JP2001269182A - 配列タグおよびコードされたヒトタンパク質 - Google Patents

配列タグおよびコードされたヒトタンパク質

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JP2001269182A
JP2001269182A JP2000118773A JP2000118773A JP2001269182A JP 2001269182 A JP2001269182 A JP 2001269182A JP 2000118773 A JP2000118773 A JP 2000118773A JP 2000118773 A JP2000118773 A JP 2000118773A JP 2001269182 A JP2001269182 A JP 2001269182A
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Milne Edwards Jean-Baptiste Dumas
ドゥマ ミルヌ エドワーズ ジャン−バプティスト
Aymeric Duclert
デュクレール アイメリック
Jean-Yves Giordano
ジョルダン ジャン−イヴ
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【解決手段】 ヒトの分泌型タンパク質をコードするmR
NAから誘導される5'ESTの配列を開示する。ＥＳＴは発
現配列タグと呼ばれる配列で、ほんの短い鑞長のcDNAを
配列決定して得られる。5'ESTは、5'ESTに対応するcDNA
およびゲノムDNAを取得するためのものである。 【効果】5'ESTは、診断方法、法医学的方法、遺伝子治
療法および染色体マッピング法にも使用することができ
る。5'ESTを使用して上流制御配列を取得することも可
能である。また、5'ESTは、発現ベクターや分泌ベクタ
ーの設計にも使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】（発明の背景）ヒト染色体に散在している
推定50,000〜100,000の遺伝子は、ヒト疾患の理解、診
断および治療にかなり有望である。また、ヒトゲノムに
分布する遺伝子座に特異的にハイブリダイゼーションす
ることができるプローブには、高分解能染色体マップの
構築および個体の識別における用途がある。
【０００２】過去には、ヒト遺伝子を１本だけでも特徴
付けることが骨の折れる過程であり、数年の努力を要し
た。クローニングベクター、DNA配列決定およびコンピ
ューター技術分野における最近の発展により、ヒトの遺
伝子を単離、配列決定、マッピングおよび特徴づけする
ことができる速度が大きく加速された。酵母人工染色体
（YAC）および細菌人工染色体（BAC）のようなクローニ
ングベクターは、それぞれ鎖長300〜1000キロベース（k
b）または100〜400kbのDNA挿入物を受け入れることがで
き、それによってヒト染色体の長い距離にわたって分布
するDNA配列の操作および順序づけが容易になる。自動D
NA配列決定装置によりヒト遺伝子の迅速な配列決定が可
能になる。バイオインフォーマティクス（Bioinformati
cs）ソフトウェアは核酸とタンパク質の配列を比較し、
それによってヒト遺伝子産物の特徴づけを助けることが
できる。
【０００３】現在、ヒトゲノムに分布する遺伝子を同定
し、特徴付けるための２つの異なる方法が検討されてい
る。一方の方法では、ゲノムDNAの大きいフラグメント
を単離し、クローニングし、配列決定する。バイオイン
フォーマティクス（Bioinformatics）ソフトウェアを使
用して、これらのゲノム配列のオープンリーティングフ
レームと思われるものを同定する。しかし、この方法
は、ゲノム全体に分布するタンパク質コード配列を見つ
けるために、タンパク質をコードしない大量のヒトDNA
の配列決定を伴う。広範な配列決定が必要であることに
加えて、バイオインフォーマティクス（Bioinformatic
s）ソフトウェアは得られたゲノム配列を間違って特徴
づけすることがある。従って、このソフトウェアは非コ
ードDNAをコードDNAと間違って特徴づけする偽陽性また
はコードDNAを非コードDNAと誤って標識する偽陰性を生
じることがある。
【０００４】別の方法はヒトの遺伝子を同定し、特徴づ
けするさらに直接的な経路を取る。この方法では、ヒト
タンパク質をコードする単離されたメッセンジャーＲＮ
Ａ（mRNA）から相補的なDNA（ｃDNA）を合成する。この
方法を使用すると、ゲノムのタンパク質コード部分から
誘導されるDNAについてのみ配列決定が実施される。し
ばしば、ほんの短い鎖長のｃDNAを配列決定して、発現
配列タグ（ＥＳＴ）と呼ばれる配列を得る。次いで、Ｅ
ＳＴを使用して、ＥＳＴ配列に隣接する配列を含む伸長
ｃDNAを単離または精製することができる。伸長ｃDNA
は、それらを得るために使用されたＥＳＴの配列の全て
を含んでいてもよいし、それらを得るために使用された
ＥＳＴの配列の一部だけを含んでもよい。また、伸長ｃ
DNAは、ＥＳＴが誘導される遺伝子の完全長のコード配
列を含んでもよく、またはＥＳＴが誘導される遺伝子の
コード配列の一部を含んでもよい。選択的スプライシン
グまたは第２プロモーターの活性の結果としてＥＳＴ配
列を含む伸長ｃDNAがいくつか存在しうることが認識さ
れよう。あるいは、部分的にオーバーラップした配列を
有するＥＳＴを同定し、このオーバーラップしたＥＳＴ
のコンセンサス配列を含むコンティグを同定することも
できる。
【０００５】過去には、これらの短いＥＳＴ配列はオリ
ゴ−ｄＴをプライマーとしたｃDNAライブラリーからし
ばしば得られた。従って、それらは主にmRNAの３’非翻
訳領域に相当した。一部には、mRNAの３’末端から誘導
されるＥＳＴ配列が普及したのは、ｃDNAを得るための
典型的な技法はmRNAの５’末端から誘導されるｃDNA配
列を単離するためにはあまり適していないという事実の
結果である（アダムス（Adams）ら、Nature 377:3〜17
4,1996、ヒリアー（Hillier）ら、Genome Res.6:807〜
828,1996）。
【０００６】また、より長いｃDNA配列が得られたと報
告されている例では、その報告された配列は、一般に、
コード配列に相当し、ｃDNAが誘導されるmRNAの全長の
５’非翻訳領域（5'UTR）を含まない。5'UTRは、mRNAの
安定性または翻訳に影響を及ぼすことにより、しばしば
遺伝子発現の調節に関与する。実際、5'UTRは、翻訳開
始に影響を及ぼすことが分かっている以下の特徴を含み
得る：（1）キャップ構造と開始コドンとの間の距離、
（2）cis-作用要素（ポリピリミジン領域（Kasparら、
J. Biol. Chem. 267, 508-514, 1992; Seversonら、Eur
J. Biochem 229: 426-32, 1995）などの直線配列であ
ってもIRE（Rouault and Klausner, CurrTop Cell Regu
l 35: 1-19, 1997）などのような二次構造であってもよ
い）の存在、および（3）上流オープンリーディングフ
レームまたはuORF (Geballe and Morris, Trends Bioch
em Sci 19: 159-64, 1994)。従って、遺伝子発現の調節
は、代わりの5'UTRを使用することにより行うことがで
きる。例えば、メタロプロテアーゼmRNAの組織インヒビ
ターの翻訳は、細胞分裂促進活性化細胞において、他の
プロモーターを用いてその5'UTRの中のuORFの開始コド
ンを修飾することにより、促進される（Waterhouseら、
J Biol. Chem. 265: 5585-9, 1990）。さらに、突然変
異、挿入または転座による5'UTRの修飾も、病原として
含まれよう。例えば、脆弱X症候群（遺伝性精神遅延の
最も一般的な原因である）は、脆X mRNAの5'UTR中への
複数の３ヌクレオチドCGGの挿入により生じるリボソー
ムの停留によるタンパク質合成の阻害に、一部起因する
（Fengら、Science 268: 731-4,1995）。プロト-オンコ
ジーンc-mycの翻訳を阻害することが知られている5'UTR
の領域における異常突然変異により、複数の骨髄腫を有
する患者の細胞におけるC-mycタンパク質レベルがアッ
プレギュレーションされることが分かった（Willisら、
Curr Top Microbiol Immunol 224: 269-76, 1997）。し
かし、オリゴ-dTにプライミングされたcDNAライブラリ
ーを使用すると、完全長5'UTRを単離することができな
い。なぜなら、このように得られた不完全配列は、特に
第１のエクソンが短い場合には、mRNAの第１のエクソン
を含まないかもしれないからである。さらに、それらの
配列は、スプライシング部位の上流に位置するいくつか
のエクソン（たいてい短い）を含まないことがある。従
って、mRNAの５’末端から誘導される配列を得る必要が
ある。
【０００７】ヒトの染色体から誘導される多数の配列に
は実用的な用途があるが、タンパク質産物をコードする
これらの染色体配列の同定および特徴づけに基づいた方
法は、診断および治療的用途に特に関連がある。幾つか
のケースでは、このような治療または診断技法で使用す
る配列は、それらが合成される細胞から分泌されるタン
パク質をコードする配列、並びに分泌されるタンパク質
自体が、治療効果をもつ可能性のある薬剤として特に有
用である。このようなタンパク質はしばしば細胞間の連
絡に関係しており、標的細胞において臨床的に適切な応
答を生ずることに関与している。
【０００８】実際、組織プラスミノーゲン活性化因子、
Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、エリスロポイエチン、ヒト
成長ホルモン、インスリン、インターフェロン−α、イ
ンターフェロン−β、インターフェロン−γおよびイン
ターロイキン−２を含むいくつかの分泌タンパク質が、
現在臨床的に使用されている。これらのタンパク質は、
急性心筋梗塞、急性虚血性卒中、貧血、糖尿病、成長ホ
ルモン欠損症、肝炎、腎癌、化学療法による好中球減少
症および多発性硬化症を含む広範な症状を治療するため
に使用される。こうした理由のために、分泌タンパク質
をコードする伸長ｃDNAまたはその一部は、治療薬の有
用な供給源となる。従って、分泌タンパク質およびそれ
らをコードする核酸を同定し、特徴付ける必要性があ
る。
【０００９】それら自体が治療的に有用であることに加
えて、分泌タンパク質は、アミノ末端に、その分泌を指
令するシグナルペプチドと呼ばれる短いペプチドを含
む。これらのシグナルペプチドは、分泌タンパク質をコ
ードする遺伝子のコード配列の５’末端に位置するシグ
ナル配列によってコードされる。これらのシグナルペプ
チドは、それらが機能的に結合している任意のタンパク
質の細胞外分泌を指令することができる。また、膜転移
配列と呼ばれる該シグナルペプチドの一部を使用して、
関心のあるペプチドまたはタンパク質の細胞内への輸送
を指令することもできる。これは、特定の遺伝子産物
を、それを産生する細胞以外の細胞に送達することが望
まれる遺伝子治療法において有用であることが明らかで
ある。シグナルペプチドをコードするシグナル配列に
は、タンパク質の精製法を単純化するという用途も見い
だされている。このような用途では、望ましいタンパク
質が細胞外分泌されることによって、不要なタンパク質
（これらのタンパク質から望ましいタンパク質を選択し
なければならない）の数を減少させることができ、精製
はかなり容易になる。従って、シグナルペプチドをコー
ドする分泌タンパク質の遺伝子の５’部分を同定し、特
徴付ける必要性が存在する。
【００１０】非分泌タンパク質をコードする配列も、治
療または診断に使用することができる。特に、このよう
な配列を使用して、非分泌タンパク質または分泌タンパ
ク質のコード配列において突然変異が生じた結果、個体
が例えば病気などの検出可能な表現型を発現しそうであ
るかどうかを決めることができる。このようなコード配
列の中に突然変異が生じた結果、個体が病気または他の
望ましくない表現型にかかる危険性がある場合、この望
ましくない表現型は、遺伝子治療を用いて正常なコード
配列を導入することによって修正することができる。あ
るいは、該コード配列によりコードされるタンパク質の
過剰発現により望ましくない表現型が生じた場合、その
タンパク質の発現は、アンチセンスまたは３重らせんに
基づく方法を用いて低減することができる。
【００１１】該コード配列によりコードされる分泌もし
くは非分泌ヒトポリペプチドを、該ポリペプチドをコー
ドする配列中の突然変異により発症した病気などの症状
を有する個体に直接投与することにより、治療で使用す
ることもできる。このような場合、その症状は、該ポリ
ペプチドをその個体に投与することにより治療または改
善することができる。更に、分泌もしくは非分泌ヒトポ
リペプチドまたはその一部を使用して、生物学的サンプ
ルの組織型もしくは起源種を決定するのに有用な抗体を
生成することができる。これらの抗体を用いて、該分泌
もしくは非分泌ヒトポリペプチドの細胞局在化、または
該ヒトポリペプチドに融合されたポリペプチドの細胞局
在化を測定することもできる。さらに、該抗体をイムノ
アフィニティークロマトグラフィー法に使用して、該ヒ
トポリペプチドまたは該ヒトポリペプチドに融合した標
的ポリペプチドを単離、精製または濃縮することもでき
る。
【００１２】プロモーターおよび上流の調節領域が同定
され、特徴付けられているヒト遺伝子の数に関して公開
されている情報は極めて少ない。一部には、このような
調節配列を単離する困難さによるかもしれない。転写因
子結合部位などの上流の調節配列は、一般に、非常に短
いので、ヒトゲノムライブラリーからプロモーターを単
離するためのプローブとして利用することができない。
最近、ヒトプロモーターを単離するいくつかの方法が開
発されている。それらの１つは、ＣｐＧアイランドライ
ブラリーを作製することである（クロス（Cross）ら、N
ature Genetics6:236〜244,1994）。第２の方法は、Spe
I結合タンパク質を使用することによって、SpeI結合部
位を有するヒトゲノムDNA配列を単離することである。
（モートロック（Mortlock）ら、Genome Res. 6:327〜
335,1996）。これらの方法はいずれも特異性の欠如によ
る限界がある。なぜなら、限られた数のプロモーターし
かCpGアイランドまたはSpeI認識部位のいずれかを持っ
ていないために、およびSpeI結合部位がプロモーター領
域に特異的に見られるわけではないため、これらの方法
は普遍的に応用できるとは限らないからである。従っ
て、遺伝子の５'末端部分を同定し、体系的に特徴付け
る必要がある。
【００１３】本発明の５’ＥＳＴを使用して、タンパク
質合成の位置、発達段階、速度および量、並びにmRNAの
安定性を制御する上流の調節領域や5'UTRを効率的に同
定し、単離することができる。これらの調節領域は、い
ったん同定され、特徴づけられると、遺伝子治療または
タンパク質の精製法に使用して、望ましい量および位置
のタンパク質合成を得ることができ、または望ましくな
い遺伝子産物の合成を阻止、軽減または抑制することが
できる。
【００１４】また、タンパク質遺伝子の５’末端を有す
るＥＳＴは、染色体マッピングおよび個体の識別のため
のプローブとして有用な配列を含みうる。従って、遺伝
子の５’コード配列の上流の配列を同定し、特徴付ける
必要性が存在する。
【００１５】（発明の開示）本発明は、対応するmRNAの
濃縮５’末端から誘導される配列を含む精製、単離、ま
たは濃縮された５'ＥＳＴに関する。「対応するmRNA」
という用語は、５’ＥＳＴを産生するｃDNA合成の鋳型
となったmRNAをいう。これらの配列をこれ以後「５’Ｅ
ＳＴ」と呼ぶ。また本発明は、オーバーラップ配列を含
む複数のESTからコンセンサス配列を決定することによ
りアセンブルされたコンティグを含む、精製、単離、ま
たは濃縮された核酸も含む。これらのコンティグは、本
明細書において「コンセンサス・コンティグ化ＥＳＴ
（consensus contigated ＥＳＴ）」と称する。
【００１６】本明細書において使用される「精製され
た」という用語は絶対的な純度を要求するのではなく、
むしろ、それは相対的な定義であると意図される。ｃDN
Aライブラリーから単離された個々の５’ＥＳＴクロー
ンは、通常、電気泳動的等質性が得られるまで精製され
ている。これらのクローンから得られる配列はライブラ
リーまたはヒト全DNAから直接得ることはできなかっ
た。ｃDNAクローンはそのままで天然に存在していない
が、部分的に精製された天然の物質（メッセンジャーＲ
ＮＡ）を操作することによって得られる。mRNAのｃDNA
ライブラリーへの変換は合成物質（ｃDNA）を作製する
ことを含み、純粋な個々のｃDNAクローンはクローン選
択によって合成ライブラリーから単離することができ
る。従って、メッセンジャーＲＮＡからｃDNAライブラ
リーを作製し、その後ライブラリーから個々のクローン
を単離することによって、天然のメッセージの約１０4
〜１０6倍の純化が得られる。出発材料または天然材料
を少なくとも１桁、好ましくは２または３桁、さらに好
ましくは４または５桁まで精製することが特に意図され
ている。
【００１７】本明細書において使用される「単離され
た」という用語は、物質がその元の環境（例えば、それ
が天然のものである場合には、自然環境）から分離され
ることを必要とする。例えば、生存動物に存在する天然
型ポリヌクレオチドは単離されていないが、天然系にお
いて共存する物質の一部または全てから分離された該ポ
リヌクレオチドは単離されている。
【００１８】本明細書において使用される「濃縮され
た」という用語は、５’ＥＳＴが、天然の環境では隣接
していない「骨格」核酸に隣接していることを意味す
る。また、「濃縮され」るためには、５’ＥＳＴが、核
酸骨格分子の集団中の核酸挿入物の数の５％以上に相当
する。本発明による骨格分子には、発現ベクター、自己
複製核酸、ウィルス、組込み核酸および関心のある核酸
挿入物を維持または操作するために使用される他のベク
ターまたは核酸などの核酸が含まれる。好ましくは、濃
縮された５’ＥＳＴは、組換え骨格分子の集団中の核酸
挿入物の数の１５％以上に相当する。さらに好ましく
は、濃縮された５’ＥＳＴは組換え骨格分子の集団中の
核酸挿入物の数の５０％以上に相当する。非常に好まし
い態様において、濃縮された５’ＥＳＴは組換え骨格分
子の集団中の核酸挿入物の数の９０％以上に相当する。
【００１９】「ストリンジェントな」、「中程度の」お
よび「低度の」ハイブリダイゼーション条件は以下に定
義されるとおりである。「ポリペプチド」とは、ポリマ
ーの長さに関わらず、アミノ酸のポリマーを指す。従っ
て、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質も、
ポリペプチドの定義内に含まれる。また、この用語は、
ポリペプチドの発現後修飾に限定したり、これを除外し
たりするわけではなく、例えばグリコシル基、アセチル
基、リン酸基およびリピド基等の共有結合を含むポリペ
プチドも、ポリペプチドという用語の定義に明らかに含
まれる。また、この用語の定義には、アミノ酸（例えば
非自然発生的なアミノ酸、無関係の生物系に天然にしか
生じないアミノ酸、哺乳類系由来改変アミノ酸などを含
む）の１以上の類似体を含むポリペプチド、置換結合を
有するポリペプチド、ならびに当分野で公知の他の修飾
を有するポリペプチド（天然発生するものおよび非天然
発生のものの両方を含む）が含まれる。
【００２０】本明細書中に交換可能に使用される用語で
ある、「核酸」「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌ
クレオチド」には、２以上のヌクレオチドを一本鎖もし
くは二本鎖の形で有するRNA、DNA、またはRNA/DNAハイ
ブリッド配列が含まれる。また、本明細書中において
「ヌクレオチド」という用語は、あらゆる長さの一本鎖
もしくは二本鎖のRNA、DNAまたはRNA/DNAハイブリッド
配列を含む分子を示すための形容詞としても使用され
る。また、本明細書中「ヌクレオチド」という用語は、
個々のヌクレオチドまたは種々のヌクレオチドを指す名
詞としても使用され、プリンまたはピリミジン、リボー
スもしくはデオキシリボース糖部分、およびリン酸基を
含むか、またはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオ
チドの中のヌクレオチドの場合はホスホジエステル結合
を含む、分子またはより大きな核酸分子中の個々のユニ
ットを意味する。また、本明細書中の「ヌクレオチド」
という用語は、（a）他の結合基、（b）プリンの類似形
態、（c）ピリミジンの類似形態、または（d）糖の類似
形態のうちの少なくとも１つの改変を含む「改変ヌクレ
オチド」も包含するが、類似結合基、プリン、ピリミジ
ン、および糖の例としては例えばPCT出願WO95/04064を
参照されたい。本発明のポリヌクレオチド配列は、合
成、組換え、ex vivo生成またはこれらの組合せなどの
あらゆる公知方法により、および当分野で公知のあらゆ
る精製方法を用いて、調製することができる。
【００２１】「塩基対」および「ワトソンとクリックの
塩基対」とは、本明細書中において交換可能に使用さ
れ、これらは、チミンまたはウラシル塩基がアデニン塩
基に２つの水素結合により結合され、シトシンとグアニ
ン塩基が３つの水素結合により結合されている２重らせ
んDNAに見られるようなこれらの配列の同一性により、
互いに水素結合することができるヌクレオチドを指す。
（Stryer, L., Biochemistry, 第4版、1995）。
【００２２】本明細書中において「相補的」または「そ
の相補体」とは、相補的な領域全体を通して他の特定の
ポリヌクレオチドとワトソン・クリックの塩基対を形成
することができるポルヌクレオチドの配列を言う。本発
明の目的において、第１ポリヌクレオチドの中の各塩基
がその相補的な塩基と塩基対を形成するとき、その第１
ポリヌクレオチドは第２ポリヌクレオチドに相補的であ
ると考えられる。相補的な塩基は、一般的にAとT（また
はAとU）、またはCとGである。本明細書中において「相
補体」とは、「相補的なポリヌクレオチド」、「相補的
な核酸」および「相補的なヌクレオチド配列」からの同
義語として使用される。これらの用語は、これらの配列
に完全に基づいたポリヌクレオチドの対に適用されるの
であって、２つのポリヌクレオチドが実際に結合するよ
うな条件の特定のセットに適用されるのではない。好ま
しくは、「相補な」配列とは、反対側の鎖にTが存在す
る各位置にはA、反対側の鎖にAが存在する各位置には
T、反対側の鎖にCが存在する各位置にはGおよび反対側
の鎖にGが存在する各位置にはCを有する配列である。
【００２３】従って、１つ以上の５’ＥＳＴが骨格分子
中の核酸挿入物の数の５％以上を占めているｃDNAライ
ブラリー中の５’ＥＳＴは、本明細書中で定義される
「濃縮された組換え５’ＥＳＴ」である。同様に、本発
明の５’ＥＳＴがプラスミド骨格中の挿入物の数の５％
以上となるように、本発明の１以上の５’ＥＳＴが挿入
されたプラスミド集団中の５’ＥＳＴは、本明細書で定
義する「濃縮された組換え５’ＥＳＴ」である。しか
し、５’ＥＳＴが骨格分子集団中の核酸挿入物の数の５
％未満を構成するｃDNAライブラリー、例えば、５’Ｅ
ＳＴ挿入物を有する骨格分子が極めてまれであるライブ
ラリーの５’ＥＳＴは「濃縮された組換え５’ＥＳＴ」
ではない。
【００２４】幾つかの実施形態において、本発明は、分
泌タンパク質をコードする遺伝子から誘導される５’Ｅ
ＳＴに関する。本明細書において使用される「分泌」タ
ンパク質は、好適な宿主細胞内で発現されるとき、アミ
ノ酸配列中のシグナルペプチドの結果としての輸送を含
む、膜を貫通してまたは通過して輸送されるタンパク質
である。「分泌」タンパク質は、それらが発現される細
胞から全体的に（例えば、可溶性タンパク質）または部
分的に（例えば、受容体）分泌されるタンパク質を含む
が、それに限定されない。「分泌」タンパク質はまた、
小胞体の膜を貫通して輸送されるタンパク質も含むが、
それに限定されない。
【００２５】このような５’ＥＳＴは、５’ＥＳＴが誘
導される遺伝子によりコードされるタンパク質の細胞外
分泌を指令するシグナルペプチドをコードする、シグナ
ル配列と呼ばれる核酸配列を含む。一般に、シグナルペ
プチドは分泌タンパク質のアミノ末端に位置する。
【００２６】分泌タンパク質は、「粗面」小胞体に結合
したリボソームによって翻訳される。一般に、分泌タン
パク質は、共翻訳的に小胞体膜に移送される。分泌タン
パク質の翻訳中のリボソームと小胞体の結合はシグナル
ペプチドによって仲介される。シグナルペプチドは、一
般に、小胞体内に共翻訳的にエントリーすることによっ
て切断される。小胞体への送達後、分泌タンパク質はゴ
ルジ装置を通過して前進しうる。ゴルジ装置では、タン
パク質は翻訳後修飾を受けることができ、その後細胞膜
をからそれらを輸送する分泌小胞に入る。
【００２７】本発明の５’ＥＳＴにはいくつかの重要な
用途がある。例えば、それらを使用して、５’ＥＳＴが
誘導されるmRNAのコード配列の５’末端から誘導される
真正の翻訳開始部位を含む、対応する遺伝子産物の完全
長のタンパク質コード配列を含むｃDNAクローンを取得
し、それを発現させることができる。これらのｃDNAを
これ以後「全長ｃDNA」と呼ぶ。これらのｃDNAはまた、
翻訳開始部位の上流のmRNA配列から誘導されるDNAを含
んでもよい。全長ｃDNA配列は、５’ＥＳＴに対応する
タンパク質を発現させるために使用することができる。
上記のように、分泌タンパク質および非分泌タンパク質
は、治療上重要である。従って、ｃDNAから発現される
タンパク質は種々のヒト症状を治療または予防する際に
有用となり得る。５’ＥＳＴはまた、対応するゲノムDN
Aを得るために使用することもできる。「対応するゲノ
ムDNA」という用語は、５’ＥＳＴが誘導されるmRNAを
コードするゲノムDNAをいう。
【００２８】あるいはまた、５’ＥＳＴを使用して、該
タンパク質の一部をコードする伸長ｃDNAを取得し、発
現させることができる。分泌タンパク質の場合、この部
分は、分泌タンパク質のシグナルペプチドまたはシグナ
ルペプチドが切断されたときに生成する成熟タンパク質
を含みうる。本発明は、単離、精製、または濃縮された
「ＥＳＴ-関連核酸」を含む。「単離」、「精製」また
は「濃縮」されたという用語は、上記のような意味を有
する。本明細書中に記載されるように、用語「ＥＳＴ-
関連核酸」とは、配列番号24〜4100および8178〜36681
の核酸、配列番号24〜4100および8178〜36681の核酸を
用いて得られる伸長cDNA、配列番号24〜4100および8178
〜36681の核酸を用いて得られる全長cDNA、または配列
番号24〜4100および8178〜36681の核酸を用いて得られ
るゲノムDNAを指す。また、本発明は、ＥＳＴ関連核酸
に相補的な配列も含む。
【００２９】また、本発明は、単離、精製、または濃縮
された「ＥＳＴ関連核酸」も含む。「単離」、「精製」
および「濃縮」されたという用語は、上記の意味を有す
る。本明細書中に使用される「ＥＳＴ関連核酸の断片」
とは、ＥＳＴ関連核酸の少なくとも10、12、15、18、2
0、23、25、28、30、35、40、50、75、100、200、300、
500または1000個の連続的なヌクレオチドを含む断片で
あって、これらの長さの断片が、基準とする特定のＥＳ
Ｔ関連核酸の長さに一致する程度のものを意味する。ま
た、本発明は、ＥＳＴ関連核酸の断片に相補的な配列も
含む。
【００３０】また、本発明は、単離、精製、または濃縮
された「ＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメント（po
sitional segment）」も含む。「単離」、「精製」また
は「濃縮」されたという用語は、上記の意味を有する。
本明細書中に使用される「ＥＳＴ関連核酸のポジショナ
ルセグメント」とは、ＥＳＴ関連核酸のヌクレオチド1
〜25、26〜50、51〜75、76〜100、101〜125、126〜15
0、151〜175、176〜200、201〜225、226〜250、251〜30
0、301〜325、326〜350、351〜375、376〜400、401〜42
5、426〜450、451〜475、476〜500、501〜525、526〜55
0、551〜575、576〜600および601〜末端ヌクレオチドを
含むセグメントであって、このようなヌクレオチド位置
が、基準とする特定のＥＳＴ関連核酸の長さに一致する
程度のものを意味する。また、「ＥＳＴ関連核酸のポジ
ショナルセグメント」は、ＥＳＴ関連核酸のヌクレオチ
ド1〜50、51〜100、101〜150、151〜200、201〜250、25
1〜300、301〜350、351〜400、401〜450、450〜500、50
1〜550、551〜600または601〜末端ヌクレオチドを含む
セグメントであって、このようなヌクレオチド位置が、
基準とする特定のＥＳＴ関連核酸の長さに一致する程度
のものも含む。また、「ＥＳＴ関連核酸のポジショナル
セグメント」は、ＥＳＴ関連核酸のヌクレオチド1〜10
0、101〜200、201〜300、301〜400、501〜500、500〜60
0または601〜末端ヌクレオチドを含むセグメントであっ
て、このようなヌクレオチド位置が、基準とする特定の
ＥＳＴ関連核酸の長さに一致する程度のものも意味す
る。さらに、「ＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメン
ト」なる用語は、ＥＳＴ関連核酸のヌクレオチド1〜20
0、201〜400、400〜600または601〜末端ヌクレオチドを
含むセグメントであって、このようなヌクレオチド位置
が、基準とする特定のＥＳＴ関連核酸の長さに一致する
程度のものを意味する。また、本発明は、ＥＳＴ関連核
酸のポジショナルセグメントに相補的である配列も含
む。
【００３１】また、本発明は、単離、精製、または濃縮
された「ＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメントの断
片」も含む。「単離」、「精製」または「濃縮」された
という用語は、上記の意味を有する。本明細書中に使用
される「ＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメントの断
片」とは、ＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメントの
少なくとも10、15、18、20、23、25、28、30、35、40、
50、75、100、150または200個の連続的なヌクレオチド
を含む断片を意味する。また、本発明は、ＥＳＴ関連核
酸のポジショナルセグメントの断片に相補的な配列も含
む。
【００３２】また、本発明は、単離もしくは精製された
「ＥＳＴ関連ポリペプチド」も含む。「単離」、「精
製」または「濃縮」されたという用語は、上記の意味を
有する。本明細書中に使用される「ＥＳＴ関連ポリペプ
チド」とは、ＥＳＴ関連核酸によりコードされるポリペ
プチド（配列番号4101〜8177のポリペプチドを含む）を
意味する。
【００３３】また、本発明は、単離もしくは精製された
「ＥＳＴ関連ポリペプチドの断片」も含む。「単離」も
しくは「精製」されたという用語は、上記の意味を有す
る。本明細書中に使用される「ＥＳＴ関連ポリペプチド
の断片」とは、ＥＳＴ関連ポリペプチドの少なくとも
5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100または15
0個の連続的なアミノ酸を含む断片であって、これらの
長さの断片が、基準とする特定のＥＳＴ関連ポリペプチ
ドの長さに一致する程度のものを意味する。
【００３４】また、本発明は、単離または精製された
「ＥＳＴ関連ポリペプチドのポジショナルセグメント」
も含む。本明細書中に使用される「ＥＳＴ関連ポリペプ
チドのポジショナルセグメント」とは、ＥＳＴ関連ポリ
ペプチドのアミノ酸残基1〜25、26〜50、51〜75、76〜1
00、101〜125、126〜150、151〜175、176〜200または20
1〜Ｃ末端アミノ酸を含むポリペプチドであって、この
ようなアミノ酸残基が、基準とする特定のＥＳＴ関連ポ
リペプチドの長さに一致する程度のものを含む。また、
「ＥＳＴ-関連ポリペプチドのポジショナルセグメン
ト」は、ＥＳＴ関連ポリペプチドのアミノ酸残基１〜5
0、51〜100、101〜150、151〜200または201〜Ｃ末端ア
ミノ酸を含むセグメントであって、このようなアミノ酸
残基が、基準とする特定のＥＳＴ関連ポリペプチドの長
さに一致する程度のものも含む。また、用語「ＥＳＴ関
連ポリペプチドのポジショナルセグメント」は、ＥＳＴ
関連ポリペプチドのアミノ酸１〜100または101〜200を
含むセグメントであって、このようなアミノ酸残基が基
準とする特定のＥＳＴ関連ポリペプチドの長さに一致す
る程度のものであるものも含む。更に、用語「ＥＳＴ関
連ポリペプチドのポジショナルセグメント」は、ＥＳＴ
関連ポリペプチドのアミノ酸残基１〜200または201〜Ｃ
末端アミノ酸を含むセグメントであって、このようなア
ミノ酸残基が、基準とする特定のＥＳＴ関連ポリペプチ
ドの長さに一致する程度のものも含む。
【００３５】本発明はまた、単離または精製された「Ｅ
ＳＴ関連ペプチドのポジショナルセグメントの断片」も
含む。用語「単離」または「精製」されたとは、上記意
味を有する。本明細書中に使用する「ＥＳＴ関連ポリペ
プチドのポジショナルセグメントの断片」とは、ＥＳＴ
関連ポリペプチドのポジショナルセグメントの、少なく
とも５、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100ま
たは150個の連続的なアミノ酸を含む断片であって、こ
れらの長さの断片が、基準とする特定のＥＳＴ関連ポリ
ペプチドの長さに一致する程度のものを意味する。
【００３６】本発明はまた、ＥＳＴ関連ポリペプチド、
ＥＳＴ関連ポリペプチドの断片、ＥＳＴ関連ポリペプチ
ドのポジショナルセグメント、またはＥＳＴ関連ポリペ
プチドのポジショナルセグメントの断片を特異的に認識
する抗体も含む。配列番号7798〜7888などの分泌タンパ
ク質の場合、シグナルペプチドが切断されて生成された
成熟タンパク質を特異的に認識する抗体も、以下に記載
するように得ることができる。同様に、配列番号4101〜
4729または7798〜7888のシングナルペプチドを特異的に
認識する抗体も得ることができる。
【００３７】幾つかの実施形態において、および分泌さ
れたタンパク質の場合、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核
酸の断片、ＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメント、
または核酸のポジショナルセグメントの断片は、シグナ
ル配列を含む。他の実施形態において、ＥＳＴ関連核
酸、ＥＳＴ関連核酸の断片、ＥＳＴ関連核酸のポジショ
ナルセグメント、または核酸のポジショナルセグメント
の断片は、該タンパク質の全長コード配列を含んでも良
いし、また分泌タンパク質の場合は、成熟タンパク質
（すなわちシグナルペプチドが切断されて生成されたタ
ンパク質）の全長コード配列を含んでも良い。さらに、
ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の断片、ＥＳＴ関連核
酸のポジショナルセグメント、または核酸のポジショナ
ルセグメントの断片は、翻訳開始部位の上流または停止
コドンの下流に、遺伝子発現の量、位置または発達段階
を制御する調節領域を含んでいてもよい。
【００３８】上記のように、分泌および非分泌ヒトタン
パク質はどちらも治療上重要である。従って、ＥＳＴ関
連核酸、ＥＳＴ関連核酸の断片、ＥＳＴ関連核酸のポジ
ショナルセグメント、または核酸のポジショナルセグメ
ントの断片から発現したタンパク質は、種々のヒト症状
を治療または予防するのに有用であろう。
【００３９】ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の断片、
ＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメント、または核酸
のポジショナルセグメントの断片は、個体を識別するた
めの法医学的手法、または異常な遺伝子発現により生じ
る遺伝病を有する個体を識別するための診断的手法にも
使用することができる。さらに、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳ
Ｔ関連核酸の断片、ＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグ
メント、または核酸のポジショナルセグメントの断片
は、高分解能ヒト染色体マップを構築するために有用で
ある。
【００４０】本発明はまた、関心のあるタンパク質の分
泌を指令することができる分泌ベクターにも関する。こ
のようなベクターは、生体内の別の部位に送達しようと
する遺伝子産物を１個の細胞内で産生することが望まれ
る遺伝子治療法に使用することができる。分泌ベクター
は目的のタンパク質の精製を容易にすることもできる。
【００４１】本発明はまた、挿入された遺伝子を望まし
い場所で、望ましい時期に、または望ましい量で発現さ
せることを指令することができる発現ベクターに関す
る。このようなベクターは、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関
連核酸の断片、ＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメン
ト、または核酸のポジショナルセグメントの断片の上流
に、例えばプロモーターまたは上流調節配列などの配列
を含んでもよい。
【００４２】また、本発明は、第１ポリペプチドおよび
第２ポリペプチドを含むキメラポリペプチドを作成する
ための融合ベクターも含む。このようなベクターは、キ
メラポリペプチドの細胞局在化を決定したり、キメラポ
リペプチドを単離、精製または濃縮したりするのに有用
である。
【００４３】また、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の
断片、ＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメント、また
は核酸のポジショナルセグメントの断片は、遺伝病を予
防または治療する遺伝子治療に使用することもできる。
分泌タンパク質の場合、シグナルペプチドを異種タンパ
ク質に融合させて、それらの細胞外分泌を指令すること
もできる。
【００４４】非クラスター化5'ESTの配列を含む挿入物
を有するBluescriptプラスミドを含む細菌クローンは、
そのまま、本発明者の実験室で名前を付けて４％（v/
v）グリセロール中で80℃で保存する。この非クラスタ
ー化5'ESTは、表IIに示す単一の組織に由来する単一のE
STを含むものである。挿入物は、保存した材料から、適
当なクローンを適切な培地上で増殖させることにより回
収してもよい。次いで、Bluescript DNAは、当業者に良
く知られているプラスミド単離法（例えば、アルカリ溶
解ミニプレップまたは大量アルカリ溶解プラスミド単離
法）を用いて単離できる。所望により、プラスミドDNA
は、塩化セシウム勾配での遠心分離、サイズ排除クロマ
トグラフィー、またはアニオン交換クロマトグラフィー
によりさらに富化してもよい。これらの手法を用いて得
られるプラスミドDNAは、当業者によく知られている標
準的なクローニング技術を用いて操作される。あるいは
また、挿入したEST関連核酸、EST関連核酸の断片、EST
関連核酸のポジショナルセグメントあるいはEST関連核
酸のポジショナルセグメントの断片の両端に設計したプ
ライマーを用いてPCRを行ってもよい。次いで、EST関連
核酸、EST関連核酸の断片、EST関連核酸のポジショナル
セグメントあるいはEST関連核酸のポジショナルセグメ
ントの断片に相当するそのPCR産物を、当業者によく知
られている標準的なクローニング技術を用いて操作して
もよい。
【００４５】本発明の１つの実施形態は、配列番号24〜
4100および配列番号8178〜36681ならびに配列番号24〜4
100および配列番号8178〜36681に相補的な配列の中から
選ばれる配列を含む精製した核酸である。
【００４６】本発明の別の実施形態は、配列番号24〜41
00および配列番号8178〜36681ならびに配列番号24〜410
0および配列番号8178〜36681に相補的な配列の中から選
ばれる配列の少なくとも10個の連続するヌクレオチドを
含む精製した核酸である。
【００４７】本発明の別の実施形態は、配列番号24〜41
00および配列番号8178〜36681ならびに配列番号24〜410
0および配列番号8178〜36681に相補的な配列の中から選
ばれる配列の少なくとも15個の連続するヌクレオチドを
含む精製した核酸である。
【００４８】本発明の別の実施形態は、配列番号24〜41
00からなる群から選択される配列のコード配列を含む、
精製された核酸である。
【００４９】本発明のさらに別の実施形態は、配列番号
3721〜3811からなる群から選択される配列の全コード配
列を含む精製された核酸であって、該全コード配列がシ
グナルペプチドをコードする配列と成熟タンパク質をコ
ードする配列を含む、核酸である。
【００５０】本発明のさらに別の実施形態は、成熟タン
パク質をコードする配列番号3721〜3811からなる群から
選択される配列の連続スパンを含む、精製された核酸で
ある。
【００５１】本発明の別の実施形態は、シグナルペプチ
ドをコードする配列番号24〜652および3721〜3811から
なる群から選択される配列の連続スパンを含む、精製さ
れた核酸である。
【００５２】本発明の別の実施形態は、配列番号4101〜
8177の配列からなる群から選択される配列を含むポリペ
プチドをコードする、精製された核酸である。
【００５３】本発明の別の実施形態は、配列番号7798〜
7888の配列からなる群から選択される配列を含むポリペ
プチドをコードする、精製された核酸である。
【００５４】本発明の別の実施形態は、配列番号7798〜
7888の配列からなる群から選択される配列に含まれる成
熟タンパク質を含むポリペプチドをコードする、精製さ
れた核酸である。
【００５５】本発明の別の実施形態は、配列番号4101〜
4729および配列番号7798〜7888の配列からなる群から選
択される配列に含まれるシグナルペプチドを含むポリペ
プチドをコードする、精製された核酸である。
【００５６】本発明の別の実施形態は、配列番号24〜41
00および8178〜36681の配列、ならびに配列番号24〜410
0および8178〜36681の配列に相補的な配列からなる群か
ら選択される配列にストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズする、少なくとも15、18、20、23、25、28、3
0、35、40、50、75、100、200、300、500または1000ヌ
クレオチドの長さの精製された核酸である。
【００５７】本発明の別の実施形態は、配列番号4101〜
8177の配列からなる群から選択される配列を含む、精製
または単離されたポリペプチドである。
【００５８】本発明の別の実施形態は、配列番号7798〜
7888からなる群から選択される配列を含む、精製または
単離されたポリペプチドである。
【００５９】本発明の別の実施形態は、配列番号7798〜
7888からなる群から選択されるポリペプチドの成熟タン
パク質を含む、精製または単離されたポリペプチドであ
る。
【００６０】本発明の別の実施形態は、配列番号4101-4
729および7798〜7888のポリペプチドからなる群から選
択される配列のシグナルペプチドを含む、精製または単
離されたポリペプチドである。
【００６１】本発明の別の実施形態は、配列番号4101-8
177の配列からなる群から選択される配列の少なくとも1
0個の連続したアミノ酸を含む、精製または単離された
ポリペプチドである。
【００６２】本発明の別の実施形態は、cDNAを作製する
方法であって、ヒト細胞由来のmRNA分子の集合体に、配
列番号24〜4100および8178〜36681に相補的な配列から
なる群から選択される配列の少なくとも15個の連続した
ヌクレオチドを含むプライマーを接触させ、該プライマ
ーを、該タンパク質をコードする該集合体中のmRNAにハ
イブリダイズさせ、該ハイブリダイズしたプライマーを
逆転写して、該mRNAから第１cDNA鎖を作製し、第１cDNA
鎖に相補的な第２cDNA鎖を作製し、そして該タンパク質
をコードする、第１cDNA鎖と第２cDNA鎖からなる得られ
たcDNAを単離する、各ステップを含む方法である。
【００６３】本発明の別の実施形態は、上記段落の方法
により得られる、精製されたcDNAである。
【００６４】上記実施形態の一態様において、前記cDNA
はヒトポリペプチドの少なくとも一部をコードする。
【００６５】本発明の別の実施形態は、cDNAを作製する
方法であって、配列番号24〜4100および8178〜36681の
配列からなる群から選択される配列を含むcDNAを取得
し、該cDNAに、配列番号24〜4100および8178〜36681の
配列および配列番号24〜4100および8178〜36681に相補
的な配列からなる群から選択される配列の少なくとも15
個の連続したヌクレオチドを含む検出可能なプローブ
を、該プローブが該cDNAにハイブリダイズする条件下で
接触させ、該検出可能なプローブにハイブリダイズする
cDNAを同定し、そして該プローブにハイブリダイズする
該cDNAを単離する、各ステップを含む方法である。
【００６６】本発明の別の実施形態は、上記段落の方法
により得られる、精製されたcDNAである。
【００６７】上記実施形態の一態様において、前記cDNA
はヒトポリペプチドの少なくとも一部をコードする。
【００６８】本発明の別の実施形態は、cDNAを作製する
方法であって、ヒト細胞由来のmRNA分子の集合体に、該
mRNAのポリAテイルにハイブリダイズできる第１プライ
マーを接触させ、該第１プライマーを該ポリAテイルに
ハイブリダイズさせ、該mRNAを逆転写して第１cDNA鎖を
作製し、配列番号24〜4100および8178〜36681の配列か
らなる群から選択される配列の少なくとも15個の連続し
たヌクレオチドを含む少なくとも１つのプライマーを用
いて、第１cDNA鎖に相補的な第２cDNA鎖を作製し、そし
て第１cDNA鎖と第２cDNA鎖からなる、得られたcDNAを単
離する、各ステップを含む方法である。
【００６９】本発明の別の実施形態は、上記段落の方法
により得られる、精製されたcDNAである。
【００７０】上記実施形態の一態様において、前記cDNA
はヒトポリペプチドの少なくとも一部をコードする。
【００７１】上記方法の別の一態様において、第２cDNA
鎖の作製が、第１cDNA鎖に第１のプライマー対を接触さ
せ（ここで、第１のプライマー対は、配列番号24〜4100
および8178〜36681からなる群から選択される配列の少
なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む第２プライ
マーおよび第１プライマーの配列内に含まれる配列を有
する第３プライマーを含む）、第１のプライマー対によ
り第１のポリメラーゼ連鎖反応を行って第１PCR産物を
生成させ、第１PCR産物に第２のプライマー対を接触さ
せ（ここで、第２のプライマー対は第４プライマーおよ
び第５プライマーを含み、ここで、第４プライマーは配
列番号24〜4100および8178〜36681からなる群から選択
される該配列の少なくとも15個の連続したヌクレオチド
を含み、そして第４および第５のプライマーは第１PCR
産物内の配列にハイブリダイズ可能である）、そして第
２のポリメラーゼ連鎖反応を行い、それにより第２PCR
産物を生成させる、ことにより行われる方法である。
【００７２】上記実施形態の一態様は、上記段落の方法
により得られる、精製されたcDNAである。
【００７３】上記実施形態の別態様において、前記cDNA
はヒトポリペプチドの少なくとも一部をコードする。
【００７４】あるいはまた、第２cDNA鎖の作製は、第１
cDNA鎖に、配列番号24〜4100および8178〜36681からな
る群から選択される配列の少なくとも15個の連続したヌ
クレオチドを含む第２プライマーを接触させ、第２プラ
イマーを第１cDNA鎖にハイブリダイズさせ、そしてハイ
ブリダイズした第２プライマーを伸長させて第２cDNA鎖
を生成させる、ことにより行われてもよい。
【００７５】上記実施形態の一態様は、上記段落の方法
により得られる、精製されたcDNAである。
【００７６】上記実施形態の別態様において、前記cDNA
はヒトポリペプチドの少なくとも一部をコードする。
【００７７】本発明の別の実施形態は、ポリペプチドを
生産する方法であって、配列番号24〜4100からなる群か
ら選択される配列を含む核酸によりコードされるポリペ
プチドをコードするcDNAまたは配列番号24〜4100からな
る群から選択される配列によりコードされるポリペプチ
ドの少なくとも10個の連続したアミノ酸を含むポリペプ
チドをコードするcDNAを取得し、該cDNAがプロモーター
に機能しうる形で連結されるように発現ベクターに挿入
し、該発現ベクターを宿主細胞内に導入して、該宿主細
胞に該cDNAによりコードされるタンパク質を産生させ、
そして該タンパク質を単離する、各ステップを含む方
法。
【００７８】本実施形態の別態様は、上記段落の方法に
より得られる、単離されたタンパク質である。
【００７９】本発明の別の実施形態は、プロモーターDN
Aを取得する方法であって、配列番号24〜4100および817
8〜36681の配列および配列番号24〜4100および8178〜36
681の配列に相補的な配列からなる群から選択される配
列を含む核酸の上流に位置するゲノムDNAを取得し、該
ゲノムDNAをスクリーニングして、転写開始を指令する
ことができるプロモーターを同定し、そして同定した該
プロモーターを含むDNAを単離する、各ステップを含む
方法である。
【００８０】上記実施形態の一態様において、前記取得
ステップは、配列番号24〜4100および8178〜36681の配
列および配列番号24〜4100および8178〜36681の配列に
相補的な配列からなる群から選択される配列を含むゲノ
ムDNAからの染色体歩行を含む。同実施形態の別態様に
おいて、前記スクリーニングステップは、配列番号24〜
4100および8178〜36681の配列および配列番号24〜4100
および8178〜36681の配列に相補的な配列からなる群か
ら選択される配列の上流に位置するゲノムDNAをプロモ
ーターレポーターベクターに挿入することを含む。例え
ば、前記スクリーニングステップは、配列番号24〜4100
および8178〜36681の配列および配列番号24〜4100およ
び8178〜36681の配列に相補的な配列からなる群から選
択される配列の上流に位置するゲノムDNA中の、転写因
子結合部位かまたは転写開始部位にあたるモチーフを同
定することを含んでいてもよい。
【００８１】本発明の別の実施形態は、上記段落の方法
によって得られる単離されたプロモーターである。
【００８２】本発明の別の実施形態は、個々のESTまた
は長さが少なくとも15ヌクレオチドのその断片のアレイ
に、配列番号24〜4100および8178〜36681の配列、配列
番号24〜4100および8178〜36681の配列に相補的な配
列、および該配列の少なくとも15個の連続したヌクレオ
チドを含む断片からなる群から選択される少なくとも１
つの配列を加えることである。同実施形態のいくつかの
態様において、前記アレイは、配列番号24〜4100および
8178〜36681の配列、配列番号24〜4100および8178〜366
81の配列に相補的な配列、および該配列の少なくとも15
個の連続したヌクレオチドを含む断片からなる群から選
択される配列を少なくとも２つ含む。本発明の別の態様
において、前記アレイは、配列番号24〜4100および8178
〜36681の配列、配列番号24〜4100および8178〜36681の
配列に相補的な配列、ならびに該配列の少なくとも15個
の連続したヌクレオチドを含む断片からなる群から選択
される配列を少なくとも５つ含む。
【００８３】本発明の別の実施形態は、インサート核酸
とバックボーン核酸を含む組換え核酸の濃縮集団であっ
て、該集団中のインサート核酸の少なくとも5%が配列番
号24〜4100および8178〜36681の配列および配列番号24
〜4100および8178〜36681の配列に相補的な配列からな
る群から選択される配列を含む、上記濃縮集団である。
【００８４】本発明の別の実施形態は、配列番号4101〜
8177からなる群から選択される配列を含むポリペプチド
に特異的に結合することができる、精製または単離され
た抗体である。
【００８５】配列番号4101〜8177からなる群から選択さ
れる配列の少なくとも10個の連続したアミノ酸を含むポ
リペプチドに特異的に結合することができる、精製また
は単離された抗体。
【００８６】配列番号4101〜8177のいずれかの少なくと
も８アミノ酸の連続スパンを含むポリペプチドのエピト
ープ含有断片に特異的に結合することができる、ポリク
ローナルまたはモノクローナルの抗体組成物。
【００８７】本発明の別の実施形態は、配列番号24〜41
00および8178〜36681の核酸コードおよび配列番号4101
〜8177のポリペプチドコードからなる群から選択される
配列を記憶させたコンピュータ読取り可能媒体である。
【００８８】本発明の別の実施形態は、プロセッサとデ
