JP2012510814A - 抗フェロポーチン1モノクローナル抗体およびその使用 - Google Patents
抗フェロポーチン1モノクローナル抗体およびその使用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
(a)403SPFEDIRSRFIQGESITPTK422(配列番号12);
(b)406EDIRSRFIQGESIT419(配列番号13);
(c)409RSRFIQGESITPTK422(配列番号14);
(d)403SPFEDIRSRFIQG415(配列番号15);
(e)409RSRFIQGESIT419(配列番号16);および
(f)409RSRFIQG415(配列番号95)
からなる群より選択されるヒトFPN1の少なくとも一つのペプチドフラグメントを含む、ヒトFPN1に特異的に結合し、フェロポーチンへのヘプシジンの結合をブロックし、インビトロにおけるヘプシジン活性を潜在的に阻害し、インビボにおいて用量依存的に血清鉄濃度を上昇させ、そして、受容可能な溶解性、インビボでの安定性、および、排出半減期の特性を有し、これら抗ヒトFPN1抗体を、静脈内注入を介して(または、おそらく皮下注射を介してであっても)投与することにより、それらは、貧血の治療を必要とする被験体において貧血を治療および/または予防するのに有用な薬剤となる。
(a)403SPFEDIRSRFIQGESITPTK422(配列番号12);
(b)406EDIRSRFIQGESIT419(配列番号13);
(c)409RSRFIQGESITPTK422(配列番号14);
(d)403SPFEDIRSRFIQG415(配列番号15);
(e)409RSRFIQGESIT419(配列番号16);および
(f)409RSRFIQG415(配列番号95)
からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸配列に局在するアミノ酸を含むエピトープにて、配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるヒトフェロポーチン1に特異的に結合する、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
(i)配列番号20、32、33、30、31、および19にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2およびHCDR3;
(ii)配列番号42、32、33、30、43、および19にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2およびHCDR3;
(iii)配列番号42、27、22、23、41、および19にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2およびHCDR3;
(iv)配列番号42、32、33、23、41、および19にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2およびHCDR3;
(v)配列番号20、21、22、17、18、および19にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2およびHCDR3;
(vi)配列番号20、27、29、23、24、および19にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2およびHCDR3;
(vii)配列番号37、27、22、23、41、および19にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2およびHCDR3;
(viii)配列番号170、171、172、182、173、および19にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2およびHCDR3;
(ix)配列番号37、127、22、23、116、および19にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2およびHCDR3;
(x)配列番号37、125、22、23、110、および19にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2およびHCDR3;
(xi)配列番号37、122、22、23、110、および19にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2およびHCDR3;
(xii)配列番号37、129、22、107、118、および120にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2およびHCDR3;
(xiii)配列番号37、128、22、105、41、および119にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2およびHCDR3;
(xiv)配列番号37、174、22、175、176、および120にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2およびHCDR3;
(xvi)配列番号37、128、22、105、117、および19にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2およびHCDR3;ならびに
(xvii)配列番号37、177、22、23、112、および19にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2およびHCDR3
