JP2004516018A - 遺伝性ヘモクロマトーシスに関連するフェロポルチン1遺伝子における突然変異 - Google Patents
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Abstract
本発明は、遺伝性ヘモクロマトーシスに関連するフェロポルチン1をコードする遺伝子における突然変異、および、そのような突然変異の同定に基づく遺伝性ヘモクロマトーシスの診断のための方法に関する。
Description
【0001】
発明の背景
本発明は、遺伝性ヘモクロマトーシスに関連するフェロポルチン(ferroportin)1をコードする遺伝子における突然変異、および、遺伝性ヘモクロマトーシスのための診断法としてのそのような突然変異の同定に関する。
【0002】
従来技術
ヘモクロマトーシスは、生物における鉄の過剰蓄積を特徴とする、遺伝性の病状であり、長期にわたると、異なる器官および組織、特に、肝臓、心筋層、膵臓、腎臓、脾臓、性腺、および皮膚、の損傷を引き起こす。突発性ヘモクロマトーシスは、西洋の人々には最も一般的な遺伝性疾患であり(発生率 1:300)、劣性の遺伝を特徴とする。近年、このタイプのヘモクロマトーシスは、染色体6の短腕に位置する、HFE遺伝子の突然変異と関連付けられている。実際に、この病状を患っている患者において行われた研究において、分析された被験者の83%が、この遺伝子(C282Y)において、一点突然変異を有することが観察された(フェダー(Feder)ら、Nat Genet 1996、13: 399−408)。
【0003】
しかし、より最近の研究により、地中海人種の人々では、遺伝性ヘモクロマトーシスを患っている患者の64%のみが、C282Yに関するホモ接合体であることが示された。このことは、特に南ヨーロッパの人々では、HFE以外の他の遺伝子が、突発性ヘモクロマトーシスの原因であり得ることを示唆している(ピペルノ(Piperno)ら、ガストロエンテロロジー(Gastroenterology) 1998、114: 996−1002およびボロト(Borot)ら、イムノゲンティクス(Immunogentics) 1997、45: 320−324)。
【0004】
遺伝性ヘモクロマトーシスの原因である遺伝的突然変異の同定は、診断および治療に非常に重要である。現在まで、ヘモクロマトーシスの診断は、非常に遅れており、かつ、しばしば取り返しのつかない組織の損傷の結果として進行する、臨床的症状に基づいている。その上、この病状の診断は、その症状が、鉄ホメオスタシスの変化を特徴とする他の病状のものと類似することがあるという事実により、困難になる。
【0005】
遺伝性ヘモクロマトーシスの、症状が起こる前の段階での早期診断のための遺伝的スクリーニング方法の開発は、器官および組織へのダメージが起こる前の、適時の静脈切開介入(timely phlebotomy intervention)を可能にし得る。
【0006】
さらに、遺伝性ヘモクロマトーシスに関連する遺伝的変化の同定および症状の進行においてそれらが果たす役割の理解は、新たな改良された治療的ストラテジーの準備のために、きわめて重要である。
【0007】
発明の要約
本発明者は、常染色体に優性な遺伝パターンによって、非HFE依存性ヘモクロマトーシスの状態を患っている群を、あらかじめ同定し、かつ特徴付けした(ピエトランゲロ(Pietrangelo)ら、New Eng J Med 1999, 341: 725−732)。
そこで、本発明者は、驚くべきことに、この症状の遺伝子座は、染色体2(2q32)の長腕上にあること、および、このタイプのヘモクロマトーシスを患っている被験者は、同じ染色体領域に位置する、フェロポルチン1をコードする遺伝子のヘキソン3に位置するコドンに、その症状を患っていない被験者では観察されない突然変異を有することを見出した。この突然変異は、フェロポルチン1分子において、アミノ酸の置換を引き起こす。
【0008】
従って、本発明は、配列番号2の77位に相当するアミノ酸をコードするコドンの突然変異を特徴とする突然変異フェロポルチン1をコードする核酸、前記核酸によってコードされた突然変異フェロポルチン1蛋白質、および、前記核酸または前記蛋白質の同定に基づく遺伝性ヘモクロマトーシスのインビトロ診断のための方法に関する。
【0009】
図面の説明
図1:実施例3に記載のMbollによる酵素消化による突然変異の同定のためのストラテジーのアウトライン。
【0010】
詳細:
図1aは、診断方法におけるゲノムDNA配列を示し、枠で囲んだGCC配列は、野生型フェロポルチンの77位のアミノ酸アラニンをコードするコドンであり、遺伝性ヘモクロマトーシスを患っている人々において、GACコドンに突然変異される。二本線(//)は、ヘキソン3とイントロン3のセグメントとの間の分離を示す。
【0011】
図1bは、実施例3bに記載の診断方法のPCR反応において使用されるプライマーおよびターゲットゲノムDNA配列(Nは、CまたはAヌクレオチドを意味する)である。フォワードプライマーは、アンダーラインを付した、ミスマッチなプライマーを有する(Gの代わりにA)。
【0012】
図1cは、突然変異を含まない、対照の人々からの増幅された配列を示す。
【0013】
図1dは、代わりに、症状を患っている人々からの増幅されたDNA配列を示し、対立遺伝子の1つにおいて、GCCコドンがGACコドンに突然変異させられ、かつ、Mbo II酵素に対するコンセンサス部位の出現を引き起こす。
【0014】
図2:健康な群のメンバーまたはヘモクロマトーシスを患っている群のメンバーにおける診断的分析の結果。
【0015】
詳細:
図2aは、分析された人々(家系)の間の関係を示す。ヘモクロマトーシスを患っている被験者は、黒で表されており、一方、健康な被験者は、白で表されている。丸は、女性の被験者を表し、四角は男性を表す。
【0016】
図2bは、それぞれの各人から増幅されたDNAの制限プロファイル、その後のMbo IIによる消化を示す。
【0017】
図2cに示すように、野生型配列のみを有し、その後にMbo IIによる消化が行われる、健康な被験者の場合、131塩基対が増幅された(131 base pair amplified)DNAは、消化されない。症状を患っているすべての被験者は、突然変異に対するホモ接合体であるので、これらの患者から増幅されたDNAは、131塩基対のバンド(正常な対立遺伝子)、ならびに、94および37塩基対の2つのバンド(後者は、図2bには示されていない)で消化される。
【0018】
発明の詳細な説明
以下の実施例に詳細に示されるように、本発明者らは、フェロポルチン1遺伝子のヘキソン3に位置する特定のコドンの突然変異が、HFE遺伝子に依存しない、遺伝性ヘモクロマトーシスの状態に関連することを同定した。
同定された突然変異は、配列番号2(添付の配列表)の77位に相当する位置にあるアミノ酸アラニンが置換されている、突然変異フェロポルチン1の発現を引き起こす。
【0019】
驚くべきことに、本発明者らは、上記の突然変異が、HFE遺伝子に関連しない遺伝性ヘモクロマトーシスの存在の十分な徴候であること、および、そのために、その徴候が、この症状の早期診断に有用であることを見出した。その上、本発明者らは、遺伝性ヘモクロマトーシスが、フェロポルチン1の機能の低下に関連することを見出した。
【0020】
従って、第一の態様によれば、本発明は、配列番号2の77位に相当するアミノ酸をコードするコドンの突然変異を含むことを特徴とする、突然変異フェロポルチン1をコードする核酸に関する。“フェロポルチン1をコードする核酸”という語は、配列番号2のアミノ酸配列をコードするか、または、前記アミノ酸配列と、少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%相同性であるアミノ酸配列をコードする、ゲノムDNA、cDNA、例えば、PCRから得られたDNA、もしくはmRNAを意味する。核酸がDNAの場合、これは、一重または二重らせんであり得る。
【0021】
また、本発明は、前記核酸に相補的な配列を有するアミノ酸を含む。例えば、この配列は、細胞中の遺伝子またはmRNAの発現を停止させるために使用されるアンチセンス配列であり得る。
【0022】
本発明による突然変異は、77位に相当するアミノ酸の野生型フェロポルチン1(ゲンバンク(GenBank)登録番号:AF231121)の分子中の置換を引き起こす。
“野生型フェロポルチン1”という語は、特に、その機能性を変える突然変異をもたない、その正常な生理学的役割を果たすフェロポルチン1を表す。その上、アミノ酸の位置(numerical position)は、それを同定する目的のみを有し、かつ、蛋白質のアミノ酸配列の変化があることによって、例えば、考慮される種の変化により、または、突然変異の存在もしくは前記アミノ酸の上流の領域における欠落によって変わり得る。
【0023】
本発明者は、アスパラギン酸の分子による、77位のアラニンの置換により、例えば、蛋白質二次構造の予想プログラム、いわゆる、“PHDsec” (ロスト(Rost)ら、J Mol Biol 232: 584−599、1993)および“JRED”(クフ(Cuff)ら、プロテインズ(Proteins): ストラクチャー(Structure)、ファンクション・ジェネティクス(Function Genetics)アンド(and) 34: 508−519) によって示され得る、フェロポルチン1における構造的修正が起こることを見出した。特に、前記置換は、アルファ−へリックスからベータ層構造への、アミノ酸58からアミノ酸81にわたる蛋白質領域(LLLTAVYGLVVAGS VLVLGXIIGD、配列番号8)の継代(passage)を決定する。
【0024】
フェロポルチン1の二次構造の決定における、77位のアミノ酸の重要性も、異なる動物種間での、その高い保存性(conservation)によって立証される。
【0025】
帯電している、より大きな分子、例えば、アスパラギン酸による、小さな帯電していないアミノ酸であるアラニンの置換により、アルファへリックス水素結合を不安定にする、立体的静電相互作用が生じる。同様に、例えば、アルギニン、リジン、もしくはグルタミン酸のような、帯電したアミノ酸、または、より大きな立体障害を有するアミノ酸、例えば、ヒスチジンによる、アラニンの置換は、同様の分子のひずみを引き起こし得る。
【0026】
