CN104152557A - 基因多态性变异位点早期评估乳腺癌风险的诊断试剂盒 - Google Patents
基因多态性变异位点早期评估乳腺癌风险的诊断试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基因多态性变异位点早期评估乳腺癌风险的诊断试剂盒，所述的试剂盒包括七个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与七个DNA测序引物，针对的检测基因为五个雌激素代谢通路相关基因：ESR1，GSTP1，COMT，SHBG和CYP19A1基因。常见的对乳腺癌进行发病风险估计多用单个或几个SNP位点进行分析，存在实用性差，敏感性和特异性都不行，很少能用于实际检测和应用。本发明所用的检测位点都与乳腺癌易感性相关，选择的位点有一定的代表性，通过检测，能够有效预测乳腺癌的发病风险。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体涉及一种女性乳腺癌发病风险的基因检测试剂盒，根据检测结果从基因层面评估女性乳腺癌发病的风险，并作为预防女性乳腺癌的建议指导。
背景技术
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率占全身各种恶性肿瘤的7-10%，位居女性恶性肿瘤发病率的第一位。近年随着环境和人口老龄化的影响，乳腺癌的发病率有明显增高的趋势。早期发现并及时治疗是乳腺癌防治的关键。
人类基因组计划的完成使我们对癌症发生的分子机制认识进入了新的阶段。基因多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）普遍存在于机体DNA序列中，是第三代遗传标记。SNP研究是人类基因组计划走向应用的重要步骤。因为SNP可作为一个强有力的工具，用于高危群体的发现、疾病相关基因的鉴定、药物的设计和测试以及生物学的基础研究等。通过病例对照研究不仅对于发现癌症相关基因及阐明其作用机制起着重要作用，而且对于癌症易感性早期风险诊断和个体化医疗具有重要意义。
与乳腺癌的发病直接或间接相关的基因众多，其多态性位点变异可影响乳腺癌的发病风险，因此建立简单、可靠、快速的乳腺癌遗传易感性的无创检测方法，能够检测出乳腺癌发生相关的基因单核苷酸位点基因型，及时筛查出乳腺癌易感高危人群，从而根据检测结果尽早采取预防措施，这对于提高乳腺癌的早诊早治有重要意义。
发明内容
本发明基于ESR1(rs2046210, rs9383951)、COMT(rs4680) SHBG(rs6259) GSTP1(rs1695) CYP19A1(rs10046,rs700519)的7个单核苷酸多态性位点基因型可用于评估乳腺癌风险基础上，本发明提供一种女性乳腺癌遗传易感性基因检测试剂盒。
一种基因多态性变异位点早期评估乳腺癌风险的诊断试剂盒，所述的试剂盒包括七个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与七个DNA测序引物，针对的检测基因为五个雌激素代谢通路相关基因：ESR1，GSTP1，COMT，SHBG和CYP19A1基因。
所述的特异性引物是指针ESR1(rs2046210, rs9383951)、COMT(rs4680)、SHBG(rs6259)、GSTP1(rs1695) 、CYP19A1(rs10046,rs700519)七个单核苷酸多态性位点，能特异性扩增出包含这七个SNPs位点的DNA片段的引物对。
所述的DNA测序引物是针对ESR1(rs2046210, rs9383951)、COMT(rs4680)、SHBG(rs6259)、GSTP1(rs1695) 、CYP19A1(rs10046,rs700519)七个单核苷酸多态性位点而设计，能通过DNA测序技术特异性检测出上述七个SNPs位点基因型的DNA测序引物。
所述的七对特异性引物序列如下：
（1）ESR1rs2046210正向引物：5’ CCATTTCTCCCTTCTTGTTGTGA 3’(SEQ ID NO:1); 反向引物5’AAGGCATGCTGGAAGAGTGT 3’(SEQ ID NO:2)；
（2）ESR1rs9383951正向引物：5’AGTGGCGCCAACTCTTATTGA 3’(SEQ ID NO:3); 反向引物5’ CTAAGGTTGGGAGGGCAAGT 3’(SEQ ID NO:4)；
