CN104450876A - 一种筛查子宫内膜癌易感基因的无创检测试剂盒 - Google Patents

一种筛查子宫内膜癌易感基因的无创检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明一种筛查子宫内膜癌易感基因的无创检测试剂盒，属于基因检测试剂盒领域；提供一种无痛、无创、清洁、不易引起交叉感染、结果准确可靠的检测子宫内膜癌发病的致病因素和危险因子的检测试剂盒；包括检测单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、PCR反应组件、PCR产物纯化组件和DNA测序反应组件，所述特异性引物是针对CYP1A1基因上单核苷酸多态性位点Msp I、CYP1B1基因上单核苷酸多态性位点Leu432Val、CYP17基因上单核苷酸多态性位点MspA1I、MDM2基因上单核苷酸多态性位点309和NQ01基因上单核苷酸多态性位点C609T；本发明主要应用在医学和生物学方面。

Description

一种筛查子宫内膜癌易感基因的无创检测试剂盒
技术领域
本发明一种筛查子宫内膜癌易感基因的无创检测试剂盒，属于基因检测试剂盒领域。
背景技术
子宫内膜癌是一种常见的女性生殖道恶性肿瘤，在欧美国家为女性生殖器官三大恶性肿瘤之首，在我国60年代后开始呈现发病率提高及年轻化的趋势。子宫内膜癌大约占妇女恶性肿瘤的7％左右，每年其新发病例及死亡病例数量分别占妇女恶性肿瘤的3.9％和1.7％。有分子遗传学研究显示，子宫内膜癌由于原癌基因激活、抑癌基因失活及DNA错配修复基因改变等细胞调节路径逐步改变，从而导致细胞增殖功能失调。
最近的研究表明，子宫内膜癌的发生与CYP1A1、CYP1B1、CYP17、MDM2和NQ01这5个遗传易感基因密切相关。CYP1A1又称细胞色素P4501A1，是一种重要的细胞色素P450系氧化代谢酶。该酶广泛存在于肝外组织中，具有芳烃羟化酶(AHH)活性，参与代谢一些外源性化合物及前致癌物。CYP1B1由于具有激活环境中的前致癌物并催化雌激素转化为具有基因毒性的儿茶酚雌激素，被认为是多种癌症的候选致病基因。CYP1B1基因Leu432Val存在多态性，有野生型C/C、杂合型C/G、突变型G/G三种基因型。CYP17是雌激素生物合成限速步骤中编码关键酶的基因，其变异是雌激素生物合成与代谢上调的早期信号，性激素生物合成途径中酶编码基因的这种变异具有增加子宫内膜癌危险的可能性。因此，CYP17被认为是子宫内膜癌可疑性的潜在标记物。
MDM2基因的一个常见单核苷酸多态位点309(rs22797444)，在第二个MDM2启动子加强区域，通过自发性T-G转换，增加转录激活因子Sp1启动子的亲和力，提高MDM2信使RNA以及蛋白表达水平。因此，MDM2癌基因SNPs与子宫内膜癌的发生存在相关性。
NQ01(醌氧化还原酶1)作为一类黄素蛋白酶普遍存在于真核细胞内，具有催化醌双电子还原反应，对醌及其衍生物有解毒作用，并能解除醌累物质对细胞的毒害，起到保护细胞的作用。有研究表明，NQ01第六外显子C609T可引起蛋白质编码氨基酸序列改变，使蛋白质功能改变，影响肿瘤生长。NQ01C609T基因多态性分为纯和野生基因型C/C、杂合基因型C/T和纯和突变基因型T/T三种。最近研究显示，纯和野生基因型具有完全的NQ01酶活性，杂合基因型酶活性较前者低3倍，纯和突变基因型则完全丧失。因此，可以认为NQ01C609T单核苷酸多态性与子宫内膜癌的遗传易感性有关。
综上所述，鉴于CYP1A1、CYP1B1、CYP17、MDM2、NQ01基因与子宫内膜癌的发生有着重要的关联关系，可以做为预测和筛查子宫内膜癌的潜在指征，通过对这些子宫内膜癌易感基因的检测，能在预测预防和指导治疗子宫内膜癌方面起到重要作用，并能大大降低子宫内膜癌在中国人群中的发病概率。因此，有必要对现有技术予以改进。
发明内容
为了克服现有技术的不足，提供一种无痛、无创、清洁、不易引起交叉感染、结果准确可靠的检测子宫内膜癌发病的致病因素和危险因子的检测试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种筛查子宫内膜癌易感基因的无创检测试剂盒，包括：检测单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、PCR反应组件、PCR产物纯化组件和DNA测序反应组件，所述PCR反应组件包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH2O，所述PCR产物纯化组件包括SAP酶、ExoI酶、ddH2O，所述DNA测序反应组件包括BigDye mix，EDTA溶液、100％乙醇溶液、70％乙醇溶液、HIDI溶液、ddH2O，所述特异性引物是针对CYP1A1基因上单核苷酸多态性位点Msp I、CYP1B1基因上单核苷酸多态性位点Leu432Val、CYP17基因上单核苷酸多态性位点MspA1I、MDM2基因上单核苷酸多态性位点309和NQ01基因上单核苷酸多态性位点C609T，能特异性扩增出包含5个SNPs位点的DNA片段的引物对。