その上、配列番号8に相当するフェロポルチン1領域は、本発明による突然変異蛋白質において変えられる、蛋白質の形質導入後修正部位(post−transductional modification site)、ミリスチン化部位GAIIGDを含む。知られているように、ポリペプチドと膜リン脂質との相互作用を助ける際に、ミリスチン化は重要である。
【0027】
従って、第二の態様によれば、本発明は、配列番号2の77位に相当する位置におけるアミノ酸の置換を特徴とする、上記のアミノ酸によってコードされる、突然変異フェロポルチン1に関する。
【0028】
前記の置換は、アラニンとは異なる立体的および/または静電的性質を有するアミノ酸による、77位に相当する位置におけるアミノ酸アラニンの置換である。好ましくは、前記アミノ酸は、アルギニン、リジン、グルタミン酸、またはアスパラギン酸を含む群から選ばれ、中でも、アスパラギン酸が好ましい。
【0029】
従って、特に好ましい適用によれば、本発明の核酸に存在する突然変異は、GACおよびGAUを含む群から選ばれるコドン、好ましくはGACによる、配列番号2の77位に相当する位置におけるアミノ酸をコードするコドン、好ましくはGCCの置換にある。
【0030】
本発明の更なる態様は、配列番号2の77位に相当するアミノ酸、ならびに、このすぐ下流および/または上流のアミノ酸を含む、少なくとも6個のアミノ酸のアミノ酸配列を有するペプチドに関する。そのようなペプチドの長さおよび配列は、所望の適用により、例えば、突然変異に特異的な抗体のホスト動物における生成を刺激するために、または、突然変異エピトープと特異的に相互作用するペプチドおよび/もしくは抗体を得るために、当業者に既知の規準に基づいて選択される。
そのようなペプチドの好ましい態様は、配列番号8に相当するペプチドであり、Xaaは、アスパラギン酸であることが好ましい。
【0031】
本発明は、更に、突然変異コドン、および、前記コドンを含む前記核酸の、少なくとも9個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも15個のヌクレオチドの配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、前記核酸のヌクレオチドフラグメントに関する。
前記フラグメントおよびオリゴヌクレオチドは、RNAまたはDNAであることができ、後者の場合は、一重または二重らせんであることができる。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、一重らせんである。
【0032】
更に、本発明は、前記フラグメントまたはオリゴヌクレオチドのものと相補的な配列を有するヌクレオチドフラグメントおよびオリゴヌクレオチドを含む。本発明によれば、“ヌクレオチドフラグメント”とは、100塩基対を超える長さを有する本発明の核酸の部分的な配列に相当する配列を有する核酸を意味する。
【0033】
本発明によれば、“オリゴヌクレオチド”とは、100塩基対の最大長さの本発明の核酸のフラグメントを意味する。
本発明のヌクレオチドフラグメントおよびオリゴヌクレオチドは、例えば、PCRによる増幅による、本発明の核酸の消化によって得られ得るか、または、当分野で既知の技術を用いて合成され得る。
【0034】
本発明のオリゴヌクレオチドおよびDNAフラグメントは、例えば、キメラ蛋白質もしくは抗体の生成、診断目的のための本発明の突然変異の決定、または、治療目的のための突然変異遺伝子の不活性化のような、異なる目的のために使用される。当業者は、所望の使用に適した配列および長さを有するフラグメントおよびオリゴヌクレオチドを選択することができる。例えば、前記フラグメントまたはオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション技術による、本発明の突然変異の決定のために使用されるべきであり、それらは、突然変異コドンを含む核酸配列において、ストリンジェントな条件下で、特定の方法においてハイブリダイズし得るような長さおよび配列を有さなければならない。
【0035】
好ましい態様によれば、本発明のフラグメントおよびオリゴヌクレオチドは、例えば、放射性同位体、酵素、ビオチン−アビジン、または、特定のアッセイによってそれらを視覚化し得る他の分子によって、ラベルされる。
更に、本発明は、そのようなフラグメントおよびオリゴヌクレオチドによってコードされるペプチドに関する。
【0036】
本発明の核酸、突然変異を含むそのフラグメント、または、そのようなフラグメントを含む核酸は、例えば、例えば競争研究による、突然変異蛋白質の機能的特徴の研究のために、または、抗体の生成のために、組み換え型の突然変異フェロポルチン1、そのフラグメント、またはこのフラグメントを含むキメラ蛋白質の生成のために有利に使用され得る。この目的のために、前記核酸またはフラグメントは、トランスフェクション、形質転換、感染、または核内注入のような、当分野で周知の技術を用いて、原核生物または真核生物細胞に順番に導入される、発現ベクターに挿入される。
この目的に適したベクターには、プラスミド、ウイルス起源のベクター、および酵母または哺乳動物人工染色体が含まれる。
【0037】
従って、更なる態様において、本発明は、本発明による核酸またはDNAフラグメントを含む組み換え型ベクター、ならびに、前記ベクターを含む真核生物細胞または原核生物細胞に関する。
【0038】
本発明による核酸は、本発明の突然変異フェロポルチン1をコードする導入遺伝子を含む、真核生物細胞、組織、または非ヒト(non−human)動物の調製のために使用され得る。導入遺伝子は、細胞、組織、または動物のゲノムに永続的に挿入され得るか、または、染色体外の状態で存在し得る。
【0039】
前記細胞、組織、または非ヒト動物は、遺伝子および本発明の突然変異を含む蛋白質の機能、ならびに、遺伝性ヘモクロマトーシスの発症におけるそれらの役割を研究するためのモデルとして有用である。この研究は、遺伝性ヘモクロマトーシスの治療のための、新たな治療的アプローチの開発のために、特に重要である。
【0040】
更なる態様において、本発明は、以下の段階を含む、哺乳動物、好ましくはヒトにおける遺伝性ヘモクロマトーシスのインビトロ診断のための方法に関する:
a)前記哺乳動物から得られた生物学的試料からのゲノムDNAまたはRNAの単離;
b)前記ゲノムDNAまたはRNAにおける、本発明による突然変異の存在に関する試験、
ここで、前記突然変異の存在は、前記哺乳動物が、遺伝性ヘモクロマトーシスを患っていることの徴候である。
好ましくは、前記生物学的試料は、血漿、唾液、尿、糞便、羊膜液または組織の試料である。
試験前に、逆転写反応によって、RNAを、相補的DNA(cDNA)に形質転換することが好ましい。
【0041】
ゲノムDNAまたはcDNAは、直接、または、インビトロ増幅ポリメラーゼ・チェーン反応(PCR)(サイキ(Saiki)ら、サイエンス(Science) 239: 487−491、1988)もしくは、他の技術、例えば、リガーゼ・チェーン反応(LCR)(ウー(Wu)ら、ゲノミクス(genomics) 4: 560−569、1989)、鎖置換増幅(SDA)(ウォーカー(Walker)ら、PNAS USA 89: 392−396)、もしくは自立的(self−sustained)配列複製(3SR)(ファイ(Fahy)ら、PCR methods Appl. 1: 25−33、1992)の後に分析される。
好ましくは、ゲノムDNAまたはcDNAは、配列番号2の77位に相当するアミノ酸をコードするコドンを含む前記DNAのセグメントの増幅に適したオリゴヌクレオチド(プライマー)対を用いるPCRによって増幅される。
例えば、cDNAの増幅に使用され得るプライマー対は、配列番号3および配列番号4のヌクレオチド配列を有するものであるのに対し、ゲノムDNAの増幅に適したプライマーは、配列番号5および配列番号6のヌクレオチド配列を有するものである。
【0042】
当分野で周知の多くの技術は、ゲノムDNAまたはcDNAにおいて、本発明による突然変異の有無を決定するために使用され得る。適当な技術は、例えば、制限酵素の使用に基づく技術(カン(Kan)ら、Lancet: 910−912、1978)、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーション技術(ワランス(Wallace)ら、Nucl Acids Res 6: 3543−3557、1978)であり、中でも、例えば、フィルター(サイキ(Saiki)ら、PNAS USA 86: 6230−6234、1989)もしくはマイクロチップ(チー(Chee)ら、サイエンス(Science) 274: 610−614、1996)に固定されたオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーション、および、オリゴヌクレオチドアレイ(マスコス(Maskos)ら、Nucl Acids Res 21: 2269−2270、1993)、対立遺伝子特異的PCR(ニュートン(Newton)ら、Nucl Acid Res 17: 2503−2516、1989)、ミスマッチ修復検出(MRD)(ファハム(Faham)およびコックス(Cox) Genome Res: 474−482、1995)、一本鎖構造多形分析(ラブニク−グラバク(Ravnik−Glavac)ら、Hum. Mol. Gen. 3: 801、1994)、変性剤勾配(denaturant gradient)におけるゲル電気泳動(グルドバーグ(Guldberg)ら、Nucl. Acids Res. 22: 880、1994)、熱切断(Hot Cleavage)(コットン(Cotton)ら、Proc.Natl. Acad Ski USA 85: 4397, 1988), DNAse (ユイル(Youil)ら、PNAS USA 92: 87−91、1995)およびRNAse保護アッセイ(ウインター(Winter)ら、Proc. Natl. Acad. Ski. USA, 82: 7575、1985; メイヤーズ(Meyers)ら、サイエンス(Science) 230: 1242、1985)、対立遺伝子特異的プライマー伸張(シバネン(Syvanen)ら、ゲノミクス(genomics) 8: 684−692、1990、およびシバネン(Syvanen)ら、Hum Mutat 13: 1−10、1999)、遺伝的ビット分析(GBA)(ニキフォロフ(Nikiforov)ら、Nucl Acid Res 22: 4167−4175、1994)、プライマーライゲーションアッセイ(OLA) (ランデルゲン(Landergen)ら、サイエンス(Science) 241: 1077、1988)、対立遺伝子特異的ライゲーションチェーン反応(LCR) (バラニー(Barrany) PNAS USA 88: 189−193、1991)、ギャップ−LCR(アブラバヤ(Abravaya)ら、Nucl Acids Res 23: 675−682、1995)、ならびに配列決定技術である。本発明の突然変異の決定のために特に好ましい技術は、制限酵素の使用に基づく技術、対立遺伝子特異的PCR、ハイブリダイゼーションおよび配列決定技術である。
