CN116656828A - 基因ERBB2位点g.39711928A>G突变在制备乳腺癌早期筛查试剂盒中应用 - Google Patents
基因ERBB2位点g.39711928A>G突变在制备乳腺癌早期筛查试剂盒中应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了基因ERBB2位点g.39711928A>G突变在制备乳腺癌早期筛查试剂盒中应用以及检测基因ERBB2位点g.39711928A>G突变体的引物、试剂盒，该ERBB2基因突变与ERBB2正常野生型基因序列相比具有g.39711928A>G位点突变。本发明提供了乳腺癌致病的新的突变位点，可用于早期乳腺癌筛查。通过突变位点序列的改变进行相关诊断试剂盒的研制和应用，可使得乳腺癌的诊断更加方便易行。
Description
技术领域
本发明涉及于分子生物学技术领域，更具体的说是涉及基因ERBB2位点g.39711928A>G突变在制备乳腺癌早期筛查试剂盒中应用。
背景技术
乳腺癌已被认知属于一种全身性疾病，乳腺癌的病因至今尚未明确揭示，随着肿瘤分子遗传学、肿瘤细胞遗传学和分子流行病学的发展，目前认为环境因素和遗传因素共同作用影响乳腺癌的发生，在遗传性癌综合征中，癌相关基因的种系突变决定了该家族的肿瘤遗传易感性；而在散发性癌症中，主要危险因素是环境因子，与此相关基因的遗传多态性决定了个体对这些因素的易感性。
有研究表明携带乳腺癌遗传易感基因的女性，乳腺癌的发病风险将会大大提高，以BRCA1和BRCA2基因为例，携带者终生患乳腺癌的风险高达80％，因此针对这些与乳腺癌相关的易感基因的检测可提高乳腺癌的二级预防(早发现、早诊断、早治疗)。其中，乳腺癌相关基因ERBB2又称为neu或HER-2基因，是一种细胞来原癌基因，在多种肿瘤中其癌基因及其蛋白产物(p185)均有过度表达和扩增。对ERBB2癌基因蛋白产物p185的病理研究首先多见于乳腺癌，其作用也较为明确。目前普遍认为，ERBB2蛋白产物的阳性表达可作为判断乳腺癌预后的一个独立指标，特别是ERBB2基因突变体在乳腺癌早期筛查中具有明显的临床指导意义。
研究发现有乳腺癌患者具有ERBB2基因g.39711928A>G突变。该变异为一个错义变异。这个变异在300例正常对照组中未发现，说明这一变异位点具有增加乳腺癌患病风险。该变异在乳腺癌患者中发生频率显著高于正常对照，说明该突变位点与乳腺癌密切相关。我们针对新发现的ERBB2基因g.39711928A>G位点突变建立了相应的检测方法。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了基因ERBB2位点g.39711928A>G突变在制备乳腺癌早期筛查试剂盒中应用，本发明提供了乳腺癌致病的新的突变位点，可对乳腺癌筛查辅助应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
基因ERBB2位点g.39711928A>G突变在制备乳腺癌早期筛查试剂盒中应用，其中，ERBB2基因DNA序列如SEQ ID NO:1所示；突变型ERBB2基因DNA序列如SEQ ID NO:2所示
一种检测基因ERBB2位点g.39711928A>G突变体的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4所示；
上游引物:5，-GTGGCTACATGTTCCTGATCTCCTTAGG-3，，如SEQ ID NO:3所示；
下游引物:5，-AGGGGTAGAGAGTAGAAGGCAGAGACTA-3，，如SEQ ID NO:4所示。
一种检测基因ERBB2位点g.39711928A>G突变体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括上述引物。
一种基因ERBB2位点g.39711928A>G突变体的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待检样本中DNA；
(2)以该DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增反应，获得PCR扩增产物；
(3)检测ERBB2基因是否存在g.39711928A>G突变基因；
作为本发明优选的技术方案，所述步骤(3)中检测ERBB2位点g.39711928A>G突变体的具体方法如下所示：
(1)利用琼脂糖凝胶将所述PCR扩增产物进行电泳；
(2)将电泳后的扩增产物进行纯化回收，以便于测序；
(3)纯化后的扩增产物在DNA测序仪上进行测序，将测序结果与野生型ERBB2参考序列进行比对，确定是否有ERBB2位点g.39711928A>G突变体。
作为本发明优选的技术方案，所述突变型ERBB2基因序列与野生型ERBB2基因序列具有g.39711928G>A位点突变。
作为本发明优选的技术方案，所述ERBB2基因g.39711928A>G位点突变是指突变位点在SEQ ID NO:1序列的第229位碱基A突变为G。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了基因ERBB2位点g.39711928A>G突变体在乳腺癌早期筛查及诊断试剂盒中的应用，该突变位点在乳腺癌筛查和基因诊断中具有潜在的应用前景。通过突变位点序列的改变进行相关诊断试剂盒的研制和应用，可使得乳腺癌的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为ERBB2基因g.39711928A>G突变检测的凝胶电泳图；
图2附图为ERBB2基因g.39711928A>G突变测序图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中采用的仪器以及试剂
仪器：Veriti96型PCR仪、BIO-RAD Gel Doc XR+型凝胶成像仪(美国伯乐公司)、凝胶电泳仪(北京六一公司)。