所述DNA测序引物是针对CYP1A1基因上单核苷酸多态性位点Msp I、CYP1B1基因上单核苷酸多态性位点Leu432Val、CYP17基因上单核苷酸多态性位点MspA1I、MDM2基因上单核苷酸多态性位点309和NQ01基因上单核苷酸多态性位点C609T，能通过DNA测序技术特异性检测出上述5个SNPs位点基因型的DNA测序引物。
所含的五对特异性引物序列如下：
1)CYP1A1Msp I正向引物：5’GGGAGGAAGAAGAGGAGGTAG3’
CYP1A1Msp I反向引物：5’AGGTTCTTGAAAGCAGGGACT3’
2)CYP1B1Leu432Val正向引物：5’TTGTGCCTGTCACTATTCCTCA3’
CYP1B1Leu432Val反向引物：5’AGCCAGGATGGAGATGAAGAG3’
3)CYP17MspA1I正向引物：5’CCCATACGAACCGAATAGA3’
CYP17MspA1I反向引物：5’AGTCAAGGTGAAGATCAGGGTAG3’
4)MDM2SNP309正向引物：5’CGGGAGTTCAGGGTAAAGGT3'
MDM2SNP309反向引物：5’AGCAAGTCGGTGCTTACCTG3’
5)NQ01C609T正向引物：5’TGGCACAGTTTCAAGGTTTATG3’
NQ01C609T反向引物：5’TATTCTCCAGGCGTTTCTTCC3’。
所含的五条DNA测序引物序列如下：
1)CYP1A1Msp I测序引物：5’GGGAGGAAGAAGAGGAGGTAG3'
2)CYP1B1Leu432Val测序引物：5’TTGTGCCTGTCACTATTCCTCA3’
3)CYP17MspA1I测序引物：5’CCCATACGAACCGAATAGA3’
4)MDM2SNP309测序引物：5’CGGGAGTTCAGGGTAAAGGT3’
5)NQ01C609T测序引物：5’TATTCTCCAGGCGTTTCTTCC3’。
试剂盒的组分和含量包括：
1)PCR反应体系：10×PCR反应缓冲液2.5ul，25mM dNTP混合液0.2ul，5U/ul Taq DNA聚合酶O.125ul，20uM特异性引物对，每条引物各0.25ul，ddH2O19.175ul；
2)PCR产物纯化体系：1U/ul SAP酶0.75ul，10U/ul ExoI酶0.375ul，ddH2O3.875ul；
3)测序反应体系：25％BigDye mix1ul，3.2uM DNA测序引物1ul，125mM EDTA溶液lul，100％乙醇溶液15ul，70％乙醇溶液30ul，HIDI溶液8ul，ddH2O2ul；
本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20℃。
本发明与现有技术相比所具有的有益效果为：
本发明通过检测与子宫内膜癌发生发展密切关联的五个单核苷酸多态性位点的基因型来评估子宫内膜癌患病的风险级别与程度，并根据受检者基因检测结果从基因维度指导人们有针对性的预防子宫内膜癌的发生，旨在降低子宫内膜癌的发病概率；本发明所使用样本为人口腔粘膜脱落细胞，采用口腔内壁无创采样法采集样本，该法无痛、无创、清洁、不易引起交叉感染；基因测序过程采用ABI3730型基因测序仪，方法简便，结果准确可靠，适合推广。
具体实施方式
下面通过实施例来对本发明作进一步详细的说明。
实施例1：子宫内膜癌检测试剂盒的使用
1、抽提DNA模板
刮取受检者口腔黏膜上皮细胞，用酚氯仿法抽提基因组DNA。
2、PCR扩增反应
使用检测试剂盒中的PCR反应组件，其中，含有下列引物对：
1)CYP1A1Msp I正向引物：5’GGGAGGAAGAAGAGGAGGTAG3’
CYP1A1Msp I反向引物：5’AGGTTCTTGAAAGCAGGGACT3’
2)CYP1B1Leu432Val正向引物：5’TTGTGCCTGTCACTATTCCTCA3’
CYP1B1Leu432Val反向引物：5’AGCCAGGATGGAGATGAAGAG3’
3)CYP17MspA1I正向引物：5’CCCATACGAACCGAATAGA3’