（3）COMT(rs4680)正向引物：5’CGAGGCTCATCACCATCGAG3’(SEQ ID NO:5); 反向引物5’ACTGAGGGGCCTGGTGATAG 3’(SEQ ID NO:6)；
（4）SHBG(rs6259)正向引物：5’TTGAGGGGAAGGAAACCTCTG3’(SEQ ID NO:7); 反向引物5’GTGGAGCTTTAATGGGAAGCG3’(SEQ ID NO:8)；
（5）GSTP1(rs1695)正向引物：5’TCATCCTTCCACGCACATCC3’(SEQ ID NO:9); 反向引物5’TTCTTTGTTCAGCCCCCAGT3’(SEQ ID NO:10)；
（6）CYP19A1 rs10046正向引物：5’ACAGTGTTCTGACTGACCCAT3’(SEQ ID NO:11); 反向引物5’CATGGGCCACTGAGTGTTCA3’(SEQ ID NO:12)；
（7）CYP19A1 rs700519正向引物：5’ACAGGCTTGATTTCGCTACCA3’(SEQ ID NO:13); 反向引物5’TCAACTCAGTGGCAAAGTCCA3’(SEQ ID NO:14)。
所述的七对DNA测序引物序列如下：
(a）ESR1rs2046210 测序引物：5’GATGGAGGTACAGAAAGGCAT3’(SEQ ID NO:15)；
（b）ESR1rs9383951测序引物：5’TTGGGAGGGCAAGTCCTAGT3’(SEQ ID NO:16)；
（c）COMT(rs4680) 测序引物：5’GTGGGTTTTCAGTGAACGTGG3’(SEQ ID NO:17)；
（d）SHBG(rs6259) 测序引物：5’GGAGGAGTGGAAAAGTGGGG3’(SEQ ID NO:18)；
（e）GSTP1(rs1695) 测序引物：5’CCCCAGGGCTCTATGGGAAG3’(SEQ ID NO:19)；
（f）CYP19A1 rs10046测序引物：5’TCTGGCTAACTGTCTGATCATTTTC3’(SEQ ID NO:20)；
（g）CYP19A1 rs700519测序引物：5’AGGCTTGATTTCGCTACCAGT 3’(SEQ ID NO:21)。
所述的试剂盒的每一人份包括：
（i）PCR反应体系：10×PCR反应缓冲液2.5ul；25mM dNTP混合液0.2ul；5U/ul Taq DNA 聚合酶0.125ul；20uM 特异性引物对，每条引物各0.25ul；ddH2O 19.175ul；
（ii）PCR产物纯化体系：1U/ul SAP酶0.75ul；10U/ul ExoI酶 0.375ul；ddH2O 3.875ul；
（iii）测序反应体系：25% Big Dye mix 1ul；3.2uM DNA测序引物1ul；125Mm EDTA溶液1ul；无水乙醇15ul；70%乙醇溶液30ul；HIDI溶液8ul；ddH2O 2ul。
本发明的有益效果：
常见的对乳腺癌进行发病风险估计多用单个或几个SNP位点进行分析，存在实用性差，敏感性和特异性都不行，很少能用于实际检测和应用。本发明所用的检测位点都与乳腺癌易感性相关，选择的位点有一定的代表性，通过检测，能够有效预测乳腺癌的发病风险。
具体实施方式
。ESR1基因编码雌激素受体。COMT编码儿茶酚-O-甲基转移酶，与雌激素的灭活相关。COMT第4号外显子上一个G>A多态性位点突变，导致其第158位密码子编码的氨基酸有Val变为Met。COMT基因的Val和Met等位基因与儿茶酚-O-甲基转移酶活性高低相关，Val/Val基因型酶具有高活性，Val/Met基因型酶活性中等，Met/Met基因型酶活性最低。研究表明该多态性位点与乳腺癌发病相关。CYP19A1基因编码细胞色素P450芳香化酶是雌激素合成酶，rs10046位于CYP19A1基因的3’UTR区，rs700519多态性位点导致R264C变异。SHBG编码雌激素结合球蛋白，GSTP1编码Ⅱ相代谢酶谷胱甘肽转硫酶。
下面结合具体实施例，进一步阐释本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1.