からなる群より選択される6個のCDRを含み、また、本発明のMabまたはその抗原結合フラグメントは、
(a)403SPFEDIRSRFIQGESITPTK422(配列番号12);
(b)406EDIRSRFIQGESIT419(配列番号13);
(c)409RSRFIQGESITPTK422(配列番号14);
(d)403SPFEDIRSRFIQG415(配列番号15);
(e)409RSRFIQGESIT419(配列番号16);および
(f)409RSRFIQG415(配列番号95)
からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する1つのアミノ酸または複数のアミノ酸からなるか、またはそれらから実質的になるエピトープにて、好ましくはMabについて25℃およびFabについて37℃にてSPRにより測定される場合、約100nM未満のKDで、配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるヒトFPN1に結合する。
アミノ酸が以下のカテゴリー下にある場合、使用されているヒト生殖細胞系列配列(「アセプターフレームワーク」)のフレームワークアミノ酸は、親抗体のフレームワーク(「ドナーフレームワーク」)からのフレームワークアミノ酸により置換される。
(a)アセプターフレームワークのヒトフレームワーク領域内のアミノ酸は、その位置におけるヒトフレームワークには稀であるが、ドナー免疫グロブリン内の対応するアミノ酸は、その位置におけるヒトフレームワークに典型的である;
(b)アミノ酸の位置は、CDRのうち一つと直接隣接している;または、
(c)フレームワークアミノ酸の任意の側鎖原子は、3次元免疫グロブリンモデル内のCDRアミノ酸の任意の原子の約5〜6オングストローム(中心間)以内である。
1)配列番号136および配列番号134にそれぞれ示される軽鎖可変領域および重鎖可変領域;
2)配列番号180および配列番号178にそれぞれ示される軽鎖可変領域および重鎖可変領域;または
3)配列番号140および配列番号138にそれぞれ示される軽鎖可変領域および重鎖可変領域、
を含む。さらにより好ましくは、本発明の抗FPN1 Mab、またはその抗原結合フラグメントは、
1)配列番号154および配列番号152にそれぞれ示される軽鎖および重鎖;
2)配列番号181および配列番号179にそれぞれ示される軽鎖および重鎖;または
3)配列番号158および配列番号156にそれぞれ示される軽鎖および重鎖、
を含む。さらにより好ましくは、本発明のモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントは、
1)2本の軽鎖ポリペプチドおよび2本の重鎖ポリペプチドであって、その軽鎖ポリペプチドの各々は配列番号154に示されるアミノ酸配列を有し、その重鎖ポリペプチドの各々は配列番号152に示されるアミノ酸配列を有する、2本の軽鎖ポリペプチドおよび2本の重鎖ポリペプチド;
2)2本の軽鎖ポリペプチドおよび2本の重鎖ポリペプチドであって、その軽鎖ポリペプチドの各々は配列番号181に示されるアミノ酸配列を有し、その重鎖ポリペプチドの各々は配列番号179に示されるアミノ酸配列を有する、2本の軽鎖ポリペプチドおよび2本の重鎖ポリペプチド;または
3)2本の軽鎖ポリペプチドおよび2本の重鎖ポリペプチドであって、その軽鎖ポリペプチドの各々は配列番号158に示されるアミノ酸配列を有し、その重鎖ポリペプチドの各々は配列番号156に示されるアミノ酸配列を有する、2本の軽鎖ポリペプチドおよび2本の重鎖ポリペプチドを含む。さらにより好ましくは、本発明のモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントは、25℃にて表面プラズモン共鳴によって測定される場合、約10nM未満のKDでヒトフェロポーチン1に結合する。さらにより好ましくは、本発明のモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントはFabを含み、そのFabは、37℃にて表面プラズモン共鳴によって測定される場合、約100nM未満のKDでヒトフェロポーチン1に結合する。さらにより好ましくは、Fabは、37℃にてSPRによって測定される場合、ヒトフェロポーチン1に対して約7.5×10−3S−1〜約9×10−4s−1の解離速度(koff)を有する。さらにより好ましくは、Fabは、約100nM〜約1nMのKDでヒトフェロポーチン1に結合する。さらにより好ましくは、Fabは、約10nM〜約0.5nMのKDでヒトフェロポーチン1に結合する。さらにより好ましくは、モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントは、ヘプシジン−25生物活性のインビトロアッセイにおいて約100nM〜約1nMのIC50を有する。さらにより好ましくは、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヘプシジン−25生物活性のインビトロアッセイにおいて約100nM〜約10nMのIC50を有する。さらにより好ましくは、ヘプシジン−25生物活性は、フェロポーチン1の内在化および/または分解である。さらにより好ましくは、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヘプシジン−25生物活性のインビボアッセイにおいて約100nM〜約1nMのIC50を有する。さらにより好ましくは、ヘプシジン−25生物活性のインビボアッセイは、霊長類における血清鉄濃度のIL−6により誘導される減少を測定する。最も好ましくは、抗FPN1 Mab、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号98、183〜214からなる群より選択される1つ以上のペプチドに結合しない。
