WO2004022086A1 - 副腎皮質ホルモン分泌調節剤 - Google Patents

副腎皮質ホルモン分泌調節剤 Download PDF

Info

Publication number
WO2004022086A1
WO2004022086A1 PCT/JP2003/011160 JP0311160W WO2004022086A1 WO 2004022086 A1 WO2004022086 A1 WO 2004022086A1 JP 0311160 W JP0311160 W JP 0311160W WO 2004022086 A1 WO2004022086 A1 WO 2004022086A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
amino acid
acid sequence
seq
salt
peptide
Prior art date
Application number
PCT/JP2003/011160
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Shoji Fukusumi
Shuji Hinuma
Original Assignee
Takeda Pharmaceutical Company Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takeda Pharmaceutical Company Limited filed Critical Takeda Pharmaceutical Company Limited
Priority to AU2003261874A priority Critical patent/AU2003261874A1/en
Publication of WO2004022086A1 publication Critical patent/WO2004022086A1/ja

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/38—Drugs for disorders of the endocrine system of the suprarenal hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
    • G01N2333/723—Steroid/thyroid hormone superfamily, e.g. GR, EcR, androgen receptor, oestrogen receptor

Definitions

  • the present invention relates to a novel secretory protein capable of binding to the AQ27 receptor or a corticosteroid secretion regulator containing a polynucleotide encoding the same.
  • a novel secretory protein capable of binding to the AQ27 receptor or a corticosteroid secretion regulator containing a polynucleotide encoding the same.
  • the present invention provides a novel use of the AQ27 receptor and a novel secretory protein capable of binding thereto, that is, a use as an adrenocorticotropic secretion regulator and the like. Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, succeeded in obtaining four kinds of DNAs encoding novel peptides containing secretory signals from human whole brain and the like. However, they found that a secretory peptide was encoded in this DNA. Furthermore, the present inventors have found that these secretory peptides unexpectedly bind to the AQ27 receptor and exhibit an action of promoting secretion of corticosteroids. The present inventors have further studied based on these findings, and as a result, have completed the present invention.
  • amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 7 (1) the agent described above,
  • Amino acid sequence of the 104th to 133rd amino acids amino acid sequence of the 108th to 133rd amino acids, amino acid sequence of the 109th to 133rd amino acids, 11th amino acid sequence 1st to 13th amino acid sequence, 1st to 15th to 13th amino acid sequence, 1st to 19th to 13th amino acid sequence, 1st to 24th to 13th amino acid sequence
  • N-terminal glutamine residue (G in) of the peptide consisting of the 9th to 13th amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is pyrrodal.
  • the agent according to (5) which is a preventive or therapeutic agent for hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain or obesity;
  • a corticosteroid secretion regulator comprising a secretory protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding a partial peptide thereof;
  • amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 7 (7) the agent described above,
  • low aldosteronism comprising a secretory protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding a partial peptide thereof, Cortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain, obesity, Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, Diagnostic agent for aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, stomach / duodenal ulcer or irritable bowel syndrome,
  • a secretory protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, an amide or an ester thereof, or an antibody against a salt thereof; Adrenocortical hormone secretion regulator,
  • the agent according to (14), which is a corticosteroid secretion inhibitor [16] Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocortical sting hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, nervous appetite
  • a secretory protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof, or an antibody thereof to a salt thereof
  • a corticosteroid secretion regulator comprising an antisense polynucleotide comprising:
  • a secretory protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a nucleotide sequence complementary to a polynucleotide encoding a partial peptide thereof or the same; Hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain, lupus Man, Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa Diagnostics for insomnia, insomnia, stomach, duodenal ulcer or irritable bowel syndrome,
  • a corticosteroid secretion regulator comprising a compound or a salt thereof,
  • a secretory protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, a amide thereof, a compound inhibiting the function of an ester thereof or a salt thereof, or A corticosteroid secretion inhibitor comprising the salt thereof,
  • a secretory protein comprising the amino acid sequence of 7, a partial peptide thereof, a compound thereof which promotes the expression of the amide or its ester or a salt thereof, or a corticosteroid secretagogue comprising a salt thereof;
  • a secretory protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, a compound thereof which inhibits the expression of an amide or an ester thereof, or A corticosteroid secretion inhibitor comprising the salt thereof,
  • the agent according to [30] which is a prophylactic or therapeutic agent for anorexia, insomnia, stomach, duodenal ulcer, or irritable bowel syndrome.
  • AQ27 receptor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, or a partial peptide thereof Or a corticosteroid secretion modulator comprising a salt thereof,
  • AQ27 receptor or a partial peptide thereof comprising an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13
  • a corticosteroid secretion regulator comprising a polynucleotide encoding
  • AQ27 receptor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13;
  • a corticosteroid hormone secretion modulator comprising an antibody against a peptide or a salt thereof;
  • AQ27 receptor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13; Hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain, obesity, Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenal gland containing antibodies to the peptide or its salts Corticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, stomach 'duodenal ulcer or Irritable bowel disease JP2003 / 011160
  • AQ27 receptor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, or a part thereof.
  • a corticosteroid secretion regulator comprising an antisense polynucleotide comprising a base sequence complementary to or almost part of a polynucleotide encoding a peptide;
  • AQ27 receptor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, or a part thereof.
  • AQ27 receptor containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, or a partial peptide thereof Or a corticosteroid secretion regulator comprising a compound that promotes or inhibits the function of a salt thereof or a salt thereof;
  • AQ27 receptor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13; A compound or a salt thereof that promotes the function of the peptide or a salt thereof.
  • PC Kasumi 11160 containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13; A compound or a salt thereof that promotes the function of the peptide or a salt thereof.
  • AQ27 receptor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13;
  • a corticosteroid secretion inhibitor comprising a compound that inhibits the function of a peptide or a salt thereof or a salt thereof;
  • AQ27 receptor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, or a partial peptide thereof Or a corticosteroid secretion regulator comprising a compound that promotes or inhibits the expression of a salt thereof or a salt thereof,
  • AQ27 receptor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, or a partial peptide thereof
  • a corticosteroid secretagogue comprising a compound that promotes the expression of a salt thereof or a salt thereof;
  • AQ27 receptor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, and a part thereof.
  • a corticosteroid secretion inhibitor comprising a compound or a salt thereof that inhibits the expression of a peptide or a salt thereof,
  • SEQ ID NO: a secreted protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by 1, a partial peptide thereof, an amide or an ester thereof or a salt thereof and (2) SEQ ID NO: : 9, AQ27 receptor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, binding to a partial peptide or a salt thereof
  • a corticosteroid secretion regulator comprising a compound or a salt thereof that alters
  • AQ27 receptor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, or a portion thereof
  • An adrenal cortex hormone secretagogue comprising an agonist for the peptide or its salt
  • the agent according to (58) which is a preventive or therapeutic agent for hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain or obesity;
  • AQ27 receptor comprising the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, a partial peptide thereof or A corticosteroid secretion inhibitor comprising an antagonist to its salt,
  • AQ27 receptor containing an amino acid sequence a compound that promotes the function of a partial peptide or a salt thereof or a salt thereof, 8SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13
  • AQ27 receptor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the AQ27 receptor a compound that promotes the expression of a partial peptide or a salt thereof or a salt thereof, or SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or Administer an effective amount of an agonist against the AQ27 receptor or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13.
  • Antibody containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • An antisense polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to a polynucleotide encoding a secretory protein or a partial peptide thereof or a nucleotide sequence complementary to the polynucleotide encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • a method for inhibiting secretion of adrenocortical hormone or (ii) Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocortical stimulating hormone, which comprises administering an effective amount of an antagonist to AQ27 receptor or a salt thereof containing Producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, stomach 'duodenal ulcer or irritable bowel Prevention and treatment of symptoms
  • a secreted protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, an amide or an ester thereof, or a salt thereof for producing a therapeutic agent (2) a polynucleotide encoding a secretory protein or a partial peptide thereof having an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; (3) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • AQ27 receptor containing the same amino acid sequence, its partial peptide or its salt, ⁇ identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 A polynucleotide encoding an AQ27 receptor or a partial peptide thereof having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, or the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 or AQ27 receptor containing substantially the same amino acid sequence, a compound or a salt thereof which promotes the function of a partial peptide or a salt thereof, 8SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: AQ27 receptor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by 13, a compound that promotes the expression of a partial peptide or a salt thereof, or a salt or a sequence number thereof: 9.
  • adrenocortical hormone secretion inhibitor or (ii) Cushing's disease, Tushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance , Congenital Prevention and treatment of adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, stomach, duodenal ulcer or irritable bowel syndrome.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 an antibody against a secretory protein containing a substantially identical amino acid sequence, a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof, or a salt thereof, 2 an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • An antisense polynucleotide comprising a base sequence complementary to a polynucleotide encoding a secretory protein or a partial peptide thereof containing an amino acid sequence or a part thereof, 3 an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; Secreted proteins containing the same or substantially the same amino acid sequence, their partial peptides, and their amides Or a compound that inhibits the function of an ester or a salt thereof, or a salt thereof, ⁇ a secreted protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, A compound or a salt thereof that inhibits the expression of an amide or an ester thereof or a salt thereof, which is the same as or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13.
  • AQ27 receptor containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, an antibody against a partial peptide thereof or a salt thereof, ⁇ identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 Contains a nucleotide sequence that is complementary to a polynucleotide encoding the AQ27 receptor or a partial peptide thereof or a portion thereof AQ27 receptor containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 A compound that inhibits the function of the human body, its partial peptide or a salt thereof, or a salt thereof; ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ an amino acid identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 A compound which inhibits the expression of an AQ27 receptor containing the sequence, a partial peptide thereof or a salt thereof, or a salt
  • Secretory protein containing 16 amino acid sequences, its partial peptide, its amide or its ester or its salt (or) SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or amino acid represented by SEQ ID NO: 13 AQ27 receptor having an amino acid sequence identical or substantially identical to an acid sequence, a partial peptide or a salt thereof, a method for screening for a corticosteroid secretion regulator, [67] sequence Secretory protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by No.
  • SEQ ID NO: 9 AQ27 containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 Receptor, its partial peptide, or-Kit K for screening grayed adrenocortical hormone secretion modulator, characterized in that a salt thereof
  • SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 1 wherein a test compound is administered to a non-mammal, and the concentration of adrenocortical hormone or male hormone in blood is measured.
  • AQ27 receptor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence, or a salt thereof.
  • a method for screening for an agonist or antagonist to the AQ27 receptor comprising measuring and comparing blood levels of adrenocortical hormone or male hormone in the method.
  • an AQ27 receptor containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13;
  • a secretory protein comprising, in a partial peptide or a salt thereof, an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, JP2003 / 011160
  • a compound having the same or substantially the same amino acid sequence as AQ27 receptor or a salt thereof as an active compound or a test compound was identified as SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 1.
  • a secretory protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, an amide or an ester thereof, or a salt thereof.
  • AQ2 containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 7 receptor or its Agonist or antagonist screening method for salt,
  • Test compound eg, a secreted protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, -amino acid or an ester thereof, or an ester thereof
  • AQ27 receptor having an amino acid sequence identical or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 with a salt thereof, a partial peptide thereof or a salt thereof AQ2 comprising the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13).
  • SEQ ID NO: 9 characterized in that the activity of promoting secretion of adrenocortical hormone or the activity of promoting secretion of androgen when contacted with cells containing 7 receptor is measured.
  • No.: 1 1 or SEQ ID NO: 1 3 A Q 2 7 receptor or screening method Agonisuto or antagonist to a salt thereof and containing not Amino acid sequence identical or substantially identical Amino acid sequence represented by,
  • an AQ27 receptor having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 or a salt thereof;
  • An activating compound or a salt thereof eg, a secreted protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, an amide or an ester thereof, or a salt thereof
  • Contacting a cell containing an AQ 27 receptor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 or a salt thereof (Ii) AQ27 containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13
  • a compound that activates the body or a salt thereof, or a salt thereof eg, a secreted protein containing the same or substantially the same amino acid sequence
  • Test compound eg, secretory protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, its partial peptide, its amide or its ester, or its salt and its sequence
  • No. 9 SEQ ID NO: 11 or AQ27 receptor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13;
  • a salt thereof is administered to a non-mammal, and the concentration of corticosteroid or male hormone in blood is measured.
  • SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: An agonist or antagonist to the AQ27 receptor or a salt thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by 13 Screening method, and [75] (i) AQ27 containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13.
  • a compound that activates the receptor or a salt thereof, or a salt thereof eg, a secreted protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, an amide thereof or (Ester or a salt thereof) to a non-human mammal, and (ii) an amino acid identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13.
  • a compound or a salt thereof that activates the AQ27 receptor containing the sequence or a salt thereof (eg, the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1)
  • Secretory protein comprising the amino acid sequence, its partial peptide, Amid or its ester or its salt
  • a test compound are administered to a non-human mammal, and the concentrations of adrenocortical hormone or male hormone in the blood are measured and compared.
  • a method for screening an agonist or an antagonist for an AQ27 receptor or a salt thereof containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 provide.
  • FIG. 1 shows the DNA sequence of the human secretory protein.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of the human secretory protein.
  • FIG. 3 shows the DNA sequence of rat secretory protein.
  • FIG. 4 shows the amino acid sequence of the rat secretory protein.
  • FIG. 5 shows a comparison diagram of the amino acid sequences of human secretory protein and rat secretory protein.
  • Figure 6 is novel human peptide: Gly - Gly - Phe - Ser - Phe - Arg - Phe-NH 2 ( SEQ ID NO: 1 of the first 27-th to 1 33 th) and a novel human type peptide:
  • Glu-His-Ala-Gly- Cys-Arg-Phe-Arg-Phe-NH 2 ( SEQ ID NO: # 80 th to 88 th 1)
  • Human AQ 27 receptor Contact Yopi human OT 7 T 0 22 receptor 2 shows the activity (luciferase activity) for increasing the expression level of a reporter gene in HEK293 cells that do not express E. coli.
  • the vertical axis indicates luciferase activity (cps).
  • the horizontal axis indicates the peptide concentration ( ⁇ ).
  • F SK indicates forskolin.
  • EHAGCR FRF-NH 2 is peptide Glu- His-Ala- Gly- Cys- Arg- Phe- Arg- Phe- NH 2: The (SEQ ID No. 8 0 th to 88 th 1), GGF S FRF peptide
  • Gly- Gly- Phe- Ser- Phe- Arg- Phe- NH 2 ( SEQ ID NO: first 27-th to 1 3 3 th 1) shows a. base indicates the case where no peptide is added.
  • Figure 7 is novel human peptide: Gly- Gly- Phe- Ser_Phe- Arg- Phe- negation 2 (SEQ ID NO: 1 of the first 27-th to 1 3 3rd) and a novel human type peptide:
  • Glu-His-Ala-Gly- Cys-Arg-Phe-Arg-Phe-NH 2 SEQ ID NO: 1 of the 80 th to 88 th human AQ 27 HE K of the receptor was expressed transiently in The activity of increasing the reporter gene expression level (luciferase activity) on 293 cells is shown.
  • the vertical axis is Shows luciferase activity (cps).
  • the horizontal axis indicates the concentration of the peptide ( ⁇ ).
  • F SK indicates forskolin.
  • Glu-His-Ala-Gly- Cys-Arg-Phe-Arg-Phe-NH 2 (SEQ ID No. 80 to No. 88 th 1), GGFSFRF peptide Gly- Gly- Phe- Ser- Phe- Arg- Phe-NH 2 (sequence number: 127 to 133). base indicates the case of calories without peptide.
  • FIG. 8 shows the DNA sequence of the mouse secretory protein.
  • FIG. 9 shows the amino acid sequence of a mouse secretory protein.
  • Figure 10 is a new human peptide: Arg_Lys-Lys-Gly_Gly- Phe- Ser- Phe-Arg- Phe- NH 2: to express human AQ27 receptor (SEQ ID NO: 1 # 124 th to 1 33 th)
  • the activity of increasing the reporter gene expression level (no luciferase activity) for HEK293 cells not present is shown.
  • the vertical axis indicates luciferase activity (cps).
  • the horizontal axis indicates the peptide concentration (// M).
  • FSK indicates forskolin.
  • RKK GGF S FR F- NH 2 is peptide Arg- Lys- Lys- Gly- Gly- Phe- Ser- Phe- Arg- Phe- NH 2: (SEQ ID No. 124 to No. 1 33 th 1). base indicates the case without peptide addition.
  • Figure 1 1 is novel human peptide: Arg-Lys- Lys - Gly - Gly-Phe-Ser- Phe- Arg- Phe- NH 2 ( SEQ ID NO: # 124 th to 1 33 th 1) human AQ27 receptor
  • the activity of increasing the reporter gene expression level (luciferase activity) in HEK293 cells in which the body was expressed is shown.
  • the vertical axis indicates luciferase activity (cps).
  • the horizontal axis indicates the peptide concentration (M).
  • F SK indicates forskolin.
  • RKKGGF S FRF-NH 2 is peptide Arg-Lys- Lys-Gly- Gly- Phe- Ser- Phe- Arg- Phe_NH 2: shows a (sequence No. 124 to No. 133 th 1). base indicates the case of calories without peptide.
  • the vertical axis indicates the cAMP concentration (pmol).
  • the horizontal axis represents the concentration of the peptide in 1 gM.
  • F SK— indicates the case without forskolin, and F SK + indicates the case with forskolin.
  • RKKGGF S FRF-NH 2 is human-type peptide: Arg- Lys-Lys- Gly- Gly- Phe- Ser-Phe- Arg- Phe- NH 2 ( SEQ ID NO: 1 124th to 133th).
  • F SK- indicates the case without forskolin, and FSK + indicates the case with forskolin.
  • RKKGGF S FRF- H 2 is human peptide: Arg- Lys- Lys- Gly- Gly- Phe- Ser_Phe- Arg- Phe- NH 2 ( SEQ ID NO: first 24-th to 133 th 1) shows a.
  • Figure 14 shows the intracellular calcium Umuion promoting release activity in AQ 27 expressing C HO cells GGF S FRF-NH 2.
  • F Luorescence the vertical axis represents the fluorescence intensity (c P s). The horizontal axis indicates time (second).
  • GGFSFRF - NH 2 is human peptide: Gly-Gly-Phe-Ser -Phe-Arg-Phe-NH 2: (SEQ ID NO: 127 th ⁇ .133 th 1).
  • o, mouth, and ⁇ indicate that the concentrations of the added GGF S FRF-NH 2 were 0 ⁇ , 1 ⁇ , and 10, respectively.
  • FIG. 15 shows the activity of RKKGGF S FRF-NH 2 for promoting intracellular calcium ion release in AQ27-expressing CHO cells. Fluorescence on the vertical axis indicates the fluorescence intensity (cps). The horizontal axis indicates time (seconds). ? 1 1 ⁇ 1:00 3 1 - Saku 2 human type peptide: Arg- Lys- Lys-Gly- Gly- Phe- Ser- Phe- Arg- Phe- NH 2 ( SEQ ID NO: the 124 th 1 1 to 33). ⁇ , mouth, and ⁇ indicate that the concentrations of the added GGF S FRF-NH 2 were 0 ⁇ , 1 and 10 ⁇ , respectively.
  • Figure 16 shows the new humanized peptide:
  • T1-F 26- NH 2 is novel human peptide:
  • Figure 17 shows the novel human peptide:
  • Figure 18 is a new human peptide Py r 1 -F 43-NH 2 5AQ27 expression C PT / JP2003 / 011160
  • Fig. 4 shows the activity of mobilizing calcium ions in HO cells.
  • F 1 uorescence on the vertical axis indicates fluorescence intensity (cps).
  • the horizontal axis indicates time (seconds).
  • the mouth indicates the case without peptide addition, and gardens, ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ and ⁇ indicate the concentration of the added peptide in 1 ogM.
  • Figure 19 is a new human peptide on intracellular calcium ion concentration changes in the mo ck CHO cells: shows the results of examining the effect of Py rl- F43- NH 2.
  • Fluorescence on the vertical axis indicates fluorescence intensity (cps).
  • the horizontal axis indicates time (seconds).
  • the mouth indicates the case without peptide addition, and Peng, ⁇ , ⁇ , ⁇ , and 0 indicate the concentration of the added peptide in 1 ogM, and are 5, 6, 7, 8, and 9, respectively. And 10 are shown.
  • Figure 22 shows a novel human peptide
  • Ala-Ser-Gln-Pro-Gln-Ala-Leu-Leu-Val-Ile-Ala-Arg-Gly-Leu-Gln-Thr-Ser-Gly-Arg-Glu-His-Ala-Gly-Cys-Arg 2 shows the activity of increasing the reporter gene expression level (luciferase activity) in HEK 293 cells that do not express the human AQ27 receptor of -Phe-NH 2 (SEQ ID NO: 1 at positions 61 to 86).
  • the vertical axis represents luciferase activity (cps), and the horizontal axis represents the concentration of the peptide in 1 gM.
  • F SK— indicates the case without forskolin, and F SK + indicates the case with forskolin added.
  • A1—F 28—NH 2 is a novel human peptide:
  • Ala-Ser-Gln-Pro-Gln-Ala-Leu-Leu-Val-Ile-Ala-Arg-Gly-Leu-Gln-Thr-Ser-Gly-Arg-Glu-His-Ala-Gly-Cys-Arg 2 shows the activity (luciferase activity) for increasing the expression level of a reporter gene in HEK 293 cells in which -Phe-NH 2 (the 6th to 86th amino acids of SEQ ID NO: 1) human AQ27 receptor was expressed.
  • F 1 uorescence on the vertical axis indicates luciferase activity (cps), and the horizontal axis indicates peptide concentration in 1 ogM.
  • F SK- indicates the case without fork / scolin
  • F SK + indicates the case with forskolin-added kamu.
  • a 1—F 28 _NH 2 is a novel human peptide:
  • FIG. 24 shows the activity of mobilizing intracellular calcium ions in CHO cells expressing AQ27 by the novel human peptide A 1 -F 28 —NH 2 .
  • F 1 uorescence on the vertical axis indicates the fluorescence intensity (cps).
  • the horizontal axis indicates time (seconds). * Indicates the case where no peptide was added, and Sono, Hata, ⁇ , ⁇ , ⁇ , and ⁇ indicate the concentration of the peptide in 1 ogM. Indicates 0.
  • Figure 25 shows the results of examining the influence of the novel human type peptide A 1- F 28-NH 2 on the intracellular calcium ion concentration changes in the mo ck CHO cells. Fluorescence on the vertical axis indicates fluorescence intensity (cps). The horizontal axis shows time (seconds). * Indicates the absence of peptide, ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ , and ⁇ indicate the concentration of peptide in 1 gM, and indicate 5, 6, 7, 8, 9, and 10, respectively. .
  • FIG. 28 shows the DNA sequence of a pest-type secretory protein.
  • FIG. 29 shows the amino acid sequence of the secretory protein.
  • FIG. 30 shows the nucleotide sequence of rat AQ27 receptor.
  • FIG. 31 shows the amino acid sequence of the rat AQ27 receptor.
  • FIG. 32 shows the nucleotide sequence of mouse AQ27 receptor.
  • FIG. 33 shows the amino acid sequence of the mouse 027 receptor.
  • FIG. 34 shows the amino acid sequence homology of human AQ27 receptor (A), rat AQ27 receptor (B) and mouse AQ27 receptor (C).
  • FIG. 35 shows the tissue distribution of AQ27 receptor mRNA in humans.
  • FIG. 36 shows the tissue distribution of AQ27 receptor mRNA in rats. I in the figure indicates infant (fetus).
  • FIG. 37 shows the tissue distribution of rat secretory protein mRNA in rats.
  • FIG. 38 shows the tissue distribution of human secretory protein mRNA in humans.
  • FIG. 39 shows the distribution of expression of AQ27 mRNA in rat brain by the in situ hybridization method.
  • the relative intensities of the signal +++ indicate the strongest (high e st), ++ indicate the medium (modera tdedensity), and tens indicate the low (lowdensity).
  • Fig. 40 shows cell supernatants of CHO cells transfected with the human secretory protein gene or CHO cells transfected with no human secretory protein gene in AQ27 receptor-expressing cells.
  • FIG. 9 shows the results of detecting a specific stimulating activity when the cells were brought into contact with (AQ 27 / HEK) or cells not expressing the AQ 27 receptor (pAKK O / HEK).
  • the vertical axis indicates the luciferase expression level (cps).
  • the horizontal axis represents the concentration or dilution of the substance reacted with the AQ27 receptor.
  • Basa 1 shows the case without addition.
  • FSK indicates the case where forskolin was added.
  • the peptide (1) is a human peptide: Glu-His-Ala-Gly-Cys-Arg-Phe-Arg-Phe-NH 2 (80th to 88th of SEQ ID NO: 1) and a peptide (2) Indicates the case where a human peptide: Gly-Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH2 (127th to 133th in SEQ ID NO: 1) is added.
  • mo c k SUP indicates the case where the cell supernatant of CHO cells into which the human secretory protein gene was not introduced was added.
  • Peptide F SUP Shows the case where the cell supernatant of CHO cells into which the human secretory protein gene was introduced was added.
  • FIG. 41 shows a reaction curve between a known anti-RFRP-1 antibody 1F3-1 and a human secretory protein.
  • Figure 42 shows the affinity chromatography-bound fraction using the known anti-RFRP-1 antibody 1F3-1 against AQ27 receptor-expressing cells (AQ27) or cells not expressing AQ27 receptor (pAKKO). Specific stimulus activity 14 is shown. Lecifera.seactivity on the abscissa indicates noreciferase activity (cps). The abscissa indicates the number of the fraction bound by affinity chromatography. ⁇ Figure 43 shows the specific stimulating activity of each fraction on AQ27 receptor-expressing cells when fraction 20 (fr. 20) of Figure 42 was isolated. On the abscissa, Luciferasseactivity indicates active receptorase (cps). The horizontal axis indicates the number of the fraction. 3 and 4 show activity peaks.
  • FIG. 44 shows the specific stimulating activity of each fraction on AQ27 receptor-expressing cells when fractions 20-13 (fr. 20-23) of FIG. 42 were separated. Luciferasaseactivity on the abscissa indicates noreciferase activity (cps). The horizontal axis indicates the number of the fraction. 1 and 2 indicate activity peaks.
  • FIG. 45 shows the measured molecular weights and the theoretical values of the human peptides contained in the activity peaks 1 to 4 in FIGS. 43 and 44, and the amino acid sequence.
  • FIG. 46 shows the amino acid sequences of human peptides having different lengths and the cAMP production inhibitory activity (EC 5 value) of various human peptides on AQ27-expressing CHO cell lines.
  • FIG. 47 shows the suppression rate of cAMP production of the humanized peptide shown in FIG. 46 against the AQ27-expressing CHO cell line. Inhibition (%) on the vertical axis indicates the cAMP production suppression rate (%). Concentration (1 gM) on the horizontal axis represents the concentration of the added human peptide in 1 gM.
  • Figure 48 shows the human peptide corticosterone shown in Figure 46. 2 shows the results of examining the secretion stimulating activity of sterone). The concentration on the vertical axis indicates the blood corticosterone concentration (ng / m1).
  • Yokotoda shows the value before administration of human peptide
  • 1 Omin shows 10 minutes after administration
  • 30 min shows 30 minutes after administration
  • the white column on the left shows the case where saline was administered (C 0 ntro 1)
  • the black column on the right shows the case where the human peptide was administered (AQ27L).
  • FIG. 49 shows the results of examining the secretion stimulating activity of testosterone (Testosterone) of the humanized peptide shown in FIG.
  • the cn c en tr a t io n on the vertical axis indicates the blood testosterone concentration (ngZmi).
  • Pre on the horizontal axis indicates the value before administration of human peptide, 10 min indicates 10 minutes after administration, 30 min indicates 30 minutes after administration, and the white column on the left indicates the case where saline was administered ( Control), the black column on the right shows the case where the human peptide was administered (AQ27 L).
  • FIG. 50 shows the results of examining the secretion stimulating activity of the aldosterone (A1dstrone) of the human peptide shown in FIG.
  • the cn c en tr a t io n on the vertical axis indicates the blood aldosterone concentration (ng / m i).
  • Pre on the horizontal axis indicates the values before administration of the human peptide, 10 min indicates 10 minutes after administration, 30 min indicates 30 minutes after administration, and the white column on the left indicates the case where saline was administered (C ontro 1), the black column on the right shows the case where the human peptide was administered (AQ27L).
  • FIG. 51 shows the results of examining the time course and concentration dependence of the aldosterone secretion stimulating activity of the human peptide shown in FIG. 46.
  • the cn c en tr a t io n on the vertical axis indicates the blood aldosterone concentration (ng / m i).
  • Time (min) on the horizontal axis indicates the time (minute) after administration.
  • the mouth was administered with physiological saline (vehicle), ⁇ was administered with human peptide at 4 nmo1 / kg, A was administered with human peptide at 40 nmo1 Zkg, X was human This shows a case where 400 nmo1 Zkg of a gamma-type peptide was administered.
  • the secreted protein of the present invention is a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1;
  • Cells eg, guinea pigs, rats, mice, chickens, egrets, pigs, sheep, hidges, magpies, monkeys, etc.
  • Cells eg, retinal cells, liver cells, spleen cells, nerve cells, glial cells, knee cells
  • Bone marrow cells mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, fat cells, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, fertilizers) Cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, osteocytes, osteoblasts, osteoclasts, breast cells, hepat
  • the amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. % Or more, more preferably about 80% or more, still more preferably 90% or more, most preferably about 95% or more.
  • the amino acid sequence having 60% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3; the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5; The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 is exemplified.
  • amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 includes:
  • amino acid sequences X for example, 1 to 15, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, and particularly preferably 1) An amino acid sequence in which the amino acids have been deleted,
  • secretory protein of the present invention include, for example,
  • a human secretory protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • a rat secretory protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3
  • a pepsin-type secretory protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, and the like.
  • SEQ ID NO: 1st to 18th amino acid sequence of amino acid sequence represented by 1 Columns indicate secretion signal sequences.
  • the 1st to 17th amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 show a secretory signal sequence.
  • the 1st to 17th amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 show a secretory signal sequence.
  • the first to 17th amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 show a secretory signal sequence.
  • the secretory protein of the present invention may be one obtained by removing the signal sequence from the above amino acid sequence.
  • the secretory protein of the present invention may have the same activity as the peptide of the present invention described later.
  • the partial peptide of the secretory protein of the present invention may be any peptide as long as it is the partial peptide of the secretory protein of the present invention described above. Peptides consisting of 5 or more, preferably 10 or more are preferred.
  • peptides of the present invention include:
  • amino acid sequence of the present invention represented by SEQ ID NO: 3 is identical or substantially identical to the 115th to 122nd amino acid sequence or the 116th to 122nd amino acid sequence (Hereinafter sometimes abbreviated as a rat peptide of the present invention),
  • Peptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the second amino acid sequence or the amino acid sequence from the 116th to the 122nd (hereinafter sometimes abbreviated as mouse-type peptide of the present invention) , (4) It has the same or substantially the same amino acid sequence as the 124th to 131st amino acid sequence or the 125th to 131st amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 of the present invention.
  • Peptides (hereinafter, may be abbreviated as a peptide of the present invention) may be used.
  • the peptide of the present invention can be used for cells of human warm-blooded animals (for example, guinea pig, rat, mouse, chicken, rabbit, pig, sheep, sheep, horse, monkey, etc.) (for example, retinal cells, hepatocytes, and spleen).
  • human warm-blooded animals for example, guinea pig, rat, mouse, chicken, rabbit, pig, sheep, sheep, horse, monkey, etc.
  • retinal cells for example, retinal cells, hepatocytes, and spleen.
  • Cells nerve cells, glial cells, knee cells] 3 cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, fat cells, immune cells (eg , Macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts Cells, osteoclasts, mammary cells, hepatocytes or stromal cells, or precursors of these cells, stem cells or cancer cells) or any tissue in which these cells are present, such as the brain, Parts of the brain ⁇ (eg, retina, olfactory bulb, nucleus, basal sphere, hippocampus, thalamus, hypothalamus, cerebral cortex, medulla oblongata, cerebellum), spinal cord, pit
  • amino acid sequence Y indicates one amino acid sequence selected from the following 10 types of amino acid sequences.
  • the amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence Y has about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably 90% or more, and most preferably about 95% or more homology with the amino acid sequence Y.
  • Amino acid sequences and the like examples include, for example, a peptide having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence Y and substantially having the amino acid sequence Y. Peptides having the same activity as the above are preferred.
  • substantially equivalent activities include, for example, the activity of the peptide of the present invention (for example, an activity of promoting secretion of adrenocortical hormone, a binding activity with a receptor, a cell stimulating activity on a receptor-expressing cell (for example, arachidonic acid release). , Acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, activity to promote GTPYS binding activity, etc.), etc.). Substantially equivalent indicates that their activities are qualitatively identical (eg, physiochemically or pharmacologically).
  • amino acid sequence Y Specific examples of the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence Y include:
  • amino acid sequence obtained by adding 1 to 5 (preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2, and more preferably 1) amino acids to the amino acid sequence Y;
  • amino acid sequence in which 1 to 5 (preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2, and more preferably 1) amino acids have been inserted into the amino acid sequence Y,
  • peptide of the present invention include, for example, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids
  • Amino acid sequence at the 20th to 13th amino acid sequence, 20th to 13th amino acid sequence, 2nd to 13th amino acid sequence, 2nd to 13th amino acid sequence, 2nd to 3rd amino acid sequence 1 3 3rd amino acid sequence, 2nd 4th to 1 3 3 The amino acid sequence of the 25th to 13th amino acid sequence, the 26th to 13th amino acid sequence, the 27th to 13th amino acid sequence, the 27th to 13th amino acid sequence, the 28th to 8th.
  • amino acid sequences 90 to 133 amino acids 91 to 133, and amino acids 93 to 133 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • amino acid sequence Nos. 108-133 amino acid sequence Nos. 109-133
  • amino acid sequence Nos. 111-133 amino acid sequence Nos. 115-133
  • No. Preferred is a human peptide comprising an amino acid sequence at positions 119 to 133, an amino acid sequence at positions 124 to 133, an amino acid sequence at positions 126 to 133 or 127 to 133, and the like.
  • the peptide consisting of the amino acid sequence at positions 91 to 133 of the amino acid sequence represented by 1 may have a glutamine residue (G1n) at the N-terminal which may be pyroglutaminated, and may be represented by SEQ ID NO: 1.
  • the N-terminal arginine residue (Ar g) may be replaced with a tyrosine residue (Tyr) (FIGS. 47 and 48). See))
  • amino acid sequence No. 52 to 122 amino acid sequence No. 53 to 122, amino acid sequence No. 54 to 122
  • the 18th to 13th amino acid sequence, the 19th to 13th amino acid sequence, and the 20th to 13th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 The amino acid sequence of the 2nd to 13th amino acid sequence, the 22nd to 13th amino acid sequence, the 23rd to 13th amino acid sequence, the 24th to 13th amino acid sequences Amino acid sequence at the 25th to 13th amino acid sequence, 26th to 13th amino acid sequence, 27th to 13th amino acid sequence, 27th to 13th amino acid sequence, 28th to 13th amino acid sequence 1st amino acid sequence, 29th to 13th 1st amino acid sequence, 30th to 13th 1st amino acid sequence, 3rd to 13th 1st.
  • amino acid sequence of the 32nd to 131st amino acid sequence, the 33th to 131st amino acid sequence, the 34th to 131st amino acid sequence, the 35th to 131st amino acid sequence, the 36th to 131st amino acid sequence The amino acid sequence at position 37, the amino acid sequence at positions 37-131, the amino acid sequence at positions 38-131, the amino acid sequence at positions 39-131, the amino acid sequence at positions 40-131, Amino acids 41-131, amino acids 42-131, amino acids 43-131, amino acids 44-131, amino acids 45-131 Sequence, amino acid sequence at positions 46-131, amino acid sequence at positions 47-131, amino acid sequence at positions 48-131, amino acid sequence at positions 49-131, amino acid sequence at positions 50-131 Amino acid sequence, position 51 131st amino acid sequence, 52nd to 131st amino acid sequence, 53rd to 131st amino acid sequence, 54th to 131st amino acid sequence, 55th to 131st amino acid sequence, 56th to
  • C-terminal amides are preferably used as these peptides.
  • the secretory protein of the present invention or the peptide of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the peptide of the present invention) has an N-terminal (amino terminal) at the left end and a C-terminal (carboxyl terminal) at the left end according to the convention of peptide labeling. It is.
  • the peptide of the present invention including a secretory protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, has a carboxyl group (one COOH), carboxylate (one COO—), amide (one CONH 2 ) or It can be any of the esters (one COOR).
  • alkyl groups such as isopropyl if 'clause n- heptyl, for example, cyclo pentyl, C 3, such as cyclohexyl - 8 cycloalkyl group
  • ⁇ 6 _ 12 aryl groups such as phenyl and 1-naphthyl
  • phenyl alkyl groups such as benzyl and phenethyl or (1-naphthyl —C ⁇ s alkyl groups such as (3 ⁇ 4-naphthylmethyl) C 7 such as - other 1 4 Ararukiru group, Viva Roy Ruo carboxymethyl group which is generally used as an oral ester.
  • the peptide of the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus
  • those in which the carboxyl group is amidated or esterified are also included in the peptide of the present invention.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • the amino group of the N-terminal amino acid residue is protected by a protecting group (eg, a formyl group, an acetyl group, etc., and a 6- amino group, such as an acyl group).
  • a protecting group eg, a formyl group, an acetyl group, etc., and a 6- amino group, such as an acyl group.
  • N-terminal daltamyl group that is cleaved in vivo to form pyroglutamic acid
  • substituents on the side chain of amino acid in the molecule for example, 1 OH, 1 SH, amino group , imidazole group, indole group, guaiacolsulfonate - protected like Gino group
  • appropriate protecting groups e.g., formyl group, etc.
  • C i-6 Ashiru group such as C i-6 Al force Noiru groups such as ⁇ cetyl group
  • a complex protein such as a so-called glycoprotein
  • salts with physiologically acceptable acids include salts with physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids) and bases (eg, alkali metal salts).
  • acid addition salts that are chemically acceptable.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with conodic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • the peptide of the present invention including salts is also referred to.
  • the peptide of the present invention can be produced from the above-described human warm-blooded animal cells or tissues by a peptide purification method known per se, or can be transformed by a peptide-encoding DNA described below. It can also be produced by culturing the body. It can also be produced according to the peptide synthesis method described below.
  • the human or mammalian tissues or cells are homogenized, and then extracted with an acid or the like, and the extract is subjected to reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, etc. Purification and isolation can be performed by combining chromatography.
  • resins for peptide synthesis can be used.
  • examples of such a gist include, for example, methyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM Resin, 4-hydroxymethylmethylphenylacetamidemethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenyloxymethyloxy) phenoxy resin, 4- (2', 4'-dimethoxyphenyl-1 Fmoc Aminoethyl) phenoxy resin and the like.
  • an amino acid having an a-amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin according to the sequence of the target peptide according to various condensation methods known per se.
  • the peptide is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.
  • an intramolecular disulfide bond formation reaction is performed in a highly diluted solution to obtain the desired peptide of the present invention or an amide thereof. get.
  • the protected amino acid is added directly to the resin together with a racemization inhibitor (eg, HOB t, HOOB t), or the protected amino acid is preliminarily converted into a symmetric acid anhydride or HOB t ester or HOOB t ester. Can be added to the resin after activation.
  • a racemization inhibitor eg, HOB t, HOOB t
  • the solvent used for activating the protected amino acid or condensing with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for peptide condensation reactions.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride, methylene chloride, and the like; Alcohols such as trifluoroethanol; sulfoxides such as dimethylsulfoxide; ethers such as pyridine, dioxane and tetrahydrofuran; nitriles such as acetonitrile and propionitrile; esters such as methyl acetate and ethyl acetate.
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for the peptide bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about 120 to 50 ° C.
  • the active amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess.
  • Examples of the protecting group for the starting amino group include Z, Boc, t-pentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycanoleponinole, C11Z, Br- Z, adamantyloxy force / reponil, triphenylenoacetic acid, phthaloynole, hosleminole, 2-trofeninolenosrefenocinole, diphenylphosphinochioyl, Fmoc and the like are used.
  • a carboxyl group can be, for example, an alkyl esterified (eg, methyl, ethyl, propynole. Butyl, t-butynole, cyclopentynole. Cyclohexyl, cyclohexyl).
  • alkyl esterified eg, methyl, ethyl, propynole. Butyl, t-butynole, cyclopentynole. Cyclohexyl, cyclohexyl).
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • Suitable groups for this esterification include, for example, lower (C ⁇ 6 ) alkanol groups such as acetyl group, aroyl groups such as benzoyl group, and groups derived from carbonic acid such as benzyloxycarbonyl group and ethoxycarbon group. Is used.
  • groups suitable for etherification include, for example, a benzinole group, a tetrahydroviranyl group, and a t-butyl group.
  • the protecting group of the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, B z 1, C 1 2 - B zl, 2-- Torobenjiru, B r- Z, such as t one-butyl is used.
  • Examples of the protecting group for imidazole of histidine include Tos, 4-methoxy-1,2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethinole, Bum, Boc, Trt, and Fmoc. .
  • Examples of the activated carboxyl groups of the raw materials include, for example, corresponding acid anhydrides, azides, active esters [alcohols (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2 , 4-diphenylphenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, ester with N-hydroxyphthalimid, HOBt), and the like.
  • active esters eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2 , 4-diphenylphenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, ester with N-hydroxyphthalimid, HOBt
  • the activated amino group of the raw material for example, a corresponding phosphoramide is used.
  • Methods for removing (eliminating) protecting groups include, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride or methanesulfonic acid.
  • a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride or methanesulfonic acid.
  • Acid treatment with trifluoromethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., and liquid ammonia Reduction with sodium in the medium is also used.
  • the elimination reaction by the above acid treatment is generally carried out at a temperature of about 120 to 40 ° C.
  • a cation scavenger such as 1,2,4-butanedithiole or 1,2-ethanedithiole.
  • 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as an indole protecting group of tributofan is substituted with 1,2-ethanedithiol, 1,4-butane.
  • acid treatment in the presence of dithiol or the like, it is also removed by alkali treatment with a dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia, or the like.
  • the protection of the functional group which should not be involved in the reaction of the raw material, the protection group, the elimination of the protective group, and the activation of the functional group involved in the reaction can be appropriately selected from known groups or known means.
  • a peptide (protein) chain is desired on the amino group side.
  • a peptide is prepared by removing only the protecting group of the N-terminal monoamino group of the peptide chain and a peptide having only the protecting group of the C-terminal carboxyl group removed.
  • the peptide is condensed in a mixed solvent as described above. Details of the condensation reaction are the same as described above.
  • an ester of the peptide of the present invention for example, after condensing the ⁇ -carboxyl group of the carboxy-terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, the same as the amide of the peptide of the present invention, The desired ester of the peptide of the present invention can be obtained.
  • the peptide of the present invention can be produced according to a peptide synthesis method known per se or by cleaving a secreted protein of the present invention with an appropriate peptidase. it can.
  • a method for synthesizing a peptide for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, the target peptide is condensed with a partial peptide or amino acid that can constitute a partial peptide of the peptide of the present invention and the remaining portion, and when the product has a protecting group, the protecting peptide is removed to obtain the desired peptide.
  • Known methods for condensation and elimination of protecting groups include, for example, the methods described in the following 1 to 6.
  • the peptide of the present invention or its partial peptide can be purified and isolated by a combination of ordinary purification methods, for example, solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization. .
  • the partial peptide of the peptide of the present invention obtained by the above method is a free form, it can be converted into an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, it can be converted into a salt.
  • it can be converted to a free form or another salt by a known method or a method analogous thereto.
  • the polynucleotide encoding the peptide of the present invention is not particularly limited as long as it contains a base sequence (DNA or RNA, preferably DNA) encoding the above-described peptide of the present invention. Is also good.
  • the polynucleotide is RNA such as DNA or mRNA encoding the peptide of the present invention, and may be double-stranded or single-stranded. In the case of double-stranded DNA, it may be double-stranded DNA, double-stranded RNA or DNA: RNA hybrid.
  • a single strand it may be a sense strand (ie, a coding strand) or an antisense strand (ie, a .non-coding strand).
  • the method of the present invention can be obtained by the method described in the well-known experimental medical special edition “New PCR and its application” 15 (7), 1997 or a method analogous thereto.
  • the mRNA of the peptide can be quantified.
  • the DNA encoding the peptide of the present invention may be any DNA as long as it contains the above-described nucleotide sequence encoding the peptide of the present invention. Further, it may be any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-mentioned cells and tissues, cDNA library derived from the above-mentioned cells and tissues, and synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of batteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, it can also be directly amplified by reverse transcriptase polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a preparation of total RNA or mRNA fraction from the above-mentioned cell'tissue.
  • RT-PCR method reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • nucleotide sequence P indicates a nucleotide sequence represented by one sequence number selected from SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, and SEQ ID NO: 8.
  • the base sequence Q indicates one base sequence selected from the following four types of base sequences.
  • Examples of the DNA encoding the secretory protein of the present invention include, for example, DNA having a base sequence of DNA containing base sequence P or Q, or base sequence P or Q A DNA containing a nucleotide sequence that hybridizes under high stringent conditions and a nucleotide sequence encoding DNA encoding a secretory protein having substantially the same activity as the secretory protein of the present invention is used.
  • Examples of the base sequence capable of hybridizing with the base sequence P or Q under high stringency conditions include, for example, about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably 70% or more with the base sequence P or Q. More preferably, a nucleotide sequence having about 80% or more, more preferably about 90% or more, most preferably about 95% or more homology is used.
  • Hybridization can be carried out by a method known per se or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). It can be done according to. When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be carried out under high stringent conditions.
  • High stringency conditions include, for example, conditions where the sodium concentration is about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and the temperature is about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 65 ° C. Is shown. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C. is most preferable.
  • DNA encoding the human secretory protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the like is used.
  • a rat-type secretory protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3
  • a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 or the like is used as the DNA to be loaded.
  • DNA encoding a human secretory protein consisting of the amino acid sequence at positions 19 to 136 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 the 55th nucleotide of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 is used.
  • DNA consisting of the base sequence from the 4th to the 40.8th base is used.
  • the 52nd nucleotide of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 As a DNA encoding a rat secretory protein consisting of the amino acid sequence at positions 18 to 124 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, the 52nd nucleotide of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 For example, a DNA consisting of the nucleotide sequence from the ⁇ ⁇ th to the 372nd nucleotide is used.
  • a DNA encoding a secretory protein consisting of the amino acid sequence at positions 18 to 134 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 a DNA encoding the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 DNA consisting of the nucleotide sequence from the 52nd to the 402nd is used.
  • nucleotide sequence R indicates one nucleotide sequence selected from the following 10 types of nucleotide sequences.
  • Examples of the DNA encoding the peptide of the present invention include, for example, a peptide containing a nucleotide sequence that hybridizes under high stringent conditions to the nucleotide sequence R and having substantially the same activity as the peptide of the present invention. Any one can be used as long as it is a DNA.
  • Examples of the base sequence capable of hybridizing with the base sequence R under high stringency conditions include, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and more preferably about 90% or more with the base sequence R.
  • a base sequence having a homology of 95% or more is used.
  • Hybridization methods are the same as those described above for high stringency conditions.
  • DNA encoding a human peptide consisting of the amino acid sequence at positions 80 to 88 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is the 238th amino acid sequence of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • DNA encoding the human peptide consisting of the amino acid sequence at positions 91 to 133 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is the 271st amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • DNA encoding a rat peptide consisting of the 115th to 122nd amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 includes a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4; DNA consisting of the nucleotide sequence at positions 343 to 366, etc.
  • DNA encoding a mouse-type peptide consisting of the 115th to 122nd amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 includes the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 DNA consisting of the nucleotide sequence at positions 343 to 366, etc.
  • DNA encoding a mouse peptide consisting of the amino acid sequence at positions 116 to 122 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 is as follows: No .: DNA consisting of the 346th to 366th base sequence of the base sequence represented by 6 is used.
  • a part of the nucleotide sequence of DNA encoding the peptide of the present invention or a polynucleotide containing a part of the nucleotide sequence complementary to the DNA is a polypeptide of the present invention. It is used to include not only the DNA to encode but also RNA.
  • an antisense polynucleotide capable of inhibiting the replication or expression of the peptide gene of the present invention is cloned or a determined peptide of the present invention is coded. It can be designed and synthesized based on base sequence information of DNA.
  • a polynucleotide can hybridize with the RNA of the peptide gene of the present invention, and has the ability to inhibit the synthesis or function of the RNA or the RNA with the peptide-related RNA of the present invention.
  • the expression of the peptide gene of the present invention can be regulated and controlled through the interaction.
  • Polynucleotides that are complementary to the selected sequence of the peptide-related RNA of the present invention, and that can specifically hybridize with the peptide-related RNA of the present invention, can be used in vivo and in vitro. It is useful for regulating and controlling the expression of the peptide gene of the present invention, and is also useful for treating or diagnosing diseases and the like.
  • the term “corresponding” means having homology or being complementary to a particular sequence of nucleotides, base sequences or nucleic acids, including genes.
  • the "correspondence" between a nucleotide, nucleotide sequence or nucleic acid and a peptide (protein) is a directive derived from the nucleotide (nucleic acid) sequence or its complement.
  • peptide protein
  • 5'-end hairpin loop, 5'-end 6-base pair 'repeat, 5'-end untranslated region, peptide translation initiation codon, protein coding region, ORF translation stop codon, 3'-end untranslated of the peptide gene of the present invention The region, the 3 'end palindrome region, and the 3' end hairpin loop may be selected as preferred regions of interest, but any region within the peptide gene of the present invention may be selected as a region of interest.
  • Antisense polynucleotides are polydeoxyribonucleotides containing 2-dexoxy-D-ribose, polyribonucleotides containing D-ribose, N-daricosides of purine or pyrimidine bases.
  • polynucleotides or other polymers with non-nucleotide backbones eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers
  • polymers containing special bonds such as One includes nucleotides having a configuration that allows base pairing and base attachment as found in DNA and RNA). They can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and even DNA: RNA hybrids, and can also be unmodified polynucleotides (or unmodified oligonucleotides).
  • nucleotide such as one having an uncharged bond (eg, methylphosphonate, phosphotriester, phosphoramidate, olebamate, etc.), a charged bond or a sulfur-containing bond (eg, those having phosphorothioate, phosphomouth dithioate, etc., such as proteins (nucleases, nucleases' inhibitors, toxins , Antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.) or sugars (for example, monosaccharides), etc., or those having an interactive compound (for example, atharidin, psoralen, etc.).
  • an intramolecular nucleotide such as one having an uncharged bond (eg, methylphosphonate, phosphotriester, phosphoramidate, olebamate, etc.), a charged bond or a sulfur-containing bond ( For example, those having phosphorothioate, phosphomouth dithioate, etc., such as proteins
  • Chelating compounds eg, metals, radioactive metals, boron, oxidizable metals
  • Those containing an alkylating agent, and those having a modified bond for example, ⁇ -anomeric nucleic acid.
  • “nucleoside”, “nucleotide” and “nucleic acid” may include not only those containing a purine or pyrimidine base but also those having another modified heterocyclic base. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles.
  • Modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, e.g., where one or more hydroxyl groups have been replaced with halogens, mosquitoes, lunar aliphatic groups, or ether, amines, etc. It may be changed or converted to a functional group.
  • the antisense 'polynucleotide (nucleic acid) of the present invention is RNA, DNA, or a modified nucleic acid (RNA, DNA).
  • modified nucleic acid include, but are not limited to, sulfur derivatives of nucleic acids ⁇ thiophosphoate derivatives, and polynucleoside amides ⁇ ⁇ oligonucleoside amides that are resistant to degradation.
  • the antisense nucleic acid of the present invention can be preferably designed according to the following policy.
  • the antisense nucleic acids of the present invention may contain altered or modified sugars, bases, or bonds, and may be provided in special forms such as ribosomes or microspheres, applied by gene therapy, or added. Can be given in a written form.
  • the additional forms include polycations, such as polylysine, which act to neutralize the charge on the phosphate backbone, and lipids, which enhance the interaction with cell membranes or increase the uptake of nucleic acids ( For example, Hoss (Lipids, cholesterol, etc.).
  • Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chromate formate, cholic acid, etc.).
  • These can be attached to the 3 'end or 5' end of the nucleic acid, and can be attached via a base, sugar, or intramolecular nucleoside bond.
  • Other groups include capping groups specifically located at the 3 'or 5' end of nucleic acids to prevent degradation by nucleases such as exonucleases and RNases. .
  • capping groups include, but are not limited to, hydroxyl-protecting groups known in the art, including glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
  • the inhibitory activity of the antisense nucleic acid can be examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of the peptide of the present invention. .
  • the nucleic acid can be applied to cells by various methods known per se.
  • the DNA encoding the peptide of the present invention may be labeled by a method known per se, and specifically, isotope-labeled DNA, fluorescently-labeled DNA (for example, fluorescent labeling with fluorescein or the like) And biotinylated or enzyme-labeled ones.
  • Cloning of the DNA completely encoding the peptide of the present invention may be carried out by amplification using a synthetic DNA primer having a partial nucleotide sequence of the peptide of the present invention by a PCR method known per se, or an appropriate method.
  • the DNA incorporated in the vector can be selected by hybridization with a DNA fragment coding for a part or the entire region of the peptide of the present invention or a DNA fragment labeled with a synthetic DNA. Hybridization can be performed according to, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). In addition, when using a commercially available library, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • Conversion of the DNA base sequence can be performed using a known kit, for example, Mutan TM -super Express Km (Takara Shuzo Co., Ltd.), Mutan TM _K (Takara Shuzo Co., Ltd.), etc., according to a method known per se such as the ODA-LAPCR method, the Gapped duplex method, the Kunkel method, or a method analogous thereto.
  • the DNA encoding the cloned peptide can be used as it is depending on the purpose, or it can be used by digesting it with a restriction enzyme as desired or by adding a linker.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon on its 5, terminal side and TAA, TGA or TAG as a translation termination codon on its 3, terminal side.
  • the expression vector for the peptide of the present invention includes, for example, (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding the peptide of the present invention, and (mouth) converting the DNA fragment into a promoter of an appropriate expression vector. It can be manufactured by connecting downstream.
  • the vector examples include plasmid derived from E. coli (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), plasmid derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, pC194), Yeast-derived plasmids (eg, pSH19, pSH15), pacteriophages such as ⁇ phage> Retroviruses, vaccinia ⁇ inores, animal ⁇ inores such as nokukuroinoresu, etc., pAl-11, pXT1, pRcZCMV , PRc / RSV, pcDNAIZNeo and the like are used.
  • E. coli eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • Bacillus subtilis eg, pUB110, pTP5, pC194
  • Yeast-derived plasmids eg, pSH
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression.
  • SRa promoter when an animal cell is used as a host, SRa promoter, SV40 promoter, HIV / LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned.
  • CMV cytomegalovirus
  • SRa promoter cytomegalovirus
  • the host is Escherichia, the trp promoter, 1 ac promoter, rec A promoter, EPL motor, promoter, T7 promoter, etc.
  • a SPOL promoter, a SP02 promoter, a penP promoter, and the like and in a case of a yeast host, a PHO5 promoter, a PGK promoter, a GAP promoter, an ADH promoter, and the like are preferable.
  • a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like are preferable.
  • the expression vector may contain, in addition to the above, an enhancer, a splicing signal, a cascade signal with poly A, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), and the like, if desired.
  • selectable markers include dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene [methotrexate (MTX) resistance], ampicillin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Ampr), neomycin Resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Neor, G418 resistance) and the like.
  • dhfr gene when used as a selectable marker using dhfr gene-deficient Chinese hamster cells, the target gene can be selected using a thymidine-free medium.
  • a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the peptide of the present invention. If the host is Escherichia, Pho A signal sequence, Omp A signal sequence, etc., if the host is Bacillus, ⁇ -amylase signal sequence, subtilisin signal sequence, etc. If the host is yeast, MFo; signal sequence, SUC2, signal sequence, etc. The host is an animal. If it is a cell, insulin signal sequence, a-interferon signal sequence, antibody molecule A signal sequence or the like can be used.
  • a transformant can be produced.
  • Escherichia bacteria for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells, and the like are used.
  • Escherichia bacteria include, for example, Escherichia coli
  • Bacillus subtilis MI114 Gene, 24 vol., 255 (1983)
  • 207-21 Journal of Biochemistry
  • yeast examples include Saccharomyces cerevisiae AH 22, AH 22 R “, NA8 7-1 1 A, DKD—5D, 20 B_ 1.2, and Schizosaccharomyces pombe NC YC 19 13, NCYC 2036, Pichia pastoris K K71, and the like are used.
  • Insect cells include, for example, when the virus is Ac NPV, a cell line derived from the larvae of night roth moth (Spodoptera frugiperda cell; S f cell), MG 1 cells derived from the midgut of Trichoplusia ni, and eggs derived from eggs of Trichoplusia ni High Five TM cells, cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estigmenaacrea are used. If the virus is BmNPV, a silkworm-derived cell line (Bombyx raori N cell; BmN cell) or the like is used. Examples of the Sf cells include Sf9 cells (ATCC CRL1711) and Sf21 cells (Vaughn, JL et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)) and the like. Is used.
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, Vol. 315, 592 (11985)].
  • animal cells examples include monkey cells COS-7 (COS 7), Vero, Chinese nomster cells CH ⁇ (hereinafter abbreviated as CHO cells), dhfr gene-deficient chick-use hamster cells CHO (hereinafter, referred to as CHO).
  • CHO monkey cells COS-7
  • Vero Chinese nomster cells CH ⁇
  • CH ⁇ Chinese nomster cells
  • CHO dhfr gene-deficient chick-use hamster cells
  • CHO CHO
  • mouse L cells mouse AtT-20
  • mouse myeloma cells rat GH3, human FL cells, and the like.
  • a liquid medium is suitable as a medium for cultivation, and a carbon source necessary for growth of the transformant is contained therein.
  • the carbon source include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose.
  • examples of the nitrogen source include ammonium salts, nitrates, cone chip liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, Inorganic such as potato extract or
  • examples of the organic substance and the inorganic substance include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride.
  • yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • an M9 medium containing glucose and casamino acids As a medium for culturing the genus Escherichia, for example, an M9 medium containing glucose and casamino acids (Miller, Journal of Ob 'et al. In-Molecular Sciences, Inc. Experiments in Molecular Genetics), 431--4d3, Cold Spring Harbor Labo Human, New York 1972]. If necessary, an agent such as 3] 3-indolylacrylic acid can be added to make the promoter work efficiently.
  • the cultivation is usually carried out at about 15 to 43 ° C for about 3 to 2.4 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
  • the cultivation is usually carried out at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be applied.
  • the culture medium When culturing a transformant in which the host is yeast, the culture medium may be, for example, a Parkholder (Burkholder) minimal medium [Bostian, KL, et al., Processings of the National Academy Off; Natl. Acad. Sci. USA, 77 volume, 450 ( 1980 )] or an SD medium containing 0.5% casamino acid [Bitter Proc. Natl, Acad. Sci. USA, Proc. Nat'l, Acad. Sci. USA, Proc.'S The National Academy Of Obc. Sci. 1 9 8 4)].
  • the pH of the medium is adjusted to about 5-8.
  • the cultivation is usually performed at about 20 to 35 ° C for about 24 to 72 hours, and aeration and stirring are added as necessary.
  • the culture medium was immobilized in Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, 195, 788 (1962)).
  • a product obtained by appropriately adding an additive such as a serum or the like is used.
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4.
  • Culture is usually carried out at about 27 ° C for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
  • the pH is about 6-8.
  • Cultivation is usually carried out at about 30 to 40 ° C for about 15 to 60 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
  • the peptide of the present invention can be produced in the cells of the transformant, in the cell membrane or outside the cells.
  • the peptide of the present invention can be separated and purified from the culture by, for example, the following method.
  • cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and subjected to ultrasonication, lysozyme and / or freeze-thawing.
  • a method of obtaining a crude extract of the peptide of the present invention by centrifugation or filtration after disrupting cells or cells is suitably used.
  • the buffer may contain a protein denaturing agent such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant 'I' bioactive such as Triton X-100 TM.
  • the supernatant is separated from the cells or cells by a method known per se, and the supernatant is collected.
  • Purification of the peptide of the present invention contained in the thus obtained culture supernatant or extract can be carried out by appropriately combining known separation and purification methods.
  • These known separation and purification methods include methods utilizing solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, mainly for molecular weight analysis.
  • Method using difference method using difference in charge such as ion exchange chromatography, method using specific affinity such as affinity mouth chromatography, difference in hydrophobicity such as reversed-phase high-performance liquid chromatography
  • Method of isoelectric focusing such as isoelectric focusing A method utilizing the difference is used.
  • a method known per se can be converted into a salt by a method analogous thereto, and conversely, when the peptide is obtained as a salt, It can be converted to a free form or another salt by a method known per se or a method analogous thereto.
  • the peptide of the present invention produced by the recombinant can be arbitrarily modified or partially removed by applying an appropriate protein modifying enzyme before or after purification.
  • an appropriate protein modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, arginylendopeptidase, protein kinase, 'glycosidase and the like are used.
  • An antibody against the peptide of the present invention may be any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody as long as it can recognize the antibody against the peptide of the present invention.
  • An antibody against the peptide of the present invention can be produced by using the peptide of the present invention as an antigen according to a method for producing an antibody or antiserum known per se.
  • the peptide of the present invention is administered to a warm-blooded animal at a site capable of producing an antibody by administration, itself or together with a carrier or diluent.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration.
  • the administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times.
  • warm-blooded animals to be used include monkeys, rabbits, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and birds, and mice and rats are preferably used.
  • a warm-blooded animal immunized with the antigen for example, an individual with an antibody titer is selected from a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization.
  • an individual with an antibody titer is selected from a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared.
  • the measurement of the antibody titer in the antiserum is performed, for example, as described below. After reacting the labeled peptide with the antiserum, the activity can be measured by measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Köhler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, and PEG is preferably used.
  • myeloma cells examples include myeloma cells of warm-blooded animals such as NS-1, P3U1, SP2 / 0, and AP-1, but P3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1 ::! To 20: 1, and PEG (preferably PEG 1000 to PEG600) is about 10 to 80%.
  • the cell fusion can be carried out efficiently by incubating the mixture at a concentration of 2 to 40 ° C, preferably 30 to 37 ° C for 1 to 10 minutes.
  • hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, a microplate) on which a peptide (protein) antigen is adsorbed directly or together with a carrier.
  • a solid phase eg, a microplate
  • a peptide (protein) antigen is adsorbed directly or together with a carrier.
  • an anti-immunoglobulin antibody labeled with a radioactive substance or enzyme if the cells used for cell fusion are mice, an anti-mouse immunoglobulin antibody is used
  • a monoclonal antibody bound to the solid phase Antibody detection method Add the hybridoma culture supernatant to a solid phase to which anti-immunoglobulin antibody or protein A is adsorbed, add peptides labeled with radioactive substances, enzymes, etc., and detect monoclonal antibodies bound to the solid phase And the like.
  • the selection of the monoclonal antibody can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto. Usually, it can be performed in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as the hybridoma can grow.
  • RPMI 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum, GIT medium containing 1 to 10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) or Serum-free medium for Hypri-doma culture (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) can be used.
  • the culture temperature is usually from 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the culturing time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • the culture can be usually performed under 5% carbon dioxide gas.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified by methods known per se, for example, immunoglobulin separation and purification methods (eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis, ion exchanger (eg, DEAE)) Absorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or specific purification method in which only antibody is collected using an active adsorbent such as protein A or protein G, and the bond is dissociated to obtain the antibody. You can do it.
  • immunoglobulin separation and purification methods eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis, ion exchanger (eg, DEAE)
  • Absorption / desorption method eg, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or specific purification method in which only antibody is collected using an active adsorbent such as protein A or protein G, and
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced by a method known per se or a method analogous thereto. For example, an immunizing antigen (peptide antigen) itself or a complex thereof with a carrier protein is formed, and immunization is performed on a warm-blooded animal in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody.
  • the antibody can be produced by collecting an antibody-containing substance against the antibody and separating and purifying the antibody.
  • the type of carrier protein and the mixing ratio of carrier to hapten are determined by the antibody against the hapten immunized by cross-linking the carrier. Any material may be cross-linked at any ratio as long as it can be efficiently used. For example, serum serum albumin, psiloglopurine, hemocyanin, etc. are mixed in a weight ratio of about 0.1 to 1 for hapten. A method of coupling at a rate of about 20 to 20 and preferably about 1 to 5 is used.
  • various condensing agents can be used for force coupling between the hapten and the carrier, and an active ester reagent containing a daltalaldehyde carbodiimide, a maleimide active ester, a thiol group, or a dithioviridyl group is used.
  • Condensation products may be located at sites where antibody production is possible in warm-blooded animals or by themselves. Is administered with a carrier and diluent. Complete Freund's adjuvant ⁇ Incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration. The administration is usually performed once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
  • the polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, etc., preferably from the blood of a warm-blooded animal immunized by the above method.
  • the polyclonal antibody titer in the antiserum can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above. Separation and purification of the polyclonal antibody can be carried out according to the same immunoglobulin separation and purification method as the above-described separation and purification of the monoclonal antibody.
  • an antisense DNA having a nucleotide sequence complementary to or substantially complementary to a DNA encoding the peptide of the present invention (hereinafter, these DNAs may be referred to as the DNA of the present invention). These DNAs may be abbreviated as antisense DNA) as having a nucleotide sequence complementary to or substantially complementary to the DNA of the present invention, and suppresses the expression of the DNA. Any antisense DNA may be used as long as it has an action that can be performed.
  • the nucleotide sequence substantially complementary to the DNA of the present invention is, for example, the entire nucleotide sequence or a partial nucleotide sequence of the nucleotide sequence complementary to the DNA of the present invention (that is, the complementary strand of the DNA of the present invention). Nucleotide sequences having about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more homology with the sequence.
  • the nucleotide sequence of the portion encoding the N-terminal portion of the peptide of the present invention for example, a base sequence near the initiation codon
  • the complementary strand of about 7%.
  • Antisense DNA having a homology of 0% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more is suitable. These antisense DNAs can be produced using a known DNA synthesizer or the like.
  • a therapeutic or prophylactic agent for various diseases related to the peptides of the present invention is a therapeutic or prophylactic agent for various diseases related to the peptides of the present invention.
  • the peptide of the present invention and the DNA encoding the same are safe and low toxic drugs,
  • it is useful as a corticosteroid secretion regulator, preferably a corticosteroid secretagogue.
  • corticosteroids examples include mineral corticoids such as aldosterone and deoxycorticosterone, and glucocorticoids such as corticosterone, cortisol, cortisone, and hydrocortisone butyrate. Among them, corticosterone and aldosterone are preferable.
  • the peptide of the present invention and DNA encoding the same include, for example, prevention of hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain, obesity, etc. ⁇ Useful as a therapeutic agent. Further, the peptide of the present invention and the DNA encoding the same are useful as safe and low-toxicity drugs, for example, androgen secretion regulators, preferably androgen secretagogues.
  • Male hormones include testosterone.
  • the peptide of the present invention and DNA encoding the same include, for example, male gonad dysfunction, male infertility associated with impaired spermatozoa, aplastic anemia, myelofibrosis, renal anemia, terminal female genital cancer It is useful as an agent for relieving pain, preventing and treating breast cancer (eg, inoperable breast cancer), mastopathy, breast tumors, gynecomastia.
  • the peptide of the present invention and the DNA of the present invention can be used, for example, in the case where there is a patient in which the peptide of the present invention is reduced or deficient in a living body, (a) administering the DNA of the present invention to the patient.
  • a patient in which the peptide of the present invention is reduced or deficient in a living body
  • administering the DNA of the present invention to the patient.
  • the peptide of the present invention By expressing the peptide of the present invention in vivo, (mouth) inserting the DNA of the present invention into cells, expressing the peptide of the present invention, and then transplanting the cells into a patient; or C)
  • the role of the peptide of the present invention in the patient can be sufficiently or normally exerted by administering the peptide of the present invention to the patient.
  • the DNA of the present invention When the DNA of the present invention is used as the above-mentioned therapeutic or prophylactic agent, the DNA is usually used alone or after being introduced into a suitable vector such as a lethal virus vector, an adenovirus vector, or an adenovirus associated virus vector. It can be administered to humans or warm-blooded animals according to conventional practice.
  • the DNA of the present invention can be used as such or physiologically recognized as an auxiliary agent for promoting uptake.
  • the peptide of the present invention is used as the above-mentioned therapeutic or prophylactic agent, at least
  • the peptide of the present invention can be used, for example, in the form of tablets, capsules, elixirs, microcapsules, and the like, which are sugar-coated as required, orally, or with water or other pharmaceutically acceptable liquids. It can be used parenterally in the form of injections, such as solutions or suspensions.
  • the peptide of the present invention may be used together with physiologically acceptable carriers, flavors, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like in a unit dosage form generally required for the practice of preparations. It can be manufactured by mixing. The amount of active ingredient in these preparations is such that a suitable dose in the specified range can be obtained.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid.
  • Such leavening agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry are used.
  • a liquid carrier such as oil and fat can be further contained in the material of the above-mentioned type.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in a vehicle such as water for injection, or naturally occurring vegetable oils such as sesame oil or coconut oil. .
  • aqueous liquids for injection examples include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mantol, sodium chloride, etc.).
  • Solubilizing agents such as alcohols (eg, ethanol), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactants (eg, Polysorbate 80 TM , HCO-50, etc.) You may use together.
  • an oily liquid for example, Sesame oil, soybean oil, and the like, and may be used in combination with benzyl benzoate, benzyl alcohol, and the like as a solubilizer.
  • buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.
  • soothing agents eg, benzalkonium chloride, hydrochloride proforce, etc.
  • stabilizers eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • Preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants eg, antioxidants and the like.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the vector into which the DNA of the present invention has been inserted is also formulated in the same manner as described above, and is usually used parenterally.
  • the preparations obtained in this way are safe and of low toxicity, for example in humans or warm-blooded animals (for example, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, hidge., Pigs, pests, pests). , Cats, dogs, monkeys, etc.).
  • the dose of the peptide of the present invention varies depending on the target disease, the subject of administration, the administration route, and the like. For example, when the peptide of the present invention is orally administered, in general, for an adult (with a body weight of 60 kg), About 0.1 to: 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg of the peptide is administered per day.
  • the single dose of the peptide varies depending on the administration target, the target disease and the like.
  • the peptide of the present invention can be administered to an adult (with a body weight of 60 kg) in the form of an injection.
  • about 0.01-3 Omg, preferably about 0 ::!-20 mg, more preferably about 0:!-1 Omg of the peptide is injected into the affected area per day. It is expedient to administer the drug.
  • the dose can be administered per 60 kg body weight.
  • the peptide of the present invention can be used in a method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the function of the peptide of the present invention.
  • Functions of the peptide of the present invention include a binding action to AQ27 receptor, a signal transduction action via AQ27 receptor, a cell stimulating activity described later, and the like.
  • the DNA of the present invention can be used in a method for screening a compound or its salt that promotes or inhibits the expression of the peptide of the present invention.
  • a screening method using the peptide of the present invention or the DNA of the present invention will be specifically described.
  • the screening can be carried out by using the peptide of the present invention or constructing an expression system for the recombinant peptide of the present invention, and using the receptor-binding assay system using the expression system to obtain the peptide of the present invention.
  • Compounds that alter the binding to AQ27 receptor (compounds that promote or inhibit the activity of the peptide of the present invention) or salts thereof can be screened.
  • Such compounds include compounds having the cell stimulating activity of the peptide of the present invention via the AQ27 receptor (that is, AQ27 receptor agonist) and compounds having no such cell stimulating activity (that is, the compounds having the cell stimulating activity).
  • AQ27 receptor antagonist “Altering the binding property” includes both cases of inhibiting and promoting the binding to the peptide AQ27 receptor of the present invention.
  • AQ27 receptor-mediated cell stimulating activities include, for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca2 + release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane Potential fluctuation, phosphorylation of intracellular protein, activation of c-fos, decrease of pH, GTPyS binding activity, activity of promoting or suppressing corticosteroid secretion, androgen secretion, etc.
  • the activity of inhibiting intracellular cAMP production, the activity of promoting secretion of corticosteroids, and the activity of promoting secretion of androgens are preferred.
  • a method for screening a compound or a salt thereof which promotes or inhibits the function of the peptide of the present invention which comprises using the peptide of the present invention.
  • AQ27 receptor secretion of adrenocortical hormone characterized by using the peptide of the present invention and / or the AQ27 receptor or a partial peptide thereof (hereinafter simply referred to as AQ27 receptor).
  • Screening methods for modulators eg, corticosteroid secretagogues,
  • AQ27 receptor or its partial peptide hereinafter referred to simply as receptor
  • AQ27 Abbreviated as receptor
  • a method for screening a compound (a compound that promotes or inhibits the function of the peptide of the present invention) or a salt thereof, which changes the binding property between the peptide of the present invention and the AQ27 receptor, is provided.
  • the screening method of the present invention (i) the case where the peptide of the present invention is brought into contact with the AQ27 receptor and (ii) the case where the peptide of the present invention and the test compound are brought into contact with the AQ27 receptor.
  • the binding amount of the peptide of the present invention to the AQ27 receptor, cell stimulating activity, and the like are measured and compared.
  • the labeled invention of the present invention when the labeled peptide of the present invention is brought into contact with the AQ 2.7 receptor, and when the labeled peptide of the present invention and the test compound are brought into contact with the AQ27 receptor.
  • the labeled peptide of the present invention When the labeled peptide of the present invention is brought into contact with a cell containing the AQ27 receptor or a membrane fraction of the cell, and when the labeled peptide and the test compound of the present invention contain the AQ27 receptor
  • the present invention is characterized in that the amount of the labeled peptide of the present invention bound to the cell or the membrane fraction when the cell is contacted with the cell or the membrane fraction of the cell is measured and compared.
  • a method for screening a compound that changes the binding property between a peptide and an AQ27 receptor (a compound that promotes or inhibits the function of the peptide of the present invention) or a salt thereof,
  • a compound that activates the AQ27 receptor or a salt thereof (eg, the peptide of the present invention) is brought into contact with a cell containing the AQ27 receptor;
  • This book is characterized by measuring and comparing AQ27 receptor-mediated cell stimulating activity when the salt and a test compound are brought into contact with cells containing AQ27 receptor (eg, CHO cells).
  • a compound that activates the AQ27 receptor or a salt thereof (such as the peptide of the present invention) is cultured on a cell membrane by culturing a transformant containing DNA encoding the AQ2.7 receptor.
  • the expressed AQ27 receptor is contacted, and when the compound activating the AQ27 receptor or a salt thereof is transformed with the DNA encoding the AQ27 receptor
  • a peptide of the present invention characterized by measuring and comparing AQ27 receptor-mediated cell stimulating activity when an AQ27 receptor expressed on a cell membrane is brought into contact by culturing the body, and comparing the AQ27 receptor with the AQ27 receptor.
  • Q27 A compound that changes the binding to the receptor (a compound that promotes or inhibits the function of the peptide of the present invention) or a method for screening a salt thereof.
  • the AQ27 receptor used in the screening method of the present invention may be any as long as it recognizes the peptide of the present invention as a ligand. And the like are preferred. However, since it is extremely difficult to obtain human-derived organs in particular, the AQ27 receptor that has been mass-produced using recombinants and the like are suitable for screening.
  • the AQ27 receptor can be produced according to a known method.
  • the preparation when the cell containing the AQ27 receptor is the cell membrane fraction or the like, the preparation may be performed according to the method described below.
  • the cells When cells containing the AQ27 receptor are used, the cells may be glutaraldehyde, It may be fixed with formalin or the like.
  • the fixing method can be performed according to a method known per se.
  • the cell containing the AQ27 receptor refers to a host cell expressing the AQ27 receptor.
  • the host cell include the aforementioned Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells, and the like.
  • host cells that have expressed the AQ27 receptor include the same method as the method for producing a transformant transformed with the above-described expression vector containing the peptide of the present invention.
  • the membrane fraction refers to a fraction abundant in cell membrane obtained by a method known per se after cell framing.
  • Cells can be crushed by crushing the cells with a Potter-Elvehjem homogenizer, crushing with a Perling Blender ⁇ ⁇ ⁇ polytron (manufactured by Kinematica), crushing by ultrasonic waves, crushing the cells with a French press, etc. Crushing by ejecting from a thin nozzle can be mentioned.
  • centrifugal fractionation methods such as differential centrifugation and density gradient centrifugation are mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at a low speed (500-3000 rpm) for a short time (typically about 1-10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a higher speed (1500-3000 rpm) for 30 minutes. Centrifuge for 2 hours, and use the resulting precipitate as the membrane fraction.
  • the membrane fraction is rich in the expressed AQ27 receptor and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • the amount of AQ 2 7 receptor cells or membrane fraction containing the AQ 2 7 receptor is preferably from 1 0 3 to 1 0 8 molecules per fine-cells, 1 0 5-1 0 Preferably, it is seven molecules.
  • a compound that changes the binding property between the peptide of the present invention and the AQ27 receptor a compound that promotes or inhibits the function of the peptide of the present invention
  • a salt thereof for example, an appropriate AQ27 receptor fraction and a labeled peptide of the present invention are used.
  • the AQ27 receptor fraction a natural AQ27 receptor fraction or a recombinant AQ27 receptor fraction having an activity equivalent thereto is desirable.
  • “equivalent activity” means “equivalent ligand binding” Shows activity.
  • the labeled peptide of the present invention for example, the peptide of the present invention labeled with [ 3 H], [ 125 I], [ 14 C], [ 35 S], or the like, or an analog compound thereof can be used. Among them, preferred is the peptide of the present invention labeled with [ 1251 ].
  • a cell or a cell containing the AQ27 receptor containing A receptor preparation is prepared by suspending the membrane fraction in a buffer suitable for screening.
  • the buffer may be any buffer such as a phosphate buffer having a pH of 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) or a buffer such as Tris-HCl buffer, which does not inhibit the binding between the ligand and the receptor.
  • a buffer suitable for screening may be any buffer such as a phosphate buffer having a pH of 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) or a buffer such as Tris-HCl buffer, which does not inhibit the binding between the ligand and the receptor.
  • CHAP S, Twe e n- 80 TM Kao one Atlas
  • digitonin also be added surface active '1 1 Namazai such Dokishikoreto the buffer over .
  • a protease inhibitor such as PMS F, leptin, E-64 (manufactured by Peptide Research Laboratories), and pepstatin can be added for the purpose of suppressing the degradation of the AQ27 receptor and the peptide of the present invention by the protease. . 0.0 1: to the receptor solution I 0 m I, a certain amount added labeled peptide of the present invention (5,000 to 50 0000 cpm), at the same time 1 0 1 () of ⁇ 1 0 one 7 M test Coexist with compounds.
  • a reaction tube containing a large excess of the unlabeled peptide of the present invention is also prepared to determine the non-specific binding amount (NSB).
  • the reaction is carried out at 0 to 50 ° C, preferably 4 to 37 ° C, for 20 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 3 hours.
  • the reaction solution is filtered through a glass fiber filter, washed with an appropriate amount of the same buffer, and the radioactivity remaining on the glass fiber filter is measured with a liquid scintillation counter or a ⁇ -counter.
  • Non-specific binding amount (NS) is subtracted from non-specific binding amount (NSB) from the count when no antagonist is present ( ⁇ .
  • One NSB) the specific binding amount (B—NS B) is defined as 100%.
  • a salt thereof of the present invention Contains AQ27 receptor-mediated cells
  • the t specifically can be measured using the super activity known method or a commercially available assay kit, first cultured cells containing the AQ 2 7 receptor multiwell plate or the like. Prior to screening, the cells were replaced with fresh medium or a suitable buffer that does not show toxicity to cells, and test compounds were added and incubated for a certain period of time. The product is quantified according to the respective method.
  • a substance eg, cAMP, arachidonic acid, etc.
  • an inhibitor for the degrading enzyme is added to perform the assay. You may.
  • activities such as inhibition of cAMP production can be detected as an activity of inhibiting production of cells whose basic production has been increased by forskolin or the like.
  • cells expressing the appropriate AQ27 receptor are required.
  • the cell expressing the AQ27 receptor the above-mentioned AQ27 receptor-expressing cell line is desirable.
  • test compound and the salt that the test compound may form the same as those described above are used.
  • a compound designed to bind to the ligand binding pocket based on the atomic coordinates of the active site of the AQ27 receptor and the position of the ligand binding pocket is preferably used.
  • the atomic coordinates of the active site of the AQ27 receptor and the position of the ligand binding pocket can be measured by a known method or a method analogous thereto.
  • a compound or a salt thereof that changes the binding property between the peptide of the present invention and the AQ27 receptor can be used as the ligand.
  • a compound or a salt thereof that alters the binding between the peptide of the present invention and the AQ27 receptor can be obtained, for example, by carrying out the above-described squaring method of the present invention using the peptide of the present invention as a ligand. Obtainable. .
  • Peptide and AQ 2 7 compounds that alter the binding property between the receptor of the present invention or screening kit of a salt thereof (compounds that promote or inhibit the function of the peptide of the present invention), AQ 2 7 receptor or Its salt, partial peptide of AQ27 receptor Or a salt thereof, a cell containing the AQ27 receptor, or a membrane fraction of a cell containing the AQ27 receptor, and the peptide of the present invention.
  • Examples of the screening kit of the present invention include the following.
  • CHO cells expressing AQ27 receptor were subcultured on a 12-well plate at 5 ⁇ 10 5 cells / well, and cultured at 37 ° C., 5% CO 2 , and 95% air for 2 days.
  • the peptide of the present invention is dissolved to a concentration of 1 mM in PBS containing 0.1% serum albumin (manufactured by Sigma) and stored at 120 ° C.
  • Compounds or salts thereof obtained by using the screening method or screening kit of the present invention are compounds that alter the binding of the peptide of the present invention to the AQ27 receptor (compounds that promote or inhibit the function of the peptide of the present invention) Or a salt thereof, specifically, a compound having a cell stimulating activity via the AQ27 receptor or a salt thereof (so-called AQ27 receptor agonist), or a compound not having the stimulating activity or a compound thereof It is a salt (the so-called AQ27 receptor antagonist).
  • Compounds obtained using the screening method or screening kit of the present invention include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and plasma. These compounds may be novel compounds or may be known compounds.
  • a salt of the compound a salt with a physiologically acceptable acid (eg, an inorganic acid, etc.) or a base (eg, an organic acid, etc.) is used, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable. .
  • salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid) Succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • Succinic acid tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.
  • the binding indicated by the above-mentioned screening methods 1 to 3 After carrying out an atsetic procedure to obtain a compound or a salt thereof that changes the binding property of the peptide of the present invention to the AQ27 receptor (particularly, inhibits the binding), the compound or a salt thereof is converted to the above-described AQ27 receptor.
  • the ability to have cell-stimulating activity through the body is measured.
  • the compound having a cell stimulating activity or a salt thereof is an AQ27 receptor agonist, and the compound having no such activity or a salt thereof is an AQ27 receptor antagonist.
  • Test compound eg, a compound or a salt thereof that changes the binding property between the peptide of the present invention and the AQ27 receptor by performing the binding assay shown in the screening methods (1) to (3) above
  • Is brought into contact with cells containing AQ27 receptor eg, CHO cells
  • the compound having a cell stimulating activity or a salt thereof is an AQ27 receptor agonist.
  • a compound or a salt thereof that activates the AQ27 receptor for example, a peptide agonist of the present invention
  • a salt thereof and a test compound e.g., a compound that binds to the peptide of the present invention and binds to the AQ27 receptor by performing the binding method shown in the above-described screening methods (1) to (3)
  • a salt thereof capable of decreasing the cell stimulating activity of a compound that activates the AQ27 receptor is an AQ27 receptor antagonist.
  • a test compound eg, a compound or a salt thereof that binds to the AQ27 receptor of the present invention and binds to the AQ27 receptor by performing binding and binding by the screening method described in (1) to (3) above.
  • Administer to mammals eg, mice, rats, hamsters, egrets
  • the compound or salt thereof that increases the concentration of corticosteroids or androgens in the blood is the AQ27 receptor agonist.
  • compounds or salts thereof that reduce blood levels of corticosteroids or androgens are AQ27 receptor antagonists.
  • a compound that activates the AQ27 receptor or a salt thereof eg, a peptide agonist of the present invention
  • a non-human mammal eg, mouse, rat, hamster, egret
  • the compound that activates the receptor or a salt thereof and a test compound are administered to non-human mammals (eg, mice, rats, hamsters, rabbits)
  • the amount of adrenocortical hormone or male hormone in blood Measure the concentration and compare.
  • a compound or a salt thereof capable of decreasing the secretion-promoting effect of adrenocortical hormone or androgen in blood by a compound that activates AQ27 receptor is an AQ27 receptor antagonist.
  • the corticosteroid secretion action and the male hormone secretion action can be measured according to Examples 1 to 5 described later.
  • a compound or a salt thereof that alters the binding of the peptide of the present invention to the AQ27 receptor obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention (function of the peptide of the present invention) are useful as safe and low-toxicity regulators of corticosteroid secretion.
  • the AQ 27 receptor agonist or the compound or its salt that promotes the function of the peptide of the present invention has the same action as the physiological activity of the peptide of the present invention on the AQ 27 receptor, Like the peptide of the present invention, it is useful as a safe and low-toxicity corticosteroid secretion regulator, preferably a corticosteroid secretagogue.
  • the AQ27 receptor agonist or the compound of the present invention that promotes the function of the peptide or a salt thereof is hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocortogni, Addison's disease, adrenal gland It is useful as a preventive and therapeutic agent for dysfunction, pain, obesity, etc.
  • the AQ27 receptor agonist or the compound of the present invention that promotes the function of the peptide or a salt thereof is useful as a safe and low-toxicity male mormon secretion regulator, preferably a male hormone secretagogue.
  • the AQ27 receptor agonist or the compound of the present invention that promotes the function of the peptide or a salt thereof includes, for example, male gonad dysfunction, male infertility associated with impaired spermatogenic function, and aplastic anemia. It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for myelofibrosis, renal anemia, pain relief for end-stage female genital cancer, breast cancer (eg, inoperable breast cancer), mastopathy, breast tumor, gynecomastia.
  • a compound or a salt thereof that inhibits the function of the AQ27 receptor antagonist or the peptide of the present invention can suppress the physiological activity of the peptide of the present invention on the AQ27 receptor, and is therefore safe.
  • a low-toxicity corticosteroid secretion regulator preferably a corticosteroid secretion inhibitor (adrenocortic hormone secretion inhibitor).
  • AQ27 receptor antagonists or compounds that inhibit the function of the peptide of the present invention or salts thereof include Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, and aldosterone It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for osteopathy, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, stomach and duodenal ulcer, irritable bowel syndrome, etc. .
  • the AQ27 receptor antagonist or a compound that inhibits the function of the peptide of the present invention or a salt thereof is a safe and low-toxic androgen secretion regulator, preferably an androgen secretion inhibitor (androgen secretion inhibitor). Agent).
  • compounds or salts thereof that inhibit the function of the AQ27 receptor antagonist or the peptide of the present invention include, for example, penile enlargement, testicular atrophy, testicular dysfunction (eg, sperm reduction), menstrual abnormalities, hirsutism, pigmentation, It is useful as a preventive and therapeutic agent for hoarseness, irritability, acne, nausea, vomiting, gastrointestinal symptoms (eg, anorexia), and full moon-like face.
  • a compound obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned therapeutic / prophylactic agent, it can be carried out according to a conventional method.
  • tablets, capsules, elixirs, microcapsules, sterile solutions, suspensions, and the like can be prepared in the same manner as the above-mentioned drug containing the peptide of the present invention.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic and can be used, for example, in humans or warm-blooded animals (for example, mice, rats, puppies, sheep, pigs, puppies, pumas, birds, cats, dogs). , Monkeys, chimpanzees, etc.).
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on its action, target disease, subject to be administered, route of administration, and the like.
  • an AQ27 receptor agonist is orally administered, generally the adult (body weight) is used.
  • the 27 receptor agonist is administered at about 0.1 to 10 Omg, preferably about 1.0 to 5 Omg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • the single dose of the compound varies depending on the administration target, target disease, etc., for example, AQ27 receptor agonist is usually administered in the form of an injection to an adult (per 60 kg body weight).
  • AQ27 receptor agonist is usually administered in the form of an injection to an adult (per 60 kg body weight).
  • about 0.01 to 3 Omg, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to about 10 mg of the compound per day is administered by intravenous injection. Is convenient.
  • the dose can be administered in terms of the body weight per 6 O kg.
  • the AQ27 receptor includes a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, or a G protein-coupled receptor protein thereof. Salt (hereinafter sometimes abbreviated as AQ27 receptor) is used.
  • amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 include, for example, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 1.
  • An amino acid sequence having about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and still more preferably about 95% or more homology with the amino acid sequence represented by 3 is exemplified.
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 according to the present invention include, for example, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: A protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by 11 or SEQ ID NO: 13, and comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 Proteins having substantially the same activity as the above are preferred.
  • substantially equivalent activities include, for example, ligand binding activity, signal information transmission activity, and the like. Substantially the same means that their activities are the same in nature. Therefore, it is preferable that the activities such as the ligand binding activity and the signal transduction activity are equivalent (eg, about 0.5 to 2 times). It may be.
  • Activities such as ligand binding activity and signal information transduction can be measured in the same manner as described above.
  • the AQ27 receptor includes (1) one or two or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 (preferably, about 1 to 30; Preferably about 1 to 10 amino acids, and more preferably several (one or two) amino acid sequences in which amino acid has been deleted, 2 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 1 or 2 (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably several (1 or 2)) amino acids in the amino acid sequence represented by The amino acid sequence represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 (preferably about 1 to 30, more preferably 1 to 1) About 0, more preferably several (1 or 2) amino acids Amino acid sequence was replaced with an amino acid, or 4 well as their deletion, Tsukeka ⁇ 'protein containing a ⁇ amino acid sequence which is a combination of substitutions is used.
  • the AQ27 receptor has an N-terminus (amino terminus) at the left end and a C-terminus (carboxyl terminus) at the right end according to the convention of peptide labeling.
  • AQ27 receptors including proteins consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, usually have C-terminal carboxyl groups (one COOH) and carboxylate. (One COO—), amide (one CONH 2 ) or ester (one COOR).
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl Honoré
  • alkyl groups such as isopropyl, n- heptyl, for example, ⁇ 3 cycloalkyl pentyl, cyclo etc.
  • cyclohexyl - 8 cycloalkyl group for example, phenyl , C 6, such as ⁇ - naphthyl - 12 Ariru group, e.g., benzyl, such as phenethyl A phenylalkyl group or an ⁇ -naphthyl group such as ⁇ -naphthylmethyl, a aralkyl group such as an alkyl group, a piperyloxymethyl group commonly used as an oral ester, and the like are used.
  • the carboxyl group amidated or esterified is also included in the protein of the present invention.
  • the ester for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • the amino group of the methionine residue at the ⁇ -terminal is protected by a protecting group (for example, C i, such as a C 2 _ 6 alkanol group such as a formyl group and an acetyl group).
  • a protecting group for example, C i, such as a C 2 _ 6 alkanol group such as a formyl group and an acetyl group.
  • AQ27 receptor examples include, for example, a human-derived AQ27 receptor comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, and a rat-derived AQ27 receptor comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11.
  • AQ27 receptor, mouse-derived AQ27 receptor comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 and the like.
  • the partial peptide of the AQ27 receptor may be any of the above-mentioned AQ27 receptor partial peptides.
  • the cell membrane A site that is exposed outside and has a receptor binding activity is used.
  • the partial peptide of the AQ27 receptor is a peptide containing a portion analyzed as an extracellular region (hydrophilic site) in a hydrophobicity plot analysis. Further, a peptide partially containing a hydrophobic (Hydrophobic) site can also be used. A peptide containing individual domains may be used, but a peptide containing a plurality of domains at the same time may be used.
  • the number of amino acids of the partial peptide of the AQ 27 receptor is at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 100 or more of the amino acid sequences constituting the AQ 27 receptor. Peptides and the like are preferred.
  • Substantially identical amino acid sequences refer to those amino acid sequences that are at least about 50%, preferably at least about 70%, more preferably at least about 80%, even more preferably at least about 90%, and most preferably The amino acid sequence has about 95% or more homology.
  • substantially the same activity has the same meaning as described above. “Substantially the same activity” can be measured in the same manner as described above.
  • the partial peptide of the AQ27 receptor has one or more (preferably about 1 to 10, more preferably several (1 or 2)) amino acids in the above amino acid sequence deleted. Or one or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, and more preferably several (1 or 2)) amino acids are added to the amino acid sequence. One or more (preferably about 1 to 10, more preferably about 1 to 5, more preferably several (1 or 2)) amino acids in the amino acid sequence It may be substituted with another amino acid.
  • the portion of the AQ 27 receptor peptide C 'terminus is usually in the carboxyl group (_C OOH), carboxylate (one COO-), be any amino-de (one CONH 2) or E ester of (one COOR) Good.
  • the partial peptide of the AQ27 receptor has a N-terminal methionine residue whose amino group is protected by a protecting group, and the N-terminal is cleaved in vivo.
  • the resulting glutamyl group is pyroglutamine-oxidized, the one in which the substituent on the side chain of the amino acid of the molecule is protected with an appropriate protecting group, Or a complex peptide such as a so-called sugar peptide to which a sugar chain is bonded is also included.
  • a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with conodic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc. are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • any DNA may be used as long as it contains the nucleotide sequence encoding the AQ27 receptor described above.
  • it may be any of genomic DNA, genomic DNA library, the above-mentioned cDNA derived from cells and tissues, the above-mentioned cDNA library derived from cells and fibroblasts, and synthetic DNA.
  • the vector used in the library may be any of pacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • RT_PCR method Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
  • the DNA encoding the AQ27 receptor includes, for example, a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, or SEQ ID NO: 14, or SEQ ID NO: 10, DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 14 and DNA that hybridizes under high stringent conditions, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or Any DNA encoding an AQ27 receptor having substantially the same activity as the AQ27 receptor consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 (eg, ligand binding activity, signal transduction action, etc.) It may be.
  • Examples of a DNA that hybridizes under high stringent conditions with DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, or SEQ ID NO: 14 include, for example, SEQ ID NO: 10 About 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and still more preferably about 95% or more, with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 14.
  • Base sequence For example, a DNA containing a column is used.
  • Hybridization is carried out according to a method known per se or a method analogous thereto, for example, a method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab.Press, 1989). You can do it.
  • a commercially available library it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be carried out under high stringent conditions.
  • the high stringent conditions include, for example, a sodium concentration of about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and a temperature of about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 65 ° C. Indicates conditions. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C. is most preferable.
  • DNA encoding the human AQ27 receptor consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 a DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 or the like is used.
  • DNA encoding the rat AQ27 receptor consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 a DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 12 or the like is used.
  • DNA encoding the mouse AQ27 receptor consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 a DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 14, or the like is used.
  • the human AQ27 receptor, a partial peptide thereof or a salt thereof can be produced according to the method described in WO01 / 16316.
  • Rat or mouse AQ27 receptor, its partial peptide or its salt is a novel protein, and is produced according to the method described in WO0116316. 3 011160
  • the peptide of the present invention, the oligonucleotide of the present invention, the transformant of the present invention or the antibody of the present invention can be used in a method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the expression of the peptide of the present invention. it can.
  • the present invention provides a method for screening a compound or a salt thereof which promotes or inhibits the expression of a peptide of the present invention, which comprises measuring and comparing the amount of NA.
  • Examples of cells or tissues that can express the peptide of the present invention include human warm-blooded animals (eg, guinea pigs, rats, mice, chickens, rabbits, pigs, sheep, pigs, monkeys, etc.) (eg, nerve cells).
  • human warm-blooded animals eg, guinea pigs, rats, mice, chickens, rabbits, pigs, sheep, pigs, monkeys, etc.
  • nerve cells eg, nerve cells.
  • Endocrine cells Endocrine cells, neuroendocrine cells, glial cells, knee cells, bone marrow cells, hepatocytes, spleen cells, mesangial cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, adipocytes, Immune cells (eg, macrophages, ⁇ cells, ⁇ cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes, dendritic cells), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, Osteocytes, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, or stromal cells, or precursors, stem cells, or cancer cells of these cells, or any of those cells Tissues, for example, brain, various parts of the brain (eg, olfactory bulb, amygdala, basal sphere, hippocampus, thalamus, hypothalamus, cerebral cortex,
  • the method for culturing cells capable of expressing the peptide of the present invention comprises the method of 1160
  • test compound a DNA library or the like can be used in addition to the test compounds described above.
  • the expression level of the peptide of the present invention can be measured by a known method such as an immunochemical method using an antibody or the like, or mRNA encoding the peptide of the present invention can be expressed by the Northern hybridization method or RT.
  • PCR TaqMan PCR can also be performed by a known method.
  • the amount of the mRNA encoding the peptide of the present invention was measured by measuring RNA extracted from cells according to a known method and the polynucleotide of the present invention or a part thereof or the antisense polynucleotide of the present invention. This is performed by measuring the amount of the mRNA of the present invention or a part thereof or the antisense polynucleotide-bound mRNA of the present invention.
  • the polynucleotide of the present invention or a part thereof or the antisense polynucleotide of the present invention By labeling the polynucleotide of the present invention or a part thereof or the antisense polynucleotide of the present invention with, for example, a radioisotope, a dye or the like, the polynucleotide of the present invention or a part thereof or the antisense polynucleotide of the present invention can be obtained.
  • the amount of bound mRNA can be easily measured.
  • the radioisotope for example, 32 P, 3 H or the like is used.
  • fluorescein FAM manufactured by PE Biosystems
  • JOE manufactured by PE Biosystems
  • TAMRA manufactured by PE Biosystems
  • ROX PE Biosystems
  • Cy5 Amershara
  • Cy3 Amersham
  • the amount of mRNA is determined by converting RNA extracted from cells into cDNA using a reverse enzyme and then amplifying it by PCR using the polynucleotide of the present invention or a part thereof or the antisense polynucleotide of the present invention as a primer. This can be done by measuring the amount of cDNA.
  • a test for increasing the amount of mRNA encoding the peptide of the present invention The compound can be selected as a compound having an activity of promoting the expression of the peptide of the present invention or a salt thereof, and a test compound that reduces the amount of mRNA encoding the peptide of the present invention can be used. It can be selected as a compound having an activity of inhibiting the expression of the peptide of the present invention or a salt thereof.
  • a transformant transformed with the recombinant DNA, in which a reporter gene is ligated downstream of the promoter region or enhancer region of the gene encoding the peptide of the present invention, can be used in the presence or absence of a test compound. It is intended to provide a method for screening a compound or a salt thereof which promotes or inhibits one activity of the promoter, which comprises measuring and comparing the respective reporter activities when cultured in the presence.
  • Reporter genes include, for example, 1 ac Z ( ⁇ -galactosidase gene), chloramphenicol acetinol transferase (CAT), luciferase, growth factors, ⁇ -glucuronidase, anorecali phosphatase, Green fluorescent protein (GFP) ), J3-lactamase and the like are used.
  • a test compound that increases the amount of the reporter gene product can be used to control the activity of the peptide promoter or enhancer of the present invention.
  • a test compound that reduces the amount of a reporter gene product is replaced with a compound or a salt thereof that has an effect of controlling (particularly inhibiting) the activity of the peptide promoter or enhancer of the peptide of the present invention.
  • a salt thereof which has the activity of inhibiting the expression of the peptide.
  • the transformant can be cultured in the same manner as the above-described transformant of the present invention.
  • the vector construction of the reporter gene can be performed according to known techniques. (Eg, Molecular Biotechnology 13, 29-43, 1999).
  • the compound of the present invention having the activity of promoting the expression of the peptide or a salt thereof can enhance the action of the peptide of the present invention, it is as safe and low-toxic as the peptide of the present invention. It is useful as a secretion regulator, preferably a corticosteroid secretagogue. Further, the compound having an activity of promoting the expression of the peptide of the present invention or a salt thereof may be hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain, fertilization. It is useful as a preventive and therapeutic agent for fullness.
  • the compound having an activity of promoting the expression of the peptide of the present invention or a salt thereof is useful as a safe and low toxic androgen secretion regulator, preferably a androgen secretagogue.
  • compounds having an activity of promoting the expression of the peptide of the present invention or salts thereof include, for example, male gonad dysfunction, male infertility associated with impaired spermatogenic function, aplastic anemia, myelofibrosis, renal anemia It is useful as a pain relieving agent for terminal genital cancer, as a preventive and therapeutic agent for breast cancer (eg, inoperable breast cancer), mastopathy, breast tumor, gynecomastia.
  • the compound of the present invention having the activity of inhibiting the expression of the peptide or a salt thereof can suppress the physiological activity of the peptide of the present invention. It is preferably useful as a corticosteroid secretion inhibitor (adrenocortical hormone secretion inhibitor).
  • the compound having an activity of inhibiting the expression of the peptide of the present invention or a salt thereof includes Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, stomach / duodenal ulcer, irritable bowel syndrome, etc.
  • the compound having an activity of inhibiting the expression of the peptide of the present invention or a salt thereof is useful as a safe and low toxic androgen secretion regulator, preferably a androgen secretion inhibitor (androgen secretion inhibitor).
  • the compound having an activity of inhibiting peptide expression of the present invention or a salt thereof includes, for example, penile enlargement, testicular atrophy, testicular dysfunction (eg, sperm reduction), menstrual abnormalities, hirsutism, pigmentation , Hoarseness, It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for hypersensitivity, acne, nausea, vomiting, gastrointestinal symptoms (eg, anorexia), full moon-like face, etc.
  • Compounds or salts thereof obtained using the screening method or screening kit of the present invention include, for example, peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissues It is a compound selected from extracts, plasma, etc.
  • salt of the compound those similar to the aforementioned salts of the peptide of the present invention are used.
  • a compound obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned therapeutic / prophylactic agent, it can be carried out according to a conventional method.
  • tablets, capsules, elixirs, microcapsules, sterile solutions, suspensions, and the like can be prepared in the same manner as the above-mentioned drug containing the peptide of the present invention. ,.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, for example in humans or warm-blooded animals (eg mice, rats, puppies, sheep, stags, puppies, puppies, pomas, birds, cats, dogs, Monkeys, chimpanzees, etc.).