通过对330例乳腺癌患者和400例正常对照进行基因分型，分析由七个位点组成的单体型在病例组和正常组的频率。结果发现单体型TGGGGTC显著提高乳腺癌发病风险，与常见单体型相比，乳腺癌发病风险提高20倍，P<0.0001，具有显著性差异。
实施例２.检测试剂盒的应用
1、DNA抽提
抽取静脉血或刮取受捡者口腔黏膜上皮细胞，用酚氯仿法抽提基因组DNA。
2、PCR反应
使用检测试剂盒中PCR反应组件，其中含下列引物对：
（1）ESR1rs2046210正向引物：5’ CCATTTCTCCCTTCTTGTTGTGA 3’(SEQ ID NO:1); 反向引物5’AAGGCATGCTGGAAGAGTGT 3’(SEQ ID NO:2)；
（2）ESR1rs9383951正向引物：5’AGTGGCGCCAACTCTTATTGA 3’(SEQ ID NO:3); 反向引物5’ CTAAGGTTGGGAGGGCAAGT 3’(SEQ ID NO:4)；
（3）COMT(rs4680)正向引物：5’CGAGGCTCATCACCATCGAG3’(SEQ ID NO:5); 反向引物5’ACTGAGGGGCCTGGTGATAG 3’(SEQ ID NO:6)；
（4）SHBG(rs6259)正向引物：5’TTGAGGGGAAGGAAACCTCTG3’(SEQ ID NO:7); 反向引物5’GTGGAGCTTTAATGGGAAGCG3’(SEQ ID NO:8)；
（5）GSTP1(rs1695)正向引物：5’TCATCCTTCCACGCACATCC3’(SEQ ID NO:9); 反向引物5’TTCTTTGTTCAGCCCCCAGT3’(SEQ ID NO:10)；
（6）CYP19A1 rs10046正向引物：5’ACAGTGTTCTGACTGACCCAT3’(SEQ ID NO:11); 反向引物5’CATGGGCCACTGAGTGTTCA3’(SEQ ID NO:12)；
（7）CYP19A1 rs700519正向引物：5’ACAGGCTTGATTTCGCTACCA3’(SEQ ID NO:13); 反向引物5’TCAACTCAGTGGCAAAGTCCA3’(SEQ ID NO:14)。
PCR扩增的反应体系为：10×反应缓冲液2.5ul；25mM的dNTP混合液0.2ul；5U/ul Taq DNA 聚合酶0.125ul；DNA模板1ul；20uM 特异性引物对（每条引物各0.25ul）；ddH2O 19.175ul；
反应条件为：94℃ 4min变性酶激活，94℃ 30sec 变性，55℃ 30sec退火，72℃ 1min延伸，25个循环，最后72℃延长5分钟。
3、PCR产物纯化
使用试剂盒中的PCR产物纯化组件，反应体系为总体积25ul，包含PCR产物20ul，
1U/ul SAP酶0.75ul；10U/ul ExoI酶 0.375ul；ddH2O 3.875ul。
在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37℃、15min，72℃、20min。
4、DNA测序反应
使用检测试剂盒中的测序反应组件，其中，含有下列DNA测序引物：
（a）ESR1rs2046210 测序引物：5’GATGGAGGTACAGAAAGGCAT3’(SEQ ID NO:15)；
（b）ESR1rs9383951测序引物：5’TTGGGAGGGCAAGTCCTAGT3’(SEQ ID NO:16)；
（c）COMT(rs4680) 测序引物：5’GTGGGTTTTCAGTGAACGTGG3’(SEQ ID NO:17)；
（d）SHBG(rs6259) 测序引物：5’GGAGGAGTGGAAAAGTGGGG3’(SEQ ID NO:18)；
（e）GSTP1(rs1695) 测序引物：5’CCCCAGGGCTCTATGGGAAG3’(SEQ ID NO:19)；
（f）CYP19A1 rs10046测序引物：5’TCTGGCTAACTGTCTGATCATTTTC3’(SEQ ID NO:20)；
（g）CYP19A1 rs700519测序引物：5’AGGCTTGATTTCGCTACCAGT 3’(SEQ ID NO:21)。
反应的总体系为5ul，包括PCR纯化产物1ul，25% Big Dye mix 1ul；3.2uM DNA测序引物1ul；ddH2O 2ul。
在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98℃ 2min，后25个循环的96℃ 30s，55℃ 30s， 60℃ 4min。
反应结束后加入125mM EDTA溶液1ul 和无水乙醇15ul，室温下沉淀15min，4℃，3600rpm/min离心30min，去除上清液，加入70%乙醇溶液30ul，3600rpm/min离心15min，去除上清液，室温放置20min后加入HIDI溶液8ul，放入测序仪。
5、基因型分析
对测序图谱进行分析辨认所检测的SNP位点的基因型。
实施例３.提供女性乳腺癌发病风险基因检测服务
1、采样机抽提DNA
由医院检验科医师对受检者进行血样或口腔上皮细胞采样，采用酚氯仿法对标本进行DNA抽提。
2、基因型检测
使用本发明提供的试剂盒，对受检者基因组的ESR1(rs2046210, rs9383951)、COMT(rs4680) SHBG(rs6259) GSTP1(rs1695) CYP19A1(rs10046,rs700519)的7个单核苷酸多态性位点分别进行DNA测序，确定这7个SNP位点的基因型。
3、乳腺癌发病风险的评估
