MX2011005939A - Anticuerpos monoclonales anti-ferroportina 1 y usos de los mismos. - Google Patents

Anticuerpos monoclonales anti-ferroportina 1 y usos de los mismos.

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Abstract

Se proveen anticuerpos monoclonales y sus fragmentos de unión a antígeno que se unen a, e inhiben la actividad de FPN1 humano, y que son efectivos en mantener o incrementar el transporte de hierro fuera de células mamíferas y/o mantener o incrementar el nivel de hierro en suero, conteo de reticulocitos, conteo de glóbulos rojos, hemoglobina, y/o hematocrito en un sujeto in vivo.

Description

ANTICUERPOS MONOCLONALES ANTI-FERROPORTINA 1 Y ÜSOS DE LOS MISMOS La presente invención describe anticuerpos que unen ferroportina 1 (FPNl) y su uso en tratamiento de anemia.
Hierro es un elemento de traza esencial que se requiere para numerosas funciones celulares. En mamíferos, el suministro de hierro al cuerpo se regula para igualar los requerimientos de hierro del cuerpo en el nivel de absorción de hierro por enterocitos duodenales. El transporte de hierro a través de la membrana basolateral del enterocito se piensa que está mediado por ferroportina I (también conocida como transportador I hierro- egulado (IREG-1) , proteína transportadora de metal 1 (MTP1) y SLC40A1) , más adelante referida como FPNl.
FPNl es conocida por ser un receptor para hepcidina, una hormona de polipéptido producida por el hígado en respuesta a los depósitos de hierro e inflamación. La unión de hepcidina madura a FPNl conduce a la absorción y degradación de FPNl, la prevención de exportación de hierro celular, y es un principal factor de control de homeostasis de hierro sistémico.
La patente de E.U.A. No. 7,166,448 describe, inter alia, secuencias de nucleótido que codifican las proteínas FPNl humanos, proteínas FPNl humanos que tienen función de transporte de hierro, y un antisuero policlonal de conejo generado para un péptido que consiste de los aminoácidos 19 C-terminales de la FPNl humano. La publicación de solicitud de patente internacional PCT No. WO2009/094551 describe Mabs de ferroportina y métodos para usarlos en el tratamiento de trastornos de homeostasis de hierro. Más específicamente, WO2009/094551 describe anticuerpos monoclonales completamente humanos y de roedores para varios epítopes de proteínas FPNl humanos .
En vista de la participación de FPNl en el transporte de hierro y la asociación de mutaciones de FPNl con enfermedades de homeostasis de hierro, aquí existe una necesidad para los antagonistas de FPNl terapéuticamente útiles que unen con alta afinidad a un epítope extracelular de FPNl y, en unión, inhiben la absorción de FPNl mediada por hepcidina madura, con lo cual se mantiene o aumenta la exportación de hierro de depósitos intracelulares . De manera adicional, el direccionamiento de FPNl terapéuticamente con un Mab, o su fragmento de unión a antígeno, con el objetivo de inhibir la unión a un epítope extracelular de hepcidina madura se debe realizar precisamente de manera suficiente de modo que el anticuerpo no perturbe significativamente el eflujo de hierro celular y/o induzca la absorción en la unión a su objetivo. De manera adicional, un anticuerpo anti-FPN destinado al uso en terapia médica humana debe exhibir suficientes características farmacocinéticas y farmacodinámicas, incluyendo estabilidad in vivo o vida media de eliminación para permitirse su uso terapéutico. Uno o más de los anticuerpos FPNl antihumano descritos aquí unen a FPNl humano, incluyendo al menos un fragmento de péptido del mismo, seleccionado del grupo consistente de: a) 403SPFEDIRSRFIQGESITPTK422 (SEQ ID NO: 12); b) 406EDIRSRFIQGESIT4i9 (SEQ ID NO: 13) ; C) 409RSRFIQGESITPTK422 (SEQ ID NO: 14) ; d) 403SPFEDIRSRFIQG4i5 (SEQ ID NO: 15) ; e) 409RSRFIQGESIT41S, (SEQ ID NO: 16) y f ) 409RSRFIQG4i5 (SEQ ID NO: 95) , bloquea la unión de hepcidina a ferroportina, inhibiendo potentemente la actividad in vitro de hepcidina, eleva los niveles de hierro en suero de una manera dependiente de dosis in vivo, y tiene solubilidad aceptable, estabilidad in vivo, y eliminación de características de vida media, haciéndolos agentes útiles para el tratamiento y/o prevención de anemia en el sujeto en necesidad de tal tratamiento por administración vía infusión intravenosa o,qiuzá entonces, por inyección subcutánea De esta manera, entre sus varios aspectos, la presente invención provee: Anticuerpos monoclonales, o sus fragmentos de unión a antígeno, que unen a FPNl humano que consiste de la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 1 y un fragmento de epítope del mismo que comprende un aminoácido o aminoácidos localizados en una o más secuencias de aminoácido seleccionadas del grupo consistente de: a) 403SPFEDIRSRFIQGESITPTK422 (SEQ ID NO: 12) ; b) 406EDIRSRFIQGESIT419 (SEQ ID NO: 13); C) 409RSRFIQGESITPTK422 (SEQ ID NO: 14) ; d) 403SPFEDIRSRFIQG415 (SEQ ID NO: 15); e) 409RSRFIQGESIT419 (SEQ ID NO: 16) y f) 409RSRFIQG4i5 (SEQ ID NO: 95) En algunas modalidades, la presente invención provee Mabs, o sus fragmentos de unión a antígeno, que comprenden una LCDRl, LCDR2, LCDR3, HCDRl, HCDR2 , y HCDR3 que comprenden la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NOs : 37, 129, 22, 107, 118 y 120, respectivamente, y el Mab, o fragmento de unión a antígeno, unen FPN 1 humano que consiste de la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 1 en un epítope que comprende un aminoácido o aminoácidos localizados para una secuencia de aminoácido como se muestra en SEQ ID NO 12 con un KD de aproximadamente 100 nM o menos como se determina por resonancia de plasmon superficial (SPR) , preferiblemente, a 25°C para Mabs y 37°C para Fabs.
En algunas modalidades, el Mab, o su fragmento de unión a antígeno, comprende seis CDRs seleccionadas del grupo que consiste de: (i) LCDR1, LCDR2 , LCDR3 , HCDR1 , HCDR2 y HCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácido mostradas en SEQ ID NOs: 20, 32, 33, 30, 31 y 19, respectivamente; (ii) LCDR1, LCDR2 , LCDR3 , HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácido mostradas en SEQ ID NOs : 42, 32, 33, 30, 43 y 19, respectivamente; (Üi) LCDR1, LCDR2, LCDR3 , HCDR1 , HCDR2 y HCDR3 que comprenden la secuencias de aminoácido mostradas en SEQ ID NOs: 42, 27, 22, 23, 41 y 19 respectivamente; (iv) LCDR1, LCDR2, LCDR3 , HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácido mostradas en SEQ ID NOs: 42, 32, 33, 23, 41 y 19, respectivamente; (v) LCDR1, LCDR2, LCDR3 , HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácido mostradas en SEQ ID NOs : 20, 21, 22, 17, 18 y 19, respectivamente; (vi) LCDR1, LCDR2, LCDR3 , HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácido mostradas en SEQ ID NOs: 20, 27, 29, 23, 24 y 19, respectivamente; (vii) LCDR1, LCDR2, LCDR3 , HCDR1 , HCDR2 y HCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NOs : 37, 27, 22, 23, 41 y 19, respectivamente; (viii) LCDR1, LCDR2, LCDR3 , HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácido mostradas en SEQ ID NOs: 170, 171, 172, 182,173 y 19, respectivamente; (ix) LCDR1, LCDR2, LCDR3 , HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácido mostradas en SEQ ID NOs: 37, 127, 22, 23, 116 y 19, respectivamente; (x) LCDR1, LCDR2 , LCDR3 HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácido mostradas en SEQ ID NOs: 37, 125, 22, 23, 110, y 19, respectivamente; (xi) LCDR1, LCDR2, LCDR3 , HCDR1 , HCDR2 y HCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácido mostradas en SEQ ID NOs: 37, 122, 22, 23, 110, y 19, respectivamente; (xii) LCDR1, LCDR2, LCDR3 , HCDR1 , HCDR2 , y HCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácido mostradas en SEQ ID NOs: 37, 129, 22, 107, 118 y 120, respectivamente ,- (Xiii) LCDR1, LCDR2, LCDR3 , HCDR1, HCDR2 , y HCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácido mostradas en SEQ ID NOs: 37, 128, 22, 105, 41 y 119, respectivamente; (xiv) LCDR1, LCDR2 , LCDR3 , HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácido mostradas en SEQ ID NOs : 37, 174, 22, 175, 176 y 120, respectivamente; (XVÍ) LCDR1, LCDR2, LCDR3 , HCDR1 , HCDR2 y HCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácido mostradas en SEQ ID NOs: 37, 128, 22, 105,117 y 19, respectivamente; y (XVÜ) LCDR1, LCDR2, LCDR3 , HCDR1 , HCDR2 y HCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácido mostradas en SEQ ID NOs; 37, 177, 22, 23, 112 y 19, respectivamente, y unión de FPN1 humano que consiste de la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 1 en un epítope que consiste de o consiste esencialmente de un aminoácido o aminoácidos localizados para una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de: a) 403SPFEDIRSRFIQGESITPTK422 (SEQ ID NO: 12) b) 406EDIRSRFIQGESIT419 (SEQ ID NO: 13); c) 409RSRFIQGESITPTK422 (SEQ ID NO: 14); d) 403SPFEDIRSRFIQG415 (SEQ ID NO: 15) ; e) 409RSRFIQGESIT419 (SEQ ID NO: 16) ; y f) 409RSRFIQG4i5 (SEQ ID NO: 95) con un KD de aproximadamente 100 nM o menor como se determina por SPR, preferiblemente, a 25°C para Mabs y 37°C para Fabs .
En modalidades particulares, los Mabs, o su fragmento de unión a antígeno, inhiben la absorción inducida por hepcidina y/o degradación de FPNl humano, con lo cual mantiene o incrementa 1) el transporte de hierro fuera de las células; 2) el nivel de hierro en suero, 3) conteo de reticulocitos , 4) conteo de glóbulos rojos, 5) hemoglobina, y/o 6) hematocrito en un sujeto, preferiblemente, un sujeto humano, por al menos aproximadamente 10% comparado a aquellos de dicho sujeto en la ausencia de dicho Mab, o su fragmento de unión a antígeno.
En otro aspecto, polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótido que codifica Mabs de FPNl anti-humano, o sus fragmentos de unión a antígeno, de la presente invención se proveen.
En otro aspecto, se proveen composiciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los Mabs, o sus fragmentos de unión a antígeno, descritos aquí y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. También se provee 1) el uso de los Mabs, o sus fragmentos de unión a antígeno, descritos aquí en terapia, preferiblemente, una terapia para el tratamiento o prevención de anemia, 2) el uso de los Mabs, o sus fragmentos de unión a antígeno, descritos aquí en terapia de combinación, preferiblemente, una terapia de combinación para el tratamiento o prevención de anemia, 3) el uso de Mabs, o sus fragmentos de unión a antígeno, descritos aquí para el tratamiento o prevención de anemia, mantenimiento o incremento de niveles de hierro en suero, conteo de reticulocitos, conteo de glóbulos rojos, hemoglobina, y/o hematocrito en un sujeto, preferiblemente un humano, 4) el uso de los Mabs, o sus fragmentos de unión a antígeno, descritos aquí para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de anemia, mantenimiento o incremento de niveles de hierro en suero, conteo de reticulocitos, conteo de glóbulos rojos, hemoglobina y/o hematocrito en un sujeto, preferiblemente, un humano, y 5) el uso de los Mabs, o sus fragmentos de unión a antígeno, descritos aquí en la fabricación de un medicamento para el uso en terapia de combinación para el tratamiento o prevención de anemia, que incrementa niveles de hierro en suero, conteo de reticulocitos, conteo de glóbulos rojos, hemoglobina y/o hematocrito en un humano, en donde dicho medicamento es para ser administrado en combinación con uno o mas ESA u otro agente terapéutico o tratamiento terapéutico convencionalmente empleado para tratar anemia, mantener o incrementar niveles de hierro en suero, conteo de reticulocitos, conteo de glóbulos rojos, hemoglobina y/o hematocrito en un humano.
En aún otro aspecto, se proveen métodos para 1) mantener o incrementar niveles de hierro en suero, conteo de reticulocitos, conteo de glóbulos rojos, hemoglobina y/o hematocrito en un sujeto, preferiblemente, un humano, que comprenden la administración a un sujeto en su necesidad de una cantidad efectiva de un Mab, o su fragmento de unión a antígeno, descrito aqui, 2) tratamiento o prevención de anemia, incluyendo, pero sin limitarse a anemia de enfermedad crónica, anemia de cáncer, y anemia de inflamación, que comprende la administración a un sujeto, preferiblemente, un humano, en su necesidad de una cantidad efectiva de un Mab, o su fragmento de unión a antígeno, descrito aquí, 3) un método de tratamiento o prevención de anemia, incluyendo, pero sin limitarse a anemia de enfermedad crónica, anemia de cáncer, y anemia de inflamación, que comprende la administración a un sujeto, preferiblemente, un paciente humano en su necesidad de una cantidad efectiva de una combinación de Mabs, o sus fragmentos de unión a antígeno, descritos aquí, o una mezcla de al menos un Mab y al menos un fragmento de unión a antígeno descrito aquí, y 4) uno cualquiera de los métodos anteriores 1-3, que comprende además, la administración a dicho paciente humano de un ESA, u otro agente terapéutico o tratamiento terapéutico administrado para mantener o incrementar niveles de hierro en suero, conteo de reticulocitos, conteo de glóbulos rojos, hemoglobina y/o hematocrito en un humano.
En aún otro aspecto, se proveen métodos para inhibir la absorción inducida por hepcidina madura y degradación de FPNl, que comprende poner en contacto dicha FPNl y una cantidad efectiva de al menos un Mab, o su fragmento de unión a antígeno, descritos aquí.
Se provee un método para disminuir la unión de hepcidina humana madura para FPNl humano que comprende poner en contacto dicha FPNl humano y una cantidad efectiva de al menos un Mab, y/o su fragmento de unión a antígeno, descritos aquí .
Se provee un método para disminuir la cantidad de proteínas FPNl que se absorben por una célula que expresa proteínas FPNl, que comprende la administración a un paciente humano en su necesidad de una cantidad efectiva de al menos uno de los Mabs, y/o sus fragmentos de unión a antígeno, descritos aquí .
La figura 1 representa secuencias de varios péptidos que comprenden fragmentos del inmunogen usados para generar anticuerpos anti-FPNl y los resultados de experimentos de unión a péptido-anticuerpo usando los péptidos para definir el epítope de ab anti-FPNl 34A9. Aminoácidos subrayados denotan secuencias de ferroportina actuales. Mab 34A9 une a péptidos FpnE3a, 060719Z, 0708L4C, y 0708L4D, que contienen toda la secuencia de aminoácido común de RSRFIQG (SEQ ID NO: 95) .
La figura 2A muestra las secuencias de aminoácido de estructura de cadena ligera humana completa 02 con CDRs intercaladas. Las cuatro regiones estructurales se etiquetan como FRL1 , 2, 3 y 4 (SEQ ID NOs : 74, 75, 76 y 77, respectivamente) .
La figura 2B muestra la secuencia de aminoácido de la estructura de cadena pesada humana VH1-69 con CDRs intercaladas. Las cuatro regiones estructurales se etiquetan como FRH1-4 (SEQ ID NOs : 78-81, respec ivamente) .
La figura 3A muestra las secuencias de aminoácido de la estructura de cadena ligera humana 018 con CDRs intercaladas. Las cuatro regiones estructurales se etiquetan como FRL1, 2, 3 y 4 (SEQ ID NOs : 74, 75, 82 y 77, respectivamente) . Diferentes residuos de residuos 02 están en negritas y subrayados.
La figura 3B muestra la secuencia de aminoácido de la estructura de cadena pesada humana VH1-18 con CDRs intercaladas. Las cuatro regiones estructurales se etiquetan como FRH1 , 2, 3, y 4 (SEQ ID NOs : 83, 79, 84, y 81, respectivamente) . Diferentes residuos de residuos VH1-69 están en negritas y subrayados .
La figura 4A muestra las secuencias de aminoácido de la estructura de cadena ligera humana L12 con CDRs intercaladas. Las cuatro regiones estructurales se etiquetan como FRL1, 2, 3 y 4 (SEQ ID NOs : 85, 75, 86 y 77, respectivamente) . Diferentes residuos de residuos 02 están en negritas y subrayados.
La figura 4B muestra la secuencia de aminoácido de la estructura de cadena pesada humana VH1-46 con CDRs intercaladas. Las cuatro regiones estructurales se etiquetan como FRH1, 2, 3, y 4 (SEQ ID NOs : 83, 79, 87 y 81, respectivamente) . Diferentes residuos de residuos VHl-69 están en negritas y subrayados.
La figura 5 muestra las secuencias de aminoácido de la estructura de cadena ligera humana Ll con CDRs intercaladas. Las cuatro regiones estructurales se etiquetan como FRL1, 2, 3 y 4 (SEQ ID NOs : 74, 168, 76 y 169, respectivamente) . Diferentes residuos de residuos 02 están en negritas y subrayados. La secuencia de línea germinal para la región FRl de estructura de cadena ligera humana L12 es como se muestra en SEQ ID NO: 85; una variación en donde la secuencia de aminoácido de la región FRl de la estructura de cadena ligera humana Ll es como se muestra en SEQ ID NO: 74 es contemplada en ciertas modalidades de la presente invención.
La figura 6 muestra una gráfica de niveles de hepcidina en suero en monos Cynomolgus machos después de la administración de IgGl de murina de control o Mab IG9 de murina como una dosis sencilla I.V. de 30 mg/kg. Los datos son de animales individuales.
La figura 7 muestra una gráfica de niveles de hierro en suero en monos Cynomolgus machos después de la administración de IgGl de murina de control o Mab IG9 de murina como una dosis sencilla I.V. de 30 mg/kg. Los datos son de animales individuales.
La figura 8 muestra las secuencias de aminoácido y secuencia de aminoácido consenso de regiones variables de cadena pesada preferidas para los anticuerpos, y sus fragmentos de unión a antígeno de la presente invención. Un periodo (.) indica que el aminoácido en esta posición es idéntico al aminoácido correspondiente de número de secuencia 1. CDRs están subrayadas y en negritas para el número de secuencia 1.
La figura 9 muestra las secuencias de aminoácido y secuencia de aminoácido consenso de regiones variables de cadena ligera preferidas para los anticuerpos, y sus fragmentos de unión a antígeno, de la presente invención. Un periodo ( . ) indica que el aminoácido en esta posición es idéntico al aminoácido correspondiente del número de secuencia 1. CDRs están subrayadas y en negritas para el número de secuencia 1.
La figura 10 representa concentraciones de suero de Mab 4A10-3 y Mab Combill en monos Cynomolgus después de una dosis de bolo i.v. sencilla de 0.3, 1.0 o 3.0 mg/kg. Concentraciones de suero de Mab Combill en la dosis de 0.3 mg/kg están debajo del límite de detección del ensayo (<20 ng/ml) . Los datos están en la media ± SD.
La figura 11 representa las concentraciones de suero de Mab 4A10-3 y Mab Combill en ratas Sprague Dawley después de una dosis de bolo i.v. sencilla de 3.0 mg/kg. Los datos están en la media de ± SD.
Las siguientes abreviaturas se usan aquí: BCA: ácido bicinconinico, BSA: albúmina de suero bovino, CDR: región de determinación complementaria, DTT: ditiotreitol , DMEM: medio Eagle modificado de Dulbecco, D-PBS: solución salina regulada de pH-fosfato de Dulbecco, EDTA ácido etilendiamina tetraacético, ELISA: ensayo inmunosorbente ligado a enzima, ESA: agente de estimulación de eritropoyesis , FAC: citrato de amonio férrico, FBS : suero bovino fetal, Fe : TA : nitrilotriacetato férrico, FLU: unidades de fluorescencia, GFP: proteína fluorescente verde, I.V. intravenosa, IPTG: ß-D-l-tiogalactopiranosida de isopropilo, IMAC: cromatografía de afinidad de ion metálico inmovilizado, Mab: anticuerpo monoclonal, Mabs: anticuerpos monoclonales , OPD: clorhidrato de o-fenilendiamina, PBS : solución salina regulada de pH-fosfato, PBST: Tween-20 de solución salina regulada de pH-fosfato, SDS: sulfato dodecil de sodio, TBS : solución salina regulada de pH-Tris, Tris: tris (hidroximetil) aminometano, triton-X: 4- (1,1,3,3-tetrametilbutil) fenil-polietilenglicol t-octilfenoxipolietoxietanol polietilen glicol terc-octilfenil éter, Tween-20: polisorbato 20.