【0043】
従って、第一の好ましい適用によれば、分析されるDNAにおける、本発明による突然変異の存在に関する試験は、制限酵素の使用に基づく技術を用いて行われ、かつ、以下の段階を含む:
a)配列番号2の77位に相当するアミノ酸をコードするコドンを含む前記DNAのセグメントの選択的増幅に適したオリゴヌクレオチド対による、ゲノムDNAまたはcDNAの増幅、および、本発明の突然変異の存在下において、そうでなければ存在しない(otherwise not present)、制限部位に対するコンセンサス配列を生み出す、そのような突然変異の増幅されたDNAへの同時導入;
b)前記制限部位を認識し得る酵素との、増幅されたDNAのインキュベーション;ならびに、
c)消化産物の大きさの分析;ここで、消化が起こることは、ゲノムDNAまたは相補的DNAにおける本発明の突然変異の存在のサインである。
【0044】
消化産物の大きさの分析は、例えば、分子量のマーカーを用いるゲル電気泳動、その後の、例えば、臭化エチジウムを用いるDNAバンドの視覚化によって行われ得る。例えば、アスパラギン酸分子をコードするGACコドンによる、77位のアラニンをコードするGCCコドンの置換の存在を試験するために、配列番号6および配列番号7のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドが使用され得る。後述の実施例で示されるように、前記置換の存在下で、これらのオリゴヌクレオチドは、野生型DNA(図1c)から増幅されるDNAのフラグメントには存在しない、Mbo II酵素に対するコンセンサス部位、GAAGACATCATCGGT、を含む、図1dに示す配列を有する増幅されたDNAのフラグメントを生じる。Mbo IIによる増幅反応の産物のその後のインキュベーションにより、本来の配列に突然変異が存在する場合にのみ消化されるフラグメントが生じる。更に好ましい適用によれば、本発明による突然変異の決定は、本発明の核酸のフラグメントまたは本発明による突然変異に特異的なオリゴヌクレオチドが使用される、ハイブリダイゼーション技術によって行われる。
【0045】
前記フラグメントまたはオリゴヌクレオチドは、突然変異コドンを含む本発明の核酸の配列において、前記配列が、多くの他の配列と共に存在する場合にも、特定の方法においてハイブリダイズし得る。
当業者は、ハイブリダイゼーション条件、ならびに、使用される特別なハイブリダイゼーション技術に最も適したフラグメントまたはオリゴヌクレオチドの長さおよび配列、ならびに、分析されるDNA(適当なベクターにおいて増幅またはクローニングされるゲノムまたは相補的DNA)の種類を、毎回選択することができる。
【0046】
更に好ましい適用によれば、診断法は、ゲノムDNAまたは相補的DNAが、突然変異コドンを含む前記DNAのセグメントを選択的に増幅し得るが、野生型コドンを含む対応するセグメントを増幅しないオリゴヌクレオチドが使用されるPCR反応に付される、対立遺伝子特異的PCRの使用を予想する。
また、本発明は、前記方法において使用されるべき、本発明による核酸フラグメントおよびオリゴヌクレオチドにも関する。特に、それは、配列番号3、4、5、6、および7に相当するヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドに関する。
【0047】
本発明の範囲内には、各人における、本発明による突然変異の同定のための診断用キットも含まれる。特に好ましい適用によれば、前記診断用キットは、配列番号6および7に相当するヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドならびにMbo II酵素を含む。
【0048】
本発明はまた、哺乳動物における、前記哺乳動物からの生物学的試料中の、本発明による突然変異フェロポルチン1蛋白質の存在に関する試験を含む、遺伝性ヘモクロマトーシスのインビトロ診断のための方法であって、前記蛋白質の同定が、その人が遺伝性ヘモクロマトーシスを患っていることの徴候である方法に関する。
好ましくは、前記試験は、本発明による突然変異フェロポルチンの分子と野生型フェロポルチンの分子とを識別し得るモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が使用される、免疫学的アッセイによって行われる。
【0049】
従って、本発明はまた、本発明による突然変異フェロポルチン1の分子を特異的に認識し得るモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、または、突然変異を含むそのエピトープに関する。そのような抗体は、ハーロー(Harlow)およびレーン(Lane)によって、アンチボディズ(Antibodies)、ラボラトリー・マニュアル(A Laboratory Manual)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbour Laboratory) 1988に記載されているもののような、当分野で周知の方法を用いて得られる。
【0050】
その上、本発明の抗体は、蛋白質の特徴の研究において、または、治療目的のために、診断薬として特に有用である。例えば、前記抗体は、その生化学的特徴の研究または免疫親和力によるその精製のために、突然変異蛋白質の正確な組織または細胞局在化を決定するために使用され得る。
【0051】
更に、各人における、本発明の突然変異を有する遺伝子およびそれによってコードされるフェロポルチン1の存在は、遺伝性ヘモクロマトーシスの発症と相関するので、遺伝子の発現を停止するか、または、蛋白質を不活性化するための手段を有することは、非常に重要である。
【0052】
従って、本発明はまた、本発明の突然変異フェロポルチン1をコードする遺伝子の発現の阻害に適したオリゴヌクレオチド、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ならびに、本発明の突然変異フェロポルチン1の機能性を特異的に変え得る抗体およびポリペプチドに関する。
また、本発明は、薬学的に許容され得る添加剤と混合した、前記オリゴヌクレオチド、抗体、またはペプチドを含む薬学的組成物に関する。
【0053】
【実施例】
実施例1
非HFE依存性遺伝性ヘモクロマトーシスに関連する染色体および染色体の位置の同定
キアゲン・ブラッド・エクストラクション・キット(Quiagen Blood Extraction Kit)(キアゲン(Quiagen))を用いて、発端者(proband)および症状を患っている群のメンバーの末梢血から、DNA試料を抽出した。
次いで、抽出されたDNAを、ABI PRISM リンケージ・マッピング・セット(Linkage mapping set)(パーキンエルマー(Perkin Elmer)、米国)を用いることによって行われる、ゲノムの広範な研究のために使用した。製造者から提案された条件下で、蛍光性オリゴヌクレオチドを、PCR反応のために使用した。次いで、各PCR反応のアリコートを、ABI PRISM 377 DNA シーケンサーにおいて配列決定し、得られた結果を、GENESCANソフトウェアを用いて分析した。対立遺伝子の指定(assignment)は、ゲノタイパー(Genotyper)(商標)ソフトウェアを用いて行った。完全浸透度(complete penetrance)による優性常染色体疾患に基づく統計分析を行った。遺伝子疾患の頻度を、0.012で固定し、すべてのマーカー対立遺伝子を、同じ頻度とみなした。表1は、ロッドスコア(lod score)、即ち、特異的マーカーと病気との関連の最大確率、を含む。
【0054】
【表1】
【0055】
対数で表されたスコアが高いほど、病気と使用される特異的マーカーとの関連が偶然である(casual)確率が低い。例えば、1.0のロッド・スコアは、その結果が偶然である確率が10分の1であること(1 chance in 10)を意味し、2のロッド・スコアは、100分の1の確率であることを意味し、以下同様である。マーカーD2S118(5.99)およびD2S152(5.88)により、非常に高いスコアが得られるという事実は、病気に関連する遺伝子が、これらマーカーによって範囲を定められる領域に位置していることを示す。フェロポルチン1は、この染色体領域に位置する。他の染色体領域では、同様の結果は得られなかった。
【0056】
実施例2
突然変異の同定
発端者から、15人の症状を患っている群のメンバーから、および、25人の症状を患っていない群のメンバーから、血液試料を採取した。グアニジン−イソチオシアネートにおける抽出によって各試料から得られたマクロファージから、全RNAを単離し、次いで、相補的DNAを、標準プロトコルによって調製した(400 ngの全RNA、1μgのオリゴdT、1mMのdNT、20 Uの逆転写されたAMVを含む20μlの反応バッファー; プロメガ(Promega))。次いで、以下のオリゴヌクレオチド対を用いたPCR反応によって、完全なフェロポルチン1配列を、cDNAから増幅した:
フォワードプライマー 5’−GCTCAGGGCGTCCGCTAGGCT−3’
(配列番号3)
リバースプライマー 5’−GGCTTACACCCTCATGTTCT−3’
(配列番号4)
【0057】
詳細には、逆転写反応の生成物10mlを、50μl(最終容量)の1×反応バッファー(200μM dNTP、1.5mM MgCl2、0.25μgのそれぞれの上記オリゴヌクレオチド、2.6単位の酵素を含む)中で増幅した。増幅反応のために、それぞれが、以下の加熱プロファイル:
94℃、1分、
58℃、40秒、
75℃、5分
を特徴とする、30サイクルのプログラムを使用した。
