KR20230004659A - 항-인간 신경 성장 인자 항체 - Google Patents

항-인간 신경 성장 인자 항체 Download PDF

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Abstract

NGF에 특이적으로 결합할 수 있는 중화 항체, 또는 그의 항원 결합 단편 및 항체를 생산하기 위한 제조 방법이 제공된다. NGF-관련 질환 또는 장애의 치료, 특히 개별 통증을 경감 또는 개선하는데 있어서의 항체의 적용이 추가로 제공된다.

Description

항-인간 신경 성장 인자 항체
본 출원은 항체 분야에 관한 것으로, 특히 신경 성장 인자(NGF: Nerve growth factor)에 특이적으로 결합하는 항체, 그의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.
신경 성장 인자(NGF)는 가장 먼저 발견된 뉴로트로핀(신경영양 인자)으로, 뇌, 신경절, 홍채, 심장, 비장, 태반 및 기타 조직과 섬유아세포, 평활근, 골격근, 신경교세포, 슈반(schwann) 세포 등에 널리 분포되어 있다. NGF는 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF: brain-derived neurotrophic factor), NT-3, NT-4, NT-5를 추가로 포함하는 구조적으로 관련된 단백질 군인 뉴로트로핀(NT: neurotrophin)의 구성원이다[와이만(Wyman) 등의 문헌 "Gene Therapy(1999), 6: 1648-1660"]. NGF의 활성은 두 가지 다른 막 결합 수용체, 즉 종양 괴사 인자 수용체 계열의 다른 구성원과 구조적으로 관련된 티로신 키나제 A(TrkA) 수용체 및 p75 수용체를 통해 매개된다[차오(Chao) 등의 문헌 "Science 232: 518-521, 1986"].
NGF는 통증[리차즈(RICHARDS, N.)의 문헌 "Br J Anaesth(2013), 111(1): 46-51"], 관절염, 콜라겐 혈관 질환, 탈수초 질환, 기도 염증 질환[호일레(Hoyle)의 문헌 "Cytokine Growth Factor Rev(2003), 14: 551-8"; 롬마츠쉬(Lommatzsch, M.)의 문헌 "Ann NY Acad Sci(2003), 992: 241-9"], 신경 질환, 당뇨병과 같은 대사 질환[야스다(Yasuda, H.)의 문헌 "Prog Neurobiol(2003), 69(4): 229-85"], 바이러스 감염과 연관된 질환[그라시(Garaci, E.)의 문헌 "PNAS(2003), 100(15) 8927-8932"], 부정맥(국제 특허출원 공개공보 W0 제04/032852호), 건선 및 암[나카가와라((Nakagawara, A.)의 문헌 "Cancer Lett(2001), 169(2): 107-14"]과 같은 다양한 질환 또는 병태를 매개한다.
말초 조직 염증이나 신경 손상은 병리생리학적 통증의 원인이다. NGF는 말초 뉴런과 중추 뉴런의 기능을 조절하는 역할을 할 수 있다. NGF는 신체의 통증 신호 시스템과 상호작용할 수 있고 많은 종에 대해 국소 또는 전신 투여시 통각과민을 유발할 수 있는 것으로 나타났다[사르치엘리(Sarchielli)의 문헌 "Expert Rev. Neurotherapeutics(2004), 4(1):115-127"].
통증은 주변 환경으로부터 수신되고 신경계에 의해 전달되고 해석되는 신호에 기초한 인식이다[밀란(Millan)의 문헌 "Prog. Neurobiol(1999). 57: 1-164"]. 심한 통증은 인간의 삶의 질에 영향을 미치고 사회에 막대한 경제적 부담을 준다. 따라서 통증 치료는 가장 통상적인 임상적 및 사회적 요구 중 하나이다. 그러나 통증 치료는 부분적으로만 효과가 있으며 이러한 치료 중 많은 치료가 자체적으로 수많은 부작용을 낳는다. 예를 들어, 오피오이드는 좋은 진통 효과가 있지만 신독소이기도 하다. 고용량에서는 위장 자극, 궤양, 출혈 및 정신 혼란을 일으키는 경향이 있다. 더 나쁜 것은, 오피오이드의 장기간 사용은 약물 내성 및 의존성과 연관된다는 것이다.
통증 분야의 막대한 임상 수요와 시장 공간으로 인해 통증을 치료하기 위한 통증 경로를 표적으로 하는 신약 개발이 중요하고 시급하다. 최근 몇 년 동안 급성 및 만성 통증과 통각과민에서 NGF의 역할에 대한 이해가 증가함에 따라, 항 NGF 길항제가 통증 치료법의 연구에 있어서 새로운 핫스팟(hotspot)이 되었다. 많은 뮤린 및 인간화 항-NGF 항체가 보고되었다. 일부 항-NGF 항체 약물 임상 시험 데이터는 긍정적인 결과를 보여주지만, 뮤린의 항-NGF 항체와 인간화 항-NGF 항체는 면역원성 등의 문제가 있다.
따라서, NGF 관련 질환을 예방하거나 치료하는 데 사용할 수 있는 조성물 또는 방법, 예를 들어 통증 관련 질환 또는 병태를 예방하거나 치료하는 데 사용할 수 있는 조성물 및 방법에 대한 요구가 당분야에 여전히 존재한다. 본 출원은 이러한 요구를 만족시킬 수 있다.
본 발명은 높은 친화도로 NGF에 특이적으로 결합할 수 있는 신규한 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 특히 인간 NGF에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 한 바람직한 실시태양에서, 본원에 제공된 항-NGF 항체는 비-인간 영장류 NGF 및/또는 마우스 NGF를 포함하는 비-인간 NGF와 교차 반응할 수 있는 인간 항체이다. 또 다른 실시태양에서, 인간 NGF에 특이적으로 결합하는 본원에 기재된 인간 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 NGF를 중화시키는 중화 항체이다.
한 양태에서, 본 발명은 인간 NGF에 특이적으로 결합하고 뉴로트로핀-3(NT-3), 뉴로트로핀-4(NT-4), 뇌-유래 신경영양 인자(BDNF)와 교차-반응하지 않는 인간 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 이들 항체는 NGF에 대해 높은 친화도 및 높은 특이도로 결합하는 것이 특징이며 NGF의 활성을 중화시킬 수 있다.
