JP2001512013A - 前立腺に発現される分泌タンパク質の５’ｅｓｔ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 分泌型タンパク質をコードするｍＲＮＡから誘導される５’ＥＳＴの配列を開示する。５’ＥＳＴは、５’ＥＳＴに対応するｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを得るためのものである。５’ＥＳＴは、診断、法医学的、遺伝子療法、および染色体マッピングにも使用することができる。５’ＥＳＴを使用して上流調節配列を得ることができる。また、５’ＥＳＴを使用して、発現ベクターおよび分泌ベクターを設計することが可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （背景技術） ヒト染色体に散在している推定５０，０００〜１００，０００の遺伝子は、ヒ
ト疾患の理解、診断および治療にかなり有望である。また、ヒトゲノムに分布す
る遺伝子座に特異的にハイブリダイゼーションすることができるプローブには、
高分解能染色体マップの構築および個体の識別における用途がある。

【０００２】 過去には、ヒト遺伝子を１本だけでも特徴付けることが骨の折れる過程であり
、数年の努力を要した。クローニングベクター、ＤＮＡ配列決定およびコンピュ
ーター技術分野における最近の発展により、ヒトの遺伝子を単離、配列決定、マ
ッピングおよび特徴づけすることができる速度が大きく加速された。酵母人工染
色体（ＹＡＣ）および細菌人工染色体（ＢＡＣ）のようなクローニングベクター
は、それぞれ鎖長３００〜１０００キロベース（ｋｂ）または１００〜４００ｋ
ｂのＤＮＡ挿入物を受け入れることができ、それによってヒト染色体の長い距離
にわたって分布するＤＮＡ配列の操作および順序づけが容易になる。自動ＤＮＡ
配列決定装置によりヒト遺伝子の迅速な配列決定が可能になる。バイオインフォ
ーマティクス（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）ソフトウェアは核酸とタンパク
質の配列を比較し、それによってヒト遺伝子産物の特徴づけを助けることができ
る。

【０００３】 現在、ヒトゲノムに分布する遺伝子を同定し、特徴付けるための２つの異なる
方法が検討されている。一方の方法では、ゲノムＤＮＡの大きいフラグメントを
単離し、クローニングし、配列決定する。バイオインフォーマティクス（Ｂｉｏ
ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）ソフトウェアを使用して、これらのゲノム配列のオー
プンリーティングフレームと思われるものを同定する。しかし、この方法は、ゲ
ノム全体に分布するタンパク質コード配列を見つけるために、タンパク質をコー
ドしない大量のヒトＤＮＡの配列決定を伴う。広範な配列決定が必要であること
に加えて、バイオインフォーマティクス（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）ソフ
トウェアは得られたゲノム配列を間違って特徴づけすることがある。従って、こ
のソフトウェアは非コードＤＮＡをコードＤＮＡと間違って特徴づけする偽陽性
またはコードＤＮＡを非コードＤＮＡと誤って標識する偽陰性を生じることがあ
る。

【０００４】 別の方法はヒトの遺伝子を同定し、特徴づけするさらに直接的な経路を取る。
この方法では、ヒトタンパク質をコードする単離されたメッセンジャーＲＮＡ（
ｍＲＮＡ）から相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成する。この方法を使用すると
、ゲノムのタンパク質コード部分から誘導されるＤＮＡについてのみ配列決定が
実施される。しばしば、ほんの短い鎖長のｃＤＮＡを配列決定して、発現配列タ
グ（ＥＳＴ）と呼ばれる配列を得る。次いで、ＥＳＴを使用して、ＥＳＴ配列に
隣接する配列を含む伸長ｃＤＮＡを単離または精製することができる。伸長ｃＤ
ＮＡは、それらを得るために使用されたＥＳＴの配列の全てを含んでいてもよい
し、それらを得るために使用されたＥＳＴの配列の一部だけを含んでもよい。ま
た、伸長ｃＤＮＡは、ＥＳＴが誘導される遺伝子の完全長のコード配列を含んで
もよく、またはＥＳＴが誘導される遺伝子のコード配列の一部を含んでもよい。
選択的スプライシングまたは第２プロモーターの活性の結果としてＥＳＴ配列を
含む伸長ｃＤＮＡがいくつか存在しうることが認識されよう。

【０００５】 過去には、これらの短いＥＳＴ配列はオリゴ−ｄＴをプライマーとしたｃＤＮ
Ａライブラリーからしばしば得られた。従って、それらは主にｍＲＮＡの３’非
翻訳領域に相当した。一部には、ｍＲＮＡの３’末端から誘導されるＥＳＴ配列
が普及したのは、ｃＤＮＡを得るための典型的な技法はｍＲＮＡの５’末端から
誘導されるｃＤＮＡ配列を単離するためにはあまり適していないという事実の結
果である（アダムス（Ａｄａｍｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３７７：３〜１７４、１
９９６；ヒリアー（Ｈｉｌｌｉｅｒ）ら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．６：８０７〜
８２８、１９９６）。

【０００６】 また、より長いｃＤＮＡ配列が得られたと報告されている例では、その報告さ
れた配列は、一般に、コード配列に相当し、ｃＤＮＡが誘導されるｍＲＮＡの全
長の５’非翻訳領域を含まない。このような不完全な配列は、特に第１のエクソ
ンが短い場合には、ｍＲＮＡの第１のエクソンを含まないかもしれない。さらに
、それらは、スプライシング部位の上流に位置するいくつかのエクソン、しばし
ば短いものを含まないことがある。従って、ｍＲＮＡの５’末端から誘導される
配列を得る必要性が存在する。

【０００７】 ヒトの染色体から誘導される多数の配列には実用的な用途があるが、タンパク
質産物をコードするこれらの染色体配列の同定および特徴づけに基づいた方法は
、診断および治療的用途に特に関連がある。５０，０００〜１００，０００種の
タンパク質をコードする遺伝子のうち、それらが合成される細胞から分泌される
タンパク質をコードする遺伝子、並びに分泌されるタンパク質自体が、治療効果
をもつ可能性のある薬剤として特に有用である。このようなタンパク質はしばし
ば細胞間の連絡に関係しており、標的細胞において臨床的に適切な応答を生ずる
ことに関与している。

【０００８】 実際、組織プラスミノーゲン活性化因子、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、エリス
ロポイエチン、ヒト成長ホルモン、インスリン、インターフェロン−α、インタ
ーフェロン−β、インターフェロン−γおよびインターロイキン−２を含むいく
つかの分泌タンパク質が現在臨床的に使用されている。これらのタンパク質は、
急性心筋梗塞、急性虚血性卒中、貧血、糖尿病、成長ホルモン欠損症、肝炎、腎
癌、化学療法による好中球減少症および多発性硬化症を含む広範な症状を治療す
るために使用される。こうした理由のために、分泌タンパク質をコードする伸長
ｃＤＮＡまたはその一部は、治療薬の特に有用な供給源となる。従って、分泌タ
ンパク質およびそれらをコードする核酸を同定し、特徴付ける必要性が存在する
。

【０００９】 それら自体が治療的に有用であることに加えて、分泌タンパク質は、アミノ末
端に、その分泌を指令するシグナルペプチドと呼ばれる短いペプチドを含む。こ
れらのシグナルペプチドは、分泌タンパク質をコードする遺伝子のコード配列の
５’末端に位置するシグナル配列によってコードされる。これらのシグナルペプ
チドは、それらが機能的に結合している任意のタンパク質の細胞外分泌を指令す
るので、シグナル配列を使用して、シグナル配列を分泌が望まれるタンパク質を
コードする遺伝子に機能的に結合することによって、任意のタンパク質の効率的
な分泌を指令することができる。また、シグナル配列の一部を使用して、関心の
あるペプチドまたはタンパク質の細胞内への輸送を指令することもできる。これ
は、特定の遺伝子産物を、それを産生する細胞以外の細胞に送達することが望ま
れる遺伝子治療法において有用であることが明らかである。シグナルペプチドを
コードするシグナル配列には、タンパク質の精製法を単純化するという用途も見
いだされている。このような用途では、望ましいタンパク質が細胞外分泌される
ことによって、不要なタンパク質（これらのタンパク質から望ましいタンパク質
を選択しなければならない）の数を減少させることができ、精製はかなり容易に
なる。従って、シグナルペプチドをコードする分泌タンパク質の遺伝子の５’部
分を同定し、特徴付ける必要性が存在する。

【００１０】 プロモーターおよび上流の調節領域が同定され、特徴付けられているヒト遺伝
子の数に関して公開されている情報は極めて少ない。一部には、このような調節
配列を単離する困難さによるかもしれない。転写因子結合部位などの上流の調節
配列は、一般に、非常に短いので、ヒトゲノムライブラリーからプロモーターを
単離するためのプローブとして利用することができない。最近、ヒトプロモータ
ーを単離するいくつかの方法が開発されている。それらの１つは、ＣｐＧアイラ
ンドライブラリーを作製することである（クロス（Ｃｒｏｓｓ）ら、Ｎａｔｕｒ
ｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：２３６〜２４４，１９９４）。第２の方法は、Ｓｐ
ｅＩ結合タンパク質を使用することによって、ＳｐｅＩ結合部位を有するヒトゲ
ノムＤＮＡ配列を単離することである。（モートロック（Ｍｏｒｔｌｏｃｋ）ら
、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．６：３２７〜３３５，１９９６）。これらの方法はい
ずれも特異性または包括性の欠如による限界がある。

【００１１】 本発明の５’ＥＳＴを使用して、タンパク質合成の位置、発達段階、速度およ
び量、並びにｍＲＮＡの安定性を制御する上流の調節領域を効率的に同定し、単
離することができる。（テイル（Ｔｈｅｉｌ）、ＢｉｏＦａｃｔｏｒｓ ４：８
７〜９３，１９９３）。これらの調節領域は、いったん同定され、特徴づけられ
ると、遺伝子治療またはタンパク質の精製法に使用して、望ましい量および位置
のタンパク質合成を得ることができ、または望ましくない遺伝子産物の合成を阻
止、軽減または抑制することができる。

【００１２】 また、分泌タンパク質遺伝子の５’末端を有するＥＳＴは、染色体マッピング
および個体の識別のためのプローブとして有用な配列を含みうる。従って、分泌
タンパク質をコードする遺伝子の５’コード配列の上流の配列を同定し、特徴付
ける必要性が存在する。

【００１３】 （発明の開示） 本発明は、対応するｍＲＮＡの真正５’末端から誘導される配列を含む精製さ
れて単離されたまたは組換え体のＥＳＴに関する。「対応するｍＲＮＡ」という
用語は、５’ＥＳＴを産生するｃＤＮＡ合成の鋳型となったｍＲＮＡをいう。こ
れらの配列をこれ以後「５’ＥＳＴ」と呼ぶ。本明細書において使用される「精
製された」という用語は絶対的な純度を要求するのではなく、むしろ、それは相
対的な定義であると意図される。ｃＤＮＡライブラリーから単離された個々の５
’ＥＳＴクローンは、通常、電気泳動的等質性が得られるまで精製されている。
これらのクローンから得られる配列はライブラリーまたはヒト全ＤＮＡから直接
得ることはできなかった。ｃＤＮＡクローンはそのままで天然に存在していない
が、部分的に精製された天然の物質（メッセンジャーＲＮＡ）を操作することに
よって得られる。ｍＲＮＡのｃＤＮＡライブラリーへの変換は合成物質（ｃＤＮ
Ａ）を作製することを含み、純粋な個々のｃＤＮＡクローンはクローン選択によ
って合成ライブラリーから単離することができる。従って、メッセンジャーＲＮ
ＡからｃＤＮＡライブラリーを作製し、その後ライブラリーから個々のクローン
を単離することによって、天然のメッセージの約１０⁴〜１０⁶倍の純化が得られ
る。出発材料または天然材料を少なくとも１桁、好ましくは２または３桁、さら
に好ましくは４または５桁まで精製することが特に意図されている。

【００１４】 本明細書において使用される「単離された」という用語は、物質がその元の環
境（例えば、それが天然のものである場合には、自然環境）から分離されること
を必要とする。例えば、生存動物に存在する天然型ポリヌクレオチドは単離され
ていないが、天然系において共存する物質の一部または全てから分離された該ポ
リヌクレオチドは単離されている。

【００１５】 本明細書において使用される「組換え」という用語は、５’ＥＳＴが、天然の
環境では隣接していない「骨格」核酸に隣接していることを意味する。また、「
濃縮される」ためには、５’ＥＳＴが、核酸骨格分子の集団中の核酸挿入物の数
の５％以上に相当する。本発明による骨格分子には、発現ベクター、自己複製核
酸、ウィルス、組込み核酸および関心のある核酸挿入物を維持または操作するた
めに使用される他のベクターまたは核酸などの核酸が含まれる。好ましくは、濃
縮された５’ＥＳＴは、組換え骨格分子の集団中の核酸挿入物の数の１５％以上
に相当する。さらに好ましくは、濃縮された５’ＥＳＴは組換え骨格分子の集団
中の核酸挿入物の数の５０％以上に相当する。非常に好ましい態様において、濃
縮された５’ＥＳＴは組換え骨格分子の集団中の核酸挿入物の数の９０％以上に
相当する。

【００１６】 「ストリンジェントな」、「中程度の」および「低度の」ハイブリダイゼーシ
ョン条件は実施例２９に定義されるとおりである。 特に明記しない限り、「相補」配列は完全に相補的である。 従って、１つ以上の５’ＥＳＴが骨格分子中の核酸挿入物の数の５％以上を占
めているｃＤＮＡライブラリー中の５’ＥＳＴは、本明細書中で定義される「濃
縮された組換え５’ＥＳＴ」である。同様に、本発明の５’ＥＳＴがプラスミド
骨格中の挿入物の数の５％以上となるように、本発明の１以上の５’ＥＳＴが挿
入されたプラスミド集団中の５’ＥＳＴは、本明細書で定義する「濃縮された組
換え５’ＥＳＴ」である。しかし、５’ＥＳＴが骨格分子集団中の核酸挿入物の
数の５％未満を構成するｃＤＮＡライブラリー、例えば、５’ＥＳＴ挿入物を有
する骨格分子が極めてまれであるライブラリーの５’ＥＳＴは「濃縮された組換
え５’ＥＳＴ」ではない。

【００１７】 特に、本発明は、分泌タンパク質をコードする遺伝子から誘導される５’ＥＳ
Ｔに関する。本明細書において使用される「分泌」タンパク質は、好適な宿主細
胞内で発現されるとき、アミノ酸配列中のシグナルペプチドの結果としての輸送
を含む、膜を貫通してまたは通過して輸送されるタンパク質である。「分泌」タ
ンパク質は、それらが発現される細胞から全体的に（例えば、可溶性タンパク質
）または部分的に（例えば、受容体）分泌されるタンパク質を含むが、それに限
定されない。「分泌」タンパク質はまた、小胞体の膜を貫通して輸送されるタン
パク質も含むが、それに限定されない。

【００１８】 このような５’ＥＳＴは、５’ＥＳＴが誘導される遺伝子によりコードされる
タンパク質の細胞外分泌を指令するシグナルペプチドをコードする、シグナル配
列と呼ばれる核酸配列を含む。一般に、シグナルペプチドは分泌タンパク質のア
ミノ末端に位置する。

【００１９】 分泌タンパク質は、「粗面」小胞体に結合したリボソームによって翻訳される
。一般に、分泌タンパク質は、共翻訳的に小胞体膜に移送される。分泌タンパク
質の翻訳中のリボソームと小胞体の結合はシグナルペプチドによって仲介される
。シグナルペプチドは、一般に、小胞体内に共翻訳的にエントリーすることによ
って切断される。小胞体への送達後、分泌タンパク質はゴルジ装置を通過して前
進しうる。ゴルジ装置では、タンパク質は翻訳後修飾を受けることができ、その
後細胞膜をからそれらを輸送する分泌小胞に入る。

【００２０】 本発明の５’ＥＳＴにはいくつかの重要な用途がある。例えば、それらを使用
して、５’ＥＳＴが誘導されるｍＲＮＡのコード配列の５’末端から誘導される
真正の翻訳開始部位を含む、対応する遺伝子産物の完全長のタンパク質コード配
列を含むｃＤＮＡクローンを取得し、それを発現させることができる。これらの
ｃＤＮＡをこれ以後「全長ｃＤＮＡ」と呼ぶ。これらのｃＤＮＡはまた、翻訳開
始部位の上流のｍＲＮＡ配列から誘導されるＤＮＡを含んでもよい。全長ｃＤＮ
Ａ配列は、５’ＥＳＴに対応するタンパク質を発現させるために使用することが
できる。上記のように、分泌タンパク質は治療上重要である。従って、ｃＤＮＡ
から発現されるタンパク質は種々のヒト症状を治療または予防する際に有用とな
り得る。５’ＥＳＴはまた、対応するゲノムＤＮＡを得るために使用することも
できる。「対応するゲノムＤＮＡ」という用語は、５’ＥＳＴが誘導されるｍＲ
ＮＡをコードするゲノムＤＮＡをいう。

【００２１】 あるいはまた、５’ＥＳＴを使用して、分泌タンパク質の一部をコードする伸
長ｃＤＮＡを取得し、発現させることができる。この部分は、分泌タンパク質の
シグナルペプチドまたはシグナルペプチドが切断されたときに生成する成熟タン
パク質を含みうる。この部分はまた、伸長ｃＤＮＡまたは全長ｃＤＮＡによって
コードされる少なくとも１０個の連続するアミノ酸を有するポリペプチドを含ん
でもよい。または、この部分は伸長ｃＤＮＡまたは全長ｃＤＮＡによりコードさ
れる少なくとも１５個の連続するアミノ酸を含んでもよい。いくつかの実施態様
において、この部分は伸長ｃＤＮＡまたは全長ｃＤＮＡによりコードされる少な
くとも２５個の連続するアミノ酸を含んでもよい。他の態様において、この部分
は伸長ｃＤＮＡまたは全長ｃＤＮＡによりコードされる少なくとも４０個の連続
するアミノ酸を含んでもよい。

【００２２】 伸長ｃＤＮＡ、全長ｃＤＮＡによりコードされる分泌タンパク質全体、または
少なくとも１０個の連続するアミノ酸、少なくとも１５個の連続するアミノ酸、
少なくとも２５個の連続するアミノ酸もしくは少なくとも４０個の連続するアミ
ノ酸を有するそのフラグメントを特異的に認識する抗体も以下に示すように得る
ことができる。シグナルペプチドが切断されたとき形成される成熟タンパク質を
特異的に認識する抗体も以下のように得ることができる。同様に、伸長ｃＤＮＡ
または全長ｃＤＮＡによりコードされるシグナルペプチドを特異的に認識する抗
体も得ることができる。

【００２３】 いくつかの態様において、５’ＥＳＴを使用して得られる伸長ｃＤＮＡはシグ
ナル配列を含む。他の態様において、５’ＥＳＴを使用して得られる伸長ｃＤＮ
Ａは成熟タンパク質（すなわち、シグナルポリペプチドが切断されたとき形成さ
れるタンパク質）の全コード配列を含む。また、５’ＥＳＴを使用して得られる
伸長ｃＤＮＡは、翻訳開始部位の上流または停止コドンの下流の、遺伝子発現の
量、位置または発達段階を制御する調節領域を含んでもよい。

【００２４】 上記のように、分泌タンパク質は治療上重要である。従って、５’ＥＳＴを使
用して得られる伸長ｃＤＮＡまたは完全長のｃＤＮＡから発現されるタンパク質
は、種々のヒトの症状を治療または予防する際に有用となり得る。 ５’ＥＳＴ（または、それから得られるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）は、個
体を識別するための法医学的手法または５’ＥＳＴに対応する遺伝子の異常な発
現による遺伝病を有する個体を識別するための診断的手法にも使用することがで
きる。また、本発明は高分解能ヒト染色体マップを構築するために有用である。

【００２５】 本発明はまた、関心のあるタンパク質の分泌を指令することができる分泌ベク
ターに関する。このようなベクターは、生体内の別の部位に送達しようとする遺
伝子産物を１個の細胞内で産生することが望まれる遺伝子治療法に使用すること
ができる。分泌ベクターは目的のタンパク質の精製を容易にすることもできる。

【００２６】 本発明はまた、挿入された遺伝子を望ましい場所で、望ましい時期に、または
望ましい量で発現させることを指令することができる発現ベクターに関する。こ
のようなベクターは、５’ＥＳＴの上流の配列、例えばプロモーターまたは上流
調節配列を含んでもよい。

【００２７】 最後に、本発明は遺伝病を予防または治療する遺伝子治療に使用することもで
きる。シグナルペプチドを異種タンパク質に融合させて、それらの細胞外分泌を
指令することもできる。

【００２８】 本発明の５’ＥＳＴ（ＩＩにおいて配列番号の次に掲載する名称で本発明者ら
の実験室に４％（ｖ／ｖ）グリセロールに入れて８０℃で現在保管されている配
列番号３８〜３１５）を含む挿入物を有するＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドを
含有する細菌クローン。挿入物は、適当なクローンを好適な培地で生育させるこ
とによって寄託物から回収することができる。次いで、アルカリ溶解ミニプレッ
プまたは大規模アルカリ溶解プラスミド単離法などの当業者に周知のプラスミド
単離法を使用してＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＤＮＡを単離することができる。所望に
より、プラスミドＤＮＡを塩化セシウム濃度勾配での遠心分離、サイズ排除クロ
マトグラフィーまたは陰イオン交換クロマトグラフィーによってさらに濃縮して
もよい。次いで、これらの手法を使用して得られるプラスミドＤＮＡを当業者に
周知の標準的なクローニング技法を使用して操作することができる。または、Ｅ
ＳＴ挿入物の両端で設計されたプライマーを用いてＰＣＲを実施することができ
る。次いで、当業者に周知の標準的なクローニング技法を使用して、５’ＥＳＴ
に対応するＰＣＲ産物を操作することができる。

【００２９】 本発明の一態様は、配列番号３８〜３１５の１つの配列またはそれに相補的な
配列を有する精製または単離された核酸である。一実施態様において、核酸は組
換え体である。 本発明の別の態様は、配列番号３８〜３１５の１つの配列またはそれに相補的
な配列の１つの少なくとも１０個の連続する塩基を含む精製または単離された核
酸である。

【００３０】 本発明のさらに別の態様は、配列番号３８〜３１５の配列の１つまたはそれに
相補的な配列の１つの少なくとも１５個の連続する塩基を含む精製または単離さ
れた核酸である。一実施態様において、核酸は組換え体である。

【００３１】 本発明のさらに別の態様は、配列番号３８〜３１５の１つの配列または配列番
号３８〜３１５の配列に相補的な配列の１つにストリンジェントな条件において
ハイブリダイゼーションすることができる少なくとも１５塩基の精製または単離
された核酸である。一実施態様において、核酸は組換え体である。

【００３２】 本発明のさらに別の態様は、配列番号３８〜３１５の配列の１つにより部分的
にコードされる配列を有するヒト遺伝子産物をコードする精製または単離された
核酸である。

【００３３】 本発明のさらに別の態様は、配列番号３８〜３１５の１つにより部分的にコー
ドされるヒト分泌タンパク質をコードするｃＤＮＡを作製する方法である。この
方法は、ヒト細胞由来のｍＲＮＡ分子の集合物を配列番号３８〜３１５の１つに
相補的な配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むプライマーと接
触させ、前記プライマーを前記集合物中の前記タンパク質をコードするｍＲＮＡ
にハイブリダイズさせ、ハイブリダイズさせた前記プライマーを逆転写して前記
ｍＲＮＡから第１のｃＤＮＡ鎖を作製し、前記第１ｃＤＮＡ鎖に相補的な第２の
ｃＤＮＡ鎖を作製し、そして、前記第１ｃＤＮＡ鎖と前記第２ｃＤＮＡ鎖とを含
み、前記タンパク質をコードする得られたｃＤＮＡを単離する、各ステップを含
んでなる。

【００３４】 本発明の別の態様は、配列番号３８〜３１５の１つによりコードされるタンパ
ク質または少なくとも１０アミノ酸からなるそのフラグメントを含むヒト分泌タ
ンパク質をコードし、上記段落に記載する方法によって得られる精製または単離
されたｃＤＮＡである。一実施態様において、ｃＤＮＡは、その配列が配列番号
３８〜３１５の配列の１つに部分的に含まれる、前記タンパク質の全タンパク質
コード配列を含む。

【００３５】 本発明の別の態様は、配列番号３８〜３１５の１つにより部分的にコードされ
るヒト分泌タンパク質をコードするｃＤＮＡを作製する方法である。この方法は
、配列番号３８〜３１５の配列の１つを含むｃＤＮＡを取得し、前記ｃＤＮＡと
配列番号３８〜３１５の前記配列またはそれに相補的な配列の少なくとも１５個
の連続するヌクレオチドを含む検出可能なプローブとを、前記プローブを前記ｃ
ＤＮＡにハイブリダイズさせる条件下において接触させ、前記検出可能なプロー
ブにハイブリダイズするｃＤＮＡを同定し、そして、前記プローブにハイブリダ
イズする前記ｃＤＮＡを単離する、各ステップを含んでなる。

【００３６】 本発明の別の態様は、配列番号３８〜３１５の１つによりコードされるタンパ
ク質または少なくとも１０アミノ酸のフラグメントを含むヒト分泌タンパク質を
コードし、上記段落に記載する方法によって得られる精製または単離されたｃＤ
ＮＡである。一実施態様において、ｃＤＮＡは配列番号３８〜３１５の配列の１
つに部分的に含まれる全タンパク質コード配列を含む。

【００３７】 本発明の別の態様は、配列番号３８〜３１５の配列の１つを含むｃＤＮＡを作
製する方法である。この方法は、ヒト細胞由来のｍＲＮＡ分子の集合体と前記ｍ
ＲＮＡのポリＡテイルにハイブリダイズすることができる第１のプライマーとを
接触させ、前記第１のプライマーを前記ポリＡテイルにハイブリダイズさせ、前
記ｍＲＮＡを逆転写して第１ｃＤＮＡ鎖を作製し、配列番号３８〜３１５の配列
の１つの少なくとも１５ヌクレオチドを含む少なくとも１つのプライマーを使用
して前記第１ｃＤＮＡ鎖に相補的な第２ｃＤＮＡ鎖を作製し、そして、前記第１
ｃＤＮＡ鎖と前記第２ｃＤＮＡ鎖を含むｃＤＮＡを単離する、各ステップを含ん
でなる。

【００３８】 本発明の別の態様は、配列番号３８〜３１５の１つによりコードされるタンパ
ク質または少なくとも１０アミノ酸のそのフラグメントを含むヒト分泌タンパク
質をコードし、上記段落に記載する方法によって得られる精製または単離された
ｃＤＮＡである。一実施態様において、ｃＤＮＡは配列番号３８〜３１５の配列
の１つに部分的に含まれる全タンパク質コード配列を含む。

【００３９】 上記２つの段落に記載した方法の一実施態様において、第２ｃＤＮＡ鎖を作製
するには、前記第１ｃＤＮＡ鎖に、配列番号３８〜３１５の配列の１つの少なく
とも１５個の連続するヌクレオチドを含む第２プライマーと前記第１プライマー
の配列内に含まれる配列を有する第３プライマーとを含む第１のプライマー対を
接触させ、ネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）プライマーの前記第１の対を用いて第１
のポリメラーゼ連鎖反応を実施して第１のＰＣＲ産物を生成し、前記第１のＰＣ
Ｒ産物に、配列番号３８〜３１５の１つの前記配列の少なくとも１５個の連続す
るヌクレオチドを含みかつ前記第１のＰＣＲ産物内の配列にハイブリダイズし得
る第４プライマーと前記第１のＰＣＲ産物内の配列にハイブリダイズし得る第５
のプライマーとを含む第２のプライマー対を接触させ、第２のポリメラーゼ連鎖
反応を実施することにより第２のＰＣＲ産物を生成することによって行う。

【００４０】 本発明の一態様は、配列番号３８〜３１５の１つによりコードされるタンパク
質または少なくとも１０アミノ酸のそのフラグメントを含むヒト分泌タンパク質
をコードし、上記段落の方法によって得られる単離または精製されたｃＤＮＡで
ある。一実施態様において、ｃＤＮＡは配列番号３８〜３１５の配列の１つに部
分的に含まれる全タンパク質コード配列を含む。

【００４１】 本発明の別の態様は、第２ｃＤＮＡ鎖が、前記第１ｃＤＮＡ鎖に、配列番号３
８〜３１５の配列の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む第２プライマー
を接触させ、前記第２プライマーを前記第１ｃＤＮＡ鎖にハイブリダイズさせ、
ハイブリダイズした前記第２プライマーを伸長して前記第２ｃＤＮＡ鎖を形成す
ることによって作製される、上記４つの段落に記載した方法である。

【００４２】 本発明の別の態様は、配列番号３８〜３１５の１つにより部分的にコードされ
るタンパク質または少なくとも１０アミノ酸のフラグメントを含むヒト分泌タン
パク質をコードし、上記段落に記載する方法によって得られる単離または精製さ
れたｃＤＮＡである。一実施態様において、ｃＤＮＡは配列番号３８〜３１５の
配列の１つに部分的に含まれる全タンパク質コード配列を含む。

【００４３】 本発明の別の態様は、配列番号３１６〜５９３の配列の１つを含むタンパク質
を作製する方法である。この方法は、配列番号３８〜３１５の配列の１つに部分
的に含まれる全タンパク質配列をコードするｃＤＮＡを取得し、前記ｃＤＮＡが
機能しうる形でプロモーターに連結されるように前記ｃＤＮＡを発現ベクターに
挿入し、前記発現ベクターを宿主細胞に導入し、それにより前記宿主細胞に前記
ｃＤＮＡがコードするタンパク質を産生させ、そして前記タンパク質を単離する
、各ステップを含んでなる。

【００４４】 本発明の別の態様は、上記段落に記載する方法によって得られる単離されたタ
ンパク質である。 本発明の別の態様は、プロモーターＤＮＡを取得する方法である。この方法は
、配列番号３８〜３１５の核酸またはそれに相補的な配列の上流に位置するＤＮ
Ａを取得し、前記上流ＤＮＡをスクリーニングして転写開始を指令することがで
きるプロモーターを同定し、同定した前記プロモーターを含む前記ＤＮＡを単離
する、各ステップを含んでなる。一実施態様において、取得ステップは配列番号
３８〜３１５の前記核酸またはそれに相補的な配列からの染色体歩行を含む。別
の態様において、スクリーニングステップは前記上流配列をプロモーターレポー
ターベクターに挿入することを含む。別の実施態様において、スクリーニングス
テップは、転写因子結合部位または転写開始部位である前記上流ＤＮＡ中のモチ
ーフを同定することを含む。

【００４５】 本発明の別の態様は、上記の方法によって得られる単離されたプロモーターで
ある。 本発明の別の態様は、配列番号３１６〜５９３の配列の１つを含む単離または
精製されたタンパク質である。

【００４６】 本発明の別の態様は、個々のＥＳＴまたは鎖長が少なくとも１５ヌクレオチド
のフラグメントのアレイ中に、配列番号３８〜３１５の配列のうち少なくとも１
つ、または配列番号３８〜３１５の配列に相補的な配列のうち１つ、または少な
くとも１５個の連続するヌクレオチドのそのフラグメントを含めることである。
一実施態様において、アレイは配列番号３８〜３１５の配列、配列番号３８〜３
１５の配列に相補的な配列または少なくとも１５個の連続するヌクレオチドのそ
のフラグメントのうち少なくとも２つを含む。別の実施態様において、アレイは
配列番号３８〜３１５の配列、配列番号３８〜３１５の配列に相補的な配列、ま
たは少なくとも１５個の連続するヌクレオチドのフラグメントのうち少なくとも
５つを含む。 本発明の別の態様は、配列番号３１、３４および３７からなる群から選択され
た配列を有するプロモーターである。

【００４７】 （好ましい実施態様の詳細な説明） 表ＩＶは、本明細書に記載するシグナルペプチド同定法を用いて偽陽性および
偽陰性の頻度を調べるための、全てのヒトスイスプロット（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ
）タンパク質のＮ末端にある４３アミノ酸の分析である。 表Ｖは、本明細書に記載する各カテゴリーにおける５’ＥＳＴの分布および所
定の最小フォン ヘイジン スコア（Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ ｓｃｏｒｅ）を有
する各カテゴリー中の５’ＥＳＴ数を示す。 表ＶＩは、組織（これから対応するｍＲＮＡの５’ＥＳＴが得られた）に関し
て本明細書に記載する各カテゴリーにおける５’ＥＳＴの分布を示す。 表ＶＩＩは、これらのプロモーターのそれぞれに存在する転写因子結合部位を
示す。

【００４８】Ｉ．完全な５’末端を有するｍＲＮＡに由来する５’ＥＳＴを取得する一般的方 法 本発明の５’ＥＳＴを得るためには、完全な５’末端を有するｍＲＮＡを取得
しなければならない。現在、完全な５’末端を有するこのようなｍＲＮＡを得る
ための方法としては、以下に記載するように化学的（１）または酵素的（２）の
２つの方法が存在する。

【００４９】１．完全な５’末端を有するｍＲＮＡを得るための化学的方法 これらの方法の１つは、ｍＲＮＡの５’末端を誘導体化し、誘導体化したｍＲ
ＮＡを選択することを含む化学的修飾方法である。真核生物のｍＲＮＡの５’末
端は、７位がメチル化されたグアノシンを含む「キャップ」と呼ばれる構造を有
する。キャップは、５’，５’−トリホスフェート結合によって、ｍＲＮＡの最
初に転写される塩基に結合する。５’グアノシンは２位と７位の両方がメチル化
されている場合もある。まれに、５’グアノシンは２位、７位および７位がトリ
メチル化されている。完全な５’末端を有するｍＲＮＡを得るための化学的方法
では、５’キャップを特異的に誘導体化して、固定化用支持体上の反応性基に結
合させる。この特異的な誘導体化は、ｍＲＮＡの５’末端のメチル化グアノシン
に結合するリボースとｍＲＮＡの３’末端の塩基に結合するリボースだけが２’
，３’−ｃｉｓジオールを有するという事実に基づいている。

【００５０】 場合により、３’末端リボースの２’，３’−ｃｉｓジオールを化学的に修飾
、置換、変換または除去して、２’，３’−ｃｉｓジオールを有するｍＲＮＡの
５’末端のメチル化グアノシンに結合するリボースだけを残すことができる。３
’末端リボースの２’，３’−ｃｉｓジオールを除去する種々の技法を利用する
ことができる。例えば、制御されたアルカリ加水分解を使用して、３’末端リボ
ースが３’−ホスフェート、２’−ホスフェートまたは（２’，３’）−シクロ
ホスフェートであるｍＲＮＡフラグメントを作製することができる。その後、も
との３’リボースを含むフラグメントをオリゴｄＴカラムによるクロマトグラフ
ィーによって混合物から除去することができる。あるいはまた、２’，３’−ｃ
ｉｓジオールを持たない塩基を、Ｔ４ＲＮＡリガーゼなどのＲＮＡリガーゼを使
用してｍＲＮＡの３’末端に付加することができる。以下の実施例１には、メッ
センジャーＲＮＡの３’末端にヌクレオシド二リン酸をライゲートする方法を記
載する。

【００５１】実施例１ ｍＲＮＡの３’末端へのヌクレオシド二リン酸ｐＣｐのライゲーション 製造業者（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）から提供される緩衝液中の５ＵのＴ ₄ ファージＲＮＡリガーゼ、４０ＵのＲＮａｓｅ阻害剤ＲＮａｓｉｎ（プロメガ （Ｐｒｏｍｅｇａ））および２μｌの³²ｐＣｐ（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ
）＃ＰＢ１０２０８）の存在下で最終反応媒体１０μｌ中で１μｇのＲＮＡをイ
ンキュベーションした。インキュベーションは３７℃で２時間または７〜８℃で
一夜実施した。

【００５２】 ３’リボースの２’，３’−ｃｉｓジオールの修飾または除去後、ｍＲＮＡの
５’末端に存在する２’，３’−ｃｉｓジオールをＮａＢＨ₄、ＮａＢＨ₃ＣＮま
たは過ヨウ素酸ナトリウムなどの試薬を使用して酸化することによって、２’，
３’−ｃｉｓジオールをジアルデヒドに変換することができる。実施例２は、過
ヨウ素酸ナトリウムを用いたｍＲＮＡの５’末端の２’，３’−ｃｉｓジオール
の酸化を記載する。

【００５３】実施例２ 過ヨウ素酸ナトリウムを用いたｍＲＮＡの５’末端の２’，３’−ｃｉｓジオー ルの酸化 ４７ヌクレオチドのキャップ付きオリゴリボヌクレオチド（キャップを含む）
または４６ヌクレオチドのキャップのないオリゴリボヌクレオチドの０．１ＯＤ
単位を以下のように処理した。転写キット「ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７」（
エピセンター テクノロジーズ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ））を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によってオリゴリボヌクレオチドを作製
した。以下に示すように、ＲＮＡ転写物のＤＮＡ鋳型は１個のシトシンを含有し
ていた。キャップのないＲＮＡを合成するために、４種のＮＴＰｓ全てをｉｎ
ｖｉｔｒｏ転写反応中に加えた。キャップ付きＲＮＡを得るためには、ＧＴＰを
キャップの類似体であるｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇと交換した。ポリメラ
ーゼによって認識されるこの化合物は、転写開始時には新生転写物の５’末端に
導入されたが、伸長段階では導入されなかった。結果として、得られたＲＮＡは
その５’末端にキャップをもっていた。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応によって作製
されたオリゴリボヌクレオチドの配列は以下のようであった： ＋キャップ： ５’ｍ７ＧｐｐｐＧＣＡＵＣＣＵＡＣＵＣＣＣＡＵＣＣＡＡＵＵＣＣＡＣＣＣＵ
ＡＡＣＵＣＣＵＣＣＣＡＵＣＵＣＣＡＣ−３’（配列番号１） −キャップ： ５’−ｐｐｐＧＣＡＵＣＣＵＡＣＵＣＣＣＡＵＣＣＡＡＵＵＣＣＡＣＣＣＵＡＡ
ＣＵＣＣＵＣＣＣＡＵＣＵＣＣＡＣ−３’（配列番号２）

【００５４】 オリゴリボヌクレオチドを９μｌの酢酸緩衝液（０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐ
Ｈ５．２）および３μｌの調製直後の０．１Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム溶液に溶解
した。混合物を４℃または室温で遮光して１時間インキュベーションした。その
後、１０％エチレングリコール４μｌを添加して反応を停止した。生成物をエタ
ノールで沈殿させ、水または適当な緩衝液の少なくとも１０μｌに溶解し、水に
対して透析した。

【００５５】 次いで、ｍＲＮＡの５’末端の濃縮を促進するために、ヒドラジン、カルバジ
ド、チオカルバジドまたはセミカルバジド基などの反応性アミン基を有する分子
に、得られたアルデヒド基を結合することができる。完全な５’末端を有するｍ
ＲＮＡを選択する際に使用するのに好適な反応性アミン基を有する分子としては
、アビジン、タンパク質、抗体、ビタミン、受容体分子に特異的に結合すること
ができるリガンドまたはオリゴヌクレオチドが含まれる。実施例３には、得られ
たジアルデヒドとビオチンとの結合を記載する。

【００５６】実施例３ 転写物の５’末端のジアルデヒドとビオチンとの結合 実施例２で得られた酸化生成物を、ｐＨ５〜５．２の酢酸ナトリウム５０μｌ
および式：

【化１】 のビオチンヒドラジドをメトキシエタノール／水混合物（１：１）に加えた調製
直後の０．０２Ｍ溶液５０μｌに溶解した。

【００５７】 これらの実験に使用した化合物ではｎ＝５である。しかし、ｎが０〜５まで変
わる上記式の分子など、他の市販ヒドラジドを使用できることが理解されよう。
次いで、混合物を３７℃で２時間インキュベーションし、エタノールで沈殿させ
、蒸留水に対して透析した。実施例４ではビオチン化反応の特異性を明らかにす
る。

【００５８】実施例４ キャップ付き転写物のビオチン化反応の特異性 キャップ付きｍＲＮＡのビオチン化反応の特異性は以下の試料のゲル電気泳動
によって評価した： 試料１．実施例２のように調製し、実施例１に記載するように³²ｐＣｐで標識
した４６ヌクレオチドのキャップのないｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物。 試料２．実施例２のように調製し、実施例１に記載するように³²ｐＣｐで標識
し、実施例２の酸化反応で処理し、実施例３のビオチン化条件にかけた４６ヌク
レオチドのキャップのないｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物。 試料３．実施例２のように調製し、実施例１に記載するように³²ｐＣｐで標識
した４７ヌクレオチドのキャップ付きｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物。 試料４．実施例２のように調製し、実施例１に記載するように³²ｐＣｐで標識
し、実施例２の酸化反応で処理し、実施例３のビオチン化条件にかけた４７ヌク
レオチドのキャップ付きｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物。

