PT2374819T - Anticorpos para masp-2 - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO ANTICORPOS PARA A MASP-2 Área da Invenção A presente invenção está relacionada com anticorpos para MASP-2 e com equivalentes funcionais dos mesmos. Em particular, a invenção está relacionada com anticorpos MASP-2 capazes de inibir a função da MASP-2. Além disso, a invenção está relacionada com os métodos de produção dos referidos anticorpos, métodos de inibição da atividade da MASP-2, assim como com as composições farmacêuticas que compreendem anticorpos MASP-2.

Antecedentes da Invenção 0 sistema complemento compreende uma complexa matriz de enzimas e de proteínas não enzimáticas importantes para a função da defesa imune inata, assim como da defesa imune adaptativa1. Até recentemente, eram conhecidos dois modos de ativação, a via clássica inibida por complexos antigénio-anticorpo e a via alternativa inibida por certas estruturas nas superfícies microbianas. Uma terceira e nova via de ativação complementar, independente de anticorpos, foi descrita2. Esta via é inibida quando a lectina de ligação à manose (MBL, primeiramente descrita como proteína de ligação à manose3, MBP, ver Ezekowitz, U.S. Patent 5,270,199) se liga a hidratos de carbono e é conhecida como via MBLectina. A MBL está estruturalmente relacionada com o subcomponente Clq do componente Cl do complemento e parece que a MBL ativa o sistema complemento através duma protease de serina associada designada MASP4 ou plOO5, a qual é semelhante aos componentes Cl r e Cl s da via clássica. A nova via de ativação do complemento é designada de via MBLectina. De acordo com o mecanismo postulado para esta via, a MBL liga-se a estruturas de hidratos de carbono especificas encontradas à superfície de uma variedade de microrganismos incluindo bactérias, leveduras, protozoários parasitas e virus5, e a sua atividade antimicrobiana resulta da ativação dos componentes terminais líticos da via do complemento7 ou da promoção da fagocitose8.

As MASPs (protease de serina associada à MBL) são proteases de serina semelhantes em estrutura aos componentes Cl r e Cl s da via do complemento. A MASP-1 tem uma estrutura em loop de histidina do tipo encontrado na tripsina ou em proteases de serina tipo tripsina. Descobriu-se que a MASP-1 está envolvida na ativação do complemento pela MBL. Foi descrito que um clone de cADN que codifica a MASP-1 codifica um péptido líder de 19 aminoácidos seguido por 680 resíduos de aminoácidos, que se prevê formarem o péptido maduro. A MASP-2 (protease de serina 2 associada com a MBL)22 é uma protease de serina também semelhante em estrutura aos componentes Cl r e Cls da via do complemento. Como esta, e ao contrário da MASP-1, não apresenta estrutura de loop de histidina do tipo encontrado na tripsina ou em proteases de serina tipo tripsina, foi descoberto que a MASP-2 está envolvida na ativação do complemento pela MBL.

Os anticorpos para a MASP-2 foram descritos na arte prévia. A WO 02/06460 descreve a MASP-2 humana. O documento descreve ainda os anticorpos para a MASP-2 criados por imunização de coelhos com os 19 aminoácidos N-terminais da MASP-2 humana ou de frangos com 505 a 523 aa e 538 a 556 aa da MASP-2 humana.

Petersen et al., 1998, Molecular Immunology, vol 35, no 6/7, p.409 descreve a criação de anticorpos contra a MASP-2 usando sistemas de expressão bacteriana. Os anticorpos reagem com a MASP-2 num ensaio TRIFMA e/ou Western blot.

Sumário da Invenção

Interessantemente, os inventores da presente invenção reconheceram que a inibição da via da MBLectina pode ser desejável no tratamento de várias condições clinicas. No entanto, os inibidores específicos da via da MBLectina não estão bem caracterizados na arte prévia e, como tal, existe uma grande necessidade de inibidores específicos. A presente invenção refere que os anticorpos para a parte terminal-C da MASP-2 são capazes de inibir a atividade da MASP-2 de forma mais eficiente que os anticorpos para o terminal-N da MASP-2. 0 pedido descreve ainda epítopos da MASP-2 em que os anticorpos que reconhecem os ditos epítopos são particularmente úteis para inibir a atividade da MASP- 2. Os epítopos preferidos são descritos abaixo.

Num aspeto, a invenção refere-se a um anticorpo ou um seu equivalente funcional reconhecendo e ligando especificamente pelo menos parte de um epitopo reconhecido por um ou mais anticorpos de referência selecionados do grupo que consiste em i. 0 anticorpo monoclonal produzido pela linha celular de hibridoma depositada sob o número de deposição 03050904; ii. O anticorpo monoclonal produzido pela linha celular de hibridoma designada M0545YM029; iii. o anticorpo monoclonal produzido pela linha celular de hibridoma designada por M0545YM035; iv. 0 anticorpo monoclonal produzido pela linha celular de hibridoma designada M0545YM046; e v. 0 anticorpo monoclonal produzido pela linha celular de hibridoma designada M0545YM048.

De forma concordante, é objeto da presente invenção proporcionar anticorpos ou eguivalentes funcionais dos mesmos, gue reconhecem e se ligam especificamente a um epitopo na parte terminal-C da MASP-2 ou um homólogo funcional do mesmo. É ainda um objeto da presente invenção polipéptidos isolados gue compreendem um fragmento terminal-C da MASP-2, sendo os referidos polipéptidos úteis para criar anticorpos para epitopos no terminal-C da MASP-2. Em particular, os polipéptidos isolados da parte terminal-C da MASP-2 ou um homólogo funcional dos mesmos, podem ser polipéptidos gue compreendem ou consistem em: i. os domínios EGF, CUB2, CCP1, CCP2 e protease de serina; ou ii. os domínios CUB2, CCP1, CCP2 e protease de serina; ou iii. o domínio CCP1; ou iv. o domínio CCP2; ou os domínios CCP1 e CCP2. É ainda um objeto da presente invenção métodos de produção de um anticorpo gue inibe a atividade da MASP-2, por imunização de um animal, preferencialmente um mamífero, com os péptidos isolados compreendendo um fragmento terminal-C da MASP-2, sendo os referidos péptidos úteis na criação de anticorpos para epitopos no terminal-C da MASP-2. Em particular, os polipéptidos isolados da parte terminal-C da MASP-2 ou um homólogo funcional dos mesmos, podem ser polipéptidos que compreendem ou consistem em: v. os domínios EGF, CUB2, CCP1, CCP2 e protease de serina; ou vi. os domínios CUB2, CCP1, CCP2 e protease de serina; ou vii. o domínio CCP1 e o domínio protease de serina; ou viii. o domínio CCP2 e o domínio protease de serina; ou ix. os domínios CCP1, CCP2 e protease de serina x. o domínio protease de serina. É um objeto adicional da presente invenção proporcionar métodos de produção de um anticorpo que reconheça e liga especificamente um epítopo dentro da parte C-terminal de MASP-2 ou um seu homólogo funcional, compreendendo o passo de administrar a um mamífero o terminal C Parte do MASP-2 ou um seu fragmento ou um seu homólogo funcional. Os anticorpos produzidos de acordo com o método também são revelados pela invenção. É ainda objetivo da presente invenção, proporcionar métodos para inibir a atividade da MASP-2, que compreendem as etapas 1) Proporcionar uma composição que compreende a MASP- 2; 2) Proporcionar um anticorpo MASP-2 de acordo com a invenção; 3) Incubar a referida composição com o referido anticorpo, inibindo assim a atividade da MASP-2. A inibição da MASP-2 irá conduzir à inibição da ativação do complemento, de preferência à inibição da via MBLectina. De forma concordante, os anticorpos que inibem a atividade ds MASP-2 podem ser usados para inibir a ativação da via MBLectina e, de forma concordante, os referidos anticorpos podem ser usados no tratamento de condições clinicas caracterizadas pela ativação imprópria do complemento, particularmente, pela ativação imprópria da via MBLectina.

Como tal, a invenção está relacionada com métodos para inibir a via da MBLectina, envolvendo tais métodos, de forma preferível, o uso de anticorpos MASP-2, capazes de inibir a atividade da MASP-2. É ainda objetivo da presente invenção proporcionar composições farmacêuticas que compreendem anticorpos MASP-2 ou equivalentes funcionais dos mesmos, que reconhecem um epítopo na parte terminal-C da MASP-2, juntamente com excipientes aceitáveis do ponto de vista farmacêutico. É ainda outro objetivo da presente invenção proporcionar métodos para o tratamento de uma condição clínica compreendendo um anticorpo ou um equivalente funcional do mesmo que reconheça um epítopo na parte terminal-C da MASP-2 como ingrediente ativo. É ainda objetivo da presente invenção proporcionar utilizações de anticorpos ou equivalentes funcionais dos mesmos que reconheçam um epítopo na parte terminal-C da MASP-2, para a preparação de um medicamento para o tratamento de uma condição clínica, num indivíduo que dele necessite.

Descrição dos Desenhos A Figura 1 retrata uma representação esquemática da MASP-2 indicando os domínios individuais A Figura 2 mostra um alinhamento das sequências MASP-1, MASP-2, Clr e Cls humanas, indicando a presença dos domínios individuais na MASP-2. Os aminoácidos conservados nas quatro proteínas são ainda assinalados por um asterisco. A Figura 3 retrata a inibição da deposição de C4 em soro inteiro por um anticorpo MASP-2. A Figura 4 retrata a inibição da deposição de C4 com diferentes concentrações de um anticorpo MASP-2. A Figura 5 retrata um ensaio de deposição de C4. A Figura ilustra a inibição da deposição de C4 em soro humano, usando diferentes anticorpos purificados anti-MASP-2. A Figura 6 mostra uma preparação de Western blot contra a MASP-2 em soro humano, usando 4 anticorpos diferentes. 0 soro humano foi carregado em cada linha. A Figura é apresentada a partir de quatro Western blots usando os anticorpos mostrados nas linhas acima para a detecção. A Figura 7 mostra o resultado de um ELISA competitivo para a determinação de epítopos sobrepostos. A Figura 8 ilustra a sequência da região variável da cadeia leve do anticorpo Ni-moAblOl (DWE16140-6cons). A Figura 9 ilustra a sequência da região variável da cadeia pesada do anticorpo NimoAblOl (DWE16140-3consRev). A Figura 10 mostra um alinhamento entre as sequências da cadeia pesada do anticorpo Ni-moAblOl (DWE16140-,2,3,4,5,8) juntamente com as sequências homólogas identificadas por análises BLAST. A Figura 11 mostra um alinhamento entre as sequências da cadeia leve do anticorpo Ni-moAblOl (DWE16140-6,7,9,10) juntamente com as sequências homólogas identificadas por análises BLAST.

Lista de sequências SEQ ID 1 MASP-2 humana SEQ ID 2 Parte da cadeia pesada do NimoAblOl incluindo a região variável SEQ ID 3 Parte da cadeia leve do NimoAblOl incluindo a região variável SEQ ID 4 Parte da cadeia pesada do NimoAblOl incluindo a região variável SEQ ID 5 Parte da cadeia leve do NimoAblOl incluindo a região variável SEQ ID 6 CDR1 da cadeia pesada (também designado por Hl) do

NimoAbl01 SEQ ID 7 CDR2 da cadeia pesada (também designado por H2) do

NimoAbl01 SEQ ID 8 CDR3 da cadeia pesada (também designado por H3) do

NimoAbl01 SEQ ID 9 CDR1 da cadeia leve (também designado por Ll) do NimoAblOl SEQ ID 10 CDR2 da cadeia leve (também designado por L2) do NimoAblOl SEQ ID 11 CDR3 da cadeia leve (também designado por L3) do NimoAblOl

SEQ ID 12 Primer de PCR

SEQ ID 13 Primer de PCR

Definições O termo "parte terminal-C da MASP-2" refere-se ao terminal-C da MASP-2 que compreende os domínios EGF, CUB2, CCP1, CCP2 e protease de serina, não incluindo a parte terminal-C da MASP-2 o domínio CUB1. O termo "epítopo" refere-se a um local específico de um composto, isto é, uma proteína à qual um certo anticorpo se liga especificamente. Um epítopo pode ser linear, ou seja, um péptido, ou pode ser uma estrutura tridimensional.

Descrição detalhada da invenção

Anticorpos É um aspeto da presente divulgação proporcionar anticorpos ou equivalentes funcionais dos mesmos que reconheçam e se liguem especificamente a um epítopo na parte terminal-C da MASP-2 ou a um homólogo funcional do mesmo. 0 epítopo pode ser um dos epítopos mencionados aqui abaixo. 0 anticorpo ou o equivalente funcional do mesmo pode ser um anticorpo conhecido na arte, por exemplo um anticorpo policlonal ou monoclonal derivado de um mamífero ou um anticorpo sintético, como um anticorpo de cadeia única ou híbridos compreendendo fragmentos de anticorpos. Além disso, o anticorpo pode ser uma mistura de anticorpos monoclonais ou anticorpos policlonais artificiais. Adicionalmente, os equivalentes funcionais dos anticorpos podem ser fragmentos de anticorpos, em particular fragmentos de ligação a epítopos. Além disso, os anticorpos ou equivalentes funcionais dos mesmos podem ser pequenas moléculas mímicas, mimetizando um anticorpos. Os anticorpos de ocorrência natural são molécula de imunoglobulinas que consistem em cadeias pesadas e leves. Em formas de realização preferidas da invenção, o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

Os anticorpos monoclonais (Mab's) são anticorpos em que todas as moléculas do anticorpo são semelhantes e, reconhecem assim o mesmo epítopo. Os anticorpos monoclonais são geralmente produzidos por uma linha de células de hibridoma. Os métodos de criação de anticorpos monoclonais e de síntese de anticorpos de células de hibridoma são bem conhecidos pelos peritos na arte. Os hibridomas que produzem anticorpos podem ser preparados, por exemplo, por fusão de um linfócito B que produz anticorpos com uma linha de células de linfócitos B imortalizada. Os anticorpos monoclonais, de acordo com a presente invenção, podem ser preparados, por exemplo, como descrito em Antibodies: A Maboratory Manual, By Ed Harlow and David Lane, Cold Sring Harbor Laboratory Press, 1988. Os referidos anticorpos monoclonais podem ser derivados de qualquer espécie de mamífero adequada, no entanto, frequentemente os anticorpos monoclonais são anticorpos de roedores, por exemplo anticorpos monoclonais de murino ou ratazana. É preferível que os anticorpos, de acordo com a presente invenção, sejam anticorpos monoclonais ou derivados de anticorpos monoclonais.

Os anticorpos policlonais são uma mistura de moléculas de anticorpos que reconhecem um antigénio específico, como tal, os anticorpos monoclonais podem reconhecer diferentes epítopos dentro do referido antigénio. De forma geral, os anticorpos policlonais são purificados a partir de soro de um mamífero, o qual foi previamente imunizado com o antigénio. Os anticorpos policlonais podem ser preparados, por exemplo, por qualquer um dos métodos descritos em Antibodies: A Laboratory Manual, By Ed Harlow and David Lane, Cold Sring Harbor Laboratory Press, 1988. Os anticorpos policlonais podem ser derivados de qualquer espécie de mamífero adequada, por exemplo a partir de ratos, ratazanas, coelhos, burros, cabras, ovelhas, vacas ou camelos. 0 anticorpo, preferivelmente não é derivado duma espécie não mamífera, ou seja, o anticorpo, por exemplo, não é um anticorpo de galinha. 0 anticorpo também pode ser, por exemplo, um anticorpo policlonal artificial como descrito, por exemplo, na US 5,789,208 ou US 6,335,163.

