WO2004111234A1 - 新規蛋白質 - Google Patents

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WO2004111234A1
WO2004111234A1 PCT/JP2004/008699 JP2004008699W WO2004111234A1 WO 2004111234 A1 WO2004111234 A1 WO 2004111234A1 JP 2004008699 W JP2004008699 W JP 2004008699W WO 2004111234 A1 WO2004111234 A1 WO 2004111234A1
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WO
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cells
dna
protein
metabolic
amino acid
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Application number
PCT/JP2004/008699
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English (en)
French (fr)
Inventor
Iichirou Shimomura
Yukio Yamada
Original Assignee
Takeda Pharmaceutical Company Limited
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Publication date
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Priority to US10/561,144 priority patent/US7700361B2/en
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a novel secreted or membrane protein specifically expressed in skeletal muscle, a nucleic acid encoding the same, an antibody thereto, and uses thereof.
  • adipocytic force-in various bioactive proteins secreted from adipose tissue
  • adipocytic force-in various bioactive proteins secreted from adipose tissue
  • adipocytic force-in various bioactive proteins secreted from adipose tissue
  • adipocytic force-in various bioactive proteins secreted from adipose tissue
  • adipocytic force-in various bioactive proteins secreted from adipose tissue
  • adipocytic force-in various bioactive proteins secreted from adipose tissue
  • Non-Patent Document 3 Non-Patent Document 3
  • PAI-1 plasminogen activator inhibitor 1
  • Fat accumulation during obesity also occurs in the liver, muscles, viscera, blood vessel walls, etc. It causes metabolic abnormalities in organs, causing insulin resistance, diabetes, hyperlipidemia, and high blood pressure. These ⁇ s are linked to each other via endocrine factors, and are thought to perform complex and sophisticated metabolic regulation. Therefore, it is presumed that endocrine factors having the same effect as adipocytokines are produced and secreted from muscle, S pancreas, small intestine, blood vessels, etc. Absent.
  • Non-Patent Document 1 Arita et al., "Pyochemical 'and' Piofegical 'Research. Commun. (Biochem. Biophys. Res. Commun.)", (USA), 1999, Vol. 257, p. 79-83.
  • Non-Patent Document 2 Hotta et al., "Diabetes”, (USA),
  • Non-Patent Document 3 Steppan et al., "Nature”, (UK), 2001, Vol. 409, pp. 307-312
  • Non-Patent Document 4 Shimomura et al., "Natya Medisin (Nat. Med.)", (USA), 1996, Volume 2, pp. 800-803.
  • the present invention provides useful tools for the prevention and treatment of sugar- and lipid-metabolism-related diseases, including so-called lifestyle-related diseases such as obesity, diabetes, and arteriosclerosis, and the usefulness of these diseases.
  • An object of the present invention is to identify a novel muscle-derived secretory or membrane protein that can be a diagnostic marker and a gene encoding the same.
  • the present invention provides a recombinant vector containing the gene, a transformant carrying the recombinant vector, a method for producing the secretory or membrane protein by culturing the transformant, the secretory or membrane protein, Antibodies, compounds that alter the expression level of the secretory or membrane protein, methods for determining substances (receptors or ligands) that can interact with the secretory or membrane protein, Screening methods for compounds that alter binding (antagonists, agonists)-kits therefor, binding of the substance obtained using the screening method or screening kit to the secretory or membrane protein To provide a compound that alters the sex, a compound that alters the binding property of the substance to the secretory or membrane protein, or a medicament containing a compound that alters the expression level of the secretory or membrane protein. Aim.
  • the present inventors have prepared a cDNA library derived from mouse skeletal muscle and used the cDNA as a constitutively active thrombopoietin receptor in which the N-terminal extracellular region has been deleted. (The serine at position 498 has been replaced with asparagine.)
  • a retrovirus expression library integrated on the 5th side of the cDNA was constructed, and a high titer retrovirus was recovered from the packaging cells and a mouse pro-B cell line (Ba / F3) and cells that retained the growth '14 were selected. Genomic DNA was extracted from the selected cells, and the introduced cDNA fragment from mouse skeletal muscle was subcloned using PCR, and its nucleotide sequence was determined.
  • cDNA clones containing the full length of the protein coding region were isolated from mouse, rat, and human skeletal muscle cDNAs, and their nucleotide sequences were determined. Do you get it.
  • the present inventors have conducted further research based on these findings, and as a result, have completed the present invention.
  • nucleic acid comprising a base sequence encoding the protein according to the above [1], [5] The nucleic acid according to the above [4], which contains a base sequence of base number 88 or later in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 (however, when the nucleic acid is RNA, a symbol in the base sequence The base indicated by t is replaced with peridine),
  • nucleic acid comprising a base sequence encoding a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4, or a part thereof;
  • a method for producing the protein or a salt thereof which comprises culturing the transformant according to the above [8] to produce the protein or a salt thereof according to the above [1].
  • a medicament comprising the protein according to [1] or the partial peptide according to [3] or a salt thereof,
  • a pharmaceutical comprising the nucleic acid according to the above [4],
  • SEQ ID NO: 2 or a base sequence complementary to a base sequence encoding a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by 2 or 4, or a part thereof
  • [35] A method for preventing a disease associated with skeletal muscle cell differentiation and / or metabolic abnormality characterized by using the nucleic acid according to the above [4].
  • a kit for screening and treating a disease associated with skeletal muscle cell differentiation and / or metabolic abnormality which comprises the nucleic acid according to [4].
  • An agent for preventing or treating a disease involving skeletal muscle cell division and metabolism or a metabolic abnormality comprising the modulator of the protein or salt thereof according to the above [1].
  • the protein encoded by the skeletal muscle-derived gene of the present invention is a secretory or membrane protein that is specifically expressed in skeletal muscle cells in the feeding state, diabetes, and obesity state, and functions in skeletal muscle cell differentiation and glucose / lipid metabolism. It has effects such as adjusting the BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • Figure 1 shows the tissue distribution of expression of mouse SS169 gene [brain from the left, heart, lung, kidney, spleen, testis, brown adipose tissue, white adipose tissue, to indicate liver, muscle and intestine] 0 ordinate Indicates an arbitrary unit.
  • FIG. 2 shows the expression of the SS169 gene in the skeletal muscle of a diabetes model mouse (KKAy, db / db) and a normal mouse (C57BL / 6).
  • the vertical axis indicates an arbitrary unit. * Indicates p ⁇ 0.01 and ** indicates p ⁇ 0.001.
  • FIG. 3 shows the expression of the SS169 gene in mouse skeletal muscle during free-feeding, fasting, and re-feeding.
  • the vertical axis indicates an arbitrary unit.
  • Figure 4 shows the tissue distribution of rat SS169 gene expression [from left, showing brain, lung, heart, liver, kidney, spleen, intestine, muscle, white adipose tissue, brown adipose tissue and testis].
  • the vertical axis indicates an arbitrary unit.
  • FIG. 5 shows changes in SS169 gene expression during induction of differentiation of the mouse skeletal muscle-derived cell line C2C12.
  • the vertical axis indicates an arbitrary unit, and the horizontal axis indicates the number of days after induction of differentiation.
  • FIG. 6 shows the effect of insulin on SS169 gene expression in mouse skeletal muscle-derived cell line C2C12.
  • the vertical axis shows arbitrary units, and the horizontal axis shows insulin concentration.
  • Cont. Indicates C2C12 cultured in an insulin-free medium. * Indicates p * 0.01.
  • FIG. 7 shows SS169 gene expression in skeletal muscle (gastrocnemius and soleus) of a diabetic model mouse treated with streptozotocin (STZ).
  • the vertical axis indicates an arbitrary unit.
  • Cont. Indicates a mouse not administered with STZ. * Indicates p ⁇ 0.01.
  • Figure 8 shows the results of cell lines expressing the SS169 gene stably (A: NIH3T3 cells; B: C2C12 cells). This shows the localization of SS169.
  • the flag-tagged SS169 or GFP gene is introduced into each cell line, the cell extract and the culture supernatant are immunoprecipitated using anti-Flag antibodies, respectively, and subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Western plotting was performed.
  • Figure 9 is a murine SS169 gene expression adenoviral low titer (2xl0 7 pfu), medium potency (6xl0 7 pfu) and high titer (2xl0 8 pfu) expression of SS169 genes in the liver in mice infected with Indicates the amount.
  • a mouse similarly infected with the lacZ gene-expressing adenovirus was used as a control.
  • the vertical axis indicates an arbitrary unit.
  • the bar graph shows low, medium and high titers from the left.
  • Gastrocnemius muscle shows the expression level of SS169 gene in gastrocnemius muscle of uninfected mice.
  • Figure 10 is a mouse SS169 genic expression adenoviral low titer (2xl0 7 pfu), body weight in the medium titer (6xl0 7 pfu) Oyopi high mosquito value (2xl0 8 pfu) mice infected with (A) and The daily changes in food consumption (B) are shown.
  • a mouse similarly infected with the lacZ gene-expressing adenovirus was used as a control.
  • the vertical axis shows (A) body weight (unit: g) hop (B) food consumption (unit:), and the horizontal axis shows the number of days after virus infection.
  • mice SS169 gene expression adenovirus infected mice mice SS169 gene expression adenoviral low titer (2xl0 7 pfu), medium -. titers (6xl0 7 pfu) Oyopi high mosquito value (2Xl0 8 pfu) shows the fat weight around the epididymis in the mice infected
  • the mouse the vertical axis shows the fat weight around the epididymis (unit: g)
  • the bar graph shows the lacZ gene expression adenovirus infection from the left for each titer Mice, mice infected with adenovirus expressing the SS169 gene, * indicates p ⁇ 0.01.
  • Figure 12 shows the weight of liver in mice infected with mouse SS169 genic expression adenoviral at low titer (2xl0 7 pfu), medium potency (6xl0 7 pfu) Oyopi high mosquito value (2xl0 8 pfu) .
  • the vertical axis indicates the weight of the liver (unit: g).
  • the bar graph shows the lacZ gene-expressing adenovirus-infected mice and SS169 gene-expressing adenoviruses from the left for each titer. Indicates virus-infected mice. * Indicates p * 01.
  • mice were infected mice SS169 genic expression adenoviral at low titer (2 x l0 7 pfu), medium potency (6 x l0 7 pfu) Oyopi high mosquito value (2 x l0 8 pfu)
  • A blood glucose level (unit: mg / dl)
  • B blood insulin level (unit: ng / ml)
  • C blood free fatty acid level (unit: mEq / 1)
  • D blood in mice Shows the medium triglyceride concentration (unit: mg / dl).
  • the bar graph shows the lacZ gene-expressing adenovirus-infected mouse and the SS169 gene-expressing adenovirus-infected mouse from the left for each titer. * Indicates P ⁇ 0.01.
  • FIG. 14 shows the incorporation of 3 H-2-deoxy-D-glucose (2-DG) into C2C12 cells during insulin stimulation and non-stimulation (A), and GLUT4, GLUT1 and GLUT1 during insulin stimulation.
  • FIG. 9 shows the effect of SS169 on hexokinase II (HK II) gene expression (B).
  • A the vertical axis indicates 2-DG uptake (cpm / well), and ** indicates p ⁇ 0.001.
  • B the vertical axis indicates an arbitrary unit, and n.s, indicates no significant difference.
  • FIG. 15 shows the effect of SS169 on dalycogen synthesis in C2C12 cells during insulin stimulation and non-stimulation.
  • the vertical axis D into C2C12 cells in Darikogen fraction - indicates - [1 14 C] glucose incorporation (cpm / m g protein), ** indicates p rather 0.001.
  • the protein of the present invention is a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence of amino acid number 1 or later in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4.
  • the protein of the present invention is a secreted or membrane protein that is particularly highly expressed in skeletal muscle of mammals (also weakly expressed in brown adipose tissue) (hereinafter, the protein of the present invention is sometimes referred to as “SS169”).
  • the origin is not particularly limited as long as it has the above-mentioned properties.
  • Cells e.g., hepatocytes, spleen cells, nerve cells, glial cells, 3 cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, etc.
  • it may be a protein synthesized biochemically by a chemical synthesis or cell-free translation system, or a recombinant produced from a transformant into which a nucleic acid having a base sequence encoding the above amino acid sequence has been introduced. It may be a protein.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence of amino acid number 1 or later is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4.
  • Amino acid sequences having about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90 ° / 0 or more, and particularly preferably about 95% or more homology with the amino acid sequence of 1 or more.
  • homology refers to an optimal alignment (preferably, the algorithm is optimized for optimal alignment) when two amino acid sequences are aligned using a mathematical algorithm known in the art.
  • amino acid means similar amino acids in terms of physical properties, such as aromatic amino acids (Phe, Trp, Tyr), aliphatic amino acids (Ala, Leu, Ile, Val), and polar amino acids (Gin, Asn).
  • Algorithms for determining the homology of amino acid sequences include, for example,
  • the amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence of amino acid number 1 or later is defined as the amino acid represented by SEQ ID NO: 2 or 4.
  • the amino acid represented by SEQ ID NO: 2 or 4 is defined as the amino acid represented by SEQ ID NO: 2 or 4.
  • the protein containing an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 include, for example, a protein substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 described above.
  • a protein having the same amino acid sequence as the above and having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 is preferred.
  • substantially equivalent activities include, for example, receptor (or ligand) binding activity and signal transduction.
  • “Substantially equivalent” indicates that the activities are qualitatively (eg, physiologically or pharmacologically) equivalent. Therefore, it is preferable that the activities such as receptor (ligand) binding activity and signal transduction activity are equivalent (eg, about 0.5 to about 2 times). However, such activities and degree of molecular weight of proteins are preferable. The quantitative factors may be different.
  • Activity such as receptor (or ligand) binding activity and signal transduction activity can be measured according to a method known per se. For example, a biological substance (receptor or ligand) having a specific affinity described later is used. Determination can be performed according to the method used in the method for screening antagonists and antagonists.
  • the protein of the present invention includes, for example, (1) one or two or more (preferably, 1 to 2) of amino acid sequences of amino acid number 1 or later in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 An amino acid sequence in which about 30 amino acids have been deleted, preferably about 1 to 10 amino acids, and more preferably about 1 to 5 amino acids, and (2) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4.
  • the position of the insertion, deletion or substitution is not particularly limited as long as the activity of the protein is maintained.
  • the protein of the present invention is a secreted or membrane protein, which is translated in vivo as a precursor polypeptide having a signal peptide at the N-terminus, and then processed by a signal peptidase to become a mature protein.
  • the cleavage site of the signal peptide can be determined, for example, by subjecting the completely or partially purified protein of the present invention to the Edman degradation method, and is known from the primary structure of the precursor polypeptide. It can be predicted using a mathematical algorithm. Examples of such an algorithm include an algorithm described in Nielsen et al., Int.
  • the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 must be able to cleave between amino acid No. 11 and amino acid No. 1.
  • the signal cleavage positions may differ depending on the cell type that expresses the protein of the present invention. Therefore, in SEQ ID NO: 2 or 4, In the amino acid sequence represented by amino acid number 1 and subsequent amino acids, one or more amino acids are added or deleted, and one or more amino acids are added at the N-terminus. Also included are added amino acid sequences and amino acid sequences in which one or more amino acids at the N-terminus have been deleted.
  • the protein of the present invention is preferably a human SS169 protein having an amino acid sequence of amino acid number 1 or higher in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence 1 or higher in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4
  • a mouse SS169 protein having the amino acid sequence of, or a homolog thereof in another mammal eg, a rat homolog having an amino acid sequence of amino acid number 1 or higher in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23, etc.
  • the protein or peptide is described with the N-terminus (amino terminus) at the left end and the C (carboxyl terminus) at the right end according to the examples of the peptide label.
  • the protein (SS169) of the present invention including a protein containing the amino acid sequence of amino acid number 1 or later in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 has a carboxyl group (-COOH) at the C-terminus. It may be any of carboxylate (one COO one), amide (one CO NH 2 ) or estenole (-COOR).
  • R in the ester is, for example, a Ci- 6 alkyl group such as methinole, ethyl, n-propynole, isopropyl, n-butyl; and a C 3 -8 cycloalkyl group such as pentyl, cyclohexyl and the like.
  • phenyl, CK one C 6 _ J 2 Ariru group such naphthyl; e.g., benzyl, phenylene Lou such phenethyl - 2 alkyl group; and CE- CK- naphthyl eleven 2 ⁇ alkyl group such as naphthylmethyl of c 7 one 1 4 Ararukiru group; and PIPA Roi Ruo carboxymethyl group is used.
  • the protein of the present invention When the protein of the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) at a position other than the C-terminus, the protein of the present invention includes a carboxyl group amidated or esterified.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C powder An ester at the end is used.
  • the protein of the invention (if example embodiment, a formyl group, such as Asechiru groups such as 6 ⁇ sheet Le group - - C i, such as 6 Arukanoiru)
  • Amino group protecting group of the amino acid residues of the N-terminal is protected by N-terminal daltamine residue which can be generated by cleavage in vivo, pyroglutamine oxidation,
  • Substituent on the side chain of amino acid in the molecule e.g., 1 OH, 1 SH, amino group, The imidazole group, indole group, guanidino group, etc.
  • a suitable protecting group for example, a formyl group, acetyl group, etc., a 6- alkanol group, etc., a 6- acyl group, etc.
  • Complex proteins such as bound so-called glycoproteins are also included.
  • partial peptide of SS169 (hereinafter, sometimes abbreviated simply as “partial peptide of the present invention”) is a peptide having the partial amino acid sequence of SS169 described above and has an activity 4 substantially the same as that of SS169. Or any one of them.
  • substantially the same activity is as defined above.
  • the measurement of “substantially the same property” can be performed in the same manner as in ⁇ of SS169.
  • partial peptide of the present invention for example, a biological substance (receptor) that can interact with SS169 in the amino acid sequence of amino acid number 1 or later in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4
  • a biological substance that can interact with SS169 in the amino acid sequence of amino acid number 1 or later in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4
  • those having a partial amino acid sequence that further includes a region involved in binding to (i.e., a ligand) or a region involved in signal transduction through the interaction are used.
  • the partial peptide of the present invention is preferably a peptide having at least 30 or more, preferably 60 or more, more preferably 100 or more amino acids.
  • a peptide containing a partial amino acid sequence of SS169 but not having substantially the same activity as SS169 for example, in the amino acid sequence of amino acid No. 1 or later in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4,
  • Those having a partial amino acid sequence that includes a region involved in binding to a biological substance (receptor or ligand) that can interact with SS169 but does not include a region involved in signal transmission through the interaction are described in Departure It is not included in the “clear partial peptide”.
  • such a peptide can bind to a biological substance (receptor or ligand) capable of interacting with SS169 and block the signal transduction action by SS169. It can be useful for prevention and treatment.
  • the partial peptide of the present invention may have a carboxyl group (one COOH), carboxylate (one COO—), amide (one CONH 2 ) or estenole (one COOR) at the C-terminus.
  • R in the ester those similar to those described above for SS169 can be mentioned.
  • the partial peptide of the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) at a position other than the C-terminus
  • the partial peptide of the present invention includes amidoxyl or esterified carbonyl group.
  • the ester in this case, for example, the same esters as those at the C-terminal can be used.
  • the partial peptide of the present invention has one in which the amino group of the N-terminal amino acid residue is protected with a protecting group, and one in which the N-terminal glutamine residue is pyroglutamic acid-digested.
  • a protecting group one in which the amino group of the N-terminal amino acid residue is protected with a protecting group
  • the N-terminal glutamine residue is pyroglutamic acid-digested.
  • substituent on the side chain of the amino acid in the molecule is protected with an appropriate protecting group
  • a sugar chain is bound, such as a complex peptide such as a so-called glycopeptide.
  • Examples of the salt of SS169 or a partial peptide thereof include a physiologically acceptable salt with an acid or a base, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid) Succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • Succinic acid tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid
  • SS169 or a salt thereof can be produced from the above-described mammalian cells or tissues by a protein purification method known per se. Specifically, ⁇ where SS169 is localized in the cell membrane is used to homogenize mammalian tissues or cells and perform low-speed centrifugation. After removing the cell debris, the supernatant was centrifuged at a high speed to precipitate a cell membrane-containing fraction (if necessary, the cell membrane fraction was purified by density gradient centrifugation or the like), and the fraction was subjected to reverse phase chromatography and ion chromatography. SS169 or a salt thereof can be prepared by subjecting it to chromatography such as exchange chromatography, affinity chromatography and the like.
  • SS169 When SS169 is secreted extracellularly, after culturing mammalian tissues or cells in an appropriate medium, the culture supernatant is separated by filtration or centrifugation, and the supernatant is collected as described above. In the same manner as described above, SS169 or a salt thereof can be prepared by subjecting it to mouth chromatography.
  • SS169 or a partial peptide thereof or a salt thereof can also be produced according to a known peptide synthesis method.
  • the peptide synthesis method may be, for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method.
  • the target protein can be produced by condensing a partial peptide or amino acid capable of constituting SS169s with the remaining portion and, if the product has a protective group, removing the protective group to produce the target protein. .
  • condensation and the elimination of the protecting group are carried out according to a method known per se, for example, the methods described in the following (1) to (5).
  • the protein (peptide) thus obtained can be purified and isolated by a known purification method.
  • purification methods include, for example, solvent extraction, distillation, and column Chromatography, liquid chromatography, recrystallization, combinations thereof, and the like.
  • the free form can be converted into an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, the protein (peptide) is converted into a salt.
  • the salt can be converted to a free form or another salt by a known method or a method analogous thereto.
  • resins for protein synthesis can be used.
  • resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzylhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, and PAM resin.
  • 4-Hydroxymethylmethylphenylacetamidomethyl resin Polyacrylamide resin, 4- (2,, 4, dimethoxyphenylhydroxymethinole) phenoxy resin, 4 -— (2,, 4,1-Dimethoxyphenol-1 Fmoc Aminoethyl) phenoxy resin and the like.
  • an amino acid having an amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin in accordance with the sequence of the target protein (peptide) according to various known condensation methods.
  • proteins and the like are cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.
  • an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain a target protein (peptide) or its amide.
  • carbodiimides are particularly preferable.
  • the carpoimides DCC, N, N, diisopropylcarboimide, N-ethyl-1-N,-(3-dimethylaminoprolyl) carpoimide, and the like are used.
  • a racemization inhibitor for example, HOBt, HOOBt
  • HOBt ester a symmetric acid anhydride or HOBt ester
  • the solvent used for activating the protected amino acid and for condensing with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, alcohols such as trifluorethanol.
  • Sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, amines such as pyridine, ethers such as dioxane and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, or the like.
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for a protein bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about 120 ° C to 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess.
  • the protection of the functional group which should not be involved in the reaction of the raw materials, the protecting group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
  • Examples of the protecting group for the starting amino group include Z, Boc, tertiary pentoxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, CI—Z, Br—Z, and adaman. Cyloxycarbonyl, trif-noroloacetylinole, phthaloynole, honoleminole, 2-trofenynolenosrefenoinole, diphenylphosphinoinoyl, Fmoc and the like are used.
  • the carboxyl group can be, for example, alkyl esterified (eg, methyl, ethyl, propynole, butynole, tertiary petit / le, cyclopentinole, cyclohexynole, Linear, branched or cyclic alkyl esterification such as chloroheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc., aralkyl esterification (for example, benzyl ester, 412 benzene / leestenol, 4 —Methoxybenzinoleestenole, 4-cyclohexene benzene / leestenole, benzhi dorinoreste / le), fenacinoleeste / lei, benzyloxycarbonyl hydrazide, tertiary ptoxycarponyl hydrazide, tritinolehydrazide Can be protected.
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • a group suitable for this esterification for example, a lower alkanol group such as an acetyl group, an aroyl group such as a benzoyl group, a group derived from carbonic acid such as a benzyloxycarbonyl group and an ethoxycarbonyl group, and the like are used.
  • Examples of a group suitable for ethereal dani include a benzyl group, a tetrahydrobiranyl group, a t-butynole group, and the like.
  • the protecting group of the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, B z 1, C 1 2 - B zl, 2- nitrobenzyl, B r- Z, such as tertiary butyl is used.
  • Examples of the protecting group for imidazole of histidine include Tos, 4-methoxy-1,2,3,6-trimethylbenzenesulfol, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, and Fmoc. Used.
  • Methods for removing (eliminating) the protecting group include, for example, catalytic reduction in a stream of hydrogen in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon; Acid treatment with trifluoromethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., or with sodium in liquid ammonia Reduction is also used.
  • the elimination reaction by the above-mentioned acid treatment is generally carried out at a temperature of about 120 ° C. to 40 ° C.
  • activated carboxyl groups in the raw materials include, for example, corresponding acid anhydrides, azides, active esters [alcohols (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromouth phenol, 2,4-dinitrophenol) Nonole, cyanomethinoreal alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, and esters with HOBt).
  • active esters eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromouth phenol, 2,4-dinitrophenol
  • Nonole cyanomethinoreal alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, and esters with HOBt.
  • a corresponding phosphoric amide is used as the activated amino group of the raw material.
  • an amide form of a protein for example, first, after amidating and protecting the ⁇ -carboxyl group of the carboxy-terminal amino acid, a peptide chain is extended to a desired chain length on the amino group side. Then, a protein (peptide) from which only the protecting group of the a-amino group at the ⁇ -terminal of the peptide chain was removed and a protein (peptide) from which only the protecting group of the carboxyl group at the C-terminal was removed, Both proteins (peptides) are condensed in a mixed solvent as described above. Details of the condensation reaction are the same as described above.
  • the ester form of a protein is obtained by condensing the ⁇ -carboxyl group of the carboxy terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, It can be obtained in the same manner as in the case of the amide of a protein (peptide).
  • the partial peptide or a salt thereof of the present invention can also be produced by cleaving SS169 or a salt thereof with an appropriate peptide.
  • SS169s can also be produced by culturing a transformant containing a nucleic acid encoding SS169 or a partial peptide thereof, and separating and purifying SS169s from the resulting culture.
  • the nucleic acid encoding SS169 or a partial peptide thereof may be DNA or RNA, or may be a DNAZNA chimera.
  • DNA is used.
  • the nucleic acid may be double-stranded or single-stranded. In the case of a double strand, it may be a double-stranded DNA, a double-stranded RNA or a hybrid of RNA: RNA. In the case of a single strand, it may be a sense strand (ie, a coding strand) or an antisense strand (ie, a non-coding strand).
  • DNA encoding SS169 or a partial peptide thereof examples include genomic DNA, genomic DNA library, and mammals (for example, humans, mice, monkeys, animals, pigs, higgies, goats, dogs, cats, monolemots). , Rat, mouse, rabbit, mouse, etc.) (for example, hepatocytes, spleen cells, nerve cells, glial cells, victory) 3 cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells Vesicle, goblet cell, endothelial cell, smooth muscle cell, fibroblast, fiber cell, muscle cell, adipocyte, immune cell (eg, macrophage, T cell, B cell, natural killer cell, mast cell, neutrophil, favorable Basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, hepatocytes or stromal cells
  • the vector used for the library may be any of pacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, it can be directly amplified by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as “RT-PCR method”) using the total RNA or mRNA fraction prepared from the cells and tissues described above.
  • RT-PCR method Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
  • Examples of the DNA encoding SS169 include, for example, a DNA containing the base sequence of base number 88 or later in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3, or the base represented by SEQ ID NO: 1 or 3. It contains a base sequence that hybridizes under the stringent conditions with a base sequence starting from base number 88 in the sequence, and has substantially the same activity as SS169 described above (eg, receptor (or ligand) binding activity, signaling activity And the like).
  • Examples of the DNA that can hybridize under the stringent conditions with the base sequence of base number 88 or later in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 include, for example, the base represented by SEQ ID NO: 1 or 3 About 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, particularly preferably about 80% or more, most preferably about 90% or more
  • DNA containing a base sequence having homology of at least% is used.
  • Hybridization is performed by a method known per se or a method analogous thereto, such as the method described in Molecular Cloning, 2nd edition (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). Can be performed according to When a commercially available library is used, hybridization can be performed according to the method described in the attached instruction manual. High predication can be preferably performed according to high stringency conditions.
  • the stringent conditions include, for example, sodium salt concentration of about 19 to
  • the conditions include about 40 mM, preferably about 19 to about 20 mM, and a temperature of about 50 to about 70 ° C, preferably about 60 to about 65 ° C.
  • the sodium salt concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C.
  • the DNA encoding SS169 is preferably a DNA containing a nucleotide sequence encoding a mature human SS169 protein represented by the nucleotide sequence of base number 88 or later in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, more preferably DNA having a nucleotide sequence encoding the human SS169 precursor polypeptide represented by SEQ ID NO: 1, or a mature mouse SS169 protein comprising a nucleotide sequence of base number 88 or later in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 DNA comprising a nucleotide sequence encoding the mouse SS169 precursor polypeptide represented by SEQ ID NO: 3, or a homolog thereof in another mammal (eg, SEQ ID NO: 22 DNA containing a nucleotide sequence encoding mature rat SS169 protein containing a nucleotide sequence of nucleotide number 88 or later in the nucleotide sequence represented by 22, preferably SEQ ID NO:
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention has the same or substantially the same amino acid sequence as a part of the amino acid sequence from amino acid number 1 onwards in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4.
  • Any nucleotide may be used as long as it contains a nucleotide sequence encoding a peptide.
  • it may be any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-described cells and tissues, cDNA library derived from the above-described cells and tissues, and synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of pacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • amplification can also be performed directly by the RT-PCR method using the mRNA fraction prepared from the above-mentioned cell'tissue.
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention includes, for example, (1) a partial nucleotide sequence of the nucleotide sequence of nucleotide number 88 or later in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 DNA, or (2) SEQ ID NO: represented by 1 or 3 It has a nucleotide sequence that hybridizes under high stringent conditions with DNA having a nucleotide sequence of base number 88 or higher in the nucleotide sequence, and has substantially the same activity as SS169 described above (eg, receptor (or ligand)) DNA encoding a peptide having binding activity, signal transduction action, etc.) is used.
  • SS169 eg, receptor (or ligand)
  • Examples of the DNA that can hybridize with the base sequence 8 or higher under stringent conditions include, for example, about 60% or more, preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more with the base sequence. Most preferably, DNA containing a nucleotide sequence having about 90% or more identity is used.
  • the DNA encoding SS169 or a partial peptide thereof is amplified by a PCR method using a synthetic DNA primer having a part of the nucleotide sequence encoding the SS169 or a partial peptide thereof, or incorporated into an appropriate expression vector.
  • the DNA can be cloned by hybridizing it with a DNA fragment coding for a part or the entire region of the SS169 protein or a DNA labeled with a synthetic DNA. Hybridization can be performed, for example, according to the method described in Molecular 'Cloning (Molecular Cloning), 2nd edition (described above). When a commercially available library is used, hybridization can be performed according to the method described in the instruction manual attached to the library.
  • the DNA base sequence can be determined using a known kit, for example, Mutan TM -super Express Km (Takara Shuzo), Mutan TM -K (Takara Shuzo), etc., using the 0MAA PCR method, the Gapped duplex method, the Kunkel
  • the conversion can be carried out according to a method known per se such as a method or a method analogous thereto.
  • the cloned DNA can be used as it is depending on the purpose, or after digestion with a restriction enzyme as desired, or after adding a linker.
  • the DNA has an ATG as a translation initiation codon at its 5, terminal end, and a translation at its 3, terminal end. It may have TAA, TGA or TAG as a stop codon. These translation initiation codon and translation termination codon can be added using a suitable synthetic DNA adapter.
  • an expression vector containing DNA encoding SS169 or a partial peptide thereof can be obtained by cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding SS169, and converting the DNA fragment into an appropriate expression vector. It can be produced by ligating downstream of the promoter.
  • Escherichia coli-derived plasmids eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13); Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUBll0, pTP5, pC194); Yeast-derived plasmids (eg, , SH19, pSHI 5); an insect cell expression plasmid (eg, pFast-Bac); an animal cell expression plasmid (eg, PA1-11, pXTl, pRc / CMV, pRc / RSV, pcDNAI) / Neo); pacteriophage such as phage; insect virus vectors such as paculovirus (eg, BmNPV, AcNPV); animal virus vectors such as retrovirus, vaccinia virus, and adenovirus.
  • paculovirus eg, BmNPV, AcNPV
  • retrovirus vaccinia virus,
  • any promoter can be used as long as it is appropriate for the host used for gene expression.
  • the SRo promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV (cytomegalovirus) promoter, RSV (rous meat J® virus) promoter, MoMuLV (Moroni murine leukemia virus) LTR, An HS V-TK (simple virus virus thymidine kinase) promoter is used.
  • CMV promoter, SRo; promoter and the like are preferable.
  • trp promoter When the host is Eshierihia genus, trp promoter, 1 ac promoter one, re cA promoter, P L promoter one, lpp promoter, T7-flop A mouth motor is preferred.
  • the SPO1 promoter When the host is a bacterium belonging to the genus Pachis, the SPO1 promoter, SPO2 promoter, and the like are preferred.
  • PHO5 promoter When the host is yeast, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like are preferable.
  • a polyhedrin promoter When the host is an insect cell, a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like are preferable.
  • an expression vector in addition to the above, those containing an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori) and the like, if desired, may be used. be able to.
  • the selection marker include dihydrofolate reductase gene (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr, methotrexate (MTX) resistance), ampicillin phosphorus resistant gene (hereinafter ⁇ abbreviated as # 038 r), neomycin resistance Gene (hereinafter sometimes abbreviated as neo r , G418 resistance) and the like.
  • dhfr gene-deficient Chinese hamster cells are used and the dhfr gene is used as a selection marker
  • the target gene can be selected using a thymidine-free medium.
  • a nucleotide sequence (signal codon) encoding a signal sequence suitable for the host may be added (or replaced with a native signal codon) to the 5, terminal side of the DNA encoding SS169 or its partial peptide.
  • You may.
  • the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, a Ph ⁇ signal sequence, an Omp A signal sequence, etc .; If the host is yeast, MF a signal sequence, SUC 2 signal sequence, etc .; if the host is animal cells, insulin signal sequence, ⁇ -interferon 'signal sequence, antibody molecule signal sequence Etc. are respectively used.
  • SS169s can be produced by transforming a host with an expression vector containing DNA encoding SS169 or a partial peptide thereof, and culturing the resulting transformant.
  • Escherichia bacteria for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells, and the like are used.
  • Escherichia examples include, for example, Escherichia coli K12, DH1 [Procedures of the national academy], "Sciences” of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), Vol. 60, 160 (1968)], Escherichia coli. JM103 [Nucleic Acids Research, Vol. 9, 309 (1981)], Escherichia coli. JA221 [Journal of Molecular Biology, 120, 5 17 (19778)], Escherichia coli 'HB 101 [Journal' op 'molecular biology, 41, 459 (1969)] and Escherichia coli C600 [Genetics, 39, 440 (1954)].
  • Bacillus bacteria examples include, for example, Bacillus subtilis MI114 (Gene, 24, 255 (1983)), Bacillus subtilis 207—21 [Journal op Piochemistry ( Journal of Biochemistry), 95, 87 (1984)].
  • yeast examples include, for example, Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R—, NA87-11A, DKD—5D, 20B—12, Schizosaccharomyces pombe NC YCl913, NCYC 2036, Pichia pastoris (K-71) and the like are used.
  • insect cells for example, when the virus is Ac NPV, a cell line derived from a larva of night moth (Spodoptera frugiperda cell; S f cell), the midgut of Trichoplusia ni
  • S f cell a cell line derived from a larva of night moth
  • MG1 cells derived therefrom, High Five TM cells derived from Trichoplusia ni eggs, cells derived from Mamestra brassicae, cells derived from Estigmena acrea and the like are used.
  • the virus is BmNPV
  • a silkworm-derived cell line Boombyx mori N cell; BmN cell
  • the Sf cells include, for example, Sf9 cells (ATCC CRL1711), Sf21 cells (Vaughn, JL et al., In Vivo).
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, Vol. 315, 592 (1985)].
  • animal cells examples include monkey COS-7 cells, monkey Vero cells, Chinese hamster cells CHO (hereinafter, abbreviated as CHO cells), dh fr gene-deficient Chinese hamster cells CHO (hereinafter, CHO (dhir—) cells) Abbreviations), mouse L cells, mouse AtT-20 cells, mouse myeloma cells, rat GH3 cells, human FL cells, and the like.
  • Transformation can be performed according to a known method depending on the type of host.
  • the genus Escherichia is described, for example, in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 21. 10 (1972), Gene, Vol. 17, 107 (1982) and the like.
  • Bacillus spp. Can be transformed, for example, according to the method described in Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979).
  • Yeasts are described, for example, in Methods in Enzymology, Vol. Transformation can be performed according to the method described in U.S.A. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 75, 1929 (1978). Insect cells and insects can be transformed, for example, according to the method described in Bio / Technology, Vol. 6, 47-55 (1989).
  • the transformant can be cultured according to a known method depending on the type of the host.
  • a liquid medium is preferably used as the culture medium.
  • the medium preferably contains a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance, and the like necessary for the growth of the transformant.
  • a carbon source for example, glucose, dextrin, soluble starch, sucrose, etc .
  • a nitrogen source for example, ammonium salts, nitrates, corn steep.
  • the medium may be supplemented with yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like.
  • the pH of the medium is preferably from about 5 to about 8.
  • a medium for culturing a transformant whose host is a genus Escherichia for example, an M9 medium containing glucose and casamino acid [Miller, Journal Op. , Journa II of Experiments in Molecular Genetics), 431-43, and old Spring Harbor Laboratory, New York 1972].
  • a drug such as, for example, 3 / 3-indolylatalinoleic acid may be added to the medium to make the mouth motor work efficiently.
  • Culture of a transformant whose host is a genus Escherichia is usually performed at about 15 to about 43 ° C. It takes about 3 to about 24 hours. If necessary, ventilation or stirring may be performed.
  • Culture of the transformant whose host is a bacterium belonging to the genus Bacillus is usually performed at about 30 to about 40, and is performed for about 6 to about 24 hours. If necessary, ventilation or stirring may be performed.
  • a Parkholder (Burkholder) minimal medium As a medium for culturing a transformant in which the host is yeast, for example, a Parkholder (Burkholder) minimal medium [Bostian, KL, et al., Processing's The National 'Academy' Op. Opus The USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 77, 4505 (1980)] and 0.
  • the pH of the medium is preferably from about 5 to about 8.
  • the culture is usually performed at about 20 to about 35 ° C for about 24 to about 72 hours. Ventilation and stirring may be performed as necessary.
  • 10% inactivated Grace's Insect Medium As a medium for culturing an insect cell or a transformant whose host is an insect, for example, 10% inactivated Grace's Insect Medium [Grace, TCC, Nature, 195, 788 (1962)] One that has been appropriately added with additives such as serum is used.
  • the pH of the medium is preferably from about 6.2 to about 6.4.
  • the cultivation is usually performed at about 27 ° C for about 3 to about 53. Aeration and stirring may be performed as necessary.
  • the medium used for culturing a transformant whose host is an animal cell is, for example, about
  • MEM Minimum essential medium containing 5 to about 20% fetal serum serum [Science, 122, 501 (1952)], Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) [Virology, 8 volumes, 396 (1959)], RP Ml 1640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199 :, 519 (1967)], 199 medium [Proceding, Ob, The, Society] For the Biological Medicine (Proceeding of the Society for the Biological Medicine), Volume 73, 1 (1950)] is used.
  • the pH of the medium is preferably from about 6 to about 8.
  • the culture is usually performed at about 30 ° C. to about 40 ° C. for about 15 to about 60 hours. Aeration and stirring may be performed as necessary.
  • SS169s can be produced inside or outside the cells of the transformant.
  • SS169s can be separated and purified from a culture obtained by culturing the transformant according to a method known per se.
  • the cells or cells collected by a known method from the culture medium are suspended in an appropriate buffer, and then sonicated, lysozyme Z or After rupture of cells or cells by freeze-thawing or the like, a method of obtaining a crude extract of soluble protein by centrifugation or filtration is appropriately used.
  • the buffer may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 TM .
  • SS169s are extracted from the membrane fraction, cells or cells are disrupted in the same manner as described above, and cell debris is removed by sedimentation by low-speed centrifugation, and the supernatant is centrifuged at high speed to precipitate the cell membrane-containing fraction ( (If necessary, the cell membrane fraction is purified by density gradient centrifugation, etc.).
  • a method such as collecting the culture supernatant from the culture by centrifugation or filtration is used.
  • the isolation and purification of SS169s can be performed according to a method known per se.
  • Such methods include methods using solubility such as salting out and solvent precipitation; dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, mainly for differences in molecular weight.
  • Method using charge difference such as ion-exchange chromatography; method using specific affinity such as affinity chromatography; utilizing difference in hydrophobicity such as reversed-phase high-performance liquid chromatography
  • a method utilizing a difference between isoelectric points, such as an isoelectric focusing method are suitable: they can be combined.
  • the free form can be converted into a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and when the protein or peptide is obtained as a salt, Can convert the salt into a free form or another salt by a method known per se or a method analogous thereto.
  • the SS169s produced by the transformant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by the action of an appropriate protein-modifying enzyme before or after purification.
  • an appropriate protein-modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, argier endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
  • the presence of the thus-obtained SS169s can be confirmed by, for example, enzymimnoatse ⁇ western blotting using a specific antibody.
  • SS169s use a RNA corresponding to the DNA coding for the above-mentioned SS169 or a partial peptide thereof as a type III, and a cell-free protein translation system composed of a heron reticulocyte lysate, a wheat J3 Pi bud lysate, and an E. coli lysate. Can be used for in vitro synthesis.
  • DNA encoding SS169 or a partial peptide thereof can be synthesized into type III using a cell-free transcription Z translation system further containing an RNA polymerase.
  • a base sequence encoding the SS169 protein or an initial translation product thereof that is, a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4, or a part thereof
  • a nucleic acid containing a base sequence complementary to the base sequence or a part thereof is not limited to a nucleic acid encoding SS169 or its partial peptide as described above, but also includes a base sequence out of frame. It is required.
  • Nucleic acid containing a base sequence complementary to the target region of the target nucleic acid that is, A nucleic acid that can be redisposed can be said to be “antisense” to the nucleic acid of interest.
  • a nucleic acid containing a base sequence having homology to a target region of a target nucleic acid can be said to be “sense” to the target nucleic acid.
  • “having homology” or “complementary” means about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, most preferably about 90% or more between base sequences. It means that it has 5% or more identity or complement '14.
  • a nucleic acid containing a base sequence complementary to the base sequence encoding the SS169 protein or its initial translation product or a part thereof (hereinafter, also referred to as “the antisense nucleic acid of the present invention”) has been cloned or determined. It can be designed and synthesized based on the base sequence information of the nucleic acid encoding SS169. Such a nucleic acid can inhibit the replication or expression of the SS169 gene. That is, the antisense nucleic acid of the present invention can hybridize with RNA transcribed from the SS169 gene, and can inhibit the synthesis (processing) or function (translation into protein) of mRNA.
  • the length of the target region of the antisense nucleic acid of the present invention is not particularly limited as long as the translation of the SS169 protein is inhibited as a result of the hybridization of the antisense nucleic acid. Or a partial sequence, such as a short one of about 15 bases, and a long one of mRNA or the entire sequence of the initial transcript. Considering the ease of synthesis and antigenicity, oligonucleotides consisting of about 15 to about 30 bases are preferred, but not limited thereto.
  • the nucleic acid encoding the SS169 precursor polypeptide has a five-terminal hairpin loop, a five-terminal 6—base pair 'repeat, a five-terminal untranslated region, a polypeptide translation initiation codon, a protein coding region, The ORF translation initiation codon, the three-terminal untranslated region, the three-terminal palindrome region, and the power at which the three-terminal hairpin loop can be selected as a target region Any region in the SS169 gene can be selected as a target. For example, it is also preferable to use the intron portion of the gene as a target region.
  • the antisense nucleic acid of the present invention may be SS169 mRNA or an initial transcript. Not only inhibits translation into proteins, but also binds to the double-stranded DNA, the SS169 gene, to form a triplex, which can inhibit RNA transcription. You may.
  • Antisense nucleic acids may be deoxyribonucleotides containing 2-dexoxy-D-reports, ribonucleotides containing D-reports, other types of nucleotides that are N-daricosides of purine or pyrimidine bases, or Are other polymers with non-nucleotide backbones (eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers) or other polymers containing special bonds (provided that the polymer is not contained in DNA or RNA). Pairing of bases as found (contains nucleotides having a configuration permitting base attachment)).
  • RNA hybrids can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and even DNA: RNA hybrids, and can be unmodified polynucleotides (or unmodified oligonucleotides). Nucleotides) as well as those with known modifications, such as labeled, capped, methylated, and one or more natural nucleotides as analogs known in the art.
  • Substituted, modified with an intramolecular nucleotide for example, having an uncharged bond (eg, methylphosphonate, phosphotriester, phosphoramidate, olebamate, etc.), charged bond or sulfur-containing bond (Eg, phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.), such as proteins (nucleases, nucleases' inhibitors, , Antibodies, signa / repeptide, poly-L-lysine, etc.) or sugars (eg, monosaccharides), etc., or those with an intercalating compound (eg, acridine, psoralen, etc.) Those containing chelating compounds (eg, metals, radioactive metals, boron, oxidizing metals, etc.), those containing alkylating agents, those with modified bonds (eg, alpha-anomeric nucleic acids, etc.) ).
  • an uncharged bond eg, methyl
  • nucleoside is not limited to those containing purine or pyrimidine bases. And those having other modified heterocyclic bases. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles. Modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, e.g., one or more hydroxyl groups have been replaced with a halogen and a force, an aliphatic group, or an ether, amine, etc. May be converted to a functional group of
  • An antisense nucleic acid is an RNA, a DNA, or a modified nucleic acid (RNA, DNA).
  • modified nucleic acid include, but are not limited to, sulfur derivatives and thiophosphate derivatives of nucleic acids, and those which are resistant to the decomposition of polynucleoside amide and oligonucleoside amide.
  • the antisense nucleic acid of the present invention can be preferably designed according to the following policy. That is, the antisense nucleic acid in the cell is made more stable, the cell permeability of the antisense nucleic acid is increased, the affinity for the target sense strand is increased, and if the poison 14 Minimize the toxicity of sense nucleic acids.
  • Antisense nucleic acids can contain altered or modified sugars, bases, or linkages, can be provided in special forms such as ribosomes, microspheres, applied by gene therapy, or added forms Can be given by Such additional forms include polycations, such as polylysine, which act to neutralize the charge on the phosphate backbone, and lipids, which enhance interaction with cell membranes or increase nucleic acid uptake. Examples thereof include hydrophobic substances such as phospholipids and cholesterol. Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chromate formate, Acid and the like). These can be attached to the nucleic acid at the 3, 5 or 5 end, and can be attached via bases, sugars, or intramolecular nucleoside bonds.