【００５９】 試料１と２は同じ移動速度であった。これはキャップのないＲＮＡが酸化もビ
オチン化もされなかったことを示す。試料３は試料１および２より移動が遅かっ
たが、試料４は移動が最も遅かった。試料３および４のＲＮＡの移動度の差は、
キャップ付きＲＮＡが特異的にビオチン化されたことを示す。

【００６０】 ある場合には、ｍＲＮＡを含む容器の内側、磁気ビーズ、クロマトグラフィー
マトリックスまたはナイロンもしくはニトロセルロース膜などの好適な固相支持
体に反応性アミン基を有する分子を結合することによって完全な５’末端を有す
るｍＲＮＡを濃縮してもよい。例えば、反応性アミン基を有する分子がビオチン
である場合には、固相支持体にアビジンまたはストレプトアビジンを結合させる
。または、反応性アミン基を有する分子が抗体または受容体リガンドである場合
には、固相支持体に同族の抗原または受容体を結合させる。最後に、反応性アミ
ン基を有する分子がオリゴヌクレオチドを含む場合には、固相支持体が相補的な
オリゴヌクレオチドを含むことができる。

【００６１】 完全な５’末端を有するｍＲＮＡは、濃縮法の後に固相から遊離させることが
できる。例えば、ジアルデヒドがビオチンヒドラジドに結合し、固相がストレプ
トアビジンを含む場合には、２％ＳＤＳ中で９５℃までの温度に単に加熱するこ
とよって、ｍＲＮＡを固相から遊離させることができる。ある方法では、濃縮後
に、反応性アミン基を有する分子を完全な５’末端を有するｍＲＮＡから切断し
てもよい。実施例５は、ストレプトアビジンを被覆したビーズによるビオチン化
ｍＲＮＡの捕捉と濃縮後のビーズからのビオチン化ｍＲＮＡの放出を記載する。

【００６２】実施例５ ストレプトアビジン被覆ビーズを使用したビオチン化ｍＲＮＡの捕捉と放出 ストレプトアビジンを被覆した磁気ビーズは、製造業者の指示（ＣＰＧ Ｉｎ
ｃ．、合衆国）によって調製した。ビオチン化ｍＲＮＡをハイブリダイゼーショ
ン緩衝液（１．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ５〜６）に添加した。３０分間インキュベ
ーション後、未結合および未ビオチン化材料を除去した。次いで、ビーズを１％
ＳＤＳを添加した水で数回洗浄した。このようにして得られたビーズを２％ＳＤ
Ｓを含有する水中で９５℃で１５分間インキュベーションした。 実施例６は、ビオチン化ｍＲＮＡをストレプトアビジン被覆ビーズから回収す
る際の効率を明らかにする。

【００６３】実施例６ ビオチン化ｍＲＮＡの回収効率 回収手順の効率は以下のように評価した。キャップ付きＲＮＡを上記のように ³² ｐＣｐで標識し、酸化し、ビオチン化し、ストレプトアビジン被覆ビーズに結
合した。その後、結合したＲＮＡを２％ＳＤＳの存在下で９５℃で５、１５また
は３０分インキュベーションした。 反応生成物を変性条件下（７Ｍ尿素）で１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動で分析した。ゲルをオートラジオグラフィーにかけた。この操作の間に、ヒド
ラゾン結合は還元されなかった。

【００６４】 ２％ＳＤＳ中でのインキュベーション時間が増加するにつれて、回収された核
酸の量は増加した。これはビオチン化ｍＲＮＡが効率的に回収されたことを示す
。 完全な５’末端を有するｍＲＮＡを得るための別の方法では、反応性アミン基
を含むように誘導体化したオリゴヌクレオチドを、完全なキャップを有するｍＲ
ＮＡに特異的に結合させる。好ましくは、上記のように、アルデヒド基を誘導体
化オリゴヌクレオチドに結合するステップの前に、誘導体化オリゴヌクレオチド
がｍＲＮＡの３’末端に結合しないように、ｍＲＮＡの３’末端をブロックする
。例えば、実施例１に記載するＴ４ＲＮＡリガーゼを使用して、ｐＣｐをｍＲＮ
Ａの３’末端に結合することができる。しかし、上記のように、ｍＲＮＡの３’
末端をブロックするステップは任意のステップである。誘導体化オリゴヌクレオ
チドは実施例７に記載するように調製することができる。

【００６５】実施例７ オリゴヌクレオチドの誘導体化 ３’末端がリン酸化されたオリゴヌクレオチドは、約１〜３Ｍのヒドラジンま
たは式Ｈ₂Ｎ（Ｒ１）ＮＨ₂のジヒドラジドのｐＨ４．５の水溶液で８℃で一夜処
理することによって、３’側で３’ヒドラジドに変換した。このインキュベーシ
ョンは１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドなどの
カルボジイミド型の試薬の最終濃度０．３Ｍの水溶液の存在下で実施した。

【００６６】 次いで、誘導体化オリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドを単離するため
の標準的な技法を使用して他の試薬および生成物から分離した。 上記のように、濃縮しようとするｍＲＮＡを、ｍＲＮＡに存在しうる３’ＯＨ
基を除去するように処理することができる。これは、実施例１に記載するように
、ｐＣｐなどの３’ＯＨを持たない配列の酵素的なライゲーションによって実施
することができる。あるいはまた、以下の実施例８に記載するようにアルカリ加
水分解によって３’ＯＨ基を除去してもよい。

【００６７】実施例８ アルカリ加水分解を使用したｍＲＮＡの３’ＯＨ基の除去 ０．１Ｎ水酸化ナトリウムの総容量１００μｌ中で、１．５μｇのｍＲＮＡを
４℃で４０〜６０分間インキュベーションした。この溶液を酢酸で中和し、エタ
ノールで沈殿させた。 ３’ＯＨ基を必要に応じて除去した後、ｍＲＮＡの５’末端のジオール基を以
下の実施例９に記載するように酸化する。

【００６８】実施例９ ｍＲＮＡのジオールの酸化 １ＯＤ単位までのＲＮＡを、９μｌの緩衝液（０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ
６〜７）または水と３μｌの調製直後の０．１Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム溶液に溶
解した。反応物を遮光して４℃または室温で１時間インキュベーションした。イ
ンキュベーション後、１０％エチレングリコール４μｌを添加することによって
反応を停止した。その後、混合物を室温で１５分間インキュベーションした。エ
タノールで沈殿させた後、生成物を少なくとも１０μｌの水または適当な緩衝液
に溶解して、水に対して透析した。 ｍＲＮＡの５’末端のジオール基を酸化した後、誘導体化したオリゴヌクレオ
チドを実施例１０に記載するように得られたアルデヒドに結合した。

【００６９】実施例１０ ｍＲＮＡのアルデヒドの誘導体化したオリゴヌクレオチドとの結合 酸化したｍＲＮＡを５０μｌの酢酸ナトリウムｐＨ４〜６などの酸性媒体に溶
解した。ｍＲＮＡ：誘導体化したオリゴヌクレオチドの比１：２０が得られるよ
うに、誘導体化オリゴヌクレオチドの溶液５０μｌを添加した。この混合物を水
素化ホウ素で還元し、３７℃で２時間または１０℃で一夜（１４時間）インキュ
ベーションした。次いで、混合物をエタノールで沈殿し、１０μｌ以上の水また
は適当な緩衝液に溶解し、蒸留水に対して透析した。所望により、アクリルアミ
ドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析または他の従来の技法を使用して得られた生成物
を分析することができる。 誘導体化オリゴヌクレオチドをｍＲＮＡに結合した後に、以下の実施例１１に
記載するように逆転写反応を実施することができる。

【００７０】実施例１１ 誘導体化したオリゴヌクレオチドに結合したｍＲＮＡの逆転写 オリゴデオキシリボヌクレオチドは以下のように誘導体化した。５’ＯＨ末端
と３’−Ｐ末端を有する配列５’ＡＴＣＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣＡＣＧＡＧＡＣＣ
ＡＴＴＡ３’（配列番号３）のオリゴデオキシリボヌクレオチドの３ＯＤ単位を
、２μｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを
含有するジメチルホルムアミド／水（７５：２５）中で調製した１．５Ｍヒドロ
キシベンゾトリアゾール溶液ｐＨ５．３の７０μｌ中に溶解した。混合物を２２
℃で２時間３０分インキュベーションし、次いでＬｉＣｌＯ₄／アセトンで２回 沈殿させた。ペレットを０．２５Ｍヒドラジン２００μｌに溶解し、８℃で３〜
１４時間インキュベーションした。ヒドラジン反応後、混合物をＬｉＣｌＯ₄／ アセトンで２回沈殿させた。

【００７１】 逆転写すべきメッセンジャーＲＮＡを、−８０℃で保存しておいた１辺２ｃｍ
の胎盤のブロックから抽出した。従来の酸性フェノール技法を使用して全ＲＮＡ
を抽出した。オリゴ−ｄＴクロマトグラフィーを使用してｍＲＮＡを精製した。
ｍＲＮＡの完全性はノーザンブロット法でチェックした。 胎盤由来の７μｇのｍＲＮＡのジオール基は実施例９に記載するように酸化し
た。沈殿ステップを排除クロマトグラフィーステップに変えて、ｍＲＮＡに結合
しなかった誘導体化オリゴデオキシリボヌクレオチドを除去したこと以外は上記
の実施例１０に記載するように、誘導体化オリゴヌクレオチドをｍＲＮＡに結合
した。排除クロマトグラフィーは以下のように実施した：

【００７２】 アガロースとアクリルアミドの混合物である１０ｍｌのＵｌｔｒｏｇｅｌ Ａ
ｃＡ３４（バイオセプラ（ＢｉｏＳｅｐｒａ）＃２３０１５１）ゲルを、１０ｍ
ＭのトリスｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡおよび０．０
５％ＳＤＳの溶液５０ｍｌ中で平衡化した。混合物を沈降させた。上清を除去し
、ゲルを５０ｍｌの緩衝液に懸濁させた。この手順を２または３回繰り返し行っ
た。 ガラスビーズ（直径３ｍｍ）を２ｍｌの使い捨てピペット（長さ２５ｃｍ）に
入れた。ゲルの高さがピペットの頂部から１ｃｍのところで安定するまでピペッ
トにゲル懸濁液を充填した。次いで、カラムを２０ｍｌの平衡緩衝液（１０ｍＭ
トリスＨＣｌ ｐＨ７．４、２０ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡化させた。 誘導体化オリゴヌクレオチドと反応したｍＲＮＡの１０μｌを、１０ｍＭ尿素
３９μｌと、５ｍｇのブロモフェノールブルーを６０％グリセロール（ｖ／ｖ）
に溶解し、この混合物を直径０．４５μｍのフィルターを通過させることによっ
て調製したブルー−グリセロール緩衝液２μｌ中で混合した。

【００７３】 次いで、オリゴヌクレオチドに結合したｍＲＮＡをカラムにのせた。試料が浸
透すると同時に平衡緩衝液を添加した。次いで、１００μｌの画分を集めた。ｍ
ＲＮＡに結合しなかった誘導体化オリゴヌクレオチドは画分１６またはそれ以後
の画分に出現した。従って、画分３〜１５を合わせて、エタノールで沈殿させた
。

【００７４】 誘導体化オリゴヌクレオチドが実際にｍＲＮＡに結合したかどうかを判定する
ために、合わせた画分の１０分の１をナイロン膜に２回スポットし、従来の技法
を使用して放射性標識プローブとハイブリダイズさせた。これらのハイブリダイ
ゼーションに使用した³²Ｐ標識プローブは、誘導体化オリゴヌクレオチドにアン
チ相補的（ａｎｔｉｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）な配列５’ＴＡＡＴＧＧＴＣ
ＴＣＧＴＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＧＡＴ３’（配列番号４）のオリゴデオキシリボ
ヌクレオチドであった。オートラジオグラフィーにより観察されたシグナルは誘
導体化オリゴヌクレオチドが実際にｍＲＮＡに結合していることを示した。

【００７５】 誘導体化オリゴヌクレオチドと反応したｍＲＮＡの残りの１０分の９は以下の
ように逆転写させた。逆転写反応は製造業者の指示に従って逆転写酵素とプライ
マーとしてランダム配列のノナマー（ｎｏｎａｍｅｒ）５０ｐｍｏｌを用いて実
施した。 逆転写を確実にキャップ構造を通して実施させるために、２つのタイプの実験
を実施した。

【００７６】 第１の方法では、アルカリ加水分解によって逆転写反応から得られたｃＤＮＡ
：ＲＮＡヘテロ二重鎖のＲＮＡを除去した後、得られた１本鎖ｃＤＮＡの一部を
正に荷電した膜にスポットし、従来の方法を使用して、誘導体化オリゴヌクレオ
チドの配列と同じ配列を有する³²Ｐ標識プローブにハイブリダイズさせた。誘導
体化オリゴヌクレオチドの配列と同じ配列の対照オリゴデオキシリボヌクレオチ
ドの１ｐｍｏｌ、１００ｆｍｏｌ、５０ｆｍｏｌ、１０ｆｍｏｌおよび１ｆｍｏ
ｌを含有する対照スポットを加えた。ｃＤＮＡを含有するスポットで観察された
シグナルは、約１５ｆｍｏｌの誘導体化オリゴヌクレオチドが逆転写されたこと
を示した。これらの結果は、逆転写がキャップを通して実施され、特に逆転写酵
素が真核生物メッセンジャーＲＮＡのキャップの５’−Ｐ−Ｐ−Ｐ−５’結合を
越えることを示す。

【００７７】 第２のタイプの実験では、上記の第１鎖合成で得られた１本鎖ｃＤＮＡをＰＣ
Ｒ反応の鋳型として使用した。２つのタイプの反応を実施した。第一に、αグロ
ビン、デヒドロゲナーゼ、ｐｐ１５および延長因子Ｅ４のｍＲＮＡの特異的な増
幅を、以下のオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー対を使用して実施した
。

【００７８】 αグロビン ＧＬＯ−Ｓ：５’ＣＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＡＡＣＧＴＣＡＡＣＧＣＣＧＣ３’ （配列番号５） ＧＬＯ−Ａｓ：５’ＴＣＡＣＣＡＧＣＡＧＧＣＡＧＴＧＧＣＴＴＡＧＧＡＧ３’ （配列番号６）

【００７９】 デヒドロゲナーゼ ３ＤＨ−Ｓ：５’ＡＧＴＧＡＴＴＣＣＴＧＣＴＡＣＴＴＴＧＧＡＴＧＧＣ３’ （配列番号７） ３ＤＨ−Ａｓ：５’ＧＣＴＴＧＧＴＣＴＴＧＴＴＣＴＧＧＡＧＴＴＴＡＧＡ３’ （配列番号８）

【００８０】 ｐｐ１５ ＰＰ１５−Ｓ：５’ＴＣＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＧＡＣＡＡＧＣＣＡＡＴＴＴ３’ （配列番号９） ＰＰ１５−Ａｓ：５’ＡＧＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＧＴＧＡＧＴＣＣ３
’（配列番号１０）

【００８１】 延長因子Ｅ４ ＥＦＡ１−Ｓ：５’ＡＴＧＧＧＡＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＣＴＣＡＴＡＴＣＡ３’ （配列番号１１） ＥＦ１Ａ−Ａｓ：５’ＡＧＣＡＧＣＡＡＣＡＡＴＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＡＧ３
’（配列番号１２）

【００８２】 第二に、上記の対のアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドおよび誘導
体化オリゴデオキシリボヌクレオチドの配列に由来するプライマー（５’ＡＴＣ
ＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣＡＣＧＡＧＡＣＣＡＴＴＡ３’）（配列番号１３）を用い
て非特異的増幅も実施した。

【００８３】 以下のＲＴ−ＰＣＲ産物の試料の２０分の１を１．５％アガロースゲルで分析
し、臭化エチジウムで染色した。 試料１：ｃＤＮＡの存在下での配列番号５および６のグロビンプライマーを使
用したＰＣＲ反応の産物。 試料２：添加ｃＤＮＡの非存在下での配列番号５および６のグロビンプライマ
ーを使用したＰＣＲ反応の産物。 試料３：ｃＤＮＡの存在下での配列番号７および８のデヒドロゲナーゼプライ
マーを使用したＰＣＲ反応の産物。 試料４：添加ｃＤＮＡの非存在下での配列番号７および８のデヒドロゲナーゼ
プライマーを使用したＰＣＲ反応の産物。 試料５：ｃＤＮＡの存在下での配列番号９および１０のｐｐ１５プライマーを
使用したＰＣＲ反応の産物。 試料６：添加ｃＤＮＡの非存在下での配列番号９および１０のｐｐ１５プライ
マーを使用したＰＣＲ反応の産物。 試料７：ｃＤＮＡの存在下での配列番号１１および１２のＥＩＦ４プライマー
を使用したＰＣＲ反応の産物。 試料８：添加ｃＤＮＡの非存在下での配列番号１１および１２のＥＩＦ４プラ
イマーを使用したＰＣＲ反応の産物。

【００８４】 ＰＣＲ産物の予想されるサイズのバンドは試料１、３、５および７だけに観察
され、これによってｃＤＮＡ集団中に対応する配列が存在することが示された。 また、グロビンおよびデヒドロゲナーゼプライマー（配列番号６および８）の
アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその配列が誘導体化オリゴヌクレオチド
に一致するオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ反応を実施した。上記の試料１お
よび３と等価な試料中に予期されたサイズのＰＣＲ産物が存在することは、誘導
体化オリゴヌクレオチドがｍＲＮＡに結合していたことを示した。

【００８５】 上記の実施例は、図１に示すように、完全な５’末端を有するものについてｍ
ＲＮＡを濃縮するための化学的手法をまとめたものである。このようなｍＲＮＡ
を得るための化学的方法に関する更なる詳細は、参照により本明細書に組み入れ
られる１９９６年１１月７日に公開された国際出願番号ＷＯ９６／３４９８１に
開示されている。５’キャップ構造に対する上記の化学的修飾に基づいた方法を
使用して、ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡがこれから誘導される）の５’末端を含むように
選択されたｃＤＮＡを作製することができる。このような手法の一形態では、ｍ
ＲＮＡの５’末端を上記のように修飾する。その後、逆転写反応を実施して、ｍ
ＲＮＡの５’末端に相補的なプライマーを伸長する。１本鎖ＲＮＡを除去して、
ｍＲＮＡが完全な５’末端を含むｃＤＮＡ／ｍＲＮＡヘテロ二重鎖の集団を得る
。得られたヘテロ二重鎖を固相上に捕捉する。この固相は、ｍＲＮＡの５’末端
を誘導体化するのに使用した分子と相互作用し得る分子を被覆したものである。
その後、ヘテロ二重鎖を分離して、ｍＲＮＡの５’末端を含む１本鎖の第１ｃＤ
ＮＡ鎖を回収する。次いで、第２鎖ｃＤＮＡの合成を従来の技法を使用して進行
させる。例えば、その開示内容が参照により本明細書に組み入れられるＷＯ９６
／３４９８１またはカルニンチ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ）ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３
７：３２７〜３３６、１９９６に開示されている手法を使用して、ｍＲＮＡのコ
ード配列の５’末端から誘導される配列を含むｃＤＮＡを選択することができる
。

【００８６】 ｍＲＮＡの５’キャップにオリゴヌクレオチドタグを結合した後、逆転写反応
を実施して、ｍＲＮＡに相補的なプライマーをｍＲＮＡの５’末端まで伸長する
。標準的な技法を使用して、得られたヘテロ二重鎖のＲＮＡ成分を除去した後、
オリゴヌクレオチドタグに相補的なプライマーを用いて第２鎖ｃＤＮＡの合成を
実施する。

【００８７】２．完全な５’末端を有するｍＲＮＡを得るための酵素的方法 ｃＤＮＡが誘導されるｍＲＮＡの５’末端まで伸長するｃＤＮＡを選択するた
めの他の技法は完全に酵素的な方法である。これらの技法のいくつかの形態は、
それらの開示内容が参考として本明細書に組み入れられている、デュマス ミル
ン エドワーズ（Ｄｕｍａｓ Ｍｉｌｎｅ Ｅｄｗａｒｄｓ）Ｊ．Ｂ．（パリＶ
Ｉ大学の博士論文、Ｌｅ ｃｌｏｎａｇｅ ｄｅｓ ＡＤＮｃ ｃｏｍｌｅｔｓ
：ｄｉｆｆｉｃｕｌｔｅｓ ｅｔ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｎｏｕｖｅｌｌ
ｅｓ． Ａｐｐｏｒｔｓ ｐｏｕｒ ｌ’ｅｔｕｄｅ ｄｅ ｌａ ｒｅｇｕｌ
ａｔｉｏｎ ｄｅ ｌ’ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｅ ｌａ ｔｒｙｐｔｏｐｈ
ａｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ ｄｅ ｒａｔ，１９９３年１２月２０日）、
欧州特許第６２５５７２号およびカト（Ｋａｔｏ）ら、Ｇｅｎｅ １５０：２４
３〜２５０、１９９４年に開示されている。

【００８８】 簡単に説明すると、このような方法では、単離されたｍＲＮＡをアルカリ性ホ
スファターゼで処理して、キャップのない不完全なｍＲＮＡの５’末端に存在す
るリン酸を除去する。この手順の後に、全長ｍＲＮＡに存在するキャップを、Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼまたはタバコ酸ピロホスファターゼなどの脱キャッ
プ酵素で酵素的に除去する。次いで、ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたは３’末端
にＲＮＡを有するＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドオリゴヌクレオチドのいずれであ
ってもよいオリゴヌクレオチドを、Ｔ４ＲＮＡリガーゼを使用して、脱キャップ
ｍＲＮＡの５’末端に存在するリン酸に結合させる。オリゴヌクレオチドは、合
成後のｃＤＮＡのクローニングを容易にするための制限部位を含んでいてもよい
。以下の実施例１２には、デュマス（Ｄｕｍａｓ）の博士論文に基づいた１つの
酵素的方法を記載する。

【００８９】実施例１２ ５’ＥＳＴを得るための酵素的な方法 ウシ腸ホスファターゼ（バイオラブズ（Ｂｉｏｌａｂｓ））を使用して２０μ
ｇのポリＡ＋ＲＮＡを脱リン酸化した。フェノールクロロホルムによる抽出の後
、ｍＲＮＡのキャップ構造をタバコ酸ピロホスファターゼ（シンシ（Ｓｈｉｎｓ
ｈｉ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １５：２１８５〜２１９０、１９７６に
記載されるように精製したもの）を使用して加水分解し、非リン酸化５’末端、
３’末端にアデノシンリボホスフェートの伸長部および５’末端近傍にＥｃｏＲ
Ｉ部位を有するヘミ５’ＤＮＡ／ＲＮＡ−３’オリゴヌクレオチドを、Ｔ４ＲＮ
Ａリガーゼ（バイオラブズ（Ｂｉｏｌａｂｓ））を使用してｍＲＮＡの５’Ｐ末
端に結合した。この手法で使用するのに好適なオリゴヌクレオチドは、好ましく
は、鎖長３０〜５０塩基である。５’末端に螢光色素を付加することによって、
非リン酸化５’末端を有するオリゴヌクレオチドを合成することができる。オリ
ゴヌクレオチドの３’末端にアデノシンリボホスフェートの伸長部を付加すると
、連結反応効率が増す。オリゴヌクレオチドはＥｃｏＲＩ以外のクローニング部
位を有してもよいことが認識されるだろう。

【００９０】 脱キャップｍＲＮＡの５’末端に存在するリン酸にオリゴヌクレオチドを連結
した後に、従来の方法またはそれらの開示内容が参考として本明細書に組み入れ
られている欧州特許第６２５，５７２号およびカト（Ｋａｔｏ）ら、前掲、およ
びデュマス ミルン エドワーズ（Ｄｕｍａｓ Ｍｉｌｎｅ Ｅｄｗａｒｄｓ）
、前掲、に明記されている方法を使用して、第１鎖および第２鎖のｃＤＮＡの合
成を実施する。次いで、その開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、
サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、分子クローニング：ラボラトリーマニュ
アル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ）、第２版、コールド スプリング ハーバー ラボラトリープレス（
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）
、１９８９年、に記載されるような技法を使用して、得られたｃＤＮＡを、カト
（Ｋａｔｏ）ら、前掲、に開示されるようなベクターまたは当業者に周知の他の
核酸ベクターに連結することができる。

【００９１】ＩＩ．本発明の５’ＥＳＴの取得および特徴づけ 本発明の５’ＥＳＴは、以下に記載するように完全な５’末端を有するものに
ついてｍＲＮＡを濃縮するための上記の化学的および酵素的方法を使用して得ら
れた。完全な５’ＥＳＴを有するｍＲＮＡを使用した５’ＥＳＴの取得 最初に、ｍＲＮＡを以下の実施例１３に記載するように調製した。

【００９２】実施例１３ 完全な５’ＥＳＴを有するｍＲＮＡの調製 ２９種類の異なる組織に由来するヒト全ＲＮＡまたはポリＡ＋ＲＮＡはそれぞ
れラビモ（ＬＡＢＩＭＯ）およびクローンテック（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ）から購
入し、以下のように４４のｃＤＮＡライブラリーを作製するために使用した。購
入したＲＮＡは、酸性グアニジウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム
抽出（チョムチニスキー（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｉｓｋｉ）およびサッチ（Ｓａｃｃ
ｈｉ）、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １６２：１５６〜
１５９，１９８７）を使用して細胞または組織から単離されたものである。ポリ
Ａ⁺ＲＮＡは、リボソームＲＮＡを除去するために、アビブ（Ａｖｉｖ）および レダー（Ｌｅｄｅｒ）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ６９
：１４０８〜１４１２、１９７２に記載されるように、オリゴｄＴクロマトグラ
フィーを２回通過させることによって全ＲＮＡ（ラビモ（ＬＡＢＩＭＯ））から
単離した。

【００９３】 ポリＡ＋ＲＮＡの品質および完全性を調べた。グロビンプローブによりハイブ
リダイズされるノーザンブロット法を使用して、ｍＲＮＡが分解されてないこと
を確認した。リボソーム配列によるポリＡ⁺ｍＲＮＡの汚染を、ノーザンブロッ ト法と２８ＳｒＲＮＡの配列に由来するプローブを使用して調べた。ｒＲＮＡが
５％未満であるｍＲＮＡの調製物をライブラリー構築に使用した。外因性配列（
原核生物または真菌）により汚染されたＲＮＡを用いてライブラリーを構築しな
いように、ＰＣＲを使用して、細菌の１６Ｓリボソーム配列の存在または高度に
発現される２種の真菌ｍＲＮＡの配列を調べた。

【００９４】 ｍＲＮＡの調製後に、完全な５’末端を有するものについてｍＲＮＡを濃縮す
るための上記の化学的および／または酵素的な手法を使用して、種々の組織から
５’ＥＳＴを得た。両方法において、オリゴヌクレオチドタグをｍＲＮＡの５’
末端に結合した。オリゴヌクレオチドタグは、その後のクローニング手順を容易
にするためのＥｃｏＲＩ部位を有した。ライブラリーの構築物において得られた
１本鎖ｃＤＮＡおよび２本鎖ｃＤＮＡのプロセシングを容易にするために、化学
的および酵素的方法で同一のヌクレオチド配列を使用して、ライゲートされたオ
リゴヌクレオチドを設計した。しかし、化学的手法では、使用したタグは、ｍＲ
ＮＡのキャップに連結されたオリゴデオキシリボヌクレオチドであったが、酵素
的ライゲーションでは、タグは、実施例１２に記載するように脱キャップｍＲＮ
Ａの５’末端に連結されたキメラなヘミ５’ＤＮＡ／ＲＮＡ３’オリゴヌクレオ
チドであった。

【００９５】 化学的方法または酵素的方法のどちらかによってｍＲＮＡにオリゴヌクレオチ
ドタグを結合した後、オリゴヌクレオチドタグに相補的なプローブを使用して２
００〜５００ｎｇのｍＲＮＡを用いたノーザンブロット法を実施することによっ
てｍＲＮＡの完全性を調査してから、実施例１４に記載するように第１鎖の合成
を実施した。

【００９６】実施例１４ 完全な５’末端を有するｍＲＮＡ鋳型を使用したｃＤＮＡ合成 化学的および酵素的方法を使用してオリゴヌクレオチドタグに結合させたｍＲ
ＮＡについては、スーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）ＩＩ（ギブコ
（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）またはＲＮａｓｅ Ｈ Ｍｉｎｕｓ Ｍ−ＭＬＶ（プロ
メガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））逆転写酵素とプライマーとしてランダムノナマー（ｒ
ａｎｄｏｍ ｎｏｎａｍｅｒ）を使用して第１鎖ｃＤＮＡの合成を実施した。こ
の手法の後続のステップでの消化からｃＤＮＡの内部ＥｃｏＲＩ部位を保護する
ために、メチル化ｄＣＴＰを第１鎖合成に使用した。アルカリ加水分解によって
ＲＮＡを除去した後、残存するプライマーを除去するために、第１鎖ｃＤＮＡを
イソプロパノールを使用して沈殿させた。

【００９７】 化学的方法と酵素的方法の両方において、実施例１２に記載したライゲートさ
れたオリゴヌクレオチドの５’末端に対応するプライマーを使用してクレノウ（
Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメントによりｃＤＮＡの第２鎖を合成した。好ましくは、
プライマーは鎖長が２０〜２５塩基である。クローニング中の消化からｃＤＮＡ
中の内部ＥｃｏＲＩ部位を保護するために、第２鎖合成でもメチル化ｄＣＴＰも
使用した。 ｃＤＮＡ合成後、以下の実施例１５に記載するようにｃＤＮＡをｐＢｌｕｅＳ
ｃｒｉｐｔにクローニングした。

【００９８】実施例１５ 完全な５’末端を有するｍＲＮＡから誘導したｃＤＮＡのＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ へのクローニング 第２鎖の合成後に、ｃＤＮＡの両末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（バイオラボ
ズ（Ｂｉｏｌａｂｓ））で平滑化し、ＥｃｏＲＩでｃＤＮＡを消化した。ｃＤＮ
Ａ合成中にメチル化ｄＣＴＰを使用したので、タグ中に存在するＥｃｏＲＩ部位
がただ１つのヘミメチル化部位であり、従ってＥｃｏＲＩ消化を受けやすい唯一
の部位であった。次いで、排除クロマトグラフィー（ＡｃＡ，バイオセプラ（Ｂ
ｉｏｓｅｐｒａ））を使用してｃＤＮＡをサイズ分画し、１５０ｂｐより大きい
ｃＤＮＡに対応する画分を収集して、エタノールで沈殿させた。ファージミドｐ
ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔベクター（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））の
ＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩ末端にｃＤＮＡを方向性を保ってクローニングした。
ライゲーション混合物を細菌にエレクトロポレーションで導入し、適当な抗生物
質選択下で増殖させた。 以下の実施例１６に記載するように、結合したオリゴヌクレオチドタグを有す
るクローンを選択した。

【００９９】実施例１６ オリゴヌクレオチドタグを結合させたクローンの選択 上記のように作製した５’ＥＳＴライブラリーを含有するプラスミドＤＮＡを
精製した（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））。以下のように、タグ付きクローンの陽
性選択を実施した。簡単に説明すると、この選択手順では、ファージＦ１の遺伝
子ＩＩエンドヌクレアーゼを、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたはＴ７遺伝子６エ
キソヌクレアーゼなどのエキソヌクレアーゼ（チャン（Ｃｈａｎｇ）ら、Ｇｅｎ
ｅ １２７：９５〜８、１９９３）と共に使用して、プラスミドＤＮＡを１本鎖
ＤＮＡに変換した。次いで、得られた１本鎖ＤＮＡを、フライ（Ｆｒｙ）ら、Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１３：１２４〜１３１、１９９２に記載されるよう
に、常磁性ビーズを使用して精製した。この手順では、１本鎖ＤＮＡを、実施例
１３に記載するオリゴヌクレオチドの３末端に対応する配列を有するビオチン化
オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせた。好ましくは、プライマーは２０〜
２５塩基の長さである。ビオチン化オリゴヌクレオチドに相補的な配列を含むク
ローンは、インキュベーションによって、ストレプトアビジンを被覆した磁気ビ
ーズに捕捉して、次に磁気的に選択した。陽性クローンの捕捉後、磁気ビーズか
らプラスミドＤＮＡを放出させ、アマーシャム ファルマシア バイオテック（
Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）製のＴｈｅｒｍｏＳ
ｅｑｕｅｎａｓｅなどのＤＮＡポリメチラーゼを使用して２本鎖ＤＮＡに変換し
た。または、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ製のジーントラッパーキット（Ｇｅｎ
ｅ Ｔｒａｐｐｅｒ ｋｉｔ）に記載されるようなプロトコールを使用してもよ
い。次いで、２本鎖ＤＮＡを細菌にエレクトロポレーションで導入した。５’タ
グ付きオリゴヌクレオチドを有する陽性クローンの割合は、ドットブロット分析
を使用して一般に９０〜９８％の範囲であると推定された。 エレクトロポレーション後、ライブラリーを３８４−マイクロタイタープレー
ト（ＭＴＰ）に並べた。ＭＴＰのコピーを今後使用するために保管した。次いで
、ライブラリーを９６ＭＴＰに移し、以下のように配列決定した。

【０１００】実施例１７ 選択したクローン中の挿入物の配列決定 最初に、標準的なＳＥＴＡ−ＡおよびＳＥＴＡ−Ｂプライマー（ジェンセット
（Ｇｅｎｓｅｔ）ＳＡ）、ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ（パーキン−エルマー（Ｐ
ｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ））、ｄＮＴＰｓ（ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ））、パーキン−エルマーコーポレーション（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃ
ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が推奨する緩衝液およびサイクル条件を使用して、ＰＥ
９６００サーモサイクラー（パーキン−エルマー、アプライド バイオシステム
ズ ディビジョン（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）、カリフォルニア州フォスターシティ）でＰＣＲ
によりプラスミド挿入物を増幅した。

【０１０１】 次いで、自動ＡＢＩプリズム（Ｐｒｉｓｍ）３７７シークエンサー（パーキン
−エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ））を使用してＰＣＲ産物を配列決定し
た。配列決定反応は、標準的な色素−プライマー化学とＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅ
ｎａｓｅ（アマーシャム ファルマシア バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ））を用いたＰＥ９６００サーモサイクラー
を使用して実施した。使用したプライマーは適宜にＴ７または２１Ｍ１３（ジェ
ンセット（Ｇｅｎｓｅｔ）ＳＡ）のいずれかであった。プライマーはＪＯＥ、Ｆ
ＡＭ、ＲＯＸおよびＴＡＭＲＡ染料で標識した。配列決定反応に使用したｄＮＴ
ＰｓおよびｄｄＮＴＰｓはベーリンガーから購入した。シークエンシング用緩衝
液、試薬の濃度およびサイクル条件はアマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）が推奨
するとおりにした。

【０１０２】 配列決定反応後、試料をエタノールで沈殿させ、ホルムアミドローディング用
緩衝液で懸濁し、標準的な４％アクリルアミドゲルにのせた。電気泳動はＡＢＩ
３７７シークエンサーで３００Ｖで２．５時間実施し、配列データを収集し、Ａ
ＢＩプリズム（Ｐｒｉｓｍ）ＤＮＡシークエンシング分析ソフトウェア、バージ
ョン２．１．２を使用して分析した。

【０１０３】２．得られた５’ＥＳＴのコンピュータ解析：ＮｅｔＧｅｎｅおよびＳｉｇｎａ ｌＴａｇデータベースの構築 上記のように作製した４４のｃＤＮＡライブラリーの配列データを専売のデー
タベースに移し、そこで品質管理とバリデーションステップを実施した。Ｕｎｉ
ｘシステムを用いて作動する専売の塩基コーラー（ｂａｓｅ−ｃａｌｌｅｒ）は
、ピークの形状、ピーク間分解能およびノイズレベルを考慮して、疑わしいピー
クを自動的に信号旗で知らせた。専売の塩基コーラー（ｂａｓｅ−ｃａｌｌｅｒ
）はまた自動トリミングを実施した。疑わしいピークが４つより多い２５個以下
の塩基の伸長部はいかなるものも信頼性がないとみなされ、破棄された。クロー
ニングベクターまたは連結オリゴヌクレオチドに対応する配列は自動的にＥＳＴ
配列から除かれた。しかし、得られたＥＳＴ配列は、５’末端に上記の配列に属
する１〜５塩基を含有してもよい。必要に応じて、これらはケースごとに容易に
除去することができる。

【０１０４】 上記のように配列決定した後に、５’ＥＳＴの配列を、以下に記載する保存と
操作のためにコールされる専売のデータベースであるＮｅｔＧｅｎｅ（商標名）
に加えた。データは、コンピュータが読みとり、アクセスすることのできる任意
の媒体で保存および操作できるとことが当業者には理解されよう。コンピュータ
が読みとり可能な媒体には、磁気的、場合により、電子的に読みとり可能な媒体
が含まれる。例えば、コンピュータ読みとり可能媒体はハードディスク、フロッ
ピーディスク、磁気テープ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＲＡＭまたはＲＯＭ並びに当業者に
周知の他の種類の媒体であってもよい。

【０１０５】 また、配列データは多様なフォーマットでデータプロセッサプログラムで保存
および操作することができる。例えば、配列データは、マイクロソフト（Ｍｉｃ
ｒｏｓｏｆｔ）ワード（ＷＯＲＤ）もしくはワードパーフェクト（ＷＯＲＤＰＥ
ＲＦＥＣＴ）などのワード処理ファイル中にテキストとして、またはＤＢ２、Ｓ
ＹＢＡＳＥもしくはＯＲＡＣＬＥなどの当業者に周知の種々のデータベースプロ
グラム中にＡＳＣＩＩファイルとして保存することができる。

【０１０６】 配列情報を保存するコンピュータ読みとり可能媒体はパーソナルコンピュータ
、ネットワーク、サーバーまたは当業者に周知の他のコンピュータシステム内で
あってもよい。コンピュータまたは他のシステムは、好ましくは、上記の保存媒
体と、配列データにアクセスし、操作するためのプロセッサとを含む。配列デー
タが保存されると、所望の核酸配列を有する保存配列または特定の機能性ドメイ
ンを有するタンパク質をコードする保存配列を突き止めるために操作および検索
することができる。例えば、保存されている配列情報を他の公知の配列と比較し
て、相同性、生物学的機能に必要なモチーフまたは構造モチーフを同定すること
ができる。

【０１０７】 保存された配列を検索または比較するために使用することができるプログラム
は、ＭａｃＰａｔｔｅｒｎ（ＥＭＢＬ）、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２プログ
ラムシリーズ（ＮＣＢＩ）、ヌクレオチド（ＢＬＡＳＴＮ）およびペプチド（Ｂ
ＬＡＳＴＸ）比較のための基本的なローカルアライメントツールプログラム（ア
ルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３、１
９９０）およびＦＡＳＴＡ（ペアソン（Ｐｅａｓｏｎ）およびリップマン（Ｌｉ
ｐｍａｎ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４
，１９８８）を含む。ＢＬＡＳＴプログラムは、規定されたマッチおよびミスマ
ッチ基準に基づいてアライメントを拡張する。

【０１０８】 上記のプログラムおよび実施例２８に記載するプログラムを使用して検出する
ことができるモチーフは、ロイシンジッパー、ヘリックス−ターン−ヘリックス
モチーフ、グリコシル化部位、ユビキチン化部位、αヘリックスおよびβシート
、コードされたタンパク質の分泌を指令するシグナルペプチドをコードするシグ
ナル配列、ホメオボックスなどの転写調節に関与する配列、酸性領域、酵素活性
部位、基質結合部位並びに酵素的切断部位を含む。

【０１０９】 関心のある配列モチーフについてＮｅｔＧｅｎｅ^TMデータベースでｃＤＮＡを
検索する前に、以下の実施例１８に記載するように、関心のないｍＲＮＡから誘
導されたｃＤＮＡを同定して、それ以上考慮しないように除外した。

【０１１０】実施例１８ 不要な配列の考慮対象からの除外 トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ミトコンドリアＲＮＡ、原核生物
ＲＮＡｓ、真菌ＲＮＡｓ、Ａｌｕ配列、Ｌ１配列または反復配列などの不要な配
列に由来するＮｅｔＧｅｎｅ^TMデータベース中の５’ＥＳＴを、ＦＡＳＴＡおよ
びＢＬＡＳＴＮプログラムと表Ｉに掲載するパラメータを使用して同定した。

