EA040300B1 - Анти-pacap антитело - Google Patents

Description

Данное изобретение относится к области медицины. В частности, данное изобретение относится к антителам к активирующему аденилатциклазу гипофиза пептиду (РАСАР - pituitary adenylate cyclaseactivating peptide), композициям, содержащим такие анти-РАСАР антитела, и способам применения таких антител для лечения боли, включая первичные головные боли (включая тригименальные вегетативные цефалгии), вторичные головные боли и мигрени (включая хроническую мигрень).

Пептид, активирующий аденилатциклазу гипофиза (РАСАР), представляет собой нейропептид, распространенный по всей нервной системе, включая тригеминальноваскулярную систему, полулунный узел, спинной мозг, гипоталамус и гипофиз. РАСАР существует по меньшей мере в двух αамидированных активных формах: РАСАР38 (SEQ ID NO: 13), которая содержит 38 аминокислот и является более распространенной активной формой, обычно составляющей до 90% РАСАР в ткани млекопитающего; и РАСАР27 (SEQ ID NO: 14), которая содержит те же 27 N-концевых аминокислот, что и РАСАР38. Считается, что РАСАР играет роль в нейропротекции, нейромодуляции, нейрогенном воспалении и ноцицепции, а также в вызове боли, включая головные боли и мигрени.

По оценкам, головные боли и мигрени поражают 37 млн пациентов в год, при этом более двух третей не получают лечения. Первичная головная боль(боли) классифицируется как головная боль, не являющаяся результатом другого, или отдельного, заболевания или нарушения, в то время как вторичная головная боль(боли) классифицируется как головная боль, возникающая в результате другой или отдельной обуславливающей причины (например, травмы, заболевания или другого нарушения). Автономные тригименальные цефалгии (АТЦ) классифицируются как первичные головные боли, которые включают в себя эпизодическую и хроническую кластерную головную боль, пароксизмальную гемикранию, продолжительную гемикранию и приступы односторонней невралгической головной боли. Мигрень(ни) относится к мигрени без ранних симптомов (ранее называемой обычной мигренью) и с ранними симптомами (ранее называемой классической мигренью). Хроническая мигрень(ни) классифицируется как 15 или больше дней головной боли в месяц, по меньшей мере восемь из которых являются мигренями. Когда частота мигрени составляет два или больше эпизода в месяц, или когда мигрень значительно мешает повседневной жизни пациента и/или купирующие лекарства являются неэффективными, врачам рекомендуется рассмотреть варианты профилактического лечения. Однако варианты лечения для профилактики мигрени на текущий момент часто бывают неэффективными, и современные варианты профилактического и купирующего лечения (например, гипотензивные средства, противосудорожные препараты, антидепрессанты) имеют низкую эффективность и связанные с побочными эффектами, лишающими дееспособности.

Структура РАСАР хорошо известна в данной области техники (см., например, Miyata, A. et al., Biochem Biophys Res Commun 170: 643-648 (1990)), как и анти-РАСАР антител. Например, в патенте США № 5486472 А, публикации международной заявки на патент № WO 2012/106407 A3 и публикации заявки на патент США № 2016-304604 раскрыты различные анти-РАСАР антитела и их потенциальное использование. Однако на текущий момент ни одно антитело, нацеленное на РАСАР, не было одобрено для терапевтического применения. Таким образом, остается потребность в альтернативных анти-РАСАР антителах. В частности, по-прежнему существует потребность в альтернативных анти-РАСАР антителах, которые нейтрализуют РАСАР с высокой эффективностью, обеспечивают пролонгированное действие и способны лечить боль, включая первичные и вторичные головные боли и мигрени, включая хроническую мигрень. Как и при любом терапевтическом лечении, безопасность и токсичность остаются ограничением, и альтернативные анти-РАСАР антитела не должны сопровождаться неприемлемой иммуногенностью. Таким образом, остается потребность в альтернативных анти-РАСАР антителах, которые демонстрируют сниженный риск иммуногенности у людей. Такие анти-РАСАР антитела предпочтительно также будут обладать хорошими физико-химическими свойствами для облегчения разработки, изготовления и приготовления.

Данное изобретение относится к антителу, которое связывается с РАСАР человека и которое содержит вариабельную область тяжелой цепи (HCVR) и вариабельную область легкой цепи (LCVR), причем HCVR содержит определяющие комплементарность области (CDR) HCDR1, HCDR2 и HCDR3, и LCVR содержит CDR LCDR1, LCDR2 и LCDR3, при этом аминокислотная последовательность HCDR1 представляет собой SEQ ID NO: 3, аминокислотная последовательность HCDR2 представляет собой SEQ ID NO: 4, аминокислотная последовательность HCDR3 представляет собой SEQ ID NO: 5, аминокислотная последовательность LCDR1 представляет собой SEQ ID NO: 6, аминокислотная последовательность LCDR2 представляет собой SEQ ID NO: 7, и аминокислотная последовательность LCDR3 представляет собой SEQ ID NO: 8. В конкретном варианте осуществления HCDR2 содержит аспарагиновую кислоту в положении остатка 13, HCDR3 содержит аспарагин в положении остатка 8, LCDR1 содержит серин в положении остатка 7, и LCDR2 содержит лейцин в положении остатка 7. В другом конкретном варианте осуществления HCDR2 содержит аланин в положении остатка 13, HCDR3 содержит треонин в положении остатка 8, LCDR1 содержит триптофан в положении остатка 7, и LCDR2 содержит фенилаланин в положении остатка 7. В дополнительном конкретном варианте осуществления HCDR2 содержит глутаминовую кислоту в положении остатка 13, HCDR3 содержит треонин в положении остатка 8, LCDR1 содержит триптофан в положении остатка 7, и LCDR2 содержит фенилаланин в положении остатка 7. В

- 1 040300 еще дополнительном конкретном варианте осуществления HCDR2 содержит глутамин в положении остатка 13, HCDR3 содержит треонин в положении остатка 8, LCDR1 содержит триптофан в положении остатка 7, и LCDR2 содержит фенилаланин в положении остатка 7.

Согласно вариантам осуществления данного изобретения предложено антитело, которое связывает РАСАР человека, содержащее HCVR и LCVR, при этом аминокислотная последовательность HCVR представляет собой SEQ ID NO: 9, а аминокислотная последовательность LCVR представляет собой SEQ ID NO: 10. В конкретных вариантах осуществления HCVR содержит аспарагиновую кислоту в положении остатка 62 и аспарагин в положении остатка 104, и LCVR содержит серин в положении остатка 30 и лейцин в положении остатка 55. В других конкретных вариантах осуществления HCVR содержит аланин в положении остатка 62 и треонин в положении остатка 104, и LCVR содержит триптофан в положении остатка 30 и фенилаланин в положении остатка 55. В некоторых вариантах осуществления HCVR содержит глутаминовую кислоту в положении остатка 62 и треонин в положении остатка 104, и LCVR содержит триптофан в положении остатка 30 и фенилаланин в положении остатка 55. В некоторых вариантах осуществления HCVR содержит глутамин в положении остатка 62 и треонин в положении остатка 104, и LCVR содержит триптофан в положении остатка 30 и фенилаланин в положении остатка 55.

В дополнительных вариантах осуществления согласно данному изобретению предложено антитело, которое связывается с РАСАР человека, содержащее тяжелую цепь (НС) и легкую цепь (LC), причем аминокислотная последовательность НС представляет собой SEQ ID NO: 1, и аминокислотная последовательность LC представляет собой SEQ ID NO: 2. В конкретных вариантах осуществления НС содержит аспарагиновую кислоту в положении остатка 62, аспарагин в положении остатка 104, пролин в положении остатка 231, аланин в положении остатка 237 и аланин в положении остатка 238, и LC содержит серин в положении остатка 30 и лейцин в положении остатка 55. В других конкретных вариантах осуществления НС содержит аланин в положении остатка 62, треонин в положении остатка 104, пролин в положении остатка 231, аланин в положении остатка 237 и аланин в положении остатка 238, и LC содержит триптофан в положении остатка 30 и фенилаланин в положении остатка 55. В других конкретных вариантах осуществления НС содержит глутаминовую кислоту в положении остатка 62, треонин в положении остатка 104, пролин в положении остатка 231, аланин в положении остатка 237 и аланин в положении остатка 238, и LC содержит триптофан в положении остатка 30 и фенилаланин в положении остатка 55. В некоторых конкретных вариантах осуществления НС содержит глутамин в положении остатка 62, треонин в положении остатка 104, пролин в положении остатка 231, аланин в положении остатка 237 и аланин в положении остатка 238, и LC содержит триптофан в положении остатка 30 и фенилаланин в положении остатка 55.

