用いて再刺激し、ペプチドパルスした標的細胞および抗原を内因性に発現するトランスフェクト細胞を認識する能力についてアッセイする。
（Ａ＊０３／Ａ１１免疫原性の評価）
ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ保有交叉反応性結合ペプチドもまた、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフペプチドの免疫原性を評価するために使用される方法と同様の方法を使用して、免疫原性について評価する。
（Ｂ７免疫原性の評価）
本明細書中で示されるように同定されたＢ７スーパータイプ交叉反応性結合ペプチドの免疫原性スクリーニングを、Ａ２スーパーモチーフおよびＡ３スーパーモチーフを保有するペプチドの確認と類似する様式で確認する。
他のスーパーモチーフ／モチーフ（例えば、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２４など）を保有するペプチドもまた、同様の方法論を使用して確認する。
（実施例１５：アナログを作製することによるネイティブエピトープの結合能力を改良するための伸長したスーパーモチーフの実行）
ＨＬＡモチーフおよびＨＬＡスーパーモチーフ（一次残基および／または二次残基を含む）は、本明細書中に実証されるように、高度に交叉反応性のネイティブペプチドの同定および調製において有用である。さらに、ＨＬＡモチーフおよびＨＬＡスーパーモチーフの規定はまた、ネイティブペプチド配列内の残基を同定することにより高度に交叉反応性のエピトープを操作することを可能にする。このネイティブペプチド配列を、ペプチドに特定の特性（例えば、スーパータイプを含むＨＬＡ分子の群内のより大きな交叉反応性および／またはそれらのＨＬＡ分子のいくつかもしくは全てに対するより大きな結合親和性）を付与するためにアナログ化し得る（ａｎａｌｏｇｅｄ）。調節された結合親和性を示すアナログ化ペプチドの例を、本実施例に示す。
（一次アンカー残基でのアナログ化）
ペプチド操作ストラテジーを、エピトープの交叉反応性をさらに増大させるために実行する。例えば、Ａ２スーパーモチーフ保有ペプチドの主要アンカーを、例えば、２位に好ましいＬ、Ｉ、ＶまたはＭ、およびＣ末端にＩまたはＶを導入するために改変する。
アナログペプチドの交叉反応性を分析するために、各操作アナログを、最初に、プロトタイプＡ２スーパータイプ対立遺伝子Ａ＊０２０１に対する結合について、次いで、Ａ＊０２０１結合能力が維持されていれば、Ａ２スーパータイプ交叉反応性について試験する。
あるいは、ペプチドを、１つまたは全てのスーパータイプメンバーを結合すると確認し、次いで、スーパータイプメンバーのいずれか１つ（または１以上）に対する結合親和性を調節するためにアナログ化して、集団範囲を付加する。
細胞スクリーニング分析における免疫原性についてのアナログ選択を、代表的には、親野生型（ＷＴ）ペプチドが、３つ以上のＡ２スーパータイプ対立遺伝子に少なくとも弱く結合する（すなわち、５０００ｎＭ以下のＩＣ５０にて結合する）能力によりさらに制限する。この要件についての原理は、ＷＴペプチドが生物学的に関連するに十分な量にて内因性に存在しなければならないということである。アナログ化ペプチドは、親エピトープに特異的なＴ細胞によって免疫原性および交叉反応性を増大させたことが示されている（例えば、Ｐａｒｋｈｕｒｓｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：２５３９，１９９６；およびＰｏｇｕｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：８１６６，１９９５を参照のこと）。
これらのペプチドアナログの細胞スクリーニングにおいて、アナログ特異的ＣＴＬもまた、野生型ペプチド、および可能である場合は、このエピトープを内因性に発現する標的細胞を認識し得ることを確認することが重要である。
（ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ保有ペプチドおよびＢ７スーパーモチーフ保有ペプチドのアナログ化）
ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ保有エピトープのアナログを、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ保有ペプチドのアナログ化において使用するストラテジーと同様のストラテジーを使用して生成する。例えば、Ａ３スーパータイプ分子の３／５に結合するペプチドを、２位に好ましい残基（Ｖ、Ｓ、ＭまたはＡ）を保有するように一次アンカー残基にて操作する。
次いで、このアナログペプチドを、Ａ＊０３およびＡ＊１１（プロトタイプＡ３スーパータイプ対立遺伝子）を結合する能力について試験する。次いで、≦５００ｎＭの結合能を示すペプチドを、Ａ３スーパータイプ交叉反応性を有すると確認する。
Ａ２モチーフ保有ペプチドおよびＡ３モチーフ保有ペプチドと同様に、３以上のＢ７スーパータイプ対立遺伝子を結合するペプチドを改良して、可能な場合、増大した交叉反応結合性またはより大きな結合親和性もしくは結合半減期を、達成し得る。Ｂ７スーパーモチーフ保有ペプチドを、Ｓｉｄｎｅｙら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：３４８０−３４９０，１９９６）に示されるように、例えば、Ｃ末端一次アンカー位置にて好ましい残基（Ｖ、Ｉ、ＬまたはＦ）を有するように操作する。
他のモチーフ保有エピトープおよび／または他のスーパーモチーフ保有エピトープの一次アンカー残基でのアナログ化を、同様の様式で実施する。
次いで、アナログペプチドを、代表的には、細胞スクリーニングアッセイにおいて免疫原性について確認する。繰り返すと、アナログ特異的ＣＴＬもまた、野生型ペプチド、および可能な場合、このエピトープを内因性に発現する標的を認識することが可能であることを実証することが、一般に重要である。
（二次アンカー残基でのアナログ化）
さらに、ＨＬＡスーパーモチーフは、高度に交叉反応性のペプチドおよび／または増大した親和性でＨＬＡ分子を結合するペプチドを操作することに価値があり、この操作は、これらのような特性と関連する二次アンカー位置での特定の残基を同定することによる。操作することにおいて価値がある。例えば、１位にＦ残基を有するＢ７スーパーモチーフ保有ペプチドの結合能力を分析する。次いで、このペプチドを、例えば、１位のＦをＬで置換するようにアナログ化する。このアナログ化ペプチドを、増大した結合親和性、結合半減期および／または増大した交叉反応性について評価する。このような手順は、増強した特性を有するアナログ化ペプチドを同定する。
十分に改良された結合能力または交叉反応性を有する操作されたアナログを、例えば、ＩＦＡ免疫化またはリポペプチド免疫化に従って、ＨＬＡ−Ｂ７トランスジェニックマウスにおける免疫原性についてもまた、試験し得る。アナログ化ペプチドを、２４Ｐ４Ｃ１２発現腫瘍を有する患者由来のＰＢＭＣを使用したリコール（ｒｅｃａｌｌ）応答を刺激する能力について、さらに試験する。
（他のアナログ化ストラテジー）
ペプチドアナログ化の別の形態は、アンカー位置とは無関係に、システインを、α−アミノ酪酸で置換することを包含する。その化学的性質に起因して、システインは、ジスルフィド架橋を形成し、そしてペプチドを構造的に十分に変化させる特性を有し、結合能力を減少させる。システインの代わりのα−アミノ酪酸での置換は、この問題を軽減するだけでなく、いくつかの場合において、結合能力および交叉結合能力を改良することもまた示されている（例えば、Ｓｅｔｔｅら、Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ Ｖｉｒａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，Ｒ．ＡｈｍｅｄおよびＩ．Ｃｈｅｎ編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９９９による総説を参照のこと）。
従って、単一アミノ酸置換の使用により、ＨＬＡスーパータイプ分子に対するペプチドリガンドの結合特性および／または交叉反応性が、調節され得る。
（実施例１６：ＨＬＡ−ＤＲ結合モチーフを有する２４Ｐ４Ｃ１２由来配列の同定および確認）
ＨＬＡクラスＩＩスーパーモチーフまたはＨＬＡクラスＩＩモチーフを有するペプチドエピトープを、ＨＬＡクラスＩペプチドについて記載された方法論と類似の方法論を使用して、以下に概説するように同定および確認する。
（ＨＬＡ−ＤＲスーパーモチーフ保有エピトープの選択）
２４Ｐ４Ｃ１２由来のＨＬＡクラスＩＩ ＨＴＬエピトープを同定するために、２４Ｐ４Ｃ１２抗原を、ＨＬＡ−ＤＲモチーフまたはＨＬＡ−ＤＲスーパーモチーフを保有する配列の存在について分析する。具体的には、ＤＲスーパーモチーフを含む１５マーの配列を選択する（９マーのコアならびに３残基のＮ末端隣接領域および３残基のＣ末端隣接領域を含む（計１５アミノ酸））。
ＤＲ分子に結合するペプチドを推定するためのプロトコルが開発されている（Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３６３−３３７３，１９９８）。個々のＤＲ分子に対して特異的なこれらのプロトコルは、９マーコア領域のスコア付けおよび順位付けを可能にする。各プロトコルは、９マーコア内のＤＲスーパーモチーフ一次アンカー（すなわち、１位および６位）の存在についてペプチド配列をスコア付けするのみならず、二次アンカーの存在について配列をさらにまた評価する。対立遺伝子特異的選択表（例えば、Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら，同書を参照のこと）を使用して、これらのプロトコルが、特定のＤＲ分子を結合する確率が高いペプチド配列を効率的に選択することを、見出した。さらに、これらのプロトコルを連携して（ｉｎ ｔａｎｄｅｍ）実施することは、特に、ＤＲ１、ＤＲ４ｗ４、およびＤＲ７に対する実施が、ＤＲ交叉反応性ペプチドを効率的に選択し得ることを、見出した。
上記で同定された２４Ｐ４Ｃ１２由来ペプチドを、種々の一般的なＨＬＡ−ＤＲ分子に対するそれらの結合能力について、試験する。全てのペプチドを、一次パネル：ＤＲ１、ＤＲ４ｗ４およびＤＲ７において、これらＤＲ分子に対する結合について最初に試験する。次いで、これら３つのＤＲ分子のうちの少なくとも２つを結合するペプチドを、二次アッセイにおいて、ＤＲ２ｗ２β１分子、ＤＲ２ｗ２β２分子、ＤＲ６ｗ１９分子、およびＤＲ９分子に対する結合について試験する。最後に、この４つの二次パネルＤＲ分子のうちの少なくとも２つ（従って、累積的に７つの異なるＤＲ分子のうちの少なくとも４つ）を結合するペプチドを、ＤＲ４ｗ１５、ＤＲ５ｗ１１、およびＤＲ８ｗ２分子に対する結合について三次アッセイにおいてスクリーニングする。一次スクリーニングアッセイ、二次スクリーニングアッセイおよび三次スクリーニングアッセイを含め、この１０個のＤＲ分子のうちの少なくとも７つを結合するペプチドを、交叉反応性ＤＲ結合因子（ｂｉｎｄｅｒ）とみなす。一般的なＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子を結合することが見出された２４Ｐ４Ｃ１２由来のペプチドは、特に重要である。
（ＤＲ３モチーフペプチドの選択）
ＨＬＡ−ＤＲ３が白色人種集団、黒色人種集団およびラテンアメリカ系集団において優勢である対立遺伝子であるので、ＤＲ３結合能力は、ＨＴＬエピトープの選択において適切な基準である。従って、候補であることが示されたペプチドをまた、それらのＤＲ３結合能力についてアッセイし得る。しかし、ＤＲ３モチーフの結合特異性を考慮すると、ＤＲ３に対してのみ結合するペプチドをまた、ワクチン処方物中に含めるための候補物と考え得る。
ＤＲ３を結合するペプチドを効率的に同定するために、標的２４Ｐ４Ｃ１２抗原を、Ｇｅｌｕｋら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５７４２−５７４８，１９９４）により報告された２つのＤＲ３特異的結合モチーフのうちの１つを有する配列について、分析する。次いで、対応するペプチドを合成し、１μＭまたはより良好な（すなわち、１μＭ未満）の親和性でＤＲ３を結合する能力を有するものを確認する。この結合基準を満たし、かつＨＬＡクラスＩＩ高親和性結合因子とみなされるペプチドを、見出す。
このようにして同定されるＤＲ３結合エピトープを、ＤＲスーパーモチーフ保有ペプチドエピトープとともにワクチン組成物中に含める。
ＨＬＡクラスＩモチーフ保有ペプチドの場合と同様に、クラスＩＩモチーフ保有ペプチドを、親和性または交叉反応性を改良するようにアナログ化する。例えば、９マーコア配列のうちの４位でのアスパラギン酸は、ＤＲ３結合についての最適化残基であり、そしてこの残基についての置換は、しばしば、ＤＲ３結合を改良する。
（実施例１７：２４Ｐ４Ｃ１２由来ＨＴＬエピトープの免疫原性）
この実施例は、本明細書中で記載された方法論を使用して同定されたものの中から、免疫原性のＤＲスーパーモチーフ保有エピトープおよびＤＲ３モチーフ保有エピトープを決定する。
ＨＴＬエピトープの免疫原性を、ＨＴＬ応答を刺激する能力を評価することにより、そして／または適切なトランスジェニックマウスモデルを使用することにより、ＣＴＬエピトープの免疫原性の決定に類似の様式にて、確認する。免疫原性を、以下についてスクリーニングすることにより決定する：１．）正常ＰＢＭＣを使用するインビトロ初代誘導または２．）２４Ｐ４Ｃ１２発現腫瘍を有する患者からのリコール応答。
（実施例１８：集団範囲の幅を決定するための種々の人種バックグラウンドにおけるＨＬＡスーパータイプの表現型頻度の算出）
この実施例は、複数のスーパーモチーフおよび／または複数のモチーフを含む複数のエピトープから構成されるワクチン組成物の集団範囲の幅の評価を示す。
集団範囲を分析するために、ＨＬＡ対立遺伝子の遺伝子頻度を決定する。各ＨＬＡ対立遺伝子の遺伝子頻度を、二項分布式ｇｆ＝１−（ＳＱＲＴ（１−ａｆ））を利用し、抗原頻度または対立遺伝子頻度から計算する（例えば、Ｓｉｄｎｅｙら，Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：７９−９３，１９９６を参照のこと）。表現型頻度全体を得るために、累積的遺伝子頻度を計算し、累積的抗原頻度を、逆数方程式（ｉｎｖｅｒｓｅ ｆｏｒｍｕｌａ）［ａｆ＝１−（１−Ｃｇｆ）２］を使用することにより導く。
頻度データがＤＮＡ型決定のレベルにて利用可能でない場合、血清学的に規定された抗原頻度に対する相当が仮定される。潜在的スーパータイプ集団範囲全体を得るためには、結合不均衡は仮定されず、スーパータイプの各々に属すると確認された対立遺伝子のみが含められる（最小評価（ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｔｉｍａｔｅ））。遺伝子座間の組み合わせにより達成される潜在的な範囲全体の評価を、考慮されたＢ対立遺伝子により包含されると期待され得る非Ａ包含集団の割合を、Ａ範囲に加えることにより行う（例えば、合計＝Ａ＋Ｂ＊（１−Ａ））。Ａ３様スーパータイプの確認されたメンバーは、Ａ３、Ａ１１、Ａ３１、Ａ＊３３０１、およびＡ＊６８０１である。Ａ３様スーパータイプは、Ａ３４、Ａ６６、およびＡ＊７４０１もまた含み得るが、これらの対立遺伝子は、頻度計算全体には含められなかった。同様に、Ａ２様スーパータイプファミリーの確認されたメンバーは、Ａ＊０２０１、Ａ＊０２０２、Ａ＊０２０３、Ａ＊０２０４、Ａ＊０２０５、Ａ＊０２０６、Ａ＊０２０７、Ａ＊６８０２、およびＡ＊６９０１である。最後に、Ｂ７様スーパータイプの確認された対立遺伝子は、Ｂ７、Ｂ＊３５０１−０３、Ｂ５１、Ｂ＊５３０１、Ｂ＊５４０１、Ｂ＊５５０１−２、Ｂ＊５６０１、Ｂ＊６７０１、およびＢ＊７８０１である（Ｂ＊１４０１、Ｂ＊３５０４−０６、Ｂ＊４２０１、およびＢ＊５６０２も潜在的にはメンバーである）。
Ａ２スーパータイプ、Ａ３スーパータイプおよびＢ７スーパータイプを組み合わせることにより達成される集団範囲は、５つの主要な人種群において約８６％である。範囲は、Ａ１モチーフおよびＡ２４モチーフを保有するペプチドを含めることにより拡げられ得る。平均すると、Ａ１は、５つの異なる主要人種群（白人、北アメリカの黒人、中国人、日本人、およびラテンアメリカ系人）にまたがる集団の１２％に存在し、Ａ２４は、これらの集団の２９％に存在する。まとめると、これらの対立遺伝子は、これらの同じ人種集団において平均頻度３９％で表される。Ａ１およびＡ２４が、Ａ２スーパータイプ対立遺伝子、Ａ３スーパータイプ対立遺伝子およびＢ７スーパータイプ対立遺伝子の範囲と組み合わせられると、主要人種にまたがる合計範囲は、９５％を超える。例えば、表ＩＶの（Ｇ）を参照のこと。類似のアプローチが、クラスＩＩモチーフ保有エピトープの組み合わせにより達成される集団範囲を評価するために使用され得る。
ヒトにおける免疫原性研究（例えば、Ｂｅｒｔｏｎｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：５０３，１９９７；Ｄｏｏｌａｎら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７：９７，１９９７；およびＴｈｒｅｌｋｅｌｄら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１６４８，１９９７）は、高度に交叉反応性の結合ペプチドが、エピトープとしてほぼ常に認識されることを示した。高度に交叉反応性の結合ペプチドを使用することは、多様な集団において免疫原性である、ワクチンに含めるための候補エピトープを同定することにおいて重要な選択基準である。
（本明細書中開示されるように、そして従来技術により）十分な数のエピトープを用いることにより、平均集団範囲は、５つの主要人種集団の各々において９５％を超えると推定される。ゲームの理論であるモンテカルロシミュレーション分析（これは、当該分野で公知である（例えば、Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｍ．Ｊ．およびＲｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ａ．「Ａ ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ ｇａｍｅ ｔｈｅｏｒｙ」ＭＩＴ Ｐｒｅｓｓ，１９９４を参照のこと））は、白人、北アメリカ黒人、日本人、中国人、およびラテンアメリカ人の人種群から構成される集団中のどの程度の百分率の個体が本明細書中に記載されるワクチンエピトープを認識するかを推定するために使用され得る。好ましい百分率は、９０％である。より好ましい百分率は、９５％である。
（実施例１９：プライミング後に内因性にプロセシングされた抗原のＣＴＬ認識）
この実施例では、本明細書中で記載されるように同定され、そして選択されたネイティブペプチドエピトープまたはアナログ化ペプチドエピトープにより誘導されたＣＴＬが、内因性に合成された抗原（すなわち、ネイティブ抗原）を認識することを確認する。
ペプチドエピトープ（例えば、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ保有エピトープ）で免疫したトランスジェニックマウスから単離したエフェクター細胞を、ペプチドでコーティングした刺激性因子細胞（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｃｅｌｌ）を用いてインビトロで再刺激する。６日後、エフェクター細胞を、細胞傷害性についてアッセイし、そしてペプチド特異的細胞傷害性活性を含む細胞株を、さらに再刺激する。さらに６日後、これらの細胞株を、ペプチドの存在下または非存在下で５１Ｃｒ標識化Ｊｕｒｋａｔ−Ａ２．１／Ｋｂ標的細胞に対する細胞傷害性活性について試験し、そしてまた、内因性に合成された抗原を有する５１Ｃｒ標識化標的細胞（すなわち、２４Ｐ４Ｃ１２発現ベクターで安定にトランスフェクトされた細胞）に対して試験する。
この結果は、ペプチドエピトープでプライムされた動物から得られたＣＴＬ株が、内因性に合成された２４Ｐ４Ｃ１２抗原を認識することを実証する。このような分析のために使用されるトランスジェニックマウスモデルの選択は、評価されているエピトープに依存する。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１／Ｋｂトランスジェニックマウスに加えて、ヒトＡ１１対立遺伝子（これはまた、Ａ３エピトープを評価するために使用され得る）およびヒトＢ７対立遺伝子を有するマウスを含むいくつかの他のトランスジェニックマウスモデルが特徴付けられており、そして他のもの（例えば、ＨＬＡ−Ａ１およびＡ２４についてのトランスジェニックマウス）が開発されている。ＨＬＡ−ＤＲ１およびＨＬＡ−ＤＲ３のマウスモデルもまた開発されており、これらは、ＨＴＬエピトープを評価するために使用され得る。
（実施例２０：トランスジェニックマウスにおけるＣＴＬ−ＨＴＬ結合体化エピトープの活性）
この実施例は、２４Ｐ４Ｃ１２由来のＣＴＬおよびＨＴＬのペプチドワクチン組成物の使用による、トランスジェニックマウスにおけるＣＴＬおよびＨＴＬの誘導を示す。本明細書中で使用されるワクチン組成物は、２４Ｐ４Ｃ１２発現腫瘍を有する患者に投与されるべきペプチドを含む。このペプチド組成物は、複数のＣＴＬエピトープおよび／またはＨＴＬエピトープを含み得る。これらのエピトープは、本明細書中に記載される方法論を用いて同定される。この実施例はまた、増強された免疫原性が、ＣＴＬワクチン組成物中に１以上のＨＴＬエピトープを含めることにより達成され得ることを示す；このようなペプチド組成物は、ＣＴＬエピトープに結合体化されたＨＴＬエピトープを含み得る。このＣＴＬエピトープは、５００ｎＭ以下の親和性にて、複数のＨＬＡファミリーメンバーに結合するエピトープまたはそのエピトープのアナログであり得る。これらのペプチドは、所望であれば、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｅｄ）され得る。
免疫手順：トランスジェニックマウスの免疫を、記載（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：４７５３−４７６１，１９９７）のように行う。例えば、Ａ２／Ｋｂマウス（これは、ヒトＨＬＡ Ａ２．１対立遺伝子についてトランスジェニックであり、かつＨＬＡ−Ａ＊０２０１モチーフまたはＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフを保有するエピトープの免疫原性を確認するために使用される）を、フロイント不完全アジュバント中、あるいはこのペプチド組成物が脂質化ＣＴＬ／ＨＴＬ結合体である場合は、ＤＭＳＯ／生理食塩水中、またはこのペプチド組成物がポリペプチドである場合はＰＢＳもしくはフロイント不完全アジュバント中で、０．１ｍｌのペプチドを用いて皮下で（尾の基部）プライムする。プライムして７日後、これらの動物から得た脾細胞を、ペプチドでコーティングした同系の照射ＬＰＳ活性化リンパ芽球で再刺激する。
細胞株：ペプチド特異的細胞傷害性アッセイのための標的細胞は、ＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋｂキメラ遺伝子（例えば、Ｖｉｔｉｅｌｌｏら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１００７，１９９１）を使用してトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞である。
インビトロでのＣＴＬ活性化：プライムして１週間後、１０ｍｌの培養培地／Ｔ２５フラスコ中にて脾臓細胞（３０×１０６細胞／フラスコ）を、３７℃にて同系の照射（３０００ｒａｄ）ペプチドコーティングリンパ芽球（１０×１０６細胞／フラスコ）とともに共培養する。６日後、エフェクター細胞を採取し、細胞傷害性活性についてアッセイする。
細胞傷害性活性についてのアッセイ：標的細胞（１．０〜１．５×１０６）を、２００μｌの５１Ｃｒの存在下で、３７℃にてインキュベートする。６０分後、細胞を３回洗浄し、Ｒ１０培地中に再懸濁する。ペプチドを、必要であれば１μｇ／ｍｌの濃度にて添加する。アッセイのために、１０４の５１Ｃｒ標識標的細胞を、Ｕ底９６ウェルプレート中の異なる濃度のエフェクター細胞（最終体積は２００μｌ）に添加する。３７℃にて６時間インキュベートした後、上清の０．１ｍｌのアリコートを各ウェルから取り出し、放射能を、Ｍｉｃｒｏｍｅｄｉｃ自動ガンマカウンタにて測定する。特異的溶解％を、以下の式により決定する：特異的放出％＝１００×（実験的放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出）。同じ条件下で行った別個のＣＴＬアッセイの間の比較を容易にするために、５１Ｃｒ放出％データを、溶解単位／１０６細胞として表す。１溶解単位は、６時間の５１Ｃｒ放出アッセイにおいて１０，０００個の標的細胞の３０％溶解を達成するために要したエフェクター細胞の数として任意に規定される。特異的溶解単位／１０６を得るために、ペプチドの非存在下で得た溶解単位／１０６を、ペプチドの存在下で得た溶解単位／１０６から差し引く。例えば、３０％の５１Ｃｒ放出が、ペプチドの非存在下では、５０：１のエフェクター（Ｅ）：標的（Ｔ）比（すなわち、１０，０００個の標的に対して５×１０５個のエフェクター細胞）にて得られ、そしてペプチドの存在下では５：１（すなわち、１０，０００個の標的に対して５×１０４個のエフェクター細胞）にて得られる場合、特異的溶解単位は、以下の通りである：［（１／５０，０００）−（１／５００，０００）］×１０６＝１８ＬＵ。
結果を分析して、免疫原性ＣＴＬ／ＨＴＬ結合体ワクチン調製物を注射した動物のＣＴＬ応答の大きさを評価し、「免疫原性の確認」と題した実施例において上記で概説したように、例えば、ＣＴＬエピトープを使用して達成されたＣＴＬ応答の大きさと比較する。これと類似の分析を行って、複数のＣＴＬエピトープおよび／または複数のＨＴＬエピトープを含むペプチド結合体の免疫原性を確認し得る。これらの手順に従って、ＣＴＬ応答が誘導され、同時に、ＨＴＬ応答がこのような組成物の投与の際に誘導されることが見いだされる。
（実施例２１：２４Ｐ４Ｃ１２特異的ワクチン中に含めるためのＣＴＬエピトープおよびＨＴＬエピトープの選択）
この実施例は、本発明のワクチン組成物のためのペプチドエピトープを選択するための手順を示す。この組成物中のペプチドは、ペプチドをコードする単一の配列または１以上の配列（すなわち、ミニ遺伝子）のいずれかの核酸配列の形態であり得るか、あるいは単一エピトープおよび／またはポリエピトープのペプチドであり得る。
以下の原理を、ワクチン組成物中に含めるための複数のエピトープを選択する場合に利用する。以下の原理の各々を、選択を行うために釣り合わせる。
投与の際に、２４Ｐ４Ｃ１２クリアランスと相関する免疫応答を模倣するエピトープを選択する。使用されるエピトープの数は、自発的に２４Ｐ４Ｃ１２を排除する患者の観察に依存する。例えば、自発的に２４Ｐ４Ｃ１２発現細胞を排除する患者が、２４Ｐ４Ｃ１２抗原由来の少なくとも３つのエピトープに対する免疫応答を生じることが観察された場合、ＨＬＡクラスＩについて少なくとも３つのエピトープが含められるべきである。同様の原理が、ＨＬＡクラスＩＩエピトープを決定するために使用される。
しばしば、ＨＬＡクラスＩ分子については５００ｎＭ以下のＩＣ５０、もしくはクラスＩＩについては１０００ｎＭ以下のＩＣ５０という結合親和性を有するエピトープ；またはＢＩＭＡＳウェブサイト（ＵＲＬ ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）からの高い結合スコアを有するＨＬＡクラスＩペプチドが選択される。
多様な集団全体を通じたワクチンの広い範囲を達成するために、十分なスーパーモチーフ保有ペプチド、または対立遺伝子特異的モチーフ保有ペプチドの十分なアレイを選択して、広い集団範囲が与えられる。１つの実施形態において、エピトープは、少なくとも８０％の集団範囲を提供するように選択される。モンテカルロ分析（当該分野で公知の統計学的評価法）は、集団範囲の幅、すなわち冗長性を評価するために使用され得る。