특정 실시태양에서, 항-NGF 항체 및 그의 항원 단편은 표 I에 제시된 항체의 VH 도메인 서열로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR(바람직하게는 3개의 CDR)을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 표 I에 제시된 항체의 VL 도메인 서열로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR(바람직하게는 3개의 CDR)을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 항체는 표 I에 제시된 항체의 6개의 CDR 도메인 서열을 포함한다. 한 바람직한 실시태양에서, 항체의 CDR 서열은 표 II에 제시된 CDR 서열이다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 따른 항-NGF 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 A) 중쇄 CDR: (i) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 또는 이러한 서열에 대해 1개 이상 5개 이하의 아미노산의 치환(예를 들어 보존적 치환), 결실 또는 삽입을 포함하는 서열, (ii) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 또는 이러한 서열에 대해 1개 이상 3개 이하의 아미노산의 치환(예를 들어 보존적 치환), 결실 또는 삽입을 포함하는 서열, (iii) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3, 또는 이러한 서열에 대해 1개 이상 5개 이하의 아미노산의 치환(예를 들어 보존적 치환), 결실 또는 삽입을 포함하는 서열, 및 B) 경쇄 CDR: (i) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 또는 이러한 서열에 대해 1개 이상 5개 이하의 아미노산의 치환(예를 들어 보존적 치환), 결실 또는 삽입을 포함하는 서열, (ii) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 또는 이러한 서열에 대해 1개 이상 2개 이하의 아미노산의 치환(예를 들어 보존적 치환), 결실 또는 삽입을 포함하는 서열, (iii) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3, 또는 이러한 서열에 대해 1개 이상 5개 이하의 아미노산의 치환(예를 들어 보존적 치환), 결실 또는 삽입을 포함하는 서열을 포함하고, 이때 변형된 CDR을 포함하는 항-NGF 항체는 여전히 NGF에 결합하는 능력을 갖는다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 따른 항-NGF 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 A) 중쇄 CDR: (i) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1, (ii) 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2, 및 (iii) 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3, 및 B) 경쇄 상보성 결정 영역(CDR): (i) 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1, (ii) 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2, 및 (iii) 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 따른 항-NGF 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 7의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역 VH을 포함한다. VH를 포함하는 항-NGF 항체는 NGF에 결합하는 능력을 갖는다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 따른 항-NGF 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 표 II에 제시된 항체의 3개의 중쇄 가변 영역 CDR을 포함하고 서열번호 7의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 VH를 포함한다. VH를 포함하는 항-NGF 항체는 NGF에 결합하는 능력을 갖는다. 일부 실시태양에서, 항-NGF 항체의 중쇄 가변 영역 VH는 서열번호 7의 아미노산 서열에 대해 하나 이상의 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. VH를 포함하는 항-NGF 항체는 NGF에 결합하는 능력을 갖는다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 따른 항-NGF 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 8의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역 VL을 포함한다. VL을 포함하는 항-NGF 항체는 NGF에 결합하는 능력을 갖는다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 따른 항-NGF 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 표 II에 제시된 항체의 3개의 경쇄 가변 영역 CDR을 포함하고 서열번호 8의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역 VL을 포함한다. VL을 포함하는 항-NGF 항체는 NGF에 결합하는 능력을 갖는다. 일부 실시태양에서, 항-NGF 항체의 경쇄 가변 영역 VL은 서열번호 8의 아미노산 서열에 대해 하나 이상의 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. VH를 포함하는 항-NGF 항체는 NGF에 결합하는 능력을 갖는다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 따른 항-NGF 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하며, 이때:
1) 중쇄 가변 영역 VH는 서열번호 7의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고; 경쇄 가변 영역 VL은 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 또는
2) 중쇄 가변 영역 VH는 표 II에 제시된 중쇄 가변 영역 CDR을 포함하고, 서열번호 7의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖고; 경쇄 가변 영역 VL은 표 II에 제시된 경쇄 가변 영역의 CDR을 포함하고, 서열번호 8의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 가지며; VH 및 VL을 포함하는 항-NGF 항체는 NGF에 결합하는 능력을 갖거나, 또는
3) 중쇄 가변 영역 VH는 서열번호 7의 아미노산 서열에 대해 하나 이상의 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역 VL은 서열번호 8의 아미노산 서열에 대해 하나 이상의 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 갖는 아미노산 서열을 포함하며; VH 및 VL을 포함하는 항-NGF 항체는 NGF에 결합하는 능력을 갖는다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명은 항-NGF 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하며, 이때 중쇄 가변 영역 VH는 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고; 경쇄 가변 영역 VL은 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시태양에서, 항-NGF 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간 항체 생식계열 컨센서스(consensus) 서열로부터의 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역 서열을 추가로 포함한다. 경쇄 불변 영역은 바람직하게는 인간 카파(CK) 또는 람다(Cλ) 쇄 불변 영역이다. 중쇄 불변 영역은 γ, μ, α, δ 또는 ε 쇄일 수 있다. 일부 실시태양에서, 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD, 및 IgE 이소형(isoform)이다. 각각의 중쇄, 경쇄 유형은 당업계에 잘 알려진 서열을 갖는 특정 불변 영역을 특징으로 한다.
일부 실시태양에서, 불변 영역은 바람직하게는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 이소형 불변 영역과 같은 인간 IgG 불변 영역이다. 일부 실시태양에서, 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역은 예를 들어, 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH Publication No.91-3242]에 기재된 바와 같으며, 이들 중 임의의 것이 본 발명에서 사용될 수 있다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명은 중쇄 불변 영역이 인간 IgG4 불변 영역이고, 중쇄 불변 영역 서열이 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고; 경쇄 가변 영역 VL이 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 항-NGF 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
이러한 불변 영역 도메인의 서열 변이체, 예를 들어 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 변이체가 또한 사용될 수 있음을 인식할 것이고, 이때 아미노산 위치는 카밧(Kabat) 등의 EU 인덱싱 체계(indexing system)(1991)에 따라 확인된다.
일부 실시태양에서, 변형은, 예를 들어 항체의 글리코실화를 방지하기 위해 인간 IgG 불변 영역에서 이루어지고, 변형은 N297A 또는 N297Q일 수 있다[사진스키(Sazinsky)의 문헌 "PNAS(2008), 105(51): 20167-20172"].
일부 실시태양에서, 변형은, 예를 들어 Fc 수용체 상호작용을 변경하기 위해 인간 IgG 불변 영역에서 이루어지고, 변형은 L234A 및/또는 L235E 또는 L235A일 수 있다.
일부 실시태양에서, 변형은, 예를 들어 반감기를 증가시키기 위해 인간 IgG 불변 영역에서 이루어지고, 변형은 R435H일 수 있다.
일부 실시태양에서, 변형은, 예를 들어 쇄 교환을 방지하거나 감소시키기 위해 인간 IgG 불변 영역에서 이루어지고, 변형은 S228P일 수 있다[안갈(Angal, S.)의 문헌 "Mol Immunol(1993), 30: 105-108"].
일부 실시태양에서, 변형은, 예를 들어 FcRn 결합을 향상시키기 위해 인간 IgG 불변 영역에서 이루어지고, 변형은 M252Y, S254T, T256E[달아쿠아(DallAcqua) 등의 문헌 "J. Biol. Chem(2006), 281(33): 23514-23524"; 잘레브스키(Zalevsky) 등의 문헌 "Nature Biotech(2010), 28(2): 157-159"], M428L 또는 N434S일 수 있다.
일부 실시태양에서, 변형은, 예를 들어 항체 의존성 세포독성(ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC)을 변경하기 위해 인간 IgG 불변 영역에서 이루어지고, 이러한 변형은 공지되어 있다[나츠메(Natsume) 등의 문헌 "Cancer Res(2008), 68(10): 3863-72"; 이두소기(Idusogie) 등의 문헌 "J. Immunol(2001), 166(4): 2571-5"; 무어(Moore) 등의 문헌 "mAbs(2010), 2(2): 181-189"; 라자르(Lazar) 등의 문헌 "PNAS(2006), 103(11): 4005-4010"; 쉴즈(Shields) 등의 문헌 "J. Biol. Chem.(2001), 276(9): 6591-6604"; 스타벤하겐(Stavenhagen)의 문헌 "Cancer Res(2007), 67(18): 8882-8890"; 알레그레(Alegre) 등의 문헌 "J. Immunol(1992) 148: 3461-3468"; 가네코(Kaneko), 니와(Niwa) 등의 문헌 "Biodrugs(2011), 25(1): 1-11"을 포함하지만 이에 국한되지 않음].
일부 실시태양에서, 이종이량체화는 또한 T366W 변형에 의해, 및 선택적으로로 추가로 반대 CH3 도메인 상의 S354C 및 Y349C 변형을 통한 이황화 결합의 도입에 의해 유도될 수 있다[카터(Carter)의 문헌 "Journal of Immunological Methods(2001), 248:7-15"].
일부 실시태양에서, 본 발명의 항체는 또한 NGF에 대한 결합에 있어서 상기 기재된 임의의 항체와 경쟁하는 항체, 뿐만 아니라 상기 기재된 임의의 항체와 동일한 NGF 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다.
일부 실시태양에서, 항-NGF 항체의 골격구조 서열의 적어도 일부는 인간 컨센서스 골격구조 서열이다.
한 실시태양에서, 본 발명의 항-NGF 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA 및 IgE 항체와 같은 온전한 항체이다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명의 항-NGF 항체는 그의 항원-결합 부분만을 포함하며, 예를 들어, Fab, Fab'-SH, Fv, scFv, 또는 (Fab')2 단편이다. 한 실시태양에서, 본 발명의 항-NGF 항체는 특정 기능을 달성하도록, 예를 들어 잔여 효과기 기능을 제거하기 위해 변형될 수 있다[Glu는 잔여 효과기 기능을 제거할 수 있다(레디(Reddy) 등의 문헌(2000))].
일부 실시태양에서, 본 발명의 항-NGF 항체는 NGF를 중화하기 위한 중화 항체이다.
두 번째 양태에서, 본 발명은 임의의 상기 항-NGF 항체 또는 그의 단편을 인코딩하는 핵산을 제공한다. 한 실시태양에서, 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다. 한 실시태양에서, 벡터는 발현 벡터이다.
세 번째 양태에서, 본 발명은 벡터를 포함하거나 핵산 또는 항체를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 한 실시태양에서, 숙주 세포는 진핵 세포이다. 또 다른 실시태양에서, 숙주 세포는 포유동물 세포, 예컨대 CHO 세포, HEK293 세포, COS 세포, 또는 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 생산에 적합한 다른 세포로부터 선택된다. 또 다른 실시태양에서, 숙주 세포는 원핵 세포, 예를 들어 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 세포, 또는 효모 세포이다.