【０１１１】 ｔＲＮＡをコードする５’ＥＳＴを今後の考慮対象から除外するために、この
５’ＥＳＴ配列を、ＥＭＢＬリリース３８から得られる１１９０の周知のｔＲＮ
Ａの配列（このうち、１００がヒトである）と比較した。比較は、５’ＥＳＴの
両方の鎖にＦＡＳＴＡを使用して実施した。６０より多いヌクレオチドに対して
８０％を越える相同性を有する配列をｔＲＮＡと同定した。スクリーニングした
１４４，３４１の配列のうち、２６はｔＲＮＡと同定され、今後の考慮対象から
除外した。

【０１１２】 ｒＲＮＡをコードする５’ＥＳＴを今後の考慮対象から除外するために、この
５’ＥＳＴ配列を、ＥＭＢＬリリース３８から得られる２４９７の周知のｒＲＮ
Ａの配列（このうち、７３がヒトである）と比較した。５’ＥＳＴの両方の鎖に
ＢＬＡＳＴＮ（パラメータＳ＝１０８）を使用して比較を実施した。４０ヌクレ
オチドよりも長い領域に対して８０％を越える相同性を有する配列をｒＲＮＡと
同定した。スクリーニングした１４４，３４１の配列のうち、３，３１２をｒＲ
ＮＡと同定し、今後の考慮対象から除外した。

【０１１３】 ｍＲＮＡをコードする５’ＥＳＴを今後の考慮対象から除外するために、この
５’ＥＳＴ配列を、ゲノムの配列全体を入手することができる２つの周知のミト
コンドリアゲノムの配列と、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡおよびｍＲＮＡを含むこれらの
ミトコンドリアゲノムから転写される全ての配列と、合計３８配列について比較
した。５’ＥＳＴの両方の鎖にＢＬＡＳＴＮ（パラメータＳ＝１０８）を使用し
て比較を実施した。４０ヌクレオチドよりも長い領域に対して８０％を越える相
同性を有する配列をｍｔＲＮＡと同定した。スクリーニングした１４４，３４１
の配列のうち、６，１１０をｍｔＲＮＡと同定し、今後の考慮対象から除外した
。

【０１１４】 パラメータＳ＝１４４を用いるＢＬＡＳＴＮを使用して、５’ＥＳＴ配列を細
菌および真菌部門のＥＭＢＬのリリース４６と比較することによって、異種不純
物由来であると思われる配列を今後の考慮対象から除外した。少なくとも４０の
ヌクレオチドに対して９０％を越える相同性を有する全ての配列を異種不純物と
同定した。調査した４２のｃＤＮＡのうち、含まれる原核生物および真菌の配列
の平均割合は、それぞれ、０．２％および０．５％であった。これらの配列のう
ち、わずかに１つだけが真菌に特異的な配列と同定できた。他は、脊椎動物の配
列との相同性を有するか、またはコンピュータ上での比較の際にマスクされなか
った反復配列を含む真菌または原核生物の配列であった。

【０１１５】 また、５’ＥＳＴを、このような反復配列を有する５’ＥＳＴをマスクする６
０９３のＡｌｕ配列および１１１５のＬ１配列と比較した。ＴＨＥおよびＭＥＲ
反復、ＳＳＴＲ配列またはサテライト配列、マイクロサテライト配列またはテロ
メア反復を含む５’ＥＳＴも今後の考慮対象から除外した。平均では、ライブラ
リーの配列の１１．５％が反復配列を有した。この１１．５％のうち、７％がＡ
ｌｕ反復を含有し、３．３％がＬ１反復を含有し、残り１．２％がスクリーニン
グを行った他の反復配列に由来するものであった。これらの割合は、他のグルー
プが調製したｃＤＮＡライブラリー中で見いだされるものと一致する。例えば、
アダムス（Ａｄａｍｓ）らのｃＤＮＡライブラリーは、ｃＤＮＡライブラリーを
調製するために使用したＲＮＡ源に依存して、０％〜７．４％のＡｌｕ反復を含
有した（アダムス（Ａｄａｍｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ３７７：１７４，１９９６）
。

【０１１６】 不要な配列を除外した後に残った５’ＥＳＴの配列を周知のヒトｍＲＮＡの配
列と比較して、上記の配列決定手順の精度を求めた。

【０１１７】実施例１９ 既知の配列との比較による配列決定精度の測定 上述の配列決定手順の精度をさらに決定するために、既知の配列から誘導され
た５'ＥＳＴの配列を同定し、元の既知の配列と比較した。最初に、公的なヒト ｍＲＮＡデータベースの収録事項と一致するものを同定するために、両末端にあ
る５塩基対より短い突出部を用いたＦＡＳＴＡ分析を５'ＥＳＴに実施した。次 いで、既知のヒトｍＲＮＡと一致した６６５５の５'ＥＳＴを、起源を同じくす るｍＲＮＡと再度アライメントをとり、ダイナミックプログラミングを使用して
、認識されるであろう「エラー」のリストに置換、挿入および欠失を含めた。擬
似クローニング部位が配列決定精度の分析に含まれることを避けるために、５' ＥＳＴ配列の最後の１０塩基に発生するエラーを無視した。

【０１１８】 この分析で、ＮｅｔＧｅｎｅ^TMデータベースに収録された配列の精度は、９９
．５％を超えることが明らかになった。 対応するｍＲＮＡの５'末端を含むｃＤＮＡを上記選択手順で選択する効率を 決定するために、次の分析を実施した。

【０１１９】実施例２０ ５'ＥＳＴ選択効率の決定 上記選択手順で、ｍＲＮＡの５'末端付近の配列を含む５'ＥＳＴを、それらの
起源であるｍＲＮＡから単離した際の効率を決定するために、延長因子１サブユ
ニットα遺伝子およびフェリチン重鎖遺伝子に由来する５'ＥＳＴの末端の配列 を、これらの遺伝子の既知のｃＤＮＡ配列と比較した。両遺伝子の転写開始部位
は十分に特性決定されているため、それらを使用して、真の転写開始部位を含む
誘導５'ＥＳＴのパーセンテージを決定することが可能である。

【０１２０】 両遺伝子とも、得られた５'ＥＳＴの９５％より多くが、対応するｍＲＮＡの ５'末端付近の配列または５'末端より上流の配列を実際に含んでいた。

【０１２１】 ＮｅｔＧｅｎｅ^TMデータベースのＥＳＴから５'ＥＳＴを単離する手順の信頼 性分析を拡張するために、比較用にＧｅｎＢａｎｋデータベースリリース９７か
ら抽出されたヒトｍＲＮＡ配列を含むデータベースを使用して、同様の分析を実
施した。ＧｅｎｅＢａｎｋデータベースに収録されているｍＲＮＡ由来の５'Ｅ ＳＴは、その８５％より多くの５'末端が、既知の配列の５'末端付近に位置して
いた。ＧｅｎＢａｎｋデータベースで入手可能なｍＲＮＡ配列の一部は、ゲノム
配列から推定されるため、これらの配列と一致する５'末端は内部一致とみなさ れる。従って、ここで使用した方法では、対応するｍＲＮＡの真の５'末端を含 むＥＳＴの収率が過少評価される。

【０１２２】 上で作製したＥＳＴライブラリーは、同一ｍＲＮＡに由来する複数の５'ＥＳ Ｔを含んでいた。このような５'ＥＳＴの配列を互いに比較し、各ｍＲＮＡにつ いて最も長い５'ＥＳＴを同定した。重複ｃＤＮＡを集めて連続配列（コンティ グ）を作製した。次いで、このようにして得られた連続配列を公的データベース
と比較して、下記の実施例２１に記載の通りに、既知の配列との類似性を判定し
た。

【０１２３】実施例２１ ５'ＥＳＴのクラスター化およびｃＤＮＡライブラリーに関する新規性指数の算 出 配列決定された各ＥＳＴライブラリーについて、その配列を、５'末端により クラスター化した。ＢＬＡＳＴＮ２（直接鎖、パラメータＳ＝１０７）を使用し
て、ライブラリーの各配列をそれ以外の配列と比較した。９５％同一な塩基を有
し、且つ各ＥＳＴ５'末端から１０塩基対以内より開始する、少なくとも２５塩 基対長のハイスコアセグメントペア（Ｈｉｇｈ Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｓｅｇｍｅｎ
ｔ Ｐａｉｒ；ＨＳＰ）を含むＥＳＴを分類した。クラスターに存在する最長配
列を、群の代表として使用した。次いで、スーパーコンティグの定義につながる
、ライブラリー間の包括的クラスター化を実施した。

【０１２４】 ＥＳＴライブラリー中の新規配列の収率を評価するために、新規率（ｎｏｖｅ
ｌｔｙ ｒａｔｅ；ＮＲ）を次の通りに定義した：ＮＲ＝１００×（ライブラリ
ー内で確認された新しいユニーク配列数／ライブラリーの配列総数）。一般に、
新規率は、ＥＳＴライブラリーを入手した組織によって、１０％から４１％の間
であった。ライブラリーの大部分について、新規率が２０％に達するまで、５' ＥＳＴライブラリーのランダム配列決定を続行した。

【０１２５】 上述の特性決定に続いて、下記の実施例２２に記載の通りに、潜在的シグナル
配列を担持する５'ＥＳＴを同定するために、ＮｅｔＧｅｎｅ^TMにおける５'ＥＳ
Ｔのコレクションをスクリーニングした。

【０１２６】実施例２２ ５'ＥＳＴにおける潜在的シグナル配列の同定 ＡＴＧコドンで開始してＥＳＴの末端まで伸びる４５ヌクレオチドより長い連
続オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有するものを同定するために、Ｎ
ｅｔＧｅｎｅ^TMデータベースの５'ＥＳＴをスクリーニングした。ＮｅｔＧｅｎ ｅ^TMのｃＤＮＡ配列の約半分が、このようなＯＲＦを含んでいた。次いで、潜在
的シグナルモチーフを同定するために、Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ， Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：４６８３−４６９０， １９８６（参照によ
り、その開示内容を本明細書に援用する）に開示されている手順に一部修正を加
えたものを使用して、これらの５'ＥＳＴのＯＲＦを検索した。Ｖｏｎ Ｈｅｉ ｊｎｅシグナルペプチド同定行列で少なくとも３．５のスコアを有する、少なく
とも１５アミノ酸長の領域をコードしている５'ＥＳＴ配列を、シグナル配列を 有すると考えた。既知のヒトｍＲＮＡまたはＥＳＴ配列と一致し、且つ既知の５
'末端より下流の、２０ヌクレオチドを超える５'末端を有する５'ＥＳＴを今後 の分析から除外した。シグナル配列を有する残りのｃＤＮＡを、ＳｉｇｎａｌＴ
ａｇ^TMと呼ばれるデータベースに収録した。 シグナル配列を同定するための上記方法の精度を確認するために、実施例２３
の分析を実施した。

【０１２７】実施例２３ ５'ＥＳＴにおける潜在的シグナル配列の同定精度の確認 全てのヒトＳｗｉｓｓＰｒｏｔタンパク質のＮ末端に位置する４３のアミノ酸
に本方法を適用することによって、シグナルペプチドをコードしているシグナル
配列を同定するための上記手順の精度を評価した。各タンパク質のコンピュータ
処理したＶｏｎ Ｈｅｉｊｎｅスコアを、分泌タンパク質または非分泌タンパク
質であるとして、既知のタンパク質の特性決定と比較した。この方法で、３．５
より高いスコアを有する（偽陽性）非分泌タンパク質数および３．５より低いス
コアを有する（偽陰性）分泌タンパク質数を算出することができた。

【０１２８】 上述の分析結果を使用して、ｍＲＮＡの５'領域によりコードされるペプチド が、実際に、そのＶｏｎ Ｈｅｉｊｎｅスコアに基づいた真のシグナルペプチド
である確率を、ヒトタンパク質の１０％が分泌されるという仮説またはヒトタン
パク質の２０％が分泌されるという仮説のいずれかに基づいて算出した。この分
析結果を、図２および表ＩＶに示す。

【０１２９】 上述の分泌タンパク質同定方法を使用して、分泌されることが判明している以
下のポリペプチドの５'ＥＳＴを獲得した：ヒト・グルカゴン、γインターフェ ロン誘導性モノカイン前駆体、分泌されたシクロフィリン様タンパク質、ヒト・
プレイオトロフィン（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｎ）、およびヒト・ビオチニダーゼ
前駆体。従って、上述の方法は、シグナルペプチドをコードする５'ＥＳＴを首 尾よく同定した。

【０１３０】 ５'ＥＳＴによりコードされるシグナルペプチドが、シグナルペプチドとして 実際に機能することを確認するために、５'ＥＳＴ由来のシグナル配列を、シグ ナルペプチドの同定用に設計されたベクターにクローニングすることが可能であ
る。このようなベクターは、機能し得る形で連結されたシグナル配列を有するベ
クターを含有する宿主細胞のみに、選択培地で増殖する能力を与えるように設計
されている。たとえば、５'ＥＳＴが真のシグナルペプチドをコードすることを 確認するためには、５'ＥＳＴのシグナル配列を、米国特許第５，５３６，６３ ７号（その開示内容を参照により本明細書に援用する）に記載されているような
シグナルペプチド選択ベクター中の非分泌型酵母インベルターゼ遺伝子の上流へ
読取り枠が合うように挿入すればよい。正確に挿入された５'ＥＳＴシグナル配 列を含むシグナル配列選択ベクターを含有する宿主細胞が増殖することによって
、５'ＥＳＴが真のシグナルペプチドをコードすることが確認される。

【０１３１】 あるいは、シグナルペプチドの存在は、ＥＳＴを用いて得られる伸長ｃＤＮＡ
をｐＸＴ１のような発現ベクター（以下の実施例３０に記載）へクローニングす
るか、シグナルペプチドとアッセイ可能なリポータータンパク質との間に融合タ
ンパク質をコードするプロモーター-シグナル配列-レポーター遺伝子ベクターを
構築することによって確認することが可能である。適当な宿主細胞（たとえば、
ＣＯＳ細胞やＮＩＨ ３Ｔ３細胞）にこれらのベクターを導入した後、増殖培地
を回収して、分泌されたタンパク質の有無について分析することが可能である。
これらの細胞から得られる培地を、シグナル配列または伸長ｃＤＮＡインサート
が欠如しているベクターを含有する対照細胞から得られる培地と比較して、機能
的シグナルペプチドまたは真の分泌タンパク質をコードするベクターを同定する
。

【０１３２】 上記実施例２２の方法で決定したシグナルペプチドをコードする５'ＥＳＴを 、以下の実施例２４に記載の既知の配列との相同性に基づいて、さらに４つのカ
テゴリーに分類した。

【０１３３】実施例２４ シグナルペプチドをコードする５'ＥＳＴの分類 既知の脊椎動物配列のいずれとも、公式に入手できるＥＳＴ配列のいずれとも
一致しない配列を有する５'ＥＳＴを、「新規」と呼ぶ。ＳｉｇｎａｌＴａｇ^TM データベースの配列のうち、Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅスコアが少なくとも３．５で
ある９４７の５'ＥＳＴがこのカテゴリーに入った。

【０１３４】 脊椎動物配列のいずれとも一致しないが、既知のＥＳＴ配列を５'方向に少な くとも４０ヌクレオチド伸長すれば公式に知られているＥＳＴと一致する配列を
有する５'ＥＳＴを、「ＥＳＴ−ｅｘｔ」と呼ぶ。ＳｉｇｎａｌＴａｇ^TMデータ ベースの配列のうち、Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅスコアが少なくとも３．５である１
５０の５'ＥＳＴがこのカテゴリーに入った。

【０１３５】 脊椎動物配列のいずれとも一致しないが、既知のＥＳＴを５'方向に少なくと も４０ヌクレオチド伸長しなくても公式に知られているＥＳＴと一致する配列を
有する５'ＥＳＴを「ＥＳＴ」と呼ぶ。ＳｉｇｎａｌＴａｇ^TMデータベースの配 列のうち、Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅスコアが少なくとも３．５である５９９の５' ＥＳＴがこのカテゴリーに入った。

【０１３６】 ヒトｍＲＮＡ配列と一致するが、既知の配列を５'方向に少なくとも４０ヌク レオチド伸長させた５'ＥＳＴを「ＶＥＲＴ−ｅｘｔ」と呼ぶ。ＳｉｇｎａｌＴ ａｇ^TMデータベースの配列のうち、Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅスコアが少なくとも３
．５である２３の５'ＥＳＴがこのカテゴリーに入った。このカテゴリーに含ま れるのは、ヒト・トランスロカーゼｍＲＮＡの既知の配列を５'方向に２００塩 基以上伸長させた５'ＥＳＴであった。ヒト腫瘍抑制遺伝子の配列を５'方向に伸
長させた５'ＥＳＴも同定された。 表Ｖに、各カテゴリーにおける５'ＥＳＴの分布および各カテゴリーにおける 所定の最小Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅスコアを有する５'ＥＳＴ数を示す。

【０１３７】３．５'ＥＳＴまたは伸長ｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡの空間的および時間的発 現の評価 以下の実施例２５に記載の通り、５'ＥＳＴの各々を、その対応するｍＲＮＡ を採取した組織に基づいて同様に分類した。

【０１３８】実施例２５ 発現パターンの分類 表VIは、上記各カテゴリーにおける５'ＥＳＴの分布を、対応するｍＲＮＡの ５'ＥＳＴを採取した組織ごとに示す図である。

【０１３９】 表IIには、前立腺に由来する５'ＥＳＴ配列の配列同定数、これらの配列が入 るカテゴリー、およびこれらにコードされているシグナルペプチドのｖｏｎ Ｈ
ｅｉｊｎｅスコアを示す。添付の配列表には、５'ＥＳＴ配列およびこれにコー ドされているアミノ酸配列を示す。表IIIには、５'ＥＳＴの配列番号およびこれ
にコードされているシグナルペプチドの配列を示す。本明細書に添付の配列表に
は、５'ＥＳＴ配列およびこれにコードされているポリペプチドの配列を示す。

【０１４０】 ＤＮＡ配列番号３８〜３１５の配列は、含まれるエラーについて容易にスクリ
ーニングできるため、このようなエラーまたは曖昧性（ａｍｂｉｇｕｉｔｙ）を
両鎖上に含む断片の配列決定をしなおすことによって、配列の曖昧性を解消する
ことができる。このような断片は、本発明者の研究所に保存されているプラスミ
ドから得ることができ、あるいは、本明細書に記載の技術を使用して単離するこ
とができる。このような曖昧性またはエラーの解消は、曖昧な配列またはエラー
を含む配列の近くに位置する配列にハイブリダイズするプライマーを使用するこ
とによって促進される。たとえば、プライマーは、曖昧性またはエラーから５０
〜７５塩基以内の配列にハイブリダイズすればよい。エラーまたは曖昧性が解消
すれば、エラーまたは曖昧性を含むＤＮＡによりコードされるタンパク質配列中
で、対応する訂正を行うことができる。

【０１４１】 ５'ＥＳＴを、それらの起源である組織について分類するほかにも、以下の実 施例２６に記載の通りに、５'ＥＳＴに対応するｍＲＮＡの空間的発現パターン および時間的発現パターンならびに発現レベルを決定することが可能である。以
下でさらに詳細に検討を加えるが、これらのｍＲＮの空間的発現パターン、時間
的発現パターンおよび発現レベルを特性決定することは、所望の空間的方式また
は時間的方式で、所望のレベルの遺伝子産物を産生することができる発現ベクタ
ーの構築に有用である。

【０１４２】 さらに、対応するｍＲＮＡが疾患状態に関与する５'ＥＳＴも同定することが可 能である。たとえば、ある特定の疾患は、５'ＥＳＴに対応するｍＲＮＡの発現 の欠如、過剰発現、または過少発現に起因すると考えられる。健常者から採取し
たサンプルにおけるｍＲＮＡの発現パターンと量を、ある特定の疾患に罹患した
個体のものと比較することによって、その疾患の原因である５'ＥＳＴを同定す ることが可能である。

【０１４３】 上述の５'ＥＳＴに関する特性決定手順の結果が、５'ＥＳＴに隣接する配列を
含む伸長ｃＤＮＡ（下記の通りに得られる）にもあてはまることは明らかであろ
う。また、必要に応じて、ＥＳＴ自体を特性決定するよりむしろ、伸長ｃＤＮＡ
が得られるまで特性決定を遅らせてもよいことも明らかであろう。

【０１４４】実施例２６ ５'ＥＳＴまたは伸長ｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡの発現レベルおよび発現パタ ーンの評価 国際特許出願第ＷＯ ９７／０５２７７号（その全内容を参照により本明細書 に援用する）に記載の長いプローブを用いた溶液ハイブリダイゼーションで、５
'ＥＳＴまたは伸長ｃＤＮＡ（以下の実施例２７に記載の通りに得られる）に対 応するｍＲＮＡの発現レベルおよび発現パターンを分析することが可能である。
簡単に記述すると、特性決定すべきｍＲＮＡをコードしている遺伝子に対応する
、５'ＥＳＴ、伸長ｃＤＮＡ、またはその断片を、バクテリオファージ（Ｔ３、 Ｔ７またはＳＰ６）ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのすぐ下流のクローニング
部位に挿入して、アンチセンスＲＮＡを作製する。５'ＥＳＴまたは伸長ｃＤＮ Ａは、１００以上のクレオチドを有することが好ましい。プラスミドを線状にし
、修飾リボヌクレオチド（すなわち、ビオチン−ＵＴＰおよびＤＩＧ−ＵＴＰ）
を含むリボヌクレオチドの存在下で転写する。この二重に標識した過剰のＲＮＡ
を、溶液中で、目的の細胞または組織から単離したｍＲＮＡとハイブリダイズさ
せる。標準的なストリンジェント条件下で（８０％ホルムアルデヒド、０．４Ｍ
ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７〜８）中、４０〜５０℃で１６時間）、ハイブリダイ
ゼーションを行う。一本鎖ＲＮＡに特異的なリボヌクレアーゼ（すなわち、ＲＮ
ａｓｅ ＣＬ３、Ｔ１、ＰｈｙＭ、Ｕ２またはＡ）で消化することによって、ハ
イブリダイズしていないプローブを除去する。ビオチン−ＵＴＰ修飾が存在すれ
ば、ストレプトアビジンを被覆したマイクロタイタープレート上にハイブリッド
を捕捉することが可能になる。ＤＩＧ修飾が存在すれば、アルカリホスファター
ゼに結合させた抗ＤＩＧ抗体を使用するＥＬＩＳＡによって、ハイブリッドを検
出および定量することが可能になる。

【０１４５】 英国特許出願第２ ３０５ ２４１Ａ（その全内容を参照により本明細書に援用
する）に開示されている通りに、５'ＥＳＴ、伸長ｃＤＮＡ、またはそれらの断 片に、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）用のヌクレオチド配列をタグ付けする
こともできる。この方法で、細胞、組織、生物、または遺伝子発現パターンを決
定しなければならない核酸の他の起源から、ｃＤＮＡを調製する。このようにし
て得られたｃＤＮＡを２つのプールに分ける。各プール中のｃＤＮＡを、大部分
のｃＤＮＡに少なくとも一つ存在すると思われる認識部位を有する第１の制限エ
ンドヌクレアーゼ（アンカリング酵素と呼ばれる）で切断する。切断されたｃＤ
ＮＡの５'または３'領域を最も多く含む断片を、ストレプトアビジン被覆ビーズ
のような捕捉媒体に結合させることによって単離する。増幅プライマーをハイブ
リダイズさせるための第１配列と、いわゆるタグ付きエンドヌクレアーゼに対す
る内部制限部位とを有する第１のオリゴヌクレオチドリンカーを、第１のプール
中の消化ｃＤＮＡに連結する。第２のエンドヌクレアーゼで消化して、ｃＤＮＡ
から短いタグ付き断片を生成する。

【０１４６】 増幅プライマーをハイブリダイズさせるための第２の配列と内部制限部位とを有
する第２のオリゴヌクレオチドを、第２のプール中の消化ｃＤＮＡに連結する。
第２のプールのｃＤＮＡ断片も、タグ付きエンドヌクレアーゼで消化して、第２
のプールのｃＤＮＡに由来する短いタグ断片を生成する。アンカリング酵素およ
びタグ付きエンドヌクレアーゼを用いた、第１のプールおよび第２のプールの消
化によって生じたタグを互いに連結して、いわゆるジタグ（ｄｉｔａｇ）を生成
する。一部の実施態様では、ジタグをコンカテマー化して、ジタグを２〜２００
含有する連結反応産物を生成する。次いで、タグ配列を決定し、５'ＥＳＴまた は伸長ｃＤＮＡの配列と比較して、細胞、組織、生物、またはタグが由来する核
酸の他の起源に、どの５'ＥＳＴまたは伸長ｃＤＮＡが発現されるかを決定する 。この方法で、細胞、組織、生物、または核酸の他の起源における５'ＥＳＴま たは伸長ｃＤＮＡの発現パターンが得られる。

【０１４７】 アレイを使用して、遺伝子発現の定量分析を実施することも可能である。本明
細書で使用する用語「アレイ」は、全長ｃＤＮＡ（すなわち、シグナルペプチド
のコード配列、成熟タンパク質のコード配列、および停止コドンを含む伸長ｃＤ
ＮＡ）、伸長ｃＤＮＡ、５'ＥＳＴ、または遺伝子発現の特異的検出ができるほ ど十分に長いそれらの断片の、一次元、二次元、または多次元の配列（ａｒｒａ
ｎｇｅｍｅｎｔ）を意味する。断片は、長さが少なくとも１５ヌクレオチドであ
ることが好ましい。さらに好ましくは、断片は、長さが少なくとも１００ヌクレ
オチドである。さらに好ましくは、断片は長さが１００ヌクレオチドを超える。
一部の実施態様では、断片は長さが５００ヌクレオチドを超えることもある。

【０１４８】 たとえば、Ｓｃｈｅｎａら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４６７−４７０， １
９９５； Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９
３：１０６１４−１０６１９， １９９６）により記載されている通り、下記の
全長ｃＤＮＡ、伸長ｃＤＮＡ、５'ＥＳＴ、または相補的ＤＮＡマイクロアレイ 中のそれらの断片を用いて、遺伝子発現の定量分析を実施することが可能である
。全長ｃＤＮＡ、伸長ｃＤＮＡ、５'ＥＳＴまたはそれらの断片をＰＣＲで増幅 し、高速ロボット工学を使用して、９６ウェルマイクロタイタープレートからシ
リル処理した顕微鏡スライド上に配列させた。プリントされたアレイを湿潤チャ
ンバ内でインキュベートしてアレイエレメントに再度水分を加え、０．２％ＳＤ
Ｓ中で１分間１回、水中で１分間２回および水素化ホウ素ナトリウム溶液中で５
分間１回すすぐ。このアレイを９５℃の湯に２分間沈め、０．２％ＳＤＳに１分
間移し、水で２回すすぎ、風乾し、２５℃の暗所に保存する。

【０１４９】 細胞または組織ｍＲＮＡを単離するか購入し、１ラウンドの逆転写によってプ
ローブを調製する。プローブを、１ｃｍ²のマイクロアレイに、１４×１４ｍｍ のカバーガラス下、６０℃で６〜１２時間ハイブリダイズさせる。アレイを、低
ストリンジェンシー洗浄用緩衝液（１×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ）中、２５℃で
５分間、次いで、高ストリンジェンシー洗浄用緩衝液（０．１×ＳＳＣ／０．２
％ＳＤＳ）中、室温で１０分間洗浄する。特注のフィルターセットを取り付けた
蛍光レーザー走査装置を使用して、０．１×ＳＳＣ中でアレイを走査する。２つ
の独立したハイブリダイゼーションの比率の平均をとることにより、正確な示差
的発現の測定値が得られる。

【０１５０】 Ｐｉｅｔｕら（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：４９２−５０３， １
９９６）により記載されている通り、全長ｃＤＮＡ、伸長ｃＤＮＡ、５'ＥＳＴ 、または相補的ＤＮＡアレイ中のそれらの断片を用いて、遺伝子の発現の定量分
析を実施することも可能である。全長ｃＤＮＡ、伸長ｃＤＮＡ、５'ＥＳＴまた はそれらの断片をＰＣＲ増幅し、膜上にスポットする。次いで、様々な組織また
は細胞に由来するｍＲＮＡを放射性ヌクレオチドで標識する。制御条件でハイブ
リダイズさせて洗浄した後、ハイブリダイズしたｍＲＮＡを、ホスホ-イメージ ングまたはオートラジオグラフィで検出する。実験を２回実施し、次いで、示差
的に発現したｍＲＮＡの定量分析を実施する。

【０１５１】 あるいは、Ｌｏｃｋｈａｒｔら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
１４： １６７５−１６８０， １９９６）およびＳｏｓｎｏｗｓｋｙら（Ｐ
ｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９４：１１１９−１１２３，
１９９７）により記載されている通り、高密度ヌクレオチドアレイによって、５
'ＥＳＴまたは伸長ｃＤＮＡの発現分析を行うことができる。５'ＥＳＴまたは伸
長ｃＤＮＡの配列に対応する１５〜５０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドをチ
ップ上に直接合成する（Ｌｏｃｋｈａｒｔら、前掲）か、合成してからチップに
処理する（Ｓｏｓｎｏｗｓｋｙら、前掲）。オリゴヌクレオチドは、長さ約２０
ヌクレオチドが好ましい。

【０１５２】 ビオチン、ジゴキシゲニンまたは蛍光染料のような適当な化合物で標識したｃ
ＤＮＡプローブを、適当なｍＲＮＡ集団から合成し、次いで、５０〜１００ヌク
レオチドの平均サイズまで無作為に断片化する。次いで、前述のプローブをチッ
プにハイブリダイズさせる。Ｌｏｃｋｈａｒｔら（前掲）に記載されている通り
に洗浄し、異なる電場を印加（Ｓｏｎｏｗｓｋｙら、前掲）した後、染料または
標識化合物を検出し、定量する。ハイブリダイゼーションを２回実施する。異な
るｃＤＮＡサンプル中の同一標的オリゴヌクレオチド上のｃＤＮＡプローブに由
来するシグナルの強度を比較分析することで、オリゴヌクレオチド配列が設計さ
れるもととなった５'ＥＳＴまたは伸長ｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡの示差的発 現がわかる。

【０１５３】III．伸長ｃＤＮＡのクローニングおよび対応するゲノムｃＤＮＡのクローニン グのための５' ＥＳＴの使用 上述の手順を使用して、いったん、対応するｍＲＮＡの５'末端を含む５' Ｅ
ＳＴを選択するとその後は、それらを使用して、５' ＥＳＴに隣接する配列を 含む伸長ｃＤＮＡを単離することができる。この伸長ｃＤＮＡは、真の翻訳開始
部位、シグナル配列、およびシグナルペプチドの切断後に残る成熟タンパク質を
コードしている配列を含め、対応するｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の
全コード配列を含有してもよい。このような伸長ｃＤＮＡを、本明細書で「全長
ｃＤＮＡ」と呼ぶ。あるいは、伸長ｃＤＮＡは、シグナルペプチドの切断後に残
る成熟タンパク質をコードしている配列のみを含んでもよく、シグナルペプチド
をコードしている配列のみを含んでもよい。

【０１５４】 以下の実施例２７に、５' ＥＳＴを使用して伸長ｃＤＮＡを得るための一般 的な方法を説明する。以下の実施例２８は、数種の分泌タンパク質に関する全コ
ード配列および対応するｍＲＮＡの真の５'末端を含む数種の伸長ｃＤＮＡにつ いて説明した、実施例２７で説明されている方法を使用した実験結果を提供する
。

【０１５５】 実施例２７、２８、および２９の方法を使用して、５' ＥＳＴに対応する遺 伝子によりコードされる分泌タンパク質の全コード配列より少ない配列をコード
する伸長ｃＤＮＡを得ることができる。一部の実施態様では、これらの方法を使
用して単離される伸長ｃＤＮＡは、配列番号３８〜３１５の配列によってコード
されるタンパク質類のうち１タンパク質の少なくとも１０アミノ酸をコードする
。さらなる実施態様では、伸長ｃＤＮＡは、配列番号３８〜３１５の配列により
コードされるタンパク質の少なくとも２０アミノ酸をコードする。さらなる実施
態様では、その伸長ｃＤＮＡは、配列番号３８〜３１５の配列の少なくとも３０
アミノ酸をコードする。好ましい実施態様では、伸長ｃＤＮＡは、配列番号３８
〜３１５のタンパク質コード配列を含む、全長タンパク質配列をコードする。

【０１５６】実施例２７ 全コード領域および対応するｍＲＮＡの真の５'末端を含むｃＤＮＡのクローニ ングおよび配列決定に５' ＥＳＴを使用するための一般的な方法 対応するｍＲＮＡの真の５'末端ならびに全タンパク質コード配列を有し、且 つ伸長ｃＤＮＡの取得に使用される５'ＥＳＴの配列に隣接した配列を含む、伸 長ｃＤＮＡを迅速且つ効率よく単離するのに、下記の一般的な方法が使用されて
きた。この方法は、分泌タンパク質に属するポリペプチドをコードしている５'
ＥＳＴを含め、ＮｅｔＧｅｎｅ^TMデータベース中の任意の５' ＥＳＴに関する
伸長ｃＤＮＡを取得するのに使用することができる。、その方法を、図３にまと
める。

【０１５７】１．伸長ｃＤＮＡの取得 ａ）第１鎖合成 本方法は、ｍＲＮＡの既知の５'配列を利用する。mＲＮＡの３'末端に対応す るｃＤＮＡの末端に既知の配列を付加することが可能な５'末端に４９ヌクレオ チド配列を含有するポリ１４ｄＴプライマーを用いて、精製ｍＲＮＡに逆転写反
応を実施する。たとえば、そのプライマーは次の配列:５'−ＡＴＣ ＧＴＴ ＧＡ
Ｇ ＡＣＴ ＣＧＴ ＡＣＣ ＡＧＣ ＡＧＡ ＧＴＣ ＡＣＧ ＡＧＡ ＧＡＧ ＡＣＴ
ＡＣＡ ＣＧＧ ＴＡＣ ＴＧＧ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＶＮ −３' （配列番号１４）を有していてもよい。当業者は、その他の配列もポリｄＴ配列
に付加して、第１鎖合成を開始するために使用できることを理解するであろう。
このプライマーと、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ II（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）やＲＮ
ａｓｅ Ｈ Ｍｉｎｕｓ Ｍ−ＭＬＶ（Ｐｒｏｍｅｇａ）酵素のような逆転写酵
素とを使用して、ＲＮＡの３'ポリＡ部位に固定された逆転写物を生成する。

【０１５８】 第１ｃＤＮＡ鎖にハイブリダイズしたｍＲＮＡをアルカリ加水分解で除去した
後、アルカリ加水分解の生成物および残留ポリｄＴプライマーを、実施例１１で
説明した、ＡｃＡ３４（Ｂｉｏｓｅｐｒａ）マトリックスのような排除カラムで
除去する。

【０１５９】 ｂ）第２鎖合成 ５' ＥＳＴの既知の５'配列および第１鎖合成に使用したポリｄＴプライマー
によって付加された既知の３'末端に基づいて、各末端の一対のネステッド(ｎｅ
ｓｔｅｄ)プライマーを設計する。プライマーの設計に使用されるソフトウエア は、ＧＣ含有量およびオリゴヌクレオチド融解温度に基づくか（例えばＯＳＰソ
フトウエア；Ｉｌｌｉｅｒ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ， ＰＣＲ Ｍｅｔｈ． Ａｐ
ｐｌ． １：１２４−１２８， １９９１）、例えばＰＣ−Ｒａｒｅ（ｈｔｔｐ
：／／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｗｅｉｚｍａｎｎ．ａｃ．ｉｌ／ｓｏｆ
ｔｗａｒｅ／ＰＣ−Ｒａｒｅ／ｄｏｃ／ｍａｎｕｅｌ．ｈｔｍｌ）のようなオク
ターマー頻度相違法（Ｇｒｉｆｆａｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９： ３８８７−３８９１， １９９１）のいずれかに
基づく。

【０１６０】 ５'末端のネステッドプライマーは、互いに４〜９塩基離れていることが好ま しい。ＰＣＲで使用するのに適した融解温度および特異性を有するように、５' プライマー配列を選択することが可能である。

【０１６１】 ３'末端のネステッドプライマーは、互いに４〜９塩基離れていることが好ま しい。たとえば、ネステッド３'プライマーは、次の配列：（５'−ＣＣＡ ＧＣ Ａ ＧＡＧ ＴＣＡ ＣＧＡ ＧＡＧ ＡＧＡ ＣＴＡ ＣＡＣ ＧＧ −３'（配列番号
１５）、および５'−ＣＡＣ ＧＡＧ ＡＧＡ ＧＡＣ ＴＡＣ ＡＣＧ ＧＴＡ ＣＴ
Ｇ Ｇ −３'（配列番号１６）を有していてもよい。これらのプライマーは、そ れらをＰＣＲで使用するのに適した融解温度および特異性を有するため、選択し
た。しかし、当業者は、その他の配列もプライマーとして使用できることを十分
に理解するであろう。

【０１６２】 Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＴｔｈポリメラーゼＭｉｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）および
ネステッドプライマー対のそれぞれに由来する外側プライマーを使用して、第１
の２５サイクルのＰＣＲを実施した。次いで、第１のＰＣＲ産物の１／２５００
に対して、同じ酵素およびネステッドプライマー対のそれぞれに由来する内側プ
ライマーを使用した第２の２０サイクルのＰＣＲを実施する。その後、プライマ
ーおよびヌクレオチドを除去する。

【０１６３】２．全長伸長ｃＤＮＡまたはそのフラグメントの配列決定 ＯＳＰソフトウエアを使用したＰＣＲ用に適合する５'ネステッドプライマー のデザインに対する位置の制約がないため、２つのタイプのアンプリコンが得ら
れる。第２の５'プライマーは翻訳開始コドンの上流に位置し、従って、コード 配列全体を含むネステッドＰＣＲ産物が生成することが好ましい。このような全
長伸長ｃＤＮＡには、セクションａに記載の直接クローニング手順を実施する。
しかし、第２の５'プライマーが翻訳開始コドンの下流に位置し、その結果、Ｏ ＲＦの一部のみを含むＰＣＲ産物が生成する場合もある。このような不完全なＰ
ＣＲ産物を、セクションｂに記載の改良された手順に供する。

【０１６４】 ａ）完全なＯＲＦを含むネステッドＰＣＲ産物 結果として得られるネステッドＰＣＲ産物が、５' ＥＳＴ配列から予期され る完全なコード配列を含むとき、セクション３に記載の通り、そのＰＣＲ産物を
ｐＥＤ６ｄｐｃ２のような適当なベクターでクローニングする。

【０１６５】 ｂ）不完全なＯＲＦを含むネステッドＰＣＲ産物 アンプリコンが完全なコード配列を含まないとき、完全なコード配列と、全コ
ード配列を含むＰＣＲ産物の両者を得るための中間ステップが必要である。次の
セクションで説明する通り、異なるＰＣＲ産物から直接決定される数個の部分的
配列から、完全なコード配列を組み立てることができる。

【０１６６】 いったん、全コード配列が完全に決定されると、その後は、コード領域全部を
含むアンプリコンを得るために、ＰＣＲ用に適合する新しいプライマーを設計す
る。しかし、そのような場合、ＰＣＲ用に適合する３'プライマーは、対応する ｍＲＮＡの３'ＵＴＲの内側に位置し、従って、図６に図示する通り、この領域 の一部（すなわち、ポリＡ区域および時にはポリアデニル化シグナル）が欠如し
たアンプリコンが生成する。次いで、セクション３に記載の通り、このような全
長伸長ｃＤＮＡを適当なベクターにクローニングする。

【０１６７】 ｃ）伸長ｃＤＮＡの配列決定 Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから入手可能なＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラ
ーゼＦＳキットを用いたＤｉｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ法を使用して、伸長ｃＤ
ＮＡの配列決定を実施する。

【０１６８】 ＰＣＲフラグメントの配列を決定するために、プライマーを選択するためのＯ
ＳＰのようなソフトウエア、および３２ヌクレオチドの最小限の重複を使用した
最初の５'タグを含む歩行配列のコンティグ（ｃｏｎｔｉｇ）を構築するための ＡＳＭＧ（Ｓｕｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌ． １： ９−１９， １９９５）のような自動化コンピュータソ
フトウエアを使用して、プライマ−歩行を実施する。全長ｃＤＮＡの配列が得ら
れるまでプライマ−歩行を実施することが好ましい。

