CN111304332B - 一种乳腺癌相关基因BRCA2位点g.32336265G＞T突变体的检测 - Google Patents

一种乳腺癌相关基因BRCA2位点g.32336265G＞T突变体的检测 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种乳腺癌相关基因BRCA2位点g.32336265G>T突变体、检测该突变体的特异性引物，不仅使乳腺癌的诊断更加方便易实施，便于临床医生及时精准掌握患者病情，而且可作为临床治疗效果的评价标准，并为发现有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供理论支持，同时丰富了BRCA2基因的致病突变谱，对开展遗传性乳腺癌的分子诊断与高危人群筛查具有重要意义。

Description

一种乳腺癌相关基因BRCA2位点g.32336265G＞T突变体的 检测
技术领域
本发明涉及一种医学生物技术，尤其涉及一种乳腺癌相关基因BRCA2位点g.32336265G＞T突变体的检测。
背景技术
近年来我国癌症的发病率和死亡率不断攀升，恶性肿瘤已成为我国重大的公共卫生问题。据我国肿瘤登记中心2016年发布的结果显示，2012年我国肿瘤新发病例数358.6万例，死亡例数218.7万例，粗发病率265/10万，死亡率161.5/10万。在恶性肿瘤发病现状中，乳腺癌在女性恶性肿瘤中处于第一位，每年新发约27.3万，且发病年龄不断呈现年轻化趋势，是严重威胁女性生命的第一杀手。
乳腺癌是具有很强遗传背景的恶性肿瘤，现有研究显示5-10％的乳腺癌是由遗传因素导致。目前BRCA1、BRCA2、TP53、PALB2、PTEN、CHEK2、ATM以及RAD0等基因被认定为乳腺癌易感基因，其中BRCA和BRCA2基因为遗传性乳腺癌的主要易感基因。研究表明，携带有BCA1和BRCA2基因致病突变的人群在70岁之前发生乳腺癌的概率分别可达40-80％和20-85％，同时，已被诊断为遗传性乳腺癌的患者，发生复发转移的可能性也高于普通人群。
BRCA1和BRCA2属于抑癌基因，均呈常染色体显性遗传，且突变容易引发早年发病。BRCA2基因位于人类染色体13q12，包含27个外显子，编码BRCA2蛋白含3418个氨基酸，对细胞生长的调节有重要作用。BRCA2基因发生突变后表达的蛋白质失去了修复DNA损伤的功能，导致染色体不稳定，促进肿瘤发生。男性BRCA2突变携带者终生患前列腺癌，乳腺癌，胰腺癌的概率分别为20％、6％和3％，而女性BRCA2突变携带者终生患乳腺癌为26％-84％，卵巢癌的概率为20％。BRCA2基因突变相关的肿瘤往往会表达ER(雌激素受体)与PR(孕激素受体)，与散发性乳腺癌表现出相似的特征。现已经报道的BRCA2突变主要是移码突变，也会发生大量的错义突变，但错义突变大多属于意义未明变异，因此发现BRCA2新的致病突变，对开展遗传性乳腺癌的分子诊断具有重要意义。
发明内容
发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种检测乳腺癌相关基因BRCA2位点g.32336265G>T突变体的特异性引物。
技术方案：为实现上述目的，本发明的一种乳腺癌相关基因BRCA2位点g.32336265G＞T突变体，其野生型BRCA2基因序列如SEQ ID NO:1所示，其突变型BRCA2基因序列如SEQ ID NO:2所示；突变型BRCA2基因与野生型BRCA2基因序列具有g.32336265G>T位点突变。
进一步地，用于检测乳腺癌相关基因BRCA2位点g.32336265G＞T突变体的特异性引物，其上游引物的序列如为SEQ ID NO:3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:4所示，用于检测BRCA2基因位点g.32336265G>T突变；所述BRCA2基因位点g.32336265G>T突变是指突变位点在SEQ ID NO:1序列的第181位碱基G突变为T。
进一步地，一种乳腺癌辅助诊断试剂盒，包括用于检测基因BRCA2位点g.32336265G>T突变体的特异性引物。
有益效果：本发明的一种乳腺癌相关基因BRCA2位点g.32336265G>T突变体、检测该突变体的特异性引物以及含有特异性引物的试剂盒，使乳腺癌的诊断更加方便易实施，便于临床医生及时精准掌握患者病情，而且可作为临床治疗效果的评价标准，并为发现有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供理论支持，同时丰富了BRCA2基因的致病突变谱，对开展遗传性乳腺癌的分子诊断与高危人群筛查具有重要意义。
附图说明
附图1为BRCA2位点g.32336265G>T突变体的检测凝胶电泳图；
附图2为BRCA2位点g.32336265G>T突变体的基因测序图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