네 번째 양태에서, 본 발명은 항-NGF 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제조하는 방법을 제공하며, 이때 상기 방법은 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산을 발현하기에 적합한 조건 하에 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 선택적으로 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 단리하는 단계를 포함한다. 특정 실시태양에서, 방법은 숙주 세포로부터 항-NGF 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 생성된 항-NGF 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
다섯 번째 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 항-NGF 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 제공하고; 바람직하게는, 조성물은 약제학적 조성물이다.
한 실시태양에서, 조성물은 약제학적 벡터를 추가로 포함한다. 한 실시태양에서, 조성물에 포함된 항-NGF 항체 및 그의 항원 결합 단편은 접합 작용기에 접합된다. 한 실시태양에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함한다.
여섯 번째 양태에서, 본 발명은 피험체에게 치료 유효량의 본 발명의 항-NGF 항체를 투여하거나 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, NGF와 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 피험체에게 치료 유효량의 본 발명의 항-NGF 항체를 투여하거나, 본 발명의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, NGF-매개된 질환 또는 장애와 연관된 증상을 완화 또는 개선하는 방법에 관한 것이다.
특정 실시태양에서, NGF-매개된 질환 또는 병태는 통증, 관절염, 콜라겐 혈관 질환, 탈수초 질환, 기도 염증 질환, 신경 질환, 대사 질환(예를 들어, 당뇨병), 바이러스 감염과 연관된 질환, 심장 박동 장애, 건선 및 암을 포함하나 이에 제한되지 않는, 상승된 NGF 수준 또는 NGF에 대한 증가된 감수성과 연관된 임의의 의학적 질환 또는 병태를 포함한다.
한 실시태양에서, NGF-매개된 질환 또는 장애는 통증-관련 장애, 염증성 통증, 수술 후 절개 통증, 신경병증성 통증, 골절 통증, 통풍 관절 통증, 작열통, 암 통증, 복합 부위 통증 증후군, 대상포진후 신경통 또는 겸상 적혈구 위기와 연관된 통증이다. 한 실시태양에서, 통증은 병리생리학적 통증이다.
추가로, 방법은 NGF의 활성을 제거, 억제 또는 감소시킴으로써 NGF와 연관된 임의의 질환 또는 병태를 개선, 완화, 억제 또는 예방하거나, 통증과 같은 질환과 연관된 증상을 완화할 수 있다. 한 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 같은 항-NGF 길항제를 단독으로 투여함으로써 NGF와 연관된 질환 또는 병태를 치료할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 현재 개시된 치료 방법에 따르면, 항-NGF 항체는 NGF 제제와 연관된 질환 또는 병태의 치료를 위해 다른 뉴로트로핀, 진통제, 소염제, 화학요법제 및 면역요법제로부터 선택된 제2 치료제와 조합하여 투여된다. 특정 실시태양에서, 제2 치료제는 NT-3, NT-4 또는 BDNF와 같은 또 다른 뉴로트로핀이다.
한 실시태양에서, 본 발명은 치료 유효량의 본 발명의 항-NGF 항체 또는 치료 유효량의 약제학적 조성물을 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 NGF-매개된 통증을 완화 또는 개선하는 방법을 제공한다.
일곱 번째 양태에서, 본 발명은 (a) 피험체 또는 샘플을 본원에 기재된 임의의 항-NGF 항체 또는 그의 단편과 접촉시키는 단계; 및 (b) 항-NGF 항체 또는 그의 단편과 NGF 사이의 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하는, 피험체 또는 샘플에서 NGF를 검출하는 방법을 제공한다. 한 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 항-NGF 항체 및 그의 항원 결합 단편은 검출가능한 표지를 추가로 포함한다.
한 실시태양에서, 본원에 제공된 항체를 사용하여 변경되거나 비정상적인 NGF 발현과 연관된 질환 또는 장애를 검출, 진단 및 모니터링할 수 있다.
여덟 번째 양태에서, 본 발명은 피험체에서 NGF와 연관된 질환 또는 병태를 치료하기 위한 약제 또는 키트의 제조에서 본원에 기재된 임의의 항-NGF 항체 또는 그의 단편의 용도에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 본 발명은 피험체에서 NGF와 연관된 질환 또는 병태를 치료하기 위한 약제 또는 키트의 제조에서 항-NGF 항체를 포함한 조성물의 용도를 제공한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 또한 NGF-매개된 통증을 완화 또는 개선하기 위한 약제의 제조에서 본원에 기재된 임의의 항-NGF 항체 또는 그의 단편, 또는 항-NGF 항체를 포함한 조성물의 용도에 관한 것이다.
또 다른 실시태양에서, 본원의 임의의 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 약제로서 사용된다.
아홉 번째 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 조성물을 포함하는 키트, 예를 들어 진단 키트, 검출 키트, 치료 키트 등을 제공한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 임의의 실시태양의 임의의 조합을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 실시태양, 또는 그의 임의의 조합은 본원에 기재된 본 발명의 임의의 또는 모든 항-NGF 항체 또는 그의 단편, 방법 및 용도에 적용된다.
본 발명은 NGF를 특이적으로 인식/결합할 수 있는 인간 항체 및 그의 항원 결합 단편, NGF에 대해 중화 효과를 갖지만 NT-3, NT-4 및 BDNF에 교차 반응하지 않는 항체 및 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 본 발명의 항-NGF 항체는 완전한 인간 항체이기 때문에, NGF와 연관된 질환 또는 병태를 치료하거나 NGF와 연관된 통증을 완화하면서도 피험체에 대해 낮은 면역원성을 가지므로, 피험체에 대한 상응하는 면역 반응을 효과적으로 회피하고, 따라서 종래의 항-NGF 항체와 연관된 부작용을 줄인다.
도 1은 샘플(Ns006)의 항-NGF 항체 역가의 시험 결과이다.
도 2는 항체 결합 활성의 시험 결과이다.
도 3은 항체 TRN1027 친화도 곡선이다.
도 4는 항체 TRN1027이 TF-1 세포 증식을 억제함을 도시한다.
도 5는 마우스에서 CFA-유도 염증성 통증 MWT에 대한 단일 피하 투약의 효과(n = 9)를 도시한다.
1.1 정의
본 발명을 아래에 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약으로 제한되지 않고 다양할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본 명세서에서 사용된 용어는 단지 특정 실시태양을 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범주를 제한하려는 것이 아니며, 이는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것임을 또한 이해해야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
기재내용을 해석하기 위해 다음 정의가 사용될 것이고, 적절할 때마다 단수로 사용된 용어는 복수를 포함할 수 있으며 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 본 명세서에서 사용된 용어는 단지 특정 실시태양을 설명하기 위한 것이며 한정하려는 의도가 아님을 이해해야 한다.
수치와 함께 사용될 때 용어 "약"은 지정된 수치보다 5% 더 작은 하한값 및 지정된 수치보다 5% 더 큰 상한값을 갖는 범위 내의 수치를 포함하도록 의도된다.
"및/또는"이라는 용어는 대안 중 하나 또는 둘 모두를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하다" 또는 "포함되다"는 인용된 요소, 정수 또는 단계를 포함하지만 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계를 배제하지 않음을 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 본 명세서에서 사용될 때 용어 "포함하다" 또는 "포함되다"는 달리 지시되지 않는 한, 언급된 요소, 정수 또는 단계로 구성된 경우를 포함한다. 예를 들어, 특정 서열을 "포함하는" 항체 가변 영역에 대한 언급은 또한 그 특정 서열로 이루어진 항체 가변 영역을 포함하는 것으로 의도된다.
"신경 성장 인자" 또는 "NGF"라는 용어는 인간을 포함한 모든 포유동물 종의 천연 서열 NGF를 지칭하고, NGF 돌연변이체, NGF 이종상동체, NGF 파라로그 등과 같이 NGF의 생물학적 활성의 적어도 일부를 유지하는 이들의 임의의 형태를 포함한다.