ポリエピトープ組成物、またはこれをコードするミニ遺伝子を作製する場合、目的のエピトープを含む、可能性のある最も小さなペプチドを生成することが代表的に所望される。使用される原理は、ネスト化された（ｎｅｓｔｅｄ）エピトープを含むペプチドを選択する場合に使用されるものと同じでないとしても、同様である。例えば、ワクチン組成物についてのタンパク質配列は、この配列が、配列内に含まれるエピトープの最大数を有する（すなわち、高濃度のエピトープを有する）ので、選択される。エピトープは、ネスト化されてもよいし、重複（すなわち、互いにフレームシフトしている）していてもよい。例えば、重複するエピトープを使用する場合、２つの９マーエピトープおよび１つの１０マーエピトープが、１０アミノ酸ペプチド中に存在し得る。各エピトープは露出され得、このようなペプチドの投与の際にＨＬＡ分子により結合される。マルチエピトープのペプチドは、合成的にか、組換え的にか、またはネイティブの供給源からの切断を介して生成され得る。あるいは、このネイティブ配列からアナログが生成され得、それにより１以上のエピトープは、このポリエピトープペプチドの交叉反応性特性および／または結合親和性特性を変化させる置換を含む。このようなワクチン組成物は、治療目的または予防目的のために投与される。この実施形態は、免疫系プロセシングの未だ発見されていない局面を、ネイティブのネスト化された配列に適用し、それにより治療的または予防的免疫応答誘導ワクチン組成物の生成を容易にするという可能性を提供する。さらに、このような実施形態は、現在未知のＨＬＡ構造についてのモチーフ保有エピトープの可能性を提供する。さらに、この実施形態（いかなるアナログも作製しない）は、免疫応答を、２４Ｐ４Ｃ１２中に実際存在する複数のペプチド配列に向け、従って、何らかの連結エピトープを評価する必要性を避ける。最後に、この実施形態は、核酸ワクチン組成物を生成する場合の規模の経済性を提供する。この実施形態に関連して、コンピュータープログラムが当該分野の原理に従って導出され得、このプログラムは、標的配列において配列長さあたりのエピトープの最大数を同定する。
選択されたペプチドから構成されるワクチン組成物は、投与される場合、安全で、有効であり、かつ２４Ｐ４Ｃ１２を有するか、またはこれを過剰発現する細胞を制御または消去する免疫応答と類似の大きさの免疫応答を惹起する。
（実施例２２：「ミニ遺伝子」マルチエピトープＤＮＡプラスミドの構築）
本実施例は、ミニ遺伝子発現プラスミドの構築を議論する。ミニ遺伝子プラスミドは、当然、本明細書中に記載される種々の構成のＢ細胞エピトープ、ＣＴＬエピトープおよび／もしくはＨＴＬエピトープまたはＢ細胞エピトープアナログ、ＣＴＬエピトープアナログおよび／もしくはＨＴＬエピトープアナログを含み得る。
ミニ遺伝子発現プラスミドは、代表的に、複数のＣＴＬペプチドエピトープおよびＨＴＬペプチドエピトープを含む。本実施例において、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ保有ペプチドエピトープ、ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ保有ペプチドエピトープ、ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフ保有ペプチドエピトープならびにＨＬＡ−Ａ１モチーフ保有ペプチドエピトープおよびＨＬＡ−Ａ２４モチーフ保有ペプチドエピトープを、ＤＲスーパーモチーフ保有エピトープおよび／またはＤＲ３エピトープと組み合わせて使用する。２４Ｐ４Ｃ１２由来のＨＬＡクラスＩスーパーモチーフまたはＨＬＡクラスＩモチーフを保有するペプチドエピトープを、複数のスーパーモチーフ／モチーフが提示されて広範な集団の範囲を確実にするように、選択する。同様に、ＨＬＡクラスＩＩエピトープを、広範な集団の範囲を提供するように、２４Ｐ４Ｃ１２から選択する。すなわち、ＨＬＡ ＤＲ−１−４−７スーパーモチーフ保有エピトープおよびＨＬＡ ＤＲ−３モチーフ保有エピトープの両方を、ミニ遺伝子構築物に含ませるために選択する。選択されたＣＴＬエピトープおよびＨＴＬエピトープを、次いで、発現ベクターにおける発現のためにミニ遺伝子へと組み込む。
このような構築物は、ＨＴＬエピトープを小胞体に指向させる配列をさらに含み得る。例えば、Ｉｉタンパク質（Ｉｉ ｐｒｏｔｅｉｎ）は、当該分野において記載されるように１つ以上のＨＴＬエピトープに融合され得、ここでこのＩｉタンパク質のＣＬＩＰ配列は、除去され、そしてＨＬＡクラスＩＩエピトープ配列と置換され、その結果、ＨＬＡクラスＩＩエピトープが、小胞体に指向され、このエピトープは、ＨＬＡクラスＩＩ分子に結合する。
本実施例は、ミニ遺伝子保有発現プラスミドの構築のために使用される方法を例示する。ミニ遺伝子組成物のために使用され得る他の発現ベクターは、当業者に利用可能であり、かつ公知である。
本実施例のミニ遺伝子ＤＮＡプラスミドは、コンセンサスＫｏｚａｋ配列およびコンセンサスマウスκＩｇ軽鎖シグナル配列と、それに続く本明細書中に開示される原理に従い選択されるＣＴＬエピトープおよび／またはＨＴＬエピトープを含む。この配列は、ｐｃＤＮＡ３．１ Ｍｙｃ−ＨｉｓベクターによりコードされるＭｙｃおよびＨｉｓの抗体エピトープタグに融合されたオープンリーディングフレームをコードする。
例えば、１５ヌクレオチドが重複している、平均約７０ヌクレオチド長であり得る重複オリゴヌクレオチドを合成し、そしてＨＰＬＣ精製する。これらのオリゴヌクレオチドは、選択されたペプチドエピトープならびに適切なリンカーヌクレオチド、Ｋｏｚａｋ配列、およびシグナル配列をコードする。最終的なマルチエピトープミニ遺伝子を、ＰＣＲを用いる３セットの反応において重複オリゴヌクレオチドを伸長することによってアセンブリする。Ｐｅｒｋｉｎ／Ｅｌｍｅｒ ９６００ ＰＣＲ機を用い、そして合計３０サイクルを、以下の条件を用いて実施する：９５℃で１５秒間、（各々のプライマー対の最も低いＴｍの計算値より５℃低い）アニーリング温度で３０秒間、そして７２℃で１分間。
例えば、ミニ遺伝子を以下のように調製する。第一のＰＣＲ反応において、各々５μｇの２つのオリゴヌクレオチドを、アニールし、そして伸長する。８つのオリゴヌクレオド（すなわち、４対のプライマー）を使用する実施例において、オリゴヌクレオチド１およびオリゴヌクレオチド２、オリゴヌクレオチド３およびオリゴヌクレオチド４、オリゴヌクレオチド５およびオリゴヌクレオチド６、ならびにオリゴヌクレオチド７およびオリゴヌクレオチド８を、Ｐｆｕポリメラーゼ緩衝液（１×＝１０ｍＭ ＫＣＬ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−クロリド（ｐＨ ８．７５）、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ）、０．２５ｍＭの各々のｄＮＴＰ、ならびに２．５ＵのＰｆｕポリメラーゼを含む１００μｌの反応物中で合わせる。全長の二量体産物を、ゲル精製し、そして１および２ならびに３および４の産物、５および６ならびに７および８の産物とを含む２つの反応物を混合し、アニールし、そして１０サイクルにわたり伸長する。次いで、２つの反応物の半分を混合し、そして隣接するプライマーを添加して、全長の産物を増幅する前に５サイクルのアニーリングおよび伸長を実施する。この全長産物を、ゲル精製し、ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そして個々のクローンを配列決定によりスクリーニングする。
（実施例２３：プラスミド構築物およびそのプラスミド構築物が免疫原性を誘導する程度）
プラスミド構築物（例えば、前出の実施例に従い構築されたプラスミド）が免疫原性を誘導し得る程度を、エピトープ発現核酸構築物を用いてＡＰＣを形質導入またはトランスフェクトした後、このＡＰＣによるエピトープ提示を決定することによりインビトロで確認する。このような研究により「抗原性」を決定し、そしてヒトＡＰＣの使用を可能とする。このアッセイによりこの細胞表面上のエピトープ−ＨＬＡクラスＩ複合体の密度を定量することによって、Ｔ細胞により認識される状態においてＡＰＣにより提示されるエピトープの能力を決定する。定量を、ＡＰＣから溶出されたペプチドの量を直接測定することにより実施し得る（例えば、Ｓｉｊｔｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：６８３〜６９２、１９９６；Ｄｅｍｏｔｚら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：６８２〜６８４、１９８９を参照のこと）か；またはペプチド−ＨＬＡクラスＩ複合体の数を、罹患したかまたはトランスフェクトされた標的細胞により誘導された溶解またはリンホカインの放出の量を測定し、次いで等しいレベルの溶解またはリンホカインの放出を得るために必要なペプチドの濃度を決定することにより、評価し得る（例えば、Ｋａｇｅｙａｍａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５６７〜５７６、１９９５を参照のこと）。
あるいは、免疫原性を、マウスへのインビボでの注射、引き続くＣＴＬ活性およびＨＴＬ活性（これらの活性を、細胞傷害性および細胞増殖性のアッセイ（それぞれ、例えば、Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：７５１〜７６１、１９９４において詳述される）を用いて分析する）のインビトロでの評価を介して確認する。
例えば、少なくとも１つのＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフペプチドを有するＤＮＡミニ遺伝子構築物がＣＴＬをインビボで誘導する能力を確認するために、例えば、ＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋｂトランスジェニックマウスを、１００μｇの裸のｃＤＮＡを用いて筋肉内で免疫する。ｃＤＮＡ免疫により誘導されたＣＴＬのレベルを比較する手段として、コントロール群の動物もまた、複数のエピトープがミニ遺伝子によりコードされるので、単一のポリペプチドとして合成された複数のエピトープを含む実際のペプチド組成物を用いて免疫する。
免疫した動物由来の脾細胞を、各々の組成物（ミニ遺伝子においてコードされるペプチドエピトープまたはポリエピトープペプチド）をそれぞれ用いて２回刺激し、次いで５１Ｃｒ放出アッセイにおいてペプチド特異的な細胞傷害性活性についてアッセイする。これらの結果は、Ａ２拘束性エピトープに対するＣＴＬ応答の大きさを示し、従ってミニ遺伝子ワクチンおよびポリエピトープワクチンのインビボでの免疫原性を示す。
従って、ミニ遺伝子が、ポリエピトープペプチドワクチンが誘発するような、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフペプチドエピトープに対する免疫応答を誘発することが見いだされる。ＨＬＡ−Ａ３およびＨＬＡ−Ｂ７のモチーフエピトープまたはスーパーモチーフエピトープによるＣＴＬ誘導を評価するために他のＨＬＡ−Ａ３トランスジェニックマウスモデルおよびＨＬＡ−Ｂ７トランスジェニックマウスモデルを用いて同様の分析もまた実施され、それにより、このミニ遺伝子が、提供されたエピトープに対して指向される適切な免疫応答を誘発することもまた見出される。
クラスＩＩエピトープをコードするミニ遺伝子がＨＴＬをインビボで誘導する能力を確認するためには、ＤＲトランスジェニックマウスにか、または適切なマウスＭＨＣ分子と交叉反応するエピトープについては、例えば、Ｉ−Ａｂ拘束性マウスに、１００μｇのプラスミドＤＮＡを筋肉内免疫する。ＤＮＡ免疫により誘導されたＨＴＬのレベルを比較する手段として、コントロール動物の群も、フロイント完全アジュバンド中に乳化した実際のペプチド組成物で免疫する。ＣＤ４＋Ｔ細胞（すなわちＨＴＬ）を、免疫した動物の脾臓細胞から精製し、そして各々の組成物（ミニ遺伝子中にコードされるペプチド）のそれぞれを用いて刺激する。ＨＴＬ応答を、３Ｈ−チミジン取り込み増殖アッセイを用いて測定する（例えば、Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：７５１〜７６１、１９９４を参照のこと）。この結果は、ＨＴＬ応答の大きさを示し、従って、このミニ遺伝子のインビボでの免疫原性を実証する。
前出の実施例において記載されるように構築されたＤＮＡミニ遺伝子をまた、プライムブーストプロトコル（ｐｒｉｍｅ ｂｏｏｓｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）を用いてブースト剤と組み合わせたワクチンとして確認し得る。このブースト剤は、組み換えタンパク質（例えば、Ｂａｒｎｅｔｔら、Ａｉｄｓ Ｒｅｓ．ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １４、補遺３：Ｓ２９９〜Ｓ３０９、１９９８）または例えば、完全な目的のタンパク質をコードするミニ遺伝子もしくはＤＮＡを発現する組み換えワクチン（例えば、Ｈａｎｋｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ １６：４３９〜４４５、１９９８；Ｓｅｄｅｇａｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５：７６４８〜５３、１９９８；ＨａｎｋｅおよびＭｃＭｉｃｈａｅｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ ６６：１７７〜１８１、１９９９；ならびにＲｏｂｉｎｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．５：５２６〜３４、１９９９を参照のこと）からなり得る。
例えば、プライムブーストプロトコルにて用いられるＤＮＡミニ遺伝子の有効性を、最初に、トランスジェニックマウスにおいて評価する。本実施例において、Ａ２．１／Ｋｂトランスジェニックマウスを、免疫原性ペプチド（少なくとも１つのＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ保有ペプチドを含む）をコードする１００μｇのＤＮＡミニ遺伝子でＩＭ免疫する。インキュベーション期間（３〜９週間の範囲をとる）の後、このマウスを、ＤＮＡミニ遺伝子によりコードされるのと同じ配列を発現する１０７ｐｆｕ／マウスの組み換えワクシニアウイルスを用いてＩＰでブーストする。コントロールマウスを、ミニ遺伝子配列を有さない１００μｇのＤＮＡもしくは組み換えワクシニアを用いるか、またはこのミニ遺伝子をコードするＤＮＡを用いるがワクシニアブーストを用いずに免疫する。２週間のさらなるインキュベーション期間の後、このマウス由来の脾細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてペプチド特異的な活性について直ちにアッセイする。さらに、脾細胞を、ミニ遺伝子中にコードされるＡ２拘束性ペプチドエピトープおよび組み換えワクシニアを用いてインビトロで刺激し、次いでαＩＦＮ ＥＬＩＳＡ、βＩＦＮ ＥＬＩＳＡ、および／またはγＩＦＮ ＥＬＩＳＡにおいてペプチド特異的な活性についてアッセイする。
プライムブーストプロトコルにおいて利用されるミニ遺伝子が、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフペプチドに対してＤＮＡ単独より高い免疫応答を誘発することが見出される。そのような分析をまた、ＨＬＡ−Ａ３またはＨＬＡ−Ｂ７のモチーフエピトープまたはスーパーモチーフエピトープによるＣＴＬ誘導を評価するために、ＨＬＡ−Ａ１１トランスジェニックマウスモデルまたはＨＬＡ−Ｂ７トランスジェニックマウスモデルを用いて実施し得る。ヒトにおけるプライムブーストプロトコルの使用を、「プライムブーストプロトコルを用いるＣＴＬ応答の誘導」と題した以下の実施例において記載する。
（実施例２４：予防使用のためのペプチド組成物）
本発明のワクチン組成物を使用して、この抗原を保有する腫瘍についての危険性を有するヒトにおける２４Ｐ４Ｃ１２発現を予防し得る。例えば、上記実施例において選択されるエピトープのような複数のＣＴＬエピトープおよびＨＴＬエピトープを含むポリエピトープペプチドエピトープ組成物（またはポリエピトープペプチドエピトープを含む核酸）（これらはまた、集団の８０％より多くを標的化するように選択される）を、２４Ｐ４Ｃ１２関連腫瘍についての危険性がある個体に投与する。
例えば、ペプチドベースの組成物を、複数のエピトープを含む単一のポリペプチドとして提供する。代表的には、アジュバント（例えば、フロイント不完全アジュバンド）を含む生理学的溶液中でワクチンを投与する。最初の免疫のためのペプチド用量は、７０ｋｇの患者について約１μｇ〜約５０，０００μｇであり、一般的には１００μｇ〜５，０００μｇである。ワクチンの最初の投与に引き続いて、４週間目にブースター投与をし、さらに引き続いてＰＢＭＣサンプル中のエピトープ特異的ＣＴＬ集団の存在を決定する技術により患者における免疫応答の大きさの評価をする。さらなるブースター用量を、必要である場合に投与する。この組成物は、２４Ｐ４Ｃ１２関連疾患に対する予防薬として安全かつ効果的であることが見出される。
あるいは、代表的にトランスフェクト薬剤を含む組成物を、当該分野において公知の方法論および本明細書中で開示される方法論に従い、核酸ベースのワクチンの投与のために使用する。
（実施例２５：ネイティブの２４Ｐ４Ｃ１２配列由来のポリエピトープワクチン組成物）
ネイティブの２４Ｐ４Ｃ１２ポリタンパク質配列を、複数のエピトープを含むポリタンパク質の「比較的短い」領域を同定するために、好ましくは、各々のクラスＩおよび／またはクラスＩＩのスーパーモチーフまたはモチーフについて規定されるコンピューターアルゴリズムを用いて分析する。好ましくは、この「比較的短い」領域は、全長のネイティブの抗原より長さが短い。複数の別個の、または重複する「ネスト化された（ｎｅｓｔｅｄ）」エピトープを含むこの比較的短い配列を、ミニ遺伝子構築物を作製するために使用し得る。この構築物を、ネイティブのタンパク質配列に対応するペプチドを発現するように操作する。この「比較的短い」ペプチドは、一般的に２５０アミノ酸長未満であり、しばしば１００アミノ酸長未満であり、好ましくは７５アミノ酸長未満であり、より好ましくは５０アミノ酸長未満である。このワクチン組成物のタンパク質配列は、この配列中に含まれる最大数のエピトープを有する（すなわち、それは、高濃度のエピトープを有する）ので、このワクチン組成物のタンパク質配列を選択する。本明細書中に示されるように、エピトープモチーフは、ネスト化されていても、重複してもよい（すなわち、互いに対してフレームシフトしてもよい）。例えば、重複エピトープを用いて、２つの９マーエピトープおよび１つの１０マーエピトープが、１０アミノ酸のペプチド中に存在し得る。そのようなワクチン組成物を、治療目的または予防目的のために投与する。
このワクチン組成物としては、例えば、２４Ｐ４Ｃ１２抗原由来の複数のＣＴＬエピトープおよび少なくとも１つのＨＴＬエピトープが挙げられる。このポリエピトープネイティブ配列を、ペプチドとしてかまたはこのペプチドをコードする核酸配列としてかのいずれかで投与する。あるいは、アナログを、そのネイティブ配列から作製し得、それにより１つ以上のエピトープが、そのポリエピトープペプチドの交叉反応性特性および／または結合親和性特性を変化させる置換を含む。
本実施例の実施形態は、免疫系プロセシングの未だ発見されていない局面を、ネイティブのネスト化された配列に適用し、それにより治療的または予防的な免疫応答を誘導するワクチン組成物の産生を容易にする可能性を提供する。さらに、そのような実施形態は、現在未知のＨＬＡ構造についてのモチーフ保有エピトープの可能性を提供する。さらに、この実施形態（類似の実施形態を除く）は、免疫応答をネイティブの２４Ｐ４Ｃ１２中に実際に存在する複数のペプチド配列に向け、それにより、任意の連結するエピトープを評価する必要性を除外する。最後に、この実施形態は、ペプチドワクチン組成物または核酸ワクチン組成物を産生する場合の規模の経済性を提供する。
この実施形態に関して、標的配列において、配列長あたり最も多数のエピトープを同定するために使用され得るコンピュータープログラムが、当該分野において利用可能である。
（実施例２６：複数の抗原由来のポリエピトープワクチン組成物）
本発明の２４Ｐ４Ｃ１２ペプチドエピトープを、他の標的腫瘍関連抗原由来のエピトープと組み合わせて使用して、２４Ｐ４Ｃ１２抗原およびそのような他の抗原を発現する癌の予防および処置に有用なワクチン組成物を作製する。例えば、ワクチン組成物を、２４Ｐ４Ｃ１２由来の複数のエピトープおよび２４Ｐ４Ｃ１２発現に関連する標的の癌でしばしば発現される腫瘍関連抗原を組み込む、単一のポリペプチドとして提供し得るか、または１つ以上の別個のエピトープのカクテルを含む組成物として投与し得る。あるいは、このワクチンを、ミニ遺伝子構築物として、またはインビトロでペプチドエピトープをロードした樹状細胞として投与し得る。
（実施例２７：免疫応答を評価するためのペプチドの使用）
本発明のペプチドを、２４Ｐ４Ｃ１２に対する特異的抗体、ＣＴＬまたはＨＴＬの存在についての免疫応答を分析するために使用し得る。そのような分析を、Ｏｇｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：２１０３〜２１０６、１９９８に記載される様式で実施し得る。本実施例において、本発明に従うペプチドを、診断目的または予防目的のための試薬として（免疫原としてではなく）使用する。
本実施例において、高度に感受性なヒト白血球抗原四量複合体（「四量体））を、例えば、疾患の異なる病期またはＡ＊０２０１モチーフを含む２４Ｐ４Ｃ１２ペプチドを含む免疫後のＨＬＡ Ａ＊０２０１陽性個体由来の２４Ｐ４Ｃ１２ ＨＬＡ−Ａ＊０２０１特異的ＣＴＬ頻度の横断解析のために使用する。四量体複合体を、記載される（Ｍｕｓｅｙら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３７：１２６７、１９９７）ように合成する。簡単には、精製したＨＬＡ重鎖（本実施例におけるＡ＊０２０１）およびβ２−ミクログロブリンを、原核生物発現系によって合成する。この重鎖を、膜貫通−細胞質ゾルテールの欠失およびＢｉｒＡ酵素ビオチン化部位を含む配列のＣＯＯＨ末端付加により改変する。重鎖、β２−ミクログロブリン、およびペプチドを、希釈により再折り畳みする。この４５ｋＤの再折り畳み産物を、高速タンパク質液体クロマトグラフィーによって単離し、次いでビオチン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）、アデノシン５’三リン酸およびマグネシウムの存在下でＢｉｒＡによりビオチン化する。ストレプトアビジン−フィコエリトリン結合体を、１：４のモル比で添加し、四量体産物を１ｍｇ／ｍｌまで濃縮する。得られた産物を、四量体−フェコエリトリンという。
患者の血液サンプルの分析のために、約１００万個のＰＢＭＣを、３００ｇで５分間遠心分離し、５０μｌの冷リン酸緩衝化生理食塩水に再懸濁する。三色分析を、抗ＣＤ８−トリカラー（Ｔｒｉｃｏｌｏｒ）、および抗ＣＤ３８と共に四量体−フィコエリトリンを用いて実施する。ＰＢＭＣを、氷上で四量体および抗体と共に３０〜６０分間インキュベートし、次いでホルムアルデヒド固定の前に２回洗浄する。９９．９８％より多くのコントロールサンプルを含むようなゲートを適用する。四量体についてのコントロールは、Ａ＊０２０１陰性の個体およびＡ＊０２０１陽性の罹患していないドナーの両方を含む。次いで、この四量体を用いて染色された細胞の百分率を、フローサイトメトリーによって決定する。この結果は、ＰＢＭＣサンプル中のエピトープ拘束性ＣＴＬ含有細胞の数を示し、これにより２４Ｐ４Ｃ１２エピトープに対する免疫応答の程度、従って、２４Ｐ４Ｃ１２への曝露の状態、または予防的応答もしくは治療的応答を誘発するワクチンへの曝露の状態を容易に示す。
（実施例２８：リコール（ｒｅｃａｌｌ）応答を評価するためのペプチドエピトープの使用）
本発明のペプチドエピトープを、患者におけるＴ細胞応答（例えば、急性またはリコール応答）を評価するための試薬として使用する。そのような分析を、２４Ｐ４Ｃ１２関連疾患から回復した患者または２４Ｐ４Ｃ１２ワクチンでワクチン接種した患者において実施し得る。
例えば、ワクチン接種したヒトのクラスＩ拘束性ＣＴＬ応答を分析し得る。このワクチンは、任意の２４Ｐ４Ｃ１２ワクチンでよい。ＰＢＭＣを、ワクチン接種した個体から回収し、ＨＬＡ型決定する。次いで、複数のＨＬＡスーパータイプファミリーメンバーに交叉反応性を提供するためのスーパーモチーフを必要に応じて保有する本発明の適切なペプチドエピトープを、そのＨＬＡ型を保有する個体由来のサンプルの分析のために使用する。
ワクチン接種した個体由来のＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度勾配（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で分離し、ＨＢＳＳ（ＧＩＢＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中で３回洗浄し、熱不活性化１０％のヒトＡＢ血清を含むＬ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）およびＨｅｐｅｓ（１０ｍＭ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０（ＧＩＢＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（完全ＲＰＭＩ）中に再懸濁し、マイクロ培養形式を用いてプレートする。本発明のエピトープを含む合成ペプチドを、各々のウェルに１０μｇ／ｍｌで添加し、そしてＨＢＶコア１２８〜１４０エピトープを、刺激の第一週目の間、Ｔ細胞ヘルプの供給源として各々のウェルに１μｇ／ｍｌ添加する。
マイクロ培養形式において、４×１０５ＰＢＭＣを、１００μｌ／ウェルの完全ＲＰＭＩの９６ウェルの丸底プレート中で、８つの複製培養物中にてペプチドで刺激する。３日目および１０日目に、１００μｌの完全ＲＰＭＩおよび２０Ｕ／ｍｌの最終濃度のｒＩＬ−２を、各々のウェルに添加する。７日目に、この培養物を、９６ウェルの平底プレートに移し、そしてペプチド、ｒＩＬ−２および１０５の照射（３，０００ｒａｄ）の自己フィーダー細胞を用いて再刺激する。この培養物を、１４日目に細胞傷害活性について試験する。陽性ＣＴＬ応答は、前に記載されるような（Ｒｅｈｅｒｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２：１１０４、１１０８、１９９６；Ｒｅｈｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：１６５５〜１６６５、１９９６；およびＲｅｈｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：１４３２〜１４４０、１９９６）罹患していないコントロール被験体との比較に基づいて、８つの複製培養物のうち２つ以上が１０％より多い特異的５１Ｃｒ放出を示すことを必要とする。
標的細胞株は、自己由来かつ同種異系のＥＢＶ形質転換したＢ−ＬＣＬであり、これらは、両方Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（ＡＳＨＩ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）から購入されるか、または記載されるように（Ｇｕｉｌｈｏｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２６７０〜２６７８、１９９２）患者のプールから樹立されるかのいずれかである。
