CN117511952A - 一种与乳腺癌相关的erbb2突变基因及其检测 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种与乳腺癌相关的ERBB2突变基因，其具有ERBB2位点g.39715536A>G突变，所述ERBB2突变基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，对应的ERBB2野生型基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，突变位点在SEQ ID NO:1序列的第322位，由碱基A突变为G。本发明还提供了检测该突变基因的特异性引物，通过该特异性引物可以检测受试者是否携带上述突变基因，从而实现乳腺癌的早期筛查和辅助诊断，为临床医生快速掌握患者病情以及临床效果评价奠定了基础，也为乳腺癌的治疗提供了新的治疗靶点。

Description

一种与乳腺癌相关的ERBB2突变基因及其检测

技术领域

本发明涉及一种与乳腺癌相关的ERBB2突变基因及其检测与应用，属于生物技术领域。

背景技术

乳腺癌属于一种全身性疾病，其病因至今尚未明确揭示，随着肿瘤分子遗传学、肿瘤细胞遗传学和分子流行病学的发展，目前认为环境因素和遗传因素共同作用影响乳腺癌的发生，在遗传性癌综合征中，癌相关基因的种系突变决定了该家族的肿瘤遗传易感性；而在散发性癌症中，主要危险因素是环境因子，与此相关基因的遗传多态性决定了个体对这些因素的易感性。

有研究表明携带乳腺癌遗传易感基因的女性，乳腺癌的发病风险将会大大提高，以BRCA1和BRCA2基因为例，携带者终生患乳腺癌的风险高达80％，因此针对这些与乳腺癌相关的易感基因的检测可提高乳腺癌的二级预防(早发现、早诊断、早治疗)。其中，乳腺癌相关基因ERBB2又称为neu或HER-2基因，是一种细胞来源癌基因，在多种肿瘤中其癌基因及其蛋白产物(p185)均有过度表达和扩增。对ERBB2癌基因蛋白产物p185的病理研究多见于乳腺癌，其作用也较为明确。目前普遍认为，ERBB2蛋白产物的阳性表达可作为判断乳腺癌预后的一个独立指标，特别是ERBB2基因突变体，在乳腺癌早期筛查中具有明显的临床指导意义。

本研究小组发现1名乳腺癌患者具有ERBB2基因g.39715536A>G突变，该变异为一个错义变异，这个变异在75例正常对照组(未患乳腺癌的正常体检人群)中未发现，说明这一变异位点具有增加乳腺癌患病风险。

目前，现有技术中尚无关于这个ERBB2突变基因的相关研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与乳腺癌相关的具有新的突变位点的ERBB2突变基因。

本发明的另一个目的在于提供检测上述ERBB2突变基因的特异性引物序列。

技术方案

一种与乳腺癌相关的ERBB2突变基因，其具有ERBB2位点g.39715536A>G突变，所述ERBB2突变基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，对应的ERBB2野生型基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，突变位点在SEQ ID NO:1序列的第322位，由碱基A突变为G。

用于检测上述ERBB2突变基因的特异性引物，包括正向引物和反向引物，正向引物的序列如SEQ ID NO:3所示，反向引物的序列如SEQ ID NO:4所示。

利用该特异性引物检测ERBB2突变基因的方法：

(1)提取待检样本中DNA；

(2)以该DNA为模板，采用特异性引物进行PCR扩增反应，得到PCR反应产物；

(3)对PCR扩增反应产物进行测序；

(4)将测序结果与与ERBB2野生型基因的序列进行比较，确定是否有ERBB2位点g.39715536A>G突变。

检测上述ERBB2突变基因的试剂在制备乳腺癌诊断试剂盒中的应用。所述试剂包含特异性引物，所述特异性引物包括正向引物和反向引物，正向引物的序列如SEQ ID NO:3所示，反向引物的序列如SEQ ID NO:4所示。

有益效果：

本发明提供了一种与乳腺癌相关的具有新的突变位点的ERBB2突变基因以及检测该突变基因的特异性引物，通过该特异性引物可以检测受试者是否携带上述突变基因，实现乳腺癌的早期筛查和辅助诊断，为临床医生快速掌握患者病情以及临床效果评价奠定了基础，也为乳腺癌的治疗提供了新的治疗靶点。

附图说明

图1为实施例2中ERBB2突变基因检测的凝胶电泳图；

图2为实施例2中ERBB2突变基因的测序图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作清楚、完整的说明。

实施例1

一种与乳腺癌相关的ERBB2突变基因，其具有ERBB2位点g.39715536A>G突变，该突变发生于第17号染色体的39715536位置。该基因在NCBl参考数据库GRCh38.p13中的编号为NC_000017.11(39688084～39728662)。这里列出在该数据库中基因序列包含有本位点野生型的部分碱基序列如SEQ ID NO:1所示，ERBB2基因突变相对应的序列如SEQ ID NO:2所示，其中突变位点在SEQ ID NO:1序列的第322位由碱基A突变为G。