  • additional forms include polycations, such as polylysine, which act to neutralize the charge on the phosphate backbone, and lipids, which enhance interaction with cell membranes or increase nucleic acid uptake. Examples thereof include hydrophobic substances such as phospholipids
  • capping groups that are specifically located at the 3,5 or 5,5 ends of nucleic acids to prevent degradation by nucleases such as exonucleases and RNases.
  • capping groups include, but are not limited to, hydroxyl-protecting groups known in the art, including glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene dalicol.
  • Liposomes capable of specifically cleaving SS169 mRNA or the initial transcript inside the coding region can also be included in the antisense nucleic acid of the present invention.
  • the term “lipozyme” refers to an RNA that has the activity of an enzyme that cleaves nucleic acids.Recently, it has been revealed that oligo DNA having the nucleotide sequence of the enzyme active site also has the activity of cleaving nucleic acids. In the present specification, the term includes DNA as long as it has a sequence-specific nucleic acid cleavage activity.
  • the most versatile liposomes include self-splicing RNAs found in infectious RNAs such as viroids and willoids, and hammerhead-type and hairpin-type are known.
  • the hammerhead type exhibits enzymatic activity at about 40 bases, and cleaves several bases (approximately 10 bases in total) at both ends adjacent to the hammerhead structure. By making the sequence complementary to the site, it is possible to specifically cleave only the target mRNA.
  • This type of ribozyme has the additional advantage that it does not attack genomic DNA, since it uses only RNA as a substrate.
  • the target ribosome is linked to a hybrid ribozyme linked to an RNA motif derived from a viral nucleic acid that can specifically bind to RNA helicase.
  • the sequence can be single-stranded [Pro Natl. Acad. Sci. USA, 98 (10): 5572-5577 (2001)].
  • the lipozyme is transformed into an expression vector containing the DNA that encodes it.
  • a hybrid ribozyme in which a sequence modified from tRNA is further linked may be used to promote translocation of the transcript to the cytoplasm [Nucleic Acids Res., 29 (13): 2780-2788 (2001)].
  • RNA interference RNA interference
  • the antisense oligonucleotide and lipozyme of the present invention determine the target region of mRNA or the initial transcript based on the SS169 cDNA sequence or genomic DNA sequence information, and use a commercially available DNAZR NA automatic synthesizer (Applied (Biosystems, Beckman, etc.) and synthesize a sequence complementary thereto.
  • the sense strand and the antisense strand are synthesized by a DNA / RNA automatic synthesizer, respectively, and in an appropriate annealing buffer, for example, about 90 to about 95 °. It can be prepared by denaturing with C for about 1 minute, and then annealing at about 30 to about 70 ° C for about 1 to about 8 hours.
  • a longer double-stranded polynucleotide can be prepared by synthesizing complementary oligonucleotide chains so that they alternately overlap, annealing them, and ligating them with ligase.
  • the gene expression inhibitory activity of the antisense nucleic acid of the present invention can be determined by using a transformant containing a nucleic acid encoding SS169, an in vivo or in vitro SS169 gene expression system, or an in vivo or in vitro translation system of SS169 protein. You can find out.
  • the nucleic acid can be applied to cells by various methods known per se.
  • the present invention also provides an antibody against SS169 or a partial peptide thereof or a salt thereof.
  • the antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody as long as it has a specific affinity for SS169s.
  • Antibodies to SS169s can be produced using SS169s as antigens according to a method for producing an antibody or antiserum known per se.
  • the SS169s are administered to a mammal at a site capable of producing an antibody upon administration, or may be administered together with a carrier or diluent.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. Administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times.
  • a power mouse and a rat including monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, and goats are preferably used.
  • monoclonal antibody-producing cells When preparing monoclonal antibody-producing cells, select an individual with an antibody titer from a mammal immunized with the antigen, such as a mouse, and collect spleen or lymph nodes 2 to 5 days after the final immunization. By fusing the contained antibody-producing cells with myeloma cells, a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared.
  • the antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting the labeled SS169s described below with the antiserum, and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Koehler and Milstein [Nature; (Nature;), Vol. 256, pp. 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but PEG is preferably used.
  • myeloma cells examples include NS-1, P3U1, SP2Z0 and the like, and P3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably Preferably, PEG100-PEG600) is added at a concentration of about 100-80%, and at about 20-40 ° C, preferably at about 30-37 ° C. Incubation for about 1 to 10 minutes allows efficient cell fusion.
  • the hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, microplate) on which antigens such as proteins are directly or adsorbed together with a carrier. Then, add an anti-immunoglobulin antibody (anti-mouse immunoglobulin antibody is used if the cell used for cell fusion is mouse) or protein A, which is labeled with an alkaline substance or enzyme, and bind to the solid phase.
  • a solid phase eg, microplate
  • antigens such as proteins are directly or adsorbed together with a carrier.
  • an anti-immunoglobulin antibody anti-mouse immunoglobulin antibody is used if the cell used for cell fusion is mouse
  • protein A which is labeled with an alkaline substance or enzyme
  • a method for detecting a monoclonal antibody that has been isolated adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase to which an anti-immunoglobulin antibody or protein A has been adsorbed, and adding a protein or the like labeled with a radioactive substance, an enzyme, etc.
  • a method for detecting the bound monoclonal antibody is exemplified.
  • the selection of the monoclonal antibody can be carried out according to a method known per se or a method analogous thereto. Usually, it can be carried out in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as it can grow a hybridoma.
  • RPMI 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum, GIT medium containing 1 to 10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. )
  • serum-free medium for hybridoma culture SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the culture temperature is usually 20 to 40 ° (:, preferably, about 37 ° C.)
  • the culture time is generally 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • the antibody titer of the culture supernatant of the hybridoma can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified in the same manner as normal polyclonal antibodies, such as immunoglobulin separation and purification (e.g., salting out, alcohol precipitation, isoelectric precipitation). Method, electrophoresis, adsorption / desorption using an ion exchanger (e.g., DEAE), ultracentrifugation, gel filtration, antigen-bound solid phase, or only antibody collected using an active adsorbent such as protein A or protein G And a specific purification method of dissociating the bond to obtain an antibody].
  • immunoglobulin separation and purification e.g., salting out, alcohol precipitation, isoelectric precipitation.
  • electrophoresis e.g., electrophoresis, adsorption / desorption using an ion exchanger (e.g., DEAE), ultracentrifugation, gel filtration, antigen-bound solid phase, or only antibody collected using an active adsorbent such as protein A or protein G And a specific
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a method known per se or a method analogous thereto. For example, a complex of an immunizing antigen (antigen such as a protein) and a carrier protein is formed, and a mammal is immunized in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody. It can be produced by collecting and separating and purifying the antibody.
  • the type of carrier protein and the mixing ratio of the carrier and the hapten depend on the efficiency of the antibody against the hapten immunized by cross-linking the carrier. It is possible to crosslink any substance at any ratio, if possible.For example, serum albumin, thyroglobulin, keyhole, lindet, hemocyanin, etc. are converted into hapten 1 by weight. On the other hand, a method of coupling at a ratio of about 0.1 to 20 and preferably about 1 to 5 is used.
  • various condensing agents can be used for force coupling between the hapten and the carrier.
  • an active ester reagent containing a daltaraldehyde / carboimide, a maleimide active ester, a thiol group, or a dithioviridyl group is used.
  • the condensation product is administered to a mammal at a site capable of producing an antibody by itself or together with a carrier and a diluent.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration.
  • the administration can usually be performed once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
  • the polyclonal antibody can be collected from blood, ascites, or the like, preferably from blood, of the mammal immunized by the above method.
  • a compound eg, agonist, antagonist, etc.
  • a compound that changes the binding between SS169 and its receptor (or ligand)
  • the agonist or antagonist can be screened for each It can be used for the prevention and treatment of seed diseases.
  • DNA of the present invention DNAs encoding SS169s, SS169 or a partial peptide thereof (hereinafter, may be abbreviated as “DNA of the present invention”), antisense nucleic acids of the present invention, and antibodies against SS169s (hereinafter, “antibodies of the present invention” ) May be specifically described below.
  • SS169 or a partial peptide thereof or a salt thereof is useful as a reagent for searching for or determining a compound (receptor or ligand) having a specific affinity for SS169 or a salt thereof.
  • the present invention is characterized in that SS169s are brought into contact with a test compound.
  • a method for determining a compound having specific affinity for SS169 or a salt thereof is provided.
  • known ligands for example, angiotensin, bombesin, cannabinoid, cholecystokinin, gnoletamine, serotonin, melatonin, neuropeptide ⁇ , opioid, purine, pasoprescin, oxytocin, ⁇ ACAP, secretin, glucagon, canolecitin
  • Adrenomedullin somatostatin, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP (passoactive intestinanole and reduced polypeptide), somatostatin, dopamine, motilin, amylin, bradykinin, CGRP (calcito undine relayed peptide) ), Leukotriene, pancreastatin, prostaglandin, thromboxane, adenosine, adrenaline, ⁇ and / 3-chemokine
  • a tissue extract, cell culture supernatant, or the like is added to cells expressing SS169s, and fractionation is performed using cell stimulating activity as an index, thereby finally obtaining a single ligand.
  • SS169s can be added to intact cells, cell membrane fractions, etc., and fractionated using the cell stimulating activity, binding activity, etc. as indicators, to finally obtain a single receptor.
  • a method for determining a compound having a specific affinity for SS169 or a salt thereof is to use SS169s or construct an expression system for recombinant SS169 or a partial peptide thereof, and construct the expression system.
  • cell stimulating activity eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular c AMP generation, intracellular c
  • the binding amount of the test compound to SS169s, the cell stimulating activity, etc. Is measured.
  • the present invention provides
  • the labeled test compound is added to SS169-producing cells or a cell membrane fraction thereof, or extracellular fluid or cell culture supernatant (in this case, for example, the solid phase on which the antibody of the present invention is immobilized) Immobilize SS169 using a cell culture plate, etc.)
  • Specific affinity for SS169 or a salt thereof which comprises measuring the amount of a labeled test compound bound to the cell, the membrane fraction, the extracellular solution or the cell culture supernatant.
  • a labeled test compound was expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing DNA coding for SS169 or a partial peptide thereof, or SS169s secreted by the culture supernatant (In this case, for example, when the above-mentioned antibody of the present invention is brought into contact with a solid phase (eg, a cell culture plate or the like) on which the antibody of the present invention is immobilized, the labeled test compound is applied to SS169s.
  • a solid phase eg, a cell culture plate or the like
  • a method for determining a compound having a specific affinity for SS169 or a salt thereof which comprises measuring the amount of binding; (4) a test compound (or a cell containing a test compound, such as a membrane protein, etc., on the cell membrane; Cell stimulating activity via SS169 (or a test compound, such as a membrane protein) when cells are contacted with cells producing SS169 (or culture supernatant of cells secreting SS169).
  • Rakidon acid release Rakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AMP production, intracellular c GMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential change, intracellular protein phosphorylation, c one fos activity
  • a method for determining the ligand (or receptor) for SS169 or a salt thereof which comprises measuring the activity of promoting or suppressing the activation or reduction of pH.
  • test compound or a cell containing a membrane protein or the like as a test compound on the cell membrane
  • SS169s (or SS169s secreted into the culture supernatant by culturing a transformant containing a DNA encoding SS169 or a partial peptide thereof) (or test I spoon compound in which membrane proteins, etc.) mediated cell stimulating activity (e.g., Arakidon acid release, ⁇ acetylcholine release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AMP production, intracellular c GMP product, Inoshito one Berlin Acid production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, etc.
  • a ligand (or receptor) for SS169 or a salt thereof which is characterized by measuring.
  • the SS169s used in the method for determining the ligand (or receptor) may be any of the above-mentioned SS169 or its partial peptides or salts thereof, but were expressed in large amounts using animal cells.
  • Recombinant SS169 is suitable.
  • the above-described expression method is used, but it is preferable that DNA encoding SS169 be expressed in mammalian cells or insect cells.
  • cDNA is usually used, but is not necessarily limited thereto.
  • a gene fragment or a synthetic DNA may be used.
  • the DNA fragment In order to introduce the DNA fragment encoding SS169 into host animal (or insect) cells and express them efficiently, the DNA fragment must be transformed with a SV40-derived promoter, a retrovirus / less promoter, Mouth thionine promoter, human heat shock promoter, cytomegaloy / respromoter, SR o! It is preferably incorporated downstream of a tar or the like.
  • the SS169s may be SS169s purified according to a method known per se, or may secrete cells that produce SS169s or cell membrane fractions thereof, or SS169s. May be used as the culture supernatant of the cells to be removed.
  • the cells When cells producing SS169s are used in the method for determining a ligand of the present invention, the cells may be immobilized with daltaraldehyde, formalin, or the like.
  • the immobilization method itself can be performed according to the method of ⁇ P.
  • a cell that produces SS169s refers to a host cell that has expressed SS169s.
  • Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells and the like are used as the vesicle.
  • the cell membrane fraction refers to a fraction abundant in cell membrane obtained by a method known per se after cell disruption. Cells can be disrupted by crushing cells with a Potter-Elvehjem homogenizer, crushing with a Warlinda blender or Polytron (Kinematica), crushing with ultrasonic waves, or using a narrow nozzle while pressing with a French press.
  • a fractionation method using a centrifugal force such as a fractionation centrifugation method or a density gradient centrifugation method is mainly used.
  • centrifuged cell stones are centrifuged at a low speed (500 rpm to 300 rpm) for a short time (usually about 1 to L 0 minutes), and the supernatant is further spun at a high speed (150 rpm to 150 rpm).
  • the mixture is centrifuged usually at 3000 rpm) for 30 minutes to 2 hours, and the resulting precipitate is used as a membrane fraction.
  • the membrane fraction is rich in expressed SS169s and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • the amount of SS169 such cells or in that the membrane fraction to produce SS169 compound is 1 0 3 is preferably from ⁇ 1 0 8 molecules per cell, 1 0 5 to 1 0 7 and more preferably the molecular It is.
  • test compound labeled with an appropriate SS169-containing membrane fraction is required.
  • SS169-containing membrane fraction a natural SS169-containing membrane fraction or a recombinant SS169-containing membrane fraction having an activity equivalent thereto is desirable.
  • equivalent activity means equivalent ligand binding activity, signal transduction action, and the like.
  • SS169 analog by suspending the cell producing SS169 or its membrane fraction in a buffer suitable for the determination method. I do. Buffers such as phosphate buffer of pH 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) and Tris-monohydrochloride buffer
  • Any buffer that does not inhibit the binding of SS169 to its ligand may be used.
  • various proteins such as CHAP S, Tween-80 TM (Kao Ichi Atlas), digitonin, dexcholate, etc. You can also get calories.
  • a protease inhibitor such as PMS F, leptin, E-64 (manufactured by Peptide Research Laboratories), pepstatin and the like can be added for the purpose of suppressing the degradation of the receptor and ligand by the protease.
  • the reaction solution is filtered through a glass fiber filter paper or the like, washed with an appropriate amount of the same buffer, and the radioactivity remaining on the glass filter paper is measured using a liquid scintillation counter or a y -counter.
  • B-NSB which is obtained by subtracting the non-specific binding amount (NSB) from the total binding amount (B)
  • the cell stimulating activity via SS169 for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2 + release, intracellular c AM P production, intracellular c GMP production formation, inositol phosphate production, change in cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, c - ⁇ OS activation, activity for promoting reduction, etc. p H Or its inhibitory activity
  • SS169 for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2 + release, intracellular c AM P production, intracellular c GMP production formation, inositol phosphate production, change in cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, c - ⁇ OS activation, activity for promoting reduction, etc.
  • p H Or its inhibitory activity can be measured using a known method or a commercially available measurement kit. Specifically, first, cells producing SS169s are cultured in a multiwell plate or the like.
  • the method for determining a compound having specific affinity for SS169 has been specifically described by taking up the case where SS169 is a membrane protein. In this case, the determination of a compound having a specific affinity can be easily carried out.
  • a kit for determining a compound having specific affinity for SS169 or a salt thereof contains SS169s, SS169-producing cells or their membrane fractions, and culture supernatants of SS169-secreting cells.
  • kits for determining the ligand (receptor) of the present invention include the following.
  • CHO cells expressing the SS169 class passaged 5 X 10 5 cells on a 12-well plate, 37. C, 5% C0 2, which were cultured for 2 days in 95% air (SS169 secretion protein ⁇ , the plate is coated with anti-SS169 antibody).
  • Test conjugates that are poorly soluble in water are dissolved in dimethyl honoleamide, DMSO, methanol and the like.
  • the same as the labeled compound is prepared at a concentration of 100-: L 000-fold higher.
  • ligands capable of binding to SS169 or a salt thereof include substances specifically present in the brain, pituitary gland, kidney, and the like. Specifically, angiotensin, bombesin, cannabinoid, Cholecystokinin, Glutamine, Serotonin, Melatonin, Neuropeptide ⁇ , Opioid, Purine, Pasoprescin, Oxitocin, PACAP, Secretin, Glucagon, Calcitonin, Adrenomedullin, Somatostatin, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PT H, VIH (PasoActive Intestinal and Related Polypeptide), somatostatin, dopamine, motilin, amylin, bradykinin, CGRP (calcitonin gene-related peptide), leukotriene, pancreastatin, prostaglandin , Thromboxane, adenosine, Adore Nalin, alpha and
  • the amount of SS169 may be reduced by administering DS169s to the patient.
  • ( 2 ) (a) by administering to the patient DNA expressing SS169 or a partial peptide thereof, or (mouth) SS169 or a partial peptide thereof in target cells. Transplantation of the cells into the patient after introduction and expression of DNA encoding the same, thereby increasing the amount of SS169 in the patient's body and sufficiently exerting the action of the ligand (or receptor). That is, SS169s or the DNA encoding the same are useful as safe and low-toxic agents for the prevention and treatment of diseases associated with SS169 dysfunction.
  • SS169 is expressed almost exclusively in skeletal muscle, and is highly expressed in diabetic model mice and re-feeding after fasting.Since its expression is affected by insulin, it also affects the action of insulin.
  • Diseases associated with SS169 dysfunction include (i) skeletal muscle cell differentiation and abnormalities or (ii) metabolic abnormalities (insufficiency or enhancement) (eg, metabolic abnormalities in liver, adipose tissue, skeletal muscle, knee, etc.) (Particularly glucose and lipid metabolism abnormalities), but not limited thereto; the same applies to the following) (eg, obesity, diabetes, impaired glucose tolerance, arteriosclerosis, hypertension, hyperlipidemia, etc.) Is mentioned.
  • DNA of the present invention may be used as pharmacologically After mixing with an acceptable carrier to form a pharmaceutical composition, it can be used as a prophylactic and / or therapeutic agent for diseases related to SS169 dysfunction.
  • the pharmacologically acceptable carrier various organic or inorganic carrier substances commonly used as a drug substance are used, and excipients, lubricants, binders, disintegrants in solid preparations, and solvents in liquid preparations It is formulated as a solubilizer, suspending agent, tonicity agent, buffer, soothing agent and the like. If necessary, pharmaceutical additives such as preservatives, antioxidants, coloring agents and sweeteners can also be used.
  • excipients include lactose, sucrose, D-mannitol, D-sorbitol, starch, pregelatinized starch, dextrin, crystalline cellulose, low-substituted hydroxypropyl / recellulose, and carboxymethylsenorelose sodium.
  • Preferred examples of the lubricant include magnesium stearate, calcium stearate, talc, colloidal silica and the like.
  • binder examples include pregelatinized starch, sucrose, gelatin, acacia, meth / resenololose, olenoxoximethi / rese / relose, canolepox methinoresorenose sodium, crystalline cellulose, sucrose, D— Examples include mannitol, trehalose, dextrin, pullulan, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, and polyvierpyrrolidone.
  • disintegrants include fucose, sucrose, starch, carboxymethyl cell mouth.
  • Canolepox methinoresenololose force / residue canolepox methinoresenololose force / residue, cross force / remelose sodium, carboxymethyl starch sodium, light caffeic anhydride, low-substituted hydroxypropyl cellulose, and the like.
  • the solvent include water, physiological saline, Ringer's solution, alcohol, propylene glycol / polyethylene glycol, sesame oil, corn oil, olive oil, cottonseed oil and the like.
  • solubilizers include polyethylene glycol, propylene glycol, D-mannitol, trehalose, benzyl benzoate, ethanol, and triethanol.
  • examples include saminomethane, cholesterol, triethanolamine, sodium carbonate, sodium citrate, sodium salicylate, and sodium acetate.
  • the suspending agent include surfactants such as stearyltriethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, and glyceryl monostearate; Hydrophilic polymers such as alcohol / poly, polybutylpyrrolidone, sodium canolepoxymethinolecellulose sodium, methinoresenolose, hydroxymethyl / resenolose, hydroxyethynolecellulose, and hydroxypropylcellulose; polysorbates, Polyoxyethylene hydrogenated castor oil and the like.
  • surfactants such as stearyltriethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, and glyceryl monostearate
  • Hydrophilic polymers such as alcohol / poly, polybutylpyrrolidone, sodium can
  • Suitable examples of the tonicity agent include sodium chloride, glycerin, D-mannitol, D-sorbitol, pudose and the like.
  • buffer solutions such as phosphate, acetate, carbonate, and citrate.
  • Preferred examples of the soothing agent include benzyl alcohol and the like.
  • preservatives include paraoxybenzoic acid esters, chlorobutanol, benzyl alcohol, phenethyl alcohol, dehydroacetic acid, sorbic acid and the like.
  • the antioxidant include sulfite, asconolelebate and the like.
  • suitable examples of the coloring agent include water-soluble edible tar dyes (e.g., edible dyes such as edible red # 2, # 3 and edible yellow # 4 and # 5, edible blue # 1 and # 2, and water-insoluble Lake dyes (eg, the aluminum salt of the water-soluble edible tar dye, etc.), and natural dyes (eg, / 3-carotene, chlorophyll, redwood).
  • Preferred examples of the sweetener include saccharin sodium, dicalidium glycyrrhizinate, aspartame, stevia and the like.
  • Examples of the dosage form of the pharmaceutical composition include tablets, capsules (including soft capsules and microcapsules), granules, powders, syrups, emulsions, and suspensions. Oral; starvation (eg, simple subcutaneous, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection), external preparation (eg, nasal preparation, transdermal preparation, ointment, etc.) ), Suppositories (eg, rectal suppositories, vaginal suppositories, etc.), parenteral preparations such as pellets, infusions, sustained-release preparations (eg, sustained-release microcapsules, etc.).
  • starvation eg, simple subcutaneous, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection
  • external preparation eg, nasal preparation, transdermal preparation, ointment, etc.
  • Suppositories eg, rectal suppositories, vaginal suppositories, etc.
  • the pharmaceutical composition can be produced by a method commonly used in the technical field of formulation, for example, the method described in the Japanese Pharmacopoeia. The specific manufacturing method of the drug product is described below in detail.
  • the content of the active ingredient in the pharmaceutical composition varies depending on the dosage form, the dose of the active ingredient, and the like, and is, for example, about 0.1 to 100% by weight.
  • oral preparations include, as active ingredients, excipients (eg, lactose, sucrose, starch, D-mannitol, etc.), disintegrants (eg, carboxymethylcellular monocalcium, etc.), binders (eg, ⁇ Compression starch, gum arabic, carboxymethylcellulose, hydroxypropylcellulose, polyvinylpyrrolidone, etc.) or lubricants (eg, talc, magnesium stearate, polyethylene glycol 600, etc.) and compression molded. Then, if necessary, it is produced by coating with a coating base in a manner known per se for the purpose of taste masking, enteric coating or sustainability.
  • excipients eg, lactose, sucrose, starch, D-mannitol, etc.
  • disintegrants eg, carboxymethylcellular monocalcium, etc.
  • binders eg, ⁇ Compression starch, gum arabic, carboxymethylcellulose, hydroxypropylcellulose, polyviny
  • the coating base examples include a sugar coating base, a water-soluble film coating base, an enteric film coating base, a sustained release film coating base, and the like.
  • sucrose is used, and one or more selected from talc, precipitated calcium carbonate, gelatin, acacia, pullulan, carnapalow, and the like.
  • Two or more kinds may be used in combination.
  • water-soluble film coating base examples include cellulosic polymers such as hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethinolese / rerose, hydroxyethynoresenorelose, and methylhydroxyethylserose; polyvilaceta
  • enteric film coating bases include phenolic polymers such as hydroxypropylmethyl cenorellose phthalate, hydroxypropinolemethyi / resenolerose acetate succinate, carboxymethylethylcellulose and cellulose acetate phthalate; Copolymer L [Eudragit L (trade name), Rohm Pharma Co., Ltd.], Methacrylic acid copolymer LD [Eudragit L — 30 D55 (trade name), Rohm Pharma Co., Ltd.], Methacrylic acid copolymer S [Eudragit S (trade name), Rohm Pharma Co., Ltd.] and natural products such as shellac.
  • sustained-release film coating base examples include cellulosic polymers such as ethyl cellulose; aminoalkyl methacrylate copolymer RS (Eudragit RS (trade name), Rohm Pharma Co., Ltd.); ethyl acrylate; methyl methacrylate An acrylic acid polymer such as a copolymer suspension [Eudragit NE (trade name), Rohm Pharma Co., Ltd.] and the like.
  • cellulosic polymers such as ethyl cellulose; aminoalkyl methacrylate copolymer RS (Eudragit RS (trade name), Rohm Pharma Co., Ltd.); ethyl acrylate; methyl methacrylate
  • An acrylic acid polymer such as a copolymer suspension [Eudragit NE (trade name), Rohm Pharma Co., Ltd.] and the like.
  • the above-mentioned coating bases may be used by mixing two or more kinds thereof at an appropriate ratio. Further, at the time of coating, a light shielding agent such as titanium oxide, iron sesquioxide and the like may be used.
  • Injectables contain active ingredients as dispersants (eg, polysorbate 80, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60, polyethylene glycol, carboxymethylcellulose, sodium alginate, etc.), preservatives (eg, methyl paraben, propyl paraben, benzyl alcohol) , Chlorobutanol, phenol, etc.), isotonic agents (eg, sodium chloride, glycerin, D-mannitol, D-sorbitol, dextrose, etc.) and aqueous solvents (eg, distilled water, physiological saline, Ringer's solution, etc.) ) Or an oily solvent (eg, vegetable oils such as olive oil, sesame oil, cottonseed oil, corn oil, propylene glycol, etc.), and are manufactured by suspending or emulsifying.
  • dispersants eg, polysorbate 80, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60, polyethylene glycol, carboxymethylcellulose, sodium alginate,
  • additives such as a solubilizing agent (eg, sodium salicylate, sodium acetate, etc.), a stabilizer (eg, human serum albumin, etc.), a soothing agent (eg, benzyl alcohol, etc.) are used. Is also good.
  • a solubilizing agent eg, sodium salicylate, sodium acetate, etc.
  • a stabilizer eg, human serum albumin, etc.
  • a soothing agent eg, benzyl alcohol, etc.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, for example, mammals
  • the DNA of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic or therapeutic agent
  • the DNA of the present invention is used alone or after being inserted into an appropriate expression vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, or an adeno-associated virus vector. It can also be administered according to conventional means.
  • the DNA of the present invention can be administered as it is or together with an auxiliary agent for promoting uptake, using a force gun such as a gene gun or a hydrogel catheter.
  • the dose of SS169 varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • oral administration in general, for example, in patients with abnormal glucose and lipid metabolism (weight 6 Okg), About 0.1 to 10 Omg per day, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 2 Omg.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method and the like. (With a body weight of 60 kg), it is convenient to administer about 0.01 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 2 Omg, and more preferably about 0.1 to about L Omg per day. . Even when the subject to be administered is not human, it can be administered in an amount converted per 6 Okg body weight.
  • the dosage of the DNA of the present invention may vary depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like. About 0.1-10 Omg per day, preferably about 1.0-5 Omg, more preferably about 1.0-20 mg. When administered parenterally, the single dose varies depending on the subject of administration, target organ, symptoms, administration method, etc. (Assuming 6 Ok g body weight), about 0.01 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to about L Omg per day Is convenient. Even when the subject to be administered is not a human, the dose can be administered in terms of a body weight of 6 Okg.
  • Antibodies to SS169s are involved in signal transduction functions involved in SS169, such as SS169-mediated cell stimulating activity (e.g., arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, change in cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, c- activation fo S, and activity or inhibiting activity) promotes pH reduction, etc. to inactivate (i.e. neutralize) it can.
  • SS169-mediated cell stimulating activity e.g., arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, change in cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, c- activation fo S, and activity or inhibiting activity
  • antisense nucleic acid of SS169 or its partial peptide is obtained by blocking transcription of SS169 gene, processing of transcript and / or translation from mRNA. Can inhibit the expression of SS169. Therefore, (1) the antibody of the present invention or (2) the antisense nucleic acid of the present invention can be used as a medicament for preventing or treating a disease associated with overexpression of SS169.
  • SS169 is expressed almost exclusively in skeletal muscle, and is highly expressed in diabetic model mice and re-feeding after fasting.Since its expression is affected by insulin, it also affects the action of insulin.
  • Useful for the prevention and treatment of diseases involving skeletal muscle cell differentiation and / or metabolic abnormalities (insufficiency or enhancement) eg, obesity, diabetes, impaired glucose tolerance, arteriosclerosis, hypertension, hyperlipidemia, etc. is there.
  • the antibody of the present invention and the antisense nucleic acid of the present invention can be formulated in the same manner as in the above “agent for preventing or treating diseases associated with SS169 dysfunction”. Also, the The antisense nucleic acid can be administered as it is by a gene gun or a catheter such as a hide mouth gel catheter.
  • the dosage of the antibody of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • oral administration in general, for example, in a patient with abnormal glucose and lipid metabolism (with a body weight of 60 kg), Is about 0.1 to: 100 mg L per day, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • it is usually used, for example, in patients with abnormal glucose and lipid metabolism (body weight 6).
  • the dosage of the antisense nucleic acid of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like. (With a body weight of 60 kg), it is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day. . Even if the subject of administration is not human, ⁇ can be administered in an amount equivalent to a body weight of 60 kg.
  • a nucleic acid containing the nucleotide sequence encoding SS169 or its initial translation product or a part thereof (hereinafter, referred to as “sense nucleic acid of the present invention”) or the antisense nucleic acid of the present invention can be used as a probe to produce a mammal.
  • Animals eg humans, rats, DNA or mRNA abnormalities (genetic abnormalities) encoding SS169 in rabbits, sheep, pigs, pigs, cats, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the above-described genetic diagnosis using the sense nucleic acid or the antisense nucleic acid of the present invention can be performed, for example, by the well-known Northern hybridization or PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 84-87). Page 9 (1989), Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America, Procedings of the National Academy of Sciences Vol. 86, pages 276-27, pp. 70 (1989)).
  • SS169 when a decrease in the expression of SS169 is detected by Northern hybridization, it can be diagnosed that, for example, the patient is suffering from a disease associated with SS169 dysfunction or is likely to suffer from the disease in the future. Conversely, if overexpression of SS169 is detected by Northern hybridization, for example, it is diagnosed that the patient is suffering from a disease associated with hyperactivity of SS169 or is likely to be affected in the future can do.
  • SS169 is expressed almost exclusively in skeletal muscle and is highly expressed in diabetic model mice and in refeeding after fasting, etc., and is involved in skeletal muscle cell division and Z or abnormal metabolism (insufficiency or enhancement) It is useful for the prevention and treatment of diseases (eg, obesity, diabetes, impaired glucose tolerance, arterial stiffness, hypertension, hyperlipidemia, etc.).
  • diseases eg, obesity, diabetes, impaired glucose tolerance, arterial stiffness, hypertension, hyperlipidemia, etc.
  • the sense nucleic acid of the present invention when used as a probe, can be used for screening compounds that change the expression level of SS169.
  • the present invention provides, for example, (i) non-human mammal (1) blood, (2) specific ⁇ ,
  • the measurement of the amount of SS169 mRNA is specifically performed as follows.
  • Non-human mammals eg, mouse, rat, rabbit, sheep, pig, pig, cat, dog, monkey, etc., more specifically, obese mouse, diabetic mouse, hypertension
  • Drugs eg, anti-obesity drugs, anti-diabetic drugs, antihypertensive drugs, vasoactive drugs, anti-cancer drugs, etc.
  • physical stress eg, flooding stress
  • tissues eg, brown or white adipose tissue, etc.
  • obtain cells skeletal muscle cells, fat cells, etc.
  • SS169 mRNA contained in the obtained cells and the like can be quantified by, for example, extracting mRNA from the cells and the like by a usual method, and using, for example, a technique such as TaqManPCR, and a method known per se. It can also be analyzed by performing a Northern blot.
  • a transformant expressing SS169 or its partial peptide can be prepared according to the method described above, and the mRNA of SS169 or its partial peptide contained in the transformant can be quantified and analyzed in the same manner. it can.
  • the test compound is administered at the same time as the physical stress, and after a certain period of time after the administration (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours), the cells Included Quantitation and analysis of the amount of SS169 mRNA
  • test conjugate is mixed with the medium, and cultured for a certain period of time (1 day to 7 days, preferably 1 day to 3 days, more preferably 2 to 3 days later), by quantifying and analyzing the mRNA amount of SS169 or its partial peptide contained in the transformant.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the above screening method is a compound having an action of changing the expression level of SS169, and specifically, (a) increasing the expression level of SS169, receptor (or ligand) a cell stimulating activity mediated by the interaction with (e.g., Arakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AMP production, intracellular c GMP product, inositol phosphate production, Compounds that enhance or inhibit cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, activation or suppression of c-fos, pH reduction, etc.) It is a compound that reduces the cell stimulating activity.
  • a cell stimulating activity mediated by the interaction with (e.g., Arakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AMP production, intracellular c GMP product, inositol phosphate production, Compounds that enhance or inhibit cell membrane potential,
  • Examples of the compound include a peptide, a protein, a non-peptidic compound, a synthetic compound, a fermentation product, and the like. These compounds may be novel compounds or known compounds.
  • the compound that enhances the cell stimulating activity is useful as a safe and low-toxicity drug for enhancing the physiological activity of SS169.
  • the compound that attenuates the cell stimulating activity is useful as a safe and low toxic drug for decreasing the physiological activity of SS169.
  • a compound or a salt thereof obtained by the above-mentioned screening method is used as a medicament, it can be formulated in the same manner as in the above-mentioned "agent for preventing / treating diseases associated with SS169 dysfunction".
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, for example, mammals
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • oral administration generally, for example, a patient with abnormal sugar and lipid metabolism (with a body weight of 60 kg)
  • the amount is about 0.1 to 100 mg per day, preferably about 1.0 to 5 Omg, more preferably about 1.0 to 2 Omg.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like. 6 O kg), about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to about LO mg per day. Is convenient. Even when the subject to be administered is not human, it can be administered in an amount calculated per 60 kg body weight.
  • SS169 is almost exclusively expressed in skeletal muscle, and is highly expressed in diabetes model mice and refeeding after fasting. From the above, (i) differentiation of skeletal muscle cells and / or (ii) metabolism (for example, metabolism in liver, adipose tissue, skeletal muscle, victory, etc. (especially sugar and lipid metabolism)), and the like. (Not limited; the same applies hereinafter). Therefore, compounds that alter the expression level of SS169 are useful for diseases associated with abnormal skeletal muscle cell differentiation and / or metabolism (insufficiency or enhancement) (eg, obesity, diabetes, impaired glucose tolerance, arteriosclerosis, high blood pressure, high blood pressure, etc.). It can be used as a preventive and therapeutic agent for lipemia.
  • abnormal skeletal muscle cell differentiation and / or metabolism insufficiency or enhancement
  • the compound when used as a preventive / therapeutic agent for a disease associated with dysfunction or enhancement of SS169, it can be formulated in the same manner as in the above-mentioned "prophylactic / therapeutic agent for a disease associated with SS169 dysfunction". it can.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, so they can be administered to mammals (eg, humans, rats, rabbits, sheep, pigs, pigs, cats, dogs, monkeys, etc.). be able to.
  • the dosage of the compound or its salt varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • Is about 0.1 to 10 Omg per day preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc. (As 6 O kg), it is convenient to administer about 0.01 to 30 mg per day, preferably about 0.:! To about 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day. Even when the subject is a non-human subject, the dose can be administered in terms of 60 kg of body weight.
  • SS169s have a binding property to a ligand (or receptor) for SS169, the concentration of the ligand (or receptor) in a living body can be quantified with high sensitivity.
  • the quantification method of the present invention can be used, for example, in combination with a competition method. That is, the concentration of the ligand (or receptor) in the subject can be measured by bringing the subject into contact with SS169s. Specifically, for example, it can be used according to the method described in (1) or (2) below or a method analogous thereto.
  • the expression system of the force using SS169s or the recombinant SS169 was constructed, and the expression system was used.
  • compounds eg, peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, etc.
  • salts thereof that alter the binding between SS169 and its ligand (or receptor) can be used. Screening can be performed efficiently.
  • Such compounds via a receptor-stimulating activity (e.g., ⁇ Rakidon acid release, Asechirukorin release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AMP production formation, intracellular c GMP product, inositol Compounds having an activity of promoting or inhibiting phosphoric acid production, fluctuations in cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, activation of c-fos, reduction of pH, etc.
  • a receptor-stimulating activity e.g., ⁇ Rakidon acid release, Asechirukorin release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AMP production formation, intracellular c GMP product, inositol Compounds having an activity of promoting or inhibiting phosphoric acid production, fluctuations in cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, activation of c-fos, reduction of pH, etc.
  • agonist a compound having no cell stimulating activity (antagonist), (c) a compound that enhances the binding force between SS169 and its ligand (or receptor), or (2) SS169 and its ligand (or receptor)
  • the compound (a) is preferably screened by the above-described ligand determination method).
  • the present invention provides a comparison between (i) contacting SS169s with their ligands (or receptors) and (ii) contacting SS169s with their ligands (or receptors) and test compounds.
  • the above-mentioned screening method is characterized by measuring the amount of binding of a ligand (or receptor) to SS169, the cell stimulating activity, etc. in the cases (i) and (ii) and comparing them.
  • the present invention provides
  • Binding amount for class 9 A method of screening for a conjugate or a salt thereof that alters the binding 14 between SS169 and its ligand (or receptor), characterized by measuring and comparing
  • the labeled ligand (or receptor) is used to bind SS169-producing cells or their membrane fraction, or extracellular fluid or cell culture supernatant (for example, in this case, the antibody of the present invention is immobilized).
  • a solid phase eg, immobilizing SS169 with a cell culture plate, etc.
  • a labeled ligand (or receptor) and a test compound with cells producing SS169 or its membrane fraction
  • the amount of labeled ligand (or receptor) bound to the cell or membrane fraction, or extracellular fluid or cell culture supernatant when exposed to extracellular fluid or cell culture supernatant and compared.
  • a method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding between SS169 and its ligand (or receptor)
  • a compound that activates SS169 eg, a ligand for SS169
  • a compound that is activated by SS169 eg, a receptor for SS169
  • a compound that activates SS169 or a compound that is activated by SS169 and a test compound are added to a cell that expresses SS169 on the cell membrane or a culture in which SS169 is secreted.
  • cell stimulating activity via the receptor one e.g., ⁇ La Kydon acid free, Asechirukorin release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AMP production, intracellular c GM P product, inositol SS169 is characterized by measuring and comparing phosphoric acid production, cell membrane potential fluctuations, phosphorylation of intracellular proteins, activation of c-fos, and activities that promote or suppress pH reduction.
  • a method of screening for a compound or a salt thereof that alters the binding between the compound and its ligand (or receptor) is characterized by measuring and comparing phosphoric acid production, cell membrane potential fluctuations, phosphorylation of intracellular proteins, activation of c-fos, and activities that promote or suppress pH reduction.
  • culturing a transformant containing the DNA of the present invention with a compound that activates SS169 for example, a ligand for SS169
  • a compound that is activated by SS169 for example, a receptor for SS169
  • the compound activated by the method and the test conjugate are used to transform SS169s or the DNA containing the DNA of the present invention expressed on the cell membrane by culturing the transformant containing the DNA of the present invention.
  • Receptor-mediated cell stimulating activity e.g., arachidonic acid release, acetylcholine
  • Emissions release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AMP production, intracellular c GMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuations, phosphorylation of intracellular proteins, c- activation of fos, the p H
  • the SS169 class used in the screening methods of the present invention may be, but mammals that produce SS169 The cell membrane fraction or extracellular fluid of the organ It is suitable.
  • human-derived SS169s expressed in large amounts using recombinants are suitable for screening.
  • the DNA of the present invention is expressed in mammalian cells or insect cells.
  • cDNA is used, but is not necessarily limited thereto.
  • a gene fragment or a synthetic DNA may be used.
  • the DNA fragment In order to introduce a DNA fragment encoding SS169 or a partial peptide thereof into host animal (insect) cells and express them efficiently, the DNA fragment must be derived from an SV40-derived promoter, a retrodinores promoter, Meta mouth thionein promoter, human heat shock promoter, cytomegaloinores promoter,
  • the promoter into downstream such as the SRa promoter and the polyhedrin promoter of nuclear polyhedrosis virus (NPV) belonging to a paculovirus using an insect as a host.
  • NPV nuclear polyhedrosis virus
  • SS169s used in the screening method of the present invention may be SS169s purified according to a method known per se, or cells producing SS169s or cell membrane fraction thereof, or SS169s. May be used as the culture supernatant of cells that secrete s.
  • the cells when cells producing SS169s are used, the cells may be immobilized with daltaraldehyde, formalin, or the like.
  • the immobilization method can be performed according to a method known per se.
  • Cells producing SS169s refer to host cells expressing SS169s, and Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells, and the like are used as the host cells.
  • the cell membrane fraction refers to a fraction abundant in cell membrane obtained by a method known per se after cell framing.
  • Cell crushing methods include crushing cells with a Potter-Elvehjem homogenizer, Perling blender and poly. Examples include crushing by TRON (manufactured by Kinematica), crushing by ultrasonic waves, and crushing by ejecting cells from a thin nozzle while applying pressure with a French press.
  • a fractionation method using a centrifugal force such as a fractionation centrifugation method or a density gradient centrifugation method is mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 3000 rpm) for a short time (typically, about 1 to 10 minutes), and the supernatant is centrifuged at a higher speed (1 to 10 min).
  • the membrane fraction is rich in expressed SS169s and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • the amount of SS169s in cells producing SS169s or in the membrane fraction thereof is preferably 10 3 to 10 8 molecules per cell, and more preferably 10 5 to 10 7 molecules per cell.
  • the SS169-containing membrane fraction is preferably a natural SS169-containing membrane fraction or a recombinant SS169-containing membrane fraction having an activity equivalent thereto.
  • equivalent activity refers to equivalent ligand binding activity '14, signal transduction action and the like.
  • labeled ligand a labeled ligand, a labeled ligand analog compound and the like are used.
  • [3 H], 2 5 I], 4 C] such as a labeled ligand is used in such [3 5 s].
  • SS169 SS169 class product
  • Buffers include ⁇ ⁇ 4-10 (preferably TDH6-8) phosphate buffer, Any buffer that does not inhibit the binding between SS169 and its ligand, such as squirrel monohydrochloride buffer, may be used.
  • a surfactant such as CHAPS, Tween-80 TM (Kaoichi Atlas), digitonin, and dexcholate can be added to the buffer.
  • protease inhibitors such as PMSF, leptin, E-64 (manufactured by Peptide Research Institute) and pepstatin can be added for the purpose of suppressing the degradation of receptors and ligands by proteases.
  • the reaction is carried out at about 0 to 50 ° C, preferably at about 4 ° C to 37 ° C, for about 20 minutes to 24 hours, preferably for about 30 minutes to 3 hours.
  • the reaction solution is filtered through a glass filter and the like, washed with an appropriate amount of the same buffer, and the radioactivity remaining on the glass filter is measured by a liquid scintillation counter or a y-counter.
  • the count (B. One NSB) obtained by subtracting the non-specific binding amount (NSB) from the force (B.) when no antagonist is present is 100%
  • the specific binding amount (B-NSB) ) Potency For example, a test compound that is 50% or less can be selected as a candidate substance having inhibitory ability.
  • AMP production intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c-fos, activity to promote or suppress pH reduction, etc.
  • cells producing SS169s are cultured in a multiwell plate or the like. Use fresh media or cells before screening. Replace with a suitable buffer that does not show toxicity, add the test compound, etc., incubate for a certain period of time, extract the cells or collect the supernatant, and quantitate the resulting product according to each method. If the production of a substance that serves as an indicator of cell stimulating activity (eg, arachidonic acid) is difficult to perform due to the presence of a degrading enzyme contained in the cells, an inhibitor for the degrading enzyme is added to the mixture to perform an assay. Is also good. In addition, activities such as suppression of cAMP production can be detected as an activity of inhibiting production of cells whose basal production has been increased by forskolin or the like.
  • a substance that serves as an indicator of cell stimulating activity eg, arachidonic acid
  • SS169s For screening by measuring cell stimulating activity, appropriate cells expressing SS169s on the membrane are required. As cells expressing SS169s, cell lines producing natural SS169 and cell lines expressing the above-mentioned recombinant SS169s are desirable.
  • test compounds for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, etc. are used. Or a compound of ⁇ .
  • Examples of the screening kit of the present invention include the following.
  • the solution may be sterilized by filtration through a 0.45 m filter and stored at 4 ° C, or may be prepared at use.
  • the ligand (receptor) is dissolved in PBS containing 0.1% ⁇ serum albumin (manufactured by Sigma) so as to be ImM, and stored at 120 ° C.
  • a proteoliposome in which a receptor protein is embedded in a liposome membrane having an appropriate lipid composition is suspended in an appropriate dispersion medium (water, PBS, etc.), and heated at 4 ° C. The stored one can also be used.
  • a compound or a salt thereof obtained by using the above-described screening method or screening kit is a compound having an action of changing the binding between SS169 and a compound having specific affinity for it (ligand or receptor).
  • ligand or receptor a compound having an action of changing the binding between SS169 and a compound having specific affinity for it (ligand or receptor).
  • cell stimulating activity via ligand-receptor interaction eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, Compounds that have the activity of promoting or inhibiting inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuations, phosphorylation of intracellular proteins, activation of cfos, reduction of pH, etc.
  • agonist eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, Compounds that have the activity of promoting or inhibiting
  • the compound examples include a peptide, a protein, a non-peptidic compound, a synthetic compound, a fermentation product, and the like, and these compounds may be novel compounds or known compounds. Since the agonist for SS169 (or SS169 receptor) has the same action as the biological activity of ligand (or SS169) for SS169, it is useful as a safe and low-toxic drug depending on the ligand activity. It is.
  • An antagonist to SS169 can suppress the physiological activity of the ligand for SS169 (or SS169), and is therefore useful as a safe and low-toxic drug for suppressing the ligand activity.
  • a compound that enhances the binding force between SS169 and its ligand (or receptor) is useful as a safe and low-toxic drug for enhancing the physiological activity of the ligand for SS169 (or SS169).
  • a compound that decreases the binding force between SS169 and its ligand (or receptor) is useful as a safe and low-toxicity drug for reducing the biological activity of the ligand for SS169 (or SS169).