试剂：QIAamp DNA提取试剂盒(德国Qiagen公司)；DNA Isolation Kit提取试剂盒(北京PELFREEZ公司)；PCR缓冲液、dNTP、Taq酶(美国ABI公司)；引物由上海生工生物有限公司合成。
实施例1：特异性引物的设计
根据美国国家生物信息中心(NCBI)GenBank记录的ERBB2基因(序列号：NC_000017.11)，通过Oligo6.0引物软件设计引物，最终确定1对特异性寡核苷酸引物序列，上游引物序列如表1中SEQ ID NO:3所示；下游引物序列如SEQ ID NO:4所示，扩增产物片段长度为280bp；
表1.相关突变位点寡核苷酸引物序列
注：SEQ ID NO:3所列碱基序列是正向引物序列；SEQ ID NO:4为反向引物序列。
实施例2：样本DNA的提取
采用购置的试剂盒提取全血基因组DNA，具体步骤如下：
(1)取无菌2.0mL离心管一只，加入1mL细胞裂解液。
(2)轻轻震荡然经EDTA抗凝的全血样本，直到彻底混匀；然后吸取500μL血样加入上述含有细胞裂解液的离心管中，轻轻倾倒离心管5～6次混匀。
(3)室温孵育10分钟(期间颠倒离心管2～3次混匀)。
(4)12000rpm室温离心5分钟。
(5)用移液器缓慢的尽可能将上清液移弃干净，注意勿将两相交界处的白色物质吸出。
(6)使用涡旋振荡器(Votex)剧烈混匀，直至白细胞重悬(10～15秒)。
(7)向重悬细胞溶液中加入核裂解液300μL。用移液枪头吸放溶液5～6次裂解白细胞。此时溶液应变得很粘稠。若混合后可见细胞团块，则将溶液置于37℃孵育直至团块消散。若孵育1小时后仍可见细胞团块，则另加核裂解液100μL并重复置于37℃孵育。
(8)向核裂解物中加入蛋白沉淀液100μL，用涡旋振荡器剧烈震荡10～20秒。
(9)12000rpm室温离心5分钟。
(10)将其上清液转至对应编号的已加入300μL室温异丙醇的2.0mL离心管中。
(11)轻轻颠倒以混匀溶液，直至白色线状DNA形成沉淀。
(12)12000rpm室温离心1分钟。
(13)弃去上清液，加入与样本量等体积的室温70％乙醇，轻轻颠倒离心管数次。
(14)用移液器缓慢的尽可能将乙醇液移弃干净。将离心管置于50℃烘烤5～10分钟，尽量让残余的乙醇液挥发干净。
(15)向离心管中加入50～100μL的DNA溶解液，轻轻混匀。
(16)用1％琼脂糖凝胶电泳来评估DNA提取效果，Nanodrop核酸仪检测含量，定量到20～50ng/μL，-20℃保存。
实施例3：基因ERBB2位点g.39711928A>G突变体的检测
(1)PCR扩增：利用实施例1中设计的PCR扩增引物扩增实施例2中提取的DNA样品，得到PCR反应产物；
扩增反应体系总体积为50μL；其中含PCR 5×缓冲液10μL，DNA模板5.0μL，1U/μL的Taq聚合酶1.0μL，MgCl2终浓度为2.0mmol/L，dNTP终浓度为200nmol/L，特异性正向引物和反向引物的终浓度均为200nmol/L；加消毒双蒸水至反应体系总体积50μL。
扩增反应条件为95℃预变性5min，然后依次94℃变性30s，接着61℃退火40s，72℃延伸1min，共35个循环。
(2)凝胶电泳检测：用琼脂糖凝胶对将步骤(1)所得的增扩产物进行电泳，以检测其是否有目的片段。通过凝胶成像仪观察结果并拍照，PCR产物经电泳后显示为单一条带，无杂带，则提示PCR产物单一，无非特异扩增。若条带位置位于适当大小的位置，则为目的片段。如图1所示，M：50bp梯度分子量标记物，1：空白对照，2：野生型对照，3：ERBB2基因g.39711928A>G突变样本。
(3)PCR产物纯化：本研究采用Takara公司的Agarose Gel DNA Purification Kit试剂盒将琼脂糖凝胶电泳后的PCR产物进行纯化回收，准备测序。
(4)Sanger测序与结果判断：纯化后PCR产物在ABI3730型全自动DNA测序仪上进行测序。将核苷酸序列与ERBB2野生型参考序列(NCBI Reference Sequence:NC_000017.11)进行比对，确定是否有ERBB2位点g.39711928A>G突变。所述PCR反应产物的核苷酸序列组成可以将PCR反应产物通过测序仪进行测序。检测所得基因突变图如图2所示，图中箭头所示为ERBB2基因显示g.39711928A>G突变。
由此可知，采用本发明的引物能扩增出基因ERBB2位点g.39711928A>G突变体，该突变发生于第17号染色体的39711928位置。该基因在NCBI参考数据库GRCh38.p13中的编号为NC_000017.11(39688084～39728662)。并列出在该数据库中基因序列包含有本位点野生型的部分碱基序列如SEQ ID NO:1所示，ERBB2基因突变相对应的序列如SEQ ID NO:2所示，其中，突变位点在SEQ ID NO:1序列的第229位由碱基A突变为G；并且，ERBB2基因编码序列野生型氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，其突变的氨基酸位点在SEQ ID NO:6序列中第332位由酪氨酸(Y)转变为半胱氨酸(C)。
SEQ ID NO:1
TAATTTACAGAACTCTCTGCTTTGGTCTCCCTTTTTGCAAAATGGGAATCTCACAGTGCTGATCCCGTCTGGTTGTTGTGAGGGGTAAATGGATGTCAGGTGCTGATGCGTGGTAGGGCATTTAAGTATTGGTTGATATTATTCTTCTTGTGCCTGGGCACGGTAATGCTGCTCATGGTGGTGCACGAAGGGCCAGGGTATGTGGCTACATGTTCCTGATCTCCTTAGACAACTACCTTTCTACGGACGTGGGATCCTGCACCCTCGTCTGCCCCCTGCACAACCAAGAGGTGACAGCAGAGGATGGAACACAGCGGTGTGAGAAGTGCAGCAAGCCCTGTGCCCGAGGTACCCACTCACTGCCCCCGAGGCCAGCTGCAGTTCCTGTCCCTCTGCG