Numa forma de realização da invenção o anticorpo é um anticorpo humano, como um anticorpo monoclonal humano. Os anticorpos humanos podem ser criados para moléculas alvo humanas, por exemplo por engenharia de proteínas, por seleção em bibliotecas sintéticas ou por imunização de ratos transgénicos contendo genes de anticorpos humanos. Alternativamente, o anticorpo pode ser um anticorpo humanizado. Os anticorpos humanizados são, de forma geral, anticorpos quiméricos compreendendo regiões derivadas de um anticorpo humano e regiões derivadas de um anticorpo não humano, como um anticorpo de um roedor. A humanização (também designada Reshaping ou CDR-grafting) é uma técnica bem estabelecida para reduzir a imunogenicidade de anticorpos monoclonais (mAbs) de fontes xenogénicas (frequentemente roedores) e para melhorar a sua ativação do sistema imunitário humano. Estrutura na qual se transplantam as CDRs. 0 termo "molécula de anticorpo humanizado" (HAM) é aqui usado para descrever uma molécula com um local de ligação de antigénio derivado de uma imunoglobulina duma espécie não humana, enquanto algumas ou todas as partes restantes da molécula derivadas da imunoglobulina são derivadas de uma imunoglobulina humana. 0 local de ligação do antigénio pode compreender: um domínio completamente variável da imunoglobulina não humana fundida com um ou mais domínios humanos constantes; ou uma ou mais das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) transplantadas para uma estrutura humana apropriada no domínio variável. Um método para humanizar os MAbs está relacionado com a produção de anticorpos quiméricos nos quais um local de ligação do antigénio, que compreende os domínios completamente variáveis de um anticorpo, está fundido a domínios constantes derivados de um segundo anticorpo, preferivelmente um anticorpo humano. Os métodos para levar a cabo tais procedimentos de quimerização são decritos, por exemplo, na EP-A-0 120 694 (Celltech Limited), EP-A-0 125 023 (Genentech Inc.)λ EP-A-0 171 496 (Res. Dev. Corp. Japan), EP-A-0173494 (Stanford University) e EP-A-0 194 276 (Celltech Limited). Uma forma mais complexa de humanização de um anticorpo envolve redesenhar o domínio da região variável de forma que os aminoácidos que constituem o local de ligação do anticorpo não humano sejam integrados na estrutura da região variável do anticorpo humano (Jones et al., 1986).

Os anticorpos, de acordo com a presente invenção, também podem ser anticorpos recombinantes. Os anticorpos recombinantes são anticorpos ou fragmentos dos mesmos ou equivalentes funcionais dos mesmos, produzidos usando tecnologia recombinante. Por exemplo, os anticorpos recombinantes podem ser produzidos usando uma biblioteca sintética ou por exibição a fagócitos. Os anticorpos recombinantes podem ser produzidos de acordo com qualquer método convencional, por exemplo, por métodos descritos em "Recombinant Antibodies", Frank Breitling, Stefan Dubel, Jossey-Bass, September 1999.

Os anticorpos de acordo com a presente invenção também podem ser anticorpos bi-específicos, ou seja, anticorpos que reconhecem especificamente dois epítopos diferentes. Os anticorpos bi-específicos podem, de forma geral, estar preparados a partir de anticorpos monoclonais ou a partir de anticorpos recombinantes, por exemplo, pela fusão de dois hibridomas de forma a combinar as suas especificidades, por reticulação química ou usando tecnologias recombinantes. Os anticorpos, de acordo com a presente invenção, também podem ser anticorpos tri-específicos.

Os equivalentes funcionais dos anticorpos podem ser, numa forma de realização preferida, fragmentos de um anticorpo, de preferência um fragmento de ligação de antigénio ou uma região variável. Exemplos de fragmentos de anticorpos úteis na presente invenção incluem os fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv. A digestão dos anticorpos com papaína produz dois fragmentos de ligação de antigénio idênticos designados fragmento Fab, cada um com um local de ligação de antigénio e um fragmento "Fc" residual, assim designado pela sua capacidade de cristalizar facilmente. 0 tratamento com pepsina produz um fragmento F(ab')2 que tem dois fragmentos de ligação de antigénio, os quais são capazes de provocar a reticulação do antigénio e, um outro fragmento residual (o qual é designado por pFc'). Fragmentos adicionais podem incluir diacorpos, anticorpos lineares, moléculas de anticorpos de cadeia única e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos. Como aqui usado, "fragmentos funcionais" em relação aos anticorpos, refere-se aos fragmentos Fv, F(ab) e F(ab')2.

Os fragmentos de anticorpos preferidos retêm parte ou essencialmente toda a capacidade de um anticorpo se ligar de forma seletiva a um antigénio ou receptor. Alguns fragmentos preferidos são definidos como se segue: (1) 0 Fab é o fragmento que contém um fragmento de ligação de antigénio monovalente de uma molécula de anticorpo. Um fragmento Fab pode ser produzido por digestão de todo o anticorpo com a enzima papaina para produzir uma cadeia leve intacta e uma parte de uma cadeia pesada. (2) o Fab' é o fragmento de uma molécula de anticorpo e pode ser obtido pelo tratamento de todo o anticorpo com pepsina, seguido de uma redução, para produzir uma cadeia leve intacta e uma parte de uma cadeia pesada. São obtidos dois fragmentos Fab' por molécula de anticorpo. Os fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab por adição de alguns resíduos no terminal carboxílico do domínio CHI da cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas da região de charneira do anticorpo. (3) 0 (Fab')2 é o fragmento de um anticorpo gue pode ser obtido pelo tratamento de todo o anticorpo com a enzima pepsina sem redução subseguente. 0 F(ab')2 é um dímero de dois fragmentos Fab', mantidos juntos por duas ligações dissulfeto. (4) o Fv é o fragmento de anticorpo mais pegueno gue contém um local completo de reconhecimento e ligação de antigénio. Esta região consiste num dímero de um domínio variável duma cadeia pesada e duma cadeia leve, numa associação firme e não covalente (dímero Vh-Vl) . É nesta configuração gue as três CDRs de cada domínio variável interagem para definir um local de ligação de antigénio na superfície do dímero Vh-Vl. Coletivamente, as seis CDRs conferem especificidade de ligação do antigénio ao anticorpo. No entanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo apenas três CDRs específicas para um antigénio) tem a capacidade de reconhecer e ligar-se ao antigénio, ainda gue com uma afinidade inferior que a do local de ligação inteiro.

Numa forma de realização da presente invenção, o anticorpo é um anticorpo de cadeia única ("SCA"), definido como uma molécula geneticamente modificada contendo a região variável da cadeia leve, a região variável da cadeia pesada, ligada por um ligante polipeptídico adequado, como molécula de cadeia única geneticamente fundida. Tais anticorpos de cadeia única também são referidos como fragmentos de anticorpos "Fv de cadeia única" ou "scFv". Normalmente, o polipéptido Fv compreende ainda um ligante polipeptídico entre os domínios VH e VL que permite que o scFv forme a estrutura desejada para a ligação do antigénio. 0 anticorpo também pode ser selecionado pelas propriedades úteis, por exemplo, pode ser desejável controlar a semivida do soro do anticorpo. De forma geral, as moléculas completas de anticorpo têm uma grande persistência no soro, enquanto os fragmentos (<60-80 kDa) são filtrados muito rapidamente através do rim. A glicosilação em anticorpos completos, normalmente prolonga a persistência no soro. Como tal, se for desejada uma ação de longo termo do anticorpo MASP-2, o anticorpo MASP-2 é preferivelmente um anticorpo completo, enquanto, se for desejável uma ação mais curta do anticorpo MASP-2, pode ser preferível um fragmento de anticorpo.

Noutra forma de realização da presente divulgação, o equivalente funcional de um anticorpo é uma pequena molécula mimética, que mimetiza um anticorpo.

Os anticorpos preferidos no âmbito da presente divulgação são anticorpos ou equivalentes funcionais dos mesmos capazes de inibir a função da MASP-2. A atividade da MASP-2 pode ser a atividade da protease de serina da MASP-2,tal como a atividade da protease de serina para C4 e/ou para C2. São particularmente preferidos os anticorpos ou os equivalentes funcionais dos mesmos capazes de inibir a atividade da protease de serina da MASP-2. Ainda mais preferidos são os anticorpos ou os equivalentes funcionais dos mesmos capazes de inibir a deposição de C4 dos complexos MBL-MASP-2. Os anticorpos ainda mais preferidos, de acordo com a presente invenção, são os anticorpos ou os equivalentes funcionais dos mesmos capazes de inibir a deposição de C4 em soro completo. Ainda mais preferidos são os anticorpos ou os equivalentes funcionais dos mesmos capazes de inibir a deposição de C4 em soro completo de indivíduos com atividade de deposição de C4. São descritos abaixo ensaios úteis para a determinação da deposição de C4.

Adicionalmente, os anticorpos preferidos são os anticorpos ou os equivalentes funcionais dos mesmos capazes de inibir a deposição de C2 dos complexos MBL-MASP-2. Os Os anticorpos ainda mais preferidos, de acordo com a presente divulgação, são os anticorpos ou os equivalentes funcionais dos mesmos capazes de inibir a deposição de C2 em soro completo. Ainda mais preferidos são os anticorpos ou os equivalentes funcionais dos mesmos capazes de inibir a deposição de C2 em soro completo de indivíduos com atividade de deposição de C2. São descritos abaixo ensaios úteis para a determinação da deposição de C2.

Assim, os anticorpos preferidos são os anticorpos ou os equivalentes funcionais dos mesmos capazes de inibir a deposição de C4 e/ou C2 em soro completo para menos de 50%, como para menos de 40%, por exemplo, menos de 30%, tal como para menos de 25%, por exemplo para menos de 20%, tal como para menos de 15%, por exemplo para menos de 10%, tal como para menos de 5% de deposição de C4. Preferencialmente, o anticorpo é capaz de inibir a deposição de C4 em soro completo para menos de 30%, preferencialmente para menos de 25%, mais preferencialmente para menos de 20%, ainda mais preferencialmente para menos de 15%, e mesmo ainda mais preferencialmente para menos de 10%. Alternativamente ou para além disso, os anticorpos preferidos são capazes de inibir a deposição de C2 em soro completo para menos de 30%, preferencialmente para menos de 25%, mais preferencialmente para menos de 20%, ainda mais preferencialmente para menos de 15%, e mesmo ainda mais preferencialmente para menos de 10%.

Numa forma de realização realmente preferida da presente invenção, o anticorpo é selecionado a partir de um grupo de anticorpos monoclonais produzidos por linhas de células de hibridoma depositadas sob o número de adesão 03050904. Além disso, os equivalentes funcionais podem ser fragmentos, preferencialmente fragmentos de ligação dos referidos anticorpos.

Numa forma de realização da presente invenção, o anticorpo ou equivalente funcional do mesmo compreende regiões hipervariáveis especificas, designadas por CDR. Preferencialmente, as CDRs são CDRs de acordo com a definição de CDR de Rabat. As CDRs ou regiões hipervariáveis podem ser identificadas, por exemplo, pelo alinhamento da sequência com outros anticorpos. Preferencialmente, o anticorpo ou equivalente funcional do mesmo compreende pelo menos uma, preferencialmente pelo menos 2, ainda mais preferencialmente todas as três CDRs de cadeia pesada seguintes: 1. Hl do DWE16140-4con indicado na Figura 10 (SEQ ID 6); 2. H2 do DWE16140-4con indicado na Figura 10 (SEQ ID 7); 3. H3 do DWE16140-4con indicado na Figura 10 (SEQ ID 8).

Mais preferivelmente, o anticorpo ou equivalente funcional do mesmo compreende uma cadeia pesada que compreende ou consiste numa sequência que é pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 98%, ainda mais preferencialmente pelo menos 99% homóloga ou idêntica à SEQ ID 4. Ainda mais preferencialmente, o anticorpo ou equivalente funcional do mesmo compreende uma cadeia pesada que compreende ou consiste numa sequência estabelecida na SEQ ID 4.

Ainda mais preferencialmente, o anticorpo ou equivalente funcional do mesmo compreende uma cadeia pesada que compreende ou consiste numa sequência que é pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 98%, ainda mais preferencialmente pelo menos 99% homóloga ou idêntica à SEQ ID 2. Ainda mais preferencialmente, a cadeia pesada consiste na sequência DWE16140-4 da Figura 10. A percentagem de homologia pode ser determinada como aqui descrito para homólogos funcionais da MASP-2. Mais preferencialmente, o anticorpo ou equivalente funcional do mesmo compreende uma cadeia pesada que compreende ou consiste numa sequência estabelecida na SEQ ID 2. Preferencialmente, o referido anticorpo ou equivalente funcional do mesmo é capaz de reconhecer especificamente o epítopo reconhecido pelo anticorpo designado NimoAblOl.

Noutra forma de realização da presente invenção, o anticorpo ou equivalente funcional do mesmo compreende regiões hipervariáveis especificas, designadas por CDR. Preferencialmente, as CDRs são CDRs de acordo com a definição de CDR de Kabat. Preferencialmente, o anticorpo ou equivalente funcional do mesmo compreende pelo menos uma, preferencialmente pelo menos 2, ainda mais preferencialmente todas as três CDRs de cadeia leve seguintes: 4. LI do DWE16140-10con indicado na Figura 11 (SEQ ID 9); 5. L2 do DWE16140-10con indicado na Figura 11 (SEQ ID 10); 6. L3 do DWE16140-10con indicado na Figura 11 (SEQ ID 11) .

Mais preferivelmente, o anticorpo ou equivalente funcional do mesmo compreende uma cadeia leve que compreende ou consiste numa sequência que é pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 98%, ainda mais preferencialmente pelo menos 99% homóloga ou idêntica à SEQ ID 5. Ainda mais preferencialmente, o anticorpo ou equivalente funcional do mesmo compreende uma cadeia leve que compreende ou consiste numa sequência estabelecida na SEQ ID 5.

Ainda mais preferencialmente, o anticorpo ou equivalente funcional do mesmo compreende uma cadeia leve que compreende ou consiste numa sequência que é pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 98%, ainda mais preferencialmente pelo menos 99% homóloga ou idêntica à SEQ ID 3. A percentagem de homologia pode ser determinada como aqui descrito para homólogos funcionais da MASP-2. Mais preferencialmente, o anticorpo ou equivalente funcional do mesmo compreende uma cadeia leve que compreende ou consiste numa sequência estabelecida na SEQ ID 3. Ainda mais preferencialmente, a cadeia leve consiste na sequência DWE16140-10con da Figura 10. Preferencialmente, o referido anticorpo ou equivalente funcional do mesmo é capaz de reconhecer especificamente o epitopo reconhecido pelo anticorpo designado NimoAblOl.

Numa forma de realização preferida, o anticorpo ou equivalente funcional do mesmo compreende as CDRs da cadeia pesada e as CDRs da cadeia leve aqui acima descritas. Mais preferencialmente, o anticorpo ou equivalente funcional do mesmo compreende a região variável da cadeia pesada aqui acima descrita e a região variável da cadeia leve aqui acima descrita. Ainda mais preferencialmente, o anticorpo ou equivalente funcional do mesmo compreende a cadeia pesada aqui acima descrita e a cadeia leve aqui acima descrita.

Assim, numa forma de realização realmente preferida, a invenção está relacionada com um anticorpo que compreende uma ou mais, preferencialmente pelo menos 2, mais preferencialmente pelo menos 3, ainda mais preferencialmente pelo menos 4, ainda mais preferencialmente pelo menos 5, ainda mais preferencialmente todas as 6 CDRs selecionadas a partir do grupo constituído por: 1) CDR1 da cadeia pesada da SEQ ID 6; 2) CDR2 da cadeia pesada da SEQ ID 7; 3) CDR3 da cadeia pesada da SEQ ID 8; 4) CDR1 da cadeia leve da SEQ ID 9; 5) CDR1 da cadeia leve da SEQ ID 10;e 6) CDR1 da cadeia leve da SEQ ID 11; ou um equivalente funcional do mesmo. Além disso, este anticorpo é capaz, preferencialmente, de inibir a atividade da MASP-2 e/ou de reconhecer especificamente um epítopo da MASP-2, como aqui abaixo descrito.

Epítopos e péptidos da MASP-2 A proteína MASP-2 compreende vários domínios, nomeadamente os domínios CUB1, EGF, CUB2, CCP1, CCP2 e protease de serina. Uma representação esquemática da MASP-2 é feita na Figura 1. A posição dos domínios individuais na MASP-2 humana é indicada na Figura 2. Acredita-se que o domínio responsável pela associação com a MBL está situado no terminal-N, enquanto o domínio da protease de serina é responsável pela atividade da protease de serina da MASP-2. Surpreendentemente, os anticorpos criados para o terminal-C da MASP-2 são mais eficientes em inibir a atividade da MASP-2 em soro completo do que outros anticorpos para a MASP-2.

Os anticorpos e os equivalentes funcionais dos mesmos, de acordo com a presente invenção, reconhecem especificamente um epitopo na parte terminal-C da MASP-2. "Reconhecem especificamente" significa que o anticorpo se liga ao referido epitopo com uma afinidade significativamente superior do que a qualquer outra molécula ou parte do mesmo. Preferencialmente, o anticorpo apenas se liga ao referido epitopo, como detetado por Western blotting ou ELISA. Para assegurar que o anticorpo reconhece especificamente um epitopo num determinado fragmento da MASP-2, o referido fragmento pode ser usado como antigénio durante a criação do referido anticorpo. É preferido, na presente invenção, que o antigénio MASP-2 usado para a imunização seja maior do que 18 aminoácidos, por exemplo pelo menos 20, tal como pelo menos 25, por exemplo pelo menos 30 aminoácidos de comprimento. Por exemplo, se o anticorpo tiver de reconhecer um epitopo nos domínios CCP1, CCP2 e protease de serina, pode ser usado como antigénio um péptido com os domínios CCP1, CCP2 e protease de serina durante a criação do referido anticorpo.