Los Mabs, o sus fragmentos de unión a antígeno, de la presente invención unen un epítope que comprende o que consiste esencialmente de o que consiste de un aminoácido o aminoácidos, aminoácidos localizados 403-422 (SEQ ID NO: 12) del polipéptido FPNl humano que tiene la secuencia de aminoácido como se muestra en SEQ ID NO: 1. En modalidades preferidas, estos anticuerpos, o sus fragmentos de unión a antígeno, inhiben la absorción inducida por hepcidina humana madura y/o degradación de FPNl humano, con lo cual incrementa el transporte de hierro fuera de las células in vitro e in vivo y eleva niveles de hierro en suero in vivo. Por ejemplo, en modalidades preferidas, los anticuerpos de la presente invención disminuyen significantemente la acumulación inducida por hepcidina madura de ferritina dentro de células Caco-2, una línea celular de entericito humano que expresa de manera endógena FPN1, in vitro (véase, ejemplo 5) .
Un anticuerpo de longitud completa como este que existe naturalmente es una molécula de inmunoglobulina que comprende 2 cadenas pesadas (H) y 2 cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces de disulfuro. La porción terminal amino de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100-110 o más aminoácidos primariamente responsables para el reconocimiento de antígeno vía las CDRs contenidas aquí. La porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante primariamente responsable para la función efectora.
El término "CDR" como se usa aquí se destina a significar los sitios de combinación de antígeno no contiguos encontrados dentro de la región variable de polipéptidos de cadena pesada y ligera. Estas regiones particulares se han descrito por Kabat, et al., J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977), Kabat, et al., Secuencias de proteína de interés inmunológico, (1991), y por Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) y por MacCallum, et al., J. Mol. Biol., 262:732-745 (1996) donde las definiciones incluyen traslapar o subconjuntos de residuos de aminoácido cuando se comparan uno con otro.
Las CDRs se intercalan con regiones que son más conservadas, denominadas regiones estructurales ("FR"). Cada región variable de cadena ligera (LCVR) y región variable de cadena pesada (HCVR) se compone de tres CDRs y cuatro FRs, arreglados de amino-término a carboxi-término en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 , CDR3 , FR4. Las tres CDRs de cadena ligera son referidas como "LCDR1, LCDR2 y LCDR3" y las tres CDRs de cadena pesada son referidas como "HCDR1, HCDR2 y HCDR3" . Las CDRs contienen más de los residuos que forman interacciones específicas con el antígeno. La numeración y posicionamiento de residuos de aminoácido CDR dentro de las regiones LCVR y HCVR es de acuerdo con convenciones bien conocidas (por ejemplo, Kabat (1991) y/o Chothia (1987)).
La frase "numeración de Kabat" como se usa aquí se reconoce en la técnica y se refiere a un sistema de numeración de residuos de aminoácido que son más variables (es decir, hipervariables) que otros residuos de aminoácido en las regiones de cadena pesada y ligera de un anticuerpo (Kabat, et al., Ann NY Acad. Sci., 190:382-93 (1971); Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, Departamento de servicios de salud y humanos de E.U., NIH publicación No. 91-3242 (1991)).
Como se usa aquí, el término "anticuerpo monoclonal" ( ab) se refiere a un anticuerpo, o su fragmento de unión a antígeno, que se deriva de una copia sencilla o clon que incluye, por ejemplo, cualquier clon eucariótico, 1 procariótico o fago, y no el método por el cual este se produce . Mabs de la presente invención preferiblemente existen en una población homogénea o sustancialmente homogénea. Mabs completos contienen 2 cadenas pesadas y 2 cadenas ligeras . Anticuerpos monoclonales y sus fragmentos de unión a antígeno de la presente invención se pueden producir, por ejemplo, mediante tecnologías recombinantes , tecnologías de despliegue de fago, tecnologías sintéticas, por ejemplo CDR-injerto, o combinaciones de dichas tecnologías, u otras tecnologías conocidas en la técnica.
Como se utiliza aquí, la frase "fragmentos de unión a antígeno" de Mabs incluye, ppr ejemplo, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, y fragmentos de cadena sencilla Fv.
El término "anticuerpo" o sus versiones gramaticales, a menos que se indique de otra manera, se refiere a Mabs, sus fragmentos de unión a antígeno, así como sus combinaciones, incluyendo, por ejemplo, combinaciones de Fabs, y combinaciones de Mabs y Fabs. Anticuerpos adicionales que exhiben propiedades funcionales similares como los anticuerpos de acuerdo con la presente invención se pueden generar por métodos convencionales. Por ejemplo, ratones se pueden inmunizar con, por ejemplo, células que expresan FPN1, FPN1 o sus fragmentos, los anticuerpos resultantes se pueden recuperar y purificar, y la determinación de si poseen unión, farmacocinética, y propiedades funcionales similares a o los mismos como los anticuerpos descritos aquí se pueden valorar por los métodos descritos en los ejemplos 3-9 más adelante. Fragmentos de unión a antígeno también se pueden preparar por métodos convencionales bien conocidos en la técnica. Métodos para producir y purificar anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno también son conocidos en la técnica.
Como se utiliza aquí, la frase "enlaces específicos" se refiere a la capacidad de un anticuerpo de la presente invención a enlazarse a un polipéptido o péptido específicos, preferiblemente ferroportina humana 1, consistente de la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 1, o un fragmento de péptido especificado del mismo, con un KD menor a aproximadamente 100 pM, o menor a aproximadamente ????, como fue determindao por afinidad ELISA o ensayos SPR descritos aquí, por ejemplo, o ensayos similares conocidos en la técnica.
Adicionalmente, o alternativamente, la frase "enlaces específicos" haciendo referencia a un anticuerpo de la presente invención indica que la capacidad de un anticuerpo para enlazarse o para detectar ferroportina 1 humana consistente de la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 1, o un fragmento de péptido del mismo, es al menos 5 veces más grande, al menos 10 veces más grande, al menos 20 veces más grande, al menos 50 veces más grande, al menos 100 veces más grande, al menos 200 veces más grande, al menos 500 veces más grande o al menos 1000 veces más grande que su capacidad de enlazarse a o detectar otro polipéptido (e.g. heparina) u, opcionalmente, otro fragmento de péptido específico de ferroportina humana 1.
La presente invención también provee un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótido que codifica un Mab, o su fragmento de unión a antígeno. En modalidades particulares, la presente invención también provee un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótido que codifica i) un polipéptido de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácido como se muestra en SEQ ID NOs: 50, 51, 52, 150, 152, 156, 160 y 164, y/o ii) un polipéptido de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácido como se muestra en SEQ ID NOs : 53, 54, 55, 151, 154, 158, 162 y 166.
En otra modalidad, la presente invención provee un vector de expresión recombinante que comprende un polinucleótido que codifica un Mab, o su fragmento de unión a antígeno. En modalidades particulares, la presente invención también provee un vector de expresión recombinante que comprende un polinucleótido que codifica (i) un polipéptido de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácido como se muestra en SEQ ID NOs : 50, 51, 52, 150, 152, 156, 160, y 164, y/o ii) un polipéptido de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácido como se muestra en SEQ ID NOs : 53, 54, 55, 151, 154, 158, 162 y 166.
Cuando se usa aquí, el término "hepcidina" se refiere a cualquier forma de la proteína hepcidina conocida por estar presente en mamíferos. Cuando se usa aquí, el término "hepcidina madura" se refiere a cualquier forma madura, bioactiva de la proteína hepcidina expresada en mamíferos. Cuando se usa aquí, la frase "hepcidina humana" se refiere a cualquier forma de la proteína hepcidina presente en humanos. Cuando se usa aquí, la frase "hepcidina humana madura" se refiere a cualquier forma bioactiva, madura de proteína hepcidina conocida por estar presente en humanos . Preferiblemente, "hepcidina humana madura" se refiere a "hepcidina-25 humana", una forma madura de hepcidina humana que tiene la secuencia de aminoácido como se muestra en SEQ ID NO: 91.
El término "bioactividad" en referencia a polipéptidos de hepcidina humana tal como hepcidina-25 incluyen, pero no se limitan a, unión específica de hepcidina madura a su receptor de FPNl, una o más funciones mediadas por FPNl de hepcidina madura, tal como a) absorción inducida por hepcidina madura y/o degradación de FPNl (véase, por ejemplo, Nemeth, E., et al., Science, 306:2090-2093, (2004), b) regulación de hepcidina madura de FPN1-mediada i) eflujo de hierro, ii) niveles de hierro en suero, iii) conteo de retoculocito, iv) conteo de glóbulos rojos, v) niveles de hemoglobina, vi) hematocrito, vii) niveles de expresión de polipéptidos de hepcidina, y/o viii) distribución de tejido de polipéptidos de hepcidina.
La frase "anticuerpos humanos diseñados" se refiere a ciertas modalidades descritas aquí así como anticuerpos que tienen unión y propiedades funcionales de acuerdo con la invención similares a los anticuerpos descritos aquí, y que tienen regiones estructurales que son sustancialmente humanas o completamente humanas alrededor de CD s derivadas de un anticuerpo no humano, o su fragmento de unión a antígeno, descritos aquí. "Región estructural" o "secuencia estructural" se refiere a cualquiera de las regiones estructurales 1 a 4. Anticuerpos humanos diseñados y sus fragmentos de unión a antígeno incluidos por la presente invención incluyen moléculas en donde cualquiera de una o más regiones estructurales 1 a 4 es sustancialmente o completamente humana, es decir, en donde cualquiera de las combinaciones posibles de regiones estructurales individuales sustancialmente o completamente humanas 1 a 4, está presente. Por ejemplo, esto incluye moléculas en la cuales la región estructural 1 y la región estructural 2 , la región estructural 1 y la región estructural 3, la región 3 estructural 1, 2 o 3, etc., son sustancialmente o completamente humanas . Estructuras sustancialmente humanas son aquellas que tienen al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia para una secuencia estructural de línea germinal humana conocida. Preferiblemente, las estructuras sustancialmente humanas tienen al menos aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, o aproximadamente 95% de identidad de secuencia para una secuencia estructural de línea germinal humana conocida.
Estructuras completamente humanas son aquellas que son idénticas a una secuencia estructural de línea germinal humana conocida. Secuencias de línea germinal estructural humana se pueden obtener de ImMunoGeneTics (IMGT) vía su sitio web http://imgt.cines.fr, o de The Immunoglobulin Facts Book por Marie-Paule Lefranc and Gerard Lefranc, Academic Press, 2001, ISBN 012441351. Por ejemplo, estructuras de cadena ligera de línea germinal se pueden seleccionar del grupo que consiste de All, A17, A18, A19, A20, A27, A30, Ll, Lll, L12, L2, L5, L15, L6 , L8 , 012 , 02 , y 08 , y regiones estructurales de cadena pesada de línea germinal se pueden seleccionar del grupo que consiste de VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-20, VH3-72, VH1-46, VH3-9, VH3-66, VH3-74, VH4-31, VH1-18, VH1-69, VI-13-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-48, VH4-39, VH4-59 y VH5-51. Preferiblemente, estructuras de cadena ligera de línea germinal se seleccionan del grupo que 4 consiste de 02, 018 y L12, Ll y regiones estructurales de cadena pesada de línea germinal se seleccionan del grupo que consiste de VH1-69, VH1-18 o VH1-46. Más preferiblemente, estructuras de cadena ligera de línea germinal se seleccionan del grupo que consiste de 02 y Ll, y estructuras de cadena pesada de línea germinal se seleccionan del grupo que consiste de VH1-69 y VH1-18. Más preferiblemente, la estructura de cadena ligera de línea germinal es 02 y la región estructural de cadena pesada de línea germinal es VH1-69.
Además de los anticuerpos humanos diseñados descritos aquí, anticuerpos humanos diseñados que exhiben propiedades funcionales similares a los anticuerpos de acuerdo con la presente invención se pueden generar usando varios métodos diferentes. Los anticuerpos específicos descritos aquí se pueden usar como templados o anticuerpos de origen para preparar anticuerpos adicionales. En un método, las CDRs de un anticuerpo de origen se injertan en una estructura humana que tiene una identidad de secuencia alta con la estructura de anticuerpo de origen. La identidad de secuencia de la nueva estructura generalmente será al menos de aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 99% idéntica a la secuencia de la estructura correspondiente en el anticuerpo de origen. Este injerto puede resultar en una reducción en la afinidad de unión comparada con la del anticuerpo de origen. Si este es el caso, la estructura puede ser retro-mutada a la estructura de origen en ciertas posiciones basadas en el criterio específico descrito por Queen, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA. , 88:2869 (1991). Referencias adicionales que describen métodos útiles en humanización de anticuerpos de ratón incluyen la patente de E.U.A. Nos. 4,816,397; 5,225,539 y 5,693,761; programas de computadora ABMOD y ENCAD como se describe en Levitt, J., Mol. Biol . 168:595-620 (1983); y el método de inter y co-trabajadores (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann, et al., Nature, 332:323-327 (1988); y Verhoeyen, et al., Science 239:1534-1536 (1988).
La identificación de residuos a considerar para retro-mutación se puede llevar a cabo como sigue: Cuando un aminoácido cae bajo la siguiente categoría, el aminoácido estructural de la secuencia de línea germinal humana que está siendo usado (la "estructura aceptora" ) se reemplaza por un aminoácido estructural de una estructura del anticuerpo de origen (la "estructura donadora" ) : (a) el aminoácido en la región estructural humana de la estructura aceptora es inusual para estructuras humanas en esta posición, con lo cual el aminoácido correspondiente en la inmunoglobulina donadora es usualmente para estructuras humanas en esta posición; (b) la posición del aminoácido es inmediatamente adyacente a una de las CDRs; o (c) cualquier átomo de cadena lateral de un aminoácido estructural está dentro de aproximadamente 5-6 angstroms (centro a centro) de cualquier átomo de un aminoácido de CDR en un modelo de inmunoglobulina tridimensional .
Cuando cada uno de los aminoácidos en la región estructural humana de la estructura aceptora y un aminoácido correspondiente en la estructura donadora es generalmente inusual para estructuras humanas en esta posición, dicho aminoácido se puede reemplazar por un aminoácido usual para estructuras humanas en esta posición. Este criterio de retro-mutación permite recuperar la actividad del anticuerpo de origen.
Otro método para generar anticuerpos humanos diseñados que exhiben propiedades funcionales similares a los anticuerpos descritos aquí involucra la mutación aleatoria de aminoácidos dentro de las CDRs injertados sin cambiar la estructura, y clasificando las moléculas resultantes para afinidad de unión y otras propiedades funcionales que son tan buenas como o mejores que aquellas de los anticuerpos de origen. Mutaciones sencillas también se pueden introducir en cada posición de aminoácido dentro de cada CDR, después de la valoración de los efectos de dichas mutaciones en afinidad de unión y otras propiedades funcionales. Mutaciones sencillas que producen propiedades mejoradas se pueden combinar para valorar sus efectos en combinación una con otra.
Además, una combinación de ambos métodos es posible.
Después de injertar la CDR, uno puede retro-mutar regiones estructurales específicas además de introducir cambios de aminoácido en los CDRs. Esta metodología se describe en Wu. Et al., J. Mol. Biol. 294:151-162 (1999). Preferiblemente, la sustitución de aminoácido dentro de las estructuras se restringe a una, dos o tres posiciones dentro de cualquiera de una o más de las regiones estructurales de cadena pesada y/o cadena ligera descritas aquí (es decir, regiones estructurales mostradas en las figuras 2-5) . Preferiblemente, la sustitución de aminoácido dentro de las CDRs es restringida a una, dos o tres posiciones dentro de una o más de las tres CDRs de cadena pesada y/o cadena ligera. Combinaciones de los varios cambios descritos dentro de las regiones estructurales y las CDRs también se contemplan aquí . En modalidades particulares de este aspecto de la invención, todas las regiones estructurales de región variable de cadena pesada y ligera de dichos Mabs diseñados humanos, o sus fragmentos de unión a antígeno, son completamente humanos.
Las tablas 1A y IB posteriores representan las secuencias de aminoácido de CDR y secuencias de aminoácido consenso de anticuerpos preferidos, o sus fragmentos de unión a antígeno, de la presente invención. Las tablas 2A y 2B posteriores representan las secuencias de aminoácido de CDR y secuencias de aminoácido consenso de anticuerpos más preferidos, o sus fragmentos de unión a antígeno, de la presente invención. 9 Tabla 1A 0 Tabla IB * Tablas 1A y IB, secuencias consenso 1-5 (C1-C5) , en donde Xx es N o S; X2 es E, K o R; X3 es E o A; X6 es S o I; X7 es N o K, X4 es T, K o R; Xs es F, H, Q; X8 es L, T, S o A.
Tabla 2A Tabla 2B * Tablas 2A y 2B, secuencia consenso 6, en donde X es Y, R o K; X2 es A, o R; X3 es T o R; X4 es G o R; X5 es G o R; X6 es T o R; X7 es E, T, S o ; X8 es K o V; X9 es G o R; io es D O V; Xu es L O R; Xi2 es H, R, V o Y; X13 es S, W o Y.
Modalidades aún más preferidas, o fragmentos de unión a antígeno, de la invención comprenden LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácido mostradas en SEQ ID NOs: 170, 171, 172, 23, 173 y 19, respectivamente o SEQ ID NOs: 170, 171, 172, 182, 173 y 19, respectivamente. Anticuerpos aún más preferidos, o fragmentos de unión a antígeno, de la invención comprenden una LCDR1, LCDR2 , LCDR3 , HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácido mostradas en SEQ ID NOs: 37, 174, 22, 175, 176, y 120, respectivamente. Basado en características farmacocinéticas (véase, por ejemplo 11) y farmacodinámicas (por ejemplo, véase Ejemplo 12) así como las propiedades funcionales de Mabs anti-FPNl ejemplares, o sus fragmentos de unión a antígeno (por ejemplo, véase Ejemplos 3 (mapeo de epítope) , 4 (afinidad) , 5 (efecto de concentración de ferritina en células in vitro) , 6 (efecto en unión de hepcidina madura por células diseñadas para expresar una fusión FPN1-GFP in vitro) , 7 y 9 (efecto en la absorción inducida por hepcidina y degradación de FPNl in vitro) y 8 (efecto en niveles de hierro en suero in vivo) , los Mabs más preferidos, o sus fragmentos de unión a antígeno de la presente invención son Mabs 4A10-3, L2.2-4, y ComllGY, o sus fragmentos de unión a antígeno. Las secuencias de aminoácido que codifican las cadenas pesadas, las cadenas ligeras, las regiones variables de cadena pesada y ligera, y las CDRs para Mabs 34A9, IG9, 3D8, Combill, 4A10-3, L2.2-4, 1B7 , IF8 y ComllGY se indican posteriormente en la tabla 3 (a) y la tabla 3(b) para referencia a SEQ ID NOs.
Tabla 3 (a) Tabla 3 (b) En algunas modalidades, los Mabs anti-FPNl, o sus 5 fragmentos de unión a antígeno, descritos aquí se pueden usar en combinación con uno o más ESAs a fin de proveer beneficios adicionales con respecto a incrementar niveles de hierro en suero, incrementar hematocritos, incrementar niveles de hemoglobina, reduciendo la necesidad de transfusión, y/o mejorando el estatus funcional, productividad, y calidad de vida de pacientes anémicos como los comparados con la administración de terapia ESA sola. Por la frase "terapia de combinación" o "en combinación con" significa que un Mab anti-FPNl, o su fragmento de unión a antígeno, de la presente invención se administra separadamente, de manera simultánea, o secuencial con otro agente destinado a incrementar niveles de hierro en suero, incrementar hematocritos, incrementar niveles de hemoglobina, reduciendo la necesidad de transfusión y/o mejorando el estatus funcional, productividad, y calidad de vida de pacientes anémicos como se compara con la administración del Mab anti-FPNl, o su fragmento de unión a antígeno, solo.
En algunas modalidades, un Mab anti-FPNl, o su fragmento de unión a antígeno, descrito aquí se puede administrar en vez de terapia ESA en pacientes intolerantes o sin respuesta a terapia ESA.