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, and are administered, for example, to mammals (eg, humans, rats, puppies, sheep, pigs, puppies, cats, dogs, monkeys, etc.). be able to.
  • mammals eg, humans, rats, puppies, sheep, pigs, puppies, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like. Is from about 0.1 to: LO Omg per day, preferably from about 1.0 to 50 mg, more preferably from about 1.0 to 20 mg. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, and the like. About 0.1 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to about L Omg per day. It is convenient to administer. Even when the subject to be administered is not a human, the dose can be administered in terms of per 6 O kg of body weight.
  • SS169 is expressed almost exclusively in skeletal muscle, and is highly expressed in diabetic model mice and refeeding after fasting, etc., so that skeletal muscle cells are divided and / or metabolized (especially sugar and lipid metabolism). It is thought to play an important role in the regulation of. Therefore, compounds (agonists, antagonists) that alter the binding between SS169 and its ligand (or receptor) are useful in diseases involving skeletal muscle cell differentiation Z or metabolic abnormalities (failure or hyperactivity). (Eg, obesity, diabetes, impaired glucose tolerance, arteriosclerosis, hypertension, hyperlipidemia, etc.).
  • the compound When the compound is used as a prophylactic / therapeutic agent for a disease associated with SS169 dysfunction or enhancement, it should be formulated in the same manner as the above-mentioned "prophylactic / therapeutic agent for a disease associated with SS169 dysfunction". Can be.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, and are administered, for example, to mammals (eg, humans, rats, puppies, sheep, pigs, puppies, cats, dogs, monkeys, etc.). be able to.
  • mammals eg, humans, rats, puppies, sheep, pigs, puppies, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • oral administration in general, for example, a patient having abnormal glucose and lipid metabolism (assuming a body weight of 60 kg).
  • the amount is about 0.1 to: L 00 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, and the like. 60 kg), about 0.01 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to about L Omg per day. It is convenient to administer. Even when the subject to be administered is not a human, the dose can be administered in terms of per 6 O kg of body weight.
  • the antibody of the present invention can specifically recognize SS169s, it can be used for quantification of SS169s in a test solution, particularly for quantification by sandwich immunoassay. That is, the present invention provides, for example, (i) reacting the antibody of the present invention with a test solution or a labeled protein in a competitive manner, and measuring the ratio of the labeled protein or the like bound to the antibody.
  • a method for quantifying SS169s in a test solution wherein (ii) the test solution and the antibody of the present invention and the labeled antibody of the present invention insolubilized on a carrier are simultaneously or continuously used.
  • the present invention provides a method for quantifying SS169s in a test solution, which comprises measuring the activity of a labeling agent on an insolubilized carrier after the reaction.
  • the insoluble antibody and the labeled antibody have an antigen recognition site such that they do not interfere with binding to SS169s (for example, the N-terminal of one antibody S169s). , And the other antibody reacts with the C-terminal of SS169s).
  • the monoclonal antibody of the present invention In addition to measuring SS169s using a monoclonal antibody against SS169s (hereinafter sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention), detection by tissue staining or the like is also possible.
  • the antibody molecule itself may be used, or F (ab,) 2, Fab 'or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the measurement method using an antibody against SS169s is not particularly limited, and the amount of the antibody, the antigen, or the antibody-antigen complex corresponding to the amount of the antigen (eg, the amount of SS169) in the liquid to be measured is determined.
  • Any measurement method may be used as long as it is detected by physical or physical means and calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of the antigen.
  • a nephelometry, a competition method, an immunometric method, and a sandwich method are preferably used, and in terms of sensitivity and specificity, it is particularly preferable to use a sandwich method described later.
  • Examples of the labeling agent used in the measurement method using the labeling substance include, for example, radioisotope Elements, enzymes, fluorescent substances, luminescent substances, etc. are used.
  • the »f isotope if example embodiment, 2 5 I], 3 1 I], [3 H], 4 C], etc..
  • As the above-mentioned enzyme a stable enzyme having a large specific activity is preferable.
  • As the fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescein isothiosinate and the like are used.
  • As the luminescent substance for example, luminol, luminol derivative, / reciferin, lucigenin and the like are used.
  • a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
  • insolubilization of the antigen or antibody physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used for insolubilizing and immobilizing proteins or enzymes may be used.
  • the carrier for example, insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon, and glass are used.
  • the test solution is reacted with the insoluble monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with the labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction).
  • primary reaction the insoluble monoclonal antibody of the present invention
  • secondary reaction the labeled monoclonal antibody of the present invention
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be in accordance with those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody does not necessarily need to be one kind, and a mixture of two or more kinds of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. May be used.
  • the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody having a different site for binding to SS169s.
  • the antibodies used in the primary and secondary reactions For example, if the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of SS169s, the antibody used in the primary reaction is preferably an antibody that recognizes other than the C-terminal, for example, the N-terminal Can be
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephrometry.
  • a competition method after the antigen in the test solution and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, the unreacted labeled antigen, (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated. (B / F separation)
  • the labeling amount of either B or F is measured, and the amount of antigen in the test solution is quantified.
  • a soluble antibody is used as the antibody, BZF separation is performed using polyethylene glycol, a liquid phase method using a second antibody against the above antibody, or a solid phase antibody is used as the first antibody.
  • a soluble antibody is used, and an immobilization method using an immobilized antibody as the second antibody is used.
  • the amount of insoluble precipitate generated as a result of an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and a small amount of sediment cannot be obtained, laser nefometry using laser scattering is preferably used.
  • SS169s can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • the antibody of the present invention can be used for specifically detecting SS169 or a salt thereof present in a subject such as a body fluid or a tissue. Further, it can be used for preparing an antibody column used for purifying SS169s, detecting SS169s in each fraction during purification, and analyzing the behavior of SS169 in test cells.
  • the antibody of the present invention can specifically recognize SS169s, it can be used for screening a compound that changes the amount of SS169 in the cell membrane or extracellularly. That is, the present invention, for example,
  • Transformants expressing SS169 or a partial peptide thereof are sectioned, and the staining degree of SS169s on the cell surface is quantified by using immunostaining method.
  • the present invention provides a method for screening for a compound that alters the amount of SS169s in a cell membrane by confirming the following.
  • the quantification of SS169s contained in the cell membrane fraction is specifically performed as follows.
  • Drugs eg, anti-obesity drugs, anti-diabetic drugs, anti-hypertensive drugs, vasoactive drugs, anti-cancer drugs, etc.
  • a mitogen eg, brown or white adipose tissue
  • cells eg, fat cells, muscle cells, etc.
  • an appropriate buffer eg, Tris-HCl buffer, phosphate buffer, HEPES buffer, etc.
  • a surfactant eg, Triton 100 "
  • the cell membrane fraction refers to a fraction abundant in cell membrane obtained by disrupting cells and then obtained by a method known per se.
  • Cells can be crushed by crushing the cells with a Potter-Elvehjem homogenizer, crushing with a Pelling Blender ⁇ polytron (manufactured by Kinematica), crushing by ultrasonic waves, or thinning the cells while applying pressure with a French press. Crushing by jetting from a nozzle can be mentioned.
  • a fractionation method using a centrifugal force such as a fractionation centrifugation method or a density gradient centrifugation method is mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 300 rpm) for a short time (typically about 1 to 10 minutes), and the supernatant is further spun at a higher speed (150 rpm to 300 rpm).
  • the mixture is centrifuged at 00 rm) for 30 minutes to 2 hours, and the resulting precipitate is used as the membrane fraction.
  • the membrane fraction is rich in SS169s and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • SS169s contained in the cell membrane fraction can be quantified by, for example, San Deutsch immunoassay using the antibody of the present invention, Western blot analysis, or the like.
  • Such a sandwich immunoassay can be performed in the same manner as described above, and the Western plot can be performed by its own means.
  • a transformant expressing SS169 or a partial peptide thereof is prepared according to the method described above, and SS169s contained in the cell membrane fraction can be quantified.
  • the screening of the conjugate that changes the amount of SS169 in the cell membrane is (i) A given time before giving a drug or physical stress to a normal or disease model non-human mammal (30 minutes to 24 hours before, preferably 30 minutes to 12 hours before, More preferably 1 hour to 6 hours ago) or after a certain time (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours), or a drug or
  • the test compound is administered at the same time as the physical stress, and after a lapse of a certain time after the administration (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 24 hours, more preferably 1 hour to 24 hours),
  • test compound When culturing the transformant according to a conventional method, the test compound is mixed with the medium, and after culturing for a certain period of time (1 to 7 days, preferably 1 to 3 days, more preferably 2 days) Or 3 days later) by quantifying the amount of SS169s in the cell membrane.
  • non-human mammals for example, mice, rats, rabbits, sheep, sheep, stags, horses, cats, dogs, monkeys, etc., more specifically, obese mice, diabetic mice, hypertension, etc.
  • Drugs eg, anti-obesity drugs, anti-diabetic drugs, antihypertensive drugs, vasoactive drugs, anti-cancer drugs, etc.
  • physical stress eg, flooding stress, electricity
  • tissues eg, brown or white adipose tissue
  • Gets cells eg, fat cells, muscle cells, etc.
  • the obtained cells and the like are used as a tissue section according to a conventional method, and immunostaining is performed using the antibody of the present invention.
  • immunostaining is performed using the antibody of the present invention.
  • the above screening method has been specifically described by taking up a screening method for a compound that changes the amount of SS169 in the cell membrane when SS169 is a membrane protein. Needless to say, screening for a compound that alters the amount of SS169 extracellularly can be easily performed when is a secreted protein.
  • the compound or a salt thereof obtained by the above screening method is a compound having an action of changing the amount of SS169 in the cell membrane or extracellularly. Specifically, (a) the amount of SS169 in the cell membrane or extracellularly by increasing the cell stimulating activity mediated by ligand one receptor interactions (e.g., Arakidon San ⁇ away, Asechirukorin release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AMP production, intracellular c GMP product, inositol phosphate Compounds that enhance or inhibit production, cell membrane potential fluctuations, phosphorylation of intracellular proteins, activation of c-fos, reduction of pH, etc.), (mouth) cell membrane or extracellular It is a compound that reduces the cell stimulating activity by reducing the amount of SS169.
  • ligand one receptor interactions e.g., Arakidon San ⁇ away, Asechirukorin release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AMP production, intracellular c GMP product, inos
  • Examples of the compound include a peptide, a protein, a non-peptidic compound, a synthetic compound, a fermentation product, and the like. These compounds may be novel compounds or known compounds.
  • the compound that enhances the cell stimulating activity is useful as a safe and low toxic drug for enhancing the physiological activity of SS169.
  • the compound that attenuates the cell stimulating activity is useful as a safe and low toxic drug for decreasing the physiological activity of SS169.
  • a compound or a salt thereof obtained by the above-mentioned screening method is used as a medicament, it can be formulated as in the above-mentioned "agent for preventing or treating a disease associated with SS169 dysfunction".
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, for example, mammals (Eg, humans, rats, egrets, sheep, pigs, dogs, cats, dogs, monkeys, etc.).
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like.
  • Is from about 0.1 to: 00 mg L per day, preferably from about 1.0 to 5 Omg, more preferably from about 1.0 to 20 mg.
  • the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • SS169 is almost exclusively expressed in skeletal muscle, and is highly expressed in diabetic model mice and refeeding after fasting. Therefore, differentiation of skeletal muscle cells Z or metabolism (particularly glucose and lipid metabolism) It is thought to play an important role in the regulation of. Therefore, compounds that alter the amount of SS169 in the cell membrane or extracellularly are used in diseases involving skeletal muscle cell differentiation or metabolic disorders (insufficiency or hypertension) (eg, obesity, diabetes, glucose tolerance). It can be used as a preventive or therapeutic agent for abnormalities, arteriosclerosis, hypertension, hyperlipidemia, etc.
  • the compound when used as a preventive / therapeutic agent for a disease associated with dysfunction or enhancement of SS169, it can be formulated in the same manner as in the above-mentioned "prophylactic / therapeutic agent for a disease associated with SS169 dysfunction". it can.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, for example, mammals
  • the dosage of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like.
  • oral administration in general, for example, a patient having abnormal glucose and lipid metabolism (with a body weight of 60 kg) About 0.1 to 100 mg per day, preferably about 1.0 to 5 O mg, more preferably about 1.0 to 2 O mg per day.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like. 6 O kg), about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to about LO mg per day. Is convenient. Even when the subject to be administered is not human, it can be administered in an amount calculated per 60 kg body weight.
  • the term “modulator” of SS169 refers to the expression (including transcription, translation, post-translational modification, etc.), amount (including transport to the membrane / extracellularly, stability, etc.), activity (including receptor) of SS169. (Or ligand) (including binding activity, signal transduction, etc.) is used as a term comprehensively meaning a compound capable of regulating (promoting or suppressing). Therefore, for example, the above-mentioned compounds that change the expression level of SS169, compounds that have a specific affinity for SS169 and SS169 (eg, agonists, antagonists, etc.), change the amount of SS169 in the cell membrane or extracellularly Compounds are listed as SS169 modulators. These compounds can be obtained by performing the above-described screening methods.
  • the SS169 modulator can be used as a prophylactic / therapeutic agent for diseases involving skeletal muscle cell differentiation and / or metabolic abnormalities (particularly abnormal glucose and lipid metabolism). That is, a preventive / therapeutic agent for various diseases containing a compound that alters the expression level of SS169, and for various diseases containing a compound having specific affinity for SS169 and SS169 (eg, agonist, antagonist, etc.). Prevention and treatment of various diseases containing compounds that alter the amount of SS169 in the cell membrane or extracellularly. Alternatively, it can be formulated and administered.
  • the present invention relates to a non-human having a DNA encoding exogenous SS169 (hereinafter abbreviated as the exogenous DNA of the present invention) or a mutant DNA thereof (which may be abbreviated as the exogenous mutant DNA of the present invention).
  • a mammal is provided.
  • the non-human mammal having the exogenous DNA of the present invention or the mutant DNA thereof is an embryo containing an unfertilized egg, a fertilized egg, a sperm, and a progenitor cell thereof.
  • the DNA transgenic animal of the present invention is an embryo containing an unfertilized egg, a fertilized egg, a sperm, and a progenitor cell thereof.
  • the stage of embryo development in non-human mammal development preferably at the stage of single cells or fertilized egg cells and generally before the 8-cell stage
  • calcium phosphate method preferably at the stage of single cells or fertilized egg cells and generally before the 8-cell stage
  • electric pulse method It can be produced by transferring the target DNA by the lipofection method, agglomeration method, microinjection method, particle gun method, DEAE-dextran method, or the like.
  • the exogenous DNA of the present invention intended for somatic cells, organs of living organisms, tissue cells and the like can be transferred and used for cell culture, tissue culture, and the like.
  • the DNA-transferred animal of the present invention can also be produced.
  • mice for example, porcupines, pigs, higgins, goats, magpies, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, mice, rats and the like are used.
  • the ontogeny and biological cycle are relatively short in terms of the creation of disease animal model systems.
  • rodents that are easy to breed especially mice (eg, C57B LZ6 strain, DBA2 strain as pure strain, BeCSFi strain, BDFi strain, BeDSFi strain, BALBZc strain, ICR strain, etc.) or rat (Eg, Wistar, SD, etc.) are preferable.
  • Examples of the “mammal” in the recombinant vector that can be expressed in mammals include humans in addition to the above-mentioned non-human mammals.
  • the exogenous DNA of the present invention refers not to the DNA of the present invention originally possessed by a non-human mammal but to the DNA of the present invention once isolated and extracted from a mammal.
  • mutant DNA of the present invention those in which a mutation (for example, mutation) has occurred in the base sequence of the original DNA of the present invention, specifically, addition or deletion of a base, addition of a base to another base, Replacement DNA or the like is used, and abnormal DNA is also included.
  • a mutation for example, mutation
  • the abnormal DNA means a DNA that expresses abnormal SS169, and for example, a DNA that expresses a protein or the like that suppresses the function of normal SS169 is used.
  • the exogenous DNA of the present invention may be derived from a mammal which is the same or different from the target animal.
  • the human DNA of the present invention is transferred, it is derived from various mammals having the DNA of the present invention that are highly homologous to the DNA (eg, egret, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.).
  • the present invention is achieved by microinjecting a DNA construct (eg, a vector, etc.) in which the human DNA of the present invention is bound downstream of various promoters capable of expressing the same DNA into a fertilized egg of a target mammal, for example, a mouse fertilized egg.
  • a DNA construct eg, a vector, etc.
  • a DNA transgenic mammal that highly expresses DNA can be created.
  • Examples of the expression vector for carrying the DNA of the present invention include a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis, a plasmid derived from yeast, a bacterium phage such as ⁇ phage, a retrovirus / less such as Moroni monoleukemia virus / less, and a vaccinia winores.
  • animal viruses such as paculovirus are used.
  • a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis or a plasmid derived from yeast are preferably used.
  • Examples of the promoter that regulates the DNA expression include, but are not limited to, (1) DNA promoters derived from viruses (eg, simian virus, cytomegalovirus, Moroni mouse leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.).
  • viruses eg, simian virus, cytomegalovirus, Moroni mouse leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.
  • Oral motor (2) promoters derived from various mammals (human, egret, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.), for example, albumin, insulin II, peroplaskin II, elastase, erythropoietin, endothelial cells Muscle creatine kinase, glial fibrillary acidic protein, daltathione S-transferase, platelet-derived growth factor / 3, keratin Kl, ⁇ 10 and ⁇ 14, collagen type I and type II, cyclic AMP Dependent protein kinase) 3 I submit, dystrophy Tartrate-resistant alkaline phosphatase, atrial sodium diuretic factor, endothelial receptor thymic synthase (generally abbreviated as Tie 2), sodium potassium adenosine 3 kinase (Na, K- ATPase), neurofilament light chain, meta-oral thi
  • a cytomegalovirus promoter that can be highly expressed throughout the whole body, a human peptide chain elongation factor 1 ⁇ (EF-1a) promoter, a human and a -Pet / 3/3 actin promoter are preferable.
  • the vector preferably has a sequence that terminates transcription of the messenger RNA of interest in the DNA-transferred mammal (generally called terminator).
  • terminator A sequence can be used, and preferably, a SV40 terminator of simian virus or the like is used.
  • the splicing signal of each DNA, the enhancer region, a part of the intron of eukaryotic DNA, etc., 5 'upstream of the promoter region, the promoter region and the translation region for the purpose of further expressing the desired foreign DNA It is also possible depending on the purpose to ligate between the 3 or downstream of the translation region.
  • the normal SS169 translation region can be obtained from liver, kidney, fat tissue, muscle-derived DNA from various mammals (eg, human, rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.) and commercially available DNA. All or part of genomic DNA can be obtained from various genomic DNA libraries, or cDNA prepared from ⁇ or tissue-derived RNA by a known method can be obtained as a raw material. In addition, an exogenous abnormal DNA can be obtained by preparing a translation region obtained by mutating a normal SS169 translation region obtained from the above cells or tissues by a point mutagenesis method.
  • the translation region can be obtained as a DNA construct that can be expressed in a transgenic animal by a conventional DNA engineering technique in which the translation region is linked downstream of the promoter (and optionally upstream of the transcription termination site).
  • the transfer of the exogenous D ⁇ ⁇ of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germinal and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the transgenic animal after the transfer of the DNA indicates that the progeny of the transgenic animal and all of the embryonic and somatic cells of the present invention have the exogenous DNA of the present invention. It means retaining DNA.
  • the progeny of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have the exogenous DNA of the present invention in all of their germ cells and somatic cells.
  • the non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred is confirmed to stably maintain the exogenous DNA by mating, and is subcultured as a DNA-bearing animal in a normal breeding environment. I can do it.
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in excess in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • Excessive presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA transfer indicates that all the offspring of the produced animal transfer the exogenous DNA of the present invention to all of its germinal and somatic cells. It means having extra.
  • the offspring of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have an excess of the exogenous DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
  • the non-human mammal having the normal DNA of the present invention has high expression of the normal DNA of the present invention, and eventually develops hyperactivity of SS169 by enhancing the function of endogenous normal DNA. It can be used as a disease model animal. For example, using the normal DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of hyperactivity of SS169 and SS169-related diseases, and to examine treatment methods for these diseases. .
  • the mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of free SS169, it can be used for a screening test of a therapeutic agent for a disease associated with SS169.
  • the non-human mammal having the exogenous abnormal DNA of the present invention is confirmed to stably retain the exogenous DNA by mating, and is to be subcultured as an animal having the DNA in a normal breeding environment. Can be done. Furthermore, the desired exogenous DNA can be incorporated into the above-mentioned plasmid and used as a raw material.
  • a DNA construct with a promoter can be prepared by ordinary DNA engineering techniques. Fertilized egg The transfer of the abnormal DNA of the present invention at the cell stage is ensured to be present in all germinal and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the abnormal DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA transfer means that all the offspring of the produced animal have the abnormal DNA of the present invention in all of the germinal and somatic cells. .
  • the progeny of this type of animal that has inherited the exogenous DNA of the present invention has the abnormal DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • a homozygous animal having the introduced DNA on one side of the homologous chromosome is obtained, and by crossing these male and female animals, it is possible to breed and pass the offspring so that all offspring have the DNA.
  • the non-human mammal having the abnormal DNA of the present invention in which the abnormal DNA of the present invention is highly expressed, inhibits the function of endogenous normal DNA, and eventually causes SS169 to become functionally inactive refractory. It can be used as a disease model animal. For example, using the abnormal DNA metastasized animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of SS169 function-inactive refractory disease and to examine a method for treating this disease.
  • the mammal into which the foreign abnormal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the released abnormal SS169, it can be used in a screening test for a therapeutic drug for SS169 function-inactive refractory disease. is there.
  • SS169-related diseases including SS169 function-inactive refractory disease, etc. More detailed pathological findings in ⁇ can be obtained, contributing to the development of new treatment methods and the research and treatment of secondary diseases caused by the disease.
  • each organ can be taken out from the DNA-transferred animal of the present invention, and after minced, it is possible to obtain free DNA-transferred cells, culture them, or systematize the cultured cells with a protease such as trypsin. It is.
  • a protease such as trypsin. It is.
  • the present invention provides a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated, and a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention. That is, the present invention
  • a reporter gene eg, a / 3-galactosidase gene derived from Escherichia coli
  • a non-human mammal deficient in expression of the DNA in which the DNA of the present invention is inactivated the DNA introduces a reporter gene (eg, a monogalactosidase enzyme gene derived from Escherichia coli).
  • a reporter gene eg, a monogalactosidase enzyme gene derived from Escherichia coli.
  • the reporter gene can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention, wherein the non-human mammal is a rodent; (6) the non-human mammal according to the above (9), wherein the rodent is a mouse, the non-human primate according to the above (8), and the (10) animal according to the above (7);
  • the present invention provides a method for screening a ligase compound or a salt thereof which promotes or inhibits the activity of a promoter for DNA, according to the present invention, characterized by detecting the expression of a reporter gene.
  • a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated is defined as a DNA that is obtained by artificially mutating the DNA of the present invention possessed by the non-human mammal, thereby suppressing the expression of DNA. Or by substantially losing the activity of SS169 encoded by the DNA, whereby the DNA does not substantially have the ability to express SS169 (hereinafter referred to as the knockout DNA of the present invention.
  • ES cells embryonic stem cells of non-human mammals
  • non-human mammal the same one as described above is used.
  • the method of artificially mutating the DNA of the present invention can be performed, for example, by deleting a part or all of the DNA sequence by a genetic engineering technique, and inserting or substituting another DNA. Due to these mutations, for example, codon reading
  • the knockout DNA of the present invention may be prepared by shifting the reading frame or disrupting the function of the promoter or exon.
  • Non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated include:
  • the DNA of the present invention possessed by a non-human mammal described above is isolated and its exon portion is a drug resistance gene represented by a neomycin resistance gene, a hygromycin resistance gene, or 1 ac Z (j3-galactosidase gene), cat A DNA sequence that disrupts exon function by introducing a reporter gene or the like represented by (a chloramuecotyl acetyltransferase gene), or terminates transcription of a gene in an intron between exons (for example, poly A additional signal) to prevent the synthesis of complete mRNA, resulting in gene
  • a DNA strand having a DNA sequence constructed so as to be broken hereinafter abbreviated as a targeting vector
  • DNA sequence on or near the targeting vector and the DNA sequence on the targeting vector and the neighboring region other than the DNA of the present invention used in the production of the targeting vector can be obtained by analyzing by a PCR method using the DNA sequence as a primer and selecting the knockout ES cells of the present invention.
  • ES cells from which the DNA of the present invention is inactivated by the homologous recombination method or the like for example, those already established may be used as described above.
  • a newly established one may be used.
  • 129 ES cells are generally used.
  • the immunological background is not clear, a pure and immunological genetic strain that substitutes for this is used.
  • BDF which improved the number of eggs collected by C57BLZ6 mice and C57BLZ6 by crossing with DBA / 2
  • Those established using mice can also be used favorably.
  • BDF mice have the advantage of a large number of eggs collected and robust eggs, and also have C57BLZ6 mice as their background. It can be used advantageously in that the genetic background can be replaced by C57BLZ6 mice by backcrossing.
  • blastocysts on days 3 and 5 after fertilization are generally used. Many early embryos can be obtained.
  • male ES cells are generally more convenient for producing a germline chimera. It is also desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce the complexity of culturing.
  • An example of a method for determining the sex of ES cells is a method of amplifying and detecting a gene in the sex-determining region on the Y chromosome by PCR. Using this method, the number of ES cells needed to perform karyotyping analysis was about 10 6 , whereas the number of ES cells (about 50 cells) was enough for culturing. The primary selection of ES cells in the initial stage can be performed by discriminating between males and females, and the early selection of male cells can greatly reduce the labor required in the initial culture.
  • the secondary selection can be performed, for example, by confirming the number of chromosomes by the G-panning method.
  • the embryonic stem cell line obtained in this way usually has very good growth potential, but it must be carefully subcultured because it tends to lose its ability to generate individuals.
  • a suitable feeder cell such as STO fibroblasts
  • CO2 incubator preferably 5% CO2, 95% air or 5%
  • LIF 1-1000 OU / ml
  • trypsin ZEDTA solution usually 0.001-0.5% trypsin 0.1- 5 mM EDTA, preferably about 0.1 ° / 0 trypsin
  • ImM EDTA ImM EDTA
  • Such subculture is usually performed every 11 to 13 days. At this time, it is desirable to observe the cells, and if morphologically abnormal cells are found, discard the cultured cells.
  • ES cells can be transformed into various types of cells, such as parietal, visceral, and cardiac muscles, under appropriate conditions by monolayer culture up to high density or by suspension culture until cell clumps are formed.
  • MJ Evans and MH Kaufman Nature, Vol. 292, pp. 154, 1981; GR Martin, Proceedings of the National Academy of Sciences. Natl. Acad. Sci. USA, Vol . 78, p. 7634, 1981; TC Doetschman et al., J. Embryol. Exp. Morphol.), Vol. 87, p. 27, 1985
  • the DNA-deficient cells of the present invention obtained by differentiating the ES cells of the present invention are useful for in vitro studies on SS169 or SS169 cell biology. is there.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be distinguished from a normal animal by measuring the mRNA amount of the animal using a known method and indirectly comparing the expression levels.
  • non-human mammal the same one as described above is used.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be obtained, for example, by introducing the targeting vector prepared as described above into a mouse embryonic stem cell or a mouse egg cell. Homologous recombination in which the DNA sequence of the inserted targeting vector in which the DNA of the present invention is inactivated is replaced with the DNA of the present invention on the chromosome of mouse embryonic stem cells or mouse egg cells by gene homologous recombination By doing so, the DNA of the present invention can be knocked out.
  • a drug resistance gene such as a neomycin resistance gene can be incorporated into the DNA of the present invention.
  • a targeting vector containing a thymidine kinase (tk) gene is constructed in the vicinity of the DNA of the present invention and introduced into embryonic stem cells or egg cells, and a drug corresponding to the inserted drug resistance gene (for example, And a method of selecting cells that survive in the presence of ganciclovir.
  • the mutated DNA of the present invention when the mutated DNA of the present invention is integrated into the chromosome by homologous recombination, the tk gene is eliminated, so that it is ganciclovir-resistant. As a result, the building becomes sensitive to the Gangsiku mouth building.
  • a diphtheria toxin gene is used instead of the tk gene, the randomly inserted cells will be killed by the production of the toxin, so that selection with a single drug becomes possible.
  • the final confirmation of cells in which the DNA of the present invention has been knocked out is performed by Southern hybridization analysis using a DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe, or a targeting vector and a targeting vector.
  • the analysis can be carried out by PCR using the DNA sequence of the neighboring region other than the DNA of the present invention derived from the mouse used as a primer as a primer.
  • a cell line in which the DNA of the present invention has been inactivated by gene homologous recombination is cloned, and the cell is cultured at an appropriate time, for example, at the 8-cell stage.
  • the chimeric embryo is injected into a human mammalian embryo or blastocyst and the resulting chimeric embryo is transplanted into the uterus of the pseudopregnant non-human mammal.
  • the animals produced were both cells having the normal DNA locus of the present invention and cells having the artificially mutated DNA locus of the present invention. It is a chimeric animal composed of forces.
  • all tissues are artificially mutated from a population obtained by crossing such a chimeric individual with a normal individual.
  • a transgenic non-human mammal having a targeting slab introduced into the chromosome can be obtained by injecting DNA into the nucleus of the egg by microinjection at an intense night. It can be obtained from these transgenic non-human mammals by selecting those having a mutation in the DNA locus of the present invention by homologous recombination.
  • the animal individual obtained by mating should be confirmed to be knocked out of the DNA, and bred in a normal breeding environment. Can be.
  • the germline can be obtained and maintained according to a conventional method. That is, by crossing male and female animals possessed by the inactivated DNA, a homozygous animal having the inactivated DNA on both homologous chromosomes can be obtained. The obtained homozygous animal can be efficiently obtained by rearing the mother animal in a state where one normal individual and plural homozygous animals are obtained. By mating male and female heterozygous animals, homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and subcultured.
  • non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated are very useful for producing a non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention may be induced by SS169. Since it lacks various biological activities, it can be used as a model for diseases caused by inactivation of the biological activity of SS169, and is useful for investigating the causes of these diseases and examining therapeutic methods.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be used for screening for a compound having a therapeutic / preventive effect against diseases caused by DNA deficiency or damage of the present invention.
  • the present invention is characterized in that a test compound is administered to a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention, and changes in the animal are observed and measured. Screening methods for compounds or salts thereof that have therapeutic and / or prophylactic effects on diseases caused by the disease.
  • Examples of the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention used in the screening method include those described above.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and plasma.These compounds are novel compounds. Or a known compound.
  • a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is treated with a test compound, compared with a non-treated control animal, and changes in the organs, tissues, disease symptoms, etc. of the animal are used as indicators. Therapeutic and prophylactic effects of test compounds can be tested.
  • test compound for example, oral administration, intravenous injection and the like are used, and it can be appropriately selected according to the symptoms of the test animal, the properties of the test compound, and the like.
  • the dose of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, the properties of the test compound, and the like.
  • test compound when administered to a test animal, When the blood glucose level of the test animal is reduced by about 10% or more, preferably about 30% or more, more preferably about 50% or more, the test compound is a compound having a therapeutic / preventive effect against the above-mentioned diseases.
  • the test compound is a compound having a therapeutic / preventive effect against the above-mentioned diseases.
  • the conjugation product obtained by the screening method is a compound selected from the test compounds described above, and is a disease caused by SS169 deficiency or damage, for example, skeletal muscle cell differentiation and Z or metabolic abnormality. It can be used as a drug for safe and low-toxic prophylactic agents for diseases associated with (eg, obesity, diabetes, impaired glucose tolerance, arteriosclerosis, hypertension, hyperlipidemia, etc.). Further, a compound derived from the compound obtained by the above-mentioned SCREENG may also be used.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt.
  • the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids, etc.) and bases (eg, alkali metals). And the like, and especially preferred are physiologically acceptable acid addition salts.
  • physiologically acceptable acids eg, inorganic acids, organic acids, etc.
  • bases eg, alkali metals
  • physiologically acceptable acid addition salts examples include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid) And succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid,
  • the compound obtained by the screening method or a salt thereof is used as a medicament, it can be prepared in the same manner as in the above "agent for preventing / treating diseases associated with SS169 dysfunction".
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, for example, mammals (eg, humans, rats, mice, monoremots, egrets, sheep, pigs, pigs, dogs, cats, dogs, monkeys) Etc.).
  • mammals eg, humans, rats, mice, monoremots, egrets, sheep, pigs, pigs, dogs, cats, dogs, monkeys
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the subject of administration, the administration route, and the like.
  • the compound is orally administered, and generally, for example, a patient with a sugar or lipid metabolism disorder (body weight). 6 O kg) about 0.1 to 1 per day 00 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • the single dose varies depending on the subject of administration, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • it is usually used, for example, for patients with abnormal glucose and lipid metabolism (body weight). 6 Ok g), about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, and more preferably about 0 to 20 mg per day.
  • ⁇ can be administered in an amount converted per 60 kg of body weight.
  • the present invention provides a test compound administered to a non-human mammal deficient in expression of a DNA of the present invention, and detects or inhibits the expression of a reporter gene. Perform a screening method for the compound or its salt.
  • the non-human mammal deficient in expression of DNA of the present invention may be one of the above-mentioned non-human mammals deficient in expression of DNA of the present invention in which the DNA of the present invention is not introduced by introducing a reporter gene. Those which are activated and which can express the reporter gene under the control of the promoter for the DNA of the present invention are used.
  • test tie examples are the same as described above.
  • the reporter gene the same one as described above is used, and a ⁇ -galactosidase gene (1 ac ⁇ ), a soluble alkaline phosphatase gene, a luciferase gene and the like are preferable.
  • the reporter gene encodes because the reporter gene is under the control of the promoter for the DNA of the present invention.
  • the activity of the promoter can be detected. For example, when a part of the DNA region encoding SS169 is replaced with a [3-galactosidase gene (1 ac Z) derived from Escherichia coli, a tissue that originally expresses SS169, instead of SS169] -Galactosidase is expressed.
  • SS169 can be easily prepared.
  • a reagent serving as a substrate for / 3-galactosidase for example, 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-j3-galactopyranoside (X-ga1)
  • X-ga1 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-j3-galactopyranoside
  • SS169 can be easily prepared.
  • a mouse lacking SS169 or a tissue section thereof is fixed with glutaraldehyde or the like, washed with phosphate buffered saline (PBS), and then stained with X-ga1 at room temperature or at room temperature.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the / 3-galactosidase reaction may be stopped by washing the tissue specimen with an ImM ED TAZPBS solution, and the coloration may be observed.
  • mRNA encoding 1 ac Z may be detected according to a conventional method.
  • the compound or a salt thereof obtained by the above screening method is a compound selected from the test compounds described above, and is a compound that promotes or inhibits the promoter activity for DNA of the present invention.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt.
  • the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids) and bases (eg, organic acids).
  • a physiologically acceptable acid addition salt is preferred.
  • such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.), and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid) Succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • Succinic acid tartaric acid, citric acid
  • the conjugate of the present invention or a salt thereof that promotes the promoter activity for DNA promotes the expression of SS169, and can promote the function of SS169. It is useful as a preventive and therapeutic drug. Since the compound of the present invention or a salt thereof that inhibits the promoter activity for DNA can inhibit the expression of SS169 and inhibit the function of SS169, for example, it can prevent diseases related to overexpression of SS169. ⁇ It is useful as a medicine such as a therapeutic drug.
  • Diseases associated with SS169 dysfunction or overexpression include, for example, diseases involving skeletal muscle cell dysfunction and / or metabolic abnormalities (eg, obesity, diabetes, impaired glucose tolerance, arteriosclerosis, hypertension, high blood pressure) Lipemia, etc.).
  • diseases involving skeletal muscle cell dysfunction and / or metabolic abnormalities eg, obesity, diabetes, impaired glucose tolerance, arteriosclerosis, hypertension, high blood pressure
  • Lipemia etc.
  • the compound obtained by the screening method or a salt thereof is used as a medicament, it can be prepared in the same manner as in the above "agent for preventing / treating diseases associated with SS169 dysfunction".
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, for example, mammals (for example, humans, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, pigs, pigs, dogs, cats, dogs, monkeys) Etc.).
  • mammals for example, humans, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, pigs, pigs, dogs, cats, dogs, monkeys
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the subject of administration, the route of administration, and the like.
  • a compound that promotes or inhibits the promoter activity of DNA of the present invention is orally administered,
  • the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method and the like. (As 6 O kg), it is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to about L Omg per day.
  • the amount can be administered in terms of per 60 kg body weight.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention is extremely useful for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the promoter for the DNA of the present invention. Yes, it can greatly contribute to the investigation of the cause of various diseases caused by DNA expression deficiency or the development of preventive and therapeutic drugs of the present invention.
  • transgenic animal transgenic animal
  • genes encoding various proteins are ligated downstream of the DNA and injected into animal egg cells to create a so-called transgenic animal (transgenic animal). Then, it would be possible to specifically synthesize the protein and examine its action in living organisms.
  • transgenic animal transgenic animal
  • a low-molecular-weight compound that specifically promotes or suppresses the ability of SS169 itself to produce in the body can be obtained. Can be used as a search system.
  • d TT P Deoxythymidine triphosphate dGTP Deoxyguanosine triphosphate dCTP Deoxycytidine triphosphate ATP Adenosine triphosphate
  • Trt Trityl
  • HONB 1-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide
  • DCC N, N, 1-dicyclohexylcarposimide
  • 1 shows the nucleotide sequence of the human soleus muscle-derived secretory or membrane protein SS169 gene.
  • 1 shows the amino acid sequence encoded by the human soleus muscle-derived secretory or membrane protein SS169 gene.
  • amino acid sequence encoded by the SS169 gene from mouse soleus-derived secretory or membrane protein is shown.
  • 1 shows the nucleotide sequence of a primer for amplifying mouse secretory muscle-derived secretory or membrane protein SS169 cDNA fragment.
  • the base sequence of a primer for amplifying a mouse soleus muscle-derived secretory or membrane protein SS169 cDNA fragment is shown.
  • the nucleotide sequence of the SS169 cDNA fragment derived from mouse soleus muscle-derived secretory or membrane protein obtained by the SST method.
  • the nucleotide sequence of the 5'-RACE primer used for the clone of the mouse SS169 gene is shown.
  • the base sequence of the 3'-RACE primer used for closing the mouse SS169 gene is shown.
  • [SEQ ID NO: 10] 2 shows the cDNA sequence of mouse SS169.
  • the nucleotide sequence of the 5, -RACE primer used for closing the human SS169 gene is shown below.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence of a primer used for amplifying mouse SS169 cDNA fragment.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence of a primer used for amplifying mouse SS169 cDNA fragment.
  • the nucleotide sequence of the 3'-RACE primer used for closing the rat SS169 gene is shown.
  • the nucleotide sequence of the 3'-RACE primer used for closing the rat SS169 gene is shown.
  • the base sequence of the 3, -RACE primer used for closing the rat SS169 gene is shown below.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence of the SS169 gene, a secretory or membrane protein derived from rat gastrocnemius muscle.
  • the amino acid sequence encoded by the secretory or membrane protein SS169 gene from rat gastrocnemius muscle is shown.
  • the base sequence of a primer used for amplifying a rat SS169 cDNA fragment is shown.
  • the base sequence of the primer used to amplify the rat SS169 cDNA fragment is shown.
  • the mouse pro-B cell line Ba / F 3 (RIKEN cell punk; RCB0805) requires IL-3 for its survival-proliferation.
  • the cells express the topopopoietin receptor (MPL) on the cell membrane, and form a homopolymer by the binding of the ligand thrombopoietin, and a proliferation signal is transmitted to the cells.
  • MPL topopopoietin receptor
  • MP L becomes a ligand-independent constitutively active (MP L M) by S er 4 9 8 A sn mutation transmembrane region, also their survival in B a / F 3 force SIL-3 absence and proliferation is maintained, moreover, the active i4 of MP L M unnecessary most of the extracellular domain, expressed on the cell membrane to form a homodimer when including 1 8 7 ⁇ amino acid C-terminal (Kojima and Kitamura, Nature Biotech., 17: 487-490, 1999).
  • M e 1 1 ⁇ T hr 4 4 1 retroviral vector one containing the coding region of MP L M that was deleted (AMP L M) and (pMX - SST; Kojima and Kitamura, above)
  • a retrovirus expression library was constructed by inserting free-, fasted, and re-fed mouse soleus muscle cDNAs into the BstXI site of, and cloned the secreted and membrane protein cDNA. .
  • the resulting cDNA was ⁇ the BstXI site of the retroviral vector PMX- SST with BstXI ⁇ adapter (Invitrogen), was 'Raigeshiyon the cDM on the 5' side of the MPL M.
  • the obtained DNA was introduced into E. coli DH10B strain by electroporation and amplified. Common law The plasmid DNA was purified according to the procedure described above, and packaging cells for retrovirus production (Plat-E; Morita et al., Gene Ther., 7 (12): 1063-1066, 2000; University of Tokyo; Institute of Medical Science 'from Dr.
  • Toshio Kitamura (2 ⁇ 10 6 cells / dish) were transfected using Lipofectamine 2000 TM reagent (Invitrogen) according to the attached protocol. After culturing for 24 hours in DMEM medium supplemented with 10% fetal bovine serum, replace the medium with fresh medium and culture for 24 hours, collect the culture supernatant, and collect the infectious high-potency retrovirus stock (infectious efficiency of 10%). -30%). Infect cells (Ba / F3) for protein expression with this retrovirus stock, culture them in RPMI1640 medium supplemented with IL-3 for 8 to 24 hours, and place them in a 96-well plate at 1 to 10 ⁇ 10 3 Zwell. And selected in a medium without IL-3.
  • 5′-RACE primer 1 (TCCTGAGCCCCACAGCATCACAATCATAGC; SEQ ID NO: 8) and 3′-RACE primer 1 (CCTTGACAGACTCTCAGCT; SEQ ID NO: 9) were designed, and 5′-RACE, 3′-RACE was performed.
  • clontech SMART TM RACE cDNA amplification kit The experiment was performed according to the package insert of the kit. Total RNA was extracted from C57BL / 6J mouse skeletal muscle, and an adapter was added and a reverse transcription reaction was performed to prepare cDNA.
  • the PCR product was separated by 1% agarose gel electrophoresis, and the obtained band was cut out from the gel, extracted, and then subjected to TA cloning (PROMEGA pGEM-T EASY). When the sequence of the obtained plasmid was determined, this gene was found to be novel.
  • SEQ ID NO: 10 was composed of 5 ethasons from the results of mouse genome blast search, and contained 0RF represented by SEQ ID NOs: 3 and 4 consisting of 393 bp and 130 aa.
  • Escherichia coli DH5a (Invitrogen) was transformed with the plasmid pGEM-T (clonel69) into which this cDNA clone was inserted.
  • pGEM-T clonel69
  • a blast search was performed on the human genome based on the sequence of the mouse SS169 gene, and it was found that a sequence showing high homology with mouse ethasons 2 and 3 was present. Based on this sequence, a 5'-RACE primer (GACTGTGGGTGTTGACTGCACATCTATG; SEQ ID NO: 11) and a 3'-RACE primer (CTGATCTTTCACGAGATGCTGGACTGGA; SEQ ID NO: 12) were designed, and 5, -RACE, 3'-RACE was performed (clontech SMART TM RACE cDNA amplification kit). The experiments were performed according to the kit instructions. Using human skeletal muscle RNA (clontech), an adapter was added and a reverse transcription reaction was performed to produce cDNA.
  • the PCR product was separated by 1% agarose gel electrophoresis, and the obtained pan was cut out from the gel, extracted, and then subjected to TA cloning (PROMEGA pGEM-T EASY). When the sequence of the obtained plasmid was determined, this gene was found to be novel.
  • the obtained cDNA fragment consisting of 1655 bp contained 0RF represented by SEQ ID NOS: 1 and 2 consisting of 402 bp and 133 aa.
  • the project that introduced this cDNA clone Escherichia coli DH5Q; (Invitrogen) was transformed with Rasmid pGEM-T (clonel69).
  • Mouse SS169 was expressed specifically in skeletal muscle, and was slightly expressed in brown adipose tissue.
  • the expression level was measured in the same manner as the distribution measurement. As shown in FIG. 2, the expression level was higher in KKA y mice than in C57BL / 6J, and higher expression levels were also observed in db / db mice.
  • Example 5 when expression fluctuations due to dietary conditions were measured using the total RNA used in Example 1, as shown in Fig. 3, the expression level decreased during fasting compared to free feeding, and the expression level increased during re-feeding. The amount was recovering.
  • Example 5 when expression fluctuations due to dietary conditions were measured using the total RNA used in Example 1, as shown in Fig. 3, the expression level decreased during fasting compared to free feeding, and the expression level increased during re-feeding. The amount was recovering.
  • Example 5 When expression fluctuations due to dietary conditions were measured using the total RNA used in Example 1, as shown in Fig. 3, the expression level decreased during fasting compared to free feeding, and the expression level increased during re-feeding. The amount was recovering.
  • a blast search was performed on the rat genome based on the sequence of the mouse SS169 gene, and it was found that the sequence NW047356 showing high homology to mouse exons 1 and 2 was present. Based on this sequence, four 3'-RACE primers (SEQ ID NOS: 16, 17, 18, and 19) were designed. 3, -RACE was implemented. The experiment was performed according to the kit (clontech SMART TM RACE cDNA amplification kit) attachment. Reverse transcription reaction was performed using total RNA extracted from rat gastrocnemius muscle using RNA-STAT60 kit (manufactured by friendswood) to produce cDNA.
  • PCR was carried out using this cDNA as type I and the primers described in SEQ ID NOS: 20 and 21, and the nucleotide sequence of the rat SS169 gene (SEQ ID NO: 22) was determined from the sequence of the obtained PCR product.
  • SEQ ID NO: 22 the nucleotide sequence of the rat SS169 gene
  • Total RA was extracted from each tissue of 6-week-old os SD rat, and Light Cycler-FastStart
  • mice skeletal muscle-derived cell line C2C12 Using the mouse skeletal muscle-derived cell line C2C12, the effects of SS169 gene expression upon induction of differentiation and the effect of insulin on SS169 gene expression were examined.
  • C2C12 cells were cultured on collagen-coated plates using DMEM supplemented with 10% FCS. After the cells had grown to confluence, they were replaced with DMEM containing 2% horse serum to induce differentiation. On days 0, 3, 5, 7, and 10 after the induction of differentiation, total RNA was extracted, and the expression level of the SS169 gene was quantified in the same manner as in Example 4.
  • Fig. 5 shows the results. The induction of SS169 gene expression increased markedly after 7 days after induction of differentiation. On the other hand, the effect of insulin was quantified by replacing the medium of the cells on day 7 after induction of differentiation with DMEM supplemented with various concentrations of insulin (see Fig. 6) and preparing total RNA from the cells 24 hours later. .