Preferencialmente, o anticorpo ou o equivalente funcional do mesmo reconhece especificamente um epitopo na parte terminal-C da MASP-2, em que a parte terminal-C compreende ou, ainda mais preferencialmente, consiste nos domínios EGF, CUB2, CCP1, CCP2 e protease de serina. Numa forma de realização da invenção, a parte terminal-C da MASP-2 compreende ou, preferencialmente consiste nos domínios CUB2, CCP1, CCP2 e protease de serina. Numa outra forma de realização da presente invenção, a parte terminal-C da MASP-2 compreende ou, preferencialmente consiste nos domínios CCP1, CCP2 e protease de serina. Ainda noutra forma de realização da invenção a parte terminal-C da MASP-2 compreende ou consiste nos domínios CCP2 e protease de serina. Numa forma de realização preferida da invenção a parte terminal-C da MASP-2 compreende ou consiste no domínio protease de serina.

Ainda noutra forma de realização da invenção, o anticorpo reconhece e liga-se especificamente a um epítopo num fragmento da MASP-2 que compreende ou, preferencialmente consiste no domínio CCP1. Numa outra forma de realização da invenção, o anticorpo reconhece e liga-se especificamente a um epítopo num fragmento da MASP-2 que compreende ou, preferencialmente consiste no domínio CCP2. Ainda noutra forma de realização da invenção, o anticorpo reconhece e liga-se especificamente a um epítopo num fragmento da MASP-2 que compreende ou, preferencialmente consiste nos domínios CCP1 e CCP2. 0 termo "MASP-2" significa qualquer molécula MASP-2 conhecida pelos peritos na arte. A referida MASP-2 pode, por exemplo, ser derivada de um mamífero, a MASP-2 pode, por exemplo, derivar do ser humano. Numa forma de realização preferida da presente invenção, a MASP-2 é a MASP-2 humana, tal como identificada pela SEQ ID 1 ou um homólogo funcional da mesma, partilhando pelo menos 50%, preferencialmente pelo menos 60%, mais preferencialmente pelo menos 70%, ainda mais preferencialmente pelo menos 80%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90%, ainda mais preferencialmente pelo menos 95% de homologia ou, preferencialmente seja idêntico à SEQ ID 1. Numa forma de realização realmente preferida da invenção, a MASP-2 é a MASP-2 da SEQ ID 1.

Assim, numa forma de realização preferida, o anticorpo reconhece e liga-se especificamente a um epítopo num fragmento da MASP-2 que compreende ou consiste nos aa de 136 a 686 da SEQ ID 1 ou um equivalente funcional do mesmo. Como tal, o referido fragmento compreende os domínios EGF, CUB2, CCP1, CCP2 e protease de serina da MASP-2 humana.

Numa outra forma de realização da invenção, o anticorpo reconhece e liga-se especificamente a um epítopo num fragmento da MASP-2 que compreende ou consiste nos aa de 183 a 686 da SEQ ID 1 ou um equivalente funcional do mesmo. 0 referido fragmento compreende os domínios CUB2, CCP1, CCP2 e protease de serina da MASP-2 humana.

Ainda noutra forma de realização da invenção, o anticorpo reconhece e liga-se especificamente a um epítopo num fragmento da MASP-2 que compreende ou consiste nos aa de 293 a 362 da SEQ ID 1 ou um equivalente funcional do mesmo. 0 referido fragmento compreende o domínio CCP1 da MASP-2 humana.

Numa outra forma de realização da invenção, o anticorpo reconhece e liga-se especificamente a um epítopo num fragmento da MASP-2 que compreende ou consiste nos aa de 293 a 431 da SEQ ID 1 ou um homólogo funcional do mesmo. 0 referido fragmento compreende os domínios CCP1 e CCP2 da MASP-2 humana.

Ainda noutra forma de realização da invenção, o anticorpo reconhece e liga-se especificamente a um epítopo num fragmento da MASP-2 que compreende ou consiste nos aa de 363 a 431 da SEQ ID 1 ou um equivalente funcional do mesmo. 0 referido fragmento compreende o domínio CCP2 da MASP-2 humana.

Ainda noutra forma de realização da invenção, o anticorpo reconhece e liga-se especificamente a um epítopo num fragmento da MASP-2 que compreende ou consiste nos aa de 293 a 686 da SEQ ID 1 ou um equivalente funcional do mesmo. 0 referido fragmento compreende os domínios CCP1, CCP2 e protease de serina da MASP-2 humana.

Ainda noutra forma de realização da invenção, o anticorpo reconhece e liga-se especificamente a um epítopo num fragmento da MASP-2 que compreende ou consiste nos aa de 363 a 686 da SEQ ID 1 ou um equivalente funcional do mesmo. 0 referido fragmento (=CCP2, protease de serina).

Ainda noutra forma de realização da invenção, o anticorpo reconhece e liga-se especificamente a um epítopo num fragmento da MASP-2 que compreende ou consiste nos aa de 445 a 686 da SEQ ID 1 ou um equivalente funcional do mesmo. 0 referido fragmento compreende o domínio protease de serina da MASP-2 humana.

Numa forma de realização da presente invenção, o epítopo não está entre os aa 505 a 523 e aa 538 a 556 da SEQ ID 1.

Numa forma de realização preferida do pedido, o anticorpo reconhece e liga-se especificamente a um epítopo num fragmento da MASP-2 que compreende ou, preferencialmente consiste nos aa de 363 a 385, tal como de 370 a 390, por exemplo de 380 a 400, tal como de 390 a 410, por exemplo de 400 a 420, tal como de 410 a 430, por exemplo de 420 a 440, tal como de 430 a 450, por exemplo de 440 a 460, tal como de 450 a 470, por exemplo de 460 a 480, tal como de 470 a490, por exemplo de 480 a 500, tal como de 490 a 510, por exemplo de 500 a 520, tal como de 510 a 530, por exemplo de 520 a 540, tal como de 530 a 550, por exemplo de 540 a 560, tal como de 550 a 570, por exemplo de 560 a 580, tal como de 570 a 590, por exemplo de 580 a 600, tal como de 590 a 610, por exemplo de 600 a 620, tal como de 610 a 630, por exemplo de 620 a 640, tal como de 630 a 650, por exemplo de 640 a 660, tal como de 650 a 670, por exemplo de 660 a 686 da SEQ ID 1, em que o referido fragmento compreende, no máximo, 100, preferencialmente no máximo 80, ainda mais preferencialmente no máximo 60, e ainda mais preferencialmente no máximo 40 aminoácidos.

Numa outra forma de realização preferida, o anticorpo reconhece e liga-se especificamente a um epítopo num fragmento da MASP-2 que compreende ou, preferencialmente consiste nos aa de 400 a 420, tal como de 410 a 430, por exemplo de 420 a 440, tal como de 430 a 450, por exemplo de 440 a 460, tal como de 450 a 470, por exemplo de 460 a 480, tal como de 470 a490, por exemplo de 480 a 500, tal como de 490 a 510, por exemplo de 500 a 520, tal como de 510 a 530, por exemplo de 520 a 540, tal como de 530 a 550 da SEQ ID 1, em que o referido fragmento compreende, no máximo, 100, preferencialmente no máximo 80, ainda mais preferencialmente no máximo 60, e ainda mais preferencialmente no máximo 40 aminoácidos.

Ainda numa outra forma de realização preferida, o anticorpo reconhece e liga-se especificamente a um epítopo num fragmento da MASP-2 que compreende ou, preferencialmente consiste nos aa 410 a 430, por exemplo de 420 a 440, tal como de 430 a 450, por exemplo de 440 a 460 da SEQ ID 1, em que o referido fragmento compreende, no máximo 100, preferencialmente no máximo 80, ainda mais preferencialmente no máximo 60, e ainda mais preferencialmente no máximo 40 aminoácidos.

Ainda numa outra forma de realização realmente preferida, o anticorpo reconhece e liga-se especificamente a um epítopo num fragmento da MASP-2 que compreende ou, preferencialmente consiste nos aa de 420 a 440 ou nos aa de 430 a 450.

Numa forma de realização preferida do presente pedido, os anticorpos ou equivalentes funcionais dos mesmos, reconhecem especificamente o epítopo reconhecido pelo anticorpo monoclonal produzido pela linha de células de hibridoma designada por M0545YM035.

Numa outra forma de realização preferida do presente pedido, os anticorpos ou equivalentes funcionais dos mesmos, reconhecem especificamente o epítopo reconhecido pelo anticorpo monoclonal produzido pela linha de células de hibridoma designada por M0545YM029.

Numa outra forma de realização preferida do presente pedido, os anticorpos ou equivalentes funcionais dos mesmos, reconhecem especificamente o epítopo reconhecido pelo anticorpo monoclonal produzido pela linha de células de hibridoma designada por M0545YM046.

Numa outra forma de realização preferida do presente pedido, os anticorpos ou equivalentes funcionais dos mesmos, reconhecem especificamente o epítopo reconhecido pelo anticorpo monoclonal produzido pela linha de células de hibridoma designada por M0545YM048.

Numa forma de realização particularmente preferida do presente pedido, os anticorpos ou equivalentes funcionais dos mesmos, reconhecem especificamente o epítopo reconhecido pelo anticorpo monoclonal produzido pela linha de células de hibridoma depositada sob o número de depósito 03050904.

Em particular, os anticorpos produzidos pela linha de células de hibridoma depositada sob o número de depósito 03050904 e a linha de células de hibridoma designada M0545YM029 e M0545YM035, reconhecem epítopos sobrepostos. Assim, é preferível que os anticorpos ou equivalentes funcionais dos mesmos reconheçam especificamente epítopos ou partes dos mesmos reconhecidos por um ou mais elementos selecionados a partir do grupo constituído por: • anticorpo monoclonal produzido pela linha de células de hibridoma e depositado sob o número de depósito 03050904; • linha de células de hibridoma desiganada M0545YM029; e • linha de células de hibridoma desiganada M0545YM035.

De acordo com a presente invenção, quando um dado anticorpo reconhece pelo menos parte de um epítopo reconhecido por outro dado anticorpo estes dois anticorpos reconhecem os mesmos epítopos sobrepostos.

Diferentes ensaios, que estão disponíveis para os peritos na arte, podem ser usados para determinar se o anticorpo (também designado por anticorpo de teste) reconhece o mesmo epítopo ou um epítopo sobreposto que um anticorpo monoclonal em particular (também designado por anticorpo de referência). Preferencialmente, o ensaio envolve as etapas de: 1 1

Proporcionar a MASP-2 ou um fragmento da mesma que compreenda o epítopo reconhecido pelo anticorpo de referência • Adicionar o anticorpo teste e o anticorpo referência à referida MASP-2, em que tanto o anticorpo teste como o anticorpo de referência são marcados com um rótulo detectável. Alternativamente, ambos os anticorpos podem ser marcados com diferentes rótulos detetáveis • Detectar a presença do rótulo detectável na MASP-2 • Detectar, assim, se o anticorpo de teste pode deslocar o anticorpo de referência.

Se o anticorpo de referência for deslocado, o anticorpo de teste reconhece o mesmo epítopo ou um epítopo sobreposto que o anticorpo de referência. Assim, se o anticorpo de referência está marcado com um rótulo detectável, então um baixo sinal detectável na MASP-2 é indicativo de deslocação do anticorpo de referência. 0 fragmento de MASP-2 pode ser, preferencialmente imobilizado num suporte sólido, permitindo uma manipulação mais fácil. 0 rótulo detectável pode ser qualquer rótulo, detectável direta ou indiretamente, como uma enzima, um isótopo radioativo, um metal pesado, um composto colorido ou um composto fluorescente. No exemplo 5 na secção "ELISA competitiva da MASP-2" aqui abaixo, é descrito um método realmente preferido para determinar se um anticorpo de teste reconhece o mesmo epítopo ou um epítopo sobreposto que o anticorpo de referência. 0 perito na arte pode facilmente adaptar o referido método ao anticorpo específico em questão.

Também é objeto do presente pedido proporcionar polipéptidos isolados da MASP-2 úteis enquanto antigénios para a criação de anticorpos MASP-2, em particular anticorpos MASP-2 capazes de inibir a atividade da MASP-2 em soro completo. Os referidos polipéptidos podem, por exemplo, ser úteis para imunizar um animal de forma a criar anticorpos para os polipéptidos.

Qualquer polipéptido terminal-C da MASP-2 pode ser usado com o presente pedido. Os polipéptidos preferidos são, no entanto, polipéptidos isolados que compreendem ou, preferencialmente consistem nos domínios EGF, CUB2, CCP1, CCP2 e protease de serina da MASP-2. Assim, um polipéptido realmente preferido da MASP-2, de acordo com a invenção, compreende ou, preferencialmente consiste nos aa de 136 a 686 da SEQ ID 1 ou um equivalente funcional do mesmo.

Noutra forma de realização, o polipéptido isolado da MASP-2 compreende ou, preferencialmente consiste nos domínios CUB2, CCP1, CCP2 e protease de serina. Assim, um polipéptido preferido da MASP-2 compreende ou consiste nos aa de 183 a 686 da SEQ ID 1 ou um equivalente funcional do mesmo.

Ainda noutra forma de realização do presente pedido, o polipéptido isolado da MASP-2 compreende ou, preferencialmente consiste no domínio CCP1. Assim, um polipéptido preferido da MASP-2 compreende ou, preferencialmente consiste nos aa de 293 a 362 da SEQ ID 1 ou um equivalente funcional do mesmo.

Noutra forma de realização do presente pedido, o polipéptido isolado da MASP-2 compreende ou, preferencialmente consiste no domínio CCP2. Por exemplo, o polipéptido pode compreender ou, preferencialmente consistir nos aa de 363 a 431 da SEQ ID 1 ou um equivalente funcional do mesmo.

Ainda noutra forma de realização do presente pedido, o polipéptido isolado da MASP-2 compreende ou, preferencialmente consiste nos domínios CCP1 e CCP2. Assim, o polipéptido pode compreender ou mesmo consistir nos aa de 293 a 431 da SEQ ID 1 ou um equivalente funcional do mesmo.

Os polipéptidos de terminal-C da MASP-2 têm, preferivelmente, o comprimento de pelo menos 570 aminoácidos, por exemplo os polipéptidos podem variar de 20 a 570 aminoácidos, tal como de 30 a 500, por exemplo de 50 a 400, tal como de 100 a 300, por exemplo de 150 a 250 aminoácidos de comprimento.

Os equivalentes funcionais ou homólogos funcionais dos polipéptidos ou fragmentos da MASP-2 que compreendem uma sequência de aminoácidos pré-determinada, por exemplo um fragmento da sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID 1, definida por polipéptidos que compreendemuma sequência de aminoácidos capaz de ser reconhecida por um anticorpo também capaz de reconhecer a sequência de aminoácidos pré-determinada. Os termos "equivalente funcional" e "homólogo funcional" são aqui usados de forma indistinta.

Os homólogos funcionais, de acordo com a presente invenção, compreendem polipéptidos com uma sequência de aminoácidos, os quais partilham uma homologia com as sequências pré-determinadas de polipéptidos da MASP-2, como acima defenido. Por exemplo, tais polipéptidos são pelo menos 40 por cento, tal como pelo menos 50 por cento homólogos, por exemplo são pelo menos 60 por cento homólogos, tal como pelo menos 70 por cento homólogos, por exemplo são pelo menos 75 por cento homólogos, tal como pelo menos 80 por cento homólogos, por exemplo são pelo menos 85 por cento homólogos, tal como pelo menos 90 por cento homólogos, por exemplo são pelo menos 92 por cento homólogos, tal como pelo menos 94 por cento homólogos, por exemplo são pelo menos 95 por cento homólogos, tal como pelo menos 96 por cento homólogos, por exemplo são pelo menos 97 por cento homólogos, tal como pelo menos 98 por cento homólogos, por exemplo são pelo menos 99 por cento homólogos com a sequência pré-determinada de polipéptidos, como descrito aqui acima. A homologia pode, preferencialmente, ser calculada por qualquer algoritmo adequado ou por implementações computorizadas de tais algoritmos, por exemplo CLUSTAL no programa PC/Gene da Intelligenetics ou GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA no Winsconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG). A homologia entre as sequências de aminoácidos pode ainda ser calculada com a ajuda de matrizes bem conhecidas, como por exemplo qualquer uma entre a BLOSUM 30, BLOSUM 40, BLOSUM 45, BLOSUM 50, BLOSUM 55, BLOSUM 60, BLOSUM 62, BLOSUM 65, BLOSUM 70, BLOSUM 75, BLOSUM 80, BLOSUM 85 e BLOSUM 90.