如附图1和附图2所示的一种乳腺癌相关基因BRCA2位点g.32336265G＞T突变体，其野生型BRCA2基因序列如SEQ ID NO:1所示，其突变型BRCA2基因序列如SEQ ID NO:2所示；突变型BRCA2基因与野生型BRCA2基因序列具有g.32336265G>T位点突变。
用于上述BRCA2基因的突变位点的特异性引物，进行PCR扩增，检测BRCA2基因有无该突变产物片段；并且采用Sanger测序方法检测有无该位点碱基突变，其中PCR扩增引物的上游引物序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:4所示，用于检测BRCA2基因位点g.32336265G>T突变；所述BRCA2基因位点g.32336265G>T突变是指突变位点在SEQID NO:1序列的第181位碱基G突变为T。利用用于检测基因BRCA2位点g.32336265G>T突变体的特异性引物就可以制备乳腺癌辅助诊断试剂盒，用于筛查或临床治疗评估等方面。
本研究采用PCR扩增和Sanger测序技术在65例具有乳腺癌家族史的中国汉族女性乳腺癌患者中，我们发现有1例患者存在BRCA2基因组第13号染色体的32336265位置发生碱基G到T碱基的突变。该基因在NCBl参考数据库GRCh38.p13中的编号为NC_000013.11(32315480-32399672)。在1300例无肿瘤家族史，年龄匹配的正常女性对照人群中，未发现突变个体。该突变位点为本研究首次在中国汉族女性乳腺癌患者中发现，且在正常人群中不存在该突变。
本发明提供一种乳腺癌相关BRCA2基因g.32336265G>T位点突变体BRCA2-G637V。该突变发生于第13号染色体的32336265位置。该基因在NCBl参考数据库GRCh38.p13中的编号为NC_000013.11(32315480-32399672)。这里列出在该数据库中包含有该位点野生型的部分碱基序列供参考，如SEQ ID NO:1所示；BRCA2基因突变相对应的序列如SEQ ID NO:2所示；其中突变位点在SEQ ID NO:1序列的第181位由碱基G突变为T。所述BRCA2基因编码序列野生型氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，其中氨基酸改变在SEQ ID NO：6序列中第637位由甘氨酸(G)转变为为缬氨酸(V)。
SEQ ID NO:1
GCCCAGGCTAGTCTCGAACTCCTGGGCTCAAGCAGTCTTCCTGCCTCAGCCTCCCAAAAGTGCTGAGATTACAGGCATGAGCCACTGTGCCCAAACACTACCTTTTTAACTTAGTGAAAAATATTTAGTGAATGTGATTGATGGTACTTTAATTTTGTCACTTTGTGTTTTTATGTTTAGGTTTATTGCATTCTTCTGTGAAAAGAAGCTGTTCACAGAATGATTCTGAAGAACCAACTTTGTCCTTAACTAGCTCTTTTGGGACAATTCTGAGGAAATGTTCTAGAAATGAAACATGTTCTAATAATACAGTAATCTCTCAGGATCTTGA
SEQ ID NO:2
GCCCAGGCTAGTCTCGAACTCCTGGGCTCAAGCAGTCTTCCTGCCTCAGCCTCCCAAAAGTGCTGAGATTACAGGCATGAGCCACTGTGCCCAAACACTACCTTTTTAACTTAGTGAAAAATATTTAGTGAATGTGATTGATGGTACTTTAATTTTGTCACTTTGTGTTTTTATGTTTAGTTTTATTGCATTCTTCTGTGAAAAGAAGCTGTTCACAGAATGATTCTGAAGAACCAACTTTGTCCTTAACTAGCTCTTTTGGGACAATTCTGAGGAAATGTTCTAGAAATGAAACATGTTCTAATAATACAGTAATCTCTCAGGATCTTGA
SEQ ID NO:5
MPIGSKERPTFFEIFKTRCNKADLGPISLNWFEELSSEAPPYNSEPAEESEHKNNNYEPNLFKTPQRKPSYNQLASTPIIFKEQGLTLPLYQSPVKELDKFKLDLGRNVPNSRHKSLRTVKTKMDQADDVSCPLLNSCLSESPVVLQCTHVTPQRDKSVVCGSLFHTPKFVKGRQTPKHISESLGAEVDPDMSWSSSLATPPTLSSTVLIVRNEEASETVFPHDTTANVKSYFSNHDESLKKNDRFIASVTDSENTNQREAASHGFGKTSGNSFKVNSCKDHIGKSMPNVLEDEVYETVVDTSEEDSFSLCFSKCRTKNLQKVRTSKTRKKIFHEANADECEKSKNQVKEKYSFVSEVEPNDTDPLDSNVANQKPFESGSDKISKEVVPSLACEWSQLTLSGLNGAQMEKIPLLHISSCDQNISEKDLLDTENKRKKDFLTSENSLPRISSLPKSEKPLNEETVVNKRDEEQHLESHTDCILAVKQAISGTSPVASSFQGIKKSIFRIRESPKETFNASFSGHMTDPNFKKETEASESGLEIHTVCSQKEDSLCPNLIDNGSWPATTTQNSVALKNAGLISTLKKKTNKFIYAIHDETSYKGKKIPKDQKSELINCSAQFEANAFEAPLTFANADSGLLH
