CN111057763B - 一种检测人类乳腺癌易感基因分型的试剂盒及其使用方法与应用 - Google Patents
一种检测人类乳腺癌易感基因分型的试剂盒及其使用方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测人类乳腺癌易感基因分型的试剂盒及其使用方法与应用，所述试剂盒包括引物组，所述引物组分别针对人类乳腺癌易感基因的6个检测位点rs2241766、rs2273535、rs4680、rs4880、rs28897756和rs55770810设计的引物，具体包含对应的上游引物FAM、上游引物HEX和下游引物共3条引物；该试剂盒的使用方法为采用KASP技术针对人类乳腺癌易感基因的6个检测位点进行基因分型检测；该试剂盒及其使用方法具有检测灵敏度高、准确性高、所需的DNA样本要求量低、操作方便且成本低等优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术及医学领域，具体涉及一种检测人类乳腺癌易感基因分型的试剂盒及其使用方法与应用。
背景技术
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，根据其发病特性可以分为散发性乳腺癌和家族性乳腺癌。家族性乳腺癌患者是指一个家族中有两个或以上具有血缘关系的成员患有乳腺癌，其约占乳腺癌总体的20％，家族史是乳腺癌重要的危险因素之一，其可能是遗传基因和环境因素共同作用的结果。1990年，研究者发现了一种位于人体细胞核第17号染色体上的与遗传性乳腺癌相关的基因，并将其命名为乳腺癌1号易感基因，简称BRCA1。BRCA2位于染色体13q12.3区域，长84kb，含27个外显子，其编码的蛋白质也属于BASC复合体，负责启动双链DNA断裂修复。BRCA1/2是两种重要的抑癌基因，其在DNA的同源性重组修复机制中扮演了重要的角色。BRCA1/2基因突变约占家族性乳腺癌的15％～20％。目前，已报道的BRCA基因的突变类型包括无义突变、移码突变、同义突变、剪接位点突变及大片段缺失或重排等等。BRCA1/2基因有近4000个突变位点，这些突变点分散于各个外显子，目前还没有证据表明存在突变热点区域，只有少数几个突变频率较高的位点。
多数遗传性乳腺癌卵巢癌综合征(90％以上)是由BRCA1和BRCA2的胚系突变所引起的，BRCA基因的突变在乳腺癌、卵巢癌等疾病的遗传性中扮演着重要的角色。所以乳腺癌相关易感基因的突变检测对乳腺癌高危人群有非常大的意义，其可以评估乳腺癌等肿瘤的患病风险、指导乳腺癌患者的靶向用药和评估单侧乳腺癌患者的对侧乳腺癌风险等。
目前检测乳腺癌风险易感基因的方法有酶切、测序、荧光定量PCR技术等，然而，上述方法对DNA样本要求总量较高，实验操作费事、费力且成本高。因此，有必要发明一种对DNA要求量低、操作简单、低成本的人类乳腺癌风险易感基因分型的方法。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种检测人类乳腺癌易感基因分型的试剂盒，能够用于人类乳腺癌易感基因分型检测。
本发明还提出试剂盒的使用方法。
本发明还提出一种非疾病治疗和诊断目的检测人类乳腺癌易感基因分型的方法。
根据本发明的第一方面实施例的一种检测人类乳腺癌易感基因分型的试剂盒，所述试剂盒包括引物组，所述引物组包括分别针对人类乳腺癌易感基因的6个检测位点rs2241766、rs2273535、rs4680、rs4880、rs28897756和rs55770810设计的引物，针对每个检测位点的引物包含对应的第一上游引物、第二上游引物和下游引物。
根据本发明的第一方面实施例的试剂盒，至少具有如下有益效果：该试剂盒具有操作简单、成本低，且检测所需的样本DNA需求量低、准确度和灵敏度高等优点。
根据本发明的一些实施例，所述引物组分别包括如下引物：
(1)针对rs2241766位点的引物序列如下：
第一上游引物Rs2241766FF(SEQ ID No.1)：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGTCGTGGTTTCCTGGTCATGC；
第二上游引物Rs2241766FH(SEQ ID No.2)：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGTCGTGGTTTCCTGGTCATGA；
下游引物Rs2241766R(SEQ ID No.3)：GCTGGGAGCTGTTCTACTGCTATTA；
(2)针对rs2273535位点的引物序列如下：
第一上游引物Rs2273535FF(SEQ ID No.4)：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAGGTAATGGATTCTGACAAGGAAA；
第二上游引物Rs2273535FH(SEQ ID No.5)：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGGTAATGGATTCTGACAAGGAAT；
下游引物Rs2273535R(SEQ ID No.6)：CATTCTAGGCTACAGCTCCAGTTG；
(3)针对rs4680位点的引物序列如下：
第一上游引物Rs4680FF(SEQ ID No.7)：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGCATGCACACCTTGTCCTTCAT；
第二上游引物Rs4680FH(SEQ ID No.8)：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCATGCACACCTTGTCCTTCAC；
下游引物Rs4680R(SEQ ID No.9)：CATCACCCAGCGGATGGTGGAT；
(4)针对rs4880位点的引物序列如下：
第一上游引物Rs4880FF(SEQ ID No.10)：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGAGCCCAGATACCCCAAAG；
第二上游引物Rs4880FH(SEQ ID No.11)：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTGGAGCCCAGATACCCCAAAA；
下游引物Rs4880R(SEQ ID No.12)：CCGGGCTGTGCTTTCTCGTCTT；
(5)针对rs28897756位点的引物序列如下：
第一上游引物Rs28897756FF(SEQ ID No.13)：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAAACTGAAAAATTACAATGAAAGGTTTGTACT；
第二上游引物Rs28897756FH(SEQ ID No.14)：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACTGAAAAATTACAATGAAAGGTTTGTACC；
下游引物Rs28897756R(SEQ ID No.15)：AGCTAACATACAGTTAGCAGCGACAAAA；
(6)针对rs55770810位点的引物序列如下：
第一上游引物Rs55770810FF(SEQ ID No.16)：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCAGATGCTGAGTTTGTGTGTGAAC；
第二上游引物Rs55770810FH(SEQ ID No.17)：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCAGATGCTGAGTTTGTGTGTGAAT；
下游引物Rs55770810R(SEQ ID No.18)：TACCCATTTTCCTCCCGCAATTCCTA。
根据本发明的第二方面实施例的使用方法，包括利用上述试剂盒结合KASP技术针对人类乳腺癌易感基因的6个检测位点rs2241766、rs2273535、rs4680、rs4880、rs28897756和rs55770810进行基因分型检测。
根据本发明的第二方面实施例的使用方法，至少具有如下有益效果：竞争性等位基因特异性PCR(KASP，Kompetitive Allele-Specific PCR)技术相对于荧光定量PCR技术等方法进行基因分型检测具有特异性强、灵活度高、操作简单以及成本低等优点。
根据本发明的一些实施例，所述使用方法包括以下步骤：
S1、使用所述引物组配制引物组工作液；
S2、建立对应检测位点的PCR反应体系，所述反应体系包括人源基因组DNA、KASP预混液和步骤S1中所述的引物组工作液；
S3、设置空白对照；
S4、进行PCR扩增反应；
S5、扫描荧光数据，根据表1判读荧光信号，得到乳腺癌易感基因的分型结果。
表1.各位点荧光信号对应基因型
作为优选的，所述步骤S1中引物组工作液的配制方法为引物浓度均为100μM的溶液，按照第一上游引物12μl、第二上游引物12μl、下游引物30μl和Tris-HCl 46μl配制成100μl的引物组工作液。
作为优选的，所述步骤S2中PCR反应体系包括人源基因组DNA 2.5μl，浓度范围为(5～100)ng/μl；KASP Master Mix 2.5μl；引物组工作液0.07μl。
作为优选的，所述步骤S2中人源基因组DNA的样本提取方法包括口腔拭子提取或全血提取的至少一种。
作为优选的，所述步骤S3中空白对照为使用等体积的去离子水代替人源基因组DNA加入到所述步骤S2的PCR反应体系中。
作为优选的，述步骤S4中PCR扩增程序如下：
预变性：30℃，1分钟；94℃，15分钟；
变性：94℃，20秒变性；(65～59)℃梯度退火1分钟；共10个循环，退火温度每个循环降0.6℃；
扩增：94℃，20秒变性；57℃退火1分钟，共30个循环；
荧光扫描：30℃，1分钟。
根据本发明的第三方面实施例的一种非疾病治疗和诊断目的检测人类乳腺癌易感基因分型的方法，使用上述的试剂盒通过KASP技术进行基因分型。
根据本发明的第三方面实施例的方法，至少具有如下有益效果：该基因分型的方法具有操作简单、低成本等优点，能够准确且灵敏地检测低浓度样本DNA的人类乳腺癌易感基因分型情况。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明实施例1的检测方法得到的乳腺癌风险易感基因位点基因分型结果。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
实施例1：
1、引物设计
S1：根据人类乳腺癌风险易感基因如下位点，rs2241766、rs2273535、rs4680、rs4880、rs28897756和rs55770810在NCBI dbSNP数据库提取参考序列，设计引物：
第一组引物(针对rs2241766位点的引物组)序列如下：
Rs2241766FF(SEQ ID No.1)：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGTCGTGGTTTCCTGGTCATGC；