【０１６９】 所与の伸長ｃＤＮＡフラグメントの配列決定の完了を、下記の通りに査定する
。非クローニング生成物の場合には、ポリＡ区域の後に位置する配列を精確に決
定することが困難なため、事例ｂに記載の通りに得られた伸長ｃＤＮＡ中にポリ
Ａ区域が同定されたとき、ＰＣＲ産物に関する配列決定およびプライマ−歩行法
を中断する。配列の長さを、上記の通りに得られたネステッドＰＣＲ産物のサイ
ズと比較する。ゲル電気泳動法によるＰＣＲ産物サイズの決定の精度には限界が
あるため、得られた配列のサイズが第１のネステッドＰＣＲ産物のサイズの少な
くとも７０％であれば、配列は完全であると考えられる。コンピュータ分析で決
定された配列の長さがネステッドＰＣＲ産物の長さの少なくとも７０％でなけれ
ば、これらのＰＣＲ産物をクローニングして、挿入物の配列を決定する。ノーザ
ンブロットデータを入手できるとき、所与のＰＣＲ産物に関して検出されたｍＲ
ＮＡのサイズを使用して、配列が完全であることを最終的に査定する。上の基準
を満たさない配列を棄てて、新しい単離手順に供する。

【０１７０】 次いで、すべての伸長ｃＤＮＡ配列データを独自に開発したデータベースに転
送し、そこで、実施例1５に記載の通りに、品質管理ステプおよび検認ステップ を実施する。

【０１７１】３．全長伸長ｃＤＮＡのクローニング 次いで、全コード配列を含有するＰＣＲ産物を適当なベクターでクローニング
する。たとえば、下記の通りに、伸長ｃＤＮＡを発現ベクターｐＥＤ６ｄｐｃ２
（ＤｉｓｃｏｖｅｒＥａｓｅ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｃ
ａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）にクローニングすることができる。ＥｃｏＲＩ消化
を実施した後、充填反応（ｆｕｌｌ ｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行なうことに
よって、平滑末端を有するｐＥＤ６ｄｐｃ２ベクターＤＮＡを調製する。平滑末
端を有するベクターを脱リン酸化する。ＰＣＲプライマーを除去し、エタノール
沈殿した後、上述の通りに得られた全コード配列または伸長ｃＤＮＡを含むＰＣ
Ｒ産物をキナーゼでリン酸化し、続いて、フェノール−Ｓｅｖａｇ抽出および沈
殿によって除去する。次いで二本鎖伸長ｃＤＮＡをベクターに連結し、得られた
発現プラスミドを適当な宿主細胞に導入する。

【０１７２】 上述の通りに得られたＰＣＲ産物は、いずれの方向にもクローニングすること
ができる平滑末端を有する分子であるため、各ＰＣＲ産物について、幾つかのク
ローンの配向性を決定する。次いで、４〜１０個のクローンを微量滴定プレート
に並べ、クローニング部位付近のベクターに位置する第１のプライマーおよびｍ
ＲＮＡの３'末端に対応する伸長ｃＤＮＡの一部に位置する第２のプライマーを 使用したＰＣＲ反応に供する。この第２のプライマーは、直接クローニング（事
例ａ）の場合には、アンカード（ａｎｃｈｏｒｅｄ）ＰＣＲに使用されるアンチ
センスプライマーであってもよく、間接クローニング（事例ｂ）の場合には、３
'ＵＴＲの内側に位置するアンチセンスプライマーであってもよい。伸長ｃＤＮ Ａによりコードされるタンパク質が発現できるように伸長ｃＤＮＡの開始コドン
がベクターのプロモーターに機能しうる形で連結されているクローンを保存し、
配列決定する。ｃＤＮＡ挿入物の末端に加えて、ｃＤＮＡ挿入物の各側のベクタ
ーＤＮＡの約５０塩基対も配列決定する。

【０１７３】 次いで、前述の手順に従って、クローン化ＰＣＲ産物を完全に配列決定する。
この場合、未クローン化ＰＣＲ産物についてはプライマ−歩行中に既にコンティ
グ化（ｃｏｎｔｉｇａｔｅｄ）されている歩行配列を用いて、長いフラグメント
のコンティグ化を実施する。結果として得られるコンティグが全コード領域なら
びに両端にベクターＤＮＡを有する重複配列を含むとき、クローン化アンプリコ
ンの配列決定は完全である。

【０１７４】４．全長伸長ｃＤＮＡのコンピュータ分析 次いで、全ての全長伸長ｃＤＮＡの配列を、下記の通りに、さらに分析する。
伸長された全長ｃＤＮＡを目的の配列について検索する前に、実施例１８の５'
ＥＳＴに関する記述と本質的に類似した方法を使用して、目的物以外の伸長ｃ ＤＮＡ（ベクターＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ミトコン
ドリアＲＮＡ、原核ＲＮＡおよび菌類ＲＮＡ）を除去する。

【０１７５】 ａ）構造的特徴の同定 次に、全長伸長ｃＤＮＡの配列の構造上の特徴、たとえば、ポリＡテイルやポ
リアデニル化シグナルを下記の通りに決定する。 ポリＡテイルは、せいぜい１つの代替塩基を中に含む、Ａが少なくとも１１個
のホモポリマー延長部（ｓｔｒｅｔｃｈ）であると定義される。ポリＡテイル検
索は、配列の最後の１００ヌクレオチド（ｎｔ）に制限され、１１個連続したＡ
の延長部に限定されるが、それは、このようなポリＡ延長部の後は、しばしば配
列決定反応を読みとることができないためである。ＢＬＡＳＴ２Ｎを使用して、
８ヌクレオチド以上の９０％を超える相同性を有する延長部をポリＡテイルとし
て同定する。

【０１７６】 ポリアデニル化シグナルについて検索するために、全長配列からポリＡテイル
を切り取る。ポリＡテイルの前の５０塩基を、規定のポリアデニル化ＡＡＵＡＡ
Ａシグナルについて最初に検索し、規定のシグナルが検出されなければ、代わり
のＡＵＵＡＡＡシグナルを検索する（Sheets et al., Nuc. Acids Res. 18: 579
9-5805, 1990）。これらのコンセンサスポリアデニル化シグナルのどちらも見つ
からなければ、１つのミスマッチが可能な配列決定エラーの原因であることを明
らかにしながら、規定のモチーフを再度検索する。同定されたポリアデニル化シ
グナルは、いずれのタイプも、その８５％より多くが、ポリＡテイルから１０〜
３０塩基対で実際に終わっている。あるいは、ＡＵＵＡＡＡシグナルは、同定さ
れたポリアデニル化シグナルの総数の約1５％を表す。

【０１７７】 ｂ）機能的特徴の同定 次に、全長伸長ｃＤＮＡの配列の機能的特徴、たとえばＯＲＦやシグナル配列
を、下記の通りに決定した。 翻訳開始コドンで始まり、停止コドンで終わる最長フラグメントであると定義
されるＯＲＦについて、伸長ｃＤＮＡの上位ストランドフレーム３つを検索する
。少なくとも２０個のアミノ酸をコードしているＯＲＦが好ましい。

【０１７８】 次いで、実施例２２に記載の通り、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ （Ｎｕｃ．Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．１４：４６８３−４６９０， １９８６）（その開示内容を、参
照により本明細書に援用する）のマトリックス方法を使用して、最初のアミノ酸
５０個の中の、あるいは、しかるべき場合には、ＯＲＦのアミノ酸２０個以下ま
でのより短い領域内の、シグナルペプチドの有無について、確認された各ＯＲＦ
を走査する。

【０１７９】 ｃ）ヌクレオチド配列またはタンパク質配列のいずれかとの相同性 実施例２４の５' ＥＳＴに関する記述と本質的に同じ手順を使用して、全長 配列の分類を行うことが可能である。 続いて、サブクローニング、ＰＣＲ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏオリゴヌクレオ
チド合成のような従来の技術を使用して、上述の通りに調製された延長ｃＤＮＡ
を操作し、伸長ｃＤＮＡの所望の部分を含む核酸を得ることが可能である。たと
えば、当業者に周知の技術を使用して、全コード配列（すなわち、シグナルペプ
チドと、シグナルペプチドの切除後に残る成熟タンパク質とをコードしている配
列）のみを含む核酸を得ることができる。あるいは、従来の技術を使用して、シ
グナルペプチドの切除後に残る成熟タンパク質に関するコード配列のみを含む核
酸、またはシグナルペプチドに関するコード配列のみを含む核酸を得ることがで
きる。

【０１８０】 同様に、分泌タンパク質に関するコード配列の、任意の他の望ましい部分を含
む核酸を得ることも可能である。たとえば、核酸は、下記の伸長ｃＤＮＡの１つ
のような伸長ｃＤＮＡの少なくとも１０個の連続した塩基を含んでもよい。別の
実施態様では、核酸は、下記の伸長ｃＤＮＡの１つのような伸長ｃＤＮＡの少な
くとも１５個連続した塩基を含んでもよい。あるいは、核酸は、下記の伸長ｃＤ
ＮＡの１つのような伸長ｃＤＮＡの少なくとも２０個連続した塩基を含んでもよ
い。別の実施態様では、核酸は、下記の伸長ｃＤＮＡの１つのような伸長ｃＤＮ
Ａの少なくとも２５個連続した塩基を含んでもよい。さらに別の実施態様では、
核酸は、下記の伸長ｃＤＮＡの１つのような伸長ｃＤＮＡの少なくとも４０個連
続した塩基を含んでもよい。

【０１８１】 いったん、伸長ｃＤＮＡが得られると配列を決定し、ｃＤＮＡがコードするア
ミノ酸配列を決定する。いったん、コードされたアミノ酸配列が決定されると、
遺伝子コードの縮重を使用するだけで、そのタンパク質をコードする、多くの考
え得るｃＤＮＡを創って同定することができる。たとえば、下記の通りに、対立
遺伝子の変異体または他の相同核酸を同定することができる。あるいは、所望の
アミノ酸配列をコードしている核酸を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成することができ
る。

【０１８２】 好ましい実施態様で、ｃＤＮＡが発現されるべき宿主生物に関する既知のコド
ンまたはコドン対優位を使用して、コード配列を選択することが可能である。 以下の実施例２８に記載の通りに、本発明の５' ＥＳＴSに由来する伸長ｃＤ
ＮＡを取得した。

【０１８３】実施例２８ ５' ＥＳＴを使用して得られたクローン化伸長ｃＤＮＡの特徴づけ 上の実施例２７に記載の手順を使用して、本発明の５' ＥＳＴから誘導され る伸長ｃＤＮＡを、様々な組織で得た。このようにして得られた若干の伸長ｃＤ
ＮＡの具体例を、下記のリストに示す。

【０１８４】 このアプローチを使用して、配列番号１７（内部ＩＤ番号４８−１９−３−Ｇ
１−ＦＬ１）の全長ｃＤＮＡを取得した。このｃＤＮＡは、上述の「ＥＳＴ-ｅ ｘｔ」カテゴリーに入り、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅスコアが８．２のシグナルペプ
チドＭＫＫＶＬＬＬＩＴＡＩＬＡＶＡＶＧ（配列番号１８）をコードする。

【０１８５】 この手順を使用して、配列番号１９（内部ＩＤ番号５８−３４−２−Ｅ７−Ｆ
Ｌ２）の全長ｃＤＮＡも取得した。このｃＤＮＡは、上述の「ＥＳＴ-ｅｘｔ」 カテゴリーに入り、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅスコアが５．５のシグナルペプチドＭ
ＷＷＦＱＱＧＬＳＦＬＰＳＡＬＶＩＷＴＳＡ（配列番号２０）をコードする。

【０１８６】 上述の手順を使用して得られた別の全長ｃＤＮＡは、配列番号２１（内部ＩＤ
番号５１−２７−１−Ｅ８−ＦＬ１）の配列を有する。このｃＤＮＡは、上述の
「ＥＳＴ-ｅｘｔ」カテゴリーに入り、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅスコアが５．９の シグナルペプチドＭＶＬＴＴＬＰＳＡＮＳＡＮＳＰＶＮＭＰＴＴＧＰＮＳＬＳＹ
ＡＳＳＡＬＳＰＣＬＴ（配列番号２２）をコードする。

【０１８７】 上述の手順を使用して、配列番号２３（内部ＩＤ番号７６−４−１−Ｇ５−Ｆ
Ｌ１）の配列を有する全長ｃＤＮＡも取得した。このｃＤＮＡは、上述の「ＥＳ
Ｔ-ｅｘｔ」カテゴリーに入り、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅスコアが５．５のシグナ ルペプチドＩＬＳＴＶＴＡＬＴＦＡＸＡ（配列番号２４）をコードする。

【０１８８】 この手順を使用して、配列番号２５（内部ＩＤ番号５１−３−３−Ｂ１０−Ｆ
Ｌ３）の全長ｃＤＮＡも取得した。このｃＤＮＡは、上述の「新」カテゴリーに
入り、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅスコアが１０．１のシグナルペプチドＬＶＬＴＬＣ
ＴＬＰＬＡＶＡ（配列番号２６）をコードする。

【０１８９】 この手順を使用して、配列番号２７（内部ＩＤ番号５８−３５−２−Ｆ１０−
ＦＬ２）の全長ｃＤＮＡも取得した。このｃＤＮＡは、上述の「新」カテゴリー
に入り、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅスコアが１０．７のシグナルペプチドＬＷＬＬＦ
ＦＬＶＴＡＩＨＡ（配列番号２８）をコードする。

【０１９０】 現在、上述の全長ｃＤＮＡを含有するプラスミドを含有するバクテリアクロー
ンは、上記内部ＩＤ番号で、本発明者の研究所に保存されている。適当な培地中
で適当なバクテリアクローンのアリコートを増殖させることによって、保存物質
から挿入物を回収することが可能である。次いで、アルカリ溶解ミニプレップや
大規模アルカリ溶解プラスミド単離手順のような、当業者に周知のプラスミド単
離手順を使用して、プラスミドＤＮＡを単離することができる。必要に応じて、
塩化セシウム勾配を用いた遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィ、または陰イ
オン交換クロマトグラフィによって、プラスミドＤＮＡをさらに豊富にすること
が可能である。次いで、こうした手順を使用して取得したプラスミドＤＮＡを、
当業者に周知の標準的なクローニング技術を使用して操作することが可能である
。あるいは、ｃＤＮＡ挿入物の両端で設計されたプライマーを用いて、ＰＣＲを
実施することが可能である。次いで、当業者に周知のクローニング技術を使用し
て、ｃＤＮＡに対応するＰＣＲ産物を操作することができる。

【０１９１】 伸長ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドを、既知の構造モチーフまたは
機能的モチーフの存在について、またはタンパク質ファミリーの構成員の中に十
分に保存されている小さいアミノ酸配列であるシグネチャー（ｓｉｇｎａｔｕｒ
ｅｓ）の存在について、スクリーニングすることが可能である。保存された領域
は、PROSITEデータバンク、特にファイルｐｒｏｓｉｔｅ．ｄａｔ（１９９５年 １１月のＲｅｌｅａｓｅ １３．０ 、ｈｔｔｐ：／／ｅｘｐａｓｙ．ｈｃｕｇ
ｅ．ｃｈ／ｓｐｒｏｔ／ｐｒｏｓｉｔｅ．ｈｔｍｌ）に収録されているコンセン
サスパターンまたはマトリックスを導くのに使用されている。Ｐｒｏｓｉｔｅ＿
ｃｏｎｖｅｒｔおよびｐｒｏｓｉｔｅ＿ｓｃａｎプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｕ
ｌｒｅｃ３．ｕｎｉｌ．ｃｈ／ｆｔｐｓｅｒｖｅｕｒ／ｐｒｏｓｉｔｅ＿ｓｃａ
ｎ）を使用して、伸長ｃＤＮＡ上のシグネチャーを見つけることが可能である。

【０１９２】 ｐｒｏｓｉｔｅ．ｄａｔファイルのｐｒｏｓｉｔｅ＿ｃｏｎｖｅｒｔプログラ
ムを用いて得られた各パターンについて、データバンクＳＷＩＳＳＰＲＯＴに収
録されているヒト分泌タンパク質の集団に関する不適切なヒットの頻度を評価す
ることによって、新しいタンパク質に関する配列検出精度を査定することが可能
である。シャッフルド（ｓｈｕｆｆｌｅｄ）タンパク質（アミノ酸２０個のウイ
ンドウサイズ）に関するヒット数と天然（非シャッフル）タンパク質に関するヒ
ット数との間の比率を指数として使用することが可能である。ｐｒｏｓｉｔｅ＿
ｓｃａｎを用いた検索中に、比率が２０％を超える（生来のタンパク質に関する
ヒット５件に対してシャッフルドタンパク質に関するヒット１件）あらゆるパタ
ーンを省くことができる。タンパク質配列をシャッフルするのに使用されるプロ
グラム（ｄｂ＿ｓｈｕｆｆｌｅｄ）およびタンパク質データバンクの各パターン
に関する統計学の決定に使用されるプログラム（ｐｒｏｓｉｔｅ＿ｓｔａｔｉｓ
ｔｉｃｓ）は、ｆｔｐサイト HYPERLINK http://ulrec3.unil.ch/ftpserveur/pr
osite#scan ｈｔｔｐ：／／ｕｌｒｅｃ３．ｕｎｉｌ．ｃｈ／ｆｔｐｓｅｒｖｅ ｕｒ／ｐｒｏｓｉｔｅ＿ｓｃａｎで利用できる。

【０１９３】 伸長ｃＤＮＡを取得するためのＰＣＲに基づいた方法に加えて、伝統的なハイ
ブリダイゼーションに基づいた方法も使用することが可能である。こうした方法
を使用して、５' ＥＳＴの起源であるｍＲＮＡ、伸長ｃＤＮＡに対応するｍＲ ＮＡ、あるいは伸長ｃＤＮＡまたは５' ＥＳＴに相同な核酸をコードするゲノ ムＤＮＡを取得することもできる。以下の実施例２９に、このような方法の例を
提供する。

【０１９４】実施例２９ 全コード領域を含むｃＤＮＡおよび対応するｍＲＮＡの真の５'末端を取得する 方法 上記実施例１３、１４、１５および１６の方法を使用し、実施例１４で使用し
たランダムノナマーをｏｌｉｇｏ−ｄＴ プライマーに換えることによって、全
長ｃＤＮＡライブラリーを作成することができる。たとえば、配列番号１４のオ
リゴヌクレオチドを使用することが可能である。

【０１９５】 あるいはまた、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーを、商
業的ソースから入手してもよく、または当業者に周知の技術を使用して作成して
もよい。下記の通りに、このようなｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡラ
イブラリーを使用して、５' ＥＳＴから取得した伸長ｃＤＮＡまたは該伸長ｃ ＤＮＡもしくは５' ＥＳＴに相同な核酸を単離することができる。従来の技術 を使用して、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーを、５' ＥＳＴまたは伸長ｃＤＮＡに由来する少なくとも１０個連続したヌクレオチドを
含む検出可能なプローブにハイブリダイズさせる。プローブは、５' ＥＳＴま たは伸長ｃＤＮＡに由来する少なくとも１２個、１５個または１７個連続したヌ
クレオチドを含むことが好ましい。プローブは、５' ＥＳＴまたは伸長ｃＤＮ Ａに由来する少なくとも２０〜３０個連続したヌクレオチドを含むことがさらに
好ましい。一部の実施形態では、プローブは、５' ＥＳＴまたは伸長ｃＤＮＡ に由来する３０個を上回るヌクレオチドを含む。

【０１９６】 Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９（その開示内容を、
参照により本明細書に援用する）には、所与のプローブ配列にハイブリダイズす
るｃＤＮＡライブラリーのｃＤＮＡクローンを同定する技術が開示されている。
同じ技術を用いてゲノムDNAを単離できる。

【０１９７】 簡単に記載すると、さらなる操作のために下記の通りに検出可能なプローブと
ハイブリダイズするｃＤＮＡクローンまたはゲノムＤＮＡクローンを同定し、単
離する。５' ＥＳＴまたは伸長ｃＤＮＡに由来する少なくとも１０個連続した ヌクレオチドを含むプローブを、検出可能な標識、たとえば、放射性同位元素ま
たは蛍光分子で標識する。プローブは、５' ＥＳＴまたは伸長ｃＤＮＡに由来 する少なくとも１２個、１５個、または１７個連続したヌクレオチドを含むこと
が好ましい。プローブは、５' ＥＳＴまたは伸長ｃＤＮＡに由来する２０〜３ ０個連続したヌクレオチドを含むことがさらに好ましい。一部の実施形態におい
て、プローブは５' ＥＳＴまたは伸長ｃＤＮＡに由来する３０個を超えるヌク レオチドを含む。

【０１９８】 プローブを標識する技術は周知であり、ポリヌクレオチドキナーゼを用いたリ
ン酸化、ニック翻訳、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写、および非放射性技術が含まれる。
ライブラリー中のｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡをニトロセルロースフィルターま
たはナイロンフィルターに移動させ、変性させる。非特異的部位を遮断した後、
プローブにハイブリダイズすることができる配列を含むｃＤＮＡまたはゲノムＤ
ＮＡにプローブを結合させるのに十分な時間、フィルターを標識プローブと共に
インキュベートする。

【０１９９】 検出可能なプローブにハイブリダイズする伸長ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの
同定に使用されるハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを変えるこ
とによって、下記の通りに、プローブとの相同性のレベルが異なる伸長ｃＤＮＡ
を同定し、単離することができる。

【０２００】 １．標識プローブと高度の相同性を有する伸長ｃＤＮＡ配列またはゲノムｃＤＮ
Ａ配列の同定 プローブ配列と高度の相同性を有する伸長ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを同定
するために、次式を使用して、プローブの融解温度を算出することが可能である
。 １４〜７０ヌクレオチドの長さのプローブの場合、次式： Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ ［Ｎａ＋］）＋０．４１（分画Ｇ＋Ｃ）−
（６００／Ｎ）（式中、Ｎはプローブの長さである）を使用して、融解温度（Ｔ
ｍ）を算出する。 ホルムアミドを含有する溶液中でハイブリダイゼーションを実施する場合、式
：Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ ［Ｎａ＋］）＋０．４１（分画 Ｇ＋Ｃ
）−（０．６３％ ホルムアミド）−（６００／Ｎ）（式中、Ｎはプローブの長
さである）を使用して、融解温度を算出することができる。

【０２０１】 プレハイブリダイゼーションを、６Ｘ ＳＳＣ、５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬
、０．５％ＳＤＳ、１００μgの変性され断片化されたサケ精子ＤＮＡ中、また は６Ｘ ＳＳＣ、５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬、０．５％ＳＤＳ、１００μgの 変性され断片化されたサケ精子ＤＮＡ、５０％ホルムアミド中で実施することが
可能である。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）には、ＳＳＣおよびＤｅｎｈａｒｄｔ
溶液に関する処方が記載されている。

【０２０２】 検出可能なプローブを上記プレハイブリダイゼーション溶液に加えることによ
って、ハイブリダイゼーションを実施する。プローブが二本鎖ＤＮＡを含む場合
、これを変性させてからハイブリダイゼーション溶液に加える。プローブに相補
的な配列またはプローブに相同な配列を含む伸長ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡと
プローブをハイブリダイズさせるのに十分な時間、フィルターをハイブリダイゼ
ーション溶液と接触させる。長さが２００ヌクレオチドを超えるプローブの場合
、Ｔｍより１５〜２５℃低い温度でハイブリダイゼーションを実施することが可
能である。オリゴヌクレオチドプローブのようなより短いプローブの場合、Ｔｍ
より１５〜２５℃低い温度でハイブリダイゼーションを実施することが可能であ
る。６Ｘ ＳＳＣ中でハイブリダイゼーションする場合、約６８℃でハイブリダ
イズすることが好ましい。５０％ホルムアミド含有溶液中でハイブリダイズする
場合、約４２℃でハイブリダイズすることが好ましい。 前述のハイブリダイゼーションは全て、「ストリンジェントな」条件下である
と考えられるであろう。

【０２０３】 ハイブリダイゼーション後、フィルターを、２Ｘ ＳＳＣ、０．1％ＳＤＳ中 、室温で１５分間洗浄する。次いで、このフィルターを、０．１Ｘ ＳＳＣ、０
．５％ＳＤＳで、室温で３０分〜１時間洗浄する。その後、この溶液を、０．１
Ｘ ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中、ハイブリダイゼーション温度で洗浄する。最終
的な洗浄を、０．１Ｘ ＳＳＣ中、室温で実施する。 伸長ｃＤＮＡ、伸長ｃＤＮＡまたは５' ＥＳＴに相同な核酸、またはプロー ブとハイブリダイズしたゲノムＤＮＡを、オートラジオグラフィまたは他の従来
技術で、同定する。

【０２０４】 ２．標識プローブと低度の相同性を有する伸長ｃＤＮＡ配列またはゲノムｃＤＮ
Ａ配列の取得 プローブ配列との相同性レベルが低い伸長ｃＤＮＡ、伸長ｃＤＮＡに相同な核
酸、またはゲノムＤＮＡを同定するために、上記手順を改変することが可能であ
る。たとえば、検出可能プローブ配列との相同性が低い伸長ｃＤＮＡ、伸長ｃＤ
ＮＡに相同な核酸、またはゲノムＤＮＡを取得するために、より低いストリンジ
ェント条件を使用してもよい。たとえば、ナトリウム濃度が約１Ｍのハイブリダ
イゼーション緩衝液中で、ハイブリダイゼーション温度を、６８℃から４２℃ま
で５℃ずつ下げてもよい。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイゼーション
温度にて、２Ｘ ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでフィルターを洗浄してもよい。これ
らの条件は、５０℃以上で「中程度」条件、５０℃未満で「低度」条件であると
考えられる。

【０２０５】 あるいは、ホルムアミドを含む６Ｘ ＳＳＣのような緩衝液中、温度４２℃で
、ハイブリダイゼーションを実施してもよい。この場合、プローブとの相同性レ
ベルが低いクローンを同定するために、ハイブリダイゼーション緩衝液中のホル
ムアミド濃度を５０％から０％まで５％ずつ下げてもよい。ハイブリダイゼーシ
ョン後、５０℃の６X ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでフィルターを洗浄してもよい 。これらの条件は、２５％を超えるホルムアミドで「中程度」条件、２５％未満
のホルムアミドで「低度」条件と考えられる。

【０２０６】 伸長ｃＤＮＡ、伸長ｃＤＮＡに相同な核酸、またはプローブにハイブリダイズ
したゲノムＤＮＡを、オートラジオグラフィで同定する。

【０２０７】 ３．取得した伸長ｃＤＮＡと標識プローブとの間の相同性の程度の決定 伸長ｃＤＮＡに相同な核酸、たとえば、その対立遺伝子変異体や、伸長ｃＤＮ
Ａによりコードされるタンパク質関連のタンパク質をコードしている核酸を取得
することが望ましい場合、ＢＬＡＳＴ２Ｎを使用して、ハイブリダイズした核酸
と、プローブとして使用される伸長ｃＤＮＡまたは５' ＥＳＴとの間の相同性 のレベルをさらに決定することが可能であり、試験する配列の長さおよび相同性
の程度に応じて、パラメータを改変してもよい。ハイブリダイズした核酸と、プ
ローブの起源である伸長ｃＤＮＡまたは５' ＥＳＴとの間の相同性のレベルを 決定するために、ハイブリダイズした核酸のヌクレオチド配列と、およびプロー
ブの起源である伸長ｃＤＮＡまたは５' ＥＳＴのヌクレオチド配列とを比較す る。たとえば、上記の方法を使用して、そのプローブの起源である伸長ｃＤＮＡ
もしくは５' ＥＳＴと少なくとも９５％の核酸相同性を有する核酸を取得し、 同定することが可能である。同様に、より低いストリンジェントでないハイブリ
ダイゼーション条件を使用して、プローブの起源である伸長ｃＤＮＡまたは５'
ＥＳＴと少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％または少な くとも７５％の相同性を有する核酸を取得し、同定することが可能である。

【０２０８】 クローンが、伸長ｃＤＮＡまたは５' ＥＳＴによりコードされるタンパク質 と所定量の相同性を有するタンパク質をコードするかどうかを決定するために、
伸長ｃＤＮＡまたは５' ＥＳＴによりコードされるアミノ酸配列を、ハイブリ ダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列と比較する。伸長ｃＤＮＡまた
は５' ＥＳＴのアミノ酸配列が、ハイブリダイズする核酸のアミノ酸配列と密 接に関連しているとき、相同性は存在すると決定される。配列が伸長ｃＤＮＡま
たは５' ＥＳＴの配列と同じとき、または配列が、類似した特徴を有するアミ ノ酸が互いに置き換わっている１つまたは複数のアミノ酸置換を中に含むとき、
その配列は密接に関連している。上記の方法、ならびに試験する配列の長さおよ
び相同性の程度に応じたパラメータとを用いてＦＡＳＴＡのようなアルゴリズム
を使用して、プローブの起源である伸長ｃＤＮＡまたは５' ＥＳＴによりコー ドされるタンパク質と少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％
、少なくとも８０％または少なくとも７５％の相同性を有するタンパク質をコー
ドしている核酸を取得することが可能である。

【０２０９】 次のパラグラフに略述する通り、５' ＥＳＴを使用して伸長ｃＤＮＡを取得 するために、上述の方法に加えて、他のプロトコルが利用される。 ポリＡ選択方法または当業者に周知の技術を利用したｍＲＮＡ調製方法を使用
して、関心のある組織、細胞、または生物からｍＲＮＡを取得することによって
、伸長ｃＤＮＡを調製することが可能である。ｍＲＮＡのポリＡテイル(tail)に
ハイブリダイズすることができる第１のプライマーを、ｍＲＮＡにハイブリダイ
ズさせ、逆転写反応を実施して、第１のｃＤＮＡ鎖を生成する。

【０２１０】 第１のｃＤＮＡ鎖を、配列番号３８〜３１５の配列に由来する少なくとも１０
個連続したヌクレオチドを含む第２のプライマーにハイブリダイズさせる。この
プライマーは、配列番号３８〜３１５の配列に由来する少なくとも１２、１５、
または１７個連続したヌクレオチドを含むことが好ましい。プライマーは、配列
番号３８〜３１５の配列に由来する２０〜３０個連続したヌクレオチドを含むこ
とがさらに好ましい。一部の実施形態では、プライマーは、配列番号３８〜３１
５の配列に由来する３０個より多いヌクレオチドを含む。真の翻訳開始部位を含
む、全タンパク質コーディング配列を含む伸長ｃＤＮＡを取得することが望まし
い場合、使用される第２のプライマーは、翻訳開始部位の上流に位置する配列を
含む。第１のｃＤＮＡ鎖に相補的な第２のｃＤＮＡ鎖を生成するために、第２の
プライマーを伸長する。あるいは、取得すべきｃＤＮＡの両端に由来するプライ
マーを使用して、上述の通りにＲＴ−ＰＣＲを実施してもよい。

【０２１１】 伸長ｃＤＮＡが望ましい５' ＥＳＴの配列を含むｍＲＮＡを、５' ＥＳＴに
相補的な配列の少なくとも１０個連続したヌクレオチドを含むプライマーとハイ
ブリダイズさせ、このハイブリダイズしたプライマーを逆転写してｍＲＮＡから
第１のｃＤＮＡ鎖を作成することにより、ｍＲＮＡの５'フラグメントを含む伸 長ｃＤＮＡを調製することが可能である。このプライマーは、５' ＥＳＴに由 来する少なくとも１２、１５、または１７個連続したヌクレオチドを含むことが
好ましい。プライマーは、５' ＥＳＴに由来する２０〜３０個の連続したヌク レオチドを有することがさらに好ましい。

【０２１２】 その後、第１のｃＤＮＡ鎖に相補的な第２のｃＤＮＡ鎖を合成する。第１のｃ
ＤＮＡ鎖の配列に相補的なプライマーを第１のｃＤＮＡ鎖にハイブリダイズさせ
、プライマーを伸長して第２のｃＤＮＡ鎖を生成することによって、第２のｃＤ
ＮＡ鎖を作成することが可能である。 上述の方法を使用して作成した二本鎖伸長ｃＤＮＡを単離してクローニングす
る。伸長ｃＤＮＡを、プラスミドや適当な宿主細胞で複製することができるウイ
ルスベクター等のベクターにクローニングしてもよい。たとえば、宿主細胞は、
細菌、哺乳類、鳥類、または昆虫細胞であってもよい。

【０２１３】 ｍＲＮＡを単離し、ｍＲＮＡにハイブリダイズしたプライマーを逆転写して第
１のｃＤＮＡ鎖を生成し、プライマーを伸長して第１のｃＤＮＡ鎖に相補的な第
２のｃＤＮＡ鎖を作成し、二本鎖ｃＤＮＡを単離して、二本鎖ｃＤＮＡをクロー
ニングする技術は、当業者に周知であり、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎ
ｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． １９９７およびＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９（その全開示内容を、
参照により本明細書に援用する）に記載されている。

【０２１４】 あるいは、実施例２９に記載されているような手順を、全長ｃＤＮＡまたは伸
長ｃＤＮＡの取得に使用してもよい。このアプローチでは、全長ｃＤＮＡまたは
伸長ｃＤＮＡをｍＲＮＡから調製し、下記の通りに、二本鎖ファージミドにクロ
ーニングする。次いで、ファージF１のＧｅｎｅ II産物のようなエンドヌクレ アーゼ、およびエクソヌクレアーゼで処理することにより、二本鎖ファージミド
のｃＤＮＡライブラリーを一本鎖にする（Chang et al., Gene 127:95-8, 1993 ）。５' ＥＳＴの配列を含むビオチニル化オリゴヌクレオチド、またはその少 なくとも１０個のヌクレオチドを含む断片を、一本鎖ファージミドにハイブリダ
イズする。この断片は、５' ＥＳＴに由来する少なくとも１２、１５、または １７個連続したヌクレオチドを含むことが好ましい。断片は、５' ＥＳＴに由 来する２０-３０個連続したヌクレオチドを含むことがさらに好ましい。一部の 方法では、フラグメントは、５' ＥＳＴに由来する３０個より多い連続したヌ クレオチドを含むことがある。

【０２１５】 ビオチニル化オリゴヌクレオチドと５' ＥＳＴ配列を含む挿入物を有するフ ァージミドとの間のハイブリッドを、ハイブリッドをストレプトアビジン被覆常
磁性ビーズと共にインキュベートし、磁石を用いてビーズを回収することによっ
て単離する（Fry et al., Biotechniques, 13: 124-131, 1992）。その後、この
ようにして得られた５' ＥＳＴ配列を含むファージミドをビーズから放出し、 ５' ＥＳＴ配列に特異的なプライマーを使用して、二本鎖ＤＮＡに変換する。 あるいは、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｐｐｅｒキット（Gibco BRL）のようなプロトコル を使用してもよい。このようにして得られた二本鎖ＤＮＡを、細菌に形質転換す
る。５' ＥＳＴ配列を含む伸長ｃＤＮＡを、コロニーＰＣＲまたはコロニーハ イブリダイゼーションにより同定する。

【０２１６】 セクションIIIに上述した方法のいずれかを使用して、全長タンパク質コーデ ィング配列またはシグナルペプチドの除去後に残った成熟タンパク質のみをコー
ドしている配列を含む複数の伸長ｃＤＮＡを、以下のようなその後のコードされ
たタンパク質の評価用または診断アッセイ用のｃＤＮＡライブラリーとして提供
することができる。

【０２１７】 IV．５' ＥＳＴを使用して単離される伸長ｃＤＮＡによりコードされるタンパ ク質の発現 以下の実施例３０に記載の通り、対応するｍＲＮＡの全タンパク質コーディン
グ配列またはその一部を含む伸長ｃＤＮＡ、たとえば、成熟タンパク質をコード
しているｃＤＮＡを使用して、コードされた分泌タンパク質またはその一部を発
現させることができる。必要に応じて、伸長ｃＤＮＡは、発現したタンパク質の
分泌を促進するために、シグナルペプチドをコードしている配列を含んでもよい
。以下に記載するように、全タンパク質コーディング配列またはその一部を含む
複数の伸長ｃＤＮＡを、発現ベクターに同時にクローニングして、コードされた
タンパク質を分析するための発現ライブラリーを作成できることは、十分に理解
されるであろう。

【０２１８】実施例３０ ５' ＥＳＴまたはその一部に対応する遺伝子によりコードされるタンパク質の 発現 ５' ＥＳＴ、（またはその一部）に対応する遺伝子によりコードされるタン パク質を発現させるために、全タンパク質コード領域を含む全長ｃＤＮＡまたは
５' ＥＳＴ（またはその一部）に隣接する配列を含む伸長ｃＤＮＡを、実施例 ２７〜２９に記載の通りに取得し、適当な発現ベクターにクローニングする。必
要に応じて、核酸は、発現したタンパク質の分泌を促進するために、シグナルペ
プチドをコードしている配列を含んでもよい。発現ベクターに挿入される核酸は
、シグナルペプチドをコードしている配列の上流の配列、たとえば、発現レベル
を調節する配列や組織特異的発現を与える配列も含んでもよい。

【０２１９】 従来のクローニング技術を使用して、発現させるべきタンパク質またはポリペ
プチドをコードしている核酸を、発現ベクターにおけるプロモーターに操作可能
に連結させる。発現ベクターは、哺乳類、酵母、昆虫または当業者に周知の細菌
発現システムのいずれであってもよい。市販のベクターおよび発現系は、Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）、Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、Ｐｒｏｍｅｇａ（
Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａ
ｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を含む様々な製造業者から入手でき
る。Ｈａｔｆｉｅｌｄらの米国特許第５，０８２，７６７号（参照により本明細
書に援用する）によって説明される通り、必要に応じて、発現を強化しかつ適当
なタンパク質折畳みを促進するために、発現ベクターが導入される個々の発現生
物に合わせて、配列のコドンコンテクストおよびコドンのペアリングを最適化す
ることができる。

【０２２０】 発現ベクターにクローニングされたｃＤＮＡクローンは、全タンパク質（すな
わち、シグナルペプチドおよび成熟タンパク質）、成熟タンパク質（すなわち、
シグナルペプチドの切除によって作成されるタンパク質）、シグナルペプチドま
たはその任意の他の部分のみをコードしてもよい。

【０２２１】 上述の５' ＥＳＴまたは核酸に対応する伸長ｃＤＮＡによりコードされるタ ンパク質を発現させる代表的な方法を以下に提供する。最初に、遺伝子のメチオ
ニン開始コドンおよび遺伝子のポリＡシグナルを同定する。発現されるポリペプ
チドをコードしている核酸に、開始部位の役割をするメチオニンが欠如している
場合、従来技術を使用して、開始用メチオニンを核酸の第１コドンの隣に導入す
ることができる。同様に、伸長ｃＤＮＡにポリＡシグナルが欠如している場合、
たとえば、ＢｇlIIおよびＳａlI制限エンドヌクレアーゼ酵素を使用してｐＳＧ ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からポリＡシグナルをスプライシングし、哺乳類発
現ベクターｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に組み込むことにより、この配列
を構築物に付加することができる。ｐＸＴ１はＬＴＲおよびＭｏｌｏｎｅｙ Ｍ
ｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓから入手できるｇａｇ遺伝子の一部
を含む。構築物におけるＬＴＲの位置は、効率のよい安定したトランスフェクシ
ョンを可能にする。ベクターは、単純疱疹（Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ）チ
ミジンキナーゼプロモーターおよび選択可能なネオマイシン遺伝子を含む。伸長
ｃＤＮＡまたはその一部に相補的で、且つ５'プライマーに組み込まれたＰｓｔ Ｉおよび対応するｃＤＮＡ ３'プライマーの５'末端のＢｇｌIIに対する制限エ
ンドヌクレアーゼ配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、伸長ｃＤ
ＮＡが確実にポリＡシグナルと一緒に配置されるように気をつけて、発現すべき
ポリペプチドをコードしている伸長ｃＤＮＡまたはその一部を、細菌ベクターか
らＰＣＲによって取得する。このようにして得られたＰＣＲ反応物から得られた
精製断片をＰｓｔＩで消化し、エクソヌクレアーゼで平滑末端化し、ＢｇｌIIで
消化し、精製し、さらに、ポリＡシグナルを含み且つこの連結（ｂｌｕｎｔ／Ｂ
ｇｌII）用に調製されたｐＸＴ１に連結する。

【０２２２】 Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．，
Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を使用して、製品仕様書に
略述されている条件下で、連結生成物をマウス ＮＩＨ ３Ｔ３細胞にトランス
フェクトする。６００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉ
ｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）中で形質導入した細胞を成長させた後、陽性の形質導
入体を選択する。発現したタンパク質が培地に放出され、その結果、精製が容易
になることが好ましい。