SEQ ID NO:6
MPIGSKERPTFFEIFKTRCNKADLGPISLNWFEELSSEAPPYNSEPAEESEHKNNNYEPNLFKTPQRKPSYNQLASTPIIFKEQGLTLPLYQSPVKELDKFKLDLGRNVPNSRHKSLRTVKTKMDQADDVSCPLLNSCLSESPVVLQCTHVTPQRDKSVVCGSLFHTPKFVKGRQTPKHISESLGAEVDPDMSWSSSLATPPTLSSTVLIVRNEEASETVFPHDTTANVKSYFSNHDESLKKNDRFIASVTDSENTNQREAASHGFGKTSGNSFKVNSCKDHIGKSMPNVLEDEVYETVVDTSEEDSFSLCFSKCRTKNLQKVRTSKTRKKIFHEANADECEKSKNQVKEKYSFVSEVEPNDTDPLDSNVANQKPFESGSDKISKEVVPSLACEWSQLTLSGLNGAQMEKIPLLHISSCDQNISEKDLLDTENKRKKDFLTSENSLPRISSLPKSEKPLNEETVVNKRDEEQHLESHTDCILAVKQAISGTSPVASSFQGIKKSIFRIRESPKETFNASFSGHMTDPNFKKETEASESGLEIHTVCSQKEDSLCPNLIDNGSWPATTTQNSVALKNAGLISTLKKKTNKFIYAIHDETSYKGKKIPKDQKSELINCSAQFEANAFEAPLTFANADSVLLH
该检测方法是利用人类BRCA2基因不同基因型的特异性序列位点的改变，设计出针对突变位点的引物序列，进行聚合酶链反应来完成的。
该突变位点为本研究首次在中国汉族女性乳腺癌患者中发现，且在正常人群中不存在该突变，数据库显示欧美人群该区域的扫描也未发现该突变位点。
DNA模板的制备
采用购置的试剂盒提取全血基因组DNA，具体步骤如下：
(1)取无菌2.0mL离心管一只，加入1mL细胞裂解液。
(2)轻轻震荡然经EDTA抗凝的全血样本，直到彻底混匀；然后吸取500μL血样加入上述含有细胞裂解液的离心管中，轻轻倾倒离心管5-6次混匀。
(3)室温孵育10分钟(期间颠倒离心管2-3次混匀)。
(4)12000rpm室温离心5分钟。
(5)用移液器缓慢的尽可能将上清液移弃干净，注意勿将两相交界处的白色物质吸出。
(6)使用涡旋振荡器(Votex)剧烈混匀，直至白细胞重悬(10-15秒)。
(7)向重悬细胞溶液中加入核裂解液300μL。用移液枪头吸放溶液5-6次裂解白细胞。此时溶液应变得很粘稠。若混合后可见细胞团块，则将溶液置于37℃孵育直至团块消散。若孵育1小时后仍可见细胞团块，则另加核裂解液100μL并重复置于37℃孵育。
(8)向核裂解物中加入蛋白沉淀液100μL，用涡旋振荡器剧烈震荡10-20秒。
(9)12000rpm室温离心5分钟。
(10)将其上清液转至对应编号的已加入300μL室温异丙醇的2.0mL离心管中。
(11)轻轻颠倒以混匀溶液，直至白色线状DNA形成沉淀。
(12)12000rpm室温离心1分钟。
(13)弃去上清液，加入与样本量等体积的室温70％乙醇，轻轻颠倒离心管数次。
(14)用移液器缓慢的尽可能将乙醇液移弃干净。将离心管置于50℃烘烤5-10分钟，尽量让残余的乙醇液挥发干净。
(15)向离心管中加入50-100μL的DNA溶解液，轻轻混匀。
(16)用1％琼脂糖凝胶电泳来评估DNA提取效果，Nanodrop核酸仪检测含量，定量到20-50ng/μL，-20℃保存。
BRCA2基因g.32336265G>T突变基因检测方案：
仪器：Veriti 96型PCR仪、BIO-RAD Gel Doc XR+型凝胶成像仪(美国伯乐公司)、凝胶电泳仪(北京六一公司)。
试剂：QIAamp DNA提取试剂盒(德国Qiagen公司)；DNA Isolation Kit提取试剂盒(北京PELFREEZ公司)；PCR缓冲液、dNTP、Taq酶(美国ABI公司)；引物由上海生工生物有限公司合成。
(1)引物设计：根据美国国家生物信息中心(NCBI)GenBank记录的BRCA2基因(序列号:NC_000013.11)，通过Oligo 6.0引物软件设计引物，最终确定1对特异性寡核苷酸引物序列，正向引物序列如表1中SEQID NO:3所示；反向引物序列如SEQID NO:4所示，扩增产物片段长度为170bp。
表1.相关突变位点寡核苷酸引物序列
Figure GDA0002759603360000051
注：*F＝正向引物序列；R＝反向引物序列