細胞傷害性アッセイを、以下の様式で実施する。標的細胞は、同種異系のＨＬＡ適合性Ｂリンパ芽球細胞株または自己由来のＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球細胞株のいずれかからなり、これらを、１０μＭの本発明の合成ペプチドエピトープと共に一晩インキュベートし、そして１００μＣｉの５１Ｃｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ．、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）を用いて１時間にわたり標識し、その後これらを、ＨＢＳＳを用いて４回洗浄する。
細胞傷害活性を、３，０００標的／ウェルを含むＵ底の９６ウェルプレートを用いる標準的な４時間の、別々のウェルの５１Ｃｒ放出アッセイにおいて決定する。刺激されたＰＢＭＣを、２０〜５０：１のエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）の比率で１４日目に試験する。細胞傷害性％を、以下の式から決定する：１００×［（実験的放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出）］。最大放出を、界面活性剤（２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）による標的の溶解により決定する。自発的放出は、全ての実験について最大放出の２５％未満である。
このような分析の結果は、ＨＬＡ拘束性ＣＴＬ集団が、２４Ｐ４Ｃ１２または２４Ｐ４Ｃ１２ワクチンへの以前の曝露により刺激された程度を示す。
同様に、クラスＩＩ拘束性ＨＴＬ応答もまた分析し得る。精製されたＰＢＭＣを、１．５×１０５細胞／ウェルの密度の９６ウェルの平底プレート中で培養し、１０μｇ／ｍｌの本発明の合成ペプチド、２４Ｐ４Ｃ１２抗原全体、またはＰＨＡを用いて刺激する。細胞を、各々の条件について４〜６ウェルのレプリカとして慣用的にプレートする。７日間の培養の後、培地を除去し、そして１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む新しい培地と置換する。２日後、１μＣｉの３Ｈチミジンを、各々のウェルに添加し、そしてさらに１８時間にわたりインキュベーションを続ける。次いで、細胞ＤＮＡを、ガラスファイバーマット上に回収し、そして３Ｈチミジン取り込みについて分析する。抗原特異的Ｔ細胞増殖を、抗原の存在下での３Ｈチミジン取り込みを抗原の非存在下での３Ｈチミジン取り込みで割った比として計算する。
（実施例２９：ヒトにおける特異的ＣＴＬ応答の誘導）
本発明のＣＴＬエピトープおよびＨＴＬエピトープを含む免疫原性組成物についてのヒト臨床試験を、ＩＮＤ第Ｉ相、用量上昇研究として設定し、そして無作為化した二重盲検偽薬制御試験として実施する。そのような試験を、例えば、以下のように設計する：
全体で約２７人の個体を登録し、そして３つのグループに分ける；
グループＩ：３人の被験体に偽薬を注射し、そして６人の被験体に５μｇのペプチド組成物を注射する；
グループＩＩ：３人の被験体に偽薬を注射し、そして６人の被験体に５０μｇのペプチド組成物を注射する；
グループＩＩＩ：３人の被験体に偽薬を注射し、そして６人の被験体に５００μｇのペプチド組成物を注射する。
最初の注射の４週間後に、全ての被験体に同じ投与量で追加免疫接種した。
この研究において測定される終点は、このペプチド組成物の安全性および許容性、ならびにその免疫原性に関連する。このペプチド組成物に対する細胞性免疫応答は、このペプチド組成物の固有の活性の指標であり、従って生物学的有効性の尺度として見られ得る。以下は、安全性および有効性の終点に関する臨床データおよび研究室データを要約する。
安全性：有害な事象の発生率を、偽薬処置群および薬物処置群においてモニターし、そしてその程度および可逆性をもって評価する。
ワクチン有効性の評価：ワクチン有効性の評価のために、注射前後に、被験体から採血する。末梢血液単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離により新しいヘパリン化血液から単離し、凍結媒体中にアリコート化し、そして凍結保存する。サンプルを、ＣＴＬ活性およびＨＴＬ活性についてアッセイする。
ワクチンが、安全でありかつ有効であることが見出される。
（実施例３０：２４Ｐ４Ｃ１２を発現する患者における第ＩＩ相試験）
第ＩＩ相試験を、２４Ｐ４Ｃ１２を発現する癌を有する患者へのＣＴＬ−ＨＴＬペプチド組成物の投与の効果を研究するために実施する。この試験の主要な目的は、２４Ｐ４Ｃ１２を発現する癌患者においてＣＴＬを誘導するために有効な用量とレジメンを決定すること、これらの患者においてＣＴＬ応答およびＨＴＬ応答を誘導することの安全性を樹立すること、ならびに、どの程度のＣＴＬの活性化が、（例えば、病巣の減少および／または萎縮により明らかになるような）これらの患者の臨床像を改善するかをみることである。このような研究を、例えば、以下のように設計する。
この研究を、複数のセンターにおいて実施する。この試験の設計は、オープンラベルの未制御用量上昇プロトコルであり、ここで、このペプチド組成物を、単回容量として投与し、続いて、６週間後に同じ用量の単回の追加免疫注射を行う。この投与量は、注射一回あたり５０μｇ、５００μｇ、および５，０００μｇである。薬物関連の有害な効果（重篤度および可逆性）を記録する。
３つの患者のグループが存在する。第一のグループに５０μｇのこのペプチド組成物を注射し、第二および第三のグループにそれぞれ、５００μｇおよび５，０００μｇのペプチド組成物を注射する。各々のグループ内の患者は、２１歳〜６５歳の範囲であり、そして種々の人種集団バックグラウンドを示す。彼らの全ては、２４Ｐ４Ｃ１２を発現する腫瘍を有する。
臨床的発現または抗原特異的Ｔ細胞応答を、このペプチド組成物を投与することの効果を評価するためにモニタリングする。このワクチン組成物が、２４Ｐ４Ｃ１２関連疾患の処置において安全かつ有効であることが見出される。
（実施例３１：プライムブーストプロトコルを用いるＣＴＬ応答の誘導）
「プラスミド構築物およびそのプラスミド構築物が免疫原性を誘導する程度」と題された実施例において上述したような、トランスジェニックマウスにおけるＤＮＡワクチンの有効性を確認するために使用されるプロトコルと根底にある原理が類似するプライムブーストプロトコルをまた、ヒトにワクチンを投与するために使用し得る。そのようなワクチンレジメンは、例えば、裸のＤＮＡの最初の投与と、その後の、そのワクチンをコードする組み換えウイルス、またはアジュバント中で投与される組み換えタンパク質／ポリペプチドもしくはペプチド混合物を用いるブーストを含み得る。
例えば、最初の免疫を、発現ベクター（例えば、「『遺伝子』マルチエピトープＤＮＡプラスミドの構築」と題した実施例において、複数の部位で０．５ｍｇ〜５ｍｇの量でＩＭ（またはＳＣまたはＩＤ）投与される裸の核酸の形態で構築されるような発現ベクター）用いて実施し得る。この核酸（０．１μｇ〜１０００μｇ）をまた、遺伝子ガンを用いて投与し得る。３〜４週間のインキュベーション期間の後、次いで、ブースター用量を投与する。このブースターは、５×１０７ｐｆｕ〜５×１０９ｐｆｕの用量で投与される組み換え鶏痘ウイルスであり得る。代替的な組み換えウイルス（例えば、ＭＶＡウイルス、カナリア痘ウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルス）をまた、ブースターのために使用し得るか、またはポリエピトープタンパク質もしくはこれらのペプチドの混合物を投与し得る。ワクチン有効性の評価のために、免疫前ならびに最初のワクチンおよびワクチンのブースター用量の投与後に、間隔を空けて患者の血液サンプルを得る。末梢血液単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離により新しいヘパリン化血液から単離し、凍結培体中にアリコート化し、そして凍結保存する。サンプルを、ＣＴＬ活性およびＨＴＬ活性についてアッセイする。
これらの結果の分析は、２４Ｐ４Ｃ１２に対する治療的免疫または保護免疫を達成するのに十分な強度の応答が産生されることを示す。
（実施例３２：樹状細胞（ＤＣ）を用いるワクチン組成物の投与）
本発明のペプチドエピトープを含むワクチンを、ＡＰＣまたは「プロフェッショナル」ＡＰＣ（例えば、ＤＣ）を用いて投与し得る。本実施例において、ペプチドパルスされたＤＣを、患者に投与して、インビボでＣＴＬ応答を刺激する。この方法において、樹状細胞を、単離し、拡大させ、そして本発明のペプチドＣＴＬエピトープおよびペプチドＨＴＬエピトープを含むワクチンでパルスする。これらの樹状細胞を患者に注入して戻し、インビボでＣＴＬ応答およびＨＬＴ応答を誘発させる。次いで、誘導されたＣＴＬおよびＨＴＬは、このワクチン中のエピトープが由来する２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質を保有する標的細胞をそれぞれ破壊するか、または破壊を促進する。
例えば、エピトープを含むペプチドのカクテルを、ＰＢＭＣまたはそれから単離したＤＣにエキソビボで投与する。ＤＣの回収を容易にするための医薬（例えば、ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭ（Ｍｏｎｓａｎｔｏ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４）を用い得る。ペプチドを用いてＤＣをパルスした後、および患者への再注入の前に、このＤＣを洗浄して、結合していないペプチドを除去する。
臨床的に理解され、そして臨床的結果に基づいて当業者により容易に決定されるように、患者に再注入されるＤＣの数は変化し得る（例えば、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．４：３２８、１９９８；Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２：５２、１９９６およびＰｒｏｓｔａｔｅ ３２：２７２、１９９７を参照のこと）。患者１人あたり２〜５０×１０６個のＤＣを代表的に投与するが、より多い数のＤＣ（例えば、１０７または１０８）もまた、提供し得る。そのような細胞集団は、代表的に、５０％〜９０％の間のＤＣを含む。
いくつかの実施形態において、ペプチドをロードしたＰＢＭＣを、ＤＣを精製することなく患者に注射する。例えば、薬剤（例えば、ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭ）での処理の後に産生されたＰＢＭＣを、ＤＣを精製することなく患者に注射する。投与されるＰＢＭＣの総数は、しばしば、１０８〜１０１０の範囲をとる。一般的に、患者に注射される細胞用量は、例えば、特異的な抗ＤＣ抗体を用いる免疫蛍光分析により決定されるような、各患者の血液中のＤＣのパーセンテージに基づく。従って、例えば、ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭが所定の患者の末梢血液中の２％のＤＣを動員し、そしてその患者が５×１０６ ＤＣを受容している場合、この患者に、合計２．５×１０８ペプチドをロードしたＰＢＭＣを注射する。薬剤（例えば、ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭ）により動員されたＤＣ％は、代表的に、２〜１０％の間であると評価されるが、当業者に理解されるように変化し得る。
（エキソビボでのＣＴＬ／ＨＴＬ応答の活性化）
あるいは、２４Ｐ４Ｃ１２抗原に対するエキソビボでのＣＴＬ応答またはＨＴＬ応答は、ＤＣのようなＡＰＣの供給源および免疫原性ペプチドと共に、患者の、または遺伝的に適合性のＣＴＬ前駆体細胞またはＨＴＬ前駆体細胞を、組織培養中でインキュベーションすることによって誘導され得る。適切なインキュベーション時間（典型的には約７〜２８日間）後、その前駆該細胞は活性化され、そしてエフェクター細胞中へと拡大される。このエフェクター細胞は患者中に注入され、特異的標的細胞（すなわち、腫瘍細胞）を破壊する（ＣＴＬ）かまたは破壊を促進する（ＨＴＬ）。
（実施例３３：モチーフ保有ペプチドの同定および確認の代替方法）
モチーフ保有ペプチドを同定および確認する別の方法は、規定されたＭＨＣ分子を保有する細胞からそのペプチドを溶出することである。例えば、組織型決定に使用されるＥＢＶで形質転換されたＢ細胞株は、どのＨＬＡ分子をこれらが発現するかを決定するように広範に特徴付けられている。特定の場合において、これらの細胞は、ＨＬＡ分子の単一型のみを発現する。これらの細胞は、目的の抗原（例えば、２４Ｐ４Ｃ１２）を発現する核酸でトランスフェクトされ得る。次いで、トランスフェクションの結果として産生されるペプチドの内因性抗原プロセシングによって産生されるペプチドは、細胞内のＨＬＡ分子に結合し、そして輸送されて細胞表面に提示される。次いで、温和な酸条件にさらすことによって、ペプチドをＨＬＡ分子から溶出し、そしてこれらのアミノ酸配列を、例えば、質量分析（例えば、Ｋｕｂｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９１３，１９９４）によって決定する。特定のＨＬＡ分子に結合するペプチドの大部分はモチーフを保有していることから、これは、細胞上で発現される特定のＨＬＡ分子と関連するモチーフ保有ペプチドを得るための代替の様式である。
あるいは、内在性ＨＬＡ分子を発現しない細胞株が、単一のＨＬＡ対立遺伝子をコードする発現構築物でトランスフェクトされ得る。次いで、これらの細胞は、記載されるように使用され得る（すなわち、これらの細胞は、細胞表面上に提示されている２４Ｐ４Ｃ１２に対応するペプチドを単離するために、２４Ｐ４Ｃ１２をコードする核酸でトランスフェクトされ得る）。このような分析から得られたペプチドは、細胞中で発現される単一のＨＬＡ対立遺伝子への結合に対応するモチーフを保有する。
当業者に理解されるように、１つより多いＨＬＡ対立遺伝子を保有する細胞において同様の分析を実施し得、そしてそれに続く発現された各ＨＬＡ対立遺伝子に対して特異的なペプチドを決定し得る。さらに、当業者はまた、タンパク質抗原でのローディングのようなトランスフェクション以外の手段が、細胞に対する抗原供給源の提供のために使用され得ることを認識する。
（実施例３４：相補ポリヌクレオチド）
２４Ｐ４Ｃ１２コード配列またはその任意の部分に相補的な配列を使用して、天然に存在する２４Ｐ４Ｃ１２の発現を検出するか、減少するか、または阻害する。約１５〜３０塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用が記載されるが、より小さい配列フラグメントまたはより大きい配列フラグメントを用いて実質的に同一の手段を使用する。適切なオリゴヌクレオチドを、例えば、ＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および２４Ｐ４Ｃ１２のコード配列を使用して設計する。転写を阻害するために、相補オリゴヌクレオチドを、最も独特な５’側配列から設計し、そしてその相補オリゴヌクレオチドを使用して、コード配列へのプロモーターの結合を阻止する。翻訳を阻害するために、相補オリゴヌクレオチドを設計して、２４Ｐ４Ｃ１２をコードする転写産物へのリボソーム結合を阻止する。
（実施例３５：２４Ｐ４Ｃ１２特異的抗体を使用する、天然に存在する２４Ｐ４Ｃ１２または組換え２４Ｐ４Ｃ１２の精製）
天然に存在する２４Ｐ４Ｃ１２または組換え２４Ｐ４Ｃ１２を、２４Ｐ４Ｃ１２に特異的な抗体を使用して、免疫親和性クロマトグラフィーによって実質的に精製する。免疫親和性カラムを、活性化されたクロマトグラフィー樹脂（例えば、ＣＮＢｒ−活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ））に抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体を共有結合させることによって構築する。この結合後、樹脂をブロックし、そして製造者の指示書に従って洗浄する。
２４Ｐ４Ｃ１２を含む媒体を、免疫親和性カラムを通過させ、そしてそのカラムを２４Ｐ４Ｃ１２を優先的に吸着する条件下（例えば、界面活性剤の存在下における高イオン強度緩衝液）で洗浄する。このカラムを、抗体／２４Ｐ４Ｃ１２の結合を妨害する条件下（例えば、ｐＨ２〜ｐＨ３の緩衝液、または高濃度のカオトロープ（例えば、尿素またはチオシアネートイオン））で溶出し、そしてＧＣＲ．Ｐを回収する。
（実施例３６：２４Ｐ４Ｃ１２と相互作用する分子の同定）
２４Ｐ４Ｃ１２または生物学的に活性なそのフラグメントを、１２１ １ Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬で標識する。（例えば、Ｂｏｌｔｏｎら（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１３３：５２９．を参照のこと。）マルチウエルプレートのウェル中に事前に並べられた候補分子を、標識した２４Ｐ４Ｃ１２とともにインキュベートし、洗浄し、そして標識された２４Ｐ４Ｃ１２複合体を含む任意のウェルをアッセイする。異なる濃度の２４Ｐ４Ｃ１２を使用して得られたデータを使用して、候補分子との２４Ｐ４Ｃ１２の数、親和性、および会合の値を算出する。
（実施例３７：２４Ｐ４Ｃ１２腫瘍増殖促進についてのインビボアッセイ）
腫瘍細胞増殖に対する２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の効果を、２４Ｐ４Ｃ１２を発現しているか、または欠如している細胞の腫瘍発生および腫瘍増殖を評価することによって、インビボで評価する。例えば、ＳＣＩＤマウスに、ｔｋＮｅｏ空ベクターまたは２４Ｐ４Ｃ１２を含む１×１０６個の、３Ｔ３細胞株、前立腺癌細胞株、結腸癌細胞株、卵巣癌細胞株、肺癌細胞株、または膀胱癌細胞株（例えば、ＰＣ３細胞、Ｃａｃｏ細胞、ＰＡ−１細胞、ＣａＬｕ細胞、またはＪ８２細胞）のいずれかを、各側腹部に皮下注射する。以下の少なくとも２つの戦略を使用し得る：（１）ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（ＵＫ ２，２１１，５０４（１９８９年７月５日公表））、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから得られる構成的プロモーター、または異種哺乳動物プロモーター（例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター）（但し、これらのプロモーターは宿主細胞系と適合性である）から得られる構成的プロモーターのようなプロモーターの制御下での構成的２４Ｐ４Ｃ１２の発現、ならびに（２）誘導性ベクター系（例えば、エクジソン、テトラサイクリンなど）の制御下での調節された発現（但し、このようなプロモーターは宿主細胞系と適合性である）。次いで、腫瘍体積を、明らかな腫瘍の出現においてノギス（Ｃａｌｉｐｅｒ）測定によってモニターし、経時的に追跡して、２４Ｐ４Ｃ１２発現細胞がより早い速度で増殖する場合、２４Ｐ４Ｃ１２発現細胞によって産生される腫瘍が変化した攻撃性（例えば、転移の増強、血管新生、化学療法薬物に対する応答の減少）の特徴を示すか否かを、決定する。図３１および図３２に示されるように、２４Ｐ４Ｃ１２はＳＣＩＤマウスにおける腫瘍増殖に対し著しい効果を有する。前立腺癌細胞ＰＣ３およびＰＣ３−２４Ｐ４Ｃ１２をＳＣＩＤマウスの右側腹部に皮下注射した。腫瘍増殖をノギス測定によって評価した。腫瘍増殖における増大は、注射して４７日以内に、ＰＣ３−２４Ｐ４Ｃ１２腫瘍において観察された（図３１）。さらに、３Ｔ３−２４Ｐ４Ｃ１２の皮下注射により、ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍形成を誘導した（図３２）。この知見は、コントロール３Ｔ３細胞は腫瘍を形成しないので、有意であり、２４Ｐ４Ｃ１２は、いくつかの腫瘍増強能力（形質転換ならびに腫瘍の開始および腫瘍の促進を含む）を有することを示す。
（実施例３８：インビボにおける前立腺腫瘍の２４Ｐ４Ｃ１２モノクローナル抗体媒介性阻害）
癌組織における２４Ｐ４Ｃ１２の有意な発現は、正常組織におけるその制限された発現および細胞表面局在とともに、２４Ｐ４Ｃ１２を、抗体治療の優れた標的にする。同様に２４Ｐ４Ｃ１２は、Ｔ細胞ベースの免疫治療のための標的である。従って、ヒト前立腺癌異種移植片マウスモデルにおける抗２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＡｂの治療有効性を、ＰＣ３−２４Ｐ４Ｃ１２および３Ｔ３−２４Ｐ４Ｃ１２のような組換え細胞株（Ｋａｉｇｈｎ，Ｍ．Ｅ．，ら，Ｉｎｖｅｓｔ Ｕｒｏｌ，１９７９．１７（１）：ｐ．１６−２３を参照のこと）ならびにＬＡＰＣ９のようなヒト前立腺異種移植片モデル（Ｓａｆｆｒａｎら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００１，９８：２６５８）を用いて評価する。同様に、抗２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＡｂを、それぞれ、Ｊ８２−２４Ｐ４Ｃ１２、Ｃａｃｏ−２４Ｐ４Ｃ１２、ＰＡ−２４Ｐ４Ｃ１、またはＣａＬｕ−２４Ｐ４Ｃ１２のような組換え細胞株を用いたヒトの膀胱癌、結腸癌、卵巣癌、または肺癌の異種移植片モデルで評価する。
腫瘍増殖および転移形成に対する抗体効力を、例えば、マウスの同所性膀胱癌異種移植片モデルおよび前立腺異種移植片モデルにおいて研究する。この抗体は、本実施例において議論されるように非結合型であってもよく、または当該分野で理解されるように、治療様式に対し結合型であってもよい。抗２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＡｂは、前立腺および膀胱の異種移植片の形成を阻害する。抗２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＡｂはまた、樹立された同所性腫瘍の増殖を遅らせ、そして腫瘍保有マウスの生存を延長させる。これらの結果は、前立腺癌、結腸癌、卵巣癌、肺癌、および膀胱癌の局在的段階および進行段階の処置における抗２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＡｂの有用性を示す。（例えば、Ｓａｆｆｒａｎ，Ｄ．ら，ＰＮＡＳ １０：１０７３−１０７８またはｗｗｗ．ｐｎａｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｄｏｉ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．０５１６２４６９８を参照のこと）。
抗２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＡｂの投与は、樹立された同所性腫瘍増殖の遅延、および遠位部位への転移の阻害を導き、腫瘍保有マウスの生存の有意な延長を生じる。これらの研究は、２４Ｐ４Ｃ１２が、免疫治療のための魅力的な標的であることを示し、そして局所性および転移性の癌の処置のための抗２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＡｂの治療可能性を実証する。この実施例は、非結合型の２４Ｐ４Ｃ１２モノクローナル抗体がＳＣＩＤマウス中で増殖される、ヒトの前立腺癌、結腸癌、卵巣癌、肺癌、または膀胱癌の腫瘍異種移植片の増殖を阻害するために有効であることを実証する；従って、このような効果的なモノクローナル抗体の組み合わせもまた、有効である。
（複数の非結合体化２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＡｂを使用する腫瘍阻害）
（材料および方法）
（２４Ｐ４Ｃ１２モノクローナル抗体）：
モノクローナル抗体は、表題「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ２４Ｐ４Ｃ１２ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ｍＡｂｓ）」の実施例に記載されるように、２４Ｐ４Ｃ１２に対して惹起される。この抗体は、２４Ｐ４Ｃ１２に結合するそれらの能力について、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ＦＡＣＳ、および免疫沈降によって特徴付けられる。ＥＬＩＳＡおよびウェスタン分析によって測定されるような抗２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＡｂについてのエピトープマッピングデータは、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質上のエピトープを認識する。前立腺癌の組織および細胞の、これらの抗体を用いる免疫組織化学分析が実施される。
このモノクローナル抗体は、プロテインＧセファロースクロマトグラフィー、ＰＢＳに対する透析、濾過滅菌、および−２０℃での貯蔵によって、腹水またはハイブリドーマ組織培養上清から精製される。タンパク質測定をＢｒａｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）によって実施する。治療モノクローナル抗体、または個々のモノクローナル抗体の混合物を含むカクテルを調製し、ＳＣＡＢＥＲ、Ｊ８２、Ａ４９８、７６９Ｐ、ＣａＯｖ１またはＰＡ１の腫瘍異種移植片の皮下的または同所的な注射を受けるマウスの処置のために使用する。
（細胞株）
前立腺癌、結腸癌、卵巣癌、肺癌および膀胱癌の癌細胞株である、Ｃａｃｏ、ＰＡ−１、ＣａＬｕまたはＪ８２、ならびに繊維芽細胞株ＮＩＨ ３Ｔ３（アメリカンタイプカルチャーコレクション）を、Ｌ−グルタミンおよび１０％ＦＢＳを補充した培地中で維持する。
ＰＣ３−２４Ｐ４Ｃ１２、Ｃａｃｏ−２４Ｐ４Ｃ１２、ＰＡ−２４Ｐ４Ｃ１２、ＣａＬｕ−２４Ｐ４Ｃ１２またはＪ８２−２４Ｐ４Ｃ１２細胞および３Ｔ３−２４Ｐ４Ｃ１２細胞集団を、Ｈｕｂｅｒｔ，Ｒ．Ｓ．，ら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９９９．９６（２５）：１４５２３に記載されるようにレトロウイルス遺伝子の移送によって作製する。
（異種移植片マウスモデル）
皮下（ｓ．ｃ．）腫瘍を、雄性ＳＣＩＤマウスの右脇腹に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と１：１の希釈で混合された１×１０６個の癌細胞を注射することによって作製する。腫瘍形成における抗体効力を試験するために、ｉ．ｐ．抗体注射を、腫瘍細胞注射と同じ日に開始する。コントロールとして、マウスに、精製マウスＩｇＧ（ＩＣＮ）もしくはＰＢＳ；またはヒト細胞中に発現されない無関係の抗原を認識する精製モノクローナル抗体のいずれかを注射する。腫瘍サイズは、ノギス測定によって決定され、そして腫瘍体積は、長さ×幅×高さから算出される。１．５ｃｍよりも大きい直径のｓ．ｃ．腫瘍を有するマウスを屠殺する。
同所性の注射をケタミン／キシラジンを使用することによって、麻酔下で実施する。膀胱同所性研究のために、膀胱を露出させるために腹を通って切開し、Ｍａｔｒｉｇｅｌと混合された腫瘍細胞（５×１０５）を１０μｌ容量で、膀胱壁に注射する。腫瘍成長をモニターするために、ＢＴＡレベルを測定するために１週間おきにマウスから採血する。前立腺同所性研究のために、膀胱および精嚢を露出させるために腹筋を通って切開し、前立腺背部を露出させるために切開を送達する。Ｍａｔｒｉｇｅｌと混合されたＬＡＰＣ−９細胞（５×１０５）のような腫瘍細胞を１０μｌ容量で前立腺に注射する（Ｙｏｓｈｉｄａ Ｙら，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９８，１８：３２７；Ａｈｎら，Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ．２００１，２２：１４６）。腫瘍成長をモニターするために、ＰＳＡレベルを測定するために１週間おきにマウスを採血する。同様の手順が、肺および卵巣の異種移植片モデルについて、後に続く。マウスを、ｉ．ｐ．注射される抗２４Ｐ４Ｃ１２またはコントロールｍＡｂでの適切な処置のためにグループに分離する。
（抗２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＡｂは、２４Ｐ４Ｃ１２発現異種移植片癌腫瘍の増殖を阻害する）