ータ記憶装置を含むコンピュータシステムであって、該
データ記憶装置がそこに配列番号24〜4100および8178〜
36681の核酸コードおよび配列番号4101〜8177のポリペ
プチドコードからなる群から選択される配列を記憶して
いる、コンピュータシステムである。同実施形態の一態
様において、該コンピュータシステムは、シーケンスコ
ンペアラおよび参照配列を記憶しているデータ記憶装置
をさらに含む。例えば、前記シーケンスコンペアラは、
多型性を示すコンピュータプログラムを含みうる。同実
施形態の別の態様において、前記コンピュータシステム
は、前記配列中の特徴を識別するアイデンティファイア
をさらに含む。
【００８９】本発明の別の実施形態は、配列番号24〜41
00および8178〜36681の核酸コードおよび配列番号4101
〜8177のポリペプチドコードからなる群から選択される
第１配列と参照配列とを比較する方法であって、配列を
比較するコンピュータプログラムを使用して、第１配列
と参照配列を読取り、そして該コンピュータプログラム
により、第１配列と参照配列間の差異を調べる、各ステ
ップを含む上記方法である。同実施形態のいくつかの態
様において、第１配列と参照配列間の差異を調べるステ
ップは、多型性を識別することを含む。
【００９０】本発明の別の実施形態は、配列番号24〜41
00および8178〜36681の核酸コードおよび配列番号4101
〜8177のポリペプチドコードからなる群から選択される
配列中の特徴を識別する方法であって、配列の特徴を識
別するコンピュータプログラムを用いて該配列を読取
り、そして該コンピュータプログラムにより該配列の特
徴を識別する、各ステップを含む方法である。
【００９１】本発明の別の実施形態は、上記核酸のうち
いずれか１つの核酸を含有するベクターである。
【００９２】本発明の別の実施形態は、上記ベクターを
含有する宿主細胞である。
【００９３】本発明の別の実施形態は、上記いずれかの
核酸を生産する方法であって、該核酸が各宿主細胞内に
多コピー数で存在するように該宿主細胞に該核酸を導入
し、そして該宿主細胞から該核酸を単離する、各ステッ
プを含む方法である。
【００９４】本発明の別の実施形態は、上記いずれかの
核酸中のヌクレオチドを順次連結するステップを含む、
核酸の作製方法である。
【００９５】本発明の別の実施形態は、アミノ酸を順次
連結するステップを含む上記いずれかのポリペプチドの
作製方法であって、該ポリペプチドの長さが150アミノ
酸またはそれ以下である、方法である。
【００９６】本発明の別の実施形態は、ポリペプチドの
アミノ酸を順次連結するステップを含む上記いずれかの
ポリペプチドの作製方法であって、該ポリペプチドの長
さが120アミノ酸またはそれ以下である方法である。
【００９７】配列表の簡単な説明 配列番号１、３、５，７，９、11および13は、本明細書
に記載の方法を使用して調製した完全長cDNAである。
【００９８】配列番号２、４、６、８、10、12および14
は、配列番号１、３、５、７、９、11および13の核酸に
よってコードされるポリペプチドである。
【００９９】配列番号15、16、18、19、21および22は、
本明細書にそれらの使用が記載されているプライマーで
ある。
【０１００】配列番号17、20および23は、以下に記載す
るように得た転写因子結合部位を含む核酸の配列であ
る。
【０１０１】配列番号24〜652は、シグナルペプチドを
コードする不完全ORFを有する核酸である。本明細書で
使用する「不完全ORF」とは、開始コドンが同定され、停
止コドンは同定されていないオープンリーディングフレ
ームである。不完全ORFの位置およびシグナルペプチド
をコードする配列は、添付の配列表に記した。さらに、
以下に記載するように計算されたシグナルペプチドのVo
n Heijne(フォン・ヘイジン)スコアは、添付の配列表に
おいて「スコア」として記した。シグナル-ペプチドの配
列は、添付の配列表において「seq」として記した。シグ
ナルペプチド中の「/」は、シグナルペプチドのタンパク
質分解切断が生じて成熟タンパク質が生成される位置を
示す。
【０１０２】配列番号653〜3720は、今のところシグナ
ルペプチドをコードする配列が同定されていない不完全
ORFを有する核酸である。しかし、今後の分析によっ
て、これらの核酸においてシグナルペプチドをコードす
る配列が同定される可能性はある。不完全ORFの位置
を、添付の配列表に記した。
【０１０３】配列番号3721〜3811は、シグナルペプチド
をコードする完全ORFを有する核酸である。本明細書で
使用する「完全ORF」は、開始コドンおよび停止コドンが
同定されているオープンリーディングフレームである。
完全ORFおよびシグナルペプチドをコードする配列の位
置を、添付の配列表に記した。さらに、以下に記載した
ように計算したシグナルペプチドのVon Heijneスコア
は、添付の配列表中に「スコア」として記した。シグナル
ペプチドの配列は「sec」として添付の配列表に記した。
シグナルペプチド配列中の「/」は、シグナルペプチドの
タンパク質分解切断が生じて成熟タンパク質が生成され
る位置を示す。
【０１０４】配列番号3812〜4100は、今のところシグナ
ルペプチドをコードする配列が同定されていない完全OR
Fを有する核酸である。しかし、今後の分析によって、
これらの核酸においてシグナルペプチドをコードする配
列が同定される可能性はある。完全ORFの位置を、添付
の配列表に記した。
【０１０５】配列番号4101〜4729は、シグナルペプチド
を含む「不完全ポリペプチド配列」である。「不完全ポリ
ペプチド配列」は、開始コドンは同定されているが停止
コドンはこれまでに同定されていない核酸によってコー
ドされるポリペプチド配列である。これらのポリペプチ
ドは、配列番号24〜652の核酸によってコードされる。
シグナルペプチドの位置を、添付の配列表に記した。さ
らに、以下に記載したように計算したシグナルペプチド
のVon Heijneスコアは、添付の配列表中に「スコア」とし
て記した。シグナル-ペプチドの配列は、添付の配列表
において「seq」として記した。シグナルペプチド配列中
の「/」は、シグナルペプチドのタンパク質分解切断が生
じて成熟タンパク質が生成される位置を示す。
【０１０６】配列番号4730〜7797は、今のところシグナ
ルペプチドが同定されていない不完全ポリペプチドであ
る。しかし、今後の分析によって、これらのポリペプチ
ドにおいてシグナルペプチドが同定される可能性はあ
る。これらのポリペプチドは配列番号653〜3720の核酸
によってコードされている。
【０１０７】配列番号7798〜7888は、シグナルペプチド
を含む「完全ポリペプチド配列」である。「完全ポリペプ
チド配列」は、開始コドンおよび停止コドンが同定され
ている核酸によってコードされるポリペプチド配列であ
る。これらのポリペプチドは、配列番号3721〜3811の核
酸によってコードされている。シグナルペプチドの位置
を、添付の配列表に記した。さらに、以下に記載したよ
うに計算したシグナルペプチドのVon Heijneスコアは、
添付の配列表中に「スコア」として記した。シグナル-ペ
プチドの配列は、添付の配列表において「seq」として記
した。シグナルペプチド配列中の「/」は、シグナルペプ
チドのタンパク質分解切断が生じて成熟タンパク質が生
成される位置を示す。
【０１０８】配列番号7889〜8177は、これまでにシグナ
ルペプチドが同定されていない完全ポリペプチド配列で
ある。しかし、今後の分析によって、これらのポリペプ
チドにおいてシグナルペプチドが同定される可能性はあ
る。これらのポリペプチドは、配列番号3812〜4100の核
酸によってコードされる。
【０１０９】配列番号8178〜36681は、これまでオープ
ンリーディングフレームが確証をもって同定されていな
い核酸配列である。しかし、今後の分析によって、これ
らの核酸におけるオープンリーディングフレームが同定
される可能性はある。
【０１１０】添付の配列表において、核酸配列中の記号
「ｎ」は全ての場合において、ヌクレオチドがアデニン、
グアニン、シトシンまたはチミンであり得ることを意味
する。場合によって、配列表中のポリペプチド配列に記
号「Xaa」が含まれることもある。この記号「Xaa」は、(１)
塩基配列が曖昧なために同定できない残基、または(２)
決定された配列中において(より精密に配列決定された
場合には)存在するはずがないと出願人が考える停止コ
ドンである。遺伝子コードによって示唆される未知のア
ミノ酸の同定にはいくつかの可能性がある場合もある。
【０１１１】Ｉ．完全な5’末端を有するmRNAから誘導
した5’ESTの一般的な取得方法本発明の5’ESTを得るた
めに、完全な5’末端を有するmRNAを得なければならな
い。以下の実施例１では5’ESTの調製を記載する。
【０１１２】実施例１ mRNAの調製 30種類の異なる組織に由来するヒト全RNAまたはポリA+R
NAはそれぞれLABIMOおよびCLONETECHから購入し、以下
のように42のcDNAライブラリーを作製するために使用し
た。購入したRNAは、酸性グアニジウムチオシアネート-
フェノール-クロロホルム抽出（ChomczyniskiおよびSac
chi、Analytical Biochemistry 162:156〜159,1987）を
使用して細胞または組織から単離されたものである。ポ
リA+RNAは、リボソームRNAを除去するために、Avivおよ
びLeder、Proc. Natl.Acad.Sci.USA69:1408〜1412、1972
に記載されるように、オリゴdTクロマトグラフィーを２
回通過させることによって全RNA（LABIMO）から単離し
た。
【０１１３】ポリA+RNAの品質および完全性を調べた。
グロビンプローブによりハイブリダイズされるノーザン
ブロット法を使用して、mRNAが分解されてないことを確
認した。リボソーム配列によるポリA+mRNAの汚染を、ノ
ーザンブロット法と28SrRNAの配列に由来するプローブ
を使用して調べた。rRNAが５％未満であるmRNAの調製物
をライブラリー構築に使用した。外因性配列（原核生物
または真菌）により汚染されたRNAを用いてライブラリ
ーを構築しないように、PCRを使用して、細菌の16Sリボ
ソーム配列の存在または高度に発現される２種の真菌mR
NAの配列を調べた。
【０１１４】種々の組織由来のmRNAを調製した後に、オ
リゴヌクレオチドタグをmRNAの５’末端のキャップに特
異的に結合した。オリゴヌクレオチドタグは、その後の
クローニング手順を容易にするためのEcoRI部位を有し
た。mRNAにオリゴヌクレオチドタグを結合した後、オリ
ゴヌクレオチドタグに相補的なプローブを使用して200
〜500ngのmRNAを用いたノーザンブロット法を行ってmRN
Aの完全性を調査してから、実施例２に記載するように
第１鎖の合成を実施した。
【０１１５】実施例２ 完全な５’末端を有するmRNA鋳型を使用したcDNA合成 オリゴヌクレオチドタグに結合させたmRNAについては、
逆転写酵素とプライマーとしてランダムノナマー（rand
om nonamer）を使用して第１鎖cDNAの合成を行った。こ
の手法の後のステップでの消化からcDNAの内部EcoRI部
位を保護するために、メチル化dCTPを第１鎖合成に使用
した。アルカリ加水分解によってRNAを除去した後、残
存するプライマーを除去するために、第１鎖cDNAをイソ
プロパノールを使用して沈殿させた。
【０１１６】ライゲートされたオリゴヌクレオチドの
５’末端に対応するプライマーを使用してクレノウ（Kl
enow）断片によりcDNAの第２鎖を合成した。クローニン
グ処理における消化からcDNA中の内部EcoRI部位を保護
するために、第２鎖合成においてもメチル化dCTPを使用
した。cDNA合成後、以下の実施例３に記載するようにcD
NAをpBlueScriptにクローニングした。
【０１１７】実施例３ 完全な５’末端を有するmRNAから誘導したcDNAのBlueSc
riptへのクローニング 第２鎖の合成後に、cDNAの両末端をT4DNAポリメラーゼ
（Biolabs）で平滑化し、EcoRIでcDNAを消化した。cDNA
合成中にメチル化dCTPを使用したので、タグ中に存在す
るEcoRI部位がただ１つのヘミメチル化部位であり、従
ってEcoRI消化を受けやすい唯一の部位であった。次い
で、排除クロマトグラフィー（AcA、Biosepra）を使用
してcDNAをサイズ分画し、150bpより大きいcDNAに対応
する画分をプールして、エタノールで沈殿させた。ファ
ージミドpBlueScriptベクター（Stratagene）のSmaIお
よびEcoRI末端にcDNAを方向性を保ってクローニングし
た。ライゲーション混合物を細菌にエレクトロポレーシ
ョンで導入し、適当な抗生物質選択下で増殖させた。以
下の実施例４に記載するように、結合したオリゴヌクレ
オチドタグを有するクローンを選択した。
【０１１８】実施例４ オリゴヌクレオチドタグを結合させたクローンの選択 上記のように作製した5’ESTライブラリーを含有するプ
ラスミドDNAを精製した（Qiagen）。以下のように、タ
グ付きクローンの陽性選択を行った。簡単に説明する
と、この選択手順では、ファージF1の遺伝子IIエンドヌ
クレアーゼを、エキソヌクレアーゼIIIまたはT7遺伝子
６エキソヌクレアーゼなどのエキソヌクレアーゼ（Chan
gら、Gene 127:95〜8、1993）と共に使用して、プラスミ
ドDNAを１本鎖DNAに変換した。次いで、得られた１本鎖
DNAを、Fryら、Biotechniques、13:124〜131、1992に記載
されるように、常磁性ビーズを使用して精製した。この
手順では、１本鎖DNAを、オリゴヌクレオチドタグの３
末端に対応する配列を有するビオチン化オリゴヌクレオ
チドとハイブリダイズさせた。ビオチン化オリゴヌクレ
オチドに相補的な配列を含むクローンは、インキュベー
ションによって、ストレプトアビジンを被覆した磁気ビ
ーズに捕捉して、次に磁気的に選択した。陽性クローン
の捕捉後、磁気ビーズからプラスミドDNAを放出させ、A
mersham Pharmacia Biotech製のThermosequenaseなどの
DNAポリメチラーゼを使用して２本鎖DNAに変換した。次
いで、２本鎖DNAを細菌にエレクトロポレーションで導
入した。5’タグ付きオリゴヌクレオチドを有する陽性
クローンのパーセンテージは、ドットブロット分析を使
用して一般に90〜98％の範囲であると推定された。エレ
クトロポレーション後、ライブラリーを384-マイクロタ
イタープレート（MTP）に並べた。MTPのコピーを今後使
用するために保管した。次いで、ライブラリーを96MTP
に移し、以下のように配列決定した。
【０１１９】実施例５ 選択したクローン中のインサートの配列決定 最初に、標準的なSETA-AおよびSETA-Bプライマー（Gens
et SA）、AmpliTaqGold（Perkin-Elmer）、dNTPs（Boeh
ringer）、Perkin-Elmer Corporationが推奨する緩衝液
およびサイクル条件を使用して、PE9600サーモサイクラ
ー（Perkin-Elmer、Applied Biosystems Division、カリ
フォルニア州フォスターシティ）でPCRによりプラスミ
ドインサートを増幅した。
【０１２０】次いで、自動ABIプリズム(Prism)377シー
クエンサー（Perkin-Elmer）を使用してPCR産物を配列
決定した。配列決定反応は、標準的な色素-プライマー
化学とThermoSequenase（Amersham Pharmacia Biotec
h）を用いたPE9600サーモサイクラーを使用して実施し
た。使用したプライマーは適宜にT7または21M13（Gense
tSAより入手可能）のいずれかであった。プライマーはJ
OE、FAM、ROXおよびTAMRA染料で標識した。配列決定反
応に使用したdNTPsおよびddNTPsはベーリンガーから購
入した。配列決定用緩衝液、試薬の濃度およびサイクル
条件はAmershamが推奨するとおりにした。
【０１２１】配列決定反応後、試料をエタノールで沈殿
させ、ホルムアミドローディング用緩衝液で懸濁し、標
準的な４％アクリルアミドゲルにのせた。電気泳動はAB
I377シークエンサーで3000Vで2.5時間実施し、配列デー
タを収集し、ABIプリズム(Prism)DNAシークエンシング
分析ソフトウェア、バージョン2.1.2を使用して分析し
た。
【０１２２】実施例６ 完全な5'末端を有するmRNAから得られる完全長cDNAライ
ブラリーから５’ESTを得る あるいはまた、5’ESTはその他のcDNAまたはゲノムDNA
ライブラリーから単離できる。そのようなcDNAまたはゲ
ノムDNAライブラリーは、商業的ソースから入手する
か、当業者に公知の他の方法を使用して作製することに
よって得られる。そのようなcDNAライブラリー構築物の
一例である完全長cDNAライブラリーは以下の通りであ
る。
【０１２３】実施例１に記載のように、ポリA+RNAを調
製し、それらの質を調べる。次いで、ポリA+RNAの5’末
端にあるキャップを、オリゴヌクレオチドタグに特異的
に結合する。オリゴヌクレオチドタグは、EcoRIなどの
制限部位を含んで、その後のサブクローニング過程を簡
易化してもよい。次いでノーザンブロッティングを行っ
て、オリゴヌクレオチドタグが結合したmRNAの大きさを
調べ、該mRNAが実際にタグ付けされているかどうかを確
認する。
【０１２４】その後、ランダムノナマーの代わりにオリ
ゴ-dTプライマーを用いたこと以外は上記実施例２に記
載したように、オリゴヌクレオチドタグに結合したmRNA
のための第１鎖合成を行う。例えば、このオリゴ-dTプ
ライマーは、それぞれの組織が互いと異なる４ヌクレオ
チドの内部タグを含んでいてもよい。mRNAの5'末端に結
合したオリゴヌクレオチドタグに含まれるプライマーを
用いた第２鎖の合成の後、得られた二本鎖完全長DNAの
平滑末端を付着末端に改変してサブクローニングしやす
くする。例えば、オリゴヌクレオチドタグのEcoRI部位
を用い、かつ完全長cDNAの3’末端にHindIIIアダプター
を付加することによって完全長cDNAの両端を改変して、
BluescriptベクターのEcoRIおよびHindIII部位へサブク
ローニングできるようにしてもよい。
【０１２５】次いで、当業者に公知の方法を用いて、完
全長cDNAをそれらの大きさによっていくつかの画分に分
離する。例えば、電気泳動分離を適用して、３または６
つの異なる画分を産生してもよい。ゲル抽出および精製
の後、cDNA画分を適切なベクター(Bluescriptベクター
など)にサブクローニングし、コンピテントな細菌に形
質転換し、適切な抗生物質条件下にて増殖させる。その
後、タグ付け完全長cDNAを含むプラスミドを、実施例４
に記載ように陽性選択する。
【０１２６】次いで、そのようなcDNAライブラリーから
単離した完全長cDNAの5'末端を、実施例５に記載のよう
に配列決定してもよい。
【０１２７】II．2.単離した5’ESTのコンピュータ解
析：NetGeneTMおよびSignalTagTMデータベースの構築 上記のように作製した42のcDNAライブラリーの配列デー
タをデータベースに転送し、そこで品質管理ステップと
バリデーションステップを行った。Unixシステムを用い
て作動する塩基読み上げ装置 (base-caller)は、ピーク
の形状、ピーク間分解能およびノイズレベルを考慮し
て、疑わしいピークを自動的に表示した。専売の塩基読
み上げ装置は、自動トリミングも行った。疑わしいピー
クが４つより多い25個以下の塩基の伸長部はいかなるも
のも信頼性がないとみなされ、破棄された。クローニン
グベクターまたはライゲーションオリゴヌクレオチドに
対応する配列は自動的にEST配列から除去した。しか
し、得られたEST配列は、5’末端に上記の配列に属する
1〜5塩基を含有してもよい。必要に応じて、これらはケ
ースごとに容易に除去することができる。
【０１２８】上記のように配列決定した後に、5’ESTの
配列を、以下に記載するようなかつ図１に示すような格
納と操作のためのデータベースであるNetGeneTMに入力
した。目的の配列のためにNetGeneTMデータベース中のE
STを検索する前に、目的でないmRNA由来のEST(内因性も
しくは外因性汚染、冗長配列、小さい配列、高度に変性
した配列、または反復配列)を同定し、以後の考慮から
排除した。
【０１２９】配列決定過程の精度、および上記した5'選
択の効率を決定するために、目的でない配列を排除した
後に、NetGeneTMデータベースから得た５’ESTに対し
て、実施例７および８に記載の分析をそれぞれ行った。
【０１３０】実施例７ 既知の配列との比較による配列決定精度の測定 実施例5に記載の配列決定手順の精度をさらに決定する
ために、既知の配列から誘導されたNetGeneTMの5’EST
の配列を同定し、元の既知の配列と比較した。まず、両
末端にある５塩基対より短い突出部を用いたFASTA分析
を5’ESTに対して行って、公的なヒトmRNAデータベース
の入力事項と一致するものを同定した。次いで、既知の
ヒトmRNAと一致した6655の5’ESTを、起源を同じくする
mRNAと再度アライメントさせ、ダイナミックプログラミ
ングを使用して、認識される「エラー」のリストに置
換、挿入および欠失を含めた。擬似クローニング部位が
配列決定精度の分析に含まれることを避けるために、
5’EST配列の最後の10塩基に発生するエラーを無視し
た。
【０１３１】この分析で、NetGeneTMデータベースに収
録された配列の精度は、99.5%を超えることが明らかに
なった。
【０１３２】実施例８ 5’EST選択効率の決定 上記選択手順で、mRNAの５'末端付近の配列を含む5’ES
Tを、それらの起源であるmRNAから単離した際の効率を
決定するために、伸長因子１サブユニットα遺伝子およ
びフェリチン重鎖遺伝子に由来する5’ESTの末端の配列
を、これらの遺伝子の既知のcDNA配列と比較した。両遺
伝子の転写開始部位は十分に特性決定されているため、
それらを使用して、真の転写開始部位を含む誘導5’EST
のパーセンテージを決定することが可能である。
【０１３３】両遺伝子とも、得られた5’ESTの95%より
多くが、対応するmRNAの５'末端付近の配列または５'末
端より上流の配列を実際に含んでいた。
【０１３４】NetGeneTMデータベースのESTから5’ESTを
単離する手順の信頼性分析を拡張するために、比較用に
GenBankデータベースリリース97から引き出したヒトmRN
A配列を含むデータベースを使用して、同様の分析を実
施した。GeneBankデータベースに収録されているmRNA由
来の5’ESTは、その85%より多くの５'末端が、既知の配
列の５'末端付近に位置していた。GenBankデータベース
で入手可能なmRNA配列の一部は、ゲノム配列から推定さ
れるため、これらの配列と一致する５'末端は内部一致
とみなされる。従って、ここで使用した方法では、対応
するmRNAの真の５'末端を含むESTの収率が過少評価され
る。
【０１３５】実施例９ ５’ESTのクラスター化(clustering) 上記作製したcDNAライブラリーは、同じmRNA由来のマル
チプル5’ESTを含むため、オーバーラップ5’ESTを連続
配列に組み立ててもよい。以下の方法(図１を参照)は、
異なる遺伝子由来のmRNAのためのコンセンサス5’EST配
列だけでなく、選択的にスプライシングされたmRNA等、
同じ遺伝子から転写された異なるmRNA(いわゆる変異体)
のためのコンセンサス5’EST配列も産生するために、い
かに効率的に5’ESTをクラスター化するかを説明する。
このクラスター化は、NetGeneTM5’EST配列セットに対
して、内因性汚染の排除、不正な配列の排除、および反
復配列のマスキングの後に行った。
【０１３６】まず、配列セット全体を、所定の長さだけ
互いと完全な対合を示す配列を含む、より小さいセット
(いわゆるクラスター)に分割した。このようなクラスタ
ーは、少数の異なる遺伝子に由来する5’ESTを含む。一
部の5’配列は、他のいずれの配列とも相同的ではなか
ったか、または相同性が正確に検出されなかったため
に、この方法を用いてクラスター化されなかった。この
問題を解決するために、クラスター化されなかった配列
(いわゆるシングルトン(singleton))を、後に得るコン
センサス・コンティグ化ESTと比較し、必要であれば、
適切なクラスターに含めて他のコンセンサス・コンティ
グ化ESTを計算するのに使用する。
【０１３７】その後、所定の遺伝子の全ての変異体を、
それぞれのクラスターにおいて以下のように同定した。
所定のクラスター内のオーバーラップ配列を指向グラフ
として表わした。該グラフにおいて、各配列はノードで
あり、それぞれ端部がオーバーラップする。次いで、グ
ラフの１つに含まれ、異なるコネクスコンポーネント(c
onnex component)で表わされる異なる遺伝子を同定し、
互いから単離した。その後、同じ遺伝子の異なる変異体
を、コネクスコンポーネント中の分岐点の検出に基づく
アルゴリズムを用いて単離した。所望であれば、cDNAラ
イブラリーなどの生物学的組織から得た核酸サンプル中
のクローンをコンセンサス・コンティグ化ESTの配列に
基づくプローブとハイブリダイズさせ、それらを配列決
定することによって同定して、コンセンサス・コンティ
グ化EST配列を確認してもよい。
【０１３８】次いで、同じ変異体に属したオーバーラッ
プ5’EST配列、および同じクラスターに含まれる5’EST
配列をコンティグ化し、各変異体についてコンセンサス
・コンティグ化5’EST配列を生成した。得られたコンセ
ンサス・コンティグ化5’EST配列のいくつかは不完全で
あった。これは、唯一含まれるオーバーラップ5’EST配
列は遺伝子を単離すると考えられるという事実、および
変異体を見つけるために開発したアルゴリズムに起因す
る。これらの変異体コンセンサス・コンティグ化5’EST
配列を以下のように伸長した。同じ遺伝子から転写した
変異体を、対ごとに比較し、5’および/または3’のい
ずれかにおいて不完全な5’ESTコンセンサス配列は、他
の変異体由来の適切な配列で伸長した。５’または３’
において最終的に完成した各クラスター由来の全ての
５’ESTコンセンサス配列は、その後、同クラスターに
ついて得た個々の5’EST配列セット全体と比較した。
【０１３９】実施例１０ 5’ESTの最も可能性の高いオープンリーディングフレー
ムの同定 その後、最も可能性の高いコードオープンリーディング
フレーム(ORF)を、それぞれのコンセンサスアセンブル
化５’ESTまたは５’ESTについて決定した。
【０１４０】各核酸配列を、まず、いくつかのサブ配列
に分け、当業者に公知の異なる方法(例えば、N-mer頻度
およびその変異体の評価(FickettおよびTung, Nucleic
Acids Res; 20:6441-50 (1992))または平均相互情報法
(Grosseら、International Conference on Intelligent
Systems for Molecular Biology, Montreal, Canada,J
une 28-July 1, 1998))を用いてそのコード化傾向を評
価した。次に、上記した方法によって得られるそれぞれ
のスコアを、分配端(distribution extremity)によって
標準化し、神経ネットワークを用いて所与の配列のコー
ド化確率を表わす独自のスコアと融合する。
【０１４１】次いで、それぞれの配列について得られた
コード化確率スコア、つまり各リーディングフレームに
ついて得られた確率スコアプロフィールを、配列上に存
在する開始コドンに結合させる。各オープンリーディン
グフレーム(ATGコドンで始まる少なくとも50ヌクレオチ
ドの核酸配列と規定される)について、ORFスコアを決定
した。基本的に、このスコアは、局所的に高いスコア値
を負に計量し、維持された高いスコア値を正に計量する
関数で補正した正しいリーディングフレーム内で考慮さ
れるORF対応する各サブ配列について計算した確率スコ
アの合計である。最も高いスコアを有するORFを選択す
る。
【０１４２】２種類のORFを考慮する。いくつかの実施
形態において、コンセンサスアセンブル化5’EST配列の
末端まで伸長する少なくとも50アミノ酸のORFをコード
する5’ESTを得る。別の実施形態においては、少なくと
も100アミノ酸を含み、完全ORF(即ち、開始および停止
コドンを有するORF)をコードする5’ESTを得る。
【０１４３】実施例１１ 配列分析 実施例９に記載のクラスター化方法を、内因性汚染およ
び不正配列のない選択された126,735 のNetGeneTM 5’E
STのセットに適用したところ、9490のコンセンサスアセ
ンブル化5’EST配列または変異体が、合計8037遺伝子が
クラスター化され、98,973の個々の5’ESTを表わしてい
た。その内の１つで、21,138の配列を含み、かつ公開さ
れている配列と比較してキメラを含むと分かったものを
その後の分析から外した。
【０１４４】クラスター化されていない5’EST(即ち、
シングルトン)、およびコンセンサス・コンティグ化5’
ESTを、以下のように既知の配列と比較した。ヒトmRNA
配列と一致した配列は、その後の分析から外した。次い
で、反復配列をマスキングした後に、本発明者らによっ
て既に発見されている配列と対合する配列(即ち、10ヌ
クレオチド未満の突出部でのBLAST2Nを使用して40ヌク
レオチドよりも長い伸長部にわたって90％を上回る相同
性を示す配列)を、以後の考慮から外した。最終的なセ
ットは、本発明の配列(配列番号24〜4100および8178〜3
6681)、即ち、31,267の5’ESTおよび24,972のシングル
トンを含む6398クラスターから得た7609コンセンサス・
コンティグ化5’ESTを表わす。
【０１４５】得られた6398のクラスターの内、658が多
変異体である(即ち、同じ遺伝子のいくつかの変異体を
含む)ことが分かった。表Ｉは、内部参照(第１列)に由
来して命名されている各多変異体クラスターを示してお
り、全ての変異体のコンセンサス配列の一覧であり、各
変異体は異なる配列番号で示される。
【０１４６】その後、最も可能性のあるオープンリーデ
ィングフレームを、本発明の全配列について実施例10に
記載のように決定した。少なくとも50アミノ酸の長さの
不完全ORF(配列番号4101〜7797)をコードする3,697の
5’EST(配列番号24〜3720)を見出した。さらに、少なく
とも100アミノ酸の完全ORF(配列番号7798〜8177)をコー
ドする380の5’EST(配列番号3721〜4100)を見出した。
【０１４７】配列番号24〜4100および8178〜36681のヌ
クレオチド配列、ならびに配列番号24〜4100にコードさ
れるアミノ酸配列(即ち、配列番号4101〜8177のアミノ
酸配列)は、添付の配列表に示されている。アミノ酸配
列のいくつかは、符号「Xaa」を含んでいる。これらの
符号「Xaa」は、(１)塩基配列が曖昧なために同定できな
い残基、または(２)決定された配列中において(より精
密に配列決定された場合には)存在するはずがないと出
願人が考える停止コドンを示す。
【０１４８】配列番号24〜4100および8178〜36681の核
酸配列の１つが、1つ以上の誤ったまたは曖昧なヌクレ
オチドを含む疑いがあれば、評価するヌクレオチドを含
む断片を再度配列決定することによってこの曖昧さを容
易に解明できる。1つ以上の誤ったまたは曖昧なヌクレ
オチドが検出された場合、補正された配列を、その配列
が単離されたクラスターに含め、他のORFが同定される
他のコンセンサス・コンティグ化配列を計算するために
使用しなければならない。配列決定のエラーまたは曖昧
さを解明するための核酸断片は、寄託クローンから得る
かまたは本明細書に記載の技術を使用して単離できる。
そのような曖昧さまたはエラーの解明は、曖昧なまたは
エラーのある配列付近に配置された配列にハイブリダイ
ズするプライマーを用いることによって容易になる。例
えば、プライマーは、曖昧さまたはエラーが50〜75塩基
内にある配列にハイブリダイズできる。エラーまたは曖
昧さの解明の際に、対応する補正をエラーまたは曖昧さ
を含むDNAによってコードされるタンパク質配列に対し
て行うことができる。特定のクローンによってコードさ
れるタンパク質のアミノ酸配列は、クローンを適切な宿
主細胞中で発現し、タンパク質を回収し、その配列を決
定することによって決定できる。
【０１４９】さらに、配列番号4101〜8177の配列の１つ
が、配列におけるフレームシフトのために平滑末端ORF
を含むと疑われる場合、以下の２つの方法を組み合わせ
ることによってこのようなフレームシフトエラーを補正
することができる。第１の方法は、全ての二重予測の徹
底的な試験(即ち、異なるリーディングフレームに位置
する２つのORFの確率スコアが高く近似(好ましくは差が
0.4未満)する場合は全て)を含む。２つの潜在的ORFオー
バーラップ領域の精密な試験によってフレームシフトが
検出しやすくなる。第2の方法において、既知のタンパ
ク質との相同性を用いて疑わしいフレームシフトを補正
する。
【０１５０】実施例１２ 5’ESTにおける潜在的シグナル配列の同定 Von Heijne, Nucleic Acids Res. 14:4683-4690, 1986
（参照により、その開示内容を本明細書に援用する）に
開示されている手順に一部修正を加えたものを使用し
て、配列番号4101〜8177のアミノ酸配列を検索して、潜
在的シグナルモチーフを同定した。Von Heijneシグナル
ペプチド同定マトリクス中の少なくとも3.5のスコアを
有する長さが15アミノ酸の伸長部をコードするこれらの
配列は、シグナル配列を有すると考えられ、SIGNALTAG
TMと称するデータベースに加えた。
【０１５１】シグナル配列を含む720の核酸配列の配列
(配列番号24〜652および3721〜3811)、ならびに潜在的
シグナルペプチドを有する対応するポリペプチド(配列
番号4101〜4729および7798〜7888)は、本明細書に添付
の配列表に示した。このようなポリペプチドのシグナル
ペプチドは、添付の配列表に特記している。配列表の規
則に従って、添付の配列表において完全なタンパク質
(即ち、シグナルペプチドおよび成熟タンパク質を含有
するタンパク質)は、負の数のアミノ酸残基から正の数
のＣ末端アミノ酸残基まで延伸している。したがって、
シグナルペプチドの切断によって生じる成熟タンパク質
の第1のアミノ酸は、アミノ酸１と示され、シグナルペ
プチドの第１のアミノ酸は相当した負の数で示される。
【０１５２】シグナル配列を同定するための上記方法の
精度を確認するために、実施例１３の分析を実施した。
【０１５３】実施例１３ 5’ESTにおける潜在的シグナル配列の同定精度の確認 全てのヒトSwissProtタンパク質のＮ末端に位置する43
のアミノ酸に本方法を適用することによって、シグナル
ペプチドをコードしているシグナル配列を同定するため
の上記手順の精度を評価した。各タンパク質についてコ
ンピュータ演算したVon Heijneスコアを、分泌タンパク
質または非分泌タンパク質であるとして、既知のタンパ
ク質の特性決定と比較した。このようにして、3.5より
高いスコアを有する（偽陽性）非分泌タンパク質の数お
よび3.5より低いスコアを有する（偽陰性）分泌タンパ
ク質の数を算出することができた。
【０１５４】上述の分析結果を使用して、mRNAの５'領
域によりコードされるペプチドが、実際に、そのVon He
ijneスコアに基づいた真のシグナルペプチドである確率
を、ヒトタンパク質の10％が分泌されるという仮説また
はヒトタンパク質の20％が分泌されるという仮説のいず
れかに基づいて算出した。この分析結果を、図２に示
す。
【０１５５】上述の分泌タンパク質同定方法を使用し
て、分泌されることが判明している以下のポリペプチド
の5’ESTを獲得した：ヒト・グルカゴン、γインターフ
ェロン誘導性モノカイン前駆体、分泌されたシクロフィ
リン様タンパク質、ヒト・プレイオトロフィン(pleiotr
opin)、およびヒト・ビオチニダーゼ前駆体。従って、
上述の方法は、シグナルペプチドをコードする5’ESTを
首尾よく同定した。
【０１５６】5’ESTまたはコンティグ化・コンセンサス
5’ESTによりコードされるシグナルペプチドが、シグナ
ルペプチドとして実際に機能することを確認するため
に、5’ESTまたはコンセンサス5’EST由来のシグナル配
列を、シグナルペプチドの同定用に設計されたベクター
にクローニングすることが可能である。このようなベク
ターは、機能し得る形で連結されたシグナル配列を有す
るベクターを含有する宿主細胞のみに、選択培地で増殖
する能力を与えるように設計されている。たとえば、
5’EST またはコンセンサス5’ESTが真のシグナルペプ
チドをコードすることを確認するためには、5’EST ま
たはコンセンサス5’ESTのシグナル配列を、米国特許第
5,536,637号（その開示内容を参照により本明細書に援
用する）に記載されているようなシグナルペプチド選択
ベクター中の非分泌型酵母インベルターゼ遺伝子の上流
へフレーム内で読取り枠が合うように挿入すればよい。
正確に挿入された5’EST またはコンセンサス5’ESTシ
グナル配列を含むシグナル配列選択ベクターを含有する
宿主細胞が増殖することによって、5’EST またはコン
センサス5’ESTが真のシグナルペプチドをコードするこ
とが確認される。
【０１５７】あるいは、シグナルペプチドの存在は、ES
Tまたはコンセンサス5’ESTを用いて得られる伸長cDNA
を、以下に記載するようなpXT1のような発現ベクターへ
クローニングするか、シグナルペプチドとアッセイ可能
なリポータータンパク質との融合タンパク質をコードす
るプロモーター-シグナル配列-レポーター遺伝子ベクタ
ーを構築することによって確認することが可能である。
適当な宿主細胞（たとえば、COS細胞やNIH 3T3細胞）に
これらのベクターを導入した後、増殖培地を回収して、
分泌されたタンパク質の有無について分析することが可
能である。これらの細胞から得られる培地を、シグナル
配列または伸長cDNAインサートが欠如しているベクター
を含有する対照細胞から得られる培地と比較して、機能
的シグナルペプチドまたは真の分泌タンパク質をコード
するベクターを同定する。
【０１５８】実施例１４ 5'ESTの新規性の度合いの評価 新しい配列の収率を評価するために、得られた5'ESTお
よびコンセンサス・コンティグ化5'ESTを、EMBLリリー
ス57および出願時に利用可能であった毎日更新される最
新情報から引き出した全ての既知のヒトmRNAと比較し
た。反復配列のマスキングの後、BLAST2Ｎを用いて両方
の鎖について比較を行った。公開されている配列との相
同性がその配列全体にわたって95％を超える配列であっ
て、各端部の突出部が長くて10ヌクレオチドである配列
は、過去に同定されたものとみなした。従って、5'EST
の約90％またはコンセンサス・アセンブル化5'EST（con
sensus assembled 5'EST）は、同定されていないものと
みなした。
【０１５９】ＩＩ．３ 5'ESTまたは伸長cDNAに対応
するmRNAの空間的および時間的発現の評価 以下の実施例15に記載の通り、配列番号24〜4100および
8178〜36681の各々も、その対応するmRNAを採取した組
織に基づいて同様に分類した。
【０１６０】実施例15 5'ESTを採取したmRNAの発現パターン 表ＩＩは、それぞれ5'EST（非クラスター化EST）および
各コンセンサス・コンティグ化ESTの各々の空間的分布
を表わす。表ＩＩは、5'EST（本明細書中には他に非ク
ラスター化ESTまたはシングルトン（singleton）とも呼
ばれる）およびコンセンサス・コンティグ化ESTの配列
番号を提供する。また、表IIは、コンティグされたコン
センサスESTをアセンブリするために使用した各タイプ
の組織から得たESTの数をリストアップしている。１つ
の組織から得た１つの5'ESTを含む表II中の配列番号
は、5'ESTである。表IIにリストアップされた組織のタ
イプは、文字でコード化した。文字コードと組織型との
対応は、表IIIに記載されている。例えば、配列番号47
のコンセンサス・コンティグ化ESTは、癌性前立腺から
得た１つの5'EST、リンパ節由来の２つの5'EST、および
睾丸由来の２つの5'ESTを含む。
【０１６１】5'ESTおよびコンセンサス・コンティグ化
5'ESTを、それらの起源である組織について分類するほ
かにも、以下の実施例16に記載の通りに、5'ESTおよび
コンセンサス・コンティグ化5'ESTに対応するmRNAの空
間的発現パターンおよび時間的発現パターンならびに発
現レベルを決定することが可能である。
【０１６２】以下でさらに詳細に検討を加えるが、これ
らのmRNAの空間的発現パターン、時間的発現パターンお
よび発現レベルを特性決定することは、所望の空間的方
式または時間的方式で、所望のレベルの遺伝子産物を産
生することができる発現ベクターの構築に有用である。
【０１６３】さらに、対応するmRNAが疾患状態に関与す
る5'ESTおよびコンセンサス・コンティグ化5'ESTも同定
することが可能である。たとえば、ある特定の疾患は、
5'ESTまたはコンセンサス・コンティグ化5'ESTに対応す
るmRNAの発現の欠如、過剰発現、または過少発現に起因
すると考えられる。健常者から採取したサンプルにおけ
るmRNAの発現パターンと量を、ある特定の疾患に罹患し
た個体のものと比較することによって、その疾患の原因
である5'ESTまたはコンセンサス・コンティグ化5'ESTを
同定することが可能である。
【０１６４】上述の5'ESTおよびコンセンサス・コンテ
ィグ化5'ESTに関する特性決定手順の結果が、5'ESTおよ
びコンセンサス・コンティグ化5'ESTに隣接する配列を
含む伸長cDNA（下記の通りに得られる）にもあてはまる
ことは明らかであろう。また、必要に応じて、5'ESTお
よびコンセンサス・コンティグ化5'EST自体を特性決定
するよりむしろ、伸長cDNAが得られるまで特性決定を遅
らせてもよいことも明らかであろう。
【０１６５】実施例１６ ＥＳＴ関連核酸に対応するｍＲＮＡの発現レベルおよび
発現パターンの評価 国際特許出願第ＷＯ ９７／０５２７７号（その全内容
を参照により本明細書に援用する）に記載の長いプロー
ブを用いた溶液ハイブリダイゼーションで、ＥＳＴ関連
核酸に対応するｍＲＮＡの発現レベルおよび発現パター
ンを分析することが可能である。簡単に記述すると、特
性決定すべきｍＲＮＡをコードしている遺伝子に対応す
る、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の断片、ＥＳＴ関
連核酸のポジショナルセグメント、またはＥＳＴ関連核
酸のポジショナルセグメントの断片を、バクテリオファ
ージ（Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６）ＲＮＡポリメラーゼプ
ロモーターのすぐ下流のクローニング部位に挿入して、
アンチセンスＲＮＡを作製する。ＥＳＴ関連核酸、ＥＳ
Ｔ関連核酸の断片、ＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグ
メント、またはＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメン
トの断片は、１００以上のクレオチド長を有することが
好ましい。プラスミドを線状にし、修飾リボヌクレオチ
ド（すなわち、ビオチン−ＵＴＰおよびＤＩＧ−ＵＴ
Ｐ）を含むリボヌクレオチドの存在下で転写する。この
二重に標識した過剰のＲＮＡを、溶液中で、目的の細胞
または組織から単離したｍＲＮＡとハイブリダイズさせ
る。標準的なストリンジェント条件下で（８０％ホルム
アミド、０．４Ｍ ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７〜８）中、
４０〜５０℃で１６時間）、ハイブリダイゼーションを
行う。一本鎖ＲＮＡに特異的なリボヌクレアーゼ（すな
わち、ＲＮａｓｅ ＣＬ３、Ｔ１、ＰｈｙＭ、Ｕ２また
はＡ）で消化することによって、ハイブリダイズしてい
ないプローブを除去する。ビオチン−ＵＴＰ修飾が存在
すれば、ストレプトアビジンを被覆したマイクロタイタ
ープレート上にハイブリッドを捕捉することが可能にな
る。ＤＩＧ修飾が存在すれば、アルカリホスファターゼ
に結合させた抗ＤＩＧ抗体を使用するＥＬＩＳＡによっ
て、ハイブリッドを検出および定量することが可能にな
る。
【０１６６】英国特許出願第２ ３０５ ２４１Ａ（その
全内容を参照により本明細書に援用する）に開示されて
いる通りに、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の断片、
ＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメント、またはＥＳ
Ｔ関連核酸のポジショナルセグメントの断片に、遺伝子
発現の連続分析（ＳＡＧＥ）用のヌクレオチド配列をタ
グ付けすることもできる。この方法で、細胞、組織、生
物、または遺伝子発現パターンを決定しなければならな
い核酸の他の起源から、ｃＤＮＡを調製する。このよう
にして得られたｃＤＮＡを２つのプールに分ける。各プ
ール中のｃＤＮＡを、大部分のｃＤＮＡに少なくとも一
つ存在すると思われる認識部位を有する第１の制限エン
ドヌクレアーゼ（アンカリング酵素と呼ばれる）で切断
する。切断されたｃＤＮＡの５'または３'領域を最も多
く含む断片を、ストレプトアビジン被覆ビーズのような
捕捉媒体に結合させることによって単離する。増幅プラ
イマーをハイブリダイズさせるための第１配列と、いわ
ゆるタグ付きエンドヌクレアーゼに対する内部制限部位
とを有する第１のオリゴヌクレオチドリンカーを、第１
のプール中の消化ｃＤＮＡにライゲートする。第２のエ
ンドヌクレアーゼで消化して、ｃＤＮＡから短いタグ付
き断片を生成する。
【０１６７】増幅プライマーをハイブリダイズさせるた
めの第２の配列と内部制限部位とを有する第２のオリゴ
ヌクレオチドを、第２のプール中の消化ｃＤＮＡにライ
ゲートする。第２のプールのｃＤＮＡ断片も、タグ付き
エンドヌクレアーゼで消化して、第２のプールのｃＤＮ
Ａに由来する短いタグ断片を生成する。アンカリング酵
素およびタグ付きエンドヌクレアーゼを用いた、第１の
プールおよび第２のプールの消化によって生じたタグを
互いにライゲートして、いわゆるジタグ(ditag)を生成
する。一部の実施態様では、ジタグをコンカテマー化し
て、ジタグを２〜２００含有するライゲーション産物を
生成する。次いで、タグ配列を決定し、ＥＳＴ関連核
酸、ＥＳＴ関連核酸の断片、ＥＳＴ関連核酸のポジショ
ナルセグメント、またはＥＳＴ関連核酸のポジショナル
セグメントの断片の配列と比較して、細胞、組織、生
物、またはタグを誘導する核酸の他の起源に、どの５'
ＥＳＴ，コンティグ化(contigated)コンセンサス５'Ｅ
ＳＴまたは伸長ｃＤＮＡが発現されるかを決定する。こ
の方法で、細胞、組織、生物、または核酸の他の起源に
おける５'ＥＳＴ、コンティグ化コンセンサス５'ＥＳＴ
または伸長ｃＤＮＡの発現パターンが得られる。
【０１６８】アレイを使用して、遺伝子発現の定量分析
を実施することも可能である。本明細書で使用する用語
「アレイ」は、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の断
片、ＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメント、または
ＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメントの断片の、一
次元、二次元、または多次元の配列(arrangement)を意
味する。ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の断片、ＥＳ
Ｔ関連核酸のポジショナルセグメント、またはＥＳＴ関
連核酸のポジショナルセグメントの断片は、長さが少な
くとも１５ヌクレオチドであることが好ましい。さらに
好ましくは、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の断片、
ＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメント、またはＥＳ
Ｔ関連核酸のポジショナルセグメントの断片は、長さが
少なくとも１００ヌクレオチドである。さらに好ましく
は、断片は長さが１００ヌクレオチドを超える。一部の
実施態様では、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の断
片、ＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメント、または
ＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメントの断片は長さ
が５００ヌクレオチドを超えることもある。
【０１６９】たとえば、Schenaら(Science 270:467-47
0, 1995; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:10614-10
619, 1996)により記載されている通り、相補的ＤＮＡマ
イクロアレイ中のＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の断
片、ＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメント、または
ＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメントの断片を用い
て、遺伝子発現の定量分析を実施することが可能であ
る。ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の断片、ＥＳＴ関
連核酸のポジショナルセグメント、またはＥＳＴ関連核
酸のポジショナルセグメントの断片をＰＣＲで増幅し、
高速ロボット工学を使用して、９６ウェルマイクロタイ
タープレートからシリル処理した顕微鏡スライド上に配
列させた。プリントされたアレイを湿潤チャンバ内でイ
ンキュベートしてアレイエレメントに再度水分を加え、
０．２％SDS中で１分間１回、水中で１分間２回および
水素化ホウ素ナトリウム溶液中で５分間１回すすぐ。こ
のアレイを９５℃の湯に２分間沈め、０．２％SDSに１
分間移し、水で２回すすぎ、風乾し、２５℃の暗所に保
存する。
【０１７０】細胞または組織ｍＲＮＡを単離するか購入
し、１ラウンドの逆転写によってプローブを調製する。
プローブを、１ｃｍ2のマイクロアレイに、１４×１４
ｍｍのカバーガラス下、６０℃で６〜１２時間ハイブリ
ダイズさせる。アレイを、低ストリンジェンシー洗浄用
緩衝液（１×SSC／０．２％SDS）中、２５℃で５分間、
次いで、高ストリンジェンシー洗浄用緩衝液（０．１×
SSC／０．２％SDS）中、室温で１０分間洗浄する。特注
のフィルターセットを取り付けた蛍光レーザー走査装置
を使用して、０．１×SSC中でアレイを走査する。２つ
の独立したハイブリダイゼーションの比率の平均をとる
ことにより、正確な示差的発現の測定値が得られる。
【０１７１】Pietuら(Genome Research 6:492-503, 199
6)により記載されている通り、相補的ＤＮＡアレイ中の
ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の断片、ＥＳＴ関連核
酸のポジショナルセグメント、またはＥＳＴ関連核酸の
ポジショナルセグメントの断片を用いて、遺伝子の発現
の定量分析を実施することも可能である。ＥＳＴ関連核
酸、ＥＳＴ関連核酸の断片、ＥＳＴ関連核酸のポジショ
ナルセグメント、またはＥＳＴ関連核酸のポジショナル
セグメントの断片をＰＣＲ増幅し、膜上にスポットす
る。次いで、様々な組織または細胞に由来するｍＲＮＡ
を放射性ヌクレオチドで標識する。制御条件でハイブリ
ダイズさせて洗浄した後、ハイブリダイズしたｍＲＮＡ
を、ホスホ-イメージングまたはオートラジオグラフィ
で検出する。実験を２回実施し、次いで、示差的に発現
したｍＲＮＡの定量分析を実施する。
【０１７２】あるいは、Lockhartら(Nature Biotechnol
ogy 14: 1675-1680, 1996)およびSosnowskyら(Proc. Na
tl. Acad. Sci. 94:1119-1123, 1997)により記載されて
いる通り、高密度ヌクレオチドアレイによって、ＥＳＴ
関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の断片、ＥＳＴ関連核酸のポ
ジショナルセグメント、またはＥＳＴ関連核酸のポジシ
ョナルセグメントの断片の発現分析を行うことができ
る。ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の断片、ＥＳＴ関
連核酸のポジショナルセグメント、またはＥＳＴ関連核
酸のポジショナルセグメントの断片の配列に対応する１
５〜５０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドをチップ上
に直接合成する(Lockhartら、前掲)か、合成してからチ
ップに処理する(Sosnowskyら、前掲）。オリゴヌクレオ
チドは、長さ約２０ヌクレオチドが好ましい。
【０１７３】ビオチン、ジゴキシゲニンまたは蛍光染料
のような適当な化合物で標識したｃＤＮＡプローブを、
適当なｍＲＮＡ集団から合成し、次いで、５０〜１００
ヌクレオチドの平均サイズまで無作為に断片化する。次
いで、前述のプローブをチップにハイブリダイズさせ
る。Lockhartら（前掲）に記載されている通りに洗浄
し、異なる電場を印加(Sonowskyら、前掲)した後、染料