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on its action, target disease, subject to be administered, route of administration, and the like.
  • a compound or its salt that promotes expression of the peptide of the present invention is orally administered.
  • the compound in adults (per 60 kg body weight), the compound is used in an amount of about 0.1 to 10 Omg per day, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 10 to 50 mg per day.
  • the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, etc.
  • a compound or its salt that promotes expression of the peptide of the present invention is usually administered in the form of an injection.
  • the compound When administered to an adult (per 6 kg of body weight), the compound is administered in an amount of about 0.01 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 20 mg per day. It is convenient to administer about 1 Omg by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of weight per 60 kg.
  • These medicaments can be formulated and used as described above.
  • the antibody of the present invention can specifically recognize the peptide of the present invention, it can be used for quantification of the peptide of the present invention in a test solution, particularly for quantification by a sandwich immunoassay. .
  • one antibody may be an antibody that recognizes the N-terminal of the peptide of the present invention, and the other antibody may be an antibody that reacts with the C-terminal of the peptide of the present invention. desirable.
  • the peptide of the present invention can be quantified using a monoclonal antibody against the peptide of the present invention, and can also be detected by tissue staining or the like.
  • an antibody molecule itself may be used, also, of the antibody molecule F (ab ') 2, F ab', or Yo Le be used F ab fraction 0
  • the method for quantifying the peptide of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited, and may be an antibody, antigen, or antibody-antigen corresponding to the amount of antigen (eg, the amount of peptide) in the test solution. Any method that detects the amount of the complex by chemical or physical means and calculates this from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen can be used. Good. For example, nephelometry, a competitive method, an immunometric method and a sandwich method are preferably used, but it is particularly preferable to use a sandwich method described later in terms of sensitivity and specificity.
  • a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used.
  • the radioisotope for example, [ 125 I], [ 131 I], [ 3 H], and [ 4 C] are used.
  • the above enzyme Preferred are those which are stable and have a large specific activity.
  • -galactosidase, ⁇ -gnorecosidase, phenolic phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used.
  • the fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescein isothiosinate and the like are used.
  • the luminescent substance for example, noreminore, luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used. Further, a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass.
  • a test wave is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with another labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction).
  • primary reaction By measuring the activity of the agent, the amount of the peptide of the present invention in the test solution can be determined.
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, simultaneously, or at staggered times!
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be in accordance with those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily required to be one type, and two or more types of antibodies may be used for the purpose of improving the measurement sensitivity and the like. Mixtures may be used.
  • the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody having a different site to which the peptide of the present invention binds.
  • the antibodies used in the primary reaction and the secondary reaction are preferably used, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the peptide of the present invention.
  • an antibody that recognizes other than the C-terminal, for example, the ⁇ -terminal is used.
  • a measurement system other than the sandwich method using the monoclonal antibody of the present invention for example, It can be used for competition method, immunometric method or nephrometry. '
  • the antigen in the test solution and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, and then the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated.
  • B / F separation Measure the amount of either B or F to quantify the amount of antigen in the test solution.
  • a soluble phase is used as the antibody
  • B / F separation is performed using polyethylene glycol
  • a liquid phase method using a second antibody against the antibody or a solid phased antibody is used as the first antibody.
  • An immobilization method using a soluble antibody as the first antibody and an immobilized antibody as the second antibody is used.
  • an antigen in a test solution and a solid phase antigen are subjected to a competitive reaction with a fixed amount of a labeled antibody and then separated into a solid phase and a liquid phase. Is allowed to react with an excess amount of the labeled antibody, and then the immobilized antigen is added to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of label in either phase is measured to determine the amount of antigen in the test solution.
  • the amount of insoluble sediment produced as a result of an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.
  • the peptide measuring system of the present invention may be constructed by adding ordinary technical considerations of those skilled in the art to ordinary conditions and operation methods in each method. For details of these general technical means, refer to reviews and publications.
  • the peptide of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • a decrease in the concentration of the peptide of the present invention is detected by quantifying the concentration of the peptide of the present invention using the antibody of the present invention, for example, it is associated with dysfunction of the peptide of the present invention. It can be diagnosed as a disease or likely to be affected in the future.
  • an increase in the concentration of the peptide of the present invention is detected, for example, it can be diagnosed that the disease is caused by overexpression of the peptide of the present invention or that the disease is likely to be caused in the future.
  • Diseases associated with dysfunction of the peptide of the present invention include, for example, hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain, obesity, male gonads Dysfunction, male infertility associated with spermatogenetic dysfunction, aplastic anemia, myelofibrosis, renal anemia, pain relief for terminal female genital cancer, breast cancer (eg, inoperable breast cancer), breast disease, breast tumor, female Included breasts.
  • Diseases caused by overexpression of the peptide of the present invention include, for example, Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital sexual adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, stomach-duodenal ulcer, irritable bowel syndrome, penile enlargement, testicular atrophy, testicular dysfunction (eg, decreased sperm), abnormal menstruation, Hirsutism, pigmentation, hoarseness, irritability, acne, nausea, vomiting, digestion Systemic symptoms (eg, loss of appetite), full moon-like face, etc.
  • Cushing's disease Cushing's syndrome
  • adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor CRH-producing tumor
  • aldosterone-producing tumor aldosteronism
  • the antibody of the present invention can be used for detecting the peptide of the present invention present in a subject such as a body fluid or a tissue.
  • a subject such as a body fluid or a tissue.
  • detection of the peptide of the present invention in each fraction at the time of purification, analysis of the behavior of the peptide of the present invention in test cells, etc. Can be used.
  • the polynucleotide of the present invention or the antisense polynucleotide of the present invention can be used, for example, in a human or warm-blooded animal (eg, rat, mouse, guinea pig, egret, bird, sheep, pig, pig) by using it as a probe. , Poma, cat, dog, monkey, etc.), the abnormality (gene abnormality) of DNA or mRNA encoding the peptide of the present invention can be detected. It is useful as a gene diagnostic agent for damage, mutation or decreased expression, or addition or overexpression of the DNA or mRNA.
  • the above-described genetic diagnosis using the polynucleotide of the present invention or the antisense polynucleotide of the present invention can be performed, for example, by the known Northern hybridization or PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, 8). Procedings of the National Academy of Sciences of the Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America), pp. 86, 276-6-277, pp. 1989).
  • expression reduction when expression reduction is detected by Northern hybridization, for example, it can be diagnosed that the disease is highly likely to be a disease associated with dysfunction of the peptide of the present invention or is likely to be affected in the future. it can.
  • overexpression When overexpression is detected by Northern hybridization, for example, it is diagnosed that there is a high possibility that the disease is caused by overexpression of the peptide of the present invention or that there is a high possibility that the disease will be caused in the future. Can be.
  • Diseases caused by reduced expression of the peptide of the present invention include, for example, low aldos Heronism, hypocortisolemia, secondary or chronic adrenal insufficiency, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain, obesity, male gonad insufficiency, male infertility associated with dysgenesis dysfunction, aplastic anemia, Myelofibrosis, renal anemia, pain relief for end-stage female genital cancer, breast cancer (eg, inoperable breast cancer), mastopathy, breast tumors, gynecomastia.
  • diseases caused by overexpression of the peptide of the present invention include Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary S, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, and primary cortisol resistance , Congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, stomach + duodenal ulcer, irritable bowel syndrome, penile enlargement, testicular atrophy, testicular dysfunction (eg, sperm loss), Menstrual abnormalities, hirsutism, hyperpigmentation, hoarseness, irritability, acne, nausea, vomiting, gastrointestinal symptoms (eg, anorexia), full moon-like face, etc.
  • the antisense polynucleotide of the present invention which can complementarily bind to the polynucleotide (eg, DNA) of the present invention and suppresses the expression of the polynucleotide (eg, DNA), has low toxicity, Can suppress the function of the receptor protein of the present invention or the polynucleotide (eg, DNA) of the present invention in, for example, a prophylactic / therapeutic agent for a disease caused by overexpression of the peptide of the present invention. Can be used.
  • an antisense polynucleotide eg, antisense DNA
  • a corticosteroid secretion regulator preferably a corticosteroid It is useful as a secretion inhibitor (adrenocortical hormone secretion inhibitor).
  • the antisense polynucleotide against the DNA of the present invention includes Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, gastric / duodenal ulcer, irritable bowel syndrome, etc.
  • the antisense polynucleotide against the DNA of the present invention is useful as a safe and low toxic androgen secretion regulator, preferably a androgen secretion inhibitor (androgen secretion inhibitor).
  • the antisense polynucleotide to the DNA of the present invention may be used, for example, for male gonad dysfunction, male infertility associated with impaired dysgenesis, aplastic anemia, myelofibrosis, renal anemia, pain in terminal female genital cancer. It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for palliation, breast cancer (eg, inoperable breast cancer), mastosis, breast tumors, and female breasts.
  • the antisense polynucleotide when used as the above-mentioned therapeutic / prophylactic agent, the antisense polynucleotide can be formulated in the same manner as in the case of the above-mentioned polynucleotide of the present invention.
  • the preparations obtained in this way have low toxicity and are orally or parenterally administered to humans or mammals (eg rats, puppies, hidges, pigs, puppies, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered in a controlled manner.
  • humans or mammals eg rats, puppies, hidges, pigs, puppies, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the antisense polynucleotide can be administered as it is, or together with a physiologically acceptable carrier such as a supplement for promoting uptake, using a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
  • a physiologically acceptable carrier such as a supplement for promoting uptake, using a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
  • the dose of the antisense polynucleotide varies depending on the target disease, the subject to be administered, the route of administration, and the like, but, for example, the antisense nucleotide of the present invention may be used for the treatment of cancer in organs (eg, liver, lung, heart, When administered topically to the kidneys, etc., an adult (body weight 60 kg) can be administered approximately 0.1 to a day! O O mg.
  • organs eg, liver, lung, heart, When administered topically to the kidneys, etc., an adult (body weight 60 kg) can be administered approximately 0.1 to a day! O O mg.
  • the antisense polynucleotide can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence or expression of the DNA of the present invention in tissues or cells.
  • the present invention further provides
  • RNA containing a portion of the RNA encoding the peptide of the present invention and an RNA complementary thereto
  • RNAi double-stranded RNAs
  • ribozymes and the like can suppress the expression of the polynucleotide (eg, DNA) of the present invention in the same manner as the above-mentioned antisense polynucleotide.
  • a corticosteroid secretion regulator preferably a corticosteroid secretion inhibitor (adrenocortex) It is useful as a hormone secretion inhibitor.
  • Cushing's disease Cushing's syndrome
  • adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumors CRH-producing tumors
  • aldosterone-producing tumors aldosteronism
  • primary cortisol resistance congenital It is useful as a preventive and therapeutic agent for sexual adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, stomach and duodenal ulcer, and irritable bowel syndrome.
  • RNAs, ribozymes and the like are useful as safe and low-toxicity male hormone secretion regulators, preferably as male hormone secretion inhibitors (male hormone secretion inhibitors).
  • these double-stranded RNAs, lipozymes, etc. can be used, for example, to relieve male gonad dysfunction, male infertility associated with impaired spermatogenic function, aplastic anemia, myelofibrosis, renal anemia, and pain relief for terminal female genital cancer It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for breast cancer (eg, inoperable breast cancer), mastopathy, mammary gland tumors, and women's breasts.
  • the double-stranded RNA can be designed and manufactured based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, Nature, vol. 411, p. 494, 2001).
  • the ribozyme can be designed and manufactured based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, TRENDS in Molecular Medicine, Vol. 7, pp. 221, 2001). For example, it can be produced by linking a known lipozyme to a part of RNA encoding the peptide of the present invention.
  • RNA fragment As a part of the RNA encoding the peptide of the present invention, a portion (RNA fragment) close to a cleavage site on the RNA of the present invention, which can be cleaved by a known ribozyme, can be mentioned.
  • RNA fragment RNA fragment close to a cleavage site on the RNA of the present invention, which can be cleaved by a known ribozyme
  • the antibody of the present invention which has the activity of neutralizing the activity of the peptide of the present invention, can be used, for example, as a medicament such as a drug for preventing or treating diseases caused by overexpression of the peptide of the present invention. it can.
  • an antibody against the peptide of the present invention eg, a neutralizing antibody
  • a corticosteroid secretion regulator preferably a corticosteroid secretion inhibitor ( It is useful as a corticosteroid secretion inhibitor).
  • an antibody against the peptide of the present invention is useful as a safe and low toxic androgen secretion regulator, preferably a androgen secretion inhibitor (androgen secretion inhibitor).
  • antibodies against the peptide of the present invention include, for example, male gonad dysfunction, male infertility associated with impaired spermatogenic function, aplastic anemia, myelofibrosis, renal anemia, pain relief for terminal female genital cancer, breast cancer ( It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for, for example, inoperable breast cancer), mastosis, lunar ulcer of the mammary gland, and women's breast.
  • the therapeutic or prophylactic agent for the above-mentioned diseases containing the antibody of the present invention can be used as it is as a liquid preparation or as a pharmaceutical composition in an appropriate dosage form, in humans or mammals (eg, rat, rabbit, egret, pigeon, pig, It can be administered orally or parenterally to cats, dogs, monkeys, etc.).
  • the dosage varies depending on the administration subject, target disease, symptoms, administration route, and the like.For example, when used for adults, the antibody of the present invention is usually used in a dose of 0.01 to 20 mg / dose.
  • kg body weight preferably about 0.1 to 10 mg / kg body weight, more preferably about 0.1 to 5 mg / kg body weight, about 1 to 5 times a day, preferably about 1 to 3 times a day
  • Administered by intravenous injection Is convenient. In the case of other parenteral administration and oral administration, an equivalent dose can be administered. If the symptoms are particularly severe, the dosage may be adjusted according to the symptoms.
  • the antibodies of the present invention can be administered by themselves or as a suitable pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for the above administration contains the above or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • Such compositions are provided in dosage forms suitable for oral or parenteral administration.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (soft capsules). And syrups, emulsions, suspending agents and the like.
  • Such a composition is produced by a method known per se and contains a carrier, a diluent or a diluent commonly used in the field of formulation.
  • a carrier for example, lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for tablets.
  • compositions for parenteral administration for example, injections, suppositories, etc. are used.
  • Injections are in the form of intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, drip injections, etc. Is included.
  • Such injections are prepared according to a method known per se, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the antibody or a salt thereof in a sterile aqueous or oily liquid commonly used for injections.
  • aqueous liquid for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other auxiliary agents and the like are used, and a suitable solubilizing agent, for example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants [eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)] and the like may be used in combination.
  • alcohol eg, ethanol
  • polyalcohol eg, Propylene glycol, polyethylene glycol
  • nonionic surfactants eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as a solubilizing agent.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • a suppository for rectal administration is prepared by mixing the antibody or a salt thereof with a conventional suppository base.
  • the above-mentioned oral or parenteral pharmaceutical composition is conveniently prepared in a dosage unit form so as to be compatible with the dosage of the active ingredient. Examples of such dosage unit forms include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), and suppositories, and usually 5 to 500 mg per dosage unit form, and especially 5 to 1 mg for injections. It is preferable that the above-mentioned antibody is contained in an amount of 10 to 250 mg in other dosage forms.
  • compositions may contain another active ingredient as long as the composition does not cause an undesirable interaction with the above-mentioned antibody.
  • AQ27 receptor a corticosteroid secretagogue, (ii) hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenalism, Addison's disease, Prevention and treatment of adrenal insufficiency, pain, obesity, etc., (iii) androgen secretagogue, (iv) male gonad dysfunction, male infertility associated with impaired dysgenesis, aplastic anemia, myelofibrosis, Renal anemia, end-stage women Pain relief for genital cancer, breast cancer (eg, inoperable breast cancer), preventive and remedy for breast disease (eg, inoperable breast cancer), mastopathy, breast tumor, gynecomastia, etc.
  • a corticosteroid secretagogue e.g) hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenalism, Addison's disease, Prevention and treatment of adrenal insufficiency, pain, obesity, etc.
  • V Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol therapy Disease, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, stomach, twelve finger ⁇ horn ulcers, prevention, such as irritable bowel syndrome • treatment, (V ii) male hormone secretion inhibition Drugs (male hormone secretion inhibitors) or (viii) penile hypertrophy, testicular atrophy, testicular dysfunction (eg, sperm loss), menstrual abnormalities, hyperplasia, pigmentation, hoarseness, irritability, acne, nausea, vomiting , Gastrointestinal symptoms (eg, loss of appetite), full moon-like facial and other prophylactic and therapeutic agents, and methods to confirm that they bind to the AQ27 receptor,
  • AQ27 receptor is used, (i) corticosteroids Secretagogues, (ii) hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, addison's disease, adrenal insufficiency, pain, obesity, etc. Drugs or or (iv) male gonad dysfunction, • male infertility associated with imperfect dysgenesis, aplastic anemia, myelofibrosis, renal anemia, pain relief for terminal female genital cancer, breast cancer (eg, inoperable Breast cancer), mastopathy, breast tumors, gynecomastia, etc. How to confirm that preventive and therapeutic drugs are agonists for AQ27 receptor,
  • AQ27 receptor is used, (i) adrenocortical hormone secretion inhibitor (adrenal corticosteroid secretion inhibitor), (ii) Cushing's disease, Cushing's syndrome, and adrenocorticotropic hormone production Pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, stomach, duodenal ulcer, irritable bowel syndrome, etc.
  • adrenocortical hormone secretion inhibitor adrenal corticosteroid secretion inhibitor
  • Cushing's disease Cushing's syndrome
  • adrenocorticotropic hormone production Pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia
  • This confirmation method is carried out by using the above-mentioned drug in place of the test compound in the above-described method for screening a compound that alters the binding property between the peptide and the AQ27 receptor of the present invention. Can be.
  • the kit for confirmation and method of the present invention is a kit for screening a compound that alters the binding property between the peptide of the present invention and an AQ27 receptor, wherein the kit contains the above drug in place of the test compound. Is what you do.
  • the present invention has a DNA encoding the exogenous peptide of the present invention (hereinafter abbreviated as the exogenous DNA of the present invention) or a mutant DNA thereof (sometimes abbreviated as the exogenous mutant DNA of the present invention).
  • a non-human mammal is provided.
  • the non-human mammal having the exogenous DNA of the present invention or the mutant DNA thereof is an embryo containing an unfertilized egg, a fertilized egg, a sperm, and its progenitor cells.
  • the DNA transgenic animal of the present invention is an embryo containing an unfertilized egg, a fertilized egg, a sperm, and its progenitor cells.
  • cells and the like preferably at the stage of embryonic development in non-human mammal development (more preferably at the stage of single cells or fertilized eggs and generally before the 8-cell stage), calcium phosphate method, electric pulse method, It can be produced by transferring the target DNA by the ribofection method, agglutination method, microinjection method, particle gun method, DEAE-dextran method, or the like.
  • the exogenous DNA of the present invention can be transferred to somatic cells, organs of living organisms, tissue cells, and the like, and used for cell culture, tissue culture, and the like. Can be fused with the above-mentioned germ cells by a cell fusion method known per se to produce the DNA transgenic animal of the present invention.
  • mice for example, Japanese lions, stags, higgs, goats, puppies, dogs, cats, guinea pigs, wild animals, mice, mice, rats and the like are used.
  • rodents with relatively short ontogeny and biological cycle in terms of the preparation of disease animal model systems, and rodents that are easy to breed especially mice (for example, C57BL / 6 strain and DBA2 strain as pure strains) B6C3F ⁇ , BDF, strain, B6D2Fj, BALB / c, ICR, etc.) (For example, Wis! Ar, SD, etc.) are preferable.
  • Examples of the “mammal” in the recombinant vector that can be expressed in mammals include humans in addition to the above-mentioned non-human mammals.
  • the exogenous DNA of the present invention is not the DNA of the present invention originally possessed by a non-human mammal, but is once isolated from a mammal. Refers to the extracted DNA of the present invention.
  • mutant DNA of the present invention those in which a mutation (for example, mutation) has occurred in the base sequence of the original DNA of the present invention, specifically, addition of base, deletion, substitution with another base, etc. DNA that has been used is used, and abnormal DNA is also included.
  • the abnormal DNA means a DNA that expresses an abnormal peptide of the present invention.
  • DNA that expresses a peptide that suppresses the function of a normal peptide of the present invention is used.
  • the exogenous DNA of the present invention may be derived from a mammal of the same or different species as the animal of interest.
  • DNAs derived from various mammals eg, egrets, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.
  • DNAs derived from various mammals eg, egrets, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.
  • the present invention is achieved by microinjecting a DNA construct (eg, a vector, etc.), to which the human DNA of the present invention is bound, into a fertilized egg of a target mammal, for example, a mouse fertilized egg, downstream of various promoters capable of expressing E. coli.
  • a DNA-transferred mammal that highly expresses the DNA of the present invention can be produced.
  • Examples of expression vectors for the peptide of the present invention include plasmids derived from Escherichia coli, plasmids derived from Bacillus subtilis, plasmids derived from yeast, batter phages such as phage, retroviruses such as Moroni leukemia virus, animals such as vaccinia virus or baculovirus. A virus or the like is used. Among them, a plasmid derived from E. coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis or a plasmid derived from yeast are preferably used.
  • promoters that regulate the above-mentioned DNA expression include: (1) promoters of DNAs derived from viruses (eg, Simian virus, cytomegalovirus, Moroni leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.) (2) Promoters derived from various mammals (human, egret, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.), for example, albumin, insulin II, peropkin II, elastase, erythropoietin, endothelin, muscle creatine Kinase, glial fibrillary acidic protein, daltathione S-transferase, platelet-derived growth factor / 3, keratin K1,10,14,14 collagen, type I and type II, cyclic AMP-dependent protein ZE] 3 I-subunit, dystrophin, tartaric acid Anti-algic phosphatase, atrial sodium diuretic factor, endotheli
  • the vector preferably has a sequence that terminates the transcription of the messenger RNA of interest in a DNA-transferred mammal (generally called a terminator).
  • a terminator For example, DNs derived from viruses and various mammals can be used.
  • the sequence of A can be used.
  • the SV40 terminator of Simian virus is used.
  • the splicing signal of each DNA, the enhancer region, a part of the intron of eukaryotic DNA, etc. are placed 5 'upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region, or can also the purpose be connected to 35 downstream of the coding region.
  • the normal translation region of the peptide of the present invention includes DNA derived from liver, kidney, thyroid cells, fibroblasts derived from humans or various mammals (eg, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.). All or part of genomic DNA from various commercially available genomic DNA libraries, or complementary DNA prepared by known methods from liver, kidney, thyroid cell, or fibroblast-derived RNA can be used as a raw material. I can do it.
  • the abnormal DNA of the foreign origin can produce a translation region obtained by mutating the translation region of a normal peptide obtained from the above cells or tissues by point mutagenesis.
  • the translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a transgenic animal by a conventional DNA engineering technique in which the translation region is ligated downstream of the promoter and, if desired, upstream of the transcription termination site.
  • Transfer of the exogenous and live DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germinal and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA transfer means that all the progeny of the produced animal and the exogenous DNA of the present invention will be present in all of the germ cells and somatic cells. It means holding A.
  • the progeny of such an animal that inherits the exogenous DNA of the present invention has the exogenous DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells.
  • the non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred can be subcultured in a normal breeding environment as a DNA-bearing animal after confirming that the exogenous DNA is stably retained by the crossing. I can do it. '
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in excess in all germinal and somatic cells of the target mammal.
  • Excessive presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA transfer It means that all the offspring of the produced animal have an excess of the exogenous DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells.
  • the progeny of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have an excess of the exogenous DNA of the present invention in all of their germ cells and somatic cells.
  • the normal DNA of the present invention is highly expressed, and the function of the peptide of the present invention is ultimately promoted by promoting the function of endogenous normal DNA. It can develop hypertension and can be used as a model animal for the disease. For example, using the normal DNA-transferred animal of the present invention, elucidation of the pathological mechanism of hyperactivity of the peptide of the present invention and diseases associated with the peptide of the present invention, and examination of treatment methods for these diseases. It is possible.
  • the mammal into which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the released peptide of the present invention, it can be used in screening tests for therapeutic drugs for diseases related to the peptide of the present invention. Is also available.
  • a non-human mammal having the exogenous abnormal DNA of the present invention can be subcultured in a normal breeding environment as an animal having the DNA after confirming that the exogenous DNA is stably maintained by mating. I can do it. Furthermore, the desired foreign DNA can be incorporated into the above-mentioned plasmid and used as a raw material.
  • a DNA construct with a promoter can be prepared by ordinary DNA engineering techniques. Transfer of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germinal and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the abnormal DNA of the present invention in the germ cells of the produced animal after DNA transfer means that all the offspring of the produced animal have the abnormal DNA of the present invention in all of the embryonic and somatic cells. .
  • the offspring of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have the abnormal DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells. Obtain a homozygous animal having the introduced DNA on both homologous chromosomes, and breed these male and female animals In this way, all the offspring can be bred to have the DNA.
  • the non-human mammal having the abnormal DNA of the present invention expresses the abnormal DNA of the present invention at a high level, and eventually impairs the function of the peptide of the present invention by inhibiting the function of endogenous normal DNA. It may be active refractory and can be used as a model animal for the disease. For example, using the abnormal DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of the function-inactive refractory of the peptide of the present invention and to examine a method for treating this disease.
  • the abnormal DNA highly expressing animal of the present invention can be used to inhibit the function of a normal peptide by the abnormal peptide of the present invention in the inactive refractory disease of the peptide of the present invention (dominant negative). Action).
  • the mammal into which the foreign abnormal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the released peptide of the present invention
  • the therapeutic agent for the refractory disease of the peptide of the present invention or a functionally inactive type refractory disease is used. It can also be used for testing.
  • a peptide specifically expressed or activated by the peptide of the present invention by directly analyzing DNA or RNA in the tissue of the DNA-transferred animal of the present invention or by analyzing a peptide tissue expressed by the DNA. Analysis of the relationship with
  • the DNA-transferred animal of the present invention in order to develop a therapeutic agent for the peptide-related disease of the present invention, including the inactive refractory type of the peptide of the present invention, using the DNA-transferred animal of the present invention, It is possible to provide an effective and rapid method for screening for a therapeutic agent for the disease by using an assay method or the like. Further, using the DNA translocation product of the present invention or the exogenous DNA expression vector of the present invention, it is possible to examine and develop a method for treating a DNA-associated disease of the present invention using the DNA.
  • the present invention provides a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated, and a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
  • the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, a [3-galactosidase gene derived from E. coli);
  • a reporter gene eg, a [3-galactosidase gene derived from E. coli
  • a non-human mammal according to (vi) which can be expressed under the control of a promoter for DNA;
  • test compound is administered to the non-human mammal described in (viii), wherein the rodent is a mouse, and the animal described in (X) (vii), and the expression of the reporter gene is detected.
  • the present invention also provides a method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of a promoter for DNA of the present invention.
  • the non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated are artificially mutated to the DNA of the present invention possessed by the non-human mammal to suppress the DNA expression ability, Alternatively, by substantially losing the activity of the peptide of the present invention encoded by the DNA, the DNA does not substantially have the ability to express the peptide of the present invention (hereinafter referred to as the knockout DNA of the present invention).
  • ES cells embryonic stem cells of non-human mammals
  • non-human mammal the same one as described above is used.
  • the method of artificially mutating the DNA of the present invention can be performed, for example, by deleting a part or all of the DNA sequence and inserting or substituting another DNA by a genetic engineering technique.
  • the knockout DNA of the present invention may be prepared by, for example, shifting the reading frame of a codon or disrupting the function of a promoter or exon by these mutations.
  • non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated include, for example, The DNA of the present invention possessed by a non-human mammal to be isolated is isolated and its exon portion is a drug resistance gene typified by a live neomycin resistance 1 "gene, a hygromycin resistance gene, or 1acZ (] 3-galactosidase.
  • DNA sequence for example, poly A addition signal
  • a DNA strand having a DNA sequence constructed so as to result in the disruption of the gene by disabling the synthesis of the genomic RNA (hereinafter, abbreviated as targeting vector 1) can be obtained by, for example, a homologous recombination method.
  • DNA sequence on the Southern hybridization analysis or the targeting vector using the DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe for the obtained ES cells, and the targeting vector It can be obtained by analyzing the DNA sequence of a nearby region other than the DNA of the present invention used in one preparation by a PCR method using primers, and selecting the knockout ES cells of the present invention.
  • ES cells from which the DNA of the present invention is inactivated by the homologous recombination method or the like for example, those already established as described above may be used, and the method of the known Evans and Kaufma may be used. It may be newly established according to.
  • mouse ES cells currently 129 ES cells are generally used, but since the immunological background is not clear, it is an alternative pure immunological and genetically
  • the BDF i mouse C57B in which the number of C57BLZ6 mice or C57BLZ6 eggs collected was improved by crossing with DBA / 2 was improved.
  • BDFi mice which are established using F of B LZ6 and DB AZ2, etc., can also be used successfully.
  • BDF i mice have the advantages of high number of eggs collected and robust eggs, as well as the advantages of C57B LZ6. Since ES cells obtained using this mouse have a background, the genetic background of the ES cell obtained by creating a pathological model mouse by cross-crossing the mouse with C57BL / 6 mouse can be used to generate C57BLZ6. It can be used advantageously in that it can be replaced by a mouse.
  • blastocysts 3.5 days after fertilization are generally used, but efficiency is also achieved by collecting embryos at the 8-cell stage and culturing them up to blastocysts. Many early embryos can be obtained well.
  • Either male or female ES cells may be used, but male ES cells are generally more convenient for producing a breeding line chimera. It is also desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce the complexity of culturing.
  • Methods for determining the sex of ES cells include, for example, PCR
  • One example is a method of amplifying and detecting a gene in the sex determining region. By using this method, the number of ES cells in one colony (about 50) can be reduced, compared to about 10 6 cells for karyotype analysis.
  • the primary selection of ES cells in the early stage can be performed by gender discrimination, and the early selection of male cells can greatly reduce the labor in the early stage of culture.
  • a suitable feeder cell such as STO fibroblasts
  • a carbon dioxide incubator preferably 5% carbon dioxide, 95% air or 5% oxygen
  • LIF 1-10000 U / ml
  • CO 2 5% CO 2, 90% air
  • trypsin ZED ⁇ A solution usually 0.
  • L-5mM EDTA preferably about 0.1% triscine / ImM EDTA
  • Such subculture is usually performed every 1 to 3 days. At this time, it is desirable to observe the cells, and if morphologically abnormal cells are found, discard the cultured cells.
  • ES cells are differentiated into various types of cells, such as parietal, visceral, and cardiac muscle, by monolayer culture up to high density or suspension culture until cell clumps are formed under appropriate conditions.
  • the DNA-deficient cells of the present invention obtained by dividing the ES cells of the present invention include: It is useful in in vitro cell biological studies of the peptide of the present invention or the receptor protein of the present invention.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be distinguished from a normal animal by measuring the mRNA level of the animal using a known method and indirectly comparing the expression level. . ⁇
  • non-human mammal those similar to the above can be used.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be obtained, for example, by introducing the targeting vector prepared as described above into a mouse embryonic stem cell or a mouse egg cell, and by introducing the DNA, the DNA of the present invention of the targeting vector is inactivated.
  • the DNA of the present invention can be knocked out by causing the obtained DNA sequence to undergo homologous recombination by gene homologous recombination to replace the DNA of the present invention on the chromosome of mouse embryonic stem cells or mouse egg cells.
  • Cells in which the DNA of the present invention was knocked out were used for Southern hybridization analysis or a DNA vector on a targeting vector using the DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe, and a targeting vector. It can be determined by analysis by PCR using a DNA derived from a mouse and a DNA sequence in a nearby region other than the DNA of the present invention as a primer.
  • a non-human mammalian embryonic stem cell is used, a cell line in which the DNA of the present invention has been inactivated by gene homologous recombination is cloned, and the cell is cultured at an appropriate time, for example, at the 8-cell stage.
  • the chimeric embryo is injected into a human mammalian embryo or blastocyst, and the resulting chimeric embryo is transplanted into the uterus of the pseudopregnant non-human mammal.
  • the produced animal is a chimeric animal composed of both a normal cell having the DNA locus of the present invention and a cell having the artificially mutated DNA locus of the present invention.
  • the total number of such chimeric individuals obtained by crossing the chimeric animal with a normal individual is All the tissues can be obtained by selecting individuals composed of cells having the DNA locus of the present invention in which an artificially mutated DNA is present, for example, by judging coat color or the like.
  • the individual obtained in this manner is usually an individual having a heterozygous expression of the peptide of the present invention, which is crossed with an individual having a heterozygous expression of the peptide of the present invention, and the offspring of the peptide of the present invention are obtained from their offspring.
  • a homozygous expression deficient individual can be obtained.
  • a transgenic non-human mammal having a targeting vector introduced into a chromosome can be obtained by injecting a DNA solution into the nucleus of an egg by a microinjection method. Compared to human mammals, it can be obtained by selecting those having a mutation in the DNA locus of the present invention by homologous recombination.
  • the acquisition and maintenance of the germ line may be performed according to a conventional method. That is, by crossing male and female animals having the inactivated DNA, homozygous animals having the inactivated DNA on both homologous chromosomes can be obtained. The obtained homozygous animal can be efficiently obtained by rearing the mother animal in such a manner that one normal individual and a plurality of homozygous animals are obtained. Crossing male and female heterozygous animals to breed homozygous and heterozygous zygote animals having the inactivated DNA.
  • the non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated are extremely useful for producing the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention lacks various biological activities that can be induced by the peptide of the present invention, a disease caused by inactivation of the biological activity of the peptide of the present invention. Since it can be a model, it is useful for investigating the causes of these diseases and examining treatment methods.
  • the present invention is characterized by administering a test compound to a non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention, and observing and measuring a change in the animal.
  • the present invention provides a method for screening a compound or a salt thereof which has a therapeutic / preventive effect on a disease to be treated.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention used in the screening method includes the same ones as described above.
  • test compound and the salt that the test compound may form the same as those described above are used.
  • a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is treated with a test compound, compared with a non-treated control animal, and changes in the organs, tissues, disease symptoms, etc. of the animal are used as indices. Therapeutic and prophylactic effects of test compounds can be tested.
  • test compound for example, oral administration, intravenous injection, or the like is used, and it can be appropriately selected according to the symptoms of the test animal, properties of the test compound, and the like.
  • the dose of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, the properties of the test compound, and the like.
  • the function eg, corticosteroid secretion regulating activity
  • the test compound when it increases by 0% or more, can be selected as a compound having a therapeutic / preventive effect on the above-mentioned diseases.
  • the compound obtained by the stalling method is useful as a corticosteroid secretion regulator, preferably a corticosteroid secretagogue.
  • the compound obtained by the screening method is used as a preventive or therapeutic agent for hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain, obesity, etc. Useful.
  • the compound obtained by using the screening method is useful as a safe and low toxic male hormone secretion regulator, preferably a male hormone secretagogue.
  • compounds obtained by using the screening method include, for example, pain relief for male gonad dysfunction, male infertility associated with impaired spermatogenic function, aplastic anemia, myelofibrosis, renal anemia, and terminal female genital cancer. It is useful as a preventive / therapeutic agent for breast cancer (eg, inoperable breast cancer), mastopathy, breast tumors, and female breasts.
  • the compound obtained by using the screening method is a compound selected from the test compounds described above, and has a therapeutic / preventive effect against a disease caused by deficiency or damage of the peptide of the present invention. It can be used as a drug for safe and low-toxic treatment and prevention of diseases. Further, a compound derived from the compound obtained by the above screening can also be used. .
  • the compound obtained by the screening method may form a salt.
  • the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids, etc.) and bases (eg, , Alkali metals, etc.), and especially preferred are physiologically acceptable acid addition salts.
  • physiologically acceptable acids eg, inorganic acids, organic acids, etc.
  • bases eg, , Alkali metals, etc.
  • physiologically acceptable acid addition salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid) Succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesnoleic acid, benzenesulfonic acid, etc.).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid,
  • a drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned drug containing the peptide of the present invention.
  • the preparations obtained in this way are safe and of low toxicity and can be used, for example, in humans or mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, pigs, pigs, dogs, cats, dogs). , Monkeys, etc.).
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like.
  • the compound when the compound is orally administered, generally, in an adult patient (with a body weight of 60 kg), About 0, 1 to 100 m per day 30H160
  • the single dose of the compound varies depending on the administration subject, the target disease, etc., but, for example, the compound is usually administered in the form of an injection to an adult patient (with a body weight of 60 kg).
  • the compound is administered to the subject every day, about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 1
  • the dose can be administered in terms of weight per 60 kg.
  • the non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention may be a non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention in which the DNA of the present invention is inactivated by introducing a reporter gene.
  • the reporter is one which can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention.
  • test compound and salts which the test compound may form include the same compounds as described above.
  • the same ones as described above are used, and a galactosidase gene (1 ac Z), a soluble alkaline phosphatase gene or a luciferase gene is preferable.
  • a part of the DNA region encoding the peptide of the present invention is derived from Escherichia coli
  • J3-galactosidase is expressed in place of the peptide of the present invention in the tissue where the peptide of the present invention is originally expressed. Therefore, for example, the present invention can be easily carried out by staining with a reagent serving as a substrate for 3-galactosidase, such as 5-promo 4-chloro-3-indolyl] 3-galactopyranoside (X-gal).
  • a reagent serving as a substrate for 3-galactosidase, such as 5-promo 4-chloro-3-indolyl] 3-galactopyranoside (X-gal). The state of expression of the peptide in an animal body can be observed.
  • the peptide-deficient mouse of the present invention or a tissue section thereof is fixed with dartalaldehyde or the like, washed with phosphate-buffered saline (PBS), and then stained with X-ga1 at room temperature or at room temperature. After reacting at about 37 ° C for about 30 minutes to 1 hour, the i3-galactosidase reaction may be stopped by washing the tissue specimen with a 1 mM EDTA ZPBS solution, and the coloration may be observed. Further, mRNA encoding 1 ac Z may be detected according to a conventional method.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the compound or a salt thereof obtained by using the above-mentioned screening method is a compound or a salt thereof selected from the above-described test compounds, and a compound or a salt thereof which promotes or inhibits the DNA promoter activity of the present invention.
  • salts of the compounds obtained by the screening method salts with physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, etc.) and bases (eg, organic acids, etc.) are used.
  • physiologically acceptable acids eg, inorganic acids, etc.
  • bases eg, organic acids, etc.
  • Physiologically acceptable acid addition salts are preferred.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid,
  • salts with maleic acid, succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc. are used.
  • the compound of the present invention or a salt thereof that promotes the activity of the promoter for DNA can promote the expression of the peptide of the present invention and promote the function of the peptide. Preferably, it is useful as a corticosteroid secretion promoter. Further, the compound of the present invention or a salt thereof that promotes the activity of a promoter for DNA includes hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain, It is useful as an agent for preventing and treating obesity.
  • the compound or its salt of the present invention that promotes the promoter activity for DNA is useful as a safe and low toxic androgen secretion regulator, preferably a androgen secretion promoter.
  • the compound of the present invention that promotes the activity of a promoter for DNA or a salt thereof includes, for example, male gonad dysfunction, male infertility associated with impaired spermatogenic function, aplastic anemia, myelofibrosis, renal anemia, It is useful as a pain relieving agent for terminal genital cancer, as a preventive and therapeutic agent for breast cancer (eg, inoperable breast cancer), mastopathy, breast tumor, gynecomastia, etc.
  • the compound of the present invention which inhibits the promoter activity against DNA or a salt thereof is useful, for example, as a corticosteroid secretion regulator, preferably a corticosteroid secretion inhibitor (corticosteroid secretion inhibitor). .
  • compounds or salts thereof that inhibit the promoter activity of the DNA of the present invention include, for example, Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing B ulcer, aldosterone-producing tumor, aldosterone It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for sickness, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, stomach / duodenal ulcer, irritable bowel syndrome, etc.
  • the compound of the present invention which inhibits promoter-one activity against DNA or a salt thereof is useful as a safe and low toxic androgen secretion regulator, preferably a androgen secretion inhibitor (androgen secretion inhibitor).
  • the compound of the present invention or a salt thereof that inhibits promoter activity against DNA includes, for example, penile enlargement, testicular atrophy, testicular dysfunction (eg, sperm reduction), menstrual abnormalities, hirsutism, pigmentation, hoarseness, and hypersensitivity. It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for acne, nausea, vomiting, digestive symptoms (eg, anorexia), and full moon-like face.
  • a drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-described drug containing the peptide of the present invention or a salt thereof. Can be.
  • the preparations obtained in this way are safe and of low toxicity and can be used, for example, in humans or mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, pigs, pigs, dogs, cats, dogs). , Monkeys, etc.).
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like.
  • a compound or a salt thereof that promotes the promoter activity of DNA of the present invention is orally administered
  • the compound is administered in an amount of about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day.
  • the single dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • a compound or a salt thereof that promotes the activity of a promoter for DNA of the present invention may be used.
  • the compound When administered to an adult patient (with a body weight of 6 O kg) in the form of an injection, the compound is administered in an amount of about 0.01 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 2 Omg per day. It is convenient to administer about 0.1 to about 10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of weight per 60 kg.
  • a compound of the present invention that inhibits promoter activity against DNA or a salt thereof is orally administered, generally, in an adult patient (with a body weight of 60 kg), the compound is used in an amount of about 0.1 to 10 per day. 0 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 2 Omg is administered.
  • the single dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • the salt is usually administered to an adult patient (with a body weight of 60 kg) in the form of an injection, the compound is used in an amount of about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 20 mg per day. It is convenient to administer about 0.1 to about 0 mg L by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered per 60 kg body weight.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention It is extremely useful for screening compounds or salts thereof that promote or inhibit the activity of the promoter for the promoter, and is useful for investigating the cause of various diseases caused by insufficiency of the expression of DNA of the present invention or developing therapeutic drugs. Can contribute.
  • a DNA containing the promoter region of the peptide of the present invention genes encoding various proteins are ligated downstream thereof and injected into an egg cell of an animal to produce a so-called transgenic animal (gene transfer). Animal), it will be possible to synthesize the peptide specifically and examine its effects on living organisms.
  • an appropriate reporter gene to the above promoter portion and establishing a cell line capable of expressing the same, it has a function to specifically promote or suppress the ability of the peptide of the present invention itself to be produced in the body. It can be used as a search system for low molecular compounds.
  • Antibodies to the AQ27 receptor and antisense polynucleotides comprising a nucleotide sequence complementary to DNA encoding the AQ27 receptor or a part thereof are described in WO 01/163 It can be produced according to the method described in No. 13.
  • AQ27 receptor DNA encoding AQ27 receptor
  • antibodies to AQ27 receptor hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention
  • the antisense DNA against AQ27 receptor D.NA (hereinafter sometimes abbreviated as the antisense DNA of the present invention) has the following uses.
  • a prophylactic and / or therapeutic agent for a disease associated with AQ27 receptor dysfunction a) AQ27 receptor or b) DNA encoding AQ27 receptor, AQ27 receptor function It can be used as a medicament such as a prophylactic or therapeutic agent for diseases associated with insufficiency.
  • AQ27 receptor deficiency when AQ27 receptor is decreased in the living body, the physiological action of fatty acid as a ligand cannot be expected (AQ27 receptor deficiency).
  • B) (i) administering the DNA encoding the AQ27 receptor to the patient to replace the amount of the AQ27 receptor when administered to the patient; Or (mouth) by inserting DNA encoding the AQ27 receptor into the target cells and expressing the cells, and then transplanting the cells into the patient.
  • the amount of the receptor can be increased, and the effect of the ligand can be fully exerted. That is, DNA encoding the AQ27 receptor is useful as a prophylactic and / or therapeutic agent for diseases associated with safe and low-toxic AQ27 receptor dysfunction.
  • AQ27 receptor or AQ27 receptor DNA is useful as a safe and low-toxicity regulator of corticosteroid secretion, preferably a corticosteroid secretagogue.
  • AQ27 receptor or AQ27 receptor DNA is used to prevent or treat hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain, obesity, etc.
  • Useful as AQ27 receptor or AQ27 receptor DNA is useful as a safe and low toxic androgen secretion regulator, preferably a androgen secretagogue.
  • AQ27 receptor or AQ27 receptor DNA can be used, for example, in male gonad dysfunction, male infertility associated with impaired spermatogenic function, aplastic anemia, myelofibrosis, renal anemia, and terminal female genital cancer. It is useful as a remedy for pain relief, breast cancer (eg, inoperable breast cancer), mastosis, breast tumor, gynecomastia, etc.
  • the AQ27 receptor When the AQ27 receptor is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated according to a conventional method.
  • the AQ27 receptor DNA when used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, the AQ27 receptor DNA may be used alone or in an appropriate vector such as a retinovirus vector, an adenovirus vector, or an adenovirus associated virus vector. After insertion into the cell, it can be carried out according to conventional means. AQ27 receptor DNA can be administered as is, or with an auxiliary to promote uptake, via a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
  • a) AQ27 receptor or b) AQ27 receptor DNA may be orally administered as sugar-coated tablets, capsules, elixirs, microcapsules, etc.
  • pharmaceutically acceptable liquid It can be used parenterally in the form of injections, such as bacterial solutions or suspensions.
  • examples include: a) AQ27 receptor or b) AQ27 receptor DNA, a physiologically acceptable carrier, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative, stabilizer, binder, etc. It can also be manufactured by mixing in the unit dose form required for the generally accepted formulation practice. — The amount of active ingredient in these preparations is such that a suitable dose in the indicated range is obtained.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic
  • excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid.
  • leavening agents such as magnesium stearate
  • sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin
  • flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry are used.
  • the unit dosage form is a capsule, the above type of material can further contain a liquid carrier such as an oil or fat.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in a vehicle, such as water for injection, or any vegetable oil such as sesame oil or coconut oil.
  • a vehicle such as water for injection, or any vegetable oil such as sesame oil or coconut oil.
  • a aqueous solution for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other auxiliaries (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like are used.
  • an alcohol e.g., ethanol
  • polyalcohol e.g., propylene click "recall, polyethylene glycol
  • nonionic boundary teeth activator in combination eg, Porisoru Pies 8 0 TM, HCO-5 0
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil, and the like are used, and may be used in combination with a solubilizing agent such as benzyl benzoate or benzyl alcohol.
  • prophylactic / therapeutic agent examples include a buffer (for example, a phosphate buffer and a sodium acetate buffer), a soothing agent (for example, benzalkonium chloride, pro-proline hydrochloride, etc.), a stabilizer (for example, , Human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like.
  • a buffer for example, a phosphate buffer and a sodium acetate buffer
  • a soothing agent for example, benzalkonium chloride, pro-proline hydrochloride, etc.
  • a stabilizer for example, Human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants antioxidants and the like.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule Is done.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, for example, against human mammals (eg, rats, mice, puppies, sheep, stags, puppies, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
  • human mammals eg, rats, mice, puppies, sheep, stags, puppies, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the dosage of the AQ27 receptor varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc., but in the case of oral administration, in general, for example, in adult patients (assuming 6 kg of body weight), About 0.1 to 10 Omg per day, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 2 Omg.
  • the single dose varies depending on the subject of administration, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • injection usually, for example, an adult patient (weight: 60 kg)
  • the amount can be administered in terms of the body weight per 60 kg.
  • the dosage of AQ27 receptor DNA varies depending on the subject, target organ, symptoms, administration method, etc., but in the case of oral administration, in general, for example, in adult patients (with a body weight of 60 kg) Is about 0.1 to 100 mg per day, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like. 6 O kg), about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day is administered by intravenous injection. It is convenient.
  • the dose can be administered in terms of weight per 60 kg.
  • AQ27 receptor DNA and antisense DNA can be used as probes in humans or mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, pigs, cats, dogs, monkeys, etc.).
  • AQ 27 receptor or its Abnormality (genetic abnormality) of DNA or mRNA encoding a partial peptide can be detected. For example, damage or mutation of the DNA or mRNA is reduced in expression or increased in DNA or mRNA. Alternatively, it is useful as a diagnostic agent for genes such as overexpression.
  • the above-described genetic diagnosis using AQ27 receptor DNA or antisense DNA can be performed, for example, by the known Northern hybridization or PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1) 989 years), professional sheathing's O-flops the National Academy O Breakfast, Saienshii scan ⁇ ⁇ -up Interview 1 to Esue 1 ⁇ (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America), 86 Vol., Pages 2766-2770 (1989)).
  • the disease is likely to be caused by overexpression of the AQ27 receptor, or the disease may be affected in the future. It can be diagnosed as high.
  • Disorders associated with AQ27 receptor dysfunction include, for example, hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain, obesity, male gonads Dysfunction, male infertility associated with dysgenesis, aplastic anemia, myelofibrosis, renal anemia, pain relief for terminal female genital cancer, breast cancer (eg, inoperable breast cancer), breast disease, breast tumor And gynecomastia.
  • AQ27 receptors Diseases caused by overexpression of AQ27 receptor include, for example, Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital Adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, stomach Digital ulcer, irritable bowel syndrome, penile hypertrophy, testicular atrophy, testicular dysfunction (eg, sperm loss), menstrual abnormalities, hirsutism, pigmentation, hoarseness, irritability, acne, nausea, vomiting, gastrointestinal symptoms ( For example, anorexia), full moon-like face and the like.
  • Cushing's disease Cushing's syndrome
  • adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor CRH-producing tumor
  • aldosterone-producing tumor aldosteronism
  • the AQ27 receptor DNA can be used as a probe for screening a compound or a salt thereof that changes the expression level of the AQ27 receptor.
  • the present invention relates to, for example, AQ contained in (i) a) blood of a non-human mammal, b) a specific organ, c) a tissue or cell isolated from an organ, or (ii) a transformant.
  • AQ contained in (i) a) blood of a non-human mammal, b) a specific organ, c) a tissue or cell isolated from an organ, or (ii) a transformant.
  • a method for screening a compound or a salt thereof that changes the expression level of AQ27 receptor by measuring the mRNA level of 27 receptor is provided.
  • the measurement of the mRNA level of the AQ27 receptor is specifically performed as follows.
  • (i) Normal or disease model non-human mammals for example, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, pigs, cats, dogs, monkeys, etc., more specifically, dementia rats, obese mice, arteriosclerosis Drugs (eg, anti-dementia drugs, antihypertensive drugs, anti-cancer drugs, anti-obesity drugs, etc.) or physical stress (eg, flooding stress, electric shock, light / dark, low temperature, etc.)
  • blood or specific organs eg, brain, liver, kidney, etc.
  • tissues or cells isolated from the organs are obtained.
  • the mRNA of the AQ27 receptor contained in the obtained cells can be quantified by, for example, extracting mRNA from cells or the like by a usual method and using a method such as TaqMan PCR, for example.
  • the analysis can also be performed by performing a Northern blot by a known means.
  • a transformant expressing the AQ27 receptor is prepared according to the method described above, and the mRNA of the AQ27 receptor contained in the transformant can be quantified and analyzed in the same manner.
  • test compound is administered at the same time as the stress, and after a certain period of time after administration (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours), the cells are administered to the cells. It can be carried out by quantifying and analyzing the mRNA amount of the contained AQ27 receptor,
  • test compound is mixed in the medium and cultured for a certain period of time (1 to 7 days, preferably 1 to 3 days, more preferably 2 to 3 days) It can be carried out by quantifying and quantifying the amount of AQ27 receptor mRNA contained in the transformant.
  • test compound and salts which the test compound may form include the same compounds as described above.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is a compound or a salt thereof having an action of changing the expression level of AQ27 receptor, and specifically, (a) AQ27 receptor A compound that enhances AQ27 receptor-mediated cell stimulating activity by increasing the expression level of the body. (Mouth) Attenuates the cell stimulating activity by decreasing the expression level of AQ27 receptor.
  • Compounds obtained using the screening method of the present invention include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, and the like.These compounds may be novel compounds or known compounds. It may be a compound.
  • a salt of a compound obtained by using the screening method of the present invention a salt with a physiologically acceptable acid (eg, an inorganic acid, etc.) or a base (eg, an organic acid, etc.) is used. Particularly preferred are physiologically acceptable acid addition salts.
  • salts examples include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with formic acid, conodic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc. are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • Salts with formic acid conodic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.
  • the compound or a salt thereof that changes the expression level of the AQ27 receptor obtained by the above screening method is useful as a safe and low-toxicity regulator of corticosteroid secretion.
  • the compound or its salt that increases the expression level of the AQ27 receptor and enhances the cell stimulating activity is useful as a corticosteroid secretion regulator, preferably a corticosteroid secretagogue.
  • compounds or salts thereof that increase the expression level of the AQ27 receptor and enhance cell stimulating activity include, for example, hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenalism, Addison's disease, It is useful as a preventive and therapeutic agent for adrenal insufficiency, pain, obesity, etc.
  • the compound or its salt that increases the expression level of the AQ27 receptor and enhances the cell stimulating activity is useful as a safe and low toxic androgen secretion regulator, preferably a androgen secretagogue.
  • compounds that increase the expression level of the AQ27 receptor and enhance cell stimulating activity include, for example, penile enlargement, testicular atrophy, testicular dysfunction (eg, sperm reduction), menstrual abnormalities, hirsutism, pigmentation, It is useful as a preventive and therapeutic agent for hoarseness, irritability, acne, nausea, vomiting, gastrointestinal symptoms (eg, anorexia), and full moon-like facial appearance.
  • a compound or a salt thereof that reduces the expression level of the AQ27 receptor and attenuates the cell stimulating activity is a corticosteroid secretion regulator, preferably a corticosteroid hormone inhibitor (a corticosteroid secretion inhibitor).
  • compounds or salts thereof that decrease the expression level of the AQ27 receptor and attenuate the cell stimulating activity include, for example, Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone It is useful as a prophylactic or therapeutic agent for producing tumors, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, stomach, duodenal ulcer, irritable bowel syndrome, etc. .
  • a compound that decreases the expression level of AQ27 receptor and attenuates cell stimulating activity is useful as a safe and low toxic androgen secretion regulator, preferably an androgen secretion inhibitor (androgen secretion inhibitor).
  • Compounds or salts thereof that reduce the expression level of the AQ27 receptor and reduce the cell stimulating activity include, for example, penile enlargement, testicular atrophy, testicular dysfunction (eg, sperm reduction), menstrual abnormalities, hirsutism, pigmentation It is useful as a preventive and therapeutic agent for hoarseness, irritability, acne, nausea, vomiting, gastrointestinal symptoms (eg, anorexia), full moon-like face, etc.
  • a compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is used as a pharmaceutical composition, it can be formulated according to a conventional method.
  • the compound or a salt thereof is orally administered as a tablet, capsule, elixir, microcapsule or the like, which is sugar-coated as necessary, or water or other pharmaceutically acceptable liquid. It can be used parenterally in the form of an injection such as a sterile solution or suspension.
  • the compound can be used together with known physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders and the like in a unit dosage form generally required for the practice of pharmaceutical preparations. It can be manufactured by mixing. The amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic
  • excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid.
  • leavening agents such as magnesium stearate
  • sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin
  • flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or tea are used.
  • the unit dosage form is a capsule, the above type of material may further contain a liquid carrier such as an oil or fat.
  • Sterile compositions Me other injections formulated active I 1 Raw material in Hikuru such base as water for injection, sesame oil, in accordance with conventional pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the like coconut oil of any naturally occurring vegetable oil be able to.
  • aqueous liquids for injection include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.), and suitable solubilizing agents.
  • alcohols eg, ethanol
  • polyalcohols eg, propylene glycol, polyethylene glycol
  • nonionic surfactants eg, Polysorbate 80 TM , HCO-50
  • oily liquid examples include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with a solubilizing agent such as benzyl benzoate or benzyl alcohol.
  • Agents for example, phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agents (for example, Shirazider Benzalkonium, proforce hydrochloride, etc.), stabilizers (for example, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), It may be combined with preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants, etc. Normally filled in an appropriate ampoule.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, for example, against human mammals (eg, rats, mice, puppies, sheep, pigs, puppies, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
  • human mammals eg, rats, mice, puppies, sheep, pigs, puppies, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like.
  • oral administration in general, for example, in an adult patient (with a body weight of 60 kg), It is about 0.1 to 10 Omg per day, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like. (As O kg), it is convenient to administer about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day by intravenous injection. It is. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of the body weight per 60 kg.
  • the antibody of the present invention can specifically recognize AQ27 receptor, it can be used for quantification of AQ27 receptor in a test solution, particularly for quantification by sandwich immunoassay. That is, the present invention
  • one antibody is an antibody that recognizes the N-terminal of the AQ27 receptor and the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal of the AQ27 receptor .
  • AQ27 receptor can be quantified using a monoclonal antibody against AQ27 receptor, and detection by tissue staining or the like can also be performed.
  • the antibody molecule itself may be used, or the F (ab ') 2 , Fab, or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the method for quantifying AQ27 receptor using the antibody of the present invention is not particularly limited, and may be an antibody, an antigen or an antibody corresponding to the amount of antigen (eg, the amount of AQ27 receptor) in the test solution. Any method that detects the amount of the antigen complex by chemical or physical means and calculates this from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen can be used. Is also good. For example, nephelometry, a competitive method, an immunometric method and a sandwich method are preferably used, but in terms of sensitivity and specificity, a sandwich method described later is particularly preferable. '
  • a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used.
  • the radioisotope for example, [ 125 I], [ 131 I], [ 3 H], [ 14 C] and the like are used.
  • the enzyme those which are stable and have a large specific activity are preferable, for example, -galactosidase, ⁇ -gnorecosidase, anorecaliphosphatase, Oxidase, malate dehydrogenase and the like are used.
  • the fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescein isothiosinate and the like are used.
  • the luminescent substance for example, noreminore, luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used.
  • a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass.
  • a test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with another labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction).
  • primary reaction the insolubilized monoclonal antibody of the present invention
  • secondary reaction another labeled monoclonal antibody of the present invention
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be the same as those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily required to be one kind, and a mixture of two or more kinds of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. Oh hi.
  • the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody having a different site to which the AQ27 receptor binds.
  • the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is, for example, the antibody used in the secondary reaction.
  • the antibody used in the primary reaction is preferably used. Is an antibody that recognizes other than the C-terminal, for example, the N-terminal.
  • the competition method after the antigen in the test solution and the labeled antigen are reacted competitively with the antibody, the unreacted labeled antigen (F) is separated from the labeled antigen (B) bound to the antibody. Separation (B / F separation), measure the amount of B or F label, and quantify the amount of antigen in the test solution.
  • This reaction method uses a soluble antibody as an antibody, a liquid phase method using polyethylene glycol for B / F separation, a second antibody against the antibody, or a solid phase antibody as the first antibody.
  • an immobilization method using a soluble first antibody and an immobilized antibody as the second antibody is used.
  • an antigen in a test solution and a solid-phased antigen are subjected to a competitive reaction with a fixed amount of a labeled antibody and then separated into a solid phase and a liquid phase. After reacting with an excess amount of the labeled antibody, the immobilized antigen is added, and the unreacted labeled antibody is bound to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of label in either phase is measured to determine the amount of antigen in the test solution.
  • the amount of insoluble sediment resulting from an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured.
  • the amount of antigen in the test solution is very small.
  • laser nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.
  • An AQ27 receptor measuring system may be constructed by adding ordinary technical considerations of those skilled in the art to the ordinary conditions and procedures in each method. For details of these general technical means, reference can be made to reviews, written documents, and the like.
  • the AQ27 receptor can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • a dysfunction of the AQ27 receptor It can be diagnosed as a disease associated with or likely to be affected in the future.
  • an increase in the concentration of AQ27 receptor when detected, for example, it can be diagnosed as a disease caused by overexpression of AQ27 receptor, or is likely to be affected in the future. .
  • AQ27 receptor dysfunction Diseases associated with AQ27 receptor dysfunction include, for example, hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain, obesity, and men. Gonadal dysfunction, Male infertility due to imperfect dysgenesis, Aplastic anemia, Myelofibrosis, Renal anemia, Pain relief for terminal female genital cancer, Breast cancer (eg, inoperable breast cancer), Breast disease, Breast gland Tumors, gynecomastia, etc.
  • AQ27 receptors Diseases caused by overexpression of AQ27 receptor include, for example, Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, Congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, stomach, duodenal ulcer, irritable bowel symptoms, penile enlargement, testicular atrophy, testicular dysfunction (eg, sperm loss), abnormal menstruation , Hirsutism, pigmentation, hoarseness, irritability, acne, nausea, vomiting, digestive symptoms (Eg, anorexia), full moon-like face, etc.
  • Cushing's disease Cushing's syndrome
  • adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor CRH-producing tumor
  • aldosterone-producing tumor aldosteronism
  • the antibody of the present invention can specifically recognize the AQ27 receptor, it can be used for screening a compound or a salt thereof that changes the amount of the AQ27 receptor in the cell membrane.
  • a non-human mammal's a) blood, b) a specific organ, c) tissue or cells isolated from the organ are sectioned, and then the immunoreactive staining method is used to obtain the receptor at the cell surface.
  • a method for screening a compound or a salt thereof which changes the amount of AQ27 receptor in a cell membrane by confirming the protein on the cell membrane by quantifying the degree of staining of a body protein.
  • a transformant expressing the AQ27 receptor was sectioned, and the staining level V ⁇ of the receptor protein on the cell surface was quantified by immunostaining to obtain the cell membrane. It is intended to provide a method for screening a compound or a salt thereof, which alters the amount of AQ27 receptor in a cell membrane by confirming the above protein.
  • the quantification of the AQ27 receptor contained in the cell membrane fraction is specifically performed as follows.
  • non-human mammals eg, mouse, rat, Drugs (eg, dementia rats, obese mice, arteriosclerosis, egrets, cancer-bearing mice, etc.) against egrets, sheep, pigs, pigs, cats, dogs, monkeys, etc. Drugs, blood pressure lowering drugs, anti-cancer drugs, anti-obesity drugs, etc.) or physical stress (eg, flooding stress, electric shock, light / dark, low temperature, etc.), and after a certain period of time, blood or certain organs (eg, Obtain tissues or cells isolated from the brain, liver, kidney, etc.) or organs.
  • Drugs eg, dementia rats, obese mice, arteriosclerosis, egrets, cancer-bearing mice, etc.
  • Drugs eg, blood pressure lowering drugs, anti-cancer drugs, anti-obesity drugs, etc.
  • physical stress eg, flooding stress, electric shock, light / dark, low temperature, etc.
  • organs
  • the obtained organ, tissue or cell is suspended in, for example, an appropriate buffer (for example, Tris-HCl buffer, phosphate buffer, Hess buffer, etc.) to destroy the organ, tissue or cell.
  • an appropriate buffer for example, Tris-HCl buffer, phosphate buffer, Hess buffer, etc.
  • a cell membrane fraction is obtained by using a surfactant (for example, Triton XI 00 TM, Tween 20 TM, etc.), and further using a technique such as centrifugation, filtration, or column fractionation.
  • the cell membrane fraction refers to a fraction abundant in cell membrane obtained by disrupting cells and then obtained by a method known per se.
  • the cells can be disrupted by crushing the cells with a Potter-Elvehjem homogenizer, by using a Warlinda Blender Polytron (manufactured by Kinematica), by crushing with ultrasonic waves, or by pressing the cells while applying pressure with a French press. This includes crushing caused by jetting from a thin nozzle.
  • centrifugal fractionation methods such as differential centrifugation and density gradient centrifugation are mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 to 300 rpm) for a short time (typically about 1 to 10 minutes), and the supernatant is further processed to a higher speed (150 to 300 rpm). (Centrifugation at 100 rpm) for 30 minutes to 2 hours, and the resulting precipitate is used as the membrane fraction.
  • the membrane fraction is rich in the expressed AQ27 receptor and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • the AQ27 receptor contained in the cell membrane fraction can be quantified by, for example, Sandwich immunoassay using the antibody of the present invention, Western blot analysis, or the like.
  • Such a sandwich immunoassay can be performed in the same manner as described above, and the Western plot can be performed by a means known per se.
  • AQ27 receptor-expressing transformants are prepared according to the above-described method, and the AQ27 receptor contained in the cell membrane fraction can be quantified. Screening of a compound or a salt thereof that alters the amount of AQ27 receptor in the cell membrane
  • test compound is administered at the same time as the stress, and after a certain period of time after administration (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours), Can be performed by quantifying the amount of AQ 27 receptor,
  • the confirmation of AQ27 receptor contained in the cell membrane fraction is specifically performed as follows.
  • non-human mammals e.g., mice, rats, rabbits, sheep, sheep, pigs, rabbits, mice, dogs, monkeys, etc., more specifically, dementia rats, obese mice, Drugs (eg, anti-dementia drugs, antihypertensive drugs, anti-cancer drugs, anti-obesity drugs, etc.) or physical stress (eg, flooding stress, electric shock, light / dark, low temperature)
  • Drugs eg, anti-dementia drugs, antihypertensive drugs, anti-cancer drugs, anti-obesity drugs, etc.
  • physical stress eg, flooding stress, electric shock, light / dark, low temperature
  • blood or specific organs eg, brain, liver, kidney, etc.
  • tissues or cells isolated from the organs are obtained.
  • the obtained organ, tissue or cell is cut into a tissue section according to a conventional method, and immunostained with the antibody of the present invention.
  • test compound and salts which the test compound may form include the same compounds as described above.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is a compound or a salt thereof having an action of changing the amount of AQ27 receptor in a cell membrane.
  • a compound or a salt thereof that enhances AQ27 receptor-mediated cell stimulating activity by reducing the amount of the AQ27 receptor in the (mouth) cell membrane, A compound or a salt thereof that reduces the cell stimulating activity.
  • Compounds obtained using the screening method of the present invention include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, and the like.These compounds may be novel compounds or known compounds. It may be a compound.
  • As the salt of the compound those similar to the aforementioned salts of the peptide of the present invention are used.
  • the compound or its salt obtained by using the screening method of the present invention is useful as a safe and low-toxicity regulator of corticosteroid secretion.
  • a compound or a salt thereof that enhances cell stimulating activity by increasing the amount of AQ27 receptor in the cell membrane is useful as a corticosteroid secretion regulator, preferably a corticosteroid secretagogue. is there.
  • compounds or salts thereof that enhance cell stimulating activity by increasing the amount of AQ27 receptor in the cell membrane may be used to reduce hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic adrenal cortical hypofunction It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for sickness, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain and obesity.
  • compounds or salts thereof that enhance cell stimulating activity by increasing the amount of AQ27 receptor in the cell membrane are useful as safe and low toxic androgen secretion regulators, preferably as androgen secretagogues It is.
  • compounds or salts thereof that increase cell stimulating activity by increasing the amount of AQ27 receptor in the cell membrane include, for example, male gonad dysfunction, male infertility associated with impaired spermatogenic function, and regeneration.
  • Aplastic anemia, myelofibrosis, renal anemia, end-stage female genital cancer It is useful as a therapeutic agent for pain relief, breast cancer (eg, inoperable breast cancer), mastosis, breast tumor, gynecomastia, etc.
  • a compound or a salt thereof that attenuates the cell stimulating activity by decreasing the amount of AQ27 receptor in the cell membrane is used as a corticosteroid secretion regulator, preferably a corticosteroid secretion inhibitor (adrenocortex). It is useful as a hormone secretion inhibitor.
  • compounds or salts thereof that reduce the cell stimulating activity by reducing the amount of AQ27 receptor in the cell membrane are used for Cushing's disease, Tutzing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, Useful as a preventive or therapeutic agent for aldosterone-producing tumors, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, stomach, duodenal ulcer, irritable bowel syndrome, etc. It is.
  • a compound or a salt thereof that attenuates the cell stimulating activity by reducing the amount of AQ27 receptor in the cell membrane is a safe and low toxic androgen secretion regulator, preferably an androgen secretion inhibitor (male). It is useful as a hormone secretion inhibitor.
  • compounds or salts thereof that attenuate cell stimulating activity by reducing the amount of AQ27 receptors in the cell membrane include, for example, penile enlargement, testicular atrophy, testicular dysfunction (eg, sperm reduction), menstruation It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for abnormalities, hirsutism, pigmentation, hoarseness, irritability, acne, nausea, vomiting, gastrointestinal symptoms (eg, anorexia), and full moon-like face.
  • a compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is used as a pharmaceutical composition, it can be formulated according to a conventional method.
  • the compound or a salt thereof is orally administered as a tablet, capsule, elixir, microcapsule or the like, which is sugar-coated as necessary, or water or other pharmaceutically acceptable liquid. It can be used parenterally in the form of injections, such as sterile solutions or suspensions.
  • the compound can be used together with known physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, preservatives, preservatives, stabilizers, binders, and the like, in a unit dosage form generally required for the practice of pharmaceutical preparations. It can be manufactured by mixing. The amount of active ingredient in these preparations should be within the specified range. It is intended to obtain an appropriate capacity of the enclosure.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic
  • excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid.
  • leavening agents such as magnesium stearate
  • sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin
  • flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry are used.
  • the unit dosage form is a capsule, the above type of material can further contain a liquid carrier such as an oil or fat.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in a vehicle such as water for injection, or naturally occurring vegetable oils such as sesame oil or coconut oil.
  • a vehicle such as water for injection, or naturally occurring vegetable oils such as sesame oil or coconut oil.
  • a aqueous liquid for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing dextrose and other trapping agents (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like are used.
  • an alcohol e.g., ethanol
  • polyalcohol e.g., propylene click "recall, polyethylene glycol
  • nonionic surfactant eg, Porisoru Pies 8 0 TM, HCO- 5 0
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil, and the like are used, and may be used in combination with a solubilizing agent such as benzyl benzoate or benzyl alcohol.
  • prophylactic / therapeutic agent examples include a buffer (for example, a phosphate buffer and a sodium acetate buffer), a soothing agent (for example, benzalkonium chloride, pro-proin hydrochloride, etc.), a stabilizer (for example, It may be blended with human serum albumin, polyethylene dalicol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like.
  • a buffer for example, a phosphate buffer and a sodium acetate buffer
  • a soothing agent for example, benzalkonium chloride, pro-proin hydrochloride, etc.
  • a stabilizer for example, It may be blended with human serum albumin, polyethylene dalicol, etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants and the like examples of the prophylactic / therapeutic agent.
  • the prepared injection solution is usually filled into a suitable ampoule.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, for example, against human mammals (eg rats, mice, puppies, sheep, pigs, puppies, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
  • human mammals eg rats, mice, puppies, sheep, pigs, puppies, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof depends on the subject of administration, the target organ, symptoms, administration method, etc.
  • about 0.1 to 10 Omg per day for example, in an adult patient (assuming a body weight of 60 kg), about 0.1 to 10 Omg per day, preferably about 1.0 to 50 mg, More preferably, it is about 1.0 to 2 Omg.
  • the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like. (As O kg), it is convenient to administer about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg by intravenous injection. It is. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of weight per 60 kg. .
  • the antibody against the AQ27 receptor When the antibody against the AQ27 receptor has a neutralizing activity, it can inactivate signal transduction involving the AQ27 receptor, for example, cell stimulating activity via the AQ27 receptor.
  • antibodies to the AQ27 receptor are safe and low-toxic regulators of corticosteroid secretion, preferably inhibitors of corticosteroids (suppressors of corticosteroids).
  • antibodies to the AQ27 receptor include, for example, Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumors, CRH-producing tumors, aldosterone-producing tumors, aldosteronism, It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, stomach / duodenal ulcer, irritable bowel syndrome, etc.
  • antibodies against the AQ27 receptor are useful as safe and low-toxic androgen secretion regulators, preferably as androgen secretion inhibitors (androgen secretion inhibitors).
  • antibodies to the AQ27 receptor include, for example, penile enlargement, testicular atrophy, testicular dysfunction (eg, sperm loss), menstrual abnormalities, hyperplasia, pigmentation, hoarseness, irritability, It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for acne, nausea, vomiting, digestive symptoms (eg, anorexia), full moon-like face, etc.
  • the antisense DNA of the present invention is useful as a safe and low-toxicity regulator of corticosteroid secretion, preferably a corticosteroid secretion inhibitor (corticosteroid secretion inhibitor).
  • the antisense DNA of the present invention may be used for Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, It is useful as a preventive and therapeutic agent for depression, anorexia nervosa, insomnia, stomach, duodenal ulcer, and irritable bowel syndrome.
  • the antisense DNA of the present invention is useful as a safe and low toxic androgen secretion regulator, preferably a androgen secretion inhibitor (an androgen secretion inhibitor).
  • the antisense DNA of the present invention may be used, for example, for penis enlargement, sperm atrophy, testicular dysfunction (eg, sperm reduction), menstrual abnormalities, hirsutism, pigmentation, hoarseness, irritability, acne, nausea, vomiting, It is useful as a preventive and therapeutic agent for digestive symptoms (eg, anorexia), full moon-like face, etc.
  • the antisense DNA when used, can be used alone or by inserting it into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, and the like, followed by a conventional method.
  • the antisense DNA can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant for promoting uptake, and administered with a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
  • the antisense DNA can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence and expression of AQ27 receptor DNA in tissues and cells.
  • the present invention relates to a non-human mammal having an exogenous AQ27 receptor DNA (hereinafter abbreviated as the exogenous DNA of the present invention) or a mutant DNA thereof (sometimes abbreviated as the exogenous mutant DNA of the present invention). Provide animals.
  • the present invention (1) a non-human mammal having the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof; (2) the animal according to (1), wherein the non-human mammal is a rodent;
  • the non-human mammal having the exogenous DNA of the present invention or the mutant DNA thereof is a non-fertilized egg, a fertilized egg, a germ cell containing a sperm and its progenitor cells.
  • the calcium phosphate method, the electropulse method It can be produced by transferring the target DNA by the lipofection method, agglutination method, microinjection method, particle gun method, DEAE-dextran method, or the like.
  • the exogenous DNA of the present invention can be transferred to somatic cells, organs of living organisms, tissue cells, and the like, and used for cell culture, tissue culture, and the like.
  • An AQ27 receptor DNA-transferred animal can also be produced by fusing these cells with the above-mentioned embryo cells by a cell fusion method known per se.
  • non-human mammals for example, porcupines, pigs, higgins, goats, magpies, dogs, cats, monoremots, hamsters, mice, rats and the like are used.
  • rodents with relatively short ontogeny and biological cycle in terms of the creation of disease animal model systems, and easy reproduction especially mouse (for example, C57BLZ6 strain and DBA2 strain as pure strains)
  • a hybrid strain a B6C strain, a BDFi strain, a B6D2Fi strain, a BALB / c strain, an ICR strain, etc.
  • a rat eg, Wistar, SD, etc.
  • the “mammal” in the recombinant vector that can be expressed in mammals human and the like can be mentioned in addition to the above-mentioned non-human mammals.
  • the exogenous DNA of the present invention is not the AQ27 receptor DNA originally possessed by non-human mammals, but the AQ27 receptor once isolated and extracted from the mammal. Refers to body DNA.
  • mutant DNA of the present invention examples include those in which a mutation (for example, mutation) has occurred in the base sequence of the original AQ27 receptor DNA, specifically, addition or deletion of a base, or deletion of another base. Such as DNA in which DNA substitution has occurred is used, and also includes abnormal DNA.
  • the abnormal DNA means a DNA that expresses an abnormal AQ27 receptor.
  • DNA that expresses an AQ27 receptor that suppresses the function of a normal AQ27 receptor is used.
  • the exogenous DNA of the present invention may be derived from mammals of the same species or different species from the target animal.
  • various mammals having the AQ27 receptor DNA with high homology thereto for example, egret, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse
  • the DNA construct (eg, vector, etc.) to which the human DNA of the present invention is bound downstream of various promoters capable of expressing the derived DNA can be transferred to a fertilized egg of a target mammal, for example, a mouse fertilized egg.
  • DNA transduction mammals that highly express the AQ27 receptor DNA can be created by the induction.
  • Expression vectors for the AQ27 receptor include Escherichia coli-derived plasmid, Bacillus subtilis-derived plasmid, yeast-derived plasmid, pacteriophage such as ⁇ phage, retrovirus such as Moroni leukemia virus, vaccinia virus or baculovirus. Animal viruses such as viruses are used. Among them, a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis, a plasmid derived from yeast, and the like are preferably used.
  • promoters that regulate the above-mentioned DNA expression include: (1) DNA derived from virus (eg, Simian Pinoles, Cytomegaloy7, Moroni monoleukemia vinoless, JC virus, breast cancer virus, polio virus, etc.) (2) Promoters derived from various mammals (humans, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.), for example, albumin, insulin II, peroplaskin II, elastase, erythropoietin, endocerin, muscle creatine Kinase, glial fibrillary acidic protein, daltathione S-transferase, platelet-derived growth factor, keratins Kl, ⁇ 10 and K14, collagen type I and type II, cyclic AMP-dependent protein kinase] 3 I Subunits, dystrophin, tartrate-resistant alfa phosphatase, atrial natriuretic factor, end
  • cytomegalovirus promoter that can be expressed at high levels throughout the whole body, a promoter of human peptide chain elongation factor 1 ⁇ (EF-1), a human and a chicken] 3 actin promoter, and the like. It is suitable.
  • the vector preferably has a sequence that terminates the transcription of the messenger RNA of interest in a DNA-transferred mammal (generally called terminator 1). And preferably a Simian virus SV40 terminator.
  • one of the splicing signals of each DNA, enhancer region, and intron of eukaryotic DNA in order to further express the target exogenous DNA. It is also possible to ligate a part 5 ′ upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region, or 3 ′ downstream of the translation region.
  • the normal AQ27 receptor translation region is derived from liver, kidney, thyroid cells, and fibroblasts from humans or various mammals (eg, egrets, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.). Obtain all or part of genomic DNA from DNA and various commercially available genomic DNA libraries, or complementary DNA prepared by known methods from liver, kidney, thyroid cells, and fibroblast-derived RNA I can do it.
  • a foreign abnormal DNA can produce a translation region obtained by mutating the translation region of a normal AQ27 receptor obtained from the above cells or tissues by point mutagenesis.
  • the translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a transgenic animal by a conventional DNA engineering technique in which the translation region is ligated downstream of the promoter and, if desired, upstream of the transcription termination site.
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germinal and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA transfer means that all of the progeny of the produced animal and the exogenous DNA of the present invention will be present in all of the embryonic and somatic cells. Hold.
  • the offspring of such animals inheriting the exogenous DNA of the present invention have the exogenous DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
  • the non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred can be subcultured in a normal breeding environment as an animal having the DNA after confirming that the exogenous DNA is stably maintained by the crossing. I can do it.
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in excess in all germinal and somatic cells of the target mammal.
  • Excessive presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after the DNA transfer indicates that all the offspring of the produced animal have the exogenous DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
  • Means to have Receiving the foreign DNA of the present invention The offspring of such inherited animals have an excess of the exogenous DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
  • the normal DNA of the present invention is highly expressed, and by promoting the function of endogenous normal DNA, the function of the AQ27 receptor is ultimately enhanced.
  • the disease may develop and can be used as a model animal for the disease. For example, using the normal DNA-transferred animal of the present invention to elucidate the pathological mechanism of AQ27 receptor hyperfunction and AQ27 receptor-related diseases, and study treatment methods for these diseases It is possible to perform
  • the mammal into which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the released AQ27 receptor, it can be used for a screening test for a therapeutic drug for a disease associated with the AQ27 receptor. It is.
  • a non-human mammal having the exogenous abnormal DNA of the present invention can be subcultured in a normal breeding environment as an animal having the DNA after confirming that the exogenous DNA is stably maintained by mating.
  • the desired exogenous DNA can be incorporated into the above-mentioned plasmid and used as a raw material.
  • the DNA construct with the promoter can be prepared by ordinary DNA engineering techniques. Transfer of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germinal and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the abnormal DNA of the present invention in the germinal cells of the animal produced after the transfer of the DNA means that the offspring of the animal produced have the abnormal DNA of the present invention in all of the germinal cells and somatic cells. I do.
  • the progeny of this type of animal that has inherited the exogenous DNA of the present invention has the abnormal DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells.
  • a homozygous animal having the introduced DNA on both homologous chromosomes is obtained, and by crossing these male and female animals, all offspring have the DNA. Breeding can be subcultured.
  • the abnormal DNA of the present invention is highly expressed, and the function of the endogenous normal DNA is inhibited, so that the function of the AQ27 receptor is finally inactivated. It may cause type refractory disease and can be used as a model animal for the disease. For example, using the abnormal DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of AQ27 receptor function-inactive refractory disease and to examine a method for treating this disease.
  • the abnormal DNA highly expressing animal of the present invention can be used to inhibit the function of the normal AQ27 receptor by the abnormal AQ27 receptor of the present invention in the inactive type refractory disease of AQ27 receptor ( dominant negative action).
  • the mammal into which the abnormal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the released AQ27 receptor, it can be used for a therapeutic drug screening test for AQ27 receptor or a functionally inactive refractory disease. It is.
  • AQ27 receptor DNA transfer The clinical symptoms of AQ27 receptor-related diseases, including inactive refractory disease, etc., can be investigated, and more detailed information on AQ27 receptor-related disease models in each organ can be obtained. Pathological findings can be obtained, and this can contribute to the development of new treatment methods and the research and treatment of secondary diseases caused by the disease.
  • the present invention provides a non-human mammal embryonic stem cell in which AQ27 receptor DNA has been inactivated and a non-human mammal deficient in AQ27 receptor DNA expression.
  • DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, _galactosidase gene derived from Escherichia coli) Embryonic stem cells according to (1), wherein the (3) neomycin-resistant embryonic stem cells according to (1),
  • a reporter gene eg, _galactosidase gene derived from Escherichia coli
  • the embryonic stem cell of (1) wherein the non-human mammal is a rodent; (5) the embryonic stem cell of (4), wherein the rodent is a mouse; (6) a non-human mammal deficient in AQ27 receptor DNA inactivation of the DNA,
  • the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, an _galactosidase gene derived from Escherichia coli), and the reporter gene can be expressed under the control of a promoter for AQ27 receptor DNA. 6) the non-human mammal described in the item,
  • the non-human mammalian embryonic stem cells in which the AQ27 receptor DNA has been inactivated are defined as DNA expression ability by artificially mutating the AQ27 receptor DNA of the non-human mammal. Or by substantially eliminating the activity of the AQ27 receptor encoded by the DNA, whereby the DNA does not substantially have the ability to express the AQ27 receptor (hereinafter referred to as the present invention).
  • Non-human mammalian embryonic stem cells hereinafter abbreviated as ES cells
  • non-human mammal those similar to the above can be used.
  • a method for artificially mutating the AQ27 receptor DNA can be performed, for example, by deleting part or all of the DNA sequence by gene engineering techniques, and inserting or substituting another DNA.
  • non-human or shifting the reading frame of a codon Nokkuauto DNA to be c AQ 27 receptor DNA to be manufactured of the present invention by Yabu ⁇ the function of a promoter or Ekison is inactivated
  • Specific examples of mammalian embryonic stem cells include, for example, a target non-human mammal.
  • AQ27 receptor DNA is isolated and its exon portion is a drug resistance gene typified by a neomycin resistance gene, a hygromycin resistance gene, or lacZ (j3 galactosidase gene), cat (chloramphenicolur) Inserting a reporter gene, such as the cetyltransferase gene, disrupts exon function, or inserts a DNA sequence that terminates gene transcription into the intron between exons (for example, a polyA addition signal).
  • a DNA strand having a DNA sequence (hereinafter abbreviated as a targeting vector) constructed so as to insert and prevent the synthesis of complete messenger RNA, thereby resulting in gene breakage, is homologous, for example.
  • ES cells from which the AQ27 receptor DNA is inactivated by the homologous recombination method or the like for example, those already established may be used as described above, and the method described in the known Evans and Kaufma method may be used. A newly established one may be used. For example, in the case of mouse ES cells, currently, the 129-line ES cells are generally used. However, since the immunological background is not clear, a pure line-based immunological system has been used instead.
  • BDF mice C57BL / 6 mice or C57BLZ6 which have reduced the number of eggs collected by crossing with DBA / 2 (BDF mice) It is also possible to favorably use one established using FJ of C57B LZ6 and DB A / 2, etc.
  • the BDF i mouse has many advantages in that the number of eggs collected and the eggs are robust, Since C57BBLZ6 mice are in the background, the ES cells obtained using these cells can be used to create a pathological model mouse by cross-crossing with C57BL / 6 mice to reveal their genetic background. It can be used advantageously in that it can be replaced by C57B LZ6 mice.
  • blastocysts 3.5 days after fertilization are generally used, but the efficiency is also improved by collecting embryos at the 8-cell stage and culturing them up to blastocysts. Many early embryos can be obtained well.
  • Either male or female ES cells may be used, but male ES cells are generally more convenient for producing a germline chimera. 'In addition, it is desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce cumbersome culture labor.
  • a method for amplifying and detecting a gene in the sex-determining region on the Y chromosome by the PCR method can be given as an example.
  • this method conventionally, for example G-banding method, it requires about 1 0 6 cell number to the karyotype content, requires only ES cell number of about 1 colony (about 5 0) Therefore, the primary selection of ES cells in the early stage of culture can be performed by discriminating between males and females, and the early stages of culture can be greatly reduced by enabling the selection of male cells at an early stage.
  • the secondary selection can be performed, for example, by confirming the number of chromosomes by the G-banding method.
  • Embryonic stem cell lines obtained in this way usually have very good growth potential, but must be carefully subcultured because they tend to lose their ability to develop somatically.
  • a carbon dioxide incubator preferably 5% carbon dioxide, 95% air
  • LIF 1-10000 OU / ml
  • a suitable feeder cell such as STO fibroblasts
  • trypsin / EDTA solution usually 0.001 to 0 5% trypsin / 0:!
  • ⁇ 5mM EDTA preferably about 0.1% trypsin (Zl mM EDTA) treatment to form single cells, and inoculate them onto freshly prepared feeder cells.
  • a passage This is usually a force performed every 1 to 3 days. At this time, it is desirable to observe the cells, and if morphologically abnormal cells are found, discard the cultured cells.
  • ES cells can be cultured into various types of cells, such as parietal, visceral, and cardiac muscles, by monolayer culture up to high density under appropriate conditions or by suspension culture until cell clumps are formed. It is possible to differentiate [MJ Evans and MH Kaufman, Neichiya (Nature) 292 Certificates, 154 pp., 1981; GR Martin Proceedings O blanking National Academy O blanking Science USA (p roc. Natl. Acad. Sci. USA) Vol. 78, p. 7634, 1981; TC Doetschman et al., Giannole-op-embriology 'and' et al. Experimental Morphology, Vol. 87, p. 27, 1985], book
  • the AQ27 receptor DNA-deficient cells obtained by differentiating the ES cells of the present invention are useful in the examination of the AQ27 receptor or the cell biology of the AQ27 receptor in the mouth.
  • a non-human mammal deficient in AQ27 receptor DNA expression can be distinguished from a normal animal by measuring the mRNA level of the animal using a known method and indirectly comparing the expression level.
  • non-human mammal those similar to the above can be used.
  • the targeting vector prepared as described above is introduced into a mouse embryonic stem cell or mouse egg cell, and the AQ27 receptor DNA of the targeting vector is introduced by the introduction.
  • Knockout of AQ27 receptor DNA by homologous recombination of the inactivated DNA sequence by gene homologous recombination to replace AQ27 receptor DNA on the chromosome of mouse embryonic stem cells or mouse egg cells It can be done.
  • AQ27 receptor DN Cells in which AQ27 receptor DNA has been knocked out are identified as AQ27 receptor DN
  • Southern hybridization analysis using DNA sequence on or near A as a probe or DNA sequence on targeting vector, and neighboring regions other than mouse-derived AQ27 receptor DNA used for targeting vector Can be determined by PCR analysis using the DNA sequence of the region as a primer.
  • a cell line in which the AQ27 receptor DNA is inactivated by homologous recombination is cloned, and the cells are used at an appropriate time, for example, at the 8-cell stage.
  • the animals produced are chimeric animals composed of both cells having a normal AQ27 receptor DNA locus and cells having an artificially mutated AQ27 receptor DNA locus.
  • all tissues are more artificial than those obtained by mating such a chimeric individual with a normal individual. It can be obtained by selecting individuals composed of cells having the AQ27 receptor DNA locus with a mutation added to, for example, by judging coat color or the like. The individuals obtained in this manner are usually individuals that are deficient in the expression of the AQ27 receptor heterozygously. 'It is possible to obtain an individual lacking homo-expression of the receptor.
  • a transgenic non-human mammal having a targeting vector introduced into a chromosome can be obtained by injecting a DNA solution into a nucleus of an egg cell by a microinjection method.
  • a transgenic non-human mammals described above by selecting those having a mutation in the AQ27 receptor DNA locus by gene homologous recombination. In this way, in the individual in which the AQ27 receptor DNA has been knocked out, the animals obtained by the breeding are also confirmed to have knocked out the DNA, and then reared in a normal breeding environment. Can do it.
  • the germline can be obtained and maintained according to a conventional method. That is, by crossing male and female animals having the inactivated DNA, a homozygous animal having the inactivated DNA on both homologous chromosomes can be obtained. The obtained homozygous animal was compared with the normal animal 1 It can be obtained efficiently by breeding in a state where a plurality of animals are kept. By mating male and female heterozygous animals, homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred for about one generation.
  • Non-human mammalian embryonic stem cells in which AQ27 receptor DNA has been inactivated are extremely useful for producing non-human mammals deficient in AQ27 receptor DNA expression.
  • non-human mammals deficient in AQ27 receptor DNA expression lack various biological activities that can be induced by the AQ27 receptor, resulting in inactivation of the biological activity of the AQ27 receptor. It can be a model for such diseases, and is useful for investigating the causes of these diseases and examining treatment methods.
  • Non-human mammals deficient in AQ27 receptor DNA expression are used for screening compounds or salts that have a therapeutic or preventive effect on diseases caused by AQ27 receptor DNA deficiency or damage. be able to.
  • the present invention provides a method for administering a test compound to a non-human mammal deficient in AQ27 receptor DNA expression, and observing and measuring changes in the animal.
  • a method for screening a compound or a salt thereof or a salt thereof having a therapeutic / preventive effect against a disease caused by injury or damage, etc. ⁇ AQ27 receptor DNA expression deficiency used in the screening method And the same as above.
  • test compound and the salt which the test compound may form the same as those described above are used.
  • a non-human mammal deficient in AQ27 receptor DNA expression is treated with a test compound, compared with a non-treated control animal, and examined for organs, tissues, disease symptoms, etc. of the animal. It is possible to test the therapeutic and prophylactic effects of the test compound using the change in the index as an index.
  • Methods for treating test animals with test compounds include, for example, oral administration, intravenous Injection, etc. is used, and the appropriate choice is made according to the condition of the test animal, the nature of the test compound, etc.
  • the dose of the test compound can be appropriately selected depending on the administration method, the properties of the test compound, and the like.
  • the function of the test animal is about 10% or more, preferably about 30% or more, and more preferably about 30% or more.
  • the test compound can be selected as a compound having a therapeutic / preventive effect against the above-mentioned diseases or a salt thereof.
  • the compound or a salt thereof obtained by the screening method is a compound selected from the test compounds described above or a salt thereof, and is useful as a corticosteroid secretion regulator, preferably a corticosteroid secretagogue.
  • the compound or a salt thereof obtained by the screening method may be, for example, hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain, obesity It is useful as a preventive and therapeutic agent.
  • the compound or a salt thereof obtained by the screening method is useful as a safe and low toxic androgen secretion regulator, preferably a androgen secretagogue.
  • compounds or salts thereof obtained by using the screening method include, for example, male gonad dysfunction, male infertility associated with impaired spermatogenic function, aplastic anemia, myelofibrosis, renal anemia, terminal female genital cancer It is useful as a remedy for pain relief, breast cancer (eg, inoperable breast cancer), mastopathy, breast tumors, gynecomastia, etc.
  • a salt with a physiologically acceptable acid eg, an inorganic acid, an organic acid, etc.
  • a base eg, an alkali metal, etc.
  • Such salts include, for example, inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, Salts with sulfuric acid, etc., or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfone) Acid and the like).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, Salts with sulfuric acid, etc.
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid,
  • the drug containing the compound obtained by the screening method or a salt thereof can be produced in the same manner as the drug containing the compound that changes the binding between the AQ27 receptor and the ligand. . '
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic and can be used, for example, in humans or mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, pigs, horses, cats, cats, animals). And monkeys).
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like. For example, when the compound or a salt thereof is orally administered, an adult patient (with a body weight of 60 kg) is generally used.
  • the compound or a salt thereof is administered in an amount of about 0.1 to 10 Omg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 2 Omg per day.
  • the single dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • the compound is usually administered in the form of an injection to an adult patient (body weight 60%). ), about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the compound per day. Conveniently, it is administered by pulse injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of the body weight of 60 kg.
  • the present invention provides a test compound administered to a non-human mammal deficient in AQ27 receptor DNA expression to detect the expression of a reporter gene, thereby promoting the activity of a promoter against AQ27 receptor DNA.
  • a method for screening a compound or a salt thereof that inhibits the same is provided.
  • AQ27 receptor DNA expression non-human As the mammal among the non-human mammals deficient in AQ27 receptor DNA expression described above, the AQ27 receptor DNA is inactivated by introducing a reporter gene, and the reporter gene is converted to AQ27. Those that can be expressed under the control of a promoter for the receptor DNA are used.
  • test compound and the salt that the test compound may form include the same compounds as described above.
  • reporter gene the same ones as described above are used, and] 3-galactosidase gene (1 acZ), soluble alkaline phosphatase gene or luciferase gene and the like are preferable.
  • the reporter gene is under the control of the promoter for the AQ27 receptor DNA, the activity of the promoter can be traced by tracing the expression of the substance encoded by the reporter gene. Can be detected.
  • the AQ27 receptor-expressing tissue may be ] 3-galactosidase is expressed instead of the 7 receptor. Therefore, for example, by staining with a reagent that serves as a substrate for 3-galactosidase, such as 5-bromo-4-chloro-1-indolyl- ⁇ -galactosylanoside (X-gal), AQ can be easily performed. The expression state of the 27 receptor in an animal can be observed.
  • a reagent that serves as a substrate for 3-galactosidase such as 5-bromo-4-chloro-1-indolyl- ⁇ -galactosylanoside (X-gal)
  • the AQ 2 7 receptor-deficient mice, or its tissue section is fixed with such Darutaruarudehi de, washed with-phosphate buffered saline (PBS), staining solution containing X- g a 1, at room temperature or After reacting at 37 ° C for about 30 minutes to 1 hour, the ⁇ -galactosidase reaction is stopped by washing the tissue sample with 1 mM EDTA / PBS solution, and the coloration is observed. Just fine.
  • mRNA encoding 1 ac Z may be detected according to a conventional method.
  • a salt thereof which is a compound selected from the test compounds described above, or a salt thereof, which promotes or inhibits the activity of a promoter for AQ27 receptor DNA.
  • a salt of the compound obtained by the screening method a salt with a physiologically acceptable acid (eg, an inorganic acid, etc.) or a base (eg, an organic acid, etc.) is used, and particularly, a physiologically acceptable salt is used. Acid addition salts are preferred.
  • salts examples include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc. are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • Salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc. are used.
  • the compound or its salt that promotes or inhibits the promoter activity of AQ27 receptor DNA is useful as a safe and low-toxicity regulator of corticosteroid secretion.
  • a compound or a salt thereof that promotes the promoter activity of AQ27 receptor DNA can promote the expression of AQ27 receptor and promote the function of AQ27 receptor. It is useful as a secretion regulator, preferably as a corticosteroid secretagogue.
  • compounds or salts thereof that promote promoter activity for AQ27 receptor DNA include, for example, hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic adrenal hypoplasia, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain It can be used as a preventive and remedy for obesity.
  • a compound or a salt thereof which promotes the promoter activity for AQ27 receptor DNA is useful as a safe and low toxic androgen secretion regulator, preferably a male hormone secretagogue.
  • compounds or salts thereof that promote the promoter activity of AQ27 receptor DNA include, for example, male gonad dysfunction, male infertility associated with impaired spermatogenic function, aplastic anemia, myelofibrosis, renal anemia. It is useful as a remedy for pain relief of terminal female genital cancer, breast cancer (eg, inoperable breast cancer), mastosis, breast tumor, gynecomastia.
  • a compound or a salt thereof that inhibits the promoter activity of AQ27 receptor DNA can inhibit the expression of AQ27 receptor and inhibit the function of AQ27 receptor. It is useful as a corticosteroid secretion regulator, preferably a corticosteroid secretion inhibitor (adrenocorticotropic secretion inhibitor).
  • compounds or salts thereof that inhibit the promoter activity of AQ27 receptor DNA include, for example, Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocortical stimulating hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, and aldosterone-producing tumor.
  • prophylactic agent for prolonged disease, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, stomach and duodenal S ⁇ ulcer, irritable bowel syndrome, etc. It is.
  • compounds or salts thereof that inhibit the promoter activity of AQ27 receptor DNA are useful as safe and low toxic androgen secretion regulators, preferably male hormonal secretion inhibitors (male hormone secretion inhibitors).
  • compounds or salts thereof that inhibit the activity of the promoter against AQ27 receptor DNA include, for example, penile enlargement, testicular atrophy, testicular dysfunction (eg, sperm reduction), menstrual abnormalities, hirsutism, pigmentation, hoarseness, and hypersensitivity. It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for illness, acne, nausea, vomiting, gastrointestinal symptoms (eg, anorexia), and full moon-like face.
  • a drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method may be manufactured in the same manner as the drug containing a compound that alters the binding property between the AQ27 receptor or a salt thereof and a ligand. Can be.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic and can be used, for example, in humans or mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, pigs, pigs, dogs, cats, dogs). , Monkeys, etc.).
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like.For example, when a compound or a salt thereof that promotes the promoter activity for AQ27 receptor DNA is orally administered, Adult patients (Assuming a body weight of 60 kg):-about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 5 Omg, more preferably about 1.0 to 20 mg of the compound is administered daily.
  • the single dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • injection of a compound or a salt thereof that promotes the activity of a promoter for AQ27 receptor DNA is performed.
  • the compound or a salt thereof is about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0.1 to 20 mg. More preferably, about 0.1 to 10 mg is administered by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of weight per 60 kg.
  • non-human mammals deficient in AQ27 receptor DNA expression are extremely useful in screening for compounds or salts thereof that promote or inhibit the activity of the promoter for AQ27 receptor DNA, It can greatly contribute to investigating the cause of various diseases caused by insufficient expression of receptor DNA or preventing and developing therapeutic drugs.
  • genes encoding various proteins are ligated downstream thereof and injected into egg cells of an animal to produce a so-called transgenic animal (gene transfer). Animal), it would be possible to specifically synthesize its AQ27 receptor and study its effects in living organisms.
  • an appropriate reporter gene is ligated to the above promoter and a cell line that expresses this gene is established, it has the effect of specifically promoting or suppressing the production ability of the AQ27 receptor itself in the body. It can be used as a search system for low molecular compounds.
  • V adenine (A), guanine (G) or cytosine (C) V adenine (A), guanine (G) or cytosine (C)
  • RNA ribonucleic acid