次いで、増幅されたフェロポルチン1cDNAから、4つの部分的に上に重なっているDNAフラグメントを、以下のオリゴヌクレオチド対を用いて、新たなPCRによって得た:
1 °フラグメント:
フォワードプライマー:5’−GCTCAGGGCGTCCGCTAGGCT−3’
リバースプライマー:5’−CAGACACCGCAAAGTGCCACA−3’
2 °フラグメント:
フォワードプライマー:5’−ACCTCGCTGGTGGTACAG−3’
リバースプライマー:5’−CCGCAAGCAAAGAGCTTG−3’
3 °フラグメント:
フォワードプライマー:5’−GGTGCTATCTCCAGTTCCTT−3’
リバースプライマー:5’−AGACGTACTCCACGCACA−3’
4 °フラグメント:
フォワードプライマー:5’−TCAGTCTCCTTTGTGGCA−3’
リバースプライマー:5’−GGCTTACACCCTCATGTTCT−3’
【0058】
次いで、増幅から得られた4つのフラグメントを、アガロースゲル上で電気泳動によって分離し、ジェット・ソーブ・キット(Jet Sorb kit)(ジェネンコ(Genenco))を用いて精製し、そして、ローダミン・シーケンス・キット(Rhodamine Sequence kit)(パーキンエルマー(Perkin Elmer)、米国)を用いて直接配列決定した。配列決定により、症状を患っている被験者において、対照のどの被験者でも見られなかった、配列番号1の230位における、CのAによる置換の存在が明らかになった(ゲンバンク(GenBank)登録番号:AF231121を有する配列の534位におけるヌクレオチド)。この置換は、フェロポルチン1遺伝子のヘキソン3に位置しており、それにより、フェロポルチン1の77位でのアスパラギン酸によるアラニンの置換が起こった。
【0059】
実施例3
診断法
a)発端者、15人の症状を患っている群のメンバー、ならびに、100人の健康なボランティアおよび25人の症状を患っていない群のメンバーを含む125人の対照の人々のゲノムDNAを、血液DNA抽出キット(キアゲン(Quiagen))を用いて分析されるべき被験者の血液試料からの白血球から抽出した。
次いで、ヘキソン3を側面に有し(flanking)、かつ、以下の配列を有するイントロン領域と相補的なオリゴヌクレオチド対を用いたPCRによって、得られたDNAを増幅した:
フォワードプライマー:5’−CCTTTTGATAAGGAAGCAACTTCC−3’
(配列番号5)
リバースプライマー:5’−CAGAGGTAGCTCAGGCATTGGTCC−3’
(配列番号6)
【0060】
詳細には、200ngのゲノムDNAを、50μlの1×反応バッファー(200μM dNTP類、 1.5 mM MgCl2、20 pmoleの各オリゴヌクレオチド、および2.6 Uの酵素を含む)中で増幅させた。
それぞれが、以下の加熱プロファイル:
94℃、1分、
60℃、1分、
72℃、45秒
を特徴とする、30サイクルのプログラムを、増幅反応のために使用した。
【0061】
次いで、得られたDNAを、PCRウィザード・キット(Wizard kit)(プロメガ(Promega))を用いて精製し、PCR反応のために使用した、同じオリゴヌクレオチド対を用いて、自動ABI プリズム(Prism) 377シーケンサー(パーキンエルマー(Perkin Elmer)、米国)において配列決定した。
ヘキソン3におけるCによるAの置換が、症状を患っている被験者において見られたが、対照の被験者では見られなかった。
【0062】
b)発端者から、15人の症状を患っている群のメンバーから、および実施例2に記載の125人の対照被験者から、血液試料を得て、血液DNA抽出キット(バイオラド(Biorad))を用いて、ゲノムDNAを抽出した。
観察される突然変異は、制限部位の出現または消滅を何ら引き起こさないので、突然変異を含むヘキソン3の一部が、以下の配列を有するオリゴヌクレオチド対を用いたPCRによって増幅された:
フォワードプライマー: 5’−GTGGCAGGGTCTGTTCTGGTCCTGGAAG−3’
(配列番号7)
リバースプライマー:5’−CAGAGGTAGCTCAGGCATTGGTCC−3’
(配列番号6)
【0063】
図1bに示すように、フォワードプライマーは、ミスマッチのヌクレオチドを有する(Gの代わりにA、アンダーラインを付した)。前記オリゴヌクレオチドによる増幅は、突然変異の存在下で、図1dに示す配列を有する、Mbo II酵素に対するコンセンサス部位、GAAGACATCATCGGT、を含む、増幅されたフラグメントを生じる。それに対して、突然変異がない場合は、図1dに示す配列を有する、そのような制限部位(図1c)を含まないDNAフラグメントが得られる。
【0064】
従って、Mbo II酵素による増幅反応の生成物のその後のインキュベーションにより、本来の配列が突然変異を含んでいた場合にのみ、フラグメントが消化される。
詳細には、10μlの抽出されたゲノムDNAが、最終的に50μlの1×反応バッファー(200μM dNTP類、1.5 mM MgCl2、20 pmoleの各オリゴヌクレオチド、および2.6単位の酵素を含む)中で増幅される。それぞれのサイクルが、以下の加熱プロファイル:
94℃、1分、
58℃、1分、
72℃、45秒
を特徴とする、30サイクルのプログラムが、増幅反応のために使用された。
【0065】
次いで、増幅から得られた生成物10μlを、Mbo II酵素(ジェネコ(Geneco))を用いて、1×反応バッファー中で、3時間、37℃で消化した。
次いで、消化から得られたフラグメントを、12%ポリアクリルアミドゲル上で分離した。症状を患っている患者から得られた試料から、131、94、および37塩基対のバンドが得られた。それに対して、得られたすべての対照試料は、たった1つの131塩基対のバンドを有していた。図2は、発端者から、4人の症状を患っている群のメンバーから、および3人の健康な群のメンバーから得られた結果を示す。図からわかるように、131塩基対のフラグメントの、94塩基対および37塩基対の2つのフラグメントへの消化は、症状を患っている被験者でのみ観察された。
【0066】
本発明には、野生型遺伝子による突然変異遺伝子の置換を含む、何らかの治療操作も含まれる。従って、突然変異フェロポルチン1分子は、突然変異遺伝子の置換を目的とする、すべての遺伝的治療操作のための治療的ターゲットである。
【図面の簡単な説明】
【図1】実施例3に記載のMbollによる酵素消化による突然変異の同定のためのストラテジーのアウトライン。
【図2】健康な群のメンバーまたはヘモクロマトーシスを患っている群のメンバーにおける診断的分析の結果。
発明の背景
本発明は、遺伝性ヘモクロマトーシスに関連するフェロポルチン(ferroportin)1をコードする遺伝子における突然変異、および、遺伝性ヘモクロマトーシスのための診断法としてのそのような突然変異の同定に関する。
【0002】
従来技術
ヘモクロマトーシスは、生物における鉄の過剰蓄積を特徴とする、遺伝性の病状であり、長期にわたると、異なる器官および組織、特に、肝臓、心筋層、膵臓、腎臓、脾臓、性腺、および皮膚、の損傷を引き起こす。突発性ヘモクロマトーシスは、西洋の人々には最も一般的な遺伝性疾患であり(発生率 1:300)、劣性の遺伝を特徴とする。近年、このタイプのヘモクロマトーシスは、染色体6の短腕に位置する、HFE遺伝子の突然変異と関連付けられている。実際に、この病状を患っている患者において行われた研究において、分析された被験者の83%が、この遺伝子(C282Y)において、一点突然変異を有することが観察された(フェダー(Feder)ら、Nat Genet 1996、13: 399−408)。
【0003】
しかし、より最近の研究により、地中海人種の人々では、遺伝性ヘモクロマトーシスを患っている患者の64%のみが、C282Yに関するホモ接合体であることが示された。このことは、特に南ヨーロッパの人々では、HFE以外の他の遺伝子が、突発性ヘモクロマトーシスの原因であり得ることを示唆している(ピペルノ(Piperno)ら、ガストロエンテロロジー(Gastroenterology) 1998、114: 996−1002およびボロト(Borot)ら、イムノゲンティクス(Immunogentics) 1997、45: 320−324)。
【0004】
遺伝性ヘモクロマトーシスの原因である遺伝的突然変異の同定は、診断および治療に非常に重要である。現在まで、ヘモクロマトーシスの診断は、非常に遅れており、かつ、しばしば取り返しのつかない組織の損傷の結果として進行する、臨床的症状に基づいている。その上、この病状の診断は、その症状が、鉄ホメオスタシスの変化を特徴とする他の病状のものと類似することがあるという事実により、困難になる。
【0005】
遺伝性ヘモクロマトーシスの、症状が起こる前の段階での早期診断のための遺伝的スクリーニング方法の開発は、器官および組織へのダメージが起こる前の、適時の静脈切開介入(timely phlebotomy intervention)を可能にし得る。
【0006】
さらに、遺伝性ヘモクロマトーシスに関連する遺伝的変化の同定および症状の進行においてそれらが果たす役割の理解は、新たな改良された治療的ストラテジーの準備のために、きわめて重要である。
【0007】
発明の要約
本発明者は、常染色体に優性な遺伝パターンによって、非HFE依存性ヘモクロマトーシスの状態を患っている群を、あらかじめ同定し、かつ特徴付けした(ピエトランゲロ(Pietrangelo)ら、New Eng J Med 1999, 341: 725−732)。
そこで、本発明者は、驚くべきことに、この症状の遺伝子座は、染色体2(2q32)の長腕上にあること、および、このタイプのヘモクロマトーシスを患っている被験者は、同じ染色体領域に位置する、フェロポルチン1をコードする遺伝子のヘキソン3に位置するコドンに、その症状を患っていない被験者では観察されない突然変異を有することを見出した。この突然変異は、フェロポルチン1分子において、アミノ酸の置換を引き起こす。
【0008】
従って、本発明は、配列番号2の77位に相当するアミノ酸をコードするコドンの突然変異を特徴とする突然変異フェロポルチン1をコードする核酸、前記核酸によってコードされた突然変異フェロポルチン1蛋白質、および、前記核酸または前記蛋白質の同定に基づく遺伝性ヘモクロマトーシスのインビトロ診断のための方法に関する。
【0009】
図面の説明