腫瘍形成に対する抗２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＡｂの効果を、膀胱の増殖および進行、ならびにＰＣ３−２４Ｐ４Ｃ１２、Ｃａｃｏ−２４Ｐ４Ｃ１２、ＰＡ−２４Ｐ４Ｃ１２、ＣａＬｕ−２４Ｐ４Ｃ１２またはＪ８２−２４Ｐ４Ｃ１２同所性モデルを使用して、前立腺癌異種移植片に関して試験する。ｓ．ｃ．腫瘍モデルと比較して、これらの同所性モデルは、それぞれのマウスの前立腺、結腸、卵巣、肺および膀胱における腫瘍細胞の直接的な注射を必要とし、局所的腫瘍増殖、遠位部位への転移の発生、マウスの健康の悪化、およびそれに続く死を生じる（Ｓａｆｆｒａｎ，Ｄ．ら，ＰＮＡＳ（前出）；Ｆｕ，Ｘ．ら，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，１９９２．５２（６）：ｐ．９８７−９０；Ｋｕｂｏｔａ，Ｔ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９４．５６（１）：ｐ．４−８）。この特徴は、同所性モデルをより代表的なヒトの疾患進行のモデルとし、そして臨床的に関連する終点におけるｍＡｂの治療効果を追跡することを可能にする。
従って、腫瘍細胞をマウスの器官に注射し、そして２日後、このマウスを２つのグループに分けて以下のいずれかで処理する：ａ）２００〜５００μｇの抗２４Ｐ４Ｃ１２ Ａｂ、またはｂ）ＰＢＳ（２〜５週間にわたり１週間に３度）。
同所性癌モデルの主要な利点は、転移の発生を研究することができることである。確立された同所性腫瘍を保有するマウス中の転移の形成は、腫瘍特異的細胞表面タンパク質（例えば、膀胱癌についての抗ＣＫ２０、前立腺癌モデルについての抗ＳＴＥＡＰ）に対する抗体を使用して肺切片におけるＩＨＣ分析によって研究される（Ｌｉｎ Ｓら，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔ Ｐｒｅｖ．２００１；２５：２０２；Ｓａｆｆｒａｎ，Ｄ．，ら，ＰＮＡＳ（前出））。
確立された同所性腫瘍を保有するマウスは、４週間にわたって抗２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＡｂまたはＰＢＳのいずれかの１０００μｇ注射を投与される。両方のグループのマウスは、高い全身腫瘍組織量を確立し得、マウスの肺における転移形成を確実に高頻度にさせる。次いで、マウスを殺傷し、それらの膀胱、肝臓、骨組織および肺をＩＨＣ分析によって腫瘍細胞の存在について分析する。
これらの研究は、異種移植片マウスモデル中の前立腺癌および腎臓癌の発生および進行に対する、抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体の広範な抗腫瘍効力を示す。抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体は、腫瘍形成を阻害し、既に確立された腫瘍の増殖を遅延化し、処置されたマウスの生存を延長させる。さらに、抗２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＡｂは、大きい全身腫瘍組織量の存在下でさえも局所的な膀胱腫瘍および前立腺腫瘍の、遠位部位への拡散に対して劇的な阻害効果を示す。従って、抗２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＡｂは、主要な臨床的に関連する終点（腫瘍増殖）、生存性の延長および健康に対して効能がある。
（実施例３９：ヒトにおける抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体の治療的使用および診断的使用）
抗２４Ｐ４Ｃ１２モノクローナル抗体は安全であり、ヒトにおける診断目的、予防目的、予後目的および／または治療目的のために有効に使用される。抗２４Ｐ４Ｃ１２ｍＡｂを使用した、癌組織および癌異種移植片のウェスタンブロットおよび免疫組織化学的な分析は、癌において強く広範囲の着色が示されるが、正常組織において有意に低いかまたは検出不可能なレベルを示す。癌および転移疾患における２４Ｐ４Ｃ１２の検出は、診断指標および／または予後指標としてのｍＡｂの有用性を実証する。抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体は、従って診断適用（例えば、疑わしい患者からの癌を検出するための腎臓生体標本の免疫組織学）において使用される。
フローサイトメトリーで測定されるように、抗２４Ｐ４Ｃ１２ｍＡｂは、特異的に癌細胞に結合する。従って、抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体は、２４Ｐ４Ｃ１２の発現を示す局所性癌および転移の検出のために診断的全身画像化適用（例えば、放射免疫シンチグラフィーおよび放射免疫治療）において使用される（例えば、Ｐｏｔａｍｉａｎｏｓ Ｓら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０（２Ａ）：９２５〜９４８（２０００）を参照のこと）。２４Ｐ４Ｃ１２の細胞外ドメインの細胞外環境への発散または放出（例えば、アルカリホスファターゼＢ１０に見られる（Ｍｅｅｒｓｏｎ，Ｎ，Ｒ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２７：５６３〜５６８（１９９８））は、疑わしい患者からの血清および／または尿サンプルにおいて、抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体による２４Ｐ４Ｃ１２の診断的検出を可能にする。
２４Ｐ４Ｃ１２を特異的に結合する抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体は、２４Ｐ４Ｃ１２を発現する癌の処置のために、治療的な適用において使用される。抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体は、非結合様式および、抗体が当該分野で周知の様々な治療的様式または画像化様式（例えば、プロドラッグ、酵素または放射性同位体）の１つと結合される、結合体化形態として使用される。前臨床の研究において、非結合および結合抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体は、ＳＣＩＤマウス癌異種移植モデル（例えば、腎臓癌モデルＡＧＳ−Ｋ３およびＡＧＳ−Ｋ６）における腫瘍予防および成長阻害の効能について試験される（例えば、「２４Ｐ４Ｃ１２ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｌａｄｄｅｒ ａｎｄ Ｌｕｎｇ Ｔｕｍｏｒｓ Ｉｎ Ｖｉｖｏ」と題される実施例を参照のこと）。結合抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体および非結合抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体のいずれかが、ヒト臨床試験における治療的様式として単独、または以下の実施例において記載されるような他の治療と組み合わせのいずれかで使用される。
（実施例４０：インビボでのヒト抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体の使用を介した、ヒト癌腫の処置および診断のためのヒト臨床試験）
２４Ｐ４Ｃ１２上のエピトープを認識する抗体を本発明に従って使用し、そしてこの抗体を、表１に列挙されるような特定の腫瘍の処置において使用する。多数の因子 （２４Ｐ４Ｃ１２発現レベルを含む）に基づいて、表１に列挙されるような腫瘍は、現在好ましい指標である。これらの指標の各々と関連して、３つの臨床的アプローチを、首尾よく実行する。
Ｉ．）補助的治療： 補助的治療において、患者を、化学療法剤もしくは抗新生物剤および／または放射線療法と組み合わせて、抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体で処置する。表Ｉに列挙されるような原発性癌標的を、第一の系および第二の系の標準的な治療に、抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体を付加することによって、標準的なプロトコルの下で処置する。プロトコルの設計は、腫瘍塊の減少によって評価されるような有効性および通常用量の標準的な化学療法を低減する能力を扱う。これらの投薬量の低減は、化学療法剤の用量関連毒性を低減することによって、さらなる治療および／または延長された治療を可能にする。抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体は、化学療法剤または抗新生物剤のアドリアマイシン（進行した前立腺癌腫）、シスプラチン（進行した頭部および頸部の癌腫、ならびに肺癌腫）、タキソール（乳癌）およびドキソルビシン（臨床前）と組み合わせて、いくつかの補助的臨床試験において利用される。
ＩＩ．） 単独療法（ｍｏｎｏｔｈｅｒａｐｙ）：腫瘍の単独療法における抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体の使用に関連して、これらの抗体は、化学療法剤も抗新生物剤も伴わずに、患者に投与される。１つの実施形態において単独療法は、広範な転移性疾患に罹患する、末期の癌患者において、臨床的に実施される。患者は、いくらかの疾患安定化を示す。試験は、癌性腫瘍を有する治療抵抗性患者において有効性を実証する。
ＩＩＩ．） 造影剤：放射性核種（例えば、ヨウ素またはイットリウム（Ｉ１３１、Ｙ９０））を抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体に結合させることによって、放射性標識した抗体を、診断剤および／または造影剤として利用する。このような役割において、標識された抗体は、固形腫瘍ならびに２４Ｐ４Ｃ１２発現細胞の転移性病変の両方に局在する。造影剤としての抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体の使用に関連して、これらの抗体は、手術前スクリーニングならびにどの腫瘍が残存および／または復帰するかを決定するための術後追跡の両方として、固形腫瘍の外科的処置の補助として使用される。１実施形態において、（１１１Ｉｎ）２４Ｐ４Ｃ１２抗体を、２４Ｐ４Ｃ１２を発現する癌腫を有する患者における、第Ｉ相ヒト臨床試験において造影剤として使用する（類推として、例えば、Ｄｉｖｇｉら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８３：９７−１０４（１９９１）を参照のこと）。患者を、標準的な前方γ線カメラおよび後方γ線カメラで追跡する。これらの結果は、原発性病変および転移性病変が同定されることを示す。
（投与用量および投与経路）
当業者によって理解されるように、投与上考慮すべき事柄は、診療所において存在する類似の製品と比較して決定され得る。従って、抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体は、５〜４００ｍｇ／ｍ２の範囲の投薬量で投与され得、例えば、安全性試験に関しては、より低い投薬量で使用される。その標的に対する既知の抗体の親和性と比較した抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体の親和性は、類似の投薬量レジメンを決定するために当業者によって使用される１つのパラメーターである。さらに、完全にヒト抗体である抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体は、キメラ抗体と比較する場合、よりゆっくりしたクリアランスを有する；従って、このような完全なヒト抗体である抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体を用いる、患者における投薬は、おそらく５０〜３００ｍｇ／ｍ２の範囲において、より低くあり得、なお有効なままであり得る。ｍｇ／ｋｇでの従来の容量測定と反対に、ｍｇ／ｍ２での投薬は、表面積に基づく測定であり、そして幼児から成人までの全てのサイズの患者を含むように設計された便利な投薬測定である。
３つの別個の送達アプローチが、抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体の送達に有用である。従来の静脈内送達は、多くの腫瘍についての１つの標準的な送達技術である。しかし、腹腔内の腫瘍（例えば、卵巣、胆管、他の管などの腫瘍）に関して、腹膜腔内投与は、腫瘍において高い用量の抗体を得るために、そしてまた抗体クリアランスを最小にするために好都合であることを証明し得る。同様の様式で、特定の固形腫瘍は、局所的灌流に適切な脈管構造を有する。局所的灌流は、腫瘍部位における抗体の高い用量を可能にし、そして抗体の短期クリアランスを最小にする。
（臨床的開発計画（ＣＤＰ））
概論： ＣＤＰは、補助的治療、単独療法に関して、および造影剤として、抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体の処置を追跡および開発する。試験は、最初に安全性を実証し、その後反復投薬で効力を確認する。試験は、標準的な化学療法を、標準的治療＋抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体と比較する、オープンラベルである。理解されるように、患者の登録に関して利用され得る１つの基準は、生検によって決定されるような、患者の腫瘍における２４Ｐ４Ｃ１２の発現レベルである。
任意のタンパク質または抗体注入ベースの治療を用いるときのように、安全性の考慮は、主に以下に関連する：（ｉ）サイトカイン放出症候群（すなわち、低血圧、発熱、振せん（ｓｈａｋｉｎｇ）、悪寒；（ｉｉ）物質に対する免疫応答の発生（すなわち、患者による、抗体療法に対するヒト抗体の発生、またはＨＡＨＡ応答）；および（ｉｉｉ）２４Ｐ４Ｃ１２を発現する正常細胞に対する毒性。標準的な試験および追跡を、これらの安全性の考慮の各々をモニタリングするために利用する。抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体は、ヒト投与の際に安全であることが見出される。
（実施例４１：ヒト抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体および化学療法剤を用いる、ヒト臨床試験補助治療）
第Ｉ相ヒト臨床試験を、固形腫瘍（例えば、表Ｉに列挙される組織の癌）の処置に関して、ヒト抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体の６つの静脈内用量の安全性を評価するために開始する。この研究において、本明細書中で規定される抗新生物剤または化学療法剤（例えば、シスプラチン、トポテカン、ドキソルビシン、アドリアマイシン、タキソールなどであるが、これらに限定されない）に対する補助的治療として利用される場合、抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体の単回用量の安全性を、評価する。試験設計は、抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体の６つの単回用量の送達を含み、抗体の投薬量は、以下のスケジュールに従う処置過程にわたって、ほぼ約２５ｍｇ／ｍ２〜約２７５ｍｇ／ｍ２まで増大する：
Figure 2006508163
 抗体および化学治療剤のそれぞれの投与後、患者を１週間密接に追跡する。特に、上記の安全性の問題：（ｉ）サイトカイン放出症候群（すなわち、低血圧、発熱、振せん、悪寒）；（ｉｉ）その物質に対する免疫原性応答の発生（すなわち、ヒト抗体治療剤に対する、患者によるヒト抗体の発生、またはＨＡＨＡ応答）；ならびに（ｉｉｉ）２４Ｐ４Ｃ１２を発現する正常細胞に対する毒性について、患者を評価する。標準的な試験および追跡試験を利用して、これらの安全性の問題のそれぞれをモニターする。患者はまた、臨床結果について、そして特に、ＭＲＩまたは他の画像化によって証明されるような腫瘍塊の低減について、評価される。
この抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体は、安全かつ有効であることが実証され、第ＩＩ相臨床試験はこの有効性を確認し、そして最適な投薬をさらに正確にする。
（実施例４２：ヒト臨床試験：ヒト抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体を用いる単独治療法（ｍｏｎｏｔｈｅｒａｐｙ））
抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体は、上で考察した補助試験に関して安全であり、第ＩＩ相ヒト臨床試験は、単独治療法についての有効性および最適な投薬を確認する。このような試験が達成され、そして患者が抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体の用量を受けると同時に化学療法を受けないこと以外は、上記の補助試験と同じ安全性および結果の分析を包含する。
（実施例４３：ヒト臨床試験：抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体を用いる診断的画像化）
繰り返すと、上で考察した補助治療法が上で考察した安全性の判定基準内で安全である場合、ヒト臨床試験は、診断的造影剤としての抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体の使用に関して行われる。このプロトコルは、当該分野で記載される様式と実質的に類似の様式で設計される（例えば、Ｄｉｖｇｉら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８３：９７−１０４（１９９１））。この抗体は、診断様式として使用される場合、安全かつ有効の両方であることが見出される。
（実施例４４：既知配列との２４Ｐ４Ｃ１２の相同性の比較）
図３の２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質は、７１０アミノ酸を有し、算出された分子量は、７９．３ｋＤａであり、ｐＩは、８．９である。２４Ｐ４Ｃ１２のいくつかの改変体は、同定されており、４個のＳＮＰ（すなわち、ｖ．１、ｖ．３、ｖ．５、ｖ．６）および３個のスプライシング改変体（すなわちｖ．７、ｖ．８、およびｖ．９）が挙げられる（図１０および図１１）。２４Ｐ４Ｃ１２改変体であるｖ．３、ｖ．５およびｖ．６は、２４Ｐ４Ｃ１２とそれぞれ１アミノ酸が異なっており、それは各々、位置１８７、位置３２６および位置４３６においてである。改変体ｖ．７は、アミノ酸２３７において始まる１１１アミノ酸の欠失を有しており、一方、改変体ｖ．８および改変体ｖ．９は、各々アミノ酸６４２およびアミノ酸３７８において挿入物を含んでいる。この２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質は、以前にクローニングされたヒト遺伝子（すなわち、コレン（ｃｈｏｒｉｎｅ）トランスポーター様タンパク質４（ｇｉ １４２４９４６８）としても公知のＮＧ２２）と相同性を示す。それらは、９９％の同一性を示し、そのタンパク質の長さを超えるＣＴＬ４タンパク質と９９％相同性である（図４）。２４Ｐ４Ｃ１２は、複数膜貫通タンパク質であり、１０個、１１個、または１３個の膜貫通ドメインを有すると予想される。バイオインフォマティクスの分析は、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質が、いくつかの小胞体局在とと一緒に細胞膜に局在化することを示す（表Ｌを参照のこと）。最近の文献証拠は、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質が、細胞表面に局在化する１０回膜貫通タンパク質であることを示す（Ｏ’Ｒｅｇａｎ ＳらＰＮＡＳ ２０００、９７：１８３５）。
細胞膜の不可欠な成分としてのコリンは、正常細胞もしくは腫瘍細胞の細胞の完全性、増殖、および生存において、重要な役割を果たす。コリンは、正常な対応物と関連して、腫瘍細胞中で増大する濃度において蓄積し、従って、磁気共鳴画像法によって癌細胞を検出する（Ｋｕｒｈａｎｅｗｉｃｚ Ｊら、Ｊ Ｍａｇｎ Ｒｅｓｏｎ Ｉｍａｇｉｎｇ ２００２）ためのツールの性質がある。膜の完全性を維持することにおけるコリンの役割に加えて、コリンは、膜から核への情報伝達でさえ仲介する（Ｓｐｉｅｇｅｌ Ｓ、Ｍｉｌｓｔｉｅｎ Ｓ．Ｊ Ｍｅｍｂｒ Ｂｉｏｌ．１９９５、１４６：２２５）。コリン代謝産物は、スフィンゴシルフォスフォリルコリンおよびリソホスファチジルコリンを含み、それらの両方ともが、活性Ｇタンパク質結合レセプターである（Ｘｕ ＦらＢｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２００２、１５８２：８１）。さらに、コリンは、Ｒａｆ−１を含むキナーゼ経路の活性化をもたらす（Ｌｅｅ Ｍ、Ｈａｎ ＳＳ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ ２００２、１４：３７３）。コリンはまた、ＤＮＡのメチル化および遺伝子発現の調節においても役割を果たす。例えば、コリン代謝産物は、腫瘍増殖のために不可欠なサイトカインまたはケモカインの発現を調節する（Ｓｃｈｗａｒｔｚ ＢＭら、Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ．２００１、８１：２９１；Ｄｅｎｄａ Ａら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．２００２、２３：２４５）。細胞シグナル伝達および遺伝子発現に対するコリンの効果のために、コリンは、細胞増殖および細胞生存を制御する（Ｈｏｌｍｅｓ−ＭｃＮａｒｙ ＭＱら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００１、２７６：４１１９７；Ａｌｂｒｉｇｈｔら、ＦＡＳＥＢ １９９６、１０：５１０）コリン欠乏は、細胞死、アポトーシスおよび形質転換をもたらすが、一方で、コリンの蓄積は、腫瘍増殖に関連する（Ｚｅｉｓｅｉ Ｓら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ １９９７、１８：７３１）。従って、２４Ｐ４Ｃ１２が腫瘍形成、細胞増殖、浸潤、または細胞シグナル伝達の調節因子として機能する場合、２４Ｐ４Ｃ１２は、治療目的、診断目的、予後目的および／または予防目的のために用いられる。
（実施例４５：潜在的なシグナル伝達経路の同定および確認）
多くの哺乳動物のタンパク質は、シグナル伝達分子と相互作用し、そしてシグナル伝達経路の調節に関与することが報告されている（Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２００１；７６：２１７−２２３）。特に、コリンは、ＭＡＫカスケードおよびＧタンパク質を活性化させることが報告されており、かつＤＡＧおよびセラミドおよびスフィンゴシルフォスフォリルコリンシグナル伝達経路に関連している（Ｃｕｍｍｉｎｇｓら、上記）さらに、コリンは、コリンキナーゼおよびホスホリパーゼ活性を調節することにより、シグナルを伝達し、腫瘍形成効果を促進する結果となる（Ｒａｍｉｒｅｚら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００２、２１：４３１７；Ｌｕｃａｓら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００１、２０：１１１０；Ｃｈｕｎｇ Ｔら、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ．２０００、１２：２７９）。
免疫沈降技術およびウェスタンブロッティング技術を使用して、２４Ｐ４Ｃ１２と結合し、かつシグナル伝達事象を媒介するタンパク質を同定する。リン脂質経路（例えば、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴなど）、接着経路および移動経路（ＦＡＫ、Ｒｈｏ、Ｒａｃ−１などを含む）、ならびにＥＲＫ、ｐ３８などのような有糸分裂／生存カスケードを含む、癌の生物学において役割を果たすことが知られるいくつかの経路が、２４Ｐ４Ｃ１２によって調節され得る（Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．２０００，１１：２７９；Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９９，２７４：８０１；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２０００，１９：３００３；Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９７，１３８：９１３）。ウェスタンブロッティング技法および他の技法を用いて、２４Ｐ４Ｃ１２のこれらの経路を調節する能力を確認する。２４Ｐ４Ｃ発現細胞または２４Ｐ４Ｃ１２を欠く細胞は、処置されないか、またはサイトカイン、アンドロゲンおよび抗インテグリン抗体で刺激される。細胞溶解産物を、抗ホスホ（ｐｈｏｓｐｈｏ）特異的抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて分析し、ＥＲＫ、ｐ３８、ＡＫＴ、ＰＩ３Ｋ、ＰＬＣおよび他のシグナル伝達分子のリン酸化および調節を検出する。
２４Ｐ４Ｃ１２が細胞内で、直接的または間接的に既知のシグナル伝達経路を活性化することを確認するために、個々の遺伝子を発現する細胞において、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）ベースの転写レポーターアッセイを行う。これらの転写レポーターは、十分に特徴付けられたシグナル伝達経路の下流に位置する、既知の転写因子に対するコンセンサス結合部位を含む。これらの関連転写因子、シグナル伝達経路および活性化刺激のレポーターおよび例を、以下に列挙する。
１．ＮＦκＢ−ｌｕｃ、ＮＦκＢ／Ｒｅｌ；Ｉκ−キナーゼ／ＳＡＰＫ；増殖／アポトーシス／ストレス
２．ＳＲＥ−ｌｕｃ、ＳＲＦ／ＴＣＦ／ＥＬＫ１；ＭＡＰＫ／ＳＡＰＫ；増殖／分化
３．ＡＰ−１−ｌｕｃ、ＦＯＳ／ＪＵＮ；ＭＡＰＫ／ＳＡＰＫ／ＰＫＣ；増殖／アポトーシス／ストレス
４．ＡＲＥ−ｌｕｃ、アンドロゲンレセプター；ステロイド／ＭＡＰＫ；増殖／分化／アポトーシス
５．ｐ５３−ｌｕｃ、ｐ５３；ＳＡＰＫ；増殖／分化／アポトーシス
６．ＣＲＥ−ｌｕｃ、ＣＲＥＢ／ＡＴＦ２；ＰＫＡ／ｐ３８；増殖／アポトーシス／ストレス
７．ＴＣＦ−ｌｕｃ、ＴＣＦ／Ｌｅｆ；β−カテニン、接着／浸潤
遺伝子媒介性の影響を、ｍＲＮＡ発現を示す細胞においてアッセイし得る。ルシフェラーゼレポータープラスミドを、脂質媒介性トランスフェクション（ＴＦＸ−５０、Ｐｒｏｍｅｇａ）によって導入し得る。細胞抽出物をルシフェリン基質と共にインキュベートすることによって、相対的な転写活性の指標であるルシフェラーゼ活性を測定し、そしてこの反応の発光をルミノメーターでモニタリングする。
２４Ｐ４Ｃ１２によって活性化されるシグナル伝達経路をマッピングし、そして治療標的の同定および確認のために使用する。２４Ｐ４Ｃ１２が細胞シグナル伝達に関与する場合、これは、診断目的、予後目的、予防目的および／または治療目的のための標的として使用される。
（実施例４６：コリントランスポーターとしての２４Ｐ４Ｃ１２機能）
２４Ｐ４Ｃ１２の配列分析および相同性分析は、２４Ｐ４Ｃ１２がトランスポートドメインを有し、そして２４Ｐ４Ｃ１２がコリントランスポーターとして機能することを示す。２４Ｐ４Ｃ１２がコリンをトランスポートすることを確認するために、前立腺、結腸、膀胱および肺の株を含む初代細胞ならびに腫瘍細胞を、３Ｈ−コリンの存在下および非存在下で増殖させる。放射性コリンの取り込みを、１分あたりの取り込まれた数（ｃｐｍ）を数えることにより測定する。親の２４Ｐ４Ｃ１２陰性細胞を、本アッセイおよび同様のアッセイを用いて２４Ｐ４Ｃ１２発現細胞と比較する。同様に、親細胞および２４Ｐ４Ｃ１２発現細胞を、ＮＭＲ分光法を用いてコリン含有量について比較し得る。これらのアッセイ系を、コリンの取り込みおよび／または２４Ｐ４Ｃ１２の機能を干渉する低分子および抗体を同定するために用い得る。