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)

Abstract

配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩は副腎皮質分泌調節作用を有しており、副腎皮質ホルモン分泌調節剤として有用である。

Description

明 細 書 副腎皮質ホルモン分泌調節剤 技術分野
本発明は、 A Q 2 7受容体に結合しうる新規な分泌蛋白質またはそれをコ 一ドするポリヌクレオチドを含有する副腎皮質ホルモン分泌調節剤などに関 する。 - 背景技術
近年、 ヒトゲノム D NAあるいは各種ヒト組織由来の c D NAのランダムな 配列決定による配列情報の蓄積および遺伝子解析技術の急速な進歩によってヒ トの遺伝子が加速度的に解明されてきている。 それにともない、 機能未知の蛋 白質をコードすると予想される多くの遺伝子の存在が明らかになつている。 ォーファン G蛋白質共役型レセプター蛋白質である A Q 2 7受容体おょぴそ の D NAが報告されている （WO O 1 / 1 6 3 1 3号） 。
本発明は、 A Q 2 7受容体およびそれに結合しうる新規な分泌蛋白質の新 規な用途、 すなわち副腎皮質ホルモン分泌調節剤などとしての用途を提供す る。 発明の開示
本発明者らは、 上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、 ヒト全 脳等から分泌シグナルを含む新規なぺプチドをコ一ドする 4種類の D NAを取 得することに成功し、 この D N Aに分泌べプチドがコードされていることを見 い出した。 さらに、 本発明者らは、 これらの分泌ペプチドが予想外にも A Q 2 7受容体に結合すること、 副腎皮質ホルモン分泌促進作用を示すことを見出し た。 本発明者らは、 これらの知見に基づいて、 さらに検討を重ねた結果、 本発 明を完成するに至った。 ' すなわち、 本発明は、 〔1〕 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そのアミドもしくは そのエステルまたはその塩を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌調節剤、
〔2〕 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列が配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 5または配列番号： 7で表わされるアミノ酸配列である第 〔1〕 記載の剤、
〔3〕 部分ペプチドが、
( 1 ) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の第 8 0番目〜 8 8番目のアミ ノ酸配列または第 1 2 7番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチド、
( 2 ) 配列番号： 3で表わされるアミノ酸配列の第 1 1 6番目〜 1 2 2番目の ァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するぺプチド,
( 3 ) 配列番号： 5で表わされるアミノ酸配列の第 1 1 6番目〜 1 2 2番目の ァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するぺプチド. または
( 4 ) 配列番号： 7で表わされるアミノ酸配列の第 1 2 5番目〜 1 3 1番目の ァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するぺプチド である第 〔1〕 記載の剤、
〔4〕 部分ペプチドが、
( 1 ) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の第 9 0番目〜 1 3 3番目のァ ミノ酸配列、 第 9 1番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 9 3番目〜 1 3 3番 目のアミノ酸配列、 第 1 0 4番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 1 0 8番目 〜1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 1 0 9番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 1 1 1番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 1 1 5番目〜 1 3 3番目のァミノ 酸配列、 第 1 1 9番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 1 2 4番目〜 1 3 3番 目のアミノ酸配列、 第 1 2 6番目〜 1 3 3番目または第 1 2 7番目〜 1 3 3番 目のアミノ酸配列からなるぺプチド、
( 2 ) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の第 9 1番目〜 1 3 3番目のァ ミノ酸配列からなるぺプチドの N末端のグルタミン残基 （G i n ) がピロダル タミン化されているペプチド、 または
( 3 ) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の第 9 0番目〜 1 3 3番目のァ ミノ酸配列からなるペプチドの N末端のアルギニン残基 （A r g ) がチロシン 残基 （T y r ) に置換されているペプチドである第 〔1〕 記載の剤、
〔5〕 副腎皮質ホルモン分泌促進剤である第 〔1〕 記載の剤、
〔6〕 低アルドステロン症、 低コルチゾール血症、 続発性または慢性副腎皮質 機能低下症、 アジソン病、 副腎機能不全、 痛みまたは肥満の予防 ·治療剤であ る第 〔5〕 記載の剤、
〔7〕 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有する分泌蛋白質またはその部分べプチドをコードするポリ ヌクレオチドを含有してなる副腎皮質ホルモン分泌調節剤、 .
〔8〕 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列が配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 5または配列番号： 7で表わされるアミノ酸配列である第 〔7〕 記載の剤、
〔9〕 部分ペプチドが、 '
( 1 ) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の第 8 0番目〜 8 8番目のアミ ノ酸配列または第 1 2 7番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有するぺプチド、
( 2 ) 配列番号： 3で表わされるアミノ酸配列の第 1 1 6番目〜 1 2 2番目の アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するぺプチド.
( 3 ) 配列番号： 5で表わされるアミノ酸配列の第 1 1 6番目〜 1 2 2番目の アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するぺプチド. または
( 4 ) 配列番号： 7で表わされるアミノ酸配列の第 1 2 5番目〜 1 3 1番目の アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するぺプチド である第 〔7〕 記載の剤、
〔1 0〕 部分ペプチドが
( 1 ) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の第 9 0番目〜 1 3 3番目のァ ミノ酸配列、 第 9 1番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 9 3番目〜 1 3 3番 目のアミノ酸配列、 第 104番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 108番目 〜 133番目のアミノ酸配列、 第 109番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 1 11番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 1 15番目〜 1 33番目のァミノ 酸配列、 第 1 19番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 124番目〜 133番 目のアミノ酸配列、 第 126番目〜 133番目または第 127番目〜 133番 目のアミノ酸配列からなるぺプチド、
(2) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の第 91番目〜 133番目のァ ミノ酸配列からなるぺプチドの N末端のグルタミン残基 （G 1 n) がピロダル タミン化されているペプチド、 または
(3) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の第 90番目〜 133番目のァ ミノ酸配列からなるペプチドの N末端のアルギニン残基 （Ar g) がチロシン 残基 （Ty r) に置換されているペプチドである第 〔7〕 記載の剤、
〔1 1〕 副腎皮質ホルモン分泌促進剤である第 〔7〕 記載の剤、
〔12〕 低アルドステロン症、 低コルチゾール血症、 続発 1·生または慢性副腎皮 質機能低下症、 アジソン病、 副腎機能不全、 痛みまたは肥満の予防 ·治療剤で ある第 〔1 1〕 記載の剤、
〔13〕 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質またはその部分べプチドをコ一ドするポ リヌクレオチドを含有してなる低アルドステロン症、 低コルチゾール血症、 続 発性または慢性副腎皮質機能低下症、 アジソン病、副腎機能不全、痛み、肥満、 クッシング病、 クッシング症候群、 副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、 C RH産生腫瘍、 アルドステロン産生腫瘍、 アルドステロン症、 原発性コルチゾ ール抵抗症、 先天性副腎酵素欠乏症、 ストレス、 うつ病、 神経性食欲不振症、 不眠、 胃 ·十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の診断剤、
〔14〕 配列番号： 1で表わされるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のァミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 その部分べプチド、 そのアミドもしく はそのエステルまたはその塩に対する抗体を含有してなる副腎皮質ホルモン分 泌調節剤、
〔15〕 副腎皮質ホルモン分泌阻害剤である第 〔14〕 記載の剤、 〔1 6〕 クッシング病、 クッシング症候群、 副腎皮質刺 ホルモン産生下垂体 腫瘍、 C R H産生腫瘍、 アルドステロン産生腫瘍、 アルドステロン症、 原発性 コルチゾール抵抗症、 先天性副腎酵素欠乏症、 ストレス、 うつ病、 神経性食欲 不振症、 不眠、 胃 ·十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の予防 ·治療剤である 第 〔1 5〕 記載の剤、
〔1 7〕 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そのアミドもしく はそのエステルまたはその塩に対する抗体を含有してなる低アルドステロン症、 低コルチゾール血症、 続発性または慢性副腎皮質機能低下症、 アジソン病、 副 腎機能不全、 痛み、 肥満、 クッシング病、 クッシング症候群、 副腎皮質刺激ホ ル.モン産生下垂体腫瘍、 C R H産生腫瘍、 アルドステロン産生腫瘍、 アルドス テロン症、 原発性コルチゾール抵抗症、 先天性副腎酵素欠乏症、 ストレス、 う つ病、 神経性食欲不振症、 不眠、 胃 ·十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の診 断剤、
〔1 8〕 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のァミノ酸配列を含有する分泌蛋白質またはその部分べプチドをコードするポ リヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセン スポリヌクレオチドを含有してなる副腎皮質ホルモン分泌調節剤、
〔1 9〕 副腎皮質ホルモン分泌阻害剤である第 〔1 8〕 記載の剤、
〔2 0〕 クッシング病、 クッシング症候群、 副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体 m , C R H産生腫瘍、 アルドステロン産生腫瘍、 アルドステロン症、 原発性 コルチゾール抵抗症、 先天性副腎酵素欠乏症、 ストレス、 うつ病、 神経性食欲 不振症、 不眠、 胃 ·十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の予防'治療剤である 第 〔1 9〕 記載の剤、 '
〔2 1〕 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のァミノ酸配列を含有する分泌蛋白質またはその部分べプチドをコ一ドするポ リヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセン スポリヌクレオチドを含有してなる低アルドステロン症、 低コルチゾール血症、 続発性または慢性副腎皮質機能低下症、 アジソン病、 副腎機能不全、 痛み、 月巴 満、クッシング病、 クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、 C R H産生腫瘍、 アルドステロン産生腫瘍、 アルドステロン症、 原発性コルチ ゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、 ストレス、 うつ病、神経性食欲不振症、 不眠、 胃 ·十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の診断剤、
〔2 2〕 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そのアミドもしく はそのエステルまたはその塩の機能を促進または阻害する化合物またはその塩 を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌調節剤、
〔2 3〕 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のァミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 その部分べプチド、 そのアミドもしく はそのエステルまたはその塩の機能を促進する化合物またはその塩を含有して なる副腎皮質ホルモン分泌促進剤、
〔2 4〕 低アルドステロン症、 低.コルチゾール血症、 続発性または慢性副腎皮 質機能低下症、 アジソン病、 副腎機能不全、 痛みまたは肥満の予防 ·治療剤で ある第 〔2 3〕 記載の剤、
〔2 5〕 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そのアミドもしく はそのエステルまたはその塩の機能を阻害する化合物またはその塩を含有して なる副腎皮質ホルモン分泌阻害剤、
〔2 6〕 クッシング病、 クッシング症候群、 副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体 腫瘍、 C R H產生腫瘍、 アルドステロン産生腫瘍、 アルドステロン症、 原発性 コルチゾール抵抗症、 先天性副腎酵素欠乏症、 ストレス、 うつ病、 神経性食欲 不振症、 不眠、 胃 ·十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の予防 ·治療剤である 第 〔2 5〕 記載の剤、
〔2 7〕 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そのアミドもしく はそのエステルまたはその塩の発現を促進または阻害する化合物またはその塩 を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌調節剤、
〔2 8〕 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 3 011160
7 のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そのアミ ドもしく はそのエステルまたはその塩の発現を促進する化合物またはその塩を含有して なる副腎皮質ホルモン分泌促進剤、
〔2 9〕 低アルドステロン症、 低コルチゾール血症、 続発性または慢性副腎皮 質機能低下症、 アジソン病、 副腎機能不全、 痛みまたは肥満の予防'治療剤で ある第 〔2 8〕 記載の剤、
〔3 0〕 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そのアミドもしく はそのエステルまたはその塩の発現を阻害する化合物またはその塩を含有して なる副腎皮質ホルモン分泌阻害剤、
〔3 1〕 クッシング病、 クッシング症候群、 副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体 腫瘍、 C R H産生腫瘍、 アルドステロン産生腫瘍、 アルドステロン症、 原発性 コルチゾール抵抗症、 先天性副腎酵素欠乏症、 ストレス、 うつ病、 神経性食欲 不振症、 不眠、 胃，十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の予防 ·治療剤である 第 〔3 0〕 記載の剤、
〔3 2〕 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受 容体、 その部分ぺプチドまたはその塩を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌調 節剤、
〔3 3〕 副腎皮質ホルモン分泌促進剤である第 〔3 2〕 記載の剤、
〔3 4〕 低アルドステロン症、 低コルチゾール血症、 続発性または慢性副腎皮 質機能低下症、 アジソン病、 副腎機能不全、 痛みまたは肥満の予防 ·治療剤で ある第 〔3 3〕 記載の剤、
〔3 5〕 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受 容体またはその部分ぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチドを含有してなる副 腎皮質ホルモン分泌調節剤、
〔3 6〕 副腎皮質ホルモン分泌促進剤である第'〔3 5〕 記載の剤、
〔3 7〕 低アルドステロン症、 低コルチゾール血症、 続発"生または慢性副腎皮 2003/011160
8 質機能低下症、 アジソン病、 副腎機能不全、 痛みまたは肥満の予防。治療剤で ある第 〔3 6〕 記載の剤、
〔3 8〕 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受 容体またはその部分べプチドをコ一ドするポリヌクレオチドを含有してなる低 アルドステロン症、 低コルチゾール血症、 続発性または慢性副腎皮質機能低下 症、 アジソン病、 副腎機能不全、 痛み、 肥満、 クッシング病、 クッシング症候 群、 副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体 S重瘍、 C R H産生 g重瘍、 アルドステロン 産生腫瘍、 アルドステロン症、 原発性コルチゾール抵抗症、 先天性副腎酵素欠 乏症、 ストレス、 うつ病、 神経性食欲不振症、 不眠、 胃 ·十二指腸潰瘍または 過敏性腸症候群の診断剤、
〔3 9〕 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する A Q 2 7受 容体、 その部分べプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる副腎皮質ホ ルモン分泌調節剤、
〔4 0〕 副腎皮質ホルモン分泌阻害剤である第 〔3 9〕 記載の剤、
〔4 1〕 クッシング病、 クッシング症候群、 副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体 腫瘍、 C R H産生腫瘍、 アルドステロン産生腫瘍、 アルドステロン症、 原発性 コルチゾール抵抗症、 先天性副腎酵素欠乏症、 ストレス、 うつ病、 神経性食欲 不振症、 不眠、 胃 ·十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の予防 ·治療剤である 第 〔4 0〕 記載の剤、
〔4 2〕 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する A Q 2 7受 容体、 その部分べプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる低アルドス テロン症、 低コルチゾール血症、 続発性または慢性副腎皮質機能低下症、 アジ ソン病、 副腎機能不全、 痛み、 肥満、 クッシング病、 クッシング症候群、 副腎 皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、 C R H産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、 アルドステロン症、 原発性コルチゾール抵抗症、 先天性副腎酵素欠乏症、 スト レス、 うつ病、 神経性食欲不振症、 不眠、 胃 '十二指腸潰瘍または過敏性腸症 JP2003/011160
候群の診断剤、
〔4 3〕 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する A Q 2 7受 容体またはその部分べプチドをコ一ドするポリヌクレオチドと相補的な塩基配 列またほその一部を含有してなるアンチセンスポリヌクレオチドを含有してな る副腎皮質ホルモン分泌調節剤、
〔4 4〕 副腎皮質ホルモン分泌阻害剤である第 〔4 3〕 記載の剤、
〔4 5〕 クッシング病、 クッシング症候群、 副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体 腫瘍、 C R H産生腫瘍、 アルドステロン産生腫瘍、 アルドステロン症、 原発性 コルチゾール抵抗症、 先天性副腎酵素欠乏症、 ストレス、 うつ病、 神経性食欲 不振症、 不眠、 胃 .十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の予防 ·治療剤である 第 〔4 4〕 記載の剤、
〔4 6〕 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する A Q 2 7受 容体またはその部分ぺプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な塩基配 列またはその一部を含有してなるアンチセンスポリヌクレオチドを含有してな る低アルドステロン症、 低コルチゾール血症、 続発性または慢性副腎皮質機能 低下症、 アジソン病、 副腎機能不全、 痛み、 肥満、 クッシング病、 クッシング 症候群、 副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、 C R H産生腫瘍、 アルドステ ロン産生腫瘍、 アルドステロン症、 原発性コルチゾール抵抗症、 先天性副腎酵 素欠乏症、 ストレス、 うつ病、 神経性食欲不振症、 不眠、 胃 ·十二指腸潰瘍ま たは過敏性腸症候群の診断剤、
〔4 7〕 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する A Q 2 7受 容体、 その部分ペプチドまたはその塩の機能を促進または阻害する化合物また はその塩を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌調節剤、
〔4 8〕 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する A Q 2 7受 容体、 その部分べプチドまたはその塩の機能を促進する化合物またはその塩を PC霞謹 11160
10 含有してなる副腎皮質ホルモン分泌促進剤、
〔4 9〕 低アルドステロン症、 低コルチゾール血症、 続発性または慢性副腎皮 質機能低下症、 アジソン病、 副腎機能不全、 痛みまたは肥満の予防 ·治療剤で ある第 〔4 8〕 記載の剤、
〔5 0〕 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する A Q 2 7受 容体、 その部分べプチドまたはその塩の機能を阻害する化合物またはその塩を 含有してなる副腎皮質ホルモン分泌阻害剤、
〔5 1〕 クッシング病、 クッシング症候群、 副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体 m , C R H産生腫瘍、 アルドステロン産生腫瘍、 アルドステロン症、 原発性 コルチゾール抵抗症、 先天性副腎酵素欠乏症、 ストレス、 うつ病、 神経性食欲 不振症、 不眠、 胃 ·十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の予防'治療剤である 第 〔5 0〕 記載の剤、
〔5 2〕 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受 容体、 その部分べプチドまたはその塩の発現を促進または阻害する化合物また はその塩を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌調節剤、
〔5 3〕 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する A Q 2 7受 容体、 その部分ペプチドまたほその塩の発現を促進する化合物またはその塩を 含有してなる副腎皮質ホルモン分泌促進剤、
〔5 4〕 低アルドステロン症、 低コルチゾール血症、 続発性または慢性副腎皮 質機能低下症、 アジソン病、 副腎機能不全、 痛みまたは肥満の予防'治療剤で ある第 〔5 3〕 記載の剤、
〔5 5〕 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する A Q 2 7受 容体、 その部分べプチドまたはその塩の発現を阻害する化合物またはその塩を 含有してなる副腎皮質ホルモン分泌阻害剤、
〔5 6〕 クッシング病、 クッシング症候群、 副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体 腫瘍、 C R H産生腫瘍、 アルドステロン産生腫瘍、 アルドステロン症、 原発性 コルチゾ一ル抵抗症、 先天性副腎酵素欠乏症、 ストレス、 うつ病、 神経性食欲 不振症、 不眠、 胃 '十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の予防'治療剤である 第 〔5 5〕 記載の剤、
〔5 7〕 ( 1 ) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そのアミド もしくはそのエステルまたはその塩と （2 ) 配列番号： 9、 配列番号： 1 1ま たは配列番号： 1 3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容体、 その部分ペプチドまたはその塩との 結合性を変化させる化合物またはその塩を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌 調節剤、
〔5 8〕 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する A Q 2 7受 '容体、 その部分ペプチドまたはその塩に対するァゴニストを含有してなる副腎 皮質ホルモン分泌促進剤、
〔5 9〕 低アルドステロン症、 低コルチゾール血症、 続発性または慢性副腎皮 質機能低下症、 アジソン病、 副腎機能不全、 痛みまたは肥満の予防'治療剤で ある第 〔5 8〕 記載の剤、
〔6 0〕 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受 容体、 その部分ペプチドまたはその塩に対するアンタゴニストを含有してなる 副腎皮質ホルモン分泌阻害剤、
〔6 1〕 クッシング病、 クッシング症候群、 副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体 腫瘍、 C R H産生腫瘍、 アルドステロン産生腫瘍、 アルドステロン症、 原発性 コルチゾール抵抗症、 先天性副腎酵素欠乏症、 ストレス、 うつ病、 神経性食欲 不振症、 不眠、 胃 ·十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の予防'治療剤である 第 〔6 0〕 記載の剤、
〔6 2〕 哺乳動物に対して、 ①配列番号： 1で表わされるァミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 その部分べプチ 3 011160
12 ド、 そのアミ ドもしくはそのエステルまたはその塩、 ②配列番号： 1で表わさ れるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌 蛋白質またはその部分べプチドをコードするポリヌクレオチド、 ③配列番号：
1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含 有する分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そのアミドもしくはそのエステルまた はその塩の機能を促進する化合物またはその塩、 ④配列番号： 1で表わされる アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白 質、 その部分ペプチド、 そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の発現 を促進する化合物またはその塩、 ⑤配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列 番号： 1 3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸 配列を含有する A Q 2 7受容体、 その部分ペプチドまたはその塩、 ⑥配列番号 ： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容体またはその部 分ぺプチドをコードするポリヌクレオチド、 ⑦配列番号： 9、 配列番号： 1 1 または配列番号： 1 3で表わされるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容体、 その部分ペプチドまたはその塩の 機能を促進する化合物またはその塩、 ⑧配列番号： 9、 配列番号： 1 1または 配列番号： 1 3で表わされるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有する A Q 2 7受容体、 その部分ペプチドまたはその塩の発現を 促進する化合物またはその塩または⑨配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配 列番号： 1 3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ 酸配列を含有する A Q 2 7受容体またはその塩に対するァゴニストの有効量を 投与することを特徴とする （i ) 副腎皮質ホルモン分泌促進方法または （i i) 低アルドステロン症、 低コルチゾール血症、 続発性または慢性副腎皮質機能低 下症、 アジソン病、 副腎機能不全、 痛みまたは肥満の予防 ·治療方法、
〔6 3〕 哺乳動物に対して、 ①配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 その部分べプチ ド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体、②配列番号： 1で表わされるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含 有する分泌蛋白質またはその部分べプチドをコ一ドするポリヌクレオチドと相 補的な塩基配列またはその一部を含有してなるァンチセンスポリヌクレオチド ③配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そのアミドもしくはその エステルまたはその塩の機能を阻害する化合物またはその塩、 ④配列番号： 1 で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有 する分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そのアミドもしくはそのエステルまたは その塩の発現を阻害する化合物またはその塩、 ⑤配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有する AQ 2 7受容体、 その部分ペプチドまたはその塩 に対する抗体、 ⑥配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わ されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容体またはその部分ぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチドと相補的 な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンスポリヌクレオチド、 ⑦ 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミノ酸配 列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する AQ 2 7受容体、 そ の部分べプチドまたはその塩の機能を阻害する化合物またはその塩、 ⑧配列番 号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミノ酸配列と同 —もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する AQ 2 7受容体、 その部分 ぺプチドまたはその塩の発現を阻害する化合物またはその塩または⑨配列番 号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるァミノ酸配列と同 ' 一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容体またはその 塩に対するアンタゴ-ストの有効量を投与することを特徴とする （i ) 副腎皮 質ホルモン分泌阻害方法または （ii) クッシング病、 クッシング症候群、 副腎 皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、 C R H産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、 アルドステロン症、 原発性コルチゾール抵抗症、 先天性副腎酵素欠乏症、 スト レス、 うつ病、 神経性食欲不振症、 不眠、 胃 '十二指腸潰瘍または過敏性腸症 候群の予防 ·治療方法、
「6 4〕 （ i )副腎皮質ホルモン分泌促進剤または （ii)低アルドステロン症、 低コルチゾール血症、 続発性または慢性副腎皮質機能低下症、 アジソン病、 副 腎機能不全、 痛みまたは肥満の予防。治療剤を製造するための、 ①配列番号： 1で表わされるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含 有する分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そのアミドもしくはそのエステルまた はその塩、 ②配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質またはその部分べプチドをコ一ドす るポリヌクレオチド、 ③配列番号： 1で表わされるァミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そ のアミドもしくはそのエステルまたはその塩の機能を促進する化合物またはそ の塩、 ④配列番号： 1で表わされるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そのアミドもしく はそのエステルまたはその塩の発現を促進する化合物またはその塩、 ⑤配列番 号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるァミノ酸配列と同 一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容体、 その部分 ペプチドまたはその塩、 ⑥配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含 有する A Q 2 7受容体またはその部分べプチドをコ一ドするポリヌクレオチド. ⑦配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミノ酸 配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容体、 その部分ペプチドまたはその塩の機能を促進する化合物またはその塩、 ⑧配列 番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミノ酸配列と 同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容体、 その部 分ぺプチドまたはその塩の発現を促進する化合物またはその塩または⑨配列番 号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミノ酸配列と同 —もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容体またはその 塩に対するァゴニストの使用、
〔6 5〕 ( i ) 副腎皮質ホルモン分泌阻害剤または （ii) クッシング病、 タツ シング症候群、 副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、 C R H産生腫瘍、 アル ドステロン産生腫瘍、 アルドステロン症、 原発性コルチゾール抵抗症、 先天性 副腎酵素欠乏症、 ストレス、 うつ病、 神経性食欲不振症、 不眠、 胃，十二指腸 潰瘍または過敏性腸症候群の予防 ·治療剤を製造するための、 ①配列番号： 1 で表わされるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有 する分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そのアミドもしくはそのエステルまたは その塩に対する抗体、 ②配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質またはその部分べプチド をコードするポリヌクレオチドと相捕的な塩基配列またはその一部を含有して なるァンチセンスボリヌクレオチド、 ③配列番号： 1で表わされるアミノ酸配 列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 その部 分ぺプチド、 そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の機能を阻害する 化合物またはその塩、 ④配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そ のアミドもしくはそのエステルまたはその塩の発現を阻害する化合物またはそ の塩、 ⑤配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受 容体、 その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、 ⑥配列番号： 9、 配列番 号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるァミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容体またはその部分べプチドを コードするポリヌクレオチドと相捕的な塩基配列またはその一部を含有してな るアンチセンスポリヌクレオチド、 ⑦配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配 列番号： 1 3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ 酸配列を含有する A Q 2 7受容体、 その部分べプチドまたはその塩の機能を阻 害する化合物またはその塩、 ⑧配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号 ： 1 3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列 を含有する A Q 2 7受容体、 その部分ペプチドまたはその塩の発現を阻害する 化合物またはその塩または⑨配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を 含有する A Q 2 7受容体またはその塩に対するアンタゴニストの使用、 〔6 6〕 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 P T/JP2003/011160
16 のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そのアミドもしく はそのエステルまたはその塩おょぴ （または） 配列番号： 9、 配列番号： 1 1 または配列番号： 1 3で表わされるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容体、 その部分べプチドまたはその塩を 用いることを特徴とする副腎皮質ホルモン分泌調節薬のスクリーニング方法、 〔6 7〕 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸酉己列を含有する分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そのアミドもしく はそのエステルまたはその塩おょぴ （または） 配列番号： 9、 配列番号： 1 1 または配列番号： 1 3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容体、 その部分ペプチドまたはその塩を 含有することを特徴とする副腎皮質ホルモン分泌調節薬のスクリーニ グ用キ ッ K
〔6 8〕 試験化合物を非哺乳動物に投与し、 血中の副腎皮質ホルモンまたは男 性ホルモンの镌度を測定することを特徴とする配列番号： 9、 配列番号： 1 1 または配列番号： 1 3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容体またはその塩に対するァゴニストま たはアンタゴニストのスクリーニング方法、 および
〔6 9〕 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるァ. ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する A Q 2 7受 容体またはその塩を活性ィ匕する化合物またはその塩を非ヒト哺乳動物に投与し た場合と、 該 A Q 2 7受容体を活性化する化合物またはその塩および試験ィ匕合 物を非ヒト哺乳動物に投与した場合における、 血中の副腎皮質ホルモンまたは 男性ホルモンの濃度を測定し、 比較することを特徴とする該 A Q 2 7受容体に 対するァゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法を提供する。
さらに、 本発明は、
〔7 0〕 （ i ) 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わさ れるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容体、 その部分ペプチドまたはその塩に、 配列番号： 1で表わされるァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 JP2003/011160
17 その部分ペプチド、 そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を接触させ だ場合と （i i) 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わさ れるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容体、 その部分ペプチドまたはその塩に、 配列番号： 1で表わされるァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩おょぴ試験 化合物を接触させた場合における、 副腎皮質ホルモン分泌促進活性または男性 ホルモン分泌促進活性を測定し、 比較することを特徴とする配列番号： 1で表 わされるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する 分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そのアミドもしくはそのエステルまたはその 塩と配列番号： 9、 配列番号： 1. 1または配列番号： 1 3で表わされるァミノ 酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容体 またはその塩に対するァゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、 〔7 1〕 （ i ) 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わさ れるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容体またはその塩を活性ィ匕する化合物を、 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容体を含有する細胞に接触させた場合 と （ii) 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受 容体またはその塩を活性ィヒする化合物おょぴ試験化合物を、 配列番号： 9、 配 列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるァミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容体を含有する細胞に接触 させた場合における、 副腎皮質ホルモン分泌促進活性または男性ホルモン分泌 促進活性を測定し、 比較することを特徴とする配列番号： 1で表わされるアミ ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩と配列番 号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミノ酸配列と同 一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容体またはその 塩に対するァゴニストまたはアンタゴニストのスクリーエング方法、
〔7 2〕 試験化合物 （例、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 その部分べプチド、 -そ アミ もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 —のアミノ酸配列を含有する AQ 2 7受容体、 その部分べプチドまたはその塩 の結合性を変化させる化合物またはその塩） を、 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容体を含有する細胞に接触させた場合 における、 副腎皮質ホルモン分泌促進活性または男性ホルモン分泌促進活性を 測定することを特徴とする配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含 有する A Q 2 7受容体またはその塩に対するァゴニストまたはアンタゴニスト のスクリーニング方法、
〔7 3〕 （ i ) 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わさ れるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容体またはその塩を活性化する化合物またはその塩 （例、 配列番号： 1 で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有 する分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そのアミドもしくはそのエステルまたは その塩） を配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされる ァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する A Q 2 7 受容体またはその塩を含有する細胞に接触させた場合と、 （ii)配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容体またはその塩を活性 化する化合物またはその塩 （例、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同 一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 Ϋの部分ぺプ チド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩）および試験化合物（例、 配列番号： 1で表わされるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ 酸配列を含有する分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そのアミドもしくはそのェ ステルまたはその塩と配列番号：. 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で 表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有す る AQ 2 7受容体、 その部分ペプチドまたはその塩の結合性を変化させる化合 物またはその塩） を A Q 2 7受容体を含有する細胞に接触させた場合における、 副腎皮質ホルモン分泌促進活性または男性ホルモン分泌促進活性を測定し、 比 較することを特徴とする配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3 で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有 する A Q 2 7受容体またはその塩に対するァゴニストまたはアンタゴニストの スクリーニング方法、
〔7 4〕 試験化合物 （例、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩と配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容体、 その部分ペプチドまたはその塩 の結合性を変化させる化合物またはその塩） を非哺乳動物に投与し、 血中の副 腎皮質ホルモンまたは男性ホルモンの濃度を測定することを特徴とする配列番 号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミノ酸配列と同 一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容体またはその 塩に対するァゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、 および 〔7 5〕 ( i ) 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わさ れるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容体またはその塩を活性化する化合物またはその塩 （例、 配列番号： 1 で表わされるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有 する分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そのアミドもしくはそのエステルまたは その塩） を非ヒト哺乳動物に投与した場合と、 （ii) 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容体またはその塩を活性化する化合 物またはその塩 （例、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 その アミ ドもしくはそのエステルまたはその塩） および試験化合物を非ヒト哺乳動 物に投与した場合における、 血中の副腎皮質ホルモンまたは男性ホルモンの濃 度を測定し、 比較することを特徴とする配列番号： 9、 配列番号： 1 1または 配列番号： 1 3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有する AQ 2 7受容体またはその塩に対するァゴニストまたはァ ンタゴニストのスクリーニング方法を提供する。 図面の簡単な説明
図 1はヒト型分泌蛋白質の DN A配列を示す。
図 2はヒ ト型分泌蛋白質のアミノ酸配列を示す。
図 3はラット型分泌蛋白質の D N A配列を示す。
図 4はラット型分泌蛋白質のアミノ酸配列を示す。
図 5はヒト型分泌蛋白質とラット型分泌蛋白質のアミノ酸配列の比較図を示す。 図 6は新規ヒト型ぺプチド： Gly - Gly - Phe - Ser - Phe - Arg - Phe-NH 2 (配列番号： 1 の第 1 27番目〜 1 33番目） および新規ヒト型ペプチド：
Glu-His-Ala-Gly-Cys-Arg-Phe-Arg-Phe-NH 2 (配列番号： 1の第 80番目〜 88 番目） のヒト AQ 27受容体おょぴヒト OT 7 T 0 22受容体を発現させてい ない HEK2 9 3細胞に対するレポーター遺伝子発現量の上昇活性 （ルシフエ ラーゼ活性） を示す。 縦軸はルシフェラーゼ活性 （c p s) を示す。 横軸はぺ プチドの濃度 （μΜ) を示す。 F SKはフオルスコリンを示す。 EHAGCR FRF-NH 2はぺプチド Glu- His-Ala- Gly- Cys- Arg- Phe- Arg- Phe- NH 2 (配列番 号： 1の第 8 0番目〜 88番目） を、 GGF S FRFはペプチド
Gly- Gly- Phe- Ser- Phe- Arg- Phe- NH 2 (配列番号： 1の第 1 27番目〜 1 3 3番目） を示す。 b a s eはぺプチド無添加の場合を示す。
図 7は新規ヒト型ぺプチド： Gly- Gly- Phe- Ser_Phe- Arg- Phe-匪 2 (配列番号： 1 の第 1 27番目〜 1 3 3番目） および新規ヒト型ペプチド：
Glu-His-Ala-Gly-Cys-Arg-Phe-Arg-Phe-NH 2 (配列番号： 1の第 80番目〜 88 番目） のヒ ト AQ 27受容体を一過性に発現させた HE K 2 9 3細胞に対する レポーター遺伝子発現量の上昇活性 (ルシフェラーゼ活性) を示す。 縦軸はル シフェラーゼ活性 （c p s) を示す。 横軸はペプチドの濃度 （μΜ) を示す。 F SKはフオルスコリンを示す。 EHAGCRFRF- NH 2はぺプチド
Glu-His-Ala-Gly-Cys-Arg-Phe-Arg-Phe-NH 2 (配列番号： 1の第 80番目〜 88 番目） を、 G G F S F R Fはペプチド Gly- Gly- Phe- Ser- Phe- Arg- Phe- NH 2 (配 列番号： 1の第 127番目〜 133番目） を示す。 b a s eはペプチド無添カロ の場合を示す。
図 8はマウス型分泌蛋白質の DN A配列を示す。
図 9はマウス型分泌蛋白質のァミノ酸配列を示す。
図 10は新規ヒト型ぺプチド： Arg_Lys-Lys-Gly_Gly- Phe- Ser- Phe-Arg- Phe- NH 2 (配列番号： 1の第 124番目〜 1 33番目） のヒト AQ27受容体を発現さ せていない HEK293細胞に対するレポーター遺伝子発現量の上昇活性 （ノレ シフェラーゼ活性） を示す。 縦軸はルシフェラーゼ活性 (c p s) を示す。 横 軸はペプチドの濃度 （//M) を示す。 F S Kはフォルスコリンを示す。 RKK GGF S FR F- NH 2はぺプチド Arg- Lys- Lys- Gly- Gly- Phe- Ser-Phe- Arg- Phe- NH 2 (配列番号： 1の第 124番目〜 1 33番目） を示す。 b a s eはペプチド無 添加の場合を示す。
図 1 1は新規ヒト型ぺプチド： Arg-Lys- Lys - Gly - Gly-Phe-Ser- Phe- Arg- Phe- NH 2 (配列番号： 1の第 124番目〜 1 33番目） のヒト AQ27受容体を発現さ せた HEK293細胞に対するレポーター遺伝子発現量の上昇活性 （ルシフエ ラーゼ活性） を示す。 縦軸はルシフェラーゼ活性 （c p s) を示す。 横軸はぺ プチドの濃度 （ M) を示す。 F SKはフオルスコリンを示す。 RKKGGF S FRF-NH 2はぺプチド Arg-Lys- Lys-Gly- Gly- Phe- Ser- Phe- Arg- Phe_NH 2 (配 列番号： 1の第 124番目〜 133番目） を示す。 b a s eはペプチド無添カロ の場合を示す。
図 12は AQ 27発現 CHO細胞における c AMP産生抑制活性を示す。 n = 2の平均値である。 縦軸は c AMP濃度 (pmol)を示す。 横軸はペプチドの濃度 を 1 o gMで表したものである。 F SK—はフォルスコリン無添加の場合を、 F SK +はフオルスコリン添加の場合を示す。 RKKGGF S FRF-NH 2はヒ ト型ぺプチド： Arg- Lys-Lys- Gly- Gly- Phe- Ser-Phe- Arg- Phe- NH 2 (配列番号： 1 の第 124番目〜 1 33番目） を示す。
図 1 3は m o c k CHO細胞における c AMP産生抑制活性を示す。 n = 2の 平均値を示す。 縦軸は c AMP濃度 (pmol)を示す。 横軸はぺプチドの濃度を 1 o gMで表したものである。 F SK—はフォルスコリン無添加の場合を、 FS K +はフオルスコリン添加の場合を示す。 RKKGGF S FRF- H 2はヒト型 ぺプチド： Arg- Lys- Lys- Gly- Gly- Phe- Ser_Phe- Arg- Phe- NH 2 (配列番号： 1の第 1 24番目〜 133番目） を示す。
図 14は GGF S FRF-NH 2の AQ 27発現 C HO細胞における細胞内カルシ ゥムイオン遊離促進活性を示す。 縦軸の F l u o r e s c e n c eは蛍光強度 (cPs)を示す。横軸は時間（秒）を示す。 G G F S F R F - NH 2はヒト型ぺプチド： Gly-Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH 2 (配列番号： 1の第 127番目〜.133番目） を示す。o、口および▲はそれぞれ添加した GGF S FRF- NH2の濃度が 0 μΜ、 1 μΜおよび 10 であることを示す。
図 1 5は RKKGGF S FRF - NH 2の AQ 27発現 CHO細胞における細胞内 カルシウムイオン遊離促進活性を示す。 縦軸の F l u o r e s c e n c eは蛍 光強度（cps)を示す。横軸は時間 （秒） を示す。 1 1^1：00 3?1 -冊 2はヒ ト型ぺプチド： Arg- Lys- Lys-Gly- Gly- Phe- Ser- Phe- Arg- Phe- NH 2 (配列番号： 1 の第 124番目〜 1 33番目） を示す。 〇、 口および▲はそれぞれ添加した G GF S FRF - NH 2の濃度が 0 μΜ、 1 および 10 Μであることを示す。 図 16は新規ヒト型ぺプチド：
Thr-Ser-Gly-Pro-Leu-Gly-Asn-Leu-Ala-Glu-Glu-Leu-Asn-Gly-Tyr-Ser-Arg 一し ysHLys - Gly - Gly - Phe_Ser- Phe - Arg - Phe - NH2、
Pyr- Asp- Glu- Gly- Ser- Glu- Ala- Thr-Gly_Phe- Leu- Pro- Ala-Ala- Gly-Glu- Lys- Th r一; ¾er - Gly— Pro - Leu - Gly—AsrHLeu - Ala - Glu - Glu~Leu - Asn - Lrly—Tyr- Ser - Arg -Lys- Lys- Gly- Gly- Phe- Ser- Phe Arg- Phe- NH2 (配列番号： 1の第 108番目〜 1 33番目および第 91番目〜 133番目） のヒト AQ 27受容体を発現させて いない HE K 293細胞に対するレポーター遺伝子発現量の上昇活生 レシフ エラーゼ活性） を示す。 縦軸はルシフェラーゼ活性 （c p s) を示す。 横軸は ペプチドの濃度を 1 o gMで表したものである。 F SK—はフォルスコリン無 11160
23 添加の場合を、 F SK +はフオルスコリン添加の場合を示す。 T1—F 26— NH2は新規ヒト型ぺプチド：
Thr-Ser-Gly-Pro-Leu-Gly-Asn-Leu-Ala-Glu-Glu-Leu-Asn-Gly-Tyr-Ser-Arg-Ly s-Lys-Gly-Gly-Phe-Ser-Phe Arg- Phe- NH2 (配列番号： 1の第 108番目〜 13 3番目） 、 Py r 1— F43— NH2は新規ヒ ト型ペプチド： Pyr
-Asp- Glu- Gly- Ser- Glu- Ala_Thr_Gly_Phe- Leu- Pro- Ala- Ala- Gly- Glu- Lys- Thr - S er— Gly - Pro - Leu-Gly - Asn - Leu - Ala - (jiu - Glu— Leu— Asn - Gly - I'yr - t>er_Arg
- Lys- Lys- Gly- Gly-Phe-Ser- PheArg- Phe- NH2 (配列番号： 1の第 91番目〜 13 3番目） を示す。 Pyrは環状ピロダルタミルイ匕されたグルタミンを示す。
図 17は新規ヒト型ぺプチド：
Thr— Ser— Gly— Pro— Leu— Gly— Asn—し eu— Ala— Glu— Glu— Leu— Asn— Gly— Tyr— Ser— Ar.g -し ys - Lys_Gly_Gly - Phe Ser - Phe - Arg_Phe - H2、
Pyr- Asp- Glu- Gly_Ser- Glu- Ala- Thr- Gly- Phe- Leu-Pro- Ala- Ala- Gly- Glu-Lys-Th r-Ser-Gly-Pro-Leu-Gly-Asn-Leu-Ala-Glu-Glu-Leu-Asn-Gly-Tyr-Ser-Arg -Lys-Lys-Gly-Gly-Phe-Ser-Phe Arg- Phe- NH2 (配列番号： 1の第 108番目〜 1 33番目および第 91番目〜 133番目） のヒト AQ27受容体を発現させた • HEK293細胞に対するレポーター遺伝子発現量の上昇活' 1生 (ルシフェラー ゼ活性） を示す。 縦軸はルシフェラーゼ活性 （c p s) を示す。 横軸はぺプチ ドの濃度を 1 o gMで表したものである。 F SK—はフォルスコリン無添カロの 場合を、 F SK +はフオルスコリン添加の場合を示す。 T 1一 F 26— NH2は 新規ヒ ト型ペプチド： ,
Thr-Ser-Gly-Pro-Leu-Gly-Asn-Leu-Ala-Glu-Glu-Leu-Asn-Gly-Tyr-Ser-Arg -Lys-Lys-Gly-Gly-Phe-Ser-Phe Arg-Phe-NH2 (配列番号： 1の第 108番目〜 1 33番目、 Py r 1— F43_NH2は新規ヒ ト型ペプチド：
Pyr-Asp-Glu-Gly-Ser-Glu-Ala-Thr-Gly-Phe-Leu-Pro-Ala-Ala-Gly-Glu-Lys-Th r一 Ser- Gly - Pro -し eu - Gly- Asn— Leu - Ala - Glu - Glu - Leu - Asn - Gly - Tyr_Ser - Arg -Lys-Lys- Gly-Gly- Phe_Ser- Phe Arg_Phe-NH2 (配列番号： 1の第 91番目〜 13 3番目） を示す。 Pyrは環状ピロダルタミル化されたグルタミンを示す。
図 18は新規ヒ ト型ペプチド Py r 1 -F 43—NH2 5AQ27発現 C P T/JP2003/011160
24
HO細胞での細胞內カルシウムイオン動員活性を示す。 縦軸の F 1 u o r e s c e n c eは蛍光強度 (cps)を示す。 横軸は時間 （秒） を示す。 口はペプチド無 添加の場合を、 園、 △、 ▲、 〇、 ·および◊は添加したペプチドの濃度を 1 o gMで表したものであり、 それぞれ 5、 6、 7、 8、 9および 10を示す。 図 19は mo c k CHO細胞での細胞内カルシウムイオン濃度変化に対する 新規ヒト型ぺプチド： Py r l— F43— NH2の影響を調べた結果を示す。 縦 軸の F l u o r e s c e n c eは蛍光強度 （ c p s ) を示す。 横軸は時間 （秒） を示す。 口はペプチド無添加の場合を、 鵬、 △、 ▲、 〇、 ·およぴ0は添加し たペプチドの濃度を 1 o gMで表したものであり、 それぞれ 5、 6、 7、 8、 9および 10を示す。
図 20は新規ヒト型ぺプチド P y r 1— F 43— NH2による AQ 27発現 C HO細胞での c AMP産生抑制活性を示す。 n = 3の平均値。 縦軸の i n h i b i t i o nは CAM P産生抑制率 （％) を示す。 横軸の Co n e. は添加し たぺプチドの濃度を 1 o gMで表した。
図 21は mo c k CHOの c AMP産生抑制活性に対する新規ヒト型ぺプチ ド Py r 1— F43—NH2の影響を調べた結果を示す。 n = 3の平均値。 縦軸 の i nh i b i t i o nは c AMP産生抑制率（％) を示す。横軸の C o n c . は添力！]したべプチドの濃度を 1 o g Mで表した。
図 22は新規ヒト型ペプチド：
Ala-Ser-Gln-Pro-Gln-Ala-Leu-Leu-Val-Ile-Ala-Arg-Gly-Leu-Gln-Thr-Ser-Gl y-Arg-Glu-His-Ala-Gly-Cys-Arg-Phe-NH2 (配列番号： 1の第 61番目〜 86番 目） のヒト AQ 27受容体を発現させていない HEK 293細胞に対するレポ 一ター遺伝子発現量の上昇活性 （ルシフェラーゼ活性） を示す。 縦軸はルシフ エラーゼ活性 （c p s) 、 横軸はペプチドの濃度を 1 o gMで表したものであ る。 F SK—はフオルスコリン無添加の場合を、 F SK +はフオルスコリン添 加の場合を示す。 A1—F 28— NH2は新規ヒト型ペプチド：
Ala-Ser-Gln-Pro-Gln-Ala-Leu-Leu-Val-Ile-Ala-Arg-Gly-Leu-Gln-Thr-Ser-Gl y-Arg-Glu-His-Ala-Gly-Cys-Arg-Phe-NH2 (配列番号： 1の第 61番目〜 86番 目） を示す。 図 2 3は新規ヒト型ペプチド：
Ala-Ser-Gln-Pro-Gln-Ala-Leu-Leu-Val-Ile-Ala-Arg-Gly-Leu-Gln-Thr-Ser-Gl y-Arg-Glu-His-Ala-Gly-Cys-Arg-Phe-NH2 (配列番号： 1の第 6 1番目〜 86番 目） のヒト AQ 27受容体を発現させた HEK 293細胞に対するレポーター 遺伝子発現量の上昇活性 (ルシフェラーゼ活性) を示す。 縦軸の F 1 u o r e s c e n c eはルシフェラーゼ活性 （ c p s ) 、 横軸はぺプチドの濃度を 1 o gMで表したものである。 F SK—はフォ^/スコリン無添加の場合を、 F SK +はフオルスコリン添カ卩の場合を示す。 A 1—F 28 _NH2は新規ヒト型ぺプ チド：
Ala-Ser-Gln-Pro-Gln-Ala-Leu-Leu-Val-Ile-Ala-Arg-Gly-Leu-Gln-Thr-Ser-Gl y-Arg-Glu-His-Ala-Gly-Cys-Arg-Phe.-NH2 (配列番号： 1の第 6 1番目〜 8 6番 目） を示す。
図 24は新規ヒト型ぺプチド A 1 -F 28— NH2による AQ 27発現 CHO 細胞での細胞内カルシウムイオン動員活性を示す。 縦軸の F 1 u o r e s c e n c eは蛍光強度 （c p s) を示す。 横軸は時間 （秒） を示す。 *はぺプチド 無添加の場合を、 園、 秦、 〇、 ▲、 ◊およぴ令はペプチドの濃度を 1 o gMで 表したものであり、 それぞれ 5、 6、 7、 8、 9および 1 0を示す。
図 25は mo c k CHO細胞での細胞内カルシウムイオン濃度変化に対する 新規ヒト型ぺプチド A 1— F 28—NH 2の影響を調べた結果を示す。縦軸の F l u o r e s c e n c eは蛍光強度 （c p s) を示す。 横軸は時間 （秒） を示 す。 *はペプチド無添加の場合を、 讕、 拿、 〇、 ▲、 ◊および♦はペプチドの 濃度を 1 o gMで表したものであり、 それぞれ 5、 6、 7、 8、 9および 1 0 を示す。
図 26は新規ヒト型ペプチド A 1— F 28— NH2による AQ 27発現 CHO 細胞での c AMP産生抑制活性を示す。 n = 2の平均値。 縦軸の i n h i b i t i o nは cAM P産生抑制率 （％) を示す。 横軸の C o n e. は添加したぺ プチドの濃度を 1 o gMで表したものである。
図 2 7は m o c k CHO細胞の c AMP産生抑制活性に対する新規ヒト型ぺ プチド A 1— F 28— NH 2の影響を調べた結果を示す。 n = 2の平均値。 縦軸 の i nh i b i t i o nは c AMP産生抑制率（％) を示す。横軸の C o n e. は添加したぺプチドの濃度を 1 o gMで表したものである。
図 28はゥシ型分泌蛋白質の D N A配列を示す。
図 29はゥシ型分泌蛋白質のアミノ酸配列を示す。
図 30はラット AQ27受容体の塩基配列を示す。
図 31はラット AQ 27受容体のアミノ酸配列を示す。
図 32はマウス AQ27受容体の塩基配列を示す。
図 33はマゥス 027受容体のアミノ酸配列を示す。
図 34はヒ ト AQ 27受容体 （A) 、 ラット AQ 27受容体 （B) およびマウ ス AQ 27受容体 （C) のアミノ酸配列の相同性を示す。
図 35は AQ27受容体 mRNAの.ヒトにおける組織分布を示す。
図 36は AQ27受容体 mRNAのラットにおける組織分布を示す。 図中の i は i n f a n t (胎児） を示す。
図 37はラット型分泌蛋白質の mRNAのラットにおける組織分布を示す。 図 38はヒト型分泌蛋白質の mRNAのヒトにおける組織分布を示す。
図 39は i n s i t uハイプリダイゼーション法による AQ 27mRNAの ラット脳における発現分布を示す。 シグナルの相対強度の + + +は最も強い （ h i g h e s t) 、 + +は中程度 (mo d e r a t e d e n s i t y) 、 十 は弱い （l ow d e n s i t y) を示す。
図 40はヒト型分泌蛋白質遺伝子を導入した CHO細胞またはヒト型分泌蛋白 質遺伝子を導入していない C H O細胞の細胞上清を A Q 27受容体発現細胞
(AQ 27/HEK) または AQ 27受容体を発現していない細胞 （pAKK O/HEK) に接触させた時の特異的刺激活性を検出した結果を示す。 縦軸は ルシフェラーゼの発現量 （c p s) を示す。 横軸は AQ 27受容体に反応させ た物質の濃度または希釈度を示す。 B a s a 1は無添加の場合を示す。 FSK はフオルスコリンを添加した場合を示す。 ぺプチド (1) はヒト型ぺプチド： Glu-His-Ala-Gly-Cys-Arg-Phe-Arg-Phe-NH 2 (配列番号： 1の第 80番目〜 88 番目） を、ペプチド （2) はヒト型ペプチド： Gly - Gly- Phe - Ser- Phe - Arg - Phe - NH 2 (配列番号： 1の第 127番目〜 133番目） を添加した場合を示す。 mo c k SUP. はヒト型分泌蛋白質遺伝子を導入していない CHO細胞の細胞上清 を添加した場合を示す。 ペプチド F SUP. はヒ ト型分泌蛋白質遺伝子を導 入した C HO細胞の細胞上清を添加した場合を示す。
図 41は既知の抗 RFRP— 1抗体 1 F 3— 1とヒト型分泌蛋白質との反応 曲 を示す。 縦軸の B/B。 （％) はサンプル添加時の結合量とサンプル非添カロ 時の結合量の ^を、 横軸の P e p t i d e c o n e. はヒト型分泌蛋白質の 濃度を 1 o gMで表したものである。
図 42は既知の抗 RFRP— 1抗体 1 F 3— 1を用いたァフィ二テイクロマ トグラフィー結合画分の AQ 27受容体発現細胞 （AQ27) または AQ27 受容体を発現していない細胞 （pAKKO) に対する特異的刺激活 14を示す。 横軸の L u c i f e r a. s e a c t i v i t yはノレシフェラーゼ活十生 （c p s) を示す。 横軸はァフィ-ティクロマトグラフィー結合画分の番号を示す。 · 図 43は図 42のフラクション 20 ( f r . 20) を分離した時の各フラクシ ョンの AQ27受容体発現細胞に対する特異的刺激活性を示す。 横軸の Lu c i f e r a s e a c t i v i t yはノレシフェラーゼ活个生 ( c p s ) を示す。 横軸はフラクションの番号を示す。 3と 4は活性ピークを示す。
図 44は図 42のフラクション 20— 13 ( f r . 20— 23) を分離した時 の各フラクションの AQ 27受容体発現細胞に対する特異的刺激活性を示す。 横軸の Lu c i f e r a s e a c t i v i t yはノレシフェラーゼ活十生 (c p s) を示す。 横軸はフラクションの番号を示す。 1と 2は活性ピークを示す。 図 45は図 43および図 44の活性ピーク 1〜4に含まれるヒト型ぺプチドの 測定分子量と理論値およびァミノ酸配列を示す。
図 46は長さの異なるヒト型ペプチドのアミノ酸配列と各種ヒト型ペプチドの AQ27発現 CHO細胞株に対する c AMP産生抑制活性（EC 5。値）を示す。 図 47は図 46に示したヒト型ペプチドの AQ 27発現 C HO細胞株に対する c AMP産生抑制率を示す。 縦軸の i nh i b i t i o n (%) は c AMP産 生抑制率 （％) を示す。 横軸の C o n c e n t r a t i o n (1 o gM) は添 加したヒト型ペプチドの濃度を 1 o gMで表したものである。
図 48は図 46に示したヒト型ぺプチドのコルチコステロン （c o r t i c o s t e r o n e) の分泌刺激活性を調べた結果を示す。 縦軸の c o n c e n t r a t i o nは血中コルチコステロンの濃度 （ n g / m 1 ) を す。 横旱田の P r eはヒト型ペプチドの投与前を、 1 Om i nは投与後 1 0分を、 30m i n は投与後 30分を示し、 左の白カラムは生理食塩水を投与した場合 （C 0 n t r o 1 ) 、 右の黒カラムはヒ ト型ペプチドを投与した場合 （AQ27 L) を示 す。
図 49は図 46に示したヒト型ぺプチドのテストステロン （T e s t o s t e r o n e) の分泌刺激活性を調べた結果を示す。 縦軸の c o n c e n t r a t i o nは血中テストステロンの濃度 （n gZmi) を示す。 横軸の P r eはヒ ト型ぺプチドの投与前を、 1 0 m i nは投与後 1 0分を、 30 m i nは投与後 30分を示し、左の白カラムは生理食塩水を投与した場合 (C o n t r o l ) , 右の黒カラムはヒト型ペプチドを投与した場合 (AQ2 7 L) を示す。
図 50は図 46に示したヒト型ぺプチドのアルドステロン （A 1 d s t e r o n e ) の分泌刺激活性を調べた結果を示す。 縦軸の c o n c e n t r a t i o nは血中アルドステロンの濃度 （n g/m i ) を示す。 横軸の P r eはヒ ト型 ペプチドの投与前を、 1 0m i nは投与後 1 0分を、 30m i nは投与後 30 分を示し、 左の白カラムは生理食塩水を投与した場合 （C o n t r o 1 ) 、 右 の黒カラムはヒト型ペプチドを投与した場合 （AQ27 L) を示す。
図 5 1は図 4 6に示したヒ ト型ぺプチドのアルドステロン分泌刺激活性の時 間経過と濃度依存性を調べた結果を示す。 縦軸の c o n c e n t r a t i o nは血中アルドステロンの濃度 （n g/m i ) を示す。 横軸の T i me (m i n) は投与後の時間 （分） を示す。 口は生理食塩水 （v e h i c l e) を投 与した場合、 讕はヒ ト型ペプチド 4 nmo 1 /k gを投与した場合、 Aはヒ ト型ペプチド 4 0 nmo 1 Zk gを投与した場合、 Xはヒ ト型ペプチド 40 0 nmo 1 Zk gを投与した場合を示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明の分泌蛋白質としては、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同 一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質であり、 ヒ トゃ温血動 物 （例えば、 モルモット、 ラット、 マウス、 ニヮトリ、 ゥサギ、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） の細胞 （例えば、 網膜細胞、 肝細胞、 脾細胞、 神経細胞、 グ リア細胞、 膝臓) 3細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 内皮細胞、 繊維芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラー細胞、 肥 満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしくは間質細胞、 またはこ れら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくは癌細胞など） もしくはそれらの細胞が存 在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 網膜、 嗅球、 扁桃核、 大 脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小脳） 、脊髄、 下垂体、 胃、 腌臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋など、 または血球系の細 胞もしくはその培養細胞 （例えば、 MEL， Ml, CTLL— 2， HT_2， WEH I - 3, HL— 60, J OSK-1, K562, ML- 1 , MOLT— 3, MOLT— 4, MOLT- 10, CCRF— CEM, TALL- 1 , J u r k a t , CCRT-HS B- 2, KE—37, S KW— 3 , HUT— 78， HUT- 102, H 9, U 937, THP— 1， HE L, J K一 1， CMK, KO-812, MEG— 01など） に由来する蛋白質であってもよく、 合成蛋 白質であってもよい。
配列番号： 1で表わされるァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列とし ては、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と約 50 %以上、 好ましくは約 60 %以上、 さらに好ましくは約 70 %以上、 より好ましくは約 80 %以上、 さらに好ましくは 90 %以上、 最も好ましくは約 95 %以上の相同性を有する アミノ酸配列などがあげられる。 具体的には、 配列番号： 1で表わされるアミ ノ酸配列と 60%以上の相同性を有するアミノ酸配列としては、 配列番号： 3 で表わされるアミノ酸配列、 配列番号： 5で表わされるアミノ酸配列または配 列番号： 7で表わされるァミノ酸配列が挙げられる。
ァミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズム NCB I BLAST (N a t i o n a 1 C e n t e r f o r B i o t e c hn o l o g y I n f o rma t i o n B a s i c Lo c a l A l i g nme n t S e a r c h T o o 1 ) を用い、 以下の条件 （期待値 = 10 ；ギヤップを許す；マ トリタス = BLOSUM62 ；フィノレタリング = OFF) にて計算することが できる。
また、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列としては、
(i) 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 5または配列番号： 7 (以下、 アミノ酸配列 Xと略記する） 、
(ii) アミノ酸配列 X中の 1〜30個 （例えば 1〜 1 5個、 好ましくは 1〜1 0個、 さらに好ましくは 1〜5個、 より好ましくは 1〜3個、 特に好ましくは 1個） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(iii) アミノ酸配列 Xに 1〜30個 （例えば 1〜 15個、 好ましくは 1〜10 個、 さらに好ましくは 1〜5個、 より好ましくは 1〜3個、 特に好ましくは 1 個） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
(iv) アミノ酸配列 Xに 1〜30個 （例えば 1〜 15個、 好ましくは 1〜10 個、 さらに好ましくは 1〜5個、 より好ましくは 1〜3個、 特に好ましくは 1 個） のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
(V) アミノ酸配列 X中の：！〜 30個 （例えば:！〜 15個、 好ましくは 1〜： 10 個、 さらに好ましくは 1〜5個、 より好ましくは 1〜 3個、 特に好ましくは 1 個） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
(vi) 上記 （ii) 〜 （V) を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
本発明の分泌蛋白質の具体例としては、 例えば、
(1) 配列番号 1で表わされるァミノ酸配列からなるヒト型分泌蛋白質、 (2) 配列番号 3で表わされるァミノ酸配列からなるラット型分泌蛋白質、
(3) 配列番号 5で表わされるァミノ酸配列からなるマウス型分泌蛋白質、
(4) 配列番号 7で表わされるァミノ酸配列からなるゥシ型分泌蛋白質など が挙げられる。
配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の第 1番目〜 18番目のアミノ酸配 列は分泌シグナル配列を示す。
配列番号： 3で表わされるアミノ酸配列の第 1番目〜 1 7番目のアミノ酸配 列は分泌シグナル配列を示す。
配列番号： 5で表わされるアミノ酸配列の第 1番目〜 1 7番目のアミノ酸配 列は分泌シグナル配列を示す。
配列番号： 7で表わされるァミノ酸配列の第 1番目〜 1 7番目のアミノ酸配 列は分泌シグナル配列を示す。
したがって、 本発明の分泌蛋白質は、 上記したアミノ酸配列からシグナル配 列を除いたものであってもよい。
本発明の分泌蛋白質は、 後述する本発明のペプチドと同様の活性を有してい てもよい。
本発明の分泌蛋白質の部分ペプチド （以下、 本発明のペプチドと略記する） としては、 前記した本発明の分泌蛋白質の部分べプチドであれば何れのもので あってもよいが、 通常、 アミノ酸が 5個以上、 好ましくは 1 0個以上からなる ペプチドが好ましい。
具体的には、 本発明のぺプチドとしては、
( 1 ) 本発明の配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の第 2 6番目〜 8 8番 目のアミノ酸配列、 第 8 0番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 9 1番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列または第 1 2 7番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチド （以下、 本発明のヒ ト型ペプチドと略記する場合がある） 、
( 2 ) 本発明の配列番号： 3で表わされるアミノ酸配列の第 1 1 5番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列または第 1 1 6番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチド （以下、 本発明のラ ット型ペプチドと略記する場合がある） 、 '
( 3 ) 本発明の配列番号： 5で表わされるアミノ酸配列の第 1 1 5番目〜 1 2
2番目のアミノ酸配列または第 1 1 6番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチド （以下、 本発明のマ ウス型ペプチドと略記する場合がある） 、 (4) 本発明の配列番号： 7で表わされるアミノ酸配列の第 124番目〜1 3 1番目のアミノ酸配列または第 125番目〜 131番目のアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチド （以下、 本発明のゥ シ型ぺプチドと略記する場合がある） などが用いられる。
本発明のペプチドは、 ヒトゃ温血動物 （例えば、 モルモッ ト、 ラット、 マウ ス、 ニヮトリ、 ゥサギ、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） の細胞 （例えば、 網 膜細胞、 肝細胞、 '脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 膝臓 ]3細胞、 骨髄細胞、 メ サンギゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 内皮細胞、 繊維 芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細 胞、 B細胞、 ナチュラルキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、. 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨'細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細 胞、 肝細胞もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくは 癌細胞など） もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳 の各部位 ·（例、 網膜、 嗅球、 赢祧核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大 脳皮質、 延髄、 小脳） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 薛臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状 腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋など、 または血球系の細胞もしくはその培養細胞 （例えば、 ME L， Ml, CTLL-2, HT— 2， WEH I—3, HL_60， 】OSK— 1, K562, ML- 1 , MOLT— 3， MOLT— 4， MOLT— 10， C CRF-CEM, TALL- 1, J u r k a t , CCRT— HSB— 2， KE 一 37， SKW- 3, HUT- 78, HUT— 102, H9, U 937, TH P— 1， HEL, JK— 1, CMK, KO—812, MEG— 01など） に由 来するペプチドであってもよく、 合成べプチドであってもよい。
本願明細書において、 アミノ酸配列 Yとは、 以下の 10種類のアミノ酸配列 から選ばれる 1つのァミノ酸配列を示す。
(1) ①配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の第 26番目〜 88番目のァ ミノ酸配列、
②配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の第 80番目〜 88番目のアミノ酸 配列、
③配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の第 9 1番目〜 1 3 3番目のァミノ 酸配列、
④配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の第 1 2 7番目〜 1 33番目のアミ ノ酸配列、
(2) ①配列番号： 3で表わされるアミノ酸配列の第 1 1 5番目〜 1 22番目 のアミノ酸配列、
②配列番号： 3で表わされるアミノ酸配列の第 1 1 6番目〜 1 22番目のアミ ノ酸配列、
(3) ①配列番号： 5で表わされるアミノ酸配列の第 1 1 5番目〜 1 22番目 のアミノ酸配列、
②配列番号： 5で表わされるアミノ酸配列の第 1 1 6番目〜 1 22番目のアミ ノ酸配列、
(4) ①配列番号： 7で表わされるアミノ酸配列の第 1 24番目〜 1 3 1番目 のアミノ酸配列、
②配列番号： 7で表わされるァミノ酸配列の第 1 25番目〜 3 1番目のアミ ノ酸配列。
アミノ酸配列 Yと実質的に同一のアミノ酸配列としては、 アミノ酸配列 Yと 約.70 %以上、 好ましくは約 80 %以上、 さらに好ましくは 90 %以上、 最も 好ましくは約 95 %以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。 アミノ酸配列 Yと実質的に同一のアミノ酸配列を有するぺプチドとしては、 例えば、 前記のァミノ酸配列 Yと実質的に同一のァミノ酸配列を有し、 ァミノ 酸配列 Yを有するぺプチドと実質的に同質の活性を有するぺプチドなどが好ま しい。
ァミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズム N C B I BLAST (N a t i o n a l C e n t e r f o r B i o t e c h n o l o g y I n f o rma t i o n B a s i c L o c a l A l i g nme n t S e a r c h T o o l ) を用い、 以下の条件 （期待値 = 1 0 ；ギヤップを許す；マ トリクス = BLOSUM6 2 ；フィルタリング ==OFF) にて計算することが できる。
実質的に同質の活性としては、 例えば、 本発明のペプチドが有する活性 （例 えば、 副腎皮質ホルモン分泌促進活性、 受容体との結合活性、 受容体発現細胞 に対する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細 胞内 C a 2+遊離、細胞内 c AM P生成、細胞内 c GM P生成、イノシトールリン 酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c - f o sの活性化、 p Hの低下、 G T P Y S結合活性などを促進する活性等）等） などが挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの活性が性質的に （例、 生理化学的に、 または薬 理学的に） 同質であることを示す。
アミノ酸配列 Yと同一または実質的に同一のアミノ酸配列の具体例としては、
( i ) アミノ酸配列 Y、
(ii) アミノ酸配列 Y中の 1〜 5個 （好ましくは 1〜3個、 さらに好ましくは 1〜2個、 より好ましくは、 1個） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(iii) アミノ酸配列 Yに 1〜5個 （好ましくは 1〜3個、 さらに好ましくは 1 〜2個、 より好ましくは、 1個） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
(iv) アミノ酸配列 Yに 1〜 5個 （好ましくは 1〜 3個、 さらに好ましくは 1 〜2個、 より好ましくは、 1個） のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
(V) アミノ酸配列 Y中の 1〜1 0個 （好ましくは 1〜5個、 さらに好ましくは 1〜3個、 より好ましくは、 1個） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたァ ミノ酸配列、
(vi).上記 （i i) 〜 （V) を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
本発明のぺプチドの具体例としては、 例えば、
( 1 ) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の第 1 9番目〜 8 8番目のアミ ノ酸配列、 第 2 0番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 2 1番目〜 8 8番目のァ ミノ酸配列、 第 2 2番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 2 3番目〜 8 8番目の アミノ酸配列、 第 2 4番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 2 5番目〜 8 8番目 のアミノ酸配列、 第 2 6番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 2 7番目〜 8 8番 目のアミノ酸配列、 第 2 8番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 2 9番目〜 8 8 番目のアミノ酸配列、 第 3 0番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 3 1番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 3 2番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 3 3番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 3 4番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 3 5番目 〜8 8番目のアミノ酸配列、 第 3 6番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 3 7番 目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 3 8番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 3 9 番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 4 0番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 4 1番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 4 2番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 4 3番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 4 4番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 4 5番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 4 6番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 4 7番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 4 8番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 4 9番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 5 0番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 5 1番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 5 2番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 5 3番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 5 4番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 5 5番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 5 6番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 5 7番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 5 8番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 5 9番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 6 0番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 6 1番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 6 2番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 6 3番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 6 4番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 6 5番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 6 6番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 6 7番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 6 8番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 6 9番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 7 0番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 7 1番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 7 2番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 7 3番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 7 4番目〜 8 8番目のアミノ酸配歹 lj、 第 7 5番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 7 6番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 7 7番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 7 8番目〜 8 8番目のアミノ酸配列、 第 7 9番目〜 8 8番目のアミノ酸配列または第 8 0番目〜 8 8番目のアミノ酸 配列からなるヒ ト型ペプチド、 または配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列 の第 1 9番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 2 0番目〜 1 3 3番目のァミノ 酸配列、 第 2 1番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 2 2番目〜 1 3 3番目の アミノ酸配列、 第 2 3番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 2 4番目〜 1 3 3 番目のアミノ酸配列、 第 2 5番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 2 6番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 2 7番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 2 8 番目.〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 2 9番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 3 0番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 3 1番目〜 1 3 3番目のアミノ酸 配列、 第 3 2番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 3 3番目〜 1 3 3番目のァ ミノ酸配列、 第 3 4番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 3 5番目〜 1 3 3番 目のアミノ酸配列、 第 3 6番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 3 7番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 3 8番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 3 9番 目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 4 0番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 4 1番'目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 4 2番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配 列、 第 4 3番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 4 4番目〜 1 3 3番目のアミ ノ酸配列、 第 4 5番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 4 6番目〜 1 3 3番目 のアミノ酸配列、 第 4 7番目〜 1 3' 3番目のアミノ酸配列、 第 4 8番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 4 9番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 5 0番目 〜1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 5 1番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 5 2番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 5 3番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 5 4番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 5 5番目〜 1 3 3番目のアミノ酸 配列、 第 5 6番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 5 7番目〜 1 3 3番目のァ ミノ酸配列、 第 5 8番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 5 9番目〜 1 3 3番 目のアミノ酸配列、 第 6 0番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 6 1番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 6 2番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 6 3番 目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 6 4番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 6 5番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 6 6番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配 歹、 第 6 7番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配歹【J、 第 6 8番目〜 1 3 3番目のアミ ノ酸配列、 第 6 9番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 7 0番目〜 1 3 3番目 のアミノ酸配列、 第 7 1番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 7 2番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 7 3番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 7 4番目 〜1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 7 5番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 7 6番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 7 7番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列、 第 78番目〜 1 33番目のアミノ酸配列、 第 79番目〜 133番目のアミノ酸 配列、 第 80番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 81番目〜 133番目のァ ミノ酸配列、 第 82番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 83番目〜 133番 目のアミノ酸配列、 第 84番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 85番目〜 1 33番目のアミノ酸配列、 第 86番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 87番 目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 88番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 89番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 90番目〜 133番目のアミノ酸配 歹 IJ、 第 91番目〜 1 33番目のアミノ酸配列、 第 92番目〜 133番目のアミ ノ酸配列、 第 93番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 94番目〜 1 33番目 のアミノ酸配列、 第 95番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 96番目〜 13 3番目のアミノ酸配列、 第 97番目〜 1 33番目のアミノ酸配列、 第 98番目 〜133番目のアミノ酸配列、 第 99番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 1 00番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 101番目〜 133番目のアミノ酸 配列、 第 102番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 103番目〜 1 33番目 のアミノ酸配列、 第 104番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 105番目〜 1 33番目のアミノ酸配列、 第 106番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 1 07番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 108番目〜 133番目のアミノ酸 配列、 第 109番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 110番目〜 1 33番目 のアミノ酸配列、 第 11 1番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 1 12番目〜 1 33番目のアミノ酸配列、 第 113番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 1