SEQ ID NO:1

GGCATGGCCAGTGCTGGGAGTGATGTCCACCCTGTTCCTGGCCCTGCTGACTCCTCTCCTGACCCCTCCAGGGACCCAGCCTCCAACACTGCCCCGCTCCAGCCAGAGCAGCTCCAAGTGTTTGAGACTCTGGAAGAGATCACAGGTGGGCTCTGTCTCTGCATCCTGTTCTGCAGGGGCTGGGAGTCCTTGTCCTGTCCCCACTCCTTTAATCTCACCCTCTGCCTGCAGGTTACCTATACATCTCAGCATGGCCGGACAGCCTGCCTGACCTCAGCGTCTTCCAGAACCTGCAAGTAATCCGGGGACGAATTCTGCACAAGTGAGCACTGAGAAAGAGGGGGCCTGATGGGGAGGAGTCCCAGGGAGGAGTCCCTGTGGGAAGCTTTGGGC

SEQ ID NO:2

GGCATGGCCAGTGCTGGGAGTGATGTCCACCCTGTTCCTGGCCCTGCTGACTCCTCTCCTGACCCCTCCAGGGACCCAGCCTCCAACACTGCCCCGCTCCAGCCAGAGCAGCTCCAAGTGTTTGAGACTCTGGAAGAGATCACAGGTGGGCTCTGTCTCTGCATCCTGTTCTGCAGGGGCTGGGAGTCCTTGTCCTGTCCCCACTCCTTTAATCTCACCCTCTGCCTGCAGGTTACCTATACATCTCAGCATGGCCGGACAGCCTGCCTGACCTCAGCGTCTTCCAGAACCTGCAAGTAATCCGGGGACGAATTCTGCACAGGTGAGCACTGAGAAAGAGGGGGCCTGATGGGGAGGAGTCCCAGGGAGGAGTCCCTGTGGGAAGCTTTGGGC

一种检测ERBB2突变基因的方法：

(1)提取待检样本中DNA；

(2)针对ERBB2基因g.39715536A>G突变体区域的DNA序列设计的PCR引物进行PCR反应，得到PCR反应产物；

1)引物设计：根据美国国家生物信息中心(NCBI)GenBank记录的ERBB2基因(序列号：NC_000017.11)，通过Oligo6.0引物软件设计引物，最终确定1对特异性寡核苷酸引物序列，正向引物序列如表1中SEQ ID NO:3所示；反向引物序列如SEQ ID NO:4所示，扩增产物片段长度为193bp；

表1.相关突变位点寡核苷酸引物序列

注：SEQ ID NO:3所列碱基序列是正向引物序列；SEQ ID NO:4为反向引物序列

2)PCR扩增的反应体系：

反应体系总体积50μL；其中含PCR5×缓冲液10μL，DNA模板5.0μL，1U/μL的Taq聚合酶1.0μL，MgCl₂终浓度为2.0mmol/L，dNTP终浓度为200nmol/L，特异性正向引物和反向引物的终浓度均为200nmol/L；加消毒双蒸水至反应体系总体积50μL；

3)PCR扩增的反应程序：将上述反应体系在PCR仪中反应，反应条件：95℃预变性5min，然后94℃变性30s，接着61℃退火40s，72℃延伸1min，共35个循环；

(3)用琼脂糖凝胶将上述步骤所得的增扩产物进行电泳，以检测其是否有目的片段；

(4)对PCR扩增反应产物进行测序；

(5)将测序结果与ERBB2野生型基因的序列进行比较，确定是否有ERBB2位点g.39715536A>G突变。所述PCR反应产物的核苷酸序列组成可以将PCR反应产物通过测序仪进行测序。

实施例2

仪器：Veriti96型PCR仪、BIO-RADGelDocXR+型凝胶成像仪(美国伯乐公司)、凝胶电泳仪(北京六一公司)。

试剂：QIAampDNA提取试剂盒(德国Qiagen公司)；DNAIsolationKit提取试剂盒(北京PELFREEZ公司)；PCR缓冲液、dNTP、Taq酶(美国ABI公司)；引物由上海生工生物有限公司合成。