Rs2241766FH(SEQ ID No.2)：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGTCGTGGTTTCCTGGTCATGA；
Rs2241766R(SEQ ID No.3)：GCTGGGAGCTGTTCTACTGCTATTA；
第二组引物(针对rs2273535位点的引物组)序列如下：
Rs2273535FF(SEQ ID No.4)：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAGGTAATGGATTCTGACAAGGAAA；
Rs2273535FH(SEQ ID No.5)：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGGTAATGGATTCTGACAAGGAAT；
Rs2273535R(SEQ ID No.6)：CATTCTAGGCTACAGCTCCAGTTG；
第三组引物(针对rs4680位点的引物组)序列如下：
Rs4680FF(SEQ ID No.7)：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGCATGCACACCTTGTCCTTCAT；
Rs4680FH(SEQ ID No.8)：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCATGCACACCTTGTCCTTCAC；
Rs4680R(SEQ ID No.9)：CATCACCCAGCGGATGGTGGAT；
第四组引物(针对rs4880位点的引物组)序列如下：
Rs4880FF(SEQ ID No.10)：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGAGCCCAGATACCCCAAAG；
Rs4880FH(SEQ ID No.11)：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTGGAGCCCAGATACCCCAAAA；
Rs4880R(SEQ ID No.12)：CCGGGCTGTGCTTTCTCGTCTT；
第五组引物(针对rs28897756位点的引物组)序列如下：
Rs28897756FF(SEQ ID No.13)：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAAACTGAAAAATTACAATGAAAGGTTTGTACT；
Rs28897756FH(SEQ ID No.14)：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACTGAAAAATTACAATGAAAGGTTTGTACC；
Rs28897756R(SEQ ID No.15)：AGCTAACATACAGTTAGCAGCGACAAAA；
第六组引物(针对rs55770810位点的引物组)序列如下：
Rs55770810FF(SEQ ID No.16)：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCAGATGCTGAGTTTGTGTGTGAAC；
Rs55770810FH(SEQ ID No.17)：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCAGATGCTGAGTTTGTGTGTGAAT；
Rs55770810R(SEQ ID No.18)：TACCCATTTTCCTCCCGCAATTCCTA。
2、引物组工作液MIX配置
1)将原始引物(冻干粉)包括上游引物FAM、上游引物HEX和下游引物均稀释成100μM，具体操作如下：
a.引物开盖前先离心：4000rpm，30～60s；
b.缓慢打开管盖，加入缓冲液(Tris-HCl，pH＝8.0)将引物稀释至100μM；
c.关闭管盖后充分震荡混匀。
2)按照比例(上游引物FAM+上游引物HEX+下游引物+Tris-HCl＝12μl+12μl+30μl+46μl＝100μl)配置引物组工作液MIX。
3、PCR反应体系
按照下表2中的成分设置每组引物反应PCR反应体系：
表2.PCR反应体系
4、空白对照设置
将样本DNA用去离子水替代设置空白对照反应体系如下表3所示：
表3.空白对照PCR反应体系
| 去离子水 | 2.5μl |
| KASP Master Mix | 2.5μl |
| 引物组工作液MIX | 0.07μl |
5、PCR扩增
PCR扩增程序如下：
预变性：30℃，1分钟；94℃，15分钟；
变性：94℃，20秒变性；65℃～59℃梯度退火1分钟；共10个循环，退火温度每个循环降0.6℃；
扩增：94℃，20秒变性；57℃退火1分钟，共30个循环；
荧光扫描：30℃，1分钟，此步骤进行荧光扫描。
参照《ABI StepOne型荧光定量PCR仪标准操作规程》进行数据扫描分析，上述实验得到的乳腺癌风险易感基因位点基因分型荧光检测结果如图1所示，从图中可以看出，分型结果明显分为三簇，分别是FAM/FAM荧光信号；FAM/HEX荧光信号和HEX/HEX荧光信号，通过荧光检测结果能够准确地获得检测基因的基因型。
通过对样本YG09000968、YG09000931、01017399、01013919和YG09000981均采用上述步骤进行检测，所得到的检测结果如下表4所示：
表4.荧光定量PCR检测基因分型检测结果