通过对受检者SNPs基因型的分析，出具乳腺癌发病风险的评估分析报告。报告详细说明了受检者ESR1(rs2046210, rs9383951)、COMT(rs4680) SHBG(rs6259) GSTP1(rs1695) CYP19A1(rs10046,rs700519)的7个单核苷酸多态性位点的基因型信息及发病风险评估结果。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江省肿瘤医院
<120> 基因多态性变异位点早期评估乳腺癌风险的诊断试剂盒
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ESR1rs2046210正向引物
<400> 1
ccatttctcc cttcttgttg tga 23
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ESR1rs2046210反向引物
<400> 2
aaggcatgct ggaagagtgt 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ESR1rs9383951正向引物
<400> 3
agtggcgcca actcttattg a 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ESR1rs9383951反向引物
<400> 4
ctaaggttgg gagggcaagt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> COMT(rs4680)正向引物
<400> 5
cgaggctcat caccatcgag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> COMT(rs4680)反向引物
<400> 6
actgaggggc ctggtgatag 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SHBG(rs6259)正向引物
<400> 7
ttgaggggaa ggaaacctct g 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SHBG(rs6259)反向引物
<400> 8
gtggagcttt aatgggaagc g 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GSTP1(rs1695)正向引物
<400> 9
tcatccttcc acgcacatcc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SHBG(rs6259)反向引物
<400> 10
ttctttgttc agcccccagt 20
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CYP19A1 rs10046正向引物
<400> 11
acagtgttct gactgaccca t 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CYP19A1 rs10046反向引物
<400> 12
catgggccac tgagtgttca 20
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CYP19A1 rs700519正向引物
<400> 13
acaggcttga tttcgctacc a 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CYP19A1 rs700519反向引物
<400> 14
tcaactcagt ggcaaagtcc a 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ESR1rs2046210 测序引物
<400> 15
gatggaggta cagaaaggca t 21
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ESR1rs9383951测序引物
<400> 16
ttgggagggc aagtcctagt 20
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> COMT(rs4680) 测序引物
<400> 17
gtgggttttc agtgaacgtg g 21
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SHBG(rs6259) 测序引物
<400> 18
ggaggagtgg aaaagtgggg 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GSTP1(rs1695) 测序引物
<400> 19
ccccagggct ctatgggaag 20
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CYP19A1 rs10046测序引物
<400> 20
tctggctaac tgtctgatca ttttc 25
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CYP19A1 rs700519测序引物