Данное изобретение дополнительно относится к фармацевтическим композициям, содержащим антитело согласно данному изобретению, и один или большее количество фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или наполнителей. Дополнительно согласно данному изобретению предложен способ лечения боли, такой как головные боли, включая первичную и вторичную головную боль, включающий в себя введение пациенту, нуждающемуся в этом, фармацевтической композиции согласно данному изобретению. В еще дополнительном варианте осуществления первичной головной болью является АТЦ. В еще дополнительном варианте осуществления согласно данному изобретению предложен способ лечения мигреней, включающий в себя введение пациенту, нуждающемуся в этом, фармацевтической композиции согласно данному изобретению. В некоторых таких вариантах осуществления мигрень представляет собой хроническую мигрень. Дополнительно согласно данному изобретению предложен способ лечения боли, связанной с дегрануляцией тучных клеток, включающий в себя введение пациенту, нуждающемуся в этом, антитела или фармацевтической композиции согласно данному изобретению. Согласно некоторым таким вариантам осуществления боль, связанная с дегрануляцией тучных клеток, представляет собой одну из первичных или вторичных головных болей и мигрень.

Кроме того, согласно данному изобретению предложен способ лечения боли, такой как первичная головная боль, вторичная головная боль и/или мигрень, включающий в себя введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антитела согласно данному изобретению. Согласно некоторым вариантам осуществления первичная головная боль представляет собой АТЦ. Согласно некоторым вариантам осуществления мигрень представляет собой хроническую мигрень.

Данное изобретение также относиться к антителу согласно данному изобретению для применения в терапии. Более конкретно, данное изобретение относится к антителу согласно данному изобретению для применения в лечении боли. В конкретных вариантах осуществления данное изобретение относиться к антителу согласно данному изобретению для применения в лечении первичной головной боли, вторичной головной боли и/или мигрени.

Дополнительно данное изобретение относится к применению антитела согласно данному изобретению в изготовлении лекарственного средства для лечения боли, такой как первичная головная боль, вторичная головная боль и/или мигрень. В еще более конкретных вариантах осуществления первичная головная боль представляет собой АТЦ. В некоторых конкретных вариантах осуществления мигрень представляет собой хроническую мигрень.

Данное изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты и векторам экспрессии,

- 2 040300 кодирующим антитела согласно данному изобретению. В одном варианте осуществления согласно данному изобретению предложена молекула ДНК, содержащая полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, причем остаток 62 представляет собой аспарагиновую кислоту, остаток 104 представляет собой аспарагин, остаток 231 представляет собой пролин, остаток 237 представляет собой аланин, и остаток 238 представляет собой аланин. В некоторых вариантах осуществления остаток 62 представляет собой аланин, остаток 104 представляет собой треонин, остаток 231 представляет собой пролин, остаток 237 представляет собой аланин, и остаток 238 представляет собой аланин. В некоторых вариантах осуществления остаток 62 представляет собой глутаминовую кислоту, остаток 104 представляет собой треонин, остаток 231 представляет собой пролин, остаток 237 представляет собой аланин, и остаток 238 представляет собой аланин. В дополнительных вариантах осуществления остаток 62 представляет собой глутамин, остаток 104 представляет собой треонин, остаток 231 представляет собой пролин, остаток 237 представляет собой аланин, и остаток 238 представляет собой аланин.

Согласно вариантам осуществления данного изобретения также предложена молекула ДНК, содержащая полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, при этом остаток 30 представляет собой серин, а остаток 55 представляет собой лейцин. В некоторых вариантах осуществления остаток 30 представляет собой триптофан, а остаток 55 представляет собой фенилаланин.

В некоторых вариантах осуществления молекула ДНК данной молекулы содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, причем остаток 62 представляет собой аспарагиновую кислоту, остаток 104 представляет собой аспарагин, остаток 231 представляет собой пролин, остаток 237 представляет собой аланин, и остаток 238 представляет собой аланин, и содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, при этом остаток 30 представляет собой серин, и остаток 55 представляет собой лейцин. В конкретном варианте осуществления молекула ДНК данной молекулы содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, причем остаток 62 представляет собой аланин, остаток 104 представляет собой треонин, остаток 231 представляет собой пролин, остаток 237 представляет собой аланин, и остаток 238 представляет собой аланин, и содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, при этом остаток 30 представляет собой триптофан, а остаток 55 представляет собой фенилаланин. В конкретном варианте осуществления молекула ДНК данной молекулы содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, причем остаток 62 представляет собой глутаминовую кислоту, остаток 104 представляет собой треонин, остаток 231 представляет собой пролин, остаток 237 представляет собой аланин, и остаток 238 представляет собой аланин, и содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, при этом остаток 30 представляет собой триптофан, а остаток 55 представляет собой фенилаланин. В другом конкретном варианте осуществления молекула ДНК данной молекулы содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, причем остаток 62 представляет собой глутамин, остаток 104 представляет собой треонин, остаток 231 представляет собой пролин, остаток 237 представляет собой аланин, и остаток 238 представляет собой аланин, и содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, при этом остаток 30 представляет собой триптофан, а остаток 55 представляет собой фенилаланин. Кроме того, согласно данному изобретению предложено антитело, полученное в соответствии со способом, при этом спсоб включает в себя культивирование клеткихозяина, содержащей полинуклеотидную последовательность согласно данному изобретению, в условиях, при которых антитело экспрессируется, и выделение из указанной клетки-хозяина антитела согласно данному изобретению.

Как применяется в данном документе, антитело представляет собой молекулу иммуноглобулина, содержащую 2 НС и 2 LC, связанные дисульфидными связями. Аминоконцевая часть каждой LC и НС содержит вариабельную область из примерно 100-120 аминокислот, в первую очередь, отвечающую за распознавание антигена содержащимися в ней CDR. CDR перемежаются с областями, которые являются более консервативными, называемыми каркасными областями (FR). Каждая LCVR и HCVR состоит из 3 CDR и 4 FR, расположенных от аминоконца до карбоксиконца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 3 CDR LC обозначаются как LCDR1, LCDR2 и LCDR3, а 3 CDR НС обозначаются как HCDR1, HCDR2 и HCDR3. CDR содержат большинство остатков, которые формируют специфические связи с антигеном. На функциональную способность антитела связывать определенный антиген в значительной степени влияют шесть CDR. Отнесение аминокислот к доменам CDR в областях LCVR и HCVR антител согласно данному изобретению основано на хорошо известном соглашении по нумерации Кабата (Kabat, et al., Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93 (1971); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91- 3 040300

3242 (1991)), и соглашении по нумерации Нофа (North et al., A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations, Journal of Molecular Biology, 406:228-256 (2011)).

LC классифицируются как каппа или лямбда, каждая из которых характеризуется определенной константной областью, известной в данной области техники. Антитела согласно данному изобретению включают в себя каппа LC. НС классифицируют на гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон и определяют изотип антитела как IgG, IgM, IgA, IgD или IgE соответственно. Антитела согласно данному изобретению содержат НС IgG. Антитела IgG могут быть дополнительно разделены на подклассы, например IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. В конкретном варианте осуществления антитела согласно данному изобретению представляют собой IgG4. Карбоксиконцевая часть каждой НС определяет константную область, в первую очередь ответственную за эффекторную функцию. В конкретном варианте осуществления антитела согласно данному изобретению имеют одну или большее количество модификаций в константной области каждой НС, которые снижают эффекторную функцию. В более конкретном варианте осуществления антитела согласно данному изобретению представляют собой IgG4 и имеют модификации в константной области обеих НС, которые снижают эффекторную функцию, включая аминокислоту аланин в обоих остатках 237 и 238 (нумерация остатков является линейной и основана на иллюстративной НС SEQ ID NO: 1). В еще более конкретном варианте осуществления антитела согласно данному изобретению представляют собой IgG4 и имеют модификации в константной области обеих НС, которые снижают эффекторную функцию, включая аминокислоту аланин по обоим остаткам 237 и 238, и имеют дополнительные модификации в константной области обеих НС, способствующие стабильности, включая аминокислоту пролин в положении остатка 231 (нумерация остатков является линейной и основана на иллюстративной НС SEQ ID NO: 1).

Антитела согласно данному изобретению представляют собой моноклональные антитела (мАт). мАт могут быть получены, например, с помощью гибридомных технологий, рекомбинантных технологий, технологий фагового дисплея, синтетических технологий, например CDR-вставки, или комбинаций таких или других технологий, известных в данной области техники. Как указано в данном документе, мАт представляют собой антитела, полученные из единственной копии или клона, включая, например, любой эукариотический, прокариотический или фаговый клон, а не способ, с помощью которого их получают.