용어 "항체"는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되며, 원하는 항원 결합 활성을 나타내는 한, 단일클론성 항체, 다중클론성 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체) 및 항체 단편을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 항체 구조를 포함한다. 온전한 항체는 전형적으로 적어도 2개의 전장 중쇄 및 2개의 전장 경쇄를 포함할 것이지만, 일부 경우에는 더 적은 쇄를 포함할 수 있으며, 예를 들어 낙타에서 자연적으로 발생하는 항체는 중쇄만을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "단일클론성 항체" 또는 "mAb"는 예를 들어, 진핵생물, 원핵생물 또는 파지 클론의 단일 카피 또는 클론으로부터 유래된 항체를 지칭하고, 즉 집단을 구성하는 개별 항체가 동일하고/하거나 전형적으로 소량으로 존재하는 가능한 변이 항체(예를 들어, 자연 돌연변이를 포함하거나 단일클론성 항체 제제의 제조 중에 생성된 항체)를 제외하고 동일한 에피토프에 결합한다. 수식어 "단일클론성"은 항체가 실질적으로 균일한 항체 집단으로부터 수득되는 특징을 지칭하고, 임의의 특정 방법에 의해 항체를 생산할 필요가 있는 것으로 해석되어서는 안 된다. 단일클론성 항체는 예를 들어 하이브리도마 기술, 재조합 기술, 파지 디스플레이 기술, CDR 이식과 같은 합성 기술, 또는 이들 또는 당업계에 공지된 다른 기술의 조합에 의해 생성될 수 있다.
"천연 항체"는 상이한 구조를 갖는 천연 발생 면역글로불린 분자를 지칭한다. "천연 서열 Fc 도메인"은 자연에서 발견되는 Fc 도메인의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 천연 서열 인간 Fc 도메인은 예를 들어 천연 서열 인간 IgG1 Fc 도메인(비-A 및 A 동종이형); 천연 서열 인간 IgG2 Fc 도메인; 천연 서열 인간 IgG3 Fc 도메인; 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 도메인; 및 이의 자연 발생 변이체를 포함한다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성되거나 비인간 출처로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체를 지칭하고, 이는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체 코딩 서열을 활용한다. 인간 항체의 이러한 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 구체적으로 배제한다.
용어 "중화 항체"는 NGF의 생물학적 활성을 감소 또는 억제하는, 예컨대 그의 하나 이상의 수용체, 바람직하게는 TrkA에 대한 NGF의 결합을 감소 또는 억제하는 항체 또는 항체 단편이다. 생물학적 활성의 감소는 부분적 감소 또는 완전한 감소일 수 있다. 항체가 NGF를 중화하는 정도를 항체의 중화 효능이라고 한다. 항체의 중화 효능은 경쟁적 결합 분석, 직접 및 간접 샌드위치 분석, 면역침전 분석 및 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay)을 포함하나 이에 제한되지 않는, 당업자에게 알려져 있고/있거나 본원에 기재되거나 언급된 하나 이상의 분석을 사용하여 결정 또는 측정될 수 있다.
"항-NGF 항체"는 NGF에 결합하고 NGF의 생물학적 활성 및/또는 NGF 신호전달에 의해 매개되는 다운스트림 경로를 억제하는 항체를 지칭한다. 항-NGF 항체는 NGF 신호전달, 예컨대 수용체 결합 및/또는 NGF에 대한 세포 반응 유도에 의해 매개되는 다운스트림 경로를 포함하여, NGF 생물학적 활성을 차단, 길항, 억제 또는 감소(상당한 감소를 포함함)시키는 항체를 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 또한 항-NGF 항체의 단편을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, 디아바디, 선형 항체, 단일쇄 항체 분자(예를 들어, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
NGF의 "생물학적 활성"은 일반적으로 NGF 수용체에 결합하고/하거나 NGF 수용체 신호전달 경로를 활성화하는 능력을 지칭한다. 예를 들어, 생물학적 활성은 다음 중 임의의 하나 이상을 포함한다: p75 및/또는 TrkA와 같은 NGF 수용체에 결합하는 능력; TrkA 수용체 이량체화 및/또는 TrkA 자가인산화를 촉진하는 능력; NGF 수용체 신호전달 경로를 활성화하는 능력; 세포 분화, 증식, 생존, 성장 및 세포 생리의 다른 변화를 촉진하는 능력; 마우스 E13.5 삼차 신경 뉴런의 생존을 촉진하고 수술 후 통증을 포함한 통증을 중재하는 능력.
각 중쇄는 중쇄 가변 영역(HCVR 또는 VH)과 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3의 3개 도메인으로 이루어진다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(LCVR 또는 VL)과 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 이루어진다. VH 및 VL 영역은 골격구조 영역(FR)이라고 하는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는, 상보적 결정 영역(CDR)이라고 하는 초가변 영역으로 더 나눌 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단에서 카르복시 말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된 3개의 CDR과 4개의 FR로 이루어진다.
"상보성 결정 영역" 또는 "CDR 영역" 또는 "CDR" 또는 "초가변 영역"은 항원의 에피토프에 대한 결합을 주로 담당하는 항체 가변 영역의 한 영역이다. 중쇄 및 경쇄의 CDR은 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 지칭되고, 통상적으로 N-말단으로부터 순차적으로 번호가 매겨진다.
주어진 VH 또는 VL 아미노산 서열의 CDR 서열을 결정하기 위한 다양한 체계가 당업계에 공지되어 있다: 카밧 상보성 결정 영역(CDR)은 서열 가변성에 기초하여 결정되고 가장 통상적으로 사용되는 반면[카밧(Kabat) 등의 문헌 "Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991)"], 코티아(Chothia)는 구조적 루프의 위치를 나타내고[코티아 등의 문헌 "(1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917"; 코티아 등의 문헌 "(1989) Nature 342: 877-883"], AbM CDR은 카밧 CDR과 코티아 구조 루프 사이의 절충안으로 옥스포드 몰레큘라(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용되며, "컨택트(Contact)" CDR은 이용 가능한 복합체 결정 구조의 분석을 기반으로 한다. 이들 CDR 각각의 잔기는 상이한 CDR 결정 체계에 따라 아래에 기재되어 있다.
Figure pct00001
항체와 관련하여 용어 "변이체"는 본원에서 적어도 하나, 예를 들어 1-30, 또는 1-20 또는 1-10, 예를 들어 1 또는 2 또는 3 또는 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입에 의해 변경된 관심 항체의 영역(예를 들어, 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역 또는 중쇄 CDR 영역 또는 경쇄 CDR 영역)을 포함하는 항체를 지칭하고, 이때 변이체는 변경 전의 항체 분자의 생물학적 특성을 실질적으로 유지한다. 한 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 항체의 변이체를 포함한다. 한 실시태양에서, 항체 변이체는 변경 전의 항체의 생물학적 활성(예를 들어, 항원 결합 능력)의 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%를 유지한다. 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역, 또는 각각의 CDR 영역은 개별적으로 또는 조합하여 변경될 수 있는 것으로 이해한다. 일부 실시태양에서, 1개 이상 또는 3개 모두의 중쇄 CDR에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이하의 아미노산 변경이 존재한다. 바람직하게는, 아미노산 변경은 아미노산 치환, 바람직하게는 보존적 치환이다.
"보존적 치환"이라는 용어는 동일한 부류의 한 아미노산에 대한 다른 아미노산의 치환, 예를 들어 하나의 산성 아미노산에 대한 다른 산성 아미노산으로의 치환, 하나의 염기성 아미노산에 대한 다른 염기성 아미노산으로의 치환, 또는 하나의 중성 아미노산에 대한 다른 중성 아미노산으로의 치환을 지칭한다. 예시적인 치환은 하기 표에 제시되어 있다.
Figure pct00002
일부 실시태양에서, 항체 변이체는 관심 항체 서열의 영역에 걸쳐 모 항체에 대해 적어도 80%, 90% 또는 95%, 또는 99% 이상의 아미노산 동일성을 갖는다.
"단리된" 항체는 그의 자연 환경의 구성 요소로부터 분리된 항체이다. 일부 실시태양에서, 항체는 예를 들어 전기영동(예를 들어, SDS-PAGE, IEF, 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 95% 또는 99% 초과 순도로 정제된다. 항체 순도를 평가하는 방법에 대한 검토를 위해, 예를 들어 플라트만(Flatman) 등의 문헌[J. Chromatogr. B848: 79-87(2007)]을 참조한다.
"단리된" 핵산은 그의 자연 환경의 구성요소로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 일반적으로 핵산 분자를 함유하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 염색체외 또는 그의 자연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
본 명세서에 사용된 용어 "벡터"는 연관된 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 이 용어는 자가 복제 핵산 구성체인 벡터 뿐만 아니라 이들이 도입된 숙주 세포의 게놈에 통합된 벡터를 포함한다. 일부 벡터는 이들이 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
"숙주 세포", "숙주 세포주", 및 "숙주 세포 배양물"이라는 용어는 상호교환적으로 사용되며 외인성 핵산이 도입된 세포를 지칭하고, 이러한 세포의 자손을 포함한다. 숙주 세포는 계대 수에 상관없이 1차 형질전환된 세포 및 이로부터 유래된 자손을 모두 포함하는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함한다. 자손은 핵산 함량이 부모 세포와 동일하지 않고 돌연변이를 포함할 수도 있다. 본원에는 고유적으로 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선택된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 포함된다.