  • Fig. 6 shows the results. Insulin increased the expression of the SS169 gene in a concentration-dependent manner.
  • Streptozotocin was intraperitoneally administered to 10-week-old os C57BL / 6J mice that had been fasted for 12 hours, 100 mg / kg intraperitoneally, and feeding for 12 hours after administration was repeated three times to produce STZ mice.
  • total RNA was extracted from skeletal muscle, and the amount of SS169 gene expression was quantified in the same manner as in Example 4.
  • Fig. 7 shows the results.
  • the expression of the SS169 gene was significantly reduced in both the gastrocnemius muscle and soleus muscle compared to the control mouse! /.
  • PlatE cells which are Leto-oral virus packaging cells, using FuGENE6.
  • the virus solution was collected and infected into C2C12 cells and NIH3T3 cells.
  • Virus-infected cells were selected by culturing in a medium supplemented with puromycin (2 / zg / ml) for 24 hours to obtain a stable expression cell line.
  • the mouse SS169 gene cDNA was incorporated into pShutle-CMV Better and transfected into Escherichia coli together with pAdEasy containing the E1-E3 deficient type 5 adenovirus genome to produce a virus vector by homologous recombination.
  • This viral vector was introduced into 293 cells to produce a mouse SS169 gene-expressing adenovirus.
  • an adenovirus expressing the lacZ gene was prepared in the same manner. The obtained virus was inoculated at various titers from the mouse tail vein and infected.
  • Figure 9 shows the expression level of the SS169 gene in the liver of mice infected with the virus
  • Figure 10 shows changes in body weight and food consumption after infection
  • Figures 11 and 12 show the weight of epididymal fat and liver
  • Figure 13 shows The measurement results of blood glucose level, blood insulin level, blood free fatty acid level, and blood triglyceride level are shown.
  • low titer, medium titer, and high titer indicate the cases where the virus was inoculated into mice at 2 10 7 and 6 x 10 ⁇ 2 x 10 8 pfu, respectively.
  • the amount of SS169 gene expression in the liver increased in a titer-dependent manner (FIG. 9).
  • mice infected with the SS169 gene-expressing virus at high titers showed a tendency to decrease body weight and food consumption (Figure 10).
  • mice infected with the SS169 gene-expressing virus at medium and high titers there was a significant decrease in epididymal fat (Fig. 11), a significant increase in liver weight (Fig. 12), and a significant increase in liver weight.
  • Fig. 11 mice infected with the SS169 gene-expressing virus at medium and high titers
  • Fig. 12 a significant increase in liver weight
  • a significant decrease in blood glucose levels was observed (Figure 13).
  • FIG. 1A shows the measurement results of sugar uptake.
  • Sugar uptake during insulin stimulation in C2C12 was suppressed by the addition of SS169.
  • Glut4 insulin-dependent sugar transporter
  • Glutl insulin-independent sugar transporter
  • hexokinase II phosphorylate glucose to reduce free glucose concentration in C2C12 cells during insulin stimulation
  • the expression levels of the genes were measured by RT-PCR, and no change was observed in the expression levels due to the addition of SS169 (Fig. 14B). Therefore, not the glucose uptake was inhibited to the expression of these genes is decreased, is considered to SSI6 9 sugar uptake was inhibited by affecting the Insurin action '.
  • SS169 is a secretory or membrane protein that is expressed in skeletal muscle cells in the diet, diabetes, and obesity, and is associated with abnormalities in skeletal muscle cell differentiation and metabolic function. It is useful as a prophylactic / therapeutic or diagnostic agent for a disease, or as a tool for screening drug candidate compounds effective for the prophylaxis / treatment of the disease.
  • This application is based on patent applications No. 2003-171188, No. 2003-3 91047, No. 2004-23557 and No. 2004-30988 filed in Japan, the contents of which are fully incorporated herein by reference. Included. Sequence listing free text
  • Oligonucleotides designed to function as primers for amplifying mouse soleus-derived cDNA Oligonucleotides designed to function as primers for amplifying mouse soleus-derived cDNA.
  • Oligonucleotides designed to function as primers for amplification of mouse soleus-derived cDNA Oligonucleotides designed to function as primers for amplification of mouse soleus-derived cDNA.
  • Oligonucleotide designed to function as a primer for amplifying full-length mouse SS169 cDNA.
  • Oligonucleotides designed to function as primers for amplifying full-length mouse SS169 cDNA Oligonucleotides designed to function as primers for amplifying full-length mouse SS169 cDNA.
  • Oligonucleotides designed to function as primers for amplifying full-length human SS169 cDNA Oligonucleotides designed to function as primers for amplifying full-length human SS169 cDNA.
  • n represents an unidentified base.
  • Base number: 1032 n represents an unidentified base.
  • Base number: 1033) n represents an unidentified base.
  • Base number: 1043) n represents an unidentified base.
  • Base number: 1075 n represents an unidentified base.
  • Base number: 1080 n represents an unidentified base.
  • Base number: 1113) n represents an unidentified base.
  • Base number: 1138) n represents an unidentified base.
  • Base number: 1235) n represents an unidentified base.
  • Base number: 1238) n represents an unidentified base.
  • Base number: 1265) n represents an unidentified base.
  • n represents an unidentified base.
  • n an unidentified base.
  • n an unidentified base.
  • n an unidentified base.
  • n an unidentified base.
  • n an unidentified base.
  • n an unidentified base.
  • n an unidentified base.
  • n an unidentified base.
  • n an unidentified base.
  • n an unidentified base.
  • Oligonucleotide designed to function as a primer for amplifying mouse SS169 cDNA fragment.
  • Oligonucleotide designed to function as a primer for amplifying full-length rat SS169c DNA.
  • Oligonucleotides designed to function as primers for amplifying full-length rat SS169 cDNA Oligonucleotides designed to function as primers for amplifying full-length rat SS169 cDNA.
  • Oligonucleotides designed to function as primers for amplifying full-length rat SS169 cDNA Oligonucleotides designed to function as primers for amplifying full-length rat SS169 cDNA.
  • Oligonucleotides designed to function as primers for amplifying full-length rat SS169 cDNA Oligonucleotides designed to function as primers for amplifying full-length rat SS169 cDNA.
  • Oligonucleotides designed to function as primers for amplifying cDNA from rat gastrocnemius muscle.
  • Oligonucleotide designed to function as a primer for amplifying cDNA from rat gastrocnemius muscle.
  • Oligonucleotide designed to function as a primer for amplifying rat SS169 cDNA fragment.
  • Oligonucleotide designed to function as a primer for amplifying rat SS169 cDNA fragment.

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Abstract

本発明は、配列番号：２または４で表されるアミノ酸配列中、アミノ酸番号１以降のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質、それをコードする核酸、該蛋白質もしくはそれをコードする核酸を用いた骨格筋細胞の分化および／または代謝異常が関与する疾患の予防・治療物質のスクリーニング方法等を提供する。

Description

明 細 書 新規蛋白質 技術分野
本発明は、 骨格筋特異的に発現する新規分泌もしくは膜蛋白質、 それをコード する核酸、 それに対する抗体およびそれらの用途に関する。
糖尿病、 高脂血症、 高血圧、 虚血性心疾患などのいわゆる生活習慣病は、 我が 国を含めた先進諸国の医療財政を圧迫している最大の元凶である。 現代人は過食 と運動不足に陥りやすく、 その結果、 余剰エネルギーが中性脂肪として脂肪組織 に蓄積され、 肥満症を引き起こす。
近年、 脂肪組織から分泌される種々の生理活性蛋白質 （アディポサイト力イン と総称される） が代謝調節ゃィンスリン抵抗性に関与することが示され、 生活習 慣病の治療への応用が試みられている。 例えば、 アディポネクチンは、 血中に高 濃度で存在し、 内臓脂肪の増加とともに分泌が減少するアディポサイトカインと して同定され （非特許文献 1 ) 、 このホルモンの分泌咸少とインスリン作用の低 下とが深く関与していることが示唆されている （非特許文献 2 ) 。 一方、 レジス チンは脂肪細胞から分泌され、 脂肪組織、 骨格筋、 肝臓などにおけるインスリン 作用を低下させるホルモンとして同定され （非特許文献 3 ) 、 インスリン抵抗性 の発症に深く関連するアディポサイト力インとして注目されている。 また、 脂肪 蓄積が起こるとプラスミノーゲンァクティベータインヒビター 1 (P A I一 1 ) が内臓脂肪で著しく発現して血中濃度が増加し、 血管合併症の成因の 1つとなり 得ることが示されている （非特許文献 4) 。
肥満時における脂肪蓄積は肝臓、 筋肉、 勝臓、 血管壁などにも起こり、 それら 臓器での代謝異常を引き起こして、 インスリン抵抗性、 糖尿病、 高脂血症、 高血 圧などを発症させる。 これらの βは内分泌因子を介して互いに連関し、 複雑か つ高度な代謝調節を行っていると考えられる。 したがって、 筋肉、 S干臓、 小腸、 血管などからもアディポサイトカインと同様の作用を示す内分泌因子が産生 ·分 泌されていると推測されるが、 そのような因子に関する報告はこれまでほとんど なされていない。
非特許文献 1 ： Aritaら， 「パイォケミカル'アンド 'パイオフイジカル' リ サーチ.コミュニケ—ンヨン (Biochem. Biophys. Res. Commun. ) 」 , (米国)， 1999年， 第 257卷， p. 79-83
非特許文献 2 ： Hottaら， 「ダイアビーテイス （Diabetes) 」 ， （米国） ，
2001年， 第 50卷， pp. 1126-1133
非特許文献 3 ： Steppanら， 「ネイチヤー （Nature) 」 ， （英国） ， 2001年， 第 409卷， pp. 307-312
非特許文献 4 ： Shimomuraら， 「ネイチヤー 'メデイシン （Nat. Med. ) 」 ， (米国） ， 1996年， 第 2卷， pp. 800-803 発明の開示
本発明は、 肥満症、 糖尿病、 動脈硬化症などのいわゆる生活習慣病をはじめと する糖 ·脂質代謝異常関連疾患の予防 ·治療薬開発のための有用なツール、 ある いはこれらの疾患の有用な診断マーカーとなり得るような筋肉由来の新規分泌も しくは膜蛋白質、 およびそれをコードする遺伝子を同定することを目的とする。 さらに、 本発明は、 該遺伝子を含有する組換えベクター、 該組換えベクターを保 持する形質転換体、 該形質転換体を培養することによる該分泌もしくは膜蛋白質 の製造方法、 該分泌もしくは膜蛋白質に対する抗体、 該分泌もしくは膜蛋白質の 発現量を変化させる化合物、 該分泌もしくは膜蛋白質と相互作用し得る物質 （レ セプターもしくはリガンド） の決定方法、 該物質と該分泌もしくは膜蛋白質との 結合性を変化させる化合物 （アンタゴニスト、 ァゴ-スト） のスクリーニング方 法おょぴそのためのキット、 該スクリーニング方法もしくはスクリーニング用キ ットを用いて得られる該物質と該分泌もしくは膜蛋白質との結合性を変化させる 化合物、 およぴ該物質と該分泌もしくは膜蛋白質との結合性を変化させる化合物 または該分泌もしくは膜蛋白質の発現量を変化させる化合物を含有してなる医薬 などを提供することを目的とする。
本発明者らは、 上記の目的を達成すべく、 マウス骨格筋由来の cDNAライプ ラリーを作製し、 該 cDNAを、 N末端の細胞外領域を欠失させた恒常的活性型 トロンボポイエチン受容体 （498位のセリンがァスパラギンに置換されてい る） cDNAの 5， 側に組み込んだレトロウイルス発現ライブラリーを構築、 パ ッケージング細胞から高力価レトロウイルスを回収してマウスプロ B細胞株 (B a/F3) を感染させ、 増殖 '14を保持した細胞を選択した。 選択された細胞から ゲノム DNAを抽出、 PCR法を用いて、 導入されたマウス骨格筋由来 cDNA 断片をサプクローニングし、 その塩基配列を決定した。 得られた cDNA断片を 用いて、 マウス、 ラットおよぴヒト骨格筋 cDNAから蛋白質コード領域の全長 を含む cDNAクローンを単離し、 それらの塩基配列を決定したところ、 いずれ も新規遺伝子であることが分かった。 本発明者らは、 これらの知見に基づいてさ らに研究を重ねた結果、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、
[1] 配列番号： 2または 4で表されるアミノ酸配列中、 アミノ酸番号 1以降 のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質また はその塩、
[2] 配列番号： 2または 4で表されるアミノ酸配列中、 アミノ酸番号 1以降 のアミノ酸配列を含有する上記 [1] 記載の蛋白質またはその塩、
[3] 上記 [1] 記載の蛋白質の部分ペプチドまたはその塩、
[4] 上記 [1] 記載の蛋白質をコードする塩基配列を含有する核酸、 [5] 配列番号： 1または 3で表される塩基配列中、 塩基番号 88以降の塩基 配列を含有する上記 [4] 記載の核酸 （但し、 該核酸が RNAの場合、 該塩基配 列中記号 tで示される塩基はゥリジンに置き換える） 、
[6] 配列番号： 2または 4で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同 一のァミノ酸配列を含有するポリぺプチドをコ一ドする塩基配列またはその一部 を含有する核酸、
[7] 上記 [4] 記載の核酸を含有する組換えべクタ—、
[8] 上記 [7] 記載の組換えベクターで宿主細胞を形質転換して得られる形 質転換体、
[9] 上記 [8] 記載の形質転換体を培養し、 上記 [1] 記載の蛋白質または その塩を生成せしめることを特徴とする、 該蛋白質またはその塩の製造方法、
[10] 上記 [1] 記載の蛋白質もしくは上記 [3] 記載の部分ペプチドまた はその塩を含有してなる医薬、
[11] 上記 [4] 記載の核酸を含有してなる医薬、
[12] 骨格筋細胞の分化および/または代謝異常が関与する疾患の予防 ·治 療剤である上記 [10] または [11] 記載の医薬、
[13] 代謝異常が糖 ·脂質代謝異常である上記 [ 12 ] 記載の医薬、
[14] 上記 [1] 記載の蛋白質もしくは上記 [3] 記載の部分ペプチドまた はその塩、 あるいは上記 [4] 記載の核酸の有効量を哺乳動物に投与することを 含む、 骨格筋細胞の分化および Zまたは代謝異常が関与する疾患の予防 ·治療方 法、
[15] 代謝異常が糖 ·脂質代謝異常である上記 [14] 記載の方法、
[16] 骨格筋細胞の分化および/または代謝異常が関与する疾患の予防 ·治 療剤の製造のための、 上記 [1] 記載の蛋白質もしくは上記 [3] 記載の部分べ プチドまたはその塩、 あるいは上記 [4] 記載の核酸の使用、
[17] 代謝異常が糖 ·脂質代謝異常である上記 [16] 記載の使用、 [18] 上記 [6] 記載の核酸を含有してなる診断薬、
[19] 上記 [ 1 ] 記載の蛋白質もしくは上記 [ 3 ] 記載の部分べプチドまた はその塩に る抗体、
[20] 上記 [19] 記載の抗体を含有してなる診断薬、
[21] 骨格筋細胞の分化および Zまたは代謝異常が関与する疾患の診斬用で ある上記 [18] または [20] 記載の診断薬、
[22] 上記 [19] 記載の抗体を含有してなる医薬、
[23] 配列番号： 2または 4で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に 同一のァミノ酸配列を含有するポリぺプチドをコ一ドする塩基配列と相補的な塩 基配列またはその一部を含有する核酸、
[24] 上記 [ 23 ] 記載の核酸を含有してなる医薬、
[25] 骨格筋細胞の分化および Zまたは代謝異常が関与する疾患の予防 ·治 療剤である上記 [22] または [24] 記載の医薬、
[26] 代謝異常が糖 ·脂質代謝異常である上記 [25] 記載の医薬、
[27] 上記 [19] 記載の抗体または上記 [23] 記載の核酸の有効量を哺 乳動物に投与することを含む、 骨格筋細胞の分化および/または代謝異常が関与 する疾患の予防 ·治療方法、
[28] 代謝異常が糖 ·脂質代謝異常である上記 [27] 記載の方法、
[29] 骨格筋細胞の分化および Zまたは代謝異常が関与する疾患の予防 ·治 療剤の製造のための、 上記 [19] 記載の抗体または上記 [23] 記載の核酸の 使用、
[30] 代謝異常が糖 ·脂質代謝異常である上記 [ 29 ] 記載の使用、
[31] 上記 [1] 記載の蛋白質もしくは上記 [3] 記載の部分ペプチドまた はその塩を用いることを特徴とする、 骨格筋細胞の分ィ匕および/または代謝異常 が関与する疾患の予防 ·治療物質のスクリ一ユング方法、
[32] 代謝異常が糖'脂質代謝異常である上記 [31] 記載のスクリーニン グ方法、
[33] 上記 [ 1 ] 記載の蛋白質もしくは上記 [ 3 ] 記載の部分べプチドまた はその塩を含むことを特徴とする、 骨格筋細胞の分化および/または代謝異常が 関与する疾患の予防 ·治療物質のスクリーニング用キット、
[34] 代謝異常が糖'脂質代謝異常である上記 [33] 記載のスクリーニン グ用キット、
[35] 上記 [4] 記載の核酸を用いることを特徴とする、 骨格筋細胞の分化 および/または代謝異常が関与する疾患の予防 ·治療物質のスクリーエング方法、 [36] 代謝異常が糖 ·脂質代謝異常である上記 [35] 記載のスクリーニン グ方法、
[37] 上記 [4] 記載の核酸を含むことを特徴とする、 骨格筋細胞の分化お よび/または代謝異常が関与する疾患の予防 ·治療物質のスクリ一ユング用キッ 卜、
[38] 代謝異常が糖 ·脂質代謝異常である上記 [37] 記載のスクリーニン グ用キット、
[39] 上記 [1] 記載の蛋白質またはその塩の調節薬を含有してなる、 骨格 筋細胞の分ィ匕およびノまたは代謝異常が関与する疾患の予防 ·治療剤、
[40] 代謝異常が糖 ·脂質代謝異常である上記 [39] 記載の予防 ·治療剤、 [41] ±13 [1] 記載の蛋白質またはその塩の調節薬の有効量を哺乳動物に 投与することを含む、 骨格筋細胞の分化および Zまたは代謝異常が関与する疾患 の予防 ·治療方法、
[42] 代謝異常が糖 ·脂質代謝異常である上記 [41] 記載の方法、
[43] 骨格筋細胞の分化および/または代謝異常が関与する疾患の予防 ·治 療剤の製造のための、 上記 [1] 記載の蛋白質またはその塩の調節薬の使用、 お ょぴ
[44] 代謝異常が糖 ·脂質代謝異常である上記 [43] 記載の使用などを提 供する。
本発明の骨格筋由来遺伝子にコードされる蛋白質は、 摂餌状態および糖尿病、 肥満状態において骨格筋細胞で特異的に発現する分泌もしくは膜蛋白質であり、 骨格筋細胞の分化や糖 ·脂質代謝機能を調節するなどの効果を奏する。 図面の簡単な説明
図 1は、 マウス SS169遺伝子の発現の組織分布を示す [左より脳、 心臓、 肺、 腎臓、 脾臓、 精巣、 褐色脂肪組織、 白色脂肪組織、 肝臓、 筋肉および小腸を示 す] 0 縦軸は任意の単位を示す。
図 2は、 糖尿病モデルマウス （KKAy, db/db) および正常マウス （C57BL/6) の 骨格筋における SS169遺伝子の発現を示す。 縦軸は任意の単位を示す。 *は pく 0. 01、 **は pく 0. 001を示す。
図 3は、 自.由摂食時、 絶食時およぴ再給餌時のマウス骨格筋における SS169遺 伝子の発現を示す。 縦軸は任意の単位を示す。
図 4は、 ラット SS169遺伝子の発現の組織分布を示す [左より脳、 肺、 心臓、 肝臓、 腎臓、 脾臓、 腸、 筋肉、 白色脂肪組織、 褐色脂肪組織および精巣を示す] 。 縦軸は任意の単位を示す。
図 5は、 マウス骨格筋由来細胞株 C2C12の分化誘導時における SS169遺伝子発現 の経曰変化を示す。 縦軸は任意の単位、 横軸は分化誘導後の日数を示す。
図 6は、 マウス骨格筋由来細胞株 C2C12における SS169遺伝子発現に及ぼすイン スリンの影響を示す。 縦軸は任意の単位、 横軸はィンスリン濃度を示す。 Cont. はィンスリン不含培地で培養した C2C12を示す。 *は pく 0. 01を示す。
図 7は、 ストレブトゾトシン （STZ) 投与糖尿病モデルマウスの骨格筋 （腓腹 筋およびひらめ筋） における SS169遺伝子発現を示す。 縦軸は任意の単位を示す。 Cont.は STZ非投与マウスを示す。 *は p〈0. 01を示す。
図 8は、 SS169遺伝子安定発現細胞株 (A： NIH3T3細胞； B ： C2C12細胞） にお ける SS169の局在性を示す。 Flag- tagを付けた SS169または GFP遺伝子を各細胞株 に導入し、 細胞抽出液および培養上清をそれぞれ抗 Flag抗体を用いて免疫沈降し、 SDS -ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、 抗 Flag抗体を用いたウェスタンプロッ ティングを行った。
図 9は、 マウス SS169遺伝子発現アデノウイルスを低力価 （2xl07pfu) 、 中力 価 （6xl07pfu) および高力価 （2xl08pfu) で感染させたマウスにおける肝臓で の SS169遺伝子の発現量を示す。 対照として lacZ遺伝子発現アデノウィルスを同 様に感染させたマウスを用いた。 縦軸は任意の単位を示す。 棒グラフは左より低 力価、 中力価、 高力価を示す。 腓腹筋は、 非感染マウスの腓腹筋における SS169 遺伝子の発現量を示す。
図 10は、 マウス SS169遺伝子発現アデノウイルスを低力価 （2xl07pfu) 、 中 力価 （6xl07pfu) およぴ高カ価 (2xl08pfu) で感染させたマウスにおける体重 (A) および摂食量 （B) の経日変化を示す。 対照として lacZ遺伝子発現アデノ ウィルスを同様に感染させたマウスを用いた。 縦軸は （A) 体重 （単位： g) お ょぴ （B) 摂食量 （単位： を示し、 横軸はウィルス感染後の日数を示す。 —♦—は lacZ遺伝子発現アデノウィルス感染マウス、 一画一は SS169遺伝子発現 アデノウィルス感染マウスを示す。 ' 図 1 1は、 マウス SS169遺伝子発現アデノウイルスを低力価 （2xl07pfu) 、 中- 力価 （6xl07pfu) およぴ高カ価 （2xl08pfu) で感染させたマウスにおける副睾 丸周囲の脂肪重量を示す。 縦軸は副睾丸周囲の脂肪重量 （単位： g) を示す。 棒 グラフは各力価について左より lacZ遺伝子発現アデノウィルス感染マウス、 SS169遺伝子発現アデノウィルス感染マウスを示す。 *は p<0.01を示す。
図 12は、 マウス SS169遺伝子発現アデノウイルスを低力価 （2xl07pfu) 、 中 力価 （6xl07pfu) およぴ高カ価 （2xl08pfu) で感染させたマウスにおける肝臓 の重量を示す。 縦軸は肝臓の重量 （単位： g) を示す。 棒グラフは各力価につい て左より lacZ遺伝子発現アデノウィルス感染マウス、 SS169遺伝子発現アデノゥ ィルス感染マゥスを示す。 *は pく 0· 01を示す。
図 1 3は、 マウス SS169遺伝子発現アデノウイルスを低力価 （2 x l07pfu) 、 中 力価 （6 x l07pfu) およぴ高カ価 （2 x l08pfu) で感染させたマウスにおける (A) 血糖値 （単位： mg/dl) 、 （B ) 血中インスリン値 （単位： ng/ml) 、 (C) 血中遊離脂肪酸濃度 （単位： mEq/1) および （D) 血中トリグリセリ ド濃 度 （単位： mg/dl) を示す。 棒グラフは各力価について左より lacZ遺伝子発現ァ デノウィルス感染マウス、 SS169遺伝子発現アデノウイルス感染マウスを示す。 * は P〈0. 01を示す。
図 1 4は、 インスリン刺激時おょぴ非刺激時における C2C12細胞内への3 H - 2 - deoxy-D-glucose (2-DG) の取り込み （A) 、 並びにインスリン刺激時における GLUT4, GLUT1およびへキソキナーゼ II (HK II) 遺伝子発現 （B ) に及ぼす SS169 の効果を示す。 Aにおいて、 縦軸は 2- DG取り込み （cpm/well) を示し、 **は p〈0. 001を示す。 Bにおいて、 縦軸は任意の単位を示し、 n. s,は有意差なしを示 す。
図 1 5は、 インスリン刺激時おょぴ非刺激時における C2C12細胞でのダリコー ゲン合成に及ぼす SS169の効果を示す。 縦軸は C2C12細胞内ダリコーゲン画分への D - [1 -14 C] glucoseの取り込み （cpm/mg蛋白質） を示し、 **は pく 0. 001を示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明の蛋白質は、 配列番号： 2または 4で表わされるァミノ酸配列中、 ァミ ノ酸番号 1以降のァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含 有する蛋白質である。
本発明の蛋白質は、 哺乳動物の骨格筋で特に高発現する （褐色脂肪組織でも弱 く発現する） 分泌もしくは膜蛋白質 （以下、 本発明の蛋白質を 「SS169」 と称す る場合もある） であるが、 上記の性質を有する限りその由来に特に制限はなく、 例えば、 哺乳動物 （例えば、 ヒト、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 プタ、 ゥ シ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） の細胞 [例えば、 肝細胞、 脾 細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 鹏蠘 3細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ラン ゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 杯細胞、 内皮細胞、 平滑筋細胞、 繊維芽 細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞 もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細^もしくはガン細胞な ど] もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織 [例えば、 脳、 脳の各部位 (例、 嗅球、 扁桃核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小 脳） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 聽、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆嚢、 骨髄、 副 腎、 皮膚、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 脂肪組織 （例、 褐色脂肪 組織、 白色脂肪組織） 、 骨格筋など] 等から単離 ·精製される蛋白質であっても よい。 また、 化学合成もしくは無細胞翻訳系で生化学的に合成された蛋白質であ つてもよいし、 あるいは上記アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸を 導入された形質転換体から産生される組換え蛋白質であってもよい。
配列番号： 2または 4で表されるアミノ酸配列中、 アミノ酸番号 1以降のアミ ノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、 配列番号： 2または 4で表さ れるアミノ酸配列中、 アミノ酸番号 1以降のアミノ酸配列と約 7 0 %以上、 好ま しくは約 8 0 %以上、 さらに好ましくは約 9 0 °/0以上、 特に好ましくは約 9 5 % 以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。 ここで 「相同性」 とは、 当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて 2つのアミノ酸配列を ァラインさせた場合の、 最適なアラインメント （好ましくは、 該アルゴリズムは 最適なァラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギヤップの導入を考 慮し得るものである） における、 オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同 一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合 （％) を意味する。 「類似アミノ酸」 とは物理ィ匕学的性質において類似したアミノ酸を意味し、 例えば、 芳香族ァミノ 酸 （Phe、 Trp、 Tyr) 、 脂肪族アミノ酸 （Ala、 Leu, Ile、 Val) 、 極性アミノ酸 (Gin, Asn) 、 塩基性アミノ酸 （Lys、 Arg、 His) 、 酸性アミノ酸 （Glu、 Asp) 、 水酸基を有するアミノ酸 （Ser、 Thr) 、 側鎖の小さいアミノ酸 （Gly、 Ala、 Ser、 Thr, Met) などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。 このような 類似アミノ酸による置換は蛋白質の表現型に変化をもたらさない （即ち、 保存的 アミノ酸置換である） ことが予測される。 保存的アミノ酸置換の具体例は当該技 術分野で周知であり、 種々の文献に記載されている （例えば、 Bowieら， Science, 247： 1306-1310 (1990)を参照） 。
アミノ酸配列の相同性を決定するためのアルゴリズムとしては、 例えば、
Karlinら， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 : 5873 - 5877 (1993)に記載のアル ゴリズム [該アルゴリズムは NBLASTおよび XBLASTプログラム （version 2. 0) に 組み込まれている （Altschulら， Nucleic Acids Res. , 25 : 3389-3402 (1997) ) ] 、 Needlemanら， J. Mol. Biol. , 48 : 444-453 (1970)に記載のアル ゴリズム [該アルゴリズムは GCGソフトウェアパッケージ中の GAPプログラムに組 み込まれている] 、 Myersおよび Miller, CABI0S, 4： 11 - 17 (1988)に記載のアル ゴリズム [該アルゴリズムは CGC配列アラインメントソフトウエアパッケージの —部である ALIGNプログラム （version 2. 0) に組み込まれている] 、 Pearsonら， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988)に記載のアルゴリズム [該 アルゴリズムは GCGソフトウエアパッケージ中の FASTAプログラムに組み込まれて いる] 等が挙げられる力 それらに限定されない。
より好ましくは、 配列番号： 2または 4で表されるアミノ酸配列中、 アミノ酸 番号 1以降のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、 配列番号： 2ま たは 4で表されるァミノ酸配列中、 ァミノ酸番号 1以降のァミノ酸配列と約 6 0 %以上、 好ましくは約 7 0 %以上、 さらに好ましくは約 8 0 %以上、 特に好ま しくは約 9 0 %以上の同一'性を有するァミノ酸配列である。 配列番号： 2または 4で表されるァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列 を含有する蛋白質としては、 例えば、 前記の配列番号： 2または 4で表されるァ ミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 2または 4で表 されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質など が好ましい。
実質的に同質の活性としては、 例えば、 レセプター （もしくはリガンド） 結合 活性およびシグナル情報伝達作用などが挙げられる。 「実質的に同質」 とは、 そ れらの活性が性質的に （例：生理学的に、 または薬理学的に） 同質であることを 示す。 したがって、 レセプタ一 （リガンド） 結合活性やシグナル情報伝達作用な どの活性が同等 （例：約 0 . 5〜約 2倍） であることが好ましいが、 これらの活 性の程度や蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
レセプター (もしくはリガンド) 結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性 の測定は、 自体公知の方法に準じて行なうことができるが、 例えば、 後述する特 異的親和性を有する生体物質 （レセプターもしくはリガンド） の決定方法ゃァゴ 二スト、 アンタゴニストのスクリーニング方法において用いられる方法に従って 測定することができる。
また、 本発明の蛋白質としては、 例えば、 （1)配列番号： 2または 4で表され るァミノ酸配列中ァミノ酸番号 1以降のァミノ酸配列のうち 1または 2個以上 (好ましくは、 1 ~ 3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは 数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 （2)配列番号： 2または 4で表されるァミノ酸配列中ァミノ酸番号 1以降のァミノ酸配列に 1または 2個 以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好まし くは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が付カ卩したアミノ酸配列、 （3)配列番号： 2ま たは 4で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号 1以降のアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好 ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、 （4)配列番 号： 2または 4で表されるァミノ酸配列中ァミノ酸番号 1以降のァミノ酸配列の うち 1または 2個以上 （好ましくは、 1 ~ 3 0個程度、 好ましくは 1〜 1 0個程 度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換された ァミノ酸配列、 または (5)それらを組み合わせたァミノ酸配列を含有する蛋白質 などのいわゆるムティンも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、 欠失または置換されている場合、 その揷入、 欠失または置換の位置は、 蛋白質の活性が保持される限り特に限定されない。
本発明の蛋白質は分泌もしくは膜蛋白質であり、 生体内では N末端にシグナル ペプチドを有する前駆ポリペプチドとして翻訳された後、 シグナルぺプチダーゼ によるプロセッシングを受けて成熟蛋白質となる。 シグナルペプチドの開裂部位 (成熟蛋白質の N末端） は、 例えば、 完全もしくは部分精製した本発明の蛋白質 をェドマン分解法に付すことにより決定することができるが、 前駆ポリぺプチド の一次構造から公知の数学的アルゴリズムを用いて予測することができる。 この ようなアルゴリズムとしては、 例えば、 Nielsenら， Int. Neural Syst. , 8 (5- 6)： 581-599 (1997)に記載のアルゴリズム [該アルゴリズムは SignalPプロダラ ム （WWWサーバー： http：〃 www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/上で利用可能） に 組み込まれている] 、 Emanuelssonら， J. Mol. Biol. 300： 1005-1016 (2000)に 記載のアルゴリズム [該アルゴリズムは TargetPプログラム （WWサーバー： htt ： //www. cbs. dtu. dk/services/TargetP/上で利用可能） に組み込まれてい る] 等が挙げられるが、 これらに限定されない。 例えば、 SOSUI (Signal) プロ グフム (WWWサーパ一： http:// sosui. proteome. bio. tuat. ac. jp/ cgi-bin/ sosui. cgi?/sosuisignal/sosuisignal— submit. html /上で利用可能） を用いた場合、 配 列番号： 2または 4で表されるァミノ酸配列を有するポリぺプチドはアミノ酸番 号一 1とアミノ酸番号 1の間で開裂すると予測される力 現実の開裂部位と必ず しも一致するわけではなく、 また、 本発明の蛋白質を発現する細胞種によってシ グナルの切断位置が異なる場合も起こり得る。 従って、 配列番号： 2または 4で 表されるァミノ酸配列中ァミノ酸番号 1以降のァミノ酸配列において 1または 2 個以上のアミノ酸が付加もしくは欠失したアミノ酸配列には、 その N末端に 1ま たは 2個以上のァミノ酸が付加したアミノ酸配列やその N末端の 1または 2個以 上のアミノ酸が欠失したァミノ酸配列も包含される。
本発明の蛋白質は、 好ましくは、 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列中アミ ノ酸番号 1以降のアミノ酸配列を有するヒト SS169蛋白質または配列番号： 4で 表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号 1以降のアミノ酸配列を有するマウス SS169蛋白質、 あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログ （例、 配列番号： 2 3で表されるァミノ酸配列中ァミノ酸番号 1以降のァミノ酸配列を有するラット ホモログ等） である。
本明細書において、 蛋白質おょぴペプチドは、 ペプチド標記の «例に従って左 端が N末端 （ァミノ末端） 、 右端が C (カルボキシル末端） で記載される。 配列番号： 2または 4で表されるァミノ酸配列中アミノ酸番号 1以降のアミノ酸 配列を含有する蛋白質をはじめとする、 本発明の蛋白質 （SS169) は、 C末端が カルボキシル基 (- C O OH) 、 カルボキシレート（一C O O一） 、 アミド （一 C O NH2 ) またはエステノレ (- C O O R) の何れであってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチノレ、 ェチル、 n—プロピノレ、 ィソプロピル、 n—プチルなどの C i — 6アルキル基；例えば、 シク口ペンチル、 シクロへキシルなどの C 3 _ 8 シクロアルキル基；例えば、 フエニル、 CK一ナフ チルなどの C 6 _ J 2ァリール基；例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフエ二 ルー ― 2アルキル基； CE—ナフチルメチルなどの CK—ナフチル一 一 2ァ ルキル基などの c 7一 1 4ァラルキル基；ピパロィルォキシメチル基などが用い られる。
本発明の蛋白質が C末端以外にカルボキシル基 （またはカルボキシレート） を 有している場合、 カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも 本発明の蛋白質に含まれる。 この場合のエステルとしては、 例えば上記した C末 端のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明の蛋白質には、 N末端のアミノ酸残基のァミノ基が保護基 （例 えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの ― 6 アルカノィルなどの C i — 6ァシ ル基など） で保護されているもの、 生体内で切断されて生成し得る N末端のダル タミン残基がピログルタミン酸化したもの、 分子内のァミノ酸の側鎖上の置換基 (例えば一 OH、 一 S H、 アミノ基、 イミダゾール基、 インドール基、 グァニジ ノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの _ 6ァ ルカノィル基などの — 6 ァシル基など） で保護されているもの、 あるいは糖 鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
SS169の部分ペプチド （以下、 単に 「本発明の部分ペプチド」 と略称する場合 もある） は、 上記した SS169の部分アミノ酸配列を有するペプチドであり、 且つ SS169と実質的に同質の活4を有する限り、 何れのものであってもよい。 ここで 「実質的に同質の活性」 とは上記と同意義を示す。 また、 「実質的に同質の洁 性」 の測定は SS169の^と同様に行なうことができる。
具体的には、 本発明の部分ペプチドとして、 例えば、 配列番号： 2または 4で 表されるァミノ酸配列中アミノ酸番号 1以降のァミノ酸配列のうち、 SS169と相 互作用し得る生体物質 （レセプターもしくはリガンド） との結合に関わる領域お ょぴ該相互作用を介したシグナル伝達に関わる領域をさらに含む部分ァミノ酸配 列を有するものなどが用いられる。
本発明の部分ぺプチドとしては、 少なくとも 3 0個以上、 好ましくは 6 0個以 上、 より好ましくは 1 0 0個以上のアミノ酸を有するペプチドなどが好ましい。 一方、 SS169の部分アミノ酸配列を含むが SS169と実質的に同質の活性を有しな いペプチド、 例えば、 配列番号： 2または 4で表されるアミノ酸配列中アミノ酸 番号 1以降のアミノ酸配列のうち、 SS169と相互作用し得る生体物質 （レセプタ 一もしくはリガンド） との結合に関わる領域を含むが、 該相互作用を介したシグ ナル伝達に関わる領域を含まない部分アミノ酸配列を有するものなどは、 「本発 明の部分ペプチド」 には含まれない。 しかしながら、 かかるペプチドは、 SS169 と相互作用し得る生体物質 （レセプターもしくはリガンド） と結合して SS169に よるシグナル伝達作用を遮断することができるので、 該シグナル伝達の異常亢進 が関与する病態 ·疾患の予防 ·治療などに有用であり得る。
また、 本発明の部分ペプチドは C末端がカルボキシル基 （一 C O O H) 、 カル ボキシレート （一 C O O— ) 、 アミド （一 C O NH 2 ) またはエステノレ （一 C O O R) の何れであってもよい。 ここでエステルにおける Rとしては、 SS169につ いて前記したと同様のものが挙げられる。 本発明の部分ペプチドが C末端以外に カルボキシル基 （またはカルボキシレート） を有している場合、 力ルポキシル基 がアミド化またはエステル化されているものも本発明の部分ペプチドに含まれる。 この場合のエステルとしては、 例えば、 C末端のエステルと同様のものなどが用 レヽられる。
さらに、 本発明の部分ペプチドには、 上記した SS169と同様に、 N末端のアミ ノ酸残基のァミノ基が保護基で保護されているもの、 N末端のグルタミン残基が ピログルタミン酸ィ匕したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護 基で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複 合ペプチドなども含まれる。
SS169またはその部分べプチドの塩としては、 酸または塩基との生理学的に許 容される塩が挙げられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 こ の様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫 酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタン スルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが用いられる。
SS169またはその塩は、 前述した哺乳動物の細胞または組織から自体公知の蛋 白質の精製方法によって製造することができる。 具体的には、 SS169が細胞膜に 局在する^は、 哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズし、 低速遠心により 細胞デブリスを除去した後、 上清を高速遠心して細胞膜含有画分を沈澱させ （必 要に応じて密度勾配遠心などにより細胞膜画分を精製し） 、 該画分を逆相クロマ トグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィー、 ァフィ二ティーク口マトグラフ ィ一などのクロマトグラフィ一等に付すことにより SS169またはその塩を調製す ることができる。 また、 SS169が細胞外に分泌される場合は、 哺乳動物の組織ま たは細胞を適当な培地中で培養した後、 濾過または遠心分離等により培養上清を 分取し、 該上清を上記と同様にク口マトグラフィ一等に付すことにより SS169ま たはその塩を調製することができる。
SS169もしくはその部分ペプチドまたはその塩 （以下、 「SS169類」 と総称する 場合がある） は、 公知のペプチド合成法に従って製造することもできる。
ペプチド合成法は、 例えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれであってもよい。
SS169類を構成し得る部分べプチドもしくはァミノ酸と残余部分とを縮合し、 生 成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とする蛋白質を製' 造することができる。
ここで、 縮合や保護基の脱離は、 自体公知の方法、 例えば、 以下の（1)〜(5)に 記載された方法に従って行われる。
(1) M. Bodanszky およぴ M. A. 0ndetti、 ペプチド · シンセシス （Peptide Synthesis) , Interscience Publishers, New YorK (1966年)
(2) Schroederおよぴ Luebke、 ザ *ぺプチド (The Peptide), Academic Press, New York (1965年）
(3)泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
(4)矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 蛋白質の化学 IV、 205、 (1977年）
(5)矢島治明監修、 続医薬品の開発、 第 14卷、 ペプチド合成、 広川書店
このようにして得られた蛋白質 （ペプチド） は、 公知の精製法により精製単離 することができる。 ここで、 精製法としては、 例えば、 溶媒抽出、 蒸留、 カラム クロマトグラフィー、 液体クロマトグラフィー、 再結晶、 これらの組み合わせな どが挙げられる。
上記方法で得られる蛋白質 （ペプチド） が遊離体である場合には、 該遊離体を 公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができる し、 逆に蛋白質 （ペプチド） が塩として得られた場合には、 該塩を公知の方法あ るいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
SS169類の合成には、 通常市販の蛋白質合成用樹脂を用いることができる。 そ のような樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル樹脂、 ベ ンズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4—ベンジルォキシベンジルアル コール樹脂、 4—メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 PAM樹脂、 4ーヒドロキシ メチルメチルフエ二ルァセトアミドメチル樹脂、 ポリアクリルアミド樹脂、 4一 ( 2， ， 4， ージメ トキシフエ二ルーヒドロキシメチノレ） フエノキシ樹脂、 4— ( 2， ， 4， 一ジメトキシフエエル一 Fmocアミノエチル） フエノキシ樹脂など を挙げることができる。 このような樹脂を用い、 ァミノ基と側鎖官能基を適 当に保護したアミノ酸を、 目的とする蛋白質 （ペプチド） の配列通りに、 自体公 知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂から蛋白質等 を切り出すと同時に各種保護基を除去し、 さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフ イド結合形成反応を実施し、 目的の蛋白質 （ペプチド） またはそのアミド体を取 得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 蛋白質合成に使用できる各種活性化 試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カルポジイミド 類としては、 D C C、 N, N， 一ジイソプロピルカルポジイミド、 N—ェチル一 N， - ( 3—ジメチルァミノプロリル） カルポジイミドなどが用いられる。 これ らによる活'性ィ匕にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 HO B t、 HO O B t)ととも に保護アミノ酸を直接樹脂に添加する力 \ または、 対称酸無水物または H O B t エステルあるいは HO O B tエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を 行なった後に樹脂に添加することができる。
保護ァミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒は、 蛋白質縮合反応に 使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例えば、 N, N—ジ メチルホルムアミド， N， N—ジメチルァセトアミド， N—メチルピロリドンな どの酸アミド類、 塩化メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲン化炭化水素類、 ト リフルォロェタノ一ルなどのアルコール類、 ジメチルスルホキシドなどのスルホ キシド類、 ピリジンなどのアミン類， ジォキサン， テトラヒドロフランなどのェ —テル類、 ァセトニトリル， プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メチル， 酢酸ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。 反応温度は蛋白質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜 選択され、 通常約一 2 0 °C〜5 0 °Cの範囲から適宜選択される。 活性化されたァ ミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜4倍過剰で用いられる。 ニンヒドリン反応を用いた テストの結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を 繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。 反応を繰り返しても十分 な縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァセチルイミダゾールを用いて未 反応ァミノ酸をァセチル化することができる。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保護 基の脱離、 反応に関与する官能基の活性ィ匕などは公知の基または公知の手段から 適宜選択しうる。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 B o c、 ターシャリーペンチ ルォキシカルボニル、 イソボルニルォキシカルポニル、 4ーメトキシベンジルォ キシカルボニル、 C I— Z、 B r— Z、 ァダマンチルォキシカルボニル、 トリフ ノレォロアセチノレ、 フタロイノレ、 ホノレミノレ、 2—-トロフエニノレスノレフエ二ノレ、 ジ フエニルホスフイノチオイル、 Fm o cなどが用いられる。
カルボキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 （例えば、 メチル、 ェチル、 プロピノレ、 ブチノレ、 ターシャリープチ/レ、 シクロペンチノレ、 シクロへキシノレ、 シ クロへプチル、 シクロォクチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしく は環状アルキルエステル化） 、 ァラルキルエステルイ匕 （例えば、 ベンジルエステ ノレ、 4一二トロべンジ /レエステノレ、 4—メトキシベンジノレエステノレ、 4一クロ口 ベンジ/レエステノレ、 ベンズヒ ドリノレエステ/レ化） 、 フエナシノレエステ/レイ匕、 ベン ジルォキシカルボニルヒドラジド化、 ターシャリープトキシカルポニルヒドラジ ド化、 トリチノレヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護するこ とができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基などの低 級アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシカルボニル 基、 エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。 また、 エーテルィ匕に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒドロビラニル基、 t -プチノレ基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 B z 1 、 C 1 2 — B z l 、 2—ニトロベンジル、 B r— Z、 ターシャリーブチルなどが用いられる。 ヒスチジンのィミダゾールの保護基としては、 例えば、 T o s、 4ーメトキシ 一 2， 3 , 6—トリメチルベンゼンスルホ -ル、 DN P、 ベンジルォキシメチル、 B u m, B o c、 T r t、 Fm o cなどが用いられる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 P d—黒あるいは P d—炭素な どの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタ ンスルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれ らの混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチルァミ ン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリ ゥムによる還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約一 2 0 °C〜4 0 °Cの温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソール、 フエノーノレ、 チオアニソーノレ、 メタクレゾ一ノレ、 パラクレゾーノレ、 ジメチ /レスノレ フイド、 1， 4ープタンジチオー^^、 1 , 2—エタンジチオー^^などのような力 チオン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾール保護基とし て用いられる 2， 4—ジニトロフエュル基はチォフエノール処理により除去され、 トリプトファンのィンドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1 , 2 一エタンジチオール、 1 , 4—ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱 保護以外に、 希水酸ィ匕ナトリウム溶液、 希アンモニアなどによるアルカリ処理に よっても除去される。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無水 物、 アジド、 活性エステル 〔アルコール （例えば、 ペンタクロロフエノール、 2， 4， 5—トリクロ口フエノーノレ、 2， 4—ジニトロフエノーノレ、 シァノメチノレア ルコール、 パラニトロフエノール、 HO N B、 N—ヒ ドロキシスクシミ ド、 N— ヒドロキシフタルイミド、 HO B t) とのエステル〕 などが用いられる。 原料の ァミノ基の活性ィヒされたものとしては、 例えば、 対応するリン酸アミドが用いら れる。
蛋白質 （ペプチド） のアミド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 カル ボキシ末端アミノ酸の α—カルボキシル基をアミド化して保護した後、 アミノ基 側にぺプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ぺプチド鎖の Ν末端の a—アミ ノ基の保護基のみを除いた蛋白質 （ペプチド） と C末端のカルボキシル基の保護 基のみを除去した蛋白質 （ペプチド） とを製造し、 この両蛋白質 （ペプチド） を 上記したような混合溶媒中で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様 である。 縮合により得られた保護蛋白質 （保護ペプチド） を精製した後、 上記方 法によりすベての保護基を除去し、 所望の粗蛋白質 （粗ペプチド） を得ることが できる。 この粗蛋白質 （粗ペプチド） は既知の各種精製手段を駆使して精製し、 主要画分を凍結乾燥することで所望の蛋白質 （ペプチド） のアミド体を得ること ができる。
蛋白質 （ペプチド） のエステル体は、 例えば、 カルボキシ末端アミノ酸の α— カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 上記 蛋白質 （ペプチド） のアミド体の場合と同様にして得ることができる。
本発明の部分ぺプチドまたはその塩は、 SS169またはその塩を適当なぺプチダ ーゼで切断することによつても製造することができる。
さらに、 SS169類は、 SS169またはその部分ペプチドをコードする核酸を含有す る形質転換体を培養し、 得られる培養物から SS169類を分離精製することによつ て製造することもできる。 SS169またはその部分べプチドをコードする核酸は D NAであっても R NAであってもよく、 あるいは D NAZR NAキメラであって もよい。 好ましくは D NAが挙げられる。 また、 該核酸は二本鎖であっても、一 本鎖であってもよい。 二本鎖の場合は、 二本鎖 D NA、 二本鎖 R NAまたは D N A： RNAのハイプリッドでもよい。 一本鎖の場合は、 センス鎖 （即ち、 コード 鎖） であっても、 アンチセンス鎖 （即ち、 非コード鎖） であってもよい。
SS169またはその部分ペプチドをコードする D NAとしては、 ゲノム D NA、 ゲノム DNAライブラリー、 哺乳動物 （例えば、 ヒト、 ゥシ、 サル、 ゥマ、 ブタ、 ヒッジ、 ャギ、 ィヌ、 ネコ、 モノレモッ ト、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ノヽムスター など） のあらゆる細胞 [例えば、 肝細胞、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 勝臓 )3細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細 胞、 杯細胞、 内皮細胞、 平滑筋細胞、 繊維芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラー細胞、 肥満 細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細 胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしくは間質細胞、 またはこれら細 胞の前駆細胞、 幹細胞もしくはガン細胞など] もしくはそれらの細胞が存在する あらゆる組織 [例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 嗅球、 扁桃核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小脳） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 膝臓、 腎臓、 肝 臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆嚢、 骨髄、 副腎、 皮膚、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 脂肪組織 （例、 褐色脂肪組織、 白色脂肪組織） 、 骨格筋など] 由来の c D NA、 前記した細胞 ·組織由来の c D NAライブラリー、 合成 D NAなどが 挙げられる。 ライブラリーに使用するベクターは、 パクテリオファージ、 プラス ミ ド、 コスミ ド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 上記した細 胞 ·組織より調製した全 R N Aまたは m R N A画分を用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 「R T— P C R法」 と略称す る） によって増幅することもできる。
SS169をコードする D NAとしては、 例えば、 配列番号： 1または 3で表され る塩基配列中塩基番号 8 8以降の塩基配列を含有する D NA、 または配列番号： 1または 3で表される塩基配列中塩基番号 8 8以降の塩基配列とハイストリンジ ェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、 前記した SS169と実質 的に同質の活性 （例： レセプター （もしくはリガンド） 結合活性、 シグナル伝達 作用など） を有する蛋白質をコードする D NAなどが挙げられる。
配列番号： 1または 3で表される塩基配列中塩基番号 8 8以降の塩基配列とハ イストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる D N Aとしては、 例えば、 配列番号： 1または 3で表される塩基配列中塩基番号 8 8以降の塩基配列と約 5 0 %以上、 好ましくは約 6 0 %以上、 さらに好ましくは約 7 0 %以上、 特に好ま しくは約 8 0 %以上、 最も好ましくは約 9 0 %以上の相同性を有する塩基配列を 含有する D N Aなどが用いられる。
ハイプリダイゼーシヨンは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例え ば、 モレキュラー .クローニング （Molecular Cloning) 第 2版 （J. Sambrook et al.， Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行 なうことができる。 また、 市販のライプラリーを使用する場合、 ハイブリダィゼ ーシヨンは、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。 ハイ プリダイゼーションは、 好ましくは、 ハイストリンジェントな条件に従って行な うことができる。
ノ、イストリンジェントな条件としては、 例えば、 ナトリウム塩濃度が約 1 9〜 約 4 0 mM、 好ましくは約 1 9〜約 2 0 mMで、 温度が約 5 0〜約 7 0 °C、 好ま しくは約 6 0〜約 6 5 °Cの条件等が挙げられる。 特に、 ナトリウム塩濃度が約 1 9 mMで温度が約 6 5 °Cの場合が好ましい。
SS169をコードする D NAは、 好ましくは配列番号： 1で表される塩基配列中 塩基番号 8 8以降の塩基配列で示される成熟ヒト SS169蛋白質をコードする塩基 配列を含有する D NA、 より好ましくは配列番号： 1で表されるヒト SS169前駆 ポリペプチドをコードする塩基配列を有する D NA、 または配列番号： 3で表さ れる塩基配列中塩基番号 8 8以降の塩基配列を含有する成熟マウス SS169蛋白質 をコードする塩基配列を含有する D NA、 より好ましくは配列番号： 3で表され るマウス SS169前駆ポリペプチドをコードする塩基配列を有する D NA、 あるい は他の哺乳動物におけるそのホモログ （例、 配列番号： 2 2で表される塩基配列 中塩基番号 8 8以降の塩基配列を含有する成熟ラット SS169蛋白質をコードする 塩基配列を含有する D NA、 好ましくは配列番号： 2 3で表されるラット SS169 前駆ポリべプチドをコ一ドする塩基配列を有する DN Aなど） である。
本発明の部分べプチドをコードする D N Aは、 配列番号： 2または 4で表され るァミノ酸配列中ァミノ酸番号 1以降のァミノ酸配列の一部と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を有するぺプチドをコ一ドする塩基配列を含むものであ ればいかなるものであってもよい。 また、 ゲノム D NA、 ゲノム D NAライプラ リ一、上記した細胞 ·組織由来の c D NA、 上記した細胞 ·組織由来の c D NA ライブラリー、 合成 D NAのいずれでもよい。 ライブラリーに使用するベクター は、 パクテリオファージ、 プラスミド、 コスミド、 ファージミドなどいずれであ つてもよい。 また、 上記した細胞'組織より調製した mRNA画分を用いて直接 R T- P C R法によって増幅することもできる。
具体的には、 本発明の部分ペプチドをコードする D NAとしては、 例えば、 ( 1 ) 配列番号： 1または 3で表される塩基配列中塩基番号 8 8以降の塩基配列 の部分塩基配列を有する D NA、 または （2 ) 配列番号： 1または 3で表される 塩基配列中塩基番号 8 8以降の塩基配列を有する D NAとハイストリンジェント な条件下でハイプリダイズする塩基配列を有し、 前記した SS169と実質的に同質 の活性 （例： レセプター （もしくはリガンド） 結合活性、 シグナル伝達作用な ど） を有するペプチドをコードする DNAなどが用いられる。
配列番号： 1または 3で表される塩基配列中塩基番号？ 8以降の塩基配列とハ イストリンジヱントな条件下でハイプリダイズできる D N Aとしては、 例えば、 該塩基配列と約 6 0 %以上、 好ましくは約 7 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 % 以上、 最も好ましくは約 9 0 %以上の同一性を有する塩基配列を含有する D NA などが用いられる。
SS169またはその部分ペプチドをコードする D NAは、 該 SS169またはその部分 ぺプチドをコ一ドする塩基配列の一部分を有する合成 D NAプライマーを用いて P C R法によって増幅する力 または適当な発現ベクターに組み込んだ D NAを、 SS169蛋白質の一部あるいは全領域をコードする D NA断片もしくは合成 D NA を標識したものとハイプリダイゼーシヨンすることによってクローニングするこ とができる。 ハイブリダィゼーシヨンは、 例えば、 モレキュラー 'クローニング (Molecular Cloning) 第 2版 （前述） に記載の方法などに従って行なうことが できる。 また、 市販のライブラリ一を使用する場合、 ハイブリダィゼーシヨンは、 該ライブラリ一に添付された使用説明書に記載の方法に従って行なうことができ る。
D N Aの塩基配列は、 公知のキット、 例えば、 MutanTM- super Express Km (宝 酒造 （株） ） 、 MutanTM- K (宝酒造 （株） ） 等を用いて、 0MAA PCR法、 Gapped duplex法、 Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って変 換することができる。
クローンィ匕された D NAは、 目的によりそのまま、 または所望により制限酵素 で消化するか、 リンカ一を付加した後に、 使用することができる。 該 D NAはそ の 5， 末端側に翻訳開始コドンとしての AT Gを有し、 また 3， 末端側には翻訳 終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TAGを有していてもよい。 これらの 翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合成 DNAアダプターを用いて付加 することができる。
SS169またはその部分べプチドをコ一ドする DN Aを含む発現べクターは、 例 えば、 SS169をコードする DNAから目的とする DNA断片を切り出し、 該 DN A断片を適当な発現べクタ一中のプロモーターの下流に連結することにより製造 することができる。
発現ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 pBR322, p BR 325, pUC 12, pUC 13) ；枯草菌由来のプラスミド （例、 pUB l l 0， pTP 5, p C 194) ；酵母由来プラスミド （例、 SH 19, p SHI 5) ；昆虫細胞発現プラスミド （例： pF a s t— Ba c) ；動物細胞発現ブラ スミ ド （例： P A 1— 11、 pXTl、 pRc/CMV、 pRc/RSV、 p c DNA I/Ne o) ； ファージなどのパクテリオファージ；パキュロウィルス などの昆虫ウィルスベクター （例： BmNPV、 Ac NP V) ；レトロウイルス、 ワクシニアウィルス、 アデノウイルスなどの動物ウィルスベクターなどが用いら れる。
プロモ—ターとしては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモー ターであればいかなるものでもよい。
例えば、 宿主が動物細胞である場合、 SRo;プロモーター、 SV40プロモー ター、 LTRプロモーター、 CMV (サイトメガロウィルス） プロモーター、 R S V (ラウス肉 J®ウィルス） プロモーター、 MoMuLV (モロニ一マウス白血 病ウィルス） LTR、 HS V-TK (単純へルぺスウィルスチミジンキナーゼ） プロモーターなどが用いられる。 なかでも、 CMVプロモーター、 SRo;プロモ 一ターなどが好ましい。
宿主がェシエリヒア属菌である場合、 t r pプロモーター、 1 a cプロモータ 一、 r e cAプロモーター、 PLプロモータ一、 l p pプロモーター、 T7プ 口モーターなどが好ましい。
宿主がパチ^"ス属菌である場合、 SPO lプロモーター、 S PO2プロモータ 一、 ： e n Pプロモーターなどが好ましい。
宿主が酵母である場合、 PHO 5プロモーター、 PGKプロモーター、 GAP プロモーター、 ADHプロモーターなどが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合、 ポリヘドリンプロモーター、 P 10プロモーター などが好ましい。
発現ベクターとしては、 上記の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシン グシグナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 SV40複製起点 （以下、 S V40 o r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用いることが できる。 選択マーカーとしては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子 （以下、 d h f rと略称する場合がある、 メソトレキセート （MTX) 耐性） 、 アンピシ リン耐性遺伝子 （以下、 amp r と略称する^^がある） 、 ネオマイシン耐性遺 伝子 （以下、 n e o r と略称する場合がある、 G41 8耐性） 等が挙げられる。 特に、 d h f r遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用い、 d h f r遺伝子 を選択マーカーとして使用する場合、 チミジンを含まない培地によって目的遺伝 子を選択することもできる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列をコードする塩基配列 （シグ ナルコドン） を、 SS169またはその部分ペプチドをコードする DNAの 5， 末端 側に付加 （またはネイティブなシグナルコドンと置換） してもよい。 例えば、 宿 主がェシェリヒァ属菌である場合、 Ph οΑ ·シグナル配列、 Omp A ·シグナ ル配列などが；宿主がバチルス属菌である場合、 ο:—アミラーゼ'シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列などが；宿主が酵母である場合、 MF a ·シグナノレ 配列、 SUC 2 ·シグナル配列などが；宿主が動物細胞である場合、 インスリ ン .シグナル配列、 α—インタ一フエロン 'シグナル配列、 抗体分子 ·シグナル 配列などがそれぞれ用いられる。 上記した SS169またはその部分べプチドをコードする DN Aを含む発現べクタ 一で宿主を形質転換し、 得られる形質転換体を培養することによって、 SS169類 を製造することができる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌としては、 例えば、 ェシエリヒア ' コリ （Escherichia coli) K 1 2 · DH 1 〔プロシ一ジングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·ァカデミ 一 ·ォブ 'サイェンシィズ 'ォブ ·ザ ·ユーエスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 60卷， 160 (1968)〕 ， ェシエリヒア 'コリ J M 103 〔ヌタレ イツク ·ァシッズ · リサーチ （Nucleic Acids Research) ， 9卷， 309 (19 8 1)〕 ， ェシエリヒア 'コリ JA221 〔ジャーナル ·ォブ ·モレキュラー · バイオロジー （Journal of Molecular Biology) ， 1 20卷， 5 1 7 (1 9 7 8)〕 ， ェシエリヒア 'コリ HB 101 〔ジャーナル'ォプ 'モレキュラー ·パ ィォロジ一， 41卷， 459 (1969)〕 ， ェシエリヒア ' コリ C 600 〔ジェ ネティックス （Genetics) ， 39卷， 440(1954)〕 などが用いられる。
バチルス属菌と しては、 例えば、 バチルス ' サブチルス （Bacillus subtilis) MI 1 14 〔ジーン， 24卷， 255 (1983)〕 ， バチルス ·サブ チルス 20 7— 2 1 〔ジャーナル ·ォプ ·パイオケミストリー （Journal of Biochemistry) ， 95卷， 87(1984)〕 などが用いられる。
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス 'セレビシェ （Saccharomyces cerevisiae) AH 22， AH22R—， NA87-1 1 A, DKD—5D, 20 B— 12、 シゾサッカロマイセス · ンべ (Schizosaccharomyces pombe) NC YC l 9 13， NCYC 2036、 ピキア ·パストリス （PicMa pastoris) K Μ71などが用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合、 夜盗蛾の幼虫由来 株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f細胞） 、 Trichoplusia niの中腸 由来の MG 1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High FiveTM細胞、 Mamestra brassicae由来の細胞、 Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。 ウィルス が BmNPVの場合、 昆虫細胞としては、 蚕由来株化細胞 （Bombyx mori N細 胞； BmN細胞） などが用いられる。 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 (ATCC CRL1711) 、 S f 2 1細胞 （以上、 Vaughn, J.L.ら、 イン .ヴイボ （In
Vivo) ,13， 213-217, (1977)) などが用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 ネィチヤ一 (Nature) ， 315卷， 592 (1985)〕 。
動物細胞としては、 例えば、 サル COS— 7細胞、 サル Ve r o細胞、 チヤィ ニーズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO細胞と略記） 、 dh f r遺伝子欠損 チャイニーズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO (dh i r— ) 細胞と略記） 、 マウス L細胞， マウス At T— 20細胞、 マウスミエローマ細胞， ラット GH3 細胞、 ヒト FL細胞などが用いられる。
形質転換は、 宿主の種類に応じ、 公知の方法に従って実施することができる。 ェシェリヒァ属菌は、 例えば、 プロシ一ジングズ 'ォブ ·ザ ·ナショナノレ ·ァカ デミ一 'ォブ ·サイェンジィズ 'ォブ 'ザ 'ユーエスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 69卷， 21 10 (1972) やジーン （Gene) ， 17卷， 107 (1982) などに記載の方法に従つて形質転換することができる。
バチルス属菌は、 例えば、 モレキュラー'アンド'ジェネラル ·ジエネティッ タス （Molecular & General Genetics) , 168卷， 1 1 1 (1979) など に記載の方法に従つて形質転換することができる。
酵母は、 例えば、 メソッズ · イン ' ェンザィモロジ一 （Methods in Enzymology) ， 194卷， 182— 187 (1991) 、 プロシージングズ ·ォ ブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー'ォブ ·サイェンシィズ .ォブ ·ザ ·ユーエス エー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 75卷， 1929 (1978) などに記 載の方法に従って形質転換することができる。 昆虫細胞おょぴ昆虫は、 例えば、 パイオ テクノロジー （Bio/Technology) ， 6卷， 4 7— 5 5 ( 1 9 8 8 ) などに記載の方法に従って形質転換することがで さる。
動物細胞は、 例えば、 細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プロトコール， 2 6 3 - 2 6 7 ( 1 9 9 5 ) (秀潤社発行） 、 ヴイロロジー （Virology) , 5 2卷， 4 5 6 ( 1 9 7 3 ) に記載の方法に従って形質転換することができる。
形質転換体の培養は、 宿主の種類に応じ、 公知の方法に従って実施することが できる。
例えば、 宿主がェシエリヒア属菌またはバチルス属菌である形質転換体を培養 する場合、 培養に使用される培地としては液体培地が好ましい。 また、 培地は、 形質転換体の生育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物などを含有することが好まし い。 ここで、 炭素源としては、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖などが；窒素源としては、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーン スチープ. リカー、 ペプトン、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 パレイショ抽出液 などの無機または有機物質が；無機物としては、 例えば、 塩ィ匕カルシウム、 リン 酸二水素ナトリウム、 塩化マグネシウムなどがそれぞれ挙げられる。 また、 培地 には、 酵母エキス、 ビタミン類、 生長促進因子などを添加してもよい。 培地の p Hは、 好ましくは約 5〜約 8である。
宿主がェシェリヒア属菌である形質転換体を培養する場合の培地としては、 例 えば、 グルコース、 カザミノ酸を含む M 9培地 〔ミラー （Miller) , ジャーナ ル . ォプ . ェクスペリメンッ ' イン . モレキュラー ' ジェネティックス 、Journa丄 of Experiments in Molecular Genetics) ， 4 3 1— 4 3 3 ， し old Spring Harbor Laboratory, New York 1 9 7 2〕 が好ましい。 必要により、 プ 口モーターを効率よく働かせるために、 例えば、 3 /3—インドリルアタリノレ酸の ような薬剤を培地に添加してもよい。
宿主がェシエリヒア属菌である形質転換体の培養は、 通常約 1 5〜約 4 3 °Cで、 約 3〜約 24時間行なわれる。 必要により、 通気や撹拌を行ってもよい。
宿主がバチルス属菌である形質転換体の培養は、 通常約 30〜約 40でで、 約 6〜約 24時間行なわれる。 必要により、 通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が酵母である形質転換体を培養する^の培地としては、 例えば、 パーク ホールダー （Burkholder) 最小培地 〔Bostian, K.L.ら， プロシージングズ 'ォ ブ.ザ.ナショナル 'アカデミー.ォプ .サイェンシィズ ·ォプ .ザ ·ユーエス エー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 77卷， 4505 (1 980) 〕 や 0.
5%カザミノ酸を含有する SD培地 [Bitter, G.A.ら， プロシ一ジングズ 'ォ プ.ザ.ナショナル 'アカデミー.ォブ .サイェンシィズ .ォブ .ザ .ユーエス ェ一 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 81卷， 5330 (1984) 〕 などが 挙げられる。 培地の pHは、 好ましくは約 5〜約 8である。 培養は、 通常約 2 0 〜約 35°Cで、 約 24〜約 72時間行なわれる。 必要に応じて、 通気や撹拌 を行ってもよい。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する場合の培地としては、 例えば Grace's Insect Medium [Grace, T.C.C. , ネイチヤー （Nature) ， 1 95 卷， 788 (1 962) 〕 に非働化した 10 %ゥシ血清等の添加物を適宜加えた ものなどが用いられる。 培地の pHは、 好ましくは約 6. 2〜約 6. 4である。 培養は、 通常約 27°Cで、 約 3〜約 53間行なわれる。 必要に応じて通気や撹拌 を行ってもよい。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する^^の培地としては、 例えば、 約
5〜約 20 %の胎児ゥシ血清を含む最小必須培地 （MEM) 〔サイエンス (Science) , 1 22卷， 501 (1952) 〕 ， ダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) 〔ヴイロロジー （Virology) ， 8卷， 396 (1959) 〕 ， RP Ml 1640培地 〔ジャーナル ·ォプ ·ザ ·ァメリカン'メディカル'ァソシ ェ一ション (The Journal of the American Medical Association) , 1 99： ， 5 1 9 (1 96 7) 〕 ， 199培地 〔プロシージング ·ォブ ·ザ · ソサイエテ ィ · フォー ·ザ ·バイオロジカル ·メディスン （Proceeding of the Society for the Biological Medicine) ， 7 3卷， 1 ( 1 9 5 0 ) 〕 などが用いられる。 培地の p Hは、 好ましくは約 6〜約 8である。 培養は、 通常約 3 0°C〜約 4 0 °C で、 約 1 5〜約 6 0時間行なわれる。 必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。 以上のようにして、 形質転換体の細胞内または細胞外に SS169類を製造せしめ ることができる。
前記形質転換体を培養して得られる培養物から SS169類を自体公知の方法に従 つて分離精製することができる。
例えば、 SS169類を培養菌体あるいは細胞の細胞質から抽出する場合、 培養物 力 ら公知の方法で集めた菌体あるいは細胞を適当な緩衝液に懸濁し、 超音波、 リ ゾチームおょぴ Zまたは凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壌した後、 遠心分離やろ過により可溶性蛋白質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。 該緩衝液は、 尿素や塩酸グァニジンなどの蛋白質変性剤や、 トリ トン X—1 0 0 T Mなどの界面活性剤を含んでいてもよい。 一方、 膜画分から SS169類を抽出する 場合は、 上記と同様に菌体あるいは細胞を破壊した後、 低速遠心で細胞デブリス を沈澱除去し、 上清を高速遠心して細胞膜含有画分を沈澱させる （必要に応じて 密度勾配遠心などにより細胞膜画分を精製する） などの方法が用いられる。 また、 SS169類が菌体 （細胞） 外に分泌される場合には、 培養物から遠心分離またはろ 過等により培養上清を分取するなどの方法が用いられる。
このようにして得られた可溶性画分、 膜画分あるいは培養上清中に含まれる
SS169類の単離精製は、 自体公知の方法に従って行うことができる。 このような 方法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法；透析法、 限外ろ 過法、 ゲルろ過法、 および S D S—ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主 として分子量の差を利用する方法；イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の 差を利用する方法；ァフィ二ティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利 用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方 法；等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法；などが用いられる。 こ れらの方法は、 適: ¾且み合わせることもできる。
力べして得られる蛋白質またはペプチドが遊離体である場合には、 自体公知の 方法あるいはそれに準じる方法によって、 該遊離体を塩に変換することができ、 蛋白質またはペプチドが塩として得られた場合には、 自体公知の方法あるいはそ れに準じる方法により、 該塩を遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、 形質転換体が産生する SS169類を、 精製前または精製後に適当な蛋白修 飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリペプチドを部分的 に除去することもできる。 該蛋白修飾酵素としては、 例えば、 トリプシン、 キモ トリプシン、 アルギエルエンドぺプチダーゼ、 プロテインキナーゼ、 グリコシダ ーゼなどが用いられる。
かくして得られる SS169類の存在は、 特異抗体を用いたェンザィムィムノアツ セィゃウェスタンプロッティングなどにより確認することができる。
さらに、 SS169類は、 上記の SS169またはその部分ペプチドをコードする D N A に対応する R NAを铸型として、 ゥサギ網状赤血球ライセート、 コムギ J3丕芽ライ セート、 大腸菌ライセートなどからなる無細胞蛋白質翻訳系を用いてインビトロ 合成することができる。 あるいは、 さらに R NAポリメラーゼを含む無細胞転写 Z翻訳系を用いて、 SS169またはその部分べプチドをコードする D N Aを铸型と しても合成することができる。
SS169蛋白質またはその初期翻訳産物、 即ち配列番号 2または 4で表されるァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するポリぺプチド、 をコードする塩基配列またはその一部、 あるいは該塩基配列と相補的な塩基配列 またはその一部を含有する核酸とは、 前述の SS169またはその部分ペプチドをコ 一ドする核酸だけではなく、 フレームの合わない塩基配列をも含む意味で用いら れる。
目的核酸の標的領域と相補的な塩基配列を含む核酸、 即ち、 目的核酸とハイプ リダィズすることができる核酸は、 該目的核酸に対して 「アンチセンス」 である ということができる。 一方、 目的核酸の標的領域と相同性を有する塩基配列を含 む核酸は、 該目的核酸に対して 「センス」 であるということができる。 ここで 「相同性を有する」 または 「相補的である」 とは、 塩基配列間で約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の同一性または相補 '14を有することをいう。
SS169蛋白質またはその初期翻訳産物をコードする塩基配列と相補的な塩基配 列またはその一部を含有する核酸 （以下、 「本発明のアンチセンス核酸」 ともい う） は、 クローン化した、 あるいは決定された SS169をコードする核酸の塩基配 列情報に基づき設計し、 合成しうる。 そうした核酸は、 SS169遺伝子の複製また は発現を阻害することができる。 即ち、 本発明のアンチセンス核酸は、 SS169遣 伝子から転写される R N Aとハイブリダィズすることができ、 m R N Aの合成 (プロセッシング) または機能 （蛋白質への翻訳） を阻害することができる。
本発明のアンチセンス核酸の標的領域は、 アンチセンス核酸がハイプリダイズ することにより、 結果として SS169蛋白質の翻訳が阻害されるものであればその 長さに特に制限はなく、 SS169 mR N Aの全配列であっても部分配列であっても よく、 短いもので約 1 5塩基程度、 長いもので mR NAまたは初期転写産物の全 配列が挙げられる。 合成の容易さや抗原性の問題を考慮すれば、 約 1 5〜約 3 0 塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいがそれに限定されなレ、。 具体的には、 例えば、 SS169前駆ポリペプチドをコードする核酸の 5， 端ヘアピンループ、 5， 端 6—ベースペア ' リピート、 5， 端非翻訳領域、 ポリペプチド翻訳開始コ ドン、 蛋白質コード領域、 O R F翻訳開始コドン、 3， 端非翻訳領域、 3， 端パ リンドローム領域、 および 3， 端ヘアピンループが標的領域として選択しうる力 SS169遺伝子内の如何なる領域も標的として選択しうる。 例えば、 該遺伝子のィ ントロン部分を標的領域とすることもまた好ましい。
さらに、 本発明のアンチセンス核酸は、 SS169 mR NAもしくは初期転写産物 とハイプリダイズして蛋白質への翻訳を阻害するだけでなく、 二本鎖 D NAであ る SS169遺伝子と結合して三重鎖 (トリプレックス) を形成し、 RNAの転写を 阻害し得るものであってもよい。
アンチセンス核酸は、 2—デォキシ一 D—リポースを含有しているデォキシリ ボヌクレオチド、 D—リポースを含有しているリボヌクレオチド、 プリンまたは ピリミジン塩基の N—ダリコシドであるその他のタイプのヌクレオチド、 あるい は非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー （例えば、 市販の蛋白質核酸お よび合成配列特異的な核酸ポリマー） または特殊な結合を含有するその他のポリ マ一 （但し、 該ポリマーは D NAや RNA中に見出されるような塩基のペアリン グゃ塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する） などが挙げられ る。 それらは、 2本鎖 DNA、 1本鎖 D NA、 2本鎖 R NA、 1本鎖 R NA、 さ らに D NA : RNAハイブリッドであることができ、 さらに非修飾ポリヌクレオ チド （または非修飾オリゴヌクレオチド） 、 さらには公知の修飾の付加されたも の、 例えば当該分野で知られた標識のあるもの、 キャップの付いたもの、 メチル 化されたもの、 1個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、 分子内 ヌクレオチド修飾のされたもの、 例えば非荷電結合 （例えば、 メチルホスホネー ト、 ホスホトリエステル、 ホスホルアミデート、 力ルバメートなど） を持つもの、 電荷を有する結合または硫黄含有結合 （例えば、 ホスホロチォエート、 ホスホロ ジチォェ一トなど） を持つもの、 例えば蛋白質 （ヌクレアーゼ、 ヌクレア一ゼ' インヒビター、 トキシン、 抗体、 シグナ /レペプチド、 ポリ一 L—リジンなど） や 糖 （例えば、 モノサッカライドなど） などの側鎖基を有しているもの、 インター カレント化合物 （例えば、 ァクリジン、 プソラレンなど） を持つもの、 キレート 化合物 （例えば、 金属、 放射活性をもつ金属、 ホウ素、 酸化性の金属など） を含 有するもの、 アルキル化剤を含有するもの、 修飾された結合を持つもの （例えば、 αァノマー型の核酸など） であってもよい。 ここで 「ヌクレオシド」 、 「ヌクレ ォチド」 および 「核酸」 とは、 プリンおょぴピリミジン塩基を含有するのみでな く、 修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。 こう した修飾物は、 メチルイヒされたプリンおょぴピリミジン、 ァシル化されたプリン およびピリミジン、 あるいはその他の複素環を含むものであってよい。 修飾され たヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよ く、 例えば、 1個以上の水酸基がハロゲンと力、、 脂肪族基などで置換されていた り、 あるいはエーテル、 ァミンなどの官能基に変換されていてよい。
アンチセンス核酸は、 R NA、 D NA、 あるいは修飾された核酸 （R NA、 D NA) である。 修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチォホスフ エート誘導体、 そしてポリヌクレオシドアミドゃォリゴヌクレオシドアミドの分 解に抵抗性のものが挙げられるが、 それに限定されるものではない。 本発明のァ ンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。 すなわち、 細胞内で のァンチセンス核酸をより安定なものにする、 ァンチセンス核酸の細胞透過性を より高める、 目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、 そし てもし毒 14があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。 こうし た修飾は当該分野で数多く知られており、 例えば J. Kawakami et al. , Pharm Tech Japan, Vol. 8， pp. 247, 1992； Vol. 8， pp. 395, 1992； S. T. Crooke et al. ed. , Ant i sense Research and Applications, CRC Press, 1993 などに (¾ がある。
アンチセンス核酸は、 変化せしめられたり、 修飾された糖、 塩基、 結合を含有 していて良く、 リボゾーム、 ミクロスフエアのような特殊な形態で供与されたり、 遺伝子治療により適用されたり、 付加された形態で与えられることができうる。 こうして付加形態で用いられるものとしては、 リン酸基骨格の電荷を中和するよ うに働くポリリジンのようなポリカチオン体、 細胞膜との相互作用を高めたり、 核酸の取込みを増大せしめるような脂質 （例えば、 ホスホリピド、 コレステロ一 ルなど） といった疎水性のものが挙げられる。 付加するに好ましい脂質としては、 コレステロールやその誘導体 （例えば、 コレステリルクロ口ホルメート、 コール 酸など） が挙げられる。 こうしたものは、 核酸の 3， 端あるいは 5， 端に付着さ せることができ、 塩基、 糖、 分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることが できうる。 その他の基としては、 核酸の 3， 端あるいは 5， 端に特異的に配置さ れたキャップ用の基で、 ェキソヌクレアーゼ、 RN a s eなどのヌクレアーゼに よる分解を阻止するためのものが挙げられる。 こうしたキャップ用の基としては、 ポリエチレングリコール、 テトラエチレンダリコールなどのグリコールをはじめ とした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、 それに限定されるも のではない。
SS169 mRN Aもしくは初期転写産物を、 コード領域の内部 （初期転写産物の 場合はイントロン部分を含む） で特異的に切断し得るリポザィムもまた、 本発明 のアンチセンス核酸に包含され得る。 「リポザィム」 とは核酸を切断する酵素活 性を有する R NAをいう力 最近では当該酵素活性部位の塩基配列を有するオリ ゴ DNAも同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、 本明細 書では配列特異的な核酸切断活性を有する限り D N Aをも包含する概念として用 いるものとする。 リポザィムとして最も汎用性の高いものとしては、 ウイロイド やウィルソィド等の感染性 R NAに見られるセルフスプライシング R NAがあり、 ハンマーへッド型ゃヘアピン型等が知られている。 ハンマーへッド型は約 4 0塩 基程度で酵素活性を発揮し、 ハンマーへッド構造をとる部分に隣接する両端の数 塩基ずつ （合わせて約 1 0塩基程度） を mRNAの所望の切断部位と相補的な配 列にすることにより、 標的 mRNAのみを特異的に切断することが可能である。 このタイプのリボザィムは、 R NAのみを基質とするので、 ゲノム D NAを攻撃 することがないというさらなる利点を有する。 SS169 mR N Aが自身で二本鎖構 造をとる場合には、 R NAヘリカーゼと特異的に結合し得るウィルス核酸由来の R NAモチーフを連結したハイプリッドリボザィムを用いることにより、 標的配 列を一本鎖にすることができる [Pro Natl. Acad. Sci. USA, 98 (10)： 5572- 5577 (2001) ] 。 さらに、 リポザィムを、 それをコードする D N Aを含む発現べ クターの形態で使用する場合には、 転写産物の細胞質への移行を促進するために、 t R N Aを改変した配列をさらに連結したハイブリツドリボザィムとすることも できる [Nucleic Acids Res.， 29 (13)： 2780—2788 (2001)] 。
SS169 mRNAもしくは初期転写産物のコード領域内の部分配列 （初期転写産 物の場合はイントロン部分を含む） に相補的な二本鎖オリゴ R NA ( s i R N A) もまた、 本発明のアンチセンス核酸に包含され得る。 短い二本鎖 RNAを細 胞内に導入するとその RNAに相補的な mRNAが^される、 いわゆる R NA 干渉 （R NA i ) と呼ばれる現象は、 以前から線虫、 昆虫、 植物等で知られてい たが、 最近、 この現象が哺乳動物細胞でも起こることが確認されたことから [Nature, 411 (6836)： 494-498 (2001) ] 、 リボザィムの代替技術として注目さ れている。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド及ぴリポザィムは、 SS169 c D NA 配列もしくはゲノミック D NA配列情報に基づいて mR NAもしくは初期転写産 物の標的領域を決定し、 市販の D NAZR NA自動合成機 （アプライド'バイオ システムズ社、 ベックマン社等） を用いて、 これに相補的な配列を合成すること により調製することができる。 RNA i活性を有する s i R NAは、 センス鎖及 ぴアンチセンス鎖を D NA/R NA自動合成機でそれぞれ合成し、 適当なァニー リング緩衝液中で、 例えば、 約 9 0〜約 9 5 °Cで約 1分程度変性させた後、 約 3 0〜約 7 0°Cで約 1〜約 8時間アニーリングさせることにより調製することがで きる。 また、 相補的なオリゴヌクレオチド鎖を交互にォーパーラップするように 合成して、 これらをァニーリングさせた後リガーゼでライゲーションすることに より、 より長い二本鎖ポリヌクレオチドを調製することもできる。
本発明のアンチセンス核酸の遺伝子発現阻害活性は、 SS169をコードする核酸 を含有する形質転換体、 生体内や生体外の SS169遺伝子発現系または SS169蛋白質 の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。 該核酸それ自体公知の 各種の方法で細胞に適用できる。 本発明はまた、 SS169もしくはその部分べプチドまたはその塩に対する抗体を 提供する。 該抗体は、 SS169類に対して特異的親和性を有するものであれば、 モ ノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。 SS169類に対 する抗体は、 SS169類を抗原として用い、 自体公知の抗体または抗血清の製造法 に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
( a ) モノクロナール抗体産生細胞の ί«
SS169類は、 哺乳動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あ るいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全フロイントアジュパントや不完全フロイントアジュパントを投与してもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜1 0回程度行なわれる。 用いられる哺 乳動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモット、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギが挙げられる力 マウスおょぴラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原を免疫された哺乳動物、 例えば、 マウスから抗体価の認め れた個体を選択し最終免疫の 2〜5日後に脾 臓またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合 させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイプリドーマを調製することがで きる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の標識化 SS169類と抗血清とを 反応させた後、 抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことが できる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケーラーとミルスタインの方法 〔ネィ チヤ一 （Nature；)、 2 5 6卷、 4 9 5頁 （1 9 7 5年） 〕 に従い実施することが できる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレングリコール （P E G) ゃセ ンダイゥィルスなどが挙げられるが、 好ましくは P E Gが用いられる。
骨髄腫細胞としては、 例えば、 N S— 1、 P 3 U 1、 S P 2 Z 0などが挙げら れるが、 P 3 U 1が好ましく用いられる。 用いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1〜2 0 ： 1程度であり、 P E G (好 ましくは、 P E G 1 0 0 0〜P E G 6 0 0 0 ) が 1 0〜 8 0 %程度の濃度で添加 され、 約 2 0〜4 0 °C、 好ましくは約 3 0〜3 7 °Cで約 1〜1 0分間インキュべ ートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリ一ユングには種々の方法が使 用できるが、 例えば、 蛋白質等の抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固 相 （例、 マイクロプレート） にハイプリドーマ培養上清を添加し、 次にお谢性物 質や酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体 （細胞融合に用いられる細胞がマ ウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる） またはプロテイン Aを 加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免疫グロブリン抗 体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリ ドーマ培養上清を添加し、 放 射性物質や酵素などで標識した蛋白質等を加え、 固相に結合したモノクローナル 抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、 自体公知あるいはそれに準じる方法に従つて行 なうことができるが、 通常は HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジ ン） を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。 選別おょぴ育種用培 地としては、 ハイプリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても 良い。 例えば、 1〜 2 0 %、 好ましくは 1 0〜 2 0 %の牛胎児血清を含む R PM I 1 6 4 0培地、 1〜 1 0 %の牛胎児血清を含む G I T培地 （和光純薬工業 (株） ) またはハイプリドーマ培養用無血清培地 （S F M— 1 0 1、 日水製薬 (株） ) などを用いることができる。 培養温度は、 通常 2 0〜4 0 ° (：、 好ましく は約 3 7 °Cである。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間 である。 培養は、 通常 5 %炭酸ガス下で行なうことができる。 ハイプリドーマ培 養上清の抗体価は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
( b ) モノクロナー/レ抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、 通常のポリク口ーナル抗体の分離精製と同 様に免疫グロブリンの分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿 法、 電気泳動法、 イオン交換体 （例、 D E AE) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲ ルろ過法、 抗原結合固相またはプロテイン Aあるいはプロテイン Gなどの活性吸 着剤により抗体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従 つて行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクロ一ナル抗体は、 それ自体公知あるいはそれに準じる方法にし たがって製造することができる。 例えば、 免疫抗原 （蛋白質等の抗原） とキヤリ ァー蛋白質との複合体を作り、 上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳 動物に免疫を行ない、 該免疫動物から SS169類に対する抗体含有物を採取して、 抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体 に関し、 キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、 キ ャリァ一に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、 どの 様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アルブミン、 ゥシサイログロブリン、 キーホール · リンぺット ·へモシァニン等を重量比でハ プテン 1に対し、 約 0 . 1〜2 0、 好ましくは約 1〜5の割合でカプルさせる方 法が用いられる。
また、 ハプテンとキャリアーの力プリングには、 種々の縮合剤を用いることが できるが、 ダルタルアルデヒドゃカルポジイミド、 マレイミド活性エステル、 チ オール基、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、 哺乳動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは 担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全 フロイントアジュパントゃ不完全フロイントアジュパントを投与してもよい。 投 与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜 1 0回程度行なうことができる。 ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、 腹水など、 好ましくは血液から採取することができる。 抗血清中のポリク口ーナル抗体価の測定は、 上記の血清中の抗体価の測定と同 様にして測定できる。 ポリクローナル抗体の分離精製は、 上記のモノクローナル 抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従つて行なうことができ る。
SS169もしくはその部分べプチドまたはその塩、 SS169またはその部分ぺプチド をコードする核酸 （アンチセンス核酸を含む） 、 および SS169またはその部分べ プチドに対する抗体は、 （1 ) SS169に対して特異的親和性を有する化合物 （リ ガンドまたはレセプター） またはその塩の決定、 （2 ) SS169の機能不全に関連 する疾患の予防 ·治療剤、 ( 3 ) SS169の過剰発現に関連する疾患の予防 ·治療 剤、 （4 ) 遺伝子診断剤、 （5 ) SS169の発現量を変化させる化合物のスクリー ユング方法、 （6 ) SS169の発現量を変化させる化合物を含有する各種疾患の予 防 ·治療剤、 （7 ) SS169に対して特異的親和性を有する化合物の定量法、
( 8 ) SS169と SS169に対して特異的親和性を有する化合物との結合性を変ィヒさせ る化合物 （ァゴュスト、 アンタゴニストなど） のスクリーニング方法、 （9 ) SS169と SS169に対して特異的親和性を有する化合物との結合性を変化させる化合 物 （ァゴ二スト、 アンタゴニスト） を含有する各種疾患の予防 ·治療剤、 （1 0 ) SS169もしくはその部分ペプチドまたはその塩の定量、 （1 1 ) 細胞膜また は細胞外液における SS169の量を変化させる化合物のスクリーニング方法、 （1 2 ) 細胞膜または細胞外液における SS169の量を変化させる化合物を含有する各 種疾患の予防'治療剤、 （1 3 ) SS169をコードする D NAを有する非ヒトトラ ンスジエニック動物の作製、 ( 1 4 ) SS169をコードする遺伝子が不活性ィ匕され た非ヒトノックアウト動物の作製などに用いることができる。
特に、 本発明の組換え SS169またはその部分ぺプチドの発現系を用いたァフィ 二ティーアツセィ系を用いることによって、 SS169とそのレセプター （もしくは リガンド） の結合性を変化させる化合物 （例、 ァゴニスト、 アンタゴニストな ど） をスクリーニングすることができ、 該ァゴ-ストまたはアンタゴニストを各 種疾患の予防 ·治 «1などとして使用することができる。
SS169類、 SS169またはその部分ペプチドをコードする DNA (以下、 「本発明 の DNA」 と略記する場合がある） 、 本発明のアンチセンス核酸おょぴ SS169類 に対する抗体 （以下、 「本発明の抗体」 と略記する場合がある） の用途について、 以下に具体的に説明する。
( 1 ) SS169に対して特異的親和性を有する化合物の決定
SS169もしくはその部分べプチドまたはその塩は、 SS169またはその塩に対して 特異的親和性を有する化合物 （レセプターもしくはリガンド） を探索し、 または 決定するための試薬として有用である。
すなわち、 本発明は、 SS169類と試験化合物とを接触させることを特徴とする