La frase "agente de estimulación de eritropoyesis" o "estimulador de eritropoyesis" significa un compuesto que causa directamente o indirectamente la activación del receptor eritropoyetina, por ejemplo, mediante la unión y causando dimerización del receptor o mediante la estimulación de la expresión de eritropoyetina endógena. ESAs incluyen eritropoyetina y sus variantes, análogos o derivados que unen y activan al receptor eritropoyetina; anticuerpos que unen al receptor eritropoyetina y activan al receptor; o péptidos que unen y activan al receptor eritropoyetina; o compuestos químicos orgánicos pequeños, opcionalmente menos de aproximadamente 1000 Daltons en peso molecular, que unen y activan al receptor eritropoyetina. ESAs incluyen, pero no se limitan a, alfa epoetina, beta epoetina, delta epoetina, omega epoetina, iota epoetina, zeta epoetina, y sus análogos, eritropoyetina pegilada, eritropoyetina carbamilada, péptidos miméticos (incluyendo EMPl/hematina) , anticuerpos miméticos e inhibidores de HIF (véase La Publicación de Patente de E.U.A No. 2005/0020487) . ESAs ejemplares incluyen variantes agonistas de eritropoyetina, darbepoetina, eritropoyetina, y péptidos o anticuerpos que unen y activan al receptor eritropoyetina incluyendo compuestos reportados en la Publicación de solicitud de patente de E.U.A. Nos. 2003/0215444 y 2006/0040858 así como moléculas de eritropoyetina o sus variantes o análogos también conocidos en la técnica. Eritropoyetina incluye, pero no se limita a, un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido como se expone en SEQ ID NO: 88. El término "epoetina", incluye, pero no se limita a, alfa epoetina, beta epoetina, delta epoetina, omega epoetina, iota epoetina, gamma epoetina, zeta epoetina, y lo similar. De manera adicional, una epoetina también incluye cualquiera de las epoetinas mencionadas anteriormente que se modifican químicamente, por ejemplo, con uno o más polímeros solubles en agua tal como, por ejemplo, polietilenglicol (incluyendo PEG-EPO-beta) . Secuencias ejemplares, fabricación, purificación y uso de eritropoyetina humana recombinante se describen en un número de publicaciones de patente, incluyendo, pero sin limitarse a Patente de E.U.A Nos. 4,703,008 y 4,667,016. Secuencias ejemplares, fabricación, purificación y uso de darbepoetina y otros análogos de eritropoyetina se describen en un número de publicaciones de patente, incluyendo Strickland et al., 91/05867, y Publicaciones de Solicitud de Patente Internacional de PCT Nos. O 95/05465, WO 00/24893, y WO 01/81405. Derivados de origen natural o polipéptidos análogos incluyen aquellos que han sido químicamente modificados, por ejemplo, para unir polímeros solubles en agua (por ejemplo, pegilados) , radionuclidos, u otro diagnóstico o direccionamiento o porciones terapéuticos.
El término "actividad eritropoyetica" significa actividad para estimular eritropoyesis como se demuestra en un ensayo in vivo, por ejemplo, el ensayo de ratón policitémico, exipóxico (véase, por ejemplo, Cotes and Bangham, Nature, 191:1065 (1961)).
El término "epítope" se refiere a esta porción de cualquier molécula capaz de ser reconocida y unida por un anticuerpo en una o más de las regiones de unión a antígeno del anticuerpo. Epítopes frecuentemente consisten de una agrupación de la superficie activa químicamente de moléculas tal como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, y tienen tres características estructurales tridimensionales específicas así como características de carga específicas. Los epítopes de FPNl humano descritos aquí se presentan en el contexto de la estructura de aminoácido primaria de FPNl (SEQ ID NO: 1) . Sin embargo, algunos de los epítopes pueden ser discontinuos más que continuos como los residuos de aminoácido, más que estando en enlace de péptido continuo, puede ser en proximidad espacial uno con otro como una consecuencia de estructura terciaria o cuaternaria de FPNl y su presentación resultante en la superficie de esta molécula. Preferiblemente, un ab anti-FPNl, o su fragmento de unión a antígeno, de la presente invención une FPNl humano que consiste de la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 1 en un epítope que comprende o consiste esencialmente de o que consiste de un aminoácido o aminoácidos localizados para la secuencia de aminoácido como se muestra en SEQ ID NO: 9. Más preferiblemente, un Mab anti-FPNl o su fragmento de unión a antígeno, de la presente invención une FPNl humano que 9 consiste de la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 1 en un epítope que comprende o que consiste esencialmente de 0 que consiste de un aminoácido o aminoácidos localizados para una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 12, 13, 14, 15, 16 y 95. Aún más preferiblemente, un Mab anti-FPNl, o su fragmento de unión a antígeno, de la presente invención une FPNl humano que consiste de la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 1 en un epítope que comprende o que consiste esencialmente de o que consiste de un aminoácido o aminoácidos localizados para una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID Nos: 12,13,14,15,16 Y 95 pero no une uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste de las SEQ ID Nos: 98, 183-214.
Anticuerpos de la presente invención también unen FPNl de mono Cynomolgus (SEQ ID NO: 3) , que facilita obligatoriamente la seguridad pre-clínica y eficacia de estudios de desarrollo de fármaco terapéutico en uno o más modelos de primate.
La frase "ferroportina 1 humana" o, alternativamente, "FPNl humano" se refiere a una proteína de transporte de hierro expresada en humanos que tiene la secuencia de aminoácido como se muestra en SEQ ID NO: 1, así como a variantes que retienen la capacidad de exportar hierro celular en respuesta a la interacción con hepcidina humana madura .
Preferiblemente, un anti-Mab FPN1, o un fragmento antígeno de enlace del mismo, de la presente invención comprende : 1) Una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada como se muestra en SEQ ID NO: 136 y SEQ ID NO: 134, respectivamente; 2) Una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada como se muestra en SEQ ID NO: 180 y SEQ ID NO: 178, respectivamente; o 3) Una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada como se muestra en SEQ ID NO: 140 y SEQ ID NO: 138, respectivamente. Aún más preferiblemente, un anti-Mab FPN1 o un fragmento antígeno de enlace del mismo, de la presente invención comprende : 1) Una cadena ligera y una cadena pesada como se muestra en SEQ ID NO: 154 y SEQ ID NO: 152, respectivamente; 2) Una cadena ligera y una cadena pesada como se muestra en SEQ ID NO: 181 y SEQ ID NO: 179, respectivamente; o 3) Una cadena ligera y una cadena pesada como se muestra en SEQ ID NO: 158 y SEQ ID NO: 156, respectivamente. Aún más preferiblemente, el anticuerpo monoclonal o el fragmento antígeno de enlace de la invención comprende: ) Dos polipéptidos de cadena ligera y dos polipéptidos de cadena pesada, y en donde cada uno de los polipéptidos de cadena ligera tienen la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 154 y cada uno de los polipéptidos de cadena pesada tienen la secuencia de aminoácido como se muestra en SEQ ID NO: 152; ) Dos polipéptidos de cadena ligera y dos polipéptidos de cadena pesada, y en donde cada uno de los polipéptidos de cadena ligera tienen la secuencia de aminoácido como se muestra en SEQ ID NO: 181 y cada uno de los polipéptidos de cadena pesada tienen la secuencia de aminoácido como se muestra en SEQ ID NO: 179 ; o ) Dos polipéptidos de cadena ligera y dos polipéptidos de cadena pesada, y en donde cada uno de los polipéptidos de cadena ligera tienen la secuencia de aminoácido como se muestra en SEQ ID NO: 158 y cada uno de los polipéptidos tienen la secuencia de aminoácido como se muestra en SEQ ID NO: 156. Aún más preferiblemente, el anticuerpo monoclonal o el fragmento de antígeno de enlace de la invención enlaza ferroportina humana 1 con KD menor a aproximadamente ???? como determinó la resonancia superficial de plasmón a 25°C. Aún más preferiblemente, el anticuerpo monoclonal o fragmento de antígeno de enlace de la invención comprende un Fab, en donde el Fab enlza ferroportina humana 1 con un KD menor a aproximadamente a 100 nM como determinó la resonancia superficial de plasmón a 37°C. Aún más preferiblemente, el Fab tiene una velocidad de disociación (koff) entre aproximadamente 7.5xl0~3 s"1 y aproximadamente 9xl0"4 s"1 como fue determinado por SPR a 37°C para ferroportina humana 1. Aún más preferiblemente, el Fab enlaza ferroportina humana 1 con un KD de entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente InM. Aún más preferiblemente, el Fab enlaza ferroportina humana 1 con un KD de entre aproximadamente 10 nM a aproximadamente 0.5 nM. Aún más preferiblemente, el anticuerpo monoclonal o el fragmento antígeno de enlace tiene un IC50 entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1 nM en un ensayo in vitro de bioactividad de hepcidina-25. Aún más preferiblemente, el anticuerpo monoclonal o un fragmento antígeno de enlace del mismo tiene un IC50 entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 10 nM en un ensayo in vitro de bioactividad de hepcidina-25. Aún más preferiblemente , la bioactividad de hepcidina-25 es internalización y/o degradación de ferroportina 1. Aún más preferiblemente, el anticuerpo monoclonal o el fragmento antígeno de enlace del mismo tiene un IC50 entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1 nM en un ensayo in vivo de bioactividad de hepcidina- 25. Aún más preferiblemente, el ensayo in vivo de bioactividad de hepcidina-25 mide un IL-6 decrecimiento inducido en los niveles de hierro en suero en un primate. Más preferiblemente, los Mab de anti-FPNl, o fragmentos de antígeno de enlace de los mismos, no enlazan uno o más péptidos seleccionados del grupo consistente de SEQ ID NOS:98, 183-214.
En modalidades particulares, los Mabs anti-FPNl, o sus fragmentos de unión a antígeno, de la presente invención se caracterizan por la unión de FPN1 humano que consiste de la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 1 en un epítope que comprende o que consiste esencialmente de o que consiste de un aminoácido o aminoácidos localizados para una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 12, 13, 14, 15, 16 y 95 con un KD menor de aproximadamente 100 nM, menor de aproximadamente 75 nM, menor de aproximadamente 50 nM, menor de aproximadamente 25 nM, o menor de aproximadamente 10 nM como se determina por SPR, preferiblemente, a 25°C para Mabs y 37°C para Fabs . Preferiblemente, los Mabs anti-FPNl, o sus fragmentos de unión a antígeno, no unen uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste de SEQ ID NO: 183-214.
En modalidades particulares, los Mabs anti-FPNl, o sus fragmentos de unión a antígeno, de la presente invención se caracterizan por la unión de FPN1 humano que consiste de la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 1 en un epítope que comprende o que consiste esencialmente de o que consiste de un aminoácido o aminoácidos localizados para una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 12, 13, 14, 15, 16 y 95 con un KD entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente .5 nM, preferiblemente, entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente .5 nM, más preferiblemente, entre aproximadamente 75 nM a aproximadamente 5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 50 nM a aproximadamente 10 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 15 nM a aproximadamente 10 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 10 nM a aproximadamente .5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente .5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente .7 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 3 nM a aproximadamente .7 nM, o más preferiblemente, de aproximadamente 3 nM a aproximadamente 1 nM, como se determina por SPR, preferiblemente, a 25°C para Mabs y 37°C para Fabs. Preferiblemente, los Mabs anti-FPNl, o sus fragmentos de unión a antígeno, no unen uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 183-21 .
En modalidades particulares, los Mabs anti-FPNl, o sus fragmentos de unión a antígeno, de la presente invención se caracterizan por la unión a FPNl humano que consiste de la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 1 en un epítope que comprende o que consiste esencialmente de o que consiste de un aminoácido o aminoácidos localizados para una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 12, 13, 14, 15, 16, y 95 con una velocidad de disociación (Koff) para ferroportina 1 humana entre aproximadamente 7.5 x 10"3 s"1 y aproximadamente 1 x 10~4 s"1, preferiblemente entre aproximadamente 2.5 x 10~3 s'1 y aproximadamente 1 x 10"4 s"1, más preferiblemente entre aproximadamente 1 x 10~3 s"1 y aproximadamente 1 x 10"4 s"1, y aún más preferiblemente entre aproximadamente 5 x 10"4 s"1 y aproximadamente 1 x 10~4 s"1, como se determina por SPR, preferiblemente, a 25°C para Mabs y 37°C para Fabs. Preferiblemente, los Mabs anti-FPNl o sus fragmentos de unión a antígeno, no unen uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 183-214.
En modalidades particulares, los Mabs anti-FPNl, o sus fragmentos de unión a antígeno, de la presente invención se caracterizan por la unión de FPN1 humano que consiste de la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID N0:1 en un epítope que comprende o que consiste esencialmente de o que consiste de un aminoácido o aminoácidos localizados para una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 12, 13, 14, 15, 16 y 95 con un KD menor de aproximadamente 100 nM, menor de aproximadamente 75 nM, menor de aproximadamente 50 nM, menor de aproximadamente 25 nM, o menor de aproximadamente 10 nM y una velocidad de disociación (k0ff) para ferroportina 1 humana entre aproximadamente 7.5 x 10~3 s"1 y aproximadamente 1 x 10~4 s"1, preferiblemente entre aproximadamente 2.5 x 10"3 s"1 y aproximadamente 1 x 10"4 s"1, más preferiblemente entre aproximadamente 1 x 10"3 s"1 y aproximadamente 1 x 10"4 s"1, y aún más preferiblemente entre aproximadamente 5 x 10"4 s"1 y aproximadamente 1 x 10~4 s"1, como se determina por SPR, preferiblemente a 25°C para Mabs y 37°C para Fabs. Preferiblemente, los Mabs anti-FPNl, o sus fragmentos de unión a antígeno, no unen uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 183-214.
En modalidades particulares, los Mabs anti-FPNl, o sus fragmentos de unión a antígeno, de la presente invención se caracterizan por la unión de FPN1 humano que consiste de la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID N0:1 en un epítope que comprende o que consiste esencialmente de o que consiste de un aminoácido o aminoácidos localizados para una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 12, 13, 14, 15, 16 y 95 con un KD entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente .5 nM, preferiblemente, entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 nM, más preferiblemente, entre aproximadamente 75 nM a aproximadamente 5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 50 nM a aproximadamente 10 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 15 nM a aproximadamente 10 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 10 nM a aproximadamente .5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente .5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente .7 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 3 nM a aproximadamente .7 nM, o más preferiblemente, de aproximadamente 3 nM a aproximadamente 1 nM, y una velocidad de disociación (koff) para ferroportina 1 humana entre aproximadamente 7.5 x 10"3 s"1 y aproximadamente 1 x 10~4 s"1, preferiblemente entre aproximadamente 2.5 x 10~3 s 1 Y aproximadamente 1 x 10~4 s"1, más preferiblemente entre aproximadamente 1 x 10"3 s"1 y aproximadamente 1 x 10"4 s"1, y aún más preferiblemente entre aproximadamente 5 x 10~4 s"1 y aproximadamente 1 x 10"4 s"1, como se determina por SPR, preferiblemente a 25°C para Mabs y 37°C para Fabs . Preferiblemente, los Mabs anti-FPNl, o sus fragmentos de unión a antígeno, no unen uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 183-214.
En modalidades particulares, los Mabs anti-FPNl, o sus fragmentos de unión a antígeno, de la presente invención comprenden una LCDR1 , LCDR2, LCDR3 , HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NOs : 37, 129, 22, 107,118 y 120, respectivamente, y unen FPN1 humano que consiste de la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 1 en un epítope que comprende o que consiste esencialmente de o que consiste de un aminoácido o aminoácidos localizados para una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 12, 13, 14, 15, 16 y 95 con un KD menor de aproximadamente 100 nM, menor de aproximadamente 75 nM, menor de aproximadamente 50 nM, menor de aproximadamente 25 nM, o menor de aproximadamente 10 nM como se determina por SPR, preferiblemente, a 25°C para Mabs y 37°C para Fabs. Preferiblemente, los Mabs anti-FPNl, o sus fragmentos de unión a antígeno, no unen uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 183-214.
En algunas modalidades, los Mabs anti-FPNl, o sus fragmentos de unión a antígeno, de la presente invención comprenden una LCDR1, LCDR2 , LCDR3 , HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NOs : 37, 129, 22, 107, 118, y 120, respectivamente, y unen FPN1 humano que consiste de la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 1 en un epítope que comprende o que consiste esencialmente de o que consiste de un aminoácido o aminoácidos localizados para una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 12, 13, 14, 15, 16 y 95 con un KD entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente .5 nM, preferiblemente, entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 nM, más preferiblemente, entre aproximadamente 75 nM a aproximadamente 5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 50 nM a aproximadamente 10 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 15 nM a aproximadamente 10 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 10 nM a aproximadamente .5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente .5 n , aún más preferiblemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente .7 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 3 nM a aproximadamente .7 nM, o más preferiblemente, de aproximadamente 3 nM a aproximadamente 1 nM como se determina por SPR, preferiblemente, a 25°C para Mabs y 37°C para Fabs. Preferiblemente, los Mabs anti-FPNl, o sus fragmentos de unión a antígeno, no unen uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 183-214.
En otras modalidades, la presente invención provee Mabs, o sus fragmentos de unión a antígeno, que comprenden una LCDR1 , LCDR2 , LCDR3 , HCDR1 , HCDR2 y HCDR3 que comprenden la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NOs: 37, 129, 22, 107, 118, y 120, respectivamente, que unen FPN1 humano que consiste de la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID N0:1 en un epítope que comprende o que consiste esencialmente de o que consiste de un aminoácido o aminoácidos localizados para una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 12, 13, 14, 15, 16 y 95 con una velocidad de disociación (koff) para ferroportina 1 humana entre aproximadamente 7.5 x 10"3 s"1 y aproximadamente 1 x 10"4 s"1, preferiblemente entre aproximadamente 2.5 x 10"3 s"1 y aproximadamente 1 x 10"4 s"1, más preferiblemente entre aproximadamente 1 x 10"3 s"1 y aproximadamente 1 x 10~4 s"1, y aún más preferiblemente entre aproximadamente 5 x 10~4 s"1 y aproximadamente 1 x 10"4 s"1, como se determina por SPR, preferiblemente, a 25°C para Mabs y 37°C para Fabs . Preferiblemente, los Mabs anti-FPNl, o sus fragmentos de unión a antígeno, no unen uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 183-214.
En modalidades particulares, los Mabs anti-FPNl, o sus fragmentos de unión a antigeno, de la presente invención comprenden una LCDR1, LCDR2, LCDR3 , HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NOs : 37, 129, 22, 107, 118, y 120, respectivamente, y la unión de FPN1 humano que consiste de la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO:l en un epítope que comprende o que consiste esencialmente de o que consiste de un aminoácido o aminoácidos localizados para una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 12, 13, 14, 15, 16 y 95 con un KD menor de aproximadamente 100 nM, menor de aproximadamente 75 nM, menor de aproximadamente 50 nM, menor de aproximadamente 25 nM, o menor de aproximadamente 10 nM y una velocidad de disociación (koff) para ferroportina 1 humana entre aproximadamente 7.5 x 10"3 s"1 y aproximadamente 1 x 10"4 s"1, preferiblemente entre aproximadamente 2.5 x 10"3 s"1 y aproximadamente 1 x 10~4 s"1, más preferiblemente entre aproximadamente 1 x 10"3 s"1 y aproximadamente 1 x 10"4 s"1, y aún más preferiblemente entre aproximadamente 5 x 10"4 s"1 y aproximadamente 1 x 10"4 s"1, como se determina por SPR, preferiblemente, a 25°C para Mabs y 37°C para Fabs. Preferiblemente, los Mabs anti-FPNl, o sus fragmentos de unión a antígeno, no unen uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 183-214.
En algunas modalidades, los Mabs anti-FPNl, o sus fragmentos de unión a antígeno, de la presente invención comprenden LCDR1, LCDR2 , LCDR3 , HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NOs: 37, 129, 22, 107, 118, y 120, respectivamente, y unen FPN1 humano que consiste de la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO:l en un epítope que comprende o que consiste esencialmente de o que consiste de un aminoácido o aminoácidos localizados para una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 12, 13, 14, 15, 16 y 95 con un KD entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente .5 nM, preferiblemente, entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 nM, más preferiblemente, entre aproximadamente 75 nM a aproximadamente 5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 50 nM a aproximadamente 10 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 15 nM a aproximadamente 10 nM, aún más preferiblemente, entre 10 nM a aproximadamente .5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente .5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente .7 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 3 nM a aproximadamente .7 nM, o más preferiblemente, de aproximadamente 3 nM a aproximadamente 1 nM y una velocidad de disociación (koff) para ferroportina 1 humana entre aproximadamente 7.5 x 10~3 s"1 y aproximadamente 1 x 10~4 s"1, preferiblemente entre aproximadamente 2.5 x 10"3 s"1 y aproximadamente 1 x 10~4 s"1, más preferiblemente entre aproximadamente 1 x 10~3 s"1 y aproximadamente 1 x 10"4 s_1, y aún más preferiblemente entre aproximadamente 5 x 10"4 s"1 y aproximadamente 1 x 10"4 s"1, como se determina por SPR, preferiblemente, a 25°C para abs y 37°C para Fabs . Preferiblemente, los Mabs anti-FPNl, o sus fragmentos de unión a antígeno, no unen uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 183-214.