(2)反应总体积：50μL，含PCR 5×缓冲液10μL，DNA模板5.0μL，Taq聚合酶(1U/μL)1.0μL，MgCl2终浓度2.0mmol/L，dNTP终浓度200nmol/L，以及特异性上、下引物终浓度200nmol/L，并加消毒双蒸水至总体积50μL。
(3)反应条件：95℃预变性5分钟，然后依次95℃变性30秒，接着61℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环。
(4)BRCA2基因g.32336265G>T突变基因检测：用1.5％琼脂糖凝胶对将步骤(2)所得的增扩产物进行电泳，以检测其是否有目的片段。通过凝胶成像仪观察结果并拍照，PCR产物经电泳后显示为单一条带，无杂带，则提示PCR产物单一，无非特异扩增。若条带位置位于适当大小的位置，则为目的片段。如图1所示，M：DNA Marker，1：空白对照，2：野生型对照，3：BRCA2基因g.32336265G>T突变样本。
(5)扩增产物纯化：本研究采用Takara公司的Agarose Gel DNA PurificationKit试剂盒，将琼脂糖凝胶电泳后的PCR产物进行纯化回收，准备测序。
(6)Sanger测序与结果判断：纯化后PCR产物在ABI3730型全自动DNA测序仪上进行测序。将测序结果与BRCA2野生型参考序列(NCBI Reference Sequence:NC_000013.11)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。检测所得基因突变如图2所示，图中箭头所示BRCA2基因位点g.32336265G>T突变。
通过控制年龄对疾病发展的影响因素，研究突变位点在乳腺癌辅助诊断的应用前景，阐述突变位点对于乳腺癌进展的影响，揭示其诊断价值。因此，本发明获得了乳腺癌发病相关突变位点谱和特异性标志物。通过突变位点的检测，可使得乳腺癌的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。因此，本研究丰富了BRCA2基因的致病突变谱，对开展遗传性乳腺癌的分子诊断与高危人群筛查具有重要意义。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 无锡市第五人民医院
<120> 一种乳腺癌相关基因BRCA2位点g.32336265G＞T突变体及其应用
<130> 5
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 331
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
gcccaggcta gtctcgaact cctgggctca agcagtcttc ctgcctcagc ctcccaaaag 60
tgctgagatt acaggcatga gccactgtgc ccaaacacta cctttttaac ttagtgaaaa 120
atatttagtg aatgtgattg atggtacttt aattttgtca ctttgtgttt ttatgtttag 180
gtttattgca ttcttctgtg aaaagaagct gttcacagaa tgattctgaa gaaccaactt 240
tgtccttaac tagctctttt gggacaattc tgaggaaatg ttctagaaat gaaacatgtt 300
ctaataatac agtaatctct caggatcttg a 331
<210> 2
<211> 331
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
gcccaggcta gtctcgaact cctgggctca agcagtcttc ctgcctcagc ctcccaaaag 60
tgctgagatt acaggcatga gccactgtgc ccaaacacta cctttttaac ttagtgaaaa 120
atatttagtg aatgtgattg atggtacttt aattttgtca ctttgtgttt ttatgtttag 180
ttttattgca ttcttctgtg aaaagaagct gttcacagaa tgattctgaa gaaccaactt 240
tgtccttaac tagctctttt gggacaattc tgaggaaatg ttctagaaat gaaacatgtt 300
ctaataatac agtaatctct caggatcttg a 331
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
ttgtcacttt gtgtttttat gtttagt 27
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
cctgagagat tactgtatta ttagaac 27