図1:実施例3に記載のMbollによる酵素消化による突然変異の同定のためのストラテジーのアウトライン。
【0010】
詳細:
図1aは、診断方法におけるゲノムDNA配列を示し、枠で囲んだGCC配列は、野生型フェロポルチンの77位のアミノ酸アラニンをコードするコドンであり、遺伝性ヘモクロマトーシスを患っている人々において、GACコドンに突然変異される。二本線(//)は、ヘキソン3とイントロン3のセグメントとの間の分離を示す。
【0011】
図1bは、実施例3bに記載の診断方法のPCR反応において使用されるプライマーおよびターゲットゲノムDNA配列(Nは、CまたはAヌクレオチドを意味する)である。フォワードプライマーは、アンダーラインを付した、ミスマッチなプライマーを有する(Gの代わりにA)。
【0012】
図1cは、突然変異を含まない、対照の人々からの増幅された配列を示す。
【0013】
図1dは、代わりに、症状を患っている人々からの増幅されたDNA配列を示し、対立遺伝子の1つにおいて、GCCコドンがGACコドンに突然変異させられ、かつ、Mbo II酵素に対するコンセンサス部位の出現を引き起こす。
【0014】
図2:健康な群のメンバーまたはヘモクロマトーシスを患っている群のメンバーにおける診断的分析の結果。
【0015】
詳細:
図2aは、分析された人々(家系)の間の関係を示す。ヘモクロマトーシスを患っている被験者は、黒で表されており、一方、健康な被験者は、白で表されている。丸は、女性の被験者を表し、四角は男性を表す。
【0016】
図2bは、それぞれの各人から増幅されたDNAの制限プロファイル、その後のMbo IIによる消化を示す。
【0017】
図2cに示すように、野生型配列のみを有し、その後にMbo IIによる消化が行われる、健康な被験者の場合、131塩基対が増幅された(131 base pair amplified)DNAは、消化されない。症状を患っているすべての被験者は、突然変異に対するホモ接合体であるので、これらの患者から増幅されたDNAは、131塩基対のバンド(正常な対立遺伝子)、ならびに、94および37塩基対の2つのバンド(後者は、図2bには示されていない)で消化される。
【0018】
発明の詳細な説明
以下の実施例に詳細に示されるように、本発明者らは、フェロポルチン1遺伝子のヘキソン3に位置する特定のコドンの突然変異が、HFE遺伝子に依存しない、遺伝性ヘモクロマトーシスの状態に関連することを同定した。
同定された突然変異は、配列番号2(添付の配列表)の77位に相当する位置にあるアミノ酸アラニンが置換されている、突然変異フェロポルチン1の発現を引き起こす。
【0019】
驚くべきことに、本発明者らは、上記の突然変異が、HFE遺伝子に関連しない遺伝性ヘモクロマトーシスの存在の十分な徴候であること、および、そのために、その徴候が、この症状の早期診断に有用であることを見出した。その上、本発明者らは、遺伝性ヘモクロマトーシスが、フェロポルチン1の機能の低下に関連することを見出した。
【0020】
従って、第一の態様によれば、本発明は、配列番号2の77位に相当するアミノ酸をコードするコドンの突然変異を含むことを特徴とする、突然変異フェロポルチン1をコードする核酸に関する。“フェロポルチン1をコードする核酸”という語は、配列番号2のアミノ酸配列をコードするか、または、前記アミノ酸配列と、少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%相同性であるアミノ酸配列をコードする、ゲノムDNA、cDNA、例えば、PCRから得られたDNA、もしくはmRNAを意味する。核酸がDNAの場合、これは、一重または二重らせんであり得る。
【0021】
また、本発明は、前記核酸に相補的な配列を有するアミノ酸を含む。例えば、この配列は、細胞中の遺伝子またはmRNAの発現を停止させるために使用されるアンチセンス配列であり得る。
【0022】
本発明による突然変異は、77位に相当するアミノ酸の野生型フェロポルチン1(ゲンバンク(GenBank)登録番号:AF231121)の分子中の置換を引き起こす。
“野生型フェロポルチン1”という語は、特に、その機能性を変える突然変異をもたない、その正常な生理学的役割を果たすフェロポルチン1を表す。その上、アミノ酸の位置(numerical position)は、それを同定する目的のみを有し、かつ、蛋白質のアミノ酸配列の変化があることによって、例えば、考慮される種の変化により、または、突然変異の存在もしくは前記アミノ酸の上流の領域における欠落によって変わり得る。
【0023】
本発明者は、アスパラギン酸の分子による、77位のアラニンの置換により、例えば、蛋白質二次構造の予想プログラム、いわゆる、“PHDsec” (ロスト(Rost)ら、J Mol Biol 232: 584−599、1993)および“JRED”(クフ(Cuff)ら、プロテインズ(Proteins): ストラクチャー(Structure)、ファンクション・ジェネティクス(Function Genetics)アンド(and) 34: 508−519) によって示され得る、フェロポルチン1における構造的修正が起こることを見出した。特に、前記置換は、アルファ−へリックスからベータ層構造への、アミノ酸58からアミノ酸81にわたる蛋白質領域(LLLTAVYGLVVAGS VLVLGXIIGD、配列番号8)の継代(passage)を決定する。
【0024】
フェロポルチン1の二次構造の決定における、77位のアミノ酸の重要性も、異なる動物種間での、その高い保存性(conservation)によって立証される。
【0025】
帯電している、より大きな分子、例えば、アスパラギン酸による、小さな帯電していないアミノ酸であるアラニンの置換により、アルファへリックス水素結合を不安定にする、立体的静電相互作用が生じる。同様に、例えば、アルギニン、リジン、もしくはグルタミン酸のような、帯電したアミノ酸、または、より大きな立体障害を有するアミノ酸、例えば、ヒスチジンによる、アラニンの置換は、同様の分子のひずみを引き起こし得る。
【0026】
その上、配列番号8に相当するフェロポルチン1領域は、本発明による突然変異蛋白質において変えられる、蛋白質の形質導入後修正部位(post−transductional modification site)、ミリスチン化部位GAIIGDを含む。知られているように、ポリペプチドと膜リン脂質との相互作用を助ける際に、ミリスチン化は重要である。
【0027】
従って、第二の態様によれば、本発明は、配列番号2の77位に相当する位置におけるアミノ酸の置換を特徴とする、上記のアミノ酸によってコードされる、突然変異フェロポルチン1に関する。
【0028】
前記の置換は、アラニンとは異なる立体的および/または静電的性質を有するアミノ酸による、77位に相当する位置におけるアミノ酸アラニンの置換である。好ましくは、前記アミノ酸は、アルギニン、リジン、グルタミン酸、またはアスパラギン酸を含む群から選ばれ、中でも、アスパラギン酸が好ましい。
【0029】
従って、特に好ましい適用によれば、本発明の核酸に存在する突然変異は、GACおよびGAUを含む群から選ばれるコドン、好ましくはGACによる、配列番号2の77位に相当する位置におけるアミノ酸をコードするコドン、好ましくはGCCの置換にある。
【0030】
本発明の更なる態様は、配列番号2の77位に相当するアミノ酸、ならびに、このすぐ下流および/または上流のアミノ酸を含む、少なくとも6個のアミノ酸のアミノ酸配列を有するペプチドに関する。そのようなペプチドの長さおよび配列は、所望の適用により、例えば、突然変異に特異的な抗体のホスト動物における生成を刺激するために、または、突然変異エピトープと特異的に相互作用するペプチドおよび/もしくは抗体を得るために、当業者に既知の規準に基づいて選択される。
そのようなペプチドの好ましい態様は、配列番号8に相当するペプチドであり、Xaaは、アスパラギン酸であることが好ましい。
【0031】
本発明は、更に、突然変異コドン、および、前記コドンを含む前記核酸の、少なくとも9個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも15個のヌクレオチドの配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、前記核酸のヌクレオチドフラグメントに関する。
前記フラグメントおよびオリゴヌクレオチドは、RNAまたはDNAであることができ、後者の場合は、一重または二重らせんであることができる。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、一重らせんである。
【0032】
更に、本発明は、前記フラグメントまたはオリゴヌクレオチドのものと相補的な配列を有するヌクレオチドフラグメントおよびオリゴヌクレオチドを含む。本発明によれば、“ヌクレオチドフラグメント”とは、100塩基対を超える長さを有する本発明の核酸の部分的な配列に相当する配列を有する核酸を意味する。
【0033】
本発明によれば、“オリゴヌクレオチド”とは、100塩基対の最大長さの本発明の核酸のフラグメントを意味する。
本発明のヌクレオチドフラグメントおよびオリゴヌクレオチドは、例えば、PCRによる増幅による、本発明の核酸の消化によって得られ得るか、または、当分野で既知の技術を用いて合成され得る。
【0034】
本発明のオリゴヌクレオチドおよびDNAフラグメントは、例えば、キメラ蛋白質もしくは抗体の生成、診断目的のための本発明の突然変異の決定、または、治療目的のための突然変異遺伝子の不活性化のような、異なる目的のために使用される。当業者は、所望の使用に適した配列および長さを有するフラグメントおよびオリゴヌクレオチドを選択することができる。例えば、前記フラグメントまたはオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション技術による、本発明の突然変異の決定のために使用されるべきであり、それらは、突然変異コドンを含む核酸配列において、ストリンジェントな条件下で、特定の方法においてハイブリダイズし得るような長さおよび配列を有さなければならない。
【0035】
好ましい態様によれば、本発明のフラグメントおよびオリゴヌクレオチドは、例えば、放射性同位体、酵素、ビオチン−アビジン、または、特定のアッセイによってそれらを視覚化し得る他の分子によって、ラベルされる。