Способы получения и очистки антител хорошо известны в данной области техники. Например, можно подвергнуть скринингу библиотеку фагов, тем самым тысячи Fab-фрагментов подвергают скринингу на взаимодействие с рекомбинантным РАСАР человека. Полученные в результате взаимодействующие молекулы могут быть выделены, очищены, и аминокислотные последовательности могут быть определены с использованием общепринятых способов, хорошо известных в данной области техники, с помощью которых могут быть сконструированы исходные антитела. Антитела согласно данному изобретению сконструированы так, что они содержат одну или большее количество каркасных областей человека. Каркасные последовательности зародышевой линии человека можно получить в ImMunoGeneTics (INGT) через их веб-сайт, http://imgt.cines.fr или из The Immunoglobulin FactsBook by Marie-Paule Lefranc and Gerard Lefranc, Academic Press, 2001, ISBN 012441351. Согласно конкретным вариантам осуществления каркасные области НС и LC зародышевой линии для применения в антителах согласно данному изобретению включают в себя 3-23 и 018 соответственно.

В конкретных вариантах осуществления данного изобретения антитело или нуклеиновая кислота, кодирующая его, предоставляется в выделенной форме. Как применяется в данном документе, термин выделенный относится к белку, пептиду или нуклеиновой кислоте, который(ая) свободен(на) или практически свободен(на) от других макромолекулярных частиц, обнаруженных в клеточной среде.

Антитела согласно данному изобретению могут быть получены и очищены с использованием известных способов. Например, последовательности кДНК, кодирующие НС (например, аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1) и LC (например, аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 2), могут быть клонированы и введены в GS (глютаминсинтетаза) вектор экспрессии. Затем сконструированный вектор экспрессии иммуноглобулина может быть стабильно трансфицирован в клетки СНО. Специалист в данной области техники поймет, что экспрессия антител в млекопитающих приведет к гликозилированию, обычно на высококонсервативных сайтах Nгликозилирования в области Fc. Стабильные клоны могут быть проверены на экспрессию антитела, специфически связывающегося с РАСАР человека. Положительные клоны могут быть размножены в бессывороточной культуральной среде для продукции антител в биореакторах. Среда, в которую было секретировано антитело, может быть очищена обычными способами. Например, среда может быть удобно нанесена на FF колонку с белком А или G с сефарозой, которая была уравновешена совместимым буфером, таким как забуференный фосфатом физиологический раствор. Колонку промывают для удаления неспецифических связующих компонентов. Связанное антитело элюируют, например, градиентом рН, и фракции антитела обнаруживают, например, с помощью ДСН-ПААГ электрофореза и затем объединяют. Антитело может быть сконцентрировано и/или стерильно отфильтровано с использованием обычных методик. Растворимый агрегат и мультимеры могут быть эффективно удалены обычными методами, включая эксклюзионную, гидрофобного взаимодействия, ионного обмена или гидроксиапатитную хро- 4 040300 матографию. Продукт может быть немедленно заморожен, например, при -70°С, или может быть лиофилизирован.

Антитела согласно данному изобретению могут быть использованы в лечении пациентов. Более конкретно, ожидается, что антитела согласно данному изобретению будут лечить класс боли, который конкретно включает головную боль как первичную, так и вторичную, и мигрень, включая хроническую мигрень. Хотя ожидается, что антитела согласно данному изобретению будут полезны в лечении боли, включая первичную и вторичную головную боль и мигрень, такие антитела также могут быть полезны в лечении другой боли. Как используется в данном документе взаимозаменяемо, лечение, и/или процесс лечения, и/или лечить предназначены для обозначения всех процессов, в которых может происходить замедление, прерывание, купирование, контроль, остановка или изменение прогрессирования нарушения, описанного в данном документе, но не обязательно указывает на полное устранение всех симптомов нарушения. Лечение включает в себя введение антитела согласно данному изобретению для лечения заболевания или патологии у человека, который бы получил пользу от снижения активности РАСАР, и включает в себя (а) ингибирование дополнительного прогрессирования заболевания, т.е. прекращение его развития; (б) облегчение заболевания, т.е. вызов регрессии заболевания или патологии, или ослабления его симптомов или осложнений; и (в) предотвращение появления симптомов заболевания.

Как используется в данном документе взаимозаменяемо, термин пациент, субъект и индивид относится к человеку. В некоторых вариантах осуществления пациент дополнительно характеризуется заболеванием, нарушением или патологией (например, болью, например первичной или вторичной головной болью и/или мигренью, включая хроническую мигрень), который получает пользу от снижения активности РАСАР. В другом варианте осуществления пациент дополнительно характеризуется как подверженный риску развития патологии, описанной выше, или патологии, которая бы улучшилась из-за уменьшения активности РАСАР.

Как применяется в данном документе, термин связывается (или связывается с) относится к взаимодействию антитела с эпитопом РАСАР человека. Термин эпитоп, как применяется в данном документе, относится к дискретным трехмерным сайтам антигена, которые распознаются антителами согласно данному изобретению.

Антитело согласно данному изобретению может быть включено в фармацевтическую композицию, которая может быть приготовлена способами, хорошо известными в данной области техники, и содержит антитело согласно данному изобретению и один или большее количество фармацевтически приемлемых носителей и/или разбавителей) (например, Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 22^nd Edition, Loyd V., Ed., Pharmaceutical Press, 2012, в котором представлен сборник методов приготовления, общеизвестных практикующим специалистам). Подходящие носители для фармацевтических композиций включают в себя любой материал, который в сочетании с антителом согласно данному изобретению сохраняет активность молекулы и не вступает в реакцию с иммунной системой пациента.

Фармацевтическая композиция, содержащая антитело согласно данному изобретению, может быть введена пациенту с риском, или проявлением, заболеваний или нарушений, как описано в данном документе, парентеральными путями (например, подкожным, внутривенным, внутрибрюшинным, внутримышечным или трансдермальным). Фармацевтическая композиция согласно данному изобретению содержит эффективное или терапевтически эффективное количество, которые используются в данном документе взаимозаменяемо, антитела согласно данному изобретению. Эффективное количество относится к количеству, необходимому (в дозах и в течение периодов времени и с целями введения) для достижения желаемого терапевтического результата. Эффективное количество антитела может изменяться в зависимости от таких факторов, как состояние болезни, возраст, пол и масса индивида, и способности антитела вызывать желаемый ответ у индивида. Эффективным количеством является также количество, при котором любые токсические или вредные эффекты антитела согласно данному изобретению перевешиваются терапевтически полезными эффектами.

Примеры

Пример 1. Конструирование и экспрессия иллюстративных анти-РАСАР антител.

Сталкивались с существенными проблемами, связанными с химической и физической стабильностью, при конструировании анти-РАСАР антитела согласно данному изобретению. Например, проблемы, испытанные с исходными гуманизированными конструкциями, включают в себя низкую аффинность связывания, неприемлемую иммуногенность, деамидирование вариабельной области, окисление, изомеризацию и низкую активность.

Поэтому были разработаны химические и физические модификации для улучшения аффинности связывания, устранения или уменьшения димеризации НС, снижения иммуногенности и улучшения химической и физической стабильности антител согласно данному изобретению. Аминокислотные модификации были сконструированы как для тяжелых, так и для легких цепей. Также были проведены обширные исследования стабильности белка, и сконструированные антитела были подвергнуты скринингу на свойства экспрессии и термостабильности, а также другие свойства, включая аффинность связывания. Следующие антитела, которые содержат многочисленные модификации исходных конструкций, идентифицированы как обладающие высокой аффинностью связывания, химически и физически стабильные,

- 5 040300 обладающие низкой иммуногенностью и обладающие фармакокинетическими свойствами, совместимыми с ежемесячным введением. Ни одна из модификаций, содержащихся в антителах согласно данному изобретению, не была идентифицирована в исходно гуманизированных конструкциях.

Иллюстративные анти-РАСАР антитела согласно данному изобретению представлены в табл. 1. Иллюстративные антитела содержат тяжелые цепи SEQ ID NO: 1 и легкие цепи SEQ ID NO: 2, а также каркасные области 3-23 НС человека и LC каппа человека с каркасом O18. Кроме того, сконструированные модификации как в легкой, так и в тяжелой цепях, которые улучшают химическую и физическую стабильность, а также функциональные свойства антител, представлены в табл. 1. Взаимосвязь различных областей приведенных иллюстративных анти-РАСАР антител выглядит следующим образом (для нумерации аминокислот применяется линейная нумерация; присвоение аминокислот вариабельным доменам основано на Международной информационной системе иммуногенетики®, доступной по адресу www.imgt.org; присвоение аминокислот доменам CDR основано на хорошо известном соглашении о нумерации Нофа (North), за исключением HCDR2, которое основано на хорошо известном соглашении о нумерации Кабата):

Таблица 1

Аминокислотные области иллюстративных анти-РАСАР антител согласно данному изобретению

SEQ ID NO:1	SEQ ID NO:2
HCVR	Область	Позиции	LCVR	Область	Позиции
FRH1	1-22	FRL1	1-23
HCDR1	23-35	LCDR1	24-34
FRH2	36-49	FRL2	35-48
HCDR2	50-66	LCDR2	49-56
FRH3	67-96	FRL3	57-88
HCDR3	97-112	LCDR3	89-97
FRH4	113-123	FRL4	98-107
Константная	СН	124-449	Константная	CL	108-214
Иллюстративное Ат А	62D; 104N;231P; 237А; 238А	Иллюстративное Ат А	30S;55L
Иллюстративное Ат В	62А; 104Т;231Р; 237А; 238А	Иллюстративное Ат В	30W; 55F
Иллюстративное Ат С	62Е; 104Т;231Р; 237А; 238А	Иллюстративное Ат С	30W; 55F
Иллюстративное Ат D	62Q; 104Т;231Р; 237А; 238А	Иллюстративное Ат D	30W; 55F

Следующие примеры и анализы демонстрируют, что антитела согласно данному изобретению полезны для лечения боли, включая первичную и вторичную головную боль и мигрень. Однако следует понимать, что следующие примеры изложены в качестве иллюстрации, а не ограничения, и что специалистом в данной области техники могут быть сделаны различные модификации.