<210> 5
<211> 640
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Met Pro Ile Gly Ser Lys Glu Arg Pro Thr Phe Phe Glu Ile Phe Lys
1 5 10 15
Thr Arg Cys Asn Lys Ala Asp Leu Gly Pro Ile Ser Leu Asn Trp Phe
20 25 30
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35 40 45
Glu Ser Glu His Lys Asn Asn Asn Tyr Glu Pro Asn Leu Phe Lys Thr
50 55 60
Pro Gln Arg Lys Pro Ser Tyr Asn Gln Leu Ala Ser Thr Pro Ile Ile
65 70 75 80
Phe Lys Glu Gln Gly Leu Thr Leu Pro Leu Tyr Gln Ser Pro Val Lys
85 90 95
Glu Leu Asp Lys Phe Lys Leu Asp Leu Gly Arg Asn Val Pro Asn Ser
100 105 110
Arg His Lys Ser Leu Arg Thr Val Lys Thr Lys Met Asp Gln Ala Asp
115 120 125
Asp Val Ser Cys Pro Leu Leu Asn Ser Cys Leu Ser Glu Ser Pro Val
130 135 140
Val Leu Gln Cys Thr His Val Thr Pro Gln Arg Asp Lys Ser Val Val
145 150 155 160
Cys Gly Ser Leu Phe His Thr Pro Lys Phe Val Lys Gly Arg Gln Thr
165 170 175
Pro Lys His Ile Ser Glu Ser Leu Gly Ala Glu Val Asp Pro Asp Met
180 185 190
Ser Trp Ser Ser Ser Leu Ala Thr Pro Pro Thr Leu Ser Ser Thr Val
195 200 205
Leu Ile Val Arg Asn Glu Glu Ala Ser Glu Thr Val Phe Pro His Asp
210 215 220
Thr Thr Ala Asn Val Lys Ser Tyr Phe Ser Asn His Asp Glu Ser Leu
225 230 235 240
Lys Lys Asn Asp Arg Phe Ile Ala Ser Val Thr Asp Ser Glu Asn Thr
245 250 255
Asn Gln Arg Glu Ala Ala Ser His Gly Phe Gly Lys Thr Ser Gly Asn
260 265 270
Ser Phe Lys Val Asn Ser Cys Lys Asp His Ile Gly Lys Ser Met Pro
275 280 285
Asn Val Leu Glu Asp Glu Val Tyr Glu Thr Val Val Asp Thr Ser Glu
290 295 300
Glu Asp Ser Phe Ser Leu Cys Phe Ser Lys Cys Arg Thr Lys Asn Leu
305 310 315 320
Gln Lys Val Arg Thr Ser Lys Thr Arg Lys Lys Ile Phe His Glu Ala
325 330 335
Asn Ala Asp Glu Cys Glu Lys Ser Lys Asn Gln Val Lys Glu Lys Tyr
340 345 350
Ser Phe Val Ser Glu Val Glu Pro Asn Asp Thr Asp Pro Leu Asp Ser
355 360 365
Asn Val Ala Asn Gln Lys Pro Phe Glu Ser Gly Ser Asp Lys Ile Ser
370 375 380
Lys Glu Val Val Pro Ser Leu Ala Cys Glu Trp Ser Gln Leu Thr Leu
385 390 395 400
Ser Gly Leu Asn Gly Ala Gln Met Glu Lys Ile Pro Leu Leu His Ile
405 410 415
Ser Ser Cys Asp Gln Asn Ile Ser Glu Lys Asp Leu Leu Asp Thr Glu
420 425 430
Asn Lys Arg Lys Lys Asp Phe Leu Thr Ser Glu Asn Ser Leu Pro Arg