ί
14番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 1 15番目〜 133番目のアミノ酸 配列、 第 1 16番目〜 1 33番目のアミノ酸配列、 第 11 7番目〜 1 33番目 のアミノ酸配列、 第 118番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 1 1 9番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 120番目〜 Ί 33番目のアミノ酸配列、 第 1 21番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 122番目〜 133番目のアミノ酸 配列、 第 123番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 124番目〜 1 33番目 のアミノ酸配列、 第 125番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 126番目〜 1 33番目のアミノ酸配列または第 127番目〜 133番目のアミノ酸配列か らなるヒ ト型ぺプチド （なかでも配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の第 26番目〜 88番目のアミノ酸配列、 第 80番目〜 88番目のアミノ酸配列、 第 90番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 91番目〜 133番目のアミノ酸 配列、 第 93番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 104番目〜 133番目の アミノ酸配列、 第 108番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 109番目〜 1 33番目のアミノ酸配列、 第 1 11番目〜 1 33番目のアミノ酸配列、 第 1 1. 5番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 1 19番目〜 133番目のアミノ酸配 歹 lj、 第 124番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 126番 〜 133番目ま たは第 127番目〜 133番目のァミノ酸配列からなるヒ ト型ぺプチドなどが 好ましく、 特に配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の第 90番目〜 1 33 番目のアミノ酸配列、 第 91番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 93番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 104番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 1 08番目〜 1 33番目のアミノ酸配列、 第 109番目〜 133番目のアミノ酸 配列、 第 1 1 1番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 1 15番目〜 133番目 のアミノ酸配列、 第 119番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 124番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 126番目〜 133番目または第 127番目〜 133番目のァミノ酸配列からなるヒ ト型ぺプチドなどが好ましく、 配列番 号： 1で表わされるアミノ酸配列の第 91番目〜 133番目のアミノ酸配列か らなるぺプチドは N末端のグルタミン残基 （G 1 n) がピログルタミン化され ていてもよく、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の第 9◦番目〜 1 33 番目のアミノ酸配列からなるペプチドは N末端のアルギニン残基 （Ar g) が チロシン残基（Ty r)に置換されていてもよい（図 47および図 48参照））、 (2) 配列番号： 3で表わされるアミノ酸配列の第 18番目〜 122番目のァ ミノ酸配列、 第 19番目〜 122番目のアミノ酸配列、 第 20番目〜 122番 目のアミノ酸配列、 第 21番目〜 122番目のアミノ酸配列、 第 22番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 23番目〜 122番目のアミノ酸配列、 第 24番 目〜 122番目のアミノ酸配列、 第 25番目〜 122番目のアミノ酸配列、 第 26番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 27番目〜 122番目のアミノ酸配 列、 第 28番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 29番目〜 122番目のアミ ノ酸配列、 第 30番目〜 122番目のアミノ酸配列、 第 31番目〜 122番目 のアミノ酸配列、 第 3 2番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 3 3番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 3 4番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 3 5番目 〜1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 3 6番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 3 7番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 3 8番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 3 9番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 4 0番目〜 1 2 2番目のアミノ酸 配列、 第 4 1番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 4 2番目〜 1 2 2番目のァ ミノ酸配列、 第 4 3番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 4 4番目〜 1 2 2番 目のアミノ酸配列、 第 4 5番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 4 6番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 4 7番目'〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 4 8番 目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 4 9番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 5 0番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 5 1番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配 列、 第 5 2番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 5 3番目〜 1 2 2番目のアミ ノ酸配列、 第 5 4番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 5 5番目〜 1 2 2番目. のアミノ酸配列、 第 5 6番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 5 7番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 5 8番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 5 9番目 〜1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 6 0番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 6 1番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 6 2番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 6 3番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 6 4番目〜 1 2 2番目のアミノ酸 配列、 第 6 5番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 6 6番目〜 1 2 2番目のァ ミノ酸配列、 第 6 7番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 6 8番目〜 1 2 2番 目のアミノ酸配列、 第 6 9番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 7 0番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 7 1番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 7 2番 '目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 7 3番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 7 4番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 7 5番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配 歹 IJ、 第 7 6番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 7 7番目〜 1 2 2番目のアミ ノ酸配列、 第 7 8番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 7 9番目〜 1 2 2番目 のアミノ酸配列、 第 8 0番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 8 1番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 3 2番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 8 3番目 〜1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 8 4番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 8 5番目〜 122番目のアミノ酸配列、 第 86番目〜 122番目のアミノ酸配列、 第 87番目〜 122番目のアミノ酸配列、 第 88番目〜 122番目のアミノ酸 配列、 第 89番目〜 122番目のアミノ酸配列、 第 90番目〜 1,22番目のァ ミノ酸配列、 第 91番目〜 122番目のアミノ酸配列、 第 92番目〜 122番 目のアミノ酸配列、 第 93番目〜 122番目のアミノ酸配列、 第 94番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 95番目〜 122番目のアミノ酸配列、 第 96番 目〜 122番目のアミノ酸配列、 第 97番目〜 122番目のアミノ酸配列、 第 98番目〜 122番目のアミノ酸配列、 第 99番目〜 122番目のアミノ酸配 列、 第 100番目〜 122番目のアミノ酸配列、 第 101番目〜 122番目の アミノ酸配列、 第 102番目〜 122番目 アミノ酸配列、 第 103番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 104番目〜 122番目のアミノ酸配列、 第 10 5番目〜 122番目のアミノ酸配列、 第 106番目〜 122番目のアミノ酸配 歹 lj、 第 107番目〜 122番目のアミノ酸配列、 第 108番目〜 122番目の アミノ酸配列、 第 109番目〜 122番目のアミノ酸配列、，第 1 10番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 1 1 1番目〜 122番目のアミノ酸配列、 第 1 1 2番目〜 122番目のアミノ酸配列、 第 1 1 3番目〜 122番目のアミノ酸配 歹 II、 第 1 14番目〜 122番目のアミノ酸配列、 第 1 15番目〜 122番目の アミノ酸配列または第 1 16番目〜 122番目のアミノ酸配列からなるラット 型ペプチド （なかでも配列番号： 3で表わされるアミノ酸配列の第 1 15番目 〜122番目のアミノ酸配列または第 1 16番目〜 122番目のアミノ酸配列 からなるラット型ぺプチドなどが好まし 、） 、
(3) 配列番号： 5で表わされるアミノ酸配列の第 18番目〜 122番目のァ ミノ酸配列、 第 19番目〜 122番目のアミノ酸配列、 第 20番目〜 122番 目のアミノ酸配列、 第 21番目〜 12.2番目のアミノ酸配列、 第 22番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 23番目〜 122番目のアミノ酸配列、 第 24番 目〜 122番目のアミノ酸配列、 第 25番目〜 122番目のアミノ酸配列、 第 26番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 27番目〜 122番目のアミノ酸配 列、 第 28番目〜 122番目のアミノ酸配列、 第 29番目〜 122番目のアミ ノ酸配列、 第 30番目〜 122番目のアミノ酸配列、 第 31番目〜 122番目 のアミノ酸配列、 第 3 2番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 3 3番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 34番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 35番目 〜1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 36番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 3 7番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 38番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 39番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 40番目〜 1 22番目のアミノ酸 配列、 第 4 1番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 42番目〜 1 2 2番目のァ ミノ酸配列、 第 43番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 44番目〜 1 2 2番 目のアミノ酸配列、 第 45番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 4 6番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 4 7番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 48番 目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 49番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 50番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 5 1番目〜 1 22番目のアミノ酸配 列、 第 52番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 5 3番目〜 1 22番目のアミ ノ酸配列、 第 54番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 55番目〜 1 22番目 のアミノ酸配列、 第 56番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 5 7番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 58番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 5 9番目 〜1 22番目のアミノ酸配列、 第 60番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 6 1番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 6 2番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第- 6 3番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 64番目〜 1 22番目のアミノ酸 配刿、 第 6 5番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 66番目〜 1 22番目のァ ミノ酸配列、 第 6 7番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 6 8番目〜 1 22番 目のアミノ酸配列、 第 69番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 70番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 7 1番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 72番 目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 7 3番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 74番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 75番目〜 1 22番目のアミノ酸配 列、 第 76番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 7 7番目〜 1 22番目のアミ ノ酸配列、 第 78番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 79番目〜 1 22番目 のアミノ酸配列、 第 80番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 8 1番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 82番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 8 3番目 〜1 22番目のアミノ酸配列、 第 84番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 8 5番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 8 6番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 8 7番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 88番目〜 1 22番目のアミノ酸 配列、 第 8 9番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 90番目〜 1 22番目のァ ミノ酸配列、 第 9 1番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 9 2番目〜 1 22番 目のアミノ酸配列、 第 93番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 94番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 9 5番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 9 6番 目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 9 7番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 98番目〜 1 2 2番目のアミノ酸配列、 第 9 9番目〜 1 22番目のアミノ酸配 列、 第 1 00番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 1 0 1番目〜 1 22番目の アミノ酸配列、 第 1 02番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 1, 03番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 1 04番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 10 5番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 1 06番目〜 1 22番目のアミノ酸配 列、 第 1 0 7番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 1 08番目〜 1 22番目の アミノ酸配列、 第 1 09番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 1 1 0番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 1 1 1番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 1 1 2番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 1 1 3番目〜 1 22番目のアミノ酸配 列、 第 1 14番目〜 1 22番目のアミノ酸配列、 第 1 1 5番目〜 1 22番目の アミノ酸配列または第 1 1 6番目〜 1 22番目のアミノ酸配列からなるマウス 型ペプチド （なかでも配列番号： 5で表わされるアミノ酸配列の第 1 1 5番目 〜1 2 2番目のアミノ酸配列または第 1 1 6番§〜1 22番目のアミノ酸配列 からなるペプチドなどが好ましレ、） 、
(4) 配列番号： 7で表わされるアミノ酸配列の第 1 8番目〜 1 3 1番目のァ ミノ酸配列、 第 1 9番目〜 1 3 1番目のアミノ酸配列、 第 20番目〜 1 3 1番 目のアミノ酸配列、 第 2 1番目〜 1 3 1番目のアミノ酸配列、 第 22番目〜 1 3 1番目のアミノ酸配列、 第 2 3番目〜 1 3 1番目のアミノ酸配列、 第 24番 目〜 1 3 1番目のアミノ酸配列、 第 2 5番目〜 1 3 1番目のアミノ酸配列、 第 26番目〜 1 3 1番目のアミノ酸配列、 第 27番目〜 1 3 1番目のアミノ酸配 列、 第 2 8番目〜 1 3 1番目のアミノ酸配列、 第 29番目〜 1 3 1番目のアミ ノ酸配列、 第 30番目〜 1 3 1番目のアミノ酸配列、 第 3 1番目〜 1 3 1番目. のアミノ酸配列、 第 32番目〜 131番目のアミノ酸配列、 第 33番目〜 13 1番目のアミノ酸配列、 第 34番目〜 131番目のアミノ酸配列、 第 35番目 〜131番目のアミノ酸配列、 第 36番目〜 131番目のアミノ酸配列、 第 3 7番目〜 131番目のアミノ酸配列、 第 38番目〜 1 31番目のアミノ酸配列、 第 39番目〜 1 31番目のアミノ酸配列、 第 40番目〜 1 31番目のアミノ酸 配列、 第 41番目〜 131番目のアミノ酸配列、 第 42番目〜 131番目のァ ミノ酸配列、 第 43番目〜 131番目のアミノ酸配列、 第 44番目〜 131番 目のアミノ酸配列、 第 45番目〜 131番目のアミノ酸配列、 第 46番目〜 1 31番目のアミノ酸配列、 第 47番目〜 131番目のアミノ酸配列、 第 48番 目〜 1 31番目のアミノ酸配列、 第 49番目〜 131番目のアミノ酸配列、 第 50番目〜 131番目のアミノ酸配列、 第 51番目〜 131番目のアミノ酸配 列、 第 52番目〜 131番目のアミノ酸配列、 第 53番目〜 131番目のアミ ノ酸配列、 第 54番目〜 131番目のアミノ酸配列、 第 55番目〜 1 31番目 のアミノ酸配列、 第 56番目〜 131番目のアミノ酸配列、 第 57番目〜 13 1番目のアミノ酸配列、 第 58番目〜 131番目のアミノ酸配列、 第 59番目 〜131番目のアミノ酸配列、 第 60番目〜 131番目のアミノ酸配列、 第 6 1番目〜 131番目のアミノ酸配列、 第 62番目〜 131番目のアミノ酸配列、 第 63番目〜 1 31番目のアミノ酸配列、 第 64番目〜 131番目のアミノ酸 配列、 第 65番目〜 131番目のアミノ酸配列、 第 66番目〜 131番目のァ ミノ酸配列、 第 67番目〜 131番目のアミノ酸配列、 第 68番目〜 13 1番 目のアミノ酸配列、 第 69番目〜 131番目のアミノ酸配列、 第 70番目〜 1 31番目のアミノ酸配列、 第 71番目〜 131番目のアミノ酸配列、 第 72番 目〜 1 3 1番目のアミノ酸配列、 第 73番目〜 131番目のアミノ酸配列、 第 74番目〜 131番目のアミノ酸配列、 第 75番目〜 131番目のアミノ酸配 列、 第 76番目〜 131番目のアミノ酸配列、 第 77番目〜 131番目のアミ ノ酸配列、 第 78番目〜 131番目のアミノ酸配列、 第 79番目〜 1 31番目 のアミノ酸配列、 第 80番目〜 131番目のアミノ酸配列、 第 81番目〜 13 1番目のアミノ酸配列、 第 82番目〜 1 31番目のアミノ酸配列、 第 83番目 〜131番目のアミノ酸配列、 第 84番目〜 131番目のアミノ酸配列、 第 8 5番目〜 1 3 1番目のアミノ酸配列、 第 86番目〜 1 3 1番目のアミノ酸配列、 第 8 7番目〜 1 3 1番目のアミノ酸配列、 第 88番目〜 1 3 1番目のアミノ酸 配列、 第 8 9番目〜 1 3 1番目のアミノ酸配列、 第 90番目〜 1 3 1番目のァ ミノ酸配列、 第 9 1番目〜 1 3 1番目のアミノ酸配列、 第 9 2番目〜 1 3 1番 目のアミノ酸配列、 第 93番目〜 1 3 1番目のアミノ酸配列、 第 94番目〜 1 3 1番目のアミノ酸配列、 第 9 5番目〜 1 3 1番目のアミノ酸配列、 第 96番 目〜 1 3 1番目のアミノ酸配列、 第 9 7番目〜 1 3 1番目のアミノ酸配列、 第 9 8番目〜 1 3 1番目のアミノ酸配列、 第 9 9番目〜 1 3 1番目のアミノ酸配 列、 第 1 00番目〜 1 3 1番目のアミノ酸配列、 第 1 0 1番目〜 1 3 1番目の アミノ酸配列、 第 1 02番目〜 1 3 1番目のアミノ酸配列、 第 1 03番目〜 1 3 1番目のアミノ酸配列、 第 1 04番目〜 1 3 1番目のアミノ酸配列、 第 1 0 5番目〜 1 3 1番目のァミノ酸配列、 第 1 0 6番目〜 1 3 1番目のァミノ酸配 歹 IJ、 第 1 0 7番目〜 1 3 1番目のアミノ酸配列、 第 1 08番目〜 1 3 1番目の アミノ酸配列、 第 1 09番目〜 1 3 1番目のアミノ酸配列、 第 1 1 0番目〜 1 3 1番目のアミノ酸配列、 第 1 1 1番目〜 1 3 1番目のアミノ酸配列、 第 1 1 2番目〜 1 3 1番目のアミノ酸配列、 第 1 1 3番目〜 1 3 1番目のアミノ酸配 列、 第 1 1 4番目〜 1 3 1番目のアミノ酸配列、 第 1 1 5番目〜 1 3 1番目の アミノ酸配列、 第 1 1 6番目〜 1 3 1番目のアミノ酸配列、 第 1 1 7番目〜 1 3 1番目のアミノ酸配列、 第 1 1 8番目〜 1 3 1番目のアミノ酸配列、 第 1 1 9番目〜 1 3 1番目のアミノ酸配列、 第 1 20番目〜 1 3 1番目のアミノ酸配 歹 1J、 第 1 2 1番目〜 1 3 1番目のアミノ酸配列、 第 1 22番目〜 1 3 1番目の アミノ酸配列、 第 1 23番目〜 1 3 1番目のアミノ酸配列、 第 1 24番目〜 1 3 1番目のアミノ酸配列または第 1 25番目〜 1 31番目のアミノ酸配列から なるゥシ型ペプチド I (なかでも配列番号： 7で表わされるアミノ酸配列の第 1 24番目〜 1 3 1番目のアミノ酸配列または第 1 2 5番目〜 1 3 1番目のァ ミノ酸配列からなるぺプチドなどが好ましい） などが挙げられる。
これらのペプチドとしては、 C末端のアミ ド体が好ましく用いられる。
本願明細書において、 上記のヒト型、 ラット型、 マウス型およびゥシ型ぺプ チドを本発明のペプチドと総称する。 本発明の分泌蛋白質または本発明のペプチド （以下、 本発明のペプチドと略 記する場合がある） は、 ペプチド標記の慣例に従って左端が N末端 （ァミノ末 端） 、 右端が C末端 (カルボキシル末端) である。
配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列からなる分泌蛋白質をはじめとする、 本発明のペプチドは C末端はカルボキシル基 （一 C O O H) 、 カルポキシレー ト （一 C O O— ) 、 アミ ド （一 C O NH 2) またはエステル （一 C O O R) の何 れであってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピ ノレ、 イソプロピルもし'くは n—プチルなどの アルキル基、 例えば、 シクロ ペンチル、 シクロへキシルなどの C 3— 8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 ひ一ナフチルなどの〇6 _ 1 2ァリ一ル基、 例え.ば、 ベンジル、 フエネチルなどの フエ二ルー アルキル基もしくは (¾—ナフチルメチルなどの 一ナフチル —C ^ sアルキル基などの C 7— 1 4ァラルキル基のほか、 経口用エステルとして 汎用されるビバロイルォキシメチル基などが用いられる。
本発明のペプチドが C末端以外にカルボキシル基 （またはカルボキシレート） を有している場合、 カルボキシル基がアミ ド化またはエステルイ匕されているも のも本発明のペプチドに含まれる。 この場合のエステルとしては、 例えば上記 した C末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明のペプチドには、 N末端のアミノ酸残基 （例、 メチォニン残 基） のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの 6アル力 ノィルなどの ァシル基など） で保護されているもの、 生体内で切断されて 生成する N末端のダルタミル基がピログルタミン酸ィヒしたもの、.分子内のアミ ノ酸の側鎖上の置換基 （例えば一 O H、 一 S H、 アミノ基、 イミダゾール基、 インドール基、 グァ -ジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァ セチル基などの C i— 6アル力ノィル基などの C i— 6ァシル基など） で保護されて いるもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども 含まれる。
本発明のペプチドの塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸、 有 機酸） や塩基 （例、 アルカリ金属塩） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学 的に許容される酸付加塩が好ましい。 このような塩としては、 例えば、 無機酸 (例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例え ば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コノヽク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン 酸） との塩などが用いられる。 以下、塩も含めて、本発明のペプチドと称する。 本発明のペプチドは、 前述したヒトゃ温血動物の細胞または組織から自体公 知のぺプチドの精製方法によって製造することもできるし、 後述するぺプチド をコードする D N Aで形質転換された形質転換体を培養することによつても製 造することができる。 また、 後述のペプチド合成法に準じて製造することもで きる。
.ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトゃ哺乳動物の組織 または細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行ない、 該抽出液を逆相ク ロマトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー を組み合わせることにより精製単離することができる。
本発明のペプチドまたはそれらのアミド体の合成には、 通常市販のペプチド 合成用樹脂を用いることができる。 そのような樹月旨としては、 例えば、 ロ口 メチル樹脂、 ヒドロキシメチル樹脂、 ベンズヒ ドリルアミン榭脂、 アミノメチ ル樹脂、 4一べンジルォキシベンジルアルコール樹脂、 4一メチルベンズヒ ド リルアミン榭脂、 P AM樹脂、 4ーヒドロキシメチルメチルフエニルァセトァ ミドメチル樹脂、 ポリアクリルアミド樹脂、 4— ( 2 '， 4'ージメトキシフエ二 ルーヒ ドロキシメチル） フエノキシ樹脂、 4一 （2 ', 4 '—ジメトキシフエ二ル 一 F m o cアミノエチル） フエノキシ榭脂などをあげることができる。 このよ うな榭脂を用い、 a—アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、 目 的とするペプチドの配列通りに、 自体公知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮 合させる。 反応の最後に樹脂からペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除 去し、 さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフイド結合形成反.応を実施し、 目的 の本発明のぺプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 ぺプチド合成に使用できる各種活 性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミ ド類がよい。 カルポジ イミ ド類としては、 D C C、 N, N，ージイソプロピルカルポジイミ ド、 N—ェ チル一 N，一（3—ジメチルァミノプロリル)カルポジィミ ドなどが用いられる。 これらによる活性ィ匕にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 H O B t , H O O B t ) とともに保護ァミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、 対称酸無水物または H O B tエステルあるいは H O O B tエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の 活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 ぺプチド 縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例えば、 N, N—ジメチルホルムアミ ド， N， N—ジメチルァセトアミ ド， N—メチル ピロリ ドンなどの酸アミ ド類、 塩ィ匕メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲン化 炭化水素.類、 トリフルォロエタノールなどのアルコール類、. ジメチルスルホキ シドなどのスルホキシド類、 ピリジン， ジォキサン， テトラヒ ドロフランなど のエーテル類、 ァセトニトリル， プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メ チル， 酢酸ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用い られる。 反応温度はペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている 範囲から適宜選択され、 通常約一 2 0〜 5 0 °Cの範囲から適宜選択される。 活 十生ィ匕されたアミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜4倍過剰で用いられる。 ニンヒ ドリン 反応を用いたテストの結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうこ となく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。 反応 を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァセチルイ ミダゾールを用いて未反応アミノ酸をァセチルイヒすることによって、 後の反応 に影響を与えないようにすることができる。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 B o c、 t—ペンチルォキ シカルボニル、 ィソボルニルォキシカルボニル、 4ーメ トキシベンジルォキシ カノレポ二ノレ、 C 1 一 Z、 B r— Z、 ァダマンチルォキシ力/レポニル、 ト リ フノレ ォロアセチノレ、 フタロイノレ、 ホスレミノレ、 2—-トロフエニノレスノレフエ二ノレ、 ジ フエニルホスフイノチオイル、 Fmocなどが用いられる。
カルボキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 (例えば、 メチル、 ェチル、 プロピノレ. ブチル、 t一ブチノレ、 シク口ペンチノレ. シクロへキシル、 シクロへ プチル、 シクロォクチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしくは環 状アルキルエステル化） 、 ァラルキルエステル化 （例えば、 ベンジルエステル、 4一二トロべンジノレエステノレ、 4ーメ トキシベンジルエステル、 4一クロ口べ ンジノレエステノレ、 ベンズヒ ドリノレエステル化） 、 フエナシノレエステノレ化、 ベン ジ ォキシ力ルポニルヒドラジド化、 t—ブトキシカルポニルヒドラジド化、 トリチノレヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護する ことができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基など の低級 （C ^ 6) アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォ キシカルボニル基、 エトキシカルボ-ル基などの炭酸から誘導される基などが 用いられる。 また、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジノレ基、 テ トラヒ ドロビラニル基、 t一プチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 B z 1、 C 1 2— B z l、 2—-トロベンジル、 B r— Z、 t一ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、 例えば、 T o s、 4ーメ トキ シ一 2， 3， 6—トリメチルベンゼンスルホニル、 D N P、 ベンジルォキシメ チノレ、 B u m, B o c、 T r t、 F m o cなどが用いられる。
原料のカルボキシル基の活性ィ匕されたものとしては、 例えば、 対応する酸無 水物、 アジド、 活生エステル 〔アルコール (例えば、 ペンタクロロフエノール、 2 , 4， 5—トリクロロフエノ一ノレ、 2 , 4一ジ-トロフエノ一ノレ、 シァノメ チルアルコール、 パラニトロフエノール、 H O N B、 N—ヒ ドロキシスクシミ ド、 N—ヒ ドロキシフタルイミ ド、 H O B t ) とのエステル〕 などが用いられ る。 原料のァミノ基の活性ィヒされたものとしては、 例えば、 対応するリン酸ァ ミ ドが用いられる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 P d—黒あるいは P d—炭素 などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタンスルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるい はこれらの混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリエ チルァミン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニ ァ中ナトリゥムによる還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約一 2 0〜4 0 °Cの温度で行なわれる力 酸処理においては、 例えば、 ァニソール、 フエノール、 チオアニソール、 メタクレゾ一ノレ、 ノ ラクレゾール、 ジメチルスルフィ ド、 1 , 4—ブタンジチォ一ノレ、 1 , 2—エタンジチォーノレ などのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダ ゾール保護基として用いられる 2 , 4—ジニトロフエニル基はチォフエノール 処理により除去され、 トリブトファンのインドール保護基として用いられるホ ルミル基は上記の 1 ， 2—エタンジチオール、 1 , 4ーブタンジチオールなど の存在下の酸処理による脱保護以外に、 希水酸化ナトリウム溶液、 希アンモ- ァなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保 護基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段 から適宜選択しうる。
本発明のペプチドのアミ ド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 カル ポキシ末端ァミノ酸の α—カルボキシル基をアミ ド化して保護した後、 ァミノ 基側にペプチド （蛋白質） 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ペプチド鎖の N 末端のひ一アミノ基の保護基のみを除いたぺプチドと C末端のカルボキシル基 の保護基のみを除去したぺプチドとを製造し、 この両ぺプチドを上記したよう な混合溶媒中で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮 合により得られた保護ペプチドを精製した後、 上記方法によりすベての保護基 を除去し、 所望の粗ペプチドを得ることができる。 この粗ペプチドは既知の各 種精製手段を駆使して精製し、 主要画分を凍結乾燥することで所望の本発明の ぺプチドのァ.ミ ド体を得ることができる。
本発明のペプチドのエステル体を得るには、 例えば、 カルボキシ末端アミノ 酸の α—カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとし た後、 本発明のペプチドのアミ ド体と同様にして、 所望の本発明のペプチドの エステル体を得ることができる。
本発明のペプチドは、 自体公知のペプチドの合成法に従って、 あるいは本発 明の分泌蛋白質を適当なぺプチダーゼで切断することによって製造することが できる。 ペプチドの合成法としては、 例えば、 固相合成法、 液相合成法のいず れによっても良い。 すなわち、 本発明のペプチドの部分ペプチドを構成し得る 部分べプチドもしくはァミノ酸と残余部分とを縮合させ、 生成物が保護基を有 する場合は保護基を脱離することにより目的のぺプチドを製造することができ る。 公知の縮合方法や保護基の脱離としては、 例えば、 以下の①〜⑥に記載さ れた方法があげられる。
(DM. Bodanszkyおよび M. A. 0ndetti、 ペプチド' シンセシス （Peptide Synthesis) , Interscience Publishers, New York u96o年)
② Schroederおよび iebke、 ザ ·ペプチド (The Peptide)， Academic Press, New York (1965年）
③泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
④矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205、 (1977年）
⑤矢島治明監修、 続医薬品の開発、 第 14卷、 ペプチド合成、 広川書店
また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出 ·蒸留 ·カラムクロマトグ ラフィ一'液体クロマトグラフィー ·再結晶などを組み合わせて本発明のぺプ チドまたはその部分ペプチドを精製単離することができる。 上記方法で得られ る本発明のぺプチドの部分べプチドが遊離体である場合は、 公知の方法あるい はそれに準じる方法によつて適当な塩に変換することができるし、 逆に塩で得 られた場合は、 公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他 の塩に変換することができる。
本発明のぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチドとしては、 上記した本発明 のペプチドをコードする塩基配列 （D NAまたは R NA、 好ましくは D NA) を含有するものであればいかなるものであってもよい。 該ポリヌクレオチドと しては、 本発明のペプチドをコードする D NA、 mR NA等の R NAであり、 二本鎖であっても、 一本鎖であってもよい。 二本鎖の場合は、 二本鎖 D NA、 ニ本鎮 R NAまたは D N A： R N Aのハイプリッドでもよい。一本鎖の場合は、 センス鎖 （すなわち、 コード鎖） であっても、 アンチセンス鎖 （すなわち、.非 コード鎖） であってもよい。 本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いて、 例えば、 公知の 実験医学増刊 「新 PCRとその応用」 1 5 (7) 、 1 9 9 7記載の方法または それに準じた方法により、 本発明のペプチドの mRN Aを定量することができ る。
本発明のペプチドをコードする DNAとしては、 前述した本発明のペプチド をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。 また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリ一、 前記した細胞'組織由来の cDNA、 前記した細胞'組織由来の c DNAライブラリー、 合成 DNAのい ずれでもよい。
ライブラリーに使用するベクターは、 バタテリオファージ、 プラスミド、 コ スミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した細胞 '組織 より total RNAまたは mRNA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 R T- P C R法と略称する） によって増幅することもできる。
本願明細書において、 塩基配列 Pとは、 配列番号： 2、 配列番号： 4、 配列 番号： 6および配列番号： 8から選ばれる 1つの配列番号で表される塩基配列 を示す。
本願明細書において、 塩基配列 Qとは、 以下の 4種類の塩基配列から選ばれ る 1つの塩基配列を示す。
( 1 ) 配列番号： 2で表わされる塩基配列の第 5 5番目〜 408番目の塩基配 列、
(2) 配列番号： 4で表わされる塩基配列の第 5 2番目〜 3 72番目の塩基配 列、
(3) 配列番号： 6で表わされる塩基配列の第 52番目〜 3 72番目の塩基配 歹 U、
(4) 配列番号： 8で表わされる塩基配列の第 5 2番目〜 402番目の塩基配 列。
本発明の分泌蛋白質をコードする DNAとしては、 例えば、 塩基配列 Pまた は Qを含有する D N Aの塩基配列を有する D N A、 または塩基配列 Pまたは Q とハイストリンジェントな条件下でハイプリダイズする塩基配列を含有し、 本 発明の分泌蛋白質と実質的に同質の活性を有する分泌蛋白質をコードする DN Aの塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。
塩基配列 Pまたは Qとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズでき る塩基配列としては、 例えば、 塩基配列 Pまたは Qと約 5 0%以上、 好ましく は約 60 %以上、さらに好ましくは 70 %以上、より好ましくは約 80 %以上、 さらに好ましくは約 90 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有す る塩基配列などが用いられる。
塩基配列の相同性は、 相同性計算アルゴリズム NCB I BLAST (N a t i o n a l C e n t e r f o r B i o t e c h n o l o g y I n f o rma t i o n B a s i c L o c a .1 A l i g nme n t S e a r c h T o o l ) を用い、 以下の条件 （期待値 = 1 0 ；ギヤップを許す；フィ ルタリング =ON；マッチスコア = 1 ； ミスマッチスコア =— 3) にて計算す ることができる。
ハイブリダィゼーシヨンは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例 えば、 モレキュラー-クローニンク (Molecular Cloning) 2 nd (J. Sambrook et al.， Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行な うことができる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説明 書に記載の方法に従って行なうことができる。 より好ましくは、 ハイストリン ジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 1 9〜 40 mM、 好ましくは約 1 9〜 20 mMで、 温度が約 50〜 70 °C、 好ましくは約 60〜 6 5 °Cの条件を示す。 特に、 ナトリゥム濃度が約 1 9 mMで温度が約 6 5 °Cの場合が最も好ましい。
より具体的には、
(1)配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列からなるヒト型分泌蛋白質をコー ドする DNAとしては、 配列番号： 2で表わされる塩基配列からなる DNAな どが用いられる。
( 2 )配列番号： 3で表わされるァミノ酸配列からなるラット型分泌蛋白質をコ ードする DNAとしては、 配列番号： 4で表わされる塩基配列からなる DNA などが用いられる。
( 3 )配列番号： 5で表わされるァミノ酸配列からなるマウス型分泌蛋白質をコ ードする DNAとしては、 配列番号： 6で表わされる塩基配列からなる DNA などが用いられる。
(4)配列番号： 7で表わされるアミノ酸配列からなるゥシ型分泌蛋白質をコー ドする DNAとしては、 配列番号： 8で表わされる塩基配列からなる DNAな どが用いられる。
(5) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の第 19番目〜 136番目のァ ミノ酸配列からなるヒト型分泌蛋白質をコードする DNAとしては、 配列番 号： 2で表わされる塩基配列の第 55番目〜 40.8番目の塩基配列からなる D N Aなどが用いられる。
(6) 配列番号： 3で表わされるアミノ酸配列の第 18番目〜 124番目のァ ミノ酸配列からなるラット型分泌蛋白質をコードする DNAとしては、 配列番 号： 4で表わされる塩基配列の第 52番目〜 372番目の塩基配列からなる D NAなどが用いられる。
(7) 配列番号： 5で表わされるアミノ酸配列の第 18番目〜 124番目のァ ミノ酸配列からなるマウス型分泌蛋白質をコードする DNAとしては、 配列番 号： 6で表わされる塩基配列の第 52番目〜 372番目の塩基配列からなる D N Aなどが用いられる。
(8) 配列番号： 7で表わされるアミノ酸配列の第 18番目〜 134番目のァ ミノ酸配列からなるゥシ型分泌蛋白質をコードする D N Aとしては、 配列番 号： 8で表わされる塩基配列の第 52番目〜 402番目の塩基配列からなる D N Aなどが用いられる。
本願明細書において、 塩基配列 Rとは、 以下の 10種類の塩基配列から選ば れる 1つの塩基配列を示す。
(1) ①配列番号： 2で表わされる塩基配列の第 76番目〜 264番目の塩基 配列、
②配列番号： 2で表わされる塩基配列の第 238番目〜 264番目の塩基配列、 ③配列番号： 2で表わされる塩基配列の第 271番目〜 399番目の塩基配列、
④配列番号： 2で表わされる塩基配列の第 379番目〜 399番目の塩基配列、
( 2 ) ①配列番号： 4で表わされる塩基配列の第 343番目〜 366番目の塩 基配列、
②配列番号： 4で表わされる塩基配列の第 346番目〜 366番目の塩基配列、
(3) ①配列番号： 6で表わされる塩基配列の第 343番目〜 366番目の塩 基配列、
②配列番号： 6で表わされる塩基配列の第 346番目〜 366番目の塩基配列、
(4) ①配列番号： 8で表わされる塩基配列の第 370番目〜 393番目の塩 基配列、 .
②配列番号： 8で表わされる塩基配列の第 373番目〜.393番目の塩基配列。 本発明のぺプチドをコードする D N Aとしては、 例えば塩基配列 Rとハイス トリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、 本発明のぺ プチドと実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DN Aなどであれ ば何れのものでもよい。
塩基配列 Rとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配 列としては、 例えば、 塩基配列 Rと約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 より好ましくは約 90 %以上、 さらに好ましくは約 95 %以上の相同性を有す る塩基配列などが用いられる。
塩基配列の相同性は、 相同性計算アルゴリズム NCB I BLAST (N a t i o n a 1 C e n t e r f o r B i o t e c hn o l o g y I n f o rma t i o n B a s i c Lo c a l A l i g nme n t S e a r c h To o l) を用い、 以下の条件 （期待値 = 10 ；ギャップを許す；フィ ルタリング =ON；マッチスコア = 1 ； ミスマッチスコア =ー 3) にて計算す ることができる。
ハイブリダイゼーションの方法おょぴハイストリンジェントな条件は前記と 同様のものが用いられる。
より具体的には、
(1) (i) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の第 26番目〜 88番目の アミノ酸配列からなるヒト型ペプチ をコ一'ドする DNAとしては、 配列番 号： 2で表わされる塩基配列の第 76番目〜 264番目の塩基配列からなる D NAなどが、
(ii) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の第 80番目〜 88番目のアミ ノ酸配列からなるヒト型ペプチドをコードする DN Aとしては、 配列番号： 2 で表わされる塩基配列の第 238番目〜 264番目の塩基配列からなる DNA などが、
(iii) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の第 91番目〜 1 33番目のァ ミノ酸配列からなるヒト型ペプチドをコードする DNAとしては、 配列番号： 2で表わされる塩基配列の第 271番目〜 399番目の塩基配列からなる DN Aなどが、 .
(iv) 配列番号： 1で表わされるァミノ酸配列の第 127番目〜 133番目の アミノ酸配列からなるヒト型ペプチドをコードする DNAとしては、 配列番 号： 2で表わされる塩基配列の第 379番目〜 399番目の塩基配列からなる DNAなどが用いられる。
(2) (i) 配列番号： 3で表わされるアミノ酸配列の第 1 15番目〜 122番 目のアミノ酸配列からなるラット型ペプチドをコードする DNAとしては、 配 列番号： 4で表わされる塩基配列の第 343番目〜 366番目の塩基配列から なる DN Aなどが、
(ii) 配列番号： 3で表わされるァミノ酸配列の第 1 16番目〜 122番目の アミノ酸配列からなるラット型ペプチドをコードする DNAとしては、 配列番 号： 4で表わされる塩基配列の第 346番目〜 366番目の塩基配列からなる DNAなどが用いられる。
(3) (i) 配列番号： 5で表わされるアミノ酸配列の第 1 15番目〜 122番 目のアミノ酸配列からなるマウス型ペプチドをコードする DNAとしては、 配 列番号： 6で表わされる塩基配列の第 343番目〜 366番目の塩基配列から なる DN Aなどが、
(ii) 配列番号： 5で表わされるアミノ酸配列の第 1 16番目〜 122番目の ァミノ酸配列からなるマウス型ぺプチドをコードする D N Aとしては、 配列番 号： 6で表わされる塩基配列の第 346番目〜 36 6番目の塩基配列からなる DNAなどが用いられる。
(4) (i) 配列番号： 8で表わされるアミノ酸配列の第 1 24番目〜 1 3 1番 目のアミノ酸配列からなるゥシ型ぺプチドをコ一ドする DNAとしては、 配列 番号： 8で表わされる塩基配列の第 3 70番目〜 3 9 3番目の塩基配列からな る DNAなどが、
(ii) 配列番号： 8で表わされるアミノ酸配列の第 1 25番目〜 1 3 1番目の アミノ酸配列からなるゥシ型ぺプチドをコ一ドする DNAとしては、 配列番 号： 8で表わされる塩基配列の第 373番目〜 39 3番目の塩基配列からなる DNAなどが用いられる。
本発明のぺプチドをコ一ドする DN Aの塩基配列の一部、 または該. DN Aと 相補的な塩基配列の一部を含有してなるポリヌクレオチドとは、 本発明のぺプ チドをコードする D N Aを包含するだけではなく、 R N Aをも包含する意味で 用いられる。
本発明に従えば、 本発明のペプチド遺伝子の複製または発現を阻害すること のできるアンチセンス ·ポリヌクレオチド (核酸) を、 クローン化した、 ある いは決定された本発明のぺプチドをコ一ドする DNAの塩基配列情報に基づき 設計し、 合成しうる。 そうしたポリヌクレオチド （核酸） は、 本発明のぺプチ ド遺伝子の RN Aとハイブリダィズすることができ、 該 RNAの合成または機 能を阻害することができる力、 あるいは本発明のペプチド関連 RN Aとの相互 作用を介して本発明のペプチド遺伝子の発現を調節 ·制御することができる。 本発明のぺプチド関連 RNAの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、 およぴ本発明のペプチド関連 R N Aと特異的にハイブリダイズすることができ るポリヌクレオチドは、 生体内および生体外で本発明のぺプチド遺伝子の発現 を調節 ·制御するのに有用であり、 また病気などの治療または診断に有用であ る。 用語 「対応する」 とは、 遺伝子を含めたヌクレオチド、 塩基配列または核 酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相捕的であることを意味する。 ヌク レオチド、 塩基配列または核酸とペプチド （蛋白質） との間で 「対応する」 と は、 ヌクレオチド （核酸） の配列またはその相補体から誘導される指令にある ペプチド （蛋白質） のアミノ酸を通常指している。 本発明のペプチド遺伝子の 5 '端ヘアピンループ、 5，端 6—ベースペア ' リピート、 5 '端非翻訳領域、 ぺプ チド翻訳開始コドン、 蛋白質コード領域、 O R F翻訳終止コドン、 3 '端非翻訳 領域、 3 '端パリンドローム領域、 および 3 '端ヘアピンループは好ましい対象領 域として選択しうるが、 本発明のぺプチド遺伝子内の如何なる領域も対象とし て選択しうる。
目的核酸と、 対象領域の少なくとも一部に相補的でハイブリダィズすること ができるポリヌクレオチドとの関係は、 対象物と 「アンチセンス」 であるとい うことができる。 ァンチセンス ·ポリヌクレオチドは、 2—デォキシ一 D—リ ボースを含有しているポリデォキシリボヌクレオチド、 D—リボースを含有し ているポリリボヌクレオチド、 プリンまたはピリミジン塩基の N—ダリコシ.ド であるその他のタイプのポリヌクレオチド、 あるいは非ヌクレオチド骨格を有 するその他のポリマー （例えば、 市販の蛋白質核酸および合成配列特異的な核 酸ポリマー） または特殊な結合を含有するその他のポリマー （伹し、 該ポリマ 一は D NAや R NA中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許 容する配置をもつヌクレオチドを含有する) などが挙げられる。 それらは、 2 本鎖 D NA、 1本鎖 D NA、 2本鎖 R NA、 1本鎖 R NA、 さらに D NA : R N Aハイブリッドであることができ、 さらに非修飾ポリヌクレオチド (または 非修飾オリゴヌクレオチド） 、 さらには公知の修 |iの付加されたもの、 例えば 当該分野で知られた標識のあるもの、 キャップの付いたもの、 メチル化された もの、 1個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、 分子内ヌクレ ォチド修飾のされたもの、 例えば非荷電結合 （例えば、 メチルホスホネート、 ホスホトリエステル、 ホスホルアミデート、 力ルバメートなど） を持つもの、 電荷を有する結合または硫黄含有結合 （例えば、 ホスホロチォエート、 ホスホ 口ジチォエートなど） を持つもの、 例えば蛋白質 （ヌクレアーゼ、 ヌクレア一 ゼ 'インヒビター、 トキシン、 抗体、 シグナルぺプチド、 ポリ一 Lーリジンな ど） や糖 （例えば、 モノサッカライドなど） などの側鎖基を有しているもの、 インターカレント化合物 (例えば、 アタリジン、 プソラレンなど) を持つもの、 キレート化合物 （例えば、 金属、 放射活性をもつ金属、 ホウ素、 酸化性の金属 など） を含有するもの、 アルキル化剤を含有するもの、 修飾された結合を持つ もの （例えば、 αァノマー型の核酸など） であってもよい。 ここで 「ヌクレオ シド」 、 「ヌクレオチド」 および 「核酸」 とは、 プリンおょぴピリミジン塩基 を含有するのみでなく、 修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを 含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル^ iされたプリンおよびピリミジン、 ァシルイ匕されたプリンおよびピリミジン、 あるいはその他の複素環を含むもの であってよい。 修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた 糖部分が修飾されていてよく、 例えば、 1個以上の水酸基がハロゲンとカ、 月旨 肪族基などで置換されていたり、 あるいはエーテル、 ァミンなどの官能基に変， 換されていてよい。
本発明のアンチセンス 'ポリヌクレオチド （核酸） は、 R NA、 D N A、 あ るいは修 iされた核酸 （R N A、 D N A) である。 修飾された核酸の具体例と しては核酸の硫黄誘導体ゃチォホスフエ一ト誘導体、 そしてポリヌクレオシド アミドゃオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、 そ れに限定されるものではない。 本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で 好ましく設計されうる。 すなわち、 細胞内でのアンチセンス核酸をより安定な ものにする、 アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、 目標とするセンス 鎖に対する親和性をより大きなものにする、 そしてもし毒性があるならアンチ センス核酸の毒性をより小さなものにする。
こうして修飾は当該分野で数多く知られており、 例えば J. Kawakami et al.， Pharm Tech Japan, Vol. 8， pp. 247, 1992； Vol. 8， pp. 395, 1992； S. T. Crooke et al. ed. , Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993 などに 開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、 変化せしめられたり、 修飾された糖、 塩基、 結合を含有していて良く、 リボゾーム、 ミクロスフエアのような特殊な形態で 供与されたり、 遺伝子治療により適用されたり、 付加された形態で与えられる ことができうる。 こうして付加形態で用いられるものとしては、 リン酸基骨格 の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、 細胞膜との 相互作用を高めたり、 核酸の取込みを増大せしめるような脂質 （例えば、 ホス ホリピド、 コレステロールなど） といった粗水性のものが挙げられる。 付加す るに好ましい脂質としては、 コレステロールやその誘導体 （例えば、 コレステ リルクロ口ホルメート、 コール酸など） が挙げられる。 こうしたものは、 核酸 の 3 '端あるいは 5 '端に付着させることができ、 塩基、 糖、 分子内ヌクレオシド 結合を介して付着させることができうる。 その他の基としては、 核酸の 3 '端あ るいは 5 '端に特異的に配置されたキャップ用の基で、 ェキソヌクレアーゼ、 R N a s eなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。 こうしたキャップ用の基としては、 ポリエチレングリコール、 テトラエチレン グリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護 基が挙げられるが、 それに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、 本発明の形質転換体、 本発明の生体内や生 体外の遺伝子発現系、 あるいは本発明のぺプチドの生体内や生体外の翻訳系を 用いて調べることができる。 該核酸それ自体公知の各種の方法で細胞に適用で きる。
本発明のペプチドをコードする D N Aは、 自体公知の方法で標識ィ匕されてい てもよく、 具体的にはアイソトープラベルイ匕されたもの、 蛍光標識されたもの (例えば、 フルォレセインなどによる蛍光標識） 、 ピオチン化されたものまた は酵素標識されたものなどがあげられる。
本発明のぺプチドを完全にコードする D N Aのクローユングの手段としては、 本発明のぺプチドの部分塩基配列を有する合成 D N Aプライマーを用いて自体 公知の P C R法によつて増幅するか、 または適当なベクターに組み込んだ D N Aを本発明のぺプチドの一部あるいは全領域をコードする D NA断片もしくは 合成 D N Aを用いて標識したものとのハイブリダィゼーションによって選別す ることができる。 ハイブリダイゼーションの方法は、 例えば、 モレキュラー · クローニンク (Molecular Cloning) 2 nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる。 また、 巿 販のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行 なうことができる。
D N Aの塩基配列の変換は、公知のキット、例えば、 Mutan™-super Express Km (宝酒造（株） ） 、 Mutan™_K (宝酒造（株） ) 等を用いて、 ODA- LAPCR法、 Gapped duplex法、 Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って 行なうことができる。
クローン化されたぺプチドをコードする DNAは目的によりそのまま、 また は所望により制限酵素で消化したり、 リンカ一を付カ卩したりして使用すること ができる。 該 DNAはその 5，末端側に翻訳開始コドンとしての ATGを有し、 また 3，末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TG Aまたは TAGを有し ていてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合成 DN
I
Aアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のペプチドの発現ベクターは、 例えば、 （ィ） 本発明のペプチドをコ 'ードする DNAから目的とする DNA断片を切り出し、 （口） 該 DNA断片を 適当な発現べクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造するこ とができる。
ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミ ド （例、 pBR 322， p BR 3 25， pUC 12, pUC 13) 、 枯草菌由来のプラスミ ド （例、 pUB 1 1 0， p TP 5, p C 194) 、 酵母由来プラスミ ド （例、 p SH19, p SH 15) 、 λファージなどのパクテリオファージ> レトロウイルス, ワクシニア ゥイノレス， ノくキュロウイノレスなどの動物ゥイノレスなどの他、 pAl— 1 1、 p XT1、 pRcZCMV、 pRc/RSV、 p c D N A I ZN e oなどが用い られる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対 応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。 例えば、 '動物細胞 を宿主として用いる場合は、 SRaプロモーター、 SV40プロモーター、 H I V · LTRプロモーター、 CMVプロモーター、 HSV-TKプロモーターな どがあげられる。
これらのうち、 CMV (サイトメガロウィルス） プロモーター、 SRaプロ モーターなどを用いるのが好ましい。 宿主がェシエリヒア属菌,である場合は、 t r pプロモーター、 1 a cプロモーター、 r e c Aプロモーター、 え P Lプ 口モーター、 プロモーター、 T7プロモーターなどが、 宿主がパチノレス 菌である場合は、 SPO lプロモーター、 SP02プロモーター、 p e nPプ 口モーターなど、 宿主が酵母である場合は、 PHO 5プロモーター、 PGKプ 口モーター、 GAPプロモーター、 ADHプロモーターなどが好ましい。 宿主 が昆虫細胞である場合は、 ポリヘドリンプロモーター、 P 10プロモーターな どが好ましい。
発現ベクターには、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシング シグナル、 ポリ A付カ卩シグナル、選択マーカー、 S V40複製オリジン (以下、 S V40 o r i と略称する場合がある） などを含有しているものを用いること ができる。 選択マーカーとしては、 例えば、 ジヒ ドロ葉酸還元酵素 （以下、 d h f rと略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセート （MTX) 耐性〕 、 アンピシリン耐性遺伝子 （以下、 Amp rと略称する場合がある） 、 ネオマイ シン耐性遺伝子 （以下、 Ne o rと略称する場合がある、 G418耐生） 等が あげられる。 特に、 d h f r遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いて d h f r遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、 目的遺伝子をチミジンを 含まない培地によっても選択できる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明のペプチドの N 端末側に付加する。 宿主がェシェリヒァ属菌である場合は、 Pho A ·シグナル配 列、 Omp A ·シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 α—アミ ラーゼ ·シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列などが、 宿主が酵母であ る場合は、 MFo; ·シグナル配列、 SUC 2 ·シグナル配列など、 宿主が動物. 細胞である場合には、 ィンシュリン ·シグナル配列、 a—ィンターフェロン · シグナル配列、 抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のペプチドをコードする DNAを含有する ベクターを用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシェリヒァ属菌の具体例としては、 例えば、 ェシェリヒア 'コリ
(Escherichia coli) K 12 · DH 1 〔プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショ ナノレ'アカデミー'ォブ。サイェンシィズ'ォプ'ザ 'ユーエスエー（Proc. Natl, Acad. Sci. USA) ， 60卷， 1 60 (1 96 8)〕 ， JM1 03 〔ヌクイレック * ァシッズ. リサーチ （Nucleic Acids Research) ， 9卷， 309 (1 98 1)〕 ， J A 2 2 1 〔ジャーナル ·ォブ ·モレキュラー ·ノ ィォロジ一 （Journal of Molecular Biology) , 1 20卷， 5 1 7 (1 978)〕 , ΗΒ 1 01 〔ジャーナ ル 'ォブ 'モレキュラー 'ノくィォロジ一， 4 1卷， 45 9 (1 96 9)〕 ， C 6 00 〔ジェネティックス （Genetics) , 3 9巻， 440 (1 9 54)〕 などが用 レヽられる。
バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス ·サブチルス (Bacillus subtilis) M I 1 14 〔ジーン， 24卷， 255 (1 9 83)〕 , 20 7 - 21 〔ジャーナ ノレ ·ォプ ·バイオケミストリー (Journal of Biochemistry) ， 95卷， 8 7 (1 984)〕 .などが用いられる。
酵母としては、 ί列えば、 サッカロマイセス セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae) AH 22, AH 22 R", NA8 7- 1 1 A, DKD— 5D， 20 B_ 1.2、 シゾサッカロマイセス ボンべ (Schizosaccharomyces pombe) NC YC 1 9 1 3, NCYC 20 36、 ピキア パス トリス （Pichia pastoris) K Μ7 1などが用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫 由来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f 細胞） 、 Trichoplusia niの 中腸由来の MG 1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five™細胞、 Mamestra brassicae由来の細胞または Estigmenaacrea由来の細胞などが用いられる。 ゥ ィルスが BmNP Vの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyx raori N細胞； BmN 細胞） などが用いられる。 該 S f 細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （ATCC CRL1711)、 S f 2 1細胞 (以上、 Vaughn, J.L.ら、 イン ·ヴイボ (In Vivo) , 13， 213-217, (1977)) などが用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 ネィチヤ 一 (Nature) ， 3 1 5卷， 5 92 (1 9 85)]。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7 (COS 7) ， V e r o, チャイニーズノヽムスター細胞 CH〇 （以下、 CHO細胞と略記） ， d h f r遺 伝子欠損チヤィユーズハムスター細胞 C HO (以下、' CHO (d h f r -) 細胞 と略記） ， マウス L細胞， マウス At T— 20, マウスミエローマ細胞， ラッ ト GH3， ヒト FL細胞などが用いられる。
ェシェリヒァ属菌を形質転換するには、 例えば、 プロシージングズ ·ォブ · ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンジィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスェ 一（Proc, Natl. Acad. Sci. USA), 69卷， 21 10 (1972)やジーン（Gene) , 1 7巻， 107 (1982)などに記載の方法に従って行なうことができる。 バチルス属菌を形質転換するには、 例えば、 モレキュラー 'アンド 'ジエネ ラノレ · ジエネティックス (Molecular & General Genetics) , 168卷， 1 1 1 ( 1 979 )などに記載の方法に従つて行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ 'イン 'ェンザィモ口ジー（Methods in Enzymology) ， 194卷， 182— 187 (1991) 、 プロシージングズ · ォブ ·ザ ·ナシ aナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユー エスエー （proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 75巻， 1929 (1978)など に記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 バイオ Zテクノロジー
(Bio/Technology) , 6， 47-55 (1988)などに記載の方法に従って行なうことが できる。
動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プ 口トコール. 263— 267 (1 995) (秀潤社発行） 、 ヴィロロジー (Virology) , 52卷， 456 (1 973)に記載の方法に従って行なうこと、が できる。
このようにして、 ぺプチドをコードする DNAを含有する発現ベクターで形 質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がェシヱリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培 養に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体 の生育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源と しては、 例えば、 グルコース、 デキス トリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素 源、としては、例えば、 アンモニゥム塩類、硝酸塩類、 コーンスチープ'リカー、 ペプトン、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または 有機物質、 無機物としては、 例えば、 塩ィ匕カルシウム、 リン酸二水素ナトリウ ム、 塩化マグネシウムなどがあげられる。 また、 酵母エキス、 ビタミン類、 生 長促進因子などを添加してもよい。 培地の p Hは約 5〜 8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザ ミノ酸を含む M 9培地 〔ミラー （Miller) , ジャーナル'ォブ 'エタスぺリメ ンッ ·イン -モレキュラー · シエネティックス (Journal of Experiments in Molecular Genetics) , 4 3 1 _ 4 d 3， Cold pring Harbor LaboHumanory, New- York 1 9 7 2〕 が好ましい。 ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせ るために、 例えば、 3 ]3—インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることが できる。
宿主がェシェリヒァ属菌の場合、 培養は通常約 1 5〜 4 3 °Cで約 3〜 2. 4時 間行ない、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 3 0〜 4 0 °Cで約 6〜 2 4時間行 ない、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 パーク ホールダー （Burkholder) 最小培地 〔Bostian， K. L. ら、 プロシージングズ · ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·オフ、、 ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユー エスエー （proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 7 7卷， 4 5 0 5 ( 1 9 8 0 )〕 や 0 . 5 %カザミノ酸を含有する S D培地〔Bitter， G. A. ら、 プロシージングズ' ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユー エスエー （Proc. Natl, Acad. Sci. USA) , 8 1卷， 5 3 3 0 ( 1 9 8 4 ) ] があげられる。 培地の p Hは約 5〜 8に調整するのが好ましい。 培養は通常約 2 0〜3 5 °Cで約 2 4〜7 2時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。 宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Grace' s Insect Medium (Grace, T. C. C.，ネイチヤー （Nature) ， 195, 788 (1962) ) に非動化した 1 0 %ゥシ血清等の添加物を適宜カ卩えたものなどが用いられる。 培地の p Hは約 6 . 2〜6 . 4に調整するのが好ましい。 培養は通常約 2 7 °C で約 3〜 5日間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5〜20%の胎児牛血清を含む MEM培地〔サイエンス（Science) , 122卷，
501 (1952)〕 ， DMEM培地 〔ヴイロロジー （Virology) ， 8卷， 39
6 (1959)] , RPM I 1640培地〔ジャーナル ·ォブ ·ザ'アメリカン' メアイ力ノレ ·ァソシェ1 ~ション (The Journal of the American Medical Association) 199卷， 519 (1967)〕 ， 1 99培地 〔プロシージング · 才ブ ·ザ ·ソサイエティ ·フォー ·ザ ·バイオロジカル 'メディスン (Proceeding of the Society for the Biological Medicine) , 73卷， 1 (1950)〕 な どが用いられる。 pHは約 6〜8であるのが好ましい。 培養は通常約 30〜4 0 °Cで約 15〜 60時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、 形質転換体の細胞内、 細胞膜または細胞外などに本発明 のぺプチドを生成せしめることができる。
上記培養物から本発明のペプチドを分離精製するには、 例えば、 下記の方法 により行なうことができる。
本発明のペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、 培養後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、 リゾチームおよび または凍結融解などによつて菌体ぁるいは細胞を破壊した のち、 遠心分離やろ過により本発明のぺプチドの粗抽出液を得る方法などが適 宜用いられる。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァ-ジンなどの蛋白質変性剤や、 ト リ トン X— 100™などの界面活' I"生剤が含まれていてもよい。 培養液中にぺプ チドが分泌される場合には、 培養終了後、 それ自体公知の方法で菌体あるいは 細胞と上清とを分離し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれる本発明のぺ プチドの精製は、 自体公知の分離 ·精製法を適宜組み合わせて行なうことがで きる。 これらの公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度 を利用する方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および SDS—ポリアク リルァミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 ィオン 交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、 ァフイエティーク口 マトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、 逆相高速液体クロマトグ ラフィ一などの疎水性の差を利用する方法、 等電点電気泳動法などの等電点の 差を利用する方法などが用いられる。
かくして得られる本発明のペプチドが遊離体で得られた場合には、 自体公知 の方法あるレ、はそれに準じる方法によつて塩に変換することができ、 逆に塩で 得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体ま たは他の塩に変換することができる。
なお、 組換え体が産生する本発明のペプチドを、 精製前または精製後に適当 な蛋白質修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ペプチド を部分的に除去することもできる。 蛋白質修飾酵素としては、 例えば、 トリプ シン、 キモトリプシン、 アルギニルェンドぺプチダーゼ、 プロテインキナーゼ、 'グリコシダーゼなどが用いられる。
本発明のペプチドに対する抗体 （以下、 単に本発明の抗体と称する場合があ る） は、 本発明のペプチドに対する抗体を認識し得る抗体であれば、 ポリクロ ーナル抗体、 モノクローナル抗体の何れであってもよレ、。
本発明のペプチドに対する抗体は、 本発明のペプチドを抗原として用い、 自 体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
( a ) モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のぺプチドは、 温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位に それ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能 を高めるため、 完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバント を投与してもよい。 投与は通常 2〜6週毎に 1回ずつ、 計 2〜1 0回程度行わ れる。 用いられる温血動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモッ ト、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギ、 -ヮトリがあげられるが、 マウスおよび ラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原で免疫された温血動物、 例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に脾 臓またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種 動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマを調製することができる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の 標識化ぺプチドと抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性を 測定することにより行なうことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケ 一ラーとミルスタインの方法 〔ネイチヤー (Nature) 、 256、 495 (1975)〕 に従 い実施することができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレングリコ ール （PEG) やセンダイウィルスなどがあげられるが、 好ましくは PEGが 用いられる。
骨髄腫細胞としては、 例えば、 NS— 1、 P 3U 1、 S P 2/0、 AP— 1 などの温血動物の骨髄腫細胞があげられるが、 P 3U 1が好ましく用いられる。 用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： ：!〜 20 ： 1程度であり、 PEG (好ましくはPEG 1 000〜PEG600 0) が 1 0〜 80%程度の濃度で添カ卩され、. 2ひ〜 40°C、 好ましくは 30〜 3 7°Cで 1〜1 0分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施 できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリ ドーマのスクリーニングには種々の方法が 使用できるが、 例えば、 ペプチド （蛋白質） 抗原を直接あるいは担体とともに 吸着させた固相（例、マイクロプレート） にハイプリ ドーマ培養上清を添カロし、 次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体 （細胞融合に用い られる細胞がマウスの場合、'抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる） また はプロテイン Aを加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免疫グロプリン抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイブリ ドーマ 培養上清を添加し、 放射性物質や酵素などで標識したペプチドを加え、 固相に 結合したモノクローナル抗体を検出する方法などがあげられる。
モノクローナル抗体の選別は、 自体公知あるいはそれに準じる方法に従って 行なうことができる。 通常 HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジ ン） を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。 選別および育種用培地 としては、 ハイプリ ドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても 良 、。 例えば、 1〜 2 0 %、 好ましくは 1 0〜 20 %の牛胎児血清を含む R P Ml 1 640培地、 1〜 1 0 %の牛胎児血清を含む G I T培地 （和光純薬工業 (株） ） あるいはハイプリ ドーマ培養用無血清培地 （S FM— 10 1、 日水製 薬 （株） ） などを用いることができる。 培養温度は、 通常 2 0〜4 0 °C、 好ま しくは約 3 7 °Cである。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培養は、 通常 5 %炭酸ガス下で行なうことができる。 ハイプリ ドーマ培養上清の抗体価は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定 できる。
( b ) モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、 自体公知の方法、 例えば、 免疫グロプリ ンの分離精製法〔例、塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿法、電気泳動法、 イオン交換体 （例、 D E A E ) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過法、 抗原 結合固相あるいはプロテイン Aあるいはプロテイン Gなどの活性吸着剤により 抗体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従って行な うことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナノレ抗体は、 それ自体公知あるいはそれに準じる方法に 従って製造することができる。 例えば、 免疫抗原 （ペプチド抗原） 自体、 ある いはそれとキャリアー蛋白質との複合体をつくり、 上記のモノクローナル抗体 の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、 該免疫動物から本発明のぺプチド に対する抗体含有物を採取して、 抗体の分離精製を行なうことにより製造する ことができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合 体に関し、 キヤリァー蛋白質の種類およびキヤリア一とハプテンとの混合比は、 キヤリァ一に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、 どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アルブ ミンゃゥシサイログロプリン、 へモシァニン等を重量比でハプテン 1に対し、 約 0 . 1〜 2 0、好ましくは約 1〜 5の割合でカプルさせる方法が用いられる。 また、 ハプテンとキャリアーの力プリングには、 種々の縮合剤を用いること ができるが、ダルタルアルデヒ ドゃカルボジィミ ド、マレイミ ド活性エステル、 チオール基、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。 縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるい は担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与してもよ レ、。 投与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜 1 0回程度行なわれる。 ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、 好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリク口一ナル抗体価の測定は、 上記の抗血清中の抗体価の測定 と同様にして測定できる。 ポリクローナル抗体の分離精製は、 上記のモノクロ ーナル抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行なうこ とができる。
本発明のペプチドをコードする D NA (以下、 これらの D NAを本発明の D N Aと赂記する場合がある） に相補的な、 または実質的に相補的な塩基配列を 有するアンチセンス D N A (以下、 これらの D N Aをアンチセンス D NAと略 記する場合がある） としては、 本発明の D NAに相補的な、 または実質的に相 補的な塩基配列を有し、 該 D N Aの発現を抑制し得る作用を有するものであれ ば、 いずれのアンチセンス D NAであってもよい。
本発明の D N Aに実質的に相補的な塩基配列とは、 例えば、 本発明の D NA に相補的な塩基配列 （すなわち、 本発明の D NAの相補鎖） の全塩基配列ある いは部分塩基配列と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは 約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有する塩基配列などが あげられる。 特に、 本発明の D N Aの相補鎖の全塩基配列うち、 本発明のぺプ チドの N末端部位をコードする部分の塩基配列 （例えば、 開始コドン付近の塩 基配列など） の相補鎖と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好まし くは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアンチセン ス D NAが好適である。 これらのアンチセンス D NAは、 公知の D NA合成装 置などを用いて製造することができる。
以下に、 ①本発明のペプチド、 ②本発明の D NA、 ③本発明の抗体、 および ④アンチセンス D N Aの用途を説明する。
( 1 ) 本発明のぺプチドが関与する各種疾病の治療 ·予防剤
本発明のぺプチドおよびそれをコードする D NAは、 安全で低毒性な医薬、 例えば、 副腎皮質ホルモン分泌調節剤、 好ましくは副腎皮質ホルモン分泌促進 剤として有用である。
副腎皮質ホルモンとしては、 アルドステロン、 デォキシコルチコステロンな どの鉱質コルチコイドやコルチコステロン、 コルチゾール、 コルチゾン、 酪酸 ヒドロコルチゾンなどの糖質コルチコイドなどが挙げられ、 なかでもコルチコ ステロン、 アルドステロンが好ましい。
また、 本発明のペプチドおよびそれをコードする D NAは、 例えば、 低アル ドステロン症、 低コルチゾール血症、 続発性または慢性副腎皮質機能低下症、 アジソン病、副腎機能不全、痛み、肥満などの予防 ·治療剤として有用である。 さらに、 本発明のペプチドおよびそれをコードする D NAは、 安全で低毒性 な医薬、 例え.ば、 男性ホルモン分泌調節剤、 好ましくは男性ホルモン分泌促進 剤として有用である。
男性ホルモンとしては、 テストステロンが挙げられる。
また、 本発明のペプチドおよびそれをコードする D NAは、 例えば、 男性性 腺機能不全、 造精機能障害に伴う男子不妊症、 再生不良性貧血、 骨髄線維症、 腎性貧血、 末期女性性器癌の疼痛緩和、 乳癌 （例、 手術不能乳癌） 、 乳腺症、 乳腺腫瘍、 女性化乳房などの予防 ·治療剤として有用である。
本発明のペプチドおょぴ本発明の D NAは、 例えば、 生体内において本発明 のペプチドが減少あるいは欠損している患者がいる場合に、 （ィ） 本発明の D NAを該患者に投与し、 生体内で本発明のペプチドを発現させることによって、 (口） 細胞に本発明の D NAを挿入し、 本発明のペプチドを発現させた後に、 該細胞を患者に移植することによって、 または （ハ） 本発明のペプチドを該患 者に投与することなどによって、 該患者における本発明のペプチドの役割を十 分に、 あるいは正常に発揮させることができる。
本発明の D N Aを上記の治療 ·予防剤として使用する場合は、 該 D N Aを単 独あるいはレト口ウィルスベクター、 アデノウィルスベクター、 アデノウィル スァソシエーテツドウィルスベクターなどの適当なベクターに揷入した後、 常 套手段に従って、 ヒトまたは温血動物に投与することができる。 本発明の D N Aは、 そのままで、 あるいは摂取促進のための捕助剤などの生理学的に認めら れる担体とともに製斉 IJィ匕し、 遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテ 一テルによって投与できる。
本発明のぺプチドを上記の治療 ·予防剤として使用する場合は、 少なくとも
9 0 %、 好ましくは 9 5 %以上、 より好ましくは 9 8 %以上、 さらに好ましく は 9 9 %以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
本発明のペプチドは、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、 エリキシノレ剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくは それ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射 剤の形で非経口的に使用できる。 例えば、 本発明のペプチドを生理学的に認め られる担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などととも に一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによつ て製造することができる。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の 適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼ ラチン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性 セルロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのよ うな膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖または サッカリンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのよう な香味剤などが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記タ イブの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のた めの無菌組成物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油な どのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施 に従って処方することができる。
注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬 を含む等張液 (例えば、 D—ソルビトール、 D—マン-トール、 塩化ナトリウ ムなど） などがあげられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例えば、 エタノールなど) 、 ポリアルコール (例えば、 プロピレングリコール、 ポリエ チレングリコールなど） 、 非イオン性界面活性剤 （例えば、 ポリソルベート 8 0 TM、 H C O— 5 0など） などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などがあげられ、 溶解捕助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジ ルアルコールなどと併用してもよい。 また、緩衝剤 (例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリウム緩衝液など） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩 酸プロ力インなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレング リコールなど) 、 保存剤 (例えば、 ベンジルアルコール、 フヱノールなど） 、 酸ィ匕防止剤などと配合してもよい。 調製された注射液は、 通常、 適当なアンプ ルに充填される。
本発明の DN Aが挿入されたベクターも上記と同様に製剤化され、 通常、 非 経口的に使用される。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトま たは温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモッ ト、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ.、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 など） に対して投与することができる。 本発明のペプチドの投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどにより 差異はあるが、 例えば、 本発明のペプチドを経口投与する場合、 一般的に成人 (体重 60 k gとして） においては、 一日につき該ペプチドを約 0. 1〜： 100 m g、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投 与する。 非経口的に投与する場合は、 該ペプチドの 1回投与量は投与対象、 対 象疾患などによっても異なるが、 例えば、 本発明のペプチドを注射剤の形で成 人 （体重 60 k gとして） に投与する場合、 一日につき該ぺプチドを約 0. 0 1-3 Omg程度、好ましくは約 0. ：!〜 20 m g程度、 より好ましくは約 0. ：!〜 1 Omg程度を患部に注射することにより投与するのが好都合である。 他 の動物の場合も、 体重 60 k g当たりに換算した量を投与することができる。
(2) 疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
本発明のぺプチドは、 本発明のぺプチドの機能を促進または阻害する化合物 またはその塩のスクリーニング方法に使用することができる。 本発明のぺプチ ドの機能としては、 AQ 27受容体への結合作用、 AQ 27受容体を介するシ グナル伝達作用、 後述する細胞刺激活性などが挙げられる。
また、 本発明の DNAは、 本発明のペプチドの発現を促進または阻害する化 合物またはその塩のスクリ一二ング方法に使用することができる。 以下に、 本発明のぺプチドまたは本発明の D NAを用いるスクリーニング方 法を具体的に説明する。