El término "inhibe" significa la capacidad de antagonizar sustancialmente, prohibir, prevenir, contener, disminuir, interrumpir, eliminar, detener, reducir, o revertir los efectos biológicos de FPN1 y/o bioactividad de hepcidina madura incluyendo, pero sin limitarse a, bioactividad de hepcidina humana madura como se mide más adelante en el ejemplo 5-11, 13 o 14 por ejemplo.
En modalidades particulares, los Mabs anti-FPNl, o sus fragmentos de unión a antígeno, de la presente invención se caracterizan por que tienen una IC50 entre aproximadamente 250 nM y aproximadamente 25 nM, preferiblemente entre 100 nM y aproximadamente 25 nM, o más preferiblemente entre 50 nM y aproximadamente 25 nM en un ensayo in vivo de bioactividad de hepcidina-25. Preferiblemente, el ensayo in vivo mide una disminución IL-6-inducida en niveles de hierro en suero.
De manera adicional, o de manera alternativa, los Mabs anti-FPNl, o sus fragmentos de unión a antígeno, de la presente invención se caracterizan por que tienen una IC50 entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1 nM, preferiblemente, entre aproximadamente 75 nM y aproximadamente 1 nM, más preferiblemente, entre aproximadamente 50 nM y aproximadamente 1 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 25 nM y aproximadamente 1 nM en un ensayo in vitro de bioactividad de hepcidina-25. Preferiblemente, el ensayo in vitro del ensayo de bioactividad hepcidina-25 mide la absorción inducida por hepcidina y/o la degradación de ferroportina 1. Aún más preferiblemente, los Mabs anti-FPNl, o sus fragmentos de unión a antígeno, no unen uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 98, 183-214.
En modalidades particulares, los Mabs anti-FPNl, o sus fragmentos de unión a antígeno, de la presente invención se caracterizan por la unión de FPN1 humano que consiste de la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 1 en un epítope que comprende o que consiste esencialmente de o que consiste de un aminoácido o aminoácidos localizados para una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 12, 13, 14, 15, 16 y 95 con un KD menor de aproximadamente 100 nM, menor de aproximadamente 75 nM, menor de aproximadamente 50 nM, menor de aproximadamente 25 nM, o menor de aproximadamente 10 nM como se determina por SPR, preferiblemente a 25°C para Mabs y 37°C para Fabs y una IC50 entre aproximadamente 250 nM y aproximadamente 25 nM, preferiblemente entre 100 nM y aproximadamente 25 nM, o más preferiblemente entre 50 nM y aproximadamente 25 nM en un ensayo in vivo de bioactividad de hepcidina-25. Preferiblemente, el ensayo in vivo mide una disminución de IL-6-inducida en niveles de hierro en suero. Aún más preferiblemente, los Mabs anti-FPNl, o sus fragmentos de unión a antígeno, no unen uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 98, 183-214.
En modalidades particulares, los Mabs anti-FPNl, o sus fragmentos de unión a antígeno, de la presente invención se caracterizan por la unión de FPN1 humano que consiste de la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID N0:l en un epítope que comprende o que consiste esencialmente de o que consiste de un aminoácido o aminoácidos localizados para una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 12, 13, 14, 15, 16 y 95 con un KD entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente .5 nM, preferiblemente, entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 nM, más preferiblemente, entre aproximadamente 75 nM a aproximadamente 5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 50 nM a aproximadamente 10 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 15 nM a aproximadamente 10 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 10 nM a aproximadamente .5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente .5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente .7 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 3 nM a aproximadamente .7 nM, o más preferiblemente, de aproximadamente 3 nM a aproximadamente 1 nM, como se determina por SPR, preferiblemente a 25°C para Mabs y 37°C para Fabs y se caracteriza adicionalmente por que tienen una IC50 entre aproximadamente 250 nM y aproximadamente 25 nM, preferiblemente entre 100 nM y aproximadamente 25 nM, o más preferiblemente entre 50 nM y aproximadamente 25 nM en un ensayo in vivo de bioactividad de hepcidina-25. Preferiblemente, el ensayo in vivo mide una disminución IL-6-inducida en niveles de hierro en suero. Aún más preferiblemente, los Mabs anti-FPNl, o sus fragmentos de unión a antígeno, no unen uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 98, 183-214.
En modalidades particulares, los Mabs anti-FPNl, o sus fragmentos de unión a antígeno, de la presente invención se caracterizan por la unión de FPN1 humano que consiste de la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO:l en un epítope que comprende o que consiste esencialmente de o que consiste de un aminoácido o aminoácidos localizados para una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 12, 13, 14, 15, 16 y 95 con un KD entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente .5 nM, preferiblemente, entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 nM, más preferiblemente, entre aproximadamente 75 nM a aproximadamente 5 nM, aún más preferiblemente , entre aproximadamente 50 nM a aproximadamente 10 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 15 nM a aproximadamente 10 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 10 nM a aproximadamente .5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente .5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente .7 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 3 nM a aproximadamente .7 nM, o más preferiblemente, de aproximadamente 3 nM a aproximadamente 1 nM, como se determina por SPR, preferiblemente a 25°C para Mabs y 37°C para Fabs, tienen una velocidad de disociación (koff) para ferroportina 1 humana entre aproximadamente 7.5 x 10"3 s"1 y aproximadamente 1 x 10"4 s"1, preferiblemente entre aproximadamente 2.5 x 10"3 s"1 y aproximadamente 1 x 104 s"1, más preferiblemente entre aproximadamente 1 x 10"3 s"1 y aproximadamente 1 x 10~4 s"1, y aún más preferiblemente entre aproximadamente 5 x 10~4 s"1 y aproximadamente 1 x 10"4 s"1, como se determina por SPR, preferiblemente, a 25°C para Mabs y 37°C para Fabs y se caracteriza adicionalmente por que tienen una IC50 entre aproximadamente 250 nM y aproximadamente 25 nM, preferiblemente entre 100 nM y aproximadamente 25 nM, o más preferiblemente entre 50 nM y aproximadamente 25 nM en un ensayo in vivo de bioactividad de hepcidina-25. Preferiblemente, el ensayo in vivo mide una disminución IL-6-inducida en niveles de hierro en suero. Aún más preferiblemente, los abs anti-FPNl, o sus fragmentos de unión a antígeno, no unen uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 98, 183-214.
En modalidades particulares, los Mabs anti-FPNl, o sus fragmentos de unión a antígeno, de la presente invención comprenden LCDR1, LCDR2 , LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NOs: 37, 129, 22, 107, 118, y 120, respectivamente, y la unión de FPN1 humano que consiste de la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID N0:1 en un epítope que comprende o que consiste esencialmente de o que consiste de un aminoácido o aminoácidos localizados para una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 12, 13, 14, 15, 16 y 95 con un KD menor de aproximadamente 100 nM, menor de aproximadamente 75 nM, menor de aproximadamente 50 nM, menor de aproximadamente 25 nM, o menor de aproximadamente 10 nM como se determina por SPR, preferiblemente, a 25°C para Mabs y 37°C para Fabs y una velocidad de disociación (koff) para ferroportina 1 humana entre aproximadamente 7.5 x 10~3 s" 1 y aproximadamente 1 x 10"4 s"1, preferiblemente entre aproximadamente 2.5 x 10"3 s"1 y aproximadamente 1 x 10"4 s"1, más preferiblemente entre aproximadamente 1 x 10"3 s"1 y aproximadamente 1 x 10"4 s"1, y aún más preferiblemente entre aproximadamente 5 x 10"4 s"1 y aproximadamente 1 x 10"4 s"1, como se determina por SPR, preferiblemente, a 25°C para Mabs y 37°C para Fabs y se caracteriza adicionalmente por que tienen una IC50 entre aproximadamente 250 nM y aproximadamente 25 nM, preferiblemente entre 100 nM y aproximadamente 25 nM, o más preferiblemente entre 50 nM y aproximadamente 25 nM en un ensayo in vivo de bioactividad de hepcidina-25. Preferiblemente, el ensayo in vivo mide una disminución IL-6-inducida en niveles de hierro en suero. Aún más preferiblemente, los Mabs anti-FPNl, o sus fragmentos de unión a antígeno, no unen uno o más pép idos seleccionados del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 98, 183-214.
En algunas modalidades, los Mabs anti-FPNl, o sus fragmentos de unión a antígeno, de la presente invención comprenden LCDR1 , LCDR2, LCDR3 , HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NOs : 37, 129, 22, 107, 118, y 120, respectivamente, y la unión de FPNl humano que consiste de la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO:l en un epítope que comprende o que consiste esencialmente de o que consiste de un aminoácido o aminoácidos localizados para una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 12, 13, 14, 15, 16 y 95 con un KD entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente .5 nM, preferiblemente, entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 nM, más preferiblemente, entre aproximadamente 75 nM a aproximadamente 5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 50 nM a aproximadamente 10 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 15 nM a aproximadamente 10 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 10 nM a aproximadamente .5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente .5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente .7 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 3 nM a aproximadamente .7 nM, o más preferiblemente, de aproximadamente 3 nM a aproximadamente l nM, como se determina por SPR, preferiblemente, a 25°C para Mabs y 37°C para Fabs y una velocidad de disociación (koff) para ferroportina 1 humana entre aproximadamente 7.5 x 10~3 s" 1 y aproximadamente 1 x 10"4 s"1, preferiblemente entre aproximadamente 2.5 x 10"3 s"1 y aproximadamente 1 x 10"4 s"1, más preferiblemente entre aproximadamente 1 x 10"3 s"1 y aproximadamente 1 x 10~4 s"1, y aún más preferiblemente entre aproximadamente 5 x 10"4 s"1 y aproximadamente 1 x 10"4 s"1, como se determina por SPR, preferiblemente, a 25°C para Mabs y 37°C para Fabs y se caracteriza adicionalmente por que tienen una IC50 entre aproximadamente 250 nM y aproximadamente 25 nM, preferiblemente entre 100 nM y aproximadamente 25 nM, o más preferiblemente entre 50 nM y aproximadamente 25 nM en un ensayo in vivo de bioactividad de hepcidina-25. Preferiblemente, el ensayo in vivo mide una disminución IL-6-inducida en niveles de hierro en suero. Aún más preferiblemente, los Mabs anti-FPNl, o sus fragmentos de unión a antígeno, no unen uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 98, 183-214.
En algunas modalidades de la presente invención, los Mabs anti-FPNl, o sus fragmentos de unión a antígeno, se caracterizan por la unión de FPN1 humano que consiste de la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID N0:1 en un epítope que comprende o que consiste esencialmente de o que consiste de un aminoácido o aminoácidos localizados para una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 12, 13, 14, 15, 16 y 95 con un KD menor de aproximadamente 75 nM, menor de aproximadamente 50 nM, menor de aproximadamente 25 nM, o menor de aproximadamente 10 nM como se determina por SPR, preferiblemente, a 25°C para Mabs y 37°C para Fabs y que tienen una IC50 entre aproximadamente 250 nM y aproximadamente 25 nM, preferiblemente entre 100 nM y aproximadamente 25 nM, o más preferiblemente entre 50 nM y aproximadamente 25 nM en un ensayo in vivo de bioactividad de hepcidina-25 y se caracteriza adicionalmente por que tienen una IC50 entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1 nM, preferiblemente entre aproximadamente 75 nM y aproximadamente 1 nM, más preferiblemente, entre aproximadamente 50 nM y aproximadamente 1 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 25 nM y aproximadamente 1 nM en un ensayo in vifcro de bioactividad de hepcidina-25. Preferiblemente, el ensayo in vivo mide una disminución IL-6-inducida en niveles de hierro en suero. Preferiblemente, el ensayo in vitro de ensayo de bioactividad de hepcidina-25 mide la absorción inducida por hepcidina y/o degradación de ferroportina 1. Aún más preferiblemente, los Mabs an i-FPNl, o sus fragmentos de unión a antígeno, no unen uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 98, 183-214.
En modalidades particulares, los Mabs anti-FPNl, o sus fragmentos de unión a antígeno, de la presente invención se caracterizan por la unión de FPN1 humano que consiste de la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO:l en un epítope que comprende o que consiste esencialmente de o que consiste de un aminoácido o aminoácidos localizados para una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 12, 13, 14, 15, 16 y 95 con un KD entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente .5 nM, preferiblemente, entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 nM, más preferiblemente, entre aproximadamente 75 nM a aproximadamente 5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 50 nM a aproximadamente 10 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 15 nM a aproximadamente 10 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 10 nM a aproximadamente .5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente .5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente .7 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 3 nM a aproximadamente .7 nM, o más preferiblemente, de aproximadamente 3 nM a aproximadamente 1 nM, como se determina por SPR, preferiblemente, a 25°C para Mabs y 37°C para Fabs y tienen una IC50 entre aproximadamente 250 nM y aproximadamente 25 nM, preferiblemente entre 100 nM y aproximadamente 25 nM, o más preferiblemente entre 50 nM y aproximadamente 25 nM en un ensayo in vivo de bioactividad de hepcidina-25 , y se caracteriza adicionalmente por que tienen una IC50 entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1 nM, preferiblemente entre aproximadamente 75 nM y aproximadamente 1 nM, más preferiblemente, entre aproximadamente 50 nM y aproximadamente 1 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 25 nM y aproximadamente 1 nM en un ensayo in vitro de bioactividad hepcidina-25. Preferiblemente, el ensayo in vivo mide una disminución IL-6-inducida en niveles de hierro en suero. Preferiblemente, el ensayo in vitro de ensayo de bioactividad hepcidina-25 mide la absorción inducida por hepcidina y/o degradación de ferroportina 1. Aún más preferiblemente, los Mabs anti-FPNl, o sus fragmentos de unión a antígeno, no unen uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 98, 183-214.
En algunas modalidades, la presente invención provee Mabs, o sus fragmentos de unión a antígeno, que unen FPN1 humano que consiste de la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID N0:1 en un epítope que comprende o que consiste esencialmente de o que consiste de un aminoácido o aminoácidos localizados para una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 12, 13, 14, 15, 16 y 95 y 1) un KD entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente .5 nM, preferiblemente, entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 nM, más preferiblemente, entre aproximadamente 75 nM a aproximadamente 5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 50 nM a aproximadamente 10 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 15 nM a aproximadamente 10 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 10 nM a aproximadamente .5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente .5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente .7 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 3 nM a aproximadamente .7 nM, o más preferiblemente, de aproximadamente 3 nM a aproximadamente 1 nM, como se determina por SPR, preferiblemente, a 25°C para Mabs y 37°C para Fabs, 2) una IC5o entre aproximadamente 250 nM y aproximadamente 25 nM, preferiblemente entre 100 nM y 5 aproximadamente 25 nM, o más preferiblemente entre 50 nM y aproximadamente 25 nM en un ensayo in vivo de bioactividad de hepcidina-25, 3) una IC50 entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente l nM, preferiblemente entre aproximadamente 75 nM y aproximadamente 1 nM, más preferiblemente, entre aproximadamente 50 nM y aproximadamente 1 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 25 nM y aproximadamente 1 nM en un ensayo in vitro de bioactividad hepcidina-25, y 4) una velocidad de disociación (k0ff) para ferroportina 1 humana entre aproximadamente 7.5 x 10"3 s"1 y aproximadamente 1 x 10"4 s"1, preferiblemente entre aproximadamente 2.5 x 103 s'1 y aproximadamente 1 x 10"4 s"1, más preferiblemente entre aproximadamente 1 x 10"3 s"1 y aproximadamente 1 x 10"4 s"1, y aún más preferiblemente entre aproximadamente 5 x 10"4 s'1 y aproximadamente 1 x 10"4 s"1, como se determina por SPR, preferiblemente, a 25°C para Mabs y 37°C para Fabs. Preferiblemente, el ensayo in vivo mide una disminución IL-6 -inducida en niveles de hierro en suero. Preferiblemente, el ensayo in vi tro del ensayo de bioactividad de hepcidina-25 mide la absorción inducida por hepcidina y/o degradación de ferroportina 1. Aún más preferiblemente, los Mabs anti-FPNl, o sus fragmentos de unión a antígeno, no unen uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 98, 183-214.
En modalidades particulares, los Mabs anti-FPNl, o sus fragmentos de unión a antígeno, de la presente invención comprenden una LCDR1 , LCDR2, LCDR3 , HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NOs: 37, 129, 22, 107, 118, y 120, respectivamente, y se caracterizan por que tienen una IC50 entre aproximadamente 250 nM y aproximadamente 25 nM, preferiblemente entre 100 nM y aproximadamente 25 nM, o más preferiblemente entre 50 nM y aproximadamente 25 nM en un ensayo in vivo de bioactividad de hepcidina-25. Preferiblemente, el ensayo in vivo mide una disminución IL-6-inducida en niveles de hierro en suero. Aún más preferiblemente, los Mabs anti-FPNl, o sus fragmentos de unión a antígeno, no unen uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste de SEQ ID NOS : 98, 183-214.
En modalidades particulares, los Mabs anti-FPNl, o sus fragmentos de unión a antígeno, de la presente invención comprenden una LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NOs : 37, 129, 22, 107, 118, y 120, respectivamente, y se caracterizan por que tienen una IC50 entre aproximadamente 250 nM y aproximadamente 25 nM, preferiblemente entre 100 nM y aproximadamente 25 nM, o más preferiblemente entre 50 nM y aproximadamente 25 nM en un ensayo in vivo de bioactividad de hepcidina-25, y una IC50 entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1 nM, preferiblemente entre aproximadamente 75 nM y aproximadamente 1 nM, más preferiblemente, entre aproximadamente 50 nM y aproximadamente 1 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 25 nM y aproximadamente 1 nM en un ensayo in vitro de bioactividad de hepcidina-25. Preferiblemente, el ensayo in vivo mide una disminución IL-6-inducida en niveles de hierro en suero. Preferiblemente, el ensayo in vitro de ensayo de bioactividad de hepcidina-25 mide la absorción inducida por hepcidina y/o degradación de ferroportina 1. Aún más preferiblemente, los Mabs anti-FPNl, o sus fragmentos de unión a antígeno, no unen uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 98, 183-214.
En modalidades particulares, los Mabs anti-FPNl, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención comprenden una LCDR1, LCDR2 , LCDR3, HCDR1, HCDR2 , y HCDR3 que comprenden la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOS: 37, 129, 22, 107, 118, y 120, respectivamente, y FPN1 humano de unión que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 en un epítope que comprende o que consta esencialmente o que consta de un aminoácido o aminoácidos localizados a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NOS: 12, 13, 14, 15, 16, y 95 con una KD menor de aproximadamente 100 mM, menor de aproximadamente 75 M, menor de aproximadamente 50 nM, menor de aproximadamente 25 nM, o menor de aproximadamente 10 nM como se determina por SPR, preferiblemente, a 25°C para Mabs y 37°C para Fabs y una IC50 entre aproximadamente 250 n y aproximadamente 25 nM, preferiblemente entre 100 nM y aproximadamente 25 nM, o más preferiblemente entre 50 nM y aproximadamente 25 nM en un ensayo in vivo de bioactividad de hepcidina-25. Preferiblemente, el ensayo in vivo mide una disminución inducida por IL-6 en niveles de hierro en suero. Aún más preferiblemente, los Mabs anti-FPNl, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, no unen uno o más péptidos seleccionados del grupo que consta de SEQ ID NOS: 98, 183-214.
En modalidades particulares, los Mabs anti-FPNl, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención comprenden una LCDRl, LCDR2, LCDR3, HCDRl, HCDR2, y HCDR3 que comprenden la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOS: 37, 129, 22, 107, 118, y 120, respectivamente, y FPN1 humano de unión que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 en un epítope que comprende o que consta esencialmente o que consta de un aminoácido o aminoácidos localizados a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NOS: 12, 13, 14, 15, 16, y 95 con una KD entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 0.5 nM, preferiblemente, entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 nM, más preferiblemente, entre aproximadamente 75 nM a aproximadamente 5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 50 nM a aproximadamente 10 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 15 nM a aproximadamente 10 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 10 nM a aproximadamente 0.5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0.5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0.7 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 3 nM a aproximadamente 0.7 nM, o más preferiblemente, de aproximadamente 3 nM a aproximadamente 1 nM, como se determina por SPR, preferiblemente a 25°C para Mabs y 37°C para Fabs y caracterizada adicionalmente por tener una IC50 entre aproximadamente 250 nM y aproximadamente 25 nM, preferiblemente entre 100 nM y aproximadamente 25 nM, o más preferiblemente entre 50 nM y aproximadamente 25 nM en un ensayo in vivo de bioactividad de hepcidina-25. Preferiblemente, el ensayo in vivo mide una disminución inducida por IL-6 en niveles de hierro en suero. Aún más preferiblemente, los Mabs anti-FPNl, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, no unen uno o más péptidos seleccionados del grupo que consta de SEQ ID NOS: 98, 183-214.