<400> 21
aggcttgatt tcgctaccag t 21
Claims (6)
1. 一种基因多态性变异位点早期评估乳腺癌风险的诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括七个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与七个DNA测序引物，针对的检测基因为五个雌激素代谢通路相关基因：ESR1，GSTP1，COMT，SHBG和CYP19A1基因。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的特异性引物是指针ESR1(rs2046210, rs9383951)、COMT(rs4680)、SHBG(rs6259)、GSTP1(rs1695) 、CYP19A1(rs10046,rs700519)七个单核苷酸多态性位点，能特异性扩增出包含这七个SNPs位点的DNA片段的引物对。
3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的DNA测序引物是针对ESR1(rs2046210, rs9383951)、COMT(rs4680)、SHBG(rs6259)、GSTP1(rs1695) 、CYP19A1(rs10046,rs700519)七个单核苷酸多态性位点而设计，能通过DNA测序技术特异性检测出上述七个SNPs位点基因型的DNA测序引物。
4. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述的七对特异性引物序列如下：
（1）ESR1rs2046210正向引物：5’ CCATTTCTCCCTTCTTGTTGTGA 3’(SEQ ID NO:1); 反向引物5’AAGGCATGCTGGAAGAGTGT 3’(SEQ ID NO:2)；
（2）ESR1rs9383951正向引物：5’AGTGGCGCCAACTCTTATTGA 3’(SEQ ID NO:3); 反向引物5’ CTAAGGTTGGGAGGGCAAGT 3’(SEQ ID NO:4)；
（3）COMT(rs4680)正向引物：5’CGAGGCTCATCACCATCGAG3’(SEQ ID NO:5); 反向引物5’ACTGAGGGGCCTGGTGATAG 3’(SEQ ID NO:6)；
（4）SHBG(rs6259)正向引物：5’TTGAGGGGAAGGAAACCTCTG3’(SEQ ID NO:7); 反向引物5’GTGGAGCTTTAATGGGAAGCG3’(SEQ ID NO:8)；
（5）GSTP1(rs1695)正向引物：5’TCATCCTTCCACGCACATCC3’(SEQ ID NO:9); 反向引物5’TTCTTTGTTCAGCCCCCAGT3’(SEQ ID NO:10)；
（6）CYP19A1 rs10046正向引物：5’ACAGTGTTCTGACTGACCCAT3’(SEQ ID NO:11); 反向引物5’CATGGGCCACTGAGTGTTCA3’(SEQ ID NO:12)；
（7）CYP19A1 rs700519正向引物：5’ACAGGCTTGATTTCGCTACCA3’(SEQ ID NO:13); 反向引物5’TCAACTCAGTGGCAAAGTCCA3’(SEQ ID NO:14)。
5. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述的七对DNA测序引物序列如下：
（a）ESR1rs2046210 测序引物：5’GATGGAGGTACAGAAAGGCAT3’(SEQ ID NO:15)；
（b）ESR1rs9383951测序引物：5’TTGGGAGGGCAAGTCCTAGT3’(SEQ ID NO:16)；
（c）COMT(rs4680) 测序引物：5’GTGGGTTTTCAGTGAACGTGG3’(SEQ ID NO:17)；
（d）SHBG(rs6259) 测序引物：5’GGAGGAGTGGAAAAGTGGGG3’(SEQ ID NO:18)；
（e）GSTP1(rs1695) 测序引物：5’CCCCAGGGCTCTATGGGAAG3’(SEQ ID NO:19)；
（f）CYP19A1 rs10046测序引物：5’TCTGGCTAACTGTCTGATCATTTTC3’(SEQ ID NO:20)；
（g）CYP19A1 rs700519测序引物：5’AGGCTTGATTTCGCTACCAGT 3’(SEQ ID NO:21)。
6. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒的每一人份包括：
（i）PCR反应体系：10×PCR反应缓冲液2.5ul；25mM dNTP混合液0.2ul；5U/ul Taq DNA 聚合酶0.125ul；20uM 特异性引物对，每条引物各0.25ul；ddH2O 19.175ul；
（ii）PCR产物纯化体系：1U/ul SAP酶0.75ul；10U/ul ExoI酶 0.375ul；ddH2O 3.875ul；
（iii）测序反应体系：25% Big Dye mix 1ul；3.2uM DNA测序引物1ul；125Mm EDTA溶液1ul；无水乙醇15ul；70%乙醇溶液30ul；HIDI溶液8ul；ddH2O 2ul。
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