更に、本発明は、そのようなフラグメントおよびオリゴヌクレオチドによってコードされるペプチドに関する。
【0036】
本発明の核酸、突然変異を含むそのフラグメント、または、そのようなフラグメントを含む核酸は、例えば、例えば競争研究による、突然変異蛋白質の機能的特徴の研究のために、または、抗体の生成のために、組み換え型の突然変異フェロポルチン1、そのフラグメント、またはこのフラグメントを含むキメラ蛋白質の生成のために有利に使用され得る。この目的のために、前記核酸またはフラグメントは、トランスフェクション、形質転換、感染、または核内注入のような、当分野で周知の技術を用いて、原核生物または真核生物細胞に順番に導入される、発現ベクターに挿入される。
この目的に適したベクターには、プラスミド、ウイルス起源のベクター、および酵母または哺乳動物人工染色体が含まれる。
【0037】
従って、更なる態様において、本発明は、本発明による核酸またはDNAフラグメントを含む組み換え型ベクター、ならびに、前記ベクターを含む真核生物細胞または原核生物細胞に関する。
【0038】
本発明による核酸は、本発明の突然変異フェロポルチン1をコードする導入遺伝子を含む、真核生物細胞、組織、または非ヒト(non−human)動物の調製のために使用され得る。導入遺伝子は、細胞、組織、または動物のゲノムに永続的に挿入され得るか、または、染色体外の状態で存在し得る。
【0039】
前記細胞、組織、または非ヒト動物は、遺伝子および本発明の突然変異を含む蛋白質の機能、ならびに、遺伝性ヘモクロマトーシスの発症におけるそれらの役割を研究するためのモデルとして有用である。この研究は、遺伝性ヘモクロマトーシスの治療のための、新たな治療的アプローチの開発のために、特に重要である。
【0040】
更なる態様において、本発明は、以下の段階を含む、哺乳動物、好ましくはヒトにおける遺伝性ヘモクロマトーシスのインビトロ診断のための方法に関する:
a)前記哺乳動物から得られた生物学的試料からのゲノムDNAまたはRNAの単離;
b)前記ゲノムDNAまたはRNAにおける、本発明による突然変異の存在に関する試験、
ここで、前記突然変異の存在は、前記哺乳動物が、遺伝性ヘモクロマトーシスを患っていることの徴候である。
好ましくは、前記生物学的試料は、血漿、唾液、尿、糞便、羊膜液または組織の試料である。
試験前に、逆転写反応によって、RNAを、相補的DNA(cDNA)に形質転換することが好ましい。
【0041】
ゲノムDNAまたはcDNAは、直接、または、インビトロ増幅ポリメラーゼ・チェーン反応(PCR)(サイキ(Saiki)ら、サイエンス(Science) 239: 487−491、1988)もしくは、他の技術、例えば、リガーゼ・チェーン反応(LCR)(ウー(Wu)ら、ゲノミクス(genomics) 4: 560−569、1989)、鎖置換増幅(SDA)(ウォーカー(Walker)ら、PNAS USA 89: 392−396)、もしくは自立的(self−sustained)配列複製(3SR)(ファイ(Fahy)ら、PCR methods Appl. 1: 25−33、1992)の後に分析される。
好ましくは、ゲノムDNAまたはcDNAは、配列番号2の77位に相当するアミノ酸をコードするコドンを含む前記DNAのセグメントの増幅に適したオリゴヌクレオチド(プライマー)対を用いるPCRによって増幅される。
例えば、cDNAの増幅に使用され得るプライマー対は、配列番号3および配列番号4のヌクレオチド配列を有するものであるのに対し、ゲノムDNAの増幅に適したプライマーは、配列番号5および配列番号6のヌクレオチド配列を有するものである。
【0042】
当分野で周知の多くの技術は、ゲノムDNAまたはcDNAにおいて、本発明による突然変異の有無を決定するために使用され得る。適当な技術は、例えば、制限酵素の使用に基づく技術(カン(Kan)ら、Lancet: 910−912、1978)、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーション技術(ワランス(Wallace)ら、Nucl Acids Res 6: 3543−3557、1978)であり、中でも、例えば、フィルター(サイキ(Saiki)ら、PNAS USA 86: 6230−6234、1989)もしくはマイクロチップ(チー(Chee)ら、サイエンス(Science) 274: 610−614、1996)に固定されたオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーション、および、オリゴヌクレオチドアレイ(マスコス(Maskos)ら、Nucl Acids Res 21: 2269−2270、1993)、対立遺伝子特異的PCR(ニュートン(Newton)ら、Nucl Acid Res 17: 2503−2516、1989)、ミスマッチ修復検出(MRD)(ファハム(Faham)およびコックス(Cox) Genome Res: 474−482、1995)、一本鎖構造多形分析(ラブニク−グラバク(Ravnik−Glavac)ら、Hum. Mol. Gen. 3: 801、1994)、変性剤勾配(denaturant gradient)におけるゲル電気泳動(グルドバーグ(Guldberg)ら、Nucl. Acids Res. 22: 880、1994)、熱切断(Hot Cleavage)(コットン(Cotton)ら、Proc.Natl. Acad Ski USA 85: 4397, 1988), DNAse (ユイル(Youil)ら、PNAS USA 92: 87−91、1995)およびRNAse保護アッセイ(ウインター(Winter)ら、Proc. Natl. Acad. Ski. USA, 82: 7575、1985; メイヤーズ(Meyers)ら、サイエンス(Science) 230: 1242、1985)、対立遺伝子特異的プライマー伸張(シバネン(Syvanen)ら、ゲノミクス(genomics) 8: 684−692、1990、およびシバネン(Syvanen)ら、Hum Mutat 13: 1−10、1999)、遺伝的ビット分析(GBA)(ニキフォロフ(Nikiforov)ら、Nucl Acid Res 22: 4167−4175、1994)、プライマーライゲーションアッセイ(OLA) (ランデルゲン(Landergen)ら、サイエンス(Science) 241: 1077、1988)、対立遺伝子特異的ライゲーションチェーン反応(LCR) (バラニー(Barrany) PNAS USA 88: 189−193、1991)、ギャップ−LCR(アブラバヤ(Abravaya)ら、Nucl Acids Res 23: 675−682、1995)、ならびに配列決定技術である。本発明の突然変異の決定のために特に好ましい技術は、制限酵素の使用に基づく技術、対立遺伝子特異的PCR、ハイブリダイゼーションおよび配列決定技術である。
【0043】
従って、第一の好ましい適用によれば、分析されるDNAにおける、本発明による突然変異の存在に関する試験は、制限酵素の使用に基づく技術を用いて行われ、かつ、以下の段階を含む:
a)配列番号2の77位に相当するアミノ酸をコードするコドンを含む前記DNAのセグメントの選択的増幅に適したオリゴヌクレオチド対による、ゲノムDNAまたはcDNAの増幅、および、本発明の突然変異の存在下において、そうでなければ存在しない(otherwise not present)、制限部位に対するコンセンサス配列を生み出す、そのような突然変異の増幅されたDNAへの同時導入;
b)前記制限部位を認識し得る酵素との、増幅されたDNAのインキュベーション;ならびに、
c)消化産物の大きさの分析;ここで、消化が起こることは、ゲノムDNAまたは相補的DNAにおける本発明の突然変異の存在のサインである。
【0044】
消化産物の大きさの分析は、例えば、分子量のマーカーを用いるゲル電気泳動、その後の、例えば、臭化エチジウムを用いるDNAバンドの視覚化によって行われ得る。例えば、アスパラギン酸分子をコードするGACコドンによる、77位のアラニンをコードするGCCコドンの置換の存在を試験するために、配列番号6および配列番号7のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドが使用され得る。後述の実施例で示されるように、前記置換の存在下で、これらのオリゴヌクレオチドは、野生型DNA(図1c)から増幅されるDNAのフラグメントには存在しない、Mbo II酵素に対するコンセンサス部位、GAAGACATCATCGGT、を含む、図1dに示す配列を有する増幅されたDNAのフラグメントを生じる。Mbo IIによる増幅反応の産物のその後のインキュベーションにより、本来の配列に突然変異が存在する場合にのみ消化されるフラグメントが生じる。更に好ましい適用によれば、本発明による突然変異の決定は、本発明の核酸のフラグメントまたは本発明による突然変異に特異的なオリゴヌクレオチドが使用される、ハイブリダイゼーション技術によって行われる。
【0045】
前記フラグメントまたはオリゴヌクレオチドは、突然変異コドンを含む本発明の核酸の配列において、前記配列が、多くの他の配列と共に存在する場合にも、特定の方法においてハイブリダイズし得る。
当業者は、ハイブリダイゼーション条件、ならびに、使用される特別なハイブリダイゼーション技術に最も適したフラグメントまたはオリゴヌクレオチドの長さおよび配列、ならびに、分析されるDNA(適当なベクターにおいて増幅またはクローニングされるゲノムまたは相補的DNA)の種類を、毎回選択することができる。
【0046】
更に好ましい適用によれば、診断法は、ゲノムDNAまたは相補的DNAが、突然変異コドンを含む前記DNAのセグメントを選択的に増幅し得るが、野生型コドンを含む対応するセグメントを増幅しないオリゴヌクレオチドが使用されるPCR反応に付される、対立遺伝子特異的PCRの使用を予想する。
また、本発明は、前記方法において使用されるべき、本発明による核酸フラグメントおよびオリゴヌクレオチドにも関する。特に、それは、配列番号3、4、5、6、および7に相当するヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドに関する。
【0047】
本発明の範囲内には、各人における、本発明による突然変異の同定のための診断用キットも含まれる。特に好ましい適用によれば、前記診断用キットは、配列番号6および7に相当するヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドならびにMbo II酵素を含む。