435 440 445
Ile Ser Ser Leu Pro Lys Ser Glu Lys Pro Leu Asn Glu Glu Thr Val
450 455 460
Val Asn Lys Arg Asp Glu Glu Gln His Leu Glu Ser His Thr Asp Cys
465 470 475 480
Ile Leu Ala Val Lys Gln Ala Ile Ser Gly Thr Ser Pro Val Ala Ser
485 490 495
Ser Phe Gln Gly Ile Lys Lys Ser Ile Phe Arg Ile Arg Glu Ser Pro
500 505 510
Lys Glu Thr Phe Asn Ala Ser Phe Ser Gly His Met Thr Asp Pro Asn
515 520 525
Phe Lys Lys Glu Thr Glu Ala Ser Glu Ser Gly Leu Glu Ile His Thr
530 535 540
Val Cys Ser Gln Lys Glu Asp Ser Leu Cys Pro Asn Leu Ile Asp Asn
545 550 555 560
Gly Ser Trp Pro Ala Thr Thr Thr Gln Asn Ser Val Ala Leu Lys Asn
565 570 575
Ala Gly Leu Ile Ser Thr Leu Lys Lys Lys Thr Asn Lys Phe Ile Tyr
580 585 590
Ala Ile His Asp Glu Thr Ser Tyr Lys Gly Lys Lys Ile Pro Lys Asp
595 600 605
Gln Lys Ser Glu Leu Ile Asn Cys Ser Ala Gln Phe Glu Ala Asn Ala
610 615 620
Phe Glu Ala Pro Leu Thr Phe Ala Asn Ala Asp Ser Gly Leu Leu His
625 630 635 640
<210> 6
<211> 640
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Met Pro Ile Gly Ser Lys Glu Arg Pro Thr Phe Phe Glu Ile Phe Lys
1 5 10 15
Thr Arg Cys Asn Lys Ala Asp Leu Gly Pro Ile Ser Leu Asn Trp Phe
20 25 30
Glu Glu Leu Ser Ser Glu Ala Pro Pro Tyr Asn Ser Glu Pro Ala Glu
35 40 45
Glu Ser Glu His Lys Asn Asn Asn Tyr Glu Pro Asn Leu Phe Lys Thr
50 55 60
Pro Gln Arg Lys Pro Ser Tyr Asn Gln Leu Ala Ser Thr Pro Ile Ile
65 70 75 80
Phe Lys Glu Gln Gly Leu Thr Leu Pro Leu Tyr Gln Ser Pro Val Lys
85 90 95
Glu Leu Asp Lys Phe Lys Leu Asp Leu Gly Arg Asn Val Pro Asn Ser
100 105 110
Arg His Lys Ser Leu Arg Thr Val Lys Thr Lys Met Asp Gln Ala Asp
115 120 125
Asp Val Ser Cys Pro Leu Leu Asn Ser Cys Leu Ser Glu Ser Pro Val
130 135 140
Val Leu Gln Cys Thr His Val Thr Pro Gln Arg Asp Lys Ser Val Val
145 150 155 160
Cys Gly Ser Leu Phe His Thr Pro Lys Phe Val Lys Gly Arg Gln Thr
165 170 175
Pro Lys His Ile Ser Glu Ser Leu Gly Ala Glu Val Asp Pro Asp Met
180 185 190
Ser Trp Ser Ser Ser Leu Ala Thr Pro Pro Thr Leu Ser Ser Thr Val
195 200 205
Leu Ile Val Arg Asn Glu Glu Ala Ser Glu Thr Val Phe Pro His Asp
210 215 220
Thr Thr Ala Asn Val Lys Ser Tyr Phe Ser Asn His Asp Glu Ser Leu
225 230 235 240