Os homólogos funcionais, de acordo com o presente pedido são, preferencialmente, polipéptidos com uma sequência de aminoácidos, a qual é pelo menos 50 por cento, preferencialmente pelo menos 60 por cento mais preferencialmente pelo menos 70 por cento, mais preferencialmente pelo menos 75 por cento, ainda mais preferencialmente pelo menos 80 por cento, ainda mais preferencialmente pelo menos 85 por cento, ainda mais preferencialmente pelo menos 90 por cento, ainda mais preferencialmente pelo menos 95 por cento homóloga, mais preferencialmente pelo menos 98 por cento idêntica à sequência pré-determinada de polipéptidos da MASP-2, como descrita aqui acima.

Os homólogos funcionais podem compreender uma sequência de aminoácidos que compreende pelo menos uma substituição de um aminoácido por qualquer outro aminoácido. Por exemplo, tal substituição pode ser uma substituição de aminoácidos conservativa ou não conservativa. Preferencialmente, as referidas substituições são substituições conservativas.

Uma substituição de aminoácidos conservativa é uma substituição de um aminoácido dentro dum grupo pré-determinado de aminoácidos por outro aminoácido dentro do mesmo grupo, em que os aminoácidos dentro dos grupos pré-determinados exibem características semelhantes ou substancialmente semelhantes. Dentro do significado do termo "substituição de aminoácidos conservativa" como aqui aplicado, um aminoácido pode ser substituído por outro dentro dos grupos de aminoácidos caracterizados por ter: i) cadeias laterais polares (Asp,Glu, Lys, Arg, His, Asn, Gin, Ser, Thr, Tyr e Cys) ii) cadeias laterias não polares (Gly, Ala, Vai, Leu, Ile, Phe, Trp, Pro e Met) iii) cadeias laterais alifáticas (Gly, Ala, Vai, Leu, Ile) iv) cadeias laterais cíclicas (Phe, Tyr, Trp, His, Pro) v) cadeias laterais aromáticas (Phe, Tyr, Trp) vi) cadeiras laterais acidicas (Asp, Glu) vii) cadeiras laterais básicas (lys, Arg, His) viii) cadeias laterais amidas (Asn, Gin) ix) cadeias laterais hidroxi (Ser, Thr) x) cadeias laterais contendo enxofre (Cys, Met), e xi) aminoácidos que são ácidos monoamino-dicarboxilicos ou ácidos monoamino-monocarboxilicos-monoamidocarboxilicos (Asp, Glu, Asn, Gin) . A adição ou deleção de um aminoácido pode ser uma adição ou deleção de 2 a 5 aminoácidos, tal como de 5 a 10 aminoácidos, por exemplo de 10 a 20 aminoácidos, tal como de 20 a 50 aminoácidos. NO entanto, as adições ou deleções de mais de 50 aminoácidos, tais como adições de 50 a 200 aminoácidos, também estão compreendidas na presente invenção.

Para além dos compostos polipeptidicos aqui descritos, compostos estericamente semelhantes podem ser formulados para mimetizar as porções chave da estrutura dos péptidos e para que tais compostos possam também ser usados da mesma maneira que os péptidos da invenção. Isto pode ser consequido por técnicas de modelação e de desenho químico conhecidas pelos peritos na arte. Por exemplo, a esterificação e outras alquilações podem ser usadas para modificar o terminal amino de, por exemplo, uma espinha dorsal peptídica de di-arginina, para mimetizar uma estrutura tetra peptídica. Será compreendido que todas as referidas construções estericamente semelhantes estão dentro do âmbito da presente invenção.

Os péptidos com alquilações no terminal-N e esterificações no terminal-C também são englobados na presnete invenção. Os equivalentes funcionais também compreendem conjugados covalentes ou agregativos glicosilados, incluindo dímeros ou radicais químicos não relacionados. Tais equivalentes funcionais são preparados por acoplamento das funcionalidades a grupos que se encontram no fragmento incluído em qualquer um ou em ambos os terminal N-e C-, por meios conhecidos na arte.

Os equivalentes funcionais podem assim compreender fragmentos conjugados com ésteres alifáticos ou acilos ou amidas do terminal carboxil, alquilaminas ou resíduos contendo cadeias laterais carboxílicas, por exemplo, conjugados com alquilaminas em resíduos de ácido aspártico; derivados O-acilo do grupo hidroxilo contendo resíduos e derivados N-acilo do terminal amino do amiácido ou grupo amino contendo resíduos, por exemplo, conjugados com Met-Leu-Phe. Os derivados dos grupos acilo são selecionados do grupo de radicais alquilo (incluindo alquilos normais de C3 a CIO), formando assim espécies alcanoílo e compostos carbocíclicos ou heterocíclicos, formando assim espécies aroilo. Os grupos reativos são, preferencialmente, compostos disfuncionais conhecidos per se pela sua utilização na reticulação de proteínas em matrizes insolúveis através de grupos laterais reativos.

Os homólogos funcionais podem ainda ser polipéptidos codificados por um ácido nucleico que é capaz de hibridar para uma vertente complementar de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica as sequências pré-determinadas de polipéptidos da MASP-2, como aqui definido sob condições rígidas.

As condições rígidas aqui usadas devem denotar o rigor normalmente aplicado em relação ao Southern blotting e hibridação como descrito, por exemplo, em Southern E.M., 1975, J. Mol.Blol. 98: 503-517. Para tais fins, é práticaa de rotina incluir etapas de pré-hibridação e hibridação. Tais etapas são normalmente realizadas usando soluções contendo 6x SSPE, Denhardt's a 5%, SDS a 0.5%, formamida a 50%, 100 pg/ml de ADN desnaturado de testículo de salmão (incubação durante 18h a 42°C), seguido de lavagens com 2x SSC e SDS a 0.5% (a temperatura ambiente e a 37°C) e uma lavagem com 0. lx SSC e SDS a 0.5% (incubação a 68% durante 30 min), como descrito por Sambrook et al., 1989 em "Molecular Cloning/ A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor). 0(s) epítopo(s) reconhecidos por um anticorpo específico podem ser determinados por qualquer método convencional, por exemplo métodos que envolvam o uso de espectrometria de massa. Exemplos não limitativos de métodos de mapeamento de epítopos usando espectrometria de massa incluem: 1. Baerga-Ortiz, Hughes, CA, Mandell, JG, Komives, EA: Epitope mapping of a monoclonal antibody against human thrombin by H/D-exchange mass spectrometry reveals selection of a diverse sequence in a highly conserved protein. Protein Sci. 11:1300-1308, 2002. 2. Hochleitner, EO, Borchers, C, Parker, C, Bienstock, RJ, Tomer, KB: Characterization os a discontinuos epitope of the human immunodeficiency virus (HIV) core protein p24 by epitope excision and differential chemical modification followed by mass spectrometric peptide mapping analysis. 3. Hochleitner, EO, Gomy, MK, Zolla-Pazner, S, Tomer, KB: Mass spectrometric characterization of a discontinuous epitope of the HIV envelope protein HIV-gp 120 recognized by the human monoclonal antibody 1331A. J. Immunol. 164:4156-4161, 2000. 4. Parker, CE, Tomer, KB: MALDI/MS-based epitope mapping of antigens bound to immobilized antibodies. Mol. Biotechnol. 20:49-62, 2002. 5. Peter, JF, Tomer, KB: A general strategy for epitope mapping by direct MALDI-TOF mass spectrometry using secondary antibodies and cross-linking. Anal. Chem. 73:4012-4019, 2001. 6. Van De, WJ, Deininger, SO, Macht, M, Przybylski, M, Gershwin, ME: Detection of molecular determinants and epitope mapping using MALDI-TOF mass spectrometry. Clin. Immunol. Immunopathol. 85:229-235, 1997. 1 1

Yu, L, Gaskell, SJ, Brookman, JL: Epitope mapping of monoclonal antibodies by mass spectrometry: identification of protein antignes in complex biological systems. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 9:208-215, 1998. 8. Zhao, Y, Chalt, BT: Protein epitope mapping by mass spectrometry. Anal. Chem. 66:3723-3726, 1994. Métodos de preparação de anticorpos MASP-2

Os anticorpos e equivalentes funcionais dos mesmos podem ser produzidos por qualquer método adequado conhecido pelos peritos na arte.

Um método para a produção dum anticorpo que reconhece e se liga especificamente a um epitopo na parte terminal-C da MASP-2 compreende a etapa de administração da parte terminal-C da MASP-2 ou um fragmento da mesma ou um homólogo funcional da mesma a um mamífero. A referida parte terminal-C da MASP-2 ou o fragmento da mesma ou o homólogo funcional da mesma pode ser qualquer fragmento e péptido da MASP-2 descrito acima. Particularmente, o fragmento da MASP-2 pode ser qualquer um dos fragmentos da MASP-2 descrito acima, em que os referidos fragmentos compreendem um epitopo. A parte terminal-C da MASP-2 ou fragmento da mesma ou homólogo funcional da mesma, administrada ao referido mamífero, é também aqui designada de "antigénio MASP-2".

Numa forma de realização, a presente invenção está relacionada com os métodos de produção de um anticorpo capaz de inibir a atividade MASP-2, em que o referido anticorpo reconhece especificamente um epitopo na parte terminal-C da MASP-2. 0 antigénio MASP-2 tem, preferencialmente, pelo enos 18 aminoácidos de comprimento, mais preferencialmente, pelo menos 20, ainda mais preferencialmente pelo menos 25 aminoácidos de comprimento. 0 antigénio MASP-2 pode ser administrado ao referido mamífero mais do que uma vez, tal como duas vezes, por exemplo 3 vezes, tal como de 3 a 5 vezes, por exemplo de 5 a 10 vezes, tal como de 10 a 20 vezes, por exemplo de 20 a 50 vezes, tal como mais de 50 vezes. Também é possível que sejam administrados ao mesmo mamífero diferentes antigénios MASP-2, simultaneamente ou sequencialmente, em qualquer ordem.

De forma geral, o antigénio MASP-2 estará numa solução aquosa ou em suspensão antes da sua administração. Além disso, o antigénio MASP-2 pode ser misturado com um ou mais compostos diferentes. Por exemplo, o antigénio MASP-2 pode ser misturado com um ou mais adjuvantes adequados e/ou um ou mais transportadores.

Adjuvantes são quaisquer substâncias que misturadas com um antigénio administrado aumentem ou modifiquem a resposta imunitária ao referido antigénio. Um adjuvante pode, por exemplo, ser selecionado a partir do grupo constituído por AIK(S04)2, AINa (S04) 2, AINH4(S04), sílica, alúmen, Al(OH)3, Ca3(P04)2, caulino, carbono, hidróxido de alumínio, dipéptidos de muramilo, N-acetil-muramilo-L-treonil-D-isoglutamina (thr-DMP), N-acetil-nomuramilo-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11687, também referido por nor-MDP), N-acetilmuramilo-L-alanil-D-isoglutamilnil-L-alanina-2-(1'2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (CGP 19835A, também designada por MTP-PE), RIBI (MPL+TDM+CWS) numa emulsão de esqualeno a 2%/Tween-80®, lipopolissacáridos e seus vários derivados incluindo lípido A, Adjuvante completo de Freund (FCA), Adjuvantes incompletos de Freund, Adjuvante 65 Merck, polinucleótidos (por exemplo, ácidos poli IC e poli AU) , cera D do Mycobacterium tuberculosis, substâncias encontradas no Corynebacterium parvum, Bordetella pertussis e membros do género Brucella, lipossomas ou outras emulsões de lípidos, Titermax, ISCOMS, Quil A, ALUN (ver US 58767 e 5,554,372), derivados do Lípido A, derivados da toxina da cólera, derivados de HSP, matrizes peptídicas sintéticas ou GMDP, interleucina 1, interleucina 2, Montanide ISA-51 e QS-21. Os adjuvantes preferidos para serem usados na invenção incluem o Adjuvante Completo de Freund (FCA) e os Adjuvantes Incompletos de Freund.

Os transportadores são estruturas de suporte, por exemplo, um polipéptido ou um polissacárido, às quais um antigénio é capaz de se associar. Um transportador pode estar presente independentemente de um adjuvante. A função dum transportador pode ser, por exemplo, aumentar o peso molecular do antigénio da MASP-2, em particular, de forma a aumentar a imunogenicidade, para conferir estabilidade, para aumentar a atividade biológica ou para aumentar a semivida do soro. 0 transportador pode ser qualquer transportador adequado conhecido pelo perito na arte, por exemplo, uma célula apresentadora de proteínas ou antigénios. Uma proteína transportadora pode ser, mas não está limitada a, hemocianina de Lapa, proteínas séricas como a transferrina, albumina sérica bovina, albumina sérica humana, tiroglobina ou ovalbumina, imunoglobulinas ou hormonas como a insulina ou o ácido palmítico. 0 antigénio MASP-2 pode ser administrado por qualquer método adequado, por exemplo, por via parenteral, oral ou tópica. No entanto, o antigénio é administrado, preferencialmente por injeção, por exemplo por via intramuscular, intradérmica, intravenosa ou subcutânea, mais preferencialmente por injeção subcutânea ou intravenosa. 0 mamífero pode ser qualquer mamífero adequado. Os anticorpos monoclonais são frequentemente preparados usando um roedor, por exemplo um rato ou uma ratazana. Os anticorpos policlonais podem ser preparados por administração do antigénio da MASP-2 a qualquer mamífero, por exemplo, ratos, ratazanas, coelhos, macacos, cabras, ovelhas, vacas ou camelos. Os anticorpos, de acordo com a invenção, também podem ser uma mistura de anticorpos, como uma mistura de anticorpos monoclonais, mistura de anticorpos policlonais ou ambas. Assim, também é considerado na invenção que mais de um tipo de animal pode ser usado.

Se o anticorpo é um anticorpo monoclonal, as células que produzem o anticorpo são, normalmente isoladas a partir do referido mamífero após a imunização. 0 método pode, por exemplo, compreender as etapas de isolamento de células produtoras de anticorpos a partir referido mamífero, preparação de células de hibridoma a partir das referidas células produtoras de anticorpos, cultivo dos referidos hibridomas e isolamento de anticorpos produzidos pelos referidos hibridomas.

Por exemplo, as referidas células podem ser isoladas a partir do referido mamífero 1 dia, tal como no intervalo de 2 a 10 dias, por exemplo no intervalo de 10 a 20 dias, tal como no intervalo de 20 a 40 dias, por exemplo no intervalo de 1 a 3 meses, tal como no intervalo de 3 a 6 meses, por exemplo no intervalo de 6 a 12 meses, tal como no intervalo de 12 a 24 meses, por exemplo mais de 24 meses após a primeira administração do antigénio MASP-2.

As células produtoras de antigénio são normalmente células B e as referidas células podem, por exemplo, ser isoladas a partir do referido mamífero por excisão do baço do referido mamífero.

Uma vez as células produtoras de anticorpos tenham sido isoladas a partir do referido mamífero, as células podem ser fundidas com outras células de forma a obter células de hibridoma. As referidas células pode ser, por exemplo, células de cancro, tal como células derivadas de leucemia, por exemplo células de mieloma. Após a fusão, as referidas células de hibridoma podem ser cultivadas usando protocolos de cultivo padrão. 0 meio de cultura (sobrenadante) pode ser testado para a presença de anticorpos de MASP-2 adequados e as células de hibridoma, capazes de produzir anticorpos de MASP-2 adequados, podem ser selecionadas e cultivadas.

Os testes podem ser realizados por qualquer método adequado, por exemplo por métodos de detecção da presença de anticorpos capazes de se associar com o antigénio MASP-2. Tais métodos incluem, mas não estão limitados a, Western blotting, ELISA (Ensaio Imunoenzimático Indireto), dot-blotting ou TRIFMA. Além disso, ou alternativamente, o referido meio de cultura pode ser testado para a presença de anticorpos MASP-2 capazes de inibir a atividade da MASP-2. São descritos abaixo ensaios adequados para determinar a atividade da MASP-2.