SS169またはその塩に対して特異的親和性を有する化合物の決定方法を提供する。 試験化合物としては、 公知のリガンド （例えば、 アンギオテンシン、 ボンべシ ン、 カナビノイド、 コレシストキニン、 グノレタミン、 セロトニン、 メラトニン、 ニューロペプチド γ、 ォピオイド、 プリン、 パソプレツシン、 ォキシトシン、 Ρ ACAP、 セクレチン、 グルカゴン、 カノレシトニン、 アドレノメジュリン、 ソマ トスタチン、 GHRH、 CRF、 ACTH、 GRP、 PTH、 V I P (パソァク ティブ インテスティナノレ アンド リレイテッド ポリペプチド） 、 ソマトス タチン、 ドーパミン、 モチリン、 アミリン、 ブラジキニン、 CGRP (カルシト ユンジーンリレーティッドペプチド） 、 ロイコトリェン、 パンクレアスタチン、 プロスタグランジン、 トロンボキサン、 アデノシン、 アドレナリン、 αおよび /3 —ケモカイン （chemokine) (例えば、 I L— 8、 G O a, GROj3、 GRO γ、 NAP— 2、 ΕΝΑ— 78、 PF4、 I P 10、 GCP— 2、 MCP— 1、 HC 14、 MCP— 3、 I一 309、 ΜΙ Ρ 1 α、 MI P— 1 /3、 R ANTES など） 、 エンドセリン、 ェンテロガストリン、 ヒスタミン、 ニューロテンシン、 TRH、 パンクレアティックポリぺプタイドまたはガラニンなど） 、 上記リガン ドに対する公知のレセプター、 ゲノム解析の結果同定されたォーファンレセプタ —などの他に、 例えば、 哺乳動物 （例えば、 ヒト、 マウス、 ラット、 プタ、 ゥシ、 ヒッジ、 サルなど） の組織抽出物、 無傷細胞、 細胞膜画分、 細胞培養上清などが 用いられる。 例えば、 組織抽出物、 細胞培養上清などを SS169類を発現する細胞 に添加し、 細胞刺激活性などを指標にしながら分画し、 最終的に単一のリガンド を得ることができる。 あるいは、 無傷細胞、 細胞膜画分などに SS169類を添カロし、 細胞刺激活性や結合活性などを指標にしながら分画し、 最終的に単一のレセプタ 一を得ることができる。
具体的には、 SS169またはその塩に対して特異的親和性を有する化合物の決定 方法は、 SS169類を用いるか、 または組換え SS169もしくはその部分ペプチドの発 現系を構築し、 該発現系を用いたァフィ二ティーアツセィ系を用いることによつ て、 SS169に結合して細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 ァセチルコリ ン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 c GMP生成、 イノ シトー/レリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o s活 性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性） を有する化合物 （例 えば、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性ィヒ合物、 合成化合物、 発酵生産物など） またはその塩を決定する方法である。
SS169またはその塩に対して特異的親和性を有する化合物の決定方法において は、 SS169類と試験化合物とを接触させた場合の、 SS169類に対する試験ィ匕合物の 結合量や細胞刺歡活性などを測定することを特徴とする。
より具体的には、 本発明は、 '
(1)標識した試験化合物を SS169類に接触させた場合における、 標識した試験ィ匕合 物の SS169類に対する結合量を測定することを特徴とする、 SS169またはその塩に 対して特異的親和性を有する化合物の決定方法、
(2〉標識した試験化合物を、 SS169を産生する細胞またはその細胞膜画分、 あるい は細胞外液または細胞培養上清 （この場合、 例えば、 上記の本発明の抗体を固定 化した固相 （細胞培養プレート等） を用いて SS169を固相化する） に接触させた 場合における、 標識した試験化合物の該細胞、 該膜画分、 該細胞外液または該細 胞培養上清に対する結合量を測定することを特徴とする、 SS169またはその塩に 対して特異的親和性を有する化合物の決定方法、
(3)標識した試験化合物を、 SS169またはその部分べプチドをコ一ドする D NAを 含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した、 または培養上 清に分泌された SS169類 （この場合、 例えば、 上記の本発明の抗体を固定ィ匕した 固相 （細胞培養プレート等） を用いて SS169類を固相化する） に接触させた場合 における、 標識した試験化合物の SS169類に対する結合量を測定することを特徴 とする、 SS169またはその塩に対して特異的親和性を有する化合物の決定方法、 (4)試験化合物 （または試験化合物である膜蛋白質等を細胞膜上に含有する細 胞） を、 SS169を産生する細胞 （または SS169を分泌する細胞の培養上清） に接触 させた場合における、 SS169 (または試験化合物である膜蛋白質等） を介した細 胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 + 遊離、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細 胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 p Hの低下など を促進する活性または抑制する活性など） を測定することを特徴とする SS169ま たはその塩に対するリガンド （またはレセプター） の決定方法、 および
(5)試験化合物 （または試験化合物である膜蛋白質等を細胞膜上に含有する細 胞） を、 SS169またはその部分ペプチドをコードする D NAを含有する形質転換 体を培養することによって細胞膜上に発現した SS169類 （SS169またはその部分べ プチドをコ一ドする D NAを含有する形質転換体を培養することによって培養上 清中に分泌された SS169類） に接触させた場合における、 SS169類 （または試験ィ匕 合物である膜蛋白質等） を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 ァ セチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 c GMP 生成、 イノシト一ルリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c — f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を 測定することを特徴とする SS169またはその塩に対するリガンド （またはレセプ ター） の決定方法を提供する。
特に、 上記（1)〜（3)の試験を行ない、 試験化合物が SS169に結合することを確 認した後に、 上記 (4)〜 (5)の試験を行なうことが好ましレ、。
まず、 リガンド （またはレセプター） 決定方法に用いる SS169類としては、 上 記した SS169もしくはその部分ぺプチドまたはその塩であれば何れのものであつ てもよいが、 動物細胞を用いて大量発現させた組換え SS169などが適している。 組換え SS169を製造するには、 前述の発現方法が用いられるが、 SS169をコード する D N Aを哺乳動物細胞や昆虫細胞で発現させることにより行なうことが好ま しい。 目的とする蛋白質部分をコードする D NA断片には、 通常、 c D NAが用 いられるが、 必ずしもこれに制約されるものではない。 例えば、 遺伝子断片や合 成 D NAを用いてもよい。 SS169をコードする D NA断片を宿主動物 （または昆 虫） 細胞に導入し、 それらを効率よく発現させるためには、 該 D NA断片を、 S V 4 0由来のプロモーター、 レトロウイ/レスのプロモーター、 メタ口チォネイン プロモーター、 ヒトヒートショックプロモーター、 サイトメガロウイ/レスプロモ 一ター、 S R o!プロモーター、 昆虫を宿主とするパキュロウィルスに属する核多 角体病ウイノレス (nuclear polyhedrosis virus； N P V) のポリへドリンプロモ 一ターなどの下流に組み込むのが好ましい。
本発明のリガンド （またはレセプター） 決定方法において、 SS169類は、 それ 自体公知の方法に従って精製した SS169類であってもよいし、 SS169類を産生する 細胞またはその細胞膜画分、 あるいは SS169類を分泌する細胞の培養上清として 用いてもよい。
本発明のリガンド決定方法において、 SS169類を産生する細胞を用いる場合、 該細胞をダルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定化してもよい。 固定化方法 はそれ自体^ Pの方法に従って行なうことができる。
SS169類を産生する細胞とは、 SS169類を発現した宿主細胞をいうが、 該宿主細 胞としては、 大腸菌、 枯草菌、 酵母、 昆虫細胞、 動物細胞などが用いられる。 前記細胞膜画分としては、 細胞を破碎した後、 それ自体公知の方法で得られる 細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。 細胞の破碎方法としては、 Potter— Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ワーリンダブレンダ一やポリ トロン （Kinematica社製） による破砕、 超音波による破砕、 フレンチプレスなど で加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられ る。 細胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力によ る分画法が主として用いられる。 例えば、 細胞石皮砕液を低速 （5 0 0 r p m〜3 0 0 0 r p m) で短時間 （通常、 約 1〜： L 0分） 遠心し、 上清をさらに高速 （1 5 0 0 0 r p m〜3 0 0 0 0 r p m) で通常 3 0分〜 2時間遠心し、 得られる沈 澱を膜画分とする。 該膜画分中には、 発現した SS169類と細胞由来のリン脂質や 膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
SS169類を産生する細胞やその膜画分中の SS169類の量は、 1細胞当たり 1 0 3 〜1 0 8分子であるのが好ましく、 1 0 5〜1 0 7分子であるのがより好適であ る。 なお、 発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性 （比活性） が高く なり、 高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、 同一ロット で大量の試料を測定できるようになる。
SS169またはその塩に対するリガンドを決定する上記の（1)〜（3)の方法を実施 するためには、 適当な SS169類含有膜画分と標識した試験化合物が必要である。
SS169類含有膜画分としては、 天然型の SS169含有膜画分か、 またはそれと同等 の活性を有する組換え SS169類含有膜画分などが望ましい。 ここで、 同等の活性 とは、 同等のリガンド結合活性、 シグナル情報伝達作用などを示す。
標識した試験化合物としては、 〔3 H〕 、 2 5 I〕 、 4 C〕 、 〔3 5 S〕 などで標識したアンギオテンシン、 ボンべシン、 カナビノイド、 コレシスト キュン、 グルタミン、 セロトニン、 メラトユン、 ニューロペプチド Y、 オビオイ ド、 プリン、 パソプレツシン、 ォキシトシン、 P A C A P、 セクレチン、 グルカ ゴン、 カルシトニン、 アドレノメジユリン、 ソマトスタチン、 GHRH、 CRF、 ACTH、 GRP、 PTH、 V I P (パソアクティブ インテスティナル アン ド リイテッド ポリペプチド） 、 ソマトスタチン、 ドーパミン、 モチリン、 ァ ミリン、 ブラジキュン、 CGRP (カルシトニンジーンリレーティッドぺプチ ド） 、 ロイコトリェン、 パンクレアスタチン、 プロスタグランジン、 トロンポキ サン、 アデノシン、 アドレナリン、 c¾および )3—ケモカイン （chemokine) (例 えば、 I L— 8、 GROa, GRO/3、 GROy、 NAP— 2、 ENA— 78、 PF4、 I P 10、 GCP— 2、 MCP— 1、 HC 14、 MCP— 3、 1—30 9、 M I P 1 Q!、 MI P— 1 /3、 R ANTE Sなど） 、 エンドセリン、 ェンテロ ガストリン、 ヒスタミン、 ニューロテンシン、 TRH、 パンクレアティックポリ ぺプタイドまたはガラニンなどが好適である。
具体的には、 SS169またはその塩に対するリガンドの決定方法を行なうには、 まず SS169を産生する細胞またはその膜画分を、 決定方法に適したバッファーに 懸濁することにより SS169類標品を調製する。 バッファーには、 pH4〜10 (望ましくは pH6〜8) のリン酸バッファー、 トリス一塩酸バッファーなどの
SS169とそのリガンドとの結合を阻害しないパッファ一であればレ、ずれでもよい。 また、 非特異的結合を低減させる目的で、 CHAP S、 Twe e n- 80™ (花王一アトラス社） 、 ジギトニン、 デォキシコレートなどの界面活性剤ゃゥシ 血清アルプミンゃゼラチンなどの各種蛋白質をバッファーにカロえることもできる。 さらに、 プロテアーゼによるレセプタ一やリガンドの分解を抑える目的で PMS F、 ロイぺプチン、 E— 64 (ペプチド研究所製） 、 ぺプスタチンなどのプロテ ァーゼ阻害剤を添加することもできる。 0.01ml〜： L Oml SS169類懸濁液に、 一定量 （5000 c m~500000 c p m) の 〔3 H〕 、 C1 2 5 I〕 、 4 C〕 、 〔3 5 S〕 などで標識した試験化合物を共存させる。 非特異的結合 量 （NS B) を知るために大過剰の未標識の試験化合物を加えた反応チューブも 用意する。 反応は約 0〜50°C、 望ましくは約 4〜37°Cで、 約 20分〜 24時 間、 望ましくは約 3 0分〜 3時間行なう。 反応後、 ガラス繊維濾紙等で濾過し、 適量の同パッファ一で洗浄した後、 ガラス «濾紙に残存する放射活性を液体シ ンチレーシヨンカウンターあるいは y—カウンターで計測する。 全結合量 (B) から非特異的結合量 (N S B) を引いたカウント （B— N S B) が O c p mを越 える試験ィ匕合物を SS169またはその塩に対するリガンド （ァゴニスト） として選 択することができる。
SS169またはその塩に対するリガンドを決定する上記の (4)〜（5)の方法を実施 するためには、 SS169を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 ァセ チルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GMP生 成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c - ί O Sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を公 知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。 具体的には、 まず、 SS169類を産生する細胞をマルチウエルプレート等に培養する。 リガンド 決定を行なうにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適 当なバッファーに交換し、 試験化合物などを添加して一定時間インキュベートし た後、 細胞を抽出あるいは上清を回収して、 生成した産物をそれぞれの方法に従 つて定量する。 細胞刺激活性の指標とする物質 （例えば、 ァラキドン酸など） の 生成が、 細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、 該分解酵素に対す る阻害剤を添加してアツセィを行なってもよい。 また、 c AMP産生抑制などの 活性については、 フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた 細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
SS169に対して特異的親和性を有する化合物の決定方法について、 SS169が膜蛋 白質である場合を取り上げて具体的に説明したが、 当業者は、 上記の手法を応用 して、 SS169が分泌蛋白質の場合についても容易に特異的親和性を有する化合物 の決定を実施することができるだろう。
SS169またはその塩に対して特異的親和性を有する化合物の決定用キットは、 SS169類、 SS169を産生する細胞またはその膜画分、 SS169を分泌する細胞の培養 上清などを含有するものである。
本発明のリガンド （レセプター） 決定用キットの例としては、 次のものが挙げ られる。
1. リガンド （レセプター） 決定用試薬
(1)測定用緩衝液およぴ洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution (ギブコ社製） に、 0.05%のゥシ血清アル ブミン （シグマ社製） を力 ϋえたもの。
孔径 0.45 /zmのフィルターで濾過滅菌し、 4でで保存するか、 あるいは用 時調製しても良い。
(2) SS169類標品
SS169類を発現させた CHO細胞を、 12穴プレートに 5 X 105個 穴で継代 し、 37。C、 5%C02、 95%a i rで 2日間培養したもの （SS169が分泌蛋白 質の^、 該プレートは抗 SS169抗体でコーティングされている） 。
(3)標識試験化合物
市販の 〔3 H〕 、 2 5 I〕 、 C1 4 C] , 〔3 5 S〕 などで標識した化合 物、 または適当な方法で標識ィ匕したもの。
水溶液の状態のものを 4°Cあるいは一 20°Cにて保存し、 用時に測定用緩衝液 にて Ι μΜに希釈する。 水に難溶性を示す試験ィ匕合物については、 ジメチルホノレ ムアミド、 DMSO、 メタノール等に溶解する。
(4)非標識試験化合物
標識化合物と同じものを 100〜： L 000倍濃い濃度に調製する。
2. 測定法
(1) 12穴組織培養用プレートにて培養した SS169類発現 CHO細胞を、 測定用緩 衝液 lmlで 2回洗浄した後 （SS169が分泌される場合は、 細胞おょぴ培養上清 を除去後プレートを測定用緩衝液で同様に洗浄した後） 、 490 1の測定用緩 衝液を各穴に加える。
(2)標識試験化合物を 5 μ 1カロえ、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合量 を知るためには非標識試験化合物を 5 / 1力 tlえておく。
(3)反応液を除去し、 1mlの洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞 （プレート） に結合した標識試験化合物を 0.2 N NaOH— 1%SDSで溶解し、 4ml の液体シンチレーター A (和光純薬製） と混合する。
(4)液体シンチレーシヨンカウンター （ベックマン社製） を用いて放射活性を測 定する。
SS169またはその塩に結合することができるリガンドとしては、 例えば、 脳、 下垂体、 腌臓などに特異的に存在する物質などが挙げられ、 具体的には、 アンギ ォテンシン、 ボンべシン、 カナビノイド、 コレシストキニン、 グルタミン、 セロ トニン、 メラトニン、 ニューロペプチド γ、 ォピオイド、 プリン、 パソプレツシ ン、 ォキシトシン、 PACAP、 セクレチン、 グルカゴン、 カルシトニン、 アド レノメジュリン、 ソマトスタチン、 GHRH、 CRF、 ACTH、 GRP、 PT H、 VI P (パソアクティブ インテスティナル アンド リレイテッド ポリ ペプチド） 、 ソマトスタチン、 ドーパミン、 モチリン、 アミリン、 ブラジキニン、 CGRP (カルシトニンジーンリレーティッドペプチド） 、 ロイコトリェン、 パ ンクレアスタチン、 プロスタグランジン、 トロンボキサン、 アデノシン、 ァドレ ナリン、 αおよび /3—ケモカイン （chemokine) (例えば、 I L— 8、 GROa、 GROj3、 GROyN NAP— 2、 ENA— 78、 PF4、 I P 10、 GCP— 2、 MCP— 1、 HC 14、 MCP— 3、 I一 309、 ΜΙ Ρ 1 α、 MI P- 1 β、 RANTESなど） 、 エンドセリン、 ェンテロガストリン、 ヒスタミン、 二 ユーロテンシン、 TRH、 パンクレアティックポリぺプタイド、 ガラニンなどの 公知のリガンド、 上記したリガンドに対するレセプターや種々のォーファンレセ プターなどが用いられる。
(2) SS169の機能不全に関連する疾患の予防'治 « 上記 （1 ) の方法において、 SS169に対して特異的親和性を有する化合物が明 らカ、になれば、 該ィ匕合物が有する作用に応じて、 （D SS169類または (2) SS169また はその部分べプチドをコ一ドする D NAを、 SS169の機能不全に関連する疾患の 予防 ·治療剤などの医薬として使用することができる。
例えば、 生体内において SS169が減少しているためにリガンド （またはレセプ ター） の生理作用が期待できない （SS169の欠乏症） 患者がいる場合に、 (D SS169類を該患者に投与して SS169の量を補充したり、 （2) (ィ） SS169または その部分べプチドをコードする D N Aを該患者に投与して発現させることによつ て、 あるいは （口） 対象となる細胞に SS169またはその部分ペプチドをコードす る D N Aを導入し発現させた後に、 該細胞を該患者に移植することなどによって、 患者の体内における SS169の量を増加させ、 リガンド （またはレセプター） の作 用を充分に発揮させることができる。 即ち、 SS169類またはそれをコードする D NAは、 安全で低毒性な、 SS169の機能不全に関連する疾患の予防 ·治療剤とし て有用である。
SS169は、 ほぼ骨格筋特異的に発現し、 糖尿病モデルマウスや絶食後再給餌に おいて高発現すること、 その発現がインスリンに影響を受けるとともに、 インス リンの作用に影響を及ぼすこと等から、 SS169の機能不全に関連する疾患として は、 （i)骨格筋細胞の分化およびノまたは（ii)代謝異常 （不全もしくは亢進） (例えば、 肝臓、 脂肪組織、 骨格筋、 膝臓などにおける代謝異常 （特に糖 ·脂質 代謝異常） 等が挙げられるが、 それらに限定されない；以下同じ） が関与する疾 患 （例えば、 肥満症、 糖尿病、 耐糖能異常、 動脈硬化、 高血圧、 高脂血症など） などが挙げられる。
(D SS169類おょぴ (2) SS169またはその部分べプチドをコ一ドする D NA (本明 細書中、 「本発明の DNA」 と称する場合もある） は、 必要に応じて薬理学的に 許容し得る担体とともに混合して医薬組成物とした後に、 SS169の機能不全に関 連する疾患の予防 ·治^ !1として用いることができる。 ここで、 薬理学的に許容される担体としては、 製剤素材として慣用の各種有機 あるいは無機担体物質が用いられ、 固形製剤における賦形剤、 滑沢剤、 結合剤、 崩壊剤；液状製剤における溶剤、 溶解補助剤、 懸濁化剤、 等張化剤、 緩衝剤、 無 痛化剤などとして配合される。 また必要に応じて、 防腐剤、 抗酸化剤、 着色剤、 甘味剤などの製剤添加物を用いることもできる。
賦形剤の好適な例としては、 乳糖、 白糖、 D—マンニトール、 D—ソルビトー ル、 デンプン、 α化デンプン、 デキストリン、 結晶セルロース、 低置換度ヒドロ キシプロピ /レセルロース、 カルボキシメチルセノレロースナトリゥム、 アラビアゴ ム、 プルラン、 軽質無水ケィ酸、 合成ケィ酸アルミエゥム、 メタケイ酸アルミン 酸マグネシウムなどが挙げられる。
滑沢剤の好適な例としては、 ステアリン酸マグネシウム、 ステアリン酸カルシ ゥム、 タルク、 コロイドシリカなどが挙げられる。
結合剤の好適な例としては、 α化デンプン、 ショ糖、 ゼラチン、 アラビアゴム、 メチ/レセノレロース、 力ノレボキシメチ/レセ/レロース、 カノレポキシメチノレセノレ口—ス ナトリウム、 結晶セルロース、 白糖、 D—マンニトール、 トレハロース、 デキス トリン、 プルラン、 ヒ ドロキシプロピルセルロース、 ヒ ドロキシプロピルメチル セルロース、 ポリビエルピロリドンなどが挙げられる。
' 崩壊剤の好適な例としては、 孚し糖、 白糖、 デンプン、 カルボキシメチルセル口
—ス、 カノレポキシメチノレセノレロース力/レシゥム、 クロス力/レメロースナトリウム、 カルボキシメチルスターチナトリゥム、 軽質無水ケィ酸、 低置換度ヒドロキシプ 口ピルセルロースなどが挙げられる。
溶剤の好適な例としては、 用水、 生理的食塩水、 リンゲル液、 アルコール、 プロピレングリコー/レ、 ポリエチレングリコーノレ、 ゴマ油、 トウモロコシ油、 ォ リーブ油、 綿実油などが挙げられる。
溶解補助剤の好適な例としては、 ポリエチレングリコール、 プロピレングリコ ール、 D—マンニトール、 トレハロース、 安息香酸べンジル、 ェタノール、 トリ スァミノメタン、 コレステロール、 トリエタノールァミン、 炭酸ナトリウム、 ク ェン酸ナトリウム、 サリチル酸ナトリウム、 酢酸ナトリウムなどが挙げられる。 懸濁化剤の好適な例としては、 ステアリルトリエタノールァミン、 ラウリル硫 酸ナトリウム、 ラウリルアミノプロピオン酸、 レシチン、 塩化ベンザルコニゥム、 塩化べンゼトニゥム、 モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤；例えばポ リビュルアルコー/レ、 ポリビュルピロリ ドン、 カノレポキシメチノレセルロースナト リウム、 メチノレセノレ口—ス、 ヒドロキシメチ /レセノレロース、 ヒドロキシェチノレセ ルロース、 ヒドロキシプロピルセル口ースなどの親水性高分子；ポリソルベート 類、 ポリオキシェチレン硬化ヒマシ油などが挙げられる。
等張化剤の好適な例としては、 塩化ナトリウム、 グリセリン、 D—マンニトー ル、 D—ソルビトール、 プドウ糖などが挙げられる。
緩衝剤の好適な例としては、 リン酸塩、 酢酸塩、 炭酸塩、 クェン酸塩などの緩 衝液などが挙げられる。
無痛化剤の好適な例としては、 ベンジルアルコールなどが挙げられる。
防腐剤の好適な例としては、 パラォキシ安息香酸エステル類、 クロロブタノ一 ル、 ベンジルアルコール、 フエネチルアルコール、 デヒドロ酢酸、 ソルビン酸な どが挙げられる。
抗酸化剤の好適な例としては、 亜硫酸塩、 ァスコノレビン酸塩などが挙げられる。 着色剤の好適な例としては、 水溶性食用タール色素 （例、 食用赤色 2号おょぴ 3号、 食用黄色 4号および 5号、 食用青色 1号および 2号などの食用色素、 水不 溶性レーキ色素 （例、 前記水溶性食用タール色素のアルミユウム塩など） 、 天然 色素 （例、 /3—カロチン、 クロロフィル、 ベンガラなど） などが挙げられる。
甘味剤の好適な例としては、 サッカリンナトリウム、 グリチルリチン酸二カリ ゥム、 アスパルテーム、 ステビアなどが挙げられる。
前記医薬組成物の剤形としては、 例えば錠剤、 カプセル剤 （ソフトカプセル、 マイクロカプセルを含む） 、 顆粒剤、 散剤、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁剤などの経 口剤；およぴ餓剤 （例、 皮下簡剤、 静脈内謝剤、 筋肉内注射剤、 腹腔内注 射剤など） 、 外用剤 （例、 経鼻投与製剤、 経皮製剤、 軟膏剤など） 、 坐剤 （例、 直腸坐剤、 膣坐剤など） 、 ペレット、 点滴剤、 徐放' ί«剤 （例、 徐放性マイクロ カプセルなど） 等の非経口剤が挙げられる。
医薬組成物は、 製剤技術分野において慣用の方法、 例えば日本薬局方に記載の 方法等により製造することができる。 以下に、 製剤の具体的な製造法について詳 述する。 医薬組成物中の有効成分の含量は、 剤形、 有効成分の投与量などにより 異なる力 例えば約 0 . 1ないし 1 0 0重量％である。
例えば、 経口剤は、 有効成分に、 賦形剤 （例、 乳糖， 白糖， デンプン， D—マ ンニトールなど） 、 崩壊剤 （例、 カルボキシメチルセル口一スカルシウムなど） 、 結合剤 （例、 α化デンプン， アラビアゴム， カルボキシメチルセルロース， ヒド ロキシプロピルセルロース， ポリビュルピロリ ドンなど） または滑沢剤 （例、 タ ルク， ステアリン酸マグネシウム， ポリエチレングリコール 6 0 0 0など） など を添加して圧縮成形し、 次いで必要により、 味のマスキング、 腸溶性あるいは持 続性を目的として、 コーティング基剤を用いて自体公知の方法でコーティングす ることにより製造される。
該コーティング基剤としては、 例えば糖衣基剤、 水溶性フィルムコーティング 基剤、 腸溶性フィルムコーティング基剤、 徐放性フィルムコーティング基剤など が挙げられる。
糖衣基剤としては、 白糖が用いられ、 さらに、 タルク、 沈降炭酸カルシウム、 ゼラチン、 アラビアゴム、 プルラン、 カルナパロウなどから選ばれる 1種または
2種以上を併用してもよい。
水溶性フィルムコーティング基剤としては、 例えばヒドロキシプロピルセル口 ース、 ヒドロキシプロピレメチノレセ/レロース、 ヒドロキシェチノレセノレロース、 メ チルヒドロキシェチルセ^ ^ロースなどのセルロース系高分子；ポリビエルァセタ
—ルジェチルァミノアセテート、 アミノアルキルメタァクリレートコポリマー Ε 〔オイドラギット E (商品名） 、 ロームフアルマ社〕 、 ポリビエルピロリ ドンな どの合成高分子；プルランなどの多糖類などが挙げられる。
腸溶性フィルムコーティング基剤としては、 例えばヒドロキシプロピルメチル セノレロース フタレート、 ヒ ドロキシプロピノレメチ /レセノレロース アセテートサ クシネート、 カルボキシメチルェチルセルロース、 酢酸フタル酸セルロースなど のセノレ口ース系高分子；メタアタリル酸コポリマー L 〔オイドラギット L (商品 名） 、 ロームフアルマ社〕 、 メタアクリル酸コポリマー L D 〔オイドラギット L — 3 0 D 5 5 (商品名） 、 ロームフアルマ社〕 、 メタアクリル酸コポリマー S 〔オイドラギット S (商品名） 、 ロームフアルマ社〕 などのアクリル酸系高分 子；セラックなどの天然物などが挙げられる。
徐放性フィルムコーティング基剤としては、 例えばェチルセルロースなどのセ ルロース系高分子；アミノアルキルメタアタリレートコポリマー R S 〔オイドラ ギット R S (商品名） 、 ロームフアルマ社〕 、 アクリル酸ェチル 'メタアクリル 酸メチル共重合体懸濁液 〔オイドラギット NE (商品名） 、 ロームフアルマ社〕 などのアクリル酸系高分子などが挙げられる。
上記したコーティング基剤は、 その 2種以上を適宜の割合で混合して用いても よい。 また、 コーティングの際に、 例えば酸化チタン、 三二酸化鉄等のような遮 光剤を用いてもよい。
注射剤は、 有効成分を分散剤 （例、 ポリソルベート 8 0， ポリオキシエチレン 硬化ヒマシ油 6 0 , ポリエチレングリコール， カルボキシメチルセルロース， ァ ルギン酸ナトリウムなど） 、保存剤 （例、 メチルパラベン， プロピルパラベン， ベンジルアルコール， クロロブタノール， フエノールなど） 、 等張化剤 （例、 塩 化ナトリウム， グリセリン， D—マンニトール， D—ソルビトール， ブドウ糖な ど） などと共に水性溶剤 （例、 蒸留水， 生理的食塩水， リンゲル液等） あるいは 油性溶剤 （例、 ォリーブ油， ゴマ油， 綿実油， トウモロコシ油などの植物油、 プ ロピレンダリコール等） などに溶解、 懸濁あるいは乳化することにより製造され る。 この際、 所望により溶解補助剤 （例、 サリチル酸ナトリウム， 酢酸ナトリウ ム等） 、 安定剤 （例、 ヒト血清アルブミン等） 、 無痛化剤 （例、 ベンジルアルコ ール等） 等の添加物を用いてもよい。 注射液は、 通常、 適当なアンプルに充填さ れる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 哺乳動物
(例えば、 ヒト、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルな ど） に対して投与することができる。
本発明の DNAを上記予防 ·治療剤として使用する場合は、 本発明の DNAを 単独あるいはレトロウイルスベクター、 アデノウイルスベクター、 アデノ随伴ゥ ィルスべクタ一などの適当な発現ベクター中に挿入した後、 常套手段に従って投 与することもできる。 また、 本発明の DNAは、 そのままで、 あるいは摂取促進 のための補助剤とともに、 遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのような力テーテ ルによって投与することもできる。
SS169類の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などにより差異は ある力 経口投与の場合、 一般的に例えば、 糖 ·脂質代謝異常患者 （体重 6 Ok gとして） においては、 一日につき約 0.1〜10 Omg、 好ましくは約 1. 0 〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜2 Omgである。 非経口的に投与する場 合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異 なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 糖 ·脂質代謝異常患者 （体重 60 k gとして） においては、 一日につき約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. 1〜： L Omg程度を投与するのが 好都合である。 投与対象がヒト以外の場合も、 体重 6 Ok g当たりに換算した量 を投与することができる。
本発明の DNAの投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などにより 差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 糖 ·脂質代謝異常患者 （体重 60 k gとして） においては、 一日につき約 0.1〜10 Omg、 好ましくは約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与 する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによつ ても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 糖 ·脂質代謝異常患者 （体 重 6 Ok gとして） においては、 一日につき約 0. 01〜30mg程度、 好まし くは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. 1〜： L Omg程度を投与す るのが好都合である。 投与対象がヒト以外の場合も、 体重 6 Ok g当たりに換算 した量を投与することができる。
(3) SS169の過剰発現に関連する疾患の予防 ·治療剤
SS169類に対する抗体は、 SS169の関与するシグナル伝達機能、 例えば、 SS169 を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞 内 Ca2 +遊離、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン 酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c- f o Sの活性化、 pH の低下などを促進する活性または抑制する活性など） を不活性化 （すなわち中 和） することができる。 一方、 SS169もしくはその部分ペプチドのアンチセンス 核酸 （リポザィムゃ RNA i活性を有する二本鎖オリゴ RNAを含む） は、 SS169遺伝子の転写、 転写産物のプロセッシングおよび/または mRNAからの 翻訳をプロックすることにより、 SS169の発現を阻害することができる。 従って、 (1)本発明の抗体または (2)本発明のアンチセンス核酸を、 SS169の過剰発現に関 連する疾患の予防'治 »Jなどの医薬として使用することができる。
SS169は、 ほぼ骨格筋特異的に発現し、 糖尿病モデルマウスや絶食後再給餌に おいて高発現すること、 その発現がインスリンに影響を受けるとともに、 インス リンの作用に影響を及ぼすこと等から、 骨格筋細胞の分化および/または代謝異 常 （不全もしくは亢進） が関与する疾患 （例えば、 肥満症、 糖尿病、 耐糖能異常、 動脈硬化、 高血圧、 高脂血症など） の予防 ·治療に有用である。
本発明の抗体おょぴ本発明のアンチセンス核酸は、 前記 「SS169の機能不全に 関連する疾患の予防'治療剤」 と同様にして製剤化することができる。 また、 該 アンチセンス核酸は、 そのままで、 遺伝子銃やハイド口ゲルカテーテルのような カテーテルによって投与することもできる。
本発明の抗体の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などにより差 異はある力 経口投与の場合、 一般的に例えば、 糖 ·脂質代謝異常患者 （体重 6 0 k gとして） においては、 一日にっき約 0. 1〜： L 00mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与する 場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても 異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 糖'脂質代謝異常患者 （体重 6 O k gとして） においては、 一日につき約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは 約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を投与 るの が好都合である。 投与対象がヒト以外の場合も、 体重 6 Ok g当たりに換算した 量を投与することができる。
本発明のアンチセンス核酸の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法 などにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 糖 ·脂質代謝異常 患者 （体重 60 k gとして） においては、 一日につき約 0. 1〜： L 0 Omg、 好 ましくは約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経 口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法 などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 糖 ·脂質代謝異 常患者 （体重 60 k gとして） においては、 一日につき約 0. 01〜30mg程 度、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. l〜10mg程 度を投与するのが好都合である。 投与対象がヒト以外の^も、 体重 60 k g当 たりに換算した量を投与することができる。
(4) 遺伝子診断剤
SS169またはその初期翻訳産物をコードする塩基配列またはその一部を含有す る核酸 （以下、 「本発明のセンス核酸」 という） または本発明のアンチセンス核 酸は、 プローブとして使用することにより、 哺乳動物 （例えば、 ヒト、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） における SS169をコード する DNAまたは mRNAの異常 （遺伝子異常） を検出することができるので、 例えば、 該 DNAまたは mRNAの損傷、 突然変異あるいは発現低下や、 該 DN Aまたは mRN Aの增加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。 本発明のセンス核酸またはアンチセンス核酸を用いる上記の遺伝子診断は、 例 えば、 自体公知のノーザンハイプリダイゼーシヨンや P C R— S S C P法 （ゲノ ミックス （Genomics) ， 第 5卷， 8 7 4〜8 7 9頁 （1 9 8 9年） 、 プロシージ ングズ ·ォプ ·ザ ·ナショナノレ ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォプ ·ュ 一エスエー ( Proceedings of the National Academy of Sciences of tne United States of America) ， 第 8 6卷， 2 7 6 6〜 2 7 7 0頁 （1 9 8 9 年） ) などにより実施することができる。
例えば、 ノーザンハイプリダイゼーションにより SS169の発現低下が検出され た場合は、 例えば、 SS169の機能不全に関連する疾患に罹患している、 もしくは 将来罹患する可能性が高いと診断することができる。 また逆に、 例えば、 ノーザ ンハイプリダイゼーシヨンにより SS169の発現過多が検出された場合は、 例えば、 SS169の機能亢進に関連する疾患に罹患している、 もしくは将来罹患する可能性 が高いと診断することができる。
SS169は、 ほぼ骨格筋特異的に発現し、 糖尿病モデルマウスや絶食後再給餌に おいて高発現すること等から、 骨格筋細胞の分ィ匕および Zまたは代謝異常 （不全 もしくは亢進） が関与する疾患 （例えば、 肥満症、 糖尿病、 耐糖能異常、 動脈硬 化、 高血圧、 高脂血症など） の予防'治療に有用である。
( 5 ) SS169の発現量を変化させるィ匕合物のスクリーニング方法
本発明のセンス核酸は、 プローブとして用いることにより、 SS169の発現量を 変化させる化合物のスクリ一ユングに用いることができる。
すなわち本発明は、 例えば、 ( i ) 非ヒト哺乳動物の（1)血液、 （2)特定の β、
(3)臓器から単離した組織もしくは細胞、 または （ii) 形質転換体等に含まれる SS169 mR N A量を測定することによる、 SS169の発現量を変化させる化合物の スクリ一ニング方法を する。
SS169 mRNA量の測定は具体的には以下のようにして行なう。
( i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥサ ギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど、 より具体的には、 肥満マウス、 糖尿病マウス、 高血圧ラット、 動脈硬化ゥサギ、 担癌マウスなど） に対して、 薬 剤 （例えば、 抗肥満薬、 抗糖尿病薬、 降圧薬、 血管作用薬、 抗癌剤など） あるい は物理的ストレス （例えば、 浸水ストレス、 電気ショック、 明喑、 低温など） な どを与え、 一定時間経過した後に、 血液、 あるいは特定の臓器 （例えば、 肝臓、 膝臓、 腎臓、 筋肉など） 、 組織 （例えば、 褐色または白色脂肪組織など） あるい は細胞 （骨格筋細胞、 脂肪細胞など） を得る。
得られた細胞等に含まれる SS169 mR NAは、 例えば、 通常の方法により該細 胞等から mR N Aを抽出し、 例えば、 TaqManPCRなどの手法を用いることにより 定量することができ、 自体公知の手段によりノーザンブロットを行なうことによ り解析することもできる。
(ii) SS169またはその部分べプチドを発現する形質転換体を前述の方法に従い 作製し、 該形質転換体に含まれる SS169またはその部分べプチドの mR NAを同 様にして定量、 解析することができる。
SS169の発現量を変化させるィ匕合物のスクリ一ユングは、
( i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、 薬剤あるいは物理的ス トレスなどを与える一定時間前 （3 0分前ないし 2 4時間前、 好ましくは 3 0分 前ないし 1 2時間前、 より好ましくは 1時間前ないし 6時間前） もしくは一定時 間後 （3 0分後ないし 3日後、 好ましくは 1時間後ないし 2日後、 より好ましく は 1時間後ないし 2 4時間後） 、 または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に被 検化合物を投与し、 投与後一定時間経過後 （3 0分後ないし 3日後、 好ましくは 1時間後ないし 2日後、 より好ましくは 1時間後ないし 2 4時間後） 、 細胞に含 まれる SS169 mRNA量を定量、 解析することにより行なうことができ、
(ii) 形質転換体を常法に従い培養する際に被検ィ匕合物を培地中に混合させ、 一 定時間培養後 （1日後ないし 7日後、 好ましくは 1日後ないし 3日後、 より好ま しくは 2日後ないし 3日後） 、 該形質転換体に含まれる SS169またはその部分べ プチドの mR NA量を定量、 解析することにより行なうことができる。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 SS169の発 現量を変化させる作用を有する化合物であり、 具体的には、 （ィ） SS169の発現 量を增加させることにより、 SS169とそのレセプター （またはリガンド） との相 互作用を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシトール リン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c - f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を増強させる化合物、 (口） SS169の発現量を減少させることにより、 該細胞刺激活性を減弱させる化 合物である。
該化合物としては、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発 酵生産物などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知 の化合物であってもよい。
該細胞刺激活性を増強させる化合物は、 SS169の生理活性を増強するための安 全で低毒'性な医薬として有用である。
該細胞刺激活性を減弱させる化合物は、 SS169の生理活性を減少させるための 安全で低毒性な医薬として有用である。
上記スクリーユング方法を用いて得られる化合物またはその塩を医薬として使 用する場合、 前記 「SS169の機能不全に関連する疾患の予防 ·治療剤」 と同様に して製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 哺乳動物
(例えば、 ヒト、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 プタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルな ど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 糖'脂質代謝異常患者 (体重 6 0 k gとして） においては、 一日にっき約 0 . 1〜 1 0 0 m g、 好まし くは約 1 . 0〜5 O m g、 より好ましくは約 1 . 0〜2 O m gである。 非経口的 に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など によっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 糖 ·脂質代謝異常患 者 （体重 6 O k gとして） においては、 一日につき約 0 . 0 1〜3 0 m g程度、 好ましくは約 0 . l〜2 0 m g程度、 より好ましくは約 0 . 1〜： L O m g程度を 投与するのが好都合である。 投与対象がヒト以外の場合も、 体重 6 0 k g当たり に換算した量を投与することができる。
( 6 ) SS169の発現量を変化させる化合物を含有する各種疾患の予防 ·治療剤 SS169は前述のとおり、 ほぼ骨格筋特異的に発現し、 糖尿病モデルマウスや絶' 食後再給餌において高発現すること等から、 （i)骨格筋細胞の分化および/また は（ii)代謝 （例えば、 肝臓、 脂肪組織、 骨格筋、 勝臓などにおける代謝 （特に 糖 ·脂質代謝） 等が挙げられるが、 それらに限定されない；以下同じ） の調節に 重要な役割を果たしていると考えられる。 従って、 SS169の発現量を変化させる 化合物は、 骨格筋細胞の分化および/または代謝異常 （不全もしくは亢進） が関 与する疾患 （例えば、 肥満症、 糖尿病、 耐糖能異常、 動脈硬化、 高血圧、 高脂血 症など） の予防 ·治療剤として用いることができる。
該化合物を SS169の機能不全もしくは亢進に関連する疾患の予防 ·治療剤とし て使用する場合は、 前記 「SS169の機能不全に関連する疾患の予防 ·治療剤」 と 同様にして製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 哺乳動物 (例えば、 ヒト、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルな ど） に対して投与することができる。 該ィ匕合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 糖 ·脂質代謝異常患者 (体重 60 k gとして） においては、 一日につき約 0. 1〜 10 Omg、 好まし くは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的 に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など によっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 糖 ·脂質代謝異常患 者 （体重 6 O k gとして） においては、 一日につき約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. ：!〜 20mg程度、 より好ましくは約 0. l〜10mg程度を 投与するのが好都合である。 投与対象がヒト以外の場合も、 体重 60 k g当たり に換算した量を投与することができる。
(7) SS169に対して特異的親和性を有する化合物 （リガンドまたはレセプタ 一） の定量法
SS169類は、 SS169に対するリガンド （またはレセプター） に対して結合性を有 しているので、 生体内における該リガンド （またはレセプター） 濃度を高感度に 定量することができる。
本発明の定量法は、 例えば、 競合法と組み合わせることによって用いることが できる。 すなわち、 被検体を SS169類と接触させることによって被検体中のリガ ンド （またはレセプター） 濃度を測定することができる。 具体的には、 例えば、 以下の（1)または (2)などに記載の方法あるいはそれに準じる方法に従って用いる ことができる。
(1)入江寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 49年発行）
(2)入江寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 54年発行）
(8) SS169と SS169に対して特異的親和性を有する化合物 （リガンドまたはレセ プター） との結合性を変化させる化合物 （ァゴ二スト、 アンタゴニストなど） の スクリーユング方法
SS169類を用いる力 \ または組換え SS169の発現系を構築し、 該発現系を用いた ァフィ二ティーアツセィ系を用いることによって、 SS169とそのリガンド （また はレセプター） の結合性を変化させる化合物 （例えば、 ペプチド、 蛋白質、 非ぺ プチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物など） またはその塩を効率よくスクリ 一二ングすることができる。
このような化合物には、 （ィ） レセプターを介して細胞刺激活性 （例えば、 ァ ラキドン酸遊離、 ァセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AMP生 成、 細胞内 c GMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋 白質のリン酸化、 c - f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑 制する活性など） を有する化合物 （ァゴ二スト） 、 （口） 該細胞刺激活性を有し ない化合物 （アンタゴニスト） 、 （ハ） SS169とそのリガンド （またはレセプタ 一） との結合力を増強する化合物、 あるいは （二） SS169とそのリガンド （また はレセプター） との結合力を減少させる化合物などが含まれる （なお、 上記 (ィ） の化合物は、 上記したリガンド決定方法によってスクリーニングすること が好ましい） 。
すなわち、 本発明は、 （i ) SS169類とそのリガンド （またはレセプター） と を接触させた場合と （ii) SS169類とそのリガンド （またはレセプター） および 試験化合物とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする、 SS169とそ のリガンド （またはレセプター） との結合性を変ィヒさせる化合物またはその塩の スクリーニング方法を する。
上記スクリーニング方法においては、 （i ) と （ii) の場合における SS169に 対するリガンド （またはレセプター） の結合量、 細胞刺激活性などを測定して、 比較することを特徴とする。
より具体的には、 本発明は、
(1)標識したリガンド （またはレセプター） を SS169類に接触させた場合と、 標識 したリガンド （またはレセプター） および試験化合物を SS169類に接触させた場 合における、 標識したリガンド （またはレセプター） の SSI69類に対する結合量 を測定し、 比較することを特徴とする SS169とそのリガンド （またはレセプタ 一） との結合 14を変化させるィ匕合物またはその塩のスクリーニング方法、
(2)標識したリガンド （またはレセプター） を、 SS169を産生する細胞またはその 膜画分、 あるいは細胞外液または細胞培養上清 （この場合、 例えば、 上記の本発 明の抗体を固定ィヒした固相 （細胞培養プレート等） を用いて SS169を固相化す る） に接触させた場合と、 標識したリガンド （またはレセプター） およひ 験化 合物を SS169を産生する細胞またはその膜画分、 あるいは細胞外液または細胞培 養上清に接触させた場合における、 標識したリガンド （またはレセプター） の該 細胞または膜画分、 あるいは細胞外液または細胞培養上清に対する結合量を測定 し、 比較することを特徴とする SS169とそのリガンド （またはレセプター） との 結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ一ユング方法、
(3)標識したリガンド （またはレセプター） を、 本発明の D NAを含有する形質 転換体を培養することによって細胞膜上に発現した SS169類、 または培養上清に' 分泌された SS169類 （この場合、 例えば、 上記の本発明の抗体を固定ィ匕した固相 (細胞培養プレート等） を用いて SS169類を固相化する） に接触させた場合と、 標識したリガンド （またはレセプター） および試験化合物を本発明の D NAを含 有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した SS169類、 または 培養上清に分泌された SS169類に接触させた場合における、 標識したリガンド (またはレセプター） の SS169類に対する結合量を測定し、 比較することを特徴 とする SS169とそのリガンド （またはレセプター） との結合性を変化させる化合 物またはその塩のスクリーエング方法、
(4) SS169を活性化する化合物 （例えば、 SS169に対するリガンドなど） または SS169により活性ィ匕される化合物 (例えば、 SS169に対するレセプターなど） を、 SS169を細胞膜上に発現する細胞または SS169が分泌された培養上清に接触させた 場合と、 SS169を活性化する化合物または SS169により活性化される化合物およぴ 試験化合物を、 SS169を細胞膜上に発現する細胞または SS169が分泌された培養上 清に接触させた場合における、 レセプタ一を介した細胞刺激活性 （例えば、 ァラ キドン酸遊離、 ァセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質 のリン酸化、 c - f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制す る活性など） を測定し、 比較することを特徴とする SS169とそのリガンド （また はレセプター） との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方 法、 および
(5) SS169を活性化する化合物 （例えば、 SS169に対するリガンドなど） または SS169により活性化される化合物 （例えば、 SS169に対するレセプターなど） を、 本発明の D NAを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現し た SS169類または本発明の D N Aを含有する形質転換体を培養することによって 培養上清中に分泌された SS169類に接触させた場合と、 SS169を活性化する化合物 または SS169により活性化される化合物およぴ試験ィ匕合物を、 本発明の D N Aを 含有する形質転換体を培養することによつて細胞膜上に発現した SS169類または 本発明の D NAを含有する形質転換体を培養することによって培養上清中に分泌 された SS169類に接触させた場合における、 レセプターを介する細胞刺激活性 (例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞 内 c AMP生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変 動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c— f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する 活性または抑制する活性など） を測定し、 比較することを特徴とする SS169とそ のリガンド （またはレセプター） との結合性を変化させる化合物またはその塩の スクリーニング方法を する。
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、 本発明のスクリーニング方法に用いる SS169類としては、 上記した SSI69 もしくはその部分べプチドまたはその塩を含有するものであれば何れのものであ つてもよいが、 SS169を産生する哺乳動物の臓器の細胞膜画分または細胞外液が 好適である。 しかし、 特にヒト由来の は入手が極めて困難なことから、 スク リーニングに用いられるものとしては、 組換え体を用いて大量発現させたヒト由 来の SS169類などが適している。
SS169類を製造するには、 前述の方法が用いられるが、 本発明の D NAを哺乳 動物細胞や昆虫細胞で発現させることにより行なうことが好ましい。 目的とする 蛋白質部分をコードする D NA断片には c D N Aが用いられるが、 必ずしもこれ に制約されるものではない。 例えば、 遺伝子断片や合成 D NAを用いてもよい。 SS169またはその部分ペプチドをコードする D NA断片を宿主動物 （昆虫） 細胞 に導入し、 それらを効率よく発現させるためには、 該 D NA断片を、 S V 4 0由 来のプロモーター、 レトロゥイノレスのプロモーター、 メタ口チォネインプロモー ター、 ヒトヒートショックプロモーター、 サイトメガロウイノレスプロモーター、
S R aプロモーター、 昆虫を宿主とするパキュロウィルスに属する核多角体病ゥ ィ /レス （nuclear polyhedrosis virus； N P V) のポリヘドリンプロモーターな どの下流に組み込むのが好ましい。
したがって、 本発明のスクリーニング方法において用いられる SS169類は、 そ れ自体公知の方法に従つて精製した SS169類であつてもよいし、 SS169類を産生す る細胞またはその細胞膜画分、 あるいは SS169類を分泌する細胞の培養上清とし て用いてもよい。
上記スクリーニング方法において、 SS169類を産生する細胞を用いる場合、 該 細胞をダルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定化してもよい。 固定化方法は それ自体公知の方法に従って行なうことができる。
SS169類を産生する細胞とは、 SS169類を発現した宿主細胞をいうが、 該宿主細 胞としては、 大腸菌、 枯草菌、 酵母、 昆虫細胞、 動物細胞などが用いられる。 前記細胞膜画分としては、 細胞を破枠した後、 それ自体公知の方法で得られる 細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。 細胞の破碎方法としては、 Potter— Elvehjem型ホモジナイザ一で細胞を押し潰す方法、 ヮーリングブレンダーゃポリ トロン （Kinematica社製） による破砕、 超音波による破枠、 フレンチプレスなど で加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられ る。 細胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力によ る分画法が主として用いられる。 例えば、 細胞破砕液を低速 （500 r pm〜3 000 r pm) で短時間 （通常、 約 1〜10分） 遠心し、 上清をさらに高速 （1