(a)配列番号154および配列番号152にそれぞれ示される軽鎖および重鎖;
(b)配列番号181および配列番号179にそれぞれ示される軽鎖および重鎖;または、
(c)配列番号158および配列番号156にそれぞれ示される軽鎖および重鎖、
を含み、配列番号12、13、14、15、16、および95からなる群より選択されるアミノ酸配列に局在する1つのアミノ酸または複数のアミノ酸を含むか、またはそれらから実質的になるか、またはそれらからなるエピトープにて、配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるヒトFPN1に結合し、1)好ましくはMabについて25℃、およびFabについて37℃にてSPRによって測定される場合、約100nM〜約0.5nM、好ましくは約100nM〜約1nM、より好ましくは約75nM〜約5nM、さらにより好ましくは約50nM〜約10nM、さらにより好ましくは約15nM〜約10nM、さらにより好ましくは約10nM〜約0.5nM、さらにより好ましくは約5nM〜約0.5nM、さらにより好ましくは約5nM〜約0.7nM、さらにより好ましくは約3nM〜約0.7nM、または最も好ましくは約3nM〜約1nMのKD、2)ヘプシジン−25生物活性のインビボアッセイにおいて、約250nM〜約25nM、好ましくは100nM〜約25nM、またはより好ましくは50nM〜約25nMのIC50、3)ヘプシジン−25生物活性のインビトロアッセイにおいて、約100nM〜約1nM、好ましくは約75nM〜約1nM、より好ましくは約50nM〜約1nM、さらにより好ましくは約25nM〜約1nMのIC50、および4)好ましくはMabについて25℃、およびFabについて37℃にてSPRによって測定される場合、約7.5×10−3s−1〜約1×10−4s−1、好ましくは約2.5×10−3s−1〜約1×10−4s−1、より好ましくは約1×10−3s−1〜約1×10−4s−1、さらにより好ましくは約5×10−4s−1〜約1×10−4s−1の、ヒトフェロポーチン1に対する解離速度(koff)を有することにより特徴付けられる。好ましくは、インビボアッセイは、血清鉄濃度のIL−6により誘導される減少を測定する。好ましくは、ヘプシジン−25生物活性アッセイのインビトロアッセイは、フェロポーチン1のヘプシジンにより誘導される内在化および/または分解を測定する。
ヒトヘプシジン−25は、商業的供給源(例えば、Peptide International(Louisville、Kentucky))から入手され得るか、または当該技術分野で公知の様々な合成または組換え技術によって生成され得る。あるいは、ヒトヘプシジン−25配列の25のアミノ酸を含みかつ配列番号91に示されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質は、大腸菌の中で発現される。封入体を、3リットルのヒトヘプシジン融合タンパク質を発現する大腸菌から、37℃での1mM IPTGを用いた3〜6時間の誘導後に単離する。この封入体を、緩衝剤A(50mM Trisおよび8M 尿素(pH 8.0))の中で可溶化する。上清をIMACカラム(20mL 樹脂)に通す。吸光度がベースラインまで戻るまでこのカラムを緩衝剤Aで洗浄し、結合したポリペプチドを、緩衝剤A中の0.5M イミダゾールによってこのカラムからバッチ溶出する。このヒトヘプシジン−25融合タンパク質をプールし、50mM DTTを用いて還元する。次いでこの融合タンパク質を、プールした物質を50μg/mL未満の最終タンパク質濃度まで2M 尿素、3mM システイン、50mM Tris(pH 8.0)の中へ希釈することによりリフォールディングする(refolded)。この物質を室温で撹拌し、48時間空気酸化する。酸化したポリペプチドを、5mL/分の流量でIMACカラム(20mL)に通し、このヒトヘプシジン−25融合タンパク質を、緩衝剤A中の0.5M イミダゾールによってこのカラムからバッチ溶出する。このヒトヘプシジン−25融合タンパク質を含有するプールした画分を濃縮し、50mM Tris、4M 尿素、pH 8.0で平衡にしたSuperdex 75(GE Healthcare、XK26/60)サイズ分け(sizing)カラムに3mL/分の流量で通した。このモノマーの融合タンパク質をプールし、次いで50mM Tris、2M 尿素、5mM CaCl2、pH 8.0に希釈し、次いでエンテロキナーゼを用いて切断し、配列番号1のヒトヘプシジン−25を生成した。切断されないヒトヘプシジン−25融合タンパク質をパッシブ(passive)IMACクロマトグラフィ(上に概略を示したとおり)によって除去した。このIMACカラムから通り抜けた流れは、次いで4.0mL/分間の流量でC−18逆相カラムに通す。吸光度がベースラインまで戻るまでこのカラムを水中の0.1% TFAで洗浄し、0.5%/分の速度の0.1% TFAを用いた20%から40%へのアセトニトリルの線形勾配を用いて、結合したポリペプチドをカラムから溶出した。このヒトヘプシジン−25ポリペプチドを含有する画分をプールし、N末端アミノ酸配列決定およびマトリックス支援レーザー脱離/イオン化質量分析(MALDI−MS)によって分析した。ラット、マウス、およびカニクイザルヘプシジン−25および種々のN末端で短縮された形態のヒトヘプシジン−25をコードするポリペプチド(ヘプシジン−22およびヘプシジン−20を含む)を、市販品として入手した(例えば、Peptide International)。