【０２２３】 あるいは、上述の通り、伸長ｃＤＮＡをｐＥＤ６ｄｐｃ２にクローニングして
もよい。このようにして得られたｐＥＤ６ｄｐｃ２構築物を適当な宿主細胞、た
とえば、ＣＯＳ １細胞にトランスフェクトしてもよい。メトトレキセート耐性
細胞を選択して、増殖する。伸長ｃＤＮＡから発現したタンパク質が培地に放出
され、その結果、精製が容易になることが好ましい。 培地中のタンパク質をゲル電気泳動法で分離する。必要に応じて、電気泳動の
前に、タンパク質を硫酸アンモニウム沈殿させてもよく、あるいはサイズまたは
電荷に基づいて分離してもよい。

【０２２４】 対照として、ｃＤＮＡ挿入物が欠如している発現ベクターを宿主細胞または生
物に導入し、培地中のタンパク質を収穫する。クーマシーブルーまたは銀染色の
ような当業者に周知の技術を使用するか、伸長ｃＤＮＡによりコードされるタン
パク質に対する抗体を使用して、培地中に存在する分泌タンパク質を検出する。
適当な５' ＥＳＴ、伸長ｃＤＮＡ、またはその一部によりコードされる配列 を有する合成１５量体ペプチドを使用して、関心のあるタンパク質を特異的に認
識することができる抗体を生成することが可能である。合成ペプチドをマウスに
注射し、５' ＥＳＴ、伸長ｃＤＮＡ、またはその一部によりコードされるポリ ペプチドに対する抗体を生成する。

【０２２５】 ５' ＥＳＴまたはその一部から誘導された伸長ｃＤＮＡを含む発現ベクター を含む宿主細胞または生物に由来する分泌タンパク質を、対照の細胞または生物
のものと比較する。対照細胞の培地に存在しないバンドが、発現ベクターを含む
細胞の培地中に存在することは、伸長ｃＤＮＡが分泌タンパク質をコードするこ
とを示す。一般に、伸長ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質に対応するバン
ドは、伸長ｃＤＮＡのオープンリーディングフレーム内のアミノ酸の数に基づい
て予期されるものに近い移動度を有する。しかし、バンドは、グリコシル化、ユ
ビキチン化、または酵素的切断のような修飾の結果として予期されるものとは異
なる移動度を有することがある。

【０２２６】 あるいは、上記発現ベクターから発現したタンパク質が、その分泌を指令する
配列を含まない場合、分泌タンパク質またはその一部をコードしている挿入物を
含む発現ベクターを含む宿主細胞から発現したタンパク質を、挿入物を含まない
発現ベクターを含む対照の宿主細胞で発現したタンパク質と比較することができ
る。挿入物を含まない発現ベクターを含む細胞からの試料に存在しないバンドが
、挿入物を含む発現ベクターを含む細胞からの試料に存在することは、所望のタ
ンパク質またはその一部が発現したことを示す。一般に、バンドは、分泌タンパ
ク質またはその一部に関して予期される移動度を有する。しかし、バンドは、グ
リコシル化、ユビキチン化、または酵素的切断のような修飾の結果として予期さ
れるものとは異なる移動度を有することがある。

【０２２７】 標準的なイムノクロマトグラフィ技術を使用して、伸長ｃＤＮＡによりコード
されるタンパク質を精製することが可能である。このような手順では、培地や細
胞抽出物のような、分泌タンパク質を含む溶液を、クロマトグラフィマトリック
スに付着した分泌タンパク質に対する抗体を有するカラムにかける。分泌タンパ
ク質をイムノクロマトグラフィカラムに結合させる。その後、カラムを洗浄して
、非特異的に結合したタンパク質を除去する。次いで、特異的に結合した分泌タ
ンパク質を、カラムから放出し、標準的な技術を使用して回収する。

【０２２８】 抗体産生ができなければ、伸長ｃＤＮＡ配列またはその一部を、キメラポリペ
プチドを使用して、精製機構で使用するために設計された発現ベクターに組み込
んでもよい。このような方法で、伸長ｃＤＮＡまたはその一部のコーディング配
列を、キメラの残り半分をコードしている遺伝子とともにインフレームで挿入す
る。キメラの残り半分は、β−グロビンまたはニッケル結合性ポリペプチドであ
ってもよい。β−グロビンに対する抗体を有するかまたはニッケルが付着したク
ロマトグラフィマトリックスを使用して、キメラタンパク質を精製する。β−グ
ロビン遺伝子またはニッケル結合性ポリペプチドと、伸長ｃＤＮＡまたはその一
部との間の、プロテアーゼ切断部位を操作することが可能である。従って、キメ
ラの２つのポリペプチドを、プロテアーゼ消化によって互いに分離することが可
能である。

【０２２９】 β−グロビンキメラの生成に有用な１つの発現ベクターは、ウサギβ−グロビ
ンをコードするｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）である。ウサギβ−グロビン
遺伝子のイントロンＩＩは、発現した転写物のスプライシングを促進し、構築物
に組込まれたポリアデニル化シグナルは、発現レベルを高める。記載されている
これらの技術は、分子生物学の当業者には周知である。標準的な方法は、Ｄａｖ
ｉｓ ｅｔ ａｌ．，（Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｄａｖｉｓ， Ｄｉｂｎｅｒ， ａｎｄ Ｂａｔｔｅｙ
， ｅｄ．， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ， １９８６）のような
方法教本に公表されており、方法の多くは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．またはＰｒｏｍｅｇａから入手できる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｅｘｐｒｅｓｓ^TM Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ）のようなｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳システムを使用して、構築
物からさらなるポリペプチドを作ることができる。

【０２３０】 ５' ＥＳＴ、伸長ｃＤＮＡ、またはそれらの断片によりコードされる分泌タ ンパク質を発現させ、精製した後、以下の実施例３１に記載のように精製タンパ
ク質が様々な細胞型の表面に結合する能力を試験することができる。以下に具体
的に記載されている作用、および作用を決定するためのアッセイが利用可能な他
の生物学的役割について同時に評価すべきタンパク質団に、これらのｃＤＮＡか
ら発現した複数のタンパク質を含めてもよいことは、十分に理解されるであろう
。

【０２３１】実施例３１ 分泌タンパク質が細胞表面に結合するかどうかを決定するための分泌タンパク質 の分析 ５’ＥＳＴ、伸長ｃＤＮＡ、またはそれらのフラグメントによりコードされる
タンパク質を、実施例３０に記載されているような発現ベクターにクローニング
する。サイズ、電荷、イムノクロマトグラフィまたはその他の当業者に周知の技
術によって、このタンパク質を精製する。精製後、このタンパク質を、当業者に
周知の技術を使用して標識する。標識タンパク質を、様々な器官または組織に由
来する細胞または細胞系と共にインキュベートし、このタンパク質を、細胞表面
上に存在する任意のレセプターに結合させる。インキュベーション後、細胞を洗
浄して、非特異的に結合したタンパク質を除去する。標識タンパク質をオートラ
ジオグラフィで検出する。あるいは、非標識タンパク質を細胞とインキュベート
し、検出可能な標識、たとえば、蛍光分子が付着した抗体を用いて検出してもよ
い。

【０２３２】 様々な量の非標識タンパク質を標識タンパク質と一緒にインキュベートする競
合分析を実施することにより、細胞表面結合の特異性を分析する。競合的非標識
タンパク質の量が増加するにつれて、細胞表面に結合した標識タンパク質の量が
減少する。対照として、標識タンパク質と無関係の様々な量の非標識タンパク質
を、幾つかの結合反応に含める。結合反応において、無関係の非標識タンパク質
の含有量を増加させても細胞表面に結合した標識タンパク質の量は減少せず、上
記ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質が細胞表面に特異的に結合することが
示唆される。

【０２３３】 上記の通り、分泌タンパク質は、多数の重要な生理学的効果を有し、結果とし
て、貴重な治療源であることが示されている。下記の通り、実施例２７〜２９に
よって作られた、伸長ｃＤＮＡまたはその一部によりコードされる分泌タンパク
質を評価して、その生理学的活性を決定することが可能である。

【０２３４】実施例３２ 伸長ｃＤＮＡまたはその一部から発現したタンパク質の、サイトカイン、細胞増 殖または細胞分化活性に関するアッセイ 上記の通り、分泌タンパク質は、サイトカイン類として作用し、または細胞増
殖もしくは分化に影響を及ぼす可能性がある。現在までに発見された多くのタン
パク質因子は、全ての既知のサイトカイン類を含め、１つまたは複数の因子依存
的細胞増殖アッセイにおいて活性を示しており、従って、これらのアッセイは、
サイトカイン活性の便利な確認方法となる。３２Ｄ、ＤＡ２、ＤＡ１Ｇ、Ｔ１０
、Ｂ９、Ｂ９／１１、ＢａＦ３、ＭＣ９／Ｇ、Ｍ⁺（ｐｒｅＢ Ｍ⁺）、２Ｅ８、
ＲＢ５、ＤＡ１、１２３、Ｔ１１６５、ＨＴ２、ＣＴＬＬ２、ＴＦ−１、Ｍｏ７
ｃおよびＣＭＫを含むが、これに限定されない細胞系では、多数の定型的な因子
依存的細胞増殖アッセイのいずれか１つによって、伸長ｃＤＮＡによりコードさ
れるタンパク質の活性が証明される。上記伸長ｃＤＮＡまたはその一部によりコ
ードされるタンパク質は、上述のアッセイまたは下記の参考文献（参照により本
明細書に組み入れる）に記載されているようなアッセイにおいて、Ｔ細胞または
胸腺細胞増殖を調節する能力について評価することが可能である（Ｃｕｒｒｅｎ
ｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｅｄ． ｂｙ Ｃｏｌ
ｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ
ｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｔａｋａｉ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３７：３４９４−３５００，１９８６
．；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４５
：１７０６−１７１２，１９９０；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃ
ｅｌｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３３：３２７−３４１，１９９１；Ｂｅｒｔａ
ｇｎｏｌｌｉ， ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４９：３７７８−
３７８３，１９９２；Ｂｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１５２：１７５６−１７６１，１９９４）。

【０２３５】 さらに、サイトカイン産生および／または脾細胞、リンパ節細胞および胸腺細
胞の増殖に関する多くのアッセイが知られている。このようなものとしては、Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，前掲 １：
３．１２．１−３．１２．１４、およびＳｃｈｒｅｉｂｅｒ Ｉｎ Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，前掲 １：６．８．
１−６．８．８に開示されている技術が挙げられる。

【０２３６】 上記ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質が造血細胞またはリンパ球産生細
胞の増殖および分化を調節する能力について、アッセイすることも可能である。
以下の参考文献（参照により本明細書に組み入れる）にあるアッセイを含め、こ
のような活性に関する多くのアッセイは当業者に周知である：Ｂｏｔｔｏｍｌｙ
ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ．，前掲 １：６．３．１−６．３．１２；ｄｅＶｒｉｅｓ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７３：１２０５−１２１１，１９９１
；Ｍｏｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６：６９０−６９２，１９８
８；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８０：２９３１−２９３８，１９８３；Ｎｏｒ
ｄａｎ， Ｒ．，Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ．，前掲 １：６．６．１−６．６．５；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ
．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８３：１
８５７−１８６１，１９８６；Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 前掲 １：６．１
５．１；Ｃｉａｒｌｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．前掲 １：６．１３．１。

【０２３７】 上記ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質が抗原に対するＴ細胞応答を調節
する能力について、アッセイすることが可能である。以下の参考文献（参照によ
り本明細書に組み入れる）にあるアッセイを含め、このような活性に関する多く
のアッセイは当業者に周知である：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 前掲，第３章（マウスリンパ球機能についてのＩｎ
Ｖｉｔｒｏアッセイ），第６章（サイトカインおよびその細胞受容体）および第
７章（ヒトにおける免疫学的研究）；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐ
ｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：６０９１−６０
９５，１９８０；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍ
ｍｕｎ． １１：４０５−４１１，１９８１；Ｔａｋａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３７：３４９４−３５００，１９８６；Ｔａｋａｉ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４０：５０８−５１２，１９８８。

【０２３８】 次いで、サイトカイン、細胞増殖、または細胞分化活性を示すタンパク質を医
薬として製剤化し、細胞増殖または分化の誘導が有益な臨床状態の治療に使用す
ることが可能である。あるいは、以下に詳述する通り、これらのタンパク質をコ
ードしている遺伝子またはこれらのタンパク質の発現を調節する核酸を適当な宿
主細胞に導入して、これらのタンパク質の発現を望み通りに増加または減少させ
ることも可能である。

【０２３９】実施例３３ 免疫系調節物質としての活性を対象とした伸長ｃＤＮＡまたはその一部から発現 されるタンパク質のアッセイ 上記ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質を、免疫調節物質としてのそれら
の効果について評価することができる。例えば、該タンパク質を、胸腺細胞また
は脾臓細胞の細胞傷害性に影響するそれらの活性について評価することができる
。そのような活性に対する多くのアッセイが当業者によく知られており、以下の
ような参考文献（これらは参照により本明細書に組み入れる）：Ｃｏｌｉｇａｎ
ら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇ
ｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅ
ｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，第３章（マウスリンパ球機能についてのｉｎ
ｖｉｔｒｏアッセイ３．１〜３．１９）および第７章（ヒトにおける免疫学的研
究）；Ｈｅｒｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ
ＳＡ ７８：２４８８−２４９２，１９８１；Ｈｅｒｍａｎｎら、Ｊ． Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ． １２８：１９６８−１９７４，１９８２；Ｈａｎｄａら、Ｊ． Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ． １３５：１５６４−１５７２，１９８５；Ｔａｋａｉら、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３７：３４９４−３５００，１９８６；Ｔａｋａｉら、
Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４０：５０８−５１２，１９８８；Ｂｏｗｍａｎら
、Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６１：１９９２−１９９８；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌ
ｉら、Ｃｅｌｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３３：３２７−３４１，１９９１；Ｂ
ｒｏｗｎら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５３：３０７９−３０９２，１９９４
；に記載のアッセイが挙げられる。

【０２４０】 上記ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質を、Ｔ細胞依存性の免疫グロブリ
ン応答およびアイソタイプスイッチに対するそれらの効果について評価すること
ができる。そのような活性に対する多くのアッセイが当業者によく知られており
、以下のような参考文献（これらは参照により本明細書に組み入れる）：Ｍａｌ
ｉｓｚｅｗｓｋｉ，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４４：３０２８−３０３３，１
９９０；Ｍｏｎｄら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ，１：３．８．１−３．８．１６，前掲；に記載のアッセイが挙げら
れる。

【０２４１】 上記ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質を、Ｔｈ１細胞および細胞傷害性
リンパ球に対する効果などの、免疫エフェクター細胞に対する効果について評価
することができる。そのような活性に対する多くのアッセイが当業者によく知ら
れており、以下のような参考文献（これらは参照により本明細書に組み入れる）
：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（前掲）
の第３章（マウスリンパ球についてのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ３．１〜３．１
９）および第７章（ヒトにおける免疫学的研究）；Ｔａｋａｉら，Ｊ． Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ． １３７：３４９４−３５００，１９８６；Ｔａｋａｉら，Ｊ． Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ． １４０：５０８−５１２，１９８８；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ
ら，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４９：３７７８−３７８３，１９９２；に記載
のアッセイが挙げられる。

【０２４２】 上記ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質を、未活性型Ｔ細胞の樹状細胞介
在性活性化に対するそれらの効果について評価することができる。そのような活
性に対する多くのアッセイが当業者によく知られており、以下のような参考文献
（これらは参照により本明細書に組み入れる）：Ｇｕｅｒｙら，Ｊ． Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ． １３４：５３６−５４４，１９９５；Ｉｎａｂａら，Ｊ． Ｅｘｐ．
Ｍｅｄ． １７３：５４９−５５９，１９９１；Ｍａｃａｔｏｎｉａら，Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５４：５０７１−５０７９，１９９５；Ｐｏｒｇａｄｏ
ｒら，Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８２：２５５−２６０，１９９５；Ｎａｉ
ｒら，Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６７：４０６２−４０６９，１９９３；Ｈｕａｎｇ
ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：９６１−９６５，１９９４；Ｍａｃａｔｏｎｉａ
ら，Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ １６９：１２５５−１２６４，１９８９；Ｂｈａ
ｒｄｗａｊら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａ
ｔｉｏｎ ９４：７９７−８０７，１９９４；およびＩｎａｂａら，Ｊ． Ｅｘ
ｐ． Ｍｅｄ １７２：６３１−６４０，１９９０；に記載のアッセイが挙げら
れる。

【０２４３】 上記ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質を、リンパ球の寿命に対するそれ
らの影響について評価することができる。そのような活性に対する多くのアッセ
イが当業者によく知られており、以下のような参考文献（これらは参照により本
明細書に組み入れる）：Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚら，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ
１３：７９５−８０８，１９９２；Ｇｏｒｃｚｙｃａら，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ７
：６５９−６７０，１９９３；Ｇｏｒｃｚｙｃａら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．
５３：１９４５−１９５１，１９９３；Ｉｔｏｈら，Ｃｅｌｌ ６６：２３３−
２４３，１９９１；Ｚａｃｈａｒｃｈｕｋ，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４５：
４０３７−４０４５，１９９０；Ｚａｍａｉら，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ １４：８
９１−８９７，１９９３；Ｇｏｒｃｚｙｃａら，Ｉｎｔ． Ｊ． Ｏｎｃｏｌ．
１：６３９−６４８，１９９２；に記載のアッセイが挙げられる。

【０２４４】 上記ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質を、Ｔ細胞の分化の方向が決定さ
れ、細胞が発達していく初期の段階に対するそれらの影響について評価すること
ができる。そのような活性に対する多くのアッセイが当業者によく知られており
、以下のような参考文献（これらの参考文献は参照により本明細書に組み入れる
）：Ａｎｔｉｃａら，Ｂｌｏｏｄ ８４：１１１−１１７，１９９４；Ｆｉｎｅ
ら，Ｃｅｌｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５５：１１１−１２２，１９９４；Ｇａ
ｌｙら，Ｂｌｏｏｄ ８５：２７７０−２７７８，１９９５；Ｔｏｋｉら，Ｐｒ
ｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：７５４８−７５５１，
１９９１；に記載のアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。

【０２４５】 次いで免疫系調節物質活性として活性を示すタンパク質を医薬として製剤化し
、免疫活性の調節が有益な臨床状態を治療するのに使用してもよい。例えば、該
タンパク質は、（重症複合型免疫不全などの）様々な免疫不全および免疫障害の
治療、例えば、Ｔおよび／またはＢリンパ球の成長および増殖の調節（上向きま
たは下向き）ならびにＮＫ細胞および他の細胞集団の細胞溶解活性の惹起に有用
である。これらの免疫不全は遺伝的であるかまたはウイルス（例えば、ＨＩＶ）
および細菌もしくは真菌感染によって生じるか、あるいは自己免疫障害から生じ
ることがある。より具体的には、ウイルス、細菌、真菌または他の感染によって
生じる感染症は、本発明の５’ＥＳＴから誘導される伸長ｃＤＮＡによりコード
されるタンパク質を用いて治療することができ、該感染症には、ＨＩＶ、肝炎ウ
イルス、ヘルペスウイルス、マイコバクテリア、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ属、Ｐｌ
ａｍｏｄｉｕｍ属による感染症およびカンジダ症などの様々な真菌感染症が挙げ
られる。この点についてはもちろん、一般的に免疫系を促進することが所望され
る場合、例えば、癌の治療においても、本発明の５’ＥＳＴから誘導される伸長
ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質は有用である。

【０２４６】 あるいは、本発明の５’ＥＳＴから誘導される伸長ｃＤＮＡによりコードされ
るタンパク質を、例えば、結合組織病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス
、慢性関節リウマチ、自己免疫性肺炎、ギヤン−バレー症候群、自己免疫性甲状
腺炎、インスリン依存性糖尿病、重症筋無力症、移植片対宿主病および自己免疫
性炎症性眼疾患などの自己免疫疾患の治療に使用してもよい。本発明の５’ＥＳ
Ｔから誘導される伸長ｃＤＮＡによりコードされるそのようなタンパク質は、喘
息（特にアレルギー性喘息）または他の呼吸器系障害などのアレルギー反応およ
び症状の治療にも有用である。免疫抑制が所望される他の症状（例えば、臓器移
植など）も、本発明の５’ＥＳＴから誘導される伸長ｃＤＮＡによりコードされ
るタンパク質を使用して治療することができる。

【０２４７】 本発明のタンパク質を使用すれば、免疫応答を上向きまたは下向きのいずれか
に調節することも可能である。

【０２４８】 ダウンレギュレーションには、既に進行中にある免疫応答の阻害または阻止が
関与するか、あるいは免疫応答の誘導の防止が関与し得る。Ｔ細胞応答を抑制す
るかまたはＴ細胞の特異的寛容性を誘導することによって、あるいはその両方に
よって、活性化されたＴ細胞の機能が阻害され得る。Ｔ細胞応答の免疫抑制は、
一般に、積極的な非抗原特異的プロセスであって、Ｔ細胞を抑制剤に継続的に暴
露する必要がある。寛容性は、Ｔ細胞の非応答性またはアネルギーを誘導するこ
とを含むが、一般に抗原特異的であり、寛容化剤への暴露が終了した後も存続す
るという点で免疫抑制とは異なる。実際には、寛容化剤が存在しない場合は、特
異的抗原に再暴露されてもＴ細胞の応答が認められないことから、寛容性を実証
することができる。

【０２４９】 １つ以上の抗原機能（例えば、Ｂ７同時刺激などのＢリンパ球抗原機能が挙げ
られるが、これに限定されない）をダウンレギュレートするかまたは防止するこ
と、例えば、活性化されたＴ細胞による高レベルのリンホカイン合成を防止する
ことは、組織、皮膚および臓器移植の状況において、ならびに移植片対宿主病（
ＧＶＨＤ）において有用である。例えば、Ｔ細胞の機能を阻止すると、組織移植
における組織破壊が減少するはずである。典型的に、組織移植では、移植片がＴ
細胞によって外来性であると認識されることによって移植片の拒絶が始まり、続
いて、免疫反応によって移植片が破壊される。Ｂ７リンパ球抗原と免疫細胞上の
その天然のリガンド（例えば、Ｂ７−２活性を有するペプチドの可溶性単量体形
態のみかあるいは該ペプチドの可溶性単量体形態ともう１つのＢリンパ球抗原（
例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−３）の活性を有するかまたは抗体を阻止するペプチド
の単量体形態とを合わせたもの）との相互作用を阻害するかまたは阻止する分子
を移植前に投与すると、対応する同時刺激シグナルを伝達することなく免疫細胞
上の天然のリガンドに該分子を結合することができる。この事柄においてＢリン
パ球抗原機能を阻止すると、Ｔ細胞などの免疫細胞によるサイトカイン合成が防
止され、それゆえ、該阻止は免疫抑制剤として作用する。更に、同時刺激の欠如
もＴ細胞をアネルギー化する（ａｎｅｒｇｉｚｅ）のに十分であり得、これによ
り、被験体に寛容性が誘導される。Ｂリンパ球抗原阻止試薬によって長期寛容性
を誘導すると、これらの阻止試薬の反復投与の必要性を回避することができる。
被験体において十分な免疫抑制または寛容性を達成するために、Ｂリンパ球抗原
の組み合わせの機能を阻止する必要があり得る。

【０２５０】 ヒトにおける評価の予想となる動物モデルを用いて、臓器移植の拒絶またはＧ
ＶＨＤを防止する特定の阻止試薬の効果を評価することができる。使用すること
のできる適切な系の例としては、ラットにおける同種心移植片およびマウスにお
ける異種ランゲルハンス島細胞移植片が挙げられ、両者ともｉｎ ｖｉｖｏでＣ
ＴＬＡ４Ｉｇ融合タンパク質の免疫抑制効果を調べるのに使用されている。これ
らのことについては、Ｌｅｎｓｃｈｏｗら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：７８９−
７９２，１９９２およびＴｕｒｋａら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ ＵＳＡ，８９：１１１０２−１１１０５，１９９２に記載されている。
更に、ＧＶＨＤのマウスモデル（Ｐａｕｌ編，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｙ，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９，８４
６〜８４７頁を参照のこと）を使用して、該疾患の進行に対するｉｎ ｖｉｖｏ
でのＢリンパ球抗原機能の阻止の効果を決定することができる。

【０２５１】 抗原機能の阻止も、自己免疫疾患の治療には治療上有効である。多くの自己免
疫障害は、Ｔ細胞の活性化が不適切であることが原因であり、この時Ｔ細胞は自
己の組織に対して反応性であり、疾患の病因に関与するサイトカインおよび自己
抗体の産生を促進する。自己反応性のＴ細胞の活性化を防止すると、疾患の症候
を減少または消失することができる。Ｂリンパ球抗原のレセプター／リガンド相
互作用を破壊することによってＴ細胞の同時刺激を阻止する試薬を投与すること
により、Ｔ細胞の活性化を阻害し、疾患のプロセスに潜在的に関与する自己抗体
またはＴ細胞誘導性サイトカインの産生を防止することができる。更に、阻止試
薬は、自己反応性Ｔ細胞の抗原特異的寛容性を誘導することができ、これにより
疾患から長期軽減を導き得る。詳細に特性づけされたヒト自己免疫疾患の多くの
動物モデルを使用して、自己免疫障害を妨げるかまたは緩和する阻止試薬の効果
を決定することができる。その例としては、マウス実験的自己免疫脳炎、ＭＲＬ
／ｐｒ／ｐｒマウスまたはＮＺＢ交雑マウスの全身性エリテマトーデス、マウス
の自己免疫性抗原性関節炎（ｍｕｒｉｎｅ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｏ ｃｏｌｌａ
ｇｅｎ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、ＯＤマウスおよびＢＢラットの糖尿病、ならび
にマウスの実験的重症筋無力症が挙げられる（Ｐａｕｌ編、前掲、８４０〜８５
６頁を参照のこと）。

【０２５２】 免疫応答をアップレギュレートする手段として、抗原機能（好ましくはＢリン
パ球の抗原機能）をアップレギュレートすることも治療に有効であり得る。免疫
応答のアップレギュレーションには、現存の免疫応答を増強するか、または以下
の例に示されるような初期免疫応答を誘発するかのいずれかが関与し得る。例え
ば、Ｂリンパ球抗原機能を刺激することをにより免疫応答を増強することは、ウ
イルス感染の場合に有用であり得る。更に、全身的なＢリンパ球抗原の刺激形態
を投与することによって、インフルエンザ、一般的な風邪、および脳炎などの全
身性ウイルス疾患を緩和し得る。

【０２５３】 あるいは、感染患者からＴ細胞を取り出し、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて本発明
の５’ＥＳＴから誘導される伸長ｃＤＮＡによりコードされるペプチドを発現す
るかまたは該ペプチドと共に本発明の５’ＥＳＴから誘導される伸長ｃＤＮＡに
よりコードされる可溶性ペプチドの刺激形態を発現するウイルス抗原で惹起され
たＡＰＣで該Ｔ細胞を同時刺激し、そしてｉｎ ｖｉｔｒｏで感作したＴ細胞を
前記患者に再導入することによって、前記患者の抗ウイルス免疫応答を増強して
もよい。これで感染細胞は、同時刺激シグナルをｉｎ ｖｉｖｏでＴ細胞に送達
し、従って、Ｔ細胞を活性化することができる。

【０２５４】 もう１つの適用では、抗原機能（好ましくはＢリンパ球の抗原機能）のアップ
レギュレーションまたは増強は、腫瘍免疫の誘導に有益であり得る。本発明の５
’ＥＳＴから誘導される伸長ｃＤＮＡによりコードされる少なくとも１つのペプ
チドをコードする核酸をトランスフェクトされた腫瘍細胞（例えば、肉腫、黒色
腫、リンパ腫、白血病、神経芽腫、癌腫）を被験体に投与して、該被験体の腫瘍
特異的寛容性を克服することができる。所望であれば、ペプチドを組み合わせて
発現するように腫瘍細胞をトランスフェクトすることもできる。例えば、患者か
ら得られる腫瘍細胞を、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、Ｂ７−２様活性を有するペプ
チドのみか、あるいは該ペプチドとＢ７−１様活性および／またはＢ７−３様活
性を有するペプチドとを合わせたものの発現を指令する発現ベクターでトランス
フェクトすることができる。トランスフェクトされた腫瘍細胞は患者に戻され、
その結果、トランスフェクトされた細胞の表面上でこれらのペプチドが発現する
。あるいは、ｉｎ ｖｉｖｏでのトランスフェクションにおいて腫瘍細胞を標的
化するために、遺伝子治療技術を使用することができる。

【０２５５】 腫瘍細胞の表面上にＢリンパ球抗原の活性を有する、本発明の５’ＥＳＴから
誘導される伸長ｃＤＮＡによりコードされるペプチドが存在すると、必要な同時
刺激シグナルがＴ細胞に提供され、トランスフェクトされた腫瘍細胞に対するＴ
細胞介在性免疫応答が誘導される。更に、十分な量のＭＨＣクラスＩまたはＭＨ
ＣクラスＩＩ分子を再発現することができないかまたは完全に損なわれている腫
瘍細胞を、ＭＨＣクラスＩα鎖およびβ₂ミクログロブリンまたはＭＨＣクラス ＩＩα鎖およびＭＨＣクラスＩＩβ鎖の全てまたは一部（例えば、細胞質ドメイ
ンを切断した部分）をコードする核酸でトランスフェクトすることができ、それ
により、該腫瘍細胞は細胞表面上にそれぞれＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩタ
ンパク質を発現する。適切なＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子がＢリンパ球
抗原（例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３）の活性を有するペプチドと合わ
せて発現すると、トランスフェクトされた腫瘍細胞に対するＴ細胞介在性免疫応
答が誘導される。場合に応じて、不変鎖などのＭＨＣクラスＩＩの発現を阻止す
るアンチセンス構築物をコードする遺伝子も、Ｂリンパ球抗原の活性を有するペ
プチドをコードするＤＮＡと共に同時トランスフェクトし、腫瘍関連抗原の提示
を促進して、腫瘍特異的免疫を誘導することができる。従って、ヒト被験体にお
いてＴ細胞介在性免疫応答を誘導することは、被験体において腫瘍特異的寛容性
を克服するのに十分であり得る。あるいは、以下に詳細に記載するように、これ
らの免疫系調節物質のタンパク質をコードする遺伝子またはそのようなタンパク
質の発現を調節する核酸を適切な宿主細胞に導入して、所望する通りに該タンパ
ク質の発現を増加または減少してもよい。

【０２５６】実施例３４ 造血調節活性を対象とした伸長ｃＤＮＡまたはその一部から発現されるタンパク 質のアッセイ 上記伸長ｃＤＮＡまたはその一部によりコードされるタンパク質を、それらの
造血調節活性について評価することができる。例えば、胚性幹細胞の分化に対す
る該タンパク質の効果を評価することができる。そのような活性に対する多くの
アッセイが当業者によく知られており、以下のような参考文献（これらは参照に
より本明細書に組み入れる）：Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら，Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．
１５：１４１−１５１，１９９５；Ｋｅｌｌｅｒら，Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｌ． １３：４７３−４８６，１９９３；ＭｃＣｌａｎａｈａｎら，Ｂｌ
ｏｏｄ ８１：２９０３−２９１５，１９９３；に記載のアッセイが挙げられる
。 上記伸長ｃＤＮＡまたはその一部によりコードされるタンパク質を、幹細胞の
寿命および幹細胞の分化に対するそれらの影響について評価することができる。
そのような活性に対する多くのアッセイが当業者によく知られており、以下のよ
うな参考文献（これらは参照により本明細書に組み入れる）：Ｆｒｅｓｈｎｅｙ
，Ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｃｏｌｏｎｙ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ａｓｓａ
ｙｓ，ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ
．，Ｆｒｅｓｈｎｅｙら編，２６５〜２６８頁，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｉｎ
ｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ．１９９４；Ｈｉｒａｙａｍａら，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：５９０７−５９１１，１
９９２；ＭｃＮｉｅｃｅおよびＢｒｉｄｄｅｌｌ，ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ
Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ、前掲；Ｎｅｂｅｎら，Ｅｘｐ．
Ｈｅｍａｔｏｌ． ２２：３５３−３５９，１９９４；Ｐｌｏｅｍａｃｈｅｒお
よびＣｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ Ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏ
ｉｅｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ，前掲，１−２１；Ｓｐｏｏｎｃｅｒら，ｉｎ Ｃｕｌ
ｔｕｒｅ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ，前掲，１６３−１
７９ならびにＳｕｔｈｅｒｌａｎｄ ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｈｅｍａｔ
ｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ，前掲，１３９−１６２；に記載のアッセイが挙
げられる。

【０２５７】 次いで、造血調節活性を示すタンパク質を、医薬として製剤化し、骨髄または
リンパ球細胞欠損症の治療など、造血の調節が有益である臨床状態を治療するた
めに使用することができる。コロニー形成細胞または因子依存性細胞系を支える
周辺の生物学的活性によっても造血の調節の改善が認められる。例えば、赤血球
前駆細胞の成長または増殖を支持するタンパク質のみかあるいは他のサイトカイ
ンとの組み合わせは、例えば、様々な貧血の治療において、あるいは赤血球前駆
細胞および／または赤血球細胞の産生を刺激するための放射線照射／化学療法と
の併用に有用である。顆粒球および単球／マクロファージなどの骨髄細胞の成長
または増殖を支持するタンパク質（即ち、従来のＣＳＦ活性）は、例えば、結果
として生じる骨髄抑制（ｍｙｅｌｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）予防するかまたは
治療するための化学療法との組み合わせにおいて有用であり得る。巨核細胞の成
長および増殖、すなわち血小板の成長および増殖を支持するタンパク質は、血小
板減少症などの様々な血小板異常の防止または治療を可能にし、一般に、血小板
輸注の代わりまたは補助に使用することができる。従って、上記の造血細胞のい
くつかおよび全てに成熟することができる造血幹細胞の成長および増殖を支持す
るタンパク質は、様々な幹細胞異常（通常、移植で治療されるものなど、例えば
、再生不良性貧血および発作性夜間血色素尿症が挙げられるが、それらに限定さ
れない）において、ならびに正常細胞または遺伝子治療のために遺伝子操作され
た細胞として、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ（骨髄移植との組み合わせ
かまたは末梢前駆細胞移植（同種または異種））のいずれかで放射線照射／化学
療法後の幹細胞画分の増殖に治療上有用である。あるいは、以下に詳細に記載さ
れるように、造血調節活性を有するタンパク質をコードする遺伝子またはそのよ
うなタンパク質の発現を調節する核酸を適切な宿主細胞に導入し、所望する通り
に該タンパク質の発現を増加または減少することができる。

【０２５８】実施例３５ 組織成長の調節を対象とした伸長ｃＤＮＡまたはその一部から発現されるタンパ ク質のアッセイ 伸長ｃＤＮＡまたはその一部によりコードされるタンパク質は、組織の成長に
対するそれらの効果についても評価することができる。そのような活性に対する
多くのアッセイが当業者によく知られており、国際特許公開ＷＯ９５／１６０３
５号、国際特許公開ＷＯ９５／０５８４６号、および国際特許公開ＷＯ９１／０
７４９１号（これらは本明細書において参考として援用される）に開示されてい
るアッセイが挙げられる。

【０２５９】 創傷治癒活性のためのアッセイとしては、Ｗｉｎｔｅｒ， Ｅｐｉｄｅｒｍａ
ｌ Ｗｏｕｎｄ Ｈｅａｌｉｎｇ、７１〜１１２頁、ＭａｉｂａｃｈおよびＲｏ
ｖｅｅ編、Ｙｅａｒ Ｂｏｏｋ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉ
ｎｃ．， Ｃｈｉｃａｇｏに記載のアッセイを、ＥａｇｌｓｔｅｉｎおよびＭｅ
ｒｔｚ， Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ．７１：３８２-８４， １９７８（これは本明細書において参考として援用される）において改変したア
ッセイが挙げられるが、これに限定される訳ではない。

【０２６０】 次いで、組織の成長の調節に関与するタンパク質を医薬として処方し、組織成
長の調節が有益である臨床症状を治療するために使用することができる。例えば
、本発明の５’ＥＳＴから誘導される伸長ｃＤＮＡによりコ-ドされるタンパク 質はまた、骨、軟骨、腱、靭帯および／または神経組織の成長または再生ならび
に創傷の治癒および組織の修復および置換に使用される組成物、ならびに火傷、
切開および潰瘍の治療に有用であり得る。

【０２６１】 本発明の５’ＥＳＴから誘導される伸長ｃＤＮＡによりコ-ドされるタンパク 質は、骨が正常に形成されない環境において軟骨および／または骨の成長を誘導
するため、ヒトおよび他の動物における骨折および軟骨の損傷または欠損の治癒
に適用性を有する。本発明のタンパク質を用いるそのような調製物は、閉鎖骨折
および開放骨折の整復ならびに人工関節の固定の改善において予防的用途を有し
得る。骨形成剤によって誘導されるde novoでの骨合成は、先天性、外傷誘導性、 または腫瘍学的切除誘導性脳顔面頭蓋欠損の修復に役立ち、また美容整形外科に
おいても有用である。

【０２６２】 本発明のタンパク質は、歯周病の治療および他の歯修復過程においても使用す
ることができる。そのような薬剤は、骨形成細胞を引き寄せる環境を提供するか
、骨形成細胞の増殖を刺激するか、または骨形成前駆細胞の分化を誘導すること
ができる。本発明のタンパク質はまた、例えば、骨および／または軟骨修復の刺
激を介するか、あるいは炎症または炎症過程によって介在される組織破壊の過程
（コラゲナーゼ活性、破骨細胞活性など）を阻止することによる、骨粗しょう症
または変形性関節症の治療にも有用である。

【０２６３】 本発明の５’ＥＳＴから誘導される伸長ｃＤＮＡによりコードされるタンパク
質に帰すことができる組織再生活性のもう１つのカテゴリーは、腱／靭帯形成で
ある。本発明の５’ＥＳＴから誘導される伸長ｃＤＮＡによりコードされるタン
パク質は、腱／靭帯様組織または他の組織が通常は形成されない環境でのそのよ
うな組織の形成を誘導し、ヒトおよび他の動物における腱または靭帯の断裂、変
形および他の腱または靭帯欠損の治癒において適用性を有する。腱／靭帯様組織
を誘導するタンパク質を用いるそのような調製物は、腱または靭帯組織に対する
損傷の防止、ならびに骨または他の組織に対する腱または靭帯固定の改善、およ
び腱または靭帯組織に対する欠損の修復において予防的用途を有し得る。本発明
の５’ＥＳＴから誘導される伸長ｃＤＮＡによりコ-ドされる組成物によって誘 導されるde novoでの腱／靭帯様組織形成は、先天性、外傷性または他に由来す る腱または靭帯欠損の修復に役立ち、また腱または靭帯の付着または修復のため
の美容整形外科に有用である。本発明の５’ＥＳＴから誘導される伸長ｃＤＮＡ
によりコードされる組成物は、腱または靭帯形成細胞を引き寄せるか、腱または
靭帯形成細胞の増殖を刺激するか、腱または靭帯形成細胞の前駆細胞の分化を誘
導するか、あるいは組織の修復を引き起こすようにin vivoに戻すためにex vivo
での腱／靭帯細胞または前駆細胞の増殖を誘導する環境を提供する。本発明の組
成物は、腱炎、手根管症候群および他の腱または靭帯欠損の治療にも有用である
。組成物は、当該分野においてキャリアとして周知の適切なマトリックスおよび
／または封鎖剤（sequestering agent）を含んでもよい。

【０２６４】 本発明の５’ＥＳＴから誘導される伸長ｃＤＮＡによりコードされるタンパク
質は、神経細胞の増殖ならびに神経および脳組織の再生、即ち、中枢神経系およ
び末梢神経系の疾患および壊疽、ならびに神経細胞または神経組織の変性、死ま
たは外傷に関与する機械性および外傷性障害の治療にも有用である。より具体的
には、タンパク質を、末梢神経の損傷、末梢性ニューロパシーおよび局限性ニュ
ーロパシーなどの末梢神経系の疾患、ならびにアルツハイマー病、パーキンソン
病、ハンチントン病、筋萎縮側索硬化症、およびシャイ-ドレーガー症候群など の中枢神経系の疾患の治療に使用してもよい。更に、本発明に従って治療され得
る症状としては、脊髄障害、頭部外傷などの機械性および外傷性障害ならびに脳
卒中などの脳血管性疾患などが挙げられる。化学療法または他の医学療法により
生じる末梢性ニューロパシーも、本発明のタンパク質を使用して治療することが
できる。