CYP17MspA1I反向引物：5’AGTCAAGGTGAAGATCAGGGTAG3’
4)MDM2SNP309正向引物：5’CGGGAGTTCAGGGTAAAGGT3’
MDM2SNP309反向引物：5’AGCAAGTCGGTGCTTACCTG3’
5)NQ01C609T正向引物：5’TGGCACAGTTTCAAGGTTTATG3’
NQ01C609T反向引物：5’TATTCTCCAGGCGTTTCTTCC3’
PCR扩增的反应体系为：10×PCR反应缓冲液2.5μl；25mM的dNTP混合液0.2μl、5U/ulTaq酶0.125μl、DNA模板1μl(12-15ng左右)、20uM正向引物反向引物各0.25μl、ddH2O19.175μl；
CYP1A1反应条件为：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，58℃30s退火，72℃延伸1min，35个循环后，72℃延伸10分钟；
CYP1B1反应条件为：94℃预变性5min，然后94℃变性40s，60℃40s退火，72℃延伸1min，35个循环后，72℃延伸10分钟；
CYP17反应条件为：94℃预变性5min，然后94℃变性50s，55℃50s退火，72℃延伸40s，32个循环后，72℃延伸10分钟；
MDM2反应条件为：94℃预变性5min，然后94℃变性50s，58℃50s退火，72℃延伸40s，32个循环后，72℃延伸10分钟；
NQ01反应条件为：94℃预变性5min，然后94℃变性50s，59℃50s退火，72℃延伸40s，32个循环后，72℃延伸10分钟。
3、PCR扩增产物纯化
使用检测试剂盒中的PCR产物纯化组件，反应体系为总体积25ul，包含PCR产物20ul，1U/ul SAP酶0.75ul，10U/ul ExoI酶0.375ul，去离子水3.875ul。
在ABI3730型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37℃、15min，72℃、20min。
4、DNA测序反应
使用检测试剂盒中的测序反应组件，其中，含有下列DNA测序引物：
1)CYP1A1Msp I测序引物：5’GGGAGGAAGAAGAGGAGGTAG3’
2)CYP1B1Leu432Val测序引物：5’TTGTGCCTGTCACTATTCCTCA3’
3)CYP17MspA1I测序引物：5’CCCATACGAACCGAATAGA3’
4)MDM2SNP309测序引物：5’CGGGAGTTCAGGGTAAAGGT3
5)NQ01C609T测序引物：5’TATTCTCCAGGCGTTTCTTCC3’
反应的体系为总体积5ul，包含PCR纯化产物1ul，25％Bigdye mix1ul，3.2uM DNA测序引物1ul，去离子水2ul。
在ABI3730型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98℃2min，进行25个循环的96℃30s，55℃30s，60℃4min。
反应结束后加入125mM EDTA溶液1ul和100％乙醇溶液15ul，于室温下沉淀15min；在4℃，3600rpm/min的转速离心30min，轻轻倒去上清液；加入70％乙醇溶液30ul，3600rpm/min离心15min，轻轻倒去上清液；室温放置20min后加入HIDI溶液8ul，放入测序仪中。
5、基因型分析
熟悉DNA测序技术的本领域技术工程师能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的SNP位点的基因型。
实施例2：筛查子宫内膜癌患病风险人群的基因无创检测服务
1.无创采样
由医院检验科医师指导受检者使用口腔采样拭进行口腔粘膜上皮细胞取样，样本用细胞保存液常温保存。
2.DNA抽提
采用酚氯仿法对采集到的口腔粘膜细胞进行DNA抽提。
3.基因型检测
使用本发明提供的试剂盒，对受检者基因组DNA的CYP1A1基因上Msp I(rs4646903)，CYP1B1基因上Leu432Val(rs1056836)，CYP17基因上MspA1I(rs743572)，MDM2基因上SNP309(rs2279744)，NQ01基因上C609T(rs1800566)的5个单核苷酸多态性位点分别进行DNA测序，确定这5个SNPs位点的基因型。
4.子宫内膜癌发病高危人群生物信息学分析及风险评估