Иллюстративные анти-РАСАР антитела согласно данному изобретению могут быть экспрессированы и очищены, по существу, следующим образом. Глутаминсинтетазный (GS) вектор экспрессии, содержащий последовательность ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность НС согласно табл. 1 (например, последовательность ДНК SEQ ID NO: 11, кодирующая НС иллюстративного антитела В, представленного в табл. 1), и ДНК последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность LC согласно табл. 1 (например, последовательность ДНК SEQ ID NO: 12, кодирующая LC иллюстративного антитела В, представленного в табл. 1), используется для трансфекции линии клеток яичника китайского хомячка (СНО) путем электропорации. Вектор экспрессии кодирует ранний промотор вируса обезьян (вирус обезьян 40Е) и ген GS. Экспрессия GS обеспечивает биохимический синтез глютамина, аминокислоты, необходимой клеткам СНО. После трансфекции клетки подвергают массовому отбору с помощью 50 мкМ L-метионинсульфоксимина (MSX). Ингибирование GS с помощью MSX используется для повышения строгости отбора. Клетки с вставкой кДНК вектора экспрессии в транскрипционно активные области генома клетки-хозяина могут быть отсеяны от клеток СНО дикого типа, которые экспрессируют эндогенный уровень GS. Трансфицированные пулы высевают с низкой плотностью, чтобы обеспечить почти клональный рост стабильно экспрессирующихся клеток. Главные лунки подвергают скринингу на экспрессию антител и затем увеличивают количество в бессывороточных суспензионных культурах, которые будут использоваться для производства. Очищенную среду, в которую было секретировано антитело, наносят на аффинную колонку с белком А, которая уравновешена совместимым буфером, таким как забуференный фосфатом физиологический раствор (рН 7,4). Колонку промывают 1М NaCl для удаления неспецифических связывающих компонентов. Связанное антитело элюируют, например, цитратом натрия при рН (примерно) 3,5, и фракции нейтрализуют 1М трис-буфером. Фракции антитела обнаруживают, например, с помощью ДСН-ПААГ электрофореза или аналитического исключения по размеру, а затем объединяют. Растворимый агрегат и мультимеры могут быть эффективно удалены

- 6 040300 обычными методами, включая эксклюзионную, гидрофобного взаимодействия, ионного обмена или гидроксиапатитную хроматографию. Иллюстративное анти-РАСАР антитело согласно данному изобретению концентрируют и/или стерильно фильтруют, используя обычные методики. Чистота иллюстративного антитела после этих стадий хроматографии составляет больше чем 95%. Иллюстративное антиРАСАР антитело согласно данному изобретению может быть немедленно заморожено при -70°С или храниться при 4°С в течение нескольких месяцев.

Пример 2. Аффинность связывания.

Аффинность связывания (Кд) для каждого комплекса антитело-антиген определяют с использованием анализа кинетического исключения в 96-луночных плашках (адаптировано из Estep et al., mAbs, 2013, 5:270-278). Вкратце, серии 3-кратных разведений для каждого иллюстративного Ат (указанных в табл. 1) готовят от начальной концентрации 7290 до 41 мкМ; каждая серия содержит пустой контроль антитела. Образцы готовят в 3% (мас./об.) растворе блокатора А (MSD, кат. № R93AA-1) и добавляют к каждому образцу фиксированную конечную концентрацию антигена 30 пМ биотинилированного по Nконцу РАСАР27 (заказной синтез, СРС Scientific) или биотинилированного по N-концу РАСАР38 (Anaspec, кат. № 23590). 100 мкл каждого образца антиген-антитело добавляют в отдельные лунки 96луночной плашки для микротитрования (Greiner, EK-20101) в двух повторностях. Плашку закрывают оптической клейкой пленкой (Thermo Fisher Scientific, кат. № 4311971) и инкубируют при 37°С в течение 3-4 дней, чтобы обеспечить уравновешивание образца (концентр.). За день до анализа, каждый ряд 96луночной стандартной плашки MSD (MSD, кат. № L15XA) покрывают 30 мкл соответствующего антитела (как используется в титровочной серии) в концентрации 3 мкг/мл в физиологическом растворе с фосфатным буфером (ФСБ). В день эксперимента стандартную плашку MSD промывают один раз 150 мкл ФСБ и блокируют 150 мкл 3% раствора блокатора А в течение 45 мин при 30°С при встряхивании 300 об/мин на настольном шейкере MaxQ 4450 (Thermo Fisher Scientific). После трех промывок ФСБ, 50 мкл каждого образца антиген-антитело (приготовленного и инкубированного, как описано выше) добавляют в стандартную плашку MSD и инкубируют в течение 150 с при 30°С со встряхиванием 300 об/мин. После однократной промывки ФСБ, добавляют 50 мкл 1 мкг/мл меченного SULFO-TAG стрептавидина (MSD, кат. № R32AD-5), приготовленного в 1% (мас./об.) растворе блокатора А, и стандартную плашку MSD и плашку инкубируют при 30°С в течение 3 мин при встряхивании 300 об/мин. Плашку еще три раза промывают ФСБ с последующим добавлением 150 мкл/лунка 1X буфера считывания (MSD, кат. № R92TC2). Стандартную плашку MSD считывают с использованием прибора MESO Quickplex SQ 120/1300 (Meso Scale Discovery). Анализ данных выполняют с использованием SigmaPlot (версия 12.5, программное обеспечение Systat) и аффинность связывания (Кд) определяют с использованием интегрированной модели четырехпараметрической логистической кривой SigmaPlot. Результаты представлены в табл. 2.

Таблица 2

Аффинность связывания (Кд) комплексов антитело-антиген при 37°С

	Аффинность связывания, Кд (пМ, 37 °C)
Антитело	Антиген (РАСАР38)	Антиген (РАСАР27)
Иллюстративное Ат А	не определено	37,0
Иллюстративное Ат В	12,8	11,6
Иллюстративное Ат С	14,6	14,5
Иллюстративное Ат D	9,0	10,5

Пример 3. Разрушение РАСАР in vivo.

Разрушение циркулирующего РАСАР38 in vivo оценивали на крысах. Одно из контрольное антитело IgG4 (10 мг/кг) или иллюстративное антитело А (10 мг/кг) вводили крысам внутривенно. Исходный уровень РАСАР38 в плазме оценивали для каждой крысы, а затем крысам внутривенно вводили 6 мкг/кг РАСАР38. После инъекции РАСАР38 образцы плазмы собирали в течение 120-минутного периода времени и определяли общие уровни РАСАР38 (связанного или несвязанного с антителом) с помощью модифицированного ИФА. Вкратце, 96-луночную MSD-плашку (MSD, кат. №: L15xA-1) покрывали 30 мкл/лунка 1 мкг/мл анти-РАСАР38 антитела (US Biological, кат. № Р1775-03С) в ФСБ, и инкубировали в течение ночи при 40°С. Плашку трижды промывали 200 мкл/лунка ФСБТ (ФСБ + Tween) с последующим блокированием 150 мкл/лунка 3% блокатором A (MSD, кат. № R93BA-2) в ФСБ при комнатной температуре в течение 1 ч с вращением 650 об/мин. После этого плашку трижды промывали 200 мкл/лунка ФСБТ. Калибровочный раствор РАСАР38 (Bachem, кат. № Н430-0500) разбавляли до 1000 пг/мл с помощью буфера для анализа, содержащего одну часть разбавителя 2 (MSD, кат. № R51-BB-3) и тридцать девять частей разбавителя 3 (MSD, кат. № R51BA-3) с добавлением 200 мкг/мл HBR1 (Scantibodies Inc, кат. № ЗКС533) и 10 мкг/мл биотин-иллюстративное антитело А. Стандартную калибровочную кривую получали трехкратным серийным разведением калибровочного раствора 1000 пг/мл с помощью буфера для анализа. Образцы плазмы разводил в 40 раз в разбавителе 3 с добавлением 200 мкг/мл

- 7 040300

HBR1 и 10 мкг/мл биотин-иллюстративное антитело А. 25 мкл различных концентраций образцов калибровочного раствора и разведенной плазмы добавляли в отдельные лунки плашки для анализа и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч с вращением 650 об/мин. После промывки плашки 3 раза 200 мкл/лунка ФСБТ, в каждую лунку добавляли 25 мкл 0,5 мкг/мл меченого сульфо-тэгом козьего античеловеческого IgG (MSD, кат. № R32AJ-1) в разбавителе 3, и плашку инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем плашки трижды промывали 200 мкл/лунка ФСБТ и 150 мкл 2Х буфера считывания Т (MSD, кат. № R92TC-3) добавляли в каждую лунку, сигнал считывали с помощью прибора считывания плашек MSD (результаты представлены как обнаруживаемые уровни РАСАР38, среднее ± СОС (n = 2-3)). Результаты представлены в табл. 3.