従って、２４Ｐ４Ｃ１２機能を阻害するために設計された化合物および低分子、ならびに下流のシグナル伝達事象を、治療目的、予後目的および／または予防目的のために用いる。
（実施例４７：転写の調節）
２４Ｐ４Ｃ１２の細胞表面局在化およびＤＮＡのメチル化を調節する能力は、２４Ｐ４Ｃ１２が、真核生遺伝子の転写調節の調節因子として有効に使用されることを示す。遺伝子発現の調節を、例えば、２４Ｐ４Ｃ１２を発現するかまたは欠損する細胞における遺伝子発現を研究することによって確認する。この目的のために、２つの型の実験を行う。
第１のセットの実験において、親細胞および２４Ｐ４Ｃ１２発現細胞由来のＲＮＡを、抽出し、そして市販される遺伝子アレイ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にハイブリダイズさせる（Ｓｍｉｄ−Ｋｏｏｐｍａｎ Ｅら、Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２０００．８３：２４６）。休止細胞とＦＢＳ、フェロモンまたは増殖因子で処理した細胞とを比較する。差次的に発現した遺伝子を、当該分野で公知の手順に従って同定する。次いで、差次的に発現した遺伝子を、生物学的経路にマッピングする（Ｃｈｅｎ Ｋら、Ｔｈｙｒｏｉｄ．２００１．１１：４１．）。
第２のセットの実験において、特定の転写経路活性化を、市販のルシフェラーゼレポーター構築物（ＮＦκＢ−ｌｕｃ、ＳＲＥ−ｌｕｃ、ＥＬＫ１−ｌｕｃ、ＡＲＥ−ｌｕｃ、ｐ５３−ｌｕｃおよびＣＲＥ−ｌｕｃを含む）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して評価する。これらの転写レポーターは、十分に特徴付けられたシグナル伝達経路の下流に位置する公知の転写因子に対するコンセンサス結合部位を含み、そして経路活性化を確かめるためならびに経路活性化の正の調節因子および負の調節因子についてスクリーニングするための良好なツールを表す。
従って、２４Ｐ４Ｃ１２は、遺伝子調節における役割を果たし、そして診断目的、予後目的、予防目的および／または治療目的のための標的として使用される。
（実施例４８：腫瘍進行への関与）
２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子は、癌細胞の増殖に寄与し得る。腫瘍増殖における２４Ｐ４Ｃ１２の役割は、種々の初代細胞株およびトランスフェクトした細胞株（２４Ｐ４Ｃ１２を安定に発現するよう操作された前立腺細胞株、結腸細胞株、膀胱細胞株、およびＮＩＨ ３Ｔ３細胞が挙げられる）において確認される。２４Ｐ４Ｃ１２を欠損した親細胞および２４Ｐ４Ｃ１２を発現する細胞を、十分に記載された増殖アッセイ（Ｆｒａｓｅｒ ＳＰ、ら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２０００；４４：６１、Ｊｏｈｎｓｏｎ ＤＥ、Ｏｃｈｉｅｎｇ Ｊ、Ｅｖａｎｓ ＳＬ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ．１９９６、７：２８８）を使用して細胞増殖について評価する。前立腺癌細胞に関するそのような研究が行われ、その結果を図２８に示した。親ＰＣ３細胞およびＰＣ３−２４Ｐ４Ｃ１２細胞の増殖を、低いＦＢＳ（０．１％）および１０％ＦＢＳにおいて比較した。２４Ｐ４Ｃ１２の発現は、１０％ＦＢＳ中で増殖するＰＣ３細胞に対して増殖の利点を与えた。同様に、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞における２４Ｐ４Ｃ１２の発現は、コントロールの３Ｔ３−ｎｅｏ細胞と比較して、これらの細胞の増殖を促進した。２４Ｐ４Ｃ１２の効果もまた、細胞周期の進行について観察され得る。コントロール細胞および２４Ｐ４Ｃ１２発現細胞を、低い血清において一晩増殖させ、１０％ＦＢＳで４８時間および７２時間処置する。細胞は、ＦＡＣＳ分析によるＢｒｄＵおよびプロピジウムのヨウ素の取り込みについて分析される。
形質転換プロセスにおける２４Ｐ４Ｃ１２の役割を確認するために、コロニー形成アッセイにおいてその影響を調査する。ストリンジェントな条件下およびより許容的な条件下での軟寒天アッセイ（Ｓｏｎｇ Ｚ．ら Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０００；６０：６７３０）を使用して、２４Ｐ４Ｃ１２を欠損した親ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、２４Ｐ４Ｃ１２を発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞と比較する。
癌細胞の浸潤および転移における２４Ｐ４Ｃ１２の役割を確認するために、十分に確立されたアッセイを使用する。限定されない実施例は、細胞が浸潤されたかどうかを検出するために用いる基底膜またはその類似物を提供するアッセイの使用である（例えば、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ Ｉｎｓｅｒｔ Ｓｙｓｔｅｍアッセイ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９９、５９：６０１０））。コントロール細胞（２４Ｐ４Ｃ１２を欠損する前立腺細胞株、および膀胱細胞株を含む）を、２４Ｐ４Ｃ１２を発現する細胞と比較する。細胞に、蛍光染料（カルセイン）をロードし、そして細胞を基底膜類似体でコートされた支持構造物の上部ウェルにプレートし（例えば、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｉｎｓｅｒｔ）、アッセイに用いる。浸潤を、細胞集団全体の蛍光に対する、下方チャンバー中の細胞の蛍光によって決定する。
２４Ｐ４Ｃ１２はまた、細胞周期およびアポトーシスにおいて役割を果たし得る。親細胞および２４Ｐ４Ｃ１２を発現する細胞を、十分に確立されたＢｒｄＵアッセイ（Ａｂｄｅｌ−Ｍａｌｅｋ ＺＡ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９８８，１３６：２４７）を使用して、細胞周期調節における差異について比較する。簡単に言えば、細胞を、最適な条件下（十分な血清）および限定された条件下（低血清）の両方で増殖させ、ＢｒｄＵで標識し、そして抗ＢｒｄＵ Ａｂおよびヨウ化プロピジウムで染色する。細胞を、細胞周期のＧ１期、Ｓ期およびＧ２Ｍ期への進入について分析する。あるいは、アポトーシスに関するストレスの効果を、コントロールの親細胞および２４Ｐ４Ｃ１２発現細胞（正常細胞および腫瘍前立腺細胞、腫瘍結腸細胞および腫瘍肺細胞）において評価される。操作された細胞および親細胞を、種々の化学療法剤（例えば、エトポシド、フルタミドなど、およびシクロヘキサミドのようなタンパク質合成阻害剤）で処置する。細胞を、アネキシンＶ−ＦＩＴＣで染色し、そして細胞死をＦＡＣＳ分析により測定する。２４Ｐ４Ｃ１２による細胞死の調節因子は、腫瘍進行および腫瘍ロード（ｌｏａｄ）の調節において重要な役割を果たし得る。
２４Ｐ４Ｃ１２が細胞増殖、形質転換、浸潤またはアポトーシスにおいて役割を果たす場合、２４Ｐ４Ｃ１２は、診断的目的、予後目的、予防目的および／または治療目的についての標的として用いる。
（実施例４９：新脈管形成への関与）
新脈管形成または新しい毛細血管形成は、腫瘍増殖に必要である（Ｈａｎａｈａｎ Ｄ．Ｆｏｌｋｍａｎ Ｊ．Ｃｅｌｌ．１９９６，８６：３５３；Ｆｏｌｋｍａｎ Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．１９９８ １３９：４４１）。内皮細胞に対するホスホジエステラーゼインヒビターの影響に基づいて、２４Ｐ４Ｃ１２は、新脈管形成において役割を果たす（ＤｅＦｏｕｗ Ｌら、Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ Ｒｅｓ ２００１、６２：２６３）。いくつかのアッセイが、インビトロおよびインビボでの新脈管形成を測定するために開発された（例えば、内皮細胞管形成および内皮細胞増殖についての組織培養アッセイ）。これらのアッセイおよびインビトロでの新生血管新生を使用して、新脈管形成における２４Ｐ４Ｃ１２の役割（増強または阻害）を確認する。
例えば、２４Ｐ４Ｃ１２を発現するように操作された内皮細胞を、管形成アッセイおよび増殖アッセイを使用して評価する。２４Ｐ４Ｃ１２の影響はまた、インビボの動物モデルにおいて確認する。例えば、２４Ｐ４Ｃ１２を発現するかまたは欠損するかいずれかである細胞を、免疫無防備状態マウスの皮下に移植する。内皮細胞の移動および新脈管形成を、５〜１５日後、免疫組織化学的技術を使用して評価する。２４Ｐ４Ｃ１２は新脈管形成に影響し、これは、診断目的、予後目的、予防目的および／または治療目的のための標的として使用される。
（実施例５０：細胞接着への関与）
細胞接着は、組織のコロニー形成および転移に重大な役割を果す。２４Ｐ４Ｃ１２におけるロイシンリッチモチーフおよびシステインリッチモチーフの存在は、細胞接着における２４Ｐ４Ｃ１２の役割を示している。２４Ｐ４Ｃ１２が細胞接着を調節することを確認するために、２４Ｐ４Ｃ１２を欠損するコントロール細胞を、以前に記載された技術を使用して、２４Ｐ４Ｃ１２を発現する細胞と比較する（例えば、Ｈａｉｅｒら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．１９９９，８０：１８６７；ＬｅｈｒおよびＰｉｅｎｔａ，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．１９９８，９０：１１８を参照のこと）。手短に言えば、１つの実施形態において、蛍光指示薬（例えば、カルセイン）で標識された細胞を、培地単独でか、またはマトリックスタンパク質でコートされた組織培養ウェル上でインキュベートする。接着性細胞を、蛍光定量分析によって検出し、接着のパーセントを計算する。これらの実験系は、細胞外マトリックスへの細胞接着および細胞−細胞相互作用を調節するタンパク質、抗体および／または低分子を同定するために用いられ得る。細胞接着は、腫瘍増殖、腫瘍進行およびコロニー形成において重要な役割を果たすので、このプロセスに関与する遺伝子は、診断様式、予防様式、および治療様式として役に立ち得る。
（実施例５１：癌患者標本における２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の検出）
２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の発現を測定するために、種々の癌患者から標本を得て、そして、２４Ｐ４Ｃ１２改変体１のアミノ酸１〜１４をコードするペプチドに対して惹起され、ＫＬＨに対して結合するアフィニティー精製のポリクローナルウサギ抗体（実施例１０：２４Ｐ４Ｃ１２ポリクローナル抗体の生成を参照のこと）を用いて染色した。この抗血清は、そのペプチドに対して高い力価（＞１０，０００）を示し、そしてトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞においては、ウェスタンブロットおよびフローサイトメトリーにより２４Ｐ４Ｃ１２を認識し（図２４）、安定な組み換えＰＣ３細胞においては、ウェスタンブロットおよび免疫組織化学により２４Ｐ４Ｃ１２を認識した（図２５）。ホルマリン固定され、パラフィン包埋された組織は、４ミクロン切片にカットされ、スライドガラス上にマウントされる。その切片を、脱ワックスし、再水和し、そして高温において抗原回収（ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）溶液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ１０）で処置する。次いで、その切片を、ポリクローナルウサギ抗２４Ｐ４Ｃ１２抗体中で３時間インキュベートした。そのスライドを、緩衝液中で３回洗浄し、さらに、ＤＡＫＯ ＥｎＶｉｓｉｏｎ＋ＴＭペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン二次抗体とともに１時間インキュベートした（ＤＡＫＯ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）。次いで、切片を緩衝液中で洗浄し、ＤＡＢキット（ＳＩＧＭＡ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて展開し、ヘマトキシリンを用いて対比染色し、明視野顕微鏡により分析した。この結果は、癌患者の組織において２４Ｐ４Ｃ１２の発現を示した（図２９および図３０）。前立腺癌患者由来の組織は、腫瘍細胞および腫瘍と隣接する正常組織の前立腺上皮において２４Ｐ４Ｃ１２の発現を示した（図２９）。概して、２４Ｐ４Ｃ１２の発現は、すべての前立腺腫瘍において高く、主に細胞膜の周囲に発現しており、このことは、２４Ｐ４Ｃ１２が前立腺組織において膜関連性であることを示す。試験された前立腺サンプルのすべては、２４Ｐ４Ｃ１２に対して陽性であった。２４Ｐ４Ｃ１２に対して陽性である他の腫瘍としては、結腸腺癌、乳管癌、膵臓腺癌、肺腺癌、膀胱移行細胞癌、および腎臓明細胞癌が挙げられる（図３０）。正常組織（心臓、骨格筋、肝臓、脳、脊髄、皮膚、副腎、リンパ節、脾臓、唾液腺、小腸および胎盤を含む）を、２４Ｐ４Ｃ１２の発現について調査した。免疫組織化学による２４Ｐ４Ｃ１２の発現は、いずれにも示されなかった。腫瘍組織と隣接する正常組織もまた、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の存在を決定するために、免疫組織化学により研究された。これらには、乳房、肺、結腸、回腸、膀胱、腎臓、および膵臓が挙げられた。これらの器官由来の組織のいくつかにおいて、２４Ｐ４Ｃ１２の弱い発現が存在した。この発現は、そのサンプルが真に正常というわけでなく、前癌の変化を示し得るという事実と関連し得る。明らかな形態学的変化を起こしていない組織において悪性度を同定する能力は、癌状態および前癌状態のための重要な診断様式である。
これらの結果は、２４Ｐ４Ｃ１２が、癌における診断適用、予防適用、予後適用および治療適用についての標的であることを示す。
本出願の全体にわたって、様々なウェブサイトのデータコンテンツ、刊行物、特許出願および特許を参照する。（ウェブサイトは、Ｕｎｉｆｏｒｍ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ＬｏｃａｔｏｒまたはＵＲＬによって、Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ上のアドレスを参照される）。
本発明は、本明細書中に開示される実施形態によって範囲を限定されるべきでなく、この実施形態は、本発明の個々の局面の一つの例示として意図され、そして任意の機能的な等価物も、本発明の範囲内である。本明細書中に記載される改変に加えて、本発明のモデルおよび方法に対する種々の改変が、先の説明および教示から当業者に明らかになり、そして本発明の範囲内にあることが同様に意図される。このような改変または他の実施形態は、本発明の真の範囲および精神から逸脱することなく実施され得る。
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
Figure 2006508163
１６０ヌクレオチドの２４Ｐ４Ｃ１２ ＳＳＨ配列。 ２４Ｐ４Ｃ１２改変体１（「２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．１」または「２４Ｐ４Ｃ１２改変体１」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ａに示す。開始メチオニンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸６〜２１３８にまたがる。 ２４Ｐ４Ｃ１２改変体１（「２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．１」または「２４Ｐ４Ｃ１２改変体１」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ａに示す。開始メチオニンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸６〜２１３８にまたがる。 ２４Ｐ４Ｃ１２改変体２（「２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．２」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｂに示す。開始メチオニンに対するコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸６〜２１３８にまたがる。 ２４Ｐ４Ｃ１２改変体２（「２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．２」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｂに示す。開始メチオニンに対するコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸６〜２１３８にまたがる。 ２４Ｐ４Ｃ１２改変体３（「２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．３」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｃに示す。開始メチオニンに対するコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸６〜２１３８にまたがる。 ２４Ｐ４Ｃ１２改変体３（「２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．３」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｃに示す。開始メチオニンに対するコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸６〜２１３８にまたがる。 ２４Ｐ４Ｃ１２改変体３（「２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．３」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｃに示す。開始メチオニンに対するコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸６〜２１３８にまたがる。 ２４Ｐ４Ｃ１２改変体４（「２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．４」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｄに示す。開始メチオニンに対するコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸６〜２１３８にまたがる。 ２４Ｐ４Ｃ１２改変体４（「２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．４」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｄに示す。開始メチオニンに対するコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸６〜２１３８にまたがる。 ２４Ｐ４Ｃ１２改変体４（「２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．４」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｄに示す。開始メチオニンに対するコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸６〜２１３８にまたがる。 ２４Ｐ４Ｃ１２改変体５（「２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．５」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｅに示す。開始メチオニンに対するコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸６〜２１３８にまたがる。 ２４Ｐ４Ｃ１２改変体５（「２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．５」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｅに示す。開始メチオニンに対するコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸６〜２１３８にまたがる。 ２４Ｐ４Ｃ１２改変体５（「２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．５」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｅに示す。開始メチオニンに対するコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸６〜２１３８にまたがる。 ２４Ｐ４Ｃ１２改変体６（「２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．６」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｆに示す。開始メチオニンに対するコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸６〜２１３８にまたがる。 ２４Ｐ４Ｃ１２改変体６（「２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．６」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｆに示す。開始メチオニンに対するコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸６〜２１３８にまたがる。 ２４Ｐ４Ｃ１２改変体６（「２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．６」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｆに示す。開始メチオニンに対するコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸６〜２１３８にまたがる。 ２４Ｐ４Ｃ１２改変体７（「２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．７」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｇに示す。開始メチオニンに対するコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸６〜１８０２にまたがる。 ２４Ｐ４Ｃ１２改変体７（「２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．７」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｇに示す。開始メチオニンに対するコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸６〜１８０２にまたがる。 ２４Ｐ４Ｃ１２改変体８（「２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．８」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｈに示す。開始メチオニンに対するコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸６〜２１７４にまたがる。 ２４Ｐ４Ｃ１２改変体８（「２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．８」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｈに示す。開始メチオニンに対するコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸６〜２１７４にまたがる。 ２４Ｐ４Ｃ１２改変体８（「２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．８」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｈに示す。開始メチオニンに対するコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸６〜２１７４にまたがる。 ２４Ｐ４Ｃ１２改変体９（「２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．９」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｉに示す。開始メチオニンに対するコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸６〜２１４４にまたがる。 ２４Ｐ４Ｃ１２改変体９（「２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．９」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｉに示す。開始メチオニンに対するコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸６〜２１４４にまたがる。 ２４Ｐ４Ｃ１２改変体９（「２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．９」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｉに示す。開始メチオニンに対するコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸６〜２１４４にまたがる。 ２４Ｐ４Ｃ１２ Ｖ．１のアミノ酸配列が図３Ａに示される；これは７１０アミノ酸を有する。２４Ｐ４Ｃ１２ Ｖ．３のアミノ酸配列が図３Ｂに示される；これは７１０アミノ酸を有する。２４Ｐ４Ｃ１２ Ｖ．５のアミノ酸配列が図３Ｃに示される；これは７１０アミノ酸を有する。 ２４Ｐ４Ｃ１２ Ｖ．６のアミノ酸配列が図３Ｄに示される；これは７１０アミノ酸を有する。２４Ｐ４Ｃ１２ Ｖ．７のアミノ酸配列が図３Ｅに示される；これは５９８アミノ酸を有する。２４Ｐ４Ｃ１２ Ｖ．８のアミノ酸配列が図３Ｆに示される；これは７２２アミノ酸を有する。 ２４Ｐ４Ｃ１２ Ｖ．９のアミノ酸配列が図３Ｇに示される；これは７１２アミノ酸を有する。本明細書中で使用される場合、２４Ｐ４Ｃ１２に対する参照は、その全ての改変体を含み、これは、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、図２、図３、図１０、および図１１に示される改変体を含む。 ２４Ｐ４Ｃ１２とヒトコリントランスポーター様タンパク質４（ＣＴＬ４）（ｇｉ│１４２４９４６８）とのアライメント。 ２４Ｐ４Ｃ１２とヒトコリントランスポーター様タンパク質４（ＣＴＬ４）（ｇｉ│１４２４９４６８）とのアライメント。 ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバを通したワールドワイドウェブ（．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｐｌ）に位置するＰｒｏｔＳｃａｌｅウェブサイト上でアクセスされるＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓの方法（Ｈｏｐｐ Ｔ．Ｐ．，Ｗｏｏｄｓ Ｋ．Ｒ．，１９８１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：３８２４−３８２８）を用いてコンピューターアルゴリズム配列分析によって決定された、２４Ｐ４Ｃ１２の親水性アミノ酸プロフィール。 ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバを通してワールドワイドウェブ（．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｐｌ）に位置するＰｒｏｔＳｃａｌｅウェブサイト上でアクセスされるＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅの方法（Ｋｙｔｅ Ｊ．，Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ Ｒ．Ｆ．，１９８２．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２）を用いたコンピューターアルゴリズム配列分析によって決定された、２４Ｐ４Ｃ１２のヒドロパシーアミノ酸プロフィール。 ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバを通してワールドワイドウェブ（．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｐｌ）に位置するＰｒｏｔＳｃａｌｅウェブサイト上でアクセスされるＪａｎｉｎの方法（Ｊａｎｉｎ Ｊ．，１９７９ Ｎａｔｕｒｅ ２７７：４９１−４９２）を用いてコンピューターアルゴリズム配列分析によって決定された、２４Ｐ４Ｃ１２のパーセント接触可能残基アミノ酸プロフィール。 ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバを通してワールドワイドウェブ（．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｐｌ）に位置するＰｒｏｔＳｃａｌｅウェブサイト上でアクセスされるＢｈａｓｋａｒａｎおよびＰｏｎｎｕｓｗａｍｙの方法（Ｂｈａｓｋａｒａｎ Ｒ．，およびＰｏｎｎｕｓｗａｍｙ Ｐ．Ｋ．，１９８８．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３２：２４２−２５５）を用いてコンピューターアルゴリズム配列分析によって決定された、２４Ｐ４Ｃ１２の平均可橈性アミノ酸プロフィール。 ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバを通してワールドワイドウェブ（．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｐｌ）に位置するＰｒｏｔＳｃａｌｅウェブサイト上でアクセスされるＤｅｌｅａｇｅおよびＲｏｕｘの方法（Ｄｅｌｅａｇｅ，Ｇ．，Ｒｏｕｘ Ｂ．１９８７ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １：２８９−２９４）を用いてコンピューターアルゴリズム配列分析によって決定された、２４Ｐ４Ｃ１２のβ−ターンアミノ酸プロフィール。 ２４Ｐ４Ｃ１２のＳＮＰ改変体の図式的アライメント。改変体２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．２〜改変体２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．６は、単一のヌクレオチド差を有する改変体である。これらのＳＮＰ改変体を別々に示すが、それらはまた、その塩基対を含む任意の組み合わせおよび任意の転写改変体において生じ得る。番号は、２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．１に対応する。黒四角は、２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．１と同じ配列を示す。ＳＮＰは、この四角で上に示される。 ２４Ｐ４Ｃ１２のタンパク質改変体の図式的アライメント。タンパク質改変体は、ヌクレオチド改変体に対応する。図１０におけるヌクレオチド改変体２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．２およびヌクレオチド改変体２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．４は、２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．１と同じタンパク質をコードする。ヌクレオチド改変体２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．７およびヌクレオチド改変体２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．８およびヌクレオチド改変体２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．９は、図１２に示されるｖ．１のスプライス改変体である。単一のアミノ酸差は、四角で上に示した。黒四角は、２４Ｐ４Ｃ１２ｖ．１と同じ配列を示す。四角の下の数字は、２４Ｐ４Ｃ１２ｖ．１に対応する。 ２４Ｐ４Ｃ１２の転写改変体のエキソン組成。改変体２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．７および改変体２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．８および改変体２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．９は、２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．１の転写改変体である。改変体２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．７は、改変体２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．１のエキソン１０およびエキソン１１を有さない。改変体２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．８は、改変体２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．１のエキソン２０の３’末端にある３６ｂｐまでおよぶ。改変体２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．９は、改変体２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．１と比較して、より長いエキソン１２およびより短いエキソン１３を有する。四角の下の「（）」の中の番号は、２４Ｐ４Ｃ１２ ｖ．１の番号に対応する。イントロンおよびエキソンの長さは、比例しない。 ２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質改変体１（配列番号１１２）の二次構造予測および膜貫通ドメイン予測。Ａ：２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質改変体１の二次構造は、ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／）からアクセスされるＨＮＮ−Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ法（Ｇｕｅｒｍｅｕｒ，１９９７，ｈｔｔｐ：／／ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ．ｐｌ？ｐａｇｅ＝ｎｐｓａ＿ｎｎ．ｈｔｍｌ）を用いて予測された。この方法は、タンパク質の一次配列から、αへリックス、伸長鎖、およびランダムコイルの存在および位置を予測する。与えられた二次構造中のこのタンパク質のパーセントがまた、列挙された。 ２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質改変体１（配列番号１１２）の二次構造予測および膜貫通ドメイン予測。Ｂ：ＴＭＢＡＳＥを利用するＨｏｆｍａｎｎおよびＳｔｏｆｆｅｌのＴＭｐｒｅｄアルゴリズム（Ｋ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｗ．Ｓｔｏｆｆｅｌ．ＴＭＢＡＳＥ−Ａ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｐａｎｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｇｍｅｎｔｓ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ ３７４：１６６，１９９３）を基にした２４Ｐ４Ｃ１２改変体１の、膜貫通領域および位置の存在の確率の図式的表示。 ２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質改変体１（配列番号１１２）の二次構造予測および膜貫通ドメイン予測。Ｃ：Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ、およびＫｒｏｇｈのＴＭＨＭＭアルゴリズム（Ｅｒｉｃ Ｌ．Ｌ．Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ，Ｇｕｎｎａｒ ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓ Ｋｒｏｇｈ：Ａ ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｈｅｌｉｃｅｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｉｎ Ｐｒｏｃ．ｏｆ Ｓｉｘｔｈ Ｉｎｔ．Ｃｏｎｆ．ｏｎ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐ１７５−１８２ Ｅｄ Ｊ． Ｇｌａｓｇｏｗ，Ｔ．Ｌｉｔｔｌｅｊｏｈｎ，Ｆ．Ｍａｊｏｒ，Ｒ．Ｌａｔｈｒｏｐ，Ｄ．Ｓａｎｋｏｆｆ，ａｎｄ Ｃ．Ｓｅｎｓｅｎ Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ：ＡＡＡＩ Ｐｒｅｓｓ，１９８８）を基にした２４Ｐ４Ｃ１２改変体１の、膜貫通領域ならびに細胞外位置および細胞内位置の存在の確率の図式の表示。このＴＭｐｒｅｄアルゴリズムおよびＴＭＨＭＭアルゴリズムは、ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／）からアクセスされる。 ＲＴ−ＰＣＲによる２４Ｐ４Ｃ１２の発現。第一鎖ｃＤＮＡは、生体のプール１（腎臓、肝臓および肺）、生体のプール２（結腸、膵臓および胃）、前立腺癌異種移植片のプール（ＬＡＰＣ−４ＡＤ、ＬＡＰＣー４ＡＩ、ＬＡＰＣ−９ＡＤおよびＬＡＰＣ−９ＡＩ）、前立腺癌のプール、膀胱癌のプール、腎臓癌のプール、結腸癌のプール、卵巣癌のプール、乳癌のプール、および癌転移のプールから作製された。標準化は、アクチンに対するプライマーを用いてＰＣＲによって行われた。２４Ｐ４Ｃ１２に対するプライマーを用いた半定量的ＰＣＲが、２６および３０の増幅サイクルで行われた。結果は、前立腺癌プールおよび卵巣癌プールにおいて、２４Ｐ４Ｃ１２の強い発現を示す。発現はまた、前立腺癌異種移植片、膀胱癌のプール、腎臓癌のプール、結腸癌のプール、乳癌のプール、癌転移のプール、生体のプール１、および生体のプール２において検出された。 正常組織における２４Ｐ４Ｃ１２の発現。１レーンにつき２μｇのｍＲＮＡを用いた２つの複数細胞組織ノーザンブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の両方は、２４Ｐ４Ｃ１２配列について検索された。キロベース（ｋｂ）におけるサイズの基準は、その片側に示される。結果は、前立腺、腎臓、および結腸において、２４Ｐ４Ｃ１２の発現を示す。低い発現は、試験された全ての１６の正常組織の間で、膵臓、肺、および胎盤において検出される。 前立腺癌異種移植片および前立腺癌細胞株における２４Ｐ４Ｃ１２の発現。ＲＮＡは、細胞株および前立腺癌異種移植片（ＰｒＥＣ、ＬＡＰＣ−４ＡＤ、ＬＡＰＣ−４ＡＩ、ＬＡＰＣ−９ＡＤ、ＬＡＰＣ−９ＡＩ、ＬＮＣａＰ、ＰＣ−３、ＤＵ１４５、ＴｓｕＰｒ、およびＬＡＰＣ−４ＣＬ）のパネルから抽出された。１レーンにつき１０μｇの総ＲＮＡを用いたノーザンブロットは、２４Ｐ４Ｃ１２ ＳＳＨ配列について検索された。キロベース（ｋｂ）におけるサイズの基準は、その片側に示される。この２４Ｐ４Ｃ１２転写物は、ＬＡＰＣ−４ＡＤ、ＬＡＰＣ−４ＡＩ、ＬＡＰＣ−９ＡＤ、ＬＡＰＣ−９ＡＩ、ＬＮＣａＰ、およびＬＡＰＣ−４ ＣＬにおいて検出された。 患者の癌標本および正常組織における２４Ｐ４Ｃ１２の発現。ＲＮＡは、前立腺癌標本、膀胱癌標本、結腸癌標本、卵巣癌標本、乳癌標本、および癌転移標本、ならびに、正常な前立腺（ＮＰ）由来標本、正常な膀胱（ＮＢ）由来標本、正常な腎臓（ＮＫ）由来標本、および正常な結腸（ＮＣ）由来標本から抽出された。１レーンにつき１０μｇの総ＲＮＡを用いたノーザンブロットは、２４Ｐ４Ｃ１２ ＳＳＨ配列について探索された。キロベース（ｋｂ）におけるサイズの基準は、その片側に示される。２４Ｐ４Ｃ１２転写物の強い発現は、患者の癌のプール標本、および正常な前立腺において検出されたが、試験された他の正常な組織においては、検出されなかった。 前立腺癌患者標本における２４Ｐ４Ｃ１２の発現。ＲＮＡは、正常な前立腺（Ｎ）、前立腺癌患者の腫瘍（Ｔ）およびそれらに対応する正常隣接組織（ｎｏｒｍａｌ ａｄｊａｃｅｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓ）（Ｎａｔ）から抽出された。１０μｇの総ＲＮＡを用いたノーザンブロットは、この２４Ｐ４Ｃ１２ ＳＳＨフラグメントについて検索された。キロベースにおけるサイズの基準は、その片側に示される。結果は、正常な前立腺、または試験された全ての前立腺癌において、２４Ｐ４Ｃ１２の発現を示す。 結腸癌患者標本における２４Ｐ４Ｃ１２の発現。ＲＮＡは、結腸癌細胞株（ＣＬ：Ｃｏｌｏ ２０５，ＬｏＶｏおよびＳＫ−ＣＯ−）、正常な結腸（Ｎ）、結腸癌患者の腫瘍（Ｔ）およびそれらに対応する正常隣接組織（Ｎａｔ）から抽出された。１０μｇの総ＲＮＡを用いたノーザンブロットは、この２４Ｐ４Ｃ１２ ＳＳＨフラグメントについて検索された。キロベースにおけるサイズの基準は、その片側に示される。結果は、正常な結腸および試験された全ての結腸患者の腫瘍において、２４Ｐ４Ｃ１２の発現を示す。発現は、細胞株Ｃｏｌｏ ２０５および細胞株ＳＫ−ＣＯ−において検出されたが、細胞株ＬｏＶｏでは検出されなかった。 肺癌患者標本における２４Ｐ４Ｃ１２の発現。ＲＮＡは、肺癌細胞株（ＣＬ：ＣＡＬＵ−１、Ａ４２７、ＮＣＩ−Ｈ８２、ＮＣＩ−Ｈ１４６）、正常な肺（Ｎ）、肺癌患者の腫瘍（Ｔ）およびそれらに対応する正常隣接組織（Ｎａｔ）から抽出された。１０μｇのトータルＲＮＡを用いたノーザンブロットは、この２４Ｐ４Ｃ１２ ＳＳＨフラグメントについて検索される。キロベースにおけるサイズの基準は、その片側に示される。結果は、試験された肺患者の腫瘍において、２４Ｐ４Ｃ１２の発現を示すが、正常な肺においては、発現を示さない。発現はまた、ＣＡＬＵ−１において検出されたが、他の細胞株Ａ４２７、ＮＣＩ−Ｈ８２およびＮＣＩ−Ｈ１４６においては、検出されなかった。 ヒト乳癌標本およびヒト胃癌標本における２４Ｐ４Ｃ１２の発現。２４Ｐ４Ｃ１２の発現は、ＲＮＡドットブロットの上で、ヒト胃癌およびヒト乳癌（Ｔ）、およびそれらにそれぞれ対応した正常組織（Ｎ）のパネルにおいて分析された。２４Ｐ４Ｃ１２発現は、胃癌および乳癌の両方において見られた。（病気組織から単離された）正常隣接組織においては検出されるが、（健康な提供者から単離された）正常組織においては検出されない発現は、これらの組織が、十分に正常ではなく、および２４Ｐ４Ｃ１２が腫瘍の初期段階で発現され得ることを示し得る。 患者の癌標本の大きいパネルにおける２４Ｐ４Ｃ１２発現。第一鎖ｃＤＮＡは、卵巣癌患者標本（Ａ）、子宮癌患者標本（Ｂ）、前立腺癌標本（Ｃ）、膀胱癌患者標本（Ｄ）、肺癌患者標本（Ｅ）、膵臓癌患者標本（Ｆ）、結腸癌標本（Ｇ）、および腎臓癌標本（Ｈ）のパネルから調製された。標準化は、アクチンに対するプライマーを用いて、ＰＣＲによって行われた。２４Ｐ４Ｃ１２に対するプライマーを用いた半定量的ＰＣＲが、２６および３０の増幅サイクルで行われた。サンプルは、アガロースゲル上で泳動され、そしてＰＣＲ産物はＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒソフトウェアを用いて定量された。発現は、無、低、中または強として記録された。結果は、試験された癌患者標本の大部分、卵巣癌患者標本の７３．３％、子宮癌患者標本の８３．３％、前立腺癌患者標本の９５．０％、膀胱癌患者標本の６１．１％、肺癌患者標本の８０．６％、膵臓癌患者の８７．５％、結腸癌標本の８７．５％、明細胞腎臓癌の６８．４％、乳頭腎臓細胞癌（ｐａｐｉｌｌａｒｙ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）の１００％において、２４Ｐ４Ｃ１２の発現を示す。 患者の癌標本の大きいパネルにおける２４Ｐ４Ｃ１２発現。第一鎖ｃＤＮＡは、卵巣癌患者標本（Ａ）、子宮癌患者標本（Ｂ）、前立腺癌標本（Ｃ）、膀胱癌患者標本（Ｄ）、肺癌患者標本（Ｅ）、膵臓癌患者標本（Ｆ）、結腸癌標本（Ｇ）、および腎臓癌標本（Ｈ）のパネルから調製された。標準化は、アクチンに対するプライマーを用いて、ＰＣＲによって行われた。２４Ｐ４Ｃ１２に対するプライマーを用いた半定量的ＰＣＲが、２６および３０の増幅サイクルで行われた。サンプルは、アガロースゲル上で泳動され、そしてＰＣＲ産物はＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒソフトウェアを用いて定量された。発現は、無、低、中または強として記録された。結果は、試験された癌患者標本の大部分、卵巣癌患者標本の７３．３％、子宮癌患者標本の８３．３％、前立腺癌患者標本の９５．０％、膀胱癌患者標本の６１．１％、肺癌患者標本の８０．６％、膵臓癌患者の８７．５％、結腸癌標本の８７．５％、明細胞腎臓癌の６８．４％、乳頭腎臓細胞癌（ｐａｐｉｌｌａｒｙ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）の１００％において、２４Ｐ４Ｃ１２の発現を示す。 患者の癌標本の大きいパネルにおける２４Ｐ４Ｃ１２発現。第一鎖ｃＤＮＡは、卵巣癌患者標本（Ａ）、子宮癌患者標本（Ｂ）、前立腺癌標本（Ｃ）、膀胱癌患者標本（Ｄ）、肺癌患者標本（Ｅ）、膵臓癌患者標本（Ｆ）、結腸癌標本（Ｇ）、および腎臓癌標本（Ｈ）のパネルから調製された。標準化は、アクチンに対するプライマーを用いて、ＰＣＲによって行われた。２４Ｐ４Ｃ１２に対するプライマーを用いた半定量的ＰＣＲが、２６および３０の増幅サイクルで行われた。サンプルは、アガロースゲル上で泳動され、そしてＰＣＲ産物はＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒソフトウェアを用いて定量された。発現は、無、低、中または強として記録された。結果は、試験された癌患者標本の大部分、卵巣癌患者標本の７３．３％、子宮癌患者標本の８３．３％、前立腺癌患者標本の９５．０％、膀胱癌患者標本の６１．１％、肺癌患者標本の８０．６％、膵臓癌患者の８７．５％、結腸癌標本の８７．５％、明細胞腎臓癌の６８．４％、乳頭腎臓細胞癌（ｐａｐｉｌｌａｒｙ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）の１００％において、２４Ｐ４Ｃ１２の発現を示す。 患者の癌標本の大きいパネルにおける２４Ｐ４Ｃ１２発現。第一鎖ｃＤＮＡは、卵巣癌患者標本（Ａ）、子宮癌患者標本（Ｂ）、前立腺癌標本（Ｃ）、膀胱癌患者標本（Ｄ）、肺癌患者標本（Ｅ）、膵臓癌患者標本（Ｆ）、結腸癌標本（Ｇ）、および腎臓癌標本（Ｈ）のパネルから調製された。標準化は、アクチンに対するプライマーを用いて、ＰＣＲによって行われた。２４Ｐ４Ｃ１２に対するプライマーを用いた半定量的ＰＣＲが、２６および３０の増幅サイクルで行われた。サンプルは、アガロースゲル上で泳動され、そしてＰＣＲ産物はＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒソフトウェアを用いて定量された。発現は、無、低、中または強として記録された。結果は、試験された癌患者標本の大部分、卵巣癌患者標本の７３．３％、子宮癌患者標本の８３．３％、前立腺癌患者標本の９５．０％、膀胱癌患者標本の６１．１％、肺癌患者標本の８０．６％、膵臓癌患者の８７．５％、結腸癌標本の８７．５％、明細胞腎臓癌の６８．４％、乳頭腎臓細胞癌（ｐａｐｉｌｌａｒｙ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）の１００％において、２４Ｐ４Ｃ１２の発現を示す。 形質導入細胞における２４Ｐ４Ｃ１２の発現。ＰＣ３前立腺癌細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３マウス細胞、および３００．１９マウス細胞は、２４Ｐ４Ｃ１２ ｐＳＲａレトロウイルスベクターを用いて形質導入された。細胞は、安定な細胞株の産生のためにネオマイシン中で選択された。ＲＮＡは、ネオマイシン中における選択の後に抽出された。１０μｇの総ＲＮＡを用いたノーザンブロットは、２４Ｐ４Ｃ１２ ＳＳＨフラグメントについて検索された。結果は、２４Ｐ４Ｃ１２ ｐＳＲａを形質導入されたＰＣ３細胞、３Ｔ３細胞および３００．１９細胞において強い発現を示したが、親のｐＳＲａ構造物を用いて形質導入されたコントロール細胞では、発現を示さなかった。 ２９３Ｔ細胞における２４Ｐ４Ｃ１２の発現。２９３Ｔ細胞は、ｐＣＤＮＡ３．１ Ｍｙｃ−Ｈｉｓタグ化発現ベクター、２４Ｐ４Ｃ１２改変体１ ｃＤＮＡまたはコントロールネオベクターをそれぞれコードするｐＳＲα発現ベクターのいずれかを用いて、一過的にトランスフェクトされた。細胞は、２日後に収集され、そして抗２４Ｐ４Ｃ１２ ｐＡｂまたは抗Ｈｉｓ ｐＡｂ（そのあとにＰＥ結合体化抗ウサギＩｇＧ二次抗体（Ａｂ）が続く）のいずれかを用いて、固定されかつ浸透された２９３Ｔ細胞上において、抗２４Ｐ４Ｃ１２ ｐＡｂを用いたウエスタンブロット（Ａ）、またはフローサイトメトリー（Ｂ）によって分析された。細胞内ＮＨ３末端およびＣＯＯＨ末端それぞれに対する抗２４Ｐ４Ｃ１２および抗Ｈｉｓ ｐＡｂを用いて染色した場合、コントロールネオ細胞と比較して、ウエスタンブロットおよび２４Ｐ４Ｃ１２−２９３Ｔ細胞の蛍光シフトによって、２４Ｐ４Ｃ１２の単量体形態および凝集された形態の発現が示される。 安定して形質導入されたＰＣ３細胞における２４Ｐ４Ｃ１２の発現および検出。ＰＣ３細胞を、２４Ｐ４Ｃ１２改変体１ ｃＤＮＡをコードするレトロウイルスに感染させ、そして安定して形質導入された細胞は、Ｇ４１８セレクションによって誘導された。細胞は、次いで、抗２４Ｐ４Ｃ１２ ｐＡｂを用いて、ウエスタンブロット（Ａ）または免疫組織染色（Ｂ）によって分析された。ウエスタンブロットの矢印によって、ＰＣ３−２４Ｐ４Ｃ１２細胞において、約９４ｋＤバンドの発現（２４Ｐ４Ｃ１２が発現したことを表す）を示すが、コントロールネオ細胞では示されない。免疫組織染色分析は、２４Ｐ４Ｃ１２−ＰＣ３細胞の特異的な染色を示し、およびｐＡｂが誘導される競合ペプチド（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ）と競争しない（ｃｏｍｐｅｔｅｄ ａｗａｙ）ＰＣ−３ネオ細胞では示されなかった。 ２９３Ｔ細胞における組み換え２４Ｐ４Ｃ１２抗原の発現。２９３Ｔ細胞は、一過的に、２４Ｐ４Ｃ１２改変体１のアミノ酸５９〜２２７または３１９〜４５３のいずれかをコードするＴａｇ５ Ｈｉｓタグ化発現ベクターまたはコントロールベクターを用いてトランスフェクトされた。２日後、上清を収集し、そして細胞を収集して溶解した。上清および溶解物は、次いで、抗Ｈｉｓ ｐＡｂを用いてウエスタンブロット分析された。上清および溶解物の両方において組み換えＴａｇ５ ５９〜２２７タンパク質の発現、および細胞溶解物においてＴａｇ５ ３１９〜４５３タンパク質の発現が示される。これらのタンパク質は、精製され、そして２４Ｐ４Ｃ１２−特異的抗体の産生に対する抗原として使用される。 フローサイトメトリーによって２９３Ｔ細胞における２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質発現を検出するモノクローナル抗体。２９３Ｔ細胞は、２４Ｐ４Ｃ１２に対するｐＣＤＮＡ ３．１ Ｈｉｓタグ化発現ベクターまたはコントロールネオベクターのいずれかを用いてトランスフェクトされ、そして２日後収集された。細胞は、固定され、透過され、そして３００．１９−２４Ｐ４Ｃ１２細胞または抗Ｈｉｓ ｐＡｂを用いて免疫されたマウスから産生される、指し示されたハイブリドーマの上清の１：２希釈を用いて染色された。次いで、細胞は、ＰＥ結合体化二次抗体を用いて染色され、そしてフローサイトメトリーによって分析された。２９３Ｔ−２４Ｐ４Ｃ１２細胞の蛍光シフトによって、ハイブリドーマの上清は２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の特異的認識を示したが、コントロールネオ細胞は示さなかった。 ２４Ｐ４Ｃ１２促進増殖の発現を示す。ＰＣ３および３Ｔ３は、一晩中、低ＦＢＳ中で培養された。次いで、細胞は、図で示すように、低ＦＢＳまたは１０％ＦＢＳにおいてインキュベートされた。増殖は、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅによって測定された。 前立腺癌患者標本における免疫組織染色による２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の検出。前立腺癌組織およびそれに対応する正常隣接組織は、前立腺癌患者から得られた。この結果は、腫瘍細胞および前立腺癌患者組織の正常上皮において強く２４Ｐ４Ｃ１２の発現を示した。（パネル（Ａ）低レベル前立腺癌、パネル（Ｂ）高レベル前立腺癌、パネル（Ｃ）腫瘍に隣接する正常組織）。この発現は、細胞膜の周辺に多く検出されたことより、２４Ｐ４Ｃ１２は、前立腺組織に関連する膜であることが示される。 種々の癌患者標本における免疫組織染色による２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の検出。組織は、結腸腺癌、乳管癌、肺腺癌、膀胱移行上皮癌、腎臓明細胞癌、および膵臓腺癌を有する患者から得られた。この結果は、癌患者の組織の腫瘍細胞において２４Ｐ４Ｃ１２の発現を示した。（パネル（Ａ）結腸腺癌、パネル（Ｂ）肺線癌、パネル（Ｃ）乳管癌、パネル（Ｄ）膀胱移行上皮癌、パネル（Ｅ）腎臓明細胞癌、パネル（Ｆ）膵臓腺癌） ＳＣＩＤマウスの２４Ｐ４Ｃ１２促進腫瘍増殖を示す。１×１０６ ＰＣ３−２４Ｐ４Ｃ１２細胞は、マトリゲルと混合され、そして１グループにつき４匹のオスのＳＣＩＤマウスの左右の脇腹に皮下注射した。それぞれのデータ点は、腫瘍体積の平均値を表す（ｎ＝８）。 ＳＣＩＤマウスの２４Ｐ４Ｃ１２促進腫瘍増殖を示す。１×１０６ ３Ｔ３−２４Ｐ４Ｃ１２細胞は、マトリゲルと混合され、そして１グループにつき７匹のオスのＳＣＩＤマウスの右の脇腹に皮下注射した。それぞれのデータ点は、腫瘍容積の平均値を表す（ｎ＝６）。