Lys Lys Asn Asp Arg Phe Ile Ala Ser Val Thr Asp Ser Glu Asn Thr
245 250 255
Asn Gln Arg Glu Ala Ala Ser His Gly Phe Gly Lys Thr Ser Gly Asn
260 265 270
Ser Phe Lys Val Asn Ser Cys Lys Asp His Ile Gly Lys Ser Met Pro
275 280 285
Asn Val Leu Glu Asp Glu Val Tyr Glu Thr Val Val Asp Thr Ser Glu
290 295 300
Glu Asp Ser Phe Ser Leu Cys Phe Ser Lys Cys Arg Thr Lys Asn Leu
305 310 315 320
Gln Lys Val Arg Thr Ser Lys Thr Arg Lys Lys Ile Phe His Glu Ala
325 330 335
Asn Ala Asp Glu Cys Glu Lys Ser Lys Asn Gln Val Lys Glu Lys Tyr
340 345 350
Ser Phe Val Ser Glu Val Glu Pro Asn Asp Thr Asp Pro Leu Asp Ser
355 360 365
Asn Val Ala Asn Gln Lys Pro Phe Glu Ser Gly Ser Asp Lys Ile Ser
370 375 380
Lys Glu Val Val Pro Ser Leu Ala Cys Glu Trp Ser Gln Leu Thr Leu
385 390 395 400
Ser Gly Leu Asn Gly Ala Gln Met Glu Lys Ile Pro Leu Leu His Ile
405 410 415
Ser Ser Cys Asp Gln Asn Ile Ser Glu Lys Asp Leu Leu Asp Thr Glu
420 425 430
Asn Lys Arg Lys Lys Asp Phe Leu Thr Ser Glu Asn Ser Leu Pro Arg
435 440 445
Ile Ser Ser Leu Pro Lys Ser Glu Lys Pro Leu Asn Glu Glu Thr Val
450 455 460
Val Asn Lys Arg Asp Glu Glu Gln His Leu Glu Ser His Thr Asp Cys
465 470 475 480
Ile Leu Ala Val Lys Gln Ala Ile Ser Gly Thr Ser Pro Val Ala Ser
485 490 495
Ser Phe Gln Gly Ile Lys Lys Ser Ile Phe Arg Ile Arg Glu Ser Pro
500 505 510
Lys Glu Thr Phe Asn Ala Ser Phe Ser Gly His Met Thr Asp Pro Asn
515 520 525
Phe Lys Lys Glu Thr Glu Ala Ser Glu Ser Gly Leu Glu Ile His Thr
530 535 540
Val Cys Ser Gln Lys Glu Asp Ser Leu Cys Pro Asn Leu Ile Asp Asn
545 550 555 560
Gly Ser Trp Pro Ala Thr Thr Thr Gln Asn Ser Val Ala Leu Lys Asn
565 570 575
Ala Gly Leu Ile Ser Thr Leu Lys Lys Lys Thr Asn Lys Phe Ile Tyr
580 585 590
Ala Ile His Asp Glu Thr Ser Tyr Lys Gly Lys Lys Ile Pro Lys Asp
595 600 605
Gln Lys Ser Glu Leu Ile Asn Cys Ser Ala Gln Phe Glu Ala Asn Ala
610 615 620
Phe Glu Ala Pro Leu Thr Phe Ala Asn Ala Asp Ser Val Leu Leu His
625 630 635 640

Claims (1)

1.一种用于检测BRCA2位点g.32336265G＞T突变的特异性引物在制备乳腺癌辅助诊断试剂盒中的应用，其特征在于：所述特异性引物的上游引物的序列如为SEQ ID NO:3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:4所示；所述BRCA2基因位点g.32336265G>T突变是指突变位点在SEQ ID NO:1序列的第181位碱基G突变为T。
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