Uma vez as células de hibridoma, capazes de produzir anticorpos MASP-2 adequados, tenham sido identificadas, as referidas células podem ser cultivadas usando qualquer protocolo padrão e os anticorpos produzidos pelas referidas células podem ser purificados. A purificação dos anticorpos pode ser feita usando qualquer protocolo padrão, por exemplo, purificação usando anticorpos anti-Ig, proteína G ou proteína A.

Se o anticorpo é um anticorpo policnlonal, o referido anticorpos pode ser purificado, por exemplo, diretamente a partir do soro de um mamífero imunizado com o antigénio MASP-2. A purificação pode ser feita usando qualquer método padrão, por exemplo purificação usando anticorpos anti-Ig, proteína G ou proteína A.

Os métodos de preparação de anticorpos monoclonais, misturas de anticorpos monoclonais ou anticorpos policlonais são descritos, por exemplo em Antibodies: A Laboratory Manual, by Ed Harlow e David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988.

Um exemplo não limitativo de um método para preparar anticorpos de acordo com a presente invenção é descrito no exemplo 1 aqui abaixo.

Dependendo da natureza do anticorpo, vários outros métodos podem ser usados.

Numa forma de realização da invenção, o anticorpo pode ser produzido usando métodos recombinantes, por exemplo a engenharia de proteínas ou por bibliotecas de seleção. As bibliotecas podem ser bibliotecas sintéticas ou bibliotecas compreendendo material natural. Um método útil é a exibição a fagócitos. De forma geral. A exibição a fagócitos envolve o rastreio de uma ou mais bibliotecas de fagócitos em busca de fagócitos que codificam anticorpos ou equivalentes funcionais dos mesmos úteis.

Noutra forma de realização da presente invenção, os métodos envolvem o uso de animais, por exemplo roedores como os ratos geneticamente modificados para produzir anticorpos quiméricos ou anticorpos de outras espécies, por exemplo anticorpos humanos. Por exemplo, os animais transgénicos como os ratos transgénicos, que carregam genes de anticorpos de outras espécies, tais como genes de anticorpos humanos, podem ser imunizados com qualquer um dos fragmentos MASP-2 mencionados acima.

Os fragmentos de anticorpos podem ser produzidos por fragmentação por fragmentação dos anticorpos de acordo com a invenção, usando qualquer método conhecido pelo perito na arte. Os métodos incluem, mas não estão limitados à diqestão com um ou mais proteases, por exemplo papaina ou pepsina, assim como à redução ou uma combinação de ambos.

Inibição da atividade da MASP-2 A presente invenção também está relacionada com os métodos de inibição da atividade da MASP-2. Em particular, os métodos podem envolver as etapas de: 1) Proporcionar uma composição que compreenda a MASP-2; 2) Proporcionar um anticorpo MASP-2 de acordo com a invenção; 3) Incubar a referida composição com o referido anticorpo, inibindo assim a atividade MASP-2 A composição pode ser qualquer composição que compreenda a MASP-2, por exemplo o soro. 0 anticorpo MASP-2 é preferencialmente um anticorpo MASP-2 capaz de inibir a atividade da MASP-2.

Ensaios para detetar a atividade da MASP-2 A atividade da MASP-2 pode ser determinada por qualquer ensaio adequado. Ensaios úteis incluem ensaios em particular em que são testadas a atividade da protease de serina dos complexos MASP-2/MBL. Os ensaios preferidos são ensaios para determinar a inibição da deposição de C2 e/ou C4.

Os ensaios podem envolver as etapas de preparação duma superfície sólida na qual um agente de associação da MBL é imobilizado, ligando os complexos MBL/MASP-2 ao referido agente de associação da MBL e fazendo o rastreio para a inibição das reações catalisadas pela MASP-2. A superfície sólida pode ser qualquer superfície sólida útil, por exemplo, poços de microtitulação. 0 agente de associação da MBL pode ser qualquer composto ao qual a MBL se ligue com grande afinidade, por exemplo os anticorpos MBL, manana ou manose, sendo no entanto preferível a manana. Os complexos MBL/MASP-2 podem ser derivados de qualquer fonte adequada, podem por exemplo ser MBL recombinante, MASP-2 recombinante ou MBL e/ou MASP-2 purificadas a partir do soro. A MBL/MASP-2 recombinante pode ter o comprimento completo da MBL/MASP-2 ou ser um fragmento funcional da mesma. Além disso, a MBL/MASP-2 recombinante pode estar ligada a um ou mais compostos, como rótulos genéticos. A MBL e/ou a MASP-2 podem ser derivadas de qualquer espécie adequada, por exemplo, podem ser MBL/MASP-2 humanas. Numa forma de realização da invenção, os complexos MBL/MASP-2 são encontrados no soro completo e não são purificados antes da realização do ensaio. Os referidos ensaios testam então a inibição da deposição de substrato, ou seja, de C4 no soro completo. A reação catalisada pela MASP-2 é preferencialmente a deposição de C2 e/ou C4. 0 anticorpo ou equivalente funcional do mesmo a ser analisado no que diz respeito à inibição da atividade é adicionado ao complexo MBL/MASP-2. 0 anticorpo pode ter sido purificado ou pode ser, por exemplo, o sobrenadante bruto da cultura de células de hibridoma. Preferencialmente são também realizados controlos sem adição de anticorpo. 0 anticorpo pode ser adicionado em concentrações no intervalo de 1 pg/ml a 500 pg/ml, preferencialmente no intervalo de 5 pg/ml a 400 pg/ml, mais preferencialmente no intervalo de 101 pg/ml a 300 pg/ml, ainda mais preferencialmente no intervalo de 15 μg/ml a 200 μg/Inl, ainda mais preferencialmente no intervalo de 20 pg/ml a 100 μg/ml.

Um substrato de MASP-2 é adicionado aos complexos MBL/MASP-2. Preferencialmente, o referido substrato é tanto o C2 como o C4 ou uma mistura de ambos. O substrato pode ser produzido de forma recombinante ou um substrato derivado de soro. O substrato pode ou não ter sido purificado antes da sua utilização mas, preferencialmente foi purificado. De forma a monitorizar a deposição, o substrato pode ser marcado com um rótulo detetável, por exemplo com uma enzima, um composto radioativo, um composto fluorescente, um corante, um metal pesado, um composto quimioluminescente ou outro semelhante.

No entanto é preferível que a deposição seja detectada usando agentes de ligação específicos como um anticorpo que reconheça especificamente o substrato. Por exemplo, os anticorpos que reconhecem o complemento C4C humano podem ser usados. Os referidos anticorpos podem ser marcados por um rótulo detetável de forma direta ou indireta, por exemplo uma enzima, um composto radioativo, um composto fluorescente, um corante, um metal pesado, um composto quimioluminescente ou um composto de afinidade, os compostos de afinidade incluem, por exemplo, outros anticorpos ou biotina, estreptavidina.

As etapas acima referidas podem ser realizadas em qualquer ordem, ou seja, o substrato pode ser adicionado antes ou ao mesmo tempo que o anticorpo de inibição, os complexos MBL/MASP-2 podem ser misturados com o substrato e/ou o anticorpo de inibição antes da imobilização na superfície sólida, etc. As etapas também podem ser realizadas na ordem descrita.

Se os complexos MBL/MASP-2, o substrato e o anticorpo foram misturados antes da imobilização, então a referida mistura pode ser pré-incubada durante um determinado tempo, por exemplo, a pré-incubação pode ocorrer no intervalo de 5 minutos a 2 horas. De forma geral, os MBL/MASP-2, o substrato e o anticorpo são pré-misturados, quando os complexos MBL/MASP-2 estão presentes no soro e não foram previamente purificados a partir do soro.

Numa forma de realização preferida da presente invenção, a atividade da MASP-2 é determinada usando qualquer um dos métodos descritos nos exemplos 2 e 3. Em particular, os anticorpos capazes de inibir a deposição de C4 devem ser, preferencialmente, capazes de inibir a deposição de C4 em pelo menos um, preferencialmente em ambos os métodos descritos no exemplo 2 e 3. Os anticorpos capazes de inibir a deposição de C4 devem ser capazes de, ainda mais preferencialmente inibir a deposição de C4 de acordo com os métodos descritos no exemplo 2, enquanto os anticorpos capazes de inibir a deposição de C4 no soro completo devem ser capazes de inibir a deposição de C4 em soro completo como descrito no exemplo 3.

Composições farmacêuticas e administração das mesmas

Numa forma de realização, a presente invenção está relacionada com composições farmacêuticas que compreendem os anticorpos e os equivalentes funcionais dos mesmos de acordo com a invenção. A invenção está ainda relacionada com medicamentos para o tratamento de uma condição clínica que compreendem o anticorpo, ou a utilização do referido anticorpo para a preparação de um medicamento para o tratamento de uma condição clínica. A condição clínica pode ser qualquer uma das condições aqui abaixo mencionadas. 0 indivíduo que necessita da administração dos anticorpos MASP-2 pode ser qualquer indivíduo que sofra da referida condição ou que esteja em risco de adquirir a referida condição clínica.

Preferencialmente, o indivíduo é um ser humano. 0 tratamento pode ser curativo, paliativo, melhorador e/ou profilático.

As composições farmacêuticas da presente invenção compreendem, preferencialmente, uma quantidade farmacêutica efetiva de pelo menos um anticorpo ou equivalente funcional do mesmo que reconhece especificamente um epítopo no terminal C da MASP-2 (aqui designado, acima e abaixo, de "anticorpo MASP-2"). Uma quantidade farmacêutica eficaz é uma quantidade de anticorpo de MASP-2 que induz a resposta desejada num indivíduo que recebe a referida composição farmacêutica. A quantidade farmacêutica efetiva de anticorpo MASP-2 depende do indivíduo ao qual deve ser administrado, em particular no tamanho de referido indivíduo, assim como da condição clínica e do modo específico de administração. No entanto, de forma geral, o anticorpo MASP-2 deve ser administrado a um ser humano adulto na dose no intervalo de lmg a 5000 mg, preferencialmente no intervalo de 10 mg a 3000 mg, mais preferencialmente no intervalo de 50 mg a 1000 mg, por exemplo no intervalo de 100 mg a 750 mg, tal como no intervalo de 150 mg a 500 mg, por exemplo no intervalo de, por exemplo no intervalo de 200 mg a 400 mg, tal como no intervalo de 250 mg a 350 mg, por exemplo cerca de 300 mg. A composição da presente invenção pode ser uma composição farmacêutica adequada para administração parenteral. Tais composições incluem, preferencialmente soluções de injeção estéreis aquosas ou não aquosas que podem conter reaqentes molhantes ou emulsificantes, anti-oxidantes, agentes tampão de pH, compostos bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação isotónica com o fluido corporal, preferencialmente o sangue do indivíduo; e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão ou agentes de espessamento. A composição pode ser apresentada em recipientes de doses unitárias ou multidoses, por exemplo, ampolas seladas e frascos e pode ser armazenada numa condição seca-congelada que requer apenas a adição do transportador liquido estéril imediatamente antes da utilização.

Preferencialmente, a composição da presente invenção compreende um ou mais excipientes adequados, que podem ser estéreis ou não estéreis, para serem usados com células, tecidos ou organismos, tais como um excipiente adequado do ponto de vista farmacêutico para administração a um indivíduo. Tais excipientes podem incluir mas não estar limitados a solução salina, solução salina tamponada, dextrose, água, glicerol, etanol e combinações destes excipientes em várias quantidades. A formulação deve estar adequada ao modo de administração. A invenção está ainda relacionada com estojos farmacêuticos de partes de compreendem um ou mais recipientes com um ou mais dos ingredientes das composições da invenção acima mencionadas. Exemplos de excipientes não aquosos são o propilenoglicol, o polietilenoglicol, óleos vegetais como o azeite, ésteres orgânicos injetáveis como o oleato de etilo.

Preferencialmente, as composições farmacêuticas da presente invenção estão preparadas de forma que sejam injetáveis, tanto em soluções líquidas como em suspensões; além disso, as formas sólidas adequadas para a solução ou suspensão em líquido antes da injeção, também estão dentro do âmbito da presente invenção. A preparação pode ser emulsionada ou o determinante imunogénico, assim como as colectinas e/ou colectinas homólogas, de acordo com a presente invenção, podem ser encapsuladas em lipossomas. 0 anticorpo MASP-2 pode ser administrado sozinho ou em combinação com outros compostos, simultaneamente ou sequencialmente numa outra ordem. A administração pode, por exemplo, ser por injeção ou infusão parenteral, infusão rápida, absorção nasofaríngea, absorção dérmica e, entérica como administração oral. A injeção parenteral pode, por exemplo ser intravenosa, intramuscular, intradérmica ou injeção subcutânea. Preferencialmente, a referida administração é parenteral, via injeção ou infusão. 0 anticorpo MASP-2 deve ser administrado tão frequentemente quanto necessário, assim o anticorpo MASP-2 pode ser administrado mais do que uma vez, tal como pelo menos duas vezes, por exemplo pelo menos 3 vezes, tal como pelo menos 4 vezes, por exemplo pelo menos 5 vezes, tal no intervalo de 1 a 100 vezes, por exemplo no intervalo de 1 a 50 vezes, tal no intervalo de 1 a 25 vezes, por exemplo no intervalo de 1 a 10 vezes.

Preferencialmente existe pelo menos 1 dia entre 2 administrações, tal como pelo menos 2 dias, por exemplo pelo menos 3 dias, tal como pelo menos 5 dias, por exemplo pelo menos 1 semana, tal como pelo menos 2 semanas, por exemplo pelo menos 1 mês, tal como pelo menos 6 meses, por exemplo pelo menos 1 ano, tal como pelo menos 2 anos, por exemplo pelo menos 3 anos, tal como pelo menos 5 anos, por exemplo pelo menos 10 anos.

Condições clínicas A condição clinica, de acordo com a presente invenção, pode ser qualquer condição que possa ser tratada de forma curativa, melhoradora ou profilática por administração dos anticorpos MASP-2. A condição clinica pode ser, numa forma de realização preferida da invenção, uma doença inflamatória crónica. As doenças inflamatórias crónicas podem ser, por exemplo, condições inflamatórias autoimunes.

As condições inflamatórias autoimunes (também aqui designadas por "distúrbios autoimunes") podem ser agrupadas de forma não rígida em condições que inicialmente estão restritas a órgãos ou tecidos específicos e aquelas que afetam todo o corpo. Exemplos de distúrbios específicos de determinados órgãos (sendo o órgão afetado) incluem esclerose múltipla (revestimento de mielina nos processos nervosos), diabetes mellitus tipo I (pâncreas), Tiroidite de Hashimoto (glândula tiróide), anemia perniciosa (estômago), doença de Addison (glândulas adrenais), miastenia gravis (receptores de acetilcolina nas junções neuromusculares), artrite reumatoide (revestimento das articulações), uveíte (olho), psoríase (pele), Síndrome Guillain Barre (células nervosas) e doença de Grave (tiroide). Doenças autoimunes sistémicas incluem o lúpus eritematoso sistémico, a glomerulonefrite e a dermatomiosite.

Numa forma de realização da presente invenção, a condição clínica preferida é selecionada a partir do grupo que consiste em artrite reumatoide e lúpus eritematoso sistémico.

Outros exemplos de distúrbios autoimunes incluem asma, eczema, dermatite atópica, dermatite de contacto, outras dermatites eczematosas, dermatite seborreica, rinite, Líquen plano, Penfigus, Penfigóide bolhoso, Epidermólise bulhosa, urticária, angioedema, vasculites, eritemas, eosinofilia cutânea, Alopecia arreata, aterosclerose, cirrose biliar primária e síndrome nefrótico. Doenças relacionadas incluem inflamações intestinais como a doença Celíaca, proctite, gastroenterite eosinofílica, mastocitose, doença inflamatória intestinal, doenças de Chrohn e colite ulcerativa, assim como alergias relacionadas com alimentos.

Numa outra forma de realização da presente invenção, a condição clinica é caracterizada por perda massiva de células, por exemplo devido a apoptose ou necrose. Tal necrose ou apoptose pode ser induzida por um número de factores diferentes.

Numa forma de realização preferida, a condição clinica é a lesão por isquémia/reperfusão. A isquémia pode ter várias causas diferentes, por exemplo após um acidente vascular cerebral (AVC), um enfarte do miocárdio, uma grande cirurgia ou um transplante de órgãos. Assim, a condição clínica pode ser uma lesão por isquemia/reperfusão causada, por exemplo, por um AVC, enfarte do miocárdio, uma grande cirurgia ou um transplante de órgãos.