En modalidades particulares, los Mabs anti-FPNl, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención comprenden una LCDRl, LCDR2, LCDR3 , HCDRl, HCDR2 , y HCDR3 que comprenden la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOS: 37, 129, 22, 107, 118, y 120, respectivamente, y FPN1 humano de unión que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 en un epítope que comprende o que consta esencialmente o que consta de un aminoácido o aminoácidos localizados a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NOS: 12, 13, 14, 15, 16, y 95 con una KD entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 0.5 nM, preferiblemente, entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 nM, más preferiblemente, entre aproximadamente 75 nM a aproximadamente 5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 50 nM a aproximadamente 10 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 15 nM a aproximadamente 10 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 10 nM a aproximadamente 0.5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0.5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0.7 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 3 nM a aproximadamente 0.7 nM, o más preferiblemente, de aproximadamente 3 nM a aproximadamente 1 nM, como se determina por SPR, preferiblemente a 25°C para Mabs y 37°C para Fabs, tienen una velocidad de disociación {koff) para ferroportina humana 1 entre aproximadamente 7.5 x 10"3s"1 y aproximadamente 1 x 10~s_1, preferiblemente entre aproximadamente 2.5 x 10"3s"1 y aproximadamente 1 x 10" s"1, más preferiblemente entre aproximadamente 1 x 10"3s_1 y aproximadamente 1 x lO^s"1, y aún más preferiblemente entre aproximadamente 5 x lO^s"1 y aproximadamente 1 x lO^s"1, como se determina por SPR, preferiblemente, a 25°C para Mabs y 37°C para Fabs y se caracterizan adicionalmente por tener una IC50 entre aproximadamente 250 n y aproximadamente 25 nM, preferiblemente entre 100 nM y aproximadamente 25 nM, o más preferiblemente entre 50 nM y aproximadamente 25 nM en un ensayo in vivo de bioactividad de hepcidina-25. Preferiblemente, el ensayo in vivo mide una disminución inducida por IL-6 en niveles de hierro en suero. Aún más preferiblemente, los Mabs anti-FPNl, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, no unen uno o más péptidos seleccionados del grupo que consta de SEQ ID NOS: 183-214.
En modalidades particulares, los Mabs anti-FPNl, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención comprenden una LCDRl, LCDR2, LCDR3, HCDRl, HCDR2 , y HCDR3 que comprenden la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOS: 37, 129, 22, 107, 118, y 120, respectivamente, y FPN1 humano de unión que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 en un epítope que comprende o que consta esencialmente o que consta de un aminoácido o aminoácidos localizados a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NOS : 12, 13, 14, 15, 16, y 95 con una KD menor de aproximadamente 100 nM, menor de aproximadamente 75 nM, menor de 7 aproximadamente 50 nM, menor de aproximadamente 25 nM, o menor de aproximadamente 10 nM como se determina por SPR, preferiblemente a 25°C para abs y 37°C para Fabs y una velocidad de disociación (kGff) para ferroportina humana 1 entre aproximadamente 7.5 x 10"3s_1 y aproximadamente 1 x 10" 4s"1, preferiblemente entre aproximadamente 2.5 x 10"3s_1 y aproximadamente 1 x 10~s_1, más preferiblemente entre aproximadamente 1 x 10"3s_1 y aproximadamente 1 x 10"4s"1, y aún más preferiblemente entre aproximadamente 5 x 10"4s_1 y aproximadamente 1 x 10~4s-1, como se determina por SPR, preferiblemente, a 25°C para Mabs y 37°C para Fabs y se caracterizan adicionalmente por tener una IC50 entre aproximadamente 250 nM y . aproximadamente 25 nM, preferiblemente entre 100 nM y aproximadamente 25 nM, o más preferiblemente entre 50 nM y aproximadamente 25 nM en un ensayo in vivo de bioactividad de hepcidina-25. Preferiblemente, el ensayo in vivo mide una disminución inducida por IL-6 en niveles de hierro en suero. Aún más preferiblemente, los Mabs anti-FPNl, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, no unen uno o más péptidos seleccionados del grupo que consta de SEQ ID NOS: 98,183-214.
En algunas modalidades de la presente invención, los Mabs anti-FPNl, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, comprenden una LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 , y HCDR3 que comprenden la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOS: 37, 129, 22, 107, 118, y 120, respectivamente, y FPN1 humano de unión que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 en un epítope que comprende o que consta esencialmente o que consta de un aminoácido o aminoácidos localizados a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NOS : 12, 13, 14, 15, 16, y 95 con una KD menor de aproximadamente 75 mM, menor de aproximadamente 50 mM, menor de aproximadamente 25 nM, o menor de aproximadamente 10 nM como se determina por SPR, preferiblemente, a 25°C para Mabs y 37°C para Fabs y tienen una IC50 entre aproximadamente 250 nM y aproximadamente 25 nM, preferiblemente entre 100 nM y aproximadamente 25 nM, o más preferiblemente entre 50 nM y aproximadamente 25 nM en un ensayo in vivo de bioactividad de hepcidina-25 y se caracteriza adicionalmente por tener una IC50 entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1 nM, preferiblemente entre aproximadamente 75 nM y aproximadamente 1 nM, más preferiblemente entre aproximadamente 50 nM y aproximadamente 1 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 25 nM y aproximadamente 1 nM en un ensayo in vitro de bioactividad de hepcidina-25. Preferiblemente, el ensayo in vivo mide una disminución inducida por IL-6 en niveles de hierro en suero. Preferiblemente, el ensayo in vitro de bioactividad de hepcidina-25 mide la absorción y/o degradación inducida por hepcidina de ferroportina 1. Aún más preferiblemente, los Mabs anti-FPNl, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, no unen uno o más péptidos seleccionados del grupo que consta de SEQ ID NOS: 98, 183-214.
En modalidades particulares, los Mabs anti-FPNl, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención comprenden una LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 , y HCDR3 que comprenden la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOS: 37, 129, 22, 107, 118, y 120, respectivamente, y FPN1 humano de unión que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 en un epítope que comprende o que consta esencialmente o que consta de un aminoácido o aminoácidos localizados a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NOS: 12, 13, 14, 15, 16, y 95 con una KD entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 0.5 nM, preferiblemente, entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 nM, más preferiblemente, entre aproximadamente 75 nM a aproximadamente 5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 50 nM a aproximadamente 10 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 15 nM a aproximadamente 10 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 10 nM a aproximadamente 0.5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0.5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0.7 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 3 nM a aproximadamente 0.7 nM, o más preferiblemente, de aproximadamente 3 nM a aproximadamente 1 nM, como se determina por SPR, preferiblemente a 25°C para Mabs y 37°C para Fabs y tienen una IC50 entre aproximadamente 250 nM y aproximadamente 25 nM, preferiblemente entre 100 nM y aproximadamente 25 nM, o más preferiblemente entre 50 nM y aproximadamente 25 nM en un ensayo in vivo de bioactividad de hepcidina-25 y se caracterizan además por tener una IC50 entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1 nM, preferiblemente entre aproximadamente 75 nM y aproximadamente 1 nM, más preferiblemente, entre aproximadamente 50 nM y aproximadamente 1 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 25 nM y aproximadamente 1 nM en un ensayo in vitro de bioactividad de hepcidina-25. Preferiblemente, el ensayo in vivo mide una disminución inducida por IL-6 en niveles de hierro en suero. Preferiblemente, el ensayo in vitro de bioactividad de hepcidina-25 mide la absorción y/o degradación inducida por hepcidina de ferroportina 1. Aún más preferiblemente, los Mabs anti-FPNl, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, no unen uno o más péptidos seleccionados del grupo que consta de SEQ ID NOS: 183-214.
En modalidades particulares, los Mabs anti-FPNl, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención comprenden una LCDR1, LCDR2 , LCDR3 , HCDR1, HCDR2 , y HCDR3 que comprenden la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOS: 37, 129, 22, 107, 118, y 120, respectivamente, y FPN1 humano de unión que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 en un epítope que comprende o que consta esencialmente o que consta de un aminoácido o aminoácidos localizados a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NOS : 12, 13, 14, 15, 16, y 95 y 1) una KD entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 0.5 nM, preferiblemente, entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 nM, más preferiblemente, entre aproximadamente 75 nM a aproximadamente 5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 50 nM a aproximadamente 10 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 15 nM a aproximadamente 10 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 10 nM a aproximadamente 0.5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0.5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0.7 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 3 nM a aproximadamente 0.7 nM, o más preferiblemente, de aproximadamente 3 nM a aproximadamente 1 nM, como se determina por SPR, preferiblemente a 25 °C para Mabs y 37°C para Fabs, 2) una IC50 entre aproximadamente 250 nM y aproximadamente 25 nM, preferiblemente entre 100 nM y aproximadamente 25 nM, o más preferiblemente entre 50 nM y aproximadamente 25 nM en un ensayo in vivo de bioactividad de hepcidina-25 , 3) una IC50 entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1 nM, preferiblemente, entre aproximadamente 75 nM y aproximadamente 1 nM, más preferiblemente, entre aproximadamente 50 nM y aproximadamente 1 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 25 nM y aproximadamente 1 nM en un ensayo in vitro de bioactividad de hepcidina-25, y 4) una velocidad de disociación (koff) para ferroportina humana 1 entre aproximadamente 7.5 x lO^s"1 y aproximadamente 1 x lO^s"1, preferiblemente entre aproximadamente 2.5 x lO^s"1 y aproximadamente 1 x 10"4s"1, más preferiblemente entre aproximadamente 1 x 10"3s"1 y aproximadamente 1 x 10~4s_1, y aún más preferiblemente entre aproximadamente 5 x lO^s"1 y aproximadamente 1 x 10"4s-1, como se determina por SPR, preferiblemente, a 25°C para Mabs y 37°C para Fabs. Preferiblemente, el ensayo in vivo mide una disminución inducida por IL-6 en niveles de hierro en suero. Preferiblemente, el ensayo in vitro de bioactividad de hepcidina-25 mide la absorción y/o degradación inducida por hepcidina de ferroportina 1. Aún más preferiblemente, los Mabs anti-FPNl, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, no unen uno o más péptidos seleccionados del grupo que consta de SEQ ID NOS: 98, 183-214.
En modalidades particulares, los Mabs anti-FPNl, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención comprenden una LCDRl, LCDR2 , LCDR3 , HCDR1, HCDR2 , y HCDR3 que comprenden la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOS: 37, 125, 22, 23, 110, y 19, respectivamente, y FPN1 humano de unión que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 en un epitope que comprende o que consta esencialmente o que consta de un aminoácido o aminoácidos localizados a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NOS : 12, 13, 14, 15, 16, y 95 y se caracterizan por tener una D entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 0.5 nM, preferiblemente, entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 nM, más preferiblemente, entre aproximadamente 75 nM a aproximadamente 5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 50 nM a aproximadamente 10 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 15 nM a aproximadamente 10 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 10 nM a aproximadamente 0.5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0.5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0.7 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 3 nM a aproximadamente 0.7 nM, o más preferiblemente, de aproximadamente 3 nM a aproximadamente 1 nM, como se determina por SPR, preferiblemente a 25°C para Mabs y 37°C para Fabs, 2) una IC50 entre aproximadamente 250 nM y aproximadamente 25 nM, preferiblemente entre 100 nM y aproximadamente 25 nM, o más preferiblemente entre 50 nM y aproximadamente 25 nM en un ensayo in vivo de bioactividad de hepcidina-25, 3) una IC50 entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1 nM, preferiblemente entre aproximadamente 75 nM y aproximadamente 1 nM, más preferiblemente, entre aproximadamente 50 nM y aproximadamente 1 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 25 nM y aproximadamente 1 nM en un ensayo in vitro de bioactividad de hepcidina-25, y 4) una velocidad de disociación (k0ff) para ferroportina humana 1 entre aproximadamente 7.5 x lO^s"1 y aproximadamente 1 x 10"4s"1, preferiblemente entre aproximadamente 2.5 x lO^s"1 y aproximadamente 1 x lO^s"1, más preferiblemente entre aproximadamente 1 x lO^s"1 y aproximadamente 1 x 10"4s"1, y aún más preferiblemente entre aproximadamente 5 x lO^s"1 y aproximadamente 1 x l0"4s"1, como se determina por SPR, preferiblemente, a 25°C para Mabs y 37°C para Fabs . Preferiblemente, el ensayo in vivo mide una disminución inducida por IL-6 en niveles de hierro en suero. Preferiblemente, el ensayo in vitro de bioactividad de hepcidina-25 mide la absorción y/o degradación inducida por hepcidina de ferroportina 1. Aún más preferiblemente, los Mabs anti-FPNl, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, no unen uno o más péptidos seleccionados del grupo que consta de SEQ ID NOS : 98, 183-214.
En modalidades particulares, los Mabs anti-FPNl, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención comprenden una LCDRl, LCDR2 , LCDR3 , HCDRl, HCDR2 , y HCDR3 que comprenden la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOS: 37, 177, 22, 23, 112, y 19, respectivamente, y FPN1 humano de unión que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 en un epítope que comprende o que consta esencialmente o que consta de un aminoácido o aminoácidos localizados a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NOS : 12, 13, 14, 15, 16, y 95 y se caracterizan por tener 1) una KD entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 0.5 nM, preferiblemente, entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 nM, más preferiblemente, entre aproximadamente 75 nM a aproximadamente 5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 50 nM a aproximadamente 10 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 15 nM a aproximadamente 10 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 10 nM a aproximadamente 0.5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0.5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0.7 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 3 nM a aproximadamente 0.7 nM, o más preferiblemente, de aproximadamente 3 nM a aproximadamente 1 nM, como se determina por SPR, preferiblemente a 25°C para Mabs y 37°C para Fabs, 2) una IC50 entre aproximadamente 250 nM y aproximadamente 25 nM, preferiblemente entre 100 nM y aproximadamente 25 nM, o más preferiblemente entre 50 nM y aproximadamente 25 nM en un ensayo in vivo de bioactividad de hepcidina-25, 3) una IC50 entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1 nM, preferiblemente entre aproximadamente 75 nM y aproximadamente 1 nM, más preferiblemente, entre aproximadamente 50 nM y aproximadamente 1 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 25 nM y aproximadamente 1 nM en un ensayo in vitro de bioactividad de hepcidina-25, y 4) una velocidad de disociación (koff) para ferroportina humana 1 entre aproximadamente 7.5 x lO^s"1 y aproximadamente 1 x 10"s"1, preferiblemente entre aproximadamente 2.5 x 10"3s_1 y aproximadamente 1 x 10"4s_1, más preferiblemente entre aproximadamente 1 x lO^s"1 y aproximadamente 1 x 10"4s_1, y aún más preferiblemente entre aproximadamente 5 x 10"4s"1 y aproximadamente 1 x 10"4s"1, como se determina por SPR, preferiblemente, a 25°C para Mabs y 37°C para Fabs. Preferiblemente, el ensayo in vivo mide una disminución inducida por IL-6 en niveles de hierro en suero. Preferiblemente, el ensayo in vitro de bioactividad de hepcidina-25 mide la absorción y/o degradación inducida por hepcidina de ferroportina 1. Aún más preferiblemente, los Mabs anti-FPNl, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, no unen uno o más péptidos seleccionados del grupo que consta de SEQ ID NOS: 98, 183-214.
En modalidades particulares, los Mabs anti-FPNl, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención comprenden una LCDRl, LCDR2, LCDR3, HCDRl, HCDR2, y HCDR3 que comprenden la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOS: 37, 122, 22, 23, 110, y 19, respectivamente, y FPN1 humano de unión que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 en un epítope que comprende o que consta esencialmente o que consta de un aminoácido o aminoácidos localizados a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NOS: 12, 13, 14, 15, 16, y 95 y se caracterizan por tener 1) una KD entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 0.5 nM, preferiblemente, entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 nM, más preferiblemente, entre aproximadamente 75 nM a aproximadamente 5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 50 nM a aproximadamente 10 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 15 nM a aproximadamente 10 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 10 nM a aproximadamente 0.5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0.5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0.7 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 3 nM a aproximadamente 0.7 nM, o más preferiblemente, de aproximadamente 3 nM a aproximadamente 1 nM, como se determina por SPR, preferiblemente a 25°C para Mabs y 37°C para Fabs, 2) una IC50 entre aproximadamente 250 nM y aproximadamente 25 nM, preferiblemente entre 100 nM y aproximadamente 25 nM, o más preferiblemente entre 50 nM y aproximadamente 25 nM en un ensayo in vivo de bioactividad de hepcidina-25 , 3) una IC50 entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1 nM, preferiblemente, entre aproximadamente 75 nM y aproximadamente 1 nM, más preferiblemente, entre aproximadamente 50 nM y aproximadamente 1 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 25 nM y aproximadamente 1 nM en un ensayo in vitro de bioactividad de hepcidina-25, y 4) una velocidad de disociación (koff) para ferroportina humana 1 entre aproximadamente 7.5 x 10"3s_1 y aproximadamente 1 x 10"4s"1, preferiblemente entre aproximadamente 2.5 x lO^s"1 y aproximadamente 1 x 10"4s"1, más preferiblemente entre aproximadamente 1 x lO^s"1 y aproximadamente 1 x 10"4s"1, y aún más preferiblemente entre aproximadamente 5 x 10"4s"1 y aproximadamente 1 x 10"4s_1, como se determina por SPR, preferiblemente, a 25°C para Mabs y 37°C para Fabs. Preferiblemente, el ensayo in vivo mide una disminución inducida por IL-6 en niveles de hierro en suero. Preferiblemente, el ensayo in vitro de bioactividad de hepcidina-25 mide la absorción y/o degradación inducida por hepcidina de ferroportina 1. Aún más preferiblemente, los 4 Mabs anti-FPNl, o fragmentos de unión a antigeno de los mismos, no unen uno o más péptidos seleccionados del grupo que consta de SEQ ID NOS: 98,183-214.
En modalidades particulares, los Mabs anti-FPNl, o fragmentos de unión a antigeno de los mismos, de la presente invención comprenden: a. una cadena ligera y una cadena pesada como se muestra en SEQ ID NO: 154 y SEQ ID NO: 152, respectivamente; b. una cadena ligera y una cadena pesada como se muestra en SEQ ID NO: 181 y SEQ ID NO: 179, respectivamente; o c. una cadena ligera y una cadena pesada como se muestra en SEQ ID NO: 158 y SEQ ID NO: 156, respectivamente; y FPN1 humano de unión que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 en un epítope que comprende o que consta esencialmente o que consta de un aminoácido o aminoácidos localizados a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NOS: 12, 13, 14, 15, 16, y 95 y se caracterizan por tener 1) una KD entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 0.5 nM, preferiblemente, entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 nM, más preferiblemente, entre aproximadamente 75 nM a aproximadamente 5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 50 nM a aproximadamente 10 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 15 nM a aproximadamente 10 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 10 nM a aproximadamente 0.5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0.5 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 5 nM a aproximadamente 0.7 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 3 nM a aproximadamente 0.7 nM, o más preferiblemente, de aproximadamente 3 nM a aproximadamente 1 nM, como se determina por SPR, preferiblemente a 25°C para Mabs y 37°C para Fabs, 2) una IC50 entre aproximadamente 250 nM y aproximadamente 25 nM, preferiblemente entre 100 nM y aproximadamente 25 nM, o más preferiblemente entre 50 nM y aproximadamente 25 nM en un ensayo in vivo de bioactividad de hepcidina-25 , 3) una IC50 entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1 nM, preferiblemente, entre aproximadamente 75 nM y aproximadamente 1 nM, más preferiblemente, entre aproximadamente 50 nM y aproximadamente 1 nM, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 25 nM y aproximadamente 1 nM en un ensayo in vitro de bioactividad de hepcidina-25, y 4) una velocidad de disociación (k0ff) para ferroportina humana 1 entre aproximadamente 7.5 x 10"3s"1 y aproximadamente 1 x 10"4s_1, preferiblemente entre aproximadamente 2.5 x 10"3s_1 y aproximadamente 1 x lO^s"1, más preferiblemente entre aproximadamente 1 x I0"3s_1 y aproximadamente 1 x lO^s"1, y aún más preferiblemente entre 6 aproximadamente 5 x lO^s"1 y aproximadamente 1 x lO^s"1, como se determina por SPR, preferiblemente, a 25°C para Mabs y 37°C para Fabs. Preferiblemente, el ensayo in vivo mide una disminución inducida por IL-6 en niveles de hierro en suero. Preferiblemente, el ensayo in vitro de bioactividad de hepcidina-25 mide la absorción y/o degradación inducida por hepcidina de ferroportina 1.