Claims (22)

  1. 以下：
    ａ）図２のタンパク質の状態を調節する物質か、または
    ｂ）図２のタンパク質によって調節され、それによって図２のタンパク質を発現する膀胱、卵巣、胸部、子宮もしく胃の細胞の状態を調節する分子、
    を含有する、組成物。
  2. 以下：
    ａ）表ＶＩＩＩ〜ＸＸＩのペプチド；
    ｂ）表ＸＸＩＩ〜ＸＬＶのペプチド；または、
    ｃ）表ＸＬＶＩ〜ＸＬＩＸのペプチド、
    を含む、組成物。
  3. 組成物であって、該組成物は、図２の少なくとも５アミノ酸からそのペプチドの末端までの整数きざみの増分のペプチド領域を含み、ここで、該アミノ酸位置は、以下：
    ａ）図５の親水性度プロフィールにおいて０．５を超える値を有するアミノ酸位置、
    ｂ）図６のヒドロパシープロフィールにおいて０．５未満の値を有するアミノ酸位置、
    ｃ）図７のパーセント接触可能残基プロフィールにおいて０．５を超える値を有するアミノ酸位置；
    ｄ）図８の平均可橈性プロフィールにおいて０．５を超える値を有するアミノ酸位置；
    ｅ）図９のβ−ターンプロフィールにおいて０．５を超える値を有するアミノ酸位置；
    ｆ）ａ）〜ｅ）のうちの少なくとも２つの組み合わせ；
    ｇ）ａ）〜ｅ）のうちの少なくとも３つの組み合わせ；
    ｈ）ａ）〜ｅ）のうちの少なくとも４つの組み合わせ；または
    ｉ）ａ）〜ｅ）の５つの組み合わせ；
    から選択される、組成物。
  4. 前記少なくとも５アミノ酸が、図２の全アミノ酸配列ではないという条件によってさらに限定される、請求項３に記載の組成物。
  5. 図２のタンパク質を発現する膀胱、卵巣、胸部、子宮もしくは胃の癌細胞の増殖を阻害する方法であって、該方法は、請求項１に記載の組成物を該細胞に投与する工程を包含する、方法。
  6. 抗体またはそのフラグメントを前記細胞に投与する工程を包含し、該抗体またはそのフラグメントのいずれかが、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質に特異的に結合する、請求項５に記載の方法。
  7. ２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質を前記細胞に投与する工程を包含する、請求項５に記載の方法。
  8. 請求項５に記載の方法であって、前記投与工程は、
    ２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質に対するコード配列を含むポリヌクレオチド、または
    ２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質に対するコード配列に相補的であるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、
    を前記細胞に投与する工程を包含する、方法。
  9. 請求項５に記載の方法であって、前記投与工程は、図２のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを切断するリボザイムを前記細胞に投与する工程を包含する、方法。
  10. 請求項５に記載の方法であって、前記投与工程は、
    ヒトＴ細胞を前記癌細胞に投与する工程を包含し、ここで、該Ｔ細胞が、図２のタンパク質のペプチド部分配列を特異的に認識する一方、該部分配列が、特定のＨＬＡ分子の状況下に存在する、方法。
  11. 請求項５に記載の方法であって、前記投与工程は、単鎖モノクローナル抗体をコードするヌクレオチドを送達するベクターを投与し、それによって該コードされる単鎖抗体が、図２のタンパク質を発現する膀胱、卵巣、胸部、子宮もしくは胃の癌細胞内で細胞内的に発現される工程を包含する、方法。
  12. 図２のタンパク質に対して指向される、膀胱、卵巣、胸部、子宮もしくは胃の癌を有する哺乳動物において哺乳動物免疫応答を生じさせる方法であって、該方法は、
    膀胱、卵巣、胸部、子宮もしくは胃の組織の悪性腫瘍を有する哺乳動物を提供する工程；
    哺乳動物の免疫系の細胞を、
    ａ）図２のタンパク質、および／または
    ｂ）該タンパク質をコードするヌクレオチド配列
    の一部に曝露し、それによって、免疫応答が、該タンパク質に対して生じさせられる工程、を包含する、方法。
  13. 請求項１２に記載の免疫応答を生じさせる方法であって、該方法は、
    少なくとも１つのＴ細胞エピトープまたは少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含む２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質を提供する工程；および
    該エピトープを、哺乳動物免疫系Ｔ細胞またはＢ細胞それぞれと接触させ、それによって、該Ｔ細胞またはＢ細胞が、活性化される工程、
    を包含する、方法。
  14. 請求項１３に記載の方法であって、前記免疫系細胞が、Ｂ細胞であり、それによって前記誘導されたＢ細胞が、前記２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質に対して特異的に結合する抗体を産生する、方法。
  15. 請求項１３に記載の方法であって、前記免疫系細胞が、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）であるＴ細胞であって、それによって、前記活性化されたＣＴＬが、前記２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質を発現する自己細胞を殺傷する、方法。
  16. 請求項１３に記載の方法であって、前記免疫系細胞が、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ）であるＴ細胞であって、それによって、前記活性化されたＨＴＬが、サイトカインを分泌し、該サイトカインが、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の細胞傷害性またはＢ細胞の抗体産生活性を助長する、方法。
  17. 膀胱、卵巣、胸部、子宮もしくは胃の組織由来のサンプル中において、２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質または２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドの存在を検出する方法であって、該方法は、
    該サンプルを、請求項１に記載の物質と接触させる工程であって、該物質が、該２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質または該２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドそれぞれに特異的に結合する、工程；および
    該物質と該２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質、または該物質と該２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドのそれぞれの複合体の存在を決定する工程、
    を包含する、方法。
  18. 請求項１７に記載の方法であって、該方法は、
    前記サンプルを抗体またはそのフラグメントと接触させる工程であって、該抗体またはそのフラグメントのいずれかが、前記２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質と特異的に結合する工程；および
    該抗体またはそのフラグメントと該２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質との複合体の存在を決定する工程
    を包含する、方法。
  19. 癌に罹患している患者または癌に罹患していることが疑われる患者から前記サンプルをとる工程をさらに包含する、請求項１７に記載の方法。
  20. サンプル中の図２のタンパク質のｍＲＮＡの存在を検出するための請求項１７に記載の方法であって、該方法は、
    少なくとも１つのプライマーを用いる逆転写によって前記サンプルからｃＤＮＡを産生する工程；
    該産生されたｃＤＮＡを、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドを使用して増幅する工程であって、ここで該センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして使用される２４Ｐ４Ｃ１２ポリヌクレオチドが、２４Ｐ４Ｃ１２ ｃＤＮＡを増幅するように働く、工程；ならびに
    該増幅された２４Ｐ４Ｃ１２ ｃＤＮＡの存在を検出する工程
    を包含する、方法。
  21. 膀胱、卵巣、胸部、子宮もしくは胃の癌を有しているかまたは癌を有する疑いのある患者由来の生物学的サンプルにおいて１つ以上の２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物をモニタリングするための請求項１７に記載の方法であって、該方法は、
    個体からの組織サンプル中の細胞によって発現される１つ以上の２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物の状態を決定する工程；
    該決定された状態を、対応する正常サンプル中の１つ以上の２４Ｐ４Ｃ１２遺伝子産物の状態と比較する工程；および
    該正常サンプルに比較して、該サンプル中の１つ以上の２４Ｐ４Ｃ１２の異常な遺伝子産物の存在を同定する工程
    を包含する、方法。
  22. 請求項２１に記載の方法であって、該方法は、２４Ｐ４Ｃ１２ ｍＲＮＡの増加した遺伝子産物または２４Ｐ４Ｃ１２タンパク質の１つ以上が存在するか否かを決定し、それによって、前記正常組織産物に対する前記試験産物中の増加した遺伝子産物の１つ以上の存在が、膀胱、卵巣、胸部、子宮もしくは胃の癌の存在または状態を示す工程をさらに包含する、方法。
JP2004557078A 2002-11-27 2002-11-27 癌の処置および検出において有用な２４ｐ４ｃ１２と称される、核酸および対応タンパク質 Pending JP2006508163A (ja)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/US2002/038264 WO2004050828A2 (en) 2002-11-27 2002-11-27 Nucleic acid corresponding protein entitled 24p4c12 useful in treatment and detection of cancer