항체를 인코딩하는 벡터를 클로닝하거나 발현시키기에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 바와 같은 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 항체는 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 요망되지 않은 경우 박테리아에서 생성될 수 있다. 박테리아에서 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들어 미국 특허 제5,648,237호; 제5,789,199호; 및 제5,840,523호를 참조하고, 또한 에스케리치아 콜라이에서 항체 단편의 발현을 설명하는 찰턴(Charlton)의 문헌[Methods in Molecular Biology, vol. 248(B.K.C.Lo, ed. Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254"]을 참조한다. 발현 후, 항체는 가용성 분별물에서 박테리아 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고 추가로 정제될 수 있다.
한 실시태양에서, 숙주 세포는 진핵 세포이다. 또 다른 실시태양에서, 숙주 세포는 효모 세포, 포유동물 세포, 또는 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 생산에 적합한 다른 세포로부터 선택된다. 예를 들어, 사상 진균류 또는 효모와 같은 진핵 미생물은 항체-인코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이며, 글리코실화 경로가 "인간화"되어 부분적으로 또는 완전히 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체를 생산하는 진균 및 효모 균주를 포함한다. 게른그로스(Gerngross)의 문헌[Nat. Biotech. 22: 1409-1414(2004)], 및 리(Li) 등의 문헌[Nat. Biotech. 24: 210-215(2006)]을 참조한다. 글리코실화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 척추동물 세포 또한 숙주로 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액에서의 성장에 적합하도록 조작된 포유동물 세포주가 사용될 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40으로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7); 인간 배아 신장 세포주[예를 들어, 그라함(Graham) 등의 문헌 "J. Gen Virol. 36:59(1977)"에 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포] 등이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 DHFR-CHO 세포를 포함하는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포[울라브(Urlaub) 등의 문헌 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 216(1980)"]; 및 YO, NSO 및 Sp2/0과 같은 골수종 세포주를 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주에 대한 검토는 예를 들어 야자키(Yazaki) 및 우(Wu)의 문헌[Methods in Molecular Biology, vol. 248(B. K. C. Lo, ed. Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268(2003)]을 참조한다.
기준 폴리펩티드 서열에 대한 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성"은 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않으면서, 최대 퍼센트 서열 동일성을 수득하기 위해 서열을 정렬한 후(필요한 경우 갭 도입 후) 기준 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로 정의된다. 서열 정렬은 당업계의 다양한 방법, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 MEGALIGN(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위해 수행될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 수득하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 정렬을 측정하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다.
본 출원에서 서열 동일성의 백분율이 언급될 때, 이 백분율은 달리 명시되지 않는 한 더 긴 서열의 전체 길이에 상대적으로 계산된다. 더 긴 서열에 대한 전체 길이 계산은 핵산 서열과 폴리펩티드 서열 모두에 적용된다.
"친화도" 또는 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원(예를 들어, 항체와 항원) 간의 상호작용을 반영하는 고유의 결합 친화도를 지칭한다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화도는 일반적으로 평형 해리 상수(KD)로 표현될 수 있다. 평형 해리 상수는 해리 속도 상수와 결합 속도 상수(각각 k해리 및 k결합)의 비율이다. 친화도는 당업계에 공지되어 있고 본원에 기재된 방법을 포함하여 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다.
본 발명의 한 실시태양에서, 본 발명의 항-NGF 항체는 1×10-7 M 이하, 1×10-8 M 이하, 1×10-9 M 이하, 1×10-10 M 이하, 1×10-11 M 이하, 1×10-12 M 이하, 1×10-13 M 이하 등의 NGF와의 평형 해리 상수(KD)를 갖는다.
"면역접합체"는 하나 이상의 이종 분자에 접합된 항체를 지칭하고, 담체를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
"약제학적 조성물"이라는 용어는 그 안에 함유된 활성 성분의 효과적인 생물학적 활성을 허용하는 형태로 존재하고, 제형이 투여되는 피험체에게 허용할 수 없는 독성을 갖는 추가적인 성분을 포함하지 않는 제형을 지칭한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 NGF 또는 그의 면역학적 활성 단편에 결합하는 하나 이상의 단일클론성 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본원에서 제공되는 항-NGF 항체 또는 약제학적 조성물은 개선된 수송, 전달, 내인성 등을 제공하기 위해 공동 투여를 위한 제형에서 적합한 담체, 부형제 및 기타 작용제에 혼입될 수 있음을 이해할 것이다.
용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 치료제와 공동 투여되는 희석제, 보조제[예를 들어, 프로인트(Freund)의 보조제(완전 및 불완전)], 부형제, 또는 비히클을 지칭한다.
본 발명에 사용하기에 적합한 약제학적 담체는 통상적일 수 있고, 문헌["Handbook of Pharmaceutical Excipients", 7th Edition, R. C. Rowe, P. J. Seskey and S. C. Owen, Pharmaceutical Press, London, Chicago]에 기재된 약제학적 제형 보조제, 및 문헌["Remington'S Pharmaceutical Sciences", E.W. Martin, Mack Publishing Co, Easton, PA Press, 21st Edition, 2012]에 기재된 개시된 항체의 약물 전달에 적합한 조성물 및 제형을 참조한다.
용어 "유효량"은 단일 또는 다중 용량으로 투여한 후 원하는 효과를 달성하거나 적어도 부분적으로 달성하기에 충분한 양 또는 용량을 지칭하고; "치료 유효량"은 피험체의 병태의 개선(예를 들어, 하나 이상의 증상의 개선) 및/또는 증상 진행의 지연 등을 포함하여, 치료 피험체에서 원하는 효과를 생성하는 양을 지칭한다. 질환을 예방하는 유효량은 질환의 발병을 예방, 중지 또는 지연시키기에 충분한 양을 지칭한다. 유효량의 결정은 당업자의 능력 내에 있고, 예를 들어, 치료 유효량은 관련된 특정 질환, 질환의 정도 또는 위중성; 개별 환자의 반응; 투여된 특정 항체; 투여 방식; 투여된 제형의 생체이용률 프로파일; 선택된 투약 계획; 및 임의의 병용 요법의 사용 등에 따라 달라진다
본원에서 사용된 바와 같이, "치료하는"은 기존 증상, 장애, 병태 또는 질환의 진행 또는 위중성을 늦추거나, 중단하거나, 저지하거나, 완화하거나, 중지하거나, 감소시키거나, 역전시킴을 지칭한다.
용어 "피험체" 또는 "개별체"는 영장류(예를 들어, 인간, 및 원숭이와 같은 비인간 영장류)이다. 특정 실시태양에서, 개별체 또는 피험체는 인간이다.
통증 또는 하나 이상의 통증 증상을 "경감"시키는 것은 항-NGF 항체를 투여하지 않는 것과 비교하여 하나 이상의 통증 증상을 감소 또는 개선하는 것을 지칭한다. "관해"에는 증상의 지속 기간을 단축하거나 줄이는 것도 포함된다.
"통증"이라는 용어는 급성 및 만성 통증 뿐만 아니라 염증 성분이 있는 임의의 통증을 포함하는 임의의 병인을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "통증"은 통증에 대한 통각 및 지각을 포함하며, 통증 점수 및 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 통증을 객관적으로 및 주관적으로 평가할 수 있다.
"통각과민"이라는 용어는 일반적으로 유해하거나 불쾌한 자극에 대한 신체의 증가된 통증 반응을 지칭한다.
1.2 본 발명의 예시적인 항-NGF 항체 TRN1027의 서열
[표 I]
항체 TRN1027 의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열:
Figure pct00003
서열번호 9
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
서열번호 10
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
[표 II]
항체 TRN1027 의 CDR 서열:
Figure pct00004
실시예
하기 실시예는 본 발명을 추가로 예시하지만, 실시예는 제한이 아니라 예시의 방식으로 기재되었으며 다양한 변형이 당업자에 의해 이루어질 수 있음을 이해해야 한다.