【０２６５】 本発明のタンパク質はまた、非治癒性創傷のより良好または迅速な閉鎖を促進
するのにも有用であり、該創傷としては、圧迫性潰瘍（pressure ulcers）、血 管不全を伴う潰瘍、外科的および外傷性創傷などが挙げられるが、これらに限定
される訳ではない。 本発明の５’ＥＳＴから誘導される伸長ｃＤＮＡによりコ-ドされるタンパク 質はまた、臓器（例えば、膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、内皮を含む）、筋肉（
平滑筋、骨格筋または心筋）および脈管（脈管内皮を含む）組織などの他の組織
の発生または再生、あるいはそのような組織を構成する細胞の増殖を促進するた
めの活性を示し得ることが予想される。所望される効果の１つは、線維性瘢痕形
成（fibrotic scarring）を阻害または調節することによって、正常な組織の発 生を可能にすることである。本発明のタンパク質はまた、脈管形成活性を示し得
る。

【０２６６】 本発明の５’ＥＳＴから誘導される伸長ｃＤＮＡによりコードされるタンパク
質は、腸の保護または再生および肺または肝繊維症、様々な組織における再灌流
障害、ならびに全身性サイトカイン障害により生じる症状の治療にも有用である
。 本発明の５’ＥＳＴから誘導される伸長ｃＤＮＡによりコードされるタンパク
質は、前駆組織または細胞からの上記組織の分化を促進または阻害すること、ま
たは上記組織の成長を阻害するのにも有用である。 あるいは、以下に詳細に記載のように、組織の成長を調製する活性を有するタ
ンパク質をコードする遺伝子またはそのようなタンパク質の発現を調節する核酸
を適切な宿主細胞に導入し、所望する通りに該タンパク質の発現を増加または減
少させることができる。

【０２６７】実施例３６ 生殖ホルモンの調節を対象とした伸長ｃＤＮＡまたはその一部から発現されるタ ンパク質のアッセイ 伸長ｃＤＮＡまたはその一部によりコードされるタンパク質は、卵胞刺激ホル
モンなどの生殖ホルモンを調節するそれらの能力について評価することもできる
。そのような活性に対する多くのアッセイが当業者によく知られており、以下の
参考文献に開示されているアッセイが挙げられるが、これらは本明細書において
参考として援用される：Ｖａｌｅら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ９１：５６２- ５７２， １９７２；Ｌｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：７７９-７８２， １９８６；Ｖａｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：７７６-７７９， １９８６； Ｍａｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３１８：６５９-６６３， １９８５；Ｆｏｒａ ｇｅら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：３０
９１-３０９５， １９８６， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６．１２章、Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕ
ｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ-Ｉｎｔｅｒｓ ｃｉｅｎｃｅ；Ｔａｕｂら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９５：１３７
０-１３７６， １９９５；Ｌｉｎｄら、ＡＰＭＩＳ １０３：１４０-１４６，
１９９５；Ｍｕｌｌｅｒら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２５：１７
４４-１７４８；Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２：５８６０-
５８６７， １９９４； Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５
３：１７６２-１７６８， １９９４。

【０２６８】 次いで、生殖ホルモンまたは細胞運動の調節物質としての活性を示すそれらの
タンパク質を医薬として処方し、生殖ホルモンの調節が有益な臨床症状を治療す
るのに使用してもよい。例えば、本発明の５’ＥＳＴから誘導される伸長ｃＤＮ
Ａによりコードされるタンパク質はまた、アクチビンまたはインヒビン関連活性
も示し得る。インヒビンは、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出を阻害する能力
を特徴とし、アクチビンはＦＳＨの放出を刺激する能力を特徴とする。従って、
本発明の５’ＥＳＴから誘導される伸長ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質
は、それのみで、またはインヒビンαファミリーのメンバーとのヘテロダイマー
の形で、雌の哺乳動物における生殖能力を減少し、雄の哺乳動物の精子形成を減
少する能力に基づく避妊薬として有用であり得る。十分な量の他のインヒビンを
投与すると、これらの動物において不妊を誘発することができる。あるいは、本
発明のタンパク質は、ホモダイマー、またはインヒビンＢ群の他のタンパク質サ
ブユニットとのヘテロダイマーとして存在し、脳下垂体前葉の細胞からのＦＳＨ
放出を刺激するアクチビン分子の能力に基づく生殖能力誘導療法として有用であ
り得る。例えば、米国特許第４，７９８，８８５号を参照のこと。該参考文献の
開示内容は本明細書において参考として援用される。本発明のタンパク質はまた
、ウシ、ヒツジおよびブタなどの家畜の生存期間中の生殖能力を向上するように
、性的に未成熟な哺乳動物の生殖能力の発生を進めるのに有用である。

【０２６９】 あるいは、以下に詳細に記載のように、生殖ホルモン調節活性を有するタンパ
ク質をコードする遺伝子またはそのようなタンパク質の発現を調節する核酸を適
切な宿主細胞に導入し、所望する通りに該タンパク質の発現を増加または減少さ
せることができる。

【０２７０】実施例３７ 走化性／ケモキネシス活性を対象とした伸長ｃＤＮＡまたはその一部から発現さ れるタンパク質のアッセイ 伸長ｃＤＮＡまたはその一部によりコードされるタンパク質は、走化性／ケモ
キネシス活性について評価することもできる。例えば、本発明の５’ＥＳＴから
誘導される伸長ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質は、例えば、単球、線維
芽細胞、好中球、Ｔ細胞、肥満細胞、好酸球、上皮および／または内皮細胞を含
む哺乳動物細胞に対する走化性またはケモキネシス活性（例えば、ケモカインと
して作用する）を有し得る。走化性およびケモキネシスタンパク質を使用して、
所望の細胞集団を所望の作用部位に移動させるかまたは引き寄せることができる
。走化性およびケモキネシスタンパク質は、組織に対する創傷および他の外傷の
治療、ならびに限局性感染症の治療に特定の利点を提供する。例えば、腫瘍また
は感染部位にリンパ球、単球または好中球を引き寄せると、腫瘍または感染因子
に対する免疫応答を改善することができる。

【０２７１】 タンパク質またはペプチドが直接的または間接的に特定の細胞集団の指令され
た方向づけまたは運動を刺激することができるのであれば、該タンパク質または
ペプチドは該特定の細胞集団に対する走化性活性を有する。好ましくは、タンパ
ク質またはペプチドは細胞の指令された運動を直接刺激する能力を有する。特定
のタンパク質が細胞の集団に対して走化性活性を有するか否かは、細胞走化性に
対する任意の既知のアッセイにおいてそのようなタンパク質またはペプチドを用
いることによって容易に決定することができる。

【０２７２】 本発明のタンパク質の活性は、中でも以下の方法によって測定することができ
る。 走化性活性のためのアッセイ（走化性を誘導または妨げるタンパク質を同定す
るもの）は、細胞が膜を横切る移動を誘導するタンパク質の能力、および１つの
細胞集団のもう１つの細胞集団への付着を誘導するタンパク質の能力を測定する
アッセイからなる。運動および付着のための適切なアッセイとしては、Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｃｏｌｉｇａｎ
、Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、ＳｈｅｖａｃｈおよびＳｔｒｏｂ
ｅｒ編、Ｐｕｂ． Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅ
ｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ-Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，６．１２章：６．１２． １-６．１２．２８；Ｔａｕｂら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．９５：１ ３７０-１３７６， １９９５；Ｌｉｎｄら、ＡＰＭＩＳ １０３：１４０-１４
６， １９９５；Ｍｕｅｌｌｅｒら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２５
：１７４４-１７４８；Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２：５ ８６０-５８６７， １９９４；Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５３：１７６２-１７６８，１９９４に記載のアッセイが挙げられるが，そ れらに限定される訳ではない。

【０２７３】実施例３８ 血液凝固の調節を対象とした伸長ｃＤＮＡまたはその一部から発現されるタンパ ク質のアッセイ 伸長ｃＤＮＡまたはその一部によりコードされるタンパク質は、血液凝固に対
するそれらの効果について評価することもできる。そのような活性に対する多く
のアッセイが当業者によく知られており、以下の参考文献に開示されているアッ
セイが挙げられるが、これらは本明細書において参考として援用される：Ｌｉｎ
ｅｔら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２６：１３１-１４０， １９８６；Ｂｕｒｄｉｃｋら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓ． ４５：４１３
-４１９， １９８７；Ｈｕｍｐｈｒｅｙら、Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ５： ７１-７９， １９９１；Ｓｃｈａｕｂ， Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ ３ ５：４６７-４７４， １９８８。

【０２７４】 次いで、血液凝固の調節に関連するそれらのタンパク質を医薬として処方し、
血液凝固の調節が有益な臨床症状を治療するのに使用してもよい。例えば、本発
明のタンパク質はまた、止血または血栓溶解（thrombolytic）活性を示し得る。
その結果、そのようなタンパク質は、様々な凝固異常（血友病などの遺伝性異常
を含む）の治療において、あるいは外傷、外科または他の原因から生じる創傷の
治療における凝固および他の止血事象を促進するのに有用であると予想される。
本発明のタンパク質はまた、血栓の溶解または血栓形成阻害ならびに血栓形成か
ら生じる症状（心血管の梗塞および中枢神経系血管の梗塞（例えば、脳卒中）な
ど）の予防および治療にも有用であり得る。あるいは、以下に詳細に記載のよう
に、血液凝固活性を有するタンパク質をコードする遺伝子またはそのようなタン
パク質の発現を調節する核酸を適切な宿主細胞に導入し、所望する通りに該タン
パク質の発現を増加または減少させることができる。

【０２７５】実施例３９ 受容体／リガンド相互作用への関与を対象とした伸長ｃＤＮＡまたはその一部か ら発現されるタンパク質のアッセイ 伸長ｃＤＮＡまたはその一部によりコードされるタンパク質は、受容体／リガ
ンド相互作用への関与について評価することもできる。そのような関与に対する
多くのアッセイが当業者によく知られており、以下の参考文献に開示されている
アッセイが挙げられるが、これらは本明細書において参考として援用される：Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、７．７．２
８．１-７．２８．２２章、Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓ ｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ-Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎ ｃｅ；Ｔａｋａｉら、Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ
８４：６８６４-６８６８， １９８７；Ｂｉｅｒｅｒら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍ ｅｄ． １６８：１１４５-１１５６， １９８８；Ｒｏｓｅｎｓｔｅｉｎら、 Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６９：１４９-１６０， １９８９；Ｓｔｏｌｔ ｅｎｂｏｒｇら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １７５：５９-６ ８， １９９４；Ｓｔｉｔｔら、Ｃｅｌｌ ８０：６６１-６７０， １９９５ ；Ｇｙｕｒｉｓら、Ｃｅｌｌ ７５：７９１-８０３， １９９３。

【０２７６】 例えば、本発明の５’ＥＳＴから誘導される伸長ｃＤＮＡによりコードされる
タンパク質は、受容体、受容体リガンドまたは受容体／リガンド相互作用の阻害
剤もしくはアゴニストとしての活性を示す。そのような受容体およびリガンドの
例としては、サイトカイン受容体およびそれらのリガンド、受容体キナーゼおよ
びそれらのリガンド、受容体ホスファターゼおよびそれらのリガンド、細胞-細 胞間相互作用に関与する受容体およびそれらのリガンド（細胞付着分子（セレク
チン、インテグリンおよびそれらのリガンドなど）、および細胞性および体液性
免疫応答の抗原提示、抗原認識および発達に関与する受容体／リガンド対を含む
がそれらに限定されない）が挙げられるが、それらに限定される訳ではない。受
容体およびリガンドは、関連の受容体／リガンド相互作用の潜在的なペプチドま
たは小分子阻害剤のスクリーニングにも有用である。本発明の５’ＥＳＴから誘
導される伸長ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質（受容体およびリガンドの
断片を含むが、それらに限定されない）は、それ自体で受容体／リガンド相互作
用の阻害剤として有用であり得る。あるいは、以下に詳細に記載のように、受容
体／リガンド相互作用に関与するタンパク質をコードする遺伝子またはそのよう
なタンパク質の発現を調節する核酸を適切な宿主細胞に導入し、所望する通りに
該タンパク質の発現を増加または減少させることができる。

【０２７７】実施例４０ 抗炎症活性を対象とした伸長ｃＤＮＡまたはその一部から発現されるタンパク質 のアッセイ 伸長ｃＤＮＡまたはその一部によりコードされるタンパク質は、抗炎症活性に
ついて評価することもできる。抗炎症活性は、炎症応答に関与する細胞に刺激を
与えることによって、細胞-細胞間相互作用（例えば、細胞付着など）を阻害も しくは促進することによって、炎症過程に関与する細胞の走化性を阻害もしくは
促進することによって、細胞溢出を阻害もしくは促進することによって、または
炎症応答をより直接的に阻害もしくは促進する他の因子の産生を刺激もしくは抑
制することによって、達成することができる。そのような活性を示すタンパク質
を使用して、慢性または急性症状を含む炎症症状を治療することができる。該炎
症症状としては、感染に伴う炎症（敗血症性ショック、敗血症または全身性炎症
応答症候群）、虚血性再灌流障害（ischemia-reperfusioninury）、エンドトキ シン死亡率、関節炎、補体介在性超急性拒絶、腎炎、サイトカインまたはケモカ
イン誘導性肺損傷、炎症性腸疾患、クローン病あるいはＴＮＦまたはＩＬ-１な どのサイトカインの過度の産生により生じる疾患が挙げられるが、これらに限定
される訳ではない。本発明のタンパク質は、抗原性物質または材料に対するアナ
フィラキシーおよび過敏症を治療するのにも有用であり得る。あるいは、以下に
詳細に記載のように、抗炎症活性を有するタンパク質をコードする遺伝子または
そのようなタンパク質の発現を調節する核酸を適切な宿主細胞に導入し、所望す
る通りに該タンパク質の発現を増加または減少させることができる。

【０２７８】実施例４１ 腫瘍阻害活性を対象とした伸長ｃＤＮＡまたはその一部から発現されるタンパク 質のアッセイ 伸長ｃＤＮＡまたはその一部によりコードされるタンパク質は、腫瘍阻害活性
について評価することもできる。腫瘍の免疫学的治療または予防についての上記
の活性に加えて、本発明のタンパク質は他の抗腫瘍活性を示し得る。タンパク質
は、腫瘍の成長を（例えば、ＡＤＣＣを介して）直接的または間接的に阻害する
ことができる。タンパク質は、腫瘍組織または腫瘍前駆組織に対して作用するこ
とによって、（例えば、血管新生を阻害することによって）腫瘍の成長を支える
のに必要な組織の形成を阻害することによって、腫瘍の成長を阻害する他の因子
、薬剤または細胞型の産生を引き起こすことによって、あるいは腫瘍の成長を促
進する因子、薬剤または細胞型を抑制するか、消失させるかまたは阻害すること
によって、該タンパク質の腫瘍阻害活性を示し得る。あるいは、以下に詳細に記
載のように、腫瘍阻害活性を有するタンパク質をコードする遺伝子またはそのよ
うなタンパク質の発現を調節する核酸を適切な宿主細胞に導入し、所望する通り
に該タンパク質の発現を増加または減少させることができる。

【０２７９】 本発明のタンパク質はまた、以下の更なる活性または効果の１つ以上を示すこ
ともできる：感染因子の増加、感染または機能を阻害すること、あるいは感染因
子を死滅すること（該感染因子としては、細菌、ウイルス、真菌および他の寄生
物が挙げられるが、これらに限定されない）；身体の特徴に影響を及ぼす（抑制
するかまたは増強する）こと（該身体の特徴としては、身長、体重、毛髪の色、
眼の色、皮膚、体脂肪率（fat to lean ratio）もしくは他の組織色素沈着、ま たは臓器または身体部分のサイズまたは形状（例えば、胸部の増大または縮小、
骨の形態または形状の変化など）が挙げられるが、これらに限定されない）；バ
イオリズムもしくはサーカディアンリズムまたはリズムに影響を及ぼすこと；雄
または雌被験体の生殖能力に影響を及ぼすこと；食事から摂取される脂肪、脂質
、タンパク質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、補因子あるいは他の栄養因子ま
たは成分の代謝、異化作用、同化作用、プロセシング、利用、貯蔵または排泄に
影響を及ぼすこと；行動特性に影響を及ぼすこと（該行動特性としては、食欲、
性欲、ストレス、認識（認識障害を含む）、うつ状態（うつ病を含む）および暴
力的行動が挙げられるが、これらに限定されない）；鎮痛効果または他の疼痛抑
制効果をもたらすこと；造血系列以外の胚性幹細胞の分化および増加を促進する
こと；体液性または内分泌活性；酵素の場合、酵素の欠乏を補正し、欠乏関連疾
患を治療すること；過増殖異常（例えば、乾癬など）の治療；免疫グロブリン様
活性（例えば、抗原または補体への結合能など）；ならびにワクチン組成物中の
抗原として作用して、そのようなタンパク質またはもう１つの材料またはそのよ
うなタンパク質と交差反応を呈するものに対して免疫応答を惹起する能力。ある
いは、以下に詳細に記載のように、上記の活性のいずれかに関与するタンパク質
をコードする遺伝子、またはそのようなタンパク質の発現を調節する核酸を適切
な宿主細胞に導入し、所望する通りに該タンパク質の発現を増加または減少させ
ることができる。

【０２８０】実施例４２ 伸長ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドと相互作用するタンパク質の同定 ５’ＥＳＴまたはそのフラグメントから誘導されるｃＤＮＡによりコードされ
るポリペプチドと相互作用するタンパク質（例えば、レセプタータンパク質）は
、Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ Ｔｗｏ Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ２（カタログ
番号Ｋ１６０４−１、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などのツーハイブリッドシステムを使
用して同定することができる。キットに添付されている取扱説明書（参照により
本明細書に組み入れる）に記載のように、５’ＥＳＴまたはそのフラグメントか
ら誘導されるｃＤＮＡを、それらが酵母の転写アクチベーターＧＡＬ４のＤＮＡ
結合ドメインをコードするＤＮＡと共にインフレームに存在するように、発現ベ
クターに挿入する。伸長ｃＤＮＡまたはその一部によりコードされるポリペプチ
ドと相互作用し得るタンパク質をコードするｃＤＮＡライブラリー中のｃＤＮＡ
を、それらがＧＡＬ４の活性化ドメインをコードするＤＮＡと共にインフレーム
に存在するように第２の発現ベクターに挿入する。２つの発現プラスミドを酵母
に形質転換し、酵母を、それぞれの発現ベクターにおける選択マーカーの発現お
よびＨＩＳ３遺伝子のＧＡＬ４依存性発現を対象に選択する選択培地上でプレー
ト化する。ヒスチジンを欠く培地上で増殖することができる形質転換体を、ＧＡ
Ｌ４依存性ｌａｃＺ発現についてスクリーニングする。ヒスチジン選択およびｌ
ａｃＺアッセイの両方において陽性であるそれらの細胞は、伸長ｃＤＮＡまたは
その一部によりコードされるポリペプチドと相互作用するタンパク質をコードす
るプラスミドを含有する。

【０２８１】 あるいは、伸長ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドと相互作用する分子
を同定するために、Ｌｕｓｔｉｇら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ ２８３：８３−９９， １９９７および米国特許第５，６５４，１５０号
（開示内容は参照により本明細書に組み入れる）に記載の系を使用してもよい。
そのような系では、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写を駆動するプロモーターの下流に
クローニングされた伸長ｃＤＮＡ挿入物を含有するベクターのプールにおいて、
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写反応を実施する。得られるｍＲＮＡのプールをＸｅｎ
ｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ卵母細胞に導入する。次いで、卵母細胞を所望の活性に
ついてアッセイする。

【０２８２】 あるいは、上記のように産生され、プールされたｉｎ ｖｉｔｒｏ転写産物を
ｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳してもよい。所望の活性または既知のポリペプチドとの
相互作用について、プールされたｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳産物をアッセイすること
ができる。

【０２８３】 様々な更なる技術によって、伸長ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドと
相互作用するタンパク質または他の分子を見出すことができる。他の方法では、
伸長ｃＤＮＡまたはその一部によりコードされるポリペプチドを含有するアフィ
ニティーカラムを構築することができる。本方法では場合により、アフィニティ
ーカラムは、伸長ｃＤＮＡまたはその一部によりコードされるタンパク質とグル
タチオンＳ−トランスフェラーゼとが融合したキメラタンパク質を含有する。細
胞タンパク質の混合物または上記の発現されたタンパク質のプールをアフィニテ
ィーカラムに適用する。次いで、カラムに付着したポリペプチドと相互作用する
タンパク質を単離し、Ｒａｍｕｎｓｅｎら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
１８：５８８−５９８， １９９７に記載のように２−Ｄ電気泳動ゲル上で分析
することができる。該参考文献の開示内容は、参照により本明細書に組み入れる
。あるいは、アフィニティーカラム上に保持されるタンパク質を、電気泳動に基
づく方法によって精製し、配列を決定することができる。同じ方法を用いて抗体
を単離するか、ファージディスプレー産物をスクリーニングするか、またはファ
ージディスプレイーヒト抗体をスクリーニングすることができる。

【０２８４】 ＥｄｗａｒｄｓおよびＬｅａｔｈｅｒｂａｒｒｏｗ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４６：１−６， １９９７に記載のように、光学
的バイオセンサーを使用しても、伸長ｃＤＮＡまたはその一部によりコードされ
るポリペプチドと相互作用するタンパク質をスクリーニングすることができる。
該参考文献の開示内容は、参照により本明細書に組み入れる。本方法の主な利点
は、タンパク質と他方の相互作用分子との間の会合比を決定することができるこ
とである。従って、高いまたは低い会合比の相互作用分子を特異的に選択するこ
とが可能である。典型的には、（カルボキシメチルデキストランマトリックスを
介して）標的分子をセンサー表面に結合し、試験分子のサンプルを標的分子に接
触させて配置する。試験分子が標的分子に結合すると、屈折率および／または濃
度に変化が生じる。バイオセンサーによってこの変化を検出する。但し、この変
化は、（センサー表面から数百ナノメートル延長した）一時的な場において生じ
る。これらのスクリーニングアッセイにおいて、標的分子は、伸長ｃＤＮＡまた
はその一部によりコードされるポリペプチドの１つであり得、試験サンプルは、
組織または細胞から抽出されたタンパク質の集合、発現されたタンパク質のプー
ル、コンビナトリアルペプチドおよび／または化学ライブラリー、あるいはファ
ージによってディスプレーされたペプチド群であり得る。試験タンパク質が抽出
される組織または細胞は、任意の種を起源とすることができる。 他の方法では、標的タンパク質は固定化され、試験集団は伸長ｃＤＮＡまたは
その一部によりコードされる独特なポリペプチドの集合である。

【０２８５】 伸長ｃＤＮＡまたはその一部によりコードされるタンパク質と薬物との間の相
互作用を研究するために、微小透析法を、Ｗａｎｇら、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ
ｐｈｉａ ４４：２０５−２０８， １９９７に記載のＨＰＬＣ法またはＢｕｓ
ｃｈら、Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． ７７７：３１１−３２８， １９９７
に記載のアフィニティーキャピラリー電気泳動法と組み合わせて使用することが
できる。該参考文献の開示内容は、参照により本明細書に組み入れる。

【０２８６】 上記で具体的に列挙した活性に加えて多くの活性について、伸長ｃＤＮＡまた
はその一部から発現されるタンパク質をアッセイすることができることが、当業
者には理解されるであろう。例えば、発現したタンパク質を、炎症、腫瘍増殖ま
たは転移、感染、あるいは他の臨床症状の調節及び制御を包含する適用について
評価することができる。更に、伸長ｃＤＮＡまたはその一部から発現されるタン
パク質は、栄養物質または化粧物質として有用であり得る。

【０２８７】 ｃＤＮＡまたはその一部から発現されるタンパク質を使用して、以下の実施例
４０に記載のように、発現されたタンパク質またはそのフラグメントに特異的に
結合可能な抗体を作製することができる。抗体は、５’ＥＳＴから誘導されるｃ
ＤＮＡによりコードされる全長タンパク質、５’ＥＳＴから誘導されるｃＤＮＡ
によりコードされる成熟タンパク質（即ち、シグナルペプチドの切断によって生
じるタンパク質）、または５’ＥＳＴから誘導されるｃＤＮＡによりコードされ
るシグナルペプチドに結合可能であり得る。あるいは、抗体は、上記のｃＤＮＡ
によりコードされるタンパク質の少なくとも１０個のアミノ酸のフラグメントに
結合可能であり得る。実施態様によっては、抗体は、上記のｃＤＮＡによりコー
ドされるタンパク質の少なくとも１５個のアミノ酸のフラグメントに結合可能で
あり得る。また他の実施態様によっては、抗体は、伸長ｃＤＮＡから発現される
タンパク質の少なくとも２５個のアミノ酸のフラグメントに結合可能であり得、
該フラグメントは、上記のｃＤＮＡによりコードされるタンパク質の少なくとも
２５個のアミノ酸を含む。更なる実施態様において、抗体は、上記のｃＤＮＡに
よりコードされるタンパク質の少なくとも４０個のアミノ酸のフラグメントに結
合可能であり得る。

【０２８８】実施例４３ ヒトタンパク質に対する抗体の産生 実質的に純粋なタンパク質またはポリペプチドを、実施例３０に記載のように
トランスフェクトした細胞または形質転換した細胞から単離する。例えば、Ａｍ
ｉｃｏｎろ過装置上で数μｇ／ｍｌのレベルまで濃縮することによって、最終調
製物のタンパク質の濃度を調整する。次いで、タンパク質に対するモノクローナ
ルまたはポリクローナル抗体を、以下のように調製することができる。

【０２８９】１．ハイブリドーマ融合体によるモノクローナル抗体の産生 記載のように同定および単離される任意のペプチドのエピトープに対するモノ
クローナル抗体を、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２５
６：４９５， １９７５の古典的方法またはそれから由来する方法に従って、マ
ウスのハイブリドーマから調製することができる。簡単に説明すると、数週間の
間、マウスに、数ミリグラムの選択されたタンパク質または該タンパク質に由来
するペプチドを反復的に接種する。次いで、マウスを屠殺し、抗体を産生する脾
臓細胞を単離する。脾臓細胞を、ポリエチレングリコールによって、マウスのミ
エローマ細胞と融合し、アミノプテリンを含む選択培地（ＨＡＴ培地）上の系の
増殖によって融合していない過度の細胞を破壊する。首尾よく融合した細胞を希
釈して、希釈物のアリコートをマイクロタイタープレートのウェルに配置し、こ
こで培養物の増殖が継続される。本来Ｅｎｇｖａｌｌ， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ． ７０：４１９， １９８０（この開示内容は、参照により本明細書に
組み入れる）に記載のＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイ手順及びそれから由来す
る方法により、ウェルの上清液中の抗体を検出することによって、抗体産生クロ
ーンを同定する。選択した陽性クローンを培養し、使用のためにそれらのモノク
ローナル抗体産物を回収することができる。モノクローナル抗体産生の詳細な手
順については、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２１−２
節に記載されている。該参考文献の開示内容は、参照により本明細書に組み入れ
る。

【０２９０】２．免疫化によるポリクローナル抗体の産性 適切な動物を、修飾されていないかまたは免疫原性を増強するために修飾する
ことができる発現されたタンパク質またはそれから誘導されるペプチドで免疫す
ることによって、単一のタンパク質の異種エピトープに対する抗体を含有するポ
リクローナル抗血清を調製することができる。抗原および宿主種の両方に関連す
る多くの因子が有効なポリクローナル抗体の産生に影響を及ぼす。例えば、小さ
な分子は、他の分子よりも免疫原性が小さい傾向があり、キャリアおよびアジュ
バントの使用が必要な場合がある。また、宿主動物の応答は、接種部位または用
量に依存して変化し、抗原の量が不適切であってもまたは過度であっても抗血清
の力価が低下する。多数の皮内部位に投与された小用量（ｎｇのレベル）の抗原
が最も信頼できるようである。ウサギに対する有効な免疫化プロトコルをＶａｉ
ｔｕｋａｉｔｉｓら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ
． ３３：９８８−９９１（１９７１）に見出すことができる。該参考文献の開
示内容は、参照により本明細書に組み入れる。

【０２９１】 定期的に追加注入することができ、抗血清は、その抗体価が低下し始める時点
で収穫される。抗体価は、例えば、抗体の既知の濃度に対する寒天中の二重免疫
拡散法によって半定量的に測定される。例えば、Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙら、Ｈ
ａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １
９章、Ｄ．Ｗｉｅｒ（編）、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ（１９７３）を参照のこと。該
参考文献の開示内容は、参照により本明細書に組み入れる。抗体のプラトー濃度
は、通常、０．１〜０．２ｍｇ／ｍｌの血清（約１２μＭ）の範囲にある。例え
ば、Ｆｉｓｈｅｒ， Ｄ．Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ、２版（ＲｏｓｅおよびＦｒｉｅｄｍａｎ編）Ａｍｅｒ． Ｓｏｃ．
Ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．（１９
８０）に記載のように、競合結合曲線を調製することによって、抗原に対する抗
血清の親和性が決定される。該参考文献の開示内容は、参照により本明細書に組
み入れる。

【０２９２】 いずれかのプロトコルに従って調製される抗体調製物は、生物学的サンプルに
おいて抗原を有する物質の濃度を決定する定量的イムノアッセイにおいて有用で
ある。それらは、生物学的サンプル中の抗原の存在を同定するために、半定量的
または定量的に使用される。該抗体は、タンパク質を発現する細胞を死滅させる
かまたは身体中のタンパク質のレベルを低下させるための治療用組成物に使用し
てもよい。

【０２９３】Ｖ． ５’ＥＳＴあるいは５’ＥＳＴまたはその一部から得られる配列の試薬と しての使用 本発明の５’ＥＳＴ（あるいはそれから得られるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ
）を、単離手順、診断アッセイ、および法医学手順における試薬として使用する
ことができる。例えば、５’ＥＳＴ（あるいはそれから得られるｃＤＮＡまたは
ゲノムＤＮＡ）由来の配列を検出可能に標識し、該配列にハイブリダイズ可能な
他の配列を単離するためのプローブとして使用してもよい。更に、５’ＥＳＴ（
あるいはそれから得られるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）由来の配列を使用して
、単離、診断、および法医学手順に使用されるＰＣＲプライマーを設計すること
ができる。

【０２９４】１．５’ＥＳＴあるいは５’ＥＳＴまたはその一部から得られる配列の、単離、 診断および法医学的手順における使用

【０２９５】実施例４４ ＰＣＲプライマーの調製およびＤＮＡの増幅 ５’ＥＳＴ配列（あるいはそれから得られるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を
使用して、そのような配列にハイブリダイズし得る核酸をクローニングするため
の単離手順、診断技術および法医学技術を含む様々な適用のためのＰＣＲプライ
マーを調製することができる。ＰＣＲプライマーは少なくとも１０塩基、好まし
くは少なくとも１２、１５、または１７塩基の長さである。より好ましくは、Ｐ
ＣＲプライマーは、少なくとも２０〜３０塩基の長さである。いくつかの実施態
様において、ＰＣＲプライマーは３０塩基を超える長さであってもよい。プライ
マー対は、融点がほぼ同じであるように、ほぼ同じＧ／Ｃ比を有する。様々なＰ
ＣＲ技術が当業者によく知られている。ＰＣＲ技術の概要については、Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
， Ｗｈｉｔｅ編、Ｍｏｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ ６７：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ １９９７を参照のこと
。該参考文献の開示内容は、参照により本明細書に組み入れる。これらのＰＣＲ
手順のそれぞれにおいて、増幅しようとする核酸配列のそれぞれの側に対するＰ
ＣＲプライマーを、ｄＮＴＰおよびＴａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、
またはＶｅｎｔポリメラーゼなどの耐熱性ポリメラーゼと共に適切に調製された
核酸サンプルに添加する。サンプル中の核酸を変性し、ＰＣＲプライマーを、サ
ンプル中の相補的な核酸配列に特異的にハイブリダイズさせる。ハイブリダイズ
したプライマーが伸張される。その後、変性、ハイブリダイゼーションおよび伸
張の別のサイクルが開始する。サイクルを複数回反復して、プライマー部位間の
核酸配列を含有する増幅されたフラグメントを生成する。

【０２９６】実施例４５ プローブとしての５’ＥＳＴの使用 全長ｃＤＮＡまたはゲノム配列を含む５’ＥＳＴ配列（あるいはそれから得ら
れるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）から誘導されるプローブを、放射性同位体お
よび非放射性標識物を含む、当業者によく知られた検出可能な標識物で標識し、
検出可能なプローブを提供することもできる。検出可能なプローブは、一本鎖ま
たは二本鎖であってもよく、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写、ニックトランスレーション
、またはキナーゼ反応を含む当業者に公知の技術を使用して作製してもよい。標
識されたプローブにハイブリダイズすることができる配列を含有する核酸サンプ
ルを、標識したプローブに接触させる。サンプル中の核酸が二本鎖である場合、
プローブに接触させる前に該核酸を変性してもよい。適用によっては、核酸サン
プルを、ニトロセルロースまたはナイロン膜などの表面上に固定化してもよい。
核酸サンプルは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー、ＲＮＡ、または組織サ
ンプルを含むさまざまな供給源から得られる核酸を含むことができる。

【０２９７】 検出可能なプローブにハイブリダイズすることができる核酸の存在を検出する
ために使用される手順には、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、
ドットブロッティング、コロニーハイブリダイゼーション、およびプラークハイ
ブリダイゼーションなどの周知の技術が含まれる。適用によっては、標識された
プローブにハイブリダイズすることができる核酸を、発現ベクター、シークエン
シングベクター、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ベクターなどのベクターにクロー
ニングして、サンプル中のハイブリダイズ核酸の特徴付けおよび発現を容易にす
ることができる。例えば、そのような技術を使用して、上記の実施例３０に記載
の検出可能なプローブにハイブリダイズすることができるゲノムライブラリーま
たはｃＤＮＡライブラリー中の配列を単離し、クローニングしてもよい。

【０２９８】 上記の実施例４４に記載のように作製されたＰＣＲプライマーは、以下の実施
例４６〜５０に記載のＤＮＡフィンガープリント技術などの法医学分析に使用す
ることもできる。そのような分析は、５’ＥＳＴあるいは５’ＥＳＴを使用して
単離されるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの配列に基づく検出可能なプローブまた
はプライマーを利用することができる。

【０２９９】実施例４６ ＤＮＡの配列決定による法医学的一致 ある例示的方法では、従来の方法によって例えば、毛、精液、血液または皮膚
細胞の法医学的標本からＤＮＡサンプルを単離する。次いで、実施例４４に従っ
て、実施例２５の多くの５’ＥＳＴあるいは上記のように該５’ＥＳＴから単離
されるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに基づくＰＣＲプライマーのパネルを利用し
、法医学的標本から長さ約１００〜２００塩基のＤＮＡを増幅する。対応する配
列は試験被験体から得られる。次いで、標準的な技術を使用して、これらの同定
ＤＮＡのそれぞれについて配列を決定し、サンプルのデータベースを比較するこ
とによって、被験体由来の配列とサンプル由来の配列との間に差異があればこれ
を決定する。被験体のＤＮＡ配列とサンプル由来のＤＮＡ配列との間に統計学的
に有意な差異が認められれば、その結果として同一性が欠如していることが明ら
かにされる。このような同一性の欠如は、例えば、ただ１つの配列によって証明
することができる。一方、同一性を有することは、多数の配列でそれらが全て一
致することによって実証されるべきである。好ましくは、長さが１００塩基の統
計学的に同一な配列を最小でも５０個使用して、被疑体とサンプルとの間の同一
性を証明する。

【０３００】実施例４７ ＤＮＡの配列決定による陽性同定 先の実施例に概略されている技術をより大きな規模で使用して、任意の個体の
独特なフィンガープリント型同定を提供することができる。本技術では、実施例
２５に由来する多くの５’ＥＳＴ配列あるいは該５’ＥＳＴ配列から得られるｃ
ＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ配列からプライマーを調製する。好ましくは、２０〜
５０個の異なるプライマーを使用する。これらのプライマーを使用して、実施例
４４に従い、問題の個体から相当する数のＰＣＲによって作製されたＤＮＡセグ
メントを得る。実施例４６に記載の方法を使用して、これらのＤＮＡセグメント
のそれぞれについて塩基配列を決定する。本手順を介して作製された配列のデー
タベースは、配列が得られた個体を特異に同定する。次いで、後にプライマーの
同じパネルを使用して、組織または他の生物学的標本と個体を絶対的に相関付け
ることができる。

【０３０１】実施例４８ サザンブロットによる法医学的同定 実施例４７の手順を反復して、個体および標本から少なくとも１０個の増幅さ
れた配列を得る。好ましくは、パネルは少なくとも５０個の増幅された配列を含
有する。より好ましくは、パネルは１００個の増幅された配列を含有する。実施
例によっては、パネルは２００個の増幅された配列を含有する。次いで、このＰ
ＣＲによって作製されたＤＮＡを、好ましくは４塩基特異的制限酵素の１つまた
は組み合わせで消化する。そのような酵素は市販されており、当業者に既知であ
る。消化後、得られた遺伝子フラグメントを、アガロースゲル上の複数の二連ウ
ェルでサイズにより分離し、当業者に周知のサザンブロッティング技術を使用し
て、ニトロセルロースに移す。サザンブロッティングの概要については、Ｄａｖ
ｉｓら（Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ， １９８６， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｐｒｅｓｓ６２〜６５頁）を参照のこ
と。該参考文献の開示内容は、参照により本明細書に組み入れる。

【０３０２】 ５’ＥＳＴ（またはそれから得られるｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）あるい
は少なくとも１０塩基のそれらのフラグメントの配列に対して、ニックトランス
レーション、末端標識化などの当該分野において公知の方法を用いて、放射性ま
たは発色性の標識を行い、当該分野において公知の方法（Ｄａｖｉｓら、前掲）
を用いて、サザンブロットにハイブリダイズさせる。好ましくは、プローブは、
５’ＥＳＴ（またはそれから得られるｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）由来の少
なくとも１２、１５、１７個の連続したヌクレオチドを含む。より好ましくは、
プローブは５’ＥＳＴ（またはそれから得られるｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ
）由来の少なくとも２０〜３０個の連続したヌクレオチドを含む。実施態様によ
っては、プローブは、５’ＥＳＴ（またはそれから得られるｃＤＮＡもしくはゲ
ノムＤＮＡ）由来の３０個を超える連続したヌクレオチドを含む。

【０３０３】 好ましくは、少なくとも５〜１０個のこれらの標識されたプローブを使用し、
より好ましくは少なくとも約２０または３０個を使用して特異なパターンを提供
する。５’ＥＳＴ（またはそれから得られるｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）の
大きなサンプルのハイブリダイゼーションから出現する得られたバンドは、特異
な同定物となる。制限酵素切断は全ての個体に対して異なるため、サザンブロッ
ト上のバンドのパターンも特異である。５’ＥＳＴ（またはそれから得られるｃ
ＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）の数が増加すると、同定において統計学的により
高いレベルの信頼度が得られる。何故なら、同定のために使用されるバンドの組
の数が増加するからである。

【０３０４】実施例４９ ドットブロット同定法 本明細書において開示される５’ＥＳＴ配列を使用して個体を同定するための
もう１つの技術は、ドットハイブリダイゼーション技術を利用する。 同定しようとする被験体の核からゲノムＤＮＡを単離する。５’ＥＳＴまたは
ｃＤＮＡもしくはそれから得られるゲノム由来の少なくとも１０個、好ましくは
５０個のＤＮＡ配列に相当する約３０ｂｐの長さのオリゴヌクレオチドプローブ
を合成する。プローブを使用して、当業者に既知の条件を介してゲノムＤＮＡに
ハイブリダイズする。ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用
して、オリゴヌクレオチドをＰ³²で末端標識する。減圧ドットブロットマニホー
ルド（ＢｉｏＲａｄ， Ｒｉｃｈｍｏｎｄ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して
、ゲノムＤＮＡをニトロセルロースなどにスポットすることによってドットブロ
ットを作製する。当該分野において公知の技術（Ｄａｖｉｓら、前掲）を用いて
、ゲノムの配列を含有するニトロセルロースフィルターをベーキングまたはＵＶ
によりフィルターに結合させ、プレハイブリダイズし、標識されたプローブでハ
イブリダイズする。³²Ｐ標識ＤＮＡフラグメントを順に成功率の高いストリンジ
ェント条件でハイブリダイズし、３０ｂｐの配列とＤＮＡとの間の最低限の差異
を検出する。塩化テトラメチルアンモニウムは、少数のヌクレオチドのミスマッ
チを含有するクローンを同定するのに有用である（Ｗｏｏｄら、Ｐｒｏｃ． Ｎ
ａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２（６）：１５８５−１５８８，
１９８５）。該参考文献の開示内容は、参照により本明細書に組み入れる。ド
ットの特異なパターンにより、１つの個体ともう１つの個体とが区別される。