通过对受检者SNPs基因型的生物信息学分析和风险评估模型鉴定，出具子宫内膜癌易感基因风险评估分析报告单。报告中详细说明了受检者CYP1A1基因上Msp I(rs4646903)，CYP1B1基因上Leu432Val(rs1056836)，CYP17基因上MspA1I(rs743572)，MDM2基因上SNP309(rs2279744)，NQ01基因上C609T(rs1800566)这5个SNP位点基因检测信息、子宫内膜癌风险评估结果和防治方案。根据受检者的风险等级，由医师向受检者详细说明并解读子宫内膜癌易感基因无创检测报告单。
以上实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围；上述实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件，除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算；除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

Claims (5)

1.一种筛查子宫内膜癌易感基因的无创检测试剂盒，包括：检测单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、PCR反应组件、PCR产物纯化组件和DNA测序反应组件，所述PCR反应组件包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH2O，所述PCR产物纯化组件包括SAP酶、ExoI酶、ddH2O，所述DNA测序反应组件包括BigDye mix，EDTA溶液、100％乙醇溶液、70％乙醇溶液、HIDI溶液、ddH2O，其特征在于：所述特异性引物是针对CYP1A1基因上单核苷酸多态性位点Msp I、CYP1B1基因上单核苷酸多态性位点Leu432Val、CYP17基因上单核苷酸多态性位点MspA1I、MDM2基因上单核苷酸多态性位点309和NQ01基因上单核苷酸多态性位点C609T，能特异性扩增出包含5个SNPs位点的DNA片段的引物对。
2.根据权利要求1所述的一种筛查子宫内膜癌易感基因的无创检测试剂盒，其特征在于：所述DNA测序引物是针对CYP1A1基因上单核苷酸多态性位点Msp I、CYP1B1基因上单核苷酸多态性位点Leu432Val、CYP17基因上单核苷酸多态性位点MspA1I、MDM2基因上单核苷酸多态性位点309和NQ01基因上单核苷酸多态性位点C609T，能通过DNA测序技术特异性检测出上述5个SNPs位点基因型的DNA测序引物。
3.根据权利要求1所述的一种筛查子宫内膜癌易感基因的无创检测试剂盒，其特征在于：所含的五对特异性引物序列如下：
1)CYP1A1Msp I正向引物：5’GGGAGGAAGAAGAGGAGGTAG3’
CYP1A1Msp I反向引物：5’AGGTTCTTGAAAGCAGGGACT3’
2)CYP1B1Leu432Val正向引物：5’TTGTGCCTGTCACTATTCCTCA3’
CYP1B1Leu432Val反向引物：5’AGCCAGGATGGAGATGAAGAG3’
3)CYP17MspA1I正向引物：5’CCCATACGAACCGAATAGA3’
CYP17MspA1I反向引物：5’AGTCAAGGTGAAGATCAGGGTAG3’
4)MDM2SNP309正向引物：5’CGGGAGTTCAGGGTAAAGGT3’
MDM2SNP309反向引物：5’AGCAAGTCGGTGCTTACCTG3’
5)NQ01C609T正向引物：5’TGGCACAGTTTCAAGGTTTATG3’
NQ01C609T反向引物：5’TATTCTCCAGGCGTTTCTTCC3’。
4.根据权利要求1或2所述的一种筛查子宫内膜癌易感基因的无创检测试剂盒，其特征在于：所含的五条DNA测序引物序列如下：
1)CYP1A1Msp I测序引物：5’GGGAGGAAGAAGAGGAGGTAG3’
2)CYP1B1Leu432Val测序引物：5’TTGTGCCTGTCACTATTCCTCA3’
3)CYP17MspA1I测序引物：5’CCCATACGAACCGAATAGA3’
4)MDM2SNP309测序引物：5’CGGGAGTTCAGGGTAAAGGT3’
5)NQ01C609T测序引物：5’TATTCTCCAGGCGTTTCTTCC3’。
5.根据权利要求1所述的一种筛查子宫内膜癌易感基因的无创检测试剂盒，其特征在于：试剂盒的组分和含量包括：
1)PCR反应体系：10×PCR反应缓冲液2.5ul，25mM dNTP混合液0.2ul，5U/ul Taq DNA聚合