または標識化合物を検出し、定量する。ハイブリダイゼ
ーションを２回実施する。異なるｃＤＮＡサンプル中の
同一標的オリゴヌクレオチド上のｃＤＮＡプローブに由
来するシグナルの強度を比較分析することで、オリゴヌ
クレオチド配列が設計されるもととなった５'ＥＳＴ、
コンセンサスコンティグ化５'ＥＳＴまたは伸長ｃＤＮ
Ａに対応するｍＲＮＡの示差的発現がわかる。
【０１７４】III．伸長ｃＤＮＡのクローニングおよび
対応するゲノムｃＤＮＡのクローニングのための５'Ｅ
ＳＴの使用 上述の手法を使用して、対応するｍＲＮＡの５'末端を
含む５'ＥＳＴまたはコンセンサスコンティグ化５'ＥＳ
Ｔを選択したら、それらを使用して、５'ＥＳＴまたは
コンティグ化コンセンサス５'ＥＳＴに隣接する配列を
含む伸長ｃＤＮＡを単離することができる。この伸長ｃ
ＤＮＡは、真の翻訳開始部位を含む対応するｍＲＮＡに
よってコードされるタンパク質の全コード配列を含有し
てもよい。伸長ｃＤＮＡが分泌タンパク質をコードする
場合には、シグナル配列、およびシグナルペプチドの切
断後に残る成熟タンパク質をコードする配列を含有して
もよい。対応するｍＲＮＡによってコードされるタンパ
ク質の全コード配列を含む伸長ｃＤＮＡは、本明細書中
で「全長ｃＤＮＡ」と呼ぶ。あるいは、伸長ｃＤＮＡ
は、対応するｍＲＮＡによってコードされるタンパク質
の全コード配列を含んでいなくてもよいが、５'ＥＳＴ
またはコンティグ化コンセンサス５'ＥＳＴに隣接する
配列は必ず含んでいる。伸長ｃＤＮＡが分泌タンパク質
をコードするｍＲＮＡから誘導されるいくつかの実施態
様では、伸長ｃＤＮＡは、シグナルペプチドの切断後に
残る成熟タンパク質をコードする配列のみを含んでもよ
く、シグナルペプチドをコードする配列のみを含んでも
よい。
【０１７５】以下の実施例１７に、５'ＥＳＴまたはコ
ンセンサスコンティグ化５'ＥＳＴを使用して伸長ｃＤ
ＮＡを得るための一般的な方法を説明する。以下の実施
例２８では、数種の分泌タンパク質に関する全コード配
列および対応するｍＲＮＡの真の５'末端を含む伸長ｃ
ＤＮＡを含む、数種の伸長ｃＤＮＡのクローニングおよ
び配列決定について説明する。
【０１７６】実施例１７および１８の方法を使用して、
５'ＥＳＴまたはコンセンサスコンティグ化ＥＳＴに対
応する遺伝子によりコードされるタンパク質の全コード
配列より少ない配列をコードする伸長ｃＤＮＡを得るこ
とができる。一部の実施態様では、これらの方法を使用
して単離される伸長ｃＤＮＡは、配列番号24〜4100およ
び8178〜36681の配列によってコードされるタンパク質
のうちの１つのタンパク質の少なくとも５、１０、１
５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１０
０または１５０個の連続したアミノ酸をコードする。さ
らなる実施態様では、これらの方法を使用して単離した
伸長ｃＤＮＡは、配列番号24〜4100の配列によりコード
されるタンパク質のうちの１つのタンパク質の少なくと
も５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５
０、７５、１００または１５０個の連続したアミノ酸を
コードする。
【０１７７】実施例１７ 全コード領域および対応するｍＲＮＡの真の５'末端を
含む伸長ｃＤＮＡのクロ ーニングおよび配列決定に５'
ＥＳＴを使用するための一般的な方法 伸長ｃＤＮＡの取得に使用される５'ＥＳＴの配列に隣
接した配列を含む伸長ｃＤＮＡを迅速且つ効率よく単離
するのに、下記の一般的な方法が使用されてきた。この
方法は、分泌タンパク質をコードする５'ＥＳＴおよび
コンセンサスコンティグ化５'ＥＳＴを含む本発明の任
意の５'ＥＳＴまたはコンセンサスコンティグ化５'ＥＳ
Ｔに関する伸長ｃＤＮＡを取得するのに使用することが
できる。この方法を、図３にまとめる。
【０１７８】１．伸長ｃＤＮＡの取得 ａ）第１鎖合成 本方法は、ｍＲＮＡの既知の５'配列を利用する。ヌク
レオチド配列を５'末端側に含有するポリｄＴプライマ
ーを用いて精製ｍＲＮＡに逆転写反応を実施し、mＲＮ
Ａの３'末端に対応するｃＤＮＡの末端に既知の配列を
付加させる。このようなプライマーおよび市販の逆転写
酵素を緩衝化ｍＲＮＡサンプルへ添加し、ＲＮＡの３'
側ポリＡ部位で結合した逆転写産物を得る。次いでヌク
レオチド単量体を添加して第１鎖合成を完了させる。
【０１７９】第１ｃＤＮＡ鎖にハイブリダイズしたｍＲ
ＮＡをアルカリ加水分解で除去した後、アルカリ加水分
解の生成物および残留ポリｄＴプライマーを排除カラム
で除去することができる。
【０１８０】ｂ）第２鎖合成 ５'ＥＳＴまたはコンティグ化コンセンサス５'ＥＳＴの
既知の５'配列および第１鎖合成に使用したポリｄＴプ
ライマーによって付加された既知の３'末端に基づい
て、各末端に対する一対のネステッド(nested)プライマ
ーを設計する。プライマーの設計に使用されるソフトウ
エアは、ＧＣ含有量およびオリゴヌクレオチド融解温度
に基づくか（例えばOSPソフトウエア;Illier and Gree
n, PCR Meth. Appl. 1:124-128, 1991)、例えばPC-Rare
(http://bioinformatics.weizmann.ac.il/software/PC-
Rare/doc/manuel.html)のようなオクターマー頻度相違
法(Griffais et al., Nucleic Acids Res. 19: 3887-38
91, 1991)のいずれかに基づく。
【０１８１】５'末端のネステッドプライマーおよび３'
末端のネステッドプライマーは、互いに４〜９塩基離れ
ていることが好ましい。ＰＣＲで使用するのに適した融
解温度および特異性を有するように、これらのプライマ
ー配列を選択することが可能である。
【０１８２】ネステッドプライマー対のそれぞれよりも
外側のプライマーを使用して、第１のＰＣＲを実施し
た。次いで、第１のＰＣＲ産物の少量のサンプルに対し
て、同じ酵素およびネステッドプライマー対のそれぞれ
よりも内側のプライマーを使用した第２のＰＣＲを実施
する。その後、プライマーおよび残留するヌクレオチド
単量体を除去する。
【０１８３】２．全長伸長ｃＤＮＡまたはその断片の配
列決定 ＯＳＰソフトウエアを使用したＰＣＲ用に適合する５'
ネステッドプライマーの設計に対しては位置の制約がな
いため、２つのタイプのアンプリコンが得られる。第２
の５'プライマーは翻訳開始コドンの上流に位置し、従
って、全コード配列を含むネステッドＰＣＲ産物が生成
することが好ましい。このような全長伸長ｃＤＮＡは、
直接クローニング手法に使用してもよい。しかし、第２
の５'プライマーが翻訳開始コドンの下流に位置し、そ
の結果、ＯＲＦの一部のみを含むＰＣＲ産物が生成する
場合もある。このような不完全なＰＣＲ産物を、以下の
セクションｂに記載の改良された手法に供する。
【０１８４】ａ）完全なＯＲＦを含むネステッドＰＣＲ
産物 結果として得られるネステッドＰＣＲ産物が、５'ＥＳ
Ｔまたはコンセンサスコンティグ化５'ＥＳＴ配列から
予期される完全なコード配列を含むとき、そのＰＣＲ産
物を適当なベクターでクローニングする。
【０１８５】ｂ）不完全なＯＲＦを含むネステッドＰＣ
Ｒ産物 アンプリコンが完全なコード配列を含まないとき、完全
なコード配列と、全コード配列を含むＰＣＲ産物の両者
を得るための中間ステップが必要である。異なるＰＣＲ
産物から直接決定される数個の部分的配列から、完全な
コード配列を組み立てることができる。
【０１８６】全コード配列が完全に決定されたら、その
後は、コード領域全部を含むアンプリコンを得るため
に、ＰＣＲ用に適合する新しいプライマーを設計する。
しかし、そのような場合、ＰＣＲ用に適合する３'プラ
イマーは、対応するｍＲＮＡの３'ＵＴＲの内側に位置
し、従って、図３に図示する通り、この領域の一部（す
なわち、ポリＡ領域および時にはポリアデニル化シグナ
ル）が欠如したアンプリコンが生成する。次いで、この
ような全長伸長ｃＤＮＡを適当なベクターにクローニン
グする。
【０１８７】ｃ）伸長ｃＤＮＡの配列決定 Perkin Elmerから入手可能なAmpliTaq ＤＮＡポリメラ
ーゼＦＳキットを用いたDie Terminator法を使用して、
伸長ｃＤＮＡの配列決定を実施することができる。
【０１８８】ＰＣＲ断片の配列を決定するために、プラ
イマーを選択するためのＯＳＰのようなソフトウエア、
および３２ヌクレオチドからなる最小限の重複を使用し
た最初の５'タグを含む歩行配列のコンティグ(contig)
を構築するためのＡＳＭＧ(Sutton et al., Genome Sci
ence Technol. 1: 9-19, 1995)のような自動化コンピュ
ータソフトウエアを使用して、プライマー歩行を実施す
る。全長ｃＤＮＡの配列が得られるまでプライマー歩行
を実施することが好ましい。
【０１８９】３．全長伸長ｃＤＮＡのクローニング 次いで、全コード配列を含有するＰＣＲ産物を適当なベ
クターでクローニングする。たとえば、伸長ｃＤＮＡを
当業界で既知の任意の発現ベクターにクローニングする
ことができる。
【０１９０】上述の通りに得られたＰＣＲ産物は、いず
れの方向にもクローニングすることができる平滑末端を
有する分子であるため、各ＰＣＲ産物について、幾つか
のクローンの配向性を決定する。次いで、４〜１０個の
クローンをマイクロタイタープレートに並べ、ベクター
中のクローニング部位付近に位置する第１のプライマー
およびｍＲＮＡの３'末端に対応する伸長ｃＤＮＡの一
部に位置する第２のプライマーを使用したＰＣＲ反応に
供する。この第２のプライマーは、直接クローニング
（事例ａ）の場合には、アンカード(anchored)ＰＣＲに
使用されるアンチセンスプライマーであってもよく、間
接クローニング（事例ｂ）の場合には、３'ＵＴＲの内
側に位置するアンチセンスプライマーであってもよい。
伸長ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質が発現でき
るように伸長ｃＤＮＡの開始コドンがベクターのプロモ
ーターに機能しうる形で連結されているクローンを保存
し、配列決定する。ｃＤＮＡインサートの末端以外に
も、ｃＤＮＡインサートの両側にあるベクターＤＮＡの
約５０塩基対も配列決定する。
【０１９１】クローン１個当たり少なくとも２つの配列
を得るために、クローン化ＰＣＲ産物を完全に配列決定
する。好ましくは、以下の改変を伴う上述の手法に従っ
て、センスおよびアンチセンス鎖の両方から配列を得
る。第一に、クローンの同一性を確認するために、クロ
ーン化ＰＣＲ産物の５'および３'末端の両方を配列決定
する。第二に、全コード領域が未だに得られていない場
合には、プライマー歩行を実施する。次いで、クローン
化産物の場合にはプライマー歩行配列を使用し、未クロ
ーン化産物の場合には既にコンティグ化(contigated)さ
れている歩行配列を使用して、コンティグ化を実施す
る。得られるコンティグが全コード領域ならびに両端に
ベクターＤＮＡと重複する配列を含む場合には、配列が
完全であると考えられる。各クローン化アンプリコンに
対するコンティグ化配列を全て、コンセンサス配列を得
るのに使用する。
【０１９２】４．本発明の５'ＥＳＴから得られるクロ
ーン化全長配列の選択 下記の通りに夾雑物またはＰＣＲアーチファクトから生
じる不要なクローン化配列を除去するために、陰性選択
を行うことができる。ベクターＤＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍｔ
ＲＮＡ、ｒＲＮＡ配列等の夾雑配列に一致する配列を排
除し、反復配列に対して広範な相同性を示すＯＲＦ配列
をコードする配列を排除する。５'および３'タグ(セク
ション１、事例ａ)上でネステッドプライマーを使用す
る直接クローニングによって得られるが、ポリＡテイル
を欠く配列を排除してもよい。シグナルペプチドを含有
し、かつポリＡテイル以前(事例ａ)またはクローン化
３'ＵＴＲの末端以前(事例ｂ)で終結するＯＲＦのみを
選択してもよい。次いで、サイズが２０アミノ酸未満ま
たは未成熟タンパク質のサイズの２５％未満の成熟タン
パク質といった、望ましくない成熟タンパク質を含むＯ
ＲＦを排除してもよい。
【０１９３】次いで、複数のＯＲＦを含有する残りの全
長伸長ｃＤＮＡの各々については、以下の基準を用いて
ＯＲＦの予備選択を実施することが可能である。シグナ
ルペプチドを有する最長のＯＲＦが好適である。ＯＲＦ
のサイズが同程度の場合には、シグナルペプチドがVon
Heijne法の最高スコアを有するＯＲＦを選択する。
【０１９４】次いで、全長伸長ｃＤＮＡクローンの配列
を、反復配列をマスクしたBLASTと対の状態(pairwise)
で比較することができる。３０ヌクレオチドにわたって
少なくとも９０％の相同性を含有する配列を同一クラス
でクラスター化させることができる。次いで、各クラス
ターを、内部プライミングまたは選択スプライシングよ
り生じる配列、複数のフレームシフトを有する同様の配
列を検出するクラスター分析にかける。この自動分析
は、配列の手動選択の基礎となる。
【０１９５】手動選択は、配列決定された各全長伸長ｃ
ＤＮＡクローンに関して自動的に得られた報告を利用し
て行うことができる。この手動操作の際には、下記の通
りに同一クラスに属するクローン間で選択を操作する。
【０１９６】目的の配列をコードする全長伸長ｃＤＮＡ
クローンの選択は、以下の基準を使用して行う。構造パ
ラメーター（最初のタグ、ポリアデニル化部位およびシ
グナル）を確認してもよい。次いで、クローン配列が既
知の核酸／タンパク質配列と一致するか否かを判定する
ために、既知の核酸およびタンパク質との相同性を調査
し、後者の場合には、そのカバー率と配列が公になった
日付を調査する。キメラまたは二重インサートから得ら
れる配列または染色体の切断点に位置する配列は、他の
配列に対する相同性によって評価することで、この手法
の際に排除してもよい。
【０１９７】上述のように調製した伸長ｃＤＮＡを次い
で遺伝子操作し、サブクローニング、ＰＣＲまたはin v
itroオリゴヌクレオチド合成等の従来の技術を利用して
伸長ｃＤＮＡの所望の部分を含む核酸を得ることができ
る。例えば、伸長ｃＤＮＡが分泌ポリペプチドをコード
する遺伝子から誘導される場合、伸長ｃＤＮＡには、全
コード配列（即ち、シグナルペプチドとシグナルペプチ
ドを切断した後に残存する成熟タンパク質をコードする
配列）、成熟ポリペプチド（即ち、シグナルペプチドを
切断した後に得られるポリペプチド）をコードする配
列、またはシグナルペプチドに対するコード配列のみ、
が含まれる。
【０１９８】同様に、コードされているタンパク質に対
するコード配列の任意の他の所望の部分を含有する核酸
を得ることもできる。例えば、核酸は、伸長ｃＤＮＡの
少なくとも１０、１２、１５、１８、２０、２３、２
５、２８、３０、３５、４０、５０、７５、１００、２
００、３００、５００または１０００個の連続した塩基
を含むことができる。
【０１９９】伸長ｃＤＮＡが得られたら、配列決定を行
ってｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列求める
ことができる。コードされているアミノ酸配列が決定さ
れれば、タンパク質をコードすると予想される多くのｃ
ＤＮＡの任意のものを、遺伝子コードの縮重を利用する
だけで作製および同定することができる。例えば、後述
するように、対立遺伝子変異体または他の相同な核酸を
同定することができる。あるいは、所望のアミノ酸配列
をコードする核酸をin vitroで合成できる。
【０２００】好適な実施態様では、ｃＤＮＡが発現され
る宿主生物に対する既知のコドンまたはコドン対の優位
性を利用してコード配列を選択してもよい。
【０２０１】対応するｍＲＮＡの真の５'末端並びに対
応するｍＲＮＡの全タンパク質コード配列を含むｃＤＮ
Ａを得るためのＰＣＲに基づく方法以外にも、従来慣用
のハイブリダイゼーションに基づく方法を使用してもよ
い。これらの方法を使用して、５'ＥＳＴまたはコンテ
ィグ化コンセンサス５'ＥＳＴの起源であるｍＲＮＡ、
伸長ｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡ、または伸長ｃＤＮ
Ａ、５'ＥＳＴまたはコンティグ化コンセンサス５'ＥＳ
Ｔに相同な核酸をコードするゲノムＤＮＡを得ることが
できる。下記の実施例１８では、このような方法の例を
提供する。
【０２０２】von Heijneの行列法（Nuc. Acids Res. 1
4:14683-4690(1986)）と実施例１２に記載の修飾を利用
して、最初のアミノ酸50個中に、または妥当な場合には
ＯＲＦのアミノ酸２０個以下までのより短い領域内にシ
グナルペプチドが存在するか否かについて、同定された
各ＯＲＦを走査してもよい。
【０２０３】ｄ）ヌクレオチドまたはタンパク質配列に
対する相同性 次いで、全長伸長ｃＤＮＡの配列を既知のヌクレオチド
配列と比較する。全長伸長ｃＤＮＡによってコードされ
るポリペプチドは既知のポリペプチド配列と比較する。
【０２０４】全長伸長ｃＤＮＡの配列は、Genbank, EMB
LデータベースおよびGenseq（特許化されたヌクレオチ
ド配列のDerwent'sデータベース）の脊椎動物およびＥ
ＳＴ配列等の既知の核酸配列と比較する。全長ｃＤＮＡ
配列は、本出願人によって既に同定されている配列を探
すために、私的データベースの配列（Genset内部配列）
とも比較する。BLASTNまたはBLAST2Nのいずれかを用い
た場合に３０ヌクレオチドにわたって９０％を超える相
同性を有するとされた全長伸長ｃＤＮＡの配列は、既に
記載されている配列とみなす。次いで、脊椎動物配列の
マッチングを、FASTAを使用して調査する。３０ヌクレ
オチドにわたって７０％を超える相同性を有する全長伸
長ｃＤＮＡは、既に記載されている配列とみなす。
【０２０５】セクションｃ）で定義したような全長伸長
ｃＤＮＡによってコードされるＯＲＦを、次いで、Swis
sprot, PIRおよびGenptept（特許化されたタンパク質配
列のDerwent'sデータベース）等の公的データベースに
見られる既知のアミノ酸配列と比較する。これらの分析
は、BLASTP（パラメータＷ＝８、最大一致は１０）を用
いて行った。既知のタンパク質配列に対して広範な相同
性を示す全長伸長ｃＤＮＡの配列は、既に同定されてい
るタンパク質とみなす。
【０２０６】さらに、全長伸長ｃＤＮＡの上部鎖の３通
りのフレームを概念的に翻訳した産物を、BLASTX（パラ
メータＥ＝0.001）を用いるSwissprotの公知のアミノ酸
配列と比較する。３０アミノ酸領域にわたって７０％を
超える相同性を有する全長伸長ｃＤＮＡの配列は、既に
同定されているアミノ酸として検出する。
【０２０７】５．本発明の５'ＥＳＴから得られたクロ
ーン化全長配列の選択 次いで、前述のコンピューター分析によって予め特性決
定しておいたクローン化全長伸長ｃＤＮＡ配列を、目的
の配列を含有する全長伸長ｃＤＮＡを予備選択するため
に自動手法にかける。
【０２０８】ａ）自動配列予備選択 両末端でベクターに結合(clipped)した完全なクローン
化全長伸長ｃＤＮＡの全てを考慮する。第一に、下記の
通りに夾雑物またはＰＣＲアーチファクトから生じる不
要なクローン化配列を除去するために、陰性選択を操作
する。セクション４ａ）に記載のように、ベクターＤＮ
Ａ、ｔＲＮＡ、ｍｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ配列等の夾雑配列
に一致する配列を排除し、反復配列に対して広範な相同
性を示すＯＲＦ配列をコードする配列を排除する。５'
および３'タグ(セクション１、事例ａ)上でネステッド
プライマーを使用する直接クローニングによって得られ
るが、ポリＡテイルを欠く配列を排除してもよい。シグ
ナルペプチドを含有し、かつポリＡテイル以前(事例ａ)
またはクローン化３'ＵＴＲの末端以前(事例ｂ)で終結
するＯＲＦのみを維持する。次いで、サイズが２０アミ
ノ酸未満または未成熟タンパク質のサイズの２５％未満
の成熟タンパク質といった、望ましくない成熟タンパク
質を含むＯＲＦを排除する。
【０２０９】次いで、複数のＯＲＦを含有する残りの全
長伸長ｃＤＮＡの各々については、以下の基準を用いて
ＯＲＦの予備選択を実施する。シグナルペプチドを有す
る最長のＯＲＦが好適である。ＯＲＦのサイズが同程度
の場合には、シグナルペプチドがVon Heijne法の最高ス
コアを有するＯＲＦを選択する。
【０２１０】次いで、全長伸長ｃＤＮＡクローンの配列
を、反復配列をマスクしたBLASTと対の状態で比較す
る。３０ヌクレオチドにわたって少なくとも９０％の相
同性を含有する配列を同一クラスでクラスター化させ
る。次いで、各クラスターを、内部プライミングまたは
選択スプライシングより生じる配列、複数のフレームシ
フトを有する同様の配列を検出するクラスター分析にか
ける。この自動分析は、配列の手動選択の基礎となる。
【０２１１】ｂ）手動配列選択 手動選択は、配列決定された各全長伸長ｃＤＮＡクロー
ンに関して自動的に得られた報告を利用して行うことが
できる。この手動操作の際には、下記の通りに同一クラ
スに属するクローン間で選択を操作する。同一のクラス
に属するクローンによってコードされるＯＲＦ配列は、
アライメントをとって比較する。同一のクラスに属する
クローンのヌクレオチド配列間の相同性が３０ヌクレオ
チド領域にわたって９０％を超える場合、または同一の
クラスに属するクローンのアミノ酸配列間の相同性が２
０アミノ酸領域にわたって８０％を超える場合には、ク
ローンは同一であると考える。選択したＯＲＦは、既知
のアミノ酸配列との一致を示すものであるか、または自
動配列予備選択のセクションで触れた基準に従うものが
最良である。ヌクレオチドおよびアミノ酸の相同性はそ
れぞれ９０％未満および８０％未満であり、クローンが
目的の配列を含む場合には、選別し得る異なるタンパク
質がコードされていると言える。
【０２１２】目的の配列をコードする全長伸長ｃＤＮＡ
クローンの選択は、以下の基準を使用して行う。構造パ
ラメーター（最初のタグ、ポリアデニル化部位およびシ
グナル）をまず確認する。次いで、クローン配列が既知
のヌクレオチド／タンパク質配列と一致するか否かを判
定するために、既知の核酸およびタンパク質との相同性
を調査し、後者の場合には、そのカバー率と配列が公に
なった日付を調査する。ＥＳＴもしくはゲノムＤＮＡ以
外の配列との間に広範な一致が認められない場合、また
はクローン配列が実質的に新規な情報（例えば、既知の
タンパク質をコードするｍＲＮＡの選択的スプライシン
グによって生じるタンパク質をコードしているといった
情報）を有している場合には、その配列を維持する。目
的の配列を含有するこのようなクローン化全長伸長ｃＤ
ＮＡの例は、実施例１８に記載する。キメラまたは二重
インサートから得られる配列または染色体の切断点に位
置する配列は、他の配列に対する相同性によって評価す
ることで、この手法の際に排除する。
【０２１３】上述のように調製した伸長ｃＤＮＡを次い
で遺伝子操作し、サブクローニング、ＰＣＲまたはin v
itroオリゴヌクレオチド合成等の従来の技術を利用して
伸長ｃＤＮＡの所望の部分を含む核酸を得ることができ
る。例えば、当業者に公知の技術を利用して、全コード
配列（即ち、シグナルペプチドとシグナルペプチドを切
断した後に残存する成熟タンパク質をコードする配列）
のみを含む核酸を得ることができる。あるいは、従来慣
用の技術を適用して、シグナルペプチドを切断した後に
残存する成熟タンパク質のコード配列のみを含む核酸、
またはシグナルペプチドのコード配列のみを含む核酸を
得ることができる。
【０２１４】同様に、コードされているタンパク質に対
するコード配列の任意の他の所望の部分を含有する核酸
を得ることもできる。例えば、核酸は、伸長ｃＤＮＡの
少なくとも１０、１５、１８、２０、２５、２８、３
０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２０
０、３００、４００または５００個の連続した塩基を含
むことができる。
【０２１５】伸長ｃＤＮＡが得られたら、配列決定を行
ってｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列求める
ことができる。コードされているアミノ酸配列が決定さ
れれば、タンパク質をコードすると予想される多くのｃ
ＤＮＡの任意のものを、遺伝子コードの縮重を利用する
だけで作製および同定することができる。例えば、後述
するように、対立遺伝子変異体または他の相同な核酸を
同定することができる。あるいは、所望のアミノ酸配列
をコードする核酸をin vitroで合成できる。
【０２１６】好適な実施態様では、ｃＤＮＡが発現され
る宿主生物に対する既知のコドンまたはコドン対の優位
性を利用してコード配列を選択してもよい。
【０２１７】対応するｍＲＮＡの真の５'末端並びに対
応するｍＲＮＡの完全なタンパク質コード配列を含むｃ
ＤＮＡを得るためのＰＣＲに基づく方法以外にも、従来
慣用のハイブリダイゼーションに基づく方法を使用して
もよい。これらの方法を使用して、５'ＥＳＴまたはコ
ンセンサスコンティグ化５'ＥＳＴの起源であるｍＲＮ
Ａ、伸長ｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡ、または伸長ｃＤ
ＮＡ、５'ＥＳＴまたはコンセンサスコンティグ化５'Ｅ
ＳＴに相同な核酸をコードするゲノムＤＮＡを得ること
ができる。下記の実施例１８では、このような方法の例
を提供する。
【０２１８】実施例１８ 全コード領域を含む伸長ｃＤＮＡおよび対応するｍＲＮ
Ａの真の５'末端または 伸長ｃＤＮＡ、５'ＥＳＴもしく
はコンセンサスコンティグ化５'ＥＳＴに相同な核酸を
取得する方法 上記実施例１〜４の方法を使用し、実施例２で使用した
ランダムノナマーをoligo-dTプライマーに換えることに
よって、全長ｃＤＮＡライブラリーを作製することがで
きる。あるいはまた、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノ
ムＤＮＡライブラリーを、販売元から入手してもよく、
または当業者に周知の技術を使用して作製してもよい。
【０２１９】下記の通りに、このようなｃＤＮＡライブ
ラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーを使用して、
５'ＥＳＴまたはコンセンサスコンティグ化５'ＥＳＴか
ら取得した伸長ｃＤＮＡまたは該伸長ｃＤＮＡ、５'Ｅ
ＳＴまたはコンセンサスコンティグ化５'ＥＳＴに相同
な核酸を単離することができる。ｃＤＮＡライブラリー
またはゲノムＤＮＡライブラリーを、検出可能なプロー
ブにハイブリダイズさせる。検出可能なプローブは、
５'ＥＳＴ、コンセンサスコンティグ化５'ＥＳＴまたは
伸長ｃＤＮＡの少なくとも１０、１５、１８、２０、２
５、２８、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１
５０、２００、３００、４００または５００個の連続し
たヌクレオチドを含むことができる。
【０２２０】Sambrookら、Molecular Cloning: A Labora
tory Manual 2d Ed., Cold SpringHarbor Laboratory P
ress, 1989（その開示内容を、参照により本明細書に援
用する）には、所与のプローブ配列にハイブリダイズす
るｃＤＮＡライブラリーのｃＤＮＡクローンを同定する
技術が開示されている。同じ技術を用いてゲノムＤＮＡ
を単離できる。
【０２２１】簡単に記載すると、さらなる操作のために
下記の通りに検出可能なプローブとハイブリダイズする
ｃＤＮＡクローンまたはゲノムＤＮＡクローンを同定
し、単離する。先の段落に記載した検出可能なプローブ
は、放射性同位元素または蛍光分子等の検出可能な標識
で標識する。プローブを標識する技術は周知であり、ポ
リヌクレオチドキナーゼを用いたリン酸化、ニック翻
訳、in vitro転写、および非放射性技術が含まれる。ラ
イブラリー中のｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡをニトロセ
ルロースフィルターまたはナイロンフィルターに転写
し、変性させる。非特異的部位を遮断した後、プローブ
にハイブリダイズすることができる配列を含むｃＤＮＡ
またはゲノムＤＮＡにプローブを結合させるのに十分な
時間、フィルターを標識プローブと共にインキュベート
する。
【０２２２】検出可能なプローブにハイブリダイズする
ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの同定に使用されるハイブ
リダイゼーション条件のストリンジェンシーを変えるこ
とによって、下記の通りに、プローブとの相同性のレベ
ルが異なるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを同定し、単離
することができる。
【０２２３】１．標識プローブと高度の相同性を有する
ｃＤＮＡ配列またはゲノムＤＮＡ配列の同定 プローブ配列と高度の相同性を有するｃＤＮＡまたはゲ
ノムＤＮＡを同定するために、次式を使用して、プロー
ブの融解温度を算出することが可能である。１４〜７０
ヌクレオチド長のプローブの場合、次式： Tm=81.5+16.6(log [Na+])+0.41(分画G+C)-(600/N) （式中、Ｎはプローブの長さである）を使用して、融解
温度（Ｔｍ）を算出する。ホルムアミドを含有する溶液
中でハイブリダイゼーションを実施する場合、式： Tm=81.5+16.6(log [Na+])+0.41(分画 G+C)-(0.63% ホル
ムアミド)-(600/N) （式中、Ｎはプローブの長さである）を使用して、融解
温度を算出することができる。
【０２２４】プレハイブリダイゼーションは、6×SSC、5
×Denhardt試薬、０．５％SDS、１００μgの変性され断
片化されたサケ精子ＤＮＡ中、または6×SSC、5×Denhar
dt試薬、０．５％SDS、１００μgの変性され断片化され
たサケ精子ＤＮＡ、５０％ホルムアミド中で実施するこ
とが可能である。Sambrookら（前出）には、SSCおよびD
enhardt溶液に関する処方が記載されている。
【０２２５】検出可能なプローブを上記プレハイブリダ
イゼーション溶液に加えることによって、ハイブリダイ
ゼーションを実施する。プローブが二本鎖ＤＮＡを含む
場合、これを変性させてからハイブリダイゼーション溶
液に加える。プローブに相補的な配列またはプローブに
相同な配列を含む伸長ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡとプ
ローブをハイブリダイズさせるのに十分な時間、フィル
ターをハイブリダイゼーション溶液と接触させる。長さ
が２００ヌクレオチドを超えるプローブの場合、Ｔｍよ
り１５〜２５℃低い温度でハイブリダイゼーションを実
施することが可能である。オリゴヌクレオチドプローブ
のようなより短いプローブの場合、Ｔｍより１５〜２５
℃低い温度でハイブリダイゼーションを実施することが
可能である。6×SSC中でハイブリダイゼーションを行う
場合、約６８℃でハイブリダイズさせることが好まし
い。５０％ホルムアミド含有溶液中でハイブリダイゼー
ションを行う場合、約４２℃でハイブリダイズさせるこ
とが好ましい。
【０２２６】前述のハイブリダイゼーションは全て、
「ストリンジェントな」条件下であると考えられる。
【０２２７】ハイブリダイゼーション後、フィルター
を、2×SSC、０．1％SDS中、室温で１５分間洗浄する。
次いで、このフィルターを、0.1×SSC、０．５％SDS
で、室温で３０分〜１時間洗浄する。その後、この溶液
を、0.1×SSC、０．５％SDS中、ハイブリダイゼーショ
ン温度で洗浄する。最終的な洗浄を、0.1×SSC中、室温
で実施する。
【０２２８】プローブとハイブリダイズしたｃＤＮＡま
たはゲノムＤＮＡを、オートラジオグラフィまたは他の
従来技術で、同定する。
【０２２９】２．標識プローブと低度の相同性を有する
ｃＤＮＡ配列またはゲノムＤＮＡ配列の取得 プローブ配列との相同性レベルを低下させたｃＤＮＡま
たはゲノムＤＮＡを同定するために、上記手法を改変す
ることが可能である。たとえば、検出可能プローブとの
相同性が低いｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを取得するた
めに、より低いストリンジェント条件を使用してもよ
い。たとえば、ナトリウム濃度が約１Ｍのハイブリダイ
ゼーション緩衝液中で、ハイブリダイゼーション温度
を、６８℃から４２℃まで５℃ずつ下げてもよい。ハイ
ブリダイゼーション後、ハイブリダイゼーション温度に
て、2×SSC、０．５％SDSでフィルターを洗浄してもよ
い。これらの条件は、５０℃以上で「中程度」条件、５
０℃未満で「低度」条件であると考えられる。
【０２３０】あるいは、ホルムアミドを含む6×SSCのよ
うな緩衝液中、温度４２℃で、ハイブリダイゼーション
を実施してもよい。この場合、プローブとの相同性レベ
ルが低いクローンを同定するために、ハイブリダイゼー
ション緩衝液中のホルムアミド濃度を５０％から０％ま
で５％ずつ下げてもよい。ハイブリダイゼーション後、
５０℃の6×SSC、０．５％SDSでフィルターを洗浄して
もよい。これらの条件は、２５％を超えるホルムアミド
で「中程度」条件、２５％未満のホルムアミドで「低
度」条件と考えられる。
【０２３１】プローブにハイブリダイズしたｃＤＮＡま
たはゲノムＤＮＡを、オートラジオグラフィで同定す
る。
【０２３２】３．取得したｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮ
Ａと５'ＥＳＴ、コンセンサスコンティグ化５'ＥＳＴも
しくは伸長ｃＤＮＡとの間の相同性、または取得したｃ
ＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡによってコードされるポリ
ペプチドと５'ＥＳＴ、コンセンサスコンティグ化５'Ｅ
ＳＴもしくは伸長ｃＤＮＡによってコードされるポリペ
プチドとの相同性の程度の決定 ハイブリダイズしたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡと、プ
ローブの起源である５'ＥＳＴ、コンセンサスコンティ
グ化５'ＥＳＴまたは伸長ｃＤＮＡとの相同性のレベル
を決定するために、ハイブリダイズした核酸のヌクレオ
チド配列と、プローブの起源である５'ＥＳＴ、コンセ
ンサスコンティグ化５'ＥＳＴまたは伸長ｃＤＮＡのヌ
クレオチド配列とを比較する。プローブの起源である
５'ＥＳＴ、コンセンサスコンティグ化５'ＥＳＴまたは
伸長ｃＤＮＡの配列と、検出可能なプローブにハイブリ
ダイズしたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ配列を、後述す
るようにコンピュータ読取り媒体に記憶し、後述するよ
うに当業者に周知の様々なアルゴリズムのうちの任意の
ものを使用して互いに比較すればよい。
【０２３３】ハイブリダイズするｃＤＮＡまたはゲノム
ＤＮＡによってコードされるポリペプチドと、プローブ
の起源である５'ＥＳＴ、コンセンサスコンティグ化５'
ＥＳＴまたは伸長ｃＤＮＡによってコードされるポリペ
プチドとの相同性のレベルを決定するために、ハイブリ
ダイズした核酸によってコードされるポリペプチド配列
と、プローブの起源である５'ＥＳＴ、コンセンサスコ
ンティグ化５'ＥＳＴまたは伸長ｃＤＮＡによってコー
ドされるポリペプチド配列とを比較する。プローブの起
源である５'ＥＳＴ、コンセンサスコンティグ化５'ＥＳ
Ｔまたは伸長ｃＤＮＡによってコードされるポリペプチ
ドの配列と、検出可能なプローブにハイブリダイズした
ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡによってコードされるポリ
ペプチド配列を、後述するようにコンピュータ読取り媒
体に記憶し、後述するように当業者に周知の様々なアル
ゴリズムのうちの任意のものを使用して互いに比較すれ
ばよい。
【０２３４】タンパク質および／または核酸配列の相同
性は、当業界で公知の様々な配列比較アルゴリズムおよ
びプログラムの任意のものを使用して評価してもよい。
このようなアルゴリズムおよびプログラムとしては、限
定するわけではないが、TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFAS
TAおよびCLUSTALW（PearsonおよびLipman, 1988, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 85(8): 2444-2448; Altschul
ら, 1990, J. Mol. Biol. 215(3): 403-410; Thompson
ら, 1994, Nucleic Acids Res. 22(2): 4673-4680; Hig
ginsら, 1996, Methods Enzymol. 266: 383-402; Altsc
hulら, 1990, J. Mol. Biol. 215(3): 403-410; Altsch
ulら, 1993, Nature Genetics 3: 266-272）が挙げられ
る。
【０２３５】特に好適な態様では、当業界で周知のBasi
c Local Alignment Search Tool(「BLAST」)を用いて、タ
ンパク質および核酸配列の相同性を評価する（例えば、
KarlinおよびAltschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 87: 2267-2268; Altschulら, 1990, J. Mol. Bio
l. 215: 403-410; Altschulら, 1993, Nature Genetics
3: 266-272; Altschulら, 1997, Nuc. Acids Res. 25:
3389-3402を参照）。特に、５つの具体的なBLASTプロ
グラムを使用して以下のタスクを実行する：
【０２３６】（１）BLASTPおよびBLAST3は、アミノ酸の
問い合せ配列をタンパク質配列データベースと比較す
る； （２）BLASTNは、ヌクレオチドの問い合せ配列をヌクレ
オチド配列データベースと比較する； （３）BLASTXは、ヌクレオチドの問い合せ配列(両鎖と
も)の6通りのフレームを概念的に翻訳した産物を、タン
パク質配列データベースと比較する； （４）TBLASTNは、タンパク質の問い合せ配列を、6通り
全てのリーディングフレーム(両鎖とも)において翻訳し
たヌクレオチド配列データベースと比較する；および （５）TBLASTXは、ヌクレオチドの問い合せ配列の6通り
のフレーム翻訳産物を、ヌクレオチド配列データベース
の6通りのフレーム翻訳産物と比較する。
【０２３７】BLASTプログラムは、アミノ酸または核酸
の問い合せ配列と好ましくはタンパク質または核酸の配
列データベースから得られる試験配列との間で類似する
セグメントを同定することによって相同な配列を同定す
るものである。該セグメントは「高スコアリングセグメ
ント対(high-scoring segment pair)」と呼ばれる。好
ましくは、スコア行列によって高スコアリングセグメン
ト対を同定する(即ち、アライメントをとる)。スコア行
列の多くは当業界で公知である。好ましくは、使用する
スコア行列はBLOSUM62行列である(Gonnetら, 1992, Sci
ence 256:1443-1445; HenikoffおよびHenikoff, 1993,
Proteins 17: 49-61)。好ましさは劣るが、PAMまたはPA
M250行列を使用してもよい(例えば、SchwartzおよびDay
hoff編、1978, Matrices for Detecting Distance Rela
tionships: Atlas of Protein Sequence and Structur
e, Washington: National Biomedical Research Founda
tionを参照)。
【０２３８】BLASTプログラムは、同定された全ての高
スコアリングセグメント対の統計学的な有意性を評価
し、好ましくは、ユーザーに特有の有意性の閾値(例え
ば、ユーザーに特有の相同性の％)を満たすセグメント
を選択する。好ましくは、高スコアリングセグメント対
の統計学的な有意性は、統計学的有意性のKarlinの式を
用いて評価する（例えば、KarlinおよびAltschul, 199
0, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 87: 2267-2268を参
照）。
【０２３９】上述のアルゴリズムに使用するパラメータ
は、配列の長さや調査する相同性の程度に応じて適応さ
せることができる。ある実施態様では、パラメータは、
ユーザーから指示がない場合にアルゴリズムで使用され
るデフォルトパラメータであってもよい。
【０２４０】ある実施態様では、ハイブリダイズした核
酸と、プローブの起源である伸長ｃＤＮＡ、５'ＥＳＴ
または５'コンセンサスコンティグ化ＥＳＴとの間の相
同性のレベルを、Brutlagら, Comp. App. Biosci. 6: 2
37-245, 1990に記載のFASTDBアルゴリズムを用いて決定
してもよい。このような分析では、パラメータは以下の
ように選択すればよい：Matrix＝Unitary、k-tuple＝
４、Mismatch Penalty＝１、Joining Penalty＝30、Ran
domization Group Length＝０、Cutoff Score＝１、Gap
Penalty＝５、Gap Size Penalty＝0.05、Window Size
＝500またはプローブにハイブリダイズする配列の長さ
のいずれか短い方。FASTDBプログラムでは相同性レベル
を計算する際に５'末端切断または３'末端切断が考慮さ
れないため、プローブの起源である伸長ｃＤＮＡ、５'
ＥＳＴまたはコンセンサスコンティグ化５'ＥＳＴの配
列に比べてプローブにハイブリダイズする配列が末端切
断されている場合には、ハイブリダイズ配列と一致しな
いかまたはアライメントが取れない伸長ｃＤＮＡ、５'
ＥＳＴまたはコンセンサスコンティグ化５'ＥＳＴのヌ
クレオチド数を計算し、非一致のまたはアライメントが
取れないヌクレオチドに相当するハイブリダイズ配列の
全ヌクレオチドの割合を決定し、この割合を相同性レベ
ルから差し引いて相同性のレベルを手動で調整する。例
えば、ハイブリダイズ配列が700ヌクレオチド長であ
り、伸長ｃＤＮＡ、５'ＥＳＴまたはコンセンサスコン
ティグ化５'ＥＳＴ配列が1000ヌクレオチド長であっ
て、伸長ｃＤＮＡ、５'ＥＳＴまたはコンセンサスコン
ティグ化５'ＥＳＴの５'末端側の最初の300塩基がハイ
ブリダイズ配列から欠けており、重複する700ヌクレオ
チドが同一である場合には、相同性レベルを以下のよう
に調整する。非一致かつアライメントが取れない300塩
基は、伸長ｃＤＮＡ、５'ＥＳＴまたはコンセンサスコ
ンティグ化５'ＥＳＴの長さの３０％に相当する。重複
する700ヌクレオチドが100％同一の場合には、調整した
後の相同性レベルは100−30＝70％相同性となる。前述
の調整は、非一致のまたはアライメントが取れないヌク
レオチドが５'末端または３'末端にある場合に限って行
うことができる点に留意すべきである。非一致のまたは
アライメントが取れない配列が内部または他の任意の条
件下にある場合は、調整を行わない。
【０２４１】例えば、上記の方法を使用することによ
り、プローブの起源である伸長ｃＤＮＡ、５'ＥＳＴま
たはコンセンサスコンティグ化５'ＥＳＴに対して少な
くとも95％の核酸相同性、少なくとも96％の核酸相同
性、少なくとも97％の核酸相同性、少なくとも98％の核
酸相同性、少なくとも99％の核酸相同性、または99％を
超える核酸相同性を有する核酸を取得・同定することが
できる。このような核酸は、対立遺伝子変異体であって
も、他の種に由来する該当する核酸であってもよい。同
様に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
を徐々に低くすることにより、プローブの起源である伸
長ｃＤＮＡ、５'ＥＳＴまたはコンセンサスコンティグ
化５'ＥＳＴに対して少なくとも90％、少なくとも85
％、少なくとも80％、または少なくとも75％の相同性を
有する核酸を取得・同定することができる。
【０２４２】上記の方法および、配列の長さや調査する
相同性の程度に応じたパラメータ(例えば、ユーザーか
ら指示がない場合にアルゴリズムで使用されるデフォル
トパラメータ)を使用するFASTA等のアルゴリズムを使用
することにより、プローブの起源である伸長ｃＤＮＡ、
５'ＥＳＴまたはコンセンサスコンティグ化５'ＥＳＴに
よってコードされるタンパク質に対して少なくとも99
％、少なくとも98％、少なくとも97％、少なくとも96
％、少なくとも95％、少なくとも90％、少なくとも85
％、少なくとも80％または少なくとも75％の相同性を有
するタンパク質をコードする核酸を取得することができ
る。ある実施態様では、「デフォルト」Opening Penalt
yと「デフォルト」Gap Penalty並びにPAM250(標準的な
スコア行列；Dayhoffら, Atlas of Protein Sequence a
nd Structure, Vol. 5, Supp. 3 (1978)を参照)等のス
コア行列を使用して、相同性レベルを決定することがで
きる。
【０２４３】あるいは、ポリペプチドの相同性のレベル
は、Brutlagら, Comp. App. Biosci. 6: 237-245, 1990
に記載のFASTDBアルゴリズムを用いて決定してもよい。
このような分析では、パラメータは以下のように選択す
ればよい：Matrix＝PAM 0、k-tuple＝２、Mismatch Pen
alty＝１、Joining Penalty＝20、Randomization Group
Length＝０、Cutoff Score＝１、Window Size＝Sequen
ce Length、Gap Penalty＝５、Gap Size Penalty＝0.0
5、Window Size＝500または相同な配列の長さのいずれ
か短い方。相同なアミノ酸配列が、Ｎ末端および／また
はＣ末端欠失の結果、伸長ｃＤＮＡ、５'ＥＳＴまたは
コンセンサスコンティグ化５'ＥＳＴによってコードさ
れるアミノ酸配列よりも短い場合には、結果を以下のよ
うに手動で補正してもよい。第一に、相同配列と一致し
ないかまたはアライメントが取れない伸長ｃＤＮＡ、
５'ＥＳＴまたはコンセンサスコンティグ化５'ＥＳＴに
よってコードされるアミノ酸配列のアミノ酸残基数を決
定する。次いで、非一致のまたはアライメントが取れな
いアミノ酸に相当する伸長ｃＤＮＡ、５'ＥＳＴまたは
コンセンサスコンティグ化５'ＥＳＴによってコードさ
れる配列の長さの割合を計算する。この割合を相同性レ
ベルから差し引く。例えば、伸長ｃＤＮＡ、５'ＥＳＴ
またはコンセンサスコンティグ化５'ＥＳＴによってコ
ードされるアミノ酸配列が100アミノ酸長であり、相同
配列の長さが80アミノ酸であり、伸長ｃＤＮＡまたは
５'ＥＳＴによってコードされるアミノ酸配列が、相同
配列と比較してＮ末端で末端切断されている場合には、
相同性レベルは以下のように計算する。上述した概要で
は、伸長ｃＤＮＡ、５'ＥＳＴまたはコンセンサスコン
ティグ化５'ＥＳＴによってコードされる配列中には、
非一致かつアライメントが取れないアミノ酸が20個存在
する。これは、伸長ｃＤＮＡ、５'ＥＳＴまたはコンセ
ンサスコンティグ化５'ＥＳＴによってコードされるア
ミノ酸配列の長さの20％に相当する。残りのアミノ酸が
2つの配列間で100％同一であれば、相同性レベルは100
％−20％＝80％相同性となる。非一致のまたはアライメ
ントが取れない配列が内部または他の任意の条件下にあ
る場合は、調整を行わない。
【０２４４】上述の方法以外にも、他のプロトコルを利
用し、以下の段落で概説する５'ＥＳＴまたはコンセン
サスコンティグ化５'ＥＳＴを用いて伸長ｃＤＮＡを得
ることもできる。
【０２４５】ポリＡ選択手法または当業者に公知の他の
技術を使用するｍＲＮＡ調製手法を利用して、目的の組
織、細胞または生物からｍＲＮＡを取得することによっ
て伸長ｃＤＮＡを調製してもよい。ｍＲＮＡのポリＡテ
イルにハイブリダイズ可能な第１プライマーをｍＲＮＡ
にハイブリダイズさせ、逆転写反応を行って第１ｃＤＮ
Ａ鎖を生成する。
【０２４６】第１ｃＤＮＡ鎖を、配列番号24〜4100およ
び8178〜36681の配列の少なくとも10個の連続したヌク
レオチドを含む第２プライマーにハイブリダイズさせ
る。好ましくは、このプライマーは、配列番号24〜4100
および8178〜36681の配列に由来する少なくとも１０、
１２、１５、１７、１８、２０、２３、２５または２８
個の連続したヌクレオチドを含んでなるものである。あ
る実施態様では、プライマーは、配列番号24〜4100およ
び8178〜36681の配列に由来する30よりも多くのヌクレ
オチドを含んでなる。真の翻訳開始部位を含む全タンパ
ク質コード配列を含む伸長ｃＤＮＡを取得するのが望ま
しい場合には、使用する第２プライマーは、翻訳開始部
位の上流に位置する配列を含むものである。第２プライ
マーを伸長させて、第１ｃＤＮＡ鎖に相補的な第２ｃＤ
ＮＡ鎖を生成させる。あるいは、取得すべきｃＤＮＡの
両末端に由来するプライマーを使用して、上述のように
ＲＴ−ＰＣＲを実施してもよい。
【０２４７】配列番号24〜4100および8178〜36681の配
列を含んでなるｍＲＮＡを、ＥＳＴ関連核酸の断片に相
補的な配列を含んでなるプライマーとハイブリダイズさ
せ、ハイブリダイズしたプライマーを逆転写してｍＲＮ
Ａから第１ｃＤＮＡ鎖を作製することにより、ｍＲＮＡ
の５'側断片を含む伸長ｃＤＮＡを調製することができ
る。好ましくは、プライマーは、配列番号24〜4100およ
び8178〜36681に相補的な配列の少なくとも１０、１
２、１５、１７、１８、２０、２３、２５または２８個
の連続したヌクレオチドを含んでなるものである。
【０２４８】その後、第１ｃＤＮＡ鎖に相補的な第２ｃ
ＤＮＡ鎖を合成する。第２ｃＤＮＡ鎖は、第１ｃＤＮＡ
鎖中の配列に相補的なプライマーを第１ｃＤＮＡ鎖へハ
イブリダイズさせ、プライマーを伸長させて第２ｃＤＮ
Ａ鎖を生成させることにより作製することができる。
【０２４９】上述の方法を利用して作製した二本鎖の伸
長ｃＤＮＡを単離およびクローニングする。伸長ｃＤＮ
Ａは、適切な宿主細胞中で複製可能なプラスミドまたは
ウイルスベクター等のベクターへクローニングする。例
えば、宿主細胞は細菌細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞、
または昆虫細胞であってよい。
【０２５０】ｍＲＮＡを単離し、ｍＲＮＡにハイブリダ
イズしたプライマーを逆転写して第１ｃＤＮＡ鎖を生成
させ、プライマーを伸長させて第１ｃＤＮＡ鎖に相補的
な第２ｃＤＮＡ鎖を作製し、二本鎖ｃＤＮＡを単離して
二本鎖ｃＤＮＡをクローニングする技術は当業者には周
知であり、Current Protocols in Molecular Biology,
John Wiley & Sons, Inc. 1997およびSambrookら, Mole
cular Cloninig: A Laboratory Manula,第二版, Cold S
pring Harbor Laboratory Press, 1989に記載されてい
る（これらの開示の全内容は、引用により本明細書に含
まれるものとする）。
【０２５１】あるいは、全長ｃＤＮＡまたは伸長ｃＤＮ
Ａを取得する他の手法を使用してもよい。一つのアプロ
ーチでは、全長または伸長ｃＤＮＡをｍＲＮＡから調製
し、以下のように二本鎖ファージミドへクローニングす
る。次いで、二本鎖ファージミドのｃＤＮＡライブラリ
ーを、ファージF1の遺伝子II産物等のエンドヌクレアー
ゼおよびエキソヌクレアーゼで処理して一本鎖にする
（Changら, Gene 127: 95-8, 1993）。ＥＳＴ関連核酸
の断片の配列を含んでなるビオチン化オリゴヌクレオチ
ドを、一本鎖ファージミドへハイブリダイズさせる。好
ましくは、この断片は、配列番号24〜4100および8178〜
36681の配列の少なくとも１０、１２、１５、１７、１
８、２０、２３、２５または２８個の連続したヌクレオ
チドを含んでなるものである。
【０２５２】ビオチン化オリゴヌクレオチドとファージ
ミドとのハイブリッドを、このハイブリッドをストレプ
トアビジンで被覆した常磁性ビーズとインキュベートし
て該ビーズを磁石で回収することによって単離する（Fr
yら, Biotechniques, 13: 124-131, 1992）。その後、
得られたファージミドをビーズから遊離させ、ビオチニ
ル化オリゴヌクレオチドを設計するのに使用した５'Ｅ
ＳＴまたはコンセンサスコンティグ化５'ＥＳＴ配列に
対して特異的なプライマーを用いて二本鎖ＤＮＡへ変換
させる。あるいは、Gene Trapperキット（Gibco BRL）
等のプロトコルを使用してもよい。得られた二本鎖ＤＮ
Ａで細菌を形質転換させる。５'ＥＳＴまたはコンセン
サスコンティグ化５'ＥＳＴ配列を含む伸長ｃＤＮＡま
たは全長ｃＤＮＡを、コロニーＰＣＲまたはコロニーハ
イブリダイゼーションによって同定する。
【０２５３】セクションIIIに記載した方法のうち任意
のものを用いて、全長タンパク質コード配列またはこの
タンパク質コード配列の一部を含む複数の伸長ｃＤＮＡ
を、コードされているタンパク質を評価するために、ま
たは後述するような診断アッセイに使用するために、ｃ
ＤＮＡライブラリーとして取得してもよい。
【０２５４】実施例１９ 全長ｃＤＮＡ 実施例１７および１８に記載の手法を利用して、様々な
組織の５'ＥＳＴ由来の376個の伸長ｃＤＮＡまたは全長
ｃＤＮＡを取得した。以下の説明は、このようにして取
得したｃＤＮＡの例を示すものである。