El término "que trata" (o "trata" o "tratamiento") se refiere a disminuir, interrumpir, suprimir, controlar, detener, reducir, o invertir el progreso o severidad de un síntoma, trastorno, condición, o enfermedad, pero no necesariamente involucra una eliminación total de todos los síntomas, condiciones o trastornos relacionados con la enfermedad.
El término "que previene" (o "previene" o "prevención") significa prohibir, reprimir, o inhibir la incidencia u ocurrencia de un síntoma, trastorno, condición, o enfermedad. Eventos agudos y condiciones crónicas se pueden tratar y prevenir. En un evento agudo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se administra en el inicio de un síntoma, trastorno, condición, o enfermedad, y se descontinúa cuando el evento agudo termina. Por el contrario, un síntoma, trastorno, condición o enfermedad crónica se trata durante un cuadro de tiempo más extenso.
Un "trastorno" es cualquier condición que puede 7 beneficiarse de tratamiento de acuerdo a la presente invención. Los términos "trastorno", "condición" y "enfermedad" se usan de manera intercambiable en la presente e incluyen trastornos promovidos por hepcidina madura, crónicos y agudos, incluyendo, pero sin limitación, anemia que incluye, pero sin limitación, anemia de enfermedad crónica.
El término "anemia de enfermedad crónica" se refiere a cualquier anemia que se desarrolla como un resultado de, por ejemplo, infección extendida, inflamación, y trastornos neoplásicos. La anemia que se desarrolla es a veces caracterizada por una extensión de la vida de glóbulos rojos acortada y el secuestro de hierro en macrófagos, lo que resulta en una disminución en la cantidad de hierro disponible para producir nuevos glóbulos rojos. Condiciones asociadas con anemia de enfermedad crónica incluyen, pero sin limitación, endocarditis bacteriana crónica, osteomielitis, fiebre reumática, colitis ulcerativa, y trastornos neoplásicos. Condiciones adicionales incluyen otras enfermedades y trastornos asociados con infección, inflamación, y neoplasmos, incluyendo, por ejemplo, infecciones inflamatorias (por ejemplo, abscesos pulmonares, tuberculosis) , trastornos no infecciosos inflamatorios (por ejemplo, artritis reumatoide, lupus eritrematoso sistémico, enfermedad de Crohn, hepatitis, enfermedad inflamatoria de intestino) , y varios canceres, tumores, y malignidades (por ejemplo, carcinoma, sarcoma, linfoma) . Anemia de enfermedad crónica se asocia con hipoferremia y secuestro de hierro celular reticuloendotelial .
Citoquinas inflamatorias son potentes inductores de expresión de hepcidina, y exceso de hepcidina pueden jugar una función clave en la patogénesis de anemia en estos pacientes ( eiss, et al., N. Engl . J. Med., 352:1011-1023 (2005); Pigeon. et al., J. Biol . Chem. 276:7811-7819 (2001); Nicolás, et al., J. Clin. Invest. 110:1037-1044 (2002); Nemeth, et al., J. Clin. Invest. 113:1271-1276 (2004); Nemeth, et al., Blood, 101:2461-2463 (2003); Lee, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA. , 102:1906-1910 (2005)). Mediadores inflamatorios tales como IL-6 pueden regular la expresión de hepcidina a través de STAT3 ( righting, et al., Blood, 108:3204-3209 (2006); Verga Falzacappa, et al., Blood, 109:353-358 (2007); Pietrangelo et al., Gastroenterology, 132:294-300 (2007)). Los datos presentados aquí proveen evidencia in vivo de que Mabs anti-FPNl de la presente invención incrementan los niveles de hierro en suero.
También se proveen por la presente invención métodos de tratamiento de anemia que comprenden la administración de Mabs anti-FPNl, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención. En algunas modalidades, el método de tratamiento de anemia comprende la etapa de administrar una composición farmacéutica que comprende un Mab anti-FPNl, o fragmentos de unión a antígeno del mismo, a un sujeto en riesgo o que exhibe patologías como se describe en la presente, por ejemplo, trastornos de anemia, usando técnicas de administración estándar.
La frase "cantidad efectiva" como se usa aquí se refiere a una cantidad necesaria (en dosificaciones y durante periodos de tiempo para los medios de administración) para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad efectiva del anticuerpo puede variar de acuerdo a factores tales como el estado de enfermedad, edad, género, y peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo o porción del anticuerpo para producir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad efectiva también es una en donde cualquier efecto tóxico o dañino del anticuerpo, se excede por los efectos benéficos terapéuticamente.
Una cantidad efectiva es al menos la cantidad mínima, pero menor que una cantidad tóxica, de un agente activo que es necesario para impartir un beneficio terapéutico a un sujeto. Establecida de otra manera, una cantidad efectiva o cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de la invención es una cantidad que en mamíferos, preferiblemente humanos, (i) incrementa niveles de hierro en suero, conteo de reticulocitos, conteo de glóbulos rojos, hemoglobina, y/o hematocritos, o (ii) trata un trastorno en donde la presencia de hepcidina madura causa o contribuye a un efecto patológico indeseado, o (iii) una disminución de bioactividad de hepcidina madura resulta en un efecto terapéutico benéfico en un mamífero, preferiblemente un humano, incluyendo sin limitación, anemia incluyendo sin limitación anemia de enfermedad crónica, incluyendo, pero sin limitación anemia que resulta de infección, inflamación, y/o cáncer. Una cantidad efectiva de un anticuerpo de la invención se puede administrar en una dosis sencilla o en dosis múltiples. Además, una cantidad efectiva de un anticuerpo de la invención se puede administrar en dosis múltiples de cantidades que pueden ser menores que una cantidad efectiva si no se administra más de una vez.
Como se sabe bien en las técnicas médicas, las dosis para cualquier sujeto dependen de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, área superficial corporal, edad, el compuesto particular a ser administrado, género, tiempo y ruta de administración, salud general, y otros fármacos que se administran concurrentemente. La dosis además puede variar dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad. Una dosis típica puede estar, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 100 mg; preferiblemente, aproximadamente 2 mg a aproximadamente 100 mg; más preferiblemente, aproximadamente 5 mg a aproximadamente 100 mg; aún más preferiblemente, aproximadamente 5 mg a aproximadamente 50 mg, aún más preferiblemente, aproximadamente 5 mg a aproximadamente 25 mg; aún más preferiblemente, aproximadamente 5 mg a aproximadamente 20 mg; aún más preferiblemente, aproximadamente 5 mg a aproximadamente 15 mg; sin embargo, dosis debajo o arriba de este intervalo ejemplar se contemplan, especialmente considerando los factores antes mencionados. Un régimen de dosificación parenteral diario puede ser de aproximadamente 10 µg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, preferiblemente de aproximadamente 100 ^qfk.q a aproximadamente 100 mg/kg, más preferiblemente, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, aún más preferiblemente, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aún más preferiblemente, de aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, o más preferiblemente de aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg. El progreso se puede monitorear por medio de valoración periódico, y la dosis ajustada en consecuencia.
Las cantidades sugeridas de anticuerpo anti-FPNl son sujetas a un gran trato de discreción terapéutica. El factor clave en la selección de una dosis apropiada y programación es el resultado obtenido. Los factores de consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que es tratado, la condición clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de suministro del anticuerpo, el tipo particular de anticuerpo, el método de administración, el programa de administración, y otros factores conocidos por los especialistas médicos.
Los anticuerpos de la presente invención se pueden usar como medicamentos en medicina humana, administrados por una variedad de rutas. Más preferiblemente, dichas condiciones son para administración parenteral . Dichas composiciones farmacéuticas se pueden preparar por métodos bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a ed. (1995) , Gennaro, A., et al., Mack Publishing Co.( y comprenden uno o más anticuerpos descritos en el presente documento, y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
El término parenteral como se usa en la presente incluye administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, rectal, vaginal o intraperitoneal . El suministro parenteral por medio de inyección intravenosa o intraperitoneal o subcutánea se prefiere. Se prefiere más la inyección subcutánea. Vehículos adecuados para dichas inyecciones se conocen bien en la técnica.
La composición farmacéutica típicamente debe ser estéril y estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento en el contenedor provisto, incluyendo, por ejemplo, un frasco sellado, jeringa u otro dispositivo de suministro, por ejemplo, una pluma. Por lo tanto, composiciones farmacéuticas pueden ser filtradas de forma estéril después de la elaboración de formulación, o hacerse de otra manera aceptable microbiológicamente .
Un anticuerpo de la invención se puede incorporar en una composición farmacéutica adecuada para administración a un sujeto humano. Un anticuerpo de la invención se puede administrar a un sujeto humano de manera individual o en combinación con un portador y/o diluyente farmacéuticamente aceptable en dosis sencillas o múltiples. Dichas composiciones farmacéuticas se diseñan para ser apropiadas para el modo seleccionado de administración, y diluyentes, portadores y/o excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes dispersantes, reguladores de pH, agentes tensioactivos, conservadores, agentes de solubilización, agentes de isotonicidad incluyendo sin limitación cloruro de sodio, agentes de estabilización y lo similar se usan como sea apropiado. Dichas composiciones se pueden diseñar de acuerdo con las técnicas convencionales descritas en, por ejemplo, Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19a Edición, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co.( Easton, PA (1995) que provee un compendio de técnicas de formulación como se conocen generalmente por los especialistas médicos. Portadores adecuados para composiciones farmacéuticas incluyen cualquier material que, cuando se combina con un anticuerpo de la invención, retiene la actividad de la molécula y no es reactivo con el sistema inmune del sujeto.
Los términos "sujeto" y "paciente" se usa de manera intercambiable aquí, se refiere a un mamífero, preferiblemente, un humano. En ciertas modalidades, el paciente tiene un trastorno que se puede beneficiar de un nivel disminuido de hepcidina madura, una disminución en bioactividad de hepcidina madura, y/o un incremento en nivel de hierro en suero, conteo de reticulocitos , conteo de glóbulos rojos, hemoglobina, y/o hematocritos .
La administración de un compuesto de anticuerpo FPN1 de manera individual puede ser útil en pacientes intolerantes a una o más ESAs, ya sea en cualquier dosis o solamente en altas dosis, debido a, por ejemplo, efectos secundarios indeseados . Un Mab FPN1 , o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la presente invención administrado de manera individual o en combinación con ESA, también puede ser útil en pacientes resistentes a ESA que son incapaces de alcanzar sus objetivos hematocritos con ESA solo, ya sea en dosis convencionales o dosis altas.
Un Mab FPN1, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la presente invención también se puede administrar cuando la terapia farmacológica de combinación, incluyendo el uso de ESA, es inadecuada para permitir que los pacientes alcancen sus objetivos hematocitos.
Los siguientes ejemplos no limitantes ilustran 5 varias propiedades de los anticuerpos anti-FPNl descritos aquí .
Ejemplo 1 Producción de hepcidina-25 humana Hepcidina-25 humana se puede obtener de fuentes comerciales (por ejemplo, Peptide International (Louisville, Kentucky) ) o producirse por una variedad de técnicas sintéticas o recombinantes conocidas en la técnica. Alternativamente, una proteína de fusión que comprende los veinticinco aminoácidos de secuencia hepcidina-25 humana y que tienen la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 91 se expresa en E. coli. Los cuerpos de inclusión se aislan de 3 litros de E. coli que expresan la proteína de fusión hepcidina humana después de una inducción de 3-6 horas con IPTG 1 mM a 37°C. Los cuerpos de inclusión se solubilizan en regulador de pH A (Tris 50 mM y urea 8M (pH 8.0)). El sobrenadante se pasa sobre una columna IMAC (20 mi de resina) La columna se lava con regulador de pH A hasta que la abosrbancia retorna a la línea base y los polipéptidos unidos se eluyan por lotes desde la columna por imidazol 0.5 M en regulador de pH A. La proteína de fusión hepcidina-25 humana se agrupa y se reduce con DTT 50 mM. Esta proteína de fusión entonces se redobla al diluir material agrupado en urea 2M, cisteína 3 mM, Tris 50 mM (pH 8.0) a una concentración de proteína final menor de 50 µ9/p?1. Este material se agita a temperatura ambiente y se oxida en aire durante 48 horas. Los polipéptidos oxidados se pasan sobre una columna IMAC (20 mi) en un caudal de 5 ml/minuto, y la proteína de fusión hepcidina-25 humana se eluye en lotes de la columna por imidazol 0.5 M en regulador de pH A. Las fracciones agrupadas que contienen la proteína de fusión hepcidina-25 humana se concentran y se pasan a través de una columna dimensionada Superdex 75 (GE Healthcare, XK26/60) equilibrada con Tris 50 mM, urea 4M, pH 8.0, en un caudal de 3 ml/minuto. La proteína de fusión monomérica se agrupa y después se diluye a Tris 50 mM, urea 2M, CaCl2 5 mM, pH 8.0 y entonces se divide con enteroquinasa para producir hepcidina-25 humana de SEQ ID NO: 1. La proteína de fusión hepcidina-25 humana no dividida se remueve por cromatografía IMAC pasiva (como se resumió anteriormente) . El flujo a través de la columna IMAC entonces se pasa sobre una columna de fase inversa C-18 a un caudal de 4.0 ml/minuto. La columna se lava con TFA 0.1% en agua hasta que la abosrbancia retorne a la línea base y los polipéptidos unidos se eluyen de la columna con un gradiente lineal de ACN de 20% a 40% con TFA 0.1% a una velocidad de 0.5%/minuto. Las fracciones que contienen el polipéptido hepcidina-25 humana se agrupan y se analizan por medio de secuenciación de aminoácidos N-terminal y espectrometría de masa desorción/ionización con láser asistida con matriz (MALDI-MS) . Los polipéptidos que codifican hepcidina-25 de rata, ratón mono Cynomolgus y varias formas truncadas terminalmente-N de hepcidina-25 humana, incluyendo hepcidina-22 y hepcidina-20 se obtienen comercialmente (por ejemplo, Peptide International) .
Ejemplo 2 Generación de 34A9 Fab Anticuerpos anti-FPNl se pueden obtener por inmunización de ratones con un péptido inmunogénico que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 11. Más específicamente, un péptido inmunogénico que comprende un epítope OVA enlazado por un enlazador de péptido a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 12, que se piensa es al menos parte de un bucle extracelular de FPN1 humano, se puede usar para inmunizar ratones. Después de la inmunización, los bazos de los ratones se colectan y las células de los bazos se clasifican por Magnetic Acivated Cell Sorting usando un péptido biotinilado que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 12 y perlas de estreptavidina. RNA se aisla de células de unión a antígeno y se convierten en DNAc usando oligo dT. Las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera de anticuerpo se obtienen por PCR usando iniciadores de estructura de anticuerpo y se clonan en un vector de fago para hacer una librería de 8 anticuerpo Fab. La librería de anticuerpo fago se clasifica con un péptido biotinilado, por ejemplo, 100 mM, que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 12. Los clones de unión positivamente entonces se caracterizan por secuenciación de DNA, la expresión de Fabs y unión al péptido de inmunización y/o células que expresan ferroportina humana.
Fab 34A9 se identifica siguiendo el procedimiento esencialmente como se describió anteriormente .
Ejemplo 3 Trazado de epítope de Mabs Anti-FPNl Los péptidos que contienen secuencias parciales del inmunógeno relacionado con FPNl se puede usar en experimentos de hibridación dot blot para determinar los epítopes del ratón Mab 34A9. Los siguientes péptidos se pueden sintetizar y disolver en agua (aminoácidos subrayados denotan secuencia de aminoácido FPNl real) : FpnE3a (SEQ ID NO: 96) : GGSPFEDIRSRFIQGESITPTKGC 060719Z (SEQ ID NO: 97) : GGSPFEDIRSRFIQGC 060719Y (SEQ ID NO: 98) : GGIQGESITPTKIPEITTEGC 0708L4A (SEQ ID NO: 99) : GGMPGSPLDLSVSPFEDGC 0708L4B (SEQ ID NO: 100) : GGSPLDLSVSPFEDIRSGC 0708L4C (SEQ ID NO: 101) : GGEDIRSRFIQGESITGC 0708L4D (SEQ ID NO: 102) : GGRSRFIQGESITPTKGC Para cada péptido, 3 µ? de 1-5 de péptido se mancha en una pieza de membrana de nitrocelulosa y se seca en aire . La membrana se bloquea con regulador de pH de bloqueo (por ejemplo, PBS que contiene BSA 1%) , después se incuba con 3-5 µg/ml de anticuerpo FPNl en regulador de pH de bloqueo a temperatura ambiente durante una hora. La membrana se lava tres veces, 5 minutos cada una, con PBST lx (fosfato sódico 10 mM, NaCl 150 mM, Tween-20 0.1%, pH 7.4) antes de que se incube con anticuerpo cabra-anti-ratón marcado con IR700 de acuerdo al protocolo del fabricante (LiCor, Inc; Lincoln, NE) , La membrana se lava tres veces, cinco minutos cada una, con PBST lx, se imagina en un sistema de formación de imagen Odyssey y software Odyssey (LiCor, Inc) .
La figura 1 indica que Mab 34A9 se une a péptidos FpnE3a, 060719Z, 0708L4C, y 0708L4D, todas las cuales contienen aminoácidos 409 a 415 de SEQ ID NO: 1. Mab 34A9 no requiere la secuencia de aminoácidos de EDI como se indica por la unión al péptido 0708L4D. Mab 34A9 se une débilmente a péptido 060719Z que a 0708L4C; el último péptido contiene aminoácidos 416-419 de FPNl (SEQ ID NO: 1) .
Ejemplo 4 Afinidades de Fabs y Mabs anti-FPNlcomo se determina por SPR Las afinidades de Fabs y Mabs de unión a FPNl se pueden determinar en Biacore TI00 y usando modelo de unión 1:1 en el software de evaluación T100 Biacore (BIAcore® AB, 1 0 Upsala, Suecia) . Brevemente, el sistema T-REx, un sistema de expresión regulado con tetraciclina disponible comercialmente sin trans-activadores virales (Invitrogen, Carlsbad, CA) se usa para generación de línea celular estable en células HEK 293 T-Rex. Todas las condiciones de crecimiento se describen en el manual T-REx provisto por Invitrogen. FPN1 es fusionada c-terminalmente con GFP. La expresión de FPN1-GFP se induce por 1-10 ng/ml doxiciclina durante 1-24 horas. Células inducidas se colectan al raspar los matraces y después lavar con PBS lx. Las pellas celulares se pueden almacenar a -80°C antes de usarse. Cerca de cinco millones de células inducidas se resuspenden en regulador de pH de fosfato 10 mM con T een-20 0.2% e inhibidores de proteasa. Por ejemplo, la tableta de cóctel de inhibidor proteasa Complete™ (Roche Diagnostics Corp., Indianápolis, IN) . Tres ciclos de congelamiento/descongelamiento/sonicación se usan para lisar las células. El lisado se diluye dos veces con regulador de pH que corre Biacore y se centrifuga para retirar residuos.
En Biacore T100, anticuerpo anti-GFP de conejo o anticuerpo anti-GFP cabra se inmoviliza sobre el flujo celular 1 a 4 de un chip CM5 en 5000-15000 Rus. FPN1-GFP se captura sobre flujo celular 2, 3 o 4 del lisado de células inducidas. El flujo celular 1 se usa como referencia. Entonces todas las células de flujo se inyectan con diferentes concentraciones de anticuerpos para evaluar la unión y cinéticas . Las mediciones basadas en resonancia plasmón superficial usando fragmentos de unión a antígeno univalentes tales como Fabs generalmente se prefieren para aquellos que usan anticuerpos multivalentes en este formato de ensayo para minimizar los efectos de afinidad. Las tablas 4a y 4b muestran las características de unión para Fabs de unión a FPNl anti-humano usando anticuerpo anti-GFP de conejo (Invitrogen, Carlsbad, CA (# de catálogo A11122)) y anticuerpo anti-GFP de cabra (R&D Systems, Minneapolis, MN (# de catálogo AF4240) ) , respectivamente.