抗FPN1抗体は、マウスを配列番号11に示されるアミノ酸配列を有する免疫原性のペプチドで免役することにより得てもよい。より特定すれば、ペプチドリンカーによって配列番号12に示されるアミノ酸配列(ヒトFPN1の細胞外のループの少なくとも一部分で考えられる)に連結したOVAエピトープを含む免疫原性のペプチドを使用して、マウスを免役してもよい。免疫化後、マウス脾臓を回収し、脾臓細胞を、配列番号12に示されるアミノ酸配列を有するビオチン化されたペプチドおよびストレプトアビジンビーズを使用するMagnetic Activated Cell Sortingによって細胞分離する(sorted)。RNAを抗原結合細胞から単離し、oligo dTを使用してcDNAへと転化する。抗体の重鎖および軽鎖可変領域を、抗体フレームワークプライマーを使用するPCRによって得て、ファージベクターにクローン化してFab抗体ライブラリーを作製する。このファージ抗体ライブラリーを、配列番号12に示されるアミノ酸配列を有するビオチン化されたペプチド、例えば、100nMでスクリーニングする。次いで陽性に結合するクローンを、DNA配列決定、Fab発現ならびにヒトフェロポーチンを発現する免疫性(immunizing)ペプチドおよび/または細胞への結合によって特徴づける。Fab 34A9を、基本的に上記のとおりの手順に従って同定した。
FPN1関連免疫原の部分配列を含有するペプチドをドットブロット(dot blot)ハイブリダイゼーション実験で使用して、マウスMab 34A9のエピトープを決定し得る。以下のペプチドが合成されて水に溶解され得る(下線を引いたアミノ酸は実際のFPN1アミノ酸配列を表す):
060719Z (配列番号 97): GGSPFEDIRSRFIQGC
060719Y (配列番号 98): GGIQGESITPTKIPEITTEGC
0708L4A (配列番号 99): GGMPGSPLDLSVSPFEDGC
0708L4B (配列番号 100): GGSPLDLSVSPFEDIRSGC
0708L4C (配列番号 101): GGEDIRSRFIQGESITGC
0708L4D (配列番号 102): GGRSRFIQGESITPTKGC
FPN1に結合するFabおよびMabの親和性は、Biacore T100で、およびBiacore T100評価ソフトウェア(BIAcore(登録商標) AB、Upsala、Sweden)での1:1結合モデルを使用して決定され得る。手短に言うと、ウイルス性トランス活性化因子を含まない市販のテトラサイクリンで制御された発現系であるT−RExシステム(Invitrogen、Carlsbad、CA)を、T−Rex HEK 293細胞における安定な細胞株生成のために使用する。すべての増殖条件はInvitrogenによって提供されるT−RExマニュアルに記載されている。FPN1は、GFPとC末端で融合している。FPN1−GFPの発現を、1〜10ng/mLのドキシサイクリンによって1〜24時間誘導する。誘導した細胞をフラスコからこそげ取ることにより回収し、次いで1×PBSで洗浄する。細胞ペレットは、使用するまで−80℃で保存し得る。約5×106の誘導した細胞を、0.2% Tween−20およびプロテアーゼ阻害剤、例えば、Complete(商標)プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤(Roche Diagnostics Corp.、Indianapolis、IN)を含む10mM リン酸緩衝剤に再懸濁する。3サイクルの凍結/解凍/超音波処理を使用して細胞を溶解する。この可溶化物をBiacoreランニング緩衝剤で2倍に希釈し、遠心して細胞片(debris)を除去する。
(25℃または37℃でBiacore T100によって測定)
FPN1を内因的に発現するCaco−2細胞(ヒト腸細胞細胞株)はフェリチンの変化についてモニターされ得る。Caco−2細胞中のフェリチン濃度は、外因性の鉄源を添加することにより増加する可能性があり、この濃度は鉄排出を防止するヘプシジンを添加するとさらに増大され得る。従って、Caco−2細胞における成熟ヘプシジンによって調節される鉄制御に対する抗ヒトFPN1抗体の効果は、以下のようにして測定され得る。
安定にトランスフェクトされたFPN−GFP/293細胞を、80μlのアッセイ培地(DMEM 11965、10% 透析したFBS、20μM FAC、ペニシリン−ストレプトマイシン)中に1ウェルあたり60,000細胞でポリ−D−リジンコーティングしたプレートの中にプレーティングし、37℃、10% CO2で4時間インキュベーションする。FPN1発現を誘導するために、ドキシサイクリンを11.2nMの最終濃度まで加える。ドキシサイクリンで誘導した細胞および誘導していない対照細胞を37℃で一晩インキュベーションする。次に、この増殖培地を捨て、30μlのアッセイ培地中の試験抗体もしくはアイソタイプの対照抗体、または30μlのアッセイ培地のみの対照で置き換え、37℃で1時間インキュベーションする。次に、20μlのビオチン化された成熟したヒトヘプシジンを30nMの最終濃度までウェルに加える。このサンプルを37℃で1時間保管しておき、その後で200μL 2% FBS、D−PBS(Invitrogen、Carlsbad、CA)で4回洗浄する。次に、65μlの溶解緩衝剤(0.5% Triton X−100、10mM EDTA)を加え、このプレートを10分間振盪する。次に、各ウェルの溶液50μLをストレプトアビジンでコーティングしたプレート(PBS中の60μlの2μg/mL ストレプトアビジン、4℃で一晩インキュベーションし、2回洗浄し(0.1% Tween 20、TBS)、カゼイン/PBSでブロックする)の個々のウェルに移し、次いで室温で1時間インキュベーションする。