달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 본 발명의 실행은 당업계의 기술 내에서 화학, 생화학, 유기 화학, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 기술, 유전학, 면역학 및 세포 생물학의 통상적인 방법을 사용할 것이다. 이러한 방법은 예를 들어 샘브룩(Sambrook) 등의 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed. 2001)]; 샘브룩 등의 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed. 1989)]; 마니아티스(Maniatis) 등의 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982)]; 어수벨(Ausubel) 등의 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, updated in July 2008)]; 문헌[분자 생물학에서의 짧은 프로토콜: 분자 생물학의 현재 프로토콜의 방법 개요(Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology), Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience]; 글로버(Glover)의 문헌[DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I&II(IRL Press, Oxford, 1985)]; 어난드(Anand)의 문헌[Techniques for Analysis of Complex Genomes(Academic Press, New York, 1992)]; 문헌[전사 및 번역(Transcription and Translation)(B. Hames&S. Higgins, Eds., 1984)]; 페르발(Perbal)의 문헌[A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)]; 하로우(Harlow) 및 레인(Lane)의 문헌[Antibodies(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998)]; 문헌[Current Protocols in Immunology Q.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach and W. Strober, eds., 1991]; 면역학의 연례 검토(Annual Review of Immunology); 면역학의 발전(Advances in Immunology)과 같은 학술지 논문에 기재되어 있다.
하기 실시예는 본 발명의 방법 및 조성물을 어떻게 제조하고 사용하는지에 대한 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제시되며 청구된 범위를 제한하려는 것이 아니다.
실시예 1. 인간 항-NGF 항체의 제조
1) PBMC 분리
다양한 질환이 있는 환자들에게 뮤린 신경 성장인자(JINLUJIE)를 주사하고 30일 동안 공동 치료하고(의사의 권고에 따라), 10 ㎖의 말초혈액을 헤파린이 함유된 항응고 튜브에 채혈하고, 혈장과 PBMC 세포를 밀도 원심분리에 의해 분리하였다. 구체적인 작업은 다음과 같다: 10 ㎖의 정맥 혈을 채취하여 400 g, 22℃에서 15분 동안 원심분리하였고; 원심분리 후 상청액 투명 혈장 층을 흡인하고 동결보존을 위해 -80℃에서 분배하였고; 나머지 부분을 동일한 양의 RPMI1640 배양 배지와 혼합하였고; 혼합물을 림프구 분리 용액 피콜(Ficoll)이 함유된 멸균 원심분리 튜브에 천천히 첨가하고 액면 층을 온전히 유지하였고; 2000 rpm의 수평 원심분리를 20분 동안 수행하였고; 흐린 층에 위치한 PBMC 세포를 모세관을 사용하여 흡입하고, 다른 멸균 원심분리 튜브에 넣고, 5배 부피의 RPMI1640 배양 배지를 첨가하였고; 10분 동안 1500 rpm의 원심분리를 수행하였고; 두 번 세척을 반복한 후 세포를 계수하고, 나중에 사용하기 위해 1×107 세포/튜브로 -80℃에서 동결 보존하였다.
2) 항-NGF 항체 역가 검출
HNGF[시노 비아올로지칼(Sino Biological)]를 pH 9.6의 인산염 코팅 완충액으로 2 ㎍/㎖로 희석하고, 96-웰 플레이트에 0.1 ㎖/웰로 첨가하고, 4℃에서 밤새 코팅하고, 차단 완충액으로 2시간 동안 37℃에서 차단하였다. 100 ㎕의 연속 희석된 혈장 샘플을 1차 항체로 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그런 다음 HRP 염소 항-인간 IgG(1:10000로 희석)로 표지된 2차 항체를 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그런 다음 100 ㎕/웰의 기질 현상 용액 TMB를 첨가하였다. 37℃ 암소에 5분간 놓아둔 후 2M 황산으로 반응을 중단시키고 OD450 값을 판독하였다. 결과는 샘플 Ns006이 더 높은 흡광도를 가짐을 나타내었고(도 1), 이는 Ns006의 혈청 샘플에서 항-NGF 항체 역가가 더 높고 hNGF에 결합할 수 있음을 나타낸다. 그런 다음 Ns006 샘플로 표지된 PBMC를 유동-분류하였다.
3) 유세포 분석에 의한 단일 형질 세포 분류
상기 혈청학적 시험 결과에 따라, Ns006 샘플의 PBMC로부터 단일 형질 세포를 유세포 분석법으로 분류하였다[BD, 팩스 아리아 소프(Facs Aria Sorp)]. 게이팅된(gated) CD3/ CD14/ CD16/ cd235a- CD19+ CD20+/- CD38hi CD27hi는 PBMC에서 특정 세포 집단을 분류하도록 설정되었다. hNGF 단백질에 특이적인 기억 형질 세포의 세포 집단(> 3%)을 분류하였다. 각 웰이 하나의 형질 세포를 포함하도록 개별 형질 세포를 96-웰 PCR 플레이트(웰당 20 ㎕의 단일 세포 용해물)에 도말하고, 나중에 사용하기 위해 -80℃ 냉동고에 보존하였다.
4) 개별 형질 세포로부터 항체 가변 영역 유전자의 단리
먼저, 불변 영역 프라이머(CN 제107760690B호에 개시된 프라이머 정보 참조) 및 수퍼스크립트(Superscript) III 역전사효소[인비트로겐(Invitrogen), 캐나다 칼스바드 소재]를 사용하여 실시예 1의 단계 3)에서 수득된 기억 형질 세포로부터 역전사에 의해 cDNA의 제1 가닥을 합성하였다. 이어서, 항체 유전자를 하기 기재된 PCR 절차에 의해 단리하였다.
제1 라운드 PCR: 50 ㎕ 시스템, 5 ㎕의 역전사 반응 생성물, 25 ㎕의 Taq 효소 믹스, 25 μM의 각 서브타입 중쇄 및 경쇄 항체 불변 영역 프라이머 첨가. 반응 조건:
95℃에서 5분 동안 사전 변성;
주기 조건: 94℃에서 30초 변성, 55℃에서 60초 어닐링, 및 72℃에서 90초 연장; 35회 주기 반복;
마지막으로 72℃에서 7분 동안 연장을 수행하였다. 반응 생성물을 PCR 반응의 제2 라운드에 사용하였다.
제2 라운드 PCR: 50 ㎕ 시스템, 3 ㎕의 제1 라운드 PCR 반응 생성물, 25 ㎕의 Taq 효소 믹스, 20 μM의 각 서브타입 중쇄 및 경쇄 항체 가변 영역 프라이머 첨가. 반응 조건:
95℃에서 5분 동안 사전 변성;
주기 조건: 94℃에서 30초 동안 변성, 58℃에서 60초 동안 어닐링(또는 64℃에서 60초 동안 람다 쇄 어닐링), 72℃에서 90초 동안 연장; 35회 주기 반복;
마지막으로 72℃에서 7분 동안 연장을 수행하였다. 수득된 PCR 산물을 1.2% 아가로스겔 전기영동으로 식별하여 가변 영역 유전자를 수득하였다. 그의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 VH는 서열번호 7에 제시되고 그의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열 VL은 서열번호 8에 제시된다.
5) 재조합 항체 발현 벡터의 구축, 발현 및 정제
하나의 예에서, 위에서 식별된 항체 가변 영역 유전자의 PCR 산물을, 인간 항-NGF 항체를 위한 발현 벡터를 구축하기 위해 통상적인 방법을 사용하여 인간 IgG 불변 영역을 함유하는 pcDNA3.1 +/C-(K)-DYK 플라스미드 내로 클로닝하였다. 그런 다음 발현 벡터를 벡터 증폭을 위해 에스케리치아 콜라이 DH5α 컴피턴트(competent) 박테리아로 형질전환시킨다. 벡터(재조합 플라스미드)를 추출하였다. 수득된 재조합 플라스미드를 HEK293 세포에 공동 형질감염시켰다. 그런 다음 HEK293 세포를 배양하고 통상적인 방법에 따라 항체를 발현시켰다. 배양 상청액을 수집하고 4000 rpm에서 1시간 동안 원심분리하였다. 상청액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. 정제된 항체를 SDS-PAGE에 의해 발현 및 정제에 대해 시험하였다. SDS-PAGE 시험 결과 항체가 성공적으로 발현된 것으로 나타났다. 항체는 TRN1027로 명명되었으며, 상대 분자량은 약 180KD이고, 중쇄는 약 55KD이며, 경쇄는 약 30KD이었다.