( 2 - 1 ) A Q 2 7受容体に対するァゴニストまたはアンタゴニストのスクリ 一二ング方法
該スクリーニングは、 本発明のペプチドを用いるか、 または組換え型本発明 のぺプチドの発現系を構築し、 該発現系を用いたレセプタ一結合ァッセィ系を 用いることによって、 本発明のぺプチドと A Q 2 7受容体との結合 1·生を変化さ せる化合物 （本発明のペプチドの活性を促進または阻害する化合物） またはそ の塩をスクリーニングすることができる。
このような化合物には、 本発明のぺプチドの A Q 2 7受容体を介した細胞刺 激活性を有する化合物 （すなわち AQ 2 7受容体ァゴニスト） .と該細胞刺激活 性を有しない化合物 （すなわち A Q 2 7受容体アンタゴニスト） などが含まれ る。 「結合性を変化させる」 とは、 本発明のペプチド A Q 2 7受容体との結合 を阻害する場合と促進する場合の両方を包含するものである。
A Q 2 7受容体を介する細胞刺激活性としては、例えば、ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 p Hの低下、 G T P y S結合活性、 副腎皮質ホルモン分 泌作用、 男性ホルモン分泌作用などを促進する活性または抑制する活性などが 挙げられ、特に細胞内 c AM P生成抑制活性、副腎皮質ホルモン分泌促進活性、 男性ホルモン分泌促進活性が好ましい。
すなわち、 本発明は、
本発明のぺプチドを用いることを特徴とする本発明のぺプチドの機能を促進 または阻害する化合物またはその塩のスクリーエング方法、 具体的には、
( i ) 本発明のペプチドおよび （または） A Q 2 7受容体またはその部分ぺプ チド （以下、 これらを単に A Q 2 7受容体と略称する） を用いることを特^:と する副腎皮質ホルモン分泌調節薬 （例、 副腎皮質ホルモン分泌促進薬、 副腎皮 '質ホルモン分泌阻害薬） のスクリーニング方法、
(ii) A Q 2 7受容体またはその部分ペプチド （以下、 これらを単に A Q 2 7 受容体と略称する） に、 本発明のペプチドを接触させた場合と （ii) A Q 2 7 受容体に、 本発明のぺプチドおよび試験化合物を接触させた場合との比較を行 なうことを特徴とする本発明のぺプチドと A Q 2 7受容体の結合性を変化させ る化合物 （本発明のペプチドの機能を促進または阻害する化合物） またはその 塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法においては、 （i) A Q 2 7受容体に、 本発明の ペプチドを接触させた場合と （ii) A Q 2 7受容体に、 本発明のペプチドおよ び試験化合物を接触させた場合における、 例えば A Q 2 7受容体に対する本発 明のペプチドの結合量、 細胞刺激活性などを測定して、 比較する。
本発明のスクリ.一ユング方法は具体的には、
①標識した本発明のペプチドを、 A Q 2.7受容体に接触させた場合と、 標識し た本発明のぺプチドおよび試験化合物を A Q 2 7受容体に接触させた場合にお ける、 標識した本発明のペプチドの A Q 2 7受容体に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とする本発明のべプチドと A Q 2 7受容体との結合性を変 化させる化合物 （本発明のペプチドの機能を促進または阻害する化合物） また はその塩のスクリーニング方法、
②標識した本発明のペプチドを、 A Q 2 7受容体を含有する細胞または該細胞 の膜画分に接触させた場合と、 標識した本発明のぺプチドおよび試験化合物を AQ 2 7受容体を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合におけ る、 標識した本発明のぺプチドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定 し、 比較することを特徴とする本発明のペプチドと A Q 2 7受容体との結合性 を変化させる化合物 （本発明のペプチドの機能を促進または阻害する化合物） またはその塩のスクリーユング方法、
③標識した本発明のぺプチドを、 A Q 2 7受容体をコードする D N Aを含有す 'る形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した A Q 2 7受容体に接 触させた場合と、 標識した本発明のペプチドおよび試験化合物を A Q 2 7受容 体をコードする D N Aを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上 に発現した A Q 2 7受容体に接触させた場合における、 標識した本発明のぺプ チドの A Q 2 7受容体に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とする本 発明のぺプチドと AQ 27受容体との結合性を変化させる化合物 （本発明のぺ プチドの機能を促進または阻害する化合物） またはその塩のスクリ一二ング方 法、
④ AQ 27受容体を活性ィヒする化合物またはその塩 （例えば、 本発明のぺプチ ド） を AQ 27受容体を含有する細胞に接触させた場合と、 AQ 27受容体を 活性化する化合物またはその塩および試験化合物を A Q 27受容体を含有する 細胞 （例、 CHO細胞） に接触させた場合における、 AQ 2 7受容体を介した 細胞刺激活性を測定し、 比較することを特徴とする本発明のぺプチドと AQ 2 7受容体との結合性を変化させる化合物 （本発明のぺプチドの機能を促進また は阻害する化合物） またはその塩のスクリーニング方法、 および
⑤ AQ 27受容体を活性ィ匕する化合物またはその塩 （例えば、 本発明のぺプチ ドなど） を AQ 2.7受容体をコードする DN Aを含有する形質転換体を培養す ることによって細胞膜上に発現した A Q 2 7受容体に接触させた場合と、 AQ 27受容体を活性化する化合物またはその塩おょぴ試験ィ匕合物を、 AQ 2 7受 容体をコードする D N Aを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜 上に発現した AQ 2 7受容体に接触させた場合における、 AQ27受容体を介 する細胞刺激活性を測定し、 比較することを特徴とする本発明のぺプチドと A Q2 7受容体との結合性を変化させる化合物 （本発明のペプチドの機能を促進 または阻害する化合物） またはその塩のスクリーユング方法などである。
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、 本発明のスクリーニング方法に用いる AQ 2 7受容体としては、 本発 明のぺプチドをリガンドとして認識するものであれば何れのものであってもよ いが、 ヒトゃ温血動物の臓器の膜画分などが好適である。 しかし、 特にヒト由 来の臓器は入手が極めて困難なことから、 スクリーニングに用いられるものと しては、 組換え体を用いて大量努現させた AQ 2 7受容体などが適している。 AQ 2 7受容体は、 公知の方法に従って製造することができる。
本発明のスクリーニング方法において、 AQ2 7受容体を含有する細胞ある レヽは該細胞膜画分などを用いる場合、 後述の調製法に従えばょレ、。
AQ 2 7受容体を含有する細胞を用いる場合、 該細胞をグルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定ィ匕してもよい。 固定ィ匕方法ほそれ自体公知の方法に従つ' て行うことができる。
AQ 27受容体を含有する細胞としては、 AQ 2 7受容体を発現した宿主細 胞をいうが、 該宿主細胞としては、 前述の大腸菌、 枯草菌、 酵母、 昆虫細胞、 動物細胞などが挙げられる。 また、 AQ 27受容体を発現した宿主細胞は、 前 述の本発明のぺプチドを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体の 製造方法と同様の方法などがあげられる。
膜画分としては、 細胞を破枠した後、 それ自体公知の方法で得られる細胞膜 が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破碎方法としては、 Potter—Elvehjem 型ホモジナイザ一で細胞を押し潰す方法、 ヮーリングブレンダーゃポリ トロン (Kinematica社製） による破枠、 超音波による破碎、 .フレンチプレスなどでカロ 圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などがあげられる。 細胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による 分画法が主として用いられる。 例えば、 細胞破碎液.を低速 （500〜 3000 r pm) で短時間 （通常、 約 1〜1 0分） 遠心し、 上清をさらに高速 （1 50 00〜30000 r pm) で通常 30分〜 2時間遠心し、 得られる沈澱を膜画 分とする。 該膜画分中には、 発現した AQ 27受容体と細胞由来のリン脂質や 膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
該 AQ 2 7受容体を含有する細胞や膜画分中の A Q 2 7受容体の量は、 1細 · 胞当たり 1 03〜1 08分子であるのが好ましく、 1 05〜1 07分子であるのが 好適である。 なお、 発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性 （比活 性）が高くなり、高感度なスクリ一二ング系の構築が可能になるばかりでなく、 同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
本発明のペプチドと AQ 27受容体との結合性を変化させる化合物 （本発明 . のペプチドの機能を促進または阻害する化合物） またはその塩をスクリーニン グする前記の①〜③を実施するためには、 適当な AQ 2 7受容体画分と、 標識 した本発明のペプチドなどが用いられる。 AQ 27受容体画分としては、 天然 型の AQ2 7受容体画分か、 またはそれと同等の活性を有する組換え型 AQ 2 7受容体画分などが望ましい。 ここで、 同等の活"生とは、 同等のリガンド結合 活性などを示す。 標識した本発明のペプチドとしては、 例えば 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで標識された本発明のペプチドやそのアナログ 化合物などを利用することができる。 このうち好ましくは、 〔1251〕 で標識さ れた本発明のぺプチドである。
具体的には、 本発明のペプチドと AQ 2 7受容体との結合性を変化させる化 合物またはその塩のスクリーニングを行うには、 まず AQ 2 7受容体を含有す る細胞または細胞の'膜画分を、 スクリーニングに適したバッファーに懸濁する ことによりレセプター標品を調製する。 バッファーには、 pH4〜1 0 (望ま しくは pH6〜8) のリン酸バッファー、 トリス 塩酸バッファーなどのリガ ンドとレセプターとの結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。 また、 非特異的結合を低減させる目的で、 CHAP S、 Twe e n-80™ (花 王一アトラス社） 、 ジギトニン、 デォキシコレートなどの界面活'11生剤をバッフ ァーに加えることもできる。 さらに、 プロテアーゼによる AQ 27受容体や本 発明のペプチドの分解を抑える目的で PMS F、 ロイぺプチン、 E—64 (ぺ プチド研究所製） 、 ぺプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することも できる。 0. 0 1〜： I 0m Iの該レセプター溶液に、 一定量 （5000〜50 0000 c p m) の標識した本発明のペプチドを添加し、 同時に 1 0— 1 ()〜1 0 一7 Mの試験化合物を共存させる。 非特異的結合量 （NSB) を知るために大過 剰の未標識の本発明のぺプチドを加えた反応チューブも用意する。 反応は 0〜 50°C、 望ましくは 4〜3 7°Cで 20分〜 24時間、 望ましくは 30分〜 3時 間行う。 反応後、 ガラス繊維濾紙等で濾過し、 適量の同バッファーで洗浄した 後、 ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーシヨンカウンターま たは γ—カウンターで計測する。 拮抗する物質がない場合のカウント （Β。） か ら非特異的結合量 （NSB) を引いたカウント （Β。一 NSB) を 1 00%とし た時、 特異的結合量 （B—NS B) が例えば 50%以下になる試験化合物を拮 抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
本発明のペプチドと AQ 27受容体との結合性を変化させる化合物 （本発明 のペプチドの機能を促進または阻害する化合物） またはその塩をスクリーニン グする前記の①〜③の方法を実施するためには、 AQ 2 7受容体を介する細胞 激活性を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる t 具体的には、 まず、 A Q 2 7受容体を含有する細胞をマルチウエルプレート等 に培養する。 スクリーニングを行うにあたっては前もって新鮮な培地あるいは 細胞に毒性を示さない適当なパッファーに交換し、 試験化合物などを添加して 一定時間インキュベートした後、 細胞を抽出あるいは上清液を回収して、 生成 した産物をそれぞれの方法に従って定量する。 細胞刺激活性の指標とする物質 (例えば、 c AMP、 ァラキドン酸など） の生成が、 細胞が含有する分解酵素 によつて検定困難な場合は、 該分解酵素に対する阻害剤を添加してァッセィを 行なってもよい。 また、 c AM P産生抑制などの活性については、 フオルスコ リンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用 として検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリ一ユングを行なうには、 適当な A Q 2 7受容 体を発現した細胞が必要である。 A Q 2 7受容体を発現した細胞としては、 前 述の A Q 2 7受容体発現細胞株などが望ましい。
試験化合物および試験化合物が形成してもよい塩としては、 前記と同様のも のが用いられる。
また、 試験化合物としては、 A Q 2 7受容体の活性部位の原子座標およびリ ガンド結合ポケットの位置に基づいて、 リガンド結合ポケットに結合するよう に設計された化合物が好ましく用いられる。 AQ 2 7受容体の活性部位の原子 座標おょぴリガンド結合ポケットの位置の測定は、 公知の方法あるいはそれに 準じる方法を用いて行うことができる。
さらに、 本発明のペプチドに代えて、 本発明のペプチドと AQ 2 7受容体と の結合性を変化させる化合物またはその塩をリガンドとして用いることもでき る。 本発明のペプチドと A Q 2 7受容体との結合^ ·生を変化させる化合物または その塩は、 例えば、 リガンドとして本発明のペプチドを用いて、 前述した本発 明のスクーニング方法を実施することによって得ることができる。 . 本発明のペプチドと A Q 2 7受容体との結合性を変化させる化合物 （本発明 のペプチドの機能を促進または阻害する化合物） またはその塩のスクリーニン グ用キットは、 A Q 2 7受容体またはその塩、 A Q 2 7受容体の部分ペプチド またはその塩、 AQ 27受容体を含有する細胞、 あるいは AQ27受容体を含 有する細胞の膜画分、 および本発明のぺプチドを含有するものである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、 次のものが挙げられる。
1. スクリーエング用試薬
①測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution (ギブコネ土製） に、 ◦.0 5%のゥシ血清ァ ルブミン （シグマ社製） を加えたもの。
孔径 0. 45 μΐηのフィルターで濾過滅菌し、 4°Cで保存するか、 あるいは用 時調製しても良い。
② AQ 2 7受容体標品
AQ 2 7受容体を発現させた CHO細胞を、 1 2穴プレートに 5x1 0 5個 / 穴で継代し、 3 7 °C、 5 % C O 2、 9 5 % a i rで 2日間培養したもの。
③標識リガンド
〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで標識した本発明のペプチドを適 当な溶媒または緩衝液に溶解したものを 4°Cあるいは一 20°Cにて保存し、 用 時に測定用緩衝液にて 1 μΜに希釈する。
④リガンド標準液
本発明のぺプチドを 0. 1 %ゥシ血清アルブミン （シグマ社製） を含む P B S で 1 mMとなるように溶解し、 一 20 °Cで保存する。
2. 測定法
① 1 2穴組織培養用プレートにて培養した AQ 2 7受容体を発現させた細胞を、 測定用緩衝液 1 m 1で 2回洗浄した後、 4 9 0 1の測定用緩衝液を各穴に加 る。
©1 0_3〜1 (T1QMの試験化合物溶液を 5 μ 1加えた後、標識した本発明のぺプ チドを 5 μ 1加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合量を知るために は試験化合物の代わりに 1 0— 3Μの本発明のぺプチドを 5 Α( 1加えておく。
③反応液を除去し、 1 m 1の洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に結合した標 識された本発明のペプチドを 0, 2 N Na OH— 1%SDSで溶解し、 4m l の液体シンチレーター A (和光純薬製） と混合する。 ④液体シンチレーシヨンカウンター （ベックマン社製） を用いて放射活性を測 定し、 Percent Maximum Binding (PMB) を次の式 〔数 1〕 で求める。
〔数 1〕
PMB= [ (B-NS B) / (B。一 NSB) ] xl 00
PMB Percent Maximum Binding
B 検体を加えた時の値
NS B Non-specific Binding (非特異的結合量）
B 0
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ る化合物またはその塩は、 本発明のペプチドと AQ 27受容体との結合を変化 させる化合物 （本発明のペプチドの機能を促進または阻害する化合物） または その塩であり、 具体的には AQ 27受容体を介して細胞刺激活性を有する化合 物またはその塩 （いわゆる AQ 27受容体ァゴ-スト） 、 あるいは該刺激活性 を有しない化合物またはその塩 （いわゆる AQ27受容体アンタゴ-スト） で ある。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ る化合物としては、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発 酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよい。 該化合物の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸など） や塩基 (例、 有機酸など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸 付加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リ ン酸、 臭化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ 酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） との塩な どが用いられる。
上記 AQ27受容体ァゴニストであるかアンタゴニストであるかの具体的な 評価方法は以下の （i) または （ii) に従えばよレ、。
( i ) 例えば、 前記①〜③のスクリ一二ング方法で示されるパインディング · アツセィを行い、 本発明のペプチドと AQ 2 7受容体との結合性を変化させる (特に、 結合を阻害する） 化合物またはその塩を得た後、 該化合物またはその 塩が上記した AQ 2 7受容体を介する細胞刺激活性を有している力否かを測定 する。 細胞刺激活性を有する化合物またはその塩は AQ 27受容体ァゴニスト であり、 該活性を有しない化合物またはその塩は AQ 2 7受容体アンタゴニス トである。
(ii) (a) 試験化合物 （例、 前記①〜③のスクリーニング方法で示されるバ インディング ·アツセィを行い、 本発明のペプチドと AQ 2 7受容体との結合 性を変化させる化合物またはその塩） を AQ 27受容体を含有する細胞 （例、 CHO細胞） に接触させ、 上記 AQ 2 7受容体を介した細胞刺激活性を測定す る。 細胞刺激活性を有する化合物またはその塩は AQ 2 7受容体ァゴニストで ある。
(b) AQ 27受容体を活性ィ匕する化合物またはその塩 （例えば、 本発明のぺ プチドアゴニストなど） を AQ 27受容体を含有する細胞に接触させた場合と、 AQ 27受容体を活性化する化合物またはその塩および試験ィヒ合物 （例、 前記 ①〜③のスクリーユング方法で示されるバインディング'アツセィを行い、 本 発明のぺプチドと AQ 2 7受容体との結合性を変化させる化合物またはその 塩） を AQ 2 7受容体を含有する細胞に接触させた場合における、 AQ2 7受 容体を介した細胞刺激活生を測定し、 比較する。 AQ 2 7受容体を活个生化する 化合物による細胞刺激活性を減少させ得る化合物またはその塩は AQ 2 7受容 体アンタゴニストである。
(c) 試験化合物 （例、 前記①〜③のスクリーニング方法で示されるバインデ イング .アツセィを行い、 本発明のペプチドと AQ 2 7受容体との結合性を変 化させる化合物またはその塩） を非哺乳動物 （例、 マウス、 ラット、 ハムスタ 一、 ゥサギ） に投与し、 血中の副腎皮質ホルモンまたは男性ホルモンの濃度を 測定する。 血中の副腎皮質ホルモンまたは男性ホルモンの濃度を上昇させる化 合物またはその塩は AQ 2 7受容体ァゴニストである。 一方、 血中の副腎皮質 ホルモンまたは男性ホルモンの濃度を減少させる化合物またはその塩は A Q 2 7受容体アンタゴニストである。 ( d ) A Q 2 7受容体を活性化する化合物またはその塩 （例えば、 本発明のぺ プチドアゴニストなど） を非ヒト哺乳動物 （例、マウス、 ラット、ハムスター、 ゥサギ） に投与した場合と、 A Q 2 7受容体を活性ィ匕する化合物またはその塩 および試験化合物を非ヒト哺乳動物 （例、 マウス、 ラット、 ハムスター、 ゥサ ギ） に投与した場合における、 血中の副腎皮質ホルモンまたは男性ホルモンの 濃度を測定し、 比較する。 A Q 2 7受容体を活性化する化合物による血中の副 腎皮質ホルモンまたは男性ホルモンの分泌促進作用を減少させ得る化合物また はその塩は A Q 2 7受容体アンタゴニストである。
副腎皮質ホルモン分泌作用および男性ホルモン分泌作用は、 後述する実施例 1〜5に準じて測定することができる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリ.一二ング用キットを用いて得られ る本発明のぺプチドと AQ 2 7受容体との結合性を変化させる化合物またはそ の塩（本発明のぺプチドの機能を促進または阻害する化合物またはその塩）は、 安全で低毒性な副腎皮質ホルモン分泌調節剤として有用である。
A Q 2 7受容体ァゴニストまたは本発明のぺプチドの機能を促進する化合物 もしくはその塩は、 A Q 2 7受容体に対する本発明のぺプチドが有する生理活 性と同様の作用を有しているので、 本発明のぺプチドと同様に安全で低毒性な 副腎皮質ホルモン分泌調節剤、 好ましくは副腎皮質ホルモン分泌促進剤として 有用である。 さらに、 該 AQ 2 7受容体ァゴニストまたは本発明のぺプチドの 機能を促進する化合物もしくはその塩は、 低アルドステロン症、 低コルチゾー ル血症、 続発性または慢性副腎皮質機能低下症、 アジソン病、 副腎機能不全、 痛み、 肥満などの予防 ·治療剤として有用である。
また、 A Q 2 7受容体ァゴニストまたは本発明のぺプチドの機能を促進する 化合物もしくはその塩は、 安全で低毒性な男性ホ モン分泌調節剤、 好ましく は男性ホルモン分泌促進剤として有用である。 さらに、 該 A Q 2 7受容体ァゴ ニストまたは本発明のぺプチドの機能を促進する化合物もしくはその塩は、 例 えば、 男性性腺機能不全、 造精機能障害に伴う男子不妊症、 再生不良性貧血、 骨髄線維症、腎性貧血、末期女性性器癌の疼痛緩和、乳癌（例、手術不能乳癌）、 乳腺症、 乳腺腫瘍、 女性化乳房などの予防 ·治療剤として有用である。 逆に、 A Q 2 7受容体アンタゴニストまたは本発明のペプチドの機能を阻害 する化合物もしくはその塩は、 A Q 2 7受容体に対する本発明のぺプチドが有 する生理活性を抑制することができるので、 安全で低毒性な副腎皮質ホルモン 分泌調節剤、 好ましくは副腎皮質ホルモン分泌阻害剤 （副腎皮質ホルモン分泌 抑制剤） として有用である。 さらに、 A Q 2 7受容体アンタゴニストまたは本 発明のペプチドの機能を阻害する化合物もしくはその塩は、 クッシング病、 ク ッシング症候群、 副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、 C R H産生腫瘍、 ァ ルドステロン産生腫瘍、 アルドステロン症、 原発性コルチゾール抵抗症、 先天 性副腎酵素欠乏症、 ス トレス、 うつ病、 神経性食欲不振症、 不眠、 胃 ·十二指 腸潰瘍、 過敏性腸症候群などの予防 ·治療剤として有用である。
. また、 A Q 2 7受容体アンタゴニス トまたは本発明のペプチドの機能を阻害 する化合物もしくはその塩は、 安全で低毒性な男性ホルモン分泌調節剤、 好ま しくは男性ホルモン分泌阻害剤（男性ホルモン分泌抑制剤） として有用である。 さらに、 A Q 2 7受容体アンタゴニストまたは本発明のペプチドの機能を阻害 する化合物もしくはその塩は、例えば、陰茎肥大、精巣萎縮、精巣機能異常（例、 精子減少） 、 月経異常、 多毛、 色素沈着、 嗄声、 過敏症、 坐瘡、 悪心、 嘔吐、 消化器系症状 （例、 食欲不振） 、 満月様顔貌などの予防 ·治療剤として有用で ある。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ る化合物を上述の治療 ·予防剤として使用する場合、 常套手段に従って実施す ることができる。 例えば、 前記した本発明のペプチドを含有する医薬と同様に して、 錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤、 無菌性溶液、 懸濁液剤などとすることができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒ トまた は温血動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 トリ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど) に対して投与することができる。 該化合物またはその塩の投与量は、 その作用、 対象疾患、 投与対象、 投与ル ートなどにより差異はあるが、 例えば、 A Q 2 7受容体ァゴニストを経口投与 する場合、 一般的に成人 （体重 6 0 k g当たり） においては、 一日につき A Q 2 7受容体ァゴニストを約 0. 1〜： 1 0 Omg、好ましくは約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投与する場合は、 該 化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例えば、 AQ 2 7受容体ァゴニストを注射剤の形で通常成人 （体重 60 k g当たり） に 投与する場合、 一日につき該化合物を約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは 約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. 1〜： I Omg程度を静脈注射 により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 6 O k g当たりに 換算した量を投与することができる。
AQ 27受容体としては、 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質.的に同一のアミノ酸配列を 含有する G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩 （以下、 AQ 27受容 体と略記する場合がある） などが用いられる。
配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミノ酸 配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、 例えば、 配列番号： 9、 配列番 号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるァミノ酸配列と約 70 %以上、 好 ましくは約 80 %以上、 より好ましくは約 90 %以上、 さらに好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
本発明の配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされる アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、 例え ば、 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミノ 酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、 配列番号： 9、 配列番号： 1 1 または配列番号： 1 3で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同 質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
ァミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズム N C B I B LAST (N a t i o n a l C e n t e r f o r B i o t e c n n o l o g y I n f o rma t i o n B a s i c L o c a l A l i g nme n t S e a r c h T o o l ) を用い、 以下の条件 （期待値 = 1 0 ；ギヤップを許す；マ トリクス=8乙0311^462 ； フィルタリング = OFF) にて計算することが できる。 実質的に同質の活性としては、 例えば、 リガンド結合活性、 シグナル情報伝 達作用などが挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの活性が性質的に同質で あることを示す。 したがって、 リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用など の活性が同等 （例、 約 0. 5〜2倍） であることが好ましいが、 これらの活性 の程度ゃ蛋白質の分子量などの量的要素は異なつていてもよい。
リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、 前記と同様 にして測定することができる。
また、 AQ 27受容体としては、 ①配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配 列番号： 1 3で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜 30個程度、 より好ましくは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数個 ( 1 または 2個） ）. のァミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 ②配列番号： 9、 配列番 号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミノ酸配列に 1または 2個以上 (好ましくは、 1〜30個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ま しくは数個 （1または 2個） ） のアミノ酸が付カ卩したアミノ酸配列、 ③配列番 号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程度、 より好ましくは 1〜1 0個 程度、 さらに好ましくは数個 （1または 2個） ） のアミノ酸が他のアミノ酸で 置換されたァミノ酸配列、 または④それら欠失 ·付カ卩 '置換を組み合わせたァ ミノ酸配列を含有する蛋白質なども用いられる。
AQ 2 7受容体は、ぺプチド標記の慣例に従って左端が N末端（ァミノ末端）、 右端が C末端 (カルボキシル末端) である。 配列番号： 9、 配列番号： 1 1ま たは配列番号： 1 3で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質をはじめとする AQ 2 7受容体は、 C末端が通常カルボキシル基 （一 COOH) 、 カルボキシ レート（一 COO— )、 アミ ド （一CONH2) またはエステル （一COOR) の 何れであってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピ ノレ、 イソプロピルもしくは n—プチルなどの アルキル基、 例えば、 シクロ ペンチル、 シクロへキシルなどの〇3— 8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 α—ナフチルなどの C6— 12ァリール基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどの フエ二ルー アルキル基もしくは α—ナフチルメチルなどの α—ナフチル ーじ ^ァルキル基などのじ卜 ァラルキル基のほカ、 経口用エステルとして 汎用されるピパ口ィルォキシメチル基などが用いられる。
A Q 2 7受容体が C末端以外にカルボキシル基 （またはカルボキシレート） を有している場合、 カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているも のも本発明の蛋白質に含まれる。 この場合のエステルとしては、 例えば上記し た C末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 A Q 2 7受容体には、 上記した蛋白質において、 Ν末端のメチォ二 ン残基のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの C 2_6アル カノィル基などの C i— 6ァシル基など） で保護されているもの、 N端側が生体内 で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、 分子内のァ ミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば、 一 O H、 一 S H、 アミノ基、 イミダゾール 基、 インドール基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの C 2— 6アル力ノィル基などの C i _ 6ァシル基など） で保護され ているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質など も含まれる。
A Q 2 7受容体の具体例としては、 例えば、 配列番号： 9で表わされるアミ ノ酸配列からなるヒト由来 A Q 2 7受容体、 配列番号： 1 1で表わされるアミ ノ酸配列からなるラット由来 A Q 2 7受容体、 配列番号： 1 3で表わされるァ ミノ酸配列からなるマウス由来 A Q 2 7受容体などがあげられる。
A Q 2 7受容体の部分べプチドとしては、 前記した A Q 2 7受容体部分ぺプ チドであれば何れのものであってもよいが、 例えば、 A Q 2 7受容体の蛋白質 分子のうち、 細胞膜の外に露出している部位であって、 レセプター結合活性を 有するものなどが用いられる。
A Q 2 7受容体の部分べプチドとしては、 疎水性プロット解析において細胞 外領域 （親水性 （Hydrophilic) 部位） であると分析された部分を含むペプチド である。 また、 疎水性 （Hydrophobic) 部位を一部に含むペプチドも同様に用い ることができる。 個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、 複数の ドメインを同時に含む部分のペプチドでも良い。 AQ 27受容体の部分ぺプチドのアミノ酸の数は、 前記した AQ 27受容体 の構成ァミノ酸配列のうち少なくとも 20個以上、 好ましくは 50個以上、 よ り好ましくは 100個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。 実質的に同一のァミノ酸配列とは、 これらァミノ酸配列と約 50 %以上、 好 ましくは約 70 %以上、 より好ましくは約 80 %以上、 さらに好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 95 %以上の相同性を有するァミノ酸配列を示す。 ァミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズム N C B I BLAST (N a t i o n a l し e n t e r i o r B i o t e c hn o l o g y I n f o rma t i o n B a s i c Lo c a l A l i g nme n t S e a r c h To o l) を用い、 以下の条件 （期待値 = 10 ；ギヤップを許す；マ トリタス = BLOSUM62 ； フィルタリング =OFF) にて計算することが. できる。
ここで、 「実質的に同質の活性」 とは、 前記と同意義を示す。 「実質的に同 質の活性」 の測定は前記と同様に行なうことができる。
また、 AQ 27受容体の部分べプチドは、 上記ァミノ酸配列中の 1または 2 個以上（好ましくは、 1〜 10個程度、 さらに好ましくは数個（ 1または 2個）） のアミノ酸が欠失し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好まし くは、 1〜20個程度、 より好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数 個 （1または 2個） ） のアミノ酸が付カ卩し、 または、 そのアミノ酸配列中の 1 または 2個以上（好ましくは、 1〜10個程度、 より好ましくは 1〜5個程度、 さらに好ましくは数個 （1または 2個） ） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換さ れていてもよい。
また、 AQ 27受容体の部分ペプチドは C'末端が通常カルボキシル基 （_C OOH) 、 カルボキシレート （一COO-) 、 アミ ド （一 CONH2) またはェ ステル （一 COOR) の何れであってもよい。
さらに、 AQ 27受容体の部分ペプチドには、 前記した AQ 27受容体と同 様に、 N末端のメチォニン残基のァミノ基が保護基で保護されているもの、 N 端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、 分子內のァミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、 あ るいは糖鎖が結合したいわゆる糖ぺプチドなどの複合べプチドなども含まれる。
AQ 2 7受容体またはその部分べプチドの塩としては、 とりわけ生理学的に 許容される酸付加塩が好ましい。 このような塩としては、 例えば無機酸 （例え ば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢 酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コノヽク酸、 酒石酸、 クェン 酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） と の塩などが用いられる。
AQ 2 7受容体をコードする DNAとしては、 前述した AQ 27受容体をコ 一ドする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。 また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリー、 前記した細胞 ·組織由来の c D N A、 前記した細胞'糸且織由来の c DNAライブラリー、 合成 DNAのいずれで もよい。 ライプラリーに使用するベクターは、 パクテリオファージ、 プラスミ ド、 コスミ ド、 ファージミドなど ヽずれであつてもよい。 また、前記した細胞 · 組織より total RNAまたは mRNA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 R T_P C R法と略称する） によって増幅することもできる。
具体的には、 AQ 2 7受容体をコードする DNAとしては、 例えば、 配列番 号： 1 0、 配列番号： 1 2または配列番号： 14で表わされる塩基配列を含有 する DNA、 または配列番号： 1 0、 配列番号： 1 2または配列番号： 1 4で 表わされる塩基配列を有する DNAとハイストリンジェントな条件下でハイブ リダィズする DN Aを有し、 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミノ酸配列からなる AQ 27受容体と実質的に同質の活性 (例、 リガンド結合活性、 シグナル情報伝達作用など） を有する AQ 27受容 体をコードする D N Aであれば何れのものでもよい。
配列番号： 1 0、 配列番号： 1 2または配列番号： 1 4で表わされる塩基配 列を含有する DNAとハイストリンジェントな条件下でハイプリダイズする D NAとしては、 例えば、 配列番号： 1 0、 配列番号： 1 2または配列番号： 1 4で表わされる塩基配列と約 70 %以上、 好ましくは約 80 %以上、 より好ま しくは約 9 0 %以上、 さらに好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有する塩基配 列を含有する DN Aなどが用いられる。
塩基配列の相同性は、 相同性計算アルゴリズム NCB I BLAST (N a t i o n a l Ce n t e r f o r B i o t e c nn o l o g y I n f o rma t i o n B a s i c L o c a l A l i gnme n t S e a r c h To o l) を用い、 以下の条件 （期待値 = 10 ；ギヤップを許す； フィ ルタリング =ON；マッチスコア = 1 ； ミスマッチスコア =—3) にて計算す ることができる。
ハイブリダィゼーシヨンは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例 えば、 モレキュラー -クローニンク (Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行な うことができる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説明 書に記載の方法に従って行なうことができる。 より好ましくは、 ハイストリン ジェントな条件に従って行なうことができる。
該ハイストリンジヱントな条件とは、 例えば、 ナトリゥム濃度が約 19〜 4 0 mM、 好ましくは約 1 9〜 20 mMで、 温度が約 50〜 70 °C、 好ましくは 約 60〜65 °Cの条件を示す。 特に、 ナトリゥム濃度が約 1 9 mMで温度が約 65 °Cの場合が最も好ましい。
より具体的には、 配列番号： 9で表わされるアミノ酸配列からなるヒ ト AQ 27受容体をコードする DNAとしては、 配列番号： 10で表わされる塩基配 列からなる DNAなどが用いられる。 配列番号： 11で表わされるアミノ酸配 列からなるラット AQ 27受容体をコードする DNAとしては、 配列番号： 1 2で表わされる塩基配列からなる DNAなどが用いられる。 配列番号： 13で 表わされるアミノ酸配列からなるマウス AQ 27受容体をコードする DNAと しては、 配列番号： 14で表わされる塩基配列からなる DNAなどが用いられ る。
ヒ ト AQ27受容体、 その部分ペプチドまたはその塩は、 WO01/163 16号公報に記載の方法に準じて製造することができる。
ラットまたはマウス AQ 27受容体、 その部分ペプチドまたはその塩は、 新 規な蛋白質であり、 WO01ノ16316号公報に記載の方法に準じて製造す 3 011160
90 ることができる。
( 2 - 2 ) 本発明のぺプチドの発現を促進または阻害する化合物またはその塩 のスクリーニング方法
本発明のぺプチド、 本発明のオリゴヌク オチド、 本発明の形質変換体また は本発明の抗体は、 本発明のペプチドの発現を促進または阻害する化合物また はその塩のスクリーニング法に使用することができる。
すなわち、 本発明は、 '
( i ) 本発明のペプチドを発現し得る細胞または組織を、 試験化合物の存在下 および非存在下で培養した場合における、 それぞれの本発明のぺプチドの発現 量または本発明のペプチドをコードする mR NA量を測定し、 比較することを 特徴とする本発明のぺプチドの発現を促進または阻害する化合物またはその塩 のスクリ一ユング方法を提供する。
本発明のペプチドを発現し得る細胞または組織としては、ヒトゃ温血動物（例 えば、 モルモット、 ラット、 マウス、 ニヮトリ、 ゥサギ、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サル等） の細胞 （例えば、 神経細胞、 内分泌細胞、 神経内分泌細胞、 グリア細 胞、 膝臓 細胞、 骨髄細胞、 肝細胞、 脾細胞、 メサンギゥム細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、 マクロファージ、 Τ細胞、 Β細胞、 ナチュラルキラー細胞、 肥満細胞、好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球、 榭状細胞） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆 細胞、 幹細胞もしくはガン細胞等、 もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる 組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 嗅球、 扁桃核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小脳） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 膝臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 唾液腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸 （精巣）'、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 車骨、 関節、 骨格筋等を用いても良い。 その際、 株化 細胞、 初代培養系を用いてもよい。 また、 前記した本発明の形質転換された形 質変換体を使用してもよレ、。
本発明のぺプチドを発現し得る細胞の培養方法は、 前記した本発明の形質変 1160
91 換体の培養法と同様である。
試験化合物としては、 前記の試験化合物の他、 DNAライブラリーなどを用 いることができる。
本発明のぺプチドの発現量は抗体などを用いて免疫化学的方法などの公知の 方法により測定することもできるし、 本発明のペプチドをコードする mRN A をノーザンハイブリダィゼーシヨン法、 RT— PCR Ta qMa n PCR 法を用いて、 公知の方法により測定することもできる。
mRN Aの発現量の比較をハイブリダィゼーション法によって行うには、 公 知の方法あるいはそれに準じる方法、 例えば、 モレキュラー 'クローニング (Molecular Cloning) 2 nd(,J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法等に従って行なうことができる。 ·
具体的には、 本発明のペプチドをコードする mRNAの量の測定は、'公知の 方法に従って細胞から抽出した RNAと、 本発明のポリヌクレオチドもしくは その一部または本発明のアンチセンスポリヌクレオチドとを接触させ、 本発明 のポリヌクレオチドもしくはその一部または本発明のアンチセンスポリヌクレ ォチド結合した mRN Aの量を測定することによって行われる。 本発明のポリ ヌクレオチドもしくはその一部または本発明のアンチセンスポリヌクレオチド を、 例えば放射性同位元素、 色素などで標識することによって、 本発明のポリ ヌクレオチドもしくはその一部または本発明のアンチセンスポリヌクレオチド に結合した mRNAの量が容易に測定できる。 放射性同位元素としては、 例え ば32 P、 3Hなどが用いられ、 色素としては、 例えば fluorescein F AM (PE Biosystems社製） 、 JOE (PE Biosystems社製） 、 TAMRA (PE Biosystems 社製）、 R O X (PE Biosystems社製）、 C y 5 (Amershara社製）、 C y 3 (Amersham 社製） などの蛍光色素が用いられる。
また、 mRNAの量は、 細胞から抽出した RNAを逆転^酵素によって c D N Aに変換した後、 本発明のポリヌクレオチドもしくはその一部または本発明 のアンチセンスポリヌクレオチドをプライマーとして用いる PC Rによって、 増幅される cDN Aの量を測定することによって行うことができる。
このように、 本発明のぺプチドをコ一ドする mRNAの量を増加させる試験 化合物を、 本発明のぺプチドの発現を促進する活"生を有する化合物またはその 塩として選択することができ、 また本発明のぺプチドをコ一ドする mR N Aの 量を減少させる試験化合物を、 本発明のぺプチドの発現を阻害する活性を有す る化合物またはその塩として選択することができる。
さらに、 本発明は、
(ii) 本発明のぺプチドをコ一ドする遺伝子のプロモーター領域またはェンハ ンサー領域の下流にレポーター遺伝子を連結した,袓換え D N Aで形質転換した 形質転換体を試験化合物の存在下およぴ非存在下で培養した場合における、 そ れぞれのレポーター活性を測定し、 比較することを特徴とする当該プロモータ 一活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供 する。
レポーター遺伝子としては、 例えば、 1 a c Z ( β—ガラクトシダーゼ遺伝 子） 、 クロラムフエ二コールァセチノレトランスフェラーゼ (CAT) 、 ルシフェラ ーゼ、 成長因子、 β -グルクロニダーゼ、 ァノレカリホスファターゼ、 Green fluorescent protein (GFP)、 j3 -ラクタマーゼなどが用いられる。
レポーター遺伝子産物 （例、 mR N A、 蛋白質） の量を公知の方法を用いて 測定することによって、 レポーター遺伝子産物の量を増加させる試験化合物を 本発明のぺプチドのプロモーターもしくはェンハンサ一の活性を制御 （特に促 進） する作用を有する化合物またはその塩、 すなわち本発明のペプチドの発現 を促進する活性を有する化合物またはその塩として選択できる。 逆に、 レポ一 タ一遺伝子産物の量を減少させる試験化合物を本発明のぺプチドのプロモータ 一もしくはェンハンサ一の活性を制御 （特に阻害） する作用を有する化合物ま たはその塩、 すなわち本発明のぺプチドの発現を阻害する活性を有する化合物 またはその塩として選択することができる。
試験化合物と試験化合物が形成してもよい塩としては、 前記と同様のものが 使用される。
形質転換体の培養は、 前記の本発明の形質転換体と同様にして行うことがで さる。
レポーター遺伝子のベクター構築ゃァッセィ法は公知の技術に従うことがで きる （例えば、 Molecular Biotechnology 13， 29-43， 1999) 。
本発明のぺプチドの発現を促進する活性を有する化合物またはその塩は、 本 発明のぺプチドの作用を増強することができるので、 本発明のぺプチドと同様 に安全で低毒性な副腎皮質ホルモン分泌調節剤、 好ましくは副腎皮質ホルモン 分泌促進剤として有用である。 さらに、 本発明のペプチドの発現を促進する活 性を有する化合物またはその塩は、低アルドステロン症、低コルチゾール血症、 続発性または慢性副腎皮質機能低下症、 アジソン病、 副腎機能不全、 痛み、 肥 満などの予防 ·治療剤として有用である。
また、 本発明のペプチドの発現を促進する活性を有する化合物またはその塩 は、 安全で低毒性な男性ホルモン分泌調節剤、 好ましくは男性ホルモン分泌促 進剤として有用である。 さらに、 本発明のペプチドの発現を促進する活性を有 する化合物またはその塩は、 例えば、 男性性腺機能不全、 造精機能障害に伴う 男子不妊症、 再生不良性貧血、 骨髄線維症、 腎性貧血、 末期女性性器癌の疼痛 緩和、 乳癌 （例、 手術不能乳癌） 、 乳腺症、 乳腺腫瘍、 女性化乳房などの予防 · 治療剤として有用である。
逆に、 本発明のぺプチドの発現を阻害する活性を有する化合物またはその塩 は、 本発明のぺプチドが有する生理活性を抑制することができるので、 安全で 低毒性な副腎皮質ホルモン分泌調節剤、 好ましくは副腎皮質ホルモン分泌阻害 剤 （副腎皮質ホルモン分泌抑制剤） として有用である。 さらに、 本発明のぺプ チドの発現を阻害する活性を有する化合物またはその塩は、 クッシング病、 ク ッシング症候群、 副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、 C R H産生腫瘍、 ァ ルドステロン産生腫瘍、 アルドステロン症、 原発性コルチゾール抵抗症、 先天 性副腎酵素欠乏症、 ストレス、 うつ病、 神経性食欲不振症、 不眠、 胃 ·十二指 腸潰瘍、 過敏性腸症候群などの予防 ·治療剤として有用である。
また、 本発明のペプチドの発現を阻害する活性を有する化合物またはその塩 は、 安全で低毒性な男性ホルモン分泌調節剤、 好ましくは男性ホルモン分泌阻 害剤 （男性ホルモン分泌抑制剤） として有用である。 さらに、 本発明のぺプチ ドの発現を阻害する活^"生を有する化合物またはその塩は、 例えば、 陰茎肥大、 精巣萎縮、 精巣機能異常 （例、 精子減少） 、 月経異常、 多毛、 色素沈着、 嗄声、 過敏症、 坐瘡、 悪心、 嘔吐、 消化器系症状 （例、 食欲不振） 、 満月様顔貌など の予防 ·治療剤として有用である。
本発明のスクリーユング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ る化合物またはその塩は、 例えば、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿な どから選ばれた化合物である。
該化合物の塩としては、 前記した本発明のぺプチドの塩と同様のものが用い られる。
本発明のスクリーユング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ る化合物を上述の治療 ·予防剤として使用する場合、 常套手段に従って実施す ることができる。 例えば、 前記した本発明のペプチドを含有する医薬と同様に して、 錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤、 無菌性溶液、 懸濁液剤などとすることができる。 ,.
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまた は温血動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 プタ、 ゥシ、 ゥマ、 トリ、 ネコ、 ィヌ、サル、 チンパンジーなど) に対して投与することができる。 該化合物またはその塩の投与量は、 その作用、 対象疾患、 投与対象、 投与ル ートなどにより差異はあるが、 例えば、 本発明のペプチドの発現を促進する化 合物またはその塩を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 6 0 k g当たり） においては、 一日につき該化合物を約 0 . 1〜1 0 O m g、 好ましぐは約 1 . 0 〜5 0 m g、 より好ましくは約 1 . 0〜2 0 m g投与する。 非経口的に投与す る場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異なる 力 例えば、 本発明のペプチドの発現を促進する化合物またはその塩を注射剤 の形で通常成人 （体重 6 O k g当たり） に投与する場合、 一日につき該化合物 を約 0 . 0 1〜 3 0 m g程度、 好ましくは約 0 . 1〜 2 0 m g程度、 より好ま しくは約 0 . 1〜1 O m g程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 6 0 k g当たりに換算した量を投与することができる。 これらの医薬は前記と同様に製剤化して、 使用することができる。
( 3 ) 本発明のぺプチドの'定量および診断方法 P 聰嶋 11160
95 本発明の抗体は、 本発明のぺプチドを特異的に認識することができるので、 被検液中の本発明のぺプチドの定量、 特にサンドィツチ免疫測定法による定量 などに使用することができる。
すなわち、 本発明は、
( i ) 本発明の抗体と、 被検液および標識化された本発明のペプチドとを競合 的に反応させ、 該抗体に結合した標識化された本発明のぺプチドの割合を測定 することを特徴とする被検液中の本発明のぺプチドの定量法、 および
(ϋ)'被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の 別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の 活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のぺプチドの定量法を提供 する。 '
上記 (ii) の定量法においては、 一方の抗体が本発明のペプチドの N端部を 認識する抗体で、 他方の抗体が本発明のぺプチドの C端部に反応する抗体であ ることが望ましい。
また、 本発明のペプチドに対するモノクローナル抗体を用いて本発明のぺプ チドの定量を行うことができるほか、 組織染色等による検出を行なうこともで きる。 これらの目的には、 抗体分子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子 の F ( a b ' )2、 F a b '、 あるいは F a b画分を用いてもょレ、0
本発明の抗体を用いる本発明のぺプチドの定量法は、 特に制限されるべきも のではなく、 被測定液中の抗原量 （例えば、 ペプチド量） に対応した抗体、 抗 原もしくは抗体一抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、 こ れを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法 であれば、 いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメトリー、競合法、 ィムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、 感度、 特異 性の点で、 後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射性同位 元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、 例えば、 〔125 I〕 、 〔131 I〕 、 〔3 H〕 、 ひ4 C〕 などが用いられる。 上記酵素 としては、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 —ガラクトシダ ーゼ、 β一グノレコシダーゼ、 ァノレ力リフォスファターゼ、 パーォキシダーゼ、 リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。 蛍光物質としては、 例えば、 フルォレ スカミン、 フルォレツセンイソチオシァネートなどが用いられる。 発光物質と しては、 例えば、 ノレミノーノレ、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニン などが用いられる。 さらに、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にピオチン一 アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化にあたっては、 物理吸着を用いてもよく、 また通 常ペプチドあるいは酵素等を不溶化、 固定ィ匕するのに用いられる化学結合を用 いる方法でもよい。 担体としては、 ァガロース、 デキス トラン、 セルロースな どの不溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合成樹 脂、 あるいはガラス等があげられる。
サンドィツチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検波 を反応させ （1次反応） 、 さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体 を反応させ （2次反応） たのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定すること により被検液中の本発明のペプチド量を定量することができる。 1次反応と 2 次反応は逆の順序に行っても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらして 行なってもよ!/、。 標識化剤およぴ不溶化の方法は前記のそれらに準じることが できる。 また、 サンドイッチ法による免疫測定法において、 固相用抗体あるい' は標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感度 を向上させる等の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドィツチ法による本発明のぺプチドの測定法においては、 1次 反応と 2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、 本発明のぺプチ ドの結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 すなわち、 1次反応 および 2次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体が、 本発明のペプチドの C端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は、 好 ましくは C端部以外、 例えば Ν端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナノレ抗体をサンドィツチ法以外の測定システム、 例えば、 競合法、 ィムノメ トリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができ る。 '
競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させ たのち、 未反応の標識抗原（F ) と、 抗体と結合した標識抗原 （B ) とを分離し ( B / F分離） 、 B， Fいずれかの標識量を測定し、 被検液中の抗原量を定量 する。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 B / F分離をポリエチレ ングリコール、 前記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、 第 1 抗体として固相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用い 第 2抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
ィムノメ トリック法では、 被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化 抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離する力、 あるいは、 被検液中 の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標 識化抗体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの 相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメ トリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生 じた不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の 沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメ ト リーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、 特別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の 条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のぺプチドの測定系 を構築すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書 などを参照することができる。
例えば、入江 寛編「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 4 9年発行） 、 入江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 5 4年発行） 、 石川栄 治ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 5 3年発行） 、 石川栄治ら編 「酵 素免疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 5 7年発行） 、 石川栄治ら編 「酵 素免疫測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭和 6 2年発行） 、 「Methods in ENZYM0L0GY」 Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A) )、 同書 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B) )、 |R]書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C) )、 同瞢 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D · Selected Immunoassays) )、 同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E： Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods) )、 同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I： Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies) ) (以上、 ァカデミックプレス社発行）などを参照することができる。 以上のようにして、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明のペプチド を感度良く定量することができる。
さらに、 本発明の抗体を用いて本発明のペプチドの濃度を定量することによ つて、 本発明のペプチドの濃度の減少が検出された場合、 例えば、 本発明のぺ プチドの機能不全に関連する疾患である、 または将来罹患する可能性が高いと 診断することができる。
また、 本発明のペプチドの濃度の増加が検出された場合には、 例えば、 本発 明のペプチドの過剰発現に起因する疾患である、 または将来罹患する可能性が 高いと診断することができる。
本発明のペプチドの機能不全に関連する疾患としては、 例えば、 低アルドス テロン症、 低コルチゾール血症、 続発性または慢性副腎皮質機能低下症、 アジ ソン病、 副腎機能不全、 痛み、 肥満、 男性性腺機能不全、 造精機能障害に伴う 男子不妊症、 再生不良性貧血、 骨髄線維症、 腎性貧血、 末期女性性器癌の疼痛 緩和、 乳癌 （例、 手術不能乳癌） 、 乳腺症、 乳腺腫瘍、 女性化乳房などが挙げ られる。
本発明のペプチドの過剰発現に起因する疾患としては、 例えば、 クッシング 病、 クッシング症候群、 副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、 C R H産生腫 瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、 先天性副腎酵素欠乏症、 ストレス、 うつ病、 神経性食欲不振症、 不眠、 胃 -十 二指腸潰瘍、 過敏性腸症候群、 陰茎肥大、 精巣萎縮、 精巣機能異常 （例、 精子 減少） 、 月経異常、 多毛、 色素沈着、 嗄声、 過敏症、 坐瘡、 悪心、 嘔吐、 消化 器系症状 （例、 食欲不振） 、 満月様顔貌などが挙げられる。
また、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する本発明のぺプ チドを検出するために使用することができる。 また、 本発明のペプチドを精製 するために使用する抗体カラムの作製、 精製時の各分画中の本発明のペプチド の検出、 被検細胞内における本発明のペプチドの挙動の分析などのために使用 することができる。
( 4 ) 遺伝子診断剤
本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、 例えば、 プローブとして使用することにより、 ヒ トまたは温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモッ ト、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネ コ、 ィヌ、 サル、 など） における本発明のペプチドをコードする D NAまたは m R NAの異常 （遺伝子異常） を検出することができるので、 例えば、 該 D N Aまたは m R N Aの損傷、 突然変異あるいは発現低下や、 該 D NAまたは mR N Aの增加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。
本発明のポリヌクレオチドまたは本発明の了ンチセンスポリヌクレオチドを 用いる上記の遺伝子診断は、 例えば、 自体公知のノーザンハイブリダィゼーシ ヨンや P C R— S S C P法 (ゲノミックス (Genomics) ， 第 5卷， 8 7 4〜 8 7 9頁 （1 9 8 9年） 、 プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·ァ力デミ 一 ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ 'ユーエスエー (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America) ， 第 8 6 , 2 7 6 6〜2 7 7 0頁 （1 9 8 9年） ) などにより実施することができる。
例えば、 ノーザンハイブリダィゼーシヨンにより発現低下が検出された場合 は、 例えば、 本発明のペプチドの機能不全に関連する疾患である可能性が高い または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、 ノーザンハイプリダイゼーシヨンにより発現過多が検出された場合は、 例えば、 本発明のぺプチドの過剰発現に起因する疾患である可能性が高いまた は将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
本発明のペプチドの発現低下に起因する疾患としては、 例えば、 低アルドス テロン症、 低コルチゾール血症、 続発性または慢性副腎皮質機能低下症、 アジ ソン病、 副腎機能不全、 痛み、 肥満、 男性性腺機能不全、 造精機能障害に伴う 男子不妊症、 再生不良性貧血、 骨髄線維症、 腎性貧血、 末期女性性器癌の疼痛 緩和、 乳癌 （例、 手術不能乳癌） 、 乳腺症、 乳腺腫瘍、 女性化乳房などが挙げ られる。
本発明のペプチドの過剰発現に起因する疾患としては、 例えば、 クッシング 病、 クッシング症候群、 副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体 S重瘍、 C R H産生腫 瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、 先天性副腎酵素欠乏症、 ス トレス、 うつ病、 神経性食欲不振症、 不眠、 胃 · + 二指腸潰瘍、 過敏性腸症候群、 陰茎肥大、 精巣萎縮、 精巣機能異常 （例、 精子 減少） 、 月経異常、 多毛、 色素沈着、 嗄声、 過敏症、 坐瘡、 悪心、 嘔吐、 消化 器系症状 （例、 食欲不振） 、 満月様顔貌などが挙げられる。
( 5 ) アンチセンスポリヌクレオチドを含有する医薬
本発明のポリヌクレオチド （例、 D NA) に相補的に結合し、 該ポリヌクレ ォチド （例、 D N A) の発現を抑制することができる本発明のアンチセンスポ リヌクレオチドは低毒性であり、 生体内における本発明のレセプター蛋白質ま たは本発明のポリヌクレオチド （例、 D NA) の機能を抑制することができる ので、 例えば、 本発明のペプチドの過剰発現に起因する疾患の予防 ·治療剤と して用いることができる。
具体的には、 本発明の D N Aに対するアンチセンスポリヌクレオチド （例、 アンチセンス D N A) は、 本発明のペプチドの機能を阻害することができるの で、副腎皮質ホルモン分泌調節剤、好ましくは副腎皮質ホルモン分泌阻害剤（副 腎皮質ホルモン分泌抑制剤） として有用である。 さらに、 本発明の D NAに対 するアンチセンスポリヌクレオチドは、 クッシング病、 クッシング症候群、 副 腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、 C R H産生腫瘍、 アルドステロン産生腫 瘍、 アルドステロン症、 原発性コルチゾール抵抗症、 先天性副腎酵素欠乏症、 ス トレス、 うつ病、 神経性食欲不振症、 不眠、 胃 ·十二指腸潰瘍、 過敏性腸症 候群などの予防 ·治療剤として有用である。 また、 本発明の D N Aに対するアンチセンスポリヌクレオチド （例、 アンチ センス D N A) は、 安全で低毒性な男性ホルモン分泌調節剤、 好ましくは男性 ホルモン分泌阻害剤 （男性ホルモン分泌抑制剤） として有用である。 さらに、 本発明の D N Aに対するァ チセンスポリヌクレオチドは、 例えば、 男性性腺 機能不全、 造精機能障害に伴う男子不妊症、 再生不良性貧血、 骨髄線維症、 腎 性貧血、 末期女性性器癌の疼痛緩和、 乳癌 （例、 手術不能乳癌） 、 乳腺症、 乳 腺腫瘍、 女性ィ匕乳房などの予防 ·治療剤として有用である。
上記アンチセンスポリヌクレオチドを上記の治療 ·予防剤として使用する場 合は、 該アンチセンスポリヌクレオチドを、 上記した本発明のポリヌクレオチ ドの場合と同様にして製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は低毒性であり、 ヒ トまたは哺乳動物 （例、 ラ ット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して経口的 または非経口的に投与することができる。
なお、 該アンチセンスポリヌクレオチドは、 そのままで、 あるいは摂取促進 用の捕助剤などの生理学的に認められる担体とともに、 遺伝子銃やハイドロゲ ルカテーテルのようなカテーテルによって投与することもできる。
該アンチセンスポリヌクレオチドの投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ル ートなどにより異なるが、 例えば、 癌の治療の.目的で本発明のアンチセンスヌ クレオチドを臓器 （例、 肝臓、 肺、 心臓、 腎臓など） に局所投与する場合、 成 人 （体重 6 0 k g ) に対して、 一日あたり約 0 . 1〜：！ O O m gである。
さらに、 該アンチセンスポリヌクレオチドは、 組織や細胞における本発明の D NAの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプロ一 ブとして使用することもできる。
本発明は、 さらに
①本発明のペプチドをコードする R N Aの一部とそれに相補的な R N Aとを含 有する二重鎖 R NA、
②前記二重鎖 R NAを含有してなる医薬、
③本発明のぺプチドをコ一ドする R N Aの一部を含有するリボザィム、 ④前記リボザィムを含有してなる医薬を提供する。
これらの二重鎖 R N A (RNAi； RNA interference法） 、 リボザィムなどは、 上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、本発明のポリヌクレオチド（例、 D N A) の発現を抑制することができ、 生体内における本発明のペプチドまた はそれをコードする本発明のポリヌクレオチド （例、 D N A) の機能を抑制す ることができるので、 例えば、 副腎皮質ホルモン分泌調節剤、 好ましくは副腎 皮質ホルモン分泌阻害剤 （副腎皮質ホルモン分泌抑制剤） として有用である。 さらに、 これらの二重鎖 R N A、 リボザィムなどは、 クッシング病、 クッシン グ症候群、 副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、 C R H産生腫瘍、 アルドス テロ'ン産生腫瘍、 アルドステロン症、 原発性コルチゾール抵抗症、 先天性副腎 酵素欠乏症、 ストレス、 うつ病、神経性食欲不振症、 不眠、 胃 ·十二指腸潰瘍、 ' 過敏性腸症候群などの予防 ·治療剤として有用である。
また、 これらの二重鎖 R N A、 リボザィムなどは、 安全で低毒性な男性ホル モン分泌調節剤、 好ましくは男性ホルモン分泌阻害剤 （男性ホルモン分泌抑制 剤） として有用である。 さらに、 これらの二重鎖 R N A、 リポザィムなどは、 例えば、男性性腺機能不全、造精機能障害に伴う男子不妊症、再生不良性貧血、 骨髄線維症、腎性貧血、末期女性性器癌の疼痛緩和、乳癌（例、手術不能乳癌）、 乳腺症、 乳腺腫瘍、 女性ィヒ乳房などの予防 ·治療剤として有用である。
二重鎖 R NAは、 公知の方法 （例、 Nature, 411卷， 494頁， 2001年） に準じ て、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。 リボザィムは、 公知の方法 （例、 TRENDS in Molecular Medicine, 7卷， 221 頁， 2001年） に準じて、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造 することができる。 例えば、 本発明のペプチドをコードする R N Aの一部に公 知のリポザィムを連結することによつて製造することができる。 本発明のぺプ チドをコードする R N Aの一部としては、 公知のリボザィムによって切断され 得る本発明の R N A上の切断部位に近接した部分（R N A断片）が挙げられる。 上記の二重鎖 R N Aまたはリボザィムを上記予防 ·治療剤として使用する場 合、 アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、 投与することがで きる。
( 6 ) 本発明の抗体を含有する医薬
本発明のぺプチドの活性を中和する作用を有する本発明の抗体は、 例えば、 本発明のぺプチドの過剰発現に起因する疾患などの予防 ·治療薬などの医薬と して使用することができる。
具体的には、 本発明のペプチドに対する抗体 （例、 中和抗体） は、 本発明の ペプチドの機能を阻害することができるので、 副腎皮質ホルモン分泌調節剤、 好ましくは副腎皮質ホルモン分泌阻害剤 （副腎皮質ホルモン分泌抑制剤） とし て有用である。 さらに、 本発明のペプチドに対する抗体 （例、 中和抗体） は、 クッシング病、 クッシング症候群、 副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、 C R H産生腫瘍、 アルドステロン産生腫瘍、 アルドステロン症、 原発性コルチゾ ール抵抗症、 先天性副腎酵素欠乏症、 ストレス、 うつ病、 神経性食欲不振症、 不眠、 胃 ·十二指腸潰瘍、 過敏性腸症候群などの予防。治療剤として有用であ る。
また、 本発明のペプチドに対する抗体 （例、 中和抗体） は、 安全で低毒性な 男性ホルモン分泌調節剤、 好ましくは男性ホルモン分泌阻害剤 （男性ホルモン 分泌抑制剤） として有用である。 さらに、 本発明のペプチドに対する抗体は、 例えば、男性性腺機能不全、造精機能障害に伴う男子不妊症、再生不良性貧血、 骨髄線維症、腎性貧血、末期女性性器癌の疼痛緩和、乳癌（例、手術不能乳癌）、 乳腺症、 乳腺月重瘍、 女性ィヒ乳房などの予防 ·治療剤として有用である。
本発明の抗体を含有する上記疾患の治療 ·予防剤は、 そのまま液剤として、 または適当な剤型の医薬組成物として、 ヒトまたは哺乳動物 （例、 ラット、 ゥ サギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して経口的または非 経口的に投与することができる。 投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与 ルートなどによっても異なるが、 例えば、 成人に使用する場合には、 本発明の 抗体を 1回量として、 通常 0 . 0 1〜2 0 m g / k g体重程度、 好ましくは 0 . l〜1 0 m g / k g体重程度、 さらに好ましくは 0 . l〜5 m g / k g体重程度 を、 1日 1〜 5回程度、 好ましくは 1日 1〜 3回程度、 静脈注射により投与す るのが好都合である。 他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量 を投与することができる。 症状が特に重い場合には、 その症状に応じて增量し てもよい。
本発明の抗体は、 それ自体または適当な医薬組成物として投与することがで きる。 上記投与に用いられる医薬組成物は、 上記またはその塩と薬理学的に許 容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、 経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
すなわち、 例えば、 経口投与のための組成物としては、 固体または液体の剤 形、 具体的には錠剤 （糖衣錠、 フィルムコーティング錠を含む） 、 丸剤、 顆粒 剤、 散剤、 カプセル剤 （ソフトカプセノレ剤を含む） 、 シロップ剤、 乳剤、 懸撣 剤などがあげられる。 かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、 製剤 分野において通常用いられる担体、 希釈剤もしぐは賦形剤を含有するものであ る。 例えば、 錠剤用の担体、 賦形剤としては、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステア リン酸マグネシウムなどが用いられる。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、 注射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射剤など の剤形を包含する。 かかる注射剤は、 自体公知の方法に従って、 例えば、 上記 抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、 懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、 適当な 溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン界面活性剤 〔例、 ポリソルベート 8 0、 H C O— 5 0 (polyoxyethylene ( 5 0 mol) adduct of hydrogenated castor oil)〕 などと併用してもよい。 油性液としては、例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジ ルアルコールなどを併用してもよい。 調製された注射液は、 通常、 適当なアン プルに充填される。 直腸投与に用いられる坐剤は、 上記抗体またはその塩を通 常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。 上記の経口用または非経口用医薬組成物は、 活 1·生成分の投与量に適合するよ うな投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。 かかる投薬単位の剤形 としては、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 (アンプル) 、 坐剤などが例示さ れ、 それぞれの投薬単位剤形当たり通常 5〜500mg、 とりわけ注射剤では 5〜1 00mg、 その他の剤形では 1 0〜2 50mgの上記抗体が含有されて いることが好ましい。
なお前記した各組成物は、 上記抗体との配合により好ましくない相互作用を 生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
(7) 各種薬物の作用メカュズムの解明方法
AQ 2 7受容体を用いることによって、 各種薬物が AQ 2 7受容体を介して
•薬理効果を発揮しているか否かを確認することができる。
すなわち、 本発明は、
(1) AQ 27受容体を用いることを特徴とする、 （i ) 副腎皮質ホルモン 分泌促進薬、 （ii) 低アルドステロン症、 低コルチゾール血症、 続発性または 慢性副腎皮質機能低下症、 アジソン病、 副腎機能不全、 痛み、 肥満などの予防 •治療薬、 （iii) 男性ホルモン分泌促進薬、 （iv) 男性性腺機能不全、 造精機 能障害に伴う男子不妊症、 再生不良性貧血、 骨髄線維症、 腎性貧血、 末期女性 十生器癌の疼痛緩和、 乳癌 （例、 手術不能乳癌） 、 乳腺症、 乳腺腫瘍、 女性化乳 房などの予防 ·治療薬、 （V ) 副腎皮質ホルモン分泌阻害薬 （副腎皮質ホルモ ン分泌抑制薬） 、 （vi) クッシング病、 クッシング症候群、 副腎皮質刺激ホル モン産生下垂体腫瘍、 CRH産生腫瘍、 アルドステロン産生腫瘍、 アルドステ ロン症、 原発性コルチゾール抵抗症、 先天性副腎酵素欠乏症、 ス トレス、 うつ 病、 神経性食欲不振症、 不眠、 胃 ·十二指 θ募潰瘍、 過敏性腸症候群などの予防 •治療薬、 （Vii) 男性ホルモン分泌阻害薬 （男性ホルモン分泌抑制薬） 、 また' は （viii) 陰茎肥大、 精巣萎縮、 精巣機能異常 （例、 精子減少） 、 月経異常、 多毛、 色素沈着、 嗄声、 過敏症、 坐瘡、 悪心、 嘔吐、 消化器系症状 （例、 食欲 不振） 、 満月様顔貌などの予防 ·治療薬が AQ 2 7受容体に結合することを確 認する方法、
(2) AQ 2 7受容体を用いることを特徴とする、 （i ) 副腎皮質ホルモン 分泌促進薬、 （ii) 低アルドステロン症、 低コルチゾール血症、 続発性または 慢性副腎皮質機能低下症、 アジソン病、 副腎機能不全、 痛み、 肥満などの予防 •治療薬、 （iii) 男性ホルモン分泌促進薬、 または （iv) 男性性腺機能不全、 • 造精機能障害に伴う男子不妊症、 再生不良性貧血、 骨髄線維症、 腎性貧血、 末 期女性性器癌の疼痛緩和、 乳癌 （例、 手術不能乳癌） 、 乳腺症、 乳腺腫瘍、 女 性化乳房などの予防 ·治療薬が A Q 2 7受容体に対するァゴニストであること を確認する方法、
( 3 ) A Q 2 7受容体を用いることを特徴とする、 （i ) 副腎皮質ホルモン 分泌阻害薬 （副腎皮質ホルモン分泌抑制薬） 、 （ii) クッシング病、 クッシン グ症候群、 副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、 C R H産生腫瘍、 アルドス テロン産生腫瘍、 アルドステロン症、 原発性コルチゾール抵抗症、 先天性副腎 酵素欠乏症、 ストレス、 うつ病、神経性食欲不振症、 不眠、 胃，十二指腸潰瘍、 過敏性腸症候群などの予防 ·治療薬、 （iii) 男性ホルモン分泌阻害薬 （男性ホ ルモン分泌抑制薬） 、 または （iv) 陰茎肥大、 精巣萎縮、 精巣機能異常 （例、 精子減少） 、 月経異常、 多毛、 色素沈着、 嗄声、 過敏症、 坐瘡、 悪心、 嘔吐、 消化器系症状 （例、 食欲不振） 、 満月様顔貌などの予防 ·治療薬が A Q 2 7受 容体に対するアンタゴニストであることを確認する方法、
( 4 ) 各薬を A Q 2 7受容体に接触させた場合における、 各薬と A Q 2 7受 容体との結合量を測定することを特徴とする上記 （1 ) 〜 （3 ) 記載のスクリ 一エング方法を提供する。
この確認方法は、 前記した本発明のぺプチドと A Q 2 7受容体との結合性を 変化させる化合物のスクリーニング方法において、 試験化合物に代えて、 上記 の薬物を使用することによつて実施することができる。
また、 本発明の確認、方法用キットは、 前記した本発明のペプチドと A Q 2 7 受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング用キットにおいて、 試 験化合物に代えて、 上記の薬物を含有するものである。
このように、 本発明の確認方法を用いることによって、 巿販または開発途中 の各種薬物が A Q 2 7受容体を介して薬理効果を発揮していることを確認する ことができる。 (8) DNA転移動物
本発明は、 外来性の本発明のペプチドをコードする DN A (以下、 本発明の 外来性 DNAと略記する） またはその変異 DNA (本発明の外来性変異 DNA と略記する場合がある） を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
( i ) 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒト哺乳動物、
(ii) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （i) 記載の動物、
(iii) ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第 （ii) 記載の動物、 および
(iv) 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを含有し、 哺乳動物におい て発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒト'哺乳動物 （以下、 本発明の DN A転移動物と略記する） は、 未受精卵、 受精卵、 精子おょぴその 始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、 好ましくは、 非ヒト哺乳動物の発生に おける胚発生の段階 （さらに好ましくは、 単細胞または受精卵細胞の段階でか つ一般に 8細胞期以前） に、 リン酸カルシウム法、 電気パルス法、 リボフェク シヨン法、 凝集法、 マイクロインジェクション法、 パーティクルガン法、 DE A E—デキストラン法などにより目的とする DNAを転移することによって作 出することができる。 また、 該 DNA転移方法により、 体細胞、 生体の臓器、 組織細胞などに目的とする本発明の外来性 DNAを転移し、 細胞培養、 組織培 養などに利用することもでき、 さらに、 これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公 知の細胞融合法により融合させることにより本発明の DN A転移動物を作出す ることもできる。
非ヒト哺乳動物としては、 例えば、 ゥシ、 プタ、 ヒッジ、 ャギ、 ゥサギ、 ィ ヌ、 ネコ、 モルモット、 ノ、ムスター、 マウス、 ラットなどが用いられる。 なか でも、 病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的 短く、 また、 繁殖が容易なゲッ歯動物、 とりわけマウス （例えば、 純系として、 C 57 BL/6系統， DBA 2系統など、 交雑系として、 B 6 C 3 F ^系銃, B D F ,系統, B 6 D 2 F j系統, B ALB/c系統， I CR系統など) またはラ ット （例えば、 Wi s t!a r， SDなど） などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる糸且換えベクターにおける「哺乳動物」 としては、 上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
本発明の外来性 DNAとは、 非ヒト哺乳動物が本来有している本発明の DN Aではなく、 いったん哺乳動物から単離。抽出された本発明の DNAをいう。 本発明の変異 DNAとしては、 元の本発明の DNAの塩基配列に変異 （例え ば、 突然変異など） が生じたもの、 具体的には、 塩基の付加、 欠損、 他の塩基 への置換などが生じた DNAなどが用いられ、 また、 異常 DNAも含まれる。 該異常 DNAとしては、 異常な本発明のペプチドを発現させる DNAを意味 し、 例えば、 正常な本発明のペプチドの機能を抑制するペプチドを発現させる DN Aなどが用いられる。
本発明の外来性 DNAは、 対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺 乳動物由来のものであってもよい。 本発明の DNAを対象動物に転移させるに あたっては、 該 DN Aを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合し た DNAコンストラク トとして用いるのが一般に有利である。 例えば、 本発明 のヒト DNAを転移させる場合、 これと相同性が高い本発明の DNAを有する 各種哺乳動物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラッ ト、 マウスなど） 由来の DNAを発現させうる各種プロモーターの下流に、 本 発明のヒト DNAを結合した DNAコンス下ラクト （例、 ベクターなど） を対 象哺乳動物の受精卵、 例えば、 マウス受精卵へマイクロインジェクションする ことによって本発明の DNAを高発現する D N A転移哺乳動物を作出すること ができる。
本発明のペプチドの発現ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド、 枯草 菌由来のプラスミド、 酵母由来のプラスミド、 えファージなどのバタテリオフ ァージ、 モロニ一白血病ウィルスなどのレトロウイルス、 ワクシニアウィルス またはバキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。 なかでも、 大 腸菌由来のプラスミ ド、 枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミド などが好ましく用いられる。 ' 上記の DNA発現調節を行なうプロモーターとしては、 例えば、 ①ウィルス (例、 シミアンウィルス、 サイ トメガロウィルス、 モロニ一白血病ウィルス、 J Cウィルス、 乳癌ウィルス、 ポリオウイルスなど） に由来する DNAのプロ モーター、 ②各種哺乳動物 （ヒ ト、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモッ ト、 ハムス ター、 ラット、 マウスなど） 由来のプロモーター、 例えば、 アルブミン、 イン スリン I I、 ゥロプラキン I I、 エラスターゼ、 エリスロポエチン、 エンドセ リン、 筋クレアチンキナーゼ、 グリア線維性酸性蛋白質、 ダルタチオン S—ト ランスフェラーゼ、 血小板由来成長因子 /3、 ケラチン K 1 , 1 0ぉょび 1 4、 コラーゲン I型および I I型、 サイクリック AMP依存蛋白質キ^ "一ゼ ]3 Iサブュニット、 ジストロフィン、 酒石酸抵抗性アル力リフォスファターゼ、 心房ナトリゥム利尿性因子、 内皮レセプターチ口シンキナーゼ （一般に T i e 2と略される） 、 ナトリウムカリウムアデノシン 3リン酸ィ匕酵素 （N a , K- ATP a s e) 、 ニューロフイラノント軽鎖、 メタロチォネィン Iおよび I I A、 メタ口プロティナーゼ 1組織インヒビター、 MHCクラス I抗原 （H— 2 L) 、 H— r a s、 レニン、 ドーパミン /3—水酸化酵素、 甲状腺ペルォキシダ ーゼ （TPO) 、 ペプチド鎖延長因子 la (EF- 1 a) 、 βァクチン、 αおよ び 0ミオシン重鎖、 ミオシン軽鎖 1および' 2、 ミエリン基礎蛋白質、 チログロ ブリン、 T h y— 1、 免疫グロブリン、 H鎖可変部 （VNP) 、 血清アミロイ ド Pコンポーネント、 ミオグロビン、 トロポニン C、 平滑筋 αァクチン、 プレ プロエンケフアリン Α、 バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。 なかでも、 全身で高発現することが可能なサイトメガロウィルスプロモーター、 ヒ トペプチド鎖延長因子 1 α (E F- 1 a) のプロモーター、 ヒ トおよぴニヮ トリ /3ァクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、 DNA転移哺乳動物において目的とするメッセンジャー R NAの転写を終結する配列 （一般にターミネータ一と呼ばれる） を有している こと 好ましく、 例えば、 ウィ^レス由来および各種哺乳動物由来の各 DN Aの 配列を用いることができ、 好ましくは、 'シミアンウィルスの SV4 0ターミネ 一ターなどが用いられる。 その他、 目的とする外来性 DNAをさらに高発現させる目的で各 DNAのス プライシングシグナル、 ェンハンサー領域、 真核 DNAのイントロンの一部な どをプロモーター領域の 5 '上流、 プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳 領域の 35下流 に連結することも目的により可能 ある。
正常な本発明のペプチドの翻訳領域は、 ヒトまたは各種哺乳動物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウスなど） 由来の 肝臓、 腎臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 DNAおよび市販の各種ゲノム DN Aライブラリーよりゲノム DNAの全てあるいは一部として、 または肝臓、 腎 臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 RNAより公知の方法により調製された相補 DN Aを原料として取得することが出来る。 また、 外来十生の異常 DN Aは、 上 記の細胞または組織より得られた正常なぺプチドの翻訳領域を点突然変異誘発 法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうる DN Aコンストラクトとして、 前 記のプロモータ一の下流およぴ所望により転写終結部位の上流に連結させる通 常の D N A工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来·生 DN Aの転移は、 対象哺乳動物の胚 芽細胞おょぴ体細胞のすべてに存在するように確保される。 DNA転移後の作 出動物の胚芽細胞において、 本発明の外来性 DN Aが存在することは、 作出動 物の後代がすべて、 その胚芽細胞おょぴ体細胞のすべてに本発明の外来性 DN Aを保持することを意味する。 本発明の外来性 DN Aを受け継いだこの種の動 物の子孫はその胚芽細胞およぴ体細胞のすべてに本発明の外来性 D N Aを有す る。
本発明の外来性正常 DNAを転移させた非ヒト哺乳動物は、 交配により外来 性 DNAを安定に保持することを確認して、 該 DNA保有動物として通常の飼 育環境で継代飼育することが出来る。'
受精卵細胞段階における本発明の外来性 D N Aの転移は、 対象哺乳動物の胚 芽細胞おょぴ体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。 DNA転移後 の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性 DN Aが過剰に存在することは、 作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 D N Aを過剰に有することを意味する。 本発明の外来性 D N Aを受け継いだこの種 の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外籴性 D N Aを過 剰に有する。
導入 D N Aを相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌 雄の動物を交配することによりすべての子孫が該 D N Aを過剰に有するように 繁殖継代することができる。 '
本発明の正常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の正常 D N Aが高発 現させられており、 内在性の正常 D N Aの機能を促進することにより最終的に 本発明のぺプチドの機能亢進症を発症することがあり、 その病態モデル動物と して利用することができる。 例えば、 本発明の正常 D N A転移動物を用いて、 本発明のぺプチドの機能亢進症や、 本発明のぺプチドが関連する疾患の病態機 序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。 また、 本発明の外来性正常 D N Aを転移させた哺乳動物は、 遊離した本発明 のぺプチドの増加症状を有すること力 ら、 本発明のぺプチドに関連する疾患に 対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、 本発明の外来性異常 D N Aを有する非ヒト哺乳動物は、 交配により外 来性 D N Aを安定に保持することを確認して該 D N A保有動物として通常の飼 育環境で継代飼育することが出来る。 さらに、 目的とする外来 D N Aを前述の プラスミドに組み込んで原料として用いることができる。 プロモーターとの D NAコンストラタ卜は、 通常の D N A工学的手法によって作製することができ る。 受精卵細胞段階における本発明の異常 D N Aの転移は、 対象哺乳動物の胚 芽細胞おょぴ体細胞の全てに存在するように確保される。 D N A転移後の作出 動物の胚芽細胞において本発明の異常 D N Aが存在することは、 作出動物の子 孫が全てその胚芽細胞おょぴ体細胞の全てに本発明の異常 D N Aを有すること を意味する。 本発明の外来性 D N Aを受け継いだこの種の動物の子孫は、 その 胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常 D N Aを有する。 導入 D N Aを相 同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌雄の動物を交配す ることによりすべての子孫が該 D NAを有するように繁殖継代することができ る。
本発明の異常 D N Aを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の異常 D N Aが高発 現させられており、 内在性の正常 D N Aの機能を阻害することにより最終的に 本発明のぺプチドの機能不活性型不応症となることがあり、 その病態モデル動 物として利用することができる。 例えば、 本発明の異常 D NA転移動物を用い て、 本発明のぺプチドの機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患 を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、 具体的な利用可能性としては、 本発明の異常 D N A高発現動物は、 本 発明のぺプチドの機能不活性型不応症における本発明の異常べプチドによる正 常ペプチドの機能阻害 （dominant negative作用） を解明するモデルとなる。 また、 本発明の外来異常 D N Aを転移させた哺乳動物は、 遊離した本発明の ぺプチドの増加症状を有することから、 本発明のぺプチドまたはの機能不活性 型不応症に対する治療薬スクリ一ユング試験にも利用可能である。
また、 上記 2種類の本発明の D NA転移動物のその他の利用可能性として、 例えば、
①組織培養のための細胞源としての使用、
②本発明の D N A転移動物の組織中の D N Aもしくは R N Aを直接分析するか、 または D N Aにより発現されたペプチド組織を分析することによる、 本発明の ぺプチドにより特異的に発現あるいは活性化するぺプチドとの関連性について の解析、
③ D N Aを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、 これらを使用 して、 一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
④上記③記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスク リーニング、 および
⑤本発明の変異べプチドを単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
さらに、 本発明の D N A転移動物を用いて、 本発明のペプチドの機能不活性 型不応症などを含む、 本発明のぺプチドに関連する疾患の臨床症状を調べるこ とができ、 また、 本発明のペプチドに関連する疾患モデルの各臓器におけるよ り詳細な病理学的所見が得られ、 新しい治療方法の開発、 さらには、 該疾患に よる二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、 本発明の D N A転移動物から各臓器を取り出し、 細切後、 トリプシン などの蛋白質分解酵素により、 遊離した D N A転移細胞の取得、 その培養また はその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。 さらに、 本発明のぺプチ ド産生細胞の特定化、 アポトーシス、 分化あるいは増殖との関連性、 またはそ れらにおけるシグナル伝達機構を調べ、 それらの異常を調べることなどができ、 本発明のぺプチドおよびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、 本発明の D N A転移動物を用いて、 本発明のペプチドの機能不活性 型不応症を含む、 本発明のぺプチドに関連する疾患の治療薬の開発を行なうた めに、 上述の検査法おょぴ定量法などを用いて、 有効で迅速な該疾患治療薬の スクリーニング法を提供することが可能となる。 また、 本発明の D NA転移動 物または本発明の外来性 D N A発現ベクターを用いて、 本発明のぺプチドが関 連する疾患の D N A治療法を検討、 開発することが可能である。
( 9 ) ノックァゥト動物
本発明は、 本発明の D NAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
( i ) 本発明の D N Aが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
(ii) 該 D NAがレポーター遺伝子 （例、 大腸菌由来の ]3—ガラクトシダーゼ 遺伝子） を導入することにより不活性化された第 （ i ) 項記載の胚幹細胞、
(iii) ネオマイシン耐性である第 （i ) 項記載の胚幹細胞、
(iv) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （i ) 項記載の胚幹細胞、
(V) ゲッ歯動物がマウスである第 （iv) 項記載の胚幹細胞、
(vi) 本発明の D NAが不活性ィヒされた該 D NA発現不全非ヒト哺乳動物、
(vii) 該 D NAがレポーター遺伝子 （例、 大腸菌由来の ]3—ガラクトシダーゼ 遺伝子） を導入することにより不活性化され、 該レポーター遺伝子が本発明の DNAに対するプロモーターの制御下で発現しうる第 （vi) 項記載の非ヒト哺 乳動物、
(viii)非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（vi)項記載の非ヒト哺乳動物、