SEQ ID NO:2
TAATTTACAGAACTCTCTGCTTTGGTCTCCCTTTTTGCAAAATGGGAATCTCACAGTGCTGATCCCGTCTGGTTGTTGTGAGGGGTAAATGGATGTCAGGTGCTGATGCGTGGTAGGGCATTTAAGTATTGGTTGATATTATTCTTCTTGTGCCTGGGCACGGTAATGCTGCTCATGGTGGTGCACGAAGGGCCAGGGTATGTGGCTACATGTTCCTGATCTCCTTAGGCAACTACCTTTCTACGGACGTGGGATCCTGCACCCTCGTCTGCCCCCTGCACAACCAAGAGGTGACAGCAGAGGATGGAACACAGCGGTGTGAGAAGTGCAGCAAGCCCTGTGCCCGAGGTACCCACTCACTGCCCCCGAGGCCAGCTGCAGTTCCTGTCCCTCTGCG
SEQ ID NO:5
MPRGSWKPQVCTGTDMKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQVVQGNLELTYLPTNASLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGASPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRSRACHPCSPMCKGSRCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCARCKGPLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLVCASALCPMCSTPQDARGGHPAWYCPIAPGTPGQNSTVKASHLSPQACLHFNHSGICELHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCVTACPYNYLSTDVGSCTLVCPLHNQEVTAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVRAVTSANIQEFAGCK
SEQ ID NO:6
MPRGSWKPQVCTGTDMKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQVVQGNLELTYLPTNASLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGASPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRSRACHPCSPMCKGSRCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCARCKGPLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLVCASALCPMCSTPQDARGGHPAWYCPIAPGTPGQNSTVKASHLSPQACLHFNHSGICELHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCVTACPCNYLSTDVGSCTLVCPLHNQEVTAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVRAVTSANIQEFAGCK
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (5)
1.基因ERBB2位点g.39711928A>G突变在制备乳腺癌早期筛查试剂盒中应用，其中，ERBB2基因DNA序列如SEQ ID NO:1所示；突变型ERBB2基因DNA序列如SEQ ID NO:2所示。
2.一种检测基因ERBB2位点g.39711928A>G突变体的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4所示；
上游引物:5，-GTGGCTACATGTTCCTGATCTCCTTAGG-3，，如SEQ ID NO:3所示；
下游引物:5，-AGGGGTAGAGAGTAGAAGGCAGAGACTA-3，，如SEQ ID NO:4所示。
3.一种检测基因ERBB2位点g.39711928A>G突变体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物。
4.一种基因ERBB2位点g.39711928A>G突变体的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待检样本中DNA；
(2)以该DNA为模板，利用权利要求2所述的引物进行PCR扩增反应，获得PCR扩增产物；
(3)检测ERBB2基因是否存在g.39711928A>G突变基因。
5.根据权利要求4所述的一种基因ERBB2位点g.39711928A>G突变体的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中检测ERBB2位点g.39711928A>G突变体的具体方法如下所示：
(1)利用琼脂糖凝胶将所述PCR扩增产物进行电泳；
(2)将电泳后的扩增产物进行纯化回收，以便于测序；
(3)纯化后的扩增产物在DNA测序仪上进行测序，将测序结果与野生型ERBB2参考序列进行比对，确定是否有ERBB2位点g.39711928A>G突变体。
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