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2010000057A Division JP5122592B2 (ja) 2010-01-04 2010-01-04 癌の処置および検出において有用な２４ｐ４ｃ１２と称される、核酸および対応タンパク質

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2006508163A true JP2006508163A (ja) 2006-03-09

Family

ID=32467113

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2004557078A Pending JP2006508163A (ja) 2002-11-27 2002-11-27 癌の処置および検出において有用な２４ｐ４ｃ１２と称される、核酸および対応タンパク質

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP1565200A4 (ja)
JP (1) JP2006508163A (ja)
AU (3) AU2002352976B2 (ja)
CA (1) CA2503346C (ja)
IL (1) IL167892A (ja)
WO (1) WO2004050828A2 (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010537671A (ja) * 2007-09-07 2010-12-09 アジェンシス，インコーポレイテッド ２４ｐ４ｃ１２タンパク質に結合する抗体および関連分子
JP2012519711A (ja) * 2009-03-06 2012-08-30 アジェンシス，インコーポレイテッド ２４ｐ４ｃ１２タンパク質に結合する抗体薬物結合体（ａｄｃ）
JP2013049646A (ja) * 2011-08-30 2013-03-14 Tokyo Medical Univ 癌治療剤
US11513127B2 (en) 2016-01-25 2022-11-29 Genentech, Inc. Methods for assaying T-cell dependent bispecific antibodies

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180059922A (ko) 2015-10-02 2018-06-05 유니버시티 오브 코펜하겐 히스톤 리더 도메인을 차단하는 소분자
EP3617312A4 (en) * 2017-04-28 2021-04-07 Hoyu Co., Ltd. ALLERGY AGENTS AND EPITOPES FOR IT

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000061746A1 (en) * 1999-04-12 2000-10-19 Agensys, Inc. 13 transmembrane protein expressed in prostate cancer
JP2001512013A (ja) * 1997-08-01 2001-08-21 ジェンセット 前立腺に発現される分泌タンパク質の５’ｅｓｔ

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4722848A (en) 1982-12-08 1988-02-02 Health Research, Incorporated Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US5019369A (en) 1984-10-22 1991-05-28 Vestar, Inc. Method of targeting tumors in humans
DE3675588D1 (de) 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
EP0452457B1 (en) 1989-11-03 1997-08-20 Vanderbilt University Method of in vivo delivery of functioning foreign genes
US5279833A (en) 1990-04-04 1994-01-18 Yale University Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells
US5204253A (en) 1990-05-29 1993-04-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method and apparatus for introducing biological substances into living cells
SE9002480D0 (sv) 1990-07-23 1990-07-23 Hans Lilja Assay of free and complexed prostate-specific antigen
EP0646178A1 (en) 1992-06-04 1995-04-05 The Regents Of The University Of California expression cassette with regularoty regions functional in the mammmlian host
US5804566A (en) 1993-08-26 1998-09-08 The Regents Of The University Of California Methods and devices for immunizing a host through administration of naked polynucleotides with encode allergenic peptides
US5679647A (en) 1993-08-26 1997-10-21 The Regents Of The University Of California Methods and devices for immunizing a host against tumor-associated antigens through administration of naked polynucleotides which encode tumor-associated antigenic peptides
JP3926839B2 (ja) 1993-09-14 2007-06-06 エピミューン，インコーポレイティド 万能ｄｒ−結合性ペプチドを用いる免疫応答の改変
US5739118A (en) 1994-04-01 1998-04-14 Apollon, Inc. Compositions and methods for delivery of genetic material
US5919652A (en) 1994-11-09 1999-07-06 The Regents Of The University Of California Nucleic acid molecules comprising the prostate specific antigen (PSA) promoter and uses thereof
US5736524A (en) 1994-11-14 1998-04-07 Merck & Co.,. Inc. Polynucleotide tuberculosis vaccine
US5962428A (en) 1995-03-30 1999-10-05 Apollon, Inc. Compositions and methods for delivery of genetic material
US5922687A (en) 1995-05-04 1999-07-13 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Intracellular delivery of nucleic acids using pressure
CU22559A1 (es) 1996-01-17 1999-05-03 Ct Ingenieria Genetica Biotech Sistema de expresión de antígenos heterologos en e. coli como proteínas de fusión
CA2248657A1 (en) 1996-03-11 1997-09-18 Epimmune Inc. Peptides with increased binding affinity for hla molecules
US6294378B1 (en) 1996-07-26 2001-09-25 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Method and reagents for genetic immunization
US5840501A (en) 1996-10-25 1998-11-24 Bayer Corporation Determination of cPSA
US6943235B1 (en) * 1999-04-12 2005-09-13 Agensys, Inc. Transmembrane protein expressed in prostate cancer
JP2004500814A (ja) * 1999-12-23 2004-01-15 インサイト・ゲノミックス・インコーポレイテッド 輸送体及びイオンチャネル

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001512013A (ja) * 1997-08-01 2001-08-21 ジェンセット 前立腺に発現される分泌タンパク質の５’ｅｓｔ
WO2000061746A1 (en) * 1999-04-12 2000-10-19 Agensys, Inc. 13 transmembrane protein expressed in prostate cancer

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010537671A (ja) * 2007-09-07 2010-12-09 アジェンシス，インコーポレイテッド ２４ｐ４ｃ１２タンパク質に結合する抗体および関連分子
JP2012519711A (ja) * 2009-03-06 2012-08-30 アジェンシス，インコーポレイテッド ２４ｐ４ｃ１２タンパク質に結合する抗体薬物結合体（ａｄｃ）
JP2013049646A (ja) * 2011-08-30 2013-03-14 Tokyo Medical Univ 癌治療剤
US11513127B2 (en) 2016-01-25 2022-11-29 Genentech, Inc. Methods for assaying T-cell dependent bispecific antibodies
JP7438662B2 (ja) 2016-01-25 2024-02-27 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｔ細胞依存性二重特異的抗体をアッセイするための方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP1565200A4 (en) 2009-06-24
EP1565200A2 (en) 2005-08-24
AU2009208065A1 (en) 2009-08-27
AU2008200628B2 (en) 2009-05-07
WO2004050828A3 (en) 2004-12-09
AU2009208065B2 (en) 2012-05-24
AU2002352976B2 (en) 2007-11-08
AU2008200628A1 (en) 2008-03-06
IL167892A (en) 2012-06-28
CA2503346A1 (en) 2004-06-17
AU2002352976A1 (en) 2004-06-23
WO2004050828A2 (en) 2004-06-17
CA2503346C (en) 2014-03-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4490502B2 (ja) 癌の処置および検出において有用な２８２ｐ１ｇ３と称される、核酸および対応タンパク質
JP5787487B2 (ja) 癌の処置および検出において有用なｓｔｅａｐ−１と名称が与えられる核酸および対応するタンパク質
JP4177877B2 (ja) 癌の処置および検出において有用な１６１ｐ２ｆ１０ｂと称される、核酸および対応タンパク質
US8853364B2 (en) Prostate stem cell antigen (PSCA) variants and subsequences thereof
JP4299872B2 (ja) 癌の処置および検出において有用な１６１ｐ２ｆ１０ｂと称される、核酸および対応タンパク質
JP2005534287A (ja) 癌の処置および検出において有用な９８ｐ４ｂ６との名称の核酸および対応するタンパク質
US7968090B2 (en) Nucleic acids and corresponding proteins entitled 191P4D12(b) useful in treatment and detection of cancer
JP2010110325A (ja) 癌の処置および検出において有用な１９３ｐ１ｅ１ｂと称される、核酸および対応タンパク質
JP2011152132A (ja) 癌の処置および検出において有用な１０９ｐ１ｄ４と称される、核酸および対応タンパク質
JP2008509880A (ja) Ｓｔｅａｐ−１タンパク質に結合する抗体とそれから由来する分子
JP2008509700A (ja) 癌の処置および検出において有用な５８ｐ１ｄ１２と称される核酸および対応するタンパク質
JP5840351B2 (ja) 癌の処置および検出において有用な９８ｐ４ｂ６と称される、核酸および対応タンパク質
CA2503346C (en) Nucleic acid and corresponding protein entitled 24p4c12 useful in treatment and detection of cancer
JP2005512509A (ja) 癌の処置および検出において有用な１０１ｐ３ａ１１またはｐｈｏｒ−１と名称が与えられる核酸および対応するタンパク質
JP5122592B2 (ja) 癌の処置および検出において有用な２４ｐ４ｃ１２と称される、核酸および対応タンパク質
JP2005537797A (ja) 癌の処置および検出において有用な９８ｐ４ｂ６と称される、核酸および対応タンパク質
JP2005508157A (ja) 癌の処置および検出において有用な２０５ｐ１ｂ５との名称の核酸および対応するタンパク質

Legal Events

Date Code Title Description
RD03 Notification of appointment of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423

Effective date: 20080314

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20080527

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20080826

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20081125

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20081202

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20081224

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20090113

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20090126

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20090203

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20090224

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20090630

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20090929

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20091006

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20091117

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20091125

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20100104

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20100831

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20101228

A911 Transfer of reconsideration by examiner before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20110203

A912 Removal of reconsideration by examiner before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912

Effective date: 20110513

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20120427

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20120507

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20120531

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20120605