Таблица 3

Уровни РАСАР38 в плазме

	Уровни РАСАР38 в плазме (нг/мл) в контрольные моменты времени после инъекции РАСАР38 (среднее значение ± СОС (N))
Антитело	исходная точка	5 мин.	30 мин.	60 мин.	90 мин.	120 мин.
Иллюстративное Ат А	0,4 ± 0,0 (2)	200,0 ± 23,0 (3)	74,1 ±11,8 (3)	37,8 ±3,2 (3)	20,7 ± 2,9 (3)	11,7 ±2,5 (2)
Контрольное Ат IgG4	0,5 ±0,5 (3)	6,2 ± 2,5 (3)	2,3 ± 0,9 (3)	1,1 ±0,3 (3)	0,5 ± 0,2 (3)	0,3 ±0,1 (3)

Результаты, представленные в табл. 3, демонстрируют то, что иллюстративное антитело А предотвращает распространение РАСАР38 при внутривенной инъекции, но не предотвращает разрушение РАСАР38 in vivo.

Пример 4. Ингибирование РАСАР27, РАСАР38 или VIP-индуцированного цАМФ.

Нейтрализацию РАСАР27, РАСАР38 и VIP-индуцированную стимуляцию цАМФ антителами согласно данному изобретению оценивали в клетках СНО-Ki (АТСС, кат. № CCL-61), трансфицированных векторами, экспрессирующими либо РАС 1 человека (NP001186564.1), либо VPAC2 человека (NP_003373.2). Клетки СНО-Ki собирали с помощью неферментного буфера диссоциации клеток (Gibco, кат. № 313131-014), подсчитывали, центрифугировали и ресуспендировали в буфере для анализа до 10000 клеток/25 мкл. Концентрированные клетки (10000 в 25 мкл) добавляли в лунки 96-луночной плаш ки.

Иллюстративные антитела (указанные в табл. 1) серийно разводили в 100 мкл буфера для анализа (HBSS с кальцием и магнием (Hyclone, ThermoScientific, SH30268), 0,1% БСА (Sigma-Aldrich, кат. № А7888), 500 мкМ IBMX (Sigma-Aldrich) (I5879)), до 4-кратной желаемой конечной концентрации. Разведенные иллюстративные антитела инкубировали с агонистом (при 2-кратной конечной концентрации) в течение 15 мин при комнатной температуре. Конечные концентрации агониста: 100 пМ для РАСАР27 и РАСАР38 в анализах с РАС1 человека, 800 пМ РАСАР27 и РАСАР38 с VPAC2 человека, 800 пМ VIP с VPAC2 человека. После этого 25 мкл раствора иллюстративное антитело-агонист добавляли в отдельные лунки 96-луночной плашки (содержащей клетки) и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Образование цАМФ в каждой лунке определяли с использованием цАМФ фемто 2 (cAMP femto 2) (Cisbio, 62AM5PEC). 25 мкл рабочего раствора цАМФ-d2 (Cisbio, 62AM5PEC) добавляли в каждую лунку с последующим добавлением 25 мкл рабочего раствора анти-цАМФ-криптата и плашку инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте. Результирующий сигнал HTRF измеряли при 665 и 620 нм с использованием прибора Envision 12 (Perkin Elmer, возбуждение 330 нм) и отношение 665/620 наносили на график для количественного определения цАМФ (график по данным строили с использованием Graphpad Prism 7, а значения IC₅₀ определяли с использованием интегрированной процедуры подгонки четырехпараметрической модели логистической кривой). Результаты представлены в табл. 4 как среднее ± СОС.

- 8 040300

Таблица 4

Нейтрализация in vitro индуцированного РАСАР27 и РАСАР38 увеличения цАМФ

	Ингибирование (IC50) (пМ, среднее ± СОС (N))
Антитело	РАСАР38 (100 пМ) в hPACl	РАСАР27 (100 нм) в hPACl	PACAP38 (800 пМ) в hVPAC2	РАСАР27 (800 пМ) в hVPAC2	VIP (800 nM) в hVPAC2
Иллюстративное Ат А	554 ± 264 (N=2)	2250 (N=l)	714± 194 (N=6)	781 ±340 (N=2)	>100,000 (N=l)
Иллюстративное Ат В	265 ± 62 (N=3)	270± 103 (N=2)	294 ± 60 (N=3)	605± 135 (N=2)	>100,000 (N=l)
Иллюстративное Ат С	303 ± 15 (N=3)	311 ±29 (N=2)	325 ± 99 (N=3)	595 ±219 (N=2)	>100,000 (N=l)
Иллюстративное Ат D	205 ±35 (N=3)	212 ±42 (N=2)	243 ±112 (N=3)	515± 127 (N=2)	>100,000 (N=l)

Пример 5. Анализ иммуногенности.

Оценка иммуногенности in silico выполняется с помощью программного обеспечения EpiMatrix для прогнозирования эпитопов Т-лимфоцитов (на веб-портале Интерактивного скрининга и Реинжиниринга белка (ISPRI) (Epivax, Inc.)), включая скорректированные по Tregitope показатели Epimatrix. Белковые последовательности вариабельной области легкой цепи (LCVR) и вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), связанные с каждым антителом, анализируют отдельно. Согласно Epivax, белковые последовательности с показателями Epimatrix, скорректированными по Tregitope, больше нуля, имеют более высокий общий иммуногенный потенциал. Оценка EpiMatrix кластеров иммуногенности также проводится для каждой LCVR и HCVR, чтобы идентифицировать кластеры эпитопов Т-лимфоцитов в пределах CDR каждого антитела. Наличие кластеров эпитопов Т-лимфоцитов, что определяется наличием 2 или большего количества смежных EpiBars, связано с более высоким общим иммуногенным потенциалом. Используя определение CDR Нофа, в иллюстративных антителах А, В или С не идентифицированы ассоциированные с CDR кластеры эпитопов Т-лимфоцитов. Эпитопный кластер Т-лимфоцита из 4 смежных EpiBars идентифицирован в CDR2 LCVR сравниваемого антитела ALD 1 .H (описано как Ab 1.H в публикации патента США № 2016/0304604), что указывает на то, что сравниваемое антитело имеет более высокий иммуногенный потенциал. Результаты представлены в табл. 5А, 5В и 5С.

Таблица 5А

Оценка риска иммуногенности in silico с помощью предсказания EpiMatrix эпитопа Т-лимфоцитов

	Балл Epimatrix
Антитело	HCVR	LCVR	HCVR+LCVR
Иллюстративное Ат A	58,84	19,44	40,61
Иллюстративное Ат В	65,12	26,41	47,21
Иллюстративное Ат С	58,74	26,41	43,79
Иллюстративное Ат D	65,49	26,41	47,41
ALD 1.Н	70,11	35,2	53,16

- 9 040300

Таблица 5В

Скорректированная по Tregitope оценка Epimatrix

	Скорректированная по Tregitope Оценка Epimatrix
Антитело	HCVR	LCVR	HCVR+LCVR
Иллюстративное Ат А	-32,82	-34,22	-33,46
Иллюстративное Ат В	-26,54	-27,24	-26,86
Иллюстративное Ат С	-32,92	-27,24	-30,29
Иллюстративное Ат D	-26,17	-27,24	-26,67
ALD 1.Н	-28,41	1,41	-13,93

Таблица 5С

Оценка риска иммуногенности in silico с помощью оценивания EpiMatrix кластеров иммуногенности

Антитело	Связанные с CDR кластеры Epibar
Иллюстративное Ат А	0
Иллюстративное Ат В	0
Иллюстративное Ат С	0
Иллюстративное Ат D	0
ALD 1.Н	1

Пример 6. Нейтрализация дегрануляции тучных клеток, вызванной высвобождением РАСАР.

Тучные клетки человека дифференцируют в культуре из стволовых клеток пуповинной крови человека с использованием StemSpan Media (StemCell) и ФСК(фактор стволовых клеток)/ИЛ-6. В день анализа тучные клетки высевают в количестве 100000 клеток/50 мкл/лунка в 96-луночную плашку для культивирования ткани в буфере Тайрода (130 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1,4 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, 5,6 мМ глюкозы, 10 мМ HEPES и 0,1% БСА, рН 7,4). Клетки обрабатывают РАСАР38 или РАСАР27 в присутствии или в отсутствие иллюстративного антитела, как описано ниже.