【０２５５】この手法を利用して、配列番号１(内部識
別番号58-34-2-E7-FL2)の全長ｃＤＮＡを取得した。こ
のｃＤＮＡは、von Heijneスコアが5.5のシグナルペプ
チドMWWFQQGLSFLPSALVIWTSA（配列番号２）をコードす
るものである。
【０２５６】このアプローチを利用して、配列番号３
(内部識別番号48-19-3-G1-FL1)の全長ｃＤＮＡを取得し
た。このｃＤＮＡは、von Heijneスコアが8.2のシグナ
ルペプチドMKKVLLLITAILAVAVG（配列番号４）をコード
するものである。
【０２５７】この手法を利用して、配列番号５(内部識
別番号58-35-2-F10-FL2)の全長ｃＤＮＡを取得した。こ
のｃＤＮＡは、von Heijneスコアが10.7のシグナルペプ
チドLWLLFFLVTAIHA（配列番号６）をコードするもので
ある。
【０２５８】さらに、伸長または全長ｃＤＮＡによって
コードされるポリペプチドを、既知の構造モチーフもし
くは機能的モチーフの有無について、またはシグネチャ
ー(signature；タンパク質ファミリーのメンバー間で十
分に保存されている短いアミノ酸配列)の有無について
スクリーニングしてもよい。５'ＥＳＴ由来のいくつか
の全長ｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドに対
して、GCGパッケージのProscanソフトウエアおよびPros
ite 15.0データベースを用いて既知のタンパク質のシグ
ネチャーおよびモチーフの有無についてスクリーニング
した結果を以下に示す。
【０２５９】配列番号７(内部呼称78-8-3-E6-CL0-1C)の
全長ｃＤＮＡによってコードされ、かつ成体の前立腺で
発現される配列番号８のタンパク質は、位置90〜112に
由来する特徴的なPROSITEシグネチャーを示すホスファ
チジルエタノールアミン結合性タンパク質に属する。線
虫からハエ、酵母、齧歯類および霊長類種に及ぶこの広
範なファミリーに由来するタンパク質は、リン脂質等の
疎水性リガンドおよびヌクレオチドと結合する。これら
は、多くの場合脳および精巣で発現され、細胞増殖およ
び／または細胞成熟、精子の成熟や運動性の調節、並び
に膜のリモデリングに作用すると考えられる。これら
は、シグナル伝達または酸化還元反応のいずれかを介し
て作用すると考えられる(概説については、Schoentgen
およびJolles, FEBS Letters, 369: 22-26 (1995)を参
照)。以上のことを考え合わせると、これらのデータか
ら、配列番号８のタンパク質が、細胞増殖、細胞成熟お
よび膜のリモデリングに作用し、並びに／または男性の
生殖能力に関与する可能性が示唆される。従って、これ
らのタンパク質は、癌、神経変性疾患(neurodegenerati
ve disease)および／または男性の生殖能力や生殖不能
に関連する障害の診断および／または治療に有用であ
る。
【０２６０】配列番号９（内部呼称108-013-5-O-H9-FL
C）の全長ｃＤＮＡによってコードされる配列番号10の
タンパク質は、真核生物(酵母、ウサギ、齧歯類および
ヒト)間で保存されているリゾホスホリパーゼのファミ
リーと相同性を示す。さらに、このファミリーのメンバ
ーには、カルシウム非依存性ホスホリパーゼA2活性を示
すものもある(Portillaら, J. Am. Soc. Nephro., 9: 1
178-1186 (1998))。このファミリーのメンバーは全て、
カルボキシルエステラーゼのGXSXGモチーフに一致する
活性部位を示し、配列番号10のタンパク質中にも見られ
る(位置54〜58)。さらに、このタンパク質は、ソフトウ
エアTopPred II（Clarosおよびvon Heijne,CABIOS appl
ic. Notes, 10: 685-686 (1994)）で予測されるような
１個の膜貫通ドメインを有する膜タンパク質であっても
よい。以上のことを考え合わせると、これらのデータか
ら、配列番号10のタンパク質が、おそらくホスホリパー
ゼとして脂肪酸代謝に作用する可能性が示唆される。従
って、このタンパク質またはその一部は、癌、糖尿病、
およびパーキンソン病やアルツハイマー病等の神経変性
疾患を含むがこれらに限定されない複数の障害の診断お
よび／または治療に有用である。また、感染因子に対す
る炎症反応のモジュレーションおよび／または移植片拒
絶の抑制にも有用である。
【０２６１】配列番号11(内部呼称108-004-5-0-D10-FL
C)の全長ｃＤＮＡによってコードされる配列番号12のタ
ンパク質は、動物(ヒト、齧歯類、ウシおよびニワトリ)
中で広く保存されているβ4-ガラクトシルトランスフェ
ラーゼのサブファミリーに対して間接的な相同性(remot
e homology)を示す。このような酵素（通常は小胞体ま
たはゴルジ装置中に位置するII型膜タンパク質）は、糖
タンパク質、糖脂質グリカンおよびラクトースの生合成
を触媒するものである。Bretonら, J. Biochem., 123:
1000-1009 (1998)中でサブファミリーＡの特性と認めら
れているその特徴的な特性は、配列番号12のタンパク質
(特に、UDP結合または触媒過程自体のいずれかに関与す
ると考えられるDVDモチーフ(位置163〜165)を含有する
領域I)中で非常によく保存されている。さらに、配列番
号12のタンパク質は、II型タンパク質の典型的な構造を
有する。実際に、ソフトウエアTopPred II（Clarosおよ
びvon Heijne, CABIOS applic. Notes, 10: 685-686 (1
994)）で予測されるように、短い28アミノ酸長のＮ末端
テイル、位置29〜49の膜貫通セグメントおよび長い278
アミノ酸長のＣ末端テイルが含まれる。以上のことを考
え合わせると、これらのデータから、配列番号12のタン
パク質が、多糖類の生合成並びに糖タンパク質および糖
脂質の炭水化物部分の生合成並びに／または細胞間認識
に作用する可能性が示唆される。従って、このタンパク
質は、癌、アテローム性動脈硬化症、心血管障害、自己
免疫異常およびリウマチ性関節炎等のリウマチ性疾患を
含むがこれらに限定されない複数の種類の障害の診断お
よび／または治療に有用である。
【０２６２】配列番号13（内部呼称108-009-5-0-A2-FL
C）の全長ｃＤＮＡによってコードされる配列番号14の
タンパク質は、転写因子のbZIPファミリー、特にヒトlu
manタンパク質(Luら, Mol. Cell. Biol., 17: 5117-512
6 (1997))に対して広範な相同性を示す。この一致に
は、塩基性ＤＮＡ結合ドメインやタンパク質を二量体化
するロイシンジッパーで構成される全bZIPドメインが含
まれる。塩基性ドメインは、位置233におけるグルタミ
ン酸のアスパラギン酸による保存置換を除けば、特徴的
なPROSITEシグネチャー(位置224〜237)によって示され
るように配列番号14のタンパク質中に保存されている。
ロイシンジッパーに対する典型的なPROSITEシグネチャ
ーも存在する(位置259〜280)。以上のことを考え合わせ
ると、これらのデータから、配列番号14のタンパク質が
ＤＮＡに結合し、転写因子として遺伝子発現を調節する
可能性が示唆される。従って、このタンパク質は、癌を
含むがこれに限定されない複数の種類の障害の診断およ
び／または治療に有用である。
【０２６３】上述の全長ｃＤＮＡを含有するプラスミド
を含む細菌クローンは、目下本発明者らの研究所に上記
の内部識別番号にて保管されている。インサートは、適
切な細菌クローンのアリコートを適切な培地中で増殖さ
せることにより保存材料から回収することもできる。次
いで、アルカリ溶解ミニプレップ(miniprep)または大規
模なアルカリ溶解プラスミド単離手法等の当業者に周知
のプラスミド単離手法を利用して、プラスミドＤＮＡを
単離することができる。必要であれば、塩化セシウム勾
配を用いた遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、
またはアニオン交換クロマトグラフィーによってプラス
ミドＤＮＡをさらに濃縮してもよい。次いで、これらの
手法を使用して得られたプラスミドＤＮＡを、当業者に
周知の標準的なクローニング技術を利用して操作すれば
よい。あるいは、ＥＳＴインサートの両末端に設計され
たプライマーを用いてＰＣＲを行うこともできる。次い
で５'ＥＳＴに対応するＰＣＲ産物を、当業者に周知の
標準的なクローニング技術を利用して操作することがで
きる。
【０２６４】IV．タンパク質の発現 ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の断片、ＥＳＴ関連核
酸のポジショナルセグメント、およびＥＳＴ関連核酸の
ポジショナルセグメントの断片を使用して、これらにコ
ードされているポリペプチドを発現させてもよい。特
に、ＥＳＴ関連ポリペプチド、ＥＳＴ関連ポリペプチド
の断片、ＥＳＴ関連ポリペプチドのポジショナルセグメ
ント、またはＥＳＴ関連ポリペプチドのポジショナルセ
グメントの断片を発現させるのに使用してもよい。ある
実施態様では、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸のポジ
ショナルセグメント、およびＥＳＴ関連核酸のポジショ
ナルセグメントの断片を使用して、分泌タンパク質の全
ポリペプチド(即ち、シグナルペプチドと成熟ポリペプ
チド)、成熟タンパク質（即ち、シグナルペプチドを切
断した後に生成するポリペプチド）、または分泌タンパ
ク質のシグナルペプチドを発現させてもよい。必要であ
れば、シグナルペプチドをコードする核酸を使用して、
発現されたタンパク質の分泌を促進してもよい。後述す
るように、複数のＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の断
片、ＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメント、または
ＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメントの断片を発現
ベクターへ同時にクローニングして、コードされている
タンパク質を分析するための発現ライブラリーを作製し
てもよいことは明らかであろう。
【０２６５】実施例２０ ５' ＥＳＴまたは５' ＥＳＴに隣接する（contigate
d）コンセンサスに対応する遺伝子によりコードされる
タンパク質の発現 ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸断片、ＥＳＴ関連核酸
の位置（positional）セグメント、ＥＳＴ関連核酸のポ
ジショナルセグメント断片を、それらにコードされてい
るタンパク質を発現させるために適当な発現ベクターに
クローニングする。場合によっては、ＥＳＴ関連ポリペ
プチド、ＥＳＴ関連ポリペプチド断片、ＥＳＴ関連ポリ
ペプチドのポジショナルセグメント、ＥＳＴ関連ポリペ
プチドのポジショナルセグメント断片をコードする核酸
を、適当な発現ベクターにクローニングしてもよい。
【０２６６】ある態様においては、発現ベクター中に挿
入される核酸は、配列番号２４-４１００からなる群か
ら選択されるコーディング配列を含んでいてもよい。別
の態様においては、発現ベクター中に挿入される核酸
は、配列番号３７２１-３８１１の一つの全長コーディ
ング配列（すなわちシグナルペプチドおよび成熟ポリペ
プチドをコードするヌクレオチド）を含んでいてもよ
い。ある態様においては、発現ベクター中に挿入される
核酸は、成熟ポリペプチドをコードする配列番号３７２
１-３８１１の配列の一つのヌクレオチド（すなわちシ
グナルペプチド切断後に生成されるポリペプチドをコー
ドするヌクレオチド）を含んでいてもよい。更なる態様
においては、発現ベクター中に挿入される核酸は、発現
されたタンパク質の分泌を促進するためにシグナルペプ
チドをコードする配列番号２４-６５２および３７２１-
３８１１のヌクレオチドを含んでいてもよい。発現ベク
ターに挿入される核酸は、シグナルペプチドをコードし
ている配列の上流の配列、たとえば、発現レベルを調節
する配列や組織特異的発現を与える配列も含んでもよ
い。
【０２６７】発現ベクター中に挿入される核酸は、配列
番号４１０１-８１７７の配列の一つを含むポリペプチ
ドをコードするものでもよい。ある態様においては、発
現ベクター中に挿入される核酸は、配列番号７７９８-
７８８８の一つに含まれる全長ポリペプチド配列（すな
わちシグナルペプチドおよび成熟ポリペプチド）をコー
ドするものでもよい。別の態様においては、発現ベクタ
ー中に挿入される核酸は、配列番号７７９８-７８８８
の配列の一つに含まれる成熟ポリペプチド（すなわちシ
グナルペプチド切断後に生成されるポリペプチド）をコ
ードするものでもよい。更なる態様においては、発現ベ
クター中に挿入される核酸は、配列番号４１０１-４７
２９および７７９８-７８８８の配列の一つに含まれる
シグナルペプチドをコードするものでもよい。
【０２６８】従来のクローニング技術を使用して、発現
させるべきタンパク質またはポリペプチドをコードして
いる核酸を、発現ベクターにおけるプロモーターに操作
可能に連結させる。発現ベクターは、哺乳類、酵母、昆
虫または当業者に周知の細菌発現システムのいずれであ
ってもよい。市販のベクターおよび発現系は、Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，
ＭＡ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，
Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉ
ｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）、およびＩｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉ
ａ）を含む様々な製造業者から入手できる。Ｈａｔｆｉ
ｅｌｄらの米国特許第５，０８２，７６７号（参照によ
り本明細書に援用する）によって説明される通り、必要
に応じて、発現を強化しかつ適当なタンパク質折畳みを
促進するために、発現ベクターが導入される個々の発現
生物に合わせて、配列のコドンコンテクストおよびコド
ンのペアリングを最適化することができる。
【０２６９】上述の核酸によりコードされるタンパク質
を発現させる代表的な方法を以下に提供する。場合によ
って、発現すべきタンパク質またはポリペプチドをコー
ドする核酸は、メチオニン開始コドンおよびポリＡシグ
ナルを含む。発現されるポリペプチドをコードしている
核酸に、開始部位の役割をするメチオニンが欠如してい
る場合、従来技術を使用して、開始用メチオニンを核酸
の第１コドンの隣に導入することができる。同様に、発
現すべきタンパク質またはポリペプチドをコードする核
酸にポリＡシグナルが欠如している場合、たとえば、Ｂ
ｇlIIおよびＳａlI制限エンドヌクレアーゼ酵素を使用
してｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からポリＡシグ
ナルをスプライシングし、哺乳類発現ベクターｐＸＴ１
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に組み込むことにより、この
配列を構築物に付加することができる。ｐＸＴ１はＬＴ
ＲおよびＭｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍ
ｉａ Ｖｉｒｕｓから入手できるｇａｇ遺伝子の一部を
含む。構築物におけるＬＴＲの位置は、効率のよい安定
したトランスフェクションを可能にする。ベクターは、
単純疱疹（Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ）チミジンキ
ナーゼプロモーターおよび選択可能なネオマイシン遺伝
子を含む。発現すべきタンパク質またはポリペプチドを
コードする核酸に相補的で、且つ５'プライマーに組み
込まれたＰｓｔＩおよび３'プライマーの５'末端のＢｇ
ｌIIに対する制限エンドヌクレアーゼ配列を含むオリゴ
ヌクレオチドプライマーを使用し、発現すべきタンパク
質またはポリペプチドをコードする核酸が確実にポリＡ
シグナルと共に正しく配置されるように気をつけて、発
現すべきポリペプチドをコードしている核酸を、細菌ベ
クターからＰＣＲによって取得する。このようにして得
られたＰＣＲ反応物から得られた精製断片をＰｓｔＩで
消化し、エクソヌクレアーゼで平滑末端化し、ＢｇｌII
で消化し、精製し、さらに、ポリＡシグナルを含み、Ｂ
ｇｌIIで消化されたｐＸＴ１に連結する。
【０２７０】Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌ
ａｎｄ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を使用して、製品仕様書
に略述されている条件下で、連結生成物をマウス ＮＩ
Ｈ ３Ｔ３細胞にトランスフェクトする。６００μｇ／
ｍｌ Ｇ４１８（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，
Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）中で形質導入した細胞を成長させ
た後、陽性の形質導入体を選択する。
【０２７１】あるいは、上述の通り、発現すべきタンパ
ク質またはポリペプチドをコードする核酸をｐＥＤ６ｄ
ｐｃ２にクローニングしてもよい。このようにして得ら
れたｐＥＤ６ｄｐｃ２構築物を適当な宿主細胞、たとえ
ば、ＣＯＳ １細胞にトランスフェクトしてもよい。メ
トトレキセート耐性細胞を選択して、増殖する。発現し
たタンパク質またはポリペプチドを上記のようにして単
離、精製、または濃縮してもよい。
【０２７２】所望のタンパク質またはポリペプチドが発
現されたことを確認するために、タンパク質またはポリ
ペプチドをコードする核酸挿入物を有するベクターを含
む細胞によって産生されたタンパク質またはポリペプチ
ドを、こうした挿入物を含まないものと比較する。発現
したタンパク質は、クマシーブルーまたは銀染色等の当
業者に公知の技術を使用して、または核酸挿入物によっ
てコードされるタンパク質またはポリペプチドに対する
抗体を使用して検出する。目的のタンパク質を特異的に
認識することができる抗体は、適当な核酸によってコー
ドされる配列を有する合成１５-merを使用して作製する
ことができる。合成ペプチドをマウスに注射して、核酸
によってコードされるポリペプチドに対する抗体を作製
する。
【０２７３】核酸挿入物によってコードされるタンパク
質またはポリペプチドが分泌されるものである場合、所
望のタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸挿
入物を含有する発現ベクターを含む宿主細胞または生物
から調製した培地を、対照の細胞または生物から調製し
た培地と比較する。対照細胞由来の調製物に存在しない
バンドが核酸挿入物を含む細胞の培地中に存在すること
は、核酸挿入物によってコードされたタンパク質または
ポリペプチドが発現され、分泌されていることを示す。
一般に、核酸挿入物によりコードされるタンパク質に対
応するバンドは、核酸挿入物のオープンリーディングフ
レーム内のアミノ酸の数に基づいて予期されるものに近
い移動度を有する。しかし、バンドは、グリコシル化、
ユビキチン化、または酵素的切断のような修飾の結果と
して予期されるものとは異なる移動度を有することがあ
る。
【０２７４】あるいは、上記発現ベクターから発現した
タンパク質が、その分泌を指令する配列を含まない場
合、分泌タンパク質またはその一部をコードしている挿
入物を含む発現ベクターを含む宿主細胞から発現したタ
ンパク質を、挿入物を含まない発現ベクターを含む対照
の宿主細胞で発現したタンパク質と比較することができ
る。挿入物を含まない発現ベクターを含む細胞からの試
料に存在しないバンドが、挿入物を含む発現ベクターを
含む細胞からの試料に存在することは、所望のタンパク
質またはその一部が発現したことを示す。一般に、バン
ドは、分泌タンパク質またはその一部に関して予期され
る移動度を有する。しかし、バンドは、グリコシル化、
ユビキチン化、または酵素的切断のような修飾の結果と
して予期されるものとは異なる移動度を有することがあ
る。
【０２７５】発現したタンパク質またはポリペプチド
は、種々の方法を使用して単離、精製、または濃縮する
ことができる。ある方法においては、タンパク質または
ポリペプチドは天然のシグナルペプチド、またはこれに
機能的に連結した異種のシグナルペプチドを介して培地
中に分泌されるようにしてもよい。別の方法において
は、タンパク質またはポリペプチドは、ニッケル結合ポ
リペプチドのように、単離、精製、または濃縮を容易に
する異種ポリペプチドに連結させてもよい。タンパク質
またはポリペプチドはまた、ゲル電気泳動、イオン交換
クロマトグラフィー、サイズクロマトグラフィー、ＨＰ
ＬＣ、塩沈殿、免疫沈降、これらのいずれかの組み合わ
せ、または当業者に知られているいかなる単離、精製、
または濃縮の技術によっても得ることができる。
【０２７６】下記により詳細に記載するように、コード
されたタンパク質またはポリペプチドに対する抗体を使
用するイムノアフィニティークロマトグラフィーを用
い、標準的なイムノクロマトグラフィ技術によって核酸
挿入物によりコードされるタンパク質を精製することも
可能である。抗体産生ができなければ、所望のタンパク
質またはポリペプチドをコードする核酸挿入物を、キメ
ラポリペプチドを使用して、精製機構で使用するために
設計された発現ベクターに組み込んでもよい。このよう
な方法で、核酸挿入物のコーディング配列を、キメラの
残り半分をコードしている遺伝子とともにインフレーム
で連結する。キメラの残り半分は、β−グロビンまたは
ニッケル結合性ポリペプチドであってもよい。β−グロ
ビンに対する抗体を有するかまたはニッケルが付着した
クロマトグラフィマトリックスを使用して、キメラタン
パク質を精製する。β−グロビン遺伝子またはニッケル
結合性ポリペプチドと、伸長ｃＤＮＡまたはその一部と
の間の、プロテアーゼ切断部位を操作することが可能で
ある。従って、キメラの２つのポリペプチドを、プロテ
アーゼ消化によって互いに分離することが可能である。
【０２７７】β−グロビンキメラの生成に有用な１つの
発現ベクターは、ウサギβ−グロビンをコードするｐＳ
Ｇ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）である。ウサギβ−グロ
ビン遺伝子のイントロンＩＩは、発現した転写物のスプ
ライシングを促進し、構築物に組込まれたポリアデニル
化シグナルは、発現レベルを高める。記載されているこ
れらの技術は、分子生物学の当業者には周知である。標
準的な方法は、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，（Ｂａｓｉ
ｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ，Ｌ．Ｇ．Ｄａｖｉｓ，Ｍ．Ｄ．Ｄｉｂｎｅ
ｒ，ａｎｄ Ｊ．Ｆ．Ｂａｔｔｅｙ，ｅｄ．，Ｅｌｓｅ
ｖｉｅｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８６）のような方法
教本に公表されており、方法の多くは、Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎ
ｃ．またはＰｒｏｍｅｇａから入手できる。ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ ＥｘｐｒｅｓｓTM Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ
Ｋｉｔ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のようなｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ翻訳システムを使用して、構築物からさらなるポ
リペプチドを作ることができる。
【０２７８】核酸挿入物によりコードされるタンパク質
またはポリペプチドを発現させ、精製した後、以下の実
施例２１に記載のように精製タンパク質が様々な細胞型
の表面に結合する能力を試験することができる。以下に
具体的に記載されている作用、および作用を決定するた
めのアッセイが利用可能な他の生物学的役割について同
時に評価すべきタンパク質団に、これらの核酸挿入物か
ら発現した複数のタンパク質を含めてもよいことは、十
分に理解されるであろう。
【０２７９】実施例２１ 分泌タンパク質が細胞表面に結合するかどうかを決定す
るための分泌タンパク質の分析 ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸断片、ＥＳＴ関連核酸
の位置（positional）セグメント、ＥＳＴ関連核酸のポ
ジショナルセグメント断片、ＥＳＴ関連ポリペプチドを
コードする核酸、ＥＳＴ関連ポリペプチド断片をコード
する核酸、ＥＳＴ関連ポリペプチドのポジショナルセグ
メントをコードする核酸。またはＥＳＴ関連ポリペプチ
ドのポジショナルセグメント断片をコードする核酸を、
実施例２０に記載されているような発現ベクターにクロ
ーニングする。コードされたタンパク質またはポリペプ
チドを上記のように精製し、単離し、または濃縮（enri
ched）する。精製、単離、または濃縮後、このタンパク
質またはポリペプチドを、当業者に周知の技術を使用し
て標識する。標識タンパク質またはポリペプチドを、様
々な器官または組織に由来する細胞または細胞系と共に
インキュベートし、このタンパク質を、細胞表面上に存
在する任意のレセプターに結合させる。インキュベーシ
ョン後、細胞を洗浄して、非特異的に結合したタンパク
質またはポリペプチドを除去する。特異的に結合した標
識タンパク質またはポリペプチドをオートラジオグラフ
ィで検出する。あるいは、非標識タンパク質またはポリ
ペプチドを細胞とインキュベートし、検出可能な標識、
たとえば、蛍光分子が付着した抗体を用いて検出しても
よい。
【０２８０】様々な量の非標識タンパク質またはポリペ
プチドを標識タンパク質またはポリペプチドと一緒にイ
ンキュベートする競合分析を実施することにより、細胞
表面結合の特異性を分析する。競合的非標識タンパク質
またはポリペプチドの量が増加するにつれて、細胞表面
に結合した標識タンパク質またはポリペプチドの量が減
少する。対照として、標識タンパク質またはポリペプチ
ドと無関係の様々な量の非標識タンパク質またはポリペ
プチドを、幾つかの結合反応に含める。結合反応におい
て、無関係の非標識タンパク質またはポリペプチドの含
有量を増加させても細胞表面に結合した標識タンパク質
またはポリペプチドの量は減少せず、上記核酸によりコ
ードされるタンパク質が細胞表面に特異的に結合するこ
とが示唆される。
【０２８１】上記の通り、ヒトのタンパク質は、多数の
重要な生理学的効果を有し、結果として、貴重な治療源
であることが示されている。下記の通り、上記のように
して作られたヒトのタンパク質またはポリペプチドを評
価して、その生理学的活性を決定することが可能であ
る。
【０２８２】実施例２２ 発現したタンパク質またはポリペプチドの、サイトカイ
ン、細胞増殖または細胞分化活性に関するアッセイ 上記の通り、分泌タンパク質は、サイトカイン類として
作用し、または細胞増殖もしくは分化に影響を及ぼす可
能性がある。現在までに発見された多くのタンパク質因
子は、全ての既知のサイトカイン類を含め、１つまたは
複数の因子依存的細胞増殖アッセイにおいて活性を示し
ており、従って、これらのアッセイは、サイトカイン活
性の便利な確認方法となる。３２Ｄ、ＤＡ２、ＤＡ１
Ｇ、Ｔ１０、Ｂ９、Ｂ９／１１、ＢａＦ３、ＭＣ９／
Ｇ、Ｍ+（ｐｒｅＢ Ｍ+）、２Ｅ８、ＲＢ５、ＤＡ１、
１２３、Ｔ１１６５、ＨＴ２、ＣＴＬＬ２、ＴＦ−１、
Ｍｏ７ｃおよびＣＭＫを含むが、これに限定されない細
胞系では、多数の定型的な因子依存的細胞増殖アッセイ
のいずれか１つによって、本発明のタンパク質またはポ
リペプチドの活性が証明される。上記のようにして調製
されるタンパク質またはポリペプチドは、上述のアッセ
イまたは下記の参考文献（参照により本明細書に組み入
れる）に記載されているようなアッセイにおいて、Ｔ細
胞または胸腺細胞増殖を調節する能力について評価する
ことが可能である（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｅｄ． ｂｙ Ｊ．
Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｒｅｅｎｅ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ
Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｔａｋａｉ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３７：３
４９４−３５００，１９８６．；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌ
ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４５：
１７０６−１７１２，１９９０；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌ
ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ． Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ． １３３：３２７−３４１，１９９１；Ｂｅｒｔａ
ｇｎｏｌｌｉ， ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ． １４９：３７７８−３７８３，１９９２；Ｂｏｗ
ｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５
２：１７５６−１７６１，１９９４）。
【０２８３】さらに、サイトカイン産生および／または
脾細胞、リンパ節細胞および胸腺細胞の増殖に関する多
くのアッセイが知られている。このようなものとして
は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａ
ｌ．編、１：３．１２．１−３．１２．１４、Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｔｏｒｏｎｔｏ．１９
９４；およびＳｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｒ．Ｄ．，Ｉｎ Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ，１：６．８．１−６．８．８に開示されて
いる技術が挙げられる。
【０２８４】上記のようにして調製されるタンパク質ま
たはポリペプチドが造血細胞またはリンパ球産生細胞の
増殖および分化を調節する能力について、アッセイする
ことも可能である。以下の参考文献（参照により本明細
書に組み入れる）にあるアッセイを含め、このような活
性に関する多くのアッセイは当業者に周知である：Ｂｏ
ｔｔｏｍｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．，前
掲 １：６．３．１−６．３．１２；ｄｅＶｒｉｅｓ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７３：１
２０５−１２１１，１９９１；Ｍｏｒｅａｕ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６：６９０−６９２，１９８
８；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏ
ｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．
Ａ． ８０：２９３１−２９３８，１９８３；Ｎｏｒｄ
ａｎ， Ｒ．，Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．，前掲 １：６．
６．１−６．６．５；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒ
ｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．
Ａ． ８３：１８５７−１８６１，１９８６；Ｂｅｎｎ
ｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 前掲
１：６．１５．１；Ｃｉａｒｌｅｔｔａ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉ
ｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．前掲 １：６．１３．１。
【０２８５】上記のようにして調製されるタンパク質ま
たはポリペプチドが抗原に対するＴ細胞応答を調節する
能力について、アッセイすることが可能である。以下の
参考文献（参照により本明細書に組み入れる）にあるア
ッセイを含め、このような活性に関する多くのアッセイ
は当業者に周知である：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 前掲，第３章
（マウスリンパ球機能についてのＩｎ Ｖｉｔｒｏアッ
セイ），第６章（サイトカインおよびその細胞受容体）
および第７章（ヒトにおける免疫学的研究）；Ｗｅｉｎ
ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：６０９１−６
０９５，１９８０；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎ． １１：４０５−
４１１，１９８１；Ｔａｋａｉ ｅｔａｌ．，Ｊ． Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ． １３７：３４９４−３５００，１９８
６；Ｔａｋａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ． １４０：５０８−５１２，１９８８。
【０２８６】次いで、サイトカイン、細胞増殖、または
細胞分化活性を示すタンパク質またはポリペプチドを医
薬として製剤化し、細胞増殖または分化の誘導が有益な
臨床状態の治療に使用することが可能である。あるい
は、以下に詳述する通り、これらのタンパク質またはポ
リペプチドをコードしている核酸またはこれらのタンパ
ク質またはポリペプチドの発現を調節する核酸を適当な
宿主細胞に導入して、これらのタンパク質の発現を望み
通りに増加または減少させることも可能である。
【０２８７】実施例２３ 免疫系調節物質としての活性を対象とした発現されたタ
ンパク質またはポリペプチドのアッセイ 上記のようにして調製されたタンパク質またはポリペプ
チドを、免疫調節物質としてのそれらの効果について評
価することができる。例えば、該タンパク質またはポリ
ペプチドを、胸腺細胞または脾臓細胞の細胞傷害性に影
響するそれらの活性について評価することができる。そ
のような活性に対する多くのアッセイが当業者によく知
られており、以下のような参考文献（これらは参照によ
り本明細書に組み入れる）：Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら
編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔ
ｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，第３章（マウスリンパ球機能につ
いてのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ３．１〜３．１９）お
よび第７章（ヒトにおける免疫学的研究）；Ｈｅｒｍａ
ｎｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃ
ｉ． ＵＳＡ ７８：２４８８−２４９２，１９８１；
Ｈｅｒｍａｎｎら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２８：
１９６８−１９７４，１９８２；Ｈａｎｄａら、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３５：１５６４−１５７２，１９
８５；Ｔａｋａｉら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３
７：３４９４−３５００，１９８６；Ｔａｋａｉら、
Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４０：５０８−５１２，１
９８８；Ｂｏｗｍａｎら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６
１：１９９２−１９９８；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら、
Ｃｅｌｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３３：３２７−３４
１，１９９１；Ｂｒｏｗｎら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１５３：３０７９−３０９２，１９９４；に記載のア
ッセイが挙げられる。
【０２８８】上記のようにして調製されたタンパク質ま
たはポリペプチドを、Ｔ細胞依存性の免疫グロブリン応
答およびアイソタイプスイッチに対するそれらの効果に
ついて評価することができる。そのような活性に対する
多くのアッセイが当業者によく知られており、以下のよ
うな参考文献（これらは参照により本明細書に組み入れ
る）：Ｍａｌｉｓｚｅｗｓｋｉ，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ． １４４：３０２８−３０３３，１９９０；Ｍｏｎ
ｄら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１：３．８．１−３．８．１６，
前掲；に記載のアッセイが挙げられる。
【０２８９】上記のようにして調製されたタンパク質ま
たはポリペプチドを、Ｔｈ１細胞および細胞傷害性リン
パ球に対する効果などの、免疫エフェクター細胞に対す
る効果について評価することができる。そのような活性
に対する多くのアッセイが当業者によく知られており、
以下のような参考文献（これらは参照により本明細書に
組み入れる）：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（前掲）の第３章（マウス
リンパ球についてのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ３．１〜
３．１９）および第７章（ヒトにおける免疫学的研
究）；Ｔａｋａｉら，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３
７：３４９４−３５００，１９８６；Ｔａｋａｉら，
Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４０：５０８−５１２，１
９８８；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら，Ｊ． Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ． １４９：３７７８−３７８３，１９９２；に記
載のアッセイが挙げられる。
【０２９０】上記のようにして調製されたタンパク質ま
たはポリペプチドを、未活性型Ｔ細胞の樹状細胞介在性
活性化に対するそれらの効果について評価することがで
きる。そのような活性に対する多くのアッセイが当業者
によく知られており、以下のような参考文献（これらは
参照により本明細書に組み入れる）：Ｇｕｅｒｙら，
Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３４：５３６−５４４，１
９９５；Ｉｎａｂａら，Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １
７３：５４９−５５９，１９９１；Ｍａｃａｔｏｎｉａ
ら，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５４：５０７１−５０
７９，１９９５；Ｐｏｒｇａｄｏｒら，Ｊ． Ｅｘｐ．
Ｍｅｄ． １８２：２５５−２６０，１９９５；Ｎａ
ｉｒら，Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６７：４０６２−４０６
９，１９９３；Ｈｕａｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６
４：９６１−９６５，１９９４；Ｍａｃａｔｏｎｉａ
ら，Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ １６９：１２５５−１２
６４，１９８９；Ｂｈａｒｄｗａｊら，Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏ
ｎ ９４：７９７−８０７，１９９４；およびＩｎａｂ
ａら，Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ １７２：６３１−６４
０，１９９０；に記載のアッセイが挙げられる。
【０２９１】上記のようにして調製されたタンパク質ま
たはポリペプチドを、リンパ球の寿命に対するそれらの
影響について評価することができる。そのような活性に
対する多くのアッセイが当業者によく知られており、以
下のような参考文献（これらは参照により本明細書に組
み入れる）：Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚら，Ｃｙｔｏ
ｍｅｔｒｙ １３：７９５−８０８，１９９２；Ｇｏｒ
ｃｚｙｃａら，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ７：６５９−６７
０，１９９３；Ｇｏｒｃｚｙｃａら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓ． ５３：１９４５−１９５１，１９９３；Ｉｔｏ
ｈら，Ｃｅｌｌ６６：２３３−２４３，１９９１；Ｚａ
ｃｈａｒｃｈｕｋ，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４５：
４０３７−４０４５，１９９０；Ｚａｍａｉら，Ｃｙｔ
ｏｍｅｔｒｙ １４：８９１−８９７，１９９３；Ｇｏ
ｒｃｚｙｃａら，Ｉｎｔ． Ｊ．Ｏｎｃｏｌ． １：６
３９−６４８，１９９２；に記載のアッセイが挙げられ
る。
【０２９２】上記のようにして調製されたタンパク質ま
たはポリペプチドを、Ｔ細胞の分化の方向が決定され、
細胞が発達していく初期の段階に対するそれらの影響に
ついて評価することができる。そのような活性に対する
多くのアッセイが当業者によく知られており、以下のよ
うな参考文献（これらの参考文献は参照により本明細書
に組み入れる）：Ａｎｔｉｃａら，Ｂｌｏｏｄ ８４：
１１１−１１７，１９９４；Ｆｉｎｅら，Ｃｅｌｌ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５５：１１１−１２２，１９９
４；Ｇａｌｙら，Ｂｌｏｏｄ ８５：２７７０−２７７
８，１９９５；Ｔｏｋｉら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａ
ｃａｄ Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：７５４８−７５５
１，１９９１；に記載のアッセイが挙げられるが、これ
らに限定されない。
【０２９３】次いで免疫系調節物質活性として活性を示
すタンパク質またはポリペプチドを医薬として製剤化
し、免疫活性の調節が有益な臨床状態を治療するのに使
用してもよい。例えば、該タンパク質またはポリペプチ
ドは、（重症複合型免疫不全などの）様々な免疫不全お
よび免疫障害の治療、例えば、Ｔおよび／またはＢリン
パ球の成長および増殖の調節（上向きまたは下向き）な
らびにＮＫ細胞および他の細胞集団の細胞溶解活性の惹
起に有用である。これらの免疫不全は遺伝的であるかま
たはウイルス（例えば、ＨＩＶ）および細菌もしくは真
菌感染によって生じるか、あるいは自己免疫障害から生
じることがある。より具体的には、ウイルス、細菌、真
菌または他の感染によって生じる感染症は、本発明のタ
ンパク質またはポリペプチドを用いて治療することがで
き、該感染症には、ＨＩＶ、肝炎ウイルス、ヘルペスウ
イルス、マイコバクテリア、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ属、
Ｐｌａｍｏｄｉｕｍ属による感染症およびカンジダ症な
どの様々な真菌感染症が挙げられる。この点については
もちろん、一般的に免疫系を促進することが所望される
場合、例えば、癌の治療においても、本発明のタンパク
質またはポリペプチドは有用である。
【０２９４】あるいは、上記のようにして調製されるタ
ンパク質またはポリペプチドを、例えば、結合組織病、
多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウ
マチ、自己免疫性肺炎、ギヤン−バレー症候群、自己免
疫性甲状腺炎、インスリン依存性糖尿病、重症筋無力
症、移植片対宿主病および自己免疫性炎症性眼疾患など
の自己免疫疾患の治療に使用してもよい。そのようなタ
ンパク質またはポリペプチドは、喘息（特にアレルギー
性喘息）または他の呼吸器系障害などのアレルギー反応
および症状の治療にも有用である。免疫抑制が所望され
る他の症状（例えば、臓器移植など）も、本発明のタン
パク質またはポリペプチドを使用して治療することがで
きる。
【０２９５】本発明のタンパク質またはポリペプチドを
使用すれば、免疫応答を上向きまたは下向きのいずれか
に調節することも可能である。ダウンレギュレーション
には、既に進行中にある免疫応答の阻害または阻止が関
与するか、あるいは免疫応答の誘導の防止が関与し得
る。Ｔ細胞応答を抑制するかまたはＴ細胞の特異的寛容
性を誘導することによって、あるいはその両方によっ
て、活性化されたＴ細胞の機能が阻害され得る。Ｔ細胞
応答の免疫抑制は、一般に、積極的な非抗原特異的プロ
セスであって、Ｔ細胞を抑制剤に継続的に暴露する必要
がある。寛容性は、Ｔ細胞の非応答性またはアネルギー
を誘導することを含むが、一般に抗原特異的であり、寛
容化剤への暴露が終了した後も存続するという点で免疫
抑制とは異なる。実際には、寛容化剤が存在しない場合
は、特異的抗原に再暴露されてもＴ細胞の応答が認めら
れないことから、寛容性を実証することができる。
【０２９６】１つ以上の抗原機能（例えば、Ｂ７同時刺
激などのＢリンパ球抗原機能が挙げられるが、これに限
定されない）をダウンレギュレートするかまたは防止す
ること、例えば、活性化されたＴ細胞による高レベルの
リンホカイン合成を防止することは、組織、皮膚および
臓器移植の状況において、ならびに移植片対宿主病（Ｇ
ＶＨＤ）において有用である。例えば、Ｔ細胞の機能を
阻止すると、組織移植における組織破壊が減少するはず
である。典型的に、組織移植では、移植片がＴ細胞によ
って外来性であると認識されることによって移植片の拒
絶が始まり、続いて、免疫反応によって移植片が破壊さ
れる。Ｂ７リンパ球抗原と免疫細胞上のその天然のリガ
ンド（例えば、Ｂ７−２活性を有するペプチドの可溶性
単量体形態のみかあるいは該ペプチドの可溶性単量体形
態ともう１つのＢリンパ球抗原（例えば、Ｂ７−１、Ｂ
７−３）の活性を有するかまたは抗体を阻止するペプチ
ドの単量体形態とを合わせたもの）との相互作用を阻害
するかまたは阻止する分子を移植前に投与すると、対応
する同時刺激シグナルを伝達することなく免疫細胞上の
天然のリガンドに該分子を結合することができる。この
事柄においてＢリンパ球抗原機能を阻止すると、Ｔ細胞
などの免疫細胞によるサイトカイン合成が防止され、そ
れゆえ、該阻止は免疫抑制剤として作用する。更に、同
時刺激の欠如もＴ細胞をアネルギー化する（ａｎｅｒｇ
ｉｚｅ）のに十分であり得、これにより、被験体に寛容
性が誘導される。Ｂリンパ球抗原阻止試薬によって長期
寛容性を誘導すると、これらの阻止試薬の反復投与の必
要性を回避することができる。被験体において十分な免
疫抑制または寛容性を達成するために、Ｂリンパ球抗原
の組み合わせの機能を阻止する必要があり得る。
【０２９７】ヒトにおける評価の予想となる動物モデル
を用いて、臓器移植の拒絶またはＧＶＨＤを防止する特
定の阻止試薬の効果を評価することができる。使用する
ことのできる適切な系の例としては、ラットにおける同
種心移植片およびマウスにおける異種ランゲルハンス島
細胞移植片が挙げられ、両者ともｉｎ ｖｉｖｏでＣＴ
ＬＡ４Ｉｇ融合タンパク質の免疫抑制効果を調べるのに
使用されている。これらのことについては、Ｌｅｎｓｃ
ｈｏｗら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：７８９−７９２
（１９９２）およびＴｕｒｋａら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ
ｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ，８９：１１１０２−
１１１０５（１９９２）に記載されている。更に、ＧＶ
ＨＤのマウスモデル（Ｐａｕｌ編，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔ
ａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９，８４６〜８４７頁を
参照のこと）を使用して、該疾患の進行に対するｉｎ
ｖｉｖｏでのＢリンパ球抗原機能の阻止の効果を決定す
ることができる。
【０２９８】抗原機能の阻止も、自己免疫疾患の治療に
は治療上有効である。多くの自己免疫障害は、Ｔ細胞の
活性化が不適切であることが原因であり、この時Ｔ細胞
は自己の組織に対して反応性であり、疾患の病因に関与
するサイトカインおよび自己抗体の産生を促進する。自
己反応性のＴ細胞の活性化を防止すると、疾患の症候を
減少または消失することができる。Ｂリンパ球抗原のレ
セプター／リガンド相互作用を破壊することによってＴ
細胞の同時刺激を阻止する試薬を投与することにより、
Ｔ細胞の活性化を阻害し、疾患のプロセスに潜在的に関
与する自己抗体またはＴ細胞誘導性サイトカインの産生
を防止することができる。更に、阻止試薬は、自己反応
性Ｔ細胞の抗原特異的寛容性を誘導することができ、こ
れにより疾患から長期軽減を導き得る。詳細に特性づけ
されたヒト自己免疫疾患の多くの動物モデルを使用し
て、自己免疫障害を妨げるかまたは緩和する阻止試薬の
効果を決定することができる。その例としては、マウス
実験的自己免疫脳炎、ＭＲＬ／ｐｒ／ｐｒマウスまたは
ＮＺＢ交雑マウスの全身性エリテマトーデス、マウスの
自己免疫性抗原性関節炎（ｍｕｒｉｎｅ ａｕｔｏｉｍ
ｍｕｎｏ ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、
ＯＤマウスおよびＢＢラットの糖尿病、ならびにマウス
の実験的重症筋無力症が挙げられる（Ｐａｕｌ編、Ｆｕ
ｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｒａｖｅ
ｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９，８４０
〜８５６頁を参照のこと）。
【０２９９】免疫応答をアップレギュレートする手段と
して、抗原機能（好ましくはＢリンパ球の抗原機能）を
アップレギュレートすることも治療に有効であり得る。
免疫応答のアップレギュレーションには、現存の免疫応
答を増強するか、または以下の例に示されるような初期
免疫応答を誘発するかのいずれかが関与し得る。例え
ば、Ｂリンパ球抗原機能を刺激することをにより免疫応
答を増強することは、ウイルス感染の場合に有用であり
得る。更に、全身的なＢリンパ球抗原の刺激形態を投与
することによって、インフルエンザ、一般的な風邪、お
よび脳炎などの全身性ウイルス疾患を緩和し得る。
【０３００】あるいは、感染患者からＴ細胞を取り出
し、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて上記タンパク質またはポ
リペプチドを発現するかまたは該タンパク質またはポリ
ペプチドと共に本発明のタンパク質またはポリペプチド
の刺激形態を発現するウイルス抗原で惹起されたＡＰＣ
で該Ｔ細胞を同時刺激し、そしてｉｎ ｖｉｔｒｏで感
作したＴ細胞を前記患者に再導入することによって、前
記患者の抗ウイルス免疫応答を増強してもよい。これで
感染細胞は、同時刺激シグナルをｉｎ ｖｉｖｏでＴ細
胞に送達し、従って、Ｔ細胞を活性化することができ
る。
【０３０１】もう１つの適用では、抗原機能（好ましく
はＢリンパ球の抗原機能）のアップレギュレーションま
たは増強は、腫瘍免疫の誘導に有益であり得る。タンパ
ク質またはポリペプチドをコードする上記核酸の一つを
トランスフェクトされた腫瘍細胞（例えば、肉腫、黒色
腫、リンパ腫、白血病、神経芽腫、癌腫）を被験体に投
与して、該被験体の腫瘍特異的寛容性を克服することが
できる。所望であれば、ペプチドを組み合わせて発現す
るように腫瘍細胞をトランスフェクトすることもでき
る。例えば、患者から得られる腫瘍細胞を、ｅｘ ｖｉ
ｖｏにおいて、Ｂ７−２様活性を有するペプチドのみ