次に、このプレートのウェルを3回洗浄し(0.1% Tween 20、TBS)、50μLの0.5μg/mLの抗ヒトヘプシジン−25 Mab 3.23を加え、このサンプルを室温で1時間インキュベーションする。この抗ヒトヘプシジン−25 Mab 3.23はPCT国際特許出願公開公報WO2009/058797に記載されている。次に、このプレートを3回洗浄し、50μLの抗ヒトIgG−西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)を1:2000希釈で加える。室温で1時間インキュベーションした後、50μlのOPD基質を加える。4分後に、この反応を100μL 1N HClで停止する。490nmでの吸光度(A490)を適切なELISAプレートリーダーを使用して読み取る。
インビトロでの細胞ベースのアッセイを使用して、ヒトFPN1に対して向けられるMab、またはその抗原−結合断片フラグメントの成熟したヘプシジン中和活性を測定し得る。このようなアッセイは、成熟したヘプシジンの受容体、FPN1の成熟したヘプシジンによって誘導される内在化および分解に基づき得る。例えば、FPN1の誘導可能な発現を許容するHEK 293安定細胞株が調製される。追跡目的のために、FPN1は、C末端でGFPと融合する。このFPN1−GFP分子の誘導可能な発現を、T−REx system(Invitrogen、Carlsbad、CA)を使用して制御する。このFPN1−GFPコード配列を、誘導可能なプロモーターおよびゼオシン耐性マーカーを含むpCDNA4/TOベクターにクローン化する。得られたコンストラクトを、ドキシサイクリンにより誘導可能な発現のために必要とされる調節タンパク質を発現するT−REx−293細胞にトランスフェクトする。ゼオシン耐性クローンをFPN−GFPの誘導可能な発現について試験する。細胞増殖条件は、基本的にT−REx System(Invitrogen)についての製造業者の使用説明書に記載されているとおりである。手短に言うと、細胞をDMEM、10% 透析したFBS、20μM FAC、さらに5μg/mL ペニシリン−ストレプトマイシンの中で増殖させる。100μg/mL ゼオシンおよび5μg/mLブラストサイジンを用いて選択を維持する。細胞をポリ−D−リジンでコーティングされた96穴の黒/透明プレート上にプレーティングする。Acumen Explorer HTS、高分解能蛍光プレートリーダーを、1ウェルあたりの全蛍光を読み取るために使用する。
血清ヘプシジンおよび血清鉄濃度に対する抗ヒトFPN1マウスのMab 1G9の生理学的効果を、Mabを単回静脈内用量として雄性カニクイザル(Macaca fascicularis;3〜4kg)に投与して、その効果をマウスのIgG1の対照投与と比較することにより検討した。投与後、血清鉄および血清ヘプシジンの分析のために血液サンプルを集めた。用量(30mg/kg)を、伏在静脈を介して注射として投与した。用量投与の直後であるが、その動物から針が取り出される前に、この用量装置におよそ2mLの生理食塩水を流した。
用量前および用量後0.5、1、3、6、10、24、48、72、96、および168時間後に血液を集めた。血液(およそ0.5mL)、大腿静脈を介して抗凝固薬を含有しないチューブの中へと集めた。血清を得るために、遠心分離の前に血液を周囲条件下で凝固させた。およそ−70℃で保存する前に血清サンプルをドライアイス上に置いた。
用量前および用量後1、3、6、24、48、72、96、および168時間後に血液を集めた。医学界内で許容できると考えられる方法に従ってすべての血液サンプルを集め、取り扱い、処理し、保存し、そして分析した。血清鉄濃度は、医学界内で、全血清鉄(Fe)を測定する許容できる方法であると一般に考えられる当該技術分野で公知の任意の方法によって測定され得る。ヘプシジンの血清濃度は、基本的にMurphyら、Blood、110:1048−54(2007)に記載されているようにして、液体クロマトグラフィ−質量分析によって測定した。血清鉄を測定するためのアッセイは当該技術分野で周知である(例えば、Goodwin,J.F.ら,Clinical Chemistry 12:47−57(1966)、およびJ.Clin.Path.,24:334−335(1971)を参照のこと)。
基本的に上記の実施例7に記載したようにして行った実験は、Mab Combi−11、4A10−3、およびL2.2−4は、Mab 34A9、3D8、および1G9と比べて、インビトロでより効果的にヒトFPN1のヒトヘプシジン−25によって誘導される内在化および分解を阻害する(表10を参照のこと)ことを実証する。より具体的には、抗FPN1 Mabを、900nMから始まり3倍の段階希釈を実施する9点濃度曲線で試験した。阻害パーセント(%)を、120nM ヒトヘプシジン処置についての値を差し引き、次いでMab処置の値をヘプシジン処置なしの値で割ることにより、測定した。相対的IC50をシグマプロットで測定した。最高阻害パーセント(%)ならびに相対的および絶対的IC50を表10に示す。
抗フェロポーチンMabの薬力学は、当業者に公知の方法に従って、静脈内用量を雌性カニクイザルに投与した後に研究され得る。例えば、5つの独立の研究で、Mab 4A10−3を、カニクイザルに単回静脈内ボーラス(n=4/群)として0.3、1.0、3.0、10および30mg/kgの用量で投与した。血液サンプル(複数の鉄パラメータについておよそ0.5mL)を、最初の用量の前および用量後1、6、12、24、48、72、96、168および264時間に採取した。より高い用量レベルでは、さらなる血液サンプルを、用量後360、456、552、および648時間に採取した。投薬時には、これらの動物の体重は2〜3kgの間であった。血液サンプルを、各動物から、大腿静脈を介して抗凝固薬を含まないチューブの中へと集めた。