실시예 2. 항체 결합 활성 분석
항체 TRN1027은 ELISA 분석에 의해 hNGF에 대한 결합 활성에 대해 시험되었다. 구체적으로, 항원으로서 2 ㎍/㎖의 hNGF를 희석하고 4℃에서 밤새 96-웰 플레이트에서 pH 9.6의 탄산염 완충액으로 코팅하였고; 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 차단 용액으로 차단하였다. 항체 TRN1027은 10 ㎍/㎖에서 시작하여 차단 용액으로 연속 희석되었으며, 12개 구배를 위해 3배 희석되었고, 이후 항체 TRN1027의 각 구배를 96-웰 플레이트에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 PBST 완충액으로 세척하고, 100 ㎕/웰의 LHRP 표지된 염소 항-인간 IgG를 첨가하고(1:10000), 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 PBST 완충액으로 세척하고 100 ㎕/웰의 TMB 현상 용액을 빛의 차단하에 첨가하고, 37℃에서 5분 동안 놓아 두었다. H2SO4를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 검출을 450 nm 파장에서 수행하였다. 결과를 계산하고 분석하였다. 이 실험에서는 선행 기술에 개시되고 효과가 좋은 항-NGF 항체 타네추맙(Tanezumab)(CAS No. 880266-57-9, CN 제102746399B호에 공개됨, E3으로도 알려짐)을 양성 대조군으로 사용하였다.
결과는 다음을 보여주었다(도 2 참조): hNGF에 대한 E3 결합의 EC50은 2.96 ng/㎖이지만; 본 출원의 인간 항-NGF 항체 TRN1027은 1.067 ng/㎖의 EC50으로 hNGF에 결합하는데, 이는 인간 항-NGF 항체 TRN1027이 강한 결합 활성을 가짐을 나타낸다.
실시예 3. 항체의 결합 친화도
항체 친화도라고 하는 항체와 항원 결정기 사이의 결합력은 항원 결정기에 결합하는 항체 분자의 능력을 반영한다. 본 실시예에서, 표면 플라즈몬 공명 분석(BIACORE3000)을 사용하여 항체 TRN1027의 항원 결합 친화도를 검출하였다. 항-인간 IgG(Fc) 항체를 아미노 커플링 방법에 의해 CM5 센서 칩(GE) 표면에 고정화시켰다. 항-NGF 항체를 리간드로서 포획하였고, 포획 수준은 약 400RU에 도달하였다. 상이한 농도의 hNGF 단백질을 분석물 스트림으로서 검출 채널을 통해 통과시켰다. 항체에 대한 항원의 결합 및 결합된 복합체의 해리를 실시간으로 모니터링하였다. 비아코어(Biacore) X100 평가 소프트웨어(2.0.1)를 사용하여 동역학 분석(해리 상수(KD) 계산)을 수행하였다.
도 3의 결과는 TRN1027의 해리 상수가 1.68E-11M 정도로 낮음을 보여주고, 이는 항체 TRN1027이 항원 hNGF에 대한 강한 결합 친화도를 갖고 있음을 나타낸다.
실시예 4. 항체의 중화 활성
본 실시예에서 TF-1 세포(인간 적백혈병 세포)를 사용하여 NGF 의존성 TrkA 수용체 매개 세포 증식 활성을 차단하는 항-NGF 항체의 능력을 시험하였다[쉐발리어(Chevalier) 등의 문헌 "Blood (1994), 83(6): 1479-1485"]. NGF는 TrkA에 결합할 수 있다. TrkA는 NGF에 대한 고친화성 수용체로서 NGF와 결합한 후 이량체를 형성하고, 이는 세포내 도메인 티로신 키나제 도메인을 활성화하고 상응하는 티로신 인산화를 일으킴으로써, 다운스트림 신호 전달 시스템을 활성화하고 표적 세포를 조절하는 기능을 수행하며, 따라서 TF-1 세포의 증식을 유도한다.
대수기의 TF-1 세포(ATCC, CRL-2003(상표명))를 37℃에 놓아 두고 5% CO2에서 24시간 동안 기아 상태로 만들었다. 32 ng/㎖ 농도의 NGF 용액을 최소 배지로 제조하고 96-웰 플레이트에 웰당 25 uL의 양으로 첨가하였다. 최소 배지에 의해 출발 농도서 6 μg/㎖ 농도의 본 발명의 항체 용액을 제조한 후, 3배 희석하여 8개 농도 구배를 수득하였다. 96-웰 플레이트의 각 웰에 인간 항-NGF 항체의 연속 희석액 25 uL을 첨가하고 37℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 96-웰 플레이트의 각 웰에 50 uL의 TF-1 세포를 6×105/㎖ 밀도로 첨가하고, 24시간 동안 기아 상태로 만들었다. 최종 hNGF 농도는 8 ng/㎖였고 최종 세포 밀도는 3×105/㎖였다. 72시간 동안 항온처리한 후, 플레이트에 MTS 시약을 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 항온처리하였다. 검출을 수행하였다. 항체 농도에 대한 신호 의존성은 E3 항체를 대조군으로 하여 흡광도에 의해 항체 TRN1027의 EC50을 계산함으로써 분석하였다.
결과(도 4)는 항체 TRN1027 및 대조군 E3 항체에 대한 용량-반응 곡선이 전형적인 S-형 용량-반응 곡선임을 보여주었다. 계산 결과, 항체 TRN1027 및 대조군의 EC50이 각각 3.01 ng/㎖ 및 14.35 ng/㎖인 것으로 나타났다. 본 발명의 항체는 보다 우수한 중화 활성으로 TF-1 세포의 NGF 유도 증식을 억제하는 것으로 나타났다.
추가로, 본 실시예에서는 PC-12 세포를 이용하여 항체 TRN1027의 중화 활성 또한 검사하였다. PC-12 세포주는 이식 가능한 뮤린의 크롬친화성 세포종에서 유래하고 NGF에 대해 가역적인 신경 표현형 반응을 나타낸다. 이 세포주는 NGF 수용체 TrkA를 고도로 발현한다. PC-12 세포는 생리학적 수준의 NGF에 의해 유도되어 교감 신경 세포 특징을 가진 세포로 분화되며, 이는 종종 성장 인자 관련 기작 및 신경 분화 연구를 분석하는 데 사용된다.
먼저, PC-12 세포의 염기성 배지로 32 ng/㎖의 NGF 용액을 준비하고, 96-웰 편평 바닥 세포 배양 플레이트에 웰당 25 uL를 첨가하였다. 최소 배지에 의해 출발 농도로서 6 μg/㎖ 농도에서 본 발명의 항체 용액을 제조한 후, 3배 희석하여 8개 농도 구배를 수득하였다. 96-웰 플레이트의 각 웰에 본 발명의 인간 항-NGF 항체의 연속 희석액 25 uL를 첨가하고 37℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 그런 다음, 96웰 플레이트의 각 웰에 PC-12 세포 50 uL를 2×105/㎖ 밀도로 첨가하고 추가로 48시간 동안 배양하였다. 셀타이터-글로 화학발광 세포 생존력 분석 키트(Celltiter-Glo chemiluminescent cell viability assay kit)를 사용하여 결과를 검출하고 계산하였다.
NGF는 TrkA에 결합하여 PC-12 세포의 분화 및 시냅스 형성을 촉진하고, PC-12 세포의 대사 활성을 향상시킨다. 빛 신호는 시스템의 ATP 양에 비례하고 ATP는 살아있는 세포 수와 양의 상관관계가 있다. 따라서 ATP의 양을 측정하여 세포의 활성을 결정할 수 있다. 계산된 결과는 TRN1027 및 E3의 용량-반응 곡선이 각각 8.826 ng/㎖ 및 32.21 ng/㎖의 EC50을 갖는 전형적인 S자 용량-반응 곡선임을 보여주었다. 본 발명의 항체는 보다 높은 중화 활성을 가지며, NGF를 중화시키고 그의 결합 수용체 TrkA를 차단함으로써 NGF에 의해 유도된 PC-12 세포의 분화를 억제할 수 있는 것으로 보여진다.
실시예 5. 항체와 BDNF, NT-3 및 NT-4의 교차 반응
본 발명은 ELISA에 의해 다른 뉴로트로핀에 대한 항체 TRN1027의 교차 반응성을 결정한다. HBDNF, hNT-3 및 hNT-4[앱신(Absin)]를 각각 4℃에서 밤새 200 μg/웰로 96-웰 플레이트를 코팅하기 위한 항원으로 사용하였다. 그런 다음 플레이트를 주변 온도에서 2시간 동안 차단 용액으로 차단하였다. 플레이트에 100 ul/웰에서 농도를 감소시키면서(10 μg/㎖-0 μg/㎖ 범위) 항체 TRN1027을 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 염소-항-인간 IgG-HRP(1:10000) 및 기질 현상 용액을 사용하여 TMB에 의해 항체 TRN1027을 검출하였다. OD 값을 450-630 nm의 이중 파장에서 측정하였다.