Определения по одному параметру выполняют путем добавления 25 мкл 4Х-концентрированного иллюстративного антитела/лунка (конечная концентрация 153 мкМ иллюстративного антитела). Анализы зависимости от дозы проводят путем добавления 25 мкл 4Х-концентрированного антитела/лунка для конечного диапазона доз от 0 до 153 мкМ (трехкратные разведения). 25 мкл 4Х-концентрированного РАСАР38 или РАСАР27 добавляют в каждую лунку до конечной концентрации 1 мкМ РАСАР (38 или 27). Только среда для анализа используется в качестве контроля без обработки, а мАт IgG4 используется в качестве отрицательного контроля. Анализ проводится три раза. 96-луночные плашки помещают в инкубатор (37°С) на 30 мин. После инкубации собирают 30 мкл/лунка супернатанта и измеряют активность триптазы с помощью коммерческого анализа (Millipore). Процент (%) высвобождения триптазы в супернатанте рассчитывают по следующему уравнению:

((экспериментальное высвобождение триптазы - высвобождение триптазы контрольного переносчика)/ (общее высвобождение триптазы - высвобождение триптазы контрольного переносчика) х 100, где общее высвобождение триптазы получают путем замораживания/оттаивания тучных клеток). Результаты представлены в табл. 6А, 6В и 6С.

- 10 040300

Таблица 6А

Ингибирование для одного параметра индуцированного РАСАР (27 и 38) высвобождения триптазы в тучных клетках человека

Процент высвобождения триптазы при добавлении

РАСАР38 или 27 (%)

Антитело	РАСАР38	РАСАР27
Иллюстративное Ат В	4,9 ± 1,1	21 ± 1,4
Иллюстративное Ат С	5,5 ± 1,4	14,2 ± 1,1
Иллюстративное Ат D	4,2 ± 0,7	15,1 ±4,0
Анализ только культур, среды	-0,3 ± 0,3	-0,3 ± 0,3
мАт IgG4	103,6 ±0,5	109,7 ±0,4

Таблица 6В

Зависимость ингибирования от дозы индуцированного РАСАР27 высвобождения триптазы в тучных клетках человека

Антитело	Доза (мкМ)	Процент высвобождения триптазы при добавлении РАСАР27 (%)
Иллюстративное Ат В	153	10,3 ± 0,9
51	19,4 ± 6,4
17	И,6 ±7,1
5,6	8,1 ±2,9
1,8	11,7 ± 1,6
0,6	54,0 ± 2,0
0,2	78,1 ± 1,0
0	85,2 ±3,4
Иллюстративное Ат С	153	9,7 ±2,3
51	17,8 ±2,3
17	8,0 ± 0,6
5,6	11,5 ±4,9
1,8	10,4 ±2,6
0,6	55,4 ±6,0
0,2	85,2 ± 1,6
0	85,8 ±4,8
Иллюстративное Ат D	153	9,4 ± 0,8
51	26,0 ± 6,3
17	19,8 ±3,4
5,6	16,4 ± 10,8
1,8	20,3 ± 8,4
0,6	73,0 ±2,1
0,2	86,5 ± 1,8
0	92,7 ± 1,5
Анализ только культур, среды		-0,2 ± 1,0
мАт IgG4	153	94,8 ± 4,8

- 11 040300

Таблица 6С

Зависимость ингибирования от дозы индуцированного РАСАР38 высвобождения триптазы в тучных клетках человека

Антитело	Доза (мкМ)	Процент высвобождения триптазы при добавлении РАСАР38 (%)
Иллюстративное Ат В	153	2,0 ±0,3
51	14,6 ±2,1
17	14,9 ±2,6
5,6	22,0 ±4,1
1,8	25,2 ± 1,4
0,6	52,4 ± 9,3
0,2	73,7 ± 1,3
0	77,2 ±1,0
Иллюстративное Ат С	153	2,8 ± 0,3
51	12,1 ±2,3
17	15,5 ±0,9
5,6	21,9 ±3,8
1,8	26,5 ± 4,3
0,6	66,6 ± 1,0
0,2	77,6 ± 0,3
0	80,3 ± 2,6
Иллюстративное Ат D	153	1,7 ±0,1
51	14,7 ± 1,5
17	19,6 ±3,6
5,6	25,9 ± 6,2
1,8	31,3 ±3,8
0,6	64,5 ±4,1
0,2	74,0 ± 1,8
0	76,5 ± 0,7
Анализ только культур, среды		-0,2 ± 1,0
мАт IgG4	153	79,6 ±4,1

Пример 7. In vivo PACAP-индуцированная нейтрализация цАМФ.

Нейтрализацию РАСАР-индуцированного повышения цАМФ в плазме in vivo оценивали на мышиной модели CD-I (Envigo). Вкратце, самцам мышей CD-I подкожно вводили 10 мг/кг одного из контрольного антитела IgG4 (N=6); контрольного антитела IgG4 плюс только ФСБ/ролипрам (N=5); иллюстративного антитела В (N=5); иллюстративного антитела С (N=5) или иллюстративного антитела D (N=6). Через три дня после обработки антителами мышам внутривенно вводили РАСАР38 (13 нмоль/кг) плюс ролипрам (100 мкг/мл); некоторым мышам, ранее обработанным контрольным антителом IgG4, внутривенно вводили только ФСБ (содержащий 0,2% этанол, 1% БСА, 5 мл/кг и ролипрам (100 мкг/мл)). Через 10 мин после обработки РАСАР38 кровь собирали в пробирки, содержащие ЭДТК, и плазму отделяли центрифугированием. Уровни цАМФ в плазме определяли с использованием коммерчески доступного цАМФ-ИФА (Cell Bios, Inc.) в соответствии с инструкциями производителя. В статистическом анализе применяют логарифм-трансформированную концентрацию цАМФ в однофакторном дисперсионном анализе (Graphpad Prism 7) с последующим вторичным анализом Даннетта. Результаты представлены в табл. 7 как среднее ± СО.

- 12 040300

Таблица 7

РАСАР-индуцированные уровни цАМФ в плазме

Антитело	Уровни цАМФ в плазме (нМ, среднее ± СОС)
Контрольное Ат IgG4 (плюс только ФСБ/ролипрам)	238 ± 60 (N=5) *
Контрольное Ат IgG4 (плюс РАСАР)	4095 ± 318 (N=6)
Иллюстративное Ат В (плюс РАСАР)	715±60(N=5) *
Иллюстративное Ат С (плюс РАСАР)	666 ± 96 (N=5) *
Иллюстративное Ат D (плюс РАСАР)	560 ± 130 (N=6) *

*р<0,0001 в сравнение с контрольным AT IgG4 (PACAP38).

Пример 8. Нейтрализация индуцированного стимуляцией полулунного узла пропотевания белка плазмы в твердой оболочке мозга in vivo.

Способность анти-РАСАР антител согласно данному изобретению блокировать in vivo пропотевание белков плазмы, индуцированное высвобождением РАСАР после стимуляции полулунного узла, исследовали на крысиной модели. Вкратце, крысам Спрейг-Доули (Envigo, самцы, 250-350 г) подкожно вводят одно из 1-10 мг/кг иллюстративного антитела А; 3-30 мг/кг иллюстративного антитела В или 3 или 10 мг/кг контрольного AT IgG4. 72 ч спустя крыс анестезируют нембуталом (65 мг/кг, внутрибрюшинно) и помещают в стереотаксическую рамку (David Kopf Instruments) с панелью резцов, установленной на -2,5 мм. Делают серединный сагитальный разрез черепа, после чего в черепе просверливают две пары двусторонних отверстий (3,2 мм сзади, 1,8 и 3,8 мм сбоку, все координаты относительно брегмы). Пары стимулирующих электродов из нержавеющей стали (Rhodes Medical Systems, Inc.) опускают через отверстия в обоих полушариях на глубину 9,2 мм от твердой мозговой оболочки. За две минуты до стимуляции полулунного узла в бедренную вену вводят меченный флуоресцеин-изотиоцианатом бычий сывороточный альбумин (FITC-БСА) (20 мг/кг, внутривенно) - маркера пропотевания белка. Левый полулунный узел стимулируют в течение 5 мин при силе тока 1,0 мА (5 Гц, длительность импульса 5 мс) с помощью устройства для стимуляции Model S48 Grass с блоком фотоэлектрической развязки PSIU6 (Grass-Telefactor). Через 5 мин после стимуляции крыс умерщвляют путем обескровливания с помощью 40 мл физиологического раствора.