5000 r pm〜30000 r pm) で通常 30分〜 2時間遠心し、 得られる沈 澱を膜画分とする。 該膜画分中には、 発現した SS169類と細胞由来のリン脂質や 膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
SS169類を産生する細胞やその膜画分中の SS169類の量は、 1細胞当たり 103 〜108分子であるのが好ましく、 105 〜107分子であるのがより好適であ る。 なお、 発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性 （比活性） が高く なり、 高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、 同一ロット で大量の試料を測定できるようになる。
SS169とそのリガンドとの結合性を変化させる化合物をスクリーニングする上 記の（1)〜(3)を実施するためには、 例えば、 適当な SS169類含有膜画分と標識し たリガンドが必要である。
SS169含有膜画分としては、 天然型の SS169含有膜画分力 \ またはそれと同等の 活性を有する組換え SS169類含有膜画分などが望ましい。 ここで、 同等の活性と は、 同等のリガンド結合活' 14、 シグナル情報伝達作用などを示す。
標識したリガンドとしては、 標識したリガンド、 標識したリガンドアナログ化 合物などが用いられる。 例えば 〔3 H〕 、 2 5 I〕 、 4 C〕 、 〔3 5 s〕 などで標識されたリガンドなどが用いられる。
具体的には、 SS169とそのリガンドとの結合性を変化させる化合物のスクリー ユングを行なうには、 まず SS169類を産生する細胞またはその膜画分を、 スクリ 一二ングに適したバッファーに懸濁することにより SS169類標品を調製する。 パ ッファーには、 ρΗ4〜10 (望ましくは TDH6〜8) のリン酸バッファー、 ト リス一塩酸パッファーなどの SS169とそのリガンドとの結合を阻害しないパッフ ァーであればいずれでもよい。 また、 非特異的結合を低減させる目的で、 CHA PS、 Twe e n-80™ (花王一アトラス社） 、 ジギトニン、 デォキシコレ —トなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。 さらに、 プロテア一 ゼによるレセプターやリガンドの分解を抑える目的で PMSF、 ロイぺプチン、 E-64 (ペプチド研究所製） 、 ぺプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加 することもできる。 0.01〜： 10mlの SS169類懸濁液に、 一定量 （5000 c pm〜500000 c pm) の標識したリガンドを添加し、 同時に 10— 4 M〜 10— 1 ° Mの試験化合物を共存させる。 非特異的結合量 (NSB) を知るため に大過剰の未標識のリガンドを加えた反応チューブも用意する。 反応は約 0でか ら 50°C、 望ましくは約 4°Cから 37°Cで、 約 20分から 24時間、 望ましくは 約 30分から 3時間行う。 反応後、 ガラス «濾紙等で濾過し、 適量の同パッフ ァ一で洗浄した後、 ガラス «濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーシヨン' カウンターまたは y—カウンタ一で計測する。 拮抗する物質がない場合の力ゥン ト（B。） から非特異的結合量 (NSB) を引いたカウント （B。一 NSB) を 1 00%とした時、 特異的結合量 (B-NSB) 力 例えば、 50%以下になる試 験化合物を 阻害能力のある候補物質として選択することができる。
SS169とそのリガンドとの結合性を変化させる化合物をスクリーニングする上 記の（ 〜（5)の方法を実施するためには、 例えば、 SS169を介する細胞刺激活性 (例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a遊離、 細胞内 c
AMP生成、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c— f o sの活性化、 pHの低下などを促進する活性 または抑制する活性など） を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定 することができる。
具体的には、 まず、 SS169類を産生する細胞をマルチウエルプレート等に培養 する。 スクリーニングを行なうにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に 毒性を示さない適当なパッファ一に交換し、 試験化合物などを添加して一定時間 インキュベートした後、 細胞を抽出あるいは上清を回収して、 生成した産物をそ れぞれの方法に従って定量する。 細胞刺激活性の指標とする物質 （例えば、 ァラ キドン酸など） の生成が、 細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、 該分解酵素に対する阻害剤を添カ卩してアツセィを行なってもよい。 また、 c AM P産生抑制などの活性については、 フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を 増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、 SS169類を膜上に発現 した適当な細胞が必要である。 SS169類を発現した細胞としては、 天然型の SS169 を産生する細胞株、 前述の組換え SS169類を発現した細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成 化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが用いられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 ^の化合物であってもよい。
SS169とそのリガンド （またはレセプター） との結合性を変化させる化合物ま たはその塩のスクリーニング方法について、 SS169が膜蛋白質である場合を取り 上げて具体的に説明したが、 SS169が分泌蛋白質である場合も、 当業者は、 上記 の手法を応用して、 SS169とそのレセプターの結合性を変化させる化合物を容易 にスクリーニングすることができる。
SS169とそれに対して特異的親和性を有する化合物 （リガンドまたはレセプタ 一） の結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キットは、 SS169類、 SS169類を産生する細胞またはその膜画分あるいは SS169類を分泌する 細胞の培養上清などを含有するものである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、 次のものが挙げられる。
1 . スクリーエング用試薬
(1)測定用緩衝液およぴ洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution (ギブコネ土製） に、 0 . 0 5 %のゥシ血清アル ブミン （シグマネ: t ) を力 13えたもの。
？し径 0. 4 5 mのフィルターで濾過滅菌し、 4°Cで保存するか、 あるいは用 時調製しても良い。
(2)SS169類標標品
SS169類を発現させた CHO細胞を、 1 2穴プレートに 5 X 1 05個/穴で継代 し、 3 7° (：、 5%C02、 9 50/oa i rで 2日間培養したもの （SS169類が分、泌さ れる^\該プレートは抗 SS169抗体でコーティングされている） 。
(3)標識リガンド （レセプター）
市販の 〔3 H〕 、 2 5 I〕 、 4 C〕 、 〔3 5 S〕 などで標識したリガ ンド （レセプター）
水溶液の状態のものを 4°Cあるいは一 2 0°Cにて保存し、 用時に測定用緩衝液 にて 1 /zMに希釈する。
(4)リガンド （レセプタ一） 標準液
リガンド （レセプター） を 0. 1 %ゥシ血清アルブミン （シグマ社製） を含む PB Sで ImMとなるように溶解し、 一 20°Cで保存する。
標識レセプターおょぴレセプター標準液としては、 レセプター蛋白質を適当な 脂質組成からなるリポソーム膜に包埋させたプロテオリポソームを適当な分散媒 (水、 PB S等） 中に懸濁し、 4°Cで保存したものを用いることもできる。
2. 測定法
(1) 1 2穴組織培養用プレートにて培養した SS169類発現 CHO細胞を、 測定用緩 衝液 1 m 1で 2回洗浄した後 （SS169類が分泌される場合は、 細胞および培養上 清を除去後プレートを測定用緩衝液で同様に洗浄した後） 、 49 0 / lの測定用 緩衝液を各穴に加える。
(2) 1 0— 3〜： L 0— 1 。 Mの試験化合物溶液を 5 μ 1カロえた後、 標識リガンド (またはレセプター） を 5 μ 1加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合 量を知るためには試験化合物の代わりに 1 0— 3 Μのリガンド （またはレセプタ 一） 標準液を 5 1加えておく。
(3)反応液を除去し、 1mlの洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞 （またはプレ ート） に結合した標識リガンド （またはレセプター） を 0. 2N Na OH- 1%SDSで溶解し、 4mlの液体シンチレーター A (和光純薬製） と混合する。 (4)液体シンチレーシヨンカウンタ一 （ベックマン社製） を用いて放射活性を測 定し、 Percent Maximum Binding (PMB) を次の式 〔数 1〕 で求める。
〔数 1〕
PMB= [ (B-NSB) / (B。― NSB) ] X 100
PMB ： Percent Maximum Binding
B ：検体を加えた時の値
NSB ： Non-specific Binding (非特異的結合量）
B 0 ：最大結合量
上記スクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られるィ匕合 物またはその塩は、 SS169とそれに対して特異的親和性を有する化合物 （リガン ドまたはレセプター） との結合性を変化させる作用を有する化合物であり、 具体 的には、 （ィ） リガンドーレセプター相互作用を介して細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2 +遊離、 細胞内 c AMP 生成、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内 蛋白質のリン酸化、 c-f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または 抑制する活性など） を有する化合物 （ァゴ二スト） 、 （口） 該細胞刺激活性を有 しない化合物 （アンタゴニスト） 、 （ハ） SS169とそのリガンド （またはレセプ ター） との結合力を増強する化合物、 あるいは （二） SS169とそのリガンド （ま たはレセプター） との結合力を減少させるィ匕合物である。
該化合物としては、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発 酵生産物などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知 の化合物であってもよい。 SS169 (もしくは SS169レセプター） に対するァゴ-ストは、 SS169に対するリ ガンド （もしくは SS169) が有する生理活性と同様の作用を有しているので、 該 リガンド活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用である。
SS169 (もしくは SS169レセプター） に対するアンタゴニストは、 SS169に対す るリガンド （もしくは SS169) が有する生理活'性を抑制することができるので、 該リガンド活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用である。
SS169とそのリガンド （もしくはレセプター） との結合力を増強する化合物は、 SS169に対するリガンド （もしくは SS169) が有する生理活性を増強するための安 全で低毒性な医薬として有用である。
SS169とそのリガンド （もしくはレセプター） との結合力を減少させる化合物 は、 SS169に対するリガンド （もしくは SS169) が有する生理活性を減少させるた めの安全で低毒性な医薬として有用である。
上記スクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合 物またはその塩を医薬として使用する場合、 前記 「SS169の機能不全に関連する 疾患の予防'治,」 と同様にして製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 哺乳動物 (例えば、 ヒト、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルな ど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 糖 ·脂質代謝異常患者 (体重 60 k gとして） においては、 一日につき約 0. 1〜： L O Omg、 好まし くは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的 に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など によっても異なるが、 例えば、 剤の形では通常例えば、 糖'脂質代謝異常患 者 （体重 6 O k gとして） においては、 一日につき約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. 1〜： L Omg程度を 投与するのが好都合である。 投与対象がヒト以外の場合も、 体重 6 O k g当たり に換算した量を投与することができる。
(9) SS169と SS169に対して特異的親和性を有する化合物 （リガンドまたはレセ プタ一） との結合性を変化させる化合物 （ァゴ二スト、 アンタゴニスト） を含有 する各種疾患の予防 ·抬療剤
SS169は前述のとおり、 ほぼ骨格筋特異的に発現し、 糖尿病モデルマウスや絶 食後再給餌において高発現すること等から、 骨格筋細胞の分ィ匕および/または代 謝 （特に糖 ·脂質代謝） の調節に重要な役割を果たしていると考えられる。 従つ て、 SS169とそのリガンド （もしくはレセプター） との結合性を変化させる化合 物 （ァゴュスト、 アンタゴニスト） は、 骨格筋細胞の分化おょぴ Zまたは代謝異 常 （不全もしくは亢進） が関与する疾患 （例えば、 肥満症、 糖尿病、 耐糖能異常、 動脈硬化、 高血圧、 高脂血症など） の予防'治療剤として用いることができる。 該化合物を SS169の機能不全もしくは亢進に関連する疾患の予防 ·治療剤とし' て使用する場合は、 前記 「SS169の機能不全に関連する疾患の予防 ·治療剤」 と 同様にして製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 哺乳動物 (例えば、 ヒト、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルな ど） に対して投与することができる。
. 該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 糖 ·脂質代謝異常患者 (体重 60 k gとして） においては、 ーョにっき約 0. 1〜： L 00mg、 好まし くは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的 に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など によっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 糖'脂質代謝異常患 者 （体重 60 k gとして） においては、 一日につき約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より好ましくは約 0. 1〜： L Omg程度を 投与するのが好都合である。 投与対象がヒト以外の場合も、 体重 6 O k g当たり に換算した量を投与することができる。
( 1 0 ) SS169類の定量
本発明の抗体は、 SS169類を特異的に認識することができるので、 被検液中の SS169類の定量、 特にサンドィツチ免疫測定法による定量などに使用することが できる。 すなわち、 本発明は、 例えば、 （i ) 本発明の抗体と、 被検液おょぴ標 識化蛋白質等とを競合的に反応させ、 該抗体に結合した標識化蛋白質等の割合を 測定することを特徴とする被検液中の SS169類の定量法、 （ii) 被検液と担体上 に不溶化した本発明の抗体およぴ標識化された本発明の抗体とを同時あるいは連 続的に反応させた後、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする 被検液中の SS169類の定量法を提供する。
上記 （ii) においては、 不溶ィ匕抗体と標識ィヒ抗体とが互いに SS169類との結合 を妨害しないような抗原認識部位を有することが好ましい （例えば、 一方の抗体 力 S169類の N端部を認識し、 他方の抗体が SS169類の C端部に反応する等） 。
SS169類に対するモノクローナル抗体 （以下、 本発明のモノクローナル抗体と 称する場合がある） を用いて SS169類の測定を行なえるほか、 組織染色等による 検出を行なうこともできる。 これらの目的には、 抗体分子そのものを用いてもよ く、 また、 抗体分子の F ( a b，） 2 、 F a b '、 あるいは F a b画分を用いても よい。 SS169類に対する抗体を用いる測定法は、 特に制限されるべきものではな く、 被測定液中の抗原量 （例えば、 SS169量） に対応した抗体、 抗原もしくは抗 体—抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、 これを既知量の抗 原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、 いずれ の測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメトリー、 競合法、 ィムノメトリック 法おょぴサンドイッチ法が好適に用いられるが、 感度、 特異性の点で、 後述する サンドィツチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射性同位元 素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 »f性同位元素としては、 例 えば、 2 5 I〕 、 3 1 I〕 、 〔3 H〕 、 4 C〕 などが用いられる。 上記酵素としては、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 /3—ガラク トシダーゼ、 グ/レコシダーゼ、 ァ カリフォスファターゼ、 パーォキシダー ゼ、 リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。 蛍光物質としては、 例えば、 フルォ レスカミン、 フルォレツセンイソチオシァネートなどが用いられる。 発光物質と しては、 例えば、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 /レシフェリン、 ルシゲニンな どが用いられる。 さらに、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビォチン一アビ ジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常、 蛋白質あるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用いる方 法でもよい。 担体としては、 例えば、 ァガロース、 デキストラン、 セルロースな どの不溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合成樹脂、 あるいはガラス等が用いられる。
サンドィツチ法においては不溶化した本発明のモノク口一ナル抗体に被検液を 反応させ （1次反応） 、 さらに標識化した本発明のモノクローナル抗体を反応さ せ （2次反応） た後、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液 中の SS169量を定量することができる。 1次反応と 2次反応は逆の順序に行なつ ても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよレ、。 標識化剤 およぴ不溶化の方法は上記のそれらに準じることができる。
また、 サンドイッチ法による免疫測定法において、 固相用抗体あるいは標識用 抗体に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感度を向上させ る等の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
サンドィツチ法による SS169類の測定法においては、 1次反応と 2次反応に用 いられる本発明のモノクローナル抗体は SS169類との結合にかかる部位が相異な る抗体が好ましく用いられる。 即ち、 1次反応および2次反応に用いられる抗体 は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体が、 SS169類の C端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は、 好ましくは C端部以外、 例えば N端部を認識する 抗体が用いられる。
本発明のモノク口一ナル抗体をサンドィツチ法以外の測定システム、 例えば、 競合法、 ィムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。 競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させた後、 未反応の標識抗原と（F )と抗体と結合した標識抗原 （B) とを分離し （B/F分 離） 、 B , Fいずれかの標識量を測定し、 被検液中の抗原量を定量する。 本反応 法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 BZF分離をポリエチレングリコール、 上記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、 第 1抗体として固相化 抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用い第 2抗体として固相 化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
ィムノメトリック法では、 被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗 体に対して競合反応させた後固相と液相を分離する力、 あるいは、 被検液中の抗 原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗 体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの相の標識 量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメトリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果、 生 じた不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の沈 降物し力得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフ口メトリー などが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を SS169類の定量に適用するにあたっては、 特別 の条件、 操作等の設定は必要とされない。 'それぞれの方法における通常の条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて SS169類の測定系を構築すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書などを参照すること できる 〔例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 4 9年発 行） 、 入江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 5 4年発行） 、 石 川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 5 3年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 5 7年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭和 6 2年発行） 、 「メソッズ ·ィ ン *ェンジモノジ一 （Methods in ENZYMOLOGY) 」 Vol. 70 (Immunochemical
Techniques (Part A))、 |R]書 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B) )、 |nj書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C) )、 同書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays) ) 同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods) )、 同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies) ) (以上、 ァカテ^ックプレ ス社発行)など参照〕 。
以上のように、 本発明の抗体を用いることによって、 SS169類を高感度に定量 することができる。
さらに、 本発明の抗体を用いて、 生体内での SS169またはその塩を定量するこ とによって、 SS169の機能不全もしくは亢進に関連する各種疾患の診断をするこ とができる。
また、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する SS169またはそ の塩を特異的に検出するために使用することができる。 また、 SS169類を精製す るために使用する抗体カラムの作製、 精製時の各分画中の SS169類の検出、 被検 細胞内における SS169の挙動の分析などに使用することができる。
( 1 1 ) 細胞膜または細胞外における SS169の量を変化させる化合物のスクリー ユング方法
本発明の抗体は、 SS169類を特異的に認識することができるので、 細胞膜また は細胞外における SS169の量を変化させる化合物のスクリーニングに用いること ができる。 すなわち本発明は、 例えば、
( i ) 非ヒト哺乳動物の（1)血液、 （2)特定の臓器、 （3)臓器から単離した組織も しくは細胞等を破壊した後、 細胞膜画分を単離し、 細胞膜画分に含まれる SS169 を定量することによる、 細胞膜における SS169の量を変化させる化合物のスクリ 一ユング方法 （あるいは、 非ヒト哺乳動物の血漿、 尿、 その他の体液等の細胞外 液を分離し、 それに含まれる SS169を定量することによる、 細胞外における SS169 の量を変化させる化合物のスクリーニング方法） 、
(ii) SS169またはその部分ペプチドを発現する形質転換体等を破壊した後、 細 胞膜画分を単離し、 細胞膜画分に含まれる SS169類を定量することによる、 細胞 膜における SS169の量を変化させる化合物のスクリーニング方法 （あるいは、 SS169またはその部分べプチドを発現する形質転換体の培養上清を分離し、 該培 養上清に含まれる SS169類を定量することによる、 細胞外における SS169の量を変 化させる化合物のスクリーニング方法) 、
(iii) 非ヒト哺乳動物の（1)血液、 （2)特定の臓器、 （3)臓器から単離した組織も しくは細胞等を切片とした後、 免疫染色法を用いることにより、 細胞表層での
SS169の染色度合いを定量ィ匕することにより、 細胞膜上の SS169を確認することに よる、 細胞膜における SS169の量を変化させるィ匕合物のスクリーニング方法、
(iv) SS169またはその部分ペプチドを発現する形質転換体等を切片とした後、 免疫染色法を用いることにより、 細胞表層での SS169類の染色度合いを定量化す ることにより、 細胞膜上の SS169類を確認することによる、 細胞膜における SS169 類の量を変ィヒさせる化合物のスクリーニング方法を提供する。
細胞膜画分に含まれる SS169類の定量は具体的には以下のようにして行なう。 ( i ) 正常あるいは疾患モデノレ非ヒト哺乳動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥサ ギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サ^"など、 より具体的には、 肥満マウス、 糖尿病マウス、 高血圧ラット、 動脈硬化ゥサギ、 担癌マウスなど） に対して、 薬 剤 （例えば、 抗肥満薬、 抗糖尿病薬、 降圧剤、 血管作用薬、 抗癌剤など） あるい 9
81 は物理的ストレス （例えば、 浸水ストレス、 電気ショック、 明喑、 低温など） な どを与え、 一定時間経過した後に、 血液、 あるいは特定の臓器 （例えば、 肝臓、 腎臓、 勝臓、 筋肉など） 、 糸建 （例えば、 褐色または白色脂肪組織など） あるい は細胞 （例えば、 脂肪細胞、 筋肉細胞など） を得る。 得られた細胞等を、 例えば、 適当な緩衝液 （例えば、 トリス塩酸緩衝液、 リン酸緩衝液、 HE P E S緩衝液な ど） 等に懸濁し、 界面活性剤 （例えば、 トリ トン 1 0 0 "? 、 ツイーン 2 0 τ Μなど） などを用いて該細胞等を破壌し、 さらに遠心分離や濾過、 カラム分画な どの手法を用いて細胞膜画分を得る。
細胞膜画分としては、 細胞を破碎した後、 それ自体公知の方法で得られる細胞 膜が多く含まれる画分のことをいう。 細胞の破砕方法としては、 Potter— Elvehjem型ホモジナイザ一で細胞を押し潰す方法、 ヮーリングブレンダーゃポリ トロン （Kinematica社製） のよる破砕、 超音波による破砕、 フレンチプレスなど で加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられ る。 細胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力によ る分画法が主として用いられる。 例えば、 細胞破砕液を低速 ( 5 0 0 r p m〜3 0 0 0 r p m) で短時間 （通常、 約 1〜1 0分） 遠心し、 上清をさらに高速 （1 5 0 0 0 r p m〜3 0 0 0 0 r m) で通常 3 0分〜 2時間遠心し、 得られる沈 澱を膜画分とする。 該膜画分中には、 SS169類と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質 などの膜成分が多く含まれる。
細胞膜画分に含まれる SS169類は、 例えば、 本発明の抗体を用いたサンドイツ チ免疫測定法、 ウェスタンプロット解析などにより定量することができる。
かかるサンドィツチ免疫測定法は前述の方法と同様にして行なうことができ、 ウェスタンプロットは自体 の手段により行なうことができる。
(ii) SS169またはその部分べプチドを発現する形質転換体を前述の方法に従つ て作製し、 細胞膜画分に含まれる SS169類を定量することができる。
細胞膜における SS169の量を変化させるィ匕合物のスクリ一二ングは、 ( i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、 薬剤あるいは物理的ス トレスなどを与える一定時間前 （3 0分前ないし 2 4時間前、 好ましくは 3 0分 前ないし 1 2時間前、 より好ましくは 1時間前ないし 6時間前） もしくは一定時 間後 （3 0分後ないし 3日後、 好ましくは 1時間後ないし 2日後、 より好ましく は 1時間後ないし 2 4時間後） 、 または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に被 検化合物を投与し、 投与後一定時間経過後 （3 0分後ないし 3日後、 好ましくは 1時間後ないし 後、 より好ましくは 1時間後ないし 2 4時間後） 、 細胞膜に おける SS169の量を定量することにより行なうことができ、
(ii) 形質転換体を常法に従い培養する際に被検化合物を培地中に混合させ、 一 定時間培養後 （1日後ないし 7日後、 好ましくは 1日後ないし 3日後、 より好ま しくは 2日後ないし 3日後） 、 細胞膜における SS169類の量を定量することによ り行なうことができる。
細胞膜画分に含まれる SS169類の確認は、 具体的には以下のようにして行なう。
(iii) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥ サギ、 ヒッジ、 プタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど、 より具体的には、 肥満マウ ス、 糖尿病マウス、 高血圧ラット、 動脈硬化ゥサギ、 担癌マウスなど） に対して、 薬剤 （例えば、 抗肥満薬、 抗糖尿病薬、 降圧剤、 血管作用薬、 抗癌剤など） ある いは物理的ストレス （例えば、 浸水ストレス、 電気ショック、 明暗、 低温など） などを与え、 一定時間経過した後に、 血液、 あるいは特定の臓器 （例えば、 肝臓、 腎臓、 膝臓、 筋肉など） 、 組織 （例えば、 褐色または白色脂肪組織など） あるい は細胞 （例えば、 脂肪細胞、 筋肉細胞など） を得る。 得られた細胞等を、 常法に 従って組織切片とし、 本発明の抗体を用いて免疫染色を行う。 細胞表層での SS169の染色度合いを定量化することによって、 細胞膜上の SS169を確認すること により、 定量的または定性的に、 細胞膜における SS169類の量を確認することが できる。
(iv) SS169またはその部分べプチドを発現する形質転換体等を用いて同様の手 段をとることにより確認することもできる。
上記スクリーニング方法について、 SS169が膜蛋白質である場合の、 細胞膜に おける SS169の量を変化させる化合物のスクリーニング方法を取り上げて具体的 に説明したが、 当業者は、 上記の手法を応用して、 SS169が分泌蛋白質である場 合の、 細胞外における SS169の量を変化させる化合物のスクリーニングについて も容易に実施し得ることはいうまでもなレ、。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 細胞膜ある いは細胞外における SS169の量を変化させる作用を有する化合物であり、 具体的 には、 （ィ） 細胞膜あるいは細胞外における SS169の量を増加させることにより、 リガンド一レセプター相互作用を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊 離、 ァセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸 化、 c— f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性な ど） を増強させる化合物、 （口） 細胞膜あるいは細胞外における SS169の量を減 少させることにより、 該細胞刺歡活性を減弱させる化合物である。
該化合物としては、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発 酵生産物などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知 の化合物であってもよい。
該細胞刺激活性を増強させる化合物は、 SS169の生理活性を増強するための安 全で低毒性な医薬として有用である。
該細胞刺激活性を減弱させる化合物は、 SS169の生理活性を減少させるための 安全で低毒性な医薬として有用である。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を医薬として使 用する場合、 前記 「SS169の機能不全に関連する疾患の予防'治療剤」 と同様に して製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 哺乳動物 (例えば、 ヒト、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 プタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルな ど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 糖 ·脂質代謝異常患者 (体重 60 k gとして） においては、 一日につき約 0.1〜： L 00mg、 好まし くは約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的 に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など によっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 糖 ·脂質代謝異常患 者 （体重 6 Ok gとして） においては、 一日につき約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より好ましくは約 0. 1〜： L Omg程度を 投与するのが好都合である。 投与対象がヒ ト以外の ¾ ^も、 体重 6 Ok g当たり に換算した量を投与することができる。
(12) 細胞膜あるいは細胞外における SS169の量を変化させる化合物を含有す る各種疾患の予防 ·治療剤
SS169は前述のとおり、 ほぼ骨格筋特異的に発現し、 糖尿病モデルマウスや絶 食後再給餌において高発現すること等から、 骨格筋細胞の分化おょぴ Zまたは代 謝 （特に糖 ·脂質代謝） の調節に重要な役割を果たしていると考えられる。 従つ て、 細胞膜あるいは細胞外における SS169の量を変化させる化合物は、 骨格筋細 胞の分化おょぴ Zまたは代謝異常 （不全もしくは亢進） が関与する疾患 （例えば、 肥満症、 糖尿病、 耐糖能異常、 動脈硬化、 高血圧、 高脂血症など） の予防 '治療 剤として用いることができる。
該化合物を SS169の機能不全もしくは亢進に関連する疾患の予防 ·治療剤とし て使用する場合は、 前記 「SS169の機能不全に関連する疾患の予防 ·治療剤」 と 同様にして製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 哺乳動物
(例えば、 ヒト、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 プタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルな ど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 糖 ·脂質代謝異常患者 (体重 6 0 k gとして） においては、 一日につき約 0 . 1〜 1 0 0 m g、 好まし くは約 1 . 0〜5 O m g、 より好ましくは約 1 . 0〜2 O m gである。 非経口的 に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など によっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 糖 ·脂質代謝異常患 者 （体重 6 O k gとして） においては、 一日につき約 0 . 0 1〜3 0 m g程度、 好ましくは約 0 . l〜2 0 m g程度、 より好ましくは約 0 . 1〜： L O m g程度を 投与するのが好都合である。 投与対象がヒト以外の場合も、 体重 6 0 k g当たり に換算した量を投与することができる。
本明細書において SS169の 「調節薬」 とは、 SS169の発現 （転写、 翻訳、 翻訳後 修飾等を含む） 、 量 （膜/細胞外への輸送、 安定性等を含む） 、 活性 （レセプダ 一 （もしくはリガンド） 結合活性、 シグナル情報伝達作用等を含む） のいずれか を調節 （促進もしくは抑制） し得る化合物を包括的に意味する用語として用いら れる。 従って、 例えば、 上記した SS169の発現量を変化させる化合物、 SS169と SS169に対して特異的親和性を有する化合物 （ァゴ二スト、 アンタゴニストな ど） 、 細胞膜あるいは細胞外における SS169の量を変化させる化合物等が SS169調 節薬として挙げられる。 これらの化合物は、 それぞれ上記したスクリーニング方 法を実施することにより取得することができる。
SS169調節薬は、 骨格筋細胞の分化および/または代謝異常 （特に糖 ·脂質代 謝異常） が関与する疾患の予防 ·治療剤として用いることができる。 即ち、 SS169の発現量を変化させる化合物を含有する各種疾患の予防 ·治療剤、 SS169と SS169に対して特異的親和性を有する化合物 （ァゴ二スト、 アンタゴニストな ど） を含有する各種疾患の予防 ·治療剤、 細胞膜あるいは細胞外における SS169 の量を変化させる化合物を含有する各種疾患の予防 ·治療剤に関して上記した通 りに、 製剤化おょぴ投与することができる。
( 1 3 ) SS169をコードする D NAを有する非ヒトトランスジエニック動物の作 製
本発明は、 外来性の SS169をコードする D NA (以下、 本発明の外来性 D NA と略記する） またはその変異 D NA (本発明の外来性変異 D N Aと略記する がある） を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
〔1〕 本発明の外来性 D NAまたはその変異 DNAを有する非ヒト哺乳動物、 〔2〕 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 〔1〕 記載の動物、
〔3〕 ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第 〔2〕 記載の動物、 および
〔4〕 本発明の外来性 D N Aまたはその変異 D NAを含有し、 哺 動物において 発現しうる組換えべクターを するものである。
本発明の外来性 D NAまたはその変異 D NAを有する非ヒト哺乳動物 （以下、 本発明の D NA転移動物と略記する） は、 未受精卵、 受精卵、 精子およびその始 原細胞を含む胚芽細胞などに対して、 好ましくは、 非ヒト哺乳動物の発生におけ る胚発生の段階 （さらに好ましくは、 単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般 に 8細胞期以前） に、 リン酸カルシウム法、 電気パルス法、 リポフエクシヨン法、 凝集法、 マイクロインジェクション法、 パーティクルガン法、 D E AE—デキス トラン法などにより目的とする D NAを転移することによって作出することがで きる。 また、 該 D NA転移方法により、 体細胞、 生体の臓器、 組織細胞などに目 的とする本発明の外来性 D NAを転移し、 細胞培養、 組織培養などに利用するこ ともでき、 さらに、 これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により 融合させることにより本発明の DN A転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、 例えば、 ゥシ、 ブタ、 ヒッジ、 ャギ、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 マウス、 ラットなどが用いられる。 なかでも、 病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、 ま た、 繁殖が容易なゲッ歯動物、 とりわけマウス （例えば、 純系として、 C57B LZ6系統， DBA2系統など、 交雑系として、 BeCSFi系統， BDFi系 統， BeDSFi系統， BALBZc系統， I CR系統など） またはラット （例 えば、 W i s t a r , S Dなど） などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えべクタ一における 「哺乳動物」 としては、 上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
本発明の外来性 DN Aとは、 非ヒト哺乳動物が本来有している本発明の DNA ではなく、 いったん哺乳動物から単離 ·抽出された本発明の DNAをいう。
本発明の変異 DN Aとしては、 元の本発明の DN Aの塩基配列に変異 （例えば、 突然変異など） が生じたもの、 具体的には、 塩基の付加、 欠失、 他の塩基への置 換などが生じた DNAなどが用いられ、 また、 異常 DNAも含まれる。
該異常 DNAとしては、 異常な SS169を発現させる DNAを意味し、 例えば、 正常な SS169の機能を抑制する蛋白質等を発現させる DNAなどが用いられる。 本発明の外来性 D N Aは、 対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳 動物由来のものであってもよい。 本発明の DNAを対象動物に転移させるにあた つては、 該 DNAを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合した DN Aコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。 例えば、 本発明のヒト D NAを転移させる場合、 これと相同性が高い本発明の DNAを有する各種哺乳動 物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウスな ど） 由来の DNAを発現させうる各種プロモーターの下流に、 本発明のヒト DN Aを結合した DNAコンストラクト （例、 ベクターなど） を対象哺乳動物の受精 卵、 例えば、 マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明 の DN Aを高発現する DN A転移哺乳動物を作出することができる。
本発明の DNAを担持させる発現ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド、 枯草菌由来のプラスミド、 酵母由来のプラスミド、 λファージなどのパクテリォ ファージ、 モロニ一白血病ウイ/レスなどのレトロウイ/レス、 ワクシニアウイノレス またはパキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。 なかでも、 大腸 菌由来のプラスミド、 枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなど が好ましく用いられる。
上記の DNA発現調節を行なうプロモーターとしては、 例えば、 （1)ウィルス (例、 シミアンウィルス、 サイトメガロウィルス、 モロニ一マウス白血病ウィル ス、 J Cウィルス、 乳癌ウィルス、 ポリオウイルスなど） に由来する DNAのプ 口モーター、 （2)各種哺乳動物 （ヒ ト、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハム スター、 ラット、 マウスなど） 由来のプロモーター、 例えば、 アルブミン、 イン スリン I I、 ゥロプラキン I I、 エラスターゼ、 エリスロポエチン、 エンドセリ ン、 筋クレアチンキナーゼ、 グリア線維性酸性蛋白質、 ダルタチオン S—トラン スフエラーゼ、 血小板由来成長因子 /3、 ケラチン K l， Κ 1 0および Κ 1 4、 コ ラーゲン I型おょぴ I I型、 サイクリック AMP依存蛋白質キナーゼ )3 Iサブュ -ット、 ジストロフィン、 酒石酸抵抗性アル力リフォスファターゼ、 心房ナトリ ゥム利尿性因子、 内皮レセプターチ口シンキナーゼ （一般に T i e 2と略され る） 、 ナトリゥムカリゥムアデノシン 3リン酸化酵素 （Na， K-ATP a s e) 、 ュユーロフィラメント軽鎖、 メタ口チォネイン Iおよび I I A、 メタロプ ロティナーゼ 1組織インヒビター、 MHCクラス I抗原 (H- 2 L) 、 H— r a s、 レニン、 ドーパミン/ 3—水酸ィ匕酵素、 甲状腺ペルォキシダーゼ （TPO) 、 ペプチド鎖延長因子 la (E F- 1 a) 、 βァクチン、 αおよび /3ミオシン重鎖、 ミオシン軽鎖 1および 2、 ミエリン基礎蛋白質、 チログロブリン、 Th y— 1、 免疫グロブリン、 H鎖可変部 （VNP) 、 血清アミロイド Pコンポーネント、 ミ ォグロビン、 トロポ-ン C、 平滑筋 ο;ァクチン、 プレプロエンケフアリン Α、 パ ソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。 なかでも、 全身で高発現する ことが可能なサイトメガロウィルスプロモーター、 ヒトペプチド鎖延長因子 1 α (EF- 1 a) のプロモーター、 ヒ トおよび-ヮトリ /3ァクチンプロモーターな どが好適である。 上記ベクターは、 D NA転移哺乳動物において目的とするメッセンジャー R N Aの転写を終結する配列 （一般にターミネタ一と呼ばれる） を有していることが 好ましく、 例えば、 ウィルス由来および各種哺乳動物由来の各 D N Aの配列を用 いることができ、 好ましくは、 シミアンウィルスの S V 4 0ターミネタ一などが 用いられる。
その他、 目的とする外来性 D NAをさらに高発現させる目的で各 D N Aのスプ ライシングシグナル、 ェンハンサー領域、 真核 D N Aのイントロンの一部などを プロモータ一領域の 5 '上流、 プロモータ一領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域 の 3 '下流に連結することも目的により可能である。
正常な SS169の翻訳領域は、 各種哺乳動物 （例えば、 ヒト、 ゥサギ、 ィヌ、 ネ コ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウスなど） 由来の肝臓、 腎臓、 脂肪組 織、 筋肉由来 D NAおよび市販の各種ゲノム D NAライブラリーよりゲノム D N Aの全てあるいは一部として、 または前記 βまたは組織由来の R NAより公知 の方法により調製された c D NAを原料として取得することが出来る。 また、 外 来性の異常 D NAは、 上記の細胞または組織より得られた正常な SS169の翻訳領 域を点突然変異誘発法により変異させた翻訳領域を作製することによって得るこ とができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうる D N Aコンストラタトとして、 前記 のプロモーターの下流 （および所望により転写終結部位の上流） に連結させる通 常の D N A工学的手法によりィ«することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 D Ν Αの転移は、 対象哺乳動物の胚芽 細胞おょぴ体細胞のすべてに存在するように確保される。 D NA転移後の作出動 物の胚芽細胞において、 本発明の外来性 D NAが存在することは、 作出動物の後 代がすべて、 その胚芽細胞おょぴ体細胞のすべてに本発明の外来性 D N Aを保持 することを意味する。 本発明の外来性 D N Aを受け継いだこの種の動物の子孫は その胚芽細胞およぴ体細胞のすべてに本発明の外来性 D N Aを有する。 本発明の外来性正常 D NAを転移させた非ヒト哺乳動物は、 交配により外来性 D NAを安定に保持することを確認して、 該 D N A保有動物として通常の飼育環 境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 D N Aの転移は、 対象哺乳動物の胚芽 細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。 D N A転移後の作 出動物の胚芽細胞において本発明の外来性 D N Aが過剰に存在することは、 作出 動物の子孫が全てその胚芽細胞おょぴ体細胞の全てに本発明の外来性 D N Aを過 剰に有することを意味する。 本発明の外来性 D NAを受け継いだこの種の動物の 子孫はその胚芽細胞おょぴ体細胞の全てに本発明の外来性 D NAを過剰に有する。 導入 D NAを相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌雄 の動物を交配することによりすベての子孫が該 D N Aを過剰に有するように繁殖 継代することができる。
本発明の正常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の正常 DNAが高発現 させられており、 内在性の正常 D N Aの機能を増強することにより最終的に SS169の機能亢進症を発症することがあり、 その病態モデル動物として利用する ことができる。 例えば、 本発明の正常 D N A転移動物を用いて、 SS169の機能亢 進症や、 SS169が関連する疾患の病態機序の解明おょぴこれらの疾患の治療方法 の検討を行なうことが可能である。
また、 本発明の外来性正常 D NAを転移させた哺乳動物は、 遊離した SS169の 増加症状を有することから、 SS169に関連する疾患に対する治療薬のスクリー二 ング試験にも利用可能である。
—方、 本発明の外来性異常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 交配により外来 性 D N Aを安定に保持することを確認して該 D N A保有動物として通常の飼育環 境で継代飼育することが出来る。 さらに、 目的とする外来 D NAを前述のプラス ミドに組み込んで原科として用いることができる。 プロモーターとの D NAコン ストラタ卜は、 通常の D NA工学的手法によって作製することができる。 受精卵 細胞段階における本発明の異常 DNAの転移は、 対象哺乳動物の胚芽細胞おょぴ 体細胞の全てに存在するように確保される。 D NA 移後の作出動物の胚芽細胞 において本発明の異常 D N Aが存在することは、 作出動物の子孫が全てその胚芽 細胞おょぴ体細胞の全てに本発明の異常 D N Aを有することを意味する。 本発明 の外来性 DN Aを受け継いだこの種の動物の子孫は、 その胚芽細胞および体細胞 の全てに本発明の異常 D N Aを有する。 導入 D N Aを相同染色体の两方に持つホ モザィゴート動物を取得し、 この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫 が該 DN Aを有するように繁殖継代することができる。
本発明の異常 D N Aを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の異常 D NAが高発現 させられており、 内在性の正常 D N Aの機能を阻害することにより最終的に SS169の機能不活性型不応症となることがあり、 その病態モデル動物として利用 することができる。 例えば、 本発明の異常 D N A転移動物を用いて、 SS169の機 能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうこ とが可能である。
また、 具体的な利用可能性としては、 本発明の異常 D N A高発現動物は、
SS169の機能不活性型不応症における異常 SS169による正常 SS169の機能阻害 (dominant negative作用） を解明するモデルとなる。
また、 本発明の外来異常 D N Aを転移させた哺乳動物は、 遊離した異常 SS169 の増加症状を有することから、 SS169の機能不活性型不応症に対する治療薬スク リ一二ング試験にも利用可能である。
また、 上記 2種類の本発明の D NA転移動物のその他の利用可能 として、 例 えば、
(1)組織培養のための細胞源としての使用、 ·
(2)本発明の D NA転移動物の組織中の D N Aもしくは R N Aを直接分析するか、 または産生された SS169を分析することによる、 SS169により特異的に発現あるい は活性化する蛋白質等との関連性についての解析、 (3) D NAを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、 これらを使用 しての、 一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
(4)上記 (3)記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスク リーニング、 および
(5)変異 SS169の単離精製おょぴその抗体作製などが考えられる。
さらに、 本発明の D NA転移動物を用いて、 SS169の機能不活性型不応症など を含む、 SS169に関連する疾患の臨床症状を調べることができ、 また、 SS169に関 連する疾患モデルの各 βにおけるより詳細な病理学的所見が得られ、 新しい治 療方法の開発、 さらには、 該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献する ことができる。
また、 本発明の DNA転移動物から各臓器を取り出し、 細切後、 トリプシンな どの蛋白質分解酵素により、 遊離した D NA転移細胞の取得、 その培養またはそ の培養細胞の系統化を行なうことが可能である。 さらに、 SS169産生細胞の特定 化、.アポトーシス、 分ィヒあるいは増殖との関連性、 またはそれらにおけるシグナ ル伝達機構を調べ、 それらの異常を調べることなどができ、 SS169の作用解明の ための有効な研究材料となる。
さらに、 本発明の D NA転移動物を用いて、 SS169の機能不活性型不応症を含 む、 SS169に関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、 上述の検査法おょぴ 定量法などを用いて、 有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供する ことが可能となる。 また、 本発明の D N Α転移動物または本発明の外来性 D N A 発現ベクターを用いて、 SS169が関連する疾患の D NA治療法を検討、 開発する ことが可能である。
( 1 4 ) SS169をコードする遺伝子が不活性ィ匕された非ヒトノックァゥト動物の 作製
本発明は、 本発明の D N Aが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞おょぴ本 発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。 すなわち、 本発明は、
〔1〕 本発明の DNAが不活性ィ匕された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
〔2〕 該 D NAがレポーター遺伝子 （例、 大腸菌由来の /3—ガラクトシダーゼ遺 伝子） を導入することにより不活性化された第 〔1〕 項記載の胚幹細胞、
〔3〕 ネオマイシン耐性である第 〔1〕 項記載の胚幹細胞、
〔4〕 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 〔1〕 項記載の胚幹細胞、
〔5〕 ゲッ歯動物がマウスである第 〔4〕 項記載の胚幹細胞、
〔6〕 本発明の DNAが不活性化された該 D NA発現不全非ヒト哺乳動物、 〔7〕 該 D NAがレポーター遺伝子 （例、 大腸菌由来の 一ガラクトシダ一ゼ遺 伝子） を導入することにより不活性化され、 該レポーター遺伝子が本発明の D N Aに対するプロモーターの制御下で発現しうる第 〔6〕 項記載の非ヒト哺乳動物、 〔8〕 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 〔6〕 項記載の非ヒト哺乳動物、 〔9〕 ゲッ齒動物がマウスである第 〔8〕 項記載の非ヒト喃乳動物、 および 〔1 0〕 第 〔7〕 項記載の動物に、 試験化合物を投与し、 レポーター遺伝子の発 現を検出することを特徴とする本発明の D NAに対するプロモーター活性を促進 または阻害するィヒ合物またはその塩のスクリ一ユング方法を提供する。
本発明の D NAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、 該非ヒト哺乳 動物が有する本発明の D NAに人為的に変異を加えることにより、 D NAの発現 能を抑制するか、 もしくは該 D NAがコードしている SS169の活性を実質的に喪 失させることにより、 . D NAが実質的に SS169の発現能を有しない （以下、 本発 明のノックアウト D NAと称することがある） 非ヒト哺乳動物の胚幹細胞 （以下、 E S細胞と略記する） をいう。