抗フェロポーチンMabの薬物動態は、当業者に周知の方法に従ってインビボで研究され得る。抗FPN1 Mab 4A10−3およびCombi 11の薬物動態を、例えば雄性カニクイザルおよびスプラーグドーリー(Sprague Dawley)ラットへの単回静脈内用量の後に検討した。投薬時には、使用したカニクイザルの体重は2.2〜5.5kgの間であり、スプラーグドーリー(Sprague Dawley)ラットの体重は240〜265gの間であった。
実施例11で上記されたMab Combi11の薬物動態研究は、Mab Combi11がMab 4A10−3と比べてより迅速に血清から浄化されるということを示唆した。このデータはまた、Mab 4A10−3と比べたMab Combi11のより迅速なクリアランスはMab 4A10−3よりもMab Combi11の、標的受容体によって媒介されるクリアランスの増加が原因ではないということを示唆した。
ヒトの遺伝子操作された、親和性が成熟した抗ヒトFPN1抗体は、HEK 293細胞の中で発現されるヒトFPN1に結合するヒトヘプシジン−25を阻害する能力についてアッセイされ得る。手短に言うと、トランスフェクトされたFPN/293細胞を、96穴プレート上でポリ−D−リジンコーティングしたプレート(BD Biosciences、San Jose、CA;BD Biocoat プレート番号35 4640)の中で、80μlのアッセイ培地(DMEM 11965、10% 透析したFBS、20μM FAC、ペニシリン−ストレプトマイシン)中に1ウェルあたり40,000細胞でプレーティングし、毎分1000回転で1分間遠心分離し、次いで37℃、10% CO2で4時間インキュベーションする。FPN1発現を、10nMのドキシサイクリン20μlをこのプレーティングした細胞に加える(2nMの、ドキシサイクリンの最終濃度)ことによって誘導する。ドキシサイクリンで誘導される細胞および誘導されない対照細胞を37℃、10% CO2で5時間インキュベーションする。次に、このプレートをDMEMで2回洗浄することによりこの誘導剤を除去する。この細胞を、100μlのアッセイ培地の中で一晩インキュベーションする。次に、このアッセイ培地を除去し、40μLの試験抗体またはアイソタイプの対照抗体溶液で三重に置き換え、37℃、10% CO2で20分間インキュベーションする。次に、20μlのビオチン化された成熟したヒトヘプシジンをこのウェルに、1ウェルあたり30nMの最終濃度で加える。このサンプルを37℃、10% CO2で1時間インキュベーションし、その後、200μL 2% FBS、D−PBS(Gibco、カタログ番号14040)で4回洗浄する。次に、65μlの溶解緩衝剤(0.5% Triton X−100、10mM EDTA)をすべてのウェルに加え、このプレートを10分間振盪する。次に、各ウェルの中の溶液50μLを、ストレプトアビジンでコーティングしたGreinerマイクロタイタープレート(PBS中の60μlの2μg/mL ストレプトアビジン(Sigma、St.Louis、MO;カタログ番号 S4762)、4℃で一晩インキュベーションし、2回(0.1% Tween 20、TBS)洗浄し、カゼイン/PBSでブロックする)の個々のウェルに移し、次いで室温で1時間インキュベーションした。次に、このプレートのウェルを3回洗浄し(0.1% Tween 20、TBS)、0.5μg/mLの50μLの抗ヒトヘプシジン−25 Mab 3.23を加え、このサンプルを室温で1時間インキュベーションする。この抗ヒトヘプシジン−25 Mab 3.23は、PCT国際特許出願公開公報WO2009/058797号に記載されている。次に、このプレートを3回洗浄し、50μlのヤギ抗ヒトIgG−西洋ワサビペルオキシダーゼ(Southern Biotechカタログ番号2060−05)を1:2000希釈で加える。室温で1時間のインキュベーション後、このプレートを4回洗浄し、50μlのOPD基質(Sigma;カタログ番号P6912)を加える。この反応を、4分後に100μL 1N HClで停止する。490nmでの吸光度(A490)を、適切なELISAプレートリーダーを使用して読み取る。アッセイ範囲は、対照抗体を受け取った誘導されたウェルから誘導されないウェルのA490を差し引くことにより測定される。
実施例5に記載したように、FPN1を内因的に発現するCaco−2細胞、ヒト腸細胞細胞株は、フェリチンの変化についてモニターされ得る。基本的に実施例5に記載したようにして行った実験では、Caco−2細胞における成熟したヘプシジンによって調節される鉄制御に対する抗ヒトFPN1抗体の効果を測定し、いくつかの独立の実験にわたって平均した阻害パーセントとして下記の表12に表す。
Claims (42)
- (a)403SPFEDIRSRFIQGESITPTK422(配列番号12);
(b)406EDIRSRFIQGESIT419(配列番号13);
(c)409RSRFIQGESITPTK422(配列番号14);
(d)403SPFEDIRSRFIQG415(配列番号15);
(e)409RSRFIQGESIT419(配列番号16);および
(f)409RSRFIQG415(配列番号95)
からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸配列に局在するアミノ酸を含むエピトープにて、配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるヒトフェロポーチン1に結合する、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。 - (a)403SPFEDIRSRFIQGESITPTK422(配列番号12);