采用实施例1的方法进行ERBB2突变基因的检测：

(1)提取全血基因组DNA，具体步骤如下：

1)取无菌2.0mL离心管一只，加入1mL细胞裂解液。

2)轻轻震荡然经EDTA抗凝的全血样本，直到彻底混匀；然后吸取500μL血样加入上述含有细胞裂解液的离心管中，轻轻倾倒离心管5-6次混匀。

3)室温孵育10分钟(期间颠倒离心管2-3次混匀)。

4)12000rpm室温离心5分钟。

5)用移液器缓慢的尽可能将上清液移弃干净，注意勿将两相交界处的白色物质吸出。

6)使用涡旋振荡器(Votex)剧烈混匀，直至白细胞重悬(10-15秒)。

7)向重悬细胞溶液中加入核裂解液300μL。用移液枪头吸放溶液5-6次裂解白细胞。此时溶液应变得很粘稠。若混合后可见细胞团块，则将溶液置于37℃孵育直至团块消散。若孵育1小时后仍可见细胞团块，则另加核裂解液100μL并重复置于37℃孵育。

8)向核裂解物中加入蛋白沉淀液100μL，用涡旋振荡器剧烈震荡10-20秒。

9)12000rpm室温离心5分钟。

10)将其上清液转至对应编号的已加入300μL室温异丙醇的2.0mL离心管中。

11)轻轻颠倒以混匀溶液，直至白色线状DNA形成沉淀。

12)12000rpm室温离心1分钟。

13)弃去上清液，加入与样本量等体积的室温70％乙醇，轻轻颠倒离心管数次。

14)用移液器缓慢的尽可能将乙醇液移弃干净。将离心管置于50℃烘烤5-10分钟，尽量让残余的乙醇液挥发干净。

15)向离心管中加入50-100μL的DNA溶解液，轻轻混匀。

16)用1％琼脂糖凝胶电泳来评估DNA提取效果，Nanodrop核酸仪检测含量，定量到20-50ng/μL，-20℃保存。

(2)以该DNA为模板，采用特异性引物(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示)进行PCR扩增反应，得到PCR反应产物；

反应体系总体积：50μL，含PCR5×缓冲液10μL，DNA模板5.0μL，Taq聚合酶(1U/μL)1.0μL，MgCl₂终浓度2.0mmol/L，dNTP终浓度200nmol/L，以及特异性上、下引物终浓度200nmol/L，并加消毒双蒸水至总体积50μL。

反应条件：95℃预变性5分钟，然后依次95℃变性30秒，接着61℃退火40秒，72℃延伸30秒分钟，共35个循环。

(3)用1.5％琼脂糖凝胶将上述步骤所得的扩增产物进行电泳，以检测其是否有目的片段。通过凝胶成像仪观察结果并拍照，PCR产物经电泳后显示为单一条带，无杂带，则提示PCR产物单一，无非特异扩增。若条带位置位于适当大小的位置，则为目的片段。如图1所示，M：50bp梯度分子量标记物，1：空白对照，2：野生型对照，3：ERBB2基因g.39715536A>G突变样本。

(4)采用Takara公司的AgaroseGelDNAPurificationKit试剂盒将琼脂糖凝胶电泳后的PCR产物进行纯化回收，准备测序，将纯化后PCR产物在ABI3730型全自动DNA测序仪上进行测序。

(5)将测序结果与ERBB2野生型参考序列(NCBI Reference Sequence:NC_000017.11)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。检测所得基因突变图如图2所示，图中箭头所示为ERBB2基因显示g.39715536A>G突变。

实施例3

一种乳腺癌诊断试剂盒，包括检测ERBB2突变基因的试剂，所述试剂包含特异性引物，所述特异性引物包括正向引物和反向引物，正向引物的序列如SEQ ID NO:3所示，反向引物的序列如SEQ ID NO:4所示。

该试剂盒还可以包括PCR反应常用的试剂，如Taq酶、dNTP混合液、MgCl₂溶液等等，还可以含有标准品和/或对照品(如确定基因型的标准品和空白对照等)。

采用该试剂盒用于乳腺癌的诊断时，只需要外周血样本即可，通过特异性引物对来检测突变位点，再通过突变位点谱辅助判断乳腺癌，不仅稳定，检测方便，且精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性。

Claims (4)

1.一种与乳腺癌相关的ERBB2突变基因，其特征在于，其具有ERBB2位点g.39715536A>G突变，所述ERBB2突变基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，对应的ERBB2野生型基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，突变位点在SEQ ID NO:1序列的第322位，由碱基A突变为G。

2.用于检测权利要求1所述ERBB2突变基因的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物包括正向引物和反向引物，正向引物的序列如SEQ ID NO:3所示，反向引物的序列如SEQID NO:4所示。

3.检测权利要求1所述ERBB2突变基因的试剂在制备乳腺癌诊断试剂盒中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂包含特异性引物，所述特异性引物包括正向引物和反向引物，正向引物的序列如SEQ ID NO:3所示，反向引物的序列如SEQ IDNO:4所示。