【０３０５】 以下の代替的フィンガープリント技術では、５’ＥＳＴ配列（またはそれから
得られるｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）あるいはこれらの配列由来の少なくと
も１０個の連続した塩基を含有するオリゴヌクレオチドを、プローブとして使用
することができる。好ましくは、プローブは、５’ＥＳＴ配列（またはそれから
得られるｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）由来の少なくとも１２、１５、１７個
の連続したヌクレオチドを含む。より好ましくは、プローブは５’ＥＳＴ配列（
またはそれから得られるｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）由来の少なくとも２０
〜３０個の連続したヌクレオチドを含む。実施態様によっては、プローブは、５
’ＥＳＴ（またはそれから得られるｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）由来の少な
くとも３０個を超える連続したヌクレオチドを含む。

【０３０６】 好ましくは、異なる遺伝子由来の配列を有する複数のプローブを代替的フィン
ガープリント技術において使用する。以下の実施例５０は、プローブが５’ＥＳ
Ｔから誘導される代表的代替的フィンガープリント手順を提供する。

【０３０７】実施例５０ 代替的「フィンガープリント」同定法 Ｇｅｎｓｅｔ， Ｐａｒｉｓ， Ｆｒａｎｃｅなどの市販のオリゴヌクレオチ
ドサービスを用いて、多数、例えば、５０，１００、または２００個の５’ＥＳ
Ｔから２０マーのオリゴヌクレオチドを調製する。当業者に周知の技術を用い、
ＤＮＡを対象として試験被験体由来の細胞サンプルを処理する。核酸をＥｃｏＲ
ＩおよびＸｂａＩなどの制限酵素で消化する。消化後、サンプルを電気泳動用ウ
ェルにアプライする。ポリアクリルアミド電気泳動に順応するために当該分野に
おいて既知の手順を改変してもよいが、本実施例では、５μｇのＤＮＡを含むサ
ンプルをウェルにロードし、０．８％のアガロースゲルで分離する。標準的なサ
ザンブロッティング技術を使用して、ゲルをニトロセルロースに移す。

【０３０８】 １０ｎｇのそれぞれのオリゴヌクレオチドをプールして、³²Ｐで末端標識する
。ニトロセルロースをブロッキング溶液でプレハイブリダイズし、標識したプロ
ーブでハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションおよび洗浄後、ニトロセル
ロースフィルターをＸ−Ｏｍａｔ ＡＲ Ｘ線フィルムに暴露する。得られるハ
イブリダイゼーションのパターンはそれぞれの個体について特異である。 本実施例では、更なる正確性または明確性のために使用されるプローブ配列の
数を変更することができることが更に考慮される。 実施例５１に記載のようにサンプルが誘導される組織型または細胞種を同定す
るために、伸長ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質を使用して、実施例３０
および４３に記載の抗体を作製することもできる。

【０３０９】実施例５１ 標識組織特異的抗体による組織型または細胞種の同定 直接的または間接的に検出可能なマーカーに結合した、実施例３０および４３
による抗体調製物によって組織特異的抗原を可視化することによって、特異的な
組織の同定が達成される。選択された標識抗体種は、組織切片、細胞懸濁物、ま
たは組織サンプル由来の可溶性タンパク質抽出物におけるそれらの特異的抗原結
合パートナーに結合して、定量的または半定量的解釈のためのパターンを提供す
る。

【０３１０】 これらの手順のための抗血清は、天然の調製物の効力を超える効力を有さなけ
ればならない。何故なら、抗体は、γグロブリン画分を単離することによって、
例えば、イオン交換クロマトグラフィーまたは硫安分画によってｍｇ／ｍｌレベ
ルに濃縮されるからである。また、最も特異的な抗血清を提供するために、抗体
をマーカーで標識する前に、例えば、不溶性免疫吸着によって、γグロブリン画
分から、例えば、一般的なタンパク質に対する所望されない抗体を除去しなけれ
ばならない。モノクローナル抗血清または異種抗血清のいずれも、いずれの手順
に適切である。

【０３１１】 Ａ． 免疫組織化学技術 上記のように調製した精製された高力価の抗体を、例えば、Ｆｕｄｅｎｂｅｒ
ｇ、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２６章、
３版、Ｌａｎｇｅ， Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， １９８
０、またはＲｏｓｅらＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ
１２章、２版、Ｊｏｈｎ ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１
９８０）（これらの開示内容は本明細書において参考として組み込まれる）に記
載のように検出可能なマーカーに結合する。

【０３１２】 蛍光マーカーであるフルオレセインまたはローダミンのいずれかが好ましいが
、基質との発色反応を支持する西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素で抗体を
標識することもできる。以下に記載のように、第２の工程において組織結合抗体
にマーカーを添加することもできる。あるいは、特異的抗血清抗体をフェリチン
または他の電子高密度粒子で標識し、電子顕微鏡で抗原−抗体複合体に結合した
フェリチンの局在を調べることができる。もう１つのアプローチでは、抗体を例
えば¹²⁵Ｉで標識し、抗体処置調製物を写真乳剤で覆うことによって抗体を検出 する。

【０３１３】 手順を実施するための調製物は、組織型、例えば、脳組織に対して特異的であ
ると同定される単一のタンパク質またはペプチドに対するモノクローナルまたは
ポリクローナル抗体を含むことができるか、あるいはいくつかの抗原性が異なる
組織特異的抗原は、パネル内で、必要であれば独立してまたは混合物で使用する
ことができる。

【０３１４】 一般的な組織学的技術により、免疫組織化学的試験のための組織切片および細
胞懸濁物を調製する。未知の組織および対照の複数のクリオスタット切片（約４
μｍ、未固定）をマウントし、それぞれのスライドを異なる希釈の抗体調製物で
覆った。既知および未知の組織の切片はまた、陽性対照、陰性対照、例えば、前
免疫血清、および非特異的染色に対する対照、例えば、緩衝液を提供するために
調製物で処置されなければならない。 処置された切片を湿式チャンバで３０分間室温でインキュベートし、濯ぎ、次
いで、３０〜４０分間、緩衝液で洗浄する。過度の液を滴り落として除き、マー
カーを展開する。

【０３１５】 組織特異的抗体を第１のインキュベーションで標識しなかった場合、この時点
の該抗体は、２次抗体−抗体反応、例えば、抗血清産生種の免疫グロブリンクラ
スに対するフルオレセインまたは酵素結合抗体、例えば、マウスＩｇＧに対する
フルオレセイン標識抗体を添加することによって標識することができる。そのよ
うな標識血清は市販されている。 上記の手順によって組織において見出される抗原を、組織切片上の色または蛍
光の強度を測定することによって、および適切な標準を用いてシグナルを検量す
ることによって定量することができる。

【０３１６】 Ｂ． 組織特異的可溶性タンパク質の同定 組織特異的タンパク質の可視化および該手順に由来する未知の組織の同定を、
免疫組織化学について記載された標識抗体試薬および検出戦略を使用して行うが
、サンプルは電気泳動技術に従って調製され、検出のために分子量に基づく順序
で組織から抽出されたタンパク質が分布する。 Ｖｉｒｔｉｓ装置を用いて、組織サンプルを均質化する。Ｄｏｕｎｃｅ均質化
または浸透圧溶解により細胞懸濁物を破壊するが、いずれの場合でも、細胞膜を
破壊するのに必要であって当該分野において慣例となっている界面活性剤を使用
する。核、ミクロソーム、および膜フラグメントなどの不溶性の細胞成分を、超
遠心分離によって除去し、必要であれば、可溶性のタンパク質を含有する画分を
濃縮して、分析のために保存する。

【０３１７】 例えば、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９−２節、Ｌｅｄｅｒ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ， １９８６（この開示内容は本明細書において参考として組み込
まれる）に記載の従来のＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動によって、サンプル
中で検出しようとするタンパク質の全分子量範囲を分けられる範囲の量のポリア
クリルアミドゲルを１組のゲルに使用して、可溶性タンパク質のサンプルを個々
のタンパク質種に分ける。構成タンパク質の分子量を見積もる目的で、平行して
サイズマーカーを泳動させる。分析のためのサンプルのサイズは５〜５５μｌの
簡便な容量で、約１〜１００μｇのタンパク質を含有する。ニトロセルロースフ
ィルター紙にブロットすることによって、分けられたタンパク質のそれぞれのア
リコートを移し、この過程では分解のパターンは維持されている。複数のコピー
を調製する。ウエスタンブロット分析として知られる手順については、Ｄａｖｉ
ｓ， Ｌ．ら、前掲、１９−３節に詳細に記載されている。ニトロセルロースブ
ロットの１つの組をクーマシーブルー染料で染色して、抗体に結合したタンパク
質と比較するために全てのタンパク質の組を可視化する。次いで、残りのニトロ
セルロースフィルターを、実施例３０および４３に記載のように調製した組織特
異的タンパク質に対する１以上の特異的抗血清の溶液と共にインキュベートする
。本手順では、上記の手順Ａにおけるように、適切な陽性および陰性サンプルな
らびに試薬対照を泳動する。

【０３１８】 手順ＡおよびＢのいずれにおいても、様々な戦略およびそれらの並べ替えに従
って、検出可能な標識を１次組織抗原−１次抗体複合体に付着させることができ
る。簡潔なアプローチでは、１次特異的抗体を標識することができる。あるいは
、非標識複合体を、標識された２次抗ＩｇＧ抗体に結合させることができる。他
のアプローチでは、１次抗体または２次抗体のいずれかをビオチン分子に結合す
る。該ビオチン分子は、その後の工程において、アビジン結合マーカーと結合す
る。もう１つの戦略によれば、抗体標識または放射性タンパク質Ａは任意のＩｇ
Ｇと結合する特性を有し、最終工程で１次抗体または２次抗体のいずれかと結合
する。

【０３１９】 伸長ｃＤＮＡ配列から同定された遺伝子配列から調製される１つ以上の組織特
異的抗体に結合する組織特異的抗原を、対照組織で見られるレベルを超えるレベ
ルで可視化すると、未知の起源の組織、例えば、法医学的サンプル、または異質
身体部位に転移した分化型腫瘍組織を同定することができる。

【０３２０】 法医学におけるそれらの適用および同定に加えて、５’ＥＳＴ（またはそれか
ら得られるｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）を、染色体の位置に対してマッピン
グすることができる。以下の実施例５２では、５’ＥＳＴを使用するヒト染色体
領域の放射性ハイブリッド（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｈｙｂｒｉｄ）（ＲＨ）マッ
ピングについて記載する。以下の実施例５３では、ヒト染色体上の５’ＥＳＴの
位置のマッピングの代表的手順について記載する。以下の実施例５４では、蛍光
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）による中期染色体上の５’
ＥＳＴのマッピングについて記載する。当業者であれば、実施例５２〜５４の方
法を使用して５’ＥＳＴから得られるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡをそれらの染
色体位置についてマッピングすることができることは理解できるであろう。 ２． 染色体マッピングにおける５’ＥＳＴあるいはそれから得られる配列また
はその一部の使用

【０３２１】実施例５２ ヒトゲノムに対する５’ＥＳＴの放射性ハイブリッドマッピング 放射性ハイブリッド（ＲＨ）マッピングは、体細胞の遺伝学的アプローチであ
り、ヒトゲノムの高解像マッピングに使用することができる。本アプローチでは
、１つ以上のヒト染色体を含有する細胞株に致死的放射線を照射し、それぞれの
染色体を、放射線の用量に依存するサイズを有するフラグメントに切断する。こ
れらのフラグメントを、培養したげっ歯類動物細胞で回収し、ヒトゲノムの異な
る部分を含有するサブクローンを得る。本技術は、Ｂｅｎｈａｍら、Ｇｅｎｏｍ
ｉｃｓ ４：５０９−５１７， １９８９；およびＣｏｘら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２５０：２４５−２５０， １９９０に記載されており、これらの全ての内容は
、本明細書において参考として組み込まれる。サブクローンは無作為的かつ独立
した性質を有するため、任意のヒトゲノムマーカーの効率的なマッピングが可能
である。８０〜１００種の細胞株から単離されたヒトＤＮＡは、５’ＥＳＴを配
列するためのマッピング試薬を提供する。本アプローチでは、マーカー間の切断
の頻度を使用して、距離を測定し、従来のＥＳＴを用いて行われているのと同程
度の細密な解像度のマップを構築することが可能である（Ｓｃｈｕｌｅｒら、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２７４：５４０−５４６， １９９６、本明細書において組み込
まれる）。

【０３２２】 ＲＨマッピングを使用して、成長ホルモン（ＧＨ）およびチミジンキナーゼ（
ＴＫ）の遺伝子が横切るヒト染色体１７ｑ２２〜ｑ２５．３（Ｆｏｓｔｅｒら、
Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３３：１８５−１９２， １９９６）、ゴーリン症候群遺伝
子を囲む領域（Ｏｂｅｒｍａｙｒら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．
４：２４２−２４５， １９９６）、第１２染色体の全短腕に渡る６０個の遺
伝子座（Ｒａｅｙｍａｅｋｅｒｓら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２９：１７０−１７８
， １９９５）、２型神経繊維腫症の遺伝子座を含有するヒト第２２染色体なら
びに第５染色体の長腕上の１３個の遺伝子座（Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎら、Ｇｅｎ
ｏｍｉｃｓ １１：７０１−７０８， １９９１）の高解像全ゲノム放射性ハイ
ブリッドマップが作製されている。

【０３２３】実施例５３ ＰＣＲ技術を使用するヒト染色体に対する５’ＥＳＴのマッピング ＰＣＲに基づく方法論を使用して、５’ＥＳＴ（またはそれから得られるｃＤ
ＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）をヒト染色体に対して割り当てることができる。そ
のようなアプローチでは、５’ＥＳＴ（またはそれから得られるｃＤＮＡもしく
はゲノムＤＮＡ）からオリゴヌクレオチドプライマー対を設計して、イントロン
を介して増幅する可能性を最小限にする。好ましくは、オリゴヌクレオチドプラ
イマーの長さは１８〜２３ｂｐであり、ＰＣＲ増幅のために設計される。既知の
配列からＰＣＲプライマーを作成するのは当業者に周知である。ＰＣＲ技術の概
要については、Ｅｒｌｉｃｈ， ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｐｒｉｎｃ
ｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，
１９９２を参照のこと。該参考文献の開示内容は本明細書において組み込まれる
。

【０３２４】 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてプライマーを使用し、全ヒトゲノム
ＤＮＡからテンプレートを増幅する。ＰＣＲ条件は以下の通りである：６０ｎｇ
のゲノムＤＮＡをＰＣＲのテンプレートとして使用し、８０ｎｇのそれぞれのオ
リゴヌクレオチドプライマー、０．６単位のＴａｑポリメラーゼ、および１μＣ
ｕの³²Ｐ標識デオキシシチジン三リン酸を伴う。ＰＣＲは、マイクロプレートサ
ーモサイクラー（Ｔｅｃｈｎｅ）において、以下の条件で行う：９４℃、１．４
分間；５５℃、２分間；および７２℃、２分間の３０サイクル；更に７２℃で１
０分間の最終伸長。増幅産物を６％ポリアクリルアミドシークエンシング用ゲル
上で分析し、オートラジオグラフィーで可視化した。得られるＰＣＲ産物の長さ
が、プライマーが誘導誘導する伸長ｃＤＮＡにおけるプライマー配列の末端間の
距離と同一であれば、ヒト−げっ歯類動物体細胞ハイブリッドの２つのパネル、
ＢＩＯＳ ＰＣＲａｂｌｅ ＤＮＡ（ＢＩＯＳ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およ
びＮＩＧＭＳヒト−げっ歯類動物体細胞ハイブリッドマッピングパネルナンバー
１（ＮＩＧＭＳ， Ｇａｍｄｅｎ， ＮＪ）由来のＤＮＡテンプレートでＰＣＲ
反応を繰り返す。

【０３２５】 ＰＣＲを使用して、ヒト染色体の規定された組を含有する一連の体細胞雑種細
胞株を、所定の５’ＥＳＴ（またはそれから得られるｃＤＮＡもしくはゲノムＤ
ＮＡ）の存在を対象にスクリーニングする。体細胞ハイブリッドからＤＮＡを単
離し、５’ＥＳＴ（またはそれから得られるｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）由
来のプライマー対を使用するＰＣＲ反応のための開始テンプレートとして使用す
る。５’ＥＳＴ（またはそれから得られるｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）に対
応するヒト遺伝子を含有する染色体を有するそれらの体細胞ハイブリッドのみが
、増幅されたフラグメントを生じる。体細胞ハイブリッドＤＮＡテンプレート由
来のＰＣＲ産物の分離パターンを分析することによって、５’ＥＳＴ（またはそ
れから得られるｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）を染色体に対して割り当てる。
増幅されたフラグメントを生じる全ての細胞ハイブリッドに存在する単一のヒト
ゲノムは、５’ＥＳＴ（またはそれから得られるｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ
）を含有する染色体である。体細胞遺伝子のマッピング実験から生じる技術およ
び分析の概要については、Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ６：４７
５−４８１， １９９０を参照のこと。該参考文献の開示内容は本明細書におい
て組み込まれる。

【０３２６】実施例５４ 蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを用いる染色体に対する伸長５’Ｅ ＳＴのマッピング 蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、所定の染色体の特定の位
置に対して５’ＥＳＴ（またはそれから得られるｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ
）をマッピングすることができる。蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
技術のために使用すべき染色体は、細胞培養物、組織、または全血を含む様々な
供給源から得ることができる。

【０３２７】 好ましい実施態様において、５’ＥＳＴ（またはそれから得られるｃＤＮＡも
しくはゲノムＤＮＡ）の染色体位置は、Ｃｈｅｒｉｆら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ
． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８７：６６３９−６６４３， １
９９０）（この開示内容は本明細書において組み込まれる）に記載のＦＩＳＨに
より得られる。中期の染色体をフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）−刺激血液細胞
供与体から調製する。健常雄由来のＰＨＡ−刺激リンパ球を、ＲＰＭＩ−１６４
０培地で７２時間培養する。同調のため、メトトレキセート（１０μＭ）を１７
時間添加し、続いて、５−ブロモデオキシウリジン（５−ＢｒｄＵ、０．１ｍＭ
）を６時間添加する。細胞を回収する前に、コルセミド（１μｇ／ｍｌ）を最後
の１５分間添加する。細胞を回収し、ＲＰＭＩで洗浄し、ＫＣｌ（７５ｍＭ）の
低張溶液と共に３７℃で１５分間インキュベートし、メタノール：酢酸（３：１
）を３回取り替えて固定する。細胞懸濁物をガラススライド上に滴下し、空気乾
燥する。５’ＥＳＴ（またはそれから得られるｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）
を、製造者（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ）の説明書に従い、ビオチン−１６ｄＵＴＰでニ
ックトランスレーションにより標識し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０カラム（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ， Ｕｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて精製し、沈殿さ
せる。ハイブリダイゼーションの直前に、ＤＮＡのペレットをハイブリダイゼー
ション緩衝液（５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ、１０％硫酸デキストラン、１
ｍｇ／ｍｌ超音波処理サケ精子ＤＮＡ、ｐＨ７）に溶解し、プローブを７０℃で
５〜１０分間変性させる。

【０３２８】 −２０℃に保たれたスライドをＲＮａｓｅ Ａ（１００μｇ／ｍｌ）により３
７℃で１時間処置し、２×ＳＳＣで３回濯いで、エタノール系列で脱水する。染
色体調製物を７０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ中、７０℃で２分間変性させ、次
いで４℃で脱水する。スライドをプロテイナーゼＫ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ中１０μｇ／１００ｍｌ、２ｍＭＣａＣｌ₂）により、３７℃で８分間処置し 、脱水する。プローブを含有するハイブリダイゼーション混合物をスライド上に
配置し、カバーガラスで覆い、ゴム糊で封をして湿式チャンバにおいて３７℃で
１晩インキュベートする。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーショ
ン後の洗浄後、ビオチン化されたプローブをアビジン−ＦＩＴＣで検出し、ビオ
チン化ヤギ抗アビジンおよびアビジン−ＦＩＴＣの更なる層で増幅する。染色体
位置決定のために、前記のように蛍光Ｒバンドを得る（Ｃｈｅｒｉｆら、前掲）
。ＬＥＩＣＡ蛍光顕微鏡（ＤＭＲＸＡ）下でスライドを観察する。染色体をヨウ
化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）で対比染色し、蛍光Ｒバ
ンド染色体の両染色分体（赤色）上に２つの対称性の黄緑色のスポットとしてプ
ローブの蛍光シグナルが出現する。従って、特定の５’ＥＳＴ（またはそれから
得られるｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）は、所定の染色体上の特定の細胞遺伝
子のＲバンドに局在し得る。 一旦、上記の実施例５２〜５４に記載の技術を使用して、５’ＥＳＴ（または
それから得られるｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）が特定の染色体に対して割り
当てられると、それらを利用して、それらが局在する染色体の高解像マップを構
築するかまたはサンプル中の染色体を同定することができる。

【０３２９】実施例５５ 染色体マップを構築または拡大するための５’ＥＳＴの使用 上記のように、染色体マッピングは特定の染色体に所定の特異な配列を割り当
てることが必要である。一旦、特異な配列が所定の染色体にマッピングされると
、該特異な配列は、同じ染色体上に位置する他の特異な配列に対する相対的な順
番が決定する。染色体マッピングに対する１つのアプローチは、伸長ｃＤＮＡ（
またはそれから得られるゲノムＤＮＡ）が得られる生物の染色体由来の数千もの
長い挿入物を有する一連の酵母人工染色体（ＹＡＣ）を利用する。本アプローチ
については、Ｎａｇａｒａｊａら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７：２１
０−２２２， １９９７に記載されている。該参考文献の開示内容は本明細書に
おいて組み込まれる。簡単に説明すると、本アプローチでは、それぞれの染色体
を、重複する片に切断して、ＹＡＣベクターに挿入する。ＰＣＲまたは他の方法
を用いてＹＡＣ挿入物をスクリーニングし、それらが位置を決定しようとする５
’ＥＳＴ（またはそれから得られるｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）を含むかど
うかを決定する。一旦、５’ＥＳＴ（またはそれから得られるｃＤＮＡもしくは
ゲノムＤＮＡ）を含む挿入物が見つかると、該挿入物をＰＣＲまたは他の方法を
用いて分析し、該挿入物が、染色体上に、または５’ＥＳＴ（またはそれから得
られるｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）を誘導した領域内に存在することが知ら
れている他の配列を含有するかどうかを決定する。この過程はＹＡＣライブラリ
ー内のそれぞれの挿入物について反復して、もう１つの既知の染色体マーカーお
よび他の既知の染色体マーカーに対するそれぞれの伸長ｃＤＮＡ（またはそれか
ら得られるゲノムＤＮＡ）の相対的な位置を決定することができる。本方法では
、生物のそれぞれの染色体に沿った多くの特異なマーカーの分布についての高解
像マップを得ることができる。 以下の実施例５６に記載のように、伸長ｃＤＮＡ（またはそれから得られるゲ
ノムＤＮＡ）を使用して、遺伝性疾患または薬物応答などの特定の表現型に関連
する遺伝子を同定することもできる。 ３． 遺伝子同定における５’ＥＳＴあるいはそれから得られる配列またはその
フラグメントの使用

【０３３０】実施例５６ 遺伝性疾患または薬物応答に関連する遺伝子の同定 本実施例は、５’ＥＳＴ（またはそれから得られるｃＤＮＡもしくはゲノムＤ
ＮＡ）と特定の表現型特性との関連性について有用なアプローチを例示する。本
実施例では、特定の５’ＥＳＴ（またはそれから得られるｃＤＮＡもしくはゲノ
ムＤＮＡ）を試験プローブとして使用し、５’ＥＳＴ（またはそれから得られる
ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）と特定の表現型特性との間の関連性について調
べる。

【０３３１】 実施例５２および５３に記載の技術または他の当該分野において公知の技術を
使用して、５’ＥＳＴ（またはそれから得られるｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ
）をヒト染色体上の特定の位置に対してマッピングする。Ａ ｓｅａｒｃｈ ｏ
ｆ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（ＭｃＫｕｓ
ｉｃｋ ｉｎ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ）
（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗｅｌｃｈ Ｍｅｄｉ
ｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙを介してオンラインで入手可能）は、５’ＥＳＴ（また
はそれから得られるｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）を含有するヒト染色体の領
域が、いくつかの公知の遺伝子および遺伝子が同定されていないいくつかの疾患
または表現型を含有する高度の遺伝子富化領域であることを示している。従って
、５’ＥＳＴ（またはそれから得られるｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）に対応
する遺伝子は、これらのそれぞれの遺伝子疾患についての直接的候補となる。

【０３３２】 これらの疾患または表現型を有する患者由来の細胞を単離し、培養で増殖させ
る。５’ＥＳＴ（またはそれから得られるｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）由来
のＰＣＲプライマーを使用して、患者由来のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＤ
ＮＡをスクリーニングする。患者の５’ＥＳＴ（またはそれから得られるｃＤＮ
ＡもしくはゲノムＤＮＡ）が増幅しない場合、該配列は更なる分析によって特定
の疾患と関連性があると見なすことができる。あるいは、ＰＣＲ分析は、サンプ
ルが健常な個体から誘導される場合よりも、サンプルが疾患に関連する表現型を
有する個体から誘導される場合に様々な長さのフラグメントを生じ、このことは
５’ＥＳＴを含有する遺伝子が遺伝子疾患の原因である可能性を示す。 ＶＩ． ベクターの構築するための５’ＥＳＴ（またはそれから得られるｃＤＮ
ＡもしくはゲノムＤＮＡ）の使用

【０３３３】 本発明の５’ＥＳＴ（またはそれから得られるｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ
）を使用して、ベクター内の遺伝子によりコードされるタンパク質の分泌を指令
し得る分泌ベクターを構築することもできる。そのような分泌ベクターは、所望
のタンパク質を精製または富化しなければならないバックグランドのタンパク質
の数を減少することによって、ベクターに挿入された遺伝子によりコードされる
タンパク質の精製または富化を容易にすることができる。例示的分泌ベクターに
ついては、以下の実施例５７に記載する。

【０３３４】１． 分泌ベクターの構築 実施例５７ 分泌ベクターの構築 分泌ベクターは、目的の宿主細胞、組織、または生物において遺伝子の発現を
指令することができるプロモーターを含む。そのようなプロモーターとしては、
ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ヒトサイトメガロウ
イルスプロモーター、および当業者によく知られている他のプロモーターが挙げ
られる。

【０３３５】 ５’ＥＳＴ（またはそれから得られるｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）由来の
シグナル配列は、プロモーターから転写されるｍＲＮＡがシグナルペプチドの翻
訳を指令するように、プロモーターに作動可能に連結している。宿主細胞、組織
、または生物は、５’ＥＳＴ（またはそれから得られるｃＤＮＡもしくはゲノム
ＤＮＡ）のシグナル配列によりコードされるシグナルペプチドを認識する任意の
細胞、組織、または生物であり得る。適切な宿主としては、哺乳動物の細胞、組
織もしくは生物、トリの細胞、組織もしくは生物、昆虫の細胞、組織もしくは生
物、または酵母が挙げられる。

【０３３６】 更に、分泌ベクターは、分泌されるべきタンパク質をコードする遺伝子を挿入
するためのクローニング部位を含む。クローニング部位は、シグナルペプチドが
、挿入された遺伝子によりコードされるタンパク質に融合している融合タンパク
質が、プロモーターより転写されるｍＲＮＡから発現されるように、シグナル配
列と読みが合った挿入遺伝子のクローニングを容易にする。シグナルペプチドは
融合タンパク質の細胞外分泌を指令する。

【０３３７】 分泌ベクターはＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、そして、宿主の染色体に
組み込まれていてもよいし、宿主の染色体外レプリコンとして安定に維持されて
いてもよいし、人工染色体であってもよいし、または宿主内に一過的に存在して
いてもよい。分泌ベクターの用途に適切な多くの核酸骨格が当業者に公知であり
、レトロウイルスベクター、ＳＶ４０ベクター、ウシパピローマウイルスベクタ
ー、酵母組込み型プラスミド、酵母エピソームプラスミド、酵母人工染色体、ヒ
ト人工染色体、Ｐエレメントベクター、バキュロウイルスベクター、または宿主
に一過的に導入され得る細菌プラスミドが挙げられる。

【０３３８】 分泌ベクターはまた、ポリＡが分泌ベクターに挿入される遺伝子の下流に位置
するようにポリＡシグナルを含み得る。

【０３３９】 分泌が所望されるタンパク質をコードする遺伝子を分泌ベクターに挿入した後
、この分泌ベクターは、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレ
クトロポレーション、リポソーム媒介性トランスエフェクション、ウイルス粒子
を用いて、またはむき出しのＤＮＡとして、宿主の細胞、組織または生物に導入
される。次いで、硫安沈殿、免疫沈降、免疫クロマトグラフィー、サイズ排除ク
ロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、およびＨＰＬＣなどの慣用
の技術を使用して、挿入された遺伝子によりコードされるタンパク質を上清より
精製するかまたは濃縮する。あるいは、分泌されたタンパク質は、更なる濃縮を
行わずとも意図する目的のために使用することができるように、十分に濃縮され
たまたは純粋な状態で上清中または宿主の増殖培地中に存在してもよい。

【０３４０】 シグナル配列はまた、遺伝子治療のために設計されたベクターに挿入してもよ
い。そのようなベクターでは、シグナル配列は、プロモーターから転写されるｍ
ＲＮＡがシグナルペプチドをコードするように、プロモーターに作動可能に連結
される。クローニング部位は、シグナルペプチドの下流に配置して、分泌が所望
されるタンパク質をコードする遺伝子が容易にベクターに挿入され、シグナルペ
プチドに融合されるようにする。ベクターは適切な宿主細胞に導入される。プロ
モーターから発現されるタンパク質は細胞外に分泌され、それによって、治療効
果を呈する。

【０３４１】 ５’ＥＳＴを使用して、遺伝子の発現を調節することができる５’ＥＳＴの上
流に位置する配列をクローニングしてもよく、そのような配列としては、プロモ
ーター配列、エンハンサー配列、および転写レベルまたは翻訳レベルに影響を及
ぼし得る他の上流配列が含まれる。同定されてクローニングされたら、これらの
上流の調節配列は、所望の場所的、時間的、発生的または量的様式で挿入遺伝子
の発現を指令するように設計された発現ベクターにおいて使用することができる
。実施例５８では、伸長ｃＤＮＡまたは５’ＥＳＴの上流にある配列をクローニ
ングするための方法について説明する。

【０３４２】２．プロモーター活性または調節活性を有する上流配列の同定 実施例５８ ゲノムＤＮＡ由来の上流配列をクローニングするための伸長ｃＤＮＡまたは５’ ＥＳＴの使用 染色体歩行技術を用い、伸長ｃＤＮＡまたは５’ＥＳＴから誘導される配列を
使用して、相当する遺伝子のプロモータを単離することができる。Ｃｌｏｎｔｅ
ｃｈより販売されているＧｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒ^TMキットを利用する１つの
染色体歩行技術では、５つの完全なゲノムＤＮＡサンプルのそれぞれを、６塩基
の認識部位を有し、かつ平滑末端を生じる異なる制限酵素で消化する。消化後、
オリゴヌクレオチドアダプターを、得られたゲノムＤＮＡ断片の両末端に連結す
る。

【０３４３】 ５つのゲノムＤＮＡライブラリーのそれぞれについて、キットに付属している
外側アダプタープライマーおよび外側遺伝子特異的プライマーを使用して、製造
者の説明書（引用により本明細書に組み入れる）に従って第１のＰＣＲ反応を実
施する。遺伝子特異的プライマーは、目的の伸長ｃＤＮＡまたは５’ＥＳＴに特
異的であるように選択されるべきであり、かつ、ＰＣＲ反応での該プライマーの
使用に適合する融解温度、長さ、および伸長ｃＤＮＡまたは５’ＥＳＴにおける
該プライマー内での位置を有するべきである。それぞれの第１のＰＣＲ反応物は
、５０μｌの全用量中に、５ｎｇのゲノムＤＮＡ、５μｌの１０×Ｔｔｈ反応緩
衝液、０．２ｍＭの各種ｄＮＴＰ、外側アダプタープライマーおよび外側遺伝子
特異的プライマーをそれぞれ０．２μＭ、１．１ｍＭのＭｇ（ＯＡｃ）₂、およ び１μｌのＴｔｈポリメラーゼ５０×ミックスを含有する。第１のＰＣＲ反応の
反応サイクルは以下の通りである：１分間−９４℃／２秒間−９４℃、３分間−
７２℃（７サイクル）／２秒間−９４℃、３分間−６７℃（３２サイクル）／５
分間−６７℃。

【０３４４】 第１のＰＣＲ反応の産物を希釈し、第１のＰＣＲ反応から生じるアンプリコン
の内部に位置するネステッドプライマーの対を用い、製造業者の説明書に従った
第２のＰＣＲ反応の鋳型として使用する。例えば、第１のＰＣＲ反応混合物の５
μｌの反応産物を１８０倍に希釈してもよい。ネステッドプライマーを使用する
こと以外は第１のＰＣＲ反応の組成と同一の組成を有する５０μｌの容量で反応
を行う。第１のネステッドプライマーは、アダプターに特異的であり、Ｇｅｎｏ
ｍｅ Ｗａｌｋｅｒ^TMキットに付属している。第２のネステッドプライマーは、
該プライマーがクローニングしようとする特定の伸長ｃＤＮＡまたは５’ＥＳＴ
に特異的であり、かつ、ＰＣＲ反応における使用に適合する融解温度、長さ、お
よび該伸長ｃＤＮＡまたは５’ＥＳＴ中での位置を有するべきである。第２のＰ
ＣＲ反応の反応パラメータは以下の通りである：１分間−９４℃／２秒間−９４
℃、３分間−７２℃（６サイクル）／２秒間−９４℃、３分間−６７℃（２５サ
イクル）／５分間−６７℃。第２のＰＣＲ反応の産物を標準的な技術を用いて精
製し、クローニングし、配列を決定する。

【０３４５】 あるいは、２種以上の制限酵素を用いることによって、２種以上のヒトゲノム
ＤＮＡライブラリーを構築することができる。消化されたゲノムＤＮＡを、一本
鎖、環状、または鎖状ＤＮＡに変換可能なベクターにクローニングする。伸長ｃ
ＤＮＡまたは５’ＥＳＴ配列由来の少なくとも１５個のヌクレオチドを含むビオ
チン化オリゴヌクレオチドを、一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせる。ビオチン
化オリゴヌクレオチドと伸長ｃＤＮＡまたはＥＳＴ配列を含む一本鎖ＤＮＡとの
ハイブリッドを、上記の実施例２９に記載のように単離する。その後、その伸長
ｃＤＮＡまたはＥＳＴ配列を含有する一本鎖ＤＮＡをビーズから遊離させ、伸長
ｃＤＮＡまたは５’ＥＳＴ配列に特異的なプライマーまたはクローニングベクタ
ーに含まれる配列に対応するプライマーを使用して、二本鎖ＤＮＡに変換する。
得られる二本鎖ＤＮＡを細菌に形質転換する。５’ＥＳＴまたは伸長ｃＤＮＡ配
列を含有するＤＮＡを、コロニーＰＣＲまたはコロニーハイブリダイゼーション
によって同定する。

【０３４６】 上記のように上流ゲノム配列をクローニングし配列決定したら、該上流配列内
の予期されるプロモーターおよび転写開始部位は、伸長ｃＤＮＡまたは５’ＥＳ
Ｔの上流にある配列を、既知の転写開始部位、転写因子結合部位またはプロモー
ター配列を含有するデータベースと比較することによって同定することができる
。

【０３４７】 更に、実施例に記載のようにして、プロモーターレポーターベクターを使用し
て、上流配列内のプロモーターを同定することができる。

【０３４８】実施例５９ クローニングされた上流配列におけるプロモーターの同定 伸長ｃＤＮＡまたは５’ＥＳＴの上流のゲノム配列を、例えばｐＳＥＡＰ−Ｂ
ａｓｉｃ、ｐＳＥＡＰ−Ｅｎｈａｎｃｅｒ、ｐβｇａｌ−Ｂａｓｉｃ、ｐβｇａ
ｌ−Ｅｎｈａｎｃｅｒ、またはＣｌｏｎｔｅｃｈより市販されているｐＥＧＦＰ
−１プロモーターレポーターベクターなどの適切なプロモーターレポーターベク
ターにクローニングする。簡単に説明すると、これらのプロモーターレポーター
ベクターのそれぞれは、分泌型アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、
またはグリーン蛍光タンパク質などの容易にアッセイをすることができるタンパ
ク質をコードするレポーター遺伝子の上流に位置する多重クローニング部位を含
む。伸長ｃＤＮＡまたは５’ＥＳＴの上流の配列を、レポーター遺伝子の上流の
クローニング部位に両方向で挿入し、適切な宿主細胞に導入する。レポーター遺
伝子のレベルをアッセイし、クローニング部位に挿入物がないベクターから得ら
れるレベルと比較する。対照のベクターと比較して、挿入物を含有するベクター
の発現レベルの上昇が認められれば、挿入物にプロモーターが存在することにな
る。必要であれば、上流配列を、弱いプロモーター配列からの転写レベルを増大
させるためのエンハンサーを含有するベクターにクローニングすることもできる
。挿入物を含まないベクターの場合に認められる上記の発現の有意なレベルは、
プロモーター配列が挿入上流配列に存在することを示す。

【０３４９】 プロモーターレポーターベクターのための適切な宿主細胞は、伸長ｃＤＮＡま
たはＥＳＴの発現パターンの上記の判定に基づいて選択することができる。例え
ば、発現パターンの分析から、特定の伸長ｃＤＮＡまたは５’ＥＳＴに対応する
ｍＲＮＡが繊維芽細胞において発現されることが示された場合、プロモーターレ
ポーターベクターをヒト繊維芽細胞系に導入することができる。

【０３５０】 上流ゲノムＤＮＡ内のプロモーター配列は、エキドヌクレアーゼＩＩＩ消化な
どの慣用の技術を使用して、上流ＤＮＡにおいてネステッド欠失を構築すること
によって、更に明確化することができる。得られる欠失断片をプロモーターレポ
ーターベクターに挿入して、その欠失がプロモーター活性を低下させるかまたは
失わせるかどうかを判定することができる。このようにして、プロモーターの境
界を規定することができる。所望であれば、プロモータ内の潜在的な転写因子結
合部位を除去するための部位特異的突然変異誘発もしくはリンカースキャニング
を単独または組合せて使用して、プロモーター内の潜在的な個々の調節部位を同
定してもよい。プロモーターレポーターベクターのクローニング部位に変異を挿
入することによって、転写レベルに対するこれらの変異の効果を決定することが
できる。

【０３５１】実施例６０ プロモーターのクローニングおよび同定 ５’ＥＳＴを用いた上記の実施例５８に記載の方法を用いて、いくつかの遺伝
子の上流の配列を得た。プライマー対ＧＧＧ ＡＡＧ ＡＴＧ ＧＡＧ ＡＴＡ
ＧＴＡ ＴＴＧ ＣＣＴ Ｇ（配列番号２９）およびＣＴＧ ＣＣＡ ＴＧＴ
ＡＣＡ ＴＧＡ ＴＡＧ ＡＧＡ ＧＡＴ ＴＣ（配列番号３０）を使用して
、Ｐ１３Ｈ２（本発明者らによる命名）（配列番号３１）を有するプロモーター
を得た。

【０３５２】 プライマー対ＧＴＡ ＣＣＡ ＧＧＧＧ ＡＣＴ ＧＴＧ ＡＣＣ ＡＴＴ
ＧＣ（配列番号３２）およびＣＴＧ ＴＧＡ ＣＣＡ ＴＴＧ ＣＴＣ ＣＣＡ
ＡＧＡ ＧＡＧ（配列番号３３）を使用して、Ｐ１５Ｂ４（本発明者らによる
命名）（配列番号３４）を有するプロモーターを得た。

【０３５３】 プライマー対ＣＴＧ ＧＧＡ ＴＧＧ ＡＡＧ ＧＣＡ ＣＧＧ ＴＡ（配列
番号３５）およびＧＡＧ ＡＣＣ ＡＣＡ ＣＡＧ ＣＴＡ ＧＡＣ ＡＡ（配
列番号３６）を使用して、Ｐ２９Ｂ６（本発明者らによる命名）（配列番号３７
）を有するプロモーターを得た。

【０３５４】 図４は、単離されたプロモーターの概略図および対応する５’タグでそれらを
アセンブリする方法を示す。コンピュータプログラムＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒ
リリース２．０（１９９６年８月）を使用して、転写因子結合部位または既知の
転写開始部位に類似するモチーフの存在に基づいて、上流配列をスクリーニング
した。