か、あるいは該ペプチドとＢ７−１様活性および／また
はＢ７−３様活性を有するペプチドとを合わせたものの
発現を指令する発現ベクターでトランスフェクトするこ
とができる。トランスフェクトされた腫瘍細胞は患者に
戻され、その結果、トランスフェクトされた細胞の表面
上でこれらのペプチドが発現する。あるいは、ｉｎ ｖ
ｉｖｏでのトランスフェクションにおいて腫瘍細胞を標
的化するために、遺伝子治療技術を使用することができ
る。
【０３０２】腫瘍細胞の表面上にＢリンパ球抗原の活性
を有する、上記核酸によりコードされるタンパク質また
はポリペプチドが存在すると、必要な同時刺激シグナル
がＴ細胞に提供され、トランスフェクトされた腫瘍細胞
に対するＴ細胞介在性免疫応答が誘導される。更に、十
分な量のＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子を
再発現することができないかまたは完全に損なわれてい
る腫瘍細胞を、ＭＨＣクラスＩα鎖およびβ2ミクログ
ロブリンまたはＭＨＣクラスＩＩα鎖およびＭＨＣクラ
スＩＩβ鎖の全てまたは一部（例えば、細胞質ドメイン
を切断した部分）をコードする核酸でトランスフェクト
することができ、それにより、該腫瘍細胞は細胞表面上
にそれぞれＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩタンパク質
を発現する。適切なＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分
子がＢリンパ球抗原（例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ
７−３）の活性を有するペプチドと合わせて発現する
と、トランスフェクトされた腫瘍細胞に対するＴ細胞介
在性免疫応答が誘導される。場合に応じて、不変鎖など
のＭＨＣクラスＩＩの発現を阻止するアンチセンス構築
物をコードする核酸も、Ｂリンパ球抗原の活性を有する
タンパク質またはポリペプチドをコードするＤＮＡと共
に同時トランスフェクトし、腫瘍関連抗原の提示を促進
して、腫瘍特異的免疫を誘導することができる。従っ
て、ヒト被験体においてＴ細胞介在性免疫応答を誘導す
ることは、被験体において腫瘍特異的寛容性を克服する
のに十分であり得る。あるいは、以下に詳細に記載する
ように、これらの免疫系調節物質のタンパク質またはポ
リペプチドをコードする核酸またはそのようなタンパク
質またはポリペプチドの発現を調節する核酸を適切な宿
主細胞に導入して、所望する通りに該タンパク質または
ポリペプチドの発現を増加または減少してもよい。
【０３０３】実施例２４ 造血調節活性を対象とした発現されたタンパク質または
ポリペプチドのアッセイ 上記核酸によりコードされるタンパク質またはポリペプ
チドを、それらの造血調節活性について評価することが
できる。例えば、胚性幹細胞の分化に対する該タンパク
質またはポリペプチドの効果を評価することができる。
そのような活性に対する多くのアッセイが当業者によく
知られており、以下のような参考文献（これらは参照に
より本明細書に組み入れる）：Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら，
Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １５：１４１−１５１，１９
９５；Ｋｅｌｌｅｒら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏ
ｌ． １３：４７３−４８６，１９９３；ＭｃＣｌａｎ
ａｈａｎら，Ｂｌｏｏｄ ８１：２９０３−２９１５，
１９９３；に記載のアッセイが挙げられる。
【０３０４】上記核酸によりコードされるタンパク質ま
たはポリペプチドを、幹細胞の寿命および幹細胞の分化
に対するそれらの影響について評価することができる。
そのような活性に対する多くのアッセイが当業者によく
知られており、以下のような参考文献（これらは参照に
より本明細書に組み入れる）：Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｍ．
Ｇ．，Ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｃｏｌｏｎｙ
Ｆｏｒｍｉｎｇ Ａｓｓａｙｓ，ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｅｌｌ
ｓ．，Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙら編，２６５〜２６８
頁，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ，ＮＹ．１９９４；Ｈｉｒａｙａｍａら，Ｐｒｏ
ｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８
９：５９０７−５９１１，１９９２；ＭｃＮｉｅｃｅ，
Ｉ．Ｋ．およびＢｒｉｄｄｅｌｌ，Ｒ．Ａ．，Ｐｒｉｍ
ｉｔｉｖｅ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｏｌｏｎ
ｙ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ Ｈｉｇｈ
ＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅＰｏｔｅｎｔｉａｌ，ｉ
ｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉ
ｃ Ｃｅｌｌｓ；Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙら編，Ｖｏ
ｌ２３〜３９頁，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ．１９９４；Ｎｅｂｅｎら，Ｅｘ
ｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２２：
３５３−３５９，１９９４；Ｐｌｏｅｍａｃｈｅｒ，
Ｒ．Ｅ．Ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ Ａｒｅａ Ｆｏｒｍ
ｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ａｓｓａｙ，Ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ
ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ，
Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙら編，１〜２１頁，Ｗｉｌｅ
ｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ．１
９９４；Ｓｐｏｏｎｃｅｒ，Ｅ．，Ｄｅｘｔｅｒ，Ｍ．
およびＡｌｌｅｎ，Ｔ．，Ｌｏｎｇ Ｔｅｒｍ Ｂｏｎ
ｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｉｎ ｔｈｅＰ
ｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｓｔｒｏｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，
ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅｏｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉ
ｃ Ｃｅｌｌｓ，Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙら編，１６
３−１７９頁，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ．１９９４；ならびにＳｕｔｈｅｒ
ｌａｎｄ，Ｈ．Ｊ．，Ｌｏｎｇ Ｔｅｒｍ Ｃｕｌｔｕ
ｒｅ Ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ａｓｓａｙ，
ｉｎＣｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉ
ｃ Ｃｅｌｌｓ，Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙら編，１３
９−１６２，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，ＮＹ．１９９４に記載のアッセイが挙げら
れる。
【０３０５】次いで、造血調節活性を示すタンパク質ま
たはポリペプチドを、医薬として製剤化し、造血の調節
が有益である臨床状態を治療するために使用することが
できる。例えば、本発明のタンパク質またはポリペプチ
ドは造血の調節に有用であり、従って、骨髄またはリン
パ球細胞欠損症の治療に有用である。コロニー形成細胞
または因子依存性細胞系を支える周辺の生物学的活性に
よっても造血の調節への関与が認められる。例えば、赤
血球前駆細胞単独あるいは他のサイトカインとの組み合
わせの成長または増殖を支持することによって、例え
ば、様々な貧血の治療において、あるいは赤血球前駆細
胞および／または赤血球細胞の産生を刺激するための放
射線照射／化学療法との併用に有用である。顆粒球およ
び単球／マクロファージなどの骨髄細胞の成長または増
殖を支持する（即ち、従来のＣＳＦ活性）ことによっ
て、例えば、結果として生じる骨髄抑制（ｍｙｅｌｏｓ
ｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）を予防するかまたは治療するた
めの化学療法との組み合わせにおいて有用であり得る。
巨核細胞の成長および増殖、すなわち血小板の成長およ
び増殖を支持することによって、血小板減少症などの様
々な血小板異常の防止または治療を可能にし、一般に、
血小板輸注の代わりまたは補助に使用することができ
る。および／または、上記の造血細胞のいくつかおよび
全てに成熟することができる造血幹細胞の成長および増
殖を支持することによって、様々な幹細胞異常（通常、
移植で治療されるものなど、例えば、再生不良性貧血お
よび発作性夜間血色素尿症が挙げられるが、それらに限
定されない）において、ならびに正常細胞または遺伝子
治療のために遺伝子操作された細胞として、ｉｎ ｖｉ
ｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ（骨髄移植との組み合わせか
または末梢前駆細胞移植（同種または異種））のいずれ
かで放射線照射／化学療法後の幹細胞画分の増殖に治療
上有用である。あるいは、以下に詳細に記載されるよう
に、これらのタンパク質もしくはポリペプチドをコード
する核酸またはこれらのタンパク質もしくはポリペプチ
ドの発現を調節する核酸を適切な宿主細胞に導入し、所
望する通りに該タンパク質の発現を増加または減少する
ことができる。
【０３０６】実施例２５ 組織成長の調節を対象とした発現されたタンパク質また
はポリペプチドのアッセイ 上記核酸によりコードされるタンパク質またはポリペプ
チドは、組織の成長に対するそれらの効果についても評
価することができる。そのような活性に対する多くのア
ッセイが当業者によく知られており、国際特許公開ＷＯ
９５／１６０３５号、国際特許公開ＷＯ９５／０５８４
６号、および国際特許公開ＷＯ９１／０７４９１号（こ
れらは本明細書において参考として援用される）に開示
されているアッセイが挙げられる。
【０３０７】創傷治癒活性のためのアッセイとしては、
Ｗｉｎｔｅｒ， Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｗｏｕｎｄ Ｈ
ｅａｌｉｎｇ、７１〜１１２頁（Ｍａｉｂａｃｈ、Ｈ１
およびＲｏｖｅｅ、ＤＴ、編）、Ｙｅａｒ Ｂｏｏｋ
Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．，
Ｃｈｉｃａｇｏに記載のアッセイを、Ｅａｇｌｓｔｅ
ｉｎおよびＭｅｒｔｚ， Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅ
ｒｍａｔｏｌ．７１：３８２-８４（１９７８）（これ
は本明細書において参考として援用される）において改
変したアッセイが挙げられるが、これに限定される訳で
はない。
【０３０８】次いで、組織の成長の調節に関与するタン
パク質またはポリペプチドを医薬として処方し、組織成
長の調節が有益である臨床症状を治療するために使用す
ることができる。例えば、タンパク質またはポリペプチ
ドは、骨、軟骨、腱、靭帯および／または神経組織の成
長または再生ならびに創傷の治癒および組織の修復およ
び置換に使用される組成物、ならびに火傷、切開および
潰瘍の治療に有用であり得る。
【０３０９】上記核酸によりコ-ドされるタンパク質ま
たはポリペプチドは、骨が正常に形成されない環境にお
いて軟骨および／または骨の成長を誘導するため、ヒト
および他の動物における骨折および軟骨の損傷または欠
損の治癒に適用性を有する。本発明のタンパク質または
ポリペプチドを用いるそのような調製物は、閉鎖骨折お
よび開放骨折の整復ならびに人工関節の固定の改善にお
いて予防的用途を有し得る。骨形成剤によって誘導され
るde novoでの骨合成は、先天性、外傷誘導性、または腫
瘍学的切除誘導性脳顔面頭蓋欠損の修復に役立ち、また
美容整形外科においても有用である。
【０３１０】本発明のタンパク質またはポリペプチド
は、歯周病の治療および他の歯修復過程においても使用
することができる。そのような薬剤は、骨形成細胞を引
き寄せる環境を提供するか、骨形成細胞の増殖を刺激す
るか、または骨形成前駆細胞の分化を誘導することがで
きる。本発明のタンパク質はまた、例えば、骨および／
または軟骨修復の刺激を介するか、あるいは炎症または
炎症過程によって介在される組織破壊の過程（コラゲナ
ーゼ活性、破骨細胞活性など）を阻止することによる、
骨粗しょう症または変形性関節症の治療にも有用であ
る。
【０３１１】上記核酸によりコードされるタンパク質ま
たはポリペプチドに帰すことができる組織再生活性のも
う１つのカテゴリーは、腱／靭帯形成である。上記核酸
によりコードされるタンパク質またはポリペプチドは、
腱／靭帯様組織または他の組織が通常は形成されない環
境でのそのような組織の形成を誘導し、ヒトおよび他の
動物における腱または靭帯の断裂、変形および他の腱ま
たは靭帯欠損の治癒において適用性を有する。腱／靭帯
様組織を誘導するタンパク質を用いるそのような調製物
は、腱または靭帯組織に対する損傷の防止、ならびに骨
または他の組織に対する腱または靭帯固定の改善、およ
び腱または靭帯組織に対する欠損の修復において予防的
用途を有し得る。本発明のタンパク質またはポリペプチ
ドによって誘導されるde novoでの腱／靭帯様組織形成
は、先天性、外傷性または他に由来する腱または靭帯欠
損の修復に役立ち、また腱または靭帯の付着または修復
のための美容整形外科に有用である。本発明のタンパク
質またはポリペプチドは、腱または靭帯形成細胞を引き
寄せるか、腱または靭帯形成細胞の増殖を刺激するか、
腱または靭帯形成細胞の前駆細胞の分化を誘導するか、
あるいは組織の修復を引き起こすようにin vivoに戻す
ためにex vivoでの腱／靭帯細胞または前駆細胞の増殖
を誘導する環境を提供する。本発明のタンパク質または
ポリペプチドは、腱炎、手根管症候群および他の腱また
は靭帯欠損の治療にも有用である。治療組成物は、当該
分野においてキャリアとして周知の適切なマトリックス
および／または封鎖剤（sequestering agent）を含んで
もよい。
【０３１２】本発明のタンパク質またはポリペプチド
は、神経細胞の増殖ならびに神経および脳組織の再生、
即ち、中枢神経系および末梢神経系の疾患および壊疽、
ならびに神経細胞または神経組織の変性、死または外傷
に関与する機械性および外傷性障害の治療にも有用であ
る。より具体的には、タンパク質またはポリペプチド
を、末梢神経の損傷、末梢性ニューロパシーおよび局限
性ニューロパシーなどの末梢神経系の疾患、ならびにア
ルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋
萎縮側索硬化症、およびシャイ-ドレーガー症候群など
の中枢神経系の疾患の治療に使用してもよい。更に、本
発明に従って治療され得る症状としては、脊髄障害、頭
部外傷などの機械性および外傷性障害ならびに脳卒中な
どの脳血管性疾患などが挙げられる。化学療法または他
の医学療法により生じる末梢性ニューロパシーも、本発
明のタンパク質またはポリペプチドを使用して治療する
ことができる。
【０３１３】本発明のタンパク質またはポリペプチドは
また、非治癒性創傷のより良好または迅速な閉鎖を促進
するのにも有用であり、該創傷としては、圧迫性潰瘍
（pressure ulcers）、血管不全を伴う潰瘍、外科的お
よび外傷性創傷などが挙げられるが、これらに限定され
る訳ではない。本発明のタンパク質またはポリペプチド
はまた、臓器（例えば、膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、
内皮を含む）、筋肉（平滑筋、骨格筋または心筋）およ
び脈管（脈管内皮を含む）組織などの他の組織の発生ま
たは再生、あるいはそのような組織を構成する細胞の増
殖を促進するための活性を示し得ることが予想される。
所望される効果の１つは、線維性瘢痕形成（fibrotic s
carring）を阻害または調節することによって、正常な
組織の発生を可能にすることである。本発明のタンパク
質またはポリペプチドはまた、脈管形成活性を示し得
る。
【０３１４】本発明のタンパク質またはポリペプチド
は、腸の保護または再生および肺または肝繊維症、様々
な組織における再灌流障害、ならびに全身性サイトカイ
ン障害により生じる症状の治療にも有用である。本発明
のタンパク質またはポリペプチドは、前駆組織または細
胞からの上記組織の分化を促進または阻害すること、ま
たは上記組織の成長を阻害するのにも有用である。ある
いは、以下に詳細に記載のように、組織の成長を調製す
る活性を有するタンパク質またはポリペプチドをコード
する核酸またはそのようなタンパク質またはポリペプチ
ドの発現を調節する核酸を適切な宿主細胞に導入し、所
望する通りに該タンパク質またはポリペプチドの発現を
増加または減少させることができる。
【０３１５】実施例２６ 生殖ホルモンの調節を対象とした発現されたタンパク質
またはポリペプチドのアッセイ 本発明のタンパク質またはポリペプチドは、卵胞刺激ホ
ルモンなどの生殖ホルモンを調節するそれらの能力につ
いて評価することもできる。そのような活性に対する多
くのアッセイが当業者によく知られており、以下の参考
文献に開示されているアッセイが挙げられるが、これら
は本明細書において参考として援用される：Ｖａｌｅ
ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ９１：５６２-５７２，
１９７２；Ｌｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：７７
９-７８２， １９８６；Ｖａｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ
３２１：７７６-７７９， １９８６；Ｍａｓｏｎら、
Ｎａｔｕｒｅ ３１８：６５９-６６３， １９８５；
Ｆｏｒａｇｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：３０９１-３０９５，１９８
６， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６．１２章、Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇ
ａｎら編、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓ
ｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ-Ｉｎｔｅｒｓ
ｃｉｅｎｃｅ；Ｔａｕｂら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖ
ｅｓｔ． ９５：１３７０-１３７６， １９９５；Ｌ
ｉｎｄら、ＡＰＭＩＳ １０３：１４０-１４６， １
９９５；Ｍｕｌｌｅｒら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ． ２５：１７４４-１７４８；Ｇｒｕｂｅｒら、
Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２：５８６０-５８６
７， １９９４； Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、Ｊ． Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ． １５３：１７６２-１７６８， １９９
４。
【０３１６】次いで、生殖ホルモンまたは細胞運動の調
節物質としての活性を示すそれらのタンパク質またはポ
リペプチドを医薬として処方し、生殖ホルモンの調節が
有益な臨床症状を治療するのに使用してもよい。例え
ば、タンパク質またはポリペプチドは、アクチビンまた
はインヒビン関連活性も示し得る。インヒビンは、卵胞
刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出を阻害する能力を特徴と
し、アクチビンはＦＳＨの放出を刺激する能力を特徴と
する。従って、本発明のタンパク質またはポリペプチド
は、それのみで、またはインヒビンαファミリーのメン
バーとのヘテロダイマーの形で、雌の哺乳動物における
生殖能力を減少し、雄の哺乳動物の精子形成を減少する
能力に基づく避妊薬として有用であり得る。十分な量の
他のインヒビンを投与すると、これらの動物において不
妊を誘発することができる。あるいは、本発明のタンパ
ク質またはポリペプチドは、ホモダイマー、またはイン
ヒビンＢ群の他のタンパク質サブユニットとのヘテロダ
イマーとして存在し、脳下垂体前葉の細胞からのＦＳＨ
放出を刺激するアクチビン分子の能力に基づく生殖能力
誘導療法として有用であり得る。例えば、米国特許第
４，７９８，８８５号を参照のこと。該参考文献の開示
内容は本明細書において参考として援用される。本発明
のタンパク質またはポリペプチドはまた、ウシ、ヒツジ
およびブタなどの家畜の生存期間中の生殖能力を向上す
るように、性的に未成熟な哺乳動物の生殖能力の発生を
進めるのに有用である。
【０３１７】あるいは、以下に詳細に記載のように、生
殖ホルモン調節活性を有するタンパク質またはポリペプ
チドをコードする核酸またはそのようなタンパク質また
はポリペプチドの発現を調節する核酸を適切な宿主細胞
に導入し、所望する通りに該タンパク質またはポリペプ
チドの発現を増加または減少させることができる。
【０３１８】実施例２７ 走化性／ケモキネシス活性を対象とした発現されたタン
パク質またはポリペプチドのアッセイ 本発明のタンパク質またはポリペプチドは、走化性／ケ
モキネシス活性について評価することもできる。例え
ば、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、例え
ば、単球、線維芽細胞、好中球、Ｔ細胞、肥満細胞、好
酸球、上皮および／または内皮細胞を含む哺乳動物細胞
に対する走化性またはケモキネシス活性（例えば、ケモ
カインとして作用する）を有し得る。走化性およびケモ
キネシスタンパク質またはポリペプチドを使用して、所
望の細胞集団を所望の作用部位に移動させるかまたは引
き寄せることができる。走化性およびケモキネシスタン
パク質またはポリペプチドは、組織に対する創傷および
他の外傷の治療、ならびに限局性感染症の治療に特定の
利点を提供する。例えば、腫瘍または感染部位にリンパ
球、単球または好中球を引き寄せると、腫瘍または感染
因子に対する免疫応答を改善することができる。
【０３１９】タンパク質またはポリペプチドが直接的ま
たは間接的に特定の細胞集団の指令された方向づけまた
は運動を刺激することができるのであれば、該タンパク
質またはポリペプチドは該特定の細胞集団に対する走化
性活性を有する。好ましくは、タンパク質またはペプチ
ドは細胞の指令された運動を直接刺激する能力を有す
る。特定のタンパク質またはポリペプチドが細胞の集団
に対して走化性活性を有するか否かは、細胞走化性に対
する任意の既知のアッセイにおいてそのようなタンパク
質またはポリペプチドを用いることによって容易に決定
することができる。
【０３２０】本発明のタンパク質またはポリペプチドの
活性は、中でも以下の方法によって測定することができ
る。走化性活性のためのアッセイ（走化性を誘導または
妨げるタンパク質またはポリペプチドを同定するもの）
は、細胞が膜を横切る移動を誘導するタンパク質または
ポリペプチドの能力、および１つの細胞集団のもう１つ
の細胞集団への付着を誘導するタンパク質またはポリペ
プチドの能力を測定するアッセイからなる。運動および
付着のための適切なアッセイとしては、Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，
Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ、Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅ
ｋ、Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａ
ｃｈおよびＷ．Ｓｔｒｏｂｅｒ編、Ｐｕｂ． Ｇｒｅｅ
ｎｅ ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａ
ｎｄ Ｗｉｌｅｙ-Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，６．１
２章：６．１２．１-６．１２．２８；Ｔａｕｂら、
Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．９５：１３７０-１
３７６， １９９５；Ｌｉｎｄら、ＡＰＭＩＳ１０３：
１４０-１４６， １９９５；Ｍｕｅｌｌｅｒら、Ｅｕ
ｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２５：１７４４-１７
４８；Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５
２：５８６０-５８６７， １９９４；Ｊｏｈｎｓｔｏ
ｎら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５３：１７６２-１
７６８，１９９４に記載のアッセイが挙げられるが，そ
れらに限定される訳ではない。
【０３２１】実施例２８ 血液凝固の調節を対象とした発現されたタンパク質また
はポリペプチドのアッセイ 本発明のタンパク質またはポリペプチドは、血液凝固に
対するそれらの効果について評価することもできる。そ
のような活性に対する多くのアッセイが当業者によく知
られており、以下の参考文献に開示されているアッセイ
が挙げられるが、これらは本明細書において参考として
援用される：Ｌｉｎｅｔら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐｈａ
ｒｍａｃｏｌ． ２６：１３１-１４０， １９８６；
Ｂｕｒｄｉｃｋら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓ．
４５：４１３-４１９， １９８７；Ｈｕｍｐｈｒｅｙ
ら、Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ５：７１-７９， １
９９１；Ｓｃｈａｕｂ， Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ
ｓ ３５：４６７-４７４， １９８８。
【０３２２】次いで、血液凝固の調節に関連するそれら
のタンパク質またはポリペプチドを医薬として処方し、
血液凝固の調節が有益な臨床症状を治療するのに使用し
てもよい。例えば、本発明のタンパク質またはポリペプ
チドはまた、止血または血栓溶解（thrombolytic）活性
を示し得る。その結果、そのようなタンパク質またはポ
リペプチドは、様々な凝固異常（血友病などの遺伝性異
常を含む）の治療において、あるいは外傷、外科または
他の原因から生じる創傷の治療における凝固および他の
止血事象を促進するのに有用であると予想される。本発
明のタンパク質またはポリペプチドはまた、血栓の溶解
または血栓形成阻害ならびに血栓形成から生じる症状
（心血管の梗塞および中枢神経系血管の梗塞（例えば、
脳卒中）など）の予防および治療にも有用であり得る。
あるいは、以下に詳細に記載のように、血液凝固活性を
有するタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸
またはそのようなタンパク質またはポリペプチドの発現
を調節する核酸を適切な宿主細胞に導入し、所望する通
りに該タンパク質またはポリペプチドの発現を増加また
は減少させることができる。
【０３２３】実施例２９ 受容体／リガンド相互作用への関与を対象とした発現さ
れたタンパク質またはポリペプチドのアッセイ 本発明のタンパク質またはポリペプチドは、受容体／リ
ガンド相互作用への関与について評価することもでき
る。そのような関与に対する多くのアッセイが当業者に
よく知られており、以下の参考文献に開示されているア
ッセイが挙げられるが、これらは本明細書において参考
として援用される：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、７．７．２８．１-
７．２８．２２章、Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｇｒ
ｅｅｎｅ ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ
ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ-Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｔ
ａｋａｉら、Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃ
ｉ． ＵＳＡ ８４：６８６４-６８６８， １９８
７；Ｂｉｅｒｅｒら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６
８：１１４５-１１５６， １９８８；Ｒｏｓｅｎｓｔ
ｅｉｎら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６９：１４９
-１６０， １９８９；Ｓｔｏｌｔｅｎｂｏｒｇら、
Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １７５：５
９-６８， １９９４；Ｓｔｉｔｔら、Ｃｅｌｌ ８
０：６６１-６７０， １９９５；Ｇｙｕｒｉｓら、Ｃ
ｅｌｌ ７５：７９１-８０３， １９９３。
【０３２４】例えば、本発明のタンパク質またはポリペ
プチドは、受容体、受容体リガンドまたは受容体／リガ
ンド相互作用の阻害剤もしくはアゴニストとしての活性
を示す。そのような受容体およびリガンドの例として
は、サイトカイン受容体およびそれらのリガンド、受容
体キナーゼおよびそれらのリガンド、受容体ホスファタ
ーゼおよびそれらのリガンド、細胞-細胞間相互作用に
関与する受容体およびそれらのリガンド（細胞付着分子
（セレクチン、インテグリンおよびそれらのリガンドな
ど）、および細胞性および体液性免疫応答の抗原提示、
抗原認識および発達に関与する受容体／リガンド対を含
むがそれらに限定されない）が挙げられるが、それらに
限定される訳ではない。受容体およびリガンドは、関連
の受容体／リガンド相互作用の潜在的なペプチドまたは
小分子阻害剤のスクリーニングにも有用である。本発明
のタンパク質またはポリペプチド（受容体およびリガン
ドの断片を含むが、それらに限定されない）は、受容体
／リガンド相互作用の阻害剤として有用であり得る。あ
るいは、以下に詳細に記載のように、受容体／リガンド
相互作用に関与するタンパク質またはポリペプチドをコ
ードする核酸またはそのようなタンパク質またはポリペ
プチドの発現を調節する核酸を適切な宿主細胞に導入
し、所望する通りに該タンパク質またはポリペプチドの
発現を増加または減少させることができる。
【０３２５】実施例３０ 抗炎症活性を対象としたタンパク質またはポリペプチド
のアッセイ 本発明のタンパク質またはポリペプチドは、抗炎症活性
について評価することもできる。抗炎症活性は、炎症応
答に関与する細胞に刺激を与えることによって、細胞-
細胞間相互作用（例えば、細胞付着など）を阻害もしく
は促進することによって、炎症過程に関与する細胞の走
化性を阻害もしくは促進することによって、細胞溢出を
阻害もしくは促進することによって、または炎症応答を
より直接的に阻害もしくは促進する他の因子の産生を刺
激もしくは抑制することによって、達成することができ
る。そのような活性を示すタンパク質またはポリペプチ
ドを使用して、慢性または急性症状を含む炎症症状を治
療することができる。該炎症症状としては、感染に伴う
炎症（敗血症性ショック、敗血症または全身性炎症応答
症候群）、虚血性再灌流障害（ischemia-reperfusionin
ury）、エンドトキシン死亡率、関節炎、補体介在性超
急性拒絶、腎炎、サイトカインまたはケモカイン誘導性
肺損傷、炎症性腸疾患、クローン病あるいはＴＮＦまた
はＩＬ-１などのサイトカインの過度の産生により生じ
る疾患が挙げられるが、これらに限定される訳ではな
い。本発明のタンパク質またはポリペプチドは、抗原性
物質または材料に対するアナフィラキシーおよび過敏症
を治療するのにも有用であり得る。あるいは、以下に詳
細に記載のように、抗炎症活性を有するタンパク質また
はポリペプチドをコードする核酸またはそのようなタン
パク質またはポリペプチドの発現を調節する核酸を適切
な宿主細胞に導入し、所望する通りに該タンパク質また
はポリペプチドの発現を増加または減少させることがで
きる。
【０３２６】実施例３１ 腫瘍阻害活性を対象とした発現されたタンパク質または
ポリペプチドのアッセイ 本発明のタンパク質またはポリ
ペプチドは、腫瘍阻害活性について評価することもでき
る。腫瘍の免疫学的治療または予防についての上記の活
性に加えて、本発明のタンパク質またはポリペプチドは
他の抗腫瘍活性を示し得る。タンパク質またはポリペプ
チドは、腫瘍の成長を（例えば、ＡＤＣＣを介して）直
接的または間接的に阻害することができる。タンパク質
またはポリペプチドは、腫瘍組織または腫瘍前駆組織に
対して作用することによって、（例えば、血管新生を阻
害することによって）腫瘍の成長を支えるのに必要な組
織の形成を阻害することによって、腫瘍の成長を阻害す
る他の因子、薬剤または細胞型の産生を引き起こすこと
によって、あるいは腫瘍の成長を促進する因子、薬剤ま
たは細胞型を抑制するか、消失させるかまたは阻害する
ことによって、該タンパク質の腫瘍阻害活性を示し得
る。あるいは、以下に詳細に記載のように、腫瘍阻害活
性を有するタンパク質またはポリペプチドをコードする
核酸またはそのようなタンパク質またはポリペプチドの
発現を調節する核酸を適切な宿主細胞に導入し、所望す
る通りに該タンパク質またはポリペプチドの発現を増加
または減少させることができる。
【０３２７】本発明のタンパク質またはポリペプチドは
また、以下の更なる活性または効果の１つ以上を示すこ
ともできる：感染因子の増加、感染または機能を阻害す
ること、あるいは感染因子を死滅すること（該感染因子
としては、細菌、ウイルス、真菌および他の寄生物が挙
げられるが、これらに限定されない）；身体の特徴に影
響を及ぼす（抑制するかまたは増強する）こと（該身体
の特徴としては、身長、体重、毛髪の色、眼の色、皮
膚、体脂肪率（fat to lean ratio）もしくは他の組織
色素沈着、または臓器または身体部分のサイズまたは形
状（例えば、胸部の増大または縮小、骨の形態または形
状の変化など）が挙げられるが、これらに限定されな
い）；バイオリズムもしくはサーカディアンリズムまた
はリズムに影響を及ぼすこと；雄または雌被験体の生殖
能力に影響を及ぼすこと；食事から摂取される脂肪、脂
質、タンパク質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、補因
子あるいは他の栄養因子または成分の代謝、異化作用、
同化作用、プロセシング、利用、貯蔵または排泄に影響
を及ぼすこと；行動特性に影響を及ぼすこと（該行動特
性としては、食欲、性欲、ストレス、認識（認識障害を
含む）、うつ状態（うつ病を含む）および暴力的行動が
挙げられるが、これらに限定されない）；鎮痛効果また
は他の疼痛抑制効果をもたらすこと；造血系列以外の胚
性幹細胞の分化および増加を促進すること；体液性また
は内分泌活性；酵素の場合、酵素の欠乏を補正し、欠乏
関連疾患を治療すること；過増殖異常（例えば、乾癬な
ど）の治療；免疫グロブリン様活性（例えば、抗原また
は補体への結合能など）；ならびにワクチン組成物中の
抗原として作用して、そのようなタンパク質またはもう
１つの材料またはそのようなタンパク質と交差反応を呈
するものに対して免疫応答を惹起する能力。あるいは、
以下に詳細に記載のように、上記の活性のいずれかに関
与するタンパク質またはポリペプチドをコードする核
酸、またはそのようなタンパク質またはポリペプチドの
発現を調節する核酸を適切な宿主細胞に導入し、所望す
る通りに該タンパク質またはポリペプチドの発現を増加
または減少させることができる。
【０３２８】実施例３２ 本発明のタンパク質またはポリペプチドと相互作用する
タンパク質またはポリペプチドの同定 本発明のタンパク質またはポリペプチドと相互作用する
タンパク質またはポリペプチド（例えば、レセプタータ
ンパク質）は、Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ ＴｗｏＨｙｂｒ
ｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ２（カタログ番号Ｋ１６０４−
１、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などのツーハイブリッドシステ
ムを使用して同定することができる。キットに添付され
ている取扱説明書（参照により本明細書に組み入れる）
に記載のように、本発明のタンパク質またはポリペプチ
ドをコードする核酸を、それらが酵母の転写アクチベー
ターＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡ
と共にインフレームに存在するように、発現ベクターに
挿入する。本発明のタンパク質またはポリペプチドと相
互作用し得るタンパク質またはポリペプチドをコードす
るｃＤＮＡライブラリー中のｃＤＮＡを、それらがＧＡ
Ｌ４の活性化ドメインをコードするＤＮＡと共にインフ
レームに存在するように第２の発現ベクターに挿入す
る。２つの発現プラスミドを酵母に形質転換し、酵母
を、それぞれの発現ベクターにおける選択マーカーの発
現およびＨＩＳ３遺伝子のＧＡＬ４依存性発現を対象に
選択する選択培地上でプレート化する。ヒスチジンを欠
く培地上で増殖することができる形質転換体を、ＧＡＬ
４依存性ｌａｃＺ発現についてスクリーニングする。ヒ
スチジン選択およびｌａｃＺアッセイの両方において陽
性であるそれらの細胞は、本発明のタンパク質またはポ
リペプチドと相互作用するタンパク質またはポリペプチ
ドをコードするプラスミドを含有する。
【０３２９】あるいは、本発明のタンパク質またはポリ
ペプチドと相互作用する分子を同定するために、Ｌｕｓ
ｔｉｇら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ２８３：８３−９９， １９９７（開示内容は参照に
より本明細書に組み入れる）に記載の系を使用してもよ
い。そのような系では、本発明のタンパク質またはポリ
ペプチドをコードする核酸挿入物を含有するベクターの
プールにおいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写反応を実施
する。核酸挿入物はｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写を駆動す
るプロモーターの下流にクローニングされる。得られる
ｍＲＮＡのプールをＸｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ卵母
細胞に導入する。次いで、卵母細胞を所望の活性につい
てアッセイする。
【０３３０】あるいは、上記のように産生され、プール
されたｉｎ ｖｉｔｒｏ転写産物をｉｎ ｖｉｔｒｏで
翻訳してもよい。所望の活性または既知のタンパク質ま
たはポリペプチドとの相互作用について、プールされた
ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳産物をアッセイすることができ
る。
【０３３１】様々な更なる技術によって、本発明のタン
パク質またはポリペプチドと相互作用するタンパク質、
ポリペプチドまたは他の分子を見出すことができる。他
の方法では、本発明のタンパク質またはポリペプチドを
含有するアフィニティーカラムを構築することができ
る。本方法では場合により、アフィニティーカラムは、
本発明のタンパク質またはポリペプチドとグルタチオン
Ｓ−トランスフェラーゼとが融合したキメラタンパク質
を含有する。細胞タンパク質の混合物または上記の発現
されたタンパク質のプールをアフィニティーカラムに適
用する。次いで、カラムに付着したタンパク質またはポ
リペプチドと相互作用する分子を単離し、Ｒａｍｕｎｓ
ｅｎら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １８：５８
８−５９８（１９９７）に記載のように２−Ｄ電気泳動
ゲル上で分析することができる。該参考文献の開示内容
は、参照により本明細書に組み入れる。あるいは、アフ
ィニティーカラム上に保持される分子を、電気泳動に基
づく方法によって精製し、配列を決定することができ
る。同じ方法を用いて抗体を単離するか、ファージディ
スプレー産物をスクリーニングするか、またはファージ
ディスプレイーヒト抗体をスクリーニングすることがで
きる。
【０３３２】ＥｄｗａｒｄｓおよびＬｅａｔｈｅｒｂａ
ｒｒｏｗ、ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ ２４６：１−６（１９９７）に記載のように、光
学的バイオセンサーを使用しても、本発明のタンパク質
またはポリペプチドと相互作用する分子をスクリーニン
グすることができる。該参考文献の開示内容は、参照に
より本明細書に組み入れる。本方法の主な利点は、タン
パク質またはポリペプチドと他方の相互作用分子との間
の会合比を決定することができることである。従って、
高いまたは低い会合比の相互作用分子を特異的に選択す
ることが可能である。典型的には、（カルボキシメチル
デキストランマトリックスを介して）標的分子をセンサ
ー表面に結合し、試験分子のサンプルを標的分子に接触
させて配置する。試験分子が標的分子に結合すると、屈
折率および／または濃度に変化が生じる。バイオセンサ
ーによってこの変化を検出する。但し、この変化は、
（センサー表面から数百ナノメートル延長した）一時的
な場において生じる。これらのスクリーニングアッセイ
において、標的分子は、本発明のタンパク質またはポリ
ペプチドの１つであり得、試験サンプルは、組織または
細胞から抽出されたタンパク質、ポリペプチド、または
他の分子の集合、発現されたタンパク質のプール、コン
ビナトリアルペプチドおよび／または化学ライブラリ
ー、あるいはファージによってディスプレーされたペプ
チド群であり得る。試験分子が抽出される組織または細
胞は、任意の種を起源とすることができる。他の方法で
は、標的タンパク質またはポリペプチドは固定化され、
試験集団は独特な本発明のタンパク質またはポリペプチ
ドの集合である。
【０３３３】本発明のタンパク質またはポリペプチドと
薬物との間の相互作用を研究するために、微小透析法
を、Ｗａｎｇら、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ ４
４：２０５−２０８（１９９７）に記載のＨＰＬＣ法ま
たはＢｕｓｃｈら、Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． ７
７７：３１１−３２８（１９９７）に記載のアフィニテ
ィーキャピラリー電気泳動法と組み合わせて使用するこ
とができる。該参考文献の開示内容は、参照により本明
細書に組み入れる。
【０３３４】開示内容を参照により本明細書に組み入れ
る米国特許第5,654,150号に記載されたシステムを使用
して、本発明のタンパク質またはポリペプチドと相互作
用する分子を同定することもできる。このシステムにお
いては、本発明のタンパク質またはポリペプチドをコー
ドする核酸のプールをｉｎ ｖｉｔｒｏで転写および翻
訳して、反応生成物の既知のポリペプチドまたは抗体と
の相互作用をアッセイする。
【０３３５】上記で具体的に列挙した活性に加えて多く
の活性について、本発明のタンパク質またはポリペプチ
ドをアッセイすることができることが、当業者には理解
されるであろう。例えば、発現したタンパク質またはポ
リペプチドを、炎症、腫瘍増殖または転移、感染、ある
いは他の臨床症状の調節及び制御を包含する適用につい
て評価することができる。更に、タンパク質またはポリ
ペプチドは、栄養物質または化粧物質として有用であり
得る。
【０３３６】本発明のタンパク質またはポリペプチドを
使用して、本発明のタンパク質またはポリペプチドに特
異的に結合可能な抗体を作製することができる。抗体
は、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗
体であってもよい。本明細書で使用する場合、「抗体」
とは少なくとも一つの結合ドメインを含むポリペプチド
またはポリペプチドのグループをいう。結合ドメイン
は、抗体分子の可変ドメインのフォールディングによっ
て、抗原の抗原決定基の性状と相補的な内表面の形状お
よび電荷分布を有する三次元の結合空間を形成するよう
に形成され、それによって抗原との免疫学的反応が可能
となる。抗体としては、結合ドメインを含有する組み換
えタンパク質、並びにＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａ
ｂ）2、およびＦ（ａｂ’）2断片等の断片が挙げられ
る。
【０３３７】本明細書で使用する場合、「抗原決定基」
とは、抗原抗体反応の特異性を決定する抗原分子の部分
である。「エピトープ」とは、ポリペプチドの抗原決定
基をいう。エピトープは、そのエピトープに独特な空間
配置（spatial conformation）にあるせいぜい３個のア
ミノ酸を含むことができる。一般に、エピトープは少な
くとも６個のこうしたアミノ酸、より一般的には少なく
とも８-１０個のこうしたアミノ酸から構成される。エ
ピトープを構成するアミノ酸を決定する方法としては、
ｘ線結晶解析、２次元NMR、およびエピトープマッピン
グ、例えば、Ｈ．Ｍａｒｉｏ Ｇｅｙｓｅｎら，１９８
４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．
Ａ．８１：３９９８−４００２；ＰＣＴ公開第ＷＯ８４
／０３５６４；およびＰＣＴ公開第ＷＯ８４／０３５０
６に記載されたＰｅｐｓｃａｎ法等が挙げられる。
【０３３８】ある態様においては、抗体は、ＥＳＴ関連
核酸、ＥＳＴ関連核酸断片、ＥＳＴ関連核酸のポジショ
ナルセグメント、またはＥＳＴ関連核酸のポジショナル
セグメント断片によってコードされるタンパク質または
ポリペプチドに特異的に結合することができるものであ
る。またある態様においては、抗体は、ＥＳＴ関連核
酸、ＥＳＴ関連核酸断片、ＥＳＴ関連核酸のポジショナ
ルセグメント、またはＥＳＴ関連核酸のポジショナルセ
グメント断片によってコードされるタンパク質またはポ
リペプチド中の抗原決定基またはエピトープに結合する
ことができるものである。
【０３３９】別の態様においては、抗体は、ＥＳＴ関連
ポリペプチド、ＥＳＴ関連ポリペプチド断片、ＥＳＴ関
連ポリペプチドのポジショナルセグメント、またはＥＳ
Ｔ関連ポリペプチドのポジショナルセグメント断片に特
異的に結合できるものである。ある態様においては、抗
体は、ＥＳＴ関連ポリペプチド、ＥＳＴ関連ポリペプチ
ド断片、ＥＳＴ関連ポリペプチドのポジショナルセグメ
ント、またはＥＳＴ関連ポリペプチドのポジショナルセ
グメント断片中の抗原決定基またはエピトープに結合で
きるものである。
【０３４０】分泌タンパク質の場合には、抗体は、本発
明の核酸によってコードされる全長タンパク質、本発明
の核酸によってコードされる成熟タンパク質（すなわち
シグナルペプチドの切断によって生成するタンパク
質）、または本発明の核酸によってコードされるシグナ
ルペプチドに結合できるものであってもよい。
【０３４１】実施例33 ヒト・ポリペプチドまたはタンパク質に対する抗体の産
生 上記のEST関連核酸、EST関連核酸の断片、EST関連核酸
のポジショナルセグメント、EST関連核酸のポジショナ
ルセグメントの断片、EST関連ポリペプチドをコードす
る核酸、EST関連ポリペプチドの断片、EST関連ポリペプ
チドのポジショナルセグメント、EST関連ポリペプチド
のポジショナルセグメントの断片は、上記のようにして
プロモーターに作動可能に連結され細胞に導入される。
【０３４２】分泌型タンパク質の場合、全タンパク質
（すなわち、成熟タンパク質およびシルナルペプチド）
をコードする核酸、成熟タンパク質（すなわち、シグナ
ルペプチドの切断により生じるタンパク質）をコードす
る核酸、またはシグナルペプチドをコードする核酸は、
上記のようにしてプロモーターに作動可能に連結され細
胞に導入される。
【０３４３】次いで、コードされたタンパク質またはポ
リペプチドを、上記のようにして実質的に精製または単
離する。例えば、Amiconフィルター装置上で数μg/mlの
レベルまで濃縮することによって、最終調製物中のタン
パク質の濃度を調整する。次いで、このタンパク質また
はポリペプチドに対するモノクローナルまたはポリクロ
ーナル抗体を、以下のように調製することができる。
【０３４４】１．ハイブリドーマ融合体によるモノクロ
ーナル抗体の産生 記載のように同定および単離される任意のタンパク質ま
たはポリペプチドのエピトープに対するモノクローナル
抗体を、KohlerおよびMilstein、Nature 256:495(1975)
の古典的方法またはそれから由来する方法に従って、マ
ウスのハイブリドーマから調製することができる。簡単
に説明すると、数週間の間、マウスに、数ミリグラムの
選択されたタンパク質または該タンパク質に由来するペ
プチドを反復的に接種する。次いで、マウスを屠殺し、
抗体を産生する脾臓細胞を単離する。脾臓細胞を、ポリ
エチレングリコールによって、マウスのミエローマ細胞
と融合し、アミノプテリンを含む選択培地（HAT培地）
上の系の増殖によって融合していない過度の細胞を破壊
する。首尾よく融合した細胞を希釈して、希釈物のアリ
コートをマイクロタイタープレートのウェルに入れ、こ
こで培養物の増殖を継続する。本来Engvall, Meth. Enz
ymol. 70:419,(1980)（この開示内容は、参照により本
明細書に組み入れる）に記載のELISAなどのイムノアッ
セイ手順及びそれから由来する方法により、ウェルの上
清液中の抗体を検出することによって、抗体産生クロー
ンを同定する。選択した陽性クローンを培養し、使用の
ためにそれらのモノクローナル抗体産物を回収すること
ができる。モノクローナル抗体産生の詳細な手順につい
ては、Davis.Lら、Basic Methods in Molecular Biology
Elsevier, New York、21-2節に記載されている。該参考
文献の開示内容は、参照により本明細書に組み入れる。
【０３４５】２．免疫化によるポリクローナル抗体の産
性 適切な動物を、修飾されていないかまたは免疫原性を増
強するために修飾することができる発現されたタンパク
質またはそれから誘導されるペプチドで免疫することに
よって、単一のタンパク質の異種エピトープに対する抗
体を含有するポリクローナル抗血清を調製することがで
きる。抗原および宿主種の両方に関連する多くの因子が
有効なポリクローナル抗体の産生に影響を及ぼす。例え
ば、小さな分子は、他の分子よりも免疫原性が小さい傾
向があり、担体およびアジュバントの使用が必要な場合
がある。また、宿主動物の応答は、接種部位または用量
に依存して変化し、抗原の量が不適切であってもまたは
過度であっても抗血清の力価が低下する。多数の皮内部
位に投与された少用量（ngのレベル）の抗原が最も信頼
できるようである。ウサギに対する有効な免疫化プロト
コルはVaitukaitisら、J. Clin. Endocrinol. Metab. 3
3:988-991(1971)に見出すことができる。該参考文献の
開示内容は、参照により本明細書に組み入れる。
【０３４６】定期的に追加免疫注入することができ、抗
血清は、その抗体価が低下し始める時点で収穫される。
抗体価は、例えば、抗体の既知の濃度に対する寒天中の
二重免疫拡散法によって半定量的に測定される。例え
ば、Ouchterlonyら、Handbookof Experimental Immunol
ogy 19章、D.Wier(編)、Blackwell(1973)を参照のこと。
該参考文献の開示内容は、参照により本明細書に組み入
れる。抗体のプラトー濃度は、通常、0.1〜0.2mg/mlの
血清（約１２μＭ）の範囲にある。例えば、Fisher, D.