(ix) ゲッ歯動物がマウスである第 （viii) 項記載の非ヒト哺乳動物、 および (X) 第 （vii) 項記載の動物に、 試験化合物を投与し、 レポーター遺伝子の発 現を検出することを特徴とする本発明の DN Aに対するプロモーター活性を促 進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明の DN Aが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、 該非ヒト哺 乳動物が有する本発明の DNAに人為的に変異を加えることにより、 D N Aの 発現能を抑制するか、 もしくは該 DN Aがコードしている本発明のペプチドの 活性を実質的に喪失させることにより、 DNAが実質的に本発明のぺプチドの 発現能を有さない （以下、 本発明のノックアウト DNAと称することがある） 非ヒト哺乳動物の胚幹細胞 （以下、 ES細胞と略記する） をいう。
非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の DNAに人為的に変異を加える方法としては、 例えば、 遺伝子工学 的手法により該 DN A配列の一部又は全部の削除、 他 DNAを挿入または置換 させることによって行なうことができる。 これらの変異により、 例えば、 コド ンの読み取り枠をずらしたり、 プロモーターあるいはェキソンの機能を破壌す ることにより本発明のノックァゥト DNAを作製すればよい。
本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞 （以下、 本発明の DNA不活性ィヒ E S細胞または本発明のノックァゥト ES細胞と略記する） の 具体例としては、 例えば、 目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明の DNA を単離し、 そのェキソン部分にネオマイシン耐 1"生遺伝子、 ハイグロマイシン耐 性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、 あるいは 1 a c Z ( ]3—ガラクトシダ ーゼ遺伝子) 、 c a t (クロラムフエニコールァセチルトランスフェラーゼ遺 伝子） を代表とするレポータ一遺伝子等を揷入することによりェキソンの機能 を破壊するか、 あるいはェキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結さ せる DNA配列 （例えば、 poly A付加シグナルなど） を揷入し、 完全なメッセ ンジャー RN Aを合成できなくすることによって、 結果的に遺伝子を破壊する ように構築した DNA配列を有する DNA鎖 （以下、 ターゲッティングベクタ 一と略記する） を、 例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、 得ら れた E S細胞について本発明の DN A上あるいはその近傍の DN A配列をプロ ーブとしたサザンハイプリダイゼーシヨン解析あるいはターゲッティングべク タ一上の D N A配列とターゲッティングべクタ一作製に使用した本発明の D N A以外の近傍領域の DNA配列をプライマーとした PC R法により解析し、 本 発明のノックァゥト E S細胞を選別することにより得ることができる。
また、 相同糸且換え法等により本発明の D N Aを不活化させる元の E S細胞ど しては、 例えば、 前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、 また公知 Evansと Kaufmaの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。 例えば、 マウス の ES細胞の場合、現在、一般的には 1 29系の E S細胞が使用されているが、 免疫学的背景がはっきりしていないので、 これに代わる純系で免疫学的に遺伝 的背景が明らかな E S細胞を取得するなどの目的で例えば、 C 5 7 B LZ6マ ウスや C 5 7 B LZ6の採卵数の少なさを DBA/2との交雑により改善した BDF iマウス （C 57 B LZ6と DB AZ2との F を用いて樹立したもの なども良好に用いうる。 BDF iマウスは、 採卵数が多く、 かつ、 卵が丈夫であ るという利点に加えて、 C 5 7 B LZ6マウスを背景に持つので、 これを用い て得られた E S細胞は病態モデルマウスを作出したとき、 C 5 7 B L/6マウ スとパッククロスすることでその遺伝的背景を C 5 7 B LZ 6マウスに代える ことが可能である点で有利に用い得る。
また、 E S細胞を樹立する場合、 一般には受精後 3. 5日目の胚盤胞を使用す るが、 これ以外に 8細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効 率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、 雌雄いずれの E S細胞を用いてもよいが、 通常雄の E S細胞の方が生 殖系列キメラを作出するのに都合が良い。 また、 煩雑な培養の手間を削減する ためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
E S細胞の雌雄の判定方法としては、 例えば、 PCR法により Y染色体上の 性決定領域の遺伝子を増幅、 検出する方法が、 その 1例としてあげることがで きる。 この方法を使用すれば、 従来、 核型分析をするのに約 106個の細胞数を 要していたのに対して、 1コロニー程度の ES細胞数（約 50個）で済むので、 培養初期における E S細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが 可能であり、 早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大 幅に削減できる。
また、 第二次セレクションとしては、 例えば、 G—バンディング法による染 色体数の確認等により行うことができる。 得られる E S細胞の染色体数は正常 数の 100%が望ましいが、 樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、 E S細胞の遺伝子をノックアウトした後、 正常細胞 （例えば、 マウスでは染色 体数が 2 n = 40である細胞） に再ぴクローニングすることが望ましい。' このようにして得られた胚幹細胞株は、 通常その増殖性は大変良いが、 個体 発生できる能力を失いやすいので、 注意深く継代培養することが必要である。 例えば、 S T O繊維芽細胞のような適当なフィーダ一細胞上で L I F ( 1〜 1 0000 U/ml)存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、 5%炭酸ガス、 95% 空気または 5%酸素、 5%炭酸ガス、 90%空気） で約 37 °Cで培養するなど の方法で培養し、 継代時には、 例えば、 トリプシン ZED τ A溶液 （通常 0. o
01〜0.5%トリプシン ZO. l〜5mM EDTA、 好ましくは約 0. 1%ト リブシン/ ImM EDTA) 処理により単細胞化し、 新たに用意したフィーダ —細胞上に播種する方法などがとられる。 このような継代は、 通常 1〜 3日毎 に行なうが、 この際に細胞の観察を行い、 形態的に異常な細胞が見受けられた 場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ES細胞は、 適当な条件により、 高密度に至るまで単層培養するか、 または 細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、 頭頂筋、 内臓筋、 心筋など の種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり 〔M. J. Evans及び M. H. Kaufman, ネイチヤー (Nature) 第 292卷、 154頁、 1981年； G. R. Martin プ ロシーディングス .ォブ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイエンス ·ユー エスエー (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.) 第 78卷、 7634頁、 1981年； T, C. Doetschman ら、 ジャーナノレ ·ォブ ·ェンブリオロジー 'アンド 'ェクスペリメ ンタル .モルフォロジ一、 第 87卷、 27頁、 1985年〕 、 本発明の ES細胞を分 化させて得られる本発明の D N A発現不全細胞は、 インビトロにおける本発明 のペプチドまたは本発明のレセプター蛋白質の細胞生物学的検討において有用 である。
. 本発明の DNA発現不全非ヒ ト哺乳動物は、 該動物の mRNA量を公知方法 を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、 正常動物と区別 することが可能である。 ·
該非ヒ ト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の DNA発現不全非ヒ ト哺乳動物は、 例えば、 前述のようにして作製 したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、 導入によりターゲッティングベクターの本発明の DN Aが不活性ィ匕された DN A配列が遺伝子相同組換えにより、 マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色 体上の本発明の DNAと入れ換わる相同組換えをさせることにより、 本発明の DNAをノックアウトさせることができる。
本発明の DN Aがノックァゥトされた細胞は、 本発明の DN A上またはその 近傍の D N A配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析または ターゲッティングべクタ一上の D N A配列と、 ターゲッティングベタターに使 用したマウス由来の本発明の DNA以外の近傍領域の DNA配列とをプライマ —とした PCR法による解析で判定することができる。 非ヒト哺乳動物胚幹細 胞を用いた場合は、 遺伝子相同組換えにより、 本発明の DNAが不活性化され た細胞株をクローニングし、 その細胞を適当な時期、 例えば、 8細胞期の非ヒ ト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、 作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒ ト哺乳動物の子宮に移植する。 作出された動物は正常な本発明の DN A座をも つ細胞と人為的に変異した本発明の DN A座をもつ細胞との両者カゝら構成され るキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明の DN A座をもつ場合、 こ のようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、 全 ての組織が人為的に変異を加えた本発明の D N A座をもつ細胞で構成された個 体を、 例えば、 コートカラーの判定等により選別することにより得られる。 こ のようにして得られた個体は、 通常、 本発明のペプチドのヘテロ発現不全個体 であり、 本発明のペプチドのヘテロ発現不全個体同志を交配し、 それらの産仔 から本発明のぺプチドのホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、 例えば、 卵細胞核内にマイクロインジェクション 法で D N A溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に 導入したトランスジエニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、 これらのトラ ンスジエニック非ヒト哺乳動物に比べて、 遺伝子相同組換えにより本発明の D N A座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明の D N Aがノックアウトされている個体は、 交配によ り得られた動物個体も該 D N Aがノックァゥトされていることを確認して通常 の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、 該不活化 D N Aの保有する雌雄の動物を交配することにより、 該不活化 D NA を相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得しうる。 得られたホモザ ィゴート動物は、 母親動物に対して、 正常個体 1 , ホモザィゴート複数になる ような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。. ヘテロザィゴー ト動物の雌雄を交配することにより、 該不活化 D N Aを有するホモザィゴート およびへテ口ザィゴート動物を繁殖継代する。
本発明の D NAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、 非常に有用である。
また、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明のペプチドにより 誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、 本発明のぺプチドの生物活性の 不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、 これらの疾病の原因究明 及び治療法の検討に有用である。
( 9 a ) 本発明の D N Aの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療 ·予防 効果を有する化合物のスクリーニング方法 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の D NAの欠損や損傷な どに起因する疾病に対して治療 ·予防効果を有する化合物のスクリーニングに 用いることができる。
すなわち、 本発明は、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物 を投与し、 該動物の変化を観察 ·測定することを特徴とする、 本発明の D NA の欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療 ·予防効果を有する化合物また はその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明の D N A発現不全非ヒト哺 乳動物としては、 前記と同様のものがあげられる。
試験化合物および試験化合物が形成してもよい塩としては、 前記と同様のも のが用いられる。
具体的には、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物を、 試験化合物で処理 し、 無処理の対照動物と比較し、 該動物の各器官、 組織、 疾病の症状などの変 化を指標として試験化合物の治療 ·予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、 例えば、 経口投与、 静脈注 射などが用いられ、 試験動物の症状、 試験化合物の性質などにあわせて適宜選 択することができる。 また、 試験化合物の投与量は、 投与方法、 試験化合物の 性質などにあわせて適宜選択することができる。
該スクリーニング方法において、 試験動物に試験化合物を投与した場合、 該 試験動物の機能 （例えば、 副腎皮質ホルモン分泌調節活性） が約 1 0 %以上、 好ましくは約 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上上昇した場合、 該試験 化合物を上記の疾患に対して治療 ·予防効果を有する化合物として選択するこ とができる。
該スタリ一-ング方法を用いて得られる化合物は、 副腎皮質ホルモン分泌調 節剤、 好ましくは副腎皮質ホルモン分泌促進剤として有用である。 さらに、 該 スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、 低アルドステロン症、 低コル チゾール血症、 続発性または慢性副腎皮質機能低下症、 アジソン病、 副腎機能 不全、 痛み、 肥満などの予防 ·治療剤として有用である。 また、 該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、 安全で低毒性な男 性ホルモン分泌調節剤、 好ましくは男性ホルモン分泌促進剤として有用である。 さらに、 該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、 例えば、 男性性腺 機能不全、 造精機能障害に伴う男子不妊症、 再生不良性貧血、 骨髄線維症、 腎 性貧血、 末期女性性器癌の疼痛緩和、 乳癌 （例、 手術不能乳癌） 、 乳腺症、 乳 腺腫瘍、 女' ι·生化乳房などの予防 ·治療剤として有用である。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、 上記した試験化合物から 選ばれた化合物であり、 本発明のペプチドの欠損や損傷などによって引き起こ される疾患に対して治療 ·予防効果を有するので、 該疾患に対する安全で低毒 性な治療 ·予防剤などの医薬として使用することができる。 さらに、 上記スク リーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができ る。 .
該スクリ一二ング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合 物の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸、 有機酸など） や塩基 (例、 アルカリ金属など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容さ れる酸付加塩が好ましい。 このような塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢 酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン 酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスノレホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前 記した本発明のペプチドを含有する医薬と同様にして製造することができる。 このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトま たは哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどに より差異はあるが、 例えば、 該化合物を経口投与する場合、 一般的に成人患者 (体重 6 0 k gとして） においては、 一日につき該化合物を約 0 , 1〜1 0 0 m 30H160
121 g、 好ましくは約 1. 0〜 50 m g、 より好ましくは約 1 · 0〜 20 m g投与 する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾 患などによっても異なるが、例えば、該化合物を注射剤の形で通常成人患者（体 重 6 0 k gとして） に投与する場合、 一日につき該化合物を約 0. 0 1〜30 mg程度、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1
Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 60 k g当たりに換算した量を投与することができる。
(9 b) 本発明の DNAに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化 合物またはその塩のスクリ一ユング方法 ' 本発明は、本発明の DN A発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、 レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明の DNAに対する プロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニン グ方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物 としては、 前記した本発明の DNA発現不全非ヒ ト哺乳動物の中でも、 本発明 の DNAがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、 該レポータ 一遺伝子が本発明の DNAに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが 用いられる。
試験化合物および試験化合物が形成してもよい塩としては、 前記と同様のも のがあげられる。
レポーター遺伝子としては、 前記と同様のものが用いられ、 —ガラクトシ ダーゼ遺伝子 （1 a c Z) 、 可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはル シフヱラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明の D N Aをレポータ一遺伝子で置換された本発明の D N A発現不全非 ヒト哺乳動物では、 レポーター遺伝子が本発明の DNAに対するプロモーター の支配下に存在するので、 レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレー スすることにより、 プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、 本発明のぺプチドをコ一ドする DN A領域の一部を大腸菌由来の ]3 一ガラクトシダーゼ遺伝子 （1 a c Z ) で置換している場合、 本来、 本発明の ぺプチドの発現する組織で、 本発明のぺプチドの代わりに J3—ガラクトシダー ゼが発現する。 従って、 例えば、 5—プロモー 4一クロロー 3—インドリル一 ]3—ガラクトピラノシド （X— g a l ) のような ;3—ガラクトシダーゼの基質 となる試薬を用いて染色することにより、 簡便に本発明のペプチドの動物生体 内における発現状態を観察することができる。 具体的には、 本発明のペプチド 欠損マウスまたはその組織切片をダルタルアルデヒドなどで固定し、 リン酸緩 衝生理食塩液 （P B S ) で洗浄後、 X— g a 1を含む染色液で、 室温または 3 7 °C付近で、 約 3 0分ないし 1時間反応させた後、 組織標本を 1 mM E D T A ZP B S溶液で洗浄することによって、 i3—ガラクトシダーゼ反応を停止させ、 呈色を観察すればよい。 また、 常法に従い、 1 a c Zをコードする mR NAを 検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 上記した 試験化合物から選ばれた化合物またはその塩であり、 本発明の D N Aに対する プロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩である。
該スクリ一二ング方法で得られた化合物の塩としては、 生理学的に許容され る酸 （例、 無機酸など） や塩基 （例、 有機酸など） などとの塩が用いられ、 と りわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 このような塩としては、 例 えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸など） との塩、 ある いは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コ ハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） との塩などが用いられる。
本発明の D N Aに対するプロモータ一活性を促進する化合物またはその塩は、 本発明のぺプチドの発現を促進し、 該ぺプチドの機能を促進することができる ので、 例えば、 副腎皮質ホルモン分泌調節剤、 好ましくは副腎皮質ホルモン分 泌促進剤として有用である。 さらに、 本発明の D N Aに対するプロモーター活 性を促進する化合物またはその塩は、 低アルドステロン症、 低コルチゾール血 症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、 アジソン病、副腎機能不全、痛み、 肥満などの予防 ·治療剤として有用である。
また、 本発明の D N Aに対するプロモーター活性を促進する化合物またはそ の塩は、 安全で低毒性な男性ホルモン分泌調節剤、 好ましくは男性ホルモン分 泌促進剤として有用である。 さらに、 本発明の D N Aに対するプロモーター活 性を促進する化合物またはその塩は、 例えば、 男性性腺機能不全、 造精機能障 害に伴う男子不妊症、 再生不良性貧血、 骨髄線維症、 腎性貧血、 末期女性性器 癌の疼痛緩和、 乳癌 （例、 手術不能乳癌） 、 乳腺症、 乳腺腫瘍、 女性化乳房な どの予防 ·治療剤として有用である。
—方、 本発明の D N Aに対するプロモータ一活性を阻害する化合物またはそ の塩は、 例えば、 副腎皮質ホルモン分泌調節剤、 好ましくは副腎皮質ホルモン 分泌阻害剤 （副腎皮質ホルモン分泌抑制剤） として有用である。'さらに、 本発 明の D N Aに対するプロモータ一活性を阻害する化合物またはその塩は、 例え ば、 クッシング病、 クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、 C R H産生 B重瘍、 アルドステロン産生腫瘍、 アルドステロン症、 原発性コルチ ゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、 うつ病、神経性食欲不振症、 不眠、 胃 ·十二指腸潰瘍、 過敏性腸症候群などの予防 ·治療剤として有用であ る。
また、 本発明の D N Aに対するプロモータ一活性を阻害する化合物またはそ の塩は、 安全で低毒性な男性ホルモン分泌調節剤、 好ましくは男性ホルモン分 泌阻害剤 （男性ホルモン分泌抑制剤） として有用である。 さらに、 本発明の D N Aに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、 例えば、 陰 茎肥大、 精巣萎縮、 精巣機能異常 （例、 精子減少） 、 月経異常、 多毛、 色素沈 着、 嗄声、 過敏症、 坐瘡、 悪心、 嘔吐、 消化器系症状 （例、 食欲不振） 、 満月 様顔貌などの予防 ·治療剤として有用である。
さらに、 上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様 に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前 記した本発明のぺプチドまたはその塩を含有する医薬と同様にして製造するこ とができる。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトま たは哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどに より差異はあるが、 例えば、 本発明の DNAに対するプロモーター活性を促進 する化合物またはその塩を経口投与する場合、 一般的に成人患者 （体重 6 O k gとして） においては、 一日につき該化合物を約 0. 1〜1 00mg、 好ましく は約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口 的に投与する場合は、 該化合物またはその塩の 1回投与量は投与対象、 対象疾 患などによっても異なるが、 例えば、 本発明の DNAに対するプロモーター活- 性を促進する化合物またはその塩を注射剤の形で通常成人患者 (体重 6 O k g として） に投与する場合、 一日につき該化合物を約 0. 0 1〜30mg程度、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. l〜1 0mg程度 を静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 6 0 k g当たりに換算した量を投与することができる。
一方、 例えば、 本発明の DNAに対するプロモーター活性を阻害する化合物 またはその塩を経口投与する場合、 一般的に成人患者 （体重 60 k gとして） においては、 一日につき該化合物を約 0. 1〜10 0mg、 好ましくは約 1. 0 〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜 2 Omg投与する。 非経口的に投与す る場合は、 該化合物またはその塩の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによ つても異なるが、 例えば、 本発明の DNAに対するプロモーター活性を阻害す る化合物またはその塩を注射剤の形で通常成人患者 （体重 6 0 k gとして） に 投与する場合、 一日につき該化合物を約 0. 01〜3 0mg程度、 好ましくは 約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. 1〜： L 0 m g程度を静脈注射 により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 60 k g当たりに 換算した量を投与することができる。
このように、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の DNAに 対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリ 一二ングする上で極めて有用であり、 本発明の DN A発現不全に起因する各種 疾患の原因究明または予防 ·治療薬の開発に大きく貢献することができる。 また、 本発明のペプチドのプロモーター領域を含有する DNAを使って、 そ の下流に種々の蛋白質をコードする遺伝子を連結し、 これを動物の卵細胞に注 入していわゆるトランスジエニック動物 （遺伝子移入動物） を作成すれば、 特 異的にそのぺプチドを合成させ、 その生体での作用を検討することも可能とな る。 さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、 これ が発現するような細胞株を樹立すれば、 本発明のぺプチドそのものの体内での 産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作^を持つ低分子化合物の探索系と して使用できる。
AQ2 7受容体に対する抗体、 AQ 2 7受容体をコードする DN Aと相補的 な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンスポリヌクレオチド （ァ ンチセンス DNA) は、 WO 0 1/1 6 3 1 3号に記載の方法に準じて製造す ることができる。
AQ 2 7受容体、 AQ 27受容体をコードする DNA (以下、 AQ2 7受容 体 DNAと略記する場合がある） 、 AQ 2 7受容体に対する抗体 （以下、 本発 明の抗体と略記する場合がある） 、 AQ2 7受容体 D.NAに対するアンチセン ス DNA (以下、 本発明のアンチセンス DNAと略言さする場合がある） は、 以 下の用途を有している。
( 1 ) AQ 2 7受容体の機能不全に関連する疾患の予防および/または治療剤 a) AQ 2 7受容体または b) AQ 2 7受容体をコードする DNAを、 AQ 2 7受容体の機能不全に関連する疾患の予防おょぴ Zまたは治療剤などの医薬 として使用することができる。
例えば、 生体内において AQ 27受容体が減少しているために、 リガンドで ある脂肪酸の生理作用が期待できない （AQ2 7受容体の欠乏症） 患者がいる 場合に、 a) AQ 2 7受容体を該患者に投与し該 AQ 2 7受容体の量を補充し たり、 b) (ィ） AQ 2 7受容体をコードする DNAを該患者に投与し発現さ せることによって、 あるいは （口） 対象となる細胞に AQ 27受容体をコード する D N Aを挿入し発現させた後に、 該細胞を該患者に移植することなどによ つて、 患者の体内における AQ.27受容体の量を増加させ、 リガンドの作用を 充分に発揮させることができる。 すなわち、 AQ 27受容体をコードする DN Aは、 安全で低毒性な AQ 27受容体の機能不全に関連する疾患の予 および または治療剤などとして有用である。
具体的には、 AQ 27受容体または A Q 27受容体 DN Aは、 安全で低毒性 な副腎皮質ホルモン分泌調節剤、 好ましくは副腎皮質ホルモン分泌促進剤とし て有用である。 さらに、 AQ 27受容体または AQ 27受容体 DNAは、 低ァ ルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、 アジソン病、副腎機能不全、痛み、肥満などの予防，治療剤として有用である。 また、 AQ 27受容体または AQ 27受容体 DNAは、 安全で低毒性な男性 ホルモン分泌調節剤、 好ましくは男性ホルモン分泌促進剤として有用である。 さらに、 AQ 27受容体または AQ 27受容体 DNAは、 例えば、 男性性腺機 能不全、 造精機能障害に伴う男子不妊症、 再生不良性貧血、 骨髄線維症、 腎性 貧血、 末期女性性器癌の疼痛緩和、 乳癌 （例、 手術不能乳癌） 、 乳腺症、 乳腺 腫瘍、 女性化乳房などの予防 ·治療剤として有用である。
AQ 27受容体を上記予防 ·治療剤として使用する場合は、 常套手段に従つ て製剤化することができる。
一方、 AQ 27受容体 DN Aを上記予防 ·治療剤として使用する場合は、 A Q 27受容体 DNAを単独あるいはレト口ウィルスベクター、 アデノウィルス ベクター、 アデノウィルスァソシエーテツドウィルスベクターなどの適当なベ クタ一に挿入した後、 常套手段に従って実施することができる。 AQ27受容 体 DNAは、 そのままで、 あるいは摂取促進のための補助剤とともに、 遺伝子 銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
例えば、 a) AQ 27受容体または b) AQ27受容体 DNAは、 必要に応 じて糖衣を施した錠剤、 カプセル斉1』、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤など として経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無 菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例^ば、 a) A Q 2 7受容体または b) A Q 2 7受容体 D N Aを生理学的に認められる公 知の担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに 一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって 製造することができる。—これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適 当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼ ラチン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性 セルロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのよ うな膨化剤、 ステアリン酸マグネシゥムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖または サッカリンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのよう な香味剤などが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記タ ィプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のた めの無菌組成物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油な どのような 然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施 に従って処方することができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩 水、 ブドウ糖やその他の捕助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D 一マンニトール、 塩化ナトリウムなど） などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール (例、 エタノール) 、 ポリアルコール (例、 プロピレンク" リコール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン性界歯活性剤 （例、 ポリソル ペート 8 0 T M、 H C O—5 0 ) などと併用してもよレ、。 油性液としては、 例 えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いられ、 溶解補助剤である安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、 上記予防 ·治療剤は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢 酸ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロ 力ィンなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコー ルなど） 、 保存剤 (例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど) 、 酸化防 止剤などと配合してもよい。 調製された注射液は通常、 適当なアンプルに充填 される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺 乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 プタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど) に対して投与することができる。
AQ 2 7受容体の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによ り差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 成人患者 （体重 6 O k g として） においては、 一日につき約 0. 1〜 1 0 Omg、 好ましくは約 1. 0〜 50mg、 より好ましくは約 1. 0〜2 Omgである。 非経口的に投与する場 合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても 異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 成人患者 （体重 6 0 k gとし 'て） においては、 一日につき約 0. 0 1〜30mg程度、 好ましくは約 0. 1 〜 2 Omg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投 与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 6 0 k g当たりに換算した 量を投与することができる。 ' AQ 2 7受容体 DNAの投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法な どにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 成人患者 （体重 6 0 k gとして）においては、一日にっき約 0. 1〜 1 00 m g、好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与す る場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによつ ても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 成人患者 （体重' 6 O k g として） においては、一日につき約 0. 0 1〜3 Omg程度、好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により 投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 6 0 k g当たりに換算し た量を投与することができる。
(2) 遺伝子診断剤
AQ 2 7受容体 DNAおよびアンチセンス DNAは、 プローブとして使用す ることにより、 ヒトまたは哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッ ジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） における AQ 27受容体またはその 部分ペプチドをコードする DNAまたは mRNAの異常 （遺伝子異常） を検出 することができるので、 例えば、 該 DN Aまたは mRNAの損傷、 突然変異あ るレ、は発現低下や、 該 D N Aまたは m R N Aの増加あるいは発現過多などの遺 伝子診断剤として有用である。
AQ 27受容体 DNAまたはアンチセンス DNAを用いる上記の遺伝子診断 は、 例えば、 自体公知のノーザンハイブリダィゼーシヨンや PCR— S S CP 法 （ゲノミックス （Genomics) , 第 5卷， 874〜 879頁 （1 989年） 、 プロシージングズ ·ォプ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィ ス · Γプ ·ュ1 ~エスェ1 ~ (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America) , 第 86卷， 2766〜 2770頁 （19 89年） ） などにより実施することができる。
例えば、 ノーザンハイブリダイゼーションにより AQ 27受容体の発現低 下が検出された場合は、 例えば、 AQ 27受容体の機能不全に関連する疾患 である可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができ る。
また、 ノーザンハイブリダィゼーシヨンにより AQ 27受容体の発現過多が 検出された場合は、 例えば、 AQ 27受容体の過剰発現に起因チる疾患である 可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
AQ 27受容体の機能不全に関連する疾患としては、 例えば、 低アルドステ ロン症、 低コルチゾール血症、 続発性または慢性副腎皮質機能低下症、 アジソ ン病、 副腎機能不全、 痛み、 肥満、 男性性腺機能不全、 造精機能障害に伴う男 子不妊症、 再生不良性貧血、 骨髄線維症、 腎性貧血、 末期女性性器癌の疼痛緩 和、 乳癌 （例、 手術不能乳癌） 、 乳腺症、 乳腺腫瘍、 女性化乳房などが挙げら れる。
AQ 27受容体の過剰発現に起因する疾患としては、例えば、クッシング病、 クッシング症候群、 副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、 CRH産生腫瘍、 アルドステロン産生腫瘍、 アルドステロン症、 原発性コルチゾール抵抗症、 先 天性副腎酵素欠乏症、 ス トレス、 うつ病、 神経性食欲不振症、 不眠、 胃 · +二 指腸潰瘍、過敏性腸症候、陰茎肥大、精巣萎縮、精巣機能異常（例、精子減少）、 月経異常、 多毛、 色素沈着、 嗄声、 過敏症、 坐瘡、 悪心、 嘔吐、 消化器系症状 (例、 食欲不振） 、 満月様顔貌などが挙げられる。
(3) AQ 27受容体の発現量を変化させる化合物またはその塩を含有する医 薬
AQ27受容体 DNAは、 プローブとして用いることにより、 AQ27受容 体の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニングに用いることが できる。
すなわち、 本発明は、 例えば、 （i ) 非ヒ ト哺乳動物の a) 血液、 b) 特定 の臓器、 c) 臓器から単離した組織もしくは細胞、 または （ii) 形質転換体等 に含まれる AQ 27受容体の mRNA量を測定することによる、 AQ27受容 体の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
AQ 27受容体の mRNA量の測定は具体的には以下のようにして行なう。 ( i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど、 より具体的には痴呆ラ ット、 肥満マウス、 動脈硬化ゥサギ、 担癌マウスなど） に対して、 薬剤 （例え ば、 抗痴呆薬、 血圧低下薬、 抗癌剤、 抗肥満薬など） あるいは物理的ス トレス (例えば、 浸水ス トレス、 電気ショック、 明暗、 低温など） などを与え、 一定 時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓など）、 または臓器から単離した組織、 あるいは細胞を得る。
得られた細胞に含まれる AQ 27受容体の mRNAは、 例えば、 通常の方法 により細胞等から mRNAを抽出し、 例えば、 Ta qMa n PCRなどの手 法を用いることにより定量することができ、 自体公知の手段によりノーザンブ ロットを行なうことにより解析することもできる。
(ii) AQ 27受容体を発現する形質転換体を上記の方法に従い作製し、 該 形質転換体に含まれる AQ 27受容体の mRNAを同様にして定量、 解析する ことができる。
AQ 27受容体の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング は、
( i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、 薬剤あるいは物理 的ストレスなどを与える一定時間前 （3 0分前〜 2 4時間前、 好ましくは 3 0 分前〜 1 2時間前、 より好ましくは 1時間前〜 6時間前） もしくは一定時間後 ( 3 0分後〜 3日後、 好ましくは 1時間後〜 2日後、 より好ましくは 1時間後 〜 2 4時間後） 、 または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に試験化合物を投 与し、 投与後一定時間経過後 （3 0分後〜 3日後、 好ましくは 1時間後〜 2日 後、 より好ましくは 1時間後〜 2 4時間後） 、 細胞に含まれる A Q 2 7受容体 の mR N A量を定量、 解析することにより行なうことができ、
(ii)形質転換体を常 に従い培養する際に試験化合物を培地中に混合させ、 一定時間培養後 （1日後〜 7日後、 好ましくは 1日後〜 3日後、 より好ましく は 2日後〜 3日後） 、 該形質転換体に含まれる A Q 2 7受容体の m R N A量を 定量、 角军析することにより行なうことができる。
試験化合物および試験化合物が形成してもよい塩としては、 前記と同様のも のがあげられる。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 A Q 2 7受容体の発現量を変化させる作用を有する化合物またはその塩であり、 具 体的には、 （ィ） A Q 2 7受容体の発現量を増加させることにより、 A Q 2 7 受容体を介する細胞刺激活性を増強させる化合物、 （口） A Q 2 7受容体の発 現量を減少させることにより、 該細胞刺激活性を減弱させる化合物である。 本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物としては、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物などが挙げられ、 これ ら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよい。 本発明のスクリ一-ング方法を用いて得られる化合物の塩としては、 生理学 的に許容される酸 （例、 無機酸など） や塩基 （例、 有機酸など） などとの塩が 用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 この様な塩と しては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸など） と の塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレ イン酸、 コノヽク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンス ルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） との塩などが用いられる。
上記スクリーニング方法で得られる A Q 2 7受容体の発現量を変化させる化 合物またはその塩は、 安全で低毒性な副腎皮質ホルモン分泌調節剤として有用 である。
A Q 2 7受容体の発現量を増加させ、 細胞刺激活性を増強させる化合物また はその塩は、 副腎皮質ホルモン分泌調節剤、 好ましくは副腎皮質ホルモン分泌 促進剤として有用である。 さらに、 A Q 2 7受容体の発現量を増加させ、 細胞 刺激活性を増強させる化合物またはその塩は、 例えば、 低アルドステロン症、 低コルチゾール血症、 続発性または慢性副腎皮質機能低下症、 アジソン病、 副 腎機能不全、 痛み、 肥満などの予防 ·治療剤として有用である。
また、 A Q 2 7受容体の発現量を増加させ、 細胞刺激活性を増強させる化合 物またはその塩は、 安全で低毒性な男性ホルモン分泌調節剤、 好ましくは男性 ホルモン分泌促進剤として有用である。 さらに、 A Q 2 7受容体の発現量を増 加させ、 細胞刺激活性を増強させる化合物は、 例えば、 陰茎肥大、 精巣萎縮、 精巣機能異常 （例、 精子減少） 、 月経異常、 多毛、 色素沈着、 嗄声、 過敏症、 坐瘡、 悪心、 嘔吐、 消化器系症状 （例、 食欲不振） 、 満月様顔貌などの予防 · 治療剤として有用である。
一方、 A Q 2 7受容体の発現量を減少させ、 細胞刺激活性を減弱させる化合 物またはその塩は、 副腎皮質ホルモン分泌調節剤、 好ましくは副腎皮質ホルモ ン分泌阻害剤 （副腎皮質ホルモン分泌抑制剤） として有用である。 さらに、 A Q 2 7受容体の発現量を減少させ、 細胞刺激活性を減弱させる化合物またはそ の塩は、 例えば、 クッシング病、 クッシング症候群、 副腎皮質刺激ホルモン産 生下垂体腫瘍、 C R H産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、 原発性コルチゾール抵抗症、 先天性副腎酵素欠乏症、 ストレス、 うつ病、 神経 性食欲不振症、 不眠、 胃 ·十二指腸潰瘍、 過敏性腸症候群などの予防 ·治療剤 として有用である。
また、 A Q 2 7受容体の発現量を減少させ、 細胞刺激活性を減弱させる化合 物またはその塩は、 安全で低毒性な男性ホルモン分泌調節剤、 好ましくは男性 ホルモン分泌阻害剤 （男性ホルモン分泌抑制剤） として有用である。 さらに、
AQ 2 7受容体の発現量を減少させ、 細胞刺激活性を減弱させる化合物または その塩は、 例えば、 陰茎肥大、 精巣萎縮、 精巣機能異常 （例、 精子減少） 、 月 経異常、多毛、色素沈着、嗄声、過敏症、坐瘡、悪心、嘔吐、消化器系症状（例、 食欲不振） 、 満月様顔貌などの予防 ·治療剤として有用である。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を医薬組 成物として使用する場合、 常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、 該化合物またはその塩は、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセ ル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水も しくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤など の注射剤の形で非経口的に使用できる。 例えば、 該化合物を生理学的に認めら れる公知の担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などと ともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することに よって製造することができる。 これら製剤における有効成分量は指示された範 囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼ ラチン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性 セルロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのよ うな膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖または サッカリンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチヱリーのよう な香味剤などが用いられる。'調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記タ ィプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のた めの無菌組成物は注射用水のようなべヒクル中の活 I1生物質、 胡麻油、 椰子油な どのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施 に従って処方することができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩 水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D 一マンニトール、 塩化ナトリウムなど） などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール (例、 エタノール) 、 ポリアルコール (例、 プロピレンク" リコール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン性界面活性剤 （例、 ポリソル ペート 80T M、 HCO-50) などと併用してもよレ、。 油性液としては、 例 えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いられ、 溶解補助剤である安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用してもよい。 - また、 上記予防 ·治療剤は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢 酸ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩ィ匕ベンザルコニゥム、 塩酸プロ 力インなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコー ルなど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フヱノールなど） 、 酸化防 止剤などと配合してもよい。 調製された注射液は通常、 適当なアンプルに充填 される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺 乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法な どにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 成人患者 （体重 6 0 k gとして）においては、一日につき約 0. 1〜10 Omg、好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与す る場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによつ ても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 成人患者 （体重 6 O k g として） においては、一日につき約 0. 01〜3 Omg程度、好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より好ましくは約 0. 1〜： 1 Omg程度を静脈注射により 投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 60 k g当たりに換算し た量を投与することができる。
(4) AQ27受容体の定量法および診断方法
本発明の抗体は、 AQ 27受容体を特異的に認識することができるので、 被検液中の AQ 27受容体の定量、 特にサンドィツチ免疫測定法による定量 などに使用することができる。 すなわち、 本発明は、
( i ) 本発明の抗体と、 被検液おょぴ標識化された AQ 27受容体とを競合 的に反応させ、 該抗体に結合した標識化された AQ 27受容体の割合を測定 することを特徴とする被検液中の AQ 27受容体の定量法、 および
(ii) 被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明 の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識 剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の A Q 27受容体の定量法を 提供する。
上記 （ii) の定量法においては、 一方の抗体が AQ 27受容体の N端部を 認識する抗体で、 他方の抗体が AQ 27受容体の C端部に反応する抗体であ ることが望ましい。
また、 AQ27受容体に対するモノクローナル抗体を用いて AQ 27受容 体の定量を行うことができるほか、 組織染色等による検出を行なうこともで きる。 これらの目的には、 抗体分子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分 子の F (a b')2、 F a b，、 あるいは F a b画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる AQ 27受容体の定量法は、 特に制限されるべきも のではなく、 被測定液中の抗原量 （例えば、 AQ 27受容体量） に対応した 抗体、 抗原もしくは抗体一抗原複合体の量を化学的または物理的手段により 検出し、 これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算 出する測定法であれば、 いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメ トリー、 競合法、 ィムノメ トリック法およびサンドイッチ法が好適に用いら れるが、 感度、 特異性の点で、 後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好 ましい。 '
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射性同 位元素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位元素とし ては、 例えば、 〔125 I〕 、 〔131 I〕 、 〔3H〕 、 〔14C〕 などが用いられ る。 上記酵素としては、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 ーガラク トシダーゼ、 β—グノレコシダ一ゼ、 ァノレカリフォスファターゼ、 パ ーォキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、 例えば、 フルォレスカミン、 フルォレツセンィソチオシァネートなどが用い られる。 発光物質としては、 例えば、 ノレミノーノレ、 ルミノール誘導体、 ルシ フェリン、 ルシゲニンなどが用いられる。 さらに、 抗体あるいは抗原と標識 剤との結合にビォチンーアビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化にあたっては、 物理吸着を用いてもよく、 また 通常 A Q 2 7受容体あるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化 学結合を用いる方法でもよい。 担体としては、 ァガロース、 デキス トラン、 セルロースなどの不溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミ ド、 シリ コン等の合成樹脂、 あるいはガラス等があげられる。
サンドィツチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検 液を反応させ （1次反応） 、 さらに標識化した別の本発明のモノクローナル 抗体を反応させ （2次反応） たのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定す ることにより被検液中の A Q 2 7受容体量を定量することができる。 1次反 応と 2次反応は逆の順序に行っても、 また、 同時に行なってもよいし時間を ずらして行なってもよい。 標識化剤およぴ不溶化の方法は前記のそれらに準 じることができる。 また、 サンドイッチ法による免疫測定法において、 固相 用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要は なく、 測定感度を向上させる等の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いて あよレ、。
本発明のサンドイッチ法による A Q 2 7受容体の測定法においては、 1次 反応と 2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、 A Q 2 7受容 体の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 すなわち、 1次反 応および 2次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体 力 A Q 2 7受容体の C端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は、 好ましくは C端部以外、 例えば N端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドィッチ法以外の測定システム、 例え ば、 競合法、 ィムノメ トリック法あるいはネフロメ トリーなどに用いること ができる。
競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応さ せたのち、 未反応の標識抗原（F ) と、 抗体と結合した標識抗原 （B ) とを分 離し （B / F分離） 、 B， Fいずれかの標識量を測定し、 被検液中の抗原量 を定量する。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 B / F分離をポ リエチレングリコール、 前記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 お よび、 第 1抗体として固相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性 のものを用い第 2抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。 ィムノメ トリック法では、 被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識 化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離する力 あるいは、 被検 液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反 応の標識化抗体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 レ、 ずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメ トリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果 生じた不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少
/
量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフ ロメ トリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、 特別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常 の条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて A Q 2 7受容体の測定 系を構築すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書などを参照することができる。
例えば、入江 寛編「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、昭和 4 9年発行）、 入江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 5 4年発行） 、 石川 栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 5 3年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 5 7年発行） 、 石川栄治ら 編 「酵素免疫測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭和 6 2年発行） 、 「Methods in ENZYM0L0GYJ Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A) )、 同書 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B) )、 同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C) )、 同書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D ·' Selected Immunoassays) )、 ι口〗書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E： Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods) )、 同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I ： Hybridoma Technology and
Monoclonal Antibodies) ) (以上、 ァカデミックプレス社発行）などを参照する ことができる。
以上のようにして、 本発明の抗体を用いることによって、 A Q 2 7受容体 を感度良く定量することができる。
さらに、 本発明の抗体を用いて A Q 2 7受容体の濃度を定量することによ つて、 A Q 2 7受容体の濃度の減少が検出された場合、 例えば、' A Q 2 7受 容体の機能不全に関連する疾患である、 または将来罹患する可能性が高いと 診断することができる。
また、 A Q 2 7受容体の濃度の増加が検出された場合には、 例えば、 A Q 2 7受容体の過剰発現に起因する疾患である、 または将来罹患する可能性が 高いと診断することができる。
A Q 2 7受容体の機能不全に関連する疾患としては、 例えば、 低アルドステ ロン症、 低コルチゾール血症、 続発性または慢性副腎皮質機能低下症、 アジソ ン病、 副腎機能不全、 痛み、 肥満、 男性性腺機能不全、 造精機能障害に伴う男 子不妊症、 再生不良性貧血、 骨髄線維症、 腎性貧血、 末期女性性器癌の疼痛緩 和、 乳癌 （例、 手術不能乳癌） 、 乳腺症、 乳腺腫瘍、 女性化乳などが挙げられ る。
A Q 2 7受容体の過剰発現に起因する疾患としては、例えば、クッシング病、 クッシング症候群、 副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、 C R H産生腫瘍、 アルドステロン産生腫瘍、 アルドステロン症、 原発性コルチゾール抵抗症、 先 天性副腎酵素欠乏症、 ス トレス、 うつ病、 神経性食欲不振症、 不眠、 胃，十二 指腸潰瘍、過敏性腸症候、陰茎肥大、精巣萎縮、精巣機能異常（例、精子減少）、 月経異常、 多毛、 色素沈着、 嗄声、 過敏症、 坐瘡、 悪心、 嘔吐、 消化器系症状 (例、 食欲不振） 、 満月様顔貌などが挙げられる。
(5) 細胞膜における AQ 2 7受容体またはその部分ペプチドの量を変化させ る化合物またはその塩を含有する医薬'
本発明の抗体は、 AQ 2 7受容体を特異的に認識することができるので、 細 胞膜における AQ 27受容体の量を変化させる化合物またはその塩のスクリー ユングに用いることができる。
すなわち本発明は、 例えば、
( i ) 非ヒト哺乳動物の a) 血液、 b) 特定の臓器、 c) 臓器から単離した 組織もしくは細胞等を破壊した後、 細胞膜画分を単離し、 細胞膜画分に含まれ る AQ 27受容体を定量することによる、 細胞膜における AQ 2 7受容体の量 を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(ii) AQ 2 7受容体を発現する形質転換体等を破壌した後、 細胞膜画分を 単離し、 細胞膜画分に含まれる AQ 2 7受容体を定量することによる、 細胞膜 における AQ 2 7受容体の量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニン グ方法、
(iii) 非ヒト哺乳動物の a) 血液、 b) 特定の臓器、 c) 臓器から単離した 組織もしくは細胞等を切片とした後、 免疫染色法を用いることにより、 細胞表 層での該受容体蛋白質の染色度合いを定量化することにより、 細胞膜上の該蛋 白質を確認することによる、 細胞膜における AQ 2 7受容体の量を変化させる 化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
(iv) AQ 2 7受容体を発現する形質転換体等を切片とした後、 免疫染色法 を用いることにより、 細胞表層での該受容体蛋白質の染色度合 Vヽを定量化する ことにより、 細胞膜上の該蛋白質を確認することによる、 細胞膜における AQ 2 7受容体の量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供 する。
細胞膜画分に含まれる AQ 2 7受容体の定量は具体的には以下のようにして 行なう。
( i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒ ト哺乳動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど、 より具体的には痴呆ラ ット、 肥満マウス、 動脈硬化ゥサギ、 担癌マウスなど） に対して、 薬剤 （例え ば、 抗痴呆薬、 血圧低下薬、 抗癌剤、 抗肥満薬など） あるいは物理的ストレス (例えば、 浸水ストレス、 電気ショック、 明暗、 低温など） などを与え、 一定 時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓など）、 または臓器から単離した組織、 あるいは細胞を得る。 得られた臓器、 組織また は細胞等を、 例えば、 適当な緩衝液 （例えば、 トリス塩酸緩衝液、 リン酸緩衝 液、 へぺス緩衝液など） 等に懸濁し、 臓器、 組織あるいは細胞を破壌し、 界面 活性剤 （例えば、 トリ トン X I 0 0™ ,ツイーン 2 0 T Mなど） などを用い、 さらに遠心分離や濾過、 カラム分画などの手法を用いて細胞膜画分を得る。
細胞膜画分としては、 細胞を破砕した後、 それ自体公知の方法で得られる細' 胞膜が多く含まれる画分のことをいう。 細胞の破砕方法としては、 Potter— Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ワーリンダブレンダーゃポ リ トロン （Kinematica社製） のよる破枠、 超音波による破碎、 フレンチプレス などで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙 げられる。 細胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠 心力による分画法が主として用いられる。 例えば、 細胞破碎液を低速 （5 0 0 〜3 0 0 0 r p m) で短時間 （通常、 約 1〜 1 0分） 遠心し、 上清をさらに高 速 （1 5 0 0 0〜3 0 0 0 0 r p m) で通常 3 0分〜 2時間遠心し、 得られる 沈澱を膜画分とする。 該膜画分中には、 発現した A Q 2 7受容体と細胞由来の リン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
細胞膜画分に含まれる A Q 2 7受容体は、 例えば、 本発明の抗体を用いたサ ンドィツチ免疫測定法、 ウェスタンブロット解析などにより定量することがで ぎる。
かかるサンドィツチ免疫測定法は上記の方法と同様にして行なうことができ、 ウェスタンプロットは自体公知の手段により行なうことができる。
(ii) A Q 2 7受容体を発現する形質転換体を上記の方法に従い作製し、 細 胞膜画分に含まれる A Q 2 7受容体を定量することができる。 細胞膜における A Q 2 7受容体の量を変化させる化合物またはその塩のスク リーニングは、
( i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、 薬剤あるいは物理 的ストレスなどを与える一定時間前 （ 3 0分前〜 2 4時間前、 好ましくは 3 0 分前〜 1 2時間前、 より好ましくは 1時間前〜 6時間前） もしくは一定時間後 ( 3 0分後〜 3日後、 好ましくは 1時間後〜 2日後、 より好ましくは 1時間後 〜2 4時間後） 、 または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に試験化合物を投 与し、 投与後一定時間経過後 （3 0分後〜 3日後、 好ましくは 1時間後〜 2日 後、 より好ましくは 1時間後〜 2 4時間後） 、 細胞膜における A Q 2 7受容体 の量を定量することにより行なうことができ、
(ϋ)形質転換体を常法に従い培養する際に試験化合物を培地中に混合させ、 一定時間培養後 （1日後〜 7日後、 好ましぐは 1日後〜 3日後、 より好ましく は 2日後〜 3日後） 、 細胞膜における A Q 2 7受容体の量を定量することによ り行なうことができる。
細胞膜画分に含まれる A Q 2 7受容体の確認は具体的には以下のようにして 行なう。
(i i i) 正常あるいは疾患モデル非ヒ ト哺乳動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネ 3、 ィヌ、 サルなど、 より具体的には痴呆ラ ット、 肥満マウス、 動脈硬化ゥサギ、 担癌マウスなど） に対して、 薬剤 （例え ば、 抗痴呆薬、 血圧低下薬、 抗癌剤、 抗肥満薬など） あるいは物理的ス トレス (例えば、 浸水ストレス、 電気ショック、 明暗、 低温など） などを与え、 一定 時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓など）、 または臓器から単離した組織、 あるいは細胞を得る。 得られた臓器、 組織また は細胞等を、常法に従い組織切片とし、本発明の抗体を用いて免疫染色を行う。 細胞表層での該受容体蛋白質の染色度合いを定量化することにより、 細胞膜上 の該蛋白質を確認することにより、 定量的または定性的に、 細胞膜における A Q 2 7受容体の量を確認することができる。
(iv) A Q 2 7受容体を発現する形質転換体等を用いて同様の手段をとるこ とにより確認することもできる。
試験化合物および試験化合物が形成してもよい塩としては、 前記と同様のも のがあげられる。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 細胞 膜における A Q 2 7受容体の量を変化させる作用を有する化合物またはその塩 であり、 具体的には、 （ィ） 細胞膜における A Q 2 7受容体の量を増加させる ことにより、 A Q 2 7受容体を介する細胞刺激活性 （を増強させる化合物また はその塩、 （口）細胞膜における A Q 2 7受容体の量を減少させることにより、 該細胞刺激活性を減弱させる化合物またはその塩である。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物としては、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物などが挙げられ、 これ ら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよい。 該化合物の塩としては、 前記した本発明べプチドの塩と同様のものが用いら れる。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 安全 で低毒性な副腎皮質ホルモン分泌調節剤として有用である。
また、 細胞膜における A Q 2 7受容体の量を増加させることにより、 細胞刺 激活性を増強させる化合物またはその塩は、 副腎皮質ホルモン分泌調節剤、 好 ましくは副腎皮質ホルモン分泌促進剤として有用である。 さらに、 細胞膜にお ける A Q 2 7受容体の量を増加させることにより、 細胞刺激活性を増強させる 化合物またはその塩は、 低アルドステロン症、 低コルチゾール血症、 続発性ま たは慢性副腎皮質機能低下症、 アジソン病、 副腎機能不全、 痛み、 肥満などの 予防 ·治療剤として有用である。
さらに、 細胞膜における A Q 2 7受容体の量を増加させることにより、 細胞 刺激活性を増強させる化合物またはその塩は、 安全で低毒性な男性ホルモン分 泌調節剤、 好ましくは男性ホルモン分泌促進剤として有用である。 さらに、 細 胞膜における A Q 2 7受容体の量を増加させることにより、 細胞刺激活性を増 強させる化合物またはその塩は、 例えば、 男性性腺機能不全、 造精機能障害に 伴う男子不妊症、 再生不良性貧血、 骨髄線維症、 腎性貧血、 末期女性性器癌の 疼痛緩和、 乳癌 （例、 手術不能乳癌） 、 乳腺症、 乳腺腫瘍、 女性化乳房などの 予防 ·'治療剤として有用である。
一方、 細胞膜における A Q 2 7受容体の量を減少させることにより、 細胞刺 激活性を減弱させる化合物またはその塩は、 副腎皮質ホルモン分泌調節剤、 好 ましくは副腎皮質ホルモン分泌阻害剤 （副腎皮質ホルモン分泌抑制剤） として 有用である。 さらに、 細胞膜における A Q 2 7受容体の量を減少させることに より、 細胞刺激活性を減弱させる化合物またはその塩は、 クッシング病、 タツ シング症候群、 副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、 C R H産生腫瘍、 アル ドステロン産生腫瘍、 アルドステロン症、 原発性コルチゾール抵抗症、 先天性 副腎酵素欠乏症、 ストレス、 うつ病、 神経性食欲不振症、 不眠、 胃 ·十二指腸 潰瘍、 過敏性腸症候群などの予防 ·治療剤として有用である。
さらに、 細胞膜における A Q 2 7受容体の量を減少させることにより、 細胞 刺激活性を減弱させる化合物またはその塩は、 安全で低毒性な男性ホルモン分 泌調節剤、 好ましくは男性ホルモン分泌阻害剤 （男性ホルモン分泌抑制剤） と して有用である。 さらに、 細胞膜における A Q 2 7受容体の量を減少させるこ とにより、 細胞刺激活性を減弱させる化合物またはその塩は、 例えば、 陰茎肥 大、 精巣萎縮、 精巣機能異常 （例、 精子減少） 、 月経異常、 多毛、 色素沈着、 嗄声、 過敏症、 坐瘡、 悪心、 嘔吐、 消化器系症状 （例、 食欲不振） 、 満月様顔 貌などの予防 ·治療剤として有用である。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を医薬組 成物として使用する場合、 常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、 該化合物またはその塩は、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセ ル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水も しくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌 '性溶液、 または懸濁液剤など の注射剤の形で非経口的に使用できる。 例えば、 該化合物を生理学的に認めら れる公知の担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクノレ、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などと ともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することに よつて製造するととができる。 これら製剤における有効成分量は指示された範 囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼ ラチン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性 セルロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのよ うな膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖または サッカリンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのよう な香味剤などが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記タ ィプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のた めの無菌組成物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油な どのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施 に従って処方することができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩 水、 ブドウ糖やその他の捕助薬を含む等張液 （例えば、 ，D—ソルビトール、 D —マンニトール、 塩化ナトリウムなど） などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール (例、 エタノール) 、 ポリアルコール （例、 プロピレンク" リコール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン性界面活性剤 （例、 ポリソル ペート 8 0 T M、 H C O— 5 0 ) などと併用してもよい。 油性液としては、 例 えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いられ、 溶解補助剤である安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、 上記予防 ·治療剤は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢 酸ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロ 力インなど） 、 安定剤 (例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレンダリコー ルなど） 、 保存剤 (例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど) 、 酸化防 止剤などと配合してもよい。 調製された注射液は通常、 適当なアンプルに充填 される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺 乳動物 (例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法な どにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 成人患者 （体重 6 0 k gとして）においては、一日につき約 0. 1〜1 0 Omg、好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜 2 Omgである。 非経口的に投与す る場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによつ ても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 成人患者 （体重 6 O k g として） においては、一日につき約 0. 0 1〜3 Omg程度、好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により 投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 6 0 k g当たりに換算し た量を投与することができる。 .
(6) AQ 2 7受容体に対する抗体を含有してなる医薬
AQ 2 7受容体に対する抗体が中和活性を有する場合は、 該 AQ 2 7受容体 の関与するシグナル伝達、 例えば、 該 AQ 2 7受容体を介する細胞刺激活性を 不活性化することができる。
. したがって、 AQ 2 7受容体に対する抗体 （例、 中和抗体） は、 安全で低毒 性な副腎皮質ホルモン分泌調節剤、好ましくは副腎皮質ホルモン分泌阻害剤（副 腎皮質ホルモン分泌抑制剤） として有用である。 さらに、 AQ 2 7受容体に対 する抗体 （例、 中和抗体） は、 例えば、 クッシング病、 クッシング症候群、 副 腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、 CRH産生腫瘍、 アルドステロン産生腫 瘍、 アルドステロン症、 原発性コルチゾール抵抗症、 先天性副腎酵素欠乏症、 ス トレス、 うつ病、 神経性食欲不振症、 不眠、 胃 ·十二指腸潰瘍、 過敏性腸症 候群などの予防 ·治療剤として有用である。
さらに、 AQ 2 7受容体に対する抗体 （例、 中和抗体） は、 安全で低毒性な 男性ホルモン分泌調節剤、 好ましくは男性ホルモン分泌阻害剤 （男性ホルモン 分泌抑制剤） として有用である。 さらに、 AQ 2 7受容体に対する抗体 （例、 中和抗体） は、 例えば、 陰茎肥大、精巣萎縮、 精巣機能異常 （例、精子減少） 、 月経異常、 多毛、 色素沈着、 嗄声、 過敏症、 坐瘡、 悪心、 嘔吐、 消化器系症状 (例、 食欲不振） 、 満月様顔貌などの予防 ·治療剤として有用である。
(7) 本発明のアンチセンス DNAを含有してなる医薬 本発明のアンチセンス DNAは、 安全で低毒性な副腎皮質ホルモン分泌調節 剤、 好ましくは副腎皮質ホルモン分泌阻害剤 （副腎皮質ホルモン分泌抑制剤） として有用である。 さらに、 本発明のアンチセンス DNAは、 クッシング病、 クッシング症候群、 副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、 CRH産生腫瘍、 アルドステロン産生腫瘍、 アルドステロン症、 原発性コルチゾール抵抗症、 先 天性副腎酵素欠乏症、 ストレス、 うつ病、 神経性食欲不振症、 不眠、 胃 ·十二 指腸潰瘍、 過敏性腸症候群などの予防 ·治療剤として有用である。
また、 本発明のアンチセンス DN Aは、 安全で低毒性な男性ホルモン分泌調 節剤、 好ましくは男性ホルモン分泌阻害剤 （男性ホルモン分泌抑制剤） として 有用である。 さらに、 本発明のアンチセンス DNAは、 例えば、 陰茎肥大、 精' 巣萎縮、 精巣機能異常 （例、 精子減少） 、 月経異常、 多毛、 色素沈着、 嗄声、 過敏症、 坐瘡、 悪心、 嘔吐、 消化器系症状 （例、 食欲不振） 、 満月様顔貌など の予防 ·治療剤として有用である。
例えば、 該アンチセンス DNAを用いる場合、 該アンチセンス DNAを単 独あるいはレトロウイルスベクター、 アデノウイルスベクター、 アデノウィ ルスァソシェ一テッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、 常套手段に従って実施することができる。 該アンチセンス DNAは、 そのま まで、 あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体と ともに製剤化し、 遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルに よって投与できる。
さらに、 該アンチセンス DNAは、 組織や細胞における AQ 27受容体 D N Aの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプロー ブとして使用することもできる。
(8) AQ 27受容体 DN A導入動物の作製
本発明は、 外来性の AQ 27受容体 DNA (以下、 本発明の外来性 DNA と略記する） またはその変異 DN A (本発明の外来性変異 DNAと略記する 場合がある） を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、 〔1〕本発明の外来性 DN Aまたはその変異 DN Aを有する非ヒト哺乳動物、 〔2〕 非ヒト哺乳動物がグッ歯動物である第 〔1〕 記載の動物、
〔3〕 ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第 〔2〕 記載の動物、 および 〔4〕 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを含有し、 哺乳動物にお いて発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒト哺乳動物 （以 下、 AQ 27受容体 DNA転移動物と略記する） は、 未受精卵、 受精卵、 精 子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、 好ましくは、 非ヒ ト哺 乳動物の発生における胚発生の段階 （さらに好ましくは、 単細胞または受精 卵細胞の段階でかつ一般に 8細胞期以前） に、 リン酸カルシウム法、 電気パ ルス法、 リポフエクシヨン法、 凝集法、 マイクロインジェクション法、 パー ティクルガン法、 DE AE—デキストラン法などにより目的とする DNAを 転移することによって作出することができる。 また、 該 DN A転移方法によ り、 体細胞、 生体の臓器、 組織細胞などに目的とする本発明の外来性 DNA を転移し、 細胞培養、 組織培養などに利用することもでき、 さらに、 これら 細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により融合させることにより AQ27受容体 DNA転移動物を作出することもできる。
非ヒ ト哺乳動物としては、 例えば、 ゥシ、 ブタ、 ヒッジ、 ャギ、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モノレモッ ト、 ハムスター、 マウス、 ラッ トなどが用いられる。 なかでも、 病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが 比較的短く、 また、 繁殖が容易なゲッ歯動物、 とりわけマウス （例えば、 純 系として、 C 5 7 BLZ6系統， DBA 2系統など、 交雑系として、 B 6 C 系統， BDFi系統， B 6D2 Fi系統， BALB/c系統， I CR系統 など） またはラット （例えば、 Wi s t a r， SDなど） などが好ましい。 哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける 「哺乳動物」 として は、 上記の非ヒ ト哺乳動物の他にヒ トなどがあげられる。
本発明の外来性 DN Aとは、 非ヒ ト哺乳動物が本来有している AQ 27受 容体 DNAではなく、 いったん哺乳動物から単離 ·抽出された AQ 27受容 体 DNAをいう。
本発明の変異 DNAとしては、 -元の AQ 27受容体 DN Aの塩基配列に変 異 （例えば、 突然変異など） が生じたもの、 具体的には、 塩基の付加、 欠損、 他の塩基への置換などが生じた DN Aなどが用いられ、 また、 異常 DNAも 含まれる。
該異常 DNAとしては、 異常な AQ 27受容体を発現させる DNAを意味 し、 例えば、 正常な AQ 27受容体の機能を抑制する AQ 27受容体を発現 させる DN Aなどが用いられる。
本発明の外来性 DN Aは、 対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの 哺乳動物由来のものであってもよい。 AQ 27受容体 DNAを対象動物に転 移させるにあたっては、 該 DNAを動物細胞で発現させうるプロモーターの 下流に結合した DNAコンストラタ トとして用いるのが一般に有利である。 例えば、 本発明のヒ ト DNAを転移させる場合、 これと相同性が高い AQ2 7受容体 DN Aを有する各種哺 ^乳動物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モル モット、 ハムスター、 ラット、 マウスなど） 由来の DNAを発現させうる各 種プロモーターの下流に、 本発明のヒ ト DNAを結合した DNAコンストラ ク ト （例、 ベクターなど） を対象哺乳動物の受精卵、 例えば、 マウス受精卵 へマイクロインジエタションすることによって AQ 27受容体 DN Aを高発 現する D N A転移哺乳動物を作出することができる。
AQ 27受容体の発現ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミ ド、 枯草 菌由来のプラスミ ド、 酵母由来のプラスミ ド、 λファージなどのパクテリォ ファージ、 モロニ一白血病ウィルスなどのレトロウイルス、 ワクシニアウイ ルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。 なかで も、 大腸菌由来のプラスミ ド、 枯草菌由来のプラスミ ドまたは酵母由来のプ ラスミ ドなどが好ましく用いられる。
上記の DNA発現調節を行なうプロモーターとしては、 例えば、 ①ウィル ス （例、 シミアンゥイノレス、 サイ トメガロウイ 7レス、 モロニ一白血病ウイノレ ス、 J Cウィルス、 乳癌ウィルス、 ポリオウイルスなど） に由来する DNA のプロモーター、 ②各種哺乳動物 （ヒ ト、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウスなど） 由来のプロモーター、 例えば、 アルブミ ン、 ィンスリン I I、 ゥロプラキン I I、 エラスターゼ、 エリスロポエチン、 ェンドセリン、 筋クレアチンキナーゼ、 グリア線維性酸性タンパク質、 ダル タチオン S—トランスフヱラーゼ、 血小板由来成長因子 、 ケラチン K l， Κ 1 0および K 1 4、 コラーゲン I型および I I型、 サイクリック AMP依 存蛋白質キナーゼ] 3 Iサブユニット、 ジストロフィン、 酒石酸抵抗性アル力 リフォスファターゼ、 心房ナトリウム利尿性因子、 内皮レセプターチ口シン キナーゼ （一般に T i e 2と略される） 、 ナトリゥムカリゥムアデノシン 3 リン酸化酵素 （N a， K— ATP a s e) 、 ニューロフィラメント軽鎖、 メ タロチォネイン Iおよび I I A、 メタ口プロティナーゼ 1組織インヒビター、 MHCクラス I抗原 （H— 2 L) 、 H— r a s、 レニン、 ドーパミン |3—水 酸化酵素、 甲状腺ペルォキシダーゼ （TPO) 、 ペプチド鎖延長因子 1α (Ε F- l a) 、 βァクチン、 αおよぴ ミオシン重鎖、 ミオシン軽鎖 1および 2、 ミエリン基礎蛋白質、 チログロブリン、 Th y_ l、 免疫グロブリン、 H鎖可変部 （VNP) 、 血清アミロイ ド Pコンポーネント、 ミオグロビン、 トロポニン C、 平滑筋 ο;ァクチン、 プレプロエンケフアリン A、 バソプレシ ンなどのプロモーターなどが用いられる。 なかでも、 全身で高発現すること が可能なサイ トメガロウィルスプロモーター、 ヒ トぺプチド鎖延長因子 1 α (EF— 1ひ） のプロモーター、 ヒ トおよびニヮ トリ ] 3ァクチンプロモータ 一などが好適である。
上記ベクターは、 DNA転移哺乳動物において目的とするメッセンジャー RNAの転写を終結する配列 （一般にターミネータ一と呼ばれる） を有して いることが好ましく、 例えば、 ウィルス由来および各種哺乳動物由来の各 D Ν Αの配列を用いることができ、 好ましくは、 シミアンウィルスの S V40 ターミネータ一などが用いられる。
その他、 目的とする外来性 DNAをさらに高発現させる目的で各 DNAの スプライシングシグナル、 ェンハンサー領域、 真核 DN Aのイントロンの一 部などをプロモーター領域の 5 '上流、 プロモーター領域と翻訳領域間あるい は翻訳領域の 3 '下流 に連結することも目的により可能である。
正常な AQ 27受容体の翻訳領域は、 ヒ トまたは各種哺乳動物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモッ ト、 ハムスター、 ラット、 マウスなど） 由来 の肝臓、 腎臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 DN Aおよび市販の各種ゲノム DNAライブラリーよりゲノム DNAの全てあるいは一部として、 または肝 臓、 腎臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 RNAより公知の方法により調製さ れた相補 DNAを原料として取得することが出来る。 また、 外来性の異常 D NAは、 上記の細胞または組織より得られた正常な AQ 27受容体の翻訳領 域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。 該翻訳領域は転移動物において発現しうる DNAコンス トラク トとして、 前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させ る通常の DN A工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 DN Aの転移は、 対象哺乳動物の 胚芽細胞おょぴ体細胞のすべてに存在するように確保される。 DNA転移後 の作出動物の胚芽細胞において、 本発明の外来性 DN Aが存在することは、 作出動物の後代がすべて、 その胚芽細胞おょぴ体細胞のすべてに本発明の外 来性 DN Aを保持することを意味する。 本発明の外来性 DN Aを受け継いだ この種の動物の子孫はその胚芽細胞およぴ体細胞のすベてに本発明の外来性 DNAを有する。
本発明の外来性正常 DNAを転移させた非ヒト哺乳動物は、 交配により外 来性 DNAを安定に保持することを確認して、 該 DNA保有動物として通常 の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 DN Aの転移は、 対象哺乳動物の 胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在す,るように確保される。 DNA転 移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性 D N Aが過剰に存在する ことは、 作出動物の子孫が全てその胚芽細胞おょぴ体細胞の全てに本発明の 外来性 DNAを過剰に有することを意味する。 本発明の外来性 DNAを受け 継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞おょぴ体細胞の全てに本発明の外 来性 DN Aを過剰に有する。
導入 DNAを相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この 雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該 DN Aを過剰に有するよ うに繁殖継代することができる。
本発明の正常 DNAを有する非ヒ ト哺乳動物は、 本発明の正常 DNAが高 発現させられており、 内在性の正常 DN Aの機能を促進することにより最終 的に AQ 27受容体の機能亢進症を発症することがあり、 その病態モデル動 物として利用することができる。 例えば、 本発明の正常 DN A転移動物を用 いて、 AQ 27受容体の機能亢進症や、 AQ 27受容体が関連する疾患の病 態機序の解明おょぴこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能であ る。
また、 本発明の外来性正常 DNAを転移させた哺乳動物は、 遊離した AQ 27受容体の増加症状を有することから、 AQ2 7受容体に関連する疾患に 対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、 本発明の外来性異常 DNAを有する非ヒ ト哺乳動物は、 交配により 外来性 D N Aを安定に保持することを確認して該 D N A保有動物として通常 の飼育環境で継代飼育することが出来る。 さらに、 目的とする外来 DN Aを 前述のプラスミ ドに組み込んで原料として用いることができる。 プロモータ 一との DNAコンストラク トは、 通常の DN A工学的手法によって作製する ことができる。 受精卵細胞段階における本発明の異常 DNAの転移は、 対象 哺乳動物の胚芽細胞おょぴ体細胞の全てに存在するように確保される。 DN A転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常 DN Aが存在すること は、 作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体'細胞の全てに本発明の異常 DN Aを有することを意味する。 本発明の外来性 DN Aを受け継いだこの種 の動物の子孫は、 その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常 DN Aを 有する。導入 DNAを相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該 DNAを有するよう に繁殖継代することができる。
本発明の異常 DNAを有する非ヒ ト哺乳動物は、 本発明の異常 DN Aが高 発現させられており、 内在性の正常 DNAの機能を阻害することにより最終 的に AQ27受容体の機能不活性型不応症となることがあり、 その病態モデ ル動物として利用することができる。 例えば、 本発明の異常 DNA転移動物 を用いて、 AQ27受容体の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこ の疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、 具体的な利用可能性としては、 本発明の異常 DNA高発現動物は、 AQ27受容体の機能不活性型不応症における本発明の異常 AQ 27受容体 による正常 AQ 27受容体の機能阻害 （dominant negative作用） を解明する モデルとなる。
また、 本発明の外来異常 DNAを転移させた哺乳動物は、 遊離した AQ2 7受容体の増加症状を有することから、 AQ27受容体またはの機能不活性 型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、 上記 2種類の AQ 27受容体 DNA転移動物のその他の利用可能性 として、 例えば、
①組織培養のための細胞源としての使用、
② AQ 27受容体 DN A転移動物の組織中の DN Aもしくは RN Aを直接分 析するか、 または DNAにより発現された AQ 2 7受容体組織を分析するこ とによる、 AQ 27受容体により特異的に発現あるいは活性化する AQ 27 受容体との関連性についての解析、 · '
③ DNAを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、 これらを使 用して、 一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
④上記③記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のス タリ一二ング、 および
⑤本発明の変異 AQ 27受容体を単離精製おょぴその抗体作製などが考えら れる。
さらに、 AQ 27受容体 DNA転移動物を用いて、 AQ 27受容体の機能 不活性型不応症などを含む、 AQ 2 7受容体に関連する疾患の臨床症状を調 ベることができ、 また、 AQ 2 7受容体に関連する疾患モデルの各臓器にお けるより詳細な病理学的所見が得られ、 新しい治療方法の開発、 さらには、 該疾患によ'る二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、' AQ 2 7受容体 DNA転移動物から各臓器を取り出し、 細切後、 ト リプシンなどの蛋白質分解酵素により、 遊離した DN A転移細胞の取得、 そ の培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。 さらに、 A Q 2 7受容体産生細胞の特定化、 アポトーシス、 分化あるいは増殖との関連 性、 またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、 それらの異常を調べる ことなどができ、 AQ 2 7受容体おょぴその作用解明のための有効な研究材 料となる。 '
さらに、 AQ 2 7受容体 DNA転移動物を用いて、 AQ 2 7受容体の機能 不活性型不応症を含む、 AQ 2 7受容体に関連する疾患の治療薬の開発を行 なうために、 上述の検査法おょぴ定量法よどを用いて、 有効で迅速な該疾患 治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。 また、 AQ 2 7受 容体 DNA転移動物または本発明の外来性 DNA発現ベクターを用いて、 A Q 2 7受容体が関連する疾患の DNA治療法を検討、 開発することが可能で ある。
(9) ノックァゥト動物
本発明は、 AQ 2 7受容体 DN Aが不活性化された非ヒ ト哺乳動物胚幹細 胞および AQ 2 7受容体 DNA発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、 '
〔1〕 AQ 2 7受容体 DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、 〔2〕 該 DNAがレポーター遺伝子 （例、 大腸菌由来の _ガラクトシダー ゼ遺伝子） を導入することにより不活性化された第〔 1〕項記載の胚幹細胞、 〔3〕 ネオマイシン耐性である第 〔1〕 項記載の胚幹細胞、
〔4〕 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 〔1〕 項記載の胚幹細胞、 〔5〕 ゲッ歯動物がマウスである第 〔4〕 項記載の胚幹細胞、 〔6〕 AQ 27受容体 DNAが不活性化された該 DNA発現不全非ヒ ト哺乳 動物、
〔7〕 該 DNAがレポーター遺伝子 （例、 大腸菌由来の _ガラクトシダー ゼ遺伝子） を導入することにより不活性化され、 該レポーター遺伝子が AQ 27受容体 DNAに対するプロモーターの制御下で発現しうる第 〔6〕 項記 載の非ヒト哺乳動物、
〔8〕非ヒ ト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔6〕項記載の非ヒト哺乳動物、 〔9〕 ゲッ歯動物がマウスである第 〔8〕 項記載の非ヒ ト哺乳動物、 および 〔10〕 第 〔7〕 項記載の動物に、 試験化合物を投与し、 レポーター遺伝子 の発現を検出することを特徴とする AQ 2 7受容体 DN Αに対するプロ,モー ター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を 提供する。
AQ 27受容体 DN Aが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、 該 非ヒ ト哺乳動物が有する AQ 2 7受容体 DNAに人為的に変異を加えること により、 DN Aの発現能を抑制するか、 もしくは該 DN Aがコードしている AQ27受容体の活性を実質的に喪失させることにより、 DNAが実質的に AQ 27受容体の発現能を有さない （以下、 本発明のノックアウト DNAと 称することがある) 非ヒ ト哺乳動物の胚幹細胞 （以下、 E S細胞と略記する） をいう
非ヒ ト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