После умерщвления крыс верхнюю часть черепа удаляют и собирают твердую оболочку. Образцы оболочки изымают из обоих полушарий, промывают водой и разравнивают на предметных стеклах. Предметные стекла сушат в течение 15 мин на нагревателе предметных стекол и ткани покрывают 70% раствором глицерина/воды. Флуоресцентный микроскоп (Zeiss), снабженный дифракционным монохроматором и спектрофотометром, используют для количественного определения красителя FITC-БСА в каждом образце твердой оболочки мозга. Пропотевание, вызванное электрической стимуляцией полулунного узла, является ипсилатеральным эффектом (т.е. происходит только на той стороне твердой оболочки мозга, на которой стимулируют полулунный узел), что позволяет нестимулированной половине твердой мозговой оболочки служить в качестве контроля. Рассчитывают соотношение пропотевания в твердой оболочке мозга с стимулированной стороны по отношению к нестимулированной. Результаты представлены в табл. 8 (среднее ± СО).

- 13 040300

Таблица 8

Пропотевание белка плазмы в твердой оболочке мозга, вызванное стимуляцией полулунного узла

Антитело (мг/кг)	Коэффициент пропотевания (среднее ± СОС)
Контрольное Ат IgG4 (10 мг/кг) (N=3)	1,87 ±0,04
Иллюстративное Ат А (1 мг/кг) (N=3)	1,93 ± 0,04
Иллюстративное Ат А (3 мг/кг) (N=3)	1,59 ±0,07
Иллюстративное Ат А (10 мг/кг) (N=3)	1,13 ±0,05
Контрольное Ат IgG4 (3 мг/кг) (N=3)	1,82 ±0,02
Контрольное Ат IgG4 (10 мг/кг) (N=3)	1,90 ±0,04
Контрольное Ат IgG4 (30 мг/кг) (N=3)	1,95 ±0,05
Иллюстративное Ат В (3 мг/кг) (N=3)	1,83 ±0,06
Иллюстративное Ат В (10 мг/кг) (N=3)	1,21 ±0,06
Иллюстративное Ат В (30 мг/кг) (N=3)	1,07 ±0,04

Пример 9. Фармакокинетика иллюстративных анти-РАСАР антител.

Определяли фармакокинетику в сыворотке иллюстративных антител согласно данному изобретению у самцов яванского макака (n=2) после однократного п-кож. введения с помощью анализа общего IgG. Животным подкожно вводили иллюстративное антитело В (10 мг/кг) и образцы сыворотки собирали через 1, 3, 6, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 240, 336, 504 и 672 ч после инъекции. Анализ общего IgG проводили в целом, как описано в данном документе. Вкратце, 100 мкл/лунка 1 мкг/мл козьего античеловеческий IgG F(ab')₂ антитела (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., кат. № 109-006-097) наносили на плашку Immulon 4HBX. Лунки инкубировали с одним из стандартов (стандартную кривую для иллюстративного антитела В получали из 15,63-1000 нг/мл), контрольными или сывороточными образцами и затем с 100 мкл/лунка разведенного 1:10000 мышиным анти-IgG человека Fc-пероксидазы хрена (HRP; SouthernBiotech, кат. № 9040-05) для обнаружения. Не связавшийся реагент для обнаружения смывали. После этого в лунки добавляли 100 мкл/лунка ТМВ Microwell Peroxidase Substrate System. Развитие цвета останавливали добавлением 100 мкл/лунка раствора ТМВ Stop и оптическую плотность измеряли при 450 нм с коррекцией длины волны, установленной на 630 нм. Иммунореактивность определяли по известным количествам иллюстративного антитела В в 100% сыворотке яванских макаков, с последующим минимальным необходимым разведением 1:10 в казеине Blocker™ в ФСБ с использованием 5параметрического алгоритма (StatLia; версия 3.2). Следуя процедурам, по существу, как описано выше, наблюдаемый клиренс (CL/F) 0,49 мл/ч/кг, наблюдаемый объем распределения (V/F) 114,0 мл/кг и конечный период полужизни, составляющий 171 ч, рассчитанный с помощью некомпартментного анализа, рассчитывали для иллюстративного антитела В. Полученные фармакокинетические результаты согласуются с терапевтическими антителами, способными к увеличенной продолжительности действия.

Последовательности

Иллюстративная НС (SEQ ID NO: 1)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYYMSWVRQAPGKGLEWVSAISLS GGSTYYAXSHKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVREVGASXHNY YGMDVWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVT VS WNS GALTS GVHTFPAVLQ S SGLYSLS SWT VP S S SLGTKT YTCNVDHKP SNTK VDKRVESKYGPPCPXCPAPEXXGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQ EDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSLG где X в положении остатка 62 представляет собой одну из D, А, Е и Q; X в положении остатка 104 представляет собой одну из N и Т; X в положении остатка 231 представляет собой одну из Р и S; X в положении остатка 237 представляет собой одну из А и F; и X в положении остатка 238 представляет собой одну из А и L.

Иллюстративная LC (SEQ ID NO: 2)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIXRWLAWYQQKPGKAPKLLIHDASQLX EGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQFDLLPLTFGGGTKVEIKRTVAA PSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

- 14 040300 где X в положении остатка 30 представляет собой одну из S и W; и X в положении остатка 55 представляет собой одну из L и F.

Иллюстративная HCDR1 (SEQ ID NO: 3)

AASGFTFSSYYMS

Иллюстративная HCDR2 (SEQ ID NO: 4)

AISLSGGSTYYAXSHKG где X в положении остатка 13 представляет собой одну из D, А, Е и Q.

Иллюстративная HCDR3 (SEQ ID NO: 5)

VREVGASXHNYYGMDV где X в положении остатка 8 представляет собой одну из N и Т.

Иллюстративная LCDR1 (SEQ ID NO: 6)

RASQSIXRWLA где X в положении остатка 7 представляет собой одну из S и W.

Иллюстративная LCDR2 (SEQ ID NO: 7)

HDASQLXE где X в положении остатка 7 представляет собой одну из L и F.

Иллюстративная LCDR3 (SEQ ID NO: 8)

QQFDLLPLT

Иллюстративная HCVR (SEQ ID NO: 9)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYYMSWVRQAPGKGLEWVSAISLS GGSTYYAXSHKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVREVGASXHNY YGMD VWGQGTMVT VS S где X в положении остатка 62 представляет собой одну из D, А, Е и Q; и X в положении остатка 104 представляет собой одну из N и Т.

Иллюстративная LCVR (SEQ ID NO: 10)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIXRWLAWYQQKPGKAPKLLIHDASQLX EGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQFDLLPLTFGGGTKVEIK где X в положении остатка 30 представляет собой одну из S и W; и X в положении остатка 55 представляет собой одну из L и F.

Нуклеотидная последовательность, кодирующая НС иллюстративного Ат В (SEQ ID NO: 11) gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactc tcctgtgcagcctctggattcacctttagc agctattacatgagctgggtccgccaggct ccagggaaggggctggagtgggtctcagct attagtctgagtggtggtagcacatactac gcagcgtcccacaagggccggttcaccatc tccagagacaattccaagaacacgctgtat ctgcaaatgaacagcctgagagccgaggac acggccgtatattactgtgtccgggaggtg ggagctagcactcacaactactacggtatg gacgtctggggccaagggaccatggtcacc gtctcttcagcttctaccaagggcccatcg gtcttcccgctagcgccctgctccaggagc acctccgagagcacagccgccctgggctgc ctggtcaaggactacttccccgaaccggtg acggtgtcgtggaactcaggcgccctgacc agcggcgtgcacaccttcccggctgtccta cagtcctcaggactctactccctcagcagc gtggtgaccgtgccctccagcagcttgggc acgaagacctacacctgcaacgtagatcac aagcccagcaacaccaaggtggacaagaga gttgagtccaaatatggtcccccatgccca ccctgcccagcacctgaggccgccggggga ccatcagtcttcctgttccccccaaaaccc aaggacactctcatgatctcccggacccct gaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagc caggaagaccccgaggtccagttcaactgg tacgtggatggcgtggaggtgcataatgcc aagacaaagccgcgggaggagcagttcaac agcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcacc gtcctgcaccaggactggctgaacggcaag gagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggc ctcccgtcctccatcgagaaaaccatctcc aaagccaaagggcagccccgagagccacag gtgtacaccctgcccccatcccaggaggag atgaccaagaaccaggtcagcctgacctgc ctggtcaaaggcttctaccccagcgacatc gccgtggagtgggaaagcaatgggcagccg gagaacaactacaagaccacgcctcccgtg ctggactccgacggctccttcttcctctac agcaggctaaccgtggacaagagcaggtgg caggaggggaatgtcttctcatgctccgtg atgcatgaggctctgcacaaccactacaca cagaagagcctctccctgtctctgggt

Нуклеотидная последовательность, кодирующая LC иллюстративного Ат В (SEQ ID NO: 12)

- 15 040300 gacatccagatgacccagtctccatcctcc ctgtctgcatctgtaggagacagagtcacc atcacttgccgggcgagtcagagtatttgg aggtggttggcctggtatcagcagaaacca gggaaagcccctaagctcctgatccacgat gcatcccaattgttcgaaggggtcccatca aggttcagtggaagtggatctgggacagat tttactttcaccatcagcagcctgcagcct gaagatattgcaacatattactgtcaacag tttgatttgctccctctcactttcggcgga gggaccaaggtggagatcaaacggaccgtg gctgcaccatctgtcttcatcttcccgcca tctgatgagcagttgaaatctggaactgcc tctgttgtgtgcctgctgaataacttctat cccagagaggccaaagtacagtggaaggtg gataacgccctccaatcgggtaactcccag gagagtgtcacagagcaggacagcaaggac agcacctacagcctcagcagcaccctgacg ctgagcaaagcagactacgagaaacacaaa gtctacgcctgcgaagtcacccatcagggc ctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaac aggggagagtgc

Аминокислотная последовательность рекомбинантного РАСАР 38 человека (SEQ ID NO: 13) HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK где K в положении остатка 38 является пост-трансляционно модифицированной с помощью Сконцевого амидирования.