Tabla 4(a) Cinéticas de unión de Fabs de anticuerpos FPNl a FPNl humano (determinado por Biacore T100 a 37 °C) Como se muestra en la tabla 4 (a) , la KD para FPNl humano del Fab 34A9 de ratón es aproximadamente 41 nM como se determina por SPR a 37°C en este formato de ensayo. La KD para FPNl humano del Fab IG9 Fab de ratón, una forma madura de afinidad del Fab 34A9 de ratón es aproximadamente 7.7 nM como se determina por SPR a 37°C, una mejora en la afinidad de unión de aproximadamente 5 veces. Fab 3D8, una forma humanizada del Fab IG9 de ratón que tiene la estructura de cadena pesada humana VHl-69 y estructura de cadena ligera 02, demuestra una KD para FPN1 humano de aproximadamente 10 nM como se determina por SPR a 37°C en este formato de ensayo.
Tabla 4(b) Cinéticas de unión de Fabs de anticuerpos FPN1 a FPN1 humano (determinado por Biacore T100 a 37 °C) Como se muestra en la tabla 4 (b) , la KD para FPN1 humano del Fab IG9 de ratón, una forma madura de afinidad del Fab 34A9 de ratón es aproximadamente 2.9 nM como se determina por SPR a 37°C en este formato de ensayo. Fab 3D8, una forma humanizada del Fab IG9 de ratón que tienen la estructura de cadena pesada humana VHl-69 y estructura de cadena ligera 02, demuestra una KD para FPN1 humano de aproximadamente 6.3 nM como se determina por SPR a 37°C en este formato de ensayo. Fabs 4A10-3 maduro de afinidad, Combill, y L2.2-4 demuestran una KD para FPN1 humano entre aproximadamente 2.4 nM a aproximadamente 1.8 nM como se determina por SPR a 37°C en este formato de ensayo La tabla 5 muestra las características de unión para Mabs de unión a FPNl anti-humano usando anticuerpo anti-GFP de conejo (Invitrogen, Carlsbad, CA (# de catálogo A11122) ) .
Tabla 5 Cinéticas de unión de Mabs a FPNl humano (determinado por Biacore T100 a 25°C o 37eC) La KD para FPNl humano del Mab 34A9 de ratón es aproximadamente 1.1 nM como se determina por SPR a 25°C. La KD para FPNl humano del Mab IG9 de ratón, una forma madura de afinidad del Mab 34A9 de ratón es aproximadamente 0.73 nM como se determina por SPR a 25°C. Una forma humanizada del Mab IG9 de ratón, 3D8 Mab, que tienen las estructuras de cadena pesada y ligera humana, VHl-69 y 02, respectivamente, demuestran una KD para FPNl humano de aproximadamente 3.4 nM como se determina por SPR a 37°C.
La KD para FPNl humano, determinada como se describe en este ejemplo, ilustra la generación de anticuerpos a FPNl humano que une FPNl humano con alta afinidad y, más específicamente, se une a un epítope de FPNl que está presente aún cuando FPNl humano se expresa por medio de células y se localiza a la membrana celular.
Ejemplo 5 Ensayo in vitro de los efectos de Mabs FPNl en niveles de ferritina celular Células Caco-2, una línea celular enterocito humano, que expresa de manera endógena FPNl se puede monitorear para cambios en ferritina. La concentración de ferritina en las células Caco-2 se pueden incrementar al agregar una fuente de hierro exógena y la concentración se puede aumentar adicionalmente con la adición de hepcidina que previene la exportación de hierro. En consecuencia, el efecto de anticuerpos FPNl anti-humano en hepcidina madura modula la regulación de hierro en células Caco-2 se pueden determinar como sigue.
Células Caco-2 se remueven del recipiente de cultivo celular usando tripsina (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Las células se colectan y se lavan en medio de crecimiento (por ejemplo, DMEM + FBS 10% + aminoácidos no esenciales 1% + antibióticos/antimicóticos 1%) y se colectan por centrifugación suave. Las células se resuspenden en medio de cultivo y se cuentan. La concentración celular se ajusta a 1 x 106 células/ml en medio de crecimiento y 2.5 µ? Fe :NTA 1 5 (preparado relación molar 1:4) se añade a las células. Cien µ? de células se añaden a pozos de una placa de pozo plano 96, seguido por la incubación durante 24 horas a 37°C, C02 5%. IgGi de ratón, un control negativo, y dos anticuerpos con diferentes afinidades a FPN1 humano se preparan en medio de crecimiento en 6x la concentración final. Diluciones de anticuerpo (25 µ?) o medio se añaden a los pozos por triplicado. Las placas se incuban a temperatura ambiente durante 15 minutos tiempo en el cual 25 µ? 5 µ? Fe : TA con o sin hepcidina 600 nM (concentración final 100 nM) se añaden a los pozos apropiados. Las células se incuban durante 24 horas a 37°C, C02 5% y después se lavan 3x con 200 µ? de PBS de Dulbecco y se lisan en 50 µ? de regulador de pH de ensayo de radioinmunoprecipitación (Tris 50 mM, pH 7.5, 150 mM NaCl, SDS 0.1%, Triton-X100® 1%, y desoxicolato de sodio 0.5%) más inhibidores de proteasa, por ejemplo, tableta de cóctel de inhibidor proteasa Complete™ (Roche Diagnostics Corp. , Indianápolis, IN) , se mezclan y congelan a -70°C hasta que se analicen para ferritina usando una ELISA.
Brevemente, placas microvaloradoras se recubren con 110 µ?/???? de 1 µg/ml de ferritina anti-humana (Leinco Technologies, St. Louis, MO) y se incuban durante la noche a 4°C. Las placas se lavan 2 veces con regulador de pH de lavado (Tris 0.02 M, NaCl 0.15 M, T een 20 0.1%, pH 7.4) y se bloquean con 150 µ? de caseína 1% en PBS (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) . Las placas se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente. Cien µ? de lisados y estándares (ferritina de hígado humano, Calbiochem/EMD Biosciences, La Jolla, CA) se añaden a los pozos apropiados y se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavan 3 veces y se detecta ferritina unida usando un conjugado anti-ferritina-HRP (Leinco Technologies) en dilución 1:2000 en 100 µ? por pozo e incubación durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavan 4 veces y 100 µ? de sustrato OPD (5 mg de tableta de sustrato, disuelta en 12.5 mi de Na2HP04 0.1 M, ácido cítrico 0.05 , pH 5.0 con 5 µ? de H202 30%) se dispensa en todos los pozos. La reacción se interrumpe con 100 µ? de HC1 1N después de 10 minutos. La absorbancia en 490 nm (A490) se lee usando un lector de placa ELISA apropiado. La concentración de proteína en cada muestra también se mide usando un kit de ensayo de proteína BCA (Thermo Fisher Scientific) . Para considerar las diferencias de pozo a pozo posibles en el número celular, los datos de concentración de ferritina se normalizan a concentración de proteína y el efecto de anticuerpos agregados se expresa como porcentaje de inhibición.
Experimentos conducidos como se describió en este ejemplo indican que los efectos de hepcidina-25 humana en concentración de ferritina en las células se inhiben por Mabs 34A9 e IG9 (tabla 6) . Además, los resultados muestran que la afinidad del Mab anti-FPNl tiene implicaciones directas en su funcionalidad. Más específicamente, entre más baja sea la afinidad Mab 34A9, aún en la concentración más alta (200 µ?/ta?) solamente inhibe ligeramente los efectos inducidos por hepcidina madura (25% de inhibición ± 0.5%), mientras que la afinidad más alta de Mab IG9 exhibe inhibición marcada en una materia dependiente de la dosis .
Tabla 6 Estos datos ilustran que Mabs IG9 y 34A9 bloquean la capacidad de hepcidina-25 humana de inducir la absorción y degradación de ferroportina y por tanto reducen el hierro exportado desde las células.
Ejemplo 6 Ensayo para la inhibición de hepcidna-25 humana de unión a FPN1 Células FPN-GFP/293 transfectadas establemente se colocan en placas recubiertas con poli-D-lisina en 60000 células por pozo en 80 µ? de medio de ensayo (DMEM 11965, FBS dializado 10%, 20 µ? FAC, penicilina-estreptomicina) y se incuban durante 4 horas a 37°C, C02 10%. Se añade doxiciclina a una concentración final de 11.2 nM para inducir expresión de FPN1. Se incuban las células control inducidas y no inducidas por doxiciclina durante la noche a 37°C. Posteriormente, el medio de crecimiento se descarta y se reemplaza con el anticuerpo de prueba o un anticuerpo control isotipo en 30 µ? de medio de ensayo o 30 µ? de medio de ensayo con control solamente y se incuba a 37°C durante 1 hora. Posteriormente, 20 µ? de hepcidina humana madura biotiniliada se añade a los pozos a una concentración final de 30 nM. Las muestras se establecen a parte durante 1 hora, a 37°C antes de lavarse cuatro veces con 200 µ? FBS 2%, D-PBS (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Posteriormente, 65 µ? de regulador de pH de lisado (Tritón 0.5% X-100, EDTA 10 mM) se añaden y las placas se agitan durante 10 minutos. Posteriormente, 50 µ? de la solución en cada pozo se transfiere a pozos individuales de una placa recubierta de estreptavidina (60 µ? de 2 de estreptavidina en PBS, se incuba a 4°C durante la noche, se lava 2 veces (Tween-20 0.1%, TBS) , se bloquea con caseína/PBS) , y después se incuban durante una hora a temperatura ambiente. Después, los pozos de las placas se lavan tres veces (Tween-20 0.1%, TBS) y 50 µ? de hepcidina-25 anti-humana Mab 3.23 en 0.5 µ9/p?1 se añade y las muestras se incuban una hora a temperatura ambiente. La hepcidina-25 Mab anti-humana 3.23 se describe en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional PCT WO 2009/058797. Después, las placas se lavan tres veces y 50 µ? de peroxidasa de rábano picante- IgG anti-humana (HRP) se añade en una dilución de 1:2000. Después de la incubación durante una hora a temperatura ambiente, 50 µ? de sustrato OPD se añade. La reacción se interrumpe con 100 µ? de HCl 1N 100 µ? después de 4 minutos. La absorbancia a 490 nm (A90) se lee usando un lector de placa ELISA apropiado.
Tabla 7 Datos generados en experimentos conducidos esencialmente descritos en el ejemplo 6 de muestran que Mabs IG9 y 34A9 inhiben la capacidad de hepcidina-25 humana para unir FPN1 humano.
Ejemplo 7 Ensayo basado en células para inhibición de anticuerpo ant-FPN1 de absorción y degradación inducida por hepcidina-25 Un ensayo basado en células in vi tro se puede usar para medir la actividad de neutralización de hepcidina madura de Mabs, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, dirigido contra FPN1 humano. Dicho ensayo se puede basar en absorción y degradación inducida por hepcidina madura de su receptor, FPN1. Por ejemplo, una línea celular estable HEK 293 se prepara permitiendo la expresión inducible de FPN1. FPN1 es fusionada C-terminalmente con GFP para propósitos de rastreo. La expresión inducible de la molécula FPN1-GFP se controla usando el sistema T-REx (Invitrogen, Carlsbad, CA) . La secuencia de codificación de FPN1-GFP se clona en vector pCDNA4/T0, que contiene un promotor inducible y un marcador de resistencia Zeocina. El constructo resultante se transfecta en células T-REx-293 que expresan la proteína reguladora requerida para la expresión inducible por doxiciclina. Los clones resistentes a zeocina se analizan para la expresión inducible de FPN-GFP. Las condiciones de crecimiento celular son esencialmente como se describe en el manual de usuario del fabricante para el System T-REx (Invitrogen) . Brevemente, las células se desarrollan en DMEM, FBS dializado 10%, 20 µ? FAC, más 5 µg/ml de penicilina-estreptomicina. Se mantiene la selección con 100 µg/ml de zeocina y 5 µg/ml de blasticidina. Las células se colocan en placas negras/claras de 96 pozos que se recubren con poli-D-lisina. Un lector de placa fluorescente de alta resolución, HTS Explorer Acumen se usa para la lectura la fluorescencia total por pozo.
Después de a tripsinización, se siembra la palca de ensayo de 96 pozos con 90000 células/pozo usando la línea celular estable FPNl-GFP/TREx. Se siembra volumen por pozo de 1 80 µ?. Se dejan unir a las células durante la noche. A la mañana siguiente, se añaden 9 µ? de 30 ng/ml de doxiciclina a cada pozo para inducir la expresión de FPN1-GFP. Después de 8 horas de inducción a 37°C, el medio se aspira y los pozos se lavan cuidadosamente con 15 µ?/???? de PBS .
Los tratamientos deseados (por ejemplo, hepcidina-25 humana y/o anticuerpos de prueba) se establecen en un formato de 96 pozos para adición rápida a una placa de ensayo después de lavar. El volumen de ensayo final por pozo es de 45 µ? . Inmediatamente después de agregar los tratamientos, la placa de ensayo se lee usando el Acumen Explorer (se establece a 550 volts en canal 1) . Esta lectura generalmente es la hora 0 de lectura y se usa para normalizar el número celular por pozo, que se correlaciona con las unidades de fluorescencia total (FLU) por pozo. Para la absorción y degradación inducida por hepcidina humana madura de FPNl, el efecto máximo se observa en 0.5 µ? de hepcidina humana madura La IC50 de hepcidina madura humana es aproximadamente 10 nM. Para ensayos de neutralización de anticuerpo anti-FPNl, la concentración de hepcidina-25 humana se mantiene a 120 nM y los Mabs anti-FPNl se analizan en 600 nM, 200 nM, 67 nM, 22 nM, y 7.4 nM. Las placas se incuban durante 24 horas, después de los cual, se leen nuevamente, y los datos se generan como la relación de FLU total por pozo en 24 horas divididas por el FLU total por pozo en 0 horas . Todos los puntos de datos se realizan por cuadriplicado. El porcentaje de inhibición (%) se determina al sustraer los valores para tratamiento con hepcidina humana madura 120 nM, y entonces se dividen los valores tratados con anticuerpo FPNl por el valor tratado con hepcidina-25 no humana.
En un ensayo in vitro conducido esencialmente como se describió anteriormente, la bioactividad de hepcidina-25 humana se neutraliza con varios anti-FPNl Mabs con un porcentaje de inhibición medido como se muestra en la tabla 8 posterior .
Tabla 8 Porcentaje de inhibición (%) anti-FPNl Mab de absorción y degradación inducida por hepcidina humana madura in vitro Los datos generados en experimentos conducidos esencialmente como se describe en el ejemplo 7 soportan la conclusión de que Mabs IG9, 34A9, y 3D8 inhiben grandemente la capacidad de hepcidina-25 humana para provocar la absorción y degradación de FPN1 humano in vi tro.
Ejemplo 8 Bioactividad de Mab IG9 en relación a una IgG Murina control después de dosis intravenosa sencilla a monos Cynomolgus Los efectos fisiológicos de Mab IG9 murina FPN1 anti-humano en niveles de hepcidina en suero y hierro en suero se investigan al administrar el Mab como una dosis intravenosa sencilla a monos macho Cynomolgus {Macaca fascicularis; 3-4 kg) y comparar sus efectos a una administración control de IgGl murina. Después de la administración de muestras de sangre se colectan para análisis de hierro en suero y hepcidina en suero. La dosis (30 mg/kg) se administra como una inyección vía una vena safena. Inmediatamente después de la administración de dosis, pero antes de que se retire la aguja del animal, el aparato de dosis se purga con aproximadamente 2 mi de solución salina Tabla 9 Concentración Volumen (mg/mL) (mL/kg) 1 Control lgG1 murina 9.53 3.15 2 1G9 murina 12.6 2.38 Muestreo para hepcidina en suero La sangre se colecta antes de la dosificación y en 0.5, 1, 3, 6, 10, 24, 48, 72, 96 y 168 horas después de la dosis. La sangre (aproximadamente 0.5 mi) se colecta vía una vena femoral en tubos que no contienen anticoagulante. La sangre se deja coagular bajo condiciones ambiente antes de la centrifugación para obtener suero. Las muestras de suero se colocan en hielo seco antes de almacenarse a aproximadamente -70°C. uestreo de hierro en suero La sangre se colecta antes de la dosificación y en 1, 3, 6, 24, 48, 72, 96 y 168 horas después de la dosis. Todas las muestras de sangre se colectan, manejan, procesan, almacenan y analizan de acuerdo con métodos considerados aceptables dentro de la comunidad médica. Los niveles de hierro en suero se pueden medir por medio de cualquier método conocido en la técnica que generalmente se considera dentro de la comunidad médica para ser un método aceptable de medición de hierro en suero total (Fe) . Las concentraciones en suero de hepcidina se determinan por cromatografía liquida-espectrometría de masa esencialmente como se describe en Murphy, et al., Blood, 110:1048-54 (2007). Ensayos para la medición de hierro en suero se conocen bien en la técnica (ver, por ejemplo, Goodwin, J.F., et al., Clinical Chemistry 12: 47-57 (1966), y J. Clin. Path. , 24:334-335 (1971)).
Las concentraciones de hepcidina en suero no se afectan por la administración de IgGl murina control y varían de 1.5 a 31 ng/ml conforme pasa el tiempo estudiado. Los niveles de hepcidina promedio en los animales control son 11.5 ± 8.8 ng/ml (media ± SD) . Después de la administración de Mab IG9 murina, los niveles de hepcidina en suero se elevan de una línea base de 7.6 y 14.7 ng/ml a un pico de 49.7 y 79.1 ng/ml, respectivamente. El pico en hepcidina en suero ocurre aproximadamente 10 horas después de la administración de la Mab IG9 murina (figura 6) . La elevación de hepcidina en suero es probable que se deba a la interacción de Mab IG9 murina con su objetivo FPN1, que, durante la unión a FPN1 bloquea la interacción de FPN1 y hepcidina, con lo cual se disminuye la evacuación y/o absorción de FPN1.
No se eleva el hierro en suero en animales tratados con igG murina control y varía de 64 a 97 µg/dl durante el cuadro de tiempo estudiado. Después de la administración de Mab IG9 murina, los niveles de hierro en suero se elevan desde una línea base de 136 y 144 µg/dl a un pico de 306 y 292 µg/dl, respectivamente. El pico en hierro en suero ocurre aproximadamente 48 horas después de la administración de Mab IG9 murina (figura 7) . Los niveles de hierro en suero gradualmente retornan a la línea base 96 horas después de la administración, indicando que la elevación de niveles de hierro en suero es irreversible.
Ejemplo 9 Ensayo basado en células para la inhibición de anticuerpo anti-FPNl de absorción y degradación inducida por hepcidina-25 Experimentos conducidos esencialmente como se describe en el ejemplo 7 anterior demuestran que Mabs Combi-11, 4A10-3, y L2.2-4 inhiben absorción y degradación inducida por hepcidina-25 humana de FPN1 humano más efectivamente in vitro en comparación con Mabs 34A9, 3D8, y IG9 (ver la tabla 10) . Más específicamente, los Mabs anti-FPNl se analizan en una curva de concentración de 9 puntos iniciando en 900 nM y realizando diluciones consecutivas tres veces. El porcentaje de inhibición (%) se determina al sustraer los valores para 120 nM de tratamiento con hepcidina, y después al dividir los valores tratados con Mab por el valor no tratado con hepcidina. IC50 relativa se determina en Sigma plot . El porcentaje de inhibición máximo (%) así como IC50 relativa y absoluta se muestra en la tabla 10.
Tabla 10 N.C. : El ajuste de la curva máxima no alcanza 50% de modo que IC50 absoluta no se puede calcular.
Ejemplo 10 Efecto farmacodinámico de anticuerpos monoclonales anti-ferroportina humanizada 4A10-3 en monos Cynomolgus Los parámetros farmacodinámicos de Mabs anti-ferroportina se puede estudiar después de la administración de dosis intravenosas a monos macho Cynomolgus de acuerdo a métodos conocidos por aquellos con experiencia en la técnica. Por ejemplo, en cinco estudios independientes Mab 4A10-3 se administra a monos Cynomolgus como un bolo intravenoso sencillo (n=4/grupo) en dosis de 0.3, 1.0, 3.0, 10 y 30 mg/kg Las muestras de sangre (aproximadamente 0.5 mi para parámetros de hierro) se toman antes de la primera dosis y en 1, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 168 y 264 horas después de la dosis En niveles de dosis más altas, las muestras de sangre adicionales se toman en 360, 456, 552, y 648 horas después de la dosis. En el momento de dosificación, el animal pesa entre 2 a 3 kg. Las muestras de sangre se colectan de cada animal vía una vena femoral en tubos que no contienen anticoagulante.