AQ 27受容体 DNAに人為的に変異を加える方法としては、 例えば、 遺 伝子工学的手法により該 DN A配列の一部又は全部の削除、 他 DNAを挿入 または置換させることによって行なうことができる。 これらの変異により、 例えば、 コドンの読み取り枠をずらしたり、 プロモーターあるいはェキソン の機能を破壌することにより本発明のノックァゥト DNAを作製すればよい c AQ 27受容体 DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞 （以下、 AQ 27受容体 DNA不活性化 E S細胞または本発明のノックァゥト E S細 胞と略記する） の具体例としては、 例えば、 目的とする非ヒト哺乳動物が有 する AQ 2 7受容体 DNAを単離し、 そのェキソン部分にネオマイシン耐性 遺伝子、 ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、 あるい は l a c Z (j3 _ガラクトシダーゼ遺伝子） 、 c a t (クロラムフエニコー ルァセチルトランスフェラーゼ遺伝子） を代表とするレポータ一遺伝子等を 挿入することによりェキソンの機能を破壊するか、 あるいはェキソン間のィ ントロン部分に遺伝子の転写を終結させる DNA配列 （例えば、 polyA付加 シグナルなど) を挿入し、 完全なメッセンジャー RNAを合成できなくする ことによって、 結果的に遺伝子を破壌するように構築した DN A配列を有す る DNA鎖 （以下、 ターゲッティングベクターと略記する） を、 例えば相同 組換え法により該動物の染色体に導入し、 得られた E S細胞について AQ 2 7受容体 D N A上あるいはその近傍の D N A配列をプローブとしたサザンハ イブリダィゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上の DNA配 列とターゲッティングベクター作製に使用した AQ 2 7受容体 DNA以外の 近傍領域の DNA配列をプライマーとした PCR法により解析し、 本発明の ノックァゥト E S細胞を選別することにより得ることができる。
また、 相同組換え法等により AQ 2 7受容体 DNAを不活化させる元の E S細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、 また公知 Evansと Kaufmaの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。 例え ば、 マウスの E S細胞の場合、 現在、 一般的には 1 2 9系の E S細胞が使用 されているが、 免疫学的背景がはっきりしていないので、 これに代わる純系 で免疫学的に遺伝的背景が明らかな E S細胞を取得するなどの目的で例えば、 C 5 7 B L/6マウスや C 5 7 B LZ 6の採卵数の少なさを D B A/ 2との 交雑により改善した BDF マウス （C 5 7 B LZ6と DB A/2との F J を用いて樹立したものなども良好に用いうる。 BDF iマウスは、採卵数が多 く、 かつ、 卵が丈夫であるという利点に加えて、 C 5 7 B LZ6マウスを背 景に持つので、 これを用いて得られた E S細胞は病態モデルマウスを作出し たとき、 C 5 7 B L/ 6マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景を C 5 7 B LZ6マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。 また、 E S細胞を樹立する場合、 一般には受精後 3. 5日目の胚盤胞を使用 するが、 これ以外に 8細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることによ り効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、 雌雄いずれの E S細胞を用いてもよいが、 通常雄の E S細胞の方が 生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。 'また、 煩雑な培養の手間を削減 するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
E S細胞の雌雄の判定方法としては、 例えば、 P CR法により Y染色体上 の性決定領域の遺伝子を増幅、 検出する方法が、 その 1例としてあげること ができる。 この方法を使用すれば、 従来、核型分 をするのに約 1 06個の細 胞数を要していたのに対して、 1コロニー程度の E S細胞数 （約 5 0個） で 済むので、 培養初期における E S細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で 行なうことが可能であり、 早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養 初期の手間は大幅に削減できる。
また、 第二次セレクションとしては、 例えば、 G—バンデイング法による 染色体数の確認等により行うことができる。 得られる E S細胞の染色体数は 正常数の 1 0 0%が望ましいが、 樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場 合は、 E S細胞の遺伝子をノックアウトした後、 正常細胞 (例えば、 マウス では染色体数が 2 n = 4 0である細胞） に再ぴクローニングすることが望ま しい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、 通常その増殖性は大変良いが、 個 体発生できる能力を失いやすいので、 注意深く継代培養することが必要であ る。例えば、 S TO繊維芽細胞のような適当なフィーダ一細胞上で L I F (1 〜1 0 0 0 OU/ml)存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、 5%炭酸ガス、 9 5 %空気または 5 %酸素、 5 %炭酸ガス、 9 0 %空気） で約 3 7 °Cで培養 するなどの方法で培養し、 継代時には、 例えば、 トリプシン/ EDTA溶液 (通常 0. 0 0 1〜0. 5%トリプシン/ 0.：!〜 5mM EDTA, 好ましく は約 0. 1 %トリプシン Zl mM EDTA) 処理により単細胞化し、 新たに 用意したフィーダ一細胞上に播種する方法などがと.られる。 このような継代 は、 通常 1〜3日毎に行なう力 この際に細胞の観察を行い、 形態的に異常 な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ES細胞は、 適当な条件により、 高密度に至るまで単層培養するか、 また は細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、 頭頂筋、 内臓筋、 心筋 などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり 〔M. J. Evans及び M. H. Kaufman, ネイチヤー （Nature) 第 292卷、 154頁、 1981年； G. R. Martin プロシーディングス ·ォブ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイエンス · ユーエスエー （proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.) 第 78卷、 7634頁、 1981年； T. C. Doetschman ら、 ジャーナノレ ·ォプ ·ェンブリオロジー 'アンド 'エタ スペリメンタル ·モルフォロジ一、 第 87卷、 27頁、 1985年〕 、 本発明の ES 細胞を分化させて得られる AQ 27受容体 DNA発現不全細胞は、 インビト 口における AQ 27受容体または AQ 27受容体の細胞生物学的検討におい て有用である。
AQ 27受容体 DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 該動物の mRNA量を 公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、 正常 動物と区別することが可能である。
該非ヒ ト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
AQ 27受容体 DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 例えば、 前述のように して作製したターゲッティングべクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細 胞に導入し、 導入によりターゲッティングベクターの AQ 27受容体 DNA が不活性化された DNA配列が遺伝子相同組換えにより、 マウス胚幹細胞ま たはマウス卵細胞の染色体上の AQ 27受容体 DNAと入れ換わる相同組換 えをさせることにより、 AQ 27受容体 DNAをノックァゥトさせることが できる。
AQ 27受容体 DNAがノックアウトされた細胞は、 AQ27受容体 DN
A上またはその近傍の DNA配列をプローブとしたサザンハイブリダィゼー ション解析またはターゲッティングベクター上の DN A配列と、 ターゲッテ ィングベクターに使用したマウス由来の AQ 27受容体 DNA以外の近傍領 域の DN A配列とをプライマーとした P CR法による解析で判定することが できる。非ヒ ト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、 AQ 2 7受容体 DN Aが不活性化された細胞株をクローニングし、 その細胞 を適当な時期、例えば、 8細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、 作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒ ト哺乳動物の子宮に移植する。 作出 された動物は正常な A Q 2 7受容体 DN A座をもつ細胞と人為的に変異した AQ 2 7受容体 DNA座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物であ る。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した AQ 2 7受容体 DN A座をもつ 場合、 このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体 群より、 全ての組織が人為的に変異を加えた AQ 2 7受容体 DN A座をもつ 細胞で構成された個体を、 例えば、 コートカラーの判定等により選別するこ とにより得られる。 このようにして得られた個体は、 通常、 AQ 2 7受容体 のへテロ発現不全個体であり、 AQ 2 7受容体のへテロ発現不全個体同志を 交配し、 それらの産仔から AQ 2 7'受容体のホモ発現不全個体を得ることが できる。
卵細胞を使用する場合は、 例えば、 卵細胞核内にマイクロインジ工クショ ン法で D N A溶液を注入することによりターゲッティングベクタ一を染色体 内に導入したトランスジエニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、 これら のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、 遺伝子相同組換えにより A Q 2 7受容体 DNA座に変異のあるものを選択することにより得られる。 このようにして AQ 2 7受容体 DN Aがノックァゥトされている個体は、 交配により得られた動物個体も該 DN Aがノックァゥトされていることを確 認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、 生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。 すなわ ち、 該不活化 DN Aの保有する雌雄の動物を交配することにより、 該不活化 DNAを相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得しうる。 得られ たホモザィゴート動物は、 母親動物に対して、 正常個体 1， ホモザィゴート 複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。 へ テロザィゴート動物の雌雄を交配することにより、 該不活化 DN Aを有する ホモザィゴートおよびへテロザィゴート動物を繁殖 ¾1代する。
AQ 2 7受容体 DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、 AQ 2 7受容体 DNA発現不全非ヒ ト哺乳動物を作出する上で、 非常に有用であ る。
また、 AQ 2 7受容体 DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 AQ 2 7受容体 により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、 AQ 2 7受容体の生物 活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、 これらの疾病の 原因究明及び治療法の検討に有用である。
(9 a) AQ 2 7受容体 DNAの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治 療 ·予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法
AQ 2 7受容体 DN A発現不全非ヒト哺乳動物は、 AQ 2 7受容体 DNA の欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療 ·予防効果を有する化合物ま たはその塩のスクリーユングに用いることができる。
すなわち、 本発明は、 AQ 2 7受容体 DNA発現不全非ヒト哺乳動物に試 験化合物を投与し、 該動物の変化を観察 ·測定することを特徴とする、 AQ 2 7受容体 DN Aの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療 ·予防効果 を有する化合物またはその塩またはその塩のスクリーニング方法を提供する < 該スクリーニング方法において用いられる AQ 2 7受容体 DNA発現不全 非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものがあげられる。
試験化合物および試験化合物が形成してもよい塩としては、 前記と同様の ものが用いられる。
具体的には、 AQ 2 7受容体 DN A発現不全非ヒ ト哺乳動物を、 試験化合 物で処理し、 無処理の対照動物と比較し、 該動物の各器官、 組織、 疾病の症 状などの変化を指標として試験化合物の治療 ·予防効果を試験することがで さる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、 例えば、 経口投与、 静脈 注射などが用いられ、 試験動物の症状、 試験化合物の性質などにあわせて適 宜選択す
ることがでぎる。 また、 試験化合物の投与量は、 投与方法、 試験化合物の性 質などにあわせて適宜選択することができる。
該スクリーニング方法において、 試験動物に試験化合物を投与した場合、 該試験動物の機能 （例えば、 副腎皮質ホルモン分泌促進活性） が約 1 0 %以 上、 好ましくは約 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上上昇した場合、 該試験化合物を上記の疾患に対して治療 ·予防効果を有する化合物またはそ の塩として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 上記した試 験化合物から選ばれた化合物またはその塩であり、 副腎皮質ホルモン分泌調節 剤、 好ましくは副腎皮質ホルモン分泌促進剤として有用である。 さらに、 該ス クリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 例えば、 低アルド ステロン症、 低コルチゾール血症、 続発性または慢性副腎皮質機能低下症、 ァ ジソン病、 副腎機能不全、 痛み、 肥満などの予防 ·治療剤として有用である。 また、 該スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 安全 で低毒性な男性ホルモン分泌調節剤、 好ましくは男性ホルモン分泌促進剤とし 'て有用である。 さらに、 該スクリーニング方法を用いて得られる化合物または その塩は、 例えば、 男性性腺機能不全、 造精機能障害に伴う男子不妊症、 再生 不良性貧血、 骨髄線維症、 腎性貧血、 末期女性性器癌の疼痛緩和、 乳癌 （例、 手術不能乳癌） 、 乳腺症、 乳腺腫瘍、 女性化乳房などの予防 ·治療剤として有 用である。
さらに、 上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様 に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物の塩としては、 生理学的に許容さ れる酸 （例、 無機酸、 有機酸など） や塩基 （例、 アルカリ金属など） などと の塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 この ような塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安 息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） との塩などが用いら れる。
該スクリー-ング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前記した AQ 2 7受容体とリガンドとの結合性を変化させる化合物を含有す る医薬と同様にして製造することができる。 '
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒ ト または哺乳動物 （例えば、 ラッ ト、 マウス、 モルモッ ト、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。 該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなど により差異はあるが、 例えば、 該化合物またはその塩を経口投与する場合、 一般的に成人患者 （体重 6 0 k gとして） においては、 一日につき該化合物 またはその塩を約 0. 1〜1 0 Omg、 好ましくは約 1. 0〜5 0mg、 より 好ましくは約 1. 0〜 2 Omg投与する。 非経口的に投与する場合は、 該化 合物またはその塩の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異なる 力 例えば、 該化合物を注射剤の形で通常、 成人患者 （体重 6 0 k gとして） に投与する場合、 一日につき該化合物を約 0. 0 1〜3 0mg程度、 好まし くは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. l〜1 0mg程度を静 脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 6 0 k g 当たりに換算した量を投与することができる。
(9 b) AQ 2 7受容体 DNAに対するプロモーターの活性を促進または阻 害する化合物またはその塩をスクリーニング方法
本発明は、 AQ 2 7受容体 DNA発現不全非ヒ ト哺乳動物に、 試験化合物 を投与し、 レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする AQ 2 7受 容体 DNAに対するプロモータ一の活性を促進または阻害する化合物または その塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、 AQ 2 7受容体 DNA発現不全非ヒ ト 哺乳動物としては、 前記した AQ 2 7受容体 DN A発現不全非ヒ ト哺乳動物 の中でも、 AQ 2 7受容体 DNAがレポーター遺伝子を導入することにより 不活性化され、 該レポーター遺伝子が AQ 2 7受容体 DNAに対するプロモ 一ターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物および試験化合物が形成してもよい塩としては、 前記と同様の ものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、 前記と同様のものが用いられ、 ]3—ガラクト シダーゼ遺伝子 （1 a c Z) 、 可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子また はルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
AQ 2 7受容体 DN Aをレポーター遺伝子で置換された AQ 2 7受容体 D '
NA発現不全非ヒト哺乳動物では、 レポーター遺伝子が AQ 2 7受容体 DN Aに対するプロモータ一の支配下に存在するので、 レポータ一遺伝子がコ一 ドする物質の発現をトレースすることにより、 プロモーターの活性を検出す ることができる。
例えば、 AQ 2 7受容体をコードする DNA領域の一部を大腸菌由来の 3 一ガラクトシダーゼ遺伝子 （ 1 a c Z) で置換している場合、 本来、 AQ 2 7受容体の発現する組織で、 AQ 2 7受容体の代わりに ]3—ガラクトシダー ゼが発現する。 従って、 例えば、 5—ブロモー 4—クロ口一3—インドリル ― β一ガラクトビラノシド (X- g a l ) のような ]3一ガラクトシダーゼの 基質となる試薬を用いて染色することにより、 簡便に AQ 2 7受容体の動物 生体内における発現状態を観察することができる。 具体的には、 AQ 2 7受 容体欠損マウスまたはその組織切片をダルタルアルデヒ ドなどで固定し、 リ ン酸緩衝生理食塩液 （P B S) で洗浄後、 X— g a 1を含む染色液 、 室温 または 3 7 °C付近で、 約 3 0分ないし 1時間反応させた後、 組織標本を 1 m M EDT A/P B S溶液で洗浄することによって、 β—ガラクトシダーゼ反 応を停止させ、 呈色を観察すればよい。 また、 常法に従い、 1 a c Zをコー ドする mRN Aを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 上記し た試験化合物から選ばれた化合物またはその塩であり、 A Q 2 7受容体 D N Aに対するプロモータ一活性を促進または阻害する化合物またはその塩であ る。
該スクリーニング方法で得られた化合物の塩としては、 生理学的に許容さ れる酸 （例、 無機酸など） や塩基 （例、 有機酸など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましレ、。 このような塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン 酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスル ホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） との塩などが用いられる。
A Q 2 7受容体 D N Aに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合 物またはその塩は、 安全で低毒性な副腎皮質ホルモン分泌調節剤として有用で ある。
A Q 2 7受容体 D N Aに対するプロモーター活性を促進する化合物または その塩は、 A Q 2 7受容体の発現を促進し、 A Q 2 7受容体の機能を促進す ることができるので、 例えば、 副腎皮質ホルモン分泌調節剤、 好ましくは副 腎皮質ホルモン分泌促進剤として有用である。 さらに、 A Q 2 7受容体 D N Aに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、 例えば、 低 アルドステロン症、 低コルチゾール血症、 続発性または慢性副腎皮質機能低 下症、 アジソン病、 副腎機能不全、 痛み、 肥満などの予防 ·治療剤として有 用でめる。
さらに、 A Q 2 7受容体 D N Aに対するプロモーター活性を促進する化合物 またはその塩は、 安全で低毒性な男性ホルモン分泌調節剤、 好ましくは男性ホ ルモン分泌促進剤として有用である。 さらに、 A Q 2 7受容体 D N Aに対する プロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、 例えば、 男性性腺機能不 全、造精機能障害に伴う男子不妊症、再生不良性貧血、骨髄線維症、 腎性貧血、 末期女性性器癌の疼痛緩和、 乳癌 （例、 手術不能乳癌） 、 乳腺症、 乳腺腫瘍、 女性化乳房などの予防 ·治療剤として有用である。 一方、 A Q 2 7受容体 D N Aに対するプロモーター活性を阻害する化合物ま たはその塩は、 A Q 2 7受容体の発現を阻害し、 A Q 2 7受容体の機能を阻害 することができるので、 例えば、 副腎皮質ホルモン分泌調節剤、 好ましくは副 腎皮質ホルモン分泌阻害剤（副腎皮質ホルモン分泌抑制剤）として有用である。 さらに、 A Q 2 7受容体 D NAに対するプロモーター活性を阻害する化合物ま たはその塩は、 例えば、 クッシング病、 クッシング症候群、 副腎皮質刺激ホル モン産生下垂体腫瘍、 C R H産生腫瘍、 アルドステロン産生腫瘍、 アルドステ ロン症、 原発性コルチゾール抵抗症、 先天性副腎酵素欠乏症、 ス トレス、 うつ 病、神経性食欲不振症、 不眠、 胃 ·十二指 S悬潰瘍、 過敏性腸症候群などの予防' 治療剤として有用である。
さらに、 A Q 2 7受容体 D N Aに対するプロモーター活性を阻害する化合物 またはその塩は、 安全で低毒性な男性ホルモン分泌調節剤、 好ましくは男性ホ ルモン分泌阻害剤 （男性ホルモン分泌抑制剤） として有用である。 さらに、 A Q 2 7受容体 D N Aに対するプロモータ一活性を阻害する化合物またはその塩 は、例えば、 陰茎肥大、 精巣萎縮、 精巣機能異常 （例、 精子減少） 、 月経異常、 多毛、 色素沈着、 嗄声、 過敏症、 坐瘡、 悪心、 嘔吐、 消化器系症状 （例、 食欲 不振） 、 満月様顔貌などの予防 ·治療剤として有用である。
さらに、 上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同 様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前記した A Q 2 7受容体またはその塩とリガンドとの結合性を変化させる化 合物を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒ ト または哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモッ ト、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど) に対して投与することができる。 該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなど により差異はあるが、 例えば、 A Q 2 7受容体 D N Aに対するプロモーター 活性を促進する化合物またはその塩を経口投与する場合、 一般的に成人患者 (体重 60 k gとして） においては、 ―日にっき該化合物を約 0. 1〜 1 00 mg、 好ましくは約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg 投与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物またはその塩の 1回投与量 は投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例えば、 AQ27受容体 D N Aに対するプロモータ一活性を促進する化合物またはその塩を注射剤の形 で通常、 成人患者 （体重 6 O k gとして） に投与する場合、 一日につき該化 合物またはその塩を約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. 1〜20 m g程度、 より好ましくは約 0. 1〜 10 m g程度を静脈注射により投与す るのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 6 0 k g当たりに換算した量 を投与することができる。
このように、 AQ 27受容体 DN A発現不全非ヒト哺乳動物は、 AQ 27 受容体 DN Aに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物また はその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、 AQ 27受容体 DN A発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防 ·治療薬の開発に大き く貢献することができる。
また、 AQ 2 7受容体のプロモーター領域を含有する DNAを使って、 そ の下流に種々の蛋白質をコードする遺伝子を連結し、 これを動物の卵細胞に 注入していわゆるトランスジエニック動物（遺伝子移入動物）を作成すれば、 特異的にその AQ 27受容体を合成させ、 その生体での作用を検討すること も可能となる。 さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結 合させ、 これが発現するような細胞株を樹立すれば、 AQ 27受容体そのも のの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化 合物の探索系として使用できる。
本明細書おょぴ図面において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 I UPAC— I UB Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あ るいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 ま たァミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示 すものとする。 DNA デォキシリボ核酸
c DNA 相補的デォキシリボ核酸
A アデニン
T チミン
G グァニン
C シトシン
I
R アデニン (A) またはグァニン (G)
Y チミン （T) またはシトシン (C)
M アデニン （A) またはシトシン （C)
K グァニン （G) またはチミン （T)
S グァニン (G) またはシトシン (C)
w アデニン （A) またはチミン （T)
B グァニン （G) 、 グァニン （G) またはチミン （T)
D アデニン （A) 、 グァニン （G) またはチミン （T)
V アデニン (A) 、 グァニン (G) またはシトシン (C)
N アデニン (A) 、 グァニン (G) 、 シトシン (C) もしくはチミン (T) または不明もしくは他の塩基
RNA ： リボ核酸
mRNA 一リボ核酸
d ATP ：デォキシアデノシン三リン酸
d TTP ：デォキシチミジン三リン酸
d GTP ：デォキシグァノシン三リン酸
d CTP ：デォキシシチジン三リン酸
ATP ：アデノシン三リン酸
EDTA ミン四酢酸
S D S ： ドデシル硫酸ナトリウム
BHA ：ベンズヒドリノレアミン
pMBHA ： p—メチルベンズヒドリルァミン T o s ： p -トノレエンス/レフォニノレ
B z 1 ：ベンジル
B om ：ベンジルォキシメチル
B o c ： t—ブチルォキシカルボ二ノレ
DCM ：ジクロロメタン
HOB t ： 1ーヒ ドロキシベンズトリァゾール
DCC ： N, N，一ジシク口へキシノレ力ノレボジィミ ド
TF A ： トリフルォロ酢酸
D I EA ： ジイソプロピルェチノレアミン
G 1 y又は G ： グリシン
A 1 a又は A . ： ァラニン
Va 1又は V ： ノ ジン
L e u又は L ： ロイシン
I 1 e又は I ：イソロイシン
S e r又は S ：セリン
Th r又は T ： スレオニン
C y s又は C ：システィン
Me t又は M ：メチォニン
G 1 u又は E ： グノレタミン酸
As p又は D ： ァスパラギン酸
L y s又は K ： リジン
A r g又は R ： アルギニン
H i s又は H ： ヒスチジン
P h e又は F ： フエニノレアラニン
丄 y r乂は Y . ァロ ンノ
T r p又は W ： トリブトファン
P r o又は P ：プロリン
A s n又は N ：ァスパラギン
G 1 n又は Q ： グルタミン p G 1 u又は P y r ： ピログルタミン酸
Ty r (I) 3—ョードチロシン
DMF N, N—ジメチルホルムアミ ド
F m o c N- 9—フルォレニノレメ トキシカノレポ二ノレ T r t トリチル
P b f 2, 2， 4， 6， 7-ペンタメチルジヒ ドロべンゾフラン- 5- スノレホニノレ
C 1 t : 2—クロ口 トリチル
Bu t ： t一ブチル
Me t (O) ：メチォニンスノレフォキシド
本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
ヒト型前駆体蛋白質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2〕
ヒト型前駆体蛋白質をコードする DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 3〕
ラット型前駆体蛋白質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 4〕
ラット型前駆体蛋白質をコードする DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 5〕
マウス型前駆体蛋白質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 6〕
マウス型前駆体蛋白質をコードする DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 7〕
ゥシ前駆体蛋白質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 8〕
ゥシ前駆体蛋白質をコードする DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 9〕
ヒ ト A Q 27受容体のァミノ酸配列を示す。 〔配列番号： 1 0〕
ヒト AQ 27受容体をコードする DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 1〕
ラット AQ 2 7受容体のァミノ酸配列を示す。 '
〔配列番号： 1 2〕
ラット AQ 2 7受容体をコードする DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 3〕
マウス AQ 2 7受容体のアミノ酸配列を示す。 .
〔配列番号： 1 4〕 ,
マウス AQ 2 7受容体をコードする DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 5〕 .
参考例 1でヒ ト型前駆体蛋白質をコードする c DNAのスクリーニングに使 用した合成 DN Aを示す。
〔配列番号： 1 6〕
参考例 1でヒト型前駆体蛋白質をコードする c DN Aのスクリーニングに使 用した合成 DN Aを示す。
〔配列番号： 1 7〕
参考例 2でラット型前駆体蛋白質をコードする cDNAのスクリーニングに 使用した合成 DN Aを示す。
〔配列番号： 1 8〕
参考例 2でラット型前駆体蛋白質をコードする c DNAのスクリーニングに 使用した合成 DN Aを示す。
〔配列番号： 1 9〕
参考例 5でマウス型前駆体蛋白質をコードする c DNAのスクリーユングに 使用した合成 DN Aを示す。
〔配列番号： 20〕
参考例 5でマウス型前駆体蛋白質をコードする cDNAのスクリーニングに 使用した合成 DN Aを示す。
〔配列番号： 2 1〕 参考例 1 6でゥシ型前駆体蛋白質をコードする cDNAのスクリーユングに 使用した合成 DN Aを示す。
〔配列番号： 22〕
参考例 16でゥシ型前駆体蛋白質をコードする c DNAのスクリーユングに 使用した合成 DNAを示す。
〔配列番号： 23〕
参考例 1 7でラット AQ27をコードする cDNAのスクリーニングに使用 した合成 DN Aを示す。
〔配列番号： 24〕
参考例 1 7でラット AQ27をコードする cDNAのスクリーニングに使用 した合成 DN Aを示す。
〔配列番号： 25〕
参考例 1 7でマウス AQ 27をコードする cDNAのスクリーエングに使用 した合成 DN Aを示す。
〔配列番号： 26〕
参考例 1 7でマウス AQ 27をコードする c DNAのスクリ一ユングに使用 した合成 DN Aを示す。
〔配列番号： 27〕
参考例 19で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 28〕
参考例 1 9で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 29〕
. 参考例 19で使用したプローブの塩基配列を示す。
〔配列番号： 30〕
参考例 20で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 31〕
参考例 20で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 32〕
参考例 20で使用したプローブの塩基配列を示す。 〔配列番号： 3 3〕
参考例 2 1で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 34〕
参考例 2 1で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 3 5〕
参考例 2 1で使用したプローブの塩基配列を示す。
〔配列番号： 36〕
参考例 2 1で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 3 7〕
参考例 2 1で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 38〕
参考例 2 1で使用したプローブの塩基配列を示す。
後述の参考例 1で得られた形質転換体 E s c h e r i c h i a c o l i JM1 09/p TAh FRF— 1は、 2002年 2月 1 8日から茨城県つくば 市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305-856 6) の独立行政法人産 業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番号 F ERM B P- 7 9 0 3として、 200 2年 2月 6日から大阪府大阪市淀川区十三本町 2 - 1 7- 8 5 (郵便番号 5 3 2— 8 6 8 6) の財団法人 ·発酵研究所 （ I F O) に寄託番 号 I FO 1 6 752として寄託されている。
後述の参考例 2で得られた形質転換体 E s c h e r i c h i a c o l i JM1 0 9ノ p TAr FRF— 1は、 200 2年 2月 1 8日から茨城県つくば 市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 856 6) の独立行政法人産 業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番号 FERM B P— 7 9 0 5として、 200 2年 2月 6日から大阪府大阪市淀川区十三本町 2— 1 7— 8 5 (郵便番号 5 3 2- 86 8 6) の財団法人 ·発酵研究所 （ I F O) に寄託番 号 I FO 1 6 754として寄託されている。
後述の参考例 5で得られた形質転換体 E s c h e r i c h i a c o l i JM1 09/p TAmFRF— 1は、 200 2年 2月 1 8日から茨城県つくば 市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 856 6) の独立行政法人産 業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号 F ERM BP— 790 4として、 2002年 2月 6日から大阪府大阪市淀川区+三本町 2— 1 7-8
5 (郵便番号 532- 8686) の財団法人 ·発酵研究所 （ I F O) に寄託番 号 I FO 16753として寄託されている。
後述の参考例 16で得られた形質転換体 E s c h e r i c h i a c o l i JM109ZpTAb FRF— 1は、 2002年 8月 21日から茨城県つくば 巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 8566) の独立行政法人産 業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号 FERM BP— 8 1 6 2として寄託されている。
後述の参考例 1 7で得られた形質転換体 E s c h e r i c h i a c o l i JM1.09/p CR2. l_r a tAQ27は、 200.2年 8月 21日から茨 城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 8566) の独立 行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号 F ERM B P_8163として寄託されている。
後述の参考例 1 8で得られた形質転換体 E s c h e r i c h i a c o l i JM109/p CR 2. 1— m o u s e AQ 27は、 2002年 8月 2 1 日から茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305- 85
6 6)の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号 FERM B P— 8 1 64として寄託されている。
実施例
以下に参考例おょぴ実施例を示して、 本発明をより詳細に説明するが、 これ らは本発明の範囲を限定するものではない。
参考例 1 ヒト cDNAからの PC R法による新規分泌蛋白質遺伝子の取得 クローンテック社より購入した Huma n Un i v e r s a l cDNA を錶型として、 以下の 2種類の合成 DNAを用いて、 PCRによる増幅を行つ た。
RFF25-ATGGTAAGGCCTTACCCCCTGATCTAC-3' (配列番号： 15)
RFR1 5-CAAATCCTTCCAAGGCGTCCTGGCCCT-3' (配列番号： 16)
PCRの反応液は c DNA溶液 1 m i c r o 1、 0. 5 m i c r o 1 RF F 2 (1 0m i c r oM) 、 0. 5 m i c r o 1 RFR 1 (l Om i c r o M) 、 2. 5 m i c r o 1添付の 1 0 x反応液、 2. 5 m i c r o 1 dNT P (1 0 mM) 、 0. 25m i c r o l E x T a q (タカラ） 、 1 7. 7
5m i c r o 1大塚蒸留水を加えて合計 25m i c r o 1にした。 反応液を、 Th e rma l Cy c l e r 96 00を用いて P C R反応にかけた。 PCR© 条件は 9 5°C · 2分の変性の後、 98°C · 1 0秒、 6 0°C · 20秒、 72°C · 30秒のサイクルを 40回繰り返した。 P CR産物の一部を用いて電気泳動で 約 400 b pの PCR産物の増幅を確認した後、 01産物を(311 i a g e n PGR p u r i f i c a t i o n K i tを用いて精製し、 直接配列決定を 行ったところ図 1で示す配列がえられた。 図 1の D N A配列から予測されるァ ミノ酸配列は図 1 2に示すものであった。 また、 図 2のアミノ酸配列の 1から 1 8番目のァミノ酸配列は分泌シグナルと予想された。
さらに、 生成するペプチドとして、
(1) C末端がアミド化された、 図 2 (配列番号： 1) に示されたアミノ酸配 列の第 26番目〜 88番目のアミノ酸配列を含有するぺプチド、
(2) C末端がアミド化された、 図 2 (配列番号： 1) に示されたアミノ酸配 列の第 80番目〜 88番目のアミノ酸配列を含有するペプチド、
(3) C末端がアミド化された、 図 2 (配列番号： 1) に示されたアミノ酸配 列の第 9 1番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列を含有するペプチド、
(4) C末端がアミド化された、 図 2 (配列番号： 1) に示されたアミノ酸配 列の第 1 2 7番目〜 1 33番目のアミノ酸配列を含有するペプチドなどが考え られる。
次に、 ゲルから回収した P CR産物を T Aクローニングキット ( I n V i t r o g e n社） を用いて大腸菌 J M 109にサブクローニングし、 大腸菌 J M 1 09Zp TAh FRF— 1を取得した。 サブクローニングで得られた大腸菌 からプラスミド pTAhFRF— 1をプラスミド抽出機 （クラボウ社） を用い て抽出し、 挿入断片の塩基配列を決定し、 その配列が図 1 1と同じヒト型分泌 蛋白質遺伝子 c DNAであることを確認した。
参考例 2 ラットゲノム DNAからの PC R法によるリガンド候捕遺伝子の取 クローンテック社より購入した R a t G e n om i c DN Aを铸型とし て、 以下の 2種類の合成 DN Aを用いて、 PC Rによる増幅を行った。
Fl 5-CCTCCTCTCTCTCCCTCCTCTGCTCAG-3' (配列番号： 1 7)
Rl 5-ACGGGGCAGAGTCCACGCAGGCCCTCA-3' (配列番号： 1 8 )
PCRの反応液はDNA溶液lm i c r o l、 0. 5m i c r o l F 1 (1 0m i c r oM) 、 0. 5 m i c r o 1 R 1 (1 0m i c r oM) 、 2. 5 m i c r o 1添付の 1 0 x反応液、 2. 5 m i c r o 1 dNTP (1 0 mM)、 0. 2 5m i c r o 1 E xT a q (タカラ） 、 1 7. 75 m i c r o 1大塚 蒸留水を加えて合計 25m i c r 0 1にした。 反応液を、 Th e rma l C y c 1 e r 960 Qを用いて PCR反応にかけた。 P C Rの条件は 9.5 °C · 2 分の変†生の後、 9 8°C · 1 0秒、 6 0°C · 20秒、 72 °C · 30秒のサイクル を 30回繰り返した。 PCR産物の一部を用いて電気泳動で約 400 b pの P CR産物の増幅を確認した後、 PCR産物を Qu i a g e n PCR p u r i f i c a t i o n K i tを用いて精製し、 直接配列決定を行ったところ図 3で示す配列がえられた。 図 3の D N A配列から予測されるァミノ酸配列は図 1 4に示すものであった。 また図 4のアミノ酸配列の 1から 1 7番目のァミノ 酸配列は分泌シグナルと予想された。
またヒト型とラット型のアミノ酸配列を比較したところ図 5のようになり、 特に C末端の RFアミドモチーフの配列 （Ar g Ph e G 1 y Ar g) が保 存されていた。 さらに、 生成するぺプチドとして C末端がアミド化された G 1 y G 1 y P h e S e r P h e Ar g P h e一 NH2 (配列番号： 2 7の第 1 1 6番目〜 1 22番目） 、 Ly s G 1 y G 1 y P h e S e r Ph e A r g Ph e -NH2 (配列番号： 2 7の第 1 1 5番目〜 1 22番目） 等が予想 された。
次に、 ゲルから回収した P CR産物を T Aクローニングキット ( I n V i t r o g e n社） を用いて大腸菌 J M 1 0 9にサブクローニングし、 大腸菌 J M 1 09/pTAr ?1 ?ー1を取得した。 サブクロー-ングで得られた大腸菌 からプラスミド p TAr FRF— 1をプラスミド抽出機 （クラボウ社） を用い て抽出し、 揷入断片の塩基配列を決定し、 その配列が図 3と同じラット型分泌 蛋白質遺伝子 c D N Aであることを確認した。
参考例 3
( 1 ) Gly-Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH 2 (配列番号： 1の第1 2 7番目〜1 3 3番目） および Glu-His-Ala-Gly-Cys-Arg-Phe-Arg-Phe-NH,2 (配列番号： 1 の第 80番目〜 8 8番目） の合成
Gly-Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH 2 (配列番号： 1の第 1 2 7番目〜 1 3 3番 目）および Glu- His- Ala_Gly- Cys- Arg_Phe- Arg- Phe- NH 2 (配列番号： 1の第 8 0番目〜 8 8番目） を自体公知のペプチド合成法を用いて製造した。
(2) Arg- Lys- Lys_Gly- Gly- Phe- Ser- Phe- Arg- Phe- NH 2 (配列番号： 1の第 1 24番目〜 1 33番目） の合成
Arg-Lys-Lys-Gly-Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH 2 (配列番号： 1の第 1 24番 目〜 1 3 3番目） を自体公知のペプチド合成法を用いて製造した。
参考例 4 新規ヒト型ぺプチド： Gly- Gly- Phe- Ser- Phe- Arg- Phe- NH 2 (配列番 号： 1の第 1 27番目〜 1 3 3番目） および
Glu- His- Ala- Gly- Cys- Arg- Phe- Arg- Phe_NH 2 (配列番号： 1の第 80番目〜 88 番目） の AQ 27受容体および OT 7T0 2 2受容体を一過性に発現させた H EK2 9 3細胞に対するレポーター遺伝子発現量の上昇活性
参考例 3で合成した新規ヒト型ぺプチドによる AQ 2 7受容体 （配列番号： 3 1) およぴヒ ト OT 7T022受容体 （配列番号： 3 5) に特異的な刺激活 性の検出は、 c AMPレスポンスエレメント （CRE) プロモーターの発現誘 導によって産生されるレポーター遺伝子産物 （ルシフヱラーゼ） の発現量を指 標に行った。
HEK 29 3細胞を増殖培地 （DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) (GibcoBRL) に 1 0%ゥシ胎児血清 （GibcoBRL) を添加したもの） に懸濁し、 l x l 05 c e l l s /w e 1 1の濃度にてコラーゲンでコートされた B 1 a c k we 1 1 9 6ゥェルプレート (ベタトンディッキンソン社) にまいた。 3 7°C 5 %C〇2条件下でー晚培養した後、 レポーター遺伝子を含むプラスミ ドである p CRE_Lu c (Clontech) と同時に、 公知の方法により動物細胞 での発現用ベクター p AKKO— 1 1 1H (Biochem. Biophys. Acta, Hinuma, S. et al.， 1219, 251-259, 1994記載の p AKKO— 1. 1 1Hと同一のプラ スミドベクター) に AQ 27遺伝子 （配列番号： 32) およびヒ ト OT 7T0 22遺伝子 （配列番号： 36) を挿入して作製した発現ベクタープラスミド、 または、 AQ 27遺伝子を含まないもとの p AKKO— 1 1 1 Hを用いて細胞 のトランスフエクションを以下のとおりに行った。
OPT I -MEM- I (GibcoBRL) と L i p o f e c t am i n e™ 200 0 Re a g e n t (GibcoBRL) を 24 : 1にて混合することにより、 リポフエ クトァミン希釈液を調製した。 また、 OPT I— MEM— I、 AQ27発現べ クタ一プラスミドまたはもとのベクタープラスミド （240 η g/μ 1 ) およ ぴ p CRE— L u c (240 n g/ μ 1 ) を 24： 0.. 9 : 0. 1にて混合す ることにより D Ν Α希釈液を調製した。 リボフェク トアミン希釈液と D N A希 釈液を等量混合し、 20分間室温で静置することにより DNAとリボフヱクト ァミンの複合体を形成させた後、 上記の HE K 293細胞を培養したプレート に 25 μ 1添カ卩し、 さらに 37 °C、 5%CO 2条件下でー晚培養した。
トランスフエクトした HE K 293細胞をアツセィ用培地 （DMEMに 0. 1%ゥシ血清アルブミンを添カ卩したもの） にて洗浄した後、 アツセィ用培地に て希釈した参考例 3で合成した新規ヒ ト型ぺプチドを 10、 1、 0. 1 Μと なるよう添加し、 37°C、 5 %C〇2条件下で 4時間培養した。 培養上清を捨て て、 ルシフェラーゼ活性測定用の基質であるピツカジーン LT 2. 0 (東洋ィ ンキ製造株式会社） を 50 ^ 1添力 Πし、 プレートリーダー （ARVO s Xマル チラベルカウンター、 Wallac社）を用いてルシフェラーゼの発光量を測定した。 その結果、 2種類の新規ヒ ト型ペプチドはいずれも AQ 27受容体に対しフ オルスコリン （ F S K) 添カ卩で刺激したルシフヱラーゼ活性を濃度依存的に増 強する反応として検出された。 一方、 ヒ ト OT 7T 022受容体に対しては F SK添加で刺激したルシフェラーゼ活性を抑制する反応として検出された。 こ れらの反応は受容体を導入していない空のベクター p AKKO-111 Hを発現さ せた細胞では検出されなかった。 したがって、 2種類の新規ヒト型ペプチドは AQ27受容体特異的にルシフェラーゼ活性の増強を引き起こしたことが確認 された （図 6、 図 7) 。
参考例 5· マウスゲノム DNAからの PCR法によるリガンド候補遺伝子の取 得
クローンテック社より購入した Mo u s e G e n om i c DNAを铸型 として、 以下の 2種類の合成 DNAを用いて、 PCR による増幅を行った。 F2 5-ATGAGGGGCTTCCGGCCTTTGCTTTCC-3' (配列番号： 1 9)
R2 5， - TCACCGTCCMAGCGGAAGCTGMGCC- 3' (配列番号： 20)
P CRの反応液は DNA溶液 1 m i c r o l、 0. 5m i c r o l F 2 ( 1
0 m i c r o M) , 0. 5 m i c r o 1 R 2 (1 0m i c r oM) 、 2. 5 m i c r o 1添付の 1 0 x反応液、 2. 5m i c r o l dNTP (1 0 mM)、
0. 25m i c r o 1 E xT a q (タカラ） 、 1 7. 75m i c r o 1大塚 蒸留水を加えて合計 2 5m i c r o 1にした。 反応液を、 Th e rma l C y c 1 e r 9600を用いて P C R反応にかけた。 PCRの条件は 9 5°C · 2 分の変性の後、 98°C · 1 0秒、 60°C · 20秒、 72°C · 30秒のサイクル を 30回,操り返した。 PCR産物の一部を用いて電気泳動で約 400 b pの P CR産物の増幅を確認した後、 PCR産物を Qu i a g e n PCR p u r
1 f i c a t i o n K i tを用いて精製し、 直接配列決定を行ったところ図 8で示す配列がえられた。 図 8の DNA配列から予測されるアミノ酸配列は図 9 に示すものであった。 また、 図 9のアミノ酸配列の 1〜1 7番目のアミノ酸配 列は分泌シグナルと予想された。 さらに生成するぺプチドとして C末端がァミ ド化された Gly Gly Phe Ser Phe Arg Phe-NH 2 (配列番号： 5の第 1 1 6番目 〜 1 22番目） 、 Lys Gly Gly Phe Ser Phe Arg Phe-NH 2 (配列番号： 5の第 1 1 5番目〜 1 2 2番目） 等が予想された。
次に、 ゲルから回収した PCR産物を TAクローニングキット （Invitrogen社） を用いて大腸菌 JM109にサブクローニングし、 大腸菌 JM109/pTAraFRF-lを取得 した。 サブク口一ユングで得られた大腸菌からプラスミド pTAmFRF- 1をプラス ミド抽出機 (クラボウ社) を用いて抽出し、 挿入断片の塩基配列を決定し、 そ の配列が図 8と同じマウス型分泌蛋白質遺伝子 cDNAであることを確認した。 参考例 6 新規ヒト型ペプチド： Arg-Lys-Lys-Gly-Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH 2 (配列番号： 1の第 1 24番目 〜1 3 3番目） の AQ27受容体を一過性に発現させた HE K 29 3細胞に対 するレポーター遺伝子発現量の上昇活性
参考例 4と同様の方法で新規ヒ ト型ぺプチド：
Arg-Lys-Lys-Gly-Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH 2 (配列番号： 1の第 1 24番目 〜1 3 3番目） の （1) AQ 2 7受容体を一過性に発現させていない HEK 2 93細胞 （図 1 0) および （2) AQ 27受容体を一過性に発現させた HE K 29 3細胞（図 1 1)に対するレポーター遺伝子発現量の上昇活性を測定した。 その結果、 新規ペプチドは AQ 27に対してはルシフェラーゼ活性の上昇作用 を （図 1 1) を引き起こした。
参考例 7 ヒ ト AQ 27発現 CHQ細胞における c AMP産生抑制活性の検出 自体公知の方法で樹立した AQ 2 7発現 CHO細胞 （図 1 2) およびコント ロールとなる mo c k CHO細胞 （図 1 3) を、 4 x 1 04/w e 1 1の濃度 にて 9 6ゥエルプレート （べクトンデッキンソン） に撒いて、 ー晚培養した。 アツセィ用バッファーには H a n k s' B a l a n c e d S a l t S o 1 u t i o rd O. 1 %ゥシ血清ァノレブミンおよび 0. 2 mM 3— I s o b u t y 1— 1一 m e t h y l x a n t h i n eを添カ卩したものを用い 7こ。 了ッセィ 用バッファーで細胞を 2回洗浄し、 3 7°Cで 30分間プレインキュベーション した。 再度細胞を 2回洗浄したのちにアツセィ用バッファーで調製したサンプ ルを添カ卩し、 3 7 °Cで 30分間インキュベーションした。 c AMP産生抑制活 性を評価するため、 c AMP産生上昇を促進するホルスコリン （F SK、 和光 純薬） 2 Mのみのサンプノレと同濃度の F SKと 1 0— 7〜1 0— 5Mの新規ヒ ト 型ぺプチド： Arg- Lys-Lys- Gly- Gly- Phe- Ser_Phe- Arg_Phe_NH 2 (配列番号： 1の 第 1 24番目〜 1 3 3番目）を含むサンプルで比較した。細胞の上清を捨てて、 c AMP S c r e e n S y s t em (アプライドバイオシステムズ） によつ て細胞内の c AMP産生量を測定した。 その結果、 図 1 2に示す通り、 AQ 2 7発現 CHOにおいてのみ、 F SKで誘導された c AMP産生がペプチドの添 加によって抑制された。
参考例 8 AQ 2 7発現 CHO細胞における細胞内カルシウムイオン遊離促進 活性の検出
自体公知の方法で樹立した AQ 27発現 CHO細胞を 96—we 1 1の黒色 培養プレート （C o s t a r社） に 4 X 1 04 c e 1 1 s /w e 1 1の細胞数で 播種し、 一晚培養した。 Ha n k' s B a l a n c e d S a l t S o l u t i o n (HB S S) に 2 OmMの HE PE S (pH7. 4， 同仁化学研 究所） 、 2. 5mM p r o b e n e c i d (S i gma社） を添加したもの をアツセィバッファ一として用意した。 細胞の培地を除去し、 アツセィバッフ ァ一に 4 μ Μの F l u o 3—AM (D o j i n d o社）および 0. 04% P l u r o n i c a c i d (Mo r e c u l a r P r o b e s社) を添加し たものを加え、 3 7°Cで 1時間インキュベーションした。 細胞をアツセィバッ ファーで洗浄して過剰な F 1 u 0 3を除去し、 FL. I PR (モレキュラーデ バイス社） にセットした。 アツセィバッファ一に溶角军した検体も同じく F L I PRにセットした後、 内蔵のマ二ュピレ一ターによってサンプルを細胞に添加 し、 励起光の照射によつて発生する細胞内カルシゥムイオン濃度に依存した蛍 光量の変化を測定した。 その結果、 サンプル無添カ卩 （〇） に対し、 新規ヒト型 ぺプチド： Arg- Lys- Lys- Gly_Gly- Phe- Ser- Phe- Arg- Phe-NH 2 (配列番号： 1の第 1 24番目〜 1 33番目 ； RKKGGF S FRF_NH2) および新規ヒ ト型ぺ プチド： Gly- Gly- Phe- Ser- Phe_Arg- Phe- NH 2 (配列番号： 1の第 1 2 7番目〜 1 3 3番目 ； GGF S FRF—NH2) について、 1 0 M (A) 、 1 μ M (□) ではそれぞれ図 14および図 1 5に示すような反応が検出され、 それぞれのぺ プチドによって AQ 27発現 CHO細胞の細胞内カルシウムイオン遊離促進活 性が検出された。
参考例 9
(1)
Thr-Ser-Gly-Pro-Leu-Gly-Asn-Leii-Ala-Glu-Glu-Leu-Asn-Gly-Tyr-Ser-Arg
-Lys-Lys-Gly-Gly-Phe-Ser-Phe Arg- Phe- NH2 (配列番号： 1の第 1 08番目〜 1 33番目 ； T 1—F 26— NH2) の合成
T 1 -F 26 _NH2を自体公知のペプチド合成法を用いて製造した。
(2) Pyr- Asp- Glu- Gly- Ser- Glu- Ala- Thr- Gly- Phe- Leu- Pro- Ala- Ala- Gly- Glu- Lys - Th r- Ser— Gly - ProHLeu— Gly - Asn - Leu— Ala-Glu— GluHLeu - Asn—Gly - Tyr— Ser— Arg - Lys- Lys- Gly- Gly- Phe_Ser- Phe Arg- Phe- NH2 (配列番号： 1の第 91番目〜 1 3 3番目 ； Py r 1— F43— NH2) の合成
Py r 1—F 43—NH2を自体公知のペプチド合成法を用いて製造した。 ( 3 ) Ala- Ser- Gin- Pro- Gin-Ala- Leu- Leu- Val-Ile- Ala- Arg- Gly
-Leu-Gin- Thr- Ser_Gly- Arg- Glu- His- Ala- Gly- Cys- Arg- Phe- NH2 (配列番号： 1の 第 61番目〜 86番目 ； A1— F 28— NH2) の合成
A 1 -F 28一 NH2を自体公知のぺプチド合成法を用いて製造した。
参考例 10 新規ヒト型ぺプチド：
Thr- Ser - Gly Pro - Leu- Gly - Asn - Leu-Ala - Glu - Glu - Leu - Asn - Gly - Tyr - Ser— Arg -Lys-Lys-Gly-Gly-Phe-Ser-Phe Arg_Phe- NH2 (配列番号： 1の第 108番目〜 1 33番目 ； T1一 F 26— NH2) および
Pyr-Asp-Glu-Gly-Ser-Glu-Ala-Thr-Gly-Phe-Leu-Pro-Ala-Ala-Gly-Glu-Lys-Th r-Ser-Gly-Pro-Leu-Gly-Asn-Leu-Ala-Glu-Glu-Leu-Asn-Gly-Tyr-Ser-Arg
-Lys- Lys- Gly- Gly- Phe- Ser- Phe Arg- Phe- N (配列番号： 1の第 91番目〜 13 3番目 ； P y r 1—F 43—NH2) のヒト AQ 27受容体を一過性に発現させ た HEK293細胞に対するレポーター遺伝子発現量の上昇活性
参考例 4と同様の方法を用いて、 ·参考例 9で合成した新規べプチド T 1一 F 26—NH2および P y r 1—F 43— NH2の （1) AQ 27受容体を一過性 に発現させていない HEK 293細胞 （図 16) 、 (2) AQ 27受容体を一 過性に発現させた HEK 293細胞 （図 1 7) に対するレポーター遺伝子発現 量の上昇活性を測定した。 その結果、 それぞれのペプチドによって AQ 27受 容体を発現させた HEK 293細胞においてルシフェラーゼ活性の上昇が検出 された。
参考例 1 1 新規ヒト型ペプチド： Py r 1—F43— NH2による AQ27発 現 C H O細胞特異的な細胞内カルシゥムイオン動員活性の検出
参考例 8と同様の方法により、 Py r 1—F43— NH2による AQ27発現 CHO細胞特異的な細胞内カルシウムイオン動員活性の検討を行った。 その結 果、 図 1 8に示す通り 1 0— 8M以上の新規ペプチド P y r 1 -F4 3— NH2 の添加によって、 CHO— AQ2 7特異的な細胞内カルシウムイオン動員活性 が認められた。 一方、 図 1 9に示す通り、 コントロールとなる mo c k CH 〇細胞においては活 1·生が認められず、 同ぺプチドが AQ 27のリガンドとして 特異的なァゴニスト活性を示すことが確認された。
参考例 1 2 新規ヒト型ペプチド： Py r 1—F 43—NH2 5AQ 2 7発 現 C H O細胞特異的な c AM P産生抑制活性
参考例 7の方法と同様の方法により、新規ペプチド P y r 1 -F 43— NH2 による AQ 2 7発現 CHO細胞特異的な c AMP産生抑制活性を検出した。 そ の結果、 図 20に示す通り、 AQ 27発現 CHO特異的に、 F SKで誘導され た c AMP産生が新規ペプチド P y r 1 -F 43—NH2の添加によって抑制 された。 一方、 図 2 1に示す通り、 コントロールとなる mo c k CHO細胞 においては活性が認められず、 同ぺプチドが AQ 27のリガンドとして特異的 なァゴニスト活性を示すことが確認された。
参考例 1 3 新規ヒト型ぺプチド：
Ala-Ser-Gln-Pro-Gln-Ala-Leu-Leu-Val-Ile-Ala-Arg-Gly-Leu-Gln-Thr-Ser-Gl y-Arg-Glu-His-Ala-Gly-Cys-Arg-Phe-NH2 (配列番号： 1の第 6 1番目〜 86番 目； A 1— F 28 _NH2) のヒト AQ 2 7受容体を一過性に発現させた H E K 293細胞に対するレポーター遺伝子発現量の上昇活性
参考例 4と同様の方法を用いて、 参考例 9で合成した新規ヒト型ぺプチド： A1— F 28— NH2の （1) AQ 27受容体を一過性に発現させていない H E K29 3細胞 （図 22) 、 (2) AQ 2 7受容体を一過性に発現させた HE K 293細胞（図 23)に対するレポーター遺伝子発現量の上昇活性を測定した。 その結果、 A 1—F 28— NH2によって AQ 2 7受容体を発現させた H E K 2 93細胞においてルシフェラーゼ活性の上昇が検出された。
参考例 14 新規ヒ ト型ペプチド： A1— F 28— NH2による AQ 27発現 C H O細胞特異的な細胞内カルシゥムィォン動員活性の検出
参考例 8と同様の方法により、新規ペプチド A1—F 28_NH2による AQ 2 7発現 C H O細胞特異的な細胞内カルシゥムィオン動員活性の検討を行つた。 その結果、図 24に示す通り 10— 6M以上の新規べプチド A 1— F 28— NH2 の添加によって、 CHO— AQ27特異的な細胞内カルシウムイオン動員活十生 が認められた。 一方、 図 25に示す通り、 コントロールとなる mo c k CH O細胞においては活性が認められず、 同ぺプチドが AQ 27のリガンドとして 特異的なァゴニスト活性を示すことが確認された。
参考例 15 新規ヒト型ペプチド： Al— F 28— NH2による AQ27発現 C HO細胞特異的な c AMP産生抑制活性
参考例 7の方法と同様の方法により、新規ペプチド Al— F28_NH2によ る AQ27発現 CHO細胞特異的な c AMP産生抑制活性を検出した。 その結 果、 図 26 こ示す通り、 AQ 27発現 CHO特異的に、 FSKで誘導された c AMP産生が 10一6 M以上の新規ペプチド A 1— F 28— NH2の添加によつ て抑制された。 一方、 図 27に示す通り、 コントロールとなる mo c k CH O細胞においては活性が認められず、 同ぺプチドが AQ 27のリガンドとして 特異的なァゴニスト活性を示すことが確認された。
参考例 1 6 ゥシゲノム DNAからの PCR法による新規分泌蛋白質 I遺伝 子の取得
クローンテック社より購入した B o V i n e Ge n om i c DNAを 錚型として、 以下の.2種類の合成 DNAを用いて、 PCRによる増幅を行つ た。 ，
b F 5，- ATGCGGAGCCCTTACTCCCTGCCCTAC -3' (配列番号： 21)
b R 5- TCACCGCCGACCGAAGCGGAAGCTGAA -3' (配列番号： 22)
P CRの反応液は DNA溶液 1 m i c r o l、 0. 5m i c r o l b F ( 1 0 m i c r o M) 0。 5m i c r o l b R (10m i c r oM) 、 2. 5 m i c r o 1添付の 10 x反応液、 2. 5 m i c r o 1 dNTP (10 mM)、 0. 25m i c r o 1 E x T a q (タカラ） 、 1 7. 75m i c r o 1大塚 蒸留水を加えて合計 25m i c r o 1にした。 反応液を、 Th e rma l C y c 1 e r 9600を用いて P C R反応にかけた。 PCRの条件は 95°C · 2 分の変性の後、 98°C ' 10秒、 60°C · 20秒、 72 °C · 30秒のサイクル を 30回繰り返した。 PCR産物の一部を用いて電気泳動で約 400 b pの P CR産物の増幅を確認した後、 PCR産物を Qu i a g e n PCR p u r i f i c a t i o n K i tを用いて精製し、 直接配列決定を行ったところ図 28で示す配列がえられた。 図 28の D N A配列から予測されるァミノ酸配列 は図 29に示すものであった。 また図 29のアミノ酸配列の 1〜1 7番目のァ ミノ酸配列は分泌シグナルと予想された。 さらに生成するペプチドとして、 C 末端がアミド化された図 29のアミノ酸配列の第 124番目〜 131番目のァ ミノ酸配列を有するペプチドまたは C末端がアミド化された図 29のアミノ酸 配列の第 125番目〜 131番目のアミノ酸配列を有するペプチド等が予想さ れる。
次に、 ゲルから回収した P CR産物を TAクローニングキット (I n v i t r o g e n社） を用いて大腸菌 J M 109にサブクロー-ングし、 大腸菌 J M 109/pTAb FRF_l。 サブクローニングで得られた大腸菌からプラス ミド pTAb FRF—lをプラスミ ド抽出機 （クラボウ社） を用いて抽出し、 揷入断片の塩基配列を決定し、 その配列が図 28と同じヒト型分泌蛋白質遺伝 子 c DN Aであることを確認した。
参考例 17 ラット副腎 c DNAからの PCR法による AQ 27受容体遺伝子 の取得
ラット副腎の p o 1 y A+RNA 1 μ gからランダムプライマー、 逆転写 酵素として S u p e r S c r i p t l I逆転写酵素（G I BCO BRL社） を用い、 添付のマニュアルに従って 42°Cで反応を行い、 cDNAを得た。 以下の 2種類の合成 DNAを用いて、 PCR による増幅を行った。
F1 5'- CGTCGACGCATGCAGGCGCTCAACATCACCGCG- 3， （配列番号： 23) R2 5'- CACTAGTTTACAGTTCATGGCCACTACCAAAAGTA- 3' (配列番号： 24)
P CRの反応液は c DNA溶液 1 m i c r o 1、 0. 5m i c r o 1 F 1 (10mi c r oM) 、 0. 5 m i c r o 1 R 1 (10m i c r oM) 、 5 m i c r o 1添付の 5 x反応液、 2. 5m i c r o 1 Gcme l t、 2. 5 mi c r o l d NT P (10 mM) 、 0. 5 m i c r o 1 A d v a n t a g e Gcme l t p o l yme r a s e Mi x (クローンテック) 、 1 2. 5m i c r o 1大塚蒸留水を加えて合計 25 m i c r o 1にした。 反応液 を、 Th e rma l Cy c l e r 9600を用いて PC R反応にかけた。 P C Rの条件は 95°C- 2分の変性の後、 98°0 10秒、 6 1 °C · 20秒、 72°C · 120秒のサイクルを 35回繰り返した。 PCR産物の一部を用いて電気泳動 で約 1300 b pの P CR産物の増幅を確認した後、 ？じ1産物を(311 i a g e n PCR p u r i f i c a t i o n K i tを用いて精製し、 TAク口 一二ングキット （ I n V i t r o g e n社） を用いて大腸菌 J M 109にサブ クローニングし、 大腸菌 J Ml .09/p CR 2. 1— r a t AQ 27を取得し た。 サブクローユングで得られた大腸菌からプラスミド p CR2. 1— r a t AQ27を Qu i a g e n Q I Aw e l l 8 U l t r a P l a sm i d K i tを用いて抽出し、 挿入断片の塩基配列を決定し、 図 30で示す配列 がえられた。 図 30の DNA配列から予測されるアミノ酸配列は図 31に示す ものであった。 また、 ヒト型およびマウス型 AQ27との相同性は図 32に示 すとおりであり、 ラット型 AQ27受容体であることが確認された。
参考例 1 8 マウス脳 c DNAからの P CR法による AQ 27受容体遺伝子 の取得
クローンテック マウス MTC P a n e 1の脳 c DNAを铸型として、 以下の 2種類の合成 DNAを用いて、 P CRによる増幅を行った。
Fl 5-CGTCGACGCATGCAGGCGCTCAACATCACCGCG-3' (配列番号： 25) R2 5-CATCGATATTACAGTTCATGTCCACTGCCGAAAGTA-3' (配列番号： 26)
P CRの反応液は c DNA溶液 1 m i c r o 1、 0. 5 m i c r o 1 F l (10m i c r oM) 、 0. 5 m i c r o 1 R 1 (10m i c r oM) 、 5 m i c r o 1添付の 5 反応液、 2. 5 m i c r o 1 Gcme l t、 2. 5 m i c r o l d NT P (10 mM) 、 0. 5 m i c r o 1 Adv a n t a g e Gcme l t p o l yme r a s e Mi x クローンテック) 、 1 2. 5m i c r o 1大塚蒸留水を加えて合計 25 m i c r o 1にした。 反応液 を、 Th e rma l Cy c l e r 9600を用いて P C R反応にかけた。 PC Rの条件は 95°C- 2分の変性の後、 98°C* 10秒、 59°C。 20秒、 72°C · 1 20秒のサイクルを 35回繰り返した。 PCR産物の一部を用いて電気泳動 で約 1300 b pの P C R産物の増幅を確認した後、 P C R産物を Q u i a g e n PCR p u r i f i c a t i o n K i tを用いて精製し、 TAク口 一エングキット （ I n v i t r o g e n社） を用いて大腸菌 JM1 0 9にサブ クロー-ングし、 大腸菌 JM1 09/p CR 2. 1— mo u s e AQ 27を取 得した。 サブクローニングで得られた大腸菌からプラスミド p CR 2. 1— m o.u s e AQ 2 7を Qu i a g e n Q I Aw e 1 1 8 U l t r a P I a sm i d K i tを用いて抽出し、 揷入断片の塩基配列を決定し、 図 3 3で 示す配列がえられた。 図 3 3の DNA配列から予測されるアミノ酸配列は図 3 4に示すものであった。 またヒト型およぴラット型 AQ 27との相同性は図 3 5のようであり、 マウス型 AQ 27受容体であることが確認された。
参考例 1 9 RT— PCRによる AQ2 7受容体 mRNAのヒ トにおける組織 分布の検討
铸型となる c DNAには、 ヒ ト各種組織由来の p o 1 yA + RNA (クロン テック社） から以下の方法で合成したものを使用した。 RNA1 μ gからラン ダムプライマー、逆転写酵素として S u p e r S c r i p t l I逆転写酵素（G I BCO BRL社） を用い、 添付のマニュアルに従って 4 2°Cで反応を行い、 反応終了後にエタノール沈殿して 1 00 μ 1に溶解した。 RT—PCRは S e q u e n c e D e t e c t i o n S y s t em P r i sm 7 700 (PE B i o s y s t em s社） を用い、 増幅と検出のためのプライマーと して 5， 一CCAGAACATTTCCGACAACTG— 3' (配列番号： 2 7) , 5' — ACAGCGGTAGACTGGACAAA— 3' (配列番 号： 28) およぴ T a qMa n p r o b eとして 5' — (F a m) 一 TG 列番号： 29) を使用した。 R T— P C R反応液は T a qMa n Un i v e r s a 1 PCR Ma s t e r M i (P E B i o s y s t em s社) 1 2. 5 μ 1に、 それぞれ 1 00 /zMのプライマー溶液を 0. 0 5 1、 5 μ Μの T a qMa n 1： 01) 6を0. 5 μ 1、 および上記で調製した c DNA 溶液を 0. 5 1カロえ、 蒸留水で総反応液量を 25 1とした。 P C R反応は 50°C · 2分、 95 °C · 1 0分の後、 9 5。C · 1 5秒、 60°C · 1分のサイク ルを 40回繰り返した。 得られたヒト各種組織における AQ 2 7受容体の mR NA発現量は t o t a l RNA 2 5 n gあたりのコピー数として算出した (図 3 6) 。
参考例 2 0 RT— P CRによる AQ 2 7受容体 mRNAのラットにおける組 織分布の検討
铸型となる c DNAには、 ラット各種組織由来の p o 1 yA+RNAから以 下の方法で合成したものを使用した。 RNA 1 z gからランダムプライマー、 逆転写酵素として S u p e r S c r i p t l l逆転写酵素 （G I B C O BRL 社） を用い、 添付のマニュアルに従って 4 2 °Cで反応を行い、 反応終了後にェ タノール沈殿して 1 0 0 μ 1に溶解した。 RT— P CRは S e q u e n c e D e t e c t i o n S y s t e m P r i s m 7 7 0 0 (P E B i o s y s t e m s社） を用い.、 増幅と検出のためのプライマーとして 5 ' —CGG AAGCCTGGGAATTCTG - 3' (配列番号： 3 0) , 5' —ATG TGTCTCCTTTGGTTTCTTCCA— 3' (配列番号： 3 1 ) よ ぴ T a qMa n p r o b eとして 5， 一 (F a m) — AGCAAAGTTA TCTCGACCACAGCGTCCA- (T am r a) — 3' (配列番号： 3 2) を使用した。 RT— P CR反応液は T a qMa n Un i v e r s a l P CR Ma s t e r M i x (P E B i o s y s t e m s社） 1 2. 5 μ 1に、 それぞれ 1 00 /ζΜのプライマー溶液を 0. 0 5 μ 1、 5 JuMのT a cl Ma n p r o b eを 0. 5 μ 1、 および上記で調製した c DNA溶液を 0. 5 μ 1加え、 蒸留水で総反応液量を 2 5 1とした。 P C R反応は 5 0°C · 2 分、 9 5°C ' 1 0分の後、 9 5°C ' 1 5秒、 6 0°C · 1分のサイクルを 4 0回 繰り返した。 得られたラット各種組織における AQ 2 7受容体の mRNA発現 量は t o t a l RNA 2 5 n gあたりのコピー数として算出した（図 3 6)。 参考例 2 1 RT— P CRにょる新規分泌蛋白質GのmRNAのラットにお ける組織分布の検討
W i s t a rラットより各種臓器を摘出し、 t o t a l RNAをI s o g e n (二ツボンジーン社） 、 p o 1 y (A) +RNAを mRNA ' p u r i f i c a t i o n k i t (P h a rm a c i a社） により、 それぞれのマ ニュアルにしたがって調製した。 得られた o 1 y .(A) +RNA 1 μ gを D n a s e I (Amp l i f i c a t i o n G r a d e , G I B CO B RL社） 処理後、 1 6 0 n g分を RNA P CR K i t (T a k a r a社） を用いて、 マニュアルに従い 4 2°Cで c DNAを合成した。 合成された c D NAは p o 1 y (A) +RNA換算で 4 n g/μ 1の溶液とし、 以後の RT— P CRの錶型として用いた。 RT— P CRは S e q u e n c e D e t e c t i o n S y s t em P r i s m 7 700 ( P E B i o s y s t e m s社） を用い、 増幅と検出のためのプライマーとして 5 ' — AGCACA CTGGCTTCCGTCTAG— 3， （配列番号： 3 3) ， 5， 一 CGC TGGC CTTCTCTGAGTC A— 3 ' (配列番号： 34) および T a qMa n p r o b eとして 5 ' — (F a m) AGGCAGGACAGTG GC A.GTGAAGC C- (T a m r a ) 一 3 ' (配列番号： 3 5 ) を使用 した。 RT— P CR反応液は T a qMa n Un i v e r s a l P GR Ma s t e r M i x (P E B i o s y s t e m s社） 1 2. 5 1に、 それぞれ 1 0 0 のプライマー溶液を 0. 2 2 5 μ 1、 5 JuMのT a clM a n p r o b eを 1. 2 5 μ 1、および上記で調製した c D N A溶液を 0. 5 μ 1カ卩え、 蒸留水で総反応液量を 2 5 μ 1 とした。 P CR反応は 5 0 °C · 2分、 9 5°C · 1 0分の後、 9 5。。 · 1 5秒、 6 0 °C · 1分のサイクルを 4 0回繰り返した。 得られたラット各種組織における新規分泌蛋白質 Gの mR NA発現量は p o 1 y (A) +RNA 1 n gあたりのコピー数として算出し た （図 3 7) 。
参考例 2 2 RT— PCRによる新規ヒト型分泌蛋白質の mRN Aのヒトにお ける組織分布の検討
mRNAの発現量検出のための RT_P CRの铸型となる c DNAには、 ヒ ト各種糸且織由来の p o 1 yA + RNA (クロンテック社） から以下の方法で合 成したものを使用した。 RNA1 gからランダムプライマー、 逆転写酵素と して S u p e r S c r i p t l l逆転写酵素 （G I BCO BRL社） を用い、 添付のマニュアルに従って 42°Cで反応を行い、 反応終了後にエタノール沈殿 して 1 00 μ 1に溶解した。 発現量の定量は S e q u e n c e D e t e c t i o n S y s t em P r i s m 7 700を用いて行った。 増幅と検出の ためのプライマーとして 5' - TGAGAGCTTCACAGCCACA-3'
(配列番号： 36) , 5' -AGCTGAAGCCGCCTTTCTT-3' (配 列番号： 3 7) および T a qMa n p r o b eとして 5' — (F am)AACC TGGCTGAGGAGCTCAATGGCTA- (T amr a)- 3' (配列番 号： 38 ) を使用した。 R T— P C R反応は参考例 1 9と同様の方法で行った。 得られたヒト各種組織における新規ヒト型分泌蛋白質の mRNA発現量は p o 1 y (A) +RNA 1 n gあたりのコピー数として算出した （図 38 ) 。 参考例 23 i n s i t uハイブリダィゼーシヨン法による新規分泌蛋白質 mRNAのラット脳における発現分布の検討
Wi s t a rラットをネンブタール麻酔下で開腹し、 左心室から 0. 9 %食 塩水を 5分間.灌流し、 続いて 4 %パラホルムアルデヒド溶液を 5分間灌流した。 取り出した脳を同溶液中に 24時間 4°Cで浸漬したのち、 30%スクロース溶 液に置換し， 4°Cで 3日間浸漬し、 解析に供する脳のサンプルを得た。
新規分泌蛋白質ァンチセンス、 センスプローブは以下の方法で調製した。 まず、 プラスミドベクター p CR I I TOPO (インビトロジェン社） に 自体公知の方法でラット型 AQ 27リガンド c DNAを挿入した。 この c DN Aを、 Ml 3プライマー （インビトロジェン社） - Ad v a n t a g e GC 2ポリメラーゼ （クロンテック社） を用いた PC Rにて増幅'直鎖化し、 エタ ノール沈殿法により精製した。 この c DNAから、 D I G RNA L a b e l l i n g K I T (S P 6/T 7) (ロッシュ社） にて S P 6もしくは T 7による i n v i t r o t r a n s c r i p t i o nを行レヽ (40 1ス ケール） 、 生成された D I Gラベルリポプロープをエタノール沈殿により精製 した。 精製したプローブは大塚精製水 1 00 μ 1に溶解した。 c DNAの揷入 方向から、 S Ρ 6により生成された D I Gラベルリボプローブがアンチセンス プローブ、 Τ 7により生成された D I Gラベルリボプローブがセンスプローブ Οつた。
I n s i t uハイブリダィゼーシヨンにはフリーフローティング法を使用 した。 まずクライオスタツト CM30 50 (ライカ社） を用いて 40 mの厚 さの前頭断凍結切片を作製した。 つぎに切片を PB Sで洗浄した後、 m l P r o t e i n a s e Kを含む l OmM T r i s— HC 1 / 1 mM EDTA (pH8. 0) 処理 （3 7°C * 1 5分） にてプロテアーゼ処 理を行った。 さらに、 0. 2 5%無水酢酸を含む 0. 1Mトリエタノールアミ ン （pH8. 0) による処理 （室温' 1 0分） にてァセチル化を行った後、 h y b r i d i z a t i o n b u f f e r (50%ホノレムアミ ド， 1 0m M T r i s— HC 1 ρΗ7. 5, lxD e n h a r d t's s o l u t i o n, 200 μ g/m 1 t RNA, 1 0%デキストラン硫酸， 60 OmM N a C 1 , 0. 25% SDS, 1 mM E D T A) による処理 （ 60 °C · 20 分) にて p r e— h y b r i d i z a t i o n反応を行った。 Hy b r i d i z a t i o n反応には、 h y b r i d i z a t i o n b u f f e rでアンチ センスプローブもしくはセンスプローブを 1 000倍に希釈し、 8 5°Cで 3分 変性した後、 切片に加え 60°Cで 1 2時間以上反応させた。 引き続き、 非特異 的に h y b r i d i z a t i o nしたプローブを洗浄するため以下の操作を行 つた。 1) 2XS S C (S S C ； lxS S C= 1 50 mM N a C 1 , 1 5 m Mクェン酸ナトリウム， pH7. 0) Z50%ホルムアミド処理 （60。C · 1 5分 · 2回） 、 2) ΤΝΕ (0. 5Μ Na C l , 1 0 mM T r i s一 HC 1 (pH7. 6) , 1 mM EDTA) 処理 ( 3 7 °C · 1 0分） 、 3) 20m g/m 1 RN a s e A i n TNE処理 （3 7°C ' 3 0分） 、 4) TN E処理 ( 3 7 °C · 1 0分） 、 5) 2xS S C処理 （60°C · 1 5分' 2回） 、 6) 0. 5xS S C処理 （60°C · 1 5分 · 2回） 。 以上の操作を行った後、 D I Gラベルプローブを検出するための免疫組織化学を行った。 まず、 D I G— 1 (1 00 mM T r i s -HC 1 p H 7. 5, 1 50 mM Na C l , 0. 1 % Twe e n 20) で洗浄した後、 1. 5% 'B l o c k i n g r e a g e n t (ロッシュ社） を含む D I G— 1による処理 （ 3 7 °C · 1時間） に て非特異反応のブロッキングを行い、 a n t i— D I G f a b— f r a gm e n t a n t i b o d y c o n j u g a t e d w i t h a l k a l i n e p h o s p h a t a s e (口ッシュ社） を含む D I G— 1 (1 : 1 00 0) を室温で 1時間反応させた。 D I G— 1で十分洗浄した後、 D I G— 3 ( l O OmM T r i s -HC 1 p H 9. 5, 1 00 mM Na C l , 50m M Mg C 12) でリンスし、, 0. 1 8mg/m 1 5— b r omo—4— c h l o r o— 3— i n d o l y l— p h o s p h a t e (BC I P) を含むジ メチルホノレムアミド、および 0. 34 m gZm 1 4— n i t r o b l u e t e t r a z o 1 i urn (NBT) を含む 70%ジメチルホルムアミドを、 D I G- 3 1m lにっきそれぞれ 3. 5m lおよび 4. 5m l加えた溶液によ つて、 室温にて発色反応を行った。 適時に発色を PB S洗浄により止めた後、 切片をスライドガラスに載せ、 90%グリセロールを含む PB Sで封入し、 光 学顕微鏡で観察した。
アンチセンスプローブにて特異的に発色していたのは、 視床下部の r e t r o c h i a sma t i c a r e aを中' に、 a r c u a t e n u c 1 e u sの吻側、 特に背側部 ·外側部にかけてであった。 これらの領域においてセン スプローブによる発色は検出されなかった。
上 きlLでは、 c o c a i n e— a n d amp n e t am i n e— r e g u 1 a t e d t r a n s c r i p t (CART) .、 POMCが発現し （と もに摂食抑制）、またレブチン受容体が高濃度に存在することが知られている。 このことから、 AQ 2 7リガンドは摂食を制御すると考えられる。 a r c u a t e nu c l e u sは GHRHの存在する部位で、 正中隆起外層に投射する 神経があることが知られている。 このことから、 新規分泌蛋白質は神経内分泌 に関与すると考えられる。 さらに、 参考例 24に記す AQ 2 7mRNAの分布 と併せ考えると、 新規分泌蛋白質が睡眠 ·覚醒、 痛覚、 交感神経系、 自発行動 •情動行動等を制御 ·修飾すると考えられる。
参考例 24 i n s i t uハイブリダィゼーシヨン法による AQ 27mRN
Aのラット脳における発現分布の検討
Wi s t a rラットをネンブタール麻酔下で開腹し、 左心室から 0. 9 %食 塩水を 5分間権流し、 続いて 4 %パラホルムアルデヒド溶液を 5分間灌流した。 取り出した脳を同溶液中に 24時間 4°Cで浸漬したのち、 30%スクロース溶 液に置換し， 4°Cで 3日間浸漬し、 解析に供する脳のサンプルを得た。
AQ 27アンチセンス、 センスプロープは以下の方法で調製した。
まず、 プラスミドベクター p CR I I TOPO (インビトロジェン社） に 自体公知の方法でラット型 AQ27 c DNAを挿入した。 この cDNAを、 M 1 3プライマー （インビトロジェン社） - Ad v a n t a g e, GC 2ポリメ ラーゼ （クロンテック社） を用いた PC Rにて増幅'直鎖化し、 エタノール沈 殿法により精製した。 この c DNAから、 D I G RNA L a b e l 1 i n g K I T (S P 6/T 7) (ロッシュ社） にて S P 6もしくは T 7による i n v i t r o t r a n s c r i p t i o nを ITレヽ ( 40 1スケーノレ) 、 生成された D I Gラベルリボプローブをさらに 4 OmM N a HCO 3, 60 mMN a 2C03 pH 1 0. 2により 400 b pにアルカリ加水分解した後ェ タノール沈殿により精製した。 精製したプローブは大塚精製水 1 00 μ 1に溶 解した。 c DNAの挿入方向から、 S P 6により生成された D I Gラベルリボ プローブがアンチセンスプローブ、 T 7により生成された D I Gラベルリボブ 口一ブがセンスプローブであった。
I n s i t uハイブリダィゼーシヨンにはフリーフローテイング法を使用 した。 まずクライオスタツト CM30 50 (ライカ社） を用いて 40 /zmの厚 さの前頭断凍結切片を作製した。 つぎに切片を PB Sで洗浄した後、 1 μ gZ m l P r o t e i n a s e Kを含む 1 OmM T r i s— HC l/lmM EDTA (pH8. 0) 処理 （37°C . 1 5分） にてプロテアーゼ処理を行つ た。 さらに、 0. 25%無水酢酸を含む 0. 1Mトリエタノールァミン （pH 8. 0) による処理 （室温 · 1 0分） にてァセチル化を行った後、 h y b r i d i z a t i o n b u f f e r (50 %ホルムァミ ド， 1 0 mM T r i s -HC 1 p H 7. 5， lxD e nh a r d t's s o l u t i o n, 200 μ g/m 1 t RNA, 1 0%デキストラン硫酸， 600 mM Na C 1 , 0. 2 5% SDS， ImM E D T A) による処理 （ 60 °C · 20分） にて p r e— h y b r i d i z a t i o n反応を行った。 Hy b r i d i z a t i o n 反応には、 h y b r i d i z a t i o n b u f f e rでアンチセンスプロ一 ブもしくはセンスプローブを 1 000倍に希釈し、 8 5°Cで 3分変性した後、 切片に加え 60°Cで 1 2時間以上反応させた。 引き続き、 非特異的に h y b r i d i z a t i o nしたプローブを洗浄するため以下の操作を行った。 1) 2 xS S C (S S C ; lxS S C= 1 50 mM N a C 1 , 1 5mMクェン酸ナト リウム， pH7. 0) /50%ホルムアミ ド処理 （60°C · 1 5分 · 2回） 、 2) TNE (0. 5M N a C 1 , 1 0 mM T r i s— HC 1 (pH7. 6 ) ， ImM EDTA) 処理 （3 7°C . 1 0分） 、 3) 2 Omg/m 1 RN a s e A i n TNE処理 （37°C · 30分） 、 4) TNE処理 （3 7°C · 1 0分） 、 5) 2xS S C処理 （60°〇 ' 1 5分' 2回） 、 6) 0. 5xS S C処理 （60°C · 1 5分. 2回） 。 以上の操作を行った後、 D I Gラベルプロ ーブを検出するための免疫組織ィヒ学を行った。 まず、 D I G— 1 (1 00 mM T r i s—HC l p H7. 5， 1 50 mM N a C 1 , 0. 1 % Twe e n 20) で洗浄した後、 1. 5% B l o c k i n g r e a g e n t (口 ッシュ社） を含む D I G— 1による処理 （3 7°C、 1時間） にて非特異反応 の'ブロッキングを行い、 a n t i -D I G f a b— f r a gme n t a n t i b o d y c o n j u g a t e d w i t h a l k a l i n e p h o s p h a t a s e (口ッシュ社） を含む D I G— l (1 : 1 000) を室温で 1時間反応させた。 D I G— 1で十分洗浄した後、 D I G— 3 ( 1 00 mM T r i s— HC 1 p H 9. 5, 1 00 mM N a C 1 , 50 mM Mg C 1 2) でリンスし、 0. I SmgZm l 5— b r omo_4— c h l o r o_ 3— i n d o l y l — p h o s p h a t e (BC I P) を含むジメチルホルムァ ミド、 ぉょぴ 0. 34 m g /m 1 4— n i t r o b l u e t e t r a z o 1 i urn (NBT) を含む 70%ジメチルホルムアミドを、 D I G— 3 1 m lにっきそれぞれ 3. 5m lおよび 4. 5 m 1加えた溶液によって、 4°Cに て一晩発色反応を行った。 適時に発色を PB S洗浄により止めた後、 切片をス ライドガラスに載せ、 90%グリセロールを含む PB Sで封入し、 光学顕微鏡 で観察した。
アンチセンスプローブにて特異的に発色していたのは、 p i r i f o r m c o r t e x (梨状皮質) 、 c o r t e x— amy g d a r a t r a n s i t i o n z o n e (皮質焉挑移行帯） 、 v e n t r a l p a l l i d um (淡蒼球) 、 l a t e r a l p r e o p t i c a r e a (視索目 ij野) 、 v e n t r ome d i a l h y p o t h a l am i c n u c l e u s (腹内 側核) 、 z o n a i n c e r t a (不確帯) 、 p o s t e r o r h y p o t h a l am i c a r e a (視床下咅 |5後核) 、 ma r g i n a l z o n e me d i a n g e n i c u l a t e (内側膝状周辺帯) , d o r s a l r a p h e n u c l e u s (背側鏠線核) 、 n u c l e u s o f o r a c h i um i n f e r i o r c o l l i c u l u s (下丘腕核) 、 i n t e r g e n i c u l a t e l e a f (膝状体間小葉） 、 l o c u s c o e r u 1 e u s (青斑核) 、 c e n t r a l g r a y, a l p h a - b e t a p a r t (中心灰白質） 等であった （図 39) 。 特に d o r s a 1 r a p h e n u c l e u s (背側縫線核） 、 l o c u s c o e r u l e u s (青斑核） では強レ、発色が認められた。 これらの領域ではセンスプローブによる発色は検 出されなかった。
以上の結果から、 新規分泌蛋白質 ZAQ 27は視床下部で統合された情報を 大脳一脳幹に伝達する役割を担うと考えられた。 具体的には、 1) 摂食、 2) 睡眠 ·覚醒、 3) 痛覚、 4) ストレス応答、 5) 自発行動 ·情動行動等の制御 -修飾作用が示唆された。
参考例 25 新規ヒト型分泌蛋白質遺伝子を導入した CHO細胞上清中の AQ 27特異的活性成分の精製
まず定法により、 新規ヒト型分泌蛋白質遺伝子全長 （配列番号： 24) を発 現ベクター p AKKO— H 1 1 1に導入した。 このベクターをリボフエタトァ ミン 2000 (G i b e o-BRL) を用いてトランスフエクシヨンし、 一過 性に CHO細胞において新規ヒト型分泌蛋白質を発現させ、 培養上清を取得し た。 この培養上清中に、 ベクターのみを導入した CH〇細胞 （mo c k CH O細胞） の培養上清と比較して、 HEK細胞に一過性に発現させたォーファン レセプタ一 AQ 2 7に対して特異的な刺激活性を見出した （図 40) 。 AQ 2 7特異的な刺激活性の検出は、 c AMPレスポンスエレメント （CRE) プロ モーターの発現誘導によって産生されるレポーター遺伝子産物 （ルシフェラー ゼ） の発現量を指標に行った。
次に、 この発現ベクターを、 ジーントランスファー （和光純薬） を用いて C HO d h f r一細胞にトランスフエクションし、 ヒト型 AQ 27リガンド遺伝 子を恒常的に発現する CHO細胞を取得した。 この新規ヒト型分泌蛋白質遺伝 子発現 CHO細胞を培養し、 培養上清を得た。
培養上清からの精製にあたって、 既知 RFアミドペプチドを認識する抗体が 新規ヒト型分泌蛋白質を認識し得るか、 液相の競合法で検討したところ、 抗 R FRP- 1抗体の 1 F 3 _ 1がヒト型分泌蛋白質の C末端構造を認識すること が判明した （図 4 1) 。 '
培養上清を 2. 4 L取得し、 1 F 3— 1抗体を用いたァフィ二ティー精製を 行った。 まず、 上清を煮沸し、 遠心にて析出物を取り除き、 1 F 3— 1抗体を 結合させた NHS— a c t i v a t e d S e p h a r o s eカラム （アマシ ャムバイオサイエンス） にアプライした。 カラムを 1. OM N a C 1を加え た PB S (P h o s p h a t e Bu f f e r e d S a l i n e) にて洗浄 後、 .0. 5Mn a C lを含む 0. 2M G l y c i n e -HC 1 pH2. 2 で 1 F 3_ 1抗体を結合させた NHS— a c t i v a t e d S e p h a r o s eカラムに結合した成分を溶出した。 この溶出画分を， Vy d a c C 1 8 2 1 8 TP 54 1 5カラムにアプライし、 20〜35%ァセトニトリルの濃度 勾配で溶出したところ、 2つのピークの AQ 27特異的な刺激活性が検出され た (図 42) 。 それぞれの活性ピークを; u RPC C 2/C 1 8 S C 2. 1 /\ 0カラムで分離したことろ、 それぞれ活性ピークは 2つに分かれ合計 4つ の活性ピーク：！〜 4が得られた （図 4 3および図 44) 。
4つの活性画分に含まれるペプチドの分子量を MALD I一 TO F— MSで 測定した。 図 4 3および図 44に示されるそれぞれの活性ピークに含まれるぺ プチドの測定分子量とそれらに対応するヒト型分泌蛋白質遺伝子から推測され る分子量の理論値およびアミノ酸配列を図 45に示す。
参考例 26 長さの異なるヒト型ぺプチドの AQ 27発現 CHO細胞株に対す る cAM P産生抑制試験
AQ 27を発現させた CHO細胞を、 96穴プレート （ファルコン） に 4x1 04個 /we 1 1でまき、 3 7°C、 5 % C O 2 · 9 5% a i rでー晚培養した。 アツセィ用バッファ一として、 H a n k s，B a 1 a n c e d S a l t S o 1 u t i o n (ギブコ） に、 終濃度 0. 1% ゥシ血清アルブミン （B SA、 シグマ） 、 200 M 3- i s o b u t y l— 1— m e t h y l x a n t h i n e (シグマ） 、 20mM HEPES (p H7. 4) (ギブコ） を加え たものを調製した。 試料希釈用パッファーとしてアツセィ用バッファ一に終濃 度 2 μΜ フォルスコリンを添加したものを作成、 これを用い図 46に示した 試料ペプチドを、 2x1 0— 6Μ、 2x1 0— 7Μ、 2x1 0— 8Μ、 2x1 0— 9Μ、 2xl 0— 10Μ、 2x1 0— HMに希釈した。 ー晚培養した細胞は、 アツセィ用バ ッファー 1 5 0 1で二回洗浄後交換して 30分、 3 7°C、 1 00% a i r で培養し、 同様に 2回洗浄して、 アツセィ用バッファー 50 1、 試料溶液 5 0 μ 1を添加し、 攪拌した後 30分、 3 7°C、 1 00% a i rで培養した。 細胞内 c AMP量を、 c AMP— S c r e e n™ S y s t em (AB I ) を 用い、 本キットのプロトコールに従い測定した。 Ma x i mam l e v e l の c AM P.量と各サンプノレを添加した時の c AMP量の差を算出して、 フオル スコリンによる c AMP産生促進量に対する百分率を算出し、 これを c AMP の産生の抑制率とした （図 47) 。 図 46に各試料の EC 50値を示す。 この結 果から、 本発明のヒト型ペプチドが AQ 2 7受容体を介して細胞内 c AMP産 生抑制活性を示すことが明らかになった。
実施例 1 新規ヒト型分泌蛋白質のラットコルチコステロンの分泌刺激活性
AQ 2 7受容体がラット副腎で高い発現をしていることから、 副腎ホルモン の分泌に作用する可能性があるため、 図 46に記載の AQ 2 7 L— 43をラッ トに投与して副腎皮質ホルモンに対する影響を調べた。 8週齢のォス Wi s t a rラットを軽く固定し尾静脈から AQ 2 7 L_43を生理食塩水に溶解し 0. 5mgZラットの濃度で投与し 30分後に断頭により採血を行った。 またコン トロールとして生理食塩水を投与したラットから採血した。 これらの血清成分 をラットコルチコステロン測定キット (アマ一シャム社） を用いて測定したと ころ AQ 2 7投与ラットで血中コルチコステロンの上昇が観察できた。
実施例 2 新規ヒト型分泌蛋白質のラットコルチコステロンの分泌刺激活性
AQ 2 7受容体がラット副腎で高い発現をしていることから、 副腎ホルモン の分泌に作用する可能性があるため、 図 46に記載の AQ 27 L— 43をラッ トに投与して副腎皮質ホルモンに対する影響を調べた。 8週齢のォス Wi s t a rラットに力-ユレーションを行い静脈から AQ 2 7 L— 43を生理食塩水 に溶解し 0. 5mg ラットの濃度で投与し採血を行った。 またコント口ール として生理食塩水を投与したラットから採血した。 これらの血清成分をラット コルチコステロン測定キット （アマ一シャム社） を用いて測定したところ AQ 2 7 L-43投与ラットで血中コルチコステロンの上昇傾向が観察できた （図 4 8) 。
実施例 3 新規ヒト型分泌蛋白質のラットテストステロンの分泌刺激活性
AQ 2 7受容体がラット副腎で高い発現をしていることから、 副腎ホルモン の分泌に作用する可能性があるため、 図 46に記載の AQ 27 L— 4 3をラッ トに投与して副腎皮質ホルモンに対する影響を調べた。 8週齢のォス Wi s t a rラットにカ二ユレーシヨンを行い静脈から AQ 2 7 L-43を生理食塩水 に溶解し 0. 5 m g Zラットの濃度で投与し採血を行った。 またコントロール として生理食塩水を投与したラットから採血した。 これらの血清成分をラット テストステロン測定キット （日本シエーリング社） を用いて測定したところ A Q 27 L-43投与ラットで血中テストステロンの上昇傾向が観察できた （図 49) o
実施例 4 新規ヒト型分泌蛋白質のラットアルドステロンの分泌刺激活性
AQ 2 7受容体がラット副腎で高い発現をしていることから、 副腎ホルモン の分泌に作用する可能性があるため、 図 46に記載の AQ 27 L— 4 3をラッ トに投与して副腎皮質ホルモンに対する影響を調べた。 8週齢のォス Wi s t a rラットに力-ュレーシヨンを行い静脈から AQ 2 7 L— 43を生理食塩水 に溶解し 0. 5mg/ラットの濃度で投与し採血を行つた。 またコント口ール として生理食塩水を投与したラットから採血した。 これらの血清成分をラット アルドステロン測定キット （日本ダイナポット社） を用いて測定したところ A Q 27 L— 43投与ラットで血中アルドステロンの上昇が観察できた（図 50) 実施例 5 新規ヒト型分泌蛋白質のラットアルドステロン分泌刺激活性の時間 経過と濃度依存性
AQ 2 7受容体がラットアルドステロンの分泌に作用があるため、 図 46に 記載の AQ 2 7 L— 43をラットに投与して時間経過と濃度依存性を調べた。 8週齢のォス W i s t a rラットにカニュレーションを行い静脈から AQ 27 L一 43を生理食塩水に溶解し 4 nmo lZk g、 40 nmo 1 k g, 40 0 nmo 1/k gの濃度で投与し採血を行つた。 またコント口ールとして生理 食塩水を投与したラットから採血した。 これらの血清成分をラットアルドステ 口ン測定キット （日本ダイナボット社） を用いて測定したところ 40 nmo 1 /k g、 400 nmo 1 /k gの AQ 27 L— 43投与ラットで血中アルドス テロンの上昇が観察できた （図 51) 。 産業上の利用可能性
本発明の新規分泌蛋白質は副腎皮質ホルモン分泌調節作用を有しており、 本発明の新規分泌蛋白質またはその DNAは、 副腎皮質ホルモン分泌調節剤 などとして有用である。.
さらに、 本発明の新規分泌蛋白質と結合する AQ 27受容体は、 本発明の 新規分泌蛋白質と A Q 2 7受容体との結合性を変化させる化合物のスクリー ユングに有用であり、 スクリーニングで得られる化合物は副腎皮質ホルモン 分泌調節剤として使用することができる。