Аминокислотная последовательность рекомбинантного РАСАР 27 человека (SEQ ID NO: 14) HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL где L в положении остатка 27 является пост-трансляционно модифицированной с помощью Сконцевого амидирования.

Claims (18)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Антитело, которое связывается с активирующим аденилатциклазу гипофиза пептидом человека и которое содержит вариабельную область тяжелой цепи (HCVR) и вариабельную область легкой цепи (LCVR), причем указанная HCVR содержит определяющие комплементарность области (CDR) HCDR1, HCDR2 и HCDR3, и указанная LCVR содержит CDR LCDR1, LCDR2 и LCDR3, при этом аминокислотная последовательность HCDR1 представляет собой SEQ ID NO: 3, аминокислотная последовательность HCDR2 представляет собой SEQ ID NO: 4, аминокислотная последовательность HCDR3 представляет собой SEQ ID NO: 5, аминокислотная последовательность LCDR1 представляет собой SEQ ID NO: 6, аминокислотная последовательность LCDR2 представляет собой SEQ ID NO: 7, и аминокислотная последовательность LCDR3 представляет собой SEQ ID NO: 8, причем

   HCDR2 содержит аспарагиновую кислоту в положении остатка 13; HCDR3 содержит аспарагин в положении остатка 8; LCDR1 содержит серин в положении остатка 7; и LCDR2 содержит лейцин в положении остатка 7, или

   HCDR2 содержит аланин в положении остатка 13; HCDR3 содержит треонин в положении остатка 8; LCDR1 содержит триптофан в положении остатка 7; и LCDR2 содержит фенилаланин в положении остатка 7, или

   HCDR2 содержит глутаминовую кислоту в положении остатка 13; HCDR3 содержит треонин в положении остатка 8; LCDR1 содержит триптофан в положении остатка 7; и LCDR2 содержит фенилаланин в положении остатка 7, или

   HCDR2 содержит глутамин в положении остатка 13; HCDR3 содержит треонин в положении остатка 8; LCDR1 содержит триптофан в положении остатка 7; и LCDR2 содержит фенилаланин в положении остатка 7.
2. 2. Антитело по п.1, отличающееся тем, что HCDR2 содержит аспарагиновую кислоту в положении остатка 13; HCDR3 содержит аспарагин в положении остатка 8; LCDR1 содержит серин в положении остатка 7; и LCDR2 содержит лейцин в положении остатка 7.
3. 3. Антитело по п.1, отличающееся тем, что HCDR2 содержит аланин в положении остатка 13; HCDR3 содержит треонин в положении остатка 8; LCDR1 содержит триптофан в положении остатка 7; и LCDR2 содержит фенилаланин в положении остатка 7.
4. 4. Антитело по п.1, отличающееся тем, что HCDR2 содержит глутаминовую кислоту в положении остатка 13; HCDR3 содержит треонин в положении остатка 8; LCDR1 содержит триптофан в положении остатка 7; и LCDR2 содержит фенилаланин в положении остатка 7.
5. 5. Антитело по п.1, отличающееся тем, что HCDR2 содержит глутамин в положении остатка 13; HCDR3 содержит треонин в положении остатка 8; LCDR1 содержит триптофан в положении остатка 7; и LCDR2 содержит фенилаланин в положении остатка 7.
6. 6. Антитело по п.1, содержащее вариабельную область тяжелой цепи (HCVR) и вариабельную область легкой цепи (LCVR), отличающееся тем, что аминокислотная последовательность указанной HCVR представляет собой SEQ ID NO: 9, и аминокислотная последовательность указанной LCVR представляет собой SEQ ID NO: 10.
7. 7. Антитело по п.6, отличающееся тем, что HCVR содержит аспарагиновую кислоту в положении

   - 16 040300 остатка 62 и аспарагин в положении остатка 104, и отличающееся тем, что LCVR содержит серин в положении остатка 30 и лейцин в положении остатка 55.
8. 8. Антитело по п.6, отличающееся тем, что HCVR содержит аланин в положении остатка 62 и треонин в положении остатка 104, и отличающееся тем, что LCVR содержит триптофан в положении остатка

   30 и фенилаланин в положении остатка 55.
9. 9. Антитело по п.6, отличающееся тем, что HCVR содержит глутаминовую кислоту в положении остатка 62 и треонин в положении остатка 104, и отличающееся тем, что LCVR содержит триптофан в положении остатка 30 и фенилаланин в положении остатка 55.
10. 10. Антитело по п.6, отличающееся тем, что HCVR содержит глутамин в положении остатка 62 и треонин в положении остатка 104, и отличающееся тем, что LCVR содержит триптофан в положении остатка 30 и фенилаланин в положении остатка 55.
11. 11. Антитело, которое связывается с активирующим аденилатциклазу гипофиза пептидом человека, содержащее тяжелую цепь (НС) и легкую цепь (LC), причем аминокислотная последовательность указанной НС представляет собой SEQ ID NO: 1, и аминокислотная последовательность указанной LC представляет собой SEQ ID NO: 2; и причем

    НС содержит аспарагиновую кислоту в положении остатка 62, аспарагин в положении остатка 104, пролин в положении остатка 231, аланин в положении остатка 237 и аланин в положении остатка 238, и LC содержит серин в положении остатка 30 и лейцин в положении остатка 55, или

    НС содержит аланин в положении остатка 62, треонин в положении остатка 104, пролин в положении остатка 231, аланин в положении остатка 237 и аланин в положении остатка 238, и LC содержит триптофан в положении остатка 30 и фенилаланин в положении остатка 55, или

    НС содержит глутаминовую кислоту в положении остатка 62, треонин в положении остатка 104, пролин в положении остатка 231, аланин в положении остатка 237 и аланин в положении остатка 238, и LC содержит триптофан в положении остатка 30 и фенилаланин в положении остатка 55, или

    НС содержит глутамин в положении остатка 62, треонин в положении остатка 104, пролин в положении остатка 231, аланин в положении остатка 237 и аланин в положении остатка 238, и LC содержит триптофан в положении остатка 30 и фенилаланин в положении остатка 55.
12. 12. Антитело по п.11, отличающееся тем, что НС содержит аспарагиновую кислоту в положении остатка 62, аспарагин в положении остатка 104, пролин в положении остатка 231, аланин в положении остатка 237 и аланин в положении остатка 238, и отличающееся тем, что LC содержит серин в положении остатка 30 и лейцин в положении остатка 55.
13. 13. Антитело по π. 11, отличающееся тем, что НС содержит аланин в положении остатка 62, треонин в положении остатка 104, пролин в положении остатка 231, аланин в положении остатка 237 и аланин в положении остатка 238, и отличающееся тем, что LC содержит триптофан в положении остатка 30 и фенилаланин в положении остатка 55.
14. 14. Антитело по п.11, отличающееся тем, что НС содержит глутаминовую кислоту в положении остатка 62, треонин в положении остатка 104, пролин в положении остатка 231, аланин в положении остатка 237 и аланин в положении остатка 238, и отличающееся тем, что LC содержит триптофан в положении остатка 30 и фенилаланин в положении остатка 55.
15. 15. Антитело по п.11, отличающееся тем, что НС содержит глутамин в положении остатка 62, треонин в положении остатка 104, пролин в положении остатка 231, аланин в положении остатка 237 и аланин в положении остатка 238, и отличающееся тем, что LC содержит триптофан в положении остатка 30 и фенилаланин в положении остатка 55.
16. 16. Способ лечения одного из первичной головной боли, вторичной головной боли и мигрени, включающий в себя введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антитела по любому из пп. 1 -15.
17. 17. Способ по п.16, отличающийся тем, что указанная первичная головная боль представляет собой тригименальную вегетативную цефалгию.
18. 18. Способ по п.17, отличающийся тем, что указанная тригименальная вегетативная цефалгия представляет собой одно из эпизодической кластерной головной боли, хронической кластерной головной боли, пароксизмальной гемикрании и приступа односторонней невралгической головной боли.

    Евразийская патентная организация, ЕАПВ

    Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2