결과에 따르면 각 농도의 항체 TRN1027은 hBDNF, hNT-3 및 hNT-4에 결합하지 않아 NGF 항체가 BDNF, NT-3 및 NT-4와 교차 반응하지 않았다. NT-3, NT-4 및 BDNF는 모두 신경영양 계열에 속하며, 이들은 아미노산 서열, 공간 구조, 생물학적 기능에서 NGF와 높은 상동성을 가지고 있다. 본 발명자들은 본 발명의 항-NGF 항체가 다른 신경영양 인자의 생물학적 활성을 방해하지 않으면서 NGF에만 특이적으로 결합한다고 생각한다. 이러한 특징은 항체의 임상적 적용에서 보다 직접적인 치료학적 효과를 나타낼 수 있다.
실시예 6. 항체의 항통각과민 활성
통증 조절에서 항체 TRN1027의 역할을 평가하기 위해 다음 실험을 수행하였다.
마우스(C57BL/6N, 수컷)를 선발하고, VonFrey(IITC) 섬유를 이용하여 왼쪽 뒷발의 발바닥 측면의 기계적 움츠림 역치(MWT: Mechanical Withdrawal Threshold)를 3회 측정하고, 3회의 평균값을 기본 통증 역치로 하였다. 다음날(1일), 블랭크 대조군을 제외한 나머지 마우스 군에 대하여 염증을 유도하기 위해 왼쪽 뒷발의 발바닥 측면에 30 ㎕의 CFA(3 mg/㎖)를 발바닥내에 주사하였다. 24시간 후(2일), 마우스의 왼쪽 뒷발 MWT를 동일한 방법으로 3회 검출하였고, 평균값을 투여 전 통증 역치로 하였다. MWT가 너무 크거나 너무 작은 동물은 제외되었다. 45마리의 동물을 선별하고 평균 MWT 값에 따라 5개 군(n = 9)으로 나누었다. 그런 다음, 동물에게 PBS 또는 시험 물질을 피하 주사하였다: 첫 번째 군은 PBS가 투여된 블랭크 대조군이었고; 두 번째 군은 PBS가 투여된 모델 대조군이었으며; 세 번째, 네 번째 및 다섯 번째 군에는 TRN1027, E3 및 음성 대조군 항체를 각각 10 mg/kg으로 투여하였다. 투여 후 24시간(3일), 48시간(4일), 및 72시간(5일)에 통증 역치를 측정하고, 투여 후 통증 역치 증가율을 계산하였다.
퍼센트 통증 역치 증가율 = (MWT 투여 군 - MWT 모델 군)/MWT 모델 군 × 100%.
단일 피하 주사 24시간 후 TRN1027, E3 및 음성 대조군의 마우스 간에 MWT 값에 유의한 차이는 없었다. MWT 값은 TRN1027 군과 E3 군이 모델 군보다 유의하게 더 높았고(P <0.01-0.001), 통증 역치 증가율은 각각 28.77% 및 26.03%였다. 투여 72시간 후 TRN1027 및 E3 군의 MWT는 여전히 모델 군에 비해 통계적으로 유의한 차이를 보였고(P <0.01-0.001), 통증 역치 증가율은 20% 이상이었다. 음성 대조 항체 군의 MWT 값은 모델 군보다 약간 더 높았으나 그 차이는 통계적 유의성이 없었다(P >0.05)(도 5, 표 1). 따라서, 이는 항체 TRN1027은 CFA에 의해 유도된 염증 반응에 대하여 유의한 통증 완화 및 치료 효과가 있음, 즉 본 발명의 인간 항-NGF 항체는 항통각과민 활성을 갖는다는 것을 보여주었다.
[표 1]
단일 피하 주사 투약 후 CFA 유도 염증 반응에 대한 통증 역치
Figure pct00005
SEQUENCE LISTING <110> Trinomab Biotech Co., Ltd. <120> Anti-human nerve growth factor antibody <130> MTPIKR220406 <140> PCT/CN2021/087014 <141> 2021-04-13 <150> CN 202010305924.8 <151> 2020-04-17 <160> 10 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 <400> 1 Gly Asp Ser Met Asn Ser Gly Gly Tyr Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 <400> 2 Ile Tyr Tyr Ser 1 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 <400> 3 Ala Arg Thr Leu Trp Phe Gly Glu Phe Glu Gly Phe Asp Pro 1 5 10 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 <400> 4 Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Phe 1 5 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR2 <400> 5 Glu Val Ser 1 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 6 Ser Ser Phe Ala Gly Ser Asn Asn Phe Val Phe 1 5 10 <210> 7 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 7 Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ser Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Asp Ser Met Asn Ser Gly 20 25 30 Gly Tyr Ser Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr His Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Glu Ser Arg Val Thr Leu Ser Leu His Arg Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Phe Leu Gln Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Thr Leu Trp Phe Gly Glu Phe Glu Gly Phe Asp Pro Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 8 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Phe Val Ser Trp Tyr Gln His His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Leu Tyr Glu Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ser Ser Phe Ala Gly Ser 85 90 95 Asn Asn Phe Val Phe Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 9 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain constant region <400> 9 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 10 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain constant region <400> 10 Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15 Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp 20 25 30 Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro 35 40 45 Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn 50 55 60 Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys 65 70 75 80 Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 85 90 95 Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105

Claims (20)

  1. 서열번호 7에 제시된 중쇄 가변 영역의 3개의 상보성 결정 영역(CDR: complementarity determining region) 및 서열번호 8에 제시된 경쇄 가변 영역의 3개의 CDR을 포함하는, 인간 신경 성장 인자(NGF: nerve growth factor)에 특이적으로 결합하는 인간 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  2. (a) 서열번호 1의 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 2의 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 3의 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 서열번호 4의 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 5의 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 6의 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, 인간 신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하는 인간 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    중쇄 가변 영역이
    (1) 제1항 또는 제2항에 따른 중쇄 CDR을 포함하고 서열번호 7에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 서열; 및
    (2) 서열번호 7을 포함하는 서열
    로부터 선택되는, 항-NGF 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    경쇄 가변 영역이
    (1) 제1항 또는 제2항에 따른 경쇄 CDR을 포함하고 서열번호 8에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 서열; 및
    (2) 서열번호 8을 포함하는 서열
    로부터 선택되는, 항-NGF 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 인간 단일클론성 항체인, 단리된 항-NGF 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 단편이 Fab, Fab'-SH, Fv, scFv 및 (Fab')2 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단리된 항-NGF 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    불변 영역 서열을 포함하고, 이때 상기 불변 영역 서열의 적어도 일부가 인간 컨센서스(consensus) 불변 영역 서열인, 단리된 항-NGF 단일클론성 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체의 중쇄 불변 영역이 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 불변 영역이 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항-NGF 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자.
  10. 제9항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터인 벡터.
  11. 제10항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포, 바람직하게는, 원핵 세포 또는 진핵 세포인 숙주 세포, 보다 바람직하게는, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 세포, 효모 세포, 포유동물 세포, 예컨대 CHO 세포, HEK293 세포, COS 세포, 및 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 생산에 적합한 기타 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 숙주 세포.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항-NGF 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 발현에 적합한 조건 하에 제11항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계;
    선택적으로, 항-NGF 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 단리하는 단계; 및
    선택적으로, 생성된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 수집하는 단계
    를 포함하는, 항-인간 NGF 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제조하는 방법.
  13. 제12항에 따른 방법에 의해 제조되는 항-NGF 단일클론성 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  14. 제1항 내지 제8항 및 제13항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  15. NGF에 의해 매개된 질환 또는 병태를 완화, 개선 또는 억제하기 위한 약제의 제조에 있어서, 제1항 내지 제8항 및 제13항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 용도.
  16. 제15항에 있어서,
    NGF에 의해 매개된 병태 또는 질환이 통증, 관절염, 콜라겐 혈관 질환, 탈수초 질환, 기도 염증 질환, 신경 질환, 당뇨병과 같은 대사 질환, 바이러스 감염과 연관된 질환, 심장 박동 장애, 건선 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 용도.
  17. 제16항에 있어서,
    NGF에 의해 매개된 병태 또는 질환과 연관된 통증이 병리생리학적 통증인, 용도.
  18. NGF-관련 장애 또는 질환과 연관된 통증을 완화 또는 억제하기 위한 제2 치료제와의 공동-치료에 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서, 제1항 내지 제8항 및 제13항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 용도.
  19. 제18항에 있어서,
    제2 치료제가 다른 뉴로트로핀(neurotrophin), 진통제, 소염제, 화학치료제 및 면역치료제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 용도.
  20. 샘플을 제1항 내지 제8항 및 제13항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는, 샘플에서 NGF의 비정상적인 발현을 검출하는 방법.
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