Manual of Clinical Immunology、2版(RoseおよびFriedm
an編)Amer. Soc. For Microbiol., Washington, D.C.(1
980)に記載のように、競合結合曲線を調製することによ
って、抗原に対する抗血清の親和性が決定される。該参
考文献の開示内容は、参照により本明細書に組み入れ
る。
【０３４７】上記のプロトコルのいずれかに従って調製
される抗体調製物は様々な場合に有用である。特に、そ
の抗体は、後記のようなイムノアフィニティクロマトグ
ラフィー法に用いて、EST関連核酸、EST関連核酸のポジ
ショナルセグメントまたはEST関連核酸のポジショナル
セグメントの断片によってコードされるタンパク質また
はポリペプチドの大量の単離、精製もしくは富化を容易
にするための、またはEST関連ポリペプチド、EST関連ポ
リペプチドの断片、EST関連ポリペプチドのポジショナ
ルセグメントもしくはEST関連ポリペプチドのポジショ
ナルセグメントの断片の単離、精製または富化を行うこ
とができる。
【０３４８】分泌型タンパク質の場合、該抗体は、全タ
ンパク質（すなわち、成熟タンパク質およびシグナルペ
プチド）、成熟タンパク質（シグナルペプチドの切断に
よって生じるタンパク質）の単離、精製または富化に用
いることができ、これらは（これらは上記のようにして
プロモーターに作動可能に連結し細胞に導入される。
【０３４９】さらに、該抗体は、後記のようなイムノア
フィニティクロマトグラフィーに用いて、EST関連核
酸、EST関連核酸のポジショナルセグメントまたはEST関
連核酸のポジショナルセグメントの断片によってコード
されるタンパク質またはポリペプチドの単離、精製もし
くは富化のための、またはEST関連ポリペプチド、EST関
連ポリペプチドの断片、EST関連ポリペプチドのポジシ
ョナルセグメントもしくはEST関連ポリペプチドのポジ
ショナルセグメントの断片を単離、精製または富化する
ことができる。
【０３５０】該抗体はまた、EST関連核酸、EST関連核酸
のポジショナルセグメントまたはEST関連核酸のポジシ
ョナルセグメントの断片によりコードされるタンパク質
またはポリペプチドによってコードされるポリペプチド
の細胞位置を決定するのに、あるいはEST関連ポリペプ
チド、EST関連ポリペプチドの断片、EST関連ポリペプチ
ドのポジショナルセグメントまたはEST関連ポリペプチ
ドのポジショナルセグメントの細胞位置を決定するのに
用いることもできる。
【０３５１】さらに、該抗体はまた、EST関連核酸、EST
関連核酸のポジショナルセグメントまたはEST関連核酸
のポジショナルセグメントの断片によってコードされる
タンパク質またはポリペプチドに結合しているポリペプ
チド、あるいはEST関連ポリペプチド、EST関連ポリペプ
チドの断片、EST関連ポリペプチドのポジショナルセグ
メントもしくはEST関連ポリペプチドのポジショナルセ
グメントの断片に結合しているポリペプチドの細胞での
位置を決定するのに用いることもできる。
【０３５２】該抗体はまた、生物学的サンプル中での抗
原を含む基質の濃度を測定する定量的イムノアッセイに
おいても用い得る。それらはまた、生物学的サンプル中
の抗原の存在を半定量的または定量的に同定するのに、
または生物学的サンプル中に存在する組織の種類を同定
するのにも用い得る。該抗体は、タンパク質を発現する
細胞を死滅させるかまたは身体中のタンパク質のレベル
を低下させるための治療用組成物に使用してもよい。
【０３５３】Ｖ． 5’ESTおよびコンセンサスコンジュ
ゲート5'ESTまたはそれらから得られる配列もしくはそ
れらのタンパク質の試薬としての使用 上記のEST関連核酸、EST関連核酸のポジショナルセグメ
ント、またはEST関連核酸のポジショナルセグメントの
断片は、単離手順、診断アッセイ、および法医学手順に
おける試薬として使用することができる。例えば、EST
関連核酸、EST関連核酸のポジショナルセグメント、ま
たはEST関連核酸のポジショナルセグメントの断片を検
出可能に標識し、該配列にハイブリダイズ可能な他の配
列を単離するためのプローブとして使用してもよい。更
に、EST関連核酸、EST関連核酸のポジショナルセグメン
ト、またはEST関連核酸のポジショナルセグメントの断
片を使用して、単離、診断、および法医学手順に使用さ
れるPCRプライマーを設計することができる。
【０３５４】１．EST関連核酸、EST関連核酸のポジショ
ナルセグメント、またはEST関連核酸のポジショナルセ
グメントの断片の、単離、診断および法医学的手順にお
ける使用
【０３５５】実施例34 PCRプライマーの調製およびDNAの増幅 EST関連核酸、EST関連核酸のポジショナルセグメント、
またはEST関連核酸のポジショナルセグメントの断片を
使用して、そのような配列にハイブリダイズし得る核酸
をクローニングするための単離手順、診断技術および法
医学技術を含む様々な適用のためのPCRプライマーを調
製することができる。幾つかの実施形態において、PCR
プライマーは少なくとも10、15、18、20、23、25、28、
30、40または50塩基の長さである。幾つかの実施形態で
は、PCRプライマーは30塩基を超える長さであってもよ
い。プライマー対は、融解温度がほぼ同じであるよう
に、ほぼ同じG/Ｃ比を有する。様々なPCR技術が当業者
によく知られている。PCR技術の概要については、Molec
ular Cloning to Genetic Engineering, White,B.A.編、
Mothods in Molecular Biology 67:Humana Press, Toto
wa 1997を参照のこと。該参考文献の開示内容は、参照
により本明細書に組み入れる。これらのPCR手順のそれ
ぞれにおいて、増幅しようとする核酸配列のそれぞれの
側に対するPCRプライマーを、dNTPおよびTaqポリメラー
ゼ、Pfuポリメラーゼ、またはVentポリメラーゼなどの
耐熱性ポリメラーゼと共に適切に調製された核酸サンプ
ルに添加する。サンプル中の核酸を変性し、PCRプライ
マーを、サンプル中の相補的な核酸配列に特異的にハイ
ブリダイズさせる。ハイブリダイズしたプライマーが伸
張される。その後、変性、ハイブリダイゼーションおよ
び伸張の別のサイクルが開始する。サイクルを複数回反
復して、プライマー部位間の核酸配列を含有する増幅さ
れた断片を生成する。
【０３５６】実施例35 プローブとしてのEST関連核酸、EST関連核酸のポジショ
ナルセグメント、または EST関連核酸のポジショナルセ
グメントの断片の使用 EST関連核酸、EST関連核酸のポジショナルセグメント、
またはEST関連核酸のポジショナルセグメントの断片か
ら誘導されるプローブを、放射性同位体および非放射性
標識物を含む、当業者によく知られた検出可能な標識物
で標識し、検出可能なプローブを提供することもでき
る。検出可能なプローブは、一本鎖または二本鎖であっ
てもよく、in vitro転写、ニックトランスレーション、
またはキナーゼ反応を含む当業者に公知の技術を使用し
て作製してもよい。標識されたプローブにハイブリダイ
ズすることができる配列を含有する核酸サンプルを、標
識したプローブに接触させる。サンプル中の核酸が二本
鎖である場合、プローブに接触させる前に該核酸を変性
してもよい。適用によっては、核酸サンプルを、ニトロ
セルロースまたはナイロン膜などの表面上に固定化して
もよい。核酸サンプルは、ゲノムDNA、cDNAライブラリ
ー、RNA、または組織サンプルを含むさまざまな供給源
から得られる核酸を含むことができる。
【０３５７】検出可能なプローブにハイブリダイズする
ことができる核酸の存在を検出するために使用される手
順には、サザンブロッティング、ノーザンブロッティン
グ、ドットブロッティング、コロニーハイブリダイゼー
ション、およびプラークハイブリダイゼーションなどの
周知の技術が含まれる。適用によっては、標識されたプ
ローブにハイブリダイズすることができる核酸を、発現
ベクター、シークエンシングベクター、またはin vitro
転写ベクターなどのベクターにクローニングして、サン
プル中のハイブリダイズ核酸の特徴付けおよび発現を容
易にすることができる。例えば、そのような技術を使用
して、上記の実施例18に記載の検出可能なプローブにハ
イブリダイズすることができるゲノムライブラリーまた
はcDNAライブラリー中の配列を単離し、クローニングし
てもよい。
【０３５８】上記の実施例34に記載のように作製された
PCRプライマーは、以下の実施例36〜40に記載のDNAフィ
ンガープリント技術などの法医学分析に使用することも
できる。そのような分析は、EST関連核酸、EST関連核酸
のポジショナルセグメント、またはEST関連核酸のポジ
ショナルセグメントの断片の配列に基づく検出可能なプ
ローブまたはプライマーを利用することができる。
【０３５９】実施例36 DNAの配列決定による法医学的マッチング １つの例示的方法では、従来の方法によって例えば、
毛、精液、血液または皮膚細胞の法医学的標本からDNA
サンプルを単離する。次いで、実施例34に従って、幾つか
の該EST関連核酸、EST関連核酸のポジショナルセグメン
ト、またはEST関連核酸のポジショナルセグメントの断
片に基づくPCRプライマーのパネルを利用し、法医学的
標本から長さ約100〜200塩基のDNAを増幅する。対応す
る配列は試験被験体から得られる。次いで、標準的な技
術を使用して、これらの同定DNAのそれぞれについて配
列を決定し、サンプルのデータベースを比較することに
よって、被験体由来の配列とサンプル由来の配列との間
に差異があればこれを決定する。被験体のDNA配列とサ
ンプル由来のDNA配列との間に統計学的に有意な差異が
認められれば、その結果として同一性が欠如しているこ
とが明らかにされる。このような同一性の欠如は、例え
ば、ただ１つの配列によって証明することができる。一
方、同一性を有することは、多数の配列でそれらが全て
一致することによって実証されるべきである。好ましく
は、長さが100塩基の統計学的に同一な配列を最小でも5
0個使用して、被疑体とサンプルとの間の同一性を証明
する。
【０３６０】実施例37 DNAの配列決定による陽性同定 先の実施例に概略されている技術をより大きな規模で使
用して、任意の個体の独特なフィンガープリント型同定
を提供することができる。この方法では、多くのEST関
連核酸、EST関連核酸のポジショナルセグメント、また
はEST関連核酸のポジショナルセグメントの断片からプ
ライマーを調製する。好ましくは、20〜50個の異なるプ
ライマーを使用する。これらのプライマーを使用して、
実施例34に従い、問題の個体から相当する数のPCRによ
って作製されたDNAセグメントを得る。実施例36に記載
の方法を使用して、これらのDNAセグメントのそれぞれ
について塩基配列を決定する。本手順を介して作製され
た配列のデータベースは、配列が得られた個体を特異に
同定する。次いで、後にプライマーの同じパネルを使用
して、組織または他の生物学的標本と個体を絶対的に相
関付けることができる。
【０３６１】実施例38 サザンブロットによる法医学的同定 実施例37の手順を反復して、個体および標本から少なく
とも１０個の増幅された配列を得る。好ましくは、パネ
ルは少なくとも５０個の増幅された配列を含有する。よ
り好ましくは、パネルは１００個の増幅された配列を含
有する。実施例によっては、パネルは２００個の増幅さ
れた配列を含有する。次いで、このPCRによって作製さ
れたDNAを、好ましくは４塩基特異的制限酵素の１つま
たは組み合わせで消化する。そのような酵素は市販され
ており、当業者に既知である。消化後、得られた遺伝子
断片を、アガロースゲル上の複数の二連ウェルでサイズ
により分離し、当業者に周知のサザンブロッティング技
術を使用して、ニトロセルロースに移す。サザンブロッ
ティングの概要については、Davisら(Basic Methods in
Molecular Biology, 1986, Elsevier Press62〜65頁）
を参照のこと。該参考文献の開示内容は、参照により本
明細書に組み入れる。
【０３６２】EST関連核酸、EST関連核酸のポジショナル
セグメント、またはEST関連核酸のポジショナルセグメ
ントの断片の配列に基づくプローブのパネルを、ニック
トランスレーション、末端標識化などの当該分野におい
て公知の方法を用いて、放射性または発色性の標識を行
い、当該分野において公知の方法（Davisら、前掲）を
用いて、サザンブロットにハイブリダイズさせる。好ま
しくは、このプローブは、長さが少なくとも10、12、1
5、18、20、25、28、30、35、40、50、75、100、150、2
00、300、400または500ヌクレオチドである。好ましく
は、このプローブは長さが少なくとも10、12、15、18、
20、25、28、30、35、40、50、75、100、150、200、30
0、400または500ヌクレオチドである。幾つかの実施形
態において、このプローブは長さが40ヌクレオチド以下
のオリゴヌクレオチドである。
【０３６３】好ましくは、少なくとも５〜10個のこれら
の標識されたプローブを使用し、より好ましくは少なく
とも約20または30個を使用して特異なパターンを提供す
る。EST関連核酸、EST関連核酸のポジショナルセグメン
ト、またはEST関連核酸のポジショナルセグメントの断
片の大きなサンプルのハイブリダイゼーションから出現
する得られたバンドは、ユニークな同定物となる。制限
酵素切断は全ての個体に対して異なるため、サザンブロ
ット上のバンドのパターンも特異である。プローブの数
が増加すると、同定において統計学的により高いレベル
の信頼度が得られる。何故なら、同定のために使用され
るバンドの組の数が増加するからである。
【０３６４】実施例39 ドットブロット同定法 本明細書において開示されるEST関連核酸、EST関連核酸
のポジショナルセグメント、またはEST関連核酸のポジ
ショナルセグメントの断片を使用して個体を同定するた
めのもう１つの技術は、ドットハイブリダイゼーション
技術を利用する。同定しようとする被験体の核からゲノ
ムDNAを単離する。EST関連核酸、EST関連核酸のポジシ
ョナルセグメント、またはEST関連核酸のポジショナル
セグメントの断片に由来する少なくとも10個、好ましく
は50個のDNA配列に相当するプローブを調製する。プロ
ーブを使用して、当業者に既知の条件を介してゲノムDN
Aにハイブリダイズする。ポリヌクレオチドキナーゼ（P
harmacia）を使用して、オリゴヌクレオチドをＰ32で末
端標識する。減圧ドットブロットマニホールド（BioRa
d, Richmond California）を使用して、ゲノムDNAをニ
トロセルロースなどにスポットすることによってドット
ブロットを作製する。当該分野において公知の技術（Da
visら、前掲）を用いて、ゲノムの配列を含有するニト
ロセルロースフィルターをベーキングまたはUVによりフ
ィルターに結合させ、プレハイブリダイズし、標識され
たプローブでハイブリダイズする。32Ｐ標識DNA断片を
順に成功率の高いストリンジェント条件でハイブリダイ
ズし、30bpの配列とDNAとの間の最低限の差異を検出す
る。塩化テトラメチルアンモニウムは、少数のヌクレオ
チドのミスマッチを含有するクローンを同定するのに有
用である（Woodら、Proc.Natl. Acad. Sci. USA 82(6):1
585-1588(1985)）。該参考文献の開示内容は、参照によ
り本明細書に組み入れる。ドットの特異なパターンによ
り、１つの個体ともう１つの個体とが区別される。
【０３６５】以下のもう１つのフィンガープリント技術
では、EST関連核酸、EST関連核酸のポジショナルセグメ
ント、またはEST関連核酸のポジショナルセグメントを
プローブとして使用することができる。幾つかの実施形
態では、そのプローブは、長さがが40ヌクレオチド以下
のオリゴヌクレオチドである。
【０３６６】好ましくは、異なるEST関連核酸、EST関連
核酸のポジショナルセグメント、またはEST関連核酸の
ポジショナルセグメントの断片に由来する配列を有する
複数のプローブをこのもう１つのフィンガープリント技
術において使用する。以下の実施例40は、プローブがES
T関連核酸、EST関連核酸のポジショナルセグメント、ま
たはEST関連核酸のポジショナルセグメントの断片から
誘導される代表的なもう１つのフィンガープリント手順
を提供する。
【０３６７】実施例40 もう１つの「フィンガープリント」同定法 Genset, Paris, Franceなどの市販のオリゴヌクレオチ
ドサービスを用いて、多数、例えば、50、100または200
個のEST関連核酸、EST関連核酸のポジショナルセグメン
ト、またはEST関連核酸のポジショナルセグメントの断
片からオリゴヌクレオチドを調製する。好ましくは、そ
のオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも10、15、1
8、20、23、25、28または30ヌクレオチドである。しか
し、幾つかの実施形態では、該オリゴヌクレオチドは長
さが20ヌクレオチドよりも長いものとし得る。当業者に
周知の技術を用い、DNAを対象として試験被験体由来の
細胞サンプルを処理する。核酸をEcoRIおよびXbaIなど
の制限酵素で消化する。消化後、サンプルを電気泳動用
ウェルにアプライする。ポリアクリルアミド電気泳動に
順応するために当該分野において既知の手順に変更を加
えてもよいが、本実施例では、５μｇのDNAを含むサン
プルをウェルにロードし、0.8%のアガロースゲルで分離
する。標準的なサザンブロッティング技術を使用して、
ゲルをニトロセルロースに移す。
【０３６８】10ngのそれぞれのオリゴヌクレオチドをプ
ールして、32Ｐで末端標識する。ニトロセルロースをブ
ロッキング溶液でプレハイブリダイズし、標識したプロ
ーブでハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションお
よび洗浄後、ニトロセルロースフィルターをX-Omat AR
Ｘ線フィルムに暴露する。得られるハイブリダイゼー
ションのパターンはそれぞれの個体について特異であ
る。
【０３６９】本実施例では、更なる正確性または明確性
のために使用されるプローブ配列の数を変更することが
できることが更に考慮される。
【０３７０】法医学におけるそれらの適用および同定に
加えて、EST関連核酸、EST関連核酸のポジショナルセグ
メント、またはEST関連核酸のポジショナルセグメント
の断片を、染色体の位置に対してマッピングすることが
できる。以下の実施例41では、EST関連核酸、EST関連核
酸のポジショナルセグメント、またはEST関連核酸のポ
ジショナルセグメントの断片を使用するヒト染色体領域
の放射性ハイブリッド（radiation hybrid）（RH）マッ
ピングについて説明する。以下の実施例42では、ヒト染
色体上のEST関連核酸、EST関連核酸のポジショナルセグ
メント、またはEST関連核酸のポジショナルセグメント
の断片の位置のマッピングの代表的手順について説明す
る。以下の実施例43では、蛍光in situハイブリダイゼ
ーション（FISH）による中期染色体上のEST関連核酸、E
ST関連核酸のポジショナルセグメント、またはEST関連
核酸のポジショナルセグメントの断片のマッピングにつ
いて説明する。
【０３７１】２． 染色体マッピングにおけるEST関連
核酸、EST関連核酸のポジショナルセグメント、またはE
ST関連核酸のポジショナルセグメントの断片の使用
【０３７２】実施例41 ヒトゲノムに対するEST関連核酸、EST関連核酸のポジシ
ョナルセグメント、またはEST関連核酸のポジショナル
セグメントの断片の放射性ハイブリッドマッピング 放射性ハイブリッド（RH）マッピングは、体細胞の遺伝
学的アプローチであり、ヒトゲノムの高解像マッピング
に使用することができる。本アプローチでは、１つ以上
のヒト染色体を含有する細胞株に致死量の放射線を照射
し、それぞれの染色体を、放射線の用量に応じたサイズ
を有する断片に切断する。これらの断片を、培養したげ
っ歯類動物細胞で回収し、ヒトゲノムの異なる部分を含
有するサブクローンを得る。本技術は、Benhamら(Genom
ics 4:509-517, 1989）およびCoxら(Science 250:245-2
50, 1990）により記載されており、これらの全ての内容
は、本明細書において参考として組み込まれる。サブク
ローンは無作為的かつ独立した性質を有するため、任意
のヒトゲノムマーカーの効率的なマッピングが可能であ
る。80〜100種の細胞系のパネルから単離されたヒトDNA
は、EST関連核酸、EST関連核酸のポジショナルセグメン
ト、またはEST関連核酸のポジショナルセグメントの断
片を配列するためのマッピング試薬を提供する。本アプ
ローチでは、マーカー間の切断の頻度を使用して、距離
を測定し、従来のESTを用いて行われているのと同程度
の細密な解像度のマップを構築することが可能である
（Schulerら、Science 274:540-546, 1996、本明細書に
おいて組み込まれる）。
【０３７３】RHマッピングを使用して、成長ホルモン
（GH）およびチミジンキナーゼ（TK）の遺伝子が横切る
ヒト染色体17q22〜q25.3(Fosterら、Genomics 33:185-19
2, 1996)、ゴーリン症候群遺伝子を囲む領域(Obermayr
ら、Eur. J. Hum. Genet. 4:242-245, 1996)、第12染色
体の全短腕に渡る60個の遺伝子座(Raeymaekersら、Genom
ics 29:170-178, 1995)、２型神経繊維腫症の遺伝子座
を含有するヒト第22染色体ならびに第５染色体の長腕上
の13個の遺伝子座(Warringtonら、Genomics 11:701-708,
1991)の高解像全ゲノム放射性ハイブリッドマップが作
製されている。
【０３７４】実施例42 PCR技術を使用するヒト染色体に対するEST関連核酸、ES
T関連核酸のポジショナルセグメント、またはEST関連核
酸のポジショナルセグメントの断片のマッピング PCRに基づく方法論を使用して、EST関連核酸、EST関連
核酸のポジショナルセグメント、またはEST関連核酸の
ポジショナルセグメントの断片をヒト染色体に対して割
り当てることができる。そのようなアプローチでは、ES
T関連核酸、EST関連核酸のポジショナルセグメント、ま
たはEST関連核酸のポジショナルセグメントの断片から
オリゴヌクレオチドプライマー対を設計して、イントロ
ンを介して増幅する可能性を最小限にする。好ましく
は、オリゴヌクレオチドプライマーの長さは18〜23bpで
あり、PCR増幅のために設計される。既知の配列からPCR
プライマーを作成するのは当業者に周知である。PCR技
術の概要については、Erlich,PCR Technology, Princip
les and Applications for DNA Amplification、Freeman
and Co., New York, 1992,W.H.Freeman and Co., New
Yorkを参照のこと。該参考文献の開示内容は本明細書に
おいて組み込まれる。
【０３７５】ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）においてプ
ライマーを使用し、全ヒトゲノムDNAからテンプレート
を増幅する。PCR条件は以下の通りである：60ngのゲノ
ムDNAをPCRのテンプレートとして使用し、80ngのそれぞ
れのオリゴヌクレオチドプライマー、0.6単位のTaqポリ
メラーゼ、および１μCuの32Ｐ標識デオキシシチジン三
リン酸を伴う。PCRは、マイクロプレートサーモサイク
ラー（Techne)において、以下の条件で行う：94℃、1.4
分間；55℃、２分間；および72℃、２分間の30サイク
ル；更に72℃で10分間の最終伸長。増幅産物を６％ポリ
アクリルアミドシークエンシング用ゲル上で分析し、オ
ートラジオグラフィーで可視化した。得られるPCR産物
の長さが、プライマーが誘導される5'ESTにおけるプラ
イマー配列の末端間の距離と同一であれば、ヒト−げっ
歯類動物体細胞ハイブリッドの２つのパネル、BIOS PCR
able DNA(BIOS Corporation)およびNIGMSヒト−げっ歯
類動物体細胞ハイブリッドマッピングパネルナンバー１
（NIGMS, Gamden, NJ）由来のDNAテンプレートでPCR反
応を繰り返す。
【０３７６】PCRを使用して、ヒト染色体の規定された
組を含有する一連の体細胞雑種細胞株を、所定の5'EST
の存在を対象にスクリーニングする。体細胞ハイブリッ
ドからDNAを単離し、EST関連核酸、EST関連核酸のポジ
ショナルセグメント、またはEST関連核酸のポジショナ
ルセグメントの断片に由来するプライマー対を使用する
PCR反応のための開始テンプレートとして使用する。EST
関連核酸、EST関連核酸のポジショナルセグメント、ま
たはEST関連核酸のポジショナルセグメントの断片に対
応するヒト遺伝子を含有する染色体を有するそれらの体
細胞ハイブリッドのみが、増幅された断片を生じる。体
細胞ハイブリッドDNAテンプレート由来のPCR産物の分離
パターンを分析することによって、該5'ESTを染色体に
対して割り当てる。増幅された断片を生じる全ての細胞
ハイブリッドに存在する単一のヒトゲノムは、そのEST
関連核酸、EST関連核酸のポジショナルセグメント、ま
たはEST関連核酸のポジショナルセグメントの断片を含
有する染色体である。体細胞遺伝子のマッピング実験か
ら生じる技術および分析の概要については、Ledbetter
ら、Genomics 6:475-481,(1990)を参照されたい（該参考
文献の開示内容は本明細書において組み込まれる。）。
【０３７７】あるいはまた、EST関連核酸、EST関連核酸
のポジショナルセグメント、またはEST関連核酸のポジ
ショナルセグメントの断片は、以下の実施例43に記載の
FISHを用いて個々の染色体に対してマッピングしてもよ
い。
【０３７８】実施例43 蛍光in situハイブリダイゼーションを用いる染色体に
対する5'EST関連核酸、5'EST関連核酸のポジショナルセ
グメント、または5'EST関連核酸のポジショナルセグメ
ントの断片のマッピング 蛍光in situハイブリダイゼーションにより、所定の染
色体の特定の位置に対してEST関連核酸、EST関連核酸の
ポジショナルセグメント、またはEST関連核酸のポジシ
ョナルセグメントの断片をマッピングすることができ
る。蛍光in situハイブリダイゼーション技術のために
使用すべき染色体は、細胞培養物、組織、または全血を
含む様々な供給源から得ることができる。
【０３７９】好ましい実施態様において、EST関連核
酸、EST関連核酸のポジショナルセグメント、またはEST
関連核酸のポジショナルセグメントの断片の染色体位置
は、Cherifら(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:663
9-6643, 1990)（この開示内容は本明細書において組み
込まれる）に記載のFISHにより得られる。中期の染色体
をフィトヘマグルチニン（PHA）−刺激血液細胞供与体
から調製する。健常雄由来のPHA-刺激リンパ球を、RPMI
-1640培地で72時間培養する。同調のため、メトトレキ
セート（10μＭ）を17時間添加し、続いて、5-ブロモデ
オキシウリジン（5-BrdU、0.1mM）を６時間添加する。細
胞を回収する前に、コルセミド（１μg/ml）を最後の15
分間添加する。細胞を回収し、RPMIで洗浄し、KCl(75m
M）の低張溶液と共に37℃で15分間インキュベートし、
メタノール：酢酸（３：１）を３回取り替えて固定す
る。細胞懸濁物をガラススライド上に滴下し、空気乾燥
する。EST関連核酸、EST関連核酸のポジショナルセグメ
ント、またはEST関連核酸のポジショナルセグメントの
断片を、製造者（Bethesda Research Laboratories, Be
thesda, MD)の説明書に従い、ビオチン-16dUTPでニック
トランスレーションにより標識し、Sephadex G-50カラ
ム(Pharmacia, Upsala, Sweden)を用いて精製し、沈殿
させる。ハイブリダイゼーションの直前に、DNAのペレ
ットをハイブリダイゼーション緩衝液（50%ホルムアミ
ド、2×SSC、10%硫酸デキストラン、1mg/ml超音波処理
サケ精子DNA、ｐＨ７）に溶解し、プローブを70℃で５
〜10分間変性させる。
【０３８０】−20℃に保たれたスライドガラスをRNase
A(100μg/ml)により37℃で１時間処置し、2×SSCで３回
濯いで、エタノール系列で脱水する。染色体調製物を70
％ホルムアミド、2×SSC中、70℃で２分間変性させ、次
いで４℃で脱水する。スライドをプロテイナーゼＫ（20
mM Tris-HCl中10μg/100ml、2mMCaCl2）により、37℃で
８分間処置し、脱水する。プローブを含有するハイブリ
ダイゼーション混合物をスライド上に配置し、カバーガ
ラスで覆い、ゴム糊で封をして湿式チャンバにおいて37
℃で１晩インキュベートする。ハイブリダイゼーション
およびハイブリダイゼーション後の洗浄後、ビオチン化
されたプローブをアビジン-FITCで検出し、ビオチン化
ヤギ抗アビジンおよびアビジン-FITCの更なる層で増幅
する。染色体位置決定のために、前記のように蛍光Ｒバ
ンドを得る（Cherifら、前掲）。LEICA蛍光顕微鏡（DMR
XA）下でスライドを観察する。染色体をヨウ化プロピジ
ウム（propidium iodide）で対比染色し、蛍光Ｒバンド
染色体の両染色分体（赤色）上に２つの対称性の黄緑色
のスポットとしてプローブの蛍光シグナルが出現する。
従って、特定のEST関連核酸、EST関連核酸のポジショナ
ルセグメント、またはEST関連核酸のポジショナルセグ
メントの断片は、所定の染色体上の特定の細胞遺伝子の
Ｒバンドに局在し得る。
【０３８１】上記の実施例41〜43に記載の技術を使用し
て、EST関連核酸、EST関連核酸のポジショナルセグメン
ト、またはEST関連核酸のポジショナルセグメントの断
片を特定の染色体に対して割り当てたら、それらを利用
して、それらが局在する染色体の高解像マップを構築す
るかまたはサンプル中の染色体を同定することができ
る。
【０３８２】実施例44 染色体マップを構築または拡大するためのEST関連核
酸、EST関連核酸のポジショナルセグメント、またはEST
関連核酸のポジショナルセグメントの断片の使用 上記のように、染色体マッピングは特定の染色体に所定
の特異な配列を割り当てることが必要である。一旦、特
異な配列が所定の染色体にマッピングされると、該特異
な配列は、同じ染色体上に位置する他の特異な配列に対
する相対的な順番が決定する。染色体マッピングに対す
る１つのアプローチは、EST関連核酸、EST関連核酸のポ
ジショナルセグメント、またはEST関連核酸のポジショ
ナルセグメントの断片が得られる生物の染色体由来の数
千もの長い挿入物を有する一連の酵母人工染色体（YA
C）を利用する。本アプローチについては、Ramaiah Nag
arajaら、Genome Research 7:210-222, 1997, 3月に記
載されている。該参考文献の開示内容は本明細書におい
て組み込まれる。簡単に説明すると、本アプローチで
は、それぞれの染色体を、重複する片に切断して、YAC
ベクターに挿入する。PCRまたは他の方法を用いてYAC挿
入物をスクリーニングし、それらが位置を決定しようと
するEST関連核酸、EST関連核酸のポジショナルセグメン
ト、またはEST関連核酸のポジショナルセグメントの断
片を含むかどうかを決定する。5'ESTを含む挿入物が見
つかったら、該挿入物をPCRまたは他の方法を用いて分
析し、該挿入物が、染色体上に、またはEST関連核酸、E
ST関連核酸のポジショナルセグメント、またはEST関連
核酸のポジショナルセグメントの断片を誘導した領域内
に存在することが知られている他の配列を含有するかど
うかを決定する。このプロセスはYACライブラリー内の
それぞれの挿入物について反復して、もう１つの既知の
染色体マーカーおよび他の既知の染色体マーカーに対す
るEST関連核酸、EST関連核酸のポジショナルセグメン
ト、またはEST関連核酸のポジショナルセグメントの断
片それぞれの相対的な位置を決定することができる。本
方法では、生物のそれぞれの染色体に沿った多くの特異
なマーカーの分布についての高解像マップを得ることが
できる。
【０３８３】以下の実施例45に記載のように、EST関連
核酸、EST関連核酸のポジショナルセグメント、またはE
ST関連核酸のポジショナルセグメントの断片を使用し
て、遺伝性疾患または薬物応答などの特定の表現型に関
連する遺伝子を同定することもできる。
【０３８４】３． 遺伝子同定におけるEST関連核酸、E
ST関連核酸のポジショナルセグメント、またはEST関連
核酸のポジショナルセグメントの断片の使用
【０３８５】実施例45 遺伝性疾患または薬物応答に関連する遺伝子の同定 本実施例は、EST関連核酸、EST関連核酸のポジショナル
セグメント、またはEST関連核酸のポジショナルセグメ
ントの断片と特定の表現型特性との関連性について有用
なアプローチを例示する。本実施例では、特定のEST関
連核酸、EST関連核酸のポジショナルセグメント、また
はEST関連核酸のポジショナルセグメントの断片を試験
プローブとして使用し、EST関連核酸、EST関連核酸のポ
ジショナルセグメント、またはEST関連核酸のポジショ
ナルセグメントの断片と特定の表現型特性との間の関連
性について調べる。
【０３８６】実施例41および42に記載の技術または他の
当該分野において公知の技術を使用して、EST関連核
酸、EST関連核酸のポジショナルセグメント、またはEST
関連核酸のポジショナルセグメントの断片をヒト染色体
上の特定の位置に対してマッピングする。A search of
Mendelian Inheritance in Man(V. McKusick in Mendel
ian Inheritance in Man)(Johns Hopkins University W
elch Medical Libraryを介してオンラインで入手可能）
は、EST関連核酸、EST関連核酸のポジショナルセグメン
ト、またはEST関連核酸のポジショナルセグメントの断
片を含有するヒト染色体の領域が、いくつかの公知の遺
伝子および遺伝子が同定されていないいくつかの疾患ま
たは表現型を含有する、非常に遺伝子に富む領域である
ことを示している。従って、このEST関連核酸、EST関連
核酸のポジショナルセグメント、またはEST関連核酸の
ポジショナルセグメントの断片に対応する遺伝子は、こ
れらのそれぞれの遺伝子疾患についての直接的候補とな
る。
【０３８７】これらの疾患または表現型を有する患者由
来の細胞を単離し、培養で増殖させる。EST関連核酸、E
ST関連核酸のポジショナルセグメント、またはEST関連
核酸のポジショナルセグメントの断片に由来するPCRプ
ライマーを使用して、患者由来のゲノムDNA、mRNAまた
はｃDNAをスクリーニングする。患者のEST関連核酸、ES
T関連核酸のポジショナルセグメント、またはEST関連核
酸のポジショナルセグメントの断片が増幅しない場合、
該配列は更なる分析によって特定の疾患と関連性がある
と見なすことができる。あるいは、PCR分析は、サンプ
ルが健常な個体から誘導される場合よりも、サンプルが
疾患に関連する表現型を有する個体から誘導される場合
に様々な長さの断片を生じ、このことは、このEST関連
核酸、EST関連核酸のポジショナルセグメント、またはE
ST関連核酸のポジショナルセグメントの断片を含有する
遺伝子が遺伝子疾患の原因である可能性を示す。
【０３８８】VI． ベクターの構築するためのEST関連
核酸、EST関連核酸のポジショナルセグメント、またはE
ST関連核酸のポジショナルセグメントの断片の使用
【０３８９】本発明のEST関連核酸、EST関連核酸のポジ
ショナルセグメント、またはEST関連核酸のポジショナ
ルセグメントの断片を使用して、ベクター内の遺伝子に
よりコードされるタンパク質の分泌を指令し得る分泌ベ
クターを構築することもできる。そのような分泌ベクタ
ーは、所望のタンパク質を精製または富化しなければな
らないバックグランドのタンパク質の数を減少すること
によって、ベクターに挿入された遺伝子によりコードさ
れるタンパク質の精製または富化を容易にすることがで
きる。例示的分泌ベクターについては、以下の実施例46
に記載する。
【０３９０】１． 分泌ベクターの構築 実施例46 分泌ベクターの構築 本発明の分泌ベクターは、目的の宿主細胞、組織、また
は生物において遺伝子の発現を指令することができるプ
ロモーターを含む。そのようなプロモーターとしては、
ラウス肉腫ウイルスプロモーター、SV40プロモーター、
ヒトサイトメガロウイルスプロモーター、および当業者
によく知られている他のプロモーターが挙げられる。
【０３９１】EST関連核酸、EST関連核酸のポジショナル
セグメント、またはEST関連核酸のポジショナルセグメ
ントの断片の１つに由来するシグナル配列は、プロモー
ターから転写されるｍＲＮＡがシグナルペプチドの翻訳
を指令するように、プロモーターに作動可能に連結して
いる。好ましくは、このシグナル配列は、配列番号24〜
4100の核酸の１つに由来するものである。宿主細胞、組
織、または生物は、EST関連核酸、EST関連核酸のポジシ
ョナルセグメント、またはEST関連核酸のポジショナル
セグメントの断片のシグナル配列によりコードされるシ
グナルペプチドを認識する任意の細胞、組織、または生
物であり得る。適切な宿主としては、哺乳動物の細胞、
組織もしくは生物、トリの細胞、組織もしくは生物、昆
虫の細胞、組織もしくは生物、または酵母が挙げられ
る。
【０３９２】更に、分泌ベクターは、分泌されるべきタ
ンパク質をコードする遺伝子を挿入するためのクローニ
ング部位を含む。クローニング部位は、シグナルペプチ
ドが、挿入された遺伝子によりコードされるタンパク質
に融合している融合タンパク質が、プロモーターより転
写されるmRNAから発現されるように、シグナル配列と読
みが合った挿入遺伝子のクローニングを容易にする。シ
グナルペプチドは融合タンパク質の細胞外分泌を指令す
る。
【０３９３】分泌ベクターはDNAまたはRNAであってもよ
く、そして、宿主の染色体に組み込まれていてもよい
し、宿主の染色体外レプリコンとして安定に維持されて
いてもよいし、人工染色体であってもよいし、または宿
主内に一過的に存在していてもよい。好ましくは、その
分泌ベクターは、各宿主細胞に多コピーで維持される。
本明細書で用いられる「多コピー（multiple copie
s）」とは、１細胞当たり少なくとも２、５、10、20、2
5、50または50より多いコピーである。幾つかの実施形
態では、この多コピーは染色体外に維持される。別の実
施形態では、この多コピーは染色体配列の増幅によって
生じる。
【０３９４】分泌ベクターの用途に適切な多くの核酸バ
ックボーンが当業者に公知であり、レトロウイルスベク
ター、SV40ベクター、ウシパピローマウイルスベクタ
ー、酵母組込み型プラスミド、酵母エピソームプラスミ
ド、酵母人工染色体、ヒト人工染色体、Ｐエレメントベ
クター、バキュロウイルスベクター、または宿主に一過
的に導入され得る細菌プラスミドが挙げられる。
【０３９５】分泌ベクターはまた、ポリＡが分泌ベクタ
ーに挿入される遺伝子の下流に位置するようにポリＡシ
グナルを含み得る。
【０３９６】分泌が所望されるタンパク質をコードする
遺伝子を分泌ベクターに挿入した後、この分泌ベクター
は、リン酸カルシウム沈殿、DEAE-デキストラン、エレ
クトロポレーション、リポソーム媒介性トランスエフェ
クション、ウイルス粒子を用いて、またはむき出しのDN
Aとして、宿主の細胞、組織または生物に導入される。
次いで、硫安沈殿、免疫沈降、免疫クロマトグラフィ
ー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィー、およびHPLCなどの慣用の技術を使用し
て、挿入された遺伝子によりコードされるタンパク質を
上清より精製するかまたは濃縮する。あるいは、分泌さ
れたタンパク質は、更なる濃縮を行わずとも意図する目
的のために使用することができるように、十分に濃縮さ
れたまたは純粋な状態で上清中または宿主の増殖培地中
に存在してもよい。
【０３９７】シグナル配列はまた、遺伝子治療のために
設計されたベクターに挿入してもよい。そのようなベク
ターでは、シグナル配列は、プロモーターから転写され
るmRNAがシグナルペプチドをコードするように、プロモ
ーターに作動可能に連結される。クローニング部位は、
シグナルペプチドの下流に配置して、分泌が所望される
タンパク質をコードする遺伝子が容易にベクターに挿入
され、シグナルペプチドに融合されるようにする。ベク
ターは適切な宿主細胞に導入される。プロモーターから
発現されるタンパク質は細胞外に分泌され、それによっ
て、治療効果を呈する。
【０３９８】実施例47 融合ベクター EST関連核酸、EST関連核酸のポジショナルセグメント、
またはEST関連核酸のポジショナルセグメントの断片
は、キメラポリペプチドの発現のための融合ベクターを
構築するのに用い得る。このキメラポリペプチドは、第
1のポリペプチド部分と第2のポリペプチド部分とを含
む。本発明の融合ベクターにおいて、第1のポリペプチ
ド部分および第2のポリペプチド部分をコードする核酸
は、キメラポリペプチドをコードする核酸を生じるよう
にイン・フレームで互いに結合させる。キメラポリをコ
ードする核酸は、該キメラポリペプチドをコードするmR
NAの発現を指令するプロモーターに作動可能に連結す
る。このプロモーターは、本明細書に記載の発現ベクタ
ーのいずれのものにあるものであってもよく、例えば実
施例20および46において記載されているものである。
【０３９９】好ましくは、融合ベクターは、多コピーで
各宿主細胞内で維持される。幾つかの実施形態では、そ
の多コピーは染色体外に維持される。別の実施形態で
は、その多コピーは染色体配列の複製によって生じるも
のである。
【０４００】第1のポリペプチド部分は、EST関連核酸、
EST関連核酸のポジショナルセグメント、またはEST関連
核酸のポジショナルセグメントの断片によってコードさ
れるポリペプチドのいずれかを含む。幾つかの実施形態
では、第1のポリペプチド部分は、EST関連ポリペプチ
ド、EST関連ポリペプチドの断片、EST関連ポリペプチド
のポジショナルセグメント、またはEST関連ポリペプチ
ドのポジショナルセグメントの断片の１つとし得る。
【０４０１】第2のポリペプチド部分は、関心のある任
意のポリペプチドを含む。幾つかの実施形態では、第2
のポリペプチド部分は、検出可能な酵素活性を有するポ
リペプチド（例えばグリーン蛍光タンパク質やβガラク
トシダーゼ）を含み得る。第2のポリペプチド部分が検
出可能なポリペプチドを含んでいるキメラポリペプチド
は、第1のポリペプチド部分の細胞内での位置を決定す
るのに用い得る。そのような手法において、キメラポリ
ペプチドをコードする融合ベクターは、該キメラポリペ
プチドの発現を促進する条件下で宿主細胞に導入する。
適切な場合、細胞を、該検出可能なポリペプチドとの触
媒反応の後で顕微鏡で目に見える検出試薬で処理し、該
検出試薬の細胞位置を決定する。例えば、検出可能な酵
素活性を有するポリペプチドがβガラクトシダーゼであ
る場合、細胞はXgalで処理し得る。あるいはまた、検出
可能なポリペプチドが検出試薬を添加しなくとも直接検
出できる場合には、キメラポリペプチドの細胞内位置
は、検出可能なポリペプチドが目に見える条件下で顕微
鏡観察を行うことによって決定される。例えば、検出可
能なポリペプチドがグリーン蛍光タンパク質またはその
修飾物である場合、宿主細胞を適当な波長を有する光に
曝して該グリーン蛍光タンパク質またはその修飾物を蛍
光発酵させることによって顕微鏡観察を行う。
【０４０２】あるいはまた、第2のポリペプチド部分
は、単離、精製または富化しようとすすポリペプチドを
含み得る。そのような実施形態では、第2のポリペプチ
ド部分の単離、精製または富化は、第1のポリペプチド
部分に対する抗体をカップリングさせてあるイムノアフ
ィニティカラムを用いた後記のようなイムノアフィニテ
ィクロマトグラフィー法を行うことによって達成でき
る。
【０４０３】EST関連核酸、EST関連核酸のポジショナル
セグメント、またはEST関連核酸のポジショナルセグメ
ントの断片によってコードされるタンパク質、あるいは
EST関連ポリペプチド、EST関連ポリペプチドの断片、ES
T関連ポリペプチドのポジショナルセグメント、EST関連
ポリペプチドのポジショナルセグメントの断片は、実施
例48に記載のようにサンプルが由来する組織の種類また
は細胞種を同定する目的で、実施例20および33で説明し
たように抗体の作製にも用い得る。
【０４０４】実施例48 標識した組織特異的抗体による組織の種類または細胞種
の同定 特定の組織の同定は、実施例20および33に従う検出可能
なマーカーに直接的または間接的に結合する抗体調製物
により、組織特異的抗原を視覚化することによって達成
される。選択した標識抗体種は、組織切片、細胞懸濁
液、または組織サンプル由来の可溶性タンパク質の抽出
物内で、その特異的な抗原結合パートナーに結合して、
定量的または半定量的解釈のためのパターンを提供す
る。
【０４０５】これらの手法のための抗血清は、天然の調
製物の効力(potency)よりも高い効力を有さなければな
らない。その理由は、抗体がγグロブリン画分の単離に
より（例えば、イオン交換クロマトグラフィーまたは硫
酸アンモニウム分画により）mg/mlにまで濃縮されるか
らである。また、最も特異的な抗血清を提供するために
は、抗体をマーカーで標識する前に、γグロブリン画分
から、例えば不溶性免疫吸着剤によって望ましくない抗
体（例えば共通のタンパク質に対する抗血清）を除去し
なければならない。いずれの手法にも、モノクローナル
抗血清または異種抗血清のいずれかが好適である。
【０４０６】１．免疫組織化学的技法 精製高力価の抗体（上記のようにして調製した）を、例
えばFudenberg, H., Chap. 26, Basic 503 Clinical Im
munology, 第3版, Lange, Los Altos, California (198
0)またはRosaら, Chap. 12, Methods in Immunodiagnos
is, 第2版, John Wiley and Sons, New York (1980)
（これらの開示内容は引用により本明細書に組み入れ
る）に記載のようにして検出可能なマーカーに結合す
る。
【０４０７】蛍光マーカー（フルオレセインまたはロー
ダミン）が好ましいが、抗体は、基質との呈色反応を補
助する酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）で
標識してもよい。マーカーは、下記に記載のように第2
の工程で、組織に結合している抗体に添加してもよい。
あるいはまた、特定の抗組織抗体をフェリチンまたは他
の電子密度の高い粒子(electron dense particles)で標
識して、フェリチンが結合している抗原−抗体複合体の
位置決定を電子顕微鏡により行う。さらに別の方法で
は、抗体は例えば125Ｉで放射性標識し、抗体処理調製
物を写真乳剤を上層することによって検出する。
【０４０８】この手法を行うための調製物は、組織の種
類（例えば脳組織）に特異的であると同定された単一の
タンパク質またはペプチドに対するモノクローナルもし
くはポリクローナル抗体を含んでもよく、あるいは抗原
性が異なる組織特異的な幾つかの抗原に対する抗体調製
物をパネル内で、必要に応じて別々にまたは混合物とし
て含んでもよい。
【０４０９】通常の組織化学的技法に従って免疫組織化
学的試験のために、組織切片および細胞懸濁液を調製す
る。未知の組織および既知の対照の複数のクリオスタッ
ト切片（約４μm、固定せず）をマウントし、それぞれ
のスライドガラスを抗体調製物の各種希釈物で覆う。既
知および未知の組織の切片も調製物で処理して、陽性の
対照、陰性の対照（例えば、免疫前の血清）および非特
異的染色用の対照（例えば緩衝液）を提供する。処理し
た切片を加湿したチャンバー内で室温にて30分間インキ
ュベートし、濯ぎ、緩衝液中で30〜45分間洗浄する。過
剰な液は吸い取り、マーカーを顕色させる。
【０４１０】組織特異的抗体を最初のインキュベーショ
ンで標識しない場合には、二次抗体−抗体反応における
この時点で標識できる。これは例えば、抗血清産生種の
免疫グロブリンクラスに対するフルオレセイン結合抗体
または酵素結合抗体（例えば、フルオレセインで標識し
たマウスIgGに対する抗体）を添加することにより行わ
れる。そのような標識血清は市販されている。
【０４１１】上記の手法により組織内で見出された抗原
は、組織切片上の色または蛍光の強度を測定することに
よって定量し、適当な標準物質(standard)を用いてその
シグナルを検量できる。
【０４１２】２．組織特異的可溶性タンパク質の同定 組織特異的タンパク質の可視化およびその手法からの未
知組織の同定は、標識抗体試薬および免疫組織化学のた
めに記載されている検出戦略を用いて行う。しかしなが
ら、サンプルは電気泳動技法に従って調製して、組織か
ら抽出したタンパク質を検出のために分子量に基づいて
順序だった並びに分布させる。
【０４１３】組織サンプルは、Virtis装置を用いてホモ
ジナイズする。細胞懸濁液は、当該技術分野で実施され
ているように、Dounceホモジナイズ化または浸透圧性溶
解により、いずれも場合も必要に応じて界面活性剤を用
いて細胞膜を破壊する。不溶性の細胞成分（例えば、
核、ミクロソームおよび膜断片）は超遠心分離により除
去し、可溶性タンパク質含有画分は必要に応じて濃縮
し、分析のために保存する。
【０４１４】可溶性タンパク質溶液のサンプルは、例え
ばDavis, L.ら, Section 19-2, Basic Methods in Mole
cular Biology (P. Leder編), Elsevir, New York (198
6)（その開示内容な引用により本明細書に組み入れる）
によって文献記載されているような慣用のSDSポリアク
リルアミド電気泳動によって、１組のゲル中に含まれる
一定範囲の量のポリアクリルアミドを用いて個々のタン
パク質種に分解して、サンプル中で検出すべきタンパク
質の全分子量範囲を分ける。構成タンパク質の分子量を
推定するために、サイズマーカーを並行して流す。サン
プルの分析サイズは５〜55μlの手頃な容量であり、約
１〜100μgのタンパク質を含む。分解したタンパク質の
各々のアリコートをニトロセルロースフィルター紙にブ
ロッティングにより移し取る。これは、分解のパターン
を保持するプロセスである。多数のコピーを調製する。
ウエスタンブロット解析として知られるこの手法は、Da
vis,L.ら，前掲, Section 19-3に十分に記載されてい
る。1組のニトロセルロースブロットをクーマシーブル
ー色素で染色して、抗体結合タンパク質との比較のため
にタンパク質の全ての組みを可視化する。次いで、残り
のニトロセルロースフィルターを実施例20および33に記
載のようにして調製した組織特異的タンパク質に対する
１以上の特異的抗体の溶液と共にインキュベートする。
この手法において、上記の手法Ａのように、適切な陽性
および陰性のサンプルおよび試薬コントロールを流す。
【０４１５】上記のいずれの手法においても、種々の戦
略およびその前変異(premutation)に従って検出可能な
標識を一次組織抗原−一次抗体複合体に結合させること
ができる。簡単なアプローチにおいて、一次特異的抗体
は標識してもよいし、未標識の複合体を標識化二次抗Ig
G抗体に結合させてもよい。別のアプローチでは、一次
または二次抗体のいずれかを、次の工程でアビジン結合
マーカーに結合できるビオチン分子に結合させる。さら
に別の戦略によれば、酵素標識した、または放射性同位
元素標識したプロテインＡ（これはいずれのIgGにも結
合する特性を有する）を最終工程において一次または二
次抗体のいずれかと結合させる。
【０４１６】実施例49ポリペプチドの免疫組織化学的位置決定 上記の実施例20および33に記載のようにして調製した抗
体を用いて、ポリペプチドの細胞位置を決定する。この
ポリペプチドは、EST関連核酸、EST関連核酸のポジショ
ナルセグメントまたはEST関連核酸のポジショナルセグ
メントの断片によってコードされるポリペプチドのいず
れであってもよいし、また、EST関連ポリペプチド、EST
関連ポリペプチドの断片、EST関連ポリペプチドのポジ
ショナルセグメントまたはEST関連ポリペプチドのポジ
ショナルセグメントの断片の１つであってもよい。幾つ
かの実施形態において、ポリペプチドは、例えば実施例
47の融合ベクターによってコードされるようなキメラポ
リペプチドとすることができる。
【０４１７】位置決定をしようとするポリペプチドを発
現する細胞を顕微鏡スライドガラスにのせ、免疫組織化
学的位置決定法で典型的に用いられる手法のいずれか
（例えば、Current Protocols in Molecular Biology,
John Wiley and Sons, Inc. 1997に記載の方法）を用い
て固定する。洗浄工程の後、細胞を抗体と接触させる。
幾つかの実施形態では、上記のようにして抗体を検出可
能なマーカーに結合させて検出を容易にする。あるいは
また、幾つかの実施形態では、位置決定しようとするポ
リペプチドに対する抗体に細胞を接触させた後、検出可
能なマーカーに結合させてある二次抗体を、位置決定し
ようとするポリペプチドに対する抗体と接触させて置
く。
【０４１８】その後、ポリペプチドの細胞位置を可視化
するのに適する条件下で顕微鏡観察を行う。
【０４１９】EST関連核酸、EST関連核酸のポジショナル
セグメント、もしくはEST関連核酸のポジショナルセグ
メントの断片によってコードされるポリペプチドに対す
る１以上の組織特異的抗体、またはEST関連ポリペプチ
ド、EST関連ポリペプチドの断片、EST関連ポリペプチド
のポジショナルセグメントもしくはEST関連ポリペプチ
ドのポジショナルセグメントの断片に対する１以上の抗
体に、上記の対照組織で見られるようなレベルで結合す
る組織特異的抗原の可視化によって、起源が未知の組
織、例えば法医学的サンプルや異質の身体部位に転移し
ている各種の腫瘍組織、を同定することができる。
【０４２０】実施例20および33の抗体はまた、下記に記
載のようなイムノアフィニティクロマトグラフィー法に
おいて用いて、EST関連核酸、EST関連核酸のポジショナ
ルセグメントまたはEST関連核酸のポジショナルセグメ
ントの断片によってコードされるポリペプチドの単離、
精製または富化、あるいはEST関連ポリペプチド、EST関
連ポリペプチドの断片、EST関連ポリペプチドのポジシ
ョナルセグメントまたはEST関連ポリペプチドのポジシ
ョナルセグメントの断片の単離、精製または富化を行う
ことも可能である。下記に記載のイムノアフィニティク
ロマトグラフィー法はまた、EST関連核酸、EST関連核酸
のポジショナルセグメントまたはEST関連核酸のポジシ
ョナルセグメントの断片によってコードされるポリペプ
チドと連結しているポリペプチドの単離、精製または富
化に、あるいはEST関連ポリペプチド、EST関連ポリペプ
チドの断片、EST関連ポリペプチドのポジショナルセグ
メントまたはEST関連ポリペプチドのポジショナルセグ
メントの断片に連結しているポリペプチドの単離、精製
または富化に用い得る。
【０４２１】実施例50 イムノアフィニティクロマトグラフィー 上記のようにして調製した抗体は支持体にカップリング
する。好ましくは、該抗体はモノクローナル抗体である
が、ポリクローナル抗体も使用できる。該支持体は、イ
ムノアフィニティクロマトグラフィーにおいて典型的に
使用されるいずれかのものとすることができ、例えば、
Sepharose CL-4B（Pharmacia, Piscataway, NJ）、Seph
arose CL-2B (Pharmachia, Piscataway, NJ)、Affi-gel
10（Biorad, Richmond, CA）またはガラスビーズが挙
げられる。
【０４２２】抗体の支持体へのカップリングは、イムノ
アフィニティクロマトグラフィーにおいて典型的に用い
られるカップリング試薬のいずれかを用いて行うことが
でき、例えば臭化シアンが挙げられる。抗体が支持体へ
カップリングした後、単離、精製または富化しようとす
る標的ポリペプチドを含むサンプルに該支持体を接触さ
せる。標的ポリペプチドは、EST関連核酸、EST関連核酸
のポジショナルセグメントまたはEST関連核酸のポジシ
ョナルセグメントの断片によってコードされるポリペプ
チドであってもよいし、あるいは標的ポリペプチドはES
T関連ポリペプチド、EST関連ポリペプチドの断片、EST
関連ポリペプチドのポジショナルセグメントまたはEST
関連ポリペプチドのポジショナルセグメントの断片であ
ってもよい。標的ポリペプチドはまた、EST関連核酸、E
ST関連核酸のポジショナルセグメントまたはEST関連核
酸のポジショナルセグメントの断片によってコードされ
るポリペプチドに連結しているポリペプチドであっても
よく、あるいは、標的ポリペプチドは上記の融合ベクタ
ーを用いてEST関連ポリペプチド、EST関連ポリペプチド
の断片、EST関連ポリペプチドのポジショナルセグメン
トまたはEST関連ポリペプチドのポジショナルセグメン
トの断片に連結しているポリペプチドであってもよい。
【０４２３】好ましくは、サンプルは、標的ポリペプチ
ドの少なくとも50％を支持体にカップリングする抗体に
特異的に結合させるような適切な条件下で、十分な時間
にわたって支持体と接触させて置かれる。
【０４２４】その後、支持体を適切な洗浄溶液で洗浄し
て、該支持体に非特異的に付着するポリペプチドを除去
する。この洗浄溶液はイムノアフィニティクロマトグラ
フィーにおいて典型的に用いられるもののいずれかであ
ってもよく、例えばPBS、Tris-塩酸リチウム緩衝液（0.