Los perfiles de concentración de hierro en suero-tiempo después de la administración intravenosa de 0.3, 1.0, 3.0, 10 y 30 mg/kg Mab 4A10-3 a monos Cynomolgus macho se asocian con un incremento dependiente de la dosis en hierro en suero que tiene un máximo en 24 horas después de la dosificación. No se observa diferencia en la respuesta de hierro pico (aproximadamente un incremento de 2 veces) o duración de respuesta entre las dosis de 10 mg/kg y 30 mg/kg. Los animales se administran con dosis de 0.3, 1.0, y 3.0 mg/kg de hierro en suero que retornan a los valores de línea base aproximadamente 48 horas después de la dosificación. En los animales administrados con dosis de 10 mg/kg y 30 mg/kg, el hierro en suero retorna a los valores de línea base alrededor de 72 horas después de la dosificación.
Además, en un estudio sencillo, la administración de una inyección subcutánea sencilla de Mab 4A10-3 en una dosis de 10 mg/kg produce una respuesta idéntica (n=2; media ± SD) en hierro en suero, en intensidad y duración, como se observa después de la dosis intravenosa equivalente (n=4; media ± SD) .
Ejemplo 11 Parámetros farmacocinéticos de anticuerpos monoclonales anti-ferroportina humanizada en ratas y monos Cynomolgus Los parámetros farmacocinéticos de abs anti-ferroportina se pueden estudiar in vivo de acuerdo a métodos bien conocidos en la técnica. En los estudios ejemplares, los parámetros farmacocinético de Mabs 4A10-3 anti-FPNl y Combi 11 se investigan después de las dosis intravenosas a monos Cynomolgus macho y ratas Sprague Dawley. En el momento de la dosificación de monos Cynomolgus usados pesan entre 2.2 y 5.5 kg y las ratas Sprague Dawley pesan entre 240 y 265 g.
El estudio farmacocinético conducido en monos Cynomolgus se realiza en tres fases, con dosis en 1.0 mg/kg, 3.0 mg/kg, y 0.3 mg/kg administrados en aproximadamente 2 intervalos semanales. En cada fase, Mab 4A10-3 o Mab combi 11 se administra como un bolo intravenoso sencillo (n=4/grupo) . Las muestras de sangre se toman antes de la primera dosis y en 1, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 168 y 264 horas después de la dosis .
En ratas Mab 4A10-3 o Mab Combi 11 se administra como una dosis de bolo intravenoso sencillo de 3 mg/kg (n=3/grupo) . Las muestras de sangre consecutivas se toman antes de la dosis y en 0.08, 1, 4, 8, 24, 48, 72, 120 y 168 horas después de la dosis .
Concentraciones en suero de Mabs 4A10-3 y Combi 11 se determinan usando un formato ELISA intercalado IgG humano. El intervalo de curva estándar es de 5 a 400 ng/ml, con un límite inferior de trabajo de cuantificación (LLOQ) definido como 10 ng/ml. Los parámetros farmacocinéticos se determinan usando análisis no departamental en WinNonlin (versión 5.2) .
Los perfiles de concentración en suero-tiempo después de la administración intravenosa a monos macho Cynomolgus se grafican en la figura 10. Mab 4A10-3 se evacúa mucho más lentamente (aproximadamente 5 veces) que Mab Combi 11 en todas las dosis estudiadas. Diferencias son aparentes en el primer punto de tiempo examinado (1 hora) cuando concentraciones en suero de Mab Combi 11 son aproximadamente 50% de aquellas observadas para Mab 4A10-3. En 24 horas después de la dosis, concentraciones en suero de Mab 4A10-3 son 20-33% de Cmáx en comparación con solo el 6-9% para Combi 11. Concentraciones periféricas de Mab Combi 11 no son evidentes después de la dosis de 0.3 mg/kg. La evacuación de Mab 4A10-3 es más rápida en algún modo en las dos dosis más bajas en comparación con la dosis de 3 mg/kg. El ? 2 para Mab 4A10-3 varía de 2 a 3 días. No obstante, el Ti2 para Mab Combi 11 varía de aproximadamente 12 a aproximadamente 27 horas .
Se tiene la hipótesis de que la evacuación incrementada de Mab Combi 11 relativa con Mab 4A10-3 resulta de interacciones incrementadas no especificadas de Mab Combi 11 con proteínas superficiales celulares que no ocurren para Mab 4A10-3. Con el fin de evaluar esta hipótesis los parámetros farmacocinéticos de Mab 4A10-3 y Mab Combi 11 se estudia en ratas ya que ni Mab se une efectivamente a ferroportina de rata.
Los perfiles de concentración en suero- tiempo después de la administración intravenosa a ratas macho se grafican en la figura 11. Similar a la observación en primates, Mab 4A10-3 se evacúa más lentamente (aproximadamente 5 veces) que en Mab Combi 11 en ratas (datos no mostrados) . Nuevamente, diferencias son aparentes en el primer punto de tiempo examinado (0.08 horas) cuando concentraciones en suero de Mab Combi 11 son aproximadamente 50% de aquellas observadas para Mab 4A10-3. El Ti/2 para Mab 4A10-3 y Mab Combi 11 es aproximadamente 4.5 días y 3 días, respectivamente, en ratas (datos no mostrados) .
Estos datos sugieren fuertemente que la evacuación más rápida observada para Mab Combi 11 no es atribuible a evacuación mediada por el receptor objetivo ya que ni Mab 4A10-3 ni Mab Combi 11 une ferroportina de rata.
Ejemplo 12 Generación de Mab Com 11GY con evacuación retardada y unión no específica menor (heparina) Los estudios farmacocinéticos de Mab Combi 11 descritos anteriormente en el ejemplo 11 sugieren que Mab Combi 11 se evac a más rápidamente de suero en comparación a Mab 4A10-3. Los datos también sugieren que la evacuación más rápida de Mab Combi 11 en comparación a Mab 4A10-3 no es atribuible a evacuación mediada con el receptor objetivo incrementada de Mab Combi 11 en relación a aquella de Mab 4A10-3.
Debido a que los residuos arginina múltiple se han introducido durante el diseño de Mab Combi 11, se espera que el incremento resultante en carga positiva de Mab Combi 11 en comparación con Mab 4A10-3, por ejemplo, resulta en la unión no específica indeseable incrementada a superficies de membrana cargadas negativamente y a heparina. Verdaderamente, el modelado de la estructura de Mab Combi 11 muestra un parche cargado positivamente fuerte en la superficie de Mab Combi 11 que se pronuncia más en Mab Combi 11 que en algunos de los otros Mabs anti-FPNl diseñados humanos, incluyendo Mab 4A10-3 y Mab L2.2-4.
Mabs Combi 11, 4A10-3, y L2.2-4 se analizan para la unión a heparina no específica usando un ELISA heparina de acuerdo a métodos conocidos por una persona con experiencia en la técnica. Mabs Combill, 4A10-3, 3D8, y L2.2-4 también se analizan para unión a FPNl humano que expresa células HEK 293 así como para controlar células HEK 293 que carecen de FPNl humano expresada en la superficie celular.
La ELISA heparina usando Mab Combi-11 muestra que Mab Combi 11 se une fuertemente a heparina mientras Mab 4A10-3 y L2.2-4 no. Además, Mab Combi 11 también se une fuertemente a células HEK 293 que expresan FPNl humano y células HEK 293 que carecen de FPNl expresada en superficie celular. Por otra parte, Mabs 4A10-3, 3D8, y L2.2-4 se unen significativamente a células HEK 293 que expresan FPNl humano pero no a las células HEK 293 control.
Mab Com 11GY es por lo tanto generado para reducir la unión no específica observada con Mab Combi 11 al reemplazar el residuo aminoácido arginina en el HCDR2 con un residuo de aminoácido glicina. Además, otro residuo de aminoácido problemático potencialmente encontrado en Mab Combi 11, el residuo de aminoácido triptofano en la LCDR2, se sustituye con residuo de aminoácido tirosina en Mab CombillGY. Datos de unión preliminares, usando parámetros de células que expresan Mabs Combi 11GY, demuestran una carencia de unión no específica a células HEK 293 control, es decir, células que no expresan FPNl humano mientras Mabs IB7 e IF8 demuestran significativamente unión más específica a las mismas células control .
Ejemplo 13 Ensayo para la inhibición de hepcidina-25 humana de unión a FPNl Anticuerpos FPN1 anti-humano maduro, de afinidad, diseñados, humanos se pueden analizar para la capacidad de inhibir la hepcidina-25 humana de unión a FPN1 humano expresada en células HEK 293 esencialmente descritas en el ejemplo 6.
Brevemente, células FPN/293 transíectadas se colocan en placas recubiertas con poli-D-lisina en placas de 96 pozos (BD Biosciences, san José, CA; BD Biocoat placas # 35 4640) en 40000 células por pozo en 80 µ? de medio de ensayo (DMEM 11965, FBS dializado 10%, FAC 20 µ?, penicilina-estreptomicina) , se centrifuga durante 1 minuto a 1000 revoluciones por minuto, y después se incuba 4 horas a 37°C, C02 10%. La expresión de FPN1 se induce al agregar 20 µ? de doxiciclina en 10 nM a las células en placas (concentración final 2 nM de doxiciclina) . Las células control inducidas y no inducidas de doxiciclina se incuban durante 5 horas a 37°C, C02 10%. Posteriormente, el agente de inducción se retira al lavar la placa 2X con DMEM. Las células se incuban durante la noche en 100 µ? de medio de ensayo. Posteriormente, el medio de ensayo se retira y se reemplaza con 40 µ? de anticuerpo de prueba o una solución de anticuerpo control isotipo por triplicado y se incuba a 37°C, C02 10% durante 20 minutos. Después, 20 µ? de hepcidina humana madura biotinilada se añade a los pozos a una concentración final de 30 nM por pozo.
Las muestras se incuban durante 1 hora, a 37°C, C02 10% antes del lavado 4 veces con 200 µ? de FBS 2%, D-PBS (Gibco, No. de catálogo 14040) . Después, 65 µ? de regulador de pH de lisado (0.5% Tritón X-100, EDTA 10 mM) se añaden a todos los pozos y las placas se agitan durante 10 minutos. Después, 50 µ? de la solución en cada pozo se transfiere a pozos individuales de una placa microvaloradora Greiner recubierta con estreptavidina (60 µ? de 2 µg/ml de estreptavidina (Sigma, St Louis, MO; No. de catálogo S4762) en PBS, se incuba a 4°C durante la noche, se lava 2 veces (Tween-20 0.1%, TBS) , se bloquea con caseína/PBS) , y entonces se incuba durante una hora a temperatura ambiente. Posteriormente, los pozos de la placa se lavan 3 veces (Tween-20 0.1%, TBS) y 50 µ? de hepcidina-25 Mab anti-humana 3.23 en 0.5 µg/ml se añade y las muestras se incuban una hora a temperatura ambiente. La hepcidina-25 Mab 3.23 anti-humana se describe en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional PCT O 2009/058797. Después, las placas se lavan tres veces y 50 µ? de peroxidasa de rábano picante- IgG anti-humana cabra (Southern Biotech No. de catálogo 2060-05) se añade en una dilución de 1:2000. Después de la incubación durante una hora a temperatura ambiente, la placa se lava 4X y 50 µ? de sustrato OPD (Sigma; No. de catálogo P6912) se añade. La reacción se interrumpe con 100 µ? de HCl 1N después de 4 minutos. La absorbancia a 490 nm (A490) se lee usando un lector de placa ELISA apropiado. El intervalo de ensayo se determina al sustraer la A490 de pozos no inducidos de los pozos inducidos que reciben anticuerpo control .
Tabla 11 Nota: 75 kg/mol es el peso molecular usado para calcular la concentración de anticuerpo.
Estos datos demuestran que Mab 3D8 humanizado y variantes maduras de afinidad del mismo inhiben significativamente la capacidad de hepcidina-25 humana para unir FPN1 humano. Más específicamente, Mab 3D8, una forma humanizada del ratón ab IG9, que tienen la estructura de cadena pesada humana VHl-69 y estructura de cadena ligera 02, demuestran una IC50 de aproximadamente 400 nM como se determina en este formato de ensayo. Mabs 4A10-3 madura de afinidad, Combi 11, y L2.2-4 demuestran una inhibición mejorada significativamente de unión como se determina en este formato de ensayo.

Claims (42)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo monoclonal, o su fragmento de unión a antígeno, que une ferroportina humana 1 que consiste de la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 1 a un epítope que comprende aminoácidos localizados en uno o más secuencias de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de: a) 403SPFEDIRSRFIQGESITPTK422 (SEQ ID NO: 12); b) 406EDIRSRFIQGES IT419 (SEQ ID NO: 13); C ) 409RSRFIQGESITPTK422 (SEQ ID NO: 14) ; d) 403SPFEDIRSRFIQG4i5 (SEQ ID NO: 15) ; e) 4o9RSRFIQGESIT419 (SEQ ID NO: 16) y f) 409RSRFIQG4i5 (SEQ ID NO: 95)
2. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 1, la cual enlaza ferroportina 1 humana que consiste de la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1 en un epítope que consiste esencialmente de aminoácidos localizados en uno o más secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de: a) 403SPFEDIRSRFIQGES ITPTK422 (SEQ ID NO: 12); b) 406EDIRSRFIQGESIT419 (SEQ ID NO: 13); c) 409RSRFIQGESITPTK422 (SEQ ID NO: 14) ; d) 403SPFEDIRSRFIQG4i5 (SEQ ID NO: 15) ; e) 409RSRFIQGESIT4i9 (SEQ ID NO: 16) y f) 409RSRFIQG415 (SEQ ID NO: 95) .
3. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo, de conformidad con la reivindicación 1-2, caracterizado porque enlaza uno o más péptidos seleccionados del grupo consistente de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 95.
4. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo no enlaza uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 98, 183-214.
5. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo, de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 que comprende una LCDR1 , LCDR2, LCDR3, HCDRl, HCDR2 y HCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácido mostradas en SEQ ID NOS: 37, 129, 22, 107, 118, y 120, respectivamente.
6. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende una LCDR1, LCDR2, LCDR3 , HCDRl, HCDR2 y HCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácido mostradas en SEQ ID NOS: 37, 174, 22, 175, 176, y 120, respectivamente.
7. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende una LCDR1, LCDR2, LCDR3 , HCDRl, HCDR2 y HCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácido mostradas en SEQ ID NOS: 37, 125, 22, 23, 110, y 19, respectivamente.
8. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende una LCDR1, LCDR2, LCDR3 , HCDR1 , HCDR2 y HCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácido mostradas en SEQ ID NOS: 37, 177, 22, 23, 112, y 19, respectivamente.
9. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 caracterizado porque comprende una LCDR1 , LCDR2 , LCDR3 , HCDR1 , HCDR2 y HCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácido mostradas en SEQ ID NOS: 37, 122, 22, 23, 110, y 19, respectivamente.
10. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque comprende una región de cadena ligera variable y una región de cadena pesada variable como se muestra en SEQ ID NO: 136 y SEQ ID NO: 134, respectivamente.
11. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque comprende una región de cadena ligera variable y una región de cadena pesada variable como se muestra en SEQ ID NO: 180 y SEQ ID NO: 178, respectivamente.
12. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque comprende una región de cadena ligera variable y una región de cadena pesada variable como se muestra en SEQ ID NO: 140 y SEQ ID NO: 138, respectivamente.
13. El anticuerpo monoclonal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 que comprende a. una región de cadena ligera variable y una región de cadena pesada variable como se muestra en SEQ ID NO: 154 y SEQ ID NO: 152, respectivamente. b. una cadena ligera y una cadena pesada como se muestra en SEQ ID NO: 181 y SEQ ID NO: 179, respectivamente. c. una cadena ligera y una cadena pesada como se muestra en SEQ ID NO: 158 y SEQ ID NO: 156, respectivamente.
14. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque comprende dos polipéptidos de cadena ligera y dos polipéptidos de cadena pesada, y en donde cada uno de los polipéptidos de cadena ligera tienen la secuecia de aminoácido como se muestra en la SEQ ID NO: 154 y cada uno de los polipéptidos de cadena pesada tienen la secuencia de aminoácido como se muestra en SEQ ID NO: 152.
15. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque comprende dos polipéptidos de cadena ligera y dos polipéptidos de cadena pesada, y en donde cada uno de los polipéptidos de cadena ligera tienen la secuecia de aminoácido como se muestra en la SEQ ID NO: 181 y cada uno de los polipéptidos de cadena pesada tienen la secuencia de aminoácido como se muestra en SEQ ID NO: 179.
16. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque comprende dos polipéptidos de cadena ligera y dos polipéptidos de cadena pesada, y en donde cada uno de los polipéptidos de cadena ligera tienen la secuecia de aminoácido como se muestra en la SEQ ID NO: 158 y cada uno de los polipéptidos de cadena pesada tienen la secuencia de aminoácido como se muestra en SEQ ID NO: 156.
17. El anticuerpo monoclonal de cualquiera de las reivindicaciones 1-16 el cual enlaza ferroportina humana 1 con un D menor a aproximadamente a lOnM como se determinó por resonancia de plasmón superficial a 25°C.
18. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1-12 que comprenden un Fab, en donde el Fab enlaza Ferroportina humana 1 con un KD menor a aproximadamente 100 n como se determinó por resonancia de plasmón superficial a 37°C.
19. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 18, en donde el Fab tiene una velocidad de disociación (koff) entre aproximadamente 7.5 x 10"3 s"1 y aproximadamente 9 x 10"4 s"1 como determinó SPR a 37°C para ferroportina humana 1.
20. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 18 o 19, en donde el Fab enlaza la ferroportina humana 1 con un KD de entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 nM.
21. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 18-19, en donde el Fab enlaza la ferroportina humana 1 con un KD de entre aproximadamente 10 nM a aproximadamente 0.5 nM.
22. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1-21, en donde el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno tiene un IC50 entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1 nM en un ensayo de bioactividad de hepcidina in vitro.
23. El anticuerpo monoclonal o f agmento de unión a antígeno de la reivindicación 22 en donde el IC50 está entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 10 nM.
24. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno de de la reivindicación 23 en donde la bioactividad de hepcidina-25 es internalización y/o degradación de ferroportina 1.
25. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1-24 en donde el anticuerpo o fragmento antígeno de enlace tiene un IC50 de entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1 nM en un ensayo de bioactividad de hepcidina-25 in vivo.
26. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 25 en donde el ensayo mide un decrecimiento de IL-6 inducido en los niveles de hierro en suero en primates .
27. Un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótido que codifica el anticuerpo monoclonal o fragmento antígeno de enlace de cualquiera de las reivindicaciones 1-26.
28. Un vector de expresión recombinante que comprende el polinucleótido de la reivindicación 27.
29. Una célula huésped la cual fue transformada por un vector de expresión de la reivindicación 28.
30. La célula huésped de acuerdo a la reivindicación 29 en donde dicha célula es de ovario de hámster chino, mieloma NSO, COS, o célula SP2/0.
31. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-26 para su uso en terapia.
32. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16 para su uso como medicamento.
33. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1-26 para el tratamiento de anemia, anemia producida por cáncer, o anemia producida por cáncer asociada a con elevados niveles de hepcidina .
34. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1-26 para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de anemia, anemia producida por cáncer, o anemia producida por cáncer asociada a elevados niveles de hepcidina en un sujeto.
35. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1-26 para su uso en incremento en los niveles de hierro en suero, conteo de reticulocitos, conteo de glóbulos rojos, hemoglobina, y/o hematocrito en humano.
36. Un método para el incremento de niveles de hierro en suero, conteo de reticulocitos, conteo de glóbulos rojos, y/o hematocrito comprendiendo administrar a un sujeto una cantidad efectiva de anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1-26.
37. Un método para tratar anemia o anemia producida por cáncer en un sujeto, comprendiendo administrar al sujeto una cantidad efectiva del anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1-26.
38. El método de cualquiera de las reivindicaciones 36-37, que además comprenden administrar a dicho paciente humano ESA, u otro agente terapéutico o tratamiento terapéutico convencionalmente empleado para incrementar los niveles de hierro en suero, conteo de reticulitos, conteo de glóbulos rojos, hemoglobina, y/o hematocrito en humano.
39. Una composición farmacéutica, comprendiendo el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1-26, y un vehículo farmacéuticament aceptable, diluente o excipiente.
40. La composición farmacéutica de reivindicación 39, además comprendiendo uno o más agentes terapéuticos adicionales.
41. Un proceso para producir un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno comprendiendo los siguientes pasos de: (i) cultivar una célula huésped de la reivindicación 29 o 30 bajo condiciones apropiadas para permitir la expresión de anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno; y (ii) recuperación del anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno.
42. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antxgeno obtenible por el proceso de la reivindicación 41.
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