【０３５５】 表ＶＩＩは、これらのプロモーターのそれぞれに存在する転写因子結合部位に
ついて記載している。「マトリックス」と書いた欄は、使用したＭａｔＩｎｓｐ
ｅｃｔｏｒマトリックスの名称を示す。「位置(position)」と書いた欄は、プロ
モーター部位の５’位を示す。配列の番号付けは、ゲノム配列と５’ＥＳＴ配列
とのマッチングにより決定した転写部位から開始する。「方向(orientation)」 と書いた欄は、その部位が見出されたＤＮＡ鎖を示し、＋鎖は、ゲノム配列と５
’ＥＳＴの配列とが一致することで決定されたコード鎖である。「スコア」と書
いた欄は、この部位に対するＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒのスコアを示す。「長さ
」と書いた欄は、部位の長さ（ヌクレオチド単位による）を示す。「配列」と書
いた欄は、見出された部位の配列を示す。

【０３５６】 上記のプロモーター配列を含有するプラスミドを含有する細菌クローンは、先
に示した内部認識番号で本発明者の研究室に現在保存されている。適切な細菌の
クローンのアリコートを適切な培地で増殖させることによって、沈殿物から挿入
物を取り出すことができる。次いで、アルカリ溶解ミニプレップまたは大量アル
カリ溶解プラスミド単離法などの当業者によく知られているプラスミド単離手順
を使用して、プラスミドＤＮＡを単離することができる。所望であれば、塩化セ
シウム勾配上での遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、または陰イオン交
換クロマトグラフィーによって、プラスミドＤＮＡを更に濃縮してもよい。次い
で、当業者によく知られている標準的なクローニング技術を用いて、これらの手
順を用いて得られるプラスミドＤＮＡを操作してもよい。あるいは、５’ＥＳＴ
挿入の両末端で設計したプライマーを用いてＰＣＲを行うことができる。次いで
、当業者によく知られている標準的なクローニング技術を用いて、５’ＥＳＴに
対応するＰＣＲ産物を操作することができる。

【０３５７】 伸長ｃＤＮＡまたは５’ＥＳＴの上流に位置するプロモーターおよび他の調節
配列を使用して、所望の場所的、時間的、発生的または量的様式の発現を指令し
得る発現ベクターを設計することができる。上記の実施例２６に記載の発現分析
の結果を使用して、所望の場所的、時間的、発生的または量的パターンで指令し
得るプロモーターを選択することができる。例えば、筋肉において高レベルの発
現をもたらすプロモーターが望まれる場合、筋肉において高レベルで発現される
ｍＲＮＡから誘導される伸長ｃＤＮＡまたは５’ＥＳＴの上流のプロモーター配
列は、実施例２６に記載の方法で決定されるように、発現ベクターで使用するこ
とができる。

【０３５８】 好ましくは、所望のプロモーターを多重制限部位の付近に配置して、プロモー
ターの上流の所望の挿入物のクローニングを容易にし、それによってプロモータ
ーが挿入遺伝子の発現を駆動することができるようにする。染色体外複製、宿主
染色体への組み込みまたは一過性発現のために設計された通常の核酸骨格にプロ
モーターを挿入することができる。本発明の発現ベクターの適切な骨格としては
、レトロウイルスの骨格、ＳＶ４０またはウシパピローマウイルスなどの真核生
物エピソーム由来の骨格、細菌エピソーム由来の骨格、または人工染色体が挙げ
られる。

【０３５９】 好ましくは、この発現ベクターはまた、該発現ベクターに挿入された遺伝子か
ら転写されるｍＲＮＡのポリアデニル化を指令するための多重制限部位の下流に
あるポリＡシグナルを含む。

【０３６０】 実施例５８〜６０の手順を使用してプロモーター配列を同定した後、以下の実
施例６１に記載するようにして、プロモーターと相互作用するタンパク質を同定
することができる。

【０３６１】実施例６１ プロモーター配列、上流調節配列、またはｍＲＮＡと相互作用するタンパク質の 同定 既知の転写因子結合部位に対する相同性によって、あるいはプロモーター配列
を含有するレポータープラスミドの慣用の変異誘発または欠失分析により、転写
因子に結合しやすいプロモーター領域内の配列を同定することができる。例えば
、アッセイ可能なレポーター遺伝子に作動可能に連結した目的のプロモーター配
列を含有するレポータープラスミド内に欠失を作製することができる。プロモー
ター領域内に様々な欠失を保有するレポータープラスミドを適切な宿主細胞にト
ランスフェクトし、発現レベルに対する欠失の影響をアッセイする。部位特異的
変異、リンカーリンカースキャニング分析、または当業者によく知られている他
の技術を使用して、欠失により発現レベルが低下する領域内で転写因子結合部位
を更に局在化することができる。

【０３６２】 Ｃｌｏｎｔｅｃｈより市販のＭａｔｃｈｍａｋｅｒ Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ（カタログ番号Ｋ１６０３−１）に添付されている説明書 （この開示内容は引用により本明細書に組み込まれる）に記載の系のような１ハ
イブリッド系(one-hybrid system)を使用して、プロモーター内の配列と相互作 用するタンパク質をコードする核酸を同定することができる。簡単に説明すると
、Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍは以下のように して使用する。結合タンパク質を同定することが所望される標的配列を、選択レ
ポーター遺伝子の上流にクローニングし、酵母のゲノムに組み込む。好ましくは
、標的配列の多コピーをタンデムにレポータープラスミドに挿入する。プロモー
ターに結合する能力について評価しようとするｃＤＮＡとＧＡＬ４などの酵母転
写因子の活性化ドメインとの融合物を含むライブラリーを、組み込まれたレポー
ター遺伝子配列を含有する酵母株へ形質転換する。この酵母を選択培地に蒔き、
プロモーター配列に連結した選択マーカーを発現している細胞を選択する。選択
培地上で増殖するコロニーは、標的配列に結合するタンパク質をコードする遺伝
子を含有する。配列を決定することによって、融合タンパク質をコードする遺伝
子内の挿入物を更に特徴付けする。更に、挿入物は、発現ベクターかまたはｉｎ
ｖｉｔｒｏ転写ベクターに挿入してもよい。挿入物によりコードされるポリペ
プチドとプロモーターＤＮＡとの結合は、ゲルシフト分析またはＤＮＡａｓｅ保
護分析などの当業者によく知られている技術によって確認することができる。

【０３６３】ＶＩＩ． 遺伝子治療における５’ＥＳＴ（またはそれから得られるｃＤＮＡも しくはゲノムＤＮＡ）の使用 本発明はまた、以下の実施例６２および６３に記載のアンチセンスおよび三重
らせん戦略を含む遺伝子治療における５’ＥＳＴ（またはそれから得られるｃＤ
ＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）の使用を包含する。アンチセンスアプローチでは、
ｍＲＮＡに相補的な核酸配列を細胞内でｍＲＮＡにハイブリダイズさせることに
よって、該ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の発現を阻止する。アンチセ
ンス配列は、様々な機構を介して遺伝子の発現を妨げることができる。例えば、
アンチセンス配列は、リボソームがｍＲＮＡを翻訳する能力を阻害することがで
きる。あるいは、アンチセンス配列は、核から細胞質へのｍＲＮＡの輸送を阻止
して、翻訳に利用可能なｍＲＮＡの量を制限することができる。アンチセンス配
列が遺伝子発現を抑制し得るもう１つの機構は、ｍＲＮＡのスプライシングを干
渉することによるものである。更にもう１つの戦略では、標的のｍＲＮＡを特異
的に切断し得るリボザイムにアンチセンス核酸を取り込ませることができる。

【０３６４】実施例６２ アンチセンスオリゴヌクレオチドの調製および使用 遺伝子治療において使用すべきアンチセンス核酸分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配
列のいずれであってもよく、５’ＥＳＴ（またはそれから得られるｃＤＮＡもし
くはゲノムＤＮＡ）の配列に相補的な配列を含んでいてもよい。アンチセンス核
酸は、二本鎖の状態でｍＲＮＡの発現を阻害するのに十分安定な細胞内二本鎖を
形成し得るよう、十分な長さおよび融解温度を有するべきである。遺伝子治療の
用途に適切なアンチセンス核酸を設計するための方法については、Ｇｒｅｅｎら
、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５５：５６９−５９７，１９８６；
およびＩｚａｎｔおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ、Ｃｅｌｌ３６：１００７−１０１
５，１９８４に開示されている。これらの参考文献は本明細書において参考とし
て援用される。

【０３６５】 いくつかの方法では、細胞中で正常に転写される鎖とは反対側の鎖を転写する
ように、プロモーターに対してコード領域の方向を逆にすることによって、タン
パク質をコードするヌクレオチド配列からアンチセンス核酸を得ている。Ｔ７ま
たはＳＰ６ポリメラーゼを使用して転写産物を作製する系などのｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ転写系を用いて、アンチセンス分子を転写することができる。もう１つのアプ
ローチは、アンチセンス配列を含有するＤＮＡを発現ベクターのプロモーターに
機能し得る形で連結することによるｉｎ ｖｉｖｏでのアンチセンス核酸の転写
に関与するものである。

【０３６６】 あるいは、細胞中で正常に転写される鎖に相補的なオリゴヌクレオチドをｉｎ
ｖｉｔｒｏで合成してもよい。従って、アンチセンス核酸は対応するｍＲＮＡ
に相補的であり、ｍＲＮＡにハイブリダイズして二本鎖を作製することができる
。いくつかの実施態様では、アンチセンス配列は、改変された糖リン酸骨格を含
有するため安定性が増し、ＲＮａｓｅ活性に対する該アンチセンス配列の感受性
が低下する。アンチセンス法での使用に適した改変の例については、Ｒｏｓｓｉ
ら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ． ５０（２）：２４５−２５４，１９９
１に記載されており、本明細書において参考として援用される。

【０３６７】 ５’ＥＳＴ（またはそれから得られるｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）の配列
に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの様々な型を使用することができる
。１つの好ましい実施態様では、国際出願であるＰＣＴ ＷＯ９４／２３０２６
号に記載の安定および半安定なアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する。該
参考文献は本明細書において参考として援用される。これらの分子では、３’末
端または３’および５’両末端は、相補的な塩基対間の分子内水素結合で結ばれ
ている。これらの分子はエキソヌクレアーゼの攻撃に更に耐えることができ、従
来のアンチセンスオリゴヌクレオチドに比べて安定性が向上している。

【０３６８】 別の好ましい実施態様では、国際出願ＷＯ９５／０４１４１号に記載の単純ヘ
ルペスウイルＩ型およびＩＩ型に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用
する。該参考文献は本明細書において参考として援用される。

【０３６９】 更に別の好ましい実施態様では、国際出願ＷＯ９６／３１５２３号に記載の共
有結合で架橋されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する。該参考文献は
本明細書において参考として援用される。これらの二本鎖または一本鎖オリゴヌ
クレオチドは、それぞれ１つ以上のオリゴヌクレオチド間またはオリゴヌクレオ
チド内の共有架橋結合を有し、ここで、該結合は、それぞれ、一方の鎖の第一級
アミノ基と他方の鎖のカルボキシル基との間のアミド結合、または同じ鎖の第一
級アミノ基とカルボキシル基との間のアミド結合から成り、第一級アミノ基は、
鎖ヌクレオチドの単糖環の２’位で直接置換されており、カルボキシル基は、他
方の鎖または同じ鎖のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体上に置換されてい
る脂肪族スペーサー基によって担持されている。

【０３７０】 国際出願ＷＯ９２／１８５２２号に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドお
よびオリゴヌクレオチドを使用することができる。該参考文献は本明細書におい
て参考として援用される。これらの分子は分解に対して安定であり、制御タンパ
ク質に結合する少なくとも１つの転写制御認識配列を含有するため、デコイとし
て有効である。これらの分子は、「ヘアピン」構造、「ダンベル」構造、「修飾
されたダンベル」構造、「架橋された」デコイ構造および「ループ」構造を含有
し得る。

【０３７１】 別の好ましい実施態様では、欧州特許出願第０ ５７２ ２８７Ａ２号に記載
の環状二本鎖オリゴヌクレオチドを使用する。該参考文献は本明細書において参
考として援用される。これらの結合型オリゴヌクレオチド「ダンベル」は、転写
因子のための結合部位を含有し、転写因子を封鎖（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒ）するこ
とによって、転写因子の制御下での遺伝子発現を阻害する。

【０３７２】 国際出願ＷＯ９２／１９７３２号に開示されている閉環型アンチセンスオリゴ
ヌクレオチドの使用も考慮される。該参考文献は本明細書において参考として援
用される。これらの分子は遊離の末端を持たないため、従来のオリゴヌクレオチ
ドよりもエキソヌクレアーゼによる分解に対して耐性が高い。これらのオリゴヌ
クレオチドは多機能性であり、標的ｍＲＮＡに隣接していない複数の領域と相互
作用する。

【０３７３】 遺伝子の発現を阻害するのに必要なアンチセンス核酸の適切なレベルは、ｉｎ
ｖｉｔｒｏ発現分析を用いて決定することができる。当該分野において公知の
手順を用いる拡散、注入、感染、トランスフェクションまたはｈ領域介在性移入
により、アンチセンス分子を細胞に導入することができる。例えば、アンチセン
ス核酸を裸のオリゴヌクレオチド、脂質にカプセル化させたオリゴヌクレオチド
、ウイルスタンパク質に封入したオリゴヌクレオチド、または発現ベクターに含
まれるプロモーターに機能し得る形で連結させたオリゴヌクレオチドとして、ア
ンチセンス核酸を身体に導入することができる。発現ベクターは当該分野におい
て公知の様々な発現ベクターのいずれであってもよく、レトロウイルスベクター
またはウイルスベクター、染色体外複製が可能なベクター、または組込みベクタ
ーが挙げられる。ベクターは、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよい。

【０３７４】 アンチセンス分子を、好ましくは１×１０^-10Ｍ〜１×１０^-4Ｍの間の多くの 異なる濃度で細胞サンプルに導入する。適切に遺伝子発現を制御することができ
る最小濃度が同定されれば、その最適化用量がｉｎ ｖｉｖｏでの使用に適切な
用量と解釈される。例えば、培養物の場合の１×１０^-7の阻害濃度は約０．６ｍ
ｇ／ｋｇ体重の用量と解釈される。１００ｍｇ／ｋｇ体重以上に達するオリゴヌ
クレオチドのレベルは、実験動物でオリゴヌクレオチドの毒性を試験すれば可能
である。脊椎動物から細胞を取り出し、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処置
して、脊椎動物に再導入することも更に考慮される。

【０３７５】 アンチセンスオリゴヌクレオチド配列をリボザイム配列に取り込ませ、アンチ
センスを特異的にその標的ｍＲＮＡに結合させてこれを切断し得るようにするこ
とも更に考慮される。リボザイムおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドの技術
的適用については、Ｒｏｓｓｉら（前掲）を参照のこと。

【０３７６】 本発明の好ましい適用では、翻訳に対するアンチセンス阻害の有効性を監視で
きるように、遺伝子によりコードされるポリペプチドを最初に同定する。監視に
はＲＩＡおよびＥＬＩＳＡ、機能アッセイ、または放射性標識などの抗体介在性
試験を含む技術が使用されるが、これらに限定されない。

【０３７７】 本発明の５’ＥＳＴ（またはそれから得られるｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ
）を、細胞内三重らせん形成に基づく遺伝子治療に使用することもできる。三重
らせんオリゴヌクレオチドを使用してゲノムからの転写を阻害する。それらは、
細胞活性の変化を研究するのに特に有用である。何故なら、これは特定の遺伝子
に関連するからである。本発明の５’ＥＳＴ（またはそれから得られるｃＤＮＡ
もしくはゲノムＤＮＡ）または、より好ましくは、それらの配列の一部は、特定
の遺伝子の発現に関連する疾患を有する個体の遺伝子発現を阻害するために使用
することができる。同様に、５’ＥＳＴ配列（またはそれから得られるｃＤＮＡ
もしくはゲノムＤＮＡ）の一部を使用して、細胞内での特定の遺伝子の転写を阻
害する効果を研究することができる。従来は、ホモプリン配列は三重らせんスト
ラテジーに最も有用であると考えられていた。しかし、ホモピリミジン配列も遺
伝子の発現を阻害することができる。そのようなホモピリミジンオリゴヌクレオ
チドは、ホモプリン：ホモピリミジン配列の主要な溝に結合する。従って、５’
ＥＳＴ由来または５’ＥＳＴに相当する遺伝子由来の両タイプの配列は、本発明
の範囲内にあるものとする。

【０３７８】実施例６３ 三重らせんプローブの調製および使用 ５’ＥＳＴ（またはそれから得られるｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）の配列
を走査して、遺伝子発現を阻害するための三重らせんに基づくストラテジーに使
用し得る１０量体〜２０量体のホモピリミジンまたはホモプリンストレッチを同
定する。ホモピリミジンまたはホモプリンストレッチの候補の同定後、候補配列
を含有する様々な量のオリゴヌクレオチドを、標的遺伝子を正常に発現する組織
培養細胞に導入することによって、遺伝子発現の阻害効率を評価する。オリゴヌ
クレオチドは、オリゴヌクレオチド合成装置で調製するか、またはＧＥＮＳＥＴ
，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅなどのオリゴヌクレオチド合成の専門業者より購入
することができる。

【０３７９】 当業者に既知の様々な方法を用いて、オリゴヌクレオチドを細胞に導入するこ
とができ、このような方法としては、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ−デキ
ストラン法、エレクトロポレーション法、リポソーム介在トランスエフェクショ
ン法または自然取り込み法が挙げられるが、それらに限定されない。

【０３８０】 ノーザンブロッティング、ＲＮａｓｅ保護アッセイ、またはＰＣＲに基づくス
トラテジーなどの技術を用いて、処置された細胞を細胞機能の変化または遺伝子
発現の減少についてモニタリングし、オリゴヌクレオチドで処置されている細胞
の標的遺伝子の転写レベルをモニタリングする。該オリゴヌクレオチドが誘導さ
れる伸長ｃＤＮＡに相当する標的遺伝子の、特定の機能に関連している既知の遺
伝子配列に対する相同性に基づいて、モニタリングしようとする細胞機能を予測
する。特に、実施例５６に記載の技術を用いて、伸長ｃＤＮＡが疾患と関連付け
られる場合には、特定の遺伝性疾患を有する個体から誘導される細胞内の異常な
生理活動の存在に基づいて、細胞機能を予測することもできる。

【０３８１】 次いで、実施例６２に記載のように、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの結果に基づいて算
出された用量で、上記の技術および実施例６２に記載の技術を用いて、組織培養
細胞における遺伝子発現を阻害するのに有効なオリゴヌクレオチドをｉｎ ｖｉ
ｖｏで導入することができる。

【０３８２】 いくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチド単位の天然の（β）アノマ
ーをαアノマーで置換し、該オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼに対してより耐
性にすることができる。更に、臭化エチジウムなどの挿入化剤（ｉｎｔｅｒｃａ
ｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）などをαオリゴヌクレオチドの３’末端に結合させ
て、三重らせんを安定化することができる。三重らせん形成に適切なオリゴヌク
レオチドの作製に関する情報については、Ｇｒｉｆｆｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４５：９６７−９７１，１９８９を参照されたい（この参考文献は参照により
本明細書に組み入れる）。

【０３８３】実施例６４ 宿主生物においてコードされるタンパク質を発現させるための、５’ＥＳＴを用 いて得られるｃＤＮＡの使用 本発明の５’ＥＳＴを用いて上述のようにして得られるｃＤＮＡを使用して、
宿主生物においてコードされるタンパク質を発現し、有益な効果を生じることが
できる。そのような手順において、コードされるタンパク質は、宿主生物におい
て一過的に発現させてもよいし、宿主生物において安定的に発現させてもよい。
コードされるタンパク質は、上記の活性のいずれかを有することができる。コー
ドされるタンパク質は宿主生物が欠くタンパク質であってもよいし、あるいは宿
主生物におけるタンパク質の現存のレベルを増大するものであってもよい。

【０３８４】 シグナルペプチドおよび成熟タンパク質をコードする完全長伸長ｃＤＮＡ、ま
たは成熟タンパク質のみをコードする伸長ｃＤＮＡを宿主生物に導入するするこ
とができる。該伸長ｃＤＮＡは、当業者に公知の様々な技術を用いて、宿主生物
に導入することができる。例えば、コードされるタンパク質が宿主生物で発現さ
れ、これにより有益な効果を生じるように、伸長ｃＤＮＡを剥き出しのＤＮＡと
して宿主に注入することができる。

【０３８５】 あるいは、伸長ｃＤＮＡを、宿主生物において活性なプロモーターの下流にお
いて発現ベクター中にクローニングすることができる。発現ベクターは遺伝子治
療での使用のために設計された発現ベクターのいずれであってもよく、このよう
なものとしては、ウイルスまたはレトロウイルスベクターが挙げられる。コード
されるタンパク質が宿主生物において発現され、これにより有益な効果を生じる
ように、発現ベクターを宿主生物に直接導入することができる。他の方法では、
発現ベクターをｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に導入することができる。その後、発現
ベクターを含有する細胞を選択して宿主生物に導入すると、ここで、該細胞はコ
ードされるタンパク質を発現して有益な効果を生じる。

【０３８６】実施例６５ タンパク質を細胞に移入するための５’ＥＳＴまたはそれから得られる配列によ りコードされるシグナルペプチドの使用 ５’ＥＳＴまたは配列番号３８〜３１５から誘導される伸長ｃＤＮＡによりコ
ードされるシグナルペプチドの短いコア疎水性領域（ｈ）を、目的のペプチドま
たはタンパク質、いわゆる積荷を組織培養細胞へ移入するキャリアとして使用す
ることができる（Ｌｉｎら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：１４２２
５−１４２５８， １９９５；Ｄｕら、Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．， ５
１：２３５−２４３， １９９８；Ｒｏｊａｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈ．， １６：３７０−３７５， １９９８）。

【０３８７】 制限されたサイズ（約２５個のアミノ酸まで）の細胞透過性ペプチドを細胞膜
を横切って移送しようとする場合、化学合成を使用して、目的の積荷ペプチドの
Ｃ末端またはＮ末端のいずれかにｈ領域を加えることができる。あるいは、更に
長いペプチドまたはタンパク質を細胞に移入しようとする場合、当業者によく知
られている技術を用いて、核酸に遺伝子操作を施し、ｈ領域をコードする伸長ｃ
ＤＮＡ配列を積荷ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’または３’末端に
結合することができる。次いで、そのように遺伝子操作された核酸を、適切な細
胞にトランスフェクション後、得られる細胞透過性ポリペプチドを産生するため
の従来の技術を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで
翻訳する。次いで、適切な宿主細胞を簡単に細胞透過性ポリペプチドと共にイン
キュベートし、次に膜を横切って輸送される。

【０３８８】 本方法は、多様な細胞内機能および細胞プロセスを研究するために適用するこ
とができる。例えば、本方法は、細胞内タンパク質の機能関連ドメインを探査し
たり、シグナル伝達経路に関連のタンパク質−タンパク質相互作用を調べるのに
使用されている（Ｌｉｎら、前掲；Ｌｉｎら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．
２７１：５３０５−５３０８， １９９６；Ｒｏｊａｓら、Ｊ． Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．， ２７１：２７４５６−２７４６１， １９９６；Ｌｉｕら、Ｐｒ
ｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９３： １１８１９−
１１８２４， １９９６； Ｒｏｊａｓら、Ｂｉｏｃｈ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ２３４：６７５−６８０， １９９７）。

【０３８９】 そのような技術は、治療効果を生じるタンパク質を移入するための細胞医療に
使用することができる。例えば、患者から単離された細胞を、移入された治療用
タンパク質で処置し、次いで、宿主生物に再導入することができる。 あるいは、本発明のシグナルペプチドのｈ領域は、核の局在化シグナルと組み
合わせて使用され得、核酸を細胞の核に送達することができる。そのようなオリ
ゴヌクレオチドは、標的細胞ＲＮＡのプロセシングおよび／または成熟化を阻害
するために、実施例６２および６３に記載のように、三重らせんを形成するため
に設計されるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドであっ
てもよい。

【０３９０】 上記のように、本発明の５’ＥＳＴｃＤＮＡまたはその一部は、さまざまな目
的のために使用することができる。ポリヌクレオチドを使用して、分析、特徴付
けまたは治療用途のための組換えタンパク質を；対応するタンパク質を（構成的
かまたは組織分化または発生の特定の段階かまたは疾患状態のいずれかにおいて
）好適に発現させる組織のためのマーカーとして；サザンゲル上の分子量マーカ
ーとして；染色体を同定するかまたは関連遺伝子の位置をマッピングするための
染色体マーカーまたはタグ（標識される場合）として；患者の内在性ＤＮＡを比
較して、潜在的遺伝子異常を同定するために；ハイブリダイズし、それにより新
規の関連ＤＮＡ配列を発見するためのプローブとして；遺伝子フィンガープリン
トのためのＰＣＲプライマーを得るための情報の供給源として；「遺伝子チップ
」または他の支持体に付着するためのオリゴマーを選択し、作製するために（発
現パターンを調べることを含む）；ＤＮＡ免疫化技術を用いて、抗タンパク質抗
体を惹起するために；および抗ＤＮＡ抗体を惹起するかまたはもう１つの免疫応
答を引き出すための抗原として、発現させることができる。ポリヌクレオチドが
（例えば、レセプター−リガンド相互作用などにおいて）別のタンパク質に結合
するかまたは潜在的に結合するタンパク質をコードする場合には、該ポリヌクレ
オチドを、結合が生じる他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを同定す
るかまたは結合相互作用の阻害剤を同定するために、相互作用トラップアッセイ
（例えば、Ｇｙｕｒｉｓら、Ｃｅｌｌ ７５：７９１−８０３， １９９３など
に記載のアッセイであって、該参考文献の開示内容は、参照により本明細書に組
み入れる）に使用することができる。

【０３９１】 本発明により提供されるタンパク質またはポリペプチドは、ハイスループット
スクリーニングのための複数のタンパク質のパネルを含む生物学的活性を決定す
るためのアッセイにおいて；抗体を惹起するかまたは別の免疫応答を引き出すた
めに；生物学的液体におけるタンパク質（またはそのレセプター）のレベルを定
量的に決定するために設計されたアッセイにおける試薬（標識された試薬を含む
）；対応するタンパク質を（構成的かまたは組織分化または発生の特定の段階か
または疾患状態のいずれかにおいて）好適に発現させる組織用のマーカーとして
；そして、もちろん、相関関係にあるレセプターまたはリガンドを単離するため
に、同様に使用することができる。タンパク質がもう１つのタンパク質に結合す
るかまたは潜在的に結合する場合、該タンパク質を、結合が生じる他のタンパク
質を同定するかまたは結合相互作用の阻害剤を同定するために使用することがで
きる。これらの結合相互作用に関与するタンパク質は、ペプチドまたは小分子阻
害剤または結合相互作用のアゴニストをスクリーニングするためにも使用するこ
とができる。

【０３９２】 これらの研究有用性のいくつかまたは全ては、研究用製品としての商品される
試薬レベルまたはキット形態にまで開発することが可能である。 上記に列挙された用途を達成するための方法は当業者に周知である。そのよう
な方法を開示している参考文献としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆ
ｒｉｔｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編、１９８９、ならびにＭｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｅｒｇ
ｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ編、１９８７が挙げられるが、これらに限定されない。

【０３９３】 本発明のポリヌクレオチドおよびタンパク質を栄養供給源または補助物として
使用することもできる。そのような使用としては、タンパク質またはアミノ酸補
助物としての使用、炭素源としての使用、窒素源としての使用および炭水化物源
としての使用が挙げられるが、これらに限定されない。そのような場合、本発明
のタンパク質またはポリヌクレオチドを特定の生物の食物に添加することができ
、または個別の固体または液体調製物として、散剤、丸剤、溶液、懸濁液または
カプセルの剤形などで投与することができる。微生物の場合、本発明のタンパク
質またはポリヌクレオチドを、微生物が培養される培地に添加することができる
。

【０３９４】 本発明を特定の好適な実施態様の形態で説明してきたが、本明細書の開示内容
から当業者に明らかである他の実施態様も本発明の範囲内にある。従って、本発
明の範囲は、添付の請求の範囲を参考にすることによってのみ規定されることを
意図している。本明細書に引用された全ての文書は、その全体を参照により本明
細書に組み入れる。

【０３９５】

【表１】

【０３９６】

【表２】

【０３９７】

【表３】

【０３９８】

【表４】

【０３９９】

【表５】

【０４００】

【表６】

【０４０１】

【表７】

【０４０２】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ｍＲＮＡ（これからｃＤＮＡが誘導される）の５’末端を含むように選択され
たｃＤＮＡを取得するための手順を示す。

【図２】 本明細書に記載するカテゴリーの各々における５’ＥＳＴのフォン ヘイジン
スコア（Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ ｓｃｏｒｅ）の分布およびこれらの５’ＥＳ
Ｔがシグナルペプチドをコードする確率を示す。

【図３】 ５’ＥＳＴに隣接する配列を有する伸長ｃＤＮＡをクローニングし、配列決定
するために使用される一般的方法を示す。

【図４】 （シグナルタグ５’ＥＳＴから単離されたプロモーター構造の説明）単離した
プロモーターの模式的説明およびそれらを対応する５‘タグと共にアセンブリー
する方法を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ラクロワ・ブルノ フランス国 エフ−69230サン‐ジェニス ラバル，ルト ド ブルレ，93

Claims (37)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号３８〜３１５のうち１つの配列を含むかまたはそ
   れに相補的な配列を含む、精製または単離された核酸。
2. 【請求項２】 前記核酸が組換え体である、請求項１に記載の核酸。
3. 【請求項３】 配列番号３８〜３１５のうち１つの配列の少なくとも１０
   個の連続する塩基を含むかまたはそれに相補的な配列を含む、精製または単離さ
   れた核酸。
4. 【請求項４】 配列番号３８〜３１５のうち１つ配列の少なくとも１５個
   の連続する塩基を含むかまたはそれに相補的な配列を含む、精製または単離され
   た核酸。
5. 【請求項５】 前記核酸が組換え体である、請求項４に記載の核酸。
6. 【請求項６】 配列番号３８〜３１５のうち１つの配列または配列番号３
   ８〜３１５の配列に相補的な配列のうち１つに対してストリンジェントな条件下
   でハイブリダイズ可能な少なくとも１５塩基からなる精製または単離された核酸
   。
7. 【請求項７】 前記核酸が組換え体である、請求項６に記載の核酸。
8. 【請求項８】 ヒト遺伝子産物をコードする精製または単離された核酸で
   あって、前記ヒト遺伝子産物の一部が配列番号３８〜３１５の配列の１つにより
   コードされる配列を有する、上記核酸。
9. 【請求項９】 配列番号３８〜３１５の１つの配列を有するかまたはそれ
   に相補的な配列を有する、精製または単離された核酸。
10. 【請求項１０】 シグナルペプチドをコードする配列番号３８〜３１５の
    １つのヌクレオチドを含む、精製または単離された核酸。
11. 【請求項１１】 配列番号３８〜３１５の配列の１つによりコードされる
    シグナルペプチドを含む、精製または単離されたポリペプチド。
12. 【請求項１２】 ポリペプチドおよびシグナルペプチドを含む融合タンパ
    ク質をコードするベクターであって、前記ポリペプチドをコードする第２の核酸
    に機能しうる形で連結された配列番号３８〜３１５の配列の１つによりコードさ
    れるシグナルペプチドをコードする第１の核酸を含む、上記ベクター。
13. 【請求項１３】 ポリペプチドの細胞外分泌またはポリペプチドの膜への
    挿入を指令する方法であって、 請求項１２に記載のベクターを取得し、そして 前記ベクターを宿主細胞に導入して、融合タンパク質が宿主細胞の細胞外環境
    に分泌されるかまたは宿主細胞の膜に挿入されるようにする、 各ステップを含んでなる上記方法。
14. 【請求項１４】 ポリペプチドを細胞に移入する方法であって、前記細胞
    に、前記ポリペプチドに機能しうる形で連結された配列番号３８〜３１５の配列
    の１つによりコードされるシグナルペプチドを含む融合タンパク質を接触させる
    ことを含んでなる上記方法。
15. 【請求項１５】 配列番号３８〜３１５の１つによりその一部がコードさ
    れるヒト分泌タンパク質をコードするｃＤＮＡを作製する方法であって、 配列番号３８〜３１５の配列の１つを含むｃＤＮＡを取得し、 前記ｃＤＮＡと、配列番号３８〜３１５の前記配列のうち少なくとも１５個の
    連続するヌクレオチドまたはそれに相補的な配列を含む検出可能なプローブとを
    、前記プローブが前記ｃＤＮＡにハイブリダイズし得る条件下で接触させ、 前記検出可能なプローブにハイブリダイズするｃＤＮＡを同定し、そして 前記検出可能なプローブにハイブリダイズする前記ｃＤＮＡを単離する、 各ステップを含んでなる上記方法。
16. 【請求項１６】 ヒト分泌タンパク質をコードする単離または精製された
    ｃＤＮＡであって、前記ヒト分泌タンパク質が配列番号３８〜３１５の１つによ
    りコードされるタンパク質または少なくとも１０個のアミノ酸からなるそのフラ
    グメントを含み、前記ｃＤＮＡが請求項１５に記載の方法によって得られる、上
    記ｃＤＮＡ。
17. 【請求項１７】 前記ｃＤＮＡが全タンパク質コード配列を含み、その一
    部が配列番号３８〜３１５の配列の１つに含まれている、請求項１６に記載のｃ
    ＤＮＡ。
18. 【請求項１８】 配列番号３８〜３１５の配列の１つを含むｃＤＮＡを作
    製する方法であって、 ヒト細胞由来のｍＲＮＡ分子の集合体と前記ｍＲＮＡのポリＡテイルにハイブ
    リダイズ可能な第１のプライマーとを接触させ、 前記第１のプライマーを前記ポリＡテイルにハイブリダイズさせ、 前記ｍＲＮＡを逆転写して第１のｃＤＮＡ鎖を作製し、 配列番号３８〜３１５のうち１つの配列の少なくとも１５ヌクレオチドを含む
    少なくとも１つのプライマーを用いて、前記第１のｃＤＮＡ鎖に相補的な第２の
    ｃＤＮＡ鎖を作製し、そして 前記第１のｃＤＮＡ鎖および前記第２のｃＤＮＡ鎖を含むｃＤＮＡを単離する
    、 各ステップを含んでなる上記方法。
19. 【請求項１９】 ヒト分泌タンパク質をコードする単離または精製された
    ｃＤＮＡであって、前記ヒト分泌タンパク質が配列番号３８〜３１５の１つによ
    りコードされるタンパク質または少なくとも１０個のアミノ酸からなるそのフラ
    グメントを含み、前記ｃＤＮＡが請求項１８に記載の方法によって得られる、上
    記ｃＤＮＡ。
20. 【請求項２０】 前記ｃＤＮＡが全タンパク質コード配列を含み、その一
    部が配列番号３８〜３１５の配列のうち１つに含まれている、請求項１９に記載
    のｃＤＮＡ。
21. 【請求項２１】 前記第２のｃＤＮＡ鎖が、 前記第１のｃＤＮＡ鎖と第１の対のプライマーとを接触させること、ただし、
    前記第１の対のプライマーは、配列番号３８〜３１５のうち１つの配列の少なく
    とも１５個の連続するヌクレオチドを含む第２のプライマーおよび前記第１のプ
    ライマーの配列内に含まれる配列を有する第３のプライマーを含むものである、 前記第１の対のネステッドプライマーで第１のポリメラーゼ連鎖反応を行い、
    第１のＰＣＲ産物を生成すること、 前記第１のＰＣＲ産物と第２の対のプライマーとを接触させること、ただし、
    前記第２の対のプライマーは第４のプライマーおよび第５のプライマーを含み、
    ここで、前記第４のプライマーは配列番号３８〜３１５のうち１つの配列の少な
    くとも１５個の連続するヌクレオチドを含み、前記第４および第５のプライマー
    は前記第１のＰＣＲ産物内の配列にハイブリダイズ可能である、および 第２のポリメラーゼ連鎖反応を行い、それにより第２のＰＣＲ産物を生成する
    こと、 によって作製される、請求項１８に記載の方法。
22. 【請求項２２】 ヒト分泌タンパク質をコードする単離または精製された
    ｃＤＮＡであって、前記ヒト分泌タンパク質が配列番号３８〜３１５の１つによ
    りコードされるタンパク質または少なくとも１０アミノ酸からなるそのフラグメ
    ントを含み、前記ｃＤＮＡは請求項２１に記載の方法によって得られる、上記ｃ
    ＤＮＡ。
23. 【請求項２３】 前記ｃＤＮＡが全タンパク質コード配列を含み、その一
    部が配列番号３８〜３１５の配列の１つに含まれている、請求項２２に記載のｃ
    ＤＮＡ。
24. 【請求項２４】 前記第２のｃＤＮＡ鎖が、 前記第１のｃＤＮＡ鎖と、配列番号３８〜３１５の配列のうち少なくとも１５
    個の連続するヌクレオチドを含む第２のプライマーとを接触させること、 前記第２のプライマーを前記第１鎖のｃＤＮＡにハイブリダイズさせること、
    および 前記ハイブリダイズした第２のプライマーを伸長して前記第２のｃＤＮＡ鎖を
    生成すること、 によって作製される、請求項１８に記載の方法。
25. 【請求項２５】 ヒト分泌タンパク質をコードする単離または精製された
    ｃＤＮＡであって、前記ヒト分泌タンパク質は配列番号３８〜３１５の１つによ
    りその一部がコードされるタンパク質を含むかまたは少なくとも１０アミノ酸か
    らなるそのフラグメントを含み、前記ｃＤＮＡは請求項２４に記載の方法によっ
    て得られる、上記ｃＤＮＡ。
26. 【請求項２６】 前記ｃＤＮＡが全タンパク質コード配列を含み、その一
    部が配列番号３８〜３１５の配列の１つに含まれている、請求項２５に記載のｃ
    ＤＮＡ。
27. 【請求項２７】 配列番号３１６〜５９３の配列の１つを含むタンパク質
    を作製する方法であって、 配列番号３８〜３１５の配列の１つに部分的に含まれている全タンパク質コー
    ド配列をコードするｃＤＮＡを取得し、 前記ｃＤＮＡを、それがプロモーターに機能しうる形で連結されるように発現
    ベクターに挿入し、 前記発現ベクターを宿主細胞に導入し、それにより前記宿主細胞に前記ｃＤＮ
    Ａによりコードされるタンパク質を産生させ、そして 前記タンパク質を単離する 各ステップを含んでなる上記方法。
28. 【請求項２８】 請求項２７の方法によって得られる単離されたタンパク
    質。
29. 【請求項２９】 プロモーターＤＮＡを得る方法であって、 配列番号３８〜３１５の核酸の上流に位置するＤＮＡまたはそれに相補的な配
    列を取得し、 前記上流ＤＮＡをスクリーニングして、転写開始を指令し得るプロモーターを
    同定し、 前記同定したプロモーターを含む前記ＤＮＡを単離する、 各ステップを含んでなる上記方法。
30. 【請求項３０】 前記取得ステップが配列番号３８〜３１５の前記核酸ま
    たはそれに相補的な配列からの染色体歩行を含む、請求項２９に記載の方法。
31. 【請求項３１】 前記スクリーニング工程が前記上流配列をプロモーター
    レポーターベクターに挿入することを含む、請求項３０に記載の方法。
32. 【請求項３２】 前記スクリーニング工程が、転写因子結合部位かまたは
    転写開始部位である前記上流ＤＮＡ中のモチーフを同定することを含む、請求項
    ３０に記載の方法。
33. 【請求項３３】 請求項３２に記載の方法によって得られる単離されたプ
    ロモーター。
34. 【請求項３４】 配列番号３１６〜５９３の配列の１つを含む、単離また
    は精製されたタンパク質。
35. 【請求項３５】 個別のＥＳＴまたは長さが少なくとも１５ヌクレオチド
    のそのフラグメントのアレイであって、その改良点が配列番号３８〜３１５の配
    列のうち少なくとも１つ、または配列番号３８〜３１５の配列に相補的な配列の
    １つ、または少なくとも１５ヌクレオチドのそのフラグメントを前記アレイに加
    えることからなる、上記アレイ。
36. 【請求項３６】 配列番号３８〜３１５の配列、配列番号３８〜３１５の
    配列に相補的な配列、または少なくとも１５個の連続したヌクレオチドのそのフ
    ラグメントのうち少なくとも２つを含む、請求項３５に記載のアレイ。
37. 【請求項３７】 配列番号３８〜３１５の配列、配列番号３８〜３１５の
    配列に相補的な配列、または少なくとも１５個の連続したヌクレオチドのそのフ
    ラグメントのうち少なくとも５つを含む、請求項３５に記載のアレイ。