【0048】
本発明はまた、哺乳動物における、前記哺乳動物からの生物学的試料中の、本発明による突然変異フェロポルチン1蛋白質の存在に関する試験を含む、遺伝性ヘモクロマトーシスのインビトロ診断のための方法であって、前記蛋白質の同定が、その人が遺伝性ヘモクロマトーシスを患っていることの徴候である方法に関する。
好ましくは、前記試験は、本発明による突然変異フェロポルチンの分子と野生型フェロポルチンの分子とを識別し得るモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が使用される、免疫学的アッセイによって行われる。
【0049】
従って、本発明はまた、本発明による突然変異フェロポルチン1の分子を特異的に認識し得るモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、または、突然変異を含むそのエピトープに関する。そのような抗体は、ハーロー(Harlow)およびレーン(Lane)によって、アンチボディズ(Antibodies)、ラボラトリー・マニュアル(A Laboratory Manual)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbour Laboratory) 1988に記載されているもののような、当分野で周知の方法を用いて得られる。
【0050】
その上、本発明の抗体は、蛋白質の特徴の研究において、または、治療目的のために、診断薬として特に有用である。例えば、前記抗体は、その生化学的特徴の研究または免疫親和力によるその精製のために、突然変異蛋白質の正確な組織または細胞局在化を決定するために使用され得る。
【0051】
更に、各人における、本発明の突然変異を有する遺伝子およびそれによってコードされるフェロポルチン1の存在は、遺伝性ヘモクロマトーシスの発症と相関するので、遺伝子の発現を停止するか、または、蛋白質を不活性化するための手段を有することは、非常に重要である。
【0052】
従って、本発明はまた、本発明の突然変異フェロポルチン1をコードする遺伝子の発現の阻害に適したオリゴヌクレオチド、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ならびに、本発明の突然変異フェロポルチン1の機能性を特異的に変え得る抗体およびポリペプチドに関する。
また、本発明は、薬学的に許容され得る添加剤と混合した、前記オリゴヌクレオチド、抗体、またはペプチドを含む薬学的組成物に関する。
【0053】
【実施例】
実施例1
非HFE依存性遺伝性ヘモクロマトーシスに関連する染色体および染色体の位置の同定
キアゲン・ブラッド・エクストラクション・キット(Quiagen Blood Extraction Kit)(キアゲン(Quiagen))を用いて、発端者(proband)および症状を患っている群のメンバーの末梢血から、DNA試料を抽出した。
次いで、抽出されたDNAを、ABI PRISM リンケージ・マッピング・セット(Linkage mapping set)(パーキンエルマー(Perkin Elmer)、米国)を用いることによって行われる、ゲノムの広範な研究のために使用した。製造者から提案された条件下で、蛍光性オリゴヌクレオチドを、PCR反応のために使用した。次いで、各PCR反応のアリコートを、ABI PRISM 377 DNA シーケンサーにおいて配列決定し、得られた結果を、GENESCANソフトウェアを用いて分析した。対立遺伝子の指定(assignment)は、ゲノタイパー(Genotyper)(商標)ソフトウェアを用いて行った。完全浸透度(complete penetrance)による優性常染色体疾患に基づく統計分析を行った。遺伝子疾患の頻度を、0.012で固定し、すべてのマーカー対立遺伝子を、同じ頻度とみなした。表1は、ロッドスコア(lod score)、即ち、特異的マーカーと病気との関連の最大確率、を含む。
【0054】
【表1】
【0055】
対数で表されたスコアが高いほど、病気と使用される特異的マーカーとの関連が偶然である(casual)確率が低い。例えば、1.0のロッド・スコアは、その結果が偶然である確率が10分の1であること(1 chance in 10)を意味し、2のロッド・スコアは、100分の1の確率であることを意味し、以下同様である。マーカーD2S118(5.99)およびD2S152(5.88)により、非常に高いスコアが得られるという事実は、病気に関連する遺伝子が、これらマーカーによって範囲を定められる領域に位置していることを示す。フェロポルチン1は、この染色体領域に位置する。他の染色体領域では、同様の結果は得られなかった。
【0056】
実施例2
突然変異の同定
発端者から、15人の症状を患っている群のメンバーから、および、25人の症状を患っていない群のメンバーから、血液試料を採取した。グアニジン−イソチオシアネートにおける抽出によって各試料から得られたマクロファージから、全RNAを単離し、次いで、相補的DNAを、標準プロトコルによって調製した(400 ngの全RNA、1μgのオリゴdT、1mMのdNT、20 Uの逆転写されたAMVを含む20μlの反応バッファー; プロメガ(Promega))。次いで、以下のオリゴヌクレオチド対を用いたPCR反応によって、完全なフェロポルチン1配列を、cDNAから増幅した:
フォワードプライマー 5’−GCTCAGGGCGTCCGCTAGGCT−3’
(配列番号3)
リバースプライマー 5’−GGCTTACACCCTCATGTTCT−3’
(配列番号4)
【0057】
詳細には、逆転写反応の生成物10mlを、50μl(最終容量)の1×反応バッファー(200μM dNTP、1.5mM MgCl2、0.25μgのそれぞれの上記オリゴヌクレオチド、2.6単位の酵素を含む)中で増幅した。増幅反応のために、それぞれが、以下の加熱プロファイル:
94℃、1分、
58℃、40秒、
75℃、5分
を特徴とする、30サイクルのプログラムを使用した。
次いで、増幅されたフェロポルチン1cDNAから、4つの部分的に上に重なっているDNAフラグメントを、以下のオリゴヌクレオチド対を用いて、新たなPCRによって得た:
1 °フラグメント:
フォワードプライマー:5’−GCTCAGGGCGTCCGCTAGGCT−3’
リバースプライマー:5’−CAGACACCGCAAAGTGCCACA−3’
2 °フラグメント:
フォワードプライマー:5’−ACCTCGCTGGTGGTACAG−3’
リバースプライマー:5’−CCGCAAGCAAAGAGCTTG−3’
3 °フラグメント:
フォワードプライマー:5’−GGTGCTATCTCCAGTTCCTT−3’
リバースプライマー:5’−AGACGTACTCCACGCACA−3’
4 °フラグメント:
フォワードプライマー:5’−TCAGTCTCCTTTGTGGCA−3’
リバースプライマー:5’−GGCTTACACCCTCATGTTCT−3’
【0058】
次いで、増幅から得られた4つのフラグメントを、アガロースゲル上で電気泳動によって分離し、ジェット・ソーブ・キット(Jet Sorb kit)(ジェネンコ(Genenco))を用いて精製し、そして、ローダミン・シーケンス・キット(Rhodamine Sequence kit)(パーキンエルマー(Perkin Elmer)、米国)を用いて直接配列決定した。配列決定により、症状を患っている被験者において、対照のどの被験者でも見られなかった、配列番号1の230位における、CのAによる置換の存在が明らかになった(ゲンバンク(GenBank)登録番号:AF231121を有する配列の534位におけるヌクレオチド)。この置換は、フェロポルチン1遺伝子のヘキソン3に位置しており、それにより、フェロポルチン1の77位でのアスパラギン酸によるアラニンの置換が起こった。
【0059】
実施例3
診断法
a)発端者、15人の症状を患っている群のメンバー、ならびに、100人の健康なボランティアおよび25人の症状を患っていない群のメンバーを含む125人の対照の人々のゲノムDNAを、血液DNA抽出キット(キアゲン(Quiagen))を用いて分析されるべき被験者の血液試料からの白血球から抽出した。
次いで、ヘキソン3を側面に有し(flanking)、かつ、以下の配列を有するイントロン領域と相補的なオリゴヌクレオチド対を用いたPCRによって、得られたDNAを増幅した:
フォワードプライマー:5’−CCTTTTGATAAGGAAGCAACTTCC−3’
(配列番号5)
リバースプライマー:5’−CAGAGGTAGCTCAGGCATTGGTCC−3’
(配列番号6)
【0060】
詳細には、200ngのゲノムDNAを、50μlの1×反応バッファー(200μM dNTP類、 1.5 mM MgCl2、20 pmoleの各オリゴヌクレオチド、および2.6 Uの酵素を含む)中で増幅させた。
それぞれが、以下の加熱プロファイル:
94℃、1分、
60℃、1分、
72℃、45秒
を特徴とする、30サイクルのプログラムを、増幅反応のために使用した。
【0061】
次いで、得られたDNAを、PCRウィザード・キット(Wizard kit)(プロメガ(Promega))を用いて精製し、PCR反応のために使用した、同じオリゴヌクレオチド対を用いて、自動ABI プリズム(Prism) 377シーケンサー(パーキンエルマー(Perkin Elmer)、米国)において配列決定した。
ヘキソン3におけるCによるAの置換が、症状を患っている被験者において見られたが、対照の被験者では見られなかった。
【0062】
b)発端者から、15人の症状を患っている群のメンバーから、および実施例2に記載の125人の対照被験者から、血液試料を得て、血液DNA抽出キット(バイオラド(Biorad))を用いて、ゲノムDNAを抽出した。
観察される突然変異は、制限部位の出現または消滅を何ら引き起こさないので、突然変異を含むヘキソン3の一部が、以下の配列を有するオリゴヌクレオチド対を用いたPCRによって増幅された:
フォワードプライマー: 5’−GTGGCAGGGTCTGTTCTGGTCCTGGAAG−3’
(配列番号7)
リバースプライマー:5’−CAGAGGTAGCTCAGGCATTGGTCC−3’
(配列番号6)
【0063】