| Rs2241766 | Rs2273535 | Rs4680 | Rs4880 | Rs28897756 | Rs55770810 | |
| YG09000968 | GT | TT | AA | AA | GG | GG |
| YG09000931 | GG | TT | GG | AA | GG | GG |
| 01017399 | TT | AT | AG | AG | GG | GG |
| 01013919 | TT | AA | AG | GG | GG | GG |
| YG09000981 | GT | AT | GG | AA | GG | GG |
各样本检测结果与一代测序(金标准)结果完全一致，而且检测成本仅为一代测序或者荧光定量PCR方法的1/10。
实施例2：
取YG09000968样本DNA，依次稀释到10ng/μl、5ng/μl、1ng/μl和0.5ng/μl，按照实施例1方法进行检测，结果如下表5所示：
表5.不同浓度DNA样本的基因分型检测结果
| 位点 | 10ng/μl | 5ng/μl | 1ng/μl | 0.5ng/μl |
| rs2241766 | GT | GT | GT | - |
| rs2273535 | TT | TT | TT | - |
| rs4680 | AA | AA | AA | - |
| rs4880 | AA | AA | AA | AA |
| rs28897756 | GG | GG | GG | GG |
| rs55770810 | GG | GG | GG | GG |
本发明可以检测1ng/μl以上DNA样本。由实验结果可知，本方案对于低浓度DNA样本的检测依然具有高灵敏度和高准确性的检测效果，样本浓度可低至1ng/μl。
综上所述，本发明提供的检测人类乳腺癌易感基因分型的试剂盒，能够通过KASP技术检测人类乳腺癌易感基因分型具有检测灵敏度高、准确性高、所需的DNA样本要求量低、操作方便且成本低等优点。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 人和未来生物科技（长沙）有限公司
<120> 一种检测人类乳腺癌易感基因分型的试剂盒
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaaggtgacc aagttcatgc tagtcgtggt ttcctggtca tgc 43
<210> 2
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaaggtcgga gtcaacggat tgagtcgtgg tttcctggtc atga 44
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gctgggagct gttctactgc tatta 25
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaaggtgacc aagttcatgc tcaggtaatg gattctgaca aggaaa 46
<210> 5
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaaggtcgga gtcaacggat tcaggtaatg gattctgaca aggaat 46
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cattctaggc tacagctcca gttg 24
<210> 7
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaaggtgacc aagttcatgc tggcatgcac accttgtcct tcat 44
<210> 8
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaaggtcgga gtcaacggat tgcatgcaca ccttgtcctt cac 43
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
catcacccag cggatggtgg at 22
<210> 10
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaaggtgacc aagttcatgc tggagcccag ataccccaaa g 41
<210> 11
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaaggtcgga gtcaacggat tctggagccc agatacccca aaa 43
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ccgggctgtg ctttctcgtc tt 22
<210> 13
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gaaggtgacc aagttcatgc taaaactgaa aaattacaat gaaaggtttg tact 54
<210> 14
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gaaggtcgga gtcaacggat tactgaaaaa ttacaatgaa aggtttgtac c 51
<210> 15
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