(b)406EDIRSRFIQGESIT419(配列番号13);
(c)409RSRFIQGESITPTK422(配列番号14);
(d)403SPFEDIRSRFIQG415(配列番号15);
(e)409RSRFIQGESIT419(配列番号16);および
(f)409RSRFIQG415(配列番号95)
からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸配列に局在するアミノ酸から実質的になるエピトープにて、配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるヒトフェロポーチン1に結合する、請求項1に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。 - 配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、および配列番号95からなる群から選択される1つ以上のペプチドに結合する、請求項1または2に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 配列番号98、183〜214からなる群から選択される1つ以上のペプチドに結合しない、請求項1から3のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 配列番号37、129、22、107、118および120にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 配列番号37、174、22、175、176および120にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 配列番号37、125、22、23、110および19にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 配列番号37、177、22、23、112および19にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 配列番号37、122、22、23、110および19にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 配列番号136および配列番号134にそれぞれ示される軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む、請求項5に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 配列番号180および配列番号178にそれぞれ示される軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む、請求項6に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 配列番号140および配列番号138にそれぞれ示される軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む、請求項7に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
- (a)配列番号154および配列番号152にそれぞれ示される軽鎖および重鎖;
(b)配列番号181および配列番号179にそれぞれ示される軽鎖および重鎖;または
(c)配列番号158および配列番号156にそれぞれ示される軽鎖および重鎖
を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。 - 2つの軽鎖ポリペプチドおよび2つの重鎖ポリペプチドを含み、前記軽鎖ポリペプチドの各々は配列番号154に示されるアミノ酸配列を有し、前記重鎖ポリペプチドの各々は配列番号152に示されるアミノ酸配列を有する、請求項13に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 2つの軽鎖ポリペプチドおよび2つの重鎖ポリペプチドを含み、前記軽鎖ポリペプチドの各々は配列番号181に示されるアミノ酸配列を有し、前記重鎖ポリペプチドの各々は配列番号179に示されるアミノ酸配列を有する、請求項13に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 2つの軽鎖ポリペプチドおよび2つの重鎖ポリペプチドを含み、前記軽鎖ポリペプチドの各々は配列番号158に示されるアミノ酸配列を有し、前記重鎖ポリペプチドの各々は配列番号156に示されるアミノ酸配列を有する、請求項13に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 25℃にて表面プラズモン共鳴により測定される場合、約10nM未満のKDでヒトフェロポーチン1に結合する、請求項1から16のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