1M リシン塩基および0.5M塩化リチウム, pH8.0）、Tris
-塩酸緩衝液（0.05M Tris-塩酸,pH8.0）またはTris/Tri
ton/NaCl緩衝液（50mMTris.cl, pH 8.0または9.0, 0.1%
Triton X-100,および0.5M NaCl）が挙げられる。
【０４２５】洗浄した後、イムノアフィニティクロマト
グラフィーにおいて典型的に用いられる高pHまたは低pH
の溶出溶液を用いて、特異的に結合した標的ポリペプチ
ドを支持体から溶出させる。特に、溶出溶液は、トリエ
タノールアミン、ジエチルアミン、塩化カルシウム、チ
オシアン酸ナトリウム、臭化カリウム、酢酸またはグリ
シンなどの溶離液を含む。幾つかの実施形態において、
溶出溶液はまた、Triton X-100またはオクチル-β-D-ガ
ラクトシドのような界面活性剤を含んでもよい。
【０４２６】EST関連核酸、EST関連核酸のポジショナル
セグメントまたはEST関連核酸のポジショナルセグメン
トの断片はまた、遺伝子発現を調節できる5'ESTの上流
に位置する配列をクローニングするのにも用いることが
でき、そのような配列としては例えば、プロモーター配
列、エンハンサー配列、および転写レベルまたは翻訳レ
ベルに影響を及ぼす他の上流配列が挙げられる。同定さ
れクローニングされたら、これらの上流調節配列は、挿
入した遺伝子の発現を所望の場所、時間、発達または量
の様式で指令するように設計した発現ベクター内で用い
得る。実施例51は、EST関連核酸、EST関連核酸のポジシ
ョナルセグメントまたはEST関連核酸のポジショナルセ
グメントの断片の上流の配列をクローニングする方法を
記載している。
【０４２７】２．プロモーター活性または調節活性を有
する上流配列の同定
【０４２８】実施例５１ ゲノムＤＮＡ由来の上流配列をクローニングするため
の、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸のポジショナルセ
グメントまたはＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメン
トの断片の使用 染色体歩行技術を用い、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核
酸のポジショナルセグメントまたはＥＳＴ関連核酸のポ
ジショナルセグメントの断片から誘導される配列を使用
して、相当する遺伝子のプロモータを単離することがで
きる。Clontechより販売されているGenome WalkerTMキ
ットを利用する１つの染色体歩行技術では、５つの完全
なゲノムＤＮＡサンプルのそれぞれを、６塩基の認識部
位を有し、かつ平滑末端を生じる異なる制限酵素で消化
する。消化後、オリゴヌクレオチドアダプターを、得ら
れたゲノムＤＮＡ断片の両末端に連結する。
【０４２９】５つのゲノムＤＮＡライブラリーのそれぞ
れについて、キットに付属している外側アダプタープラ
イマーおよび外側遺伝子特異的プライマーを使用して、
製造者の説明書（引用により本明細書に組み入れる）に
従って第１のＰＣＲ反応を実施する。遺伝子特異的プラ
イマーは、目的の５’ＥＳＴに特異的であるように選択
されるべきであり、かつ、ＰＣＲ反応での該プライマー
の使用に適合する融解温度、長さ、およびＥＳＴ関連核
酸、ＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメントもしくは
ＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメントの断片におけ
る位置を有するべきである。それぞれの第１のＰＣＲ反
応物は、５０μｌの全用量中に、５ｎｇのゲノムＤＮ
Ａ、５μｌの１０×Ｔｔｈ反応緩衝液、０．２ｍＭの各
種ｄＮＴＰ、外側アダプタープライマーおよび外側遺伝
子特異的プライマーをそれぞれ０．２μＭ、１．１ｍＭ
のＭｇ（ＯＡｃ）2、および１μｌのＴｔｈポリメラー
ゼ５０×ミックスを含有する。第１のＰＣＲ反応の反応
サイクルは以下の通りである：１分間−９４℃／２秒間
−９４℃、３分間−７２℃（７サイクル）／２秒間−９
４℃、３分間−６７℃（３２サイクル）／５分間−６７
℃。
【０４３０】第１のＰＣＲ反応の産物を希釈し、第１の
ＰＣＲ反応から生じるアンプリコンの内部に位置するネ
ステッドプライマーの対を用い、製造業者の説明書に従
った第２のＰＣＲ反応の鋳型として使用する。例えば、
第１のＰＣＲ反応混合物の５μｌの反応産物を１８０倍
に希釈してもよい。ネステッドプライマーを使用するこ
と以外は第１のＰＣＲ反応の組成と同一の組成を有する
５０μｌの容量で反応を行う。第１のネステッドプライ
マーは、アダプターに特異的であり、Genome WalkerTM
キットに付属している。第２のネステッドプライマー
は、該プライマーがクローニングしようとする特定のＥ
ＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメン
トまたはＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメントの断
片に特異的であり、かつ、ＰＣＲ反応における使用に適
合する融解温度、長さ、および該ＥＳＴ関連核酸、ＥＳ
Ｔ関連核酸のポジショナルセグメントもしくはＥＳＴ関
連核酸のポジショナルセグメントの断片中での位置を有
するべきである。第２のＰＣＲ反応の反応パラメータは
以下の通りである：１分間−９４℃／２秒間−９４℃、
３分間−７２℃（６サイクル）／２秒間−９４℃、３分
間−６７℃（２５サイクル）／５分間−６７℃。第２の
ＰＣＲ反応の産物を標準的な技術を用いて精製し、クロ
ーニングし、配列を決定する。
【０４３１】あるいは、２種以上の制限酵素を用いるこ
とによって、２種以上のヒトゲノムＤＮＡライブラリー
を構築することができる。消化されたゲノムＤＮＡを、
一本鎖、環状、または鎖状ＤＮＡに変換可能なベクター
にクローニングする。ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸
のポジショナルセグメントまたはＥＳＴ関連核酸のポジ
ショナルセグメントの断片配列由来の少なくとも１５個
のヌクレオチドを含むビオチン化オリゴヌクレオチド
を、一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせる。ビオチン化
オリゴヌクレオチドとＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸
のポジショナルセグメントまたはＥＳＴ関連核酸のポジ
ショナルセグメントの断片を含む一本鎖ＤＮＡとのハイ
ブリッドを、上記のように単離する。その後、そのＥＳ
Ｔ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメント
またはＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメントの断片
を含有する一本鎖ＤＮＡをビーズから遊離させ、ＥＳＴ
関連核酸、ＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメントま
たはＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメントの断片に
特異的なプライマーまたはクローニングベクターに含ま
れる配列に対応するプライマーを使用して、二本鎖ＤＮ
Ａに変換する。得られる二本鎖ＤＮＡを細菌に形質転換
する。ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸のポジショナル
セグメントまたはＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメ
ントの断片を含有するｃＤＮＡを、コロニーＰＣＲまた
はコロニーハイブリダイゼーションによって同定する。
【０４３２】上記のように上流ゲノム配列をクローニン
グし配列決定したら、該上流配列内の予期されるプロモ
ーターおよび転写開始部位は、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ
関連核酸のポジショナルセグメントまたはＥＳＴ関連核
酸のポジショナルセグメントの断片の上流にある配列
を、既知の転写開始部位、転写因子結合部位またはプロ
モーター配列を含有するデータベースと比較することに
よって同定することができる。
【０４３３】更に、実施例５３に記載のようにして、プ
ロモーターレポーターベクターを使用して、上流配列内
のプロモーターを同定することができる。
【０４３４】実施例５３ クローニングされた上流配列におけるプロモーターの同
定 ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメ
ントまたはＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメントの
断片の上流のゲノム配列を、例えばpSEAP-Basic、pSEAP
-Enhancer、pβgal-Basic、pβgal-Enhancer、またはCl
ontechより市販されているpEGFP-1プロモーターレポー
ターベクターなどの適切なプロモーターレポーターベク
ターにクローニングする。簡単に説明すると、これらの
プロモーターレポーターベクターのそれぞれは、分泌型
アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、または
グリーン蛍光タンパク質などの容易にアッセイをするこ
とができるタンパク質をコードするレポーター遺伝子の
上流に位置する多重クローニング部位を含む。ＥＳＴ関
連核酸、ＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメントまた
はＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメントの断片の上
流の配列を、レポーター遺伝子の上流のクローニング部
位に両方向で挿入し、適切な宿主細胞に導入する。レポ
ーター遺伝子のレベルをアッセイし、クローニング部位
に挿入物がないベクターから得られるレベルと比較す
る。対照のベクターと比較して、挿入物を含有するベク
ターの発現レベルの上昇が認められれば、挿入物にプロ
モーターが存在することになる。必要であれば、上流配
列を、弱いプロモーター配列からの転写レベルを増大さ
せるためのエンハンサーを含有するベクターにクローニ
ングすることもできる。挿入物を含まないベクターの場
合に認められる上記の発現の有意なレベルは、プロモー
ター配列が挿入上流配列に存在することを示す。
【０４３５】プロモーターレポーターベクターのための
適切な宿主細胞は、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の
ポジショナルセグメントまたはＥＳＴ関連核酸のポジシ
ョナルセグメントの断片の発現パターンの上記の判定に
基づいて選択することができる。例えば、発現パターン
の分析から、特定のＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の
ポジショナルセグメントまたはＥＳＴ関連核酸のポジシ
ョナルセグメントの断片に対応するｍＲＮＡが繊維芽細
胞において発現されることが示された場合、プロモータ
ーレポーターベクターをヒト繊維芽細胞系に導入するこ
とができる。
【０４３６】上流ゲノムＤＮＡ内のプロモーター配列
は、エキドヌクレアーゼＩＩＩ消化などの慣用の技術を
使用して、上流ＤＮＡにおいてネステッド欠失を構築す
ることによって、更に明確化することができる。得られ
る欠失断片をプロモーターレポーターベクターに挿入し
て、その欠失がプロモーター活性を低下させるかまたは
失わせるかどうかを判定することができる。このように
して、プロモーターの境界を規定することができる。所
望であれば、プロモータ内の潜在的な転写因子結合部位
を除去するための部位特異的突然変異誘発もしくはリン
カースキャニングを単独または組合せて使用して、プロ
モーター内の潜在的な個々の調節部位を同定してもよ
い。プロモーターレポーターベクターのクローニング部
位に変異を挿入することによって、転写レベルに対する
これらの変異の効果を決定することができる。
【０４３７】実施例５４ プロモーターのクローニングおよび同定 ５’ＥＳＴを用いた上記の実施例５１に記載の方法を用
いて、いくつかの遺伝子の上流の配列を得た。プライマ
ー対GGG AAG ATG GAG ATA GTA TTG CCT G（配列番号１
５）およびCTG CCA TGT ACA TGA TAG AGA GAT TC（配列
番号１６）を使用して、P13H2（本発明者らによる命
名）（配列番号１７）を有するプロモーターを得た。
【０４３８】プライマー対GTA CCA GGGG ACT GTG ACC A
TT GC（配列番号１８）およびCTG TGA CCA TTG CTC CCA
AGA GAG（配列番号１９）を使用して、P15B4（本発明
者らによる命名）（配列番号２０）を有するプロモータ
ーを得た。
【０４３９】プライマー対CTG GGA TGG AAG GCA CGG TA
（配列番号２１）およびGAG ACC ACA CAG CTA GAC AA
（配列番号２２）を使用して、P29B6（本発明者らによ
る命名）（配列番号２３）を有するプロモーターを得
た。
【０４４０】図４は、単離されたプロモーターの概略図
および対応する５’タグでそれらをアセンブリする方法
を示す。コンピュータプログラムＭａｔＩｎｓｐｅｃｔ
ｏｒリリース２．０（１９９６年８月）を使用して、転
写因子結合部位または既知の転写開始部位に類似するモ
チーフの存在に基づいて、上流配列をスクリーニングし
た。
【０４４１】図５は、これらのプロモーターのそれぞれ
に存在する転写因子結合部位について記載している。
「マトリックス」と書いた欄は、使用したＭａｔＩｎｓ
ｐｅｃｔｏｒマトリックスの名称を示す。「位置(posit
ion)」と書いた欄は、プロモーター部位の５’位を示
す。配列の番号付けは、ゲノム配列と５’ＥＳＴ配列と
のマッチングにより決定した転写部位から開始する。
「方向(orientation)」と書いた欄は、その部位が見出
されたＤＮＡ鎖を示し、＋鎖は、ゲノム配列と５’ＥＳ
Ｔの配列とが一致することで決定されたコード鎖であ
る。「スコア」と書いた欄は、この部位に対するＭａｔ
Ｉｎｓｐｅｃｔｏｒのスコアを示す。「長さ」と書いた
欄は、部位の長さ（ヌクレオチド単位による）を示す。
「配列」と書いた欄は、見出された部位の配列を示す。
【０４４２】上記のプロモーター配列を含有するプラス
ミドを含有する細菌クローンは、先に示した内部認識番
号で本発明者の研究室に現在保存されている。適切な細
菌のクローンのアリコートを適切な培地で増殖させるこ
とによって、沈殿物から挿入物を取り出すことができ
る。次いで、アルカリ溶解ミニプレップまたは大量アル
カリ溶解プラスミド単離法などの当業者によく知られて
いるプラスミド単離手順を使用して、プラスミドＤＮＡ
を単離することができる。所望であれば、塩化セシウム
勾配上での遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、
または陰イオン交換クロマトグラフィーによって、プラ
スミドＤＮＡを更に濃縮してもよい。次いで、当業者に
よく知られている標準的なクローニング技術を用いて、
これらの手順を用いて得られるプラスミドＤＮＡを操作
してもよい。あるいは、挿入されたＥＳＴ関連核酸、Ｅ
ＳＴ関連核酸のポジショナルセグメントまたはＥＳＴ関
連核酸のポジショナルセグメントの断片の両末端で設計
したプライマーを用いてＰＣＲを行うことができる。次
いで、当業者によく知られている標準的なクローニング
技術を用いて、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸のポジ
ショナルセグメントまたはＥＳＴ関連核酸のポジショナ
ルセグメントの断片に対応するＰＣＲ産物を操作するこ
とができる。
【０４４３】ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸のポジシ
ョナルセグメントまたはＥＳＴ関連核酸のポジショナル
セグメントの断片の上流に位置するプロモーターおよび
他の調節配列を使用して、所望の場所的、時間的、発生
的または量的様式の発現を指令し得る発現ベクターを設
計することができる。上記の発現分析の結果を使用し
て、所望の場所的、時間的、発生的または量的パターン
で指令し得るプロモーターを選択することができる。例
えば、筋肉において高レベルの発現をもたらすプロモー
ターが望まれる場合、筋肉において高レベルで発現され
るｍＲＮＡから誘導されるＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連
核酸のポジショナルセグメントまたはＥＳＴ関連核酸の
ポジショナルセグメントの断片の上流のプロモーター配
列は、上記の方法で決定されるように、発現ベクターで
使用することができる。
【０４４４】好ましくは、所望のプロモーターを多重制
限部位の付近に配置して、プロモーターの上流の所望の
挿入物のクローニングを容易にし、それによってプロモ
ーターが挿入遺伝子の発現を駆動することができるよう
にする。染色体外複製、宿主染色体への組み込みまたは
一過性発現のために設計された通常の核酸骨格にプロモ
ーターを挿入することができる。本発明の発現ベクター
の適切な骨格としては、レトロウイルスの骨格、ＳＶ４
０またはウシパピローマウイルスなどの真核生物エピソ
ーム由来の骨格、細菌エピソーム由来の骨格、または人
工染色体が挙げられる。
【０４４５】好ましくは、この発現ベクターはまた、該
発現ベクターに挿入された遺伝子から転写されるｍＲＮ
Ａのポリアデニル化を指令するための多重制限部位の下
流にあるポリＡシグナルを含む。
【０４４６】実施例５１〜５４の手順を使用してプロモ
ーター配列を同定した後、以下の実施例５５に記載する
ようにして、プロモーターと相互作用するタンパク質を
同定することができる。
【０４４７】実施例５５ プロモーター配列、上流調節配列、またはｍＲＮＡと相
互作用するタンパク質の同定 既知の転写因子結合部位に対する相同性によって、ある
いはプロモーター配列を含有するレポータープラスミド
の慣用の変異誘発または欠失分析により、転写因子に結
合しやすいプロモーター領域内の配列を同定することが
できる。例えば、アッセイ可能なレポーター遺伝子に作
動可能に連結した目的のプロモーター配列を含有するレ
ポータープラスミド内に欠失を作製することができる。
プロモーター領域内に様々な欠失を保有するレポーター
プラスミドを適切な宿主細胞にトランスフェクトし、発
現レベルに対する欠失の影響をアッセイする。部位特異
的変異、リンカーリンカースキャニング分析、または当
業者によく知られている他の技術を使用して、欠失によ
り発現レベルが低下する領域内で転写因子結合部位を更
に局在化することができる。
【０４４８】Clontechより市販のMatchmaker One-Hybri
d System kit（カタログ番号K1603-1）に添付されてい
る説明書（この開示内容は引用により本明細書に組み込
まれる）に記載の系のような１ハイブリッド系(one-hyb
rid system)を使用して、プロモーター内の配列と相互
作用するタンパク質をコードする核酸を同定することが
できる。簡単に説明すると、Matchmaker One-Hybrid Sy
stemは以下のようにして使用する。結合タンパク質を同
定することが所望される標的配列を、選択レポーター遺
伝子の上流にクローニングし、酵母のゲノムに組み込
む。好ましくは、標的配列の多コピーをタンデムにレポ
ータープラスミドに挿入する。プロモーターに結合する
能力について評価しようとするｃＤＮＡとＧＡＬ４など
の酵母転写因子の活性化ドメインとの融合物を含むライ
ブラリーを、組み込まれたレポーター遺伝子配列を含有
する酵母株へ形質転換する。この酵母を選択培地に蒔
き、プロモーター配列に連結した選択マーカーを発現し
ている細胞を選択する。選択培地上で増殖するコロニー
は、標的配列に結合するタンパク質をコードする遺伝子
を含有する。配列を決定することによって、融合タンパ
ク質をコードする遺伝子内の挿入物を更に特徴付けす
る。更に、挿入物は、発現ベクターかまたはin vitro転
写ベクターに挿入してもよい。挿入物によりコードされ
るポリペプチドとプロモーターＤＮＡとの結合は、ゲル
シフト分析またはＤＮＡａｓｅ保護分析などの当業者に
よく知られている技術によって確認することができる。
【０４４９】ＶＩＩ． 遺伝子治療におけるＥＳＴ関連
核酸、ＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメントまたは
ＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメントの断片の使用 本発明はまた、以下の実施例５６および５７に記載のア
ンチセンスおよび三重らせん戦略を含む遺伝子治療にお
けるＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸のポジショナルセ
グメントまたはＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメン
トの断片の使用を包含する。アンチセンスアプローチで
は、ｍＲＮＡに相補的な核酸配列を細胞内でｍＲＮＡに
ハイブリダイズさせることによって、該ｍＲＮＡにより
コードされるタンパク質の発現を阻止する。アンチセン
ス配列は、様々な機構を介して遺伝子の発現を妨げるこ
とができる。例えば、アンチセンス配列は、リボソーム
がｍＲＮＡを翻訳する能力を阻害することができる。あ
るいは、アンチセンス配列は、核から細胞質へのｍＲＮ
Ａの輸送を阻止して、翻訳に利用可能なｍＲＮＡの量を
制限することができる。アンチセンス配列が遺伝子発現
を抑制し得るもう１つの機構は、ｍＲＮＡのスプライシ
ングを干渉することによるものである。更にもう１つの
戦略では、標的のｍＲＮＡを特異的に切断し得るリボザ
イムにアンチセンス核酸を取り込ませることができる。
【０４５０】実施例５６ アンチセンスオリゴヌクレオチドの調製および使用 遺伝子治療において使用すべきアンチセンス核酸分子
は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列のいずれであってもよく、
ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメ
ントまたはＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメントの
断片の配列に相補的な配列を含んでいてもよい。アンチ
センス核酸は、二本鎖の状態でｍＲＮＡの発現を阻害す
るのに十分安定な細胞内二本鎖を形成し得るよう、十分
な長さおよび融解温度を有するべきである。遺伝子治療
の用途に適切なアンチセンス核酸を設計するための方法
については、Greenら、Ann. Rev. Biochem. 55:569-59
7, (1986);およびIzantおよびWeintraub、Cell36:1007-1
015, (1984)に開示されている。これらの参考文献は本
明細書において参考として援用される。
【０４５１】いくつかの方法では、細胞中で正常に転写
される鎖とは反対側の鎖を転写するように、プロモータ
ーに対してコード領域の方向を逆にすることによって、
タンパク質をコードするヌクレオチド配列からアンチセ
ンス核酸を得ている。Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼを
使用して転写産物を作製する系などのin vitro転写系を
用いて、アンチセンス分子を転写することができる。も
う１つのアプローチは、アンチセンス配列を含有するＤ
ＮＡを発現ベクターのプロモーターに機能し得る形で連
結することによるin vivoでのアンチセンス核酸の転写
に関与するものである。
【０４５２】あるいは、細胞中で正常に転写される鎖に
相補的なオリゴヌクレオチドをin vitroで合成してもよ
い。従って、アンチセンス核酸は対応するｍＲＮＡに相
補的であり、ｍＲＮＡにハイブリダイズして二本鎖を作
製することができる。いくつかの実施態様では、アンチ
センス配列は、改変された糖リン酸骨格を含有するため
安定性が増し、ＲＮａｓｅ活性に対する該アンチセンス
配列の感受性が低下する。アンチセンス法での使用に適
した改変の例については、Rossiら、Pharmacol. Ther.