Assim, a condição clínica pode ser uma lesão por isquémia/reperfusão, que é um resultado de PTCA (Angioplastia Coronária Percutânea Transluminal) ou CABG (Cirurgia de Revascularização Coronária). Além disso, a condição clínica pode ser uma lesão por isquémia/reperfusão, a qual é resultante de um enfarte agudo do miocárdio ou de isquémia cerebral.

Formas de Realização 0 presente pedido de patente é exemplificado pelas seguintes formas de realização. 1. Um anticorpo ou um seu equivalente funcional reconhecendo e ligando especificamente um epítopo dentro da parte C-terminal de MASP-2, em que o referido anticorpo ou seu equivalente funcional reconhece especificamente pelo menos parte do epitopo nativo reconhecido por um ou mais anticorpos de referência selecionados a partir de 0 grupo que consiste em

Vi. 0 anticorpo monoclonal produzido pela linha celular de hibridoma depositada sob o número de deposição 03050904;

Vii. O anticorpo monoclonal produzido pela linha celular de hibridoma designada M0545YM029;

Viii. O anticorpo monoclonal produzido pela linha celular de hibridoma designada por M0545YM035;

Ix. O anticorpo monoclonal produzido pela linha celular de hibridoma designada M0545YM046; e X. O anticorpo monoclonal produzido pela linha celular de hibridoma designada M0545YM048. 2. O anticorpo de acordo com a forma de realização 1, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal 3. O anticorpo de acordo com a forma de realização 1, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal murino. 4. 0 anticorpo de acordo com a forma de realização 1, em que o anticorpo foi humanizado. 5. 0 anticorpo de acordo com a forma de realização 1, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal humano. 6. 0 anticorpo de acordo com a forma de realização 1, em que o referido equivalente funcional é um fragmento de ligação de um anticorpo. 7. 0 anticorpo de acordo com a forma de realização 6, em que o referido fragmento é selecionado do grupo que consiste em Fab, Fab F (ab') 2 e Fv. 8. 0 anticorpo de acordo com a forma de realização 1, em que o referido equivalente funcional é um anticorpo de cadeia simples. 9. 0 anticorpo de acordo com a forma de realização 1, em que 0 referido equivalente funcional é uma molécula pequena imita, imitando Um anticorpo. 10. O anticorpo de acordo com a forma de realização 1, em que a parte C-terminal do MASP-2 compreende ou consiste nos domínios CCP2 e serina protéase. 11. O anticorpo de acordo com a forma de realização 1, em que a parte C-terminal do MASP-2 compreende ou consiste no domínio da serina protéase.

12. O anticorpo de acordo com a forma de realização 1, em que o MASP-2 é MASP-2 humano como identificado pela SEQ ID 1 13. 0 anticorpo de acordo com a forma de realização 1, em que o referido anticorpo reconhece e liga especificamente um epitopo dentro de um fragmento MASP-2 que compreende ou consiste em aa 363 a 686 de SEQ ID 1. (= CCP2, serina protéase) 14. 0 anticorpo de acordo com a forma de realização 1, em que o referido anticorpo reconhece e liga especificamente um epitopo dentro de um fragmento MASP-2 que compreende ou consiste em aa 445 a 686 de SEQ ID 1. (= serina protéase) 15. 0 anticorpo de acordo com a forma 1, em que o referido anticorpo é capaz de inibir a deposição de C4. 16. 0 anticorpo de acordo com a forma de realização 1, em que o referido anticorpo é capaz de inibir a deposição de C4 em soro completo 17. 0 anticorpo de acordo com a forma de realização 1, em que o referido anticorpo é capaz de inibir a deposição de C4 em soro completo a menos de 20% da deposição de C4 de controlo. 18. O anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 15 a 17, em que o referido anticorpo é capaz de inibir a deposição de C4 em soro completo de indivíduos com atividade de disposição de C4. 19. O anticorpo de acordo com a forma de realização 18, em que o referido anticorpo está presente numa concentração na gama de 1 mg / ml a 500 mg / ml. 20. O anticorpo de acordo com a forma de realização 1, em que o referido anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende ou consiste numa sequência que é pelo menos 90% homóloqa a SEQ ID 4. 21. O anticorpo de acordo com a forma de realização 1, em que o referido anticorpo compreende uma região variável da cadeia leve que compreende ou consiste numa sequência que é pelo menos 90% homóloga a SEQ ID 5. 22. O anticorpo de acordo com a forma de realização 1, em que o referido anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende ou consiste numa sequência que é pelo menos 90% homóloga a SEQ ID 4 e uma região variável da cadeia leve que compreende ou consiste em Uma sequência que é pelo menos 90% homóloga à SEQ ID 5. 23. Um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada compreendendo ou consistindo em uma sequência que é pelo menos 90% homóloga a SEQ ID 4 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio. 24. Um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia leve compreendendo ou consistindo em uma sequência que é pelo menos 90% homóloga a SEQ ID 5 ou um seu fragmento de ligação ao antigénio. 25. Um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada compreendendo ou consistindo numa sequência que seja pelo menos 90% homóloga à SEQ ID 4 e uma região variável da cadeia leve compreendendo ou consistindo numa sequência que seja pelo menos 90% homóloga Para SEQ ID 5. 26. Um anticorpo compreendendo uma ou mais CDRs selecionadas do grupo que consiste em 1) CDR1 da cadeia pesada de SEQ ID 6; 2) CDR2 da cadeia pesada de SEQ ID 7; 3) CDR3 da cadeia pesada de SEQ ID 8; 4) CDR1 da cadeia leve de SEQ ID 9; 5) CDR2 da cadeia leve de SEQ ID 10; e 6) CDR3 da cadeia leve de SEQ ID 11.

Ou um seu fragmento de ligação ao antigénio. 27. Um método para produzir um anticorpo que reconhece e liga especificamente um epítopo dentro da parte C-terminal de MASP-2 ou um seu homólogo funcional, compreendendo o passo de administrar a um mamífero a parte C-terminal de MASP-2 ou um fragmento Ou um homólogo funcional do mesmo. 28. O método de acordo com a forma de realização 27, em que a referida parte C-terminal de MASP-2 compreende ou consiste nos domínios EGF, CUB2, CCP1, CCP2 e serina protéase. 29. O método de acordo com a forma de realização 27, em que a referida parte C-terminal do MASP-2 compreende ou consiste nos domínios CUB2, CCP1, CCP2 e serina protéase. 30. O método de acordo com a forma de realização 27, em que a referida parte C-terminal de MASP-2 ou o seu fragmento compreende ou consiste nos domínios CCP1, CCP2 e protéase serina. 31. O método de acordo com a forma de realização 27, em que a referida parte C-terminal de MASP-2 ou fragmento compreende ou consiste nos domínios CCP2 e serina protéase. 32. 0 método de acordo com a forma de realização 27, em que a referida parte C-terminal de MASP-2 ou fragmento compreende ou consiste no domínio serina protéase. 33. 0 método de acordo com a forma de realização 27, em que a referida parte C-terminal de MASP-2 compreende ou consiste em aa 136 a 686 de SEQ ID 1. (= EGF, CUB2, CCP1, CCP2, serina protéase) 34. 0 método de acordo com a forma de realização 27, em que a referida parte C-terminal de MASP-2 compreende ou consiste em 183 a 686 de SEQ ID 1. (= CUB2, CCP1, CCP2, serina protéase) 35. 0 método de acordo com a forma de realização 27, em que a referida parte C-terminal de MASP-2 ou fragmento compreende ou consiste em aa 293 a 686 de SEQ ID 1. (= CCP1, CCP2, serina protéase). 36. 0 método de acordo com a forma de realização 27, em que a referida parte C-terminal de MASP-2 ou fragmento compreende ou consiste em aa 363 a 686 de SEQ ID 1. (= CCP2, serina protéase) 37. 0 método de acordo com a forma de realização 27, em que a referida parte C-terminal de MASP-2 ou fragmento compreende ou consiste em aa 445 a 686 de SEQ ID 1. (= serina protéase) . 38. 0 método de acordo com a forma de realização 27, em que o mamífero é um roedor. 39. 0 método de acordo com a forma de realização 27, em que o método compreende além disso o isolamento de células produtoras de anticorpo do referido mamífero, preparando células de hibridoma a partir das referidas células produtoras de anticorpos, cultivando os referidos hibridomas e isolando os anticorpos produzidos pelos referidos hibridomas. 40. O método de acordo com qualquer uma das formas de realização 27 a 39, em que o referido epitopo é um epitopo reconhecido por um ou mais anticorpos de referência selecionados do grupo que consiste em i. O anticorpo monoclonal produzido pela linha celular de hibridoma depositada sob o número de deposição 03050904; ii. O anticorpo monoclonal produzido pela linha celular de hibridoma designada M0545YM029; iii. O anticorpo monoclonal produzido pela linha celular de hibridoma designada M0545YM035; iv. O anticorpo monoclonal produzido pela linha celular de hibridoma designada M0545YM046; e V. O anticorpo monoclonal produzido pela linha celular de hibridoma designada M0545YM048. 41. O método de acordo com a forma de realização 40, em que o método compreende ainda a identificação e seleção de anticorpos que reconhecem os referidos epitopos. 42. O método de acordo com a forma de realização 40, em que o método compreende ainda a selecção de anticorpos de teste que reconhecem os referidos epitopos executando os passos de 1) Fornecer MASP-2 ou um seu fragmento compreendendo o epitopo reconhecido pelo referido anticorpo de referência; e 2) Adicionar um anticorpo de teste e o referido anticorpo de referência ao referido MASP-2, em que o anticorpo de teste ou o anticorpo de referência é marcado com um marcador detetável ou ambos os anticorpos são marcados com diferentes rótulos detetáveis; e 3) Detetando a presença do rótulo detetável no MASP-2 4) Detetando se o anticorpo de teste é capaz de deslocar o anticorpo de referência 5) Seleção de anticorpos de teste capazes de deslocar o anticorpo de referência 43. 0 método de acordo com qualquer uma das formas de realização 27 a 42, em que o método compreende ainda testar anticorpos se o referido anticorpo é capaz de inibir a deposição de C4 e anticorpos selecionados capazes de inibir a deposição de C4. 44. 0 método de acordo com qualquer uma das formas de realização 27 a 42, em que o método compreende ainda testes de anticorpos, dado que o referido anticorpo é capaz de inibir a deposição de C4 em soro completo e anticorpos selecionados capazes de inibir a deposição de C4 em soro completo. 45. Um anticorpo produzido de acordo com o método de qualquer das formas de realização 27 a 44. 46. Um método para inibir a atividade de MASP-2 compreendendo os passos de 1) Fornecer uma composição compreendendo MASP-2; 2) Fornecer um anticorpo de acordo com qualquer das formas de realização 1 a 25 e 44; 3) Incubação da referida composição com o referido anticorpo, inibindo assim a atividade de MASP-2 47. 0 método de acordo com a forma de realização 46, em que a composição é soro. 48. Uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou um seu equivalente funcional de acordo com qualquer um dos

Formas de realização 1 a 26 e 45 e excipientes farmaceuticamente aceitáveis. 49. Um medicamento para o tratamento de uma condição clinica compreendendo o anticorpo ou um seu equivalente funcional de acordo com qualquer das formas de realização 1 a 26 e 45 como um ingrediente ativo. 50. O medicamento de acordo com a forma de realização 49, em que a condição clinica é a lesão de isquemia/reperfusão. 51. 52. O medicamento de acordo com a forma de realização 49, em que a condição clinica é uma doença inflamatória crónica. 53. O medicamento de tratamento de acordo com a forma de realização 49, em que a condição clinica é uma autoimune

Condição inflamatória. 54. 0 medicamento de tratamento de acordo com a forma de realização 49, em que a condição clinica é caracterizada por perda de células maciças devido à apoptose. 55. 0 medicamento de tratamento de acordo com a forma de realização 49, em que a condição clinica é a lesão de isquemia/reperfusão. 56. 0 medicamento de acordo com a forma de realização 55, em que a lesão é um resultado de PTCA (angioplastia coronária transluminal percutânea) ou CABG (revascularização do miocárdio). 57. 0 medicamento de tratamento de acordo com a forma de realização 55, em que a referida lesão é um resultado de infarto agudo do miocárdio ou isquemia cerebral. 58. 0 medicamento de tratamento de acordo com a forma de realização 49, em que a condição clinica é selecionada do grupo que consiste em artrite reumatoide e lúpus eritematoso sistémico. 59. Utilização do anticorpo ou um seu equivalente funcional de acordo com qualquer das formas de realização 1 a 26 e 45 para a preparação de um medicamento para o tratamento de uma condição clinica num indivíduo que dele necessite. 60. Utilização de acordo com a forma de realização 59, em que a condição clínica é a lesão de isquemia/reperfusão. 61. Utilização de acordo com a forma de realização 60, em que a lesão é um resultado de PTCA (angioplastia coronária transluminal percutânea) ou CABG (revascularização do miocárdio). 62. Utilização de acordo com a forma de realização 60, em que a referida lesão é o resultado de infarto agudo do miocárdio ou isquemia cerebral. 63. Utilização de acordo com a forma de realização 59, em que a condição clinica é selecionada do grupo que consiste em artrite reumatoide e lúpus eritematoso sistémico.

Exemplos Exemplo 1

Anticorpo monoclonal anti-MASP-2:

Ratazanas fêmeas Wistar (com 8 semanas) foram injetadas por via subcutânea com 3 pg de MASP-2 recombinante humana de domínio CCPl-CCP2-protease de serina (CCP1/2-SP) (Rossi et ai., 2001) emulsionada em adjuvante completo de Freund e reforçada três vezes com 3 pg de CCP1/2-SP em adjuvante incompleto de Freund. Três dias antes da remoção do baço, a ratazana foi reforçada por via intravenosa com 3 pg de CCP1/2-SP em solução salina. A fusão duma suspensão das células do baço com células de mieloma de rato (X63-Ag8.653) e a cultura em células alimentadoras de rato ocorreu como descrito (Liu et ai., 2001). Para a detecção de anticorpos anti-MASP-2 nos sobrenadantes, placas de microtitulação (FluoroNUnc, Nunc, Kamstrup, Dinamarca) foram revestidas com 1 pg de mamana (Nakajima e Bailou, 1974) em 100 pg de Na2C03Í5 mM, NaHCCb 35 mM, NaN3 1.5 mM, pH 9.6 (tampão de revestimento) durante a noite a 4°C. Os locais de ligação de proteína residuais foram bloqueados por 200 pg de albumina sérica humana (HSA) em 200 pg de Tris-HCl 10 mM, NaCl 140 mM, NaN3 1.5 mM, pH 7.4 (TBS) durante 1 hora a temperatura ambiente.

Os poços foram lavados com TBS contendo Tween 20 a 0.05% (v/v) e Cacl2 5 mM (TBS/Tw/Ca2+) e posteriormente incubados durante a noite a 4°C com uma preparação de 0.5 pg de MBL/MASP em 100 pg de TBS/Tw/Ca2+.

Após a lavagem, os hibridomas sobrenadantes diluídos 5 vezes em TBS/Tw/Ca2+ foram adicionados aos poços e incubados durante 2 horas a temperatura ambiente. Os anticorpos anti-MASP-21igados foram detetados por adição de 50 ng de anticorpo de coelho anti Ig de rato (Dako, Glostrup, Dinamarca) marcados com európio (Perkin Elmer, Gaithersburg, USA) (Hemmila et al., 1984) em 100 pi de TBS/Tw, 25 pM de EDTA. Após 1 hora a temperatura ambiente, os poços foram lavados e o európio ligado foi detetado pela adição de 200 pl de solução de melhoria (Perkin Elmer) e no tempo de leitura a fluorescência foi lida num fluorómetro DELFIA® (Perkin Elmer). As culturas positivas selecionadas foram clonadas duas vezes por diluição limitada e congeladas em DMEM a 60% (v/v), soro de feto de vitelo a 30% (v/v), DMSO a 10%.

Uma preparação MBUMASP foi separada por SDS-PAGE seguido de blotting numa membrana PVDF. Os anticorpos selecionados foram testados por reconhecimento da MASP-2 no blot.