agctaacata cagttagcag cgacaaaa 28
<210> 16
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gaaggtgacc aagttcatgc tgcagatgct gagtttgtgt gtgaac 46
<210> 17
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gaaggtcgga gtcaacggat tgcagatgct gagtttgtgt gtgaat 46
<210> 18
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tacccatttt cctcccgcaa ttccta 26
Claims (8)
1.一种检测人类乳腺癌易感基因分型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括引物组，所述引物组包括分别针对人类乳腺癌易感基因的6个检测位点rs2241766、rs2273535、rs4680、rs4880、rs28897756和rs55770810设计的引物，针对每个检测位点的引物包含对应的第一上游引物、第二上游引物和下游引物；所述引物组分别包括如下引物：
针对rs2241766位点的引物包括核苷酸序列为SEQ ID No.1的第一上游引物，核苷酸序列为SEQ ID No.2的第二上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.3的下游引物；
针对rs2273535位点的引物包括核苷酸序列为SEQ ID No.4的第一上游引物，核苷酸序列为SEQ ID No.5的第二上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.6的下游引物；
针对rs4680位点的引物包括核苷酸序列为SEQ ID No.7的第一上游引物，核苷酸序列为SEQ ID No.8的第二上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.9的下游引物；
针对rs4880位点的引物包括核苷酸序列为SEQ ID No.10的第一上游引物，核苷酸序列为SEQ ID No.11的第二上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.12的下游引物；
针对rs28897756位点的引物包括核苷酸序列为SEQ ID No.13的第一上游引物，核苷酸序列为SEQ ID No.14的第二上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.15的下游引物；
针对rs55770810位点的引物包括核苷酸序列为SEQ ID No.16的第一上游引物，核苷酸序列为SEQ ID No.17的第二上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.18的下游引物。
2.一种非疾病治疗和诊断目的检测人类乳腺癌易感基因分型的方法，其特征在于，使用如权利要求1所述的试剂盒通过KASP技术进行基因分型；
包括以下步骤：利用试剂盒中的引物组结合KASP技术针对人类乳腺癌易感基因的6个检测位点rs2241766、rs2273535、rs4680、rs4880、rs28897756和rs55770810进行基因分型检测。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、使用所述引物组配制引物组工作液；
S2、建立对应检测位点的PCR反应体系，所述反应体系包括人源基因组DNA、KASP 预混液和步骤S1中所述的引物组工作液；
S3、设置空白对照；
S4、进行PCR扩增反应；
S5、扫描荧光数据，得到乳腺癌易感基因的分型结果。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中引物组工作液的配制方法为引物浓度均为100 µM的溶液，按照第一上游引物 12µl、第二上游引物 12µl、下游引物30 µl 和Tris-HCl 46 µl 配制成100 µl的引物组工作液。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中PCR反应体系包括人源基因组DNA 2.5 µl，浓度范围为5~100 ng/µl；KASP Master Mix 2.5 µl；引物组工作液0.07 µl。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中人源基因组DNA的样本提取方法包括口腔拭子提取或全血提取的至少一种。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤S3中空白对照为使用等体积的去离子水代替人源基因组DNA加入到所述步骤S2的PCR反应体系中。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤S4中PCR扩增程序如下：
预变性：30℃，1分钟；94℃，15分钟；
变性：94℃，20秒变性；65~59℃梯度退火1分钟；共10个循环，退火温度每个循环降0.6℃；
扩增：94℃，20秒变性；57℃退火1分钟，共30个循环；
荧光扫描：30℃，1分钟。
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