図1bに示すように、フォワードプライマーは、ミスマッチのヌクレオチドを有する(Gの代わりにA、アンダーラインを付した)。前記オリゴヌクレオチドによる増幅は、突然変異の存在下で、図1dに示す配列を有する、Mbo II酵素に対するコンセンサス部位、GAAGACATCATCGGT、を含む、増幅されたフラグメントを生じる。それに対して、突然変異がない場合は、図1dに示す配列を有する、そのような制限部位(図1c)を含まないDNAフラグメントが得られる。
【0064】
従って、Mbo II酵素による増幅反応の生成物のその後のインキュベーションにより、本来の配列が突然変異を含んでいた場合にのみ、フラグメントが消化される。
詳細には、10μlの抽出されたゲノムDNAが、最終的に50μlの1×反応バッファー(200μM dNTP類、1.5 mM MgCl2、20 pmoleの各オリゴヌクレオチド、および2.6単位の酵素を含む)中で増幅される。それぞれのサイクルが、以下の加熱プロファイル:
94℃、1分、
58℃、1分、
72℃、45秒
を特徴とする、30サイクルのプログラムが、増幅反応のために使用された。
【0065】
次いで、増幅から得られた生成物10μlを、Mbo II酵素(ジェネコ(Geneco))を用いて、1×反応バッファー中で、3時間、37℃で消化した。
次いで、消化から得られたフラグメントを、12%ポリアクリルアミドゲル上で分離した。症状を患っている患者から得られた試料から、131、94、および37塩基対のバンドが得られた。それに対して、得られたすべての対照試料は、たった1つの131塩基対のバンドを有していた。図2は、発端者から、4人の症状を患っている群のメンバーから、および3人の健康な群のメンバーから得られた結果を示す。図からわかるように、131塩基対のフラグメントの、94塩基対および37塩基対の2つのフラグメントへの消化は、症状を患っている被験者でのみ観察された。
【0066】
本発明には、野生型遺伝子による突然変異遺伝子の置換を含む、何らかの治療操作も含まれる。従って、突然変異フェロポルチン1分子は、突然変異遺伝子の置換を目的とする、すべての遺伝的治療操作のための治療的ターゲットである。
【図面の簡単な説明】
【図1】実施例3に記載のMbollによる酵素消化による突然変異の同定のためのストラテジーのアウトライン。
【図2】健康な群のメンバーまたはヘモクロマトーシスを患っている群のメンバーにおける診断的分析の結果。
Claims (49)
- 配列番号2の77位に相当するアミノ酸をコードするコドンの突然変異を含むことを特徴とするフェロポルチン1をコードする核酸。
- cDNAであることを特徴とする請求項1に記載の核酸。
- mRNAであることを特徴とする請求項1に記載の核酸。
- ゲノムDNAであることを特徴とする請求項1に記載の核酸。
- 前記アミノ酸がアラニンであることを特徴とする請求項1に記載の核酸。
- 前記突然変異が、異なる立体的および/または静電的特徴を有するアミノ酸による前記アミノ酸の置換を引き起こすことを特徴とする請求項1に記載の核酸。
- 異なる立体的および/または静電的特徴を有する前記アミノ酸が、アルギニン、リジン、グルタミン酸、またはアスパラギン酸を含む群から選択されることを特徴とする請求項6に記載の核酸。
- 前記アミノ酸がアスパラギン酸であることを特徴とする請求項7に記載の核酸。
- 前記突然変異が、GACまたはGAUコドンによるGCCコドンの置換にあることを特徴とする請求項8に記載の核酸。
- 前記突然変異は、GACコドンによるGCCコドンの置換にあることを特徴とする請求項9に記載の核酸。
- 請求項1に記載の核酸の配列と相補的な配列を有する核酸。
- 請求項1に記載の核酸によってコードされる突然変異フェロポルチン1。
- 配列番号2の77位に相当するアミノ酸を含む、請求項12に記載のフェロポルチンの少なくとも6個のアミノ酸の配列を有するペプチド。
- 配列番号2の77位に相当するアミノ酸をコードするコドンを含む、請求項1に記載の核酸のフラグメント。
- ラベルされていることを特徴とする請求項14に記載のフラグメント。
- 請求項1に記載の核酸の少なくとも9個のヌクレオチドの配列を有し、かつ、配列番号2の77位に相当するアミノ酸をコードするコドンを含むオリゴヌクレオチド。
- 前記配列が、少なくとも15個のオリゴヌクレオチドのものであることを特徴とする請求項16に記載のオリゴヌクレオチド。
- ラベルされていることを特徴とする請求項16に記載のオリゴヌクレオチド。
- 請求項14に記載のフラグメントの配列と相補的な配列を有するフラグメント。
- 請求項16に記載のオリゴヌクレオチドの配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド。
- 請求項14に記載のフラグメントによって、または請求項16に記載のオリゴヌクレオチドによってコードされるペプチド。
- 請求項1に記載の核酸の、または請求項14に記載のフラグメントのヌクレオチド配列を含む組み換え型ベクター。
- 請求項22に記載の組み換え型ベクターによってトランスフェクトされたか、または形質転換された細胞。
- 請求項12に記載の蛋白質をコードする導入遺伝子を含む真核生物細胞、組織、または非ヒト動物。
- 以下の段階を含む、哺乳動物における遺伝性ヘモクロマトーシスのインビトロ診断のための方法:
a)前記哺乳動物から得られた生物学的試料からのゲノムDNAまたはRNAの単離;
b)前記ゲノムDNAまたはRNAにおける、請求項1に記載の突然変異の存在に関する試験(ここで、前記突然変異の存在は、前記哺乳動物が、遺伝性ヘモクロマトーシスを患っていることの徴候である)。 - 前記哺乳動物がヒトであることを特徴とする請求項25に記載の方法。
- 前記生物学的試料が、血液、血漿、唾液、尿、糞便、羊膜液または組織の試料であることを特徴とする請求項25に記載の方法。
- 単離されたゲノムDNAが、前記試験前に増幅されることを特徴とする請求項25に記載の方法。
- 配列番号2の77位に相当するアミノ酸をコードするコドンを含む前記DNAのセグメントの増幅に適したオリゴヌクレオチドの対を用いるPCRによって、ゲノムDNAが増幅されることを特徴とする請求項28に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号5および配列番号6のヌクレオチド配列を有することを特徴とする請求項29に記載の方法。
- RNAが、前記試験前にcDNAに形質転換されることを特徴とする請求項25に記載の方法。
- cDNAが、前記試験前に増幅されることを更に特徴とする請求項31に記載の方法。
- 配列番号2の77位に相当するアミノ酸をコードするコドンを含む前記DNAのセグメントの増幅に適したオリゴヌクレオチドの対を用いるPCRによって、cDNAが増幅されることを特徴とする請求項32に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号3および配列番号4のヌクレオチド配列を有することを特徴とする請求項33に記載の方法。
- 前記試験が、制限酵素の使用に基づく技術、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーション技術、対立遺伝子特異的PCR、ミスマッチ修復検出、一本鎖構造多形分析、変性剤勾配におけるゲル電気泳動、熱切断、DNAseおよびRNAse保護アッセイ、対立遺伝子特異的プライマー伸張、遺伝的ビット分析、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ、対立遺伝子特異的ライゲーションチェーン反応、ならびに配列決定技術を含む群から選択される技術を用いて行われることを特徴とする請求項25に記載の方法。
- 前記試験が、制限酵素の使用に基づく技術、対立遺伝子特異的PCR、ハイブリダイゼーション、または配列決定技術を用いて行われることを特徴とする請求項35に記載の方法。
- 前記試験が、以下の段階を含むことを特徴とする請求項36に記載の方法:
a)配列番号2の77位に相当するアミノ酸をコードするコドンを含む前記DNAのセグメントの選択的増幅に適したオリゴヌクレオチドの対による、ゲノムDNAまたはcDNAの増幅、および、本発明の突然変異とともに、そうでなければ存在しない、制限部位に対するコンセンサス配列を生み出す、そのような突然変異の増幅されたDNAへの同時導入;
b)前記制限部位を認識し得る酵素との、増幅されたDNAのインキュベーション;ならびに、
c)消化産物の大きさの分析(ここで、消化が起こることは、ゲノムDNAまたはcDNAにおける請求項1に記載の突然変異の存在のサインである)。 - 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号6および配列番号7のヌクレオチド配列を有し、かつ、前記酵素がMbo IIであることを特徴とする請求項37に記載の方法。
- 配列番号3、4、5、6、または7のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド。
- 配列番号6および配列番号7のヌクレオチド配列を含むヌクレオチドならびにMbo II酵素を含む、各人における、請求項1に記載の突然変異の決定のための診断用キット。
- 哺乳動物における、前記哺乳動物から得られた生物学的試料における請求項12に記載のフェロポルチン1蛋白質の存在に関する試験を含む、遺伝性ヘモクロマトーシスのインビトロ診断のための方法であって、前記蛋白質の存在が、前記哺乳動物が遺伝性ヘモクロマトーシスを患っていることの徴候である方法。
- 前記同定が、前記突然変異フェロポルチン1を特異的に認識し得る抗体を用いて行われる、請求項41に記載の方法。
- 請求項12に記載の突然変異フェロポルチン1を特異的に認識し得るモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体。
- 請求項12に記載の突然変異フェロポルチン1の特異的不活性化のための抗体。
- 請求項44に記載の抗体を含む薬学的組成物。
- 請求項12に記載の突然変異フェロポルチン1の特異的不活性化のためのポリペプチド。
- 請求項46に記載のポリペプチドを含む薬学的組成物。
- 請求項12に記載の突然変異フェロポルチン1をコードする遺伝子の発現を停止させ得るオリゴヌクレオチド。
- 請求項48に記載のオリゴヌクレオチドを含む薬学的組成物。
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