Os anticorpos de inibição foram identificados por pesquisa da inibição da deposição de C4 catalisada pela MASP-2, como descrito no exemplo 2 abaixo. O sobrenadante das culturas de linhas de células de hibridoma que produzem os anticorpos selecionados foi centrifugado a 10.000g durante 15 minutos e o sobrenadante foi tamponado com Na2HP04 10 mM, EDTA 10 mM, pH7. Foram passados 100 ml de sobrenadante através de uma coluna com 1 ml de Ig anti-bovino (5 mg Ig anti-bovino Dako) por ml de Sepharose 4B ativada

por CNBr (Amersham Bioscience, Uppsala, Suécia)) equilibrada com KH2PO4 1.5 mM, Na2HP04 8.1 mM, NaCl 13 7 mM, KC1 2.7 mM, pH 7.4 (PBS) com EDTA 10 mM (PBS/EDTA) . O efluente foi passado por uma coluna com 1 ml de Sepharose Proteína G (Amersham Bioscience) pré lavada com 0.1 mM de glicina, pH 2.5 e reequilibrada com PBS/EDTA. As colunas foram lavadas com 30 ml de PBS/EDTA e eluídas com glicina a 0.1 M e pH a 2.5. O eluído foi recolhido em fracções de 0.5 ml em 40 μΐ de Tris-HCl a 1 M e pH 8.5.

Exemplo 2

Ensaio para a inibição da deposição de C4 catalisada pela MASP-2: 0 ensaio é composto por três etapas: 1) preparação dos poços de microtitulação revestidos de manana; 2) ligação de rMBL e rMASP-2 aos poços revestidos com manana; 3) análise da inibição da deposição de C4 catalisada pela MASP-2. 1) preparação dos poços de microtitulação revestidos de manana 96 placas de microtitulação (FluroNunc, Nalgene Nunc Int, Dinamarca) revestidas com manana (10 mg/ml, Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) num tampão de revestimento (Na2C03: 3.18g/l; NaHCCb: 5.86 g/1; pH ajustado para 9.6 usando HC1) durante a noite a 4°C. Os poços foram lavados duas vezes com TBS (Tris a 10 mM, NaCl a 150 mM, pH ajustado para 7.4 usando HC1). Os poços foram então bloqueados por incubação durante 1 hora a temperatura ambiente num tampão, como acima, no entanto foi adicionado 1 mg/ml de albumina humana (State Serum Institute, Copenhaga, Dinamarca). Os poços foram então lavados 3 vezes com TBST+Ca2+ (Tris a 10 mM, NaCl a 150 mM, CaCl2 a 10 mM; Tween 20 a 0.05%, pH ajustado a 7.4 usando HC1, a partir de agora é o tampão de lavagem) e ficaram prontos para uso. 2) ligação de rMBL e rMASP-2 aos poços revestidos com manana 0.8 ng/poço de MASP-2 recombinante humana purificada e marcada com His e 1 ng/poço de MBL recombinante humana purificada foram ligados aos poços de microtitulação revestidos com manana por incubação durante a noite a 4°C no tampão de lavagem acima, excepto pelo facto deste ter a adição de 1 mg/ml de albumina humana (State Serum Institute, Copenhaga, Dinamarca) . Os poços foram então lavados 3 vezes com o tampão de lavagem e ficaram prontos para uso. 3) Análise da inibição da deposição de C4 catalisada pela MASP-2 A substância a ser analisada no que diz respeito à inibição da atividade (por exemplo sobrenadante da cultura de células de hibridoma, anticorpo purificado) é adicionada aos poços de microtitulação revestidos com manana e ligados a rMBL/rMASP-2 no tampão de lavagem acima, excepto pelo facto de ser adicionado 1 mg/ml de albumina humana (State Serum Institute, Copenhaga, Dinamarca) e é incubada durante 1 hora à temperatura ambiente. Os poços são então lavados 3 vezes com o tampão de lavagem e incubados durante lhora e meia a 37°C com o componente do complemento humano C4 purificado (aproximadamente 1.5-2 ng/ml) num tampão de barbital sódico (5mM), NaCl (181 mM) , CaC12 (2.5 mM) , MgC12 (1.25 mM) , pH 7.4. É adicionado 11 mg/ml de albumina humana (State Serum Institute, Copenhaga, Dinamarca) antes do uso. Os poços são então lavados 3 vezes com o tampão de lavagem e é adicionado 0.89 mg/ml do componente do complemento C4c anti-humano de coelho biotinilado (Dako, Dinamarca, biotinilado de acordo com procedimentos padrão). Os poços são incubados por 1 hora a temperatura ambiente e lavados 3 vezes no tampão de lavagem. É adicionada estreptavidina marcada com európio (Wallac, Turku, Finlândia) a uma concentração de 0.1 mg/1 no tampão de lavagem acima descrito, excepto pelo facto de ser retirado o cálcio e serem adicionados 50 μΜ de EDTA. Os poços são incubados durante 1 hora a temperatura ambiente e lavados 3 vezes com o tampão de lavagem. Os poços são desenvolvidos por adição de 100 μΐ de solução de melhoramento Delfia (Perkin Elmer Wallac, Norton, USA) e incubados num agitador orbital durante 5 minutos a temperatura ambiente. Os poços são contados num Multi-contador Wallac Victor 2d 1420 (Wallac, Turku, Finlândia). A inibição é vista à medida gue as contagens decrescem em comparação com os poços onde não foi adicionada substância de inibição.

Exemplo 3

Ensaio para a inibição da deposição de C4 catalisada pela MASP-2 em soro completo: A amostra de soro a ser analisada é diluída 250 vezes (concentração final) no tampão barbital acima e é adicionado C4 (1.5-2 ng/ml, concentração final). A substância a ser analisada para a inibição da atividade (por exemplo um anticorpo purificado) é adicionada e as amostras são incubadas entre 5 minutos a 2 horas a 37°C. Normalmente a incubação dura 15 minutos. São adicionados 100 μΐ aos poços de microtitulação revestidos com manana, preparados como descrito acima e são incubados durante 1 hora e meia a 37°C. Os poços são lavados 3 vezes no tampão de lavagem acima e são adicionados 0.89 mg/1 do componente do complemento C4c anti-humano de coelho biotinilado (Dako, Dinamarca, biotinilado de acordo com procedimentos padrão) . Os poços são incubados durante 1 hora a temperatura ambiente e lavados 3 vezes com o tampão de lavagem. É adicionada estreptavidina marcada com európio (Wallac, Turku, Finlândia) a uma concentração de 0.1 mg/1 no tampão de lavagem acima descrito, excepto pelo facto de ser retirado o cálcio e serem adicionados 50 μΜ de EDTA. Os poços são incubados durante 1 hora a temperatura ambiente e lavados 3 vezes com o tampão de lavagem. Os poços são desenvolvidos por adição de 100 μΐ de solução de melhoramento Delfia (Perkin Elmer Wallac, Norton, USA) e incubados num agitador orbital durante 5 minutos a temperatura ambiente. Os poços são contados num Multi-contador Wallac Victor 2d 1420 (Wallac, Turku, Finlândia). A Figura 3 ilustra as contagens de Eu3 obtidas após a realização do ensaio de inibição usando tanto o anticorpo monoclonal produzido pela linha de células de hibridoma depositada sobre o número 03050904, PBS ou manose. O anticorpo é capaz de inibir largamente a deposição de C4 em todos os soros testados. A Figura 4 ilustra a inibição de deposição de C4 em soro completo pelo anticorpo monoclonal produzido pela linha de células de hibridoma depositada sobre o número 03050904 como função da concentração do anticorpo.

Exemplo 4

Composição farmacêutica

Uma unidade de dose de uma composição farmacêutica pode compreender, de acordo com a invenção, 300 mg de anticorpo MASP-2 produzido pela linha de células de hibridoma depositada sobre o número 03050904, purificado como descrito no exemplo 1 e formulado em 10 mM de tampão Tris, pH 7.4 e 140 mM de NaCl. A composição farmacêutica é filtrada através dum filtro Planova 75N e um filtro Planova 35N para remover quaisquer vírus, e filtrada de forma estéril num filtro de 0.22 pm.

Esta formulação é adequada para administração parenteral a um humano adulto.

Exemplo 5

Produção e caracterização da inibição dos anticorpos monoclonais anti-huMASP-2

Imunização

Quatro ratos (de 6-8 semanas de idade) foram imunizados. Foi administrado um total de quatro injeções (50 pg de antigénio por animal por injeção). Os ratos foram injetados no dia 0 com partes iguais (v/v) de adjuvante completo de Freund e 10 pg de MASP-2 humana marcada com His (N039-76C) . Foram realizados 3 reforços seguintes com partes iguais (v/v) de adjuvante incompleto de Freund e antigénio, com três semanas entre cada reforço. O rato com melhor resposta 10 dias após a última injeção foi selecionado usando um teste ELISA contra a MASP-2.

Hibridação, fusão

As fusões foram realizadas usando uma metodologia convencional. Os linfócitos esplénicos do animal com a melhor resposta foram fundidos com a linha de células Sp2/0-Ag-14 usando PEG (Polietilenoglicol) e os hibridomas resultantes foram semeados em placas com 96 poços em meio HAT. 0 meio foi mudado 2-3 vezes antes da análise. Normalmente, as colónias de hibridoma estão prontas para análise em 3-5 semanas. Os sobrenadantes foram testados para a presença de anticorpo inibidor através do ensaio de deposição de C4. Os hibridomas foram sub-clonados por diluição limitada.

Foram analisados 785 clones primários em relação à inibição da atividade e 50 clones de inibição foram selecionados para subclonagem. Os sub-clones foram analisados para a inibição e os clones que mostraram a maior atividade inibitória foram sub-clonados novamente. Após 2 a 3 subclonagens, restavam 4 clones inibidores com interesse (ver tabela 1 abaixo).

Ensaio da inibição da deposição de C-4

Tampão Bl/HSA: um tampão de barbital sódico (5mM), Nacl (181 mM), CaC12 (2.5mM), MgC12 (1.25 mM), pH 7.4. É adicionado 1 mg/ml de albumina humana (State Serum Institute, Copenhaga, Dinamarca) antes do uso. O ensaio é composto por três etapas: 1) preparação dos poços de microtitulação revestidos por manana, 2) pré-incubação dos anticorpos com soro humano e 3) medição da deposição de C4 catalizada pela MASP-2.

Preparação dos poços de microtitulação revestidos por manana

Placas de microtitulação com 96 poços (FluroNunc, Nalgene Nunc Int, Dinamarca) são revestidas com manana (10 mg/1, Sigma Chemical Co ., St.Louis, USA) num tampão de revestimento (Na2C03: 3.18 g/1; NaHC03: 5.86 g/1; pH ajustado a 9.6 usando HC1) durante a noite a temperatura ambiente. Os poços são lavados 2 vezes com TBS (Tris a 10 mM, NaCl a 150 mM, pH= 7.4 usando HC1). Os poços são então bloqueados por incubação durante 1 hora a temperatura ambiente num tampão como acima, mas é adicionada 1 mg/ml de albumina humana (State Serum Institute, Copenhaga, Dinamarca). Os poços são então lavados 3 vezes com TBST (Tris a 10 mM, NaCl a 150 mM, Tween 20 a 0.05%, pH=7.4 usando HC1) e estão prontos a serem utilizados.

Pré-incubação dos anticorpos com soro humano:

Os anticorpos a serem testados são diluídos em série em Bl/HSA. São transferidos 100 μΐ de cada diluição para um poço de uma placa Nucleon com 96 poços. São adicionados 100 μΐ de soro humano completo diluído xl25 (final 250x) a cada poço, juntamente com o componente do complemento C4 humano e purificado (aproximadamente 3-4 mg/1). Incubação a 37C durante 15 minutos. São então transferidos 100 μΐ da mistura de anticorpo-soro humano para as placas revestidas com manana previamente preparadas.

Medição da deposição de C4 catalisada pela MASP-2:

As placas revestidas com manana são incubadas durante 1.5 horas a 37°C. Os poços são lavados 3 vezes com o tampão de lavagem TBST+Ca (Tris a 10 mM, NaCl a 150 mM, CaC12 a 10 mM, Tween 20 a 0.05%, pH=7.4 usando HC1) e são adicionados 0.89 mg/1 do componente do complemento C4c anti-humano de coelho biotinilado diluído em TBST+Ca (Dako, Dinamarca, biotinilado de acordo com procedimentos padrão). Os poços são incubados durante 1 hora a temperatura ambiente e lavados 3 vezes em tampão de lavagem. É adicionada estreptavidina marcada com európio (Wallac, Turku, Finlândia) a uma concentração de 0.1 mg/1 no tampão de lavagem acima descrito, excepto pelo facto de ser retirado o cálcio e serem adicionados 50 μΜ de EDTA. Os poços são incubados durante 1 hora a temperatura ambiente e lavados 3 vezes com o tampão de lavagem. Os poços são desenvolvidos por adição de 100 μΐ de solução de melhoramento Delfia (Perkin Elmer Wallac, Norton, USA) e incubados num agitador orbital durante 5 minutos a temperatura ambiente. Os poços são contados num Multi-contador Wallac Victor 2d 1420 (Wallac, Turku, Finlândia).

Western blot O soro humano (0.15 μΐ/fila) foi analisado em gel de poliacrilamida NuPage 4-12% Bis-Tris e transferido para uma membrana PVDF. Os blots foram bloqueados com 0.5% de gelatina no tampão de incubação (5x: Tris a 250 mM; NaCl a 750 mM; EDTA a 25 mM, IGEPAL CA-630 a 0.5%, pH 7.4) e incubados com os anticorpos monoclonais, seguido por uma IgG anti-rato de coelho HRP-conjugada (Dako Po260). Os blots foram detetados com o conjunto SuperSignal West Pico quimioluminescente (Pierce Inc). ELISA competitiva MASP-2

Tampão de revestimento: PBS (Nacl a 13 7 mM, KC1 a 2.7 mM, KH2PO4 a 1.5 mM, Na2HP04 a 8.1 mM, pH=7.2 usando HC1)

Tampão de Bloqueio: TBS (Tris a 10 mM, NaCl a 150 mM, pH=7.4 usando HC1) contendo 1 mg/ml de HSA

Tampão de lavagem: TBST+Ca (Tris a 10 mM, NaCl a 150 mM, CaC12 a 10 mM, Tween 20 a 0.05%, pH=7.4 usando HC1)

Revestimento da placa de ELISA: O antigénio MASP-2 é diluído a 1 pg/ml no tampão de revestimento [PBS pH 7.2]. São adicionados 100 μΐ da solução de revestimento da MASP-2a cada poço da placa de microtitulação. A placa é incubada a temperatura ambiente durante 1 hora. A placa de microtitulação é esvaziada e cada poço da placa é preenchido com tampão de bloqueio e incubado durante uma hora a temperatura ambiente. A placa de microtitulação é esvaziada e cada poço da placa é preenchido com tampão de lavagem. A placa de microtitulação é esvaziada. Isto repete-se 3 vezes. Os poços são preenchidos com tampão de lavagem e armazenados a 4°C.

Os anticorpos murinos são apropriadamente diluídos (0.2 e 1.0 pg/ml final) com o tampão de lavagem. O NimoAblOl biotinilado é diluído (0.2 pg/ml final) em tampão de lavagem. Os anticorpos murinos diluídos são adicionados (100 μΐ/poço) à placa revestida por MASP-2. A placa é incubada durante 1 hora a temperatura ambiente. A placa de microtitulação é esvaziada. A placa de microtitulação é lavada enchendo completamente os poços com tampão de lavagem e posteriormente esvaziando-os. Esta etapa é repetida duas vezes num total de três lavagens. É adicionada estreptavidina marcada com európio (Wallac, Turku, Finlândia) a uma concentração de 0.1 mg/1 no tampão de lavagem acima descrito, excepto pelo facto de ser retirado o cálcio e serem adicionados 50 μΜ de EDTA. A placa de microtitulação é esvaziada e os poços são lavados três vezes com o tampão de lavagem. Os poços são desenvolvidos por adição de 100 μΐ de solução de melhoramento Delfia (Perkin Elmer Wallac, Norton, USA) e incubados num agitador orbital durante 5 minutos a temperatura ambiente. Os poços são contados num Multi-contador Wallac Victor 2d 1420 (Wallac, Turku, Finlândia).

Resultados A Tabela 1 indica quatro hibridomas que produzem anticorpor inibitórios identificados como acima.

Tabela 1

Potência dos novos anticorpos

Os quatro clones de hibridomas descritos foram transformados em crescimento sem soro e os anticorpos foram purificados a partir do sobrenadante da cultura por porificação MEP HyperCel. A capacidade de inibir a via da lectina num soro humano completo foi determinada pelo ensaio de deposição de C4, como descrito acima. Os resultados são apresentados na Figura 5. A partir dos dados pode concluir-se que o anticorpo (035) é pelo menos 3.9 vezes mais potente que o NimoAblOl na inibição da atividade da MASP-2, enquanto o anticorpo (029) é pelo menos 30 vezes mais potente. O anticorpo de controlo (002) é um anticorpo não inibitório obtido durante a análise que, provavelmente se liga ao terminal-N da MASP-2. Os anticorpos (046) e (048) também inibem mas são menos potentes que o NimoAbl01.