Claims

請求の範囲
1. 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そのアミ ドもしくはそ のエステルまたはその塩を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌調節剤。
2. 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列が配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 5または配列番号： 7 で表わされるァミノ酸配列である請求項 1記載の剤。
3. 部分ペプチドが、
(1) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の第 80番目〜 88番目のアミ ノ酸配列または第 127番目〜 133番目のアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のァミノ酸配列を含有するぺプチド、
' (2) 配列番号： 3で表わされるアミノ酸配列の第 1 16番目〜 122番目の アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するぺプチド (3) 配列番号： 5で表わされるアミノ酸配列の第 1 16番目〜 122番目の アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するぺプチド または
(4) 配列番号： 7で表わされるアミノ酸配列の第 1 25番目〜 131番目の ァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するぺプチド である請求項 1記載の剤。
4. 部分ペプチドが、
(1) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の第 90番目〜 133番目のァ ミノ酸配列、 第 91番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 93番目〜 133番 目のアミノ酸配列、 第 104番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 108番目 〜133番目のアミノ酸配列、 第 109番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 1 11番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 1 15番目〜 133番目のァミノ 酸配列、 第 1 19番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 124番目〜 133番 目のアミノ酸配列、 第 126番目〜 133番目または第 127番目〜 133番 目のアミノ酸配列からなるぺプチド、 (2) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の第 9 1番目〜 1 3 3番目のァ ミノ酸配列からなるぺプチドの N末端のグルタミン残基 （G i n) がピロダル タミン化されているペプチド、 または
(3) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の第 9 0番目〜 1 3 3番目のァ ミノ酸配列からなるペプチドの N末端のアルギニン残基 （Ar g) がチロシン 残基 （Ty r) に置換されているペプチドである請求項 1記載の剤。
5. 副腎皮質ホルモン分泌促進剤である請求項 1記載の剤。
6. 低アルドステロン症、 低コルチゾール血症、 続発性または慢性副腎皮質機 能低下症、 アジソン病、 副腎機能不全、 痛みまたは肥満の予防 ·治療剤である 請求項 5記載の剤。
7. 配列番号： 1で表わされるァミノ.酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する分泌蛋白質またはその部分ぺプ.チドをコードするポリヌ クレオチドを含有してなる副腎皮質ホルモン分泌調節剤。
8. 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列が配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 5または配列番号： 7 で表わされるァミノ酸配列である請求項 7記載の剤。
9. 部分ペプチドが、
(1) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の第 80番目〜 8 8番目のアミ ノ酸配列または第 1 27番目〜 1 3 3番目のアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のァミノ酸配列を含有するぺプチド、
(2) 配列番号： 3で表わされるアミノ酸配列の第 1 1 6番目〜 1 22番目の ァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するぺプチド,
(3) 配列番号： 5で表わされるアミノ酸配列の第 1 1 6番目〜 1 2 2番目の アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するぺプチド. または
(4) 配列番号： 7で表わされるアミノ酸配列の第 1 25番目〜 1 3 1番目の 了ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するぺプチド である請求項 7記載の剤。
1 0. 部分べプチドが、 (1) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の第 90番目〜 133番目のァ ミノ酸配列、 第 91番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 93番目〜 1 33番 目のアミノ酸配列、 第 104番目〜 1 33番目のアミノ酸配列、 第 108番目 〜1 33番目のアミノ酸配列、 第 109番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 11 1番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 1 15番目〜 1 33番目のァミノ 酸配列、 第 1 19番目〜 133番目のアミノ酸配列、 第 124番目〜 1 33番 目のアミノ酸配列、 第 126番目〜 1 33番目または第 127番目〜 1 33番 目のアミノ酸配列からなるぺプチド、
(2) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の第 91番目〜 133番目のァ ミノ酸配列からなるぺプチドの N末端のグルタミン残基 （G 1 n) がピロダル タミン化されているペプチド、 または
(3) 配列香号： 1で表わされるアミノ酸配列の第 90番目〜 133番目のァ ミノ酸配列からなるペプチドの N末端のアルギニン残基 （Ar g) がチロシン 残基 （Ty r) に置換されているペプチドである請求項 7記載の剤。
11. 副腎皮質ホルモン分泌促進剤である請求項 7記載の剤。
12. 低アルドステロン症、 低コルチゾール血症、 続発性または慢性副腎皮質 機能低下症、 アジソン病、 副腎機能不全、 痛みまたは肥満の予防 ·治療剤であ る請求項 1 1記載の剤。
13. 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有する分泌蛋白質またはその部分べプチドをコードするポリ ヌクレオチドを含有してなる低アルドステロン症、 低コルチゾール血症、 続発 性または慢性副腎皮質機能低下症、 アジソン病、 副腎機能不全、 痛み、 肥満、 クッシング病、 クッシング症候群、 副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、 C RH産生腫瘍、 アルドステロン産生腫瘍、 アルドステロン症、 原発性コルチゾ ール抵抗症、 先天性副腎酵素欠乏症、 ストレス、 うつ病、 神経性食欲不振症、 不眠、 胃 ·十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の診斬剤。
14. 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そのアミドもしくは そのエステルまたはその塩に対する抗体を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌 調節剤。 '
1 5 . 副腎皮質ホルモン分泌阻害剤である請求項 1 4記載の剤。
1 6 . クッシング病、 クッシング症候群、 副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫 瘍、 C R H産生腫瘍、 アルドステロン産生腫瘍、 アルドステロン症、 原発性コ ルチゾール抵抗症、 先天性副腎酵素欠乏症、 ス トレス、 うつ病、 神経性食欲不 振症、 不眠、 胃，十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の予防 ·治療剤である請 求項 1 5記載の剤。
1 7 . 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そのアミ ドもしくは そのエステルまたはその塩に対する抗体を含有してなる低アルドステロン症、 低コルチゾール血症、 続発性または慢性副腎皮質機能低下症、 アジソン病、 副 腎機能不全、 痛み、 肥満、 クッシング病、 クッシング症候群、 副腎皮質刺激ホ ルモン産生下垂体腫瘍、 C R H産生腫瘍、 アルドステロン産生腫瘍、 アルドス テロン症、 原発性コルチゾール抵抗症、 先天性副腎酵素欠乏症、 ストレス、 う つ病、 神経性食欲不振症、 不眠、 胃 ·十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の診 断剤。
1 8 . 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有する分泌蛋白質またはその部分べプチドをコードするポリ ヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンス ポリヌクレオチドを含有してなる副腎皮質ホルモン分泌調節剤。
1 9 . 副腎皮質ホルモン分泌阻害剤である請求項 1 8記載の剤。
2 0 . クッシング病、 クッシング症候群、 副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫 瘍、 C R H産生腫瘍、 アルドステロン産生腫瘍、 アルドステロン症、 原発性コ ルチゾール抵抗症、 先天性副腎酵素欠乏症、 ストレス、 うつ病、 神経性食欲不 振症、 不眠、 胃 ·十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の予防 ·治療剤である請 求項 1 9記載の剤。
2 1 . 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有する分泌蛋白質またはその部分べプチドをコードするポリ ヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンス ポリヌクレオチドを含有してなる低アルドステロン症、 低コルチゾール血症、 続発性または慢性副腎皮質機能低下症、 アジソン病、 副腎機能不全、 痛み、 肥 満、 クッシング病、 クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、 C R H産生腫瘍、 アルドステロン産生腫瘍、 アルドステロン症、 原発性コルチ ゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、 ストレス、 うつ病、神経性食欲不振症、 不眠、 胃 ·十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の診断剤。
2 2 . 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そのアミドもしくは そのエステルまたはその塩の機能を促進または阻害する化合物またはその塩を 含有してなる副腎皮質ホルモン分泌調節剤。
2 3 . 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そのアミドもしぐは そのエステルまたはその塩の機能を促進する化合物またはその塩を含有してな る副腎皮質ホルモン分泌促進剤。
2 4 . 低アルドステロン症、 低コルチゾール血症、 続発性または慢性副腎皮質 機能低下症、 アジソン病、 副腎機能不全、 痛みまたは肥満の予防 ·治療剤であ る請求項 2 3記載の剤。
2 5 . 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そのアミドもしくは そのエステルまたはその塩の機能を阻害する化合物またはその塩を含有してな る副腎皮質ホルモン分泌阻害剤。
2 6 . クッシング病、 クッシング症候群、 副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫 瘍、 C R H産生腫瘍、 アルドステロン産生腫瘍、 アルドステロン症、 原発性コ ルチゾール抵抗症、 先天性副腎酵素欠乏症、 ストレス、 うつ病、 神経性食欲不 振症、 不眠、 胃 ·十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の予防 ·治療剤である請 求項 2 5記載の剤。
2 7 . ·配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そのアミ ドもしくは そのエステルまたはその塩の発現を促進または阻害する化合物またはその塩を 含有してなる副腎皮質ホルモン分泌調節剤。
2 8 . 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そのアミドもしくは そのエステルまたはその塩の発現を促進する化合物またはその塩を含有してな る副腎皮質ホルモン分泌促進剤。
2 9 . 低アルドステロン症、 低コルチゾール血症、 続発性または慢性副腎皮質 機能低下症、 アジソン病、 副腎機能不全、 痛みまたは肥満の予防 ·治療剤であ る請求項 2 8記載の剤。
3 0 . 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そのアミ ドもしくは そのエステルまたはその塩の発現を阻害する化合物またはその塩を含有してな る副腎皮質ホルモン分泌阻害剤。
3 1 . クッシング病、 クッシング症候群、 副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫 瘍、 C R H産生腫瘍、 アルドステロン産生腫瘍、 アルドステロン症、 原発性コ ルチゾール抵抗症、 先天性副腎酵素欠乏症、 ストレス、 うつ病、 神経性食欲不 振症、 不眠、 胃 ·十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の予防 ·治療剤である請 求項 3 0記載の剤。
3 2 . 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミ ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容 体、 その部分ペプチドまたはその塩を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌調節 剤。
3 3 . 副腎皮質ホルモン分泌促進剤である請求項 3 2記載の剤。
3 4 . 低アルドステロン症、 低コルチゾール血症、 続発性または慢性副腎皮質 機能低下症、 アジソン病、 畐帽機能不全、 痛みまたは肥満の予防 ·治療剤であ る請求項 3 3記載の剤。
3 5 . 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミ ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容 体またはその部分ぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチドを含有してなる副腎 皮質ホルモン分泌調節剤。
3 6 . 副腎皮質ホルモン分泌促進剤である請求項 3 5記載の剤。
3 7 . 低アルドステロン症、 低コルチゾール血症、 続発性または慢性副腎皮質 機能低下症、 アジソン病、 副腎機能不全、 痛みまたは肥満の予防'治療剤であ る請求項 3 6記載の剤。
3 8 . 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミ ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容 体またはその部分べプチドをコ一ドするポリヌクレオチドを含有してなる低ァ ルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、 アジソ,ン病、 副腎裰能不全、 痛み、 肥満、 クッシング病、 クッシング症候群、 副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、 C R H産生腫瘍、 アルドステロン産生 腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、 ス トレス、 うつ病、 神経性食欲不振症、 不眠、 胃 ·十二指腸潰瘍または過敏性 腸症候群の診断剤。
3 9 . 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミ ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容 体、 その部分べプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる副腎皮質ホル モン分泌調節剤。
4 0 . 副腎皮質ホルモン分泌阻害剤である請求項 3 9記載の剤。
4 1 . クッシング病、 クッシング症候群、 副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫 瘍、 C R H産生腫瘍、 アルドステロン産生 S重瘍、 アルドステロン症、 原発性コ ルチゾール抵抗症、 先天性副腎酵素欠乏症、 ストレス、 うつ病、 神経性食欲不 振症、 不眠、 胃 ·十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の予防 ·治療剤である請 求項 4 0記載の剤。
4 2 . 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミ ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容 体、 その部分べプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる低アルドステ ロン症、 低コルチゾール血症、 続発性または慢性副腎皮質機能低下症、 アジソ ン病、 副腎機能不全、 痛み、 肥満、 クッシング病、 クッシング症候群、 副腎皮 質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、 C R H産生腫瘍、 アルドステ口ン産生腫瘍、 アルドステロン症、 原発性コルチゾール抵抗症、 先天性副腎酵素欠乏症、 スト レス、 うつ病、 神経性食欲不振症、 不眠、 胃 ·十二指腸潰瘍または過敏性腸症 候群の診断剤。
4 3 . 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミ ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容 体またはその部分べプチドをコ一ドするポリヌクレオチドと相補的な塩基配列 またはその一部を含有してなるアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる 副腎皮質ホルモン分泌調節剤。
4 4 . 副腎皮質ホルモン分泌阻害剤である請求項 4 3記載の剤。
4 5 . クッシング病、 クッシング症候群、 副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫 瘍、 C R H産生腫瘍、 アルドステロン産生腫瘍、 アルドステロン症、 原発性コ. + ルチゾール抵抗症、 先天性副腎酵素欠乏症、 ストレス、 うつ病、 神経性食欲不 振症、 不眠、 胃 '十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の予防'治療剤である請 求項 4 4記載の剤。
4 6 . 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミ ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容 体またはその部分べプチドをコ一ドするポリヌクレオチドと相補的な塩基配列 またはその一部を含有してなるアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる 低アルドステロン症、 低コルチゾール血症、 続発性または慢性副腎皮質機能低 下症、 アジソン病、 副腎機能不全、 痛み、 肥満、 クッシング病、 ダッシング症 候群、 副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、 C R H産生腫瘍、 アルドステロ ン産生腫瘍、 アルドステロン症、 原発性コルチゾール抵抗症、 先天性副腎酵素 欠乏症、 ストレス、 うつ病、 神経性食欲不振症、 不眠、 胃 ·十二指腸潰瘍また は過敏性腸症候群の診断剤。
4 7 . 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミ ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容 体、 その部分べプチドまたはその塩の機能を促進または阻害する化合物または その塩を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌調節剤。
4 8 . 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミ ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容 体、 その部分べプチドまたはその塩の機能を促進する化合物またはその塩を含 有してなる副腎皮質ホルモン分泌促進剤。
4 9 . 低アルドステロン症、 低コルチゾール血症、 続発性または慢性副腎皮質 機能低下症、 アジソン病、 副腎機能不全、 痛みまたは肥満の予防'治療剤であ る請求項 4 8記載の剤。
5 0 . 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミ ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容 体、 その部分べプチドまたはその塩の機能を阻害する化合物またはその塩を含 有してなる副腎皮質ホルモン分泌阻害剤。
5 1 . クッシング病、 クッシング症候群、 副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫 瘍、 C R H産生腫瘍、 アルドステロン産生腫瘍、 アルドステロン症、 原発性コ ルチゾール抵抗症、 先天性副腎酵素欠乏症、 ストレス、 うつ病、 神経性食欲不 振症、 不眠、 胃 ·十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の予防'治療剤である請 求項 5 0記載の剤。
5 2 . 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミ ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容 体、 その部分べプチドまたはその塩の発現を促進または阻害する化合物または その塩を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌調節剤。
5 3 . 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミ ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容 体、 その部分べプチドまたはその塩の発現を促進する化合物またはその塩を含 有してなる副腎皮質ホルモン分泌促進剤。
5 4 . 低アルドステロン症、 低コルチゾール血症、 続発性または慢性副腎皮質 機能低下症、 アジソン病、 副腎機能不全、 痛みまたは肥満の予防 ·治療剤であ る請求項 5 3記載の剤。
5 5 . 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミ ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容 体、 その部分べプチドまたはその塩の発現を阻害する化合物またはその塩を含 有してなる副腎皮質ホルモン分泌阻害剤。
5 6 . クッシング病、 クッシング症候群、 副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫 瘍、 C R H産生腫瘍、 アルドステロン産生腫瘍、 アルドステロン症、 原発性コ ルチゾ一ル抵抗症、 先天性副腎酵素欠乏症、 ストレス、 うつ病、 神経性食欲不 振症、 不眠、 胃 ·十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の予防 ·治療剤である請 求項 5 5記載の剤。
5 7 . ( 1 ) 配列番号： 1で表わされるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そのアミ ドも しくはそのエステルまたはその塩と （2 ) 配列番号： 9、 配列番号： 1 1また は配列番号： 1 3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容体、 その部分ペプチドまたはその塩との結 合性を変化させる化合物またはその塩を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌調 節剤。
5 8 . 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミ ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容 体、 その部分ペプチドまたはその塩に対するァゴニストを含有してなる副腎皮 質ホルモン分泌促進剤。
5 9 . 低アルドステロン症、 低コルチゾール血症、 続発性または慢性副腎皮質 機能低下症、 アジソン病、 副腎機能不全、 痛みまたは肥満の予防 · '治療剤であ る請求項 5 8記載の剤。
6 0 . 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミ ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容 体、 その部分ペプチドまたはその塩に対するアンタゴニストを含有してなる副 腎皮質ホルモン分泌阻害剤。
6 1 . クッシング病、 クッシング症候群、 副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫 瘍、 C R H産生腫瘍、 アルドステロン産生腫瘍、 アルドステロン症、 原発性コ ルチゾール抵抗症、 先天性副腎酵素欠乏症、 ストレス、 うつ病、 神経性食欲不 振症、 不眠、 胃 ·十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の予防 ·治療剤である請 求項 6 0記載の剤。
6 2 . 哺乳動物に対して、 ①配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一も しくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する分 、蛋白質、 その部分べプチド、 そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、 ②配列番号： 1で表わされる ァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する分泌蛋白 質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド、 ③配列番号： 1で 表わされるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有す る分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そのアミドもしくはそのエステルまたはそ の塩の機能を促進する化合物またはその塩、 ④配列番号： 1で表わされるアミ ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 その部^ペプチド、 そのアミ ドもしくはそのエステルまたはその塩の発現を促 進する化合物またはその塩、 ⑤配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号 ： 1 3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列 を含有する A Q 2 7受容体、その部分べプチドまたはその塩、⑥配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるァミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容体またはその部分ぺプ チドをコードするポリヌクレオチド、 ⑦配列番号： 9、 配列番号： 1 1または 配列番号： 1 3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有する A Q 2 7受容体、 その部分ペプチドまたはその塩の機能を 促進する化合物またはその塩、 ⑧配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番 号： 1 3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配 列を含有する A Q 2 7受容体、 その部分ペプチドまたはその塩の発現を促進す る化合物またはその塩または⑨配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号 ： 1 3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列 を含有する A Q 2 7受容体またはその塩に対するァゴニストの有効量を投与す ることを特徴とする （i ) 副腎皮質ホルモン分泌促進方法または （i i) 低アル ドステロン症、 低コルチゾール血症、 続発性または慢性副腎皮質機能低下症、 アジソン病、 副腎機能不全、 痛みまたは肥満の予防，治療方法。
6 3 . 哺乳動物に対して、 ①配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一も しくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 その部分ぺプチド、 そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体、 ②配列番号： 1 で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有 する分泌蛋白質またはその部分べプチドをコードするポリヌクレオチドと相補 的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンスポリヌクレオチド、 ③配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そのアミドもしくはその エステルまたはその塩の機能を阻害する化合物またはその塩、 ④配列番号：' 1 で表わされるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有 する分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そのアミドもしくはそのエステルまたは その塩の発現を阻害する化合物またはその塩、 ⑤配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のァミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容体、 その部分べプチドまたはその塩 に対する抗体、 ⑥配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わ されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容体またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドと相捕的 な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンスポリヌクレオチド、 ⑦ 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミノ酸配 列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容体、 そ の部分べプチドまたはその塩の機能を阻害する化合物またはその塩、 ⑧配列番 号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミノ酸配列と同 一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容体、 その部分 ぺプチドまたはその塩の発現を阻害する化合物またはその塩または⑨配列番 号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミノ酸配列と同 一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容体またはその 塩に対するアンタゴニストの有効量を投与することを特徴とする （i ) 副腎皮 質ホルモン分泌阻害方法または （ii) クッシング病、 クッシング症候群、 副腎 皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、 C R H産生腫瘍、アルドステロン産生 S重瘍、 アルドステロン症、 原発性コルチゾール抵抗症、 先天性副腎酵素欠乏症、 スト レス、 うつ病、 神経性食欲不振症、 不眠、 胃 .十二指腸潰瘍または過敏性腸症 候群の予防 ·治療方法。
6 4 . ( i ) 副腎皮質ホルモン分泌促進剤または （ii) 低アルドステロン症、 低コルチゾール血症、 続発性または慢性副腎皮質機能低下症、 アジソン病、 副 腎機能不全、 痛みまたは肥満の予防。治療剤を製造するための、 ①配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含 有する分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そのアミドもしくはそのエステルまた はその塩、 ②配列番号： 1で表わされるアミノ酸酉 ¾列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質またはその部分ぺプチドをコ一ドす るポリヌクレオチド、 ③配列番号： 1で表わされるアミノ酸 列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そ のアミドもしくはそのエステルまたはその塩の機能を促進する化合物またはそ の塩、 ④配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そのアミドもしく はそのエステルまたはその塩の発現を促進する化合物またはその塩、 ⑤配列番 号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミノ酸配列と同 一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容体、 その部分 ペプチドまたはその塩、 ⑥配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含 有する A Q 2 7受容体またはその部分べプチドをコ一ドするポリヌクレオチド. ⑦配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミノ酸 配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容体、 その部分べプチドまたはその塩の機能を促進する化合物またはその塩、 ⑧配列 番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミノ酸配列と 同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容体、 その部 分ぺプチドまたはその塩の発現を促進する化合物またはその塩または⑨配列番 号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミノ酸配列と同 一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容体またはその 塩に対するァゴニストの使用。
6 5 . ( i ) 副腎皮質ホルモン分泌阻害剤または （ii) クッシング病、 クッシ ング症候群、 副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、 C R H産生腫瘍、 アルド ステロン産生腫瘍、 アルドステロン症、 原発性コルチゾール抵抗症、 先天性副 腎酵素欠乏症、 ストレス、 うつ病、 神経性食欲不振症、 不眠、 胃 '十二指腸潰 瘍または過敏性腸症候群の予防'治療剤を製造するための、 ①配列番号： 1で 表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有す る分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そのアミドもしくはそのエステルまたはそ の塩に対する抗体、 ②配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質またはその部分べプチドを コードするポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してな るァンチセンスポリヌクレオチド、 ③配列番号： 1で表わされるァミノ酸配列 と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 .その部分 ペプチド、 そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の機能を阻害する化 合物またはその塩、 ④配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 その アミドもしくはそのエステルまたはその塩の発現を阻害する化合物またはその 塩、 ⑤配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミ ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容 体、 その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、 ⑥配列番号： 9、 配列番号 ： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容体またはその部分べプチドをコ 一ドするポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなる アンチセンスポリヌクレオチド、 ⑦配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列 番号： 1 3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸 配列を含有する A Q 2 7受容体、 その部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害 する化合物またはその塩、 ⑧配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を 含有する A Q 2 7受容体、 その部分ペプチドまたはその塩の発現を阻害する化 合物またはその塩または⑨配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含 有する A Q 2 7受容体またはその塩に対するアンタゴニストの使用。
6 6 . 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そのアミドもしくは そのエステルまたはその塩および （または） 配列番号： 9、 配列番号： 1 1ま 5 たは配列番号： 1 3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容体、 その部分ペプチドまたはその塩を用 いることを特徴とする副腎皮質ホルモン分泌調節薬のスクリ一二ング方法。
6 7 . 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、 その部分ペプチド、 そのアミドもしくは 10 そのエステルまたはその塩および （または） 配列番号： 9、 配列番号： 1 1ま たは配列番号： 1 3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容体、 その部分べプチドまたはその塩を含 有することを特徴とする副腎皮質ホルモン分泌調節薬のスクリーニング用キッ 卜。
15 6 8 . 試験化合物を非哺乳動物に投与し、 血中の副腎皮質ホルモンの濃度を測 定することを特徴とする配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3 で表わされるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有
' する A Q 2 7受容体またはその塩に対するァゴニストまたはアンタゴニストの スクリーニング方法。
20 6 9 . 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 3で表わされるアミ ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する A Q 2 7受容 '体またはその塩を活性化する化合物またはその塩を非ヒト哺乳動物に投与した 場合と、 該 AQ 2 7受容体を活性化する化合物またはその塩および試験化合物 を非ヒト哺乳動物に投与した場合における、 血中の副腎皮質ホルモンの濃度を
25 測定し、 比較することを特徴とする該 A Q 2 7受容体に対するァゴニストまた はアンタゴニストのスクリーニング方法。
PCT/JP2003/011160 2002-09-02 2003-09-01 副腎皮質ホルモン分泌調節剤 WO2004022086A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2003261874A AU2003261874A1 (en) 2002-09-02 2003-09-01 Adrenocortical hormone secretion controller

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2002256522 2002-09-02
JP2002-256522 2002-09-02
JP2003-55104 2003-03-03
JP2003055104 2003-03-03

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2004022086A1 true WO2004022086A1 (ja) 2004-03-18

Family

ID=31980561

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2003/011160 WO2004022086A1 (ja) 2002-09-02 2003-09-01 副腎皮質ホルモン分泌調節剤

Country Status (2)

Country Link
AU (1) AU2003261874A1 (ja)
WO (1) WO2004022086A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005065702A1 (ja) * 2004-01-09 2005-07-21 Taisho Pharmaceutical Co., Ltd. ＧＰＲ１０３－ｌｉｋｅ受容体蛋白質に対するリガンドの新規用途
WO2005065703A1 (ja) * 2004-01-09 2005-07-21 Taisho Pharmaceutical Co., Ltd. ＧＰＲ１０３－ｌｉｋｅ受容体蛋白質に対するリガンドの新規用途
WO2006039256A1 (en) * 2004-09-29 2006-04-13 Glaxo Group Limited Use of gpr103 agonists for modulating feeding behaviour

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000011015A1 (en) * 1998-08-24 2000-03-02 Alphagene, Inc. Secreted proteins and polynucleotides encoding them
WO2000022131A2 (en) * 1998-10-13 2000-04-20 Arena Pharmaceuticals, Inc. Non-endogenous, constitutively activated human g protein-coupled receptors
WO2000031258A2 (en) * 1998-11-20 2000-06-02 Arena Pharmaceuticals, Inc. Human orphan g protein-coupled receptors
WO2000078809A1 (en) * 1999-06-21 2000-12-28 Smithkline Beecham Corporation Axor16, a g protein coupled receptor
WO2001048189A1 (fr) * 1999-12-28 2001-07-05 Helix Research Institute Nouveaux recepteurs couples a une proteine de liaison au guanosine triphosphate, genes de ces derniers, et production et utilisation de ces derniers
WO2002004518A2 (en) * 2000-07-06 2002-01-17 Bayer Corporation Human neuropeptide y-like g protein-coupled receptor
EP1207201A1 (en) * 1999-08-27 2002-05-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Novel g protein-coupled receptor protein and dna thereof
WO2002042458A2 (en) * 2000-11-22 2002-05-30 Tularik Inc. G protein coupled receptors

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000011015A1 (en) * 1998-08-24 2000-03-02 Alphagene, Inc. Secreted proteins and polynucleotides encoding them
WO2000022131A2 (en) * 1998-10-13 2000-04-20 Arena Pharmaceuticals, Inc. Non-endogenous, constitutively activated human g protein-coupled receptors
WO2000031258A2 (en) * 1998-11-20 2000-06-02 Arena Pharmaceuticals, Inc. Human orphan g protein-coupled receptors
WO2000078809A1 (en) * 1999-06-21 2000-12-28 Smithkline Beecham Corporation Axor16, a g protein coupled receptor
EP1207201A1 (en) * 1999-08-27 2002-05-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Novel g protein-coupled receptor protein and dna thereof
WO2001048189A1 (fr) * 1999-12-28 2001-07-05 Helix Research Institute Nouveaux recepteurs couples a une proteine de liaison au guanosine triphosphate, genes de ces derniers, et production et utilisation de ces derniers
WO2002004518A2 (en) * 2000-07-06 2002-01-17 Bayer Corporation Human neuropeptide y-like g protein-coupled receptor
WO2002042458A2 (en) * 2000-11-22 2002-05-30 Tularik Inc. G protein coupled receptors

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005065702A1 (ja) * 2004-01-09 2005-07-21 Taisho Pharmaceutical Co., Ltd. ＧＰＲ１０３－ｌｉｋｅ受容体蛋白質に対するリガンドの新規用途
WO2005065703A1 (ja) * 2004-01-09 2005-07-21 Taisho Pharmaceutical Co., Ltd. ＧＰＲ１０３－ｌｉｋｅ受容体蛋白質に対するリガンドの新規用途
WO2006039256A1 (en) * 2004-09-29 2006-04-13 Glaxo Group Limited Use of gpr103 agonists for modulating feeding behaviour

Also Published As

Publication number Publication date
AU2003261874A1 (en) 2004-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1424392A1 (en) Novel secretory proteins and dna thereof
WO2001077325A1 (fr) Nouvelle proteine de recepteur couple aux proteines g et adn de celle-ci
WO2000049046A1 (fr) Nouvelle proteine de recepteur couplee a la proteine g et adn
KR20010081109A (ko) 신규 ｇ 단백질 공액형 리셉터단백질, 그 ｄｎａ 및 그리간드
EP1329508A1 (en) Novel g protein-coupled receptor protein and dna thereof
WO2006068326A1 (ja) 新規ポリペプチドおよびその用途
WO2003106683A1 (ja) 新規スクリーニング方法
WO2004022086A1 (ja) 副腎皮質ホルモン分泌調節剤
WO2001083748A1 (fr) Proteine de recepteur couple a la proteine g et adn correspondant
CA2395714A1 (en) Novel tachykinin-like polypeptides and use thereof
JP4184697B2 (ja) スクリーニング方法
WO2004041850A1 (ja) 新規なｆｐｒｌ１リガンドおよびその用途
WO2002004640A1 (fr) Nouvelle proteine du type recepteur couple aux proteines g et adn correspondant
WO2004097411A1 (ja) 新規スクリーニング方法
WO2005103283A1 (ja) 新規スクリーニング方法
WO2004111234A1 (ja) 新規蛋白質
WO2001059106A1 (fr) Nouvelles proteines receptrices couplees a des proteines g et adn associes
JP4128030B2 (ja) 新規リガンドおよびそのｄｎａ
JP4167868B2 (ja) 新規分泌蛋白質およびそのｄｎａ
WO2001073021A1 (fr) Nouvelle proteine receptrice couplee a une proteine g et adn associe
JP4004767B2 (ja) 新規ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質およびそのｄｎａ
JP4404605B2 (ja) 新規なｆｐｒｌ１リガンドおよびその用途
WO2002072816A1 (fr) Proteine de recepteur murin de type kiss-1 et adn correspondant
WO2003088992A1 (fr) Nouvelle methode de criblage
WO2002002767A1 (fr) Proteine de recepteur couple a la proteine g et adn correspondant

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
122 Ep: pct application non-entry in european phase
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: JP