50(2):245-254, (1991)に記載されており、本明細書に
おいて参考として援用される。
【０４５３】ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸のポジシ
ョナルセグメントまたはＥＳＴ関連核酸のポジショナル
セグメントの断片の配列に相補的なアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドの様々な型を使用することができる。１つ
の好ましい実施態様では、国際出願であるＰＣＴ ＷＯ
９４／２３０２６号に記載の安定および半安定なアンチ
センスオリゴヌクレオチドを使用する。該参考文献は本
明細書において参考として援用される。これらの分子で
は、３’末端または３’および５’両末端は、相補的な
塩基対間の分子内水素結合で結ばれている。これらの分
子はエキソヌクレアーゼの攻撃に更に耐えることがで
き、従来のアンチセンスオリゴヌクレオチドに比べて安
定性が向上している。
【０４５４】別の好ましい実施態様では、国際出願ＷＯ
９５／０４１４１号に記載の単純ヘルペスウイルＩ型お
よびＩＩ型に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを
使用する。該参考文献は本明細書において参考として援
用される。
【０４５５】更に別の好ましい実施態様では、国際出願
ＷＯ９６／３１５２３号に記載の共有結合で架橋された
アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する。該参考文
献は本明細書において参考として援用される。これらの
二本鎖または一本鎖オリゴヌクレオチドは、それぞれ１
つ以上のオリゴヌクレオチド間またはオリゴヌクレオチ
ド内の共有架橋結合を有し、ここで、該結合は、それぞ
れ、一方の鎖の第一級アミノ基と他方の鎖のカルボキシ
ル基との間のアミド結合、または同じ鎖の第一級アミノ
基とカルボキシル基との間のアミド結合から成り、第一
級アミノ基は、鎖ヌクレオチドの単糖環の２’位で直接
置換されており、カルボキシル基は、他方の鎖または同
じ鎖のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体上に置換
されている脂肪族スペーサー基によって担持されてい
る。
【０４５６】国際出願ＷＯ９２／１８５２２号に記載の
アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオ
チドを使用することができる。該参考文献は本明細書に
おいて参考として援用される。これらの分子は分解に対
して安定であり、制御タンパク質に結合する少なくとも
１つの転写制御認識配列を含有するため、デコイとして
有効である。これらの分子は、「ヘアピン」構造、「ダ
ンベル」構造、「修飾されたダンベル」構造、「架橋さ
れた」デコイ構造および「ループ」構造を含有し得る。
【０４５７】別の好ましい実施態様では、欧州特許出願
第０ ５７２ ２８７Ａ２号に記載の環状二本鎖オリゴ
ヌクレオチドを使用する。該参考文献は本明細書におい
て参考として援用される。これらの結合型オリゴヌクレ
オチド「ダンベル」は、転写因子のための結合部位を含
有し、転写因子を封鎖（sequester）することによっ
て、転写因子の制御下での遺伝子発現を阻害する。
【０４５８】国際出願ＷＯ９２／１９７３２号に開示さ
れている閉環型アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用
も考慮される。該参考文献は本明細書において参考とし
て援用される。これらの分子は遊離の末端を持たないた
め、従来のオリゴヌクレオチドよりもエキソヌクレアー
ゼによる分解に対して耐性が高い。これらのオリゴヌク
レオチドは多機能性であり、標的ｍＲＮＡに隣接してい
ない複数の領域と相互作用する。
【０４５９】遺伝子の発現を阻害するのに必要なアンチ
センス核酸の適切なレベルは、in vitro発現分析を用い
て決定することができる。当該分野において公知の手順
を用いる拡散、注入、感染またはトランスフェクション
により、アンチセンス分子を細胞に導入することができ
る。例えば、アンチセンス核酸を裸のオリゴヌクレオチ
ド、脂質にカプセル化させたオリゴヌクレオチド、ウイ
ルスタンパク質に封入したオリゴヌクレオチド、または
発現ベクターに含まれるプロモーターに機能し得る形で
連結させたオリゴヌクレオチドとして、アンチセンス核
酸を身体に導入することができる。発現ベクターは当該
分野において公知の様々な発現ベクターのいずれであっ
てもよく、レトロウイルスベクターまたはウイルスベク
ター、染色体外複製が可能なベクター、または組込みベ
クターが挙げられる。ベクターは、ＤＮＡであってもよ
く、ＲＮＡであってもよい。
【０４６０】アンチセンス分子を、好ましくは１×１０
-10Ｍ〜１×１０-4Ｍの間の多くの異なる濃度で細胞サ
ンプルに導入する。適切に遺伝子発現を制御することが
できる最小濃度が同定されれば、その最適化用量がin v
ivoでの使用に適切な用量と解釈される。例えば、培養
物の場合の１×１０-7の阻害濃度は約０．６ｍｇ／ｋｇ
体重の用量と解釈される。１００ｍｇ／ｋｇ体重以上に
達するオリゴヌクレオチドのレベルは、実験動物でオリ
ゴヌクレオチドの毒性を試験すれば可能である。脊椎動
物から細胞を取り出し、アンチセンスオリゴヌクレオチ
ドで処置して、脊椎動物に再導入することも更に考慮さ
れる。
【０４６１】アンチセンスオリゴヌクレオチド配列をリ
ボザイム配列に取り込ませ、アンチセンスを特異的にそ
の標的ｍＲＮＡに結合させてこれを切断し得るようにす
ることも更に考慮される。リボザイムおよびアンチセン
スオリゴヌクレオチドの技術的適用については、Rossi
ら（前掲）を参照のこと。
【０４６２】本発明の好ましい適用では、翻訳に対する
アンチセンス阻害の有効性を監視できるように、遺伝子
によりコードされるポリペプチドを最初に同定する。監
視にはＲＩＡおよびＥＬＩＳＡ、機能アッセイ、または
放射性標識などの抗体介在性試験を含む技術が使用され
るが、これらに限定されない。
【０４６３】ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸のポジシ
ョナルセグメントまたはＥＳＴ関連核酸のポジショナル
セグメントの断片を、細胞内三重らせん形成に基づく遺
伝子治療に使用することもできる。三重らせんオリゴヌ
クレオチドを使用してゲノムからの転写を阻害する。そ
れらは、細胞活性の変化を研究するのに特に有用であ
る。何故なら、これは特定の遺伝子に関連するからであ
る。本発明のＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸のポジシ
ョナルセグメントまたはＥＳＴ関連核酸のポジショナル
セグメントの断片または、より好ましくは、それらの配
列の一部は、特定の遺伝子の発現に関連する疾患を有す
る個体の遺伝子発現を阻害するために使用することがで
きる。同様に、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸のポジ
ショナルセグメントまたはＥＳＴ関連核酸のポジショナ
ルセグメントの断片を使用して、細胞内での特定の遺伝
子の転写を阻害する効果を研究することができる。従来
は、ホモプリン配列は三重らせんストラテジーに最も有
用であると考えられていた。しかし、ホモピリミジン配
列も遺伝子の発現を阻害することができる。そのような
ホモピリミジンオリゴヌクレオチドは、ホモプリン：ホ
モピリミジン配列の主要な溝に結合する。従って、ＥＳ
Ｔ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメント
またはＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメントの断片
由来の両タイプの配列は、本発明の範囲内にあるものと
する。
【０４６４】実施例５７ 三重らせんプローブの調製および使用 ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメ
ントまたはＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメントの
断片の配列を走査して、遺伝子発現を阻害するための三
重らせんに基づくストラテジーに使用し得る１０量体〜
２０量体のホモピリミジンまたはホモプリンストレッチ
を同定する。ホモピリミジンまたはホモプリンストレッ
チの候補の同定後、候補配列を含有する様々な量のオリ
ゴヌクレオチドを、標的遺伝子を正常に発現する組織培
養細胞に導入することによって、遺伝子発現の阻害効率
を評価する。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチ
ド合成装置で調製するか、またはＧＥＮＳＥＴ，Ｐａｒ
ｉｓ，Ｆｒａｎｃｅなどのオリゴヌクレオチド合成の専
門業者より購入することができる。
【０４６５】当業者に既知の様々な方法を用いて、オリ
ゴヌクレオチドを細胞に導入することができ、このよう
な方法としては、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ−
デキストラン法、エレクトロポレーション法、リポソー
ム介在トランスエフェクション法または自然取り込み法
が挙げられるが、それらに限定されない。
【０４６６】ノーザンブロッティング、ＲＮａｓｅ保護
アッセイ、またはＰＣＲに基づくストラテジーなどの技
術を用いて、処置された細胞を細胞機能の変化または遺
伝子発現の減少についてモニタリングし、オリゴヌクレ
オチドで処置されている細胞の標的遺伝子の転写レベル
をモニタリングする。該オリゴヌクレオチドが誘導され
たＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグ
メントまたはＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメント
の断片に相当する標的遺伝子の、特定の機能に関連して
いる既知の遺伝子配列に対する相同性に基づいて、モニ
タリングしようとする細胞機能を予測する。特に、本明
細書に記載の技術を用いて、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関
連核酸のポジショナルセグメントまたはＥＳＴ関連核酸
のポジショナルセグメントの断片が疾患と関連付けられ
る場合には、特定の遺伝性疾患を有する個体から誘導さ
れる細胞内の異常な生理活動の存在に基づいて、細胞機
能を予測することもできる。
【０４６７】次いで、実施例５６に記載のように、in v
itroでの結果に基づいて算出された用量で、上記の技術
および実施例５６に記載の技術を用いて、組織培養細胞
における遺伝子発現を阻害するのに有効なオリゴヌクレ
オチドをin vivoで導入することができる。
【０４６８】いくつかの実施態様において、オリゴヌク
レオチド単位の天然の（β）アノマーをαアノマーで置
換し、該オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼに対してよ
り耐性にすることができる。更に、臭化エチジウムなど
の挿入化剤（intercalatingagent）などをαオリゴヌク
レオチドの３’末端に結合させて、三重らせんを安定化
することができる。三重らせん形成に適切なオリゴヌク
レオチドの作製に関する情報については、Griffinら、S
cience 245:967-971, (1989)を参照されたい（この参考
文献は参照により本明細書に組み入れる）。
【０４６９】実施例５８ 宿主生物においてコードされるタンパク質を発現させる
ための、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸のポジショナ
ルセグメントまたはＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグ
メントの断片の使用 ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメ
ントまたはＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメントの
断片を使用して、宿主生物においてコードされるタンパ
ク質またはポリペプチドを発現し、有益な効果を生じる
こともできる。さらに、ＥＳＴ関連ポリペプチド、ＥＳ
Ｔ関連ポリペプチドのポジショナルセグメントまたはＥ
ＳＴ関連ポリペプチドのポジショナルセグメントの断片
をコードする核酸を用いて、宿主生物においてコードさ
れるタンパク質またはポリペプチドを発現し、有益な効
果を生じることができる。
【０４７０】そのような手順において、コードされるタ
ンパク質またはポリペプチドは、宿主生物において一過
的に発現させてもよいし、宿主生物において安定的に発
現させてもよい。コードされるタンパク質またはポリペ
プチドは、上記の活性のいずれかを有することができ
る。コードされるタンパク質またはポリペプチドは宿主
生物が欠くタンパク質またはポリペプチドであってもよ
いし、あるいは、コードされるタンパク質は宿主生物に
おけるタンパク質の現存のレベルを増大するものであっ
てもよい。
【０４７１】タンパク質またはポリペプチドが分泌され
るいくつかの実施形態においては、完全長タンパク質
（すなわち、シグナルペプチドおよび成熟タンパク質）
をコードする核酸、または成熟タンパク質のみをコード
する核酸を宿主生物中に導入する。
【０４７２】タンパク質またはポリペプチドをコードす
る核酸は、当業者に公知の種々の技術を用いて宿主生物
中に導入することができる。例えば、コードされるタン
パク質が宿主生物で発現され、これにより有益な効果を
生じるように、伸長ｃＤＮＡを剥き出しのＤＮＡとして
宿主に注入することができる。
【０４７３】あるいは、タンパク質またはポリペプチド
をコードする核酸を、宿主生物において活性なプロモー
ターの下流において発現ベクター中にクローニングする
ことができる。発現ベクターは遺伝子治療での使用のた
めに設計された発現ベクターのいずれであってもよく、
このようなものとしては、ウイルスまたはレトロウイル
スベクターが挙げられる。コードされるタンパク質が宿
主生物において発現され、これにより有益な効果を生じ
るように、発現ベクターを宿主生物に直接導入すること
ができる。他の方法では、発現ベクターをin vitroで細
胞に導入することができる。その後、発現ベクターを含
有する細胞を選択して宿主生物に導入すると、ここで、
該細胞はコードされるタンパク質またはポリペプチドを
発現して有益な効果を生じる。
【０４７４】実施例５９ タンパク質を細胞に移入するためのシグナルペプチドの
使用 配列番号２４〜６５２および３７２１〜３８１１の配列
によりコードされるシグナルペプチドの短いコア疎水性
領域（ｈ）を、目的のペプチドまたはタンパク質、いわ
ゆる積荷を組織培養細胞へ移入するキャリアとして使用
することができる（Linら、J. Biol. Chem. 270:14225-
14258, 1995; Duら、J. Peptide Res.,51:235-243, 199
8; Rojasら、Nature Biotech., 16:370-375, 1998）。
【０４７５】制限されたサイズ（約２５個のアミノ酸ま
で）の細胞透過性ペプチドを細胞膜を横切って移送しよ
うとする場合、化学合成を使用して、目的の積荷ペプチ
ドのＣ末端またはＮ末端のいずれかにｈ領域を加えるこ
とができる。あるいは、更に長いペプチドまたはタンパ
ク質を細胞に移入しようとする場合、当業者によく知ら
れている技術を用いて、核酸に遺伝子操作を施し、ｈ領
域をコードする伸長ｃＤＮＡ配列を積荷ポリペプチドを
コードするＤＮＡ配列の５’または３’末端に結合する
ことができる。次いで、そのように遺伝子操作された核
酸を、適切な細胞にトランスフェクション後、得られる
細胞透過性ポリペプチドを産生するための従来の技術を
使用して、in vivoまたはin vitroのいずれかで翻訳す
る。次いで、適切な宿主細胞を簡単に細胞透過性ポリペ
プチドと共にインキュベートし、次に膜を横切って輸送
される。
【０４７６】本方法は、多様な細胞内機能および細胞プ
ロセスを研究するために適用することができる。例え
ば、本方法は、細胞内タンパク質の機能関連ドメインを
探査したり、シグナル伝達経路に関連のタンパク質−タ
ンパク質相互作用を調べるのに使用されている（Lin
ら、前掲； Linら、J. Biol. Chem. 271:5305-5308, 199
6;Rojasら、J. Biol. Chem., 271:27456-27461, 1996;
Liuら、Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 93: 11819-11824,
1996; Rojasら、Bioch. Biophys. Res. Commun.,234:6
75-680, 1997）。
【０４７７】そのような技術は、治療効果を生じるタン
パク質を移入するための細胞医療に使用することができ
る。例えば、患者から単離された細胞を、移入された治
療用タンパク質で処置し、次いで、宿主生物に再導入す
ることができる。
【０４７８】あるいは、本発明のシグナルペプチドのｈ
領域は、核の局在化シグナルと組み合わせて使用され
得、核酸を細胞の核に送達することができる。そのよう
なオリゴヌクレオチドは、標的細胞ＲＮＡのプロセシン
グおよび成熟化を阻害するために、上述のように、三重
らせんを形成するために設計されるアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドであってもよ
い。
【０４７９】実施例６０ コンピュータ実施形態 本明細書において、「配列番号24〜4100および8178〜36
681の核酸コード」という用語は、配列番号24〜4100お
よび8178〜36681のヌクレオチド配列、配列番号24〜410
0および8178〜36681の断片、配列番号24〜4100および81
78〜36681に相同なヌクレオチド配列または配列番号24
〜4100および8178〜36681の断片に相同なヌクレオチド
配列、ならびに前記配列に相補的な全ての配列を包含す
る。該断片としては、配列番号24〜4100および8178〜36
681の少なくとも10、15、20、25、30、35、40、50、7
5、100、150、200、300、400または500個の連続ヌクレ
オチドを含む、配列番号24〜4100および8178〜36681の
部分が挙げられる。好ましくは、該断片は新規な断片で
ある。配列番号24〜4100および8178〜36681の相同配列
および断片とは、これらの配列に対して少なくとも99
％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、また
は75％の相同性を有する配列をいう。相同性は、実施例
１８に記載のいかなるコンピュータプログラムおよびパ
ラメータを用いて決定してもよく、例えば、初期（デフ
ォルト）パラメータまたは改変パラメータを用いるBLAS
T2Nが挙げられる。相同配列としては、配列番号24〜410
0および8178〜36681の核酸コードにおいてチミンをウリ
ジンで置き換えたＲＮＡ配列も挙げられる。相同配列
は、本明細書中に記載したいかなる手順を用いて得られ
るものでもよく、または上記の配列決定誤差の補正の結
果として得られるものでもよい。配列番号24〜4100およ
び8178〜36681の核酸コードが、通常の１文字様式（Sta
rrier, Lubert. Biochemistry、第３版、W. H Freeman
& Co., New Yorkの裏表紙の内側を参照されたい。）ま
たは配列中のヌクレオチドの正体を記録する他の全ての
様式によって表わされ得ることは明らかであろう。
【０４８０】本明細書において、「配列番号4101〜8177
のポリペプチドコード」という用語は、配列番号24〜41
00および8178〜36681の５’ＥＳＴによりコードされる
配列番号4101〜8177のポリペプチド配列、配列番号4101
〜8177のポリペプチドに相同なポリペプチド配列、また
は前記のあらゆる配列の断片を包含する。相同ポリペプ
チド配列とは、配列番号4101〜8177のポリペプチド配列
の１つと少なくとも99％、98％、97％、96％、95％、90
％、85％、80％、または75％の相同性を有するポリペプ
チド配列をいう。相同性は、本明細書に記載のいかなる
コンピュータプログラムおよびパラメータを用いて決定
してもよく、例えば、初期（デフォルト）パラメータま
たは改変パラメータを用いるFASTAが挙げられる。相同
配列は、本明細書中に記載したいかなる手順を用いて得
られるものでもよく、または上記の配列決定誤差の補正
の結果として得られるものでもよい。ポリペプチド断片
は、配列番号4101〜8177のポリペプチドの少なくとも
5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、または
150個の連続アミノ酸を含む。好ましくは、該断片は新
規な断片である。配列番号4101〜8177のポリペプチドコ
ードが、通常の１文字様式もしくは３文字様式（Starri
er, Lubert. Biochemistry、第３版、W. H Freeman & C
o., New Yorkの裏表紙の内側を参照されたい。）または
配列中のポリペプチドの正体に関する他の全ての様式に
よって表わされ得ることは明らかであろう。
【０４８１】配列番号24〜4100および8178〜36681の核
酸コードならびに配列番号4101〜8177のポリペプチドコ
ードが、コンピュータにより読み取りおよびアクセス可
能ないかなる媒体上においても記憶、記録、および操作
可能であることは、当業者には明らかであろう。ここ
で、「記録」および「記憶」とは、コンピュータ媒体上
に情報を記憶するプロセスをいう。当業者であれば、コ
ンピュータ読取り可能媒体上に情報を記録するための、
現在知られているあらゆる方法を適切に用いて、配列番
号24〜4100および8178〜36681の核酸コードの１以上な
らびに配列番号4101〜8177のポリペプチドコードの１以
上を含む製品を容易に作製することができる。本発明の
もう1つの態様は、配列番号24〜4100および8178〜36681
の少なくとも2、5、10、15、20、25、30、または50個の
核酸コードを記録したコンピュータ読取り可能媒体であ
る。本発明のもう1つの態様は、配列番号4101〜8177の
少なくとも2、5、10、15、20、25、30、または50個のポ
リペプチドコードを記録したコンピュータ読取り可能媒
体である。
【０４８２】コンピュータ読取り可能媒体としては、磁
気的読取り可能媒体、光学的読取り可能媒体、電気的読
取り可能媒体および磁気／光媒体が挙げられる。例え
ば、コンピュータ読取り可能媒体は、ハードディスク、
フロッピー（登録商標）ディスク、磁気テープ、CD-RO
M、DVD、RAM、またはROM、ならびに当業者に公知の他の
タイプの他の媒体とすることができる。
【０４８３】本発明の実施形態としては、本明細書で記
載する配列情報を含有するシステム、特にコンピュータ
システムが挙げられる。ここで、「コンピュータシステ
ム」とは、配列番号24〜4100および8178〜36681の核酸
コードのヌクレオチド配列、または配列番号4101〜8177
のポリペプチドコードのアミノ酸配列を解析するのに使
用する、ハードウエア要素、ソフトウエア要素、および
データ記憶要素をいう。該コンピュータシステムとして
は、好ましくは、上記コンピュータ読取り可能媒体、お
よび配列データにアクセスしてこれを操作するためのプ
ロセッサが挙げられる。
【０４８４】好ましくは、コンピュータは、中央処理装
置（CPU）、データを記憶するための１以上のデータ記
憶要素、データ記憶要素上に記憶させたデータを検索す
るための１以上のデータ検索装置を含む汎用システムで
ある。当業者であれば、現在利用可能なコンピュータシ
ステムのいずれもが適切であることは容易に理解でき
る。
【０４８５】１つの特定の実施形態において、上記コン
ピュータシステムはバスに接続されたプロセッサを含
み、該バスは、主要メモリ（好ましくはRAMとして与え
られた）、並びにデータを記録したハードドライブおよ
び／または他のコンピュータ読取り可能媒体などの１以
上のデータ記憶装置に接続されている。いくつかの実施
形態では、上記コンピュータシステムはさらに、データ
記憶要素上に記憶させたデータを読み取るための１以上
のデータ検索装置を含む。該データ検索装置は、例え
ば、フロッピーディスクドライブ、コンパクトディスク
ドライブ、磁気テープドライブ等を示す。いくつかの実
施形態では、前記データ記憶要素は、制御ロジックおよ
び／または記録されたデータを含有する、フロッピーデ
ィスク、コンパクトディスク、磁気テープ等のような脱
着可能なコンピュータ読取り可能媒体である。上記コン
ピュータシステムは、都合よく、データ記憶要素をデー
タ検索装置に挿入したときにそこから制御ロジックおよ
び／またはデータを読み取るための適切なソフトウエア
を含むか、またはこれによりプログラムされることがで
きる。配列番号24〜4100および8178〜36681の核酸コー
ドのヌクレオチド配列、または配列番号4101〜8177のポ
リペプチドコードのアミノ酸配列にアクセスしてこれを
処理するためのソフトウエア（探索ツール、比較ツー
ル、およびモデリングツール等のような）は、実行中は
主要メモリ内に置くことができる。
【０４８６】いくつかの実施形態では、上記コンピュー
タシステムはさらに、コンピュータ読取り可能媒体上に
記憶させた上記配列番号24〜4100および8178〜36681の
核酸コード、または配列番号4101〜8177のポリペプチド
コードを、コンピュータ読取り可能媒体上に記憶させた
参照ヌクレオチド配列またはポリペプチド配列と比較す
るためのシークエンスコンペアラ（sequence compare
r）を含んでもよい。「シークエンスコンペアラ」と
は、あるヌクレオチドもしくはポリペプチド配列を、デ
ータ記憶手段の中に記憶された他のヌクレオチドもしく
はポリペプチド配列および／またはペプチド、ペプチド
模倣体、および化学物質（これらに限定されない）など
の化合物と比較するためにコンピュータシステム上に与
えられた１以上のプログラムをいう。例えば、該シーク
エンスコンペアラは、コンピュータ読取り可能媒体上に
記憶された配列番号24〜4100および8178〜36681の核酸
コードのヌクレオチド配列、または配列番号4101〜8177
のポリペプチドコードのアミノ酸配列を、コンピュータ
読取り可能媒体上に記憶された参照配列と比較して、相
同性、生物学的機能に関わるモチーフ、または構造モチ
ーフを特定することができる。本特許明細書中の様々な
箇所で特定される種々のシークエンスコンペアラプログ
ラムは、本発明のこの態様に使用することを特に意図し
ている。
【０４８７】従って、本発明の１つの態様は、プロセッ
サ、配列番号24〜4100および8178〜36681の核酸コード
または配列番号4101〜8177のポリペプチドコードを記憶
したデータ記憶装置、配列番号24〜4100および8178〜36
681の核酸コードまたは配列番号4101〜8177のポリペプ
チドコードと比較すべき参照ヌクレオチド配列もしくは
ポリペプチド配列を検索可能な形で記憶したデータ記憶
装置、ならびに比較を行うためのシークエンスコンペア
ラを含むコンピュータシステムである。該シークエンス
コンペアラは、比較した配列間の相同性レベルを示す
か、または配列番号24〜4100および8178〜36681の上記
核酸コードならびに配列番号4101〜8177の上記ポリペプ
チドコードの中の構造モチーフを特定することができ、
また、これらの核酸コードおよびポリペプチドコードと
比較される配列中の構造モチーフを特定することができ
る。いくつかの実施形態では、前記データ記憶装置は、
配列番号24〜4100および8178〜36681の核酸コードまた
は配列番号4101〜8177のポリペプチドコードの少なくと
も2、5、10、15、20、25、30、または50個の配列を記憶
しておくことができる。
【０４８８】本発明の他の態様は、配列番号24〜4100お
よび8178〜36681の核酸コードと参照ヌクレオチド配列
との相同性レベルを決定する方法であって、該核酸コー
ドおよび該参照ヌクレオチド配列を、相同性レベルを決
定するコンピュータプログラムを用いて読み取るステッ
プ、ならびに該コンピュータプログラムを用いて該核酸
コードと該参照ヌクレオチド配列との相同性を決定する
ステップを含む前記方法である。該コンピュータプログ
ラムは、相同性レベルを決定するための多くのコンピュ
ータプログラムのいずれであってもよく、本明細書にお
いて特に列挙したもの、例えば初期パラメータまたは改
変パラメータを用いるBLAST2Nなどが挙げられる。前記
方法は、上記のコンピュータシステムを用いて実行して
もよい。また、前記方法は、配列番号24〜4100および81
78〜36681の上記核酸コードの2、5、10、15、20、25、3
0、または50個をコンピュータプログラムを用いて読み
取り、該核酸コードと参照ヌクレオチド配列との相同性
を決定することにより行ってもよい。
【０４８９】あるいは、上記コンピュータプログラム
は、本発明の核酸コードのヌクレオチド配列を参照核酸
配列と比較して、配列番号24〜4100および8178〜36681
の核酸コードが参照核酸配列と１以上の位置において異
なるかどうかを決定するコンピュータプログラムであっ
てもよい。任意で、このようなプログラムは、参照ポリ
ヌクレオチドまたは配列番号24〜4100および8178〜3668
1の核酸コードのいずれかの配列に関して、挿入、欠失
または置換されたヌクレオチドの長さおよび正体を記録
する。１つの実施形態では、前記コンピュータプログラ
ムは、配列番号24〜4100および8178〜36681の核酸コー
ドのヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列に関して
単一ヌクレオチド多形（SNP）を含有するかどうかを決
定するプログラムであってもよい。この単一ヌクレオチ
ド多形は、単一塩基の置換、挿入、または欠失を含んで
もよい。
【０４９０】本発明の他の態様は、配列番号4101〜8177
のポリペプチドコードと参照ポリペプチド配列との相同
性レベルを決定する方法であって、配列番号4101〜8177
のポリペプチドコードおよび該参照ポリペプチド配列
を、相同性レベルを決定するコンピュータプログラムを
用いて読み取るステップ、ならびに該コンピュータプロ
グラムを用いて該ポリペプチドコードと該参照ポリペプ
チド配列との相同性を決定するステップを含む前記方法
である。
【０４９１】従って、本発明の他の態様は、配列番号24
〜4100および8178〜36681の核酸コードが１以上のヌク
レオチドにおいて参照ヌクレオチド配列と異なるかどう
かを決定する方法であって、該核酸コードおよび該参照
ヌクレオチド配列を、核酸配列間の相違を同定するコン
ピュータプログラムを用いて読み取るステップ、ならび
に該コンピュータプログラムを用いて該核酸コードと該
参照ヌクレオチド配列の相違を同定するステップを含む
前記方法である。いくつかの実施形態では、該コンピュ
ータプログラムは、単一ヌクレオチド多形を同定するプ
ログラムである。該方法は、上記コンピュータシステム
により与えることができる。該方法はまた、配列番号24
〜4100および8178〜36681の前記核酸コードの少なくと
も2、5、10、15、20、25、30、または50個、ならびに前
記参照ヌクレオチド配列を前記コンピュータプログラム
を用いて読み取り、該コンピュータプログラムを用いて
該核酸コードと該参照ヌクレオチド配列との相違を同定
することにより行うこともできる。
【０４９２】他の実施形態では、コンピュータベースの
該システムはさらに、配列番号24〜4100および8178〜36
681の核酸コードのヌクレオチド配列内、または配列番
号4101〜8177のポリペプチドコードのアミノ酸配列内の
特徴を同定するためのアイデンティファイア（Identifi
er）を含んでもよい。
【０４９３】「アイデンティファイア」とは、上述の配
列番号24〜4100および8178〜36681の核酸コードのヌク
レオチド配列内、または配列番号4101〜8177のポリペプ
チドコードのアミノ酸配列内のある特徴を同定する１以
上のプログラムをいう。１つの実施形態では、前記アイ
デンティファイアは、配列番号24〜4100および8178〜36
681のｃＤＮＡコード中のオープンリーディングフレー
ムを同定するプログラムを含んでもよい。
【０４９４】他の実施形態では、上記アイデンティファ
イアは、配列番号4101〜8177のポリペプチドコードの３
次元構造を決定する分子モデリングプログラムを含んで
もよい。いくつかの実施形態では、前記分子モデリング
プログラムは、既知の３次元タンパク質構造中の残基の
構造的環境を示すプロフィールと最もよく適合する標的
配列を同定する（例えば、Eisenbergら、1995年7月25日
に発行された米国特許第5,436,850号を参照された
い）。他の技術では、あるファミリー中のタンパク質の
既知の３次元構造を重ね合わせて、該ファミリー内の構
造的保存領域を規定する。このタンパク質モデリング技
術はまた、相同なタンパク質の既知の３次元構造を用い
て、配列番号4101〜8177のポリペプチドコードの構造を
正確なものに近づける（例えば、Srinivasanら、1996年
9月17日に発行された米国特許第5,557,535号を参照され
たい）。従来の相同性モデリング技術は、プロテアーゼ
および抗体のモデルを作製するために日常的に用いられ
ている（Sowdhaminiら、Protein Engineering 10: 207,
215 (1997)）。目的のタンパク質が鋳型タンパク質と
の配列同一性に乏しいものである場合に、これに匹敵す
る方法を用いて３次元タンパク質モデルを開発すること
もできる。タンパク質は、配列同一性が非常に少ない場
合であっても、類似の３次元構造をとることがある。例
えば、多くのヘリカルサイトカインの３次元構造は、配
列相同性が少ないにもかかわらず、類似の３次元トポロ
ジーをとる。
【０４９５】最近のスレッディング法（threading meth
ods）の開発により、標的と鋳型との構造的関連性が配
列レベルでは検出不可能である多くの場合において、適
切な折り畳みパターンの同定が可能となっている。多重
配列スレッディング（Multiple Sequence Threading，M
ST）を用いて折り畳み認識を行うハイブリッド法では、
距離幾何学プログラムDRAGONによりスレッディング出力
から構造的等価性を導き出して低解像度モデルを構築
し、QUANTAなどの分子モデリングパッケージを用いて完
全原子表示を構築する。
【０４９６】この３ステップの方法に従って、多重整列
配列の１以上の３Ｄ構造上へのスレッディングを同時に
行うことのできる新規折り畳み認識アルゴリズムMSTを
用いて鋳型候補をまず同定する。第２のステップでは、
MST出力から得られる構造的等価性を残基間距離制約に
変換し、２次構造予測から得られる補助情報と共に距離
幾何学プログラムDRAGONに送る。該プログラムはバイア
スのない様式で該制約を組み合わせ、大量の低解像度モ
デル確定を迅速に生成する。第３のステップでは、これ
らの低解像度モデル確定を完全原子モデルに変換し、分
子モデリングパッケージQUANTAを用いるエネルギー最小
化に供する（例えば、Aszodiら、protein:Structure, F
unction, and Genetics, 追補1:38-42 (1997)を参照さ
れたい）。
【０４９７】次いで、分子モデリング分析の結果を合理
的なドラッグ設計技術に用いて、配列番号4101〜8177の
ポリペプチドコードの活性をモジュレートする薬剤を同
定してもよい。
【０４９８】従って、本発明の他の態様は、配列番号24
〜4100および8178〜36681の核酸コード内、または配列
番号4101〜8177のポリペプチドコード内の特徴を同定す
る方法であって、該核酸コードまたは該ポリペプチドコ
ードを、これらに内在する特徴を同定するコンピュータ
プログラムを用いて読み取り、該コンピュータプログラ
ムを用いて該核酸コード内または該ポリペプチドコード
内の特徴を同定することを含む前記方法である。１つの
実施形態では、コンピュータプログラムは、オープンリ
ーディングフレームを同定するコンピュータプログラム
を含む。さらなる実施形態では、前記コンピュータプロ
グラムは、ポリペプチド配列中の構造モチーフを同定す
る。他の実施形態では、前記コンピュータプログラム
は、分子モデリングプログラムを含む。前記方法は、配
列番号24〜4100および8178〜36681の核酸コード、また
は配列番号4101〜8177のポリペプチドコードの、単一配
列または少なくとも2、5、10、15、20、25、30、もしく
は50個を、前記コンピュータプログラムを用いて読み取
り、該コンピュータプログラムを用いて該核酸コードま
たは該ポリペプチドコード内の特徴を同定することによ
り行うことができる。
【０４９９】配列番号24〜4100および8178〜36681の核
酸コード、または配列番号4101〜8177のポリペプチドコ
ードは、種々のフォーマットの種々のデータプロセッサ
プログラムにおいて記憶させ、操作することができる。
例えば、配列番号24〜4100および8178〜36681の核酸コ
ード、または配列番号4101〜8177のポリペプチドコード
は、MicrosoftWORDもしくはWORDPERFECTなどのワードプ
ロセッシングファイルにおいてテキストとして記憶させ
るか、またはDB2、SYBASE、もしくはORACLEなどの当業
者に公知の種々のデータベースプログラムにおいてASCI
Iファイルとして記憶させることができる。さらに、シ
ークエンスコンペアラ、アイデンティファイア、または
配列番号24〜4100および8178〜36681の核酸コード、も
しくは配列番号4101〜8177のポリペプチドコードと比較
すべき参照ヌクレオチドもしくはポリペプチド配列の供
給源として、多くのコンピュータプログラムおよびデー
タベースを利用することができる。以下のリストは本発
明を限定するためのものではなく、配列番号24〜4100お
よび8178〜36681の核酸コード、または配列番号4101〜8
177のポリペプチドコードに対して有用なプログラムお
よびデータベースの案内を提供するものである。用いる
ことのできるプログラムおよびデータベースとしては、
MacPattern (EMBL)、DiscoveryBase (Molecular Applic
ations Group)、GeneMine (Molecular Applications Gr
oup)、Look (Molecular ApplicationsGroup)、MacLook
(Molecular Applications Group)、BLASTおよびBLAST2
(NCBI)、BLASTNおよびBLASTX（Altschulら、J. Mol. Bi
ol. 215: 403 (1990)）、FASTA（PearsonおよびLipma
n、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444 (1988)）、
FASTDB（Brutlagら、Comp. App. Biosci. 6: 237-245
(1990)）、Catalyst (Molecular Simulations Inc.)、C
atalyst/SHAPE (Molecular Simulations Inc.)、Cerius
2.DBAccess (Molecular Simulations Inc.)、HypoGen
(Molecular Simulations Inc.)、Insight II (Molecula
r Simulations Inc.)、Discover (MolecularSimulation
s Inc.)、CHARMm (Molecular Simulations Inc.)、Feli
x (MolecularSimulations Inc.)、DelPhi (Molecular S
imulations Inc.)、QuanteMM (Molecular Simulations
Inc.)、Homology (Molecular Simulations Inc.)、Mode
ler (Molecular Simulations Inc.)、ISIS (Molecular
Simulations Inc.)、Quanta/Protein Design (Molecula
r Simulations Inc.)、WebLab (Molecular Simulations
Inc.)、WebLab Diversity Explorer (Molecular Simul
ations Inc.)、Gene Explorer (Molecular Simulations
Inc.)、SeqFold (Molecular Simulations Inc.)、the
EMBL/Swissprotein database、the MDL Available Chem
icals Directorydatabase、the MDL Drug Data Report
data base、the Comprehensive Medicinal Chemistry d
atabase、Derwents's World Drug Index database、the
BioByteMasterFile database、the GenBank databas
e、およびthe Genseqn databaseが挙げられるが、これ
らに限定されない。本明細書の開示によれば、当業者に
は他の多くのプログラムおよびデータベースが明らかと
なるであろう。
【０５００】上記プログラムを用いて検出することので
きるモチーフとしては、ロイシンジッパーをコードする
配列、ヘリックス・ターン・ヘリックスモチーフ、グリ
コシル化部位、ユビキチン化部位、α-ヘリックスおよ
びβ-シート、コードされるタンパク質の分泌を指令す
るシグナルペプチドをコードするシグナル配列、ホメオ
ボックスなどの転写調節に関与する配列、酸性ストレッ
チ、酵素活性部位、基質結合部位、ならびに酵素開裂部
位が挙げられる。
【０５０１】実施例６１ 核酸の作製方法 本発明はまた、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の断
片、ＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメント、または
ＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメントの断片を作製
する方法を含む。該方法は、ヌクレオチドどうしを順次
結合させて、上記配列を有する核酸を製造することを含
む。種々の核酸合成法が当業者に公知となっている。
【０５０２】これらの方法のうちの多くでは、合成は固
体支持体上で行う。このような方法としては、所望のオ
リゴヌクレオチドの3'末端塩基を不溶性担体上に固定化
する3'ホスホラミダイト法が挙げられる。付加すべきヌ
クレオチド塩基の5'ヒドロキシルを保護し、3'ヒドロキ
シルを活性化して固定化ヌクレオチド塩基とカップリン
グさせる。新たな固定化ヌクレオチド化合物の脱保護及
び該サイクルの繰り返しにより、所望のポリヌクレオチ
ドが生成する。あるいは、ポリヌクレオチドは、米国特
許第5,049,656号（この開示内容は参照により本明細書
に組み入れる）の記載に従って調製してもよい。いくつ
かの実施形態では、上述のようにして調製されるいくつ
かのポリヌクレオチドを互いに連結して、所望の配列を
有する、より長いポリヌクレオチドを生成させる。
【０５０３】実施例６２ ポリペプチドの作製方法 本発明はまた、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の断
片、ＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメント、または
ＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメントの断片により
コードされるポリヌクレオチドを作製する方法、ならび
にＥＳＴ関連ポリペプチド、ＥＳＴ関連ポリペプチドの
断片、ＥＳＴ関連ポリペプチドのポジショナルセグメン
ト、またはＥＳＴ関連ポリペプチドの断片を作製する方
法を含む。該方法は、アミノ酸どうしを順次結合させ
て、上記配列を有する核ポリペプチドを製造することを
含む。いくつかの実施形態では、これらの方法により作
製されるポリペプチドは１５０アミノ酸以下の長さであ
る。他の実施形態では、これらの方法により作製される
ポリペプチドは１２０アミノ酸以下の長さである。
【０５０４】種々のポリペプチド作製法が当業者に公知
となっており、カルボキシル末端アミノ酸をポリビニル
ベンゼンその他の適切な樹脂に結合させる方法が挙げら
れる。付加すべきアミノ酸は、そのアミノ部分およびあ
らゆる側鎖反応性基上に保護基を有し、そのカルボキシ
ル部分のみが反応可能である。カルボキシル基はカルボ
ジイミドその他の活性化剤を用いて活性化され、固定化
アミノ酸にカップリングすることができる。保護基を除
去した後に、該サイクルを繰り返し、所望の配列を有す
るポリペプチドを生成させる。あるいは、米国特許第5,
049,656号（その開示内容は参照により本明細書に組み
入れる）に記載の方法を用いてもよい。
【０５０５】上記のように、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関
連核酸の断片、ＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメン
ト、またはＥＳＴ関連核酸のポジショナルセグメントの
断片は、さまざまな目的のために使用することができ
る。該ポリヌクレオチドを使用して、分析、特徴付けま
たは治療用途；分泌ポリペプチドもしくはキメラポリペ
プチドの生産、抗体生産のための組換えタンパク質を；
対応するタンパク質を（構成的かまたは組織分化または
発生の特定の段階かまたは疾患状態のいずれかにおい
て）好適に発現させる組織のためのマーカーとして；サ
ザンゲル上の分子量マーカーとして；染色体を同定する
かまたは関連遺伝子の位置をマッピングするための染色
体マーカーまたはタグ（標識される場合）として；患者
の内在性ＤＮＡを比較して、潜在的遺伝子異常を同定す
るために；ハイブリダイズし、それにより新規の関連Ｄ
ＮＡ配列を発見するためのプローブとして；遺伝子フィ
ンガープリントのためのＰＣＲプライマーを得るための
情報の供給源として；「遺伝子チップ」または他の支持
体に付着するためのオリゴマーを選択し、作製するため
に（発現パターンを調べることを含む）；ＤＮＡ免疫化
技術を用いて、抗タンパク質抗体を惹起するために；お
よび抗ＤＮＡ抗体を惹起するかまたはもう１つの免疫応
答を引き出すための抗原として、発現させることができ
る。ポリヌクレオチドが（例えば、レセプター−リガン
ド相互作用などにおいて）別のタンパク質またはポリペ
プチドに結合するかまたは潜在的に結合するタンパク質
またはポリペプチドをコードする場合には、該ポリヌク
レオチドを、結合が生じる他のタンパク質またはポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドを同定するかまた
は結合相互作用の阻害剤を同定するために、相互作用ト
ラップアッセイ（例えば、Gyurisら、Cell 75:791-803,
1993などに記載のアッセイであって、該参考文献の開
示内容は、参照により本明細書に組み入れる）に使用す
ることができる。
【０５０６】本発明により提供されるタンパク質または
ポリペプチドは、ハイスループットスクリーニングのた
めの複数のタンパク質のパネルを含む生物学的活性を決
定するためのアッセイにおいて；抗体を惹起するかまた
は別の免疫応答を引き出すために；生物学的液体におけ
るタンパク質（またはそのレセプター）のレベルを定量
的に決定するために設計されたアッセイにおける試薬
（標識された試薬を含む）；対応するタンパク質を（構
成的かまたは組織分化または発生の特定の段階かまたは
疾患状態のいずれかにおいて）好適に発現させる組織用
のマーカーとして；そして、もちろん、相関関係にある
レセプターまたはリガンドを単離するために、同様に使
用することができる。タンパク質またはポリペプチドが
もう１つのタンパク質またはポリペプチドに結合するか
または潜在的に結合する場合（例えば、受容体-リガン
ド相互作用のように）、該タンパク質を、結合が生じる
他のタンパク質を同定するかまたは結合相互作用の阻害
剤を同定するために使用することができる。これらの結
合相互作用に関与するタンパク質またはポリペプチド
は、ペプチドまたは小分子阻害剤または結合相互作用の
アゴニストをスクリーニングするためにも使用すること
ができる。
【０５０７】これらの研究有用性のいくつかまたは全て
は、研究用製品としての商品される試薬レベルまたはキ
ット形態にまで開発することが可能である。
【０５０８】上記に列挙された用途を達成するための方
法は当業者に周知である。そのような方法を開示してい
る参考文献としては、Molecular Cloning;A Laboratory
Manual、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss, Sambrook, J., E.F. FritchおよびManiatis編、198
9、ならびにMethods in Enzymology;Guide to Molecula
r Cloning Techniques, Academic Press, Berger, S.L.
およびA.R. Kimmel編、1987が挙げられるが、これらに
限定されない。
【０５０９】本発明のポリヌクレオチドおよびタンパク
質もしくはポリペプチドを栄養供給源または補助物とし
て使用することもできる。そのような使用としては、タ
ンパク質またはアミノ酸補助物としての使用、炭素源と
しての使用、窒素源としての使用および炭水化物源とし
ての使用が挙げられるが、これらに限定されない。その
ような場合、本発明のタンパク質またはポリヌクレオチ
ドを特定の生物の食物に添加することができ、または個
別の固体または液体調製物として、散剤、丸剤、溶液、
懸濁液またはカプセルの剤形などで投与することができ
る。微生物の場合、本発明のタンパク質またはポリヌク
レオチドを、微生物が培養される培地に添加することが
できる。
【０５１０】本発明を特定の好適な実施態様の形態で説
明してきたが、本明細書の開示内容から当業者に明らか
である他の実施態様も本発明の範囲内にある。従って、
本発明の範囲は、添付の請求の範囲を参考にすることに
よってのみ規定されることを意図している。本明細書に
引用された全ての文書は、その全体を参照により本明細
書に組み入れる。
【０５１１】
【表１】
【他／】
【他／】
【他／】
【０５１２】
【表２】
【他／】
【他／】
【他／】
【他／】
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【他／】 【他／】
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【他／】
【他／】
【他／】
【他／】
【他／】
【他／】
【他／】
【他／】
【他／】
【他／】
【０５１３】
【表３】
【０５１４】
【配列表】
配列表は公開・登録公報長大データＣＤ−ＲＯＭ「１３
（２００１）−００１（００１）」を参照
【図面の簡単な説明】
【図１】コンセンサス・コンティグ化ESTを得るための
コンピュータ解析法をまとめたものである。
【図２】全ヒトSwissProtタンパク質の43アミノ末端ア
ミノ酸の分析であり、本明細書中に記載のシグナルペプ
チドを同定するための技術を用いて偽陽性および偽陰性
の頻度を決定している。
【図３】伸長cDNAを作製するための方法を示す。
【図４】単離したプロモーターの模式的説明およびそれ
らを対応する５‘タグと共にアセンブリーする方法を示
す。
【図５】上記プロモーターのそれぞれに存在する転写因
子結合部位を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ ５Ｂ０７５ 5/10 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 5/00 Ａ // Ｇ０６Ｆ 17/30 Ｇ０６Ｆ 15/40 ３７０Ｆ (72)発明者 ジャン−イヴ ジョルダン フランス国 75018 パリ，ル ドュエス ム，12 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA19 AA20 BA01 BA21 BA53 BA80 CA04 CA07 CA09 CA12 DA02 DA05 DA12 EA04 FA02 FA13 FA18 GA03 HA03 HA12 HA17 HA19 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ03 QQ08 QQ42 QQ79 QQ91 QR32 QR48 QR51 QR56 QR62 QR77 QR80 QS03 QS24 QS25 QS33 QS34 QS39 QX07 4B064 AG01 AG02 AG13 AG27 CA10 CA19 CA20 DA01 DA13 4B065 AA01X AA72X AA90X AA92X AA93Y AB01 AB05 AC14 AC15 BA02 BA08 CA24 CA25 CA44 CA46 4H045 AA10 AA11 AA20 CA40 DA01 DA45 DA75 DA76 EA22 EA24 EA26 EA50 FA33 FA57 FA72 FA73 FA74 5B075 ND03 ND20 ND34 UU19

Claims (60)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号24〜4100および8178〜36681の
    配列、および配列番号24〜4100および8178〜36681の配
    列に相補的な配列からなる群から選択される配列を含
    む、精製された核酸。
  2. 【請求項２】 配列番号24〜4100および8178〜36681の
    配列、および配列番号24〜4100および8178〜36681の配
    列に相補的な配列からなる群から選択される配列の少な
    くとも10個の連続したヌクレオチドを含む、精製された
    核酸。
  3. 【請求項３】 配列番号24〜4100および8178〜36681の
    配列、および配列番号24〜4100および8178〜36681の配
    列に相補的な配列からなる群から選択される配列の少な
    くとも15個の連続したヌクレオチドを含む、精製された
    核酸。
  4. 【請求項４】 配列番号24〜4100からなる群から選択さ
    れる配列のコード配列を含む、精製された核酸。
  5. 【請求項５】 配列番号3721〜3811からなる群から選択
    される配列の全コード配列を含む精製された核酸であっ
    て、該全コード配列がシグナルペプチドをコードする配
    列と成熟タンパク質をコードする配列を含む、上記核
    酸。
  6. 【請求項６】 成熟タンパク質をコードする配列番号37
    21〜3811からなる群から選択される配列の連続スパンを
    含む、精製された核酸。
  7. 【請求項７】 シグナルペプチドをコードする配列番号
    24〜652および3721〜3811からなる群から選択される配
    列の連続スパンを含む、精製された核酸。
  8. 【請求項８】 配列番号4101〜8177の配列からなる群か
    ら選択される配列を含むポリペプチドをコードする、精
    製された核酸。
  9. 【請求項９】 配列番号7798〜7888の配列からなる群か
    ら選択される配列を含むポリペプチドをコードする、精
    製された核酸。
  10. 【請求項１０】 配列番号7798〜7888の配列からなる群
    から選択される配列に含まれる成熟タンパク質を含むポ
    リペプチドをコードする、精製された核酸。
  11. 【請求項１１】 配列番号4101〜4729および配列番号77
    98〜7888の配列からなる群から選択される配列に含まれ
    るシグナルペプチドを含むポリペプチドをコードする、
    精製された核酸。
  12. 【請求項１２】 配列番号24〜4100および8178〜36681
    の配列、および配列番号24〜4100および8178〜36681の
    配列に相補的な配列からなる群から選択される配列にス
    トリンジェントな条件下でハイブリダイズする、鎖長が
    少なくとも15ヌクレオチドの精製された核酸。
  13. 【請求項１３】 配列番号4101〜8177の配列からなる群
    から選択される配列を含む、精製または単離されたポリ
    ペプチド。
  14. 【請求項１４】 配列番号7798〜7888からなる群から選
    択される配列を含む、精製または単離されたポリペプチ
    ド。
  15. 【請求項１５】 配列番号7798〜7888からなる群から選
    択されるポリペプチドの成熟タンパク質を含む、精製ま
    たは単離されたポリペプチド。
  16. 【請求項１６】 配列番号4101-4729および7798〜7888
    のポリペプチドからなる群から選択される配列のシグナ
    ルペプチドを含む、精製または単離されたポリペプチ
    ド。
  17. 【請求項１７】 配列番号4101-8177の配列からなる群
    から選択される配列の少なくとも10個の連続したアミノ
    酸を含む、精製または単離されたポリペプチド。
  18. 【請求項１８】 cDNAを作製する方法であって、 ヒト細胞由来のmRNA分子の集合体に、配列番号24〜4100
    および8178〜36681に相補的な配列からなる群から選択
    される配列の少なくとも15個の連続したヌクレオチドを
    含むプライマーを接触させ、 該プライマーを、該タンパク質をコードする該集合体中
    のmRNAにハイブリダイズさせ、 該ハイブリダイズしたプライマーを逆転写して、該mRNA
    から第１cDNA鎖を作製し、 第１cDNA鎖に相補的な第２cDNA鎖を作製し、そして該タ
    ンパク質をコードする、第１cDNA鎖と第２cDNA鎖からな
    る得られたcDNAを単離する、各ステップを含む上記方
    法。
  19. 【請求項１９】 請求項１８記載の方法により得られ
    る、精製されたcDNA。
  20. 【請求項２０】 前記cDNAがヒトポリペプチドの少なく
    とも一部をコードする、請求項１９記載のcDNA。
  21. 【請求項２１】 cDNAを作製する方法であって、 配列番号24〜4100および8178〜36681の配列からなる群
    から選択される配列を含むcDNAを取得し、 該cDNAに、配列番号24〜4100および8178〜36681の配列
    および配列番号24〜4100および8178〜36681に相補的な
    配列からなる群から選択される配列の少なくとも15個の
    連続したヌクレオチドを含む検出可能なプローブを、該
    プローブが該cDNAにハイブリダイズする条件下で接触さ
    せ、 該検出可能なプローブにハイブリダイズするcDNAを同定
    し、そして該プローブにハイブリダイズする該cDNAを単
    離する、各ステップを含む上記方法。
  22. 【請求項２２】 請求項２１記載の方法により得られ
    る、精製されたcDNA。
  23. 【請求項２３】 前記cDNAがヒトポリペプチドの少なく
    とも一部をコードする、請求項２２記載のcDNA。
  24. 【請求項２４】 cDNAを作製する方法であって、 ヒト細胞由来のmRNA分子の集合体に、該mRNAのポリAテ
    イルにハイブリダイズできる第１プライマーを接触さ
    せ、 該第１プライマーを該ポリAテイルにハイブリダイズさ
    せ、 該mRNAを逆転写して第１cDNA鎖を作製し、 配列番号24〜4100および8178〜36681の配列からなる群
    から選択される配列の少なくとも15個の連続したヌクレ
    オチドを含む少なくとも１つのプライマーを用いて、第
    １cDNA鎖に相補的な第２cDNA鎖を作製し、そして第１cD
    NA鎖と第２cDNA鎖からなる、得られたcDNAを単離する、
    各ステップを含む上記方法。
  25. 【請求項２５】 請求項２４記載の方法により得られ
    る、精製されたcDNA。
  26. 【請求項２６】 前記cDNAがヒトポリペプチドの少なく
    とも一部をコードする、請求項２５記載のcDNA。
  27. 【請求項２７】 第２cDNA鎖の作製が、 第１cDNA鎖に第１のプライマー対を接触させ（ここで、
    第１のプライマー対は、配列番号24〜4100および8178〜
    36681からなる群から選択される配列の少なくとも15個
    の連続したヌクレオチドを含む第２プライマーおよび第
    １プライマーの配列内に含まれる配列を有する第３プラ
    イマーを含む）、 第１のプライマー対により第１のポリメラーゼ連鎖反応
    を行って第１PCR産物を生成させ、 第１PCR産物に第２のプライマー対を接触させ（ここ
    で、第２のプライマー対は第４プライマーおよび第５プ
    ライマーを含み、ここで、第４プライマーは配列番号24
    〜4100および8178〜36681からなる群から選択される該
    配列の少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含み、
    そして第４および第５のプライマーは第１PCR産物内の
    配列にハイブリダイズ可能である）、そして第２のポリ
    メラーゼ連鎖反応を行い、それにより第２PCR産物を生
    成させる、ことにより行われる、請求項２４記載の方
    法。
  28. 【請求項２８】 請求項２７記載の方法により得られ
    る、精製されたcDNA。
  29. 【請求項２９】 前記cDNAがヒトポリペプチドの少なく
    とも一部をコードする、請求項２８記載のcDNA。
  30. 【請求項３０】 第２cDNA鎖の作製が、 第１cDNA鎖に、配列番号24〜4100および8178〜36681か
    らなる群から選択される配列の少なくとも15個の連続し
    たヌクレオチドを含む第２プライマーを接触させ、 第２プライマーを第１cDNA鎖にハイブリダイズさせ、そ
    してハイブリダイズした第２プライマーを伸長させて第
    ２cDNA鎖を生成させる、ことにより行われる、請求項２
    ４記載の方法。
  31. 【請求項３１】 請求項３０記載の方法により得られ
    る、精製されたcDNA。
  32. 【請求項３２】 前記cDNAがヒトポリペプチドの少なく
    とも一部をコードする、請求項２８記載のcDNA。
  33. 【請求項３３】 ポリペプチドを生産する方法であっ
    て、 配列番号24〜4100からなる群から選択される配列を含む
    核酸によりコードされるポリペプチドをコードするcDNA
    または配列番号24〜4100からなる群から選択される配列
    によりコードされるポリペプチドの少なくとも10個の連
    続したアミノ酸を含むポリペプチドをコードするcDNAを
    取得し、 該cDNAがプロモーターに機能しうる形で連結されるよう
    に発現ベクターに挿入し、 該発現ベクターを宿主細胞内に導入して、該宿主細胞に
    該cDNAによりコードされるタンパク質を産生させ、そし
    て該タンパク質を単離する、各ステップを含む上記方
    法。
  34. 【請求項３４】 請求項３３記載の方法により得られ
    る、単離されたタンパク質。
  35. 【請求項３５】 プロモーターDNAを取得する方法であ
    って、 配列番号24〜4100および8178〜36681の配列および配列
    番号24〜4100および8178〜36681の配列に相補的な配列
    からなる群から選択される配列を含む核酸の上流に位置
    するゲノムDNAを取得し、 該ゲノムDNAをスクリーニングして、転写開始を指令す
    ることができるプロモーターを同定し、そして同定した
    該プロモーターを含むDNAを単離する、各ステップを含
    む上記方法。
  36. 【請求項３６】 前記取得ステップが、配列番号24〜41
    00および8178〜36681の配列および配列番号24〜4100お
    よび8178〜36681の配列に相補的な配列からなる群から
    選択される配列を含むゲノムDNAからの染色体歩行を含
    む、請求項３５記載の方法。
  37. 【請求項３７】 前記スクリーニングステップが、配列
    番号24〜4100および8178〜36681の配列および配列番号2
    4〜4100および8178〜36681の配列に相補的な配列からな
    る群から選択される配列の上流に位置するゲノムDNAを
    プロモーターレポーターベクターに挿入することを含
    む、請求項３６記載の方法。
  38. 【請求項３８】 前記スクリーニングステップが、配列
    番号24〜4100および8178〜36681の配列および配列番号2
    4〜4100および8178〜36681の配列に相補的な配列からな
    る群から選択される配列の上流に位置するゲノムDNA中
    の、転写因子結合部位かまたは転写開始部位にあたるモ
    チーフを同定することを含む、請求項３６記載の方法。
  39. 【請求項３９】 請求項３４記載の方法によって得られ
    る、単離されたプロモーター。
  40. 【請求項４０】 個々のESTまたは長さが少なくとも15
    ヌクレオチドのそのフラグメントのアレイであって、そ
    の改良点が、該アレイ中に、配列番号24〜4100および81
    78〜36681の配列、配列番号24〜4100および8178〜36681
    の配列に相補的な配列、および該配列の少なくとも15個
    の連続したヌクレオチドを含むフラグメントからなる群
    から選択される少なくとも１つの配列を加えることから
    なる、上記アレイ。
  41. 【請求項４１】 その中に、配列番号24〜4100および81
    78〜36681の配列、配列番号24〜4100および8178〜36681
    の配列に相補的な配列、および該配列の少なくとも15個
    の連続したヌクレオチドを含むフラグメントからなる群
    から選択される配列を少なくとも２つ含む、請求項４０
    記載のアレイ。
  42. 【請求項４２】 その中に、配列番号24〜4100および81
    78〜36681の配列、配列番号24〜4100および8178〜36681
    の配列に相補的な配列、および該配列の少なくとも15個
    の連続したヌクレオチドを含むフラグメントからなる群
    から選択される配列を少なくとも５つ含む、請求項４０
    記載のアレイ。
  43. 【請求項４３】 インサート核酸とバックボーン核酸を
    含む組換え核酸の濃縮集団であって、該集団中のインサ
    ート核酸の少なくとも5%が配列番号24〜4100および8178
    〜36681の配列および配列番号24〜4100および8178〜366
    81の配列に相補的な配列からなる群から選択される配列
    を含む、上記濃縮集団。
  44. 【請求項４４】 配列番号4101〜8177からなる群から選
    択される配列を含むポリペプチドに特異的に結合するこ
    とができる、精製または単離された抗体。
  45. 【請求項４５】 配列番号4101〜8177からなる群から選
    択される配列の少なくとも10個の連続したアミノ酸を含
    むポリペプチドに特異的に結合することができる、精製
    または単離された抗体。
  46. 【請求項４６】 配列番号4101〜8177のいずれかの少な
    くとも８アミノ酸の連続スパンを含むポリペプチドのエ
    ピトープ含有フラグメントに特異的に結合することがで
    きる、ポリクローナルまたはモノクローナルの抗体組成
    物。
  47. 【請求項４７】 配列番号24〜4100および8178〜36681
    の核酸コードおよび配列番号4101〜8177のポリペプチド
    コードからなる群から選択される配列を記憶させたコン
    ピュータ読取り可能媒体。
  48. 【請求項４８】 プロセッサとデータ記憶装置を含むコ
    ンピュータシステムであって、該データ記憶装置がそこ
    に配列番号24〜4100および8178〜36681の核酸コードお
    よび配列番号4101〜8177のポリペプチドコードからなる
    群から選択される配列を記憶している、上記コンピュー
    タシステム。
  49. 【請求項４９】 シークエンスコンペアラおよび参照配
    列を記憶しているデータ記憶装置をさらに含む、請求項
    ４８記載のコンピュータシステム。
  50. 【請求項５０】 前記シークエンスコンペアラが多型性
    を示すコンピュータプログラムを含む、請求項４９記載
    のコンピュータシステム。
  51. 【請求項５１】 前記配列中の特徴を識別するアイデン
    ティファイアをさらに含む、請求項４８記載のコンピュ
    ータシステム。
  52. 【請求項５２】 配列番号24〜4100および8178〜36681
    の核酸コードおよび配列番号4101〜8177のポリペプチド
    コードからなる群から選択される第１配列と参照配列と
    を比較する方法であって、 配列を比較するコンピュータプログラムを使用して、第
    １配列と参照配列を読取り、そして該コンピュータプロ
    グラムにより、第１配列と参照配列間の差異を調べる、
    各ステップを含む上記方法。
  53. 【請求項５３】 第１配列と参照配列間の差異を調べる
    ステップが多型性を識別することを含む、請求項５２記
    載の方法。
  54. 【請求項５４】 配列番号24〜4100および8178〜36681
    の核酸コードおよび配列番号4101〜8177のポリペプチド
    コードからなる群から選択される配列中の特徴を識別す
    る方法であって、 配列の特徴を識別するコンピュータプログラムを用いて
    該配列を読取り、そして該コンピュータプログラムによ
    り該配列の特徴を識別する、各ステップを含む上記方
    法。
  55. 【請求項５５】 請求項１〜１２のいずれか１項に記載
    の核酸を含有するベクター。
  56. 【請求項５６】 請求項５５記載の核酸を含有する宿主
    細胞。
  57. 【請求項５７】 請求項１〜１２のいずれか１項に記載
    の核酸を生産する方法であって、 該核酸が各宿主細胞内に多コピー数で存在するように該
    宿主細胞に該核酸を導入し、そして該宿主細胞から該核
    酸を単離する、各ステップを含む上記方法。
  58. 【請求項５８】 請求項１〜１２のいずれか１項に記載
    の核酸中のヌクレオチドを順次連結するステップを含
    む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の核酸の作製
    方法。
  59. 【請求項５９】 請求項１３〜１７のいずれか１項に記
    載のポリペプチド中のアミノ酸を順次連結するステップ
    を含む、長さが150アミノ酸またはそれ以下である請求
    項１３〜１７のいずれか１項に記載のポリペプチドの作
    製方法。
  60. 【請求項６０】 請求項１３〜１７のいずれか１項に記
    載のポリペプチド中のアミノ酸を順次連結するステップ
    を含む、長さが120アミノ酸またはそれ以下である請求
    項１３〜１７のいずれか１項に記載のポリペプチドの作
    製方法。
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