Mapeamento de Epítopos Western blot

Foram realizados testes de Western blot de forma a distinguir entre a ligação dos anticorpos à cadeia A do terminal-N (parte de dimerização e de ligação à MBL) ou à cadeia B do termina-C (parte da preotease de serina da MASP-2). O soro humano foi analisado num SDS-PAGE reduzido e foi realizada a imunodetecção com os quatro anticorpos em separado. A MASP-2 não ativada de tamanho completo irá exibir uma banda de 74 kDa, a cadeia A e a cadeia B exibem bandas de 47 kDa e 27 kDa, respetivamente. A Figura 6 mostra os resultados dos Western blots contra a MASP-2 em soro humano completo usando diferentes anticorpos murinos.

Pode concluir-se a partir do blot que os quatro anticorpos reconhecem uma banda de 27 kDa (cadeia B) enquanto a cadeia A (47 kDa) não pode ser detetada. Assim, todos os anticorpos reconhecem um epitopo linear na cadeia B. ELISA competitivo

Com o objetivo de elucidar se os anticorpos partilham o mesmo epitopo que o anticorpo de ratazana NimoAblOl, foi levada a cabo um ELISA competitivo. 0 ELISA foi direcionado para a MASP-2 marcada com His usando um NimoAblOl biotinilado competindo contra duas concentrações diferentes (0.2 e 1.0 pg/ml) dos anticorpos de rato.

Os resultados são apresentados na Figura 7. Quanto melhor um anticorpo compita com o NimoAblOl, menor será o sinal EU3+. Pose assim concluir-se que os anticorpos 029 (NimoAbl08) e (NimoAbl04) competem muito bem com o anticorpo NimoAblOl e, como tal, devem partilhar pelo menos parte do epitopo.

Exemplo 6

Identificação e clonagem da região VH e VL do anticorpo

NimoAblOl expresso nas células de hibridoma depositadas sob o ns de adesão ECACC 03050904 A especificidade dos anticorpos reside nas regiões determinantes de complementaridade (CDRs) dentro dos domínios variáveis das cadeias pesadas e leves. De forma a caracterizar o anticorpo monoclonal NimoAblOl, as regiões variáveis VH e VL dos domínios foram clonadas.

Abreviaturas usadas

Vh = região variável da cadeia pesada da Ig; Vl = região variável da cadeia leve da Ig; CDR = região determinante complementar; CDR1, CDR2 e CDR3 = três regiões na Vh ou na Vl, que são numeradas pelos terminais amino; FR = região de estrutura; FR3 = a terceira região de estrutura na Vh ou na Vl, numerada pelo terminal amino; scFv = fragmento Fv de cadeia única; cADN (ADN complementar) = molécula de ADN de cadeia única que é complementar à sequência de base da cadeia de ARN; 5'RACE = amplificação rápida da extremidade 5' do cDNA Materiais e métodos Isolamento do ARN e mARN total

As células de hibridoma depositadas sob o número ECAAC 03050904 foram dispensadas em 4tubos. As células foram peletizadas e o sobrenadante foi removido.

Dois dos tubos foram congelados a -80C.

Dois dos tubos foram usados para purificação do ARN usando

o conjunto RTN70 Total RNA GenElute™ Mammalian. A concentração de ARN foi determinada por espectrofotometria. O ARN total também foi purificado usando o conjunto de purificação Total RNA NUcleoSpin® RNA II: Cat. No. 740955.20 Macherey-Nagel. O rendimento foi determinado por espectrofotometria. O ARN Poli(A) foi isolado do ARN total com o conjunto mRNA NucleoTrap®: Cat. No. 740655 Macherey-nagel.

O mARN purificado foi eluido em H20 (livre de ARNase) e foi imediatamente armazenado a -80°C

Construção do cADN

5'RACE A amplificação rápida 5' das entremidades do CADN foi levada a cabo usando o conjunto de amplificação de cADN Smart RACE (Clontech) de acordo com as instruções do fabricante. Foi usado Grt para a transcrição reversa (TR) e foi realizada amplicação com G3'.

Os primers específicos dos genes usados nesta abordagem foram:

Construção do Plasmideo: clonagem de fragmentos de PCR

Plasmídeo Parental: • pCR2.1-TOPO (conjunto de clonagem InVitrogen TOPO TA) 0 fragmento de PCR purificado foi clonado no vector usando a reação TOPO.

Análise de Sequência 0 ADN da mini-preparação de plasmideos de quatro clones recombinantes de VL e da mini-preparação de plasmideos de seis clones recombinantes de VH foi sequenciado na inserção em ambas as direções usando primers padrão de sequenciação M13F e M13R. As duas sequências respetivas de cada plasmídeo foram montadas num contig usando o VNTI contig express. A parte confiável das sequências consenso contig foi importada para ficheiros da base de dados NTI DNA.

Os orfs relevantes da IgG foram identificados e traduzidos. Alinhamento da sequência e pesquisa BLAST

Análise de Computador A análise de sequência foi feita com o VectorNTI da Informax Inc. usando o módulo contig.

As pesquisas BLAST foram realizadas usando a página da NCBI (http://ncbi.nlm.nih.gov) e do Instituto Europeu de

Bio informática_(EBI) (http://www.ebi.ukfroois/homology.html).

Alinhamento de proteínas: todos os alinhamentos foram feitos com o pacote VectorNTI da informax Inc. usando o módulo ALIGN. Os alinhamentos múltiplos das proteínas VL e VH da IgG foram feitos e editados com o CLUSTALW e GeneDoc.

RESULTADOS E DISCUSSÃO 0 anticorpo NimoablOl foi criado contra a subunidade CCP1-CCP2-SP da MASP-2 humana. Os genes do fragmento Fab foram amplificados por PCR do mARN do hibridoma, usando primers de hibridação nos domínios constantes ChI e Cl adaptados da literatura (1) e primers de hibridação para um adaptador que foi incorporado na extremidade 5' dos genes do cADN. Os produtos purificados do PCR da VL e VH foram clonados no vector pCR2.1-T0P0 e sequenciados com os primers M13F e M13R. Todas as sequências VH e todas as sequências VL eram idênticas. As sequências são mostradas nas Figuras de 8 a 10.

Definição de Rabat CRD

Cadeia CDR1: resíduos 24-34 Ί CDR2: resíduos 50-56 leve CDR3: resíduos 89-97

Cadeia CDR1: resíduos 31-35 . CDR2: resíduos 50-65 pesada CDR3: resíduos 95-102 A comparação das sequências com os dados publicados das regiões variáveis dos anticorpos indica que o gene VL NimoAblOl continha uma sequência líder de 57 nucleótidos que codifica um péptido líder de 19 resíduos de aminoácidos, enquanto o gene VH NimoAblOl tinha uma sequência líder com 60 bases de comprimento que codificava um péptido líder de 20 resíduos.

Enquanto a cadeia leve tem um membro típico do subgrupo da cadeia kapa (ratazana-rato-humano) , a cadeia pesada difere de qualquer outra cadeia pesada que não a da base de dados. Tem uma inserção de 6 aminoácidos na CDR H3 (após o resíduo 100, numeração de Rabat).

REFERENCIAS 1) Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Domains published in the Spinger Verlag Laboratory Manual on Antibody Engineering edited by Stefan Duebel and Roland Kontermann

Deposição biológica 0 material biológico seguinte foi depositado numa instituição depositária reconhecida sob o Tratado de Budapeste.

Uma linha de células de hibridoma capaz de produzir anticorpos para a MASP-2, capaz de inibir a atividade da MASP-2 foi depositada sob o número 03050904 no EUROPEAN COLLECTION OF CELL CULTURES (ECACC), Salisbury, Wittshire SP4 OJG, Reino Unido. A linha de células é uma linha de células de hibridoma derivada da fusão de células de baço de ratazana e células de mieloma de rato. Esta linha de células de hibridoma produz um anticorpo monoclonal que é aqui referido como NimoAblOl ou NimoAblOl N128-71B. As células foram depositadas a 9 de Maio de 2003. A linha de células de hibridoma designada M0545YM035S2 (também aqui designada por M0545YM035) foi depositada no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Germany. A linha de células é uma linha de células de hibridoma derivada da fusão de células de baço murinas e células de mieloma de rato. A referência de identificação é N162-91A- 01 a 12. Esta linha de células de hibridoma produz um anticorpo monoclonal o qual é aqui referido como NimoAbl04 ou "035" ou "Ab035". As células foram depositadas a 6 de Maio de 2004.

Uma linha de células de hibridoma designada M0545YM029S2 (aqui também designada por M0545YM029) foi depositada no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Germany. A linha de células é uma linha de células de hibridoma derivada da fusão de células de baço murinas e células de mieloma de rato. A referência de identificação é N162-90C-01 a 12. Esta linha de células de hibridoma produz um anticorpo monoclonal o qual é aqui referido como NimoAbl08 ou /J029" ou "Ab029". As células foram depositadas a 6 de Maio de 2004.

Uma linha de células de hibridoma designada M0545YM046S2 (aqui também designada por M0545YM046) foi depositada no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Germany. A linha de células é uma linha de células de hibridoma derivada da fusão de células de baço murinas e células de mieloma de rato. A referência de identificação é N162-90D-01 a 12. Esta linha de células de hibridoma produz um anticorpo monoclonal o qual é aqui referido como NimoAbl09 ou "046" ou "Ab046". As células foram depositadas a 6 de Maio de 2004.

Uma linha de células de hibridoma designada M0545YM048S2 (aqui também designada por M0545YM048) foi depositada no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Germany. A linha de células é uma linha de células de hibridoma derivada da fusão de células de baço murinas e células de mieloma de rato. A referência de identificação é N162-90-01 a 12. Esta linha de células de hibridoma produz um anticorpo monoclonal o qual é aqui referido como NimoAbllO ou "048" ou "Ab048". As células foram depositadas a 6 de Maio de 2004.

Referências

Hemmila, I., Dakubu, S., Mukkala, V.M., Siitari, H. and Lovgren, T. (1984) Europium as a label in time-resolved immunofluorometric assays. Anal Biochem 137, 335-43.

Jones, P. T., Dear, P. H., Foote, J., Neuberger, M. S., Winter, G., 1986. Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse. Nature, 321, 522-525

Liu, H., Jensen, L., Hansen, S., Petersen, S.V., Takahashi, K., Ezekowitz, A.B., Hansen, F.D., Jensenius, J.C. and

Thiel, S. (2001) Characterization and quantification of mouse mannan-binding lectins (MBL-A and MBL-C) and study of acute phase responses. Scand J Immunol 53, 489-97.

Nakajima, T. and Ballou, C.E. (1974) Characterization of the carbohydrate fragments obtained from Saccharomyces cerevisiae mannan by alkaline degradation. J Biol Chem 249, 7679-84.

Rossi, V., Cseh, S., Bally, I., Thielens, N.M., Jensenius, J.C. and Arlaud, G.J. (2001) Substrate specificities of recombinant mannan-binding lectin-associated serine proteases-1 and -2. J Biol Chem 276, 40880-7.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS «»©> Anticorpos para a MASP-2 «33«* M^f·

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Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Um anticorpo monoclonal ou um seu fragmento de ligação ao antigénio reconhecendo especificamente e ligando um epítopo dentro da parte C-terminal de MASP-2, em que o anticorpo, ou o seu fragmento de ligação ao antigénio, compreende as seguintes CDR: 1) CDR1 da cadeia pesada de SEQ ID 6; 2) CDR2 da cadeia pesada de SEQ ID 7; 3) CDR3 da cadeia pesada de SEQ ID 8; 4) CDR1 da cadeia leve de SEQ ID 9; 5) CDR2 da cadeia leve de SEQ ID 10; e 6) CDR3 da cadeia leve de SEQ ID 11; e É capaz de inibir a deposição de C4.
2. 2. O anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que o referido fragmento de ligação ao antigénio é selecionado do grupo que consiste em fragmentos Fab, Fab ', F (ab') 2 e Fv.
3. 3. O anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que o referido anticorpo é um anticorpo de cadeia simples.
4. 4. O anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que MASP-2 é MASP-2 humano como identificado pela SEQ ID NO: 1.
5. 5. O anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que o referido anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigénio é capaz de inibir a deposição de C4 em soro completo. 1 1 O anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que o referido anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigénio é capaz de inibir a deposição de C4 em soro completo a menos de 20% da deposição de C4 de controlo. 7. 0 anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigénio de acordo com a reivindicação 1, em que a parte C-terminal do MASP-2 compreende ou consiste nos domínios EGF, CUB2, CCP1, CCP2 e SP. 8. 0 anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que o referido anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigénio foi humanizado.
6. 9. Um método para selecionar um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigénio reconhecendo especificamente e ligando um epítopo dentro da parte C-terminal de MASP-2, compreendendo o método: (a) testando se (i) anticorpos isolados de um mamífero ao qual a parte C-terminal de MASP-2 ou um seu fragmento tinha sido administrado, ou (ii) anticorpos produzidos usando tecnologia recombinante determinada para se ligar à parte C-terminal De MASP-2 são capazes de inibir a deposição de C4; e (b) selecionar anticorpos capazes de inibir a deposição de C4 em soro completo.
7. 10. O método de acordo com a reivindicação 9, em que a referida parte C-terminal de MASP-2 compreende ou consiste nos domínios EGF, CUB2, CCP1, CCP2 e serina protéase.
8. 11. O método de acordo com a reivindicação 9, em que o método compreende adicionalmente o isolamento de células produtoras de anticorpo do referido mamífero, preparando células de hibridoma a partir das referidas células produtoras de anticorpo, cultivando os referidos hibridomas e isolando os anticorpos produzidos pelos referidos hibridomas. 12. 0 método da reivindicação 9, compreendendo ainda o passo de determinar se os referidos anticorpos selecionados reconhecem o mesmo ou um epitopo sobreposto como um ou mais anticorpos de referência num ensaio envolvendo os passos de: • fornecer MASP-2 ou um seu fragmento compreendendo o epitopo reconhecido pelo anticorpo de referência; • adição do anticorpo selecionado e do anticorpo de referência ao referido MASP-2, em que o anticorpo selecionado e/ou o anticorpo de referência é rotulado com um rótulo detetável; • detetar a presença do rótulo detetável no MASP-2; • detetando assim se o anticorpo selecionado é capaz de deslocar o anticorpo de referência; em que o anticorpo selecionado reconhece o mesmo ou um epitopo sobreposto se o anticorpo de referência for deslocado, em que o anticorpo de referência é selecionado do grupo que consiste em: i. 0 anticorpo monoclonal produzido pela linha celular de hibridoma depositada sob o número de deposição 03050904; ii. O anticorpo monoclonal produzido pela linha celular de hibridoma depositada sob o número de deposição DSM ACC2657; iii. O anticorpo monoclonal produzido pela linha celular de hibridoma depositada sob o número de deposição DSM ACC2660; iv. O anticorpo monoclonal produzido pela linha celular de hibridoma depositada sob o número de deposição DSM ACC2658; e V. O anticorpo monoclonal produzido pela linha celular de hibridoma depositada sob o número de deposição DSM ACC 2659.
9. 13. O método de acordo com a reivindicação 12, em que o método compreende ainda a seleção de anticorpos capazes de deslocar pelo menos um dos referidos anticorpos de referência.
10. 14. Um anticorpo monoclonal ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, reconhecendo especificamente e ligando um epítopo dentro da parte C-terminal de MASP-2 e inibindo a deposição de C4, em que o referido anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigénio é uma molécula de anticorpo humanizada possuindo um local de ligação ao antigénio derivado de uma imunoglobulina produzida por uma linha celular de hibridoma selecionada do grupo que consiste em: i a linha celular de hibridoma depositada sob o número de deposição DSM ACC2657; ii. a linha celular de hibridoma depositada sob o número de deposição DSM ACC2660; iii. a linha celular de hibridoma depositada sob o número de deposição DSM ACC2658; e iv. A linha celular de hibridoma depositada sob o número de depósito DSM ACC 2659.
11. 15. Uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigénio de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8 ou 14.
12. 16. Um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigénio de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 ou 14 para utilização no tratamento de uma condição clinica selecionada do grupo constituído por uma lesão de isquemia/reperfusão, uma doença inflamatória crónica, EE uma condição inflamatória autoimune.