非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の D NAに人為的に変異を加える方法としては、 例えば、 遺伝子工学的 手法により該 D N A配列の一部又は全部の削除、 他 D NAを挿入または置換させ ることによって行なうことができる。 これらの変異により、 例えば、 コドンの読 み取り枠をずらしたり、 プロモーターあるいはェキソンの機能を破壊することに より本発明のノックァゥト DN Aを作製すればよい。
本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞 （以下、 本発明の D NA不活性ィ匕 E S細胞または本発明のノックアウト E S細胞と略記する） の具体 例としては、 例えば、 目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明の DNAを単離 し、 そのェキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、 ハイグロマイシン耐性遺伝子 を代表とする薬剤耐性遺伝子、 あるいは 1 a c Z (j3—ガラクトシダーゼ遺伝 子） 、 c a t (クロラムフエュコールァセチルトランスフェラーゼ遺伝子） を代 表とするレポーター遺伝子等を揷入することによりェキソンの機能を破壊するか、 あるいはェキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させる DNA配列 (例えば、 poly A付加シグナルなど） を挿入し、 完全な mRN Aを合成できなく することによって、 結果的に遺伝子を破壊するように構築した DNA配列を有す る DNA鎖 （以下、 ターゲッティングベクターと略記する） を、 例えば相同組換 え法により該動物の染色体に導入し、 得られた ES細胞について本発明の DNA 上あるいはその近傍の DNA配列をプローブとしたサザンハイブリダィゼーショ ン解析あるいはターグッティングべクタ一上の D N A配列とターグッティングべ クター作製に使用した本発明の DN A以外の近傍領域の DN A配列をプライマー とした P C R法により解析し、 本発明のノックアウト ES細胞を選別することに より得ることができる。
また、 相同組換え法等により本発明の DNAを不活化させる元の ES細胞とし ては、 例えば、 前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、 また公知の Evansと Kaufmanの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。 例えば、 マウスの ES細胞の場合、 現在、 一般的には 129系の ES細胞が使用されているが、 免 疫学的背景がはっきりしていないので、 これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背 景が明らかな ES細胞を取得するなどの目的で例えば、 C57BLZ6マウスや C 57BLZ6の採卵数の少なさを DBA/2との交雑により改善した BDF， マウス （C 57BLZ6と DBA/2との ) を用いて樹立したものなども良 好に用いうる。 BDF マウスは、 採卵数が多く、 かつ、 卵が丈夫であるという 利点に加えて、 C57BLZ6マウスを背景に持つので、 これを用いて得られた ES細胞は病態モデレマウスを作出したとき、 C57BLZ6マウスとパックク ロスすることでその遺伝的背景を C 57 BLZ 6マウスに代えることが可能であ る点で有利に用い得る。
また、 ES細胞を樹立する場合、 一般には受精後 3· 5日目の胚盤胞を使用す るが、 これ以外に 8細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率 よく多数の初期胚を取得することができる。
また、 雌雄いずれの ES細胞を用いてもよいが、 通常雄の ES細胞の方が生殖 系列キメラを作出するのに都合が良い。 また、 煩雑な培養の手間を削減するため にもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
ES細胞の雌雄の判定方法としては、 例えば、 PCR法により Y染色体上の性 決定領域の遺伝子を増幅、 検出する方法が、 その 1例としてあげることができる。 この方法を使用すれば、 従来、 核型分析をするのに約 106個の細胞数を要して いたのに対して、 1コロユー程度の ES細胞数 （約 50個） で済むので、 培養初 期における E S細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であ り、 早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減で さる。
また、 第二次セレクションとしては、 例えば、 G—パンディング法による染色 体数の確認等により行うことができる。 得られる E S細胞の染色体数は正常数の 100%が望ましいが、 樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、 ES細 胞の遺伝子をノックアウトした後、 正常細胞 （例えば、 マウスでは染色体数が 2 n = 40である細胞） に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、 通常その増殖性は大変良いが、 個体発 生できる能力を失いやすいので、 注意深く継代培養することが必要である。 例え ば、 S TO繊維芽細胞のような適当なフィーダ一細胞上で L I F (1— 1000 OU/ml) 存在下に炭酸ガス培養器内 （好ましくは、 5%炭酸ガス、 95%空気ま たは 5 %酸素、 5 °/0炭酸ガス、 90 %空気） で約 37 °Cで培養するなどの方法で 培養し、 継代時には、 例えば、 トリプシン ZEDTA溶液 （通常 0.001-0. 5 %トリプシンノ 0.1-5 mM E D T A、 好ましくは約 0. 1 °/0トリプシンノ
ImM EDTA) 処理により単細胞化し、 新たに用意したフィーダ一細胞上に 播種する方法などがとられる。 このような継代は、 通常 1一 3日毎に行なうが、 この際に細胞の観察を行い、 形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養 細胞は放棄することが望まれる。
ES細胞は、 適当な条件により、 高密度に至るまで単層培養する力 \ または細 胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、 頭頂筋、 内臓筋、 心筋などの 種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり 〔M. J. Evans及ぴ M. H. Kaufman, ネイチヤー （Nature) 第 292卷、 1 54頁、 1 981年； G. R. Martin, プロシーディングス .ォブ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ 'サイェン ス ·ユーエスエー （proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.) 第 78卷、 7634頁、 1981年； T. C. Doetschman ら、 ジャーナノレ ·ォブ ·ェンブリオロジー ·ァ ンド .ェクスペリメンタ 7レ ·モノレフォロジ一 （J. Embryol. Exp. Morphol. ) 、 第 87卷、 27頁、 1985年〕 、 本発明の E S細胞を分化させて得られる本発 明の DNA発現不全細胞は、 インビトロにおける SS169または SS169の細胞生物学 的検討において有用である。
本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 該動物の mRN A量を公知方法を 用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、 正常動物と区別する ことが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 例えば、 前述のようにして作製し たタ一ゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマゥス卵細胞に導入し、 導 入されたターゲッティングベタタ 中の本発明の D NAが不活性ィ匕された D NA 配列が遺伝子相同組換えにより、 マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上 の本発明の DNAと入れ換わる相同組換えをさせることにより、 本発明の D NA をノックアウトさせることができる。 喃乳動物における組換えの多くは非相同的 であるため、 相同組換えを起こした細胞をスクリーニングする手段として、 例え ば、 本発明の D NAの内部にネオマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐'性遺伝子を挿 入するとともに、 本発明の DNAの近傍にチミジンキナーゼ （t k) 遺伝子を含 むターゲッティングベクターを構築して胚幹細胞または卵細胞に導入し、 挿入さ れた薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤 （例えば、 ネオマイシン耐性遺伝子であれば G418等） およびガンシクロビル存在下で生存する細胞を選択する方法が挙げられ る。 即ち、 相同組換えにより本発明の揷入変異 DNAが染色体上に組み込まれた 場合、 t k遺伝子は排除されるのでガンシクロビル耐性であるが、 非相同組換え で組み込まれた場合は t k遺伝子も同時に組み込まれるためガンシク口ビル感受 性となる。 また、 t k遺伝子の代わりにジフテリア毒素遺伝子などを用いれば、 ランダム挿入された細胞は該毒素の産生により死滅するので、 単一の薬剤での選 択が可能となる。
本発明の D NAがノックアウトされた細胞の最終的な確認は、 本発明の D NA 上またはその近傍の D N A配列をプロープとしたサザンハイブリダイゼーション 解析またはターゲッティングベクタ一上の D N A配列と、 ターゲッティングベタ ターに使用したマウス由来の本発明の DNA以外の近傍領域の D NA配列とをプ ライマーとした P C R法による解析を用いて行なうことができる。
非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、 遺伝子相同組換えにより、 本発明の D NAが不活性化された細胞株をクローニングし、 その細胞を適当な時期、 例え ば、 8細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、 作製したキメラ胚を偽 妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。 作出された動物は正常な本発明 の D NA座をもつ細胞と人為的に変異した本発明の DNA座をもつ細胞との両者 力 ら構成されるキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明の D NA座をもつ場合、 この ようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、 全ての 組織が人為的に変異を加えた本発明の D NA座をもつ細胞で構成された個体を、 例えば、 コートカラーの判定等により選別することにより得られる。 このように して得られた個体は、 通常へテロ発現不全個体であるので、 当該へテロ発現不全 個体同志を交配し、 それらの産仔から本発明の蛋白質のホモ発現不全個体を得る ことができる。
卵細胞を使用する場合は、 例えば、 卵細胞核内にマイクロインジェクション法 で D NA激夜を注入することによりタ一ゲッティングベタタ一を染色体内に導入 したトランスジエニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、 これらのトランスジ エニック非ヒト哺乳動物から、 遺伝子相同組換えにより本発明の DN A座に変異 のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明の D NAがノックアウトされている個体は、 交配により 得られた動物個体も該 D NAがノックアウトされていることを確認して通常の飼 育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、 生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。 すなわち、 該不活ィ匕 D N Aの保有する雌雄の動物を交配することにより、 該不活化 D NAを 相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得しうる。 得られたホモザィゴ ート動物は、 母親動物に対して、 正常個体 1， ホモザィゴート複数になるような 状態で飼育することにより効率的に得ることができる。 ヘテロザィゴート動物の 雌雄を交配することにより、 該不活化 D NAを有するホモザィゴートおよびへテ 口ザィゴート動物を繁殖継代する。
本発明の D NAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、 本発明の D NA 発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、 非常に有用である。
また、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 SS169により誘導され得る 種々の生物活性を欠失するため、 SS169の生物活性の不活性化を原因とする疾患 のモデルとなり得るので、 これらの疾患の原因究明及ぴ治療法の検討に有用であ る。
( 1 4 a ) 本発明の D NAの欠損や損傷などに起因する疾患に対して治療 ·予防 効果を有する化合物のスクリ一二ング方法
本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の D N Aの欠損や損傷など に起因する疾患に対して治療 ·予防効果を有する化合物のスクリーニングに用い ることができる。
すなわち、 本発明は、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を 投与し、 該動物の変化を観察'測定することを特徴とする、 本発明の D NAの欠 損や損傷などに起因する疾患に対して治療 ·予防効果を有する化合物またはその 塩のスクリーニング方法を ¾する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳 動物としては、 前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成 化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿などがあ げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であって もよい。
具体的には、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物を、 試験化合物で処理し、 無処理の対照動物と比較し、 該動物の各器官、 組織、 疾患の症状などの変化を指 標として試験化合物の治療 ·予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、 例えば、 経口投与、 静脈注射 などが用いられ、 試験動物の症状、 試験化合物の性質などにあわせて適宜選択す ることができる。 また、 試験化合物の投与量は、 投与方法、 試験化合物の性質な どにあわせて適宜選択することができる。
該スクリーニング方法において、 試験動物に試験化合物を投与した場合、 該試 験動物の血糖値が約 1 0 %以上、 好ましくは約 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上低下した場合、 該試験化合物を上記の疾患に対して治療 ·予防効果を有 する化合物として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られるィ匕合物は、 上記した試験化合物から選 ばれた化合物であり、 SS169の欠損や損傷などによって引き起こされる疾患、 例 えば、 骨格筋細胞の分化および Zまたは代謝異常が関与する疾患 （例：肥満症、 糖尿病、 耐糖能異常、 動脈硬化、 高血圧、 高脂血症など） に対する安全で低毒性 な治療'予防剤などの医薬として使用することができる。 さらに、 上記スクリー ユングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーエング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合物 の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸、 有機酸など） や塩基 （例、 アルカリ金属など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付 加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピ オン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） との塩などが用いられ る。
該スクリーユング方法で得られた化合物またはその塩を医薬として使用する場 合は、 前記 「SS169の機能不全に関連する疾患の予防 ·治療剤」 と同様にして製 剤化することができる。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 哺乳動物 (例えば、 ヒト、 ラット、 マウス、 モノレモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどによ り差異はあるが、 例えば、 該化合物を経口投与する^、 一般的に例えば、 糖' 脂質代謝異常患者 （体重 6 O k gとして） においては、 一日につき約 0 . 1〜1 00 m g、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg である。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症 状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 糖 ·脂質代謝異常患者 （体重 6 Ok gとして） においては、 一日につき約 0. 0 1〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より好ましくは約 0,
1〜1 Omg程度を投与するのが好都合である。 投与対象がヒト以外の^^も、 体重 60 k g当たりに換算した量を投与することができる。
(14 b) 本発明の DNAに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化 合物のスクリーニング方法
本発明は、 本発明の DN A発現不全非ヒト哺乳動物に、 試験化合物を投与し、 レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明の DNAに対するプ 口モーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリ一-ング方 法を する。
上記スクリーニング方法において、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物と しては、 前記した本発明の DN A発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、 本発明の D NAがレポーター遺伝子を導入することにより不活性ィ匕され、 該レポーター遺伝 子が本発明の DNAに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられ る。
試験ィ匕合物としては、 前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、 前記と同様のものが用いられ、 β—ガラク トシダ ーゼ遺伝子 (1 a c Ζ) 、 可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフ ェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明の D N Aをレポータ一遺伝子で置換された本発明の D N A発現不全非ヒ ト哺乳動物では、 レポ一タ一遺伝子が本発明の D N Aに対するプロモーターの支 配下に存在するので、 レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースする ことにより、 プロモーターの活性を検出することができる。 例えば、 SS169をコードする D N A領域の一部を大腸菌由来の ]3—ガラクトシ ダ一ゼ遺伝子 （1 a c Z ) で置換している場合、 本来、 SS169の発現する組織で、 SS169の代わりに ]3—ガラクトシダーゼが発現する。 従って、 例えば、 5—ブロ モー 4—クロロー 3—インドリル一 j3—ガラクトピラノシド （X— g a 1 ) のよ うな /3—ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、 簡便 に SS169の動物生体内における発現状態を観察することができる。 具体的には、 SS169を欠損するマウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、 リン酸緩衝生理食塩液 (P B S ) で洗浄後、 X - g a 1を含む染色液で、 室温ま たは 3 7 °C付近で、 約 3 0分ないし 1時間反応させた後、 組織標本を I mM E D TAZP B S溶液で洗浄することによって、 /3—ガラクトシダーゼ反応を停止 させ、 呈色を観察すればよい。 また、 常法に従い、 1 a c Zをコードする mRN Aを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 上記した試 験化合物から選ばれた化合物であり、 本発明の D NAに対するプロモーター活性 を促進または阻害する化合物である。
該スクリーユング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合物 の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸など） や塩基 （例、 有機酸 など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好まし い。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマ ル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） との塩などが用いられる。
本発明の D NAに対するプロモーター活性を促進するィ匕合物またはその塩は、 SS169の発現を促進し、 SS169の機能を促進することができるので、 例えば、 SS169の機能不全に関連する疾患などの予防 ·治療薬などの医薬として有用であ る。 本発明の DNAに対するプロモーター活性を阻害するィ匕合物またはその塩は、 SS169の発現を阻害し、 SS169の機能を阻害することができるので、 例えば、 SS169の発現過多に関連する疾患などの予防 ·治療薬などの医薬として有用であ る。
SS169の機能不全もしくは発現過多に関連する疾患としては、 例えば、 骨格筋 細胞の分ィヒおよび/または代謝異常が関与する疾患 （例えば、 肥満症、 糖尿病、 耐糖能異常、 動脈硬化、 高血圧、 高脂血症など） 等が挙げられる。
さらに、 上記スクリ一ユングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に 用いることができる。
該スクリーユング方法で得られた化合物またはその塩を医薬として使用する場 合は、 前記 「SS169の機能不全に関連する疾患の予防 ·治療剤」 と同様にして製 剤化することができる。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 哺乳動物 (例えば、 ヒト、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどによ り差異はあるが、 例えば、 本発明の DNAに対するプロモーター活性を促進また は阻害する化合物を経口投与する場合、 一般的に例えば、 糖'脂質代謝異常患者 (体重 6 O k gとして） においては、 一日につき約 0. 1〜： L 00mg、 好まし くは約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜 20 m gである。 非経口的 に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など によっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 糖'脂質代謝異常患 者 （体重 6 O k gとして） においては、 一日につき約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より好ましくは約 0. 1〜： L Omg程度を 投与するのが好都合である。 投与対象がヒト以外の も、 体重 60 k g当たり に換算した量を投与することができる。 このように、 本発明の DN A癸現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の D NAに対 するプロモーターの活 '性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリー二 ングする上で極めて有用であり、 本発明の D N A発現不全に起因する各種疾患の 原因究明または予防 ·治療薬の開発に大きく貢献することができる。
また、 SS169のプロモーター領域を含有する D NAを使って、 その下流に種々 の蛋白質をコードする遺伝子を連結し、 これを動物の卵細胞に注入していわゆる トランスジェユック動物 （遺伝子移入動物） を作成すれば、 特異的にその蛋白質 を合成させ、 その生体での作用を検討することも可能となる。 さらに上記プロモ 一ター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、 これが発現するような細胞株 を樹立すれば、 SS169そのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制 する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
本明細書おょぴ図面において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 I U P A C— I U B Commission on Biochemical Nomenclature ίこよる略 ¾>る いは当該分野における' w:用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またァ ミノ酸に関し光学異 14体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すもの とする。
DNA デォキシリボ核酸
c DNA 相補的デォキシリボ核酸
A アデニン
T チミン
G グァニン
C RNA ： リポ核酸
mRNA ：メッセンジャーリポ核酸
d AT P ：デォキシアデノシン三リン酸
d TT P ：デォキシチミジン三リン酸 dGTP デォキシグァノシン三リン酸 dCTP デォキシシチジン三リン酸 ATP アデノシン三リン酸
EDTA エチレンジァミン四酢酸 SDS ドデシル硫酸ナトリウム G 1 y グリシン
A 1 a ァラニン
Va 1 パリン
Leu ロイシン
I 1 e イソロイシン
S e r セリン
Th r スレ才ニン
C y s システィン
Me t メチ才ユン
G 1 u グルタミン酸
As ァスパラギン酸
L y s リジン
A r g アルギニン
H i s ヒスチジン
Ph e フエニノレアラニン
Ty r チロシン
T r p
Pr o プロリン
A s n ァスパラギン
G 1 n グノレタミン
p G 1 u ピログ/レタミン酸 Me ：メチノレ基
E t ：ェチル基
B u ：ブチル基
P h ：フエニル基
TC ：チアゾリジン一 4 (R) 一カルボキサミド基
また、 本明細書中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下記の記号で表記 する。
T o s ： p—トノレエンスノレフォニノレ
CHO ：ホノレ^;ノレ
BB zz 11 ：ベンジル
Cl2Bzl ： 2， 6—ジクロ口べンジ /レ
Bom ：ベンジノレオキシメチ /レ
Z ：べンジ /レオキシカルボ-ル
C 1 -Z ： 2—クロ口べンジ /レオキシカルポニル
B r— Z ： 2—ブロモべンジ /レオキシカルボニル
B o c ： t—ブトキシ力/レポ二ノレ
DNP ：ジニトロフエノーノレ
T r t ： トリチル
Bum ： t—ブトキシメチノレ
Fmo c ： N— 9—フルォレニルメトキシカルボニル
HOB t ： 1—ヒ ドロキシベンズトリァゾーノレ
HOOB t ： 3, 4—ジヒドロー 3—ヒドロキシー 4一ォキソ一
1， 2, 3—ベンゾトリアジン
HONB ： 1-ヒドロキ - 5-ノルボルネン- 2, 3—ジカルボキシィミド DCC ： N、 N， 一ジシクロへキシルカルポジイミド
本明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。 〔配列番号： 1〕
ヒトひらめ筋由来分泌もしくは膜蛋白質 SS169遺伝子の塩基配列を示す。
〔配列番号： 2〕
ヒトひらめ筋由来分泌もしくは膜蛋白質 SS169遺伝子にコードされるアミノ酸 配列を示す。
〔配列番号： 3〕
マウスひらめ筋由来分泌もしくは膜蛋白質 SS169遺伝子の塩基配列を示す。 〔配列番号： 4〕
マウスひらめ筋由来分泌もしくは膜蛋白質 SS169遺伝子にコードされるァミノ 酸配列を示す。
〔配列番号： 5〕
マウスひらめ筋由来分泌もしくは膜蛋白質 SS169 c D NA断片を増幅するため のプライマ一の塩基配列を示す。
〔配列番号： 6〕
マウスひらめ筋由来分泌もしくは膜蛋白質 SS169 c D NA断片を増幅するため のプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 7〕
SST法で得たマウスひらめ筋由来分泌もしくは膜蛋白質 SS169 c D NA断片の 塩基配列を示す。
〔配列番号： 8〕
マウス SS169遺伝子のクロ一ニングに用いた 5' - RACEプライマーの塩基配列を 示す。
〔配列番号： 9〕
マウス SS169遺伝子のクローユングに用いた 3' - RACEプライマーの塩基配列を 示す。
〔配列番号： 1 0〕 マウス SS169の c D NA配列を示す。
〔配列番号： 1 1〕
ヒト SS169遺伝子のクローユングに用いた 5， -RACEプライマーの塩基配列を示 す。
〔配列番号： 1 2〕
ヒト SS169遺伝子のクローユングに用いた 3' -RACEプライマ^"の塩基配列を示 す。
〔配列番号： 1 3〕
ヒト SS169遺伝子の c D NA配列を示す。
〔配列番号： 1 4〕
マウス SS169 c D NA断片を増幅させるために用いたプライマーの塩基配列を 示す。
画番号： 1 5〕
マウス SS169 c D NA断片を増幅させるために用いたプライマーの塩基配列を 示す。
〔配列番号： 1 6〕
ラット SS169遺伝子のクローユングに用いた 3' -RACEプライマーの塩基配列を 示す。
〔配列番号： 1 7〕
ラット SS169遺伝子のクローユングに用いた 3' -RACEプライマーの塩基配列を 示す。
〔配列番号： 1 8〕
ラット SS169遺伝子のクローユングに用いた 3， -RACEプライマーの塩基配列を 示す。
〔配列番号： 1 9〕
ラット SS169遺伝子のクローユングに用いた 3' - RACEプライマーの塩基配列を 示す。
〔配列番号： 20〕
ラット SS169 cDNA断片 （CDS) を増幅させるために用いたプライマーの塩 基配列を示す。
〔配列番号： 21〕
ラット SS169 cDNA断片 （CDS) を増幅させるために用いたプライマーの塩 基配列を示す。
〔配列番号： 22〕
ラット腓腹筋由来分泌もしくは膜蛋白質 SS169遺伝子の塩基配列を示す。
〔配列番号： 23〕
ラット腓腹筋由来分泌もしくは膜蛋白質 SS169遺伝子にコ一ドされるアミノ酸 配列を示す。
〔配列番号： 24〕
ラット SS169 c DNA断片を増幅させるために用いたプライマーの塩基配列を 示す。
〔配列番号： 25〕
ラット SS169 cDNA断片を増幅させるために用いたプライマーの塩基配列を 示す。
以下に実施例を示して、 本発明をより詳細に説明するが、 これらは本発明の範 囲を限定するものではない。 なお、 クロ一ニング方法おょぴ塩基配列の決定法な どの遺伝子操作法は、 公知の方法 （例えば、 Molecular cloning、 2nd., J. Sambrook et al.， Cold Spring Harbor Lab. Press (1989)等に記載の方法） に従って行った。 実施例 1
マウス骨格筋由来の分泌 ·膜蛋白質 c DNAのスクリ一二ング マウスプロ B細胞株 B a /F 3 (理研セルパンク ； RCB0805) は、 その生存- 増殖に I L— 3が必須である。 該細胞は細胞膜上にト口ンポポイエチン受容体 (MP L) を発現しており、 リガンドであるトロンボポイエチンの結合によりホ モニ量体を形成し、 細胞内に増殖シグナルが伝えられる。 MP Lは、 膜貫通領域 の S e r 4 9 8 A s n変異によりリガンド非依存的な恒常的活性型 (MP LM ) になり、 B a /F 3力 S I L— 3非存在下においてもその生存 ·増殖が維持され、 しかも、 MP LMの活 i4には細胞外ドメインの大半は不要で、 C末端の 1 8 7ァ ミノ酸を含めば細胞膜上に発現してホモ二量体を形成し得ることが見出されてい る （Kojimaおよぴ Kitamura, Nature Biotech. , 17: 487-490， 1999) 。 すなわち、 細胞外領域を欠失させた MP LMの 5， 側に c D N Aを組み込めるようデザィン されたレトロウイルスベクターを作製し、 組み込んだ c DN Aがシグナルシーク エンスを有していれば、 c DNAにコードされた蛋白質と MP LMの融合蛋白質 が B a /F 3の細胞膜上に発現し、 該 B a ZF 3が I L— 3非依存下で生存 ·増 殖することになる。 この原理に基づいて、 M e 1： 1〜 T h r 4 4 1 を欠失させた MP LMのコード領域 ( AMP LM ) を含むレトロウイルスベクタ一 （pMX - SST； Kojimaおよび Kitamura、 上述） の BstXIサイトに、 自由摂食、 絶食、 およぴ再摂 食マウスひらめ筋由来 c D NAを挿入してレトロウイルス発現ライブラリーを構 築し、 分泌 ·膜蛋白質 c D NAのクローニングを行った。
まず、 自由摂食、 絶食おょぴ再摂食マウス （C57B1/6J, 13週齢， メス。 絶食の 場合は 24時間絶食後、 再摂食は絶食再摂食後 6時間後） からひらめ筋を切除し、 Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia) を用いて、 添付のプロトコ一 ルに従って poly A (+) RNAを単離し、 Superscript Choice System (Gibco-BRL) を用いてランダムへキサマーにより cDNAに変換した。 得られた cDNAを、 BstXIァ ダプター （Invitrogen) を用いてレトロウイルスベクター pMX- SSTの BstXIサイト に揷入し、 MPLMの 5' 側に該 cDMをライゲーシヨン'させた。 得られた D NAを E. coli DH10B株にエレクトロポレーシヨン法を用いて導入し、 増幅させた。 常法 に従ってプラスミド D NAを精製し、 レトロウイルス作製用パッケージング細胞 (Plat- E； Moritaら， Gene Ther. , 7 (12)： 1063 - 1066， 2000；東京大学.医科学 研究所'北村俊雄博士より入手） （2 X 106 細胞/ dish) に Lipofectamine 2000™ 試薬 (Invitrogen) を用いて添付のプロトコールに従いトランスフエクシヨンし た。 10%ゥシ胎仔血清添加 DMEM培地中で 24時間培養後に、 同新鮮培地に交換し 2 4時間培養し培養上清を採取して感染性を有した高カ価レトロウィルスストッ ク （感染効率 10 - 30%) を得た。 このレトロウイルスストックで蛋白質発現用細胞 (Ba/F3) を感染させ、 IL- 3添加 RPMI1640培地中で 8〜24時間培養した後、 96 - wellプレート中に 1 〜； I0x 103 Zwellとなるように播き、 I L— 3無添加培地中で 選択した。 感染後に増殖性を保持した Ba/F3を選択し、 それらから常法によりゲ ノム DNAを抽出した。 次いで、 プライマー 1および 2 (配列番号 5および 6) を用い ゲノム DNAを铸型として PCRを行った （98°C、 60秒の後、 98°C、 20秒おょぴ 68°C、 120秒を 30サイクル) 。 増幅された断片の塩基配列を BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Kit (PE Biosystems) および DNA自動シークェンサ一 （ABI Prism 377) を用いて決定したところ、 配列番号 7で示される cDNAクローンが確認 された。 実施例 2
マウス SS169遺伝子のクローニング
上記シーケンスをもとに NCBI blastにてサーチしたところ XM - 155941
L0C239790と相同性を示すことが判明した。 その配列をもとに 5' - RACEプライマ 一 (TCCTGAGCCCCACAGCATCACAATCATAGC；配列番号 8) およぴ 3' -RACEプライマ一 ( CCTTGACAGACTCTCAGCT ；配列番号 9 ) を設計し、 5' - RACE, 3' -RACEを実施 (clontech SMART™ RACE cDNA amplification kit) した。 実験は kitの添付書に 従って実施した。 C57BL/6Jマウス骨格筋からトータル RNAを抽出しアダプターの 附加と逆転写反応を行い、 cDNAを作製した。 この cDNAをもとに PCRを行つた（94°C 5sec, 72 °C 3min=5cycle, 94°C 5sec， 69 °C lOsec, 72 °C 3min=5cycle, 94°C 5sec, 66°C lOsec, 72。C 3min=40cycle)o PCR産物を 1%ァガロースゲル電気泳動 で分離し、 得られたパン ドをゲルから切り 出し抽出してから、 TA cloning (PROMEGA pGEM-T EASY)した。 得られたプラスミドの配列を決定したとこ ろ、 この遺伝子は新規であることが判明した。 得られた 1153bpからなる cDNA断片
(配列番号 10) はマウスゲノム blast検索の結果から 5つのエタソンからなり、 393bp, 130aaからなる配列番号 3および 4で示した 0RFを含んでいた。 この cDNA cloneを揷入したプラスミ ド pGEM-T(clonel69)で大腸菌コンビテントセル Escherichia coli DH5 a (Invitrogen)を开質転換した。 実施例 3
ヒト SS169遺伝子のクローニング
上記マウス SS169遺伝子の配列を基にヒトゲノムに対して blast検索を行い、 マ ウスのエタソン 2および 3と高い相同性を示す配列が存在することを見出した。 こ の配列を基に 5' -RACEプライマー （GACTGTGGGTGTTGACTGCACATCTATG；配列番号 11) および 3' - RACEプライマー （CTGATCTTTCACGAGATGCTGGACTGGA；配列番号 12) を設計 し、 5，- RACE, 3' -RACEを実施 （ clontech SMART™ RACE cDNA amplification kit) した。 実験は kitの添付書に従って実施した。 Human skeletal muscle RNA(clontech)を用いてアダプターの附加と逆転写反応を行い、 cDNAを作製した。 この cDNAをもとに PCRを行った（94°C 5sec， 72°C 3min=5cycle, 9 °C 5sec, 69 °C lOsec, 72 °C 3min=5cycle, 94°C 5sec, 66 °C lOsec, 72 °C 3min=40cycle)。 PCR産物を 1% ァガロースゲル電気泳動で分離し、 得られたパン ドをゲルから切り出し抽出してから、 TA cloning (PROMEGA pGEM-T EASY)した。 得られたプラスミドの配列を決定したところ、 この遺伝子は新規であることが判 明した。 得られた 1655bpからなる cDNA断片 （配列番号 13) は 402bp、 133aaから なる配列番号 1および 2で示した 0RFを含んでいた。 この cDNA cloneを揷入したプ ラスミ ド pGEM-T (clonel69)で大腸菌コンビテントセル Escherichia coli DH5 Q; (Invitrogen)を形質転換した。 実施例 4
SS169遺伝子の発現解析
配列番号 14および 15で示したプライマーを用いて、 種々の条件下でリアルタイ ム PCR法によりマウス SS169遺伝子の発現の様子を調べた。
まず、 発現組織を調べるため、 11週齢ォス C57BL/6Jマウス各組織からトータル RNAを抽出し、 Light Cycler- Fas tart DNA Master SYBR Green 1 (Roche社） を 用いて添付のプロトコールに従い、 PCRを行った (95°C 10min、 95°C 15sec、 65°C 5sec、 72°C 15sec、 室温放置） 。 結果を図 1に示す。 マウス SS169は骨格筋 特異的に発現しており、 他にはわずかに褐色脂肪組織で発現していた。
また、 病態動物での発現を調べるため、 12週齢ォス C57BL/6Jマウス、 メス KKAy マウスおょぴ 1 1週齢ォス db/dbマウス骨格筋からトータル RNAを抽出し、 発現組 織分布の測定と同様にして発現量を測定した。 図 2に示すように、 KKAyマウスでは C57BL/6Jに比べて高い発現量を示し、 db/dbマウスにおいても高い発現量を認め た。
さらに、 食餌状態による発現変動を実施例 1で用いたトータル RNAを用いて測定 したところ、 図 3に示すように自由摂食下に比べて絶食で発現量は減少し、'再摂 責で発現量は回復していた。 実施例 5
ラット SS169遺伝子のクローニング
マウス SS169遺伝子の配列を基にラットゲノムに対して blast検索を行いマウス のェクソン 1および 2と高い相同性を示す配列 NW047356が存在することを見出した。 この配列を基に 4種の 3' -RACEプライマー （配列番号 16、 17、 18および 19) を設 計し、 3， -RACEを実施した。 実験はキッ ト（clontech SMART™ RACE cDNA amplification kit)添付書に従い実施した。 ラッ ト腓腹筋から RNA - STAT60 kit (friendswood社製）により抽出したトータル RNAを用いて逆転写反応を行い、 cDNAを作製した。 この cDNAを铸型として配列番号 20および 21に記したプライマー を用いて PCRを行い、 得られた PCR産物の配列からラット SS169遺伝子の塩基配列 (配列番号 22) を決定した。 実施例 Θ
ラット SS169遺伝子の翻織分布
配列番号 24および 25で示したプライマーを用いて、 リアルタイム PCR法により ラット SS169遺伝子の発現組織を調べた。
6週齢ォス SDラット各組織からトータル R Aを抽出し、 Light Cycler-FastStart
DNA Master SYBR Green 1 (Roche社） を用いて添付のプロトコールに従い、 PCR' を行った （95°C 10min、 95°C 15sec、 65°C 5sec、 72°C 15sec、 室温放置） 。 結 果を図 4に示す。 ラット SS169遺伝子は骨格筋特異的に発現しており、 他にはわず かに褐色脂肪組織などで発現して！/、た。 実施例 7
マウス骨格筋由来細胞株での発現変動
マウス骨格筋由来細胞株 C2C12を用いて、 分化誘導時における SS169遺伝子発現 およびィンスリンの SS169遺伝子発現に及ぼす影響を調べた。
C2C12細胞は 10%FCS添加 DMEMを用いてコラーゲンコートプレートで培養した。 細胞がコンフレントに成育した後 2%馬血清を含む DMEMに交換し分化を誘導した。 分化誘導後 0、 3、 5、 7、 10日目にトータル RNAを抽出し、 実施例 4と同様にして SS169遺伝子発現量を定量した。 結果を図 5に示す。 SS169遺伝子の発現誘導は分 化誘導後 7日目以後顕著に増大した。 一方、 インスリンの影響は、 分化誘導後 7日目の細胞の培地を種々の濃度のィ ンスリン （図 6参照） を添加した DMEMに交換し、 24時間後に細胞からトータル RNA を調製して定量した。 結果を図 6に示す。 インスリンは濃度依存的に SS169遺伝子 の発現を増大させた。 実施例 8
STZマウス骨格筋での発現変動
12時間絶食させた 10週齢ォス C57BL/6Jマウスにストレプトゾトシン （STZ) を lOOmg/kg腹腔内に投与し、 投与後 12時間給餌するということを 3回繰り返して、 STZマウスを作製した。 最終の STZ投与後 4日目に骨格筋より トータル RNAを抽出し、 実施例 4と同様にして SS169遺伝子発現量を定量した。 結果を図 7に示す。 1型糖 尿病モデルである STZマウスでは、 腓腹筋、 ひらめ筋のいずれにおいても対照マ ゥスに比べて SS169遺伝子の発現が有意に低下して!/、た。 実施例 9
SS169遺伝子安定発現細胞株の作製
C -末端に Flag- tagを付与した SS169遺伝子あるいは GFP遺伝子を揷入した発現べ クター pMXs- puroを作製し、 FuGENE6を用いてレト口ウィルスパッケージング細胞 である PlatE細胞に導入した。 遺伝子導入 48時間後にウィルス液を回収し、 C2C12 細胞および NIH3T3細胞に感染させた。 ピューロマイシン （2 /z g/ml) 添加培地で 24時間培養することによりウィルス感染細胞を選別し、 安定発現細胞株を得た。 得られた安定発現株について、 C2C12の場合は分化誘導 7 B目に培地を FCS不含培 地に交換し、 24時間後の培養上清おょぴ細胞抽出液を抗 Flag抗体を用いて免疫沈 降し、 SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、 抗 Flag抗体を用いたウェスタン プロッティングにより SS169遺伝子産物の検出を行った。 NIH3T3の場合はコンフ レントにまで培養した細胞の培地を FCS不含培地に交換し、 C2C12の場合と同様に 処理して SS169遺伝子産物の検出を行った。 図 8に示すように、 SS169遺伝子産物 は大部分培養上清中に存在し、 C2C12および NIH3T3細胞において SS169は細胞外に 分泌されることがわかつた。 実施例 1 0
SS169発現アデノウィルスベクターの作製
マウス SS169遺伝子 cDNAを pShutle- CMVベタターに組み込み、 E1-E3を欠損した 5 型アデノウィルスゲノムを含む pAdEasyと共に大腸菌にトランスフエクションし、 相同組換えによりウィルスベクターを作製した。 このウィルスベクターを 293細 胞に導入してマウス SS169遺伝子発現アデノウイルスを作製した。 対照として lacZ遺伝子発現アデノウィルスを同様の方法で作製した。 得られたウィルスをマ ウス尾静脈から種々の力価で接種し、 感染させた。 図 9にウィルス感染マウス肝 臓での SS169遺伝子の発現量、 図 10に感染後の体重および摂食量の変化、 図 11お ょぴ 12に副睾丸周囲脂肪おょぴ肝臓の重量、 図 13に血糖値、 血中インスリン値、 血中遊離脂肪酸濃度、 血中トリグリセリド濃度の測定結果をそれぞれ示す。 なお、 これらの図中で、 低力価、 中力価、 高力価はそれぞれウィルスをマウスに 2 χ 107、 6 x l0\ 2 x l08pfu接種した場合を示す。 SS169遺伝子発現ウィルス感染マウスで は、 力価依存的に肝臓での SS169遺伝子発現量が増大した （図 9) 。 高力価で SS169遺伝子発現ゥィルスに感染させたマウスは体重およぴ摂食量の減少傾向を 示した （図 10) 。 また、 中力価およぴ高カ価で SS169遺伝子発現ウィルスに感染 させたマウスでは、 副睾丸周囲脂肪の有意な減少 （図 11) 、 肝重量の有意な増カロ (図 12) およぴ血糖値の有意な減少 （図 13) が認められた。 実施例 1 1
骨格筋細胞の糖取り込み活性に及ぼす影響
C2C12細胞を用いて SS169の糖取り込みに及ぼす影響を調べた。 分化誘導 5日目 の C2C12細胞の培地を FCS不含 DMEMに交換し、 ここに SSI69の Flag~tag体を 0. 5 μ g/ml添加し 5時間培養した。 その後 30分間インスリン （ΙΟΟηΜ) 刺激を加え、 3H-2- deoxy- D~glucoseの細胞内への取り込み活性を既報 （Am. J. Physiol. 276, E849-E855, 1999) に従いシンチレーシヨンカウンターで測定した。 なお、 SS169 Flag- tag体は実施例 9記載の SS169安定発現 C2C12株の培養上清より抗 Flag抗体力 ラムを用いて精製したものを用いた。 糖取り込みの測定結果を図 1 Aに示す。 C2C12におけるィンスリン刺激時の糖取り込みは SS169添加により抑制された。 ま た、 インスリン刺激時の C2C12細胞での Glut4 (インスリン依存的糖輸送担体） 、 Glutl (インスリン非依存的糖輸送担体） 、 hexokinase II (グルコースをリン 酸化して遊離グルコース濃度を減少させ、 細胞内への糖取り込みを促進する） 遺 伝子の発現量を RT- PCRにより測定したが、 これらの発現量には SS169の添加によ る変化は認められなかった （図 14B) 。 このことから、 これらの遺伝子の発現が 低下したために糖取り込みが抑制されたものではなく、 SSI69がィンスリン作用 ' に影響して糖取り込みが抑制されたと考えられる。 実施例 1 2
骨格筋細胞のグリコーゲン合成に及ぼす影響
実施例 11と同様に培養し、 SS169で処理した C2C12細胞を用いて SS169のダリコ 一ゲン合成に及ぼす影響を調べた。 ダリコーゲン合成は D- C1-1 4 C] glucoseの細胞 内グリコーゲン画分への取り込みを指標に既報 （J. Biol. Chem. 274, 24202 - 21210, 1999) に従って測定した。 結果を図 15に示す。 C2C12細胞におけるグリコ 一ゲン合成は SS169添加により抑制された。 産業上の利用可能性
SS169は食餌状態および糖尿病、 肥満状態において骨格筋細胞で発現する分泌 もしくは膜蛋白質であるので、 骨格筋細胞の分化や代謝機能の異常に関連する疾 患の予防 ·治療剤または診断剤として、 あるいは当該疾患の予防 ·治療に有効な 医薬品候補化合物のスクリ一ユングのためのツーノレとして有用である。 本出願は、 日本で出願された特願 2003— 171188、 特願 2003-3 91047、 特願 2004-23557及ぴ特願 2004— 30988を基礎と しており、 それらの内容は本明細書に全て包含されるものである。 配列表フリーテキスト
〔配列番号： 5〕
マウスひらめ筋由来 cDNAを増幅するためのプライマーとして機能すべく設 計されたオリゴヌクレオチド。
〔配列番号： 6〕
マウスひらめ筋由来 cDNAを增幅するためのプライマーとして機能すべく設 計されたォリゴヌクレオチド。
〔配列番号： 8〕
全長マウス SS169 cDNAを増幅するためのプライマーとして機能すベく設計 されたオリゴヌクレオチド。
〔配列番号： 9〕
全長マウス SS169 cDNAを増幅するためのプライマーとして機能すべく設計 されたォリゴヌクレオチド。
〔配列番号： 1 1〕
全長ヒト SS169 cDNAを増幅するためのプライマ一として機能すべく設計さ れたオリゴヌクレオチド。
〔配列番号： 12〕
全長ヒト SS169 cDNAを増幅するためのプライマ一として機能すべく設計さ れたオリゴヌクレオチド。 画番号： 13〕
(塩基番号： 763)
は未同定の塩基を表す。 (塩基番号： 965) nは未同定の塩基を表す。
(塩基番号： 1032) nは未同定の塩基を表す。 (塩基番号： 1033) nは未同定の塩基を表す。 (塩基番号： 1043) nは未同定の塩基を表す。 (塩基番号： 1075) nは未同定の塩基を表す。 (塩基番号： 1080) nは未同定の塩基を表す。
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(塩基番号： 1277) nは未同定の塩基を表す。
(塩基番号： 1280)
nは未同定の塩基を表す。
(塩基番号： 1291)
nは未同定の塩基を表す。
(塩基番号： 1301)
nは未同定の塩基を表す。
(塩基番号： 1328)
nは未同定の塩基を表す。
(塩基番号： 1347)
nは未同定の塩基を表す。
(塩基番号： 1366)
nは未同定の塩基を表す。
(塩基番号： 1454)
nは未同定の塩基を表す。
(塩基番号： 1553)
nは未同定の塩基を表す。
(塩基番号 : 1580)
nは未同定の塩基を表す。
(塩基番号： 1625)
nは未同定の塩基を表す。
〔配列番号： 14〕
マウス SS169 c D NA断片を増幅するためのプライマーとして機能すべく設計 されたオリゴヌクレオチド。
〔配列番号： 15〕
マウス SS169 cDNA断片を増幅するためのプライマーとして機能すべく設計 されたォリゴヌクレオチド。
〔配列番号： 16〕
全長ラット SS169 c D N Aを増幅するためのプライマーとして機能すベく設計 されたォリゴヌクレオチド。
〔配列番号： 17〕
全長ラット SS169 cDNAを増幅するためのプライマーとして機能すべく設計 されたオリゴヌクレオチド。
〔配列番号： 18〕
全長ラット SS169 cDNAを増幅するためのプライマーとして機能すべく設計 されたォリゴヌクレオチド。
〔配列番号： 19〕
全長ラット SS169 cDNAを増幅するためのプライマ一として機能すべく設計 されたォリゴヌクレオチド。
〔配列番号： 20〕
ラット腓腹筋由来 cDNAを増幅させるためのプライマーとして機能すべく設 計されたォリゴヌクレオチド。
〔配列番号： 21〕
ラット腓腹筋由来 cDNAを増幅させるためのプライマーとして機能すべく設 計されたオリゴヌクレオチド。
〔配列番号： 24〕
ラット SS169 cDNA断片を増幅させるためのプライマーとして機能すぺく設 計されたオリゴヌクレオチド。
〔配列番号： 25〕
ラット SS169 cDNA断片を増幅させるためのプライマ一として機能すべく設 計されたオリゴヌクレオチド。

Claims

請求の範囲
1 . 配列番号： 2または 4で表されるアミノ酸配列中、 アミノ酸番号 1以降のァ ミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはそ の塩。
2 . 配列番号： 2または 4で表されるアミノ酸配列中、 アミノ酸番号 1以降のァ ミノ酸配列を含有する請求項 1記載の蛋白質またはその: &
3 . 請求項 1記載の蛋白質の部分ペプチドまたはその塩。
4. 請求項 1記載の蛋白質をコードする塩基配列を含有する核酸。
5 . 配列番号： 1または 3で表される塩基配列中、 塩基番号 8 8以降の塩基配列 を含有する請求項 4記載の核酸 （但し、 該核酸が R NAの場合、 該塩基配列中記 号！;で示される塩基はゥリジンに置き換える） 。
6 . 配列番号： 2または 4で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一の アミノ酸配列を含有するポリべプチドをコ一ドする塩基配列またはその一部を含 有する核酸。
7. 請求項 4記載の核酸を含有する組換えべクタ一。
8 . 請求項 7記載の組換えべクターで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換 体。
9 . 請求項 8記載の形質転換体を培養し、 請求項 1記載の蛋白質またはその塩を 生成せしめることを特徴とする、 該蛋白質またはその塩の製造方法。
1 0 . 請求項 1記載の蛋白質もしくは請求項 3記載の部分ペプチドまたはその塩 を含有してなる医薬。
1 1 . 請求項 4記載の核酸を含有してなる医薬。
1 2 . 骨格筋細胞の分化および/または代謝異常が関与する疾患の予防'治療剤 である請求項 1 0または 1 1記載の医薬。
1 3 . 代謝異常が糖 ·脂質代謝異常である請求項 1 2記載の医薬。
1 4. 請求項 1記載の蛋白質もしくは請求項 3記載の部分ペプチドまたはその塩、 あるいは請求項 4記載の核酸の有効量を哺季し動物に投与することを含む、 骨格筋 細胞の分化および Zまたは代謝異常が関与する疾患の予防 ·治療方法。
1 5 . 代謝異常が糖 ·脂質代謝異常である請求項 1 4記載の方法。
1 6 . 骨格筋細胞の分ィ匕および Zまたは代謝異常が関与する疾患の予防 '治 の製造のための、 請求項 1記載の蛋白質もしくは請求項 3記載の部分ペプチドま たはその塩、 あるいは請求項 4記載の核酸の使用。
1 7. 代謝異常が糖'脂質代謝異常である請求項 1 6記載の使用。
1 8. 請求項 6記載の核酸を含有してなる診断薬。
1 9 . 請求項 1記載の蛋白質もしくは請求項 3記載の部分ペプチドまたはその塩 に対する抗体。
2 0. 請求項 1 9記載の抗体を含有してなる診断薬。
2 1 . 骨格筋細胞の分化および Zまたは代謝異常が関与する疾患の診断用である 請求項 1 8または 2 0記載の診断薬。
2 2. 請求項 1 9記載の抗体を含有してなる医薬。
2 3 . 配列番号： 2または 4で表されるァミノ酸配列と同一または実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するポリべプチドをコ一ドする塩基配列と相補的な塩基配 列またはその一部を含有する核酸。
2 4. 請求項 2 3記載の核酸を含有してなる医薬。
2 5 . 骨格筋細胞の分化および Zまたは代謝異常が関与する疾患の予防 ·治療剤 である請求項 2 2または 2 4記載の医薬。
2 6 . 代謝異常が糖 ·脂質代謝異常である請求項 2 5記載の医薬。
2 7 . 請求項 1 9記載の抗体または請求項 2 3記載の核酸の有効量を哺乳動物に 投与することを含む、 骨格筋細胞の分化および/または代謝異常が関与する疾患 の予防 .治療方法。 2 8， 代謝異常が糖 ·脂質代謝異常である請求項 2 7記載の方法。
2 9 . 骨格筋細胞の分化および Zまたは代謝異常が関与する疾患の予防 ·治療剤 の製造のための、 請求項 1 9記載の抗体または請求項 2 3記載の核酸の使用。
3 0. 代謝異常が糖 .脂質代謝異常である請求項 2 9記載の使用。
3 1 . 請求項 1記載の蛋白質もしくは請求項 3記載の部分ペプチドまたはその塩 を用いることを特徴とする、 骨格筋細胞の分ィ匕おょぴノまたは代謝異常が関与す る疾患の予防 ·治療物質のスクリ一ユング方法。
3 2. 代謝異常が糖 ·脂質代謝異常である請求項 3 1記載のスクリーニング方法。
3 3 . 請求項 1記載の蛋白質もしくは請求項 3記載の部分ペプチドまたはその塩 を含むことを特徴とする、 骨格筋細胞の分化および/または代謝異常が関与する 疾患の予防 ·治療物質のスクリ一ユング用キット。
3 4 . 代謝異常が糖 ·脂質代謝異常である請求項 3 3記載のスクリ一ニング用キ ッ卜。
3 5 . 請求項 4記載の核酸を用いることを特徴とする、 骨格筋細胞の分化おょぴ /"または代謝異常が関与する疾患の予防 ·治療物質のスクリーニング方法。
3 6 . 代謝異常が糖 ·脂質代謝異常である請求項 3 5記載のスクリーニング方法。
3 7 . 請求項 4記載の核酸を含むことを特徴とする、 骨格筋細胞の分化および Z または代謝異常が関与する疾患の予防 ·治療物質のスクリーニング用キット。
3 8 . 代謝異常が糖'脂質代謝異常である請求項 3 7記載のスクリーニング用キ ッ卜。
3 9 . 請求項 1記載の蛋白質またはその塩の調節薬を含有してなる、 骨格筋細胞 の分ィ匕および/または代謝異常が関与する疾患の予防 ·治療剤。
4 0 . 代謝異常が糖 ·脂質代謝異常である請求項 3 9記載の予防 ·治療剤。
4 1 . 請求項 1記載の蛋白質またはその塩の調節薬の有効量を哺乳動物に投与す ることを含む、 骨格筋細胞の分化および Zまたは代謝異常が関与する疾患の予 防 .治療方法。 4 2 . 代謝異常が糖 ·脂質代謝異常である請求項 4 1記載の方法。
4 3 . 骨格筋細胞の分化およびノまたは代謝異常が関与する疾患の予防 ·治療剤 の製造のための、 請求項 1記載の蛋白質またはその塩の調節薬の使用。 4 4. 代謝異常が糖 ·脂質代謝異常である請求項 4 3記載の使用。
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