- 37℃にて表面プラズモン共鳴により測定される場合、約100nM未満のKDでヒトフェロポーチン1に結合するFabを含む、請求項1から12のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記Fabは、ヒトフェロポーチン1について37℃にてSPRにより測定される場合、約7.5×10−3s−1〜約9×10−4s−1の解離速度(koff)を有する、請求項18に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記Fabは、約100nM〜約1nMのKDでヒトフェロポーチン1に結合する、請求項18または19に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記Fabは、約10nM〜約0.5nMのKDでヒトフェロポーチン1に結合する、請求項18から20のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
- ヘプシジン−25生物活性のインビトロアッセイにおいて約100nM〜約1nMのIC50を有する、請求項1から21のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記IC50は、約100nM〜約10nMである、請求項22に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記ヘプシジン−25生物活性は、フェロポーチン1の内在化および/または分解である、請求項23に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
- ヘプシジン−25生物活性のインビボアッセイにおいて約100nM〜約1nMのIC50を有する、請求項1から24のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記アッセイは、霊長類における血清鉄濃度のIL−6により誘導される減少を測定する、請求項25に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 請求項1から26のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
- 請求項27に記載のポリヌクレオチドを含む、組み換え発現ベクター。
- 請求項28に記載の発現ベクターにより形質転換された、宿主細胞。
- 前記宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、NS0骨髄腫細胞、COS細胞、または、SP2/0細胞である、請求項29に記載の宿主細胞。
- 治療に使用するための請求項1から26のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 医薬として使用するための請求項1から26のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 貧血、癌による貧血、または、ヘプシジンの向上した濃度と関連する癌による貧血を治療するための、請求項1から26のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 被験体において、貧血、癌による貧血、または、ヘプシジンの向上した濃度と関連する癌による貧血を治療または予防するための医薬を調製するための、請求項1から26のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの使用。
- ヒトにおいて血清鉄濃度、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および/またはヘマトクリットを増加させるのに使用するための、請求項1から26のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 請求項1から26のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの有効量を被験体に投与する工程を含む、血清鉄濃度、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および/またはヘマトクリットを増加させる方法。
- 請求項1から26のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの有効量を被験体に投与する工程を含む、被験体において貧血または癌による貧血を治療する方法。
- ESA、あるいはヒトにおいて血清鉄濃度、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および/またはヘマトクリットを増加させるために通常利用される他の治療剤または治療的処置を、前記ヒト患者に施す工程をさらに含む、請求項36または37に記載の方法。
- 請求項1から26のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント、および薬学的に受容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む、薬学的組成物。
- 1つ以上の他の治療剤をさらに含む、請求項39に記載の薬学的組成物。
- (i)モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを発現させるのに適切な条件下にて請求項29または30に記載の宿主細胞を培養する工程、および、
(ii)前記発現させたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを回収する工程、
を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを生成する方法。 - 請求項41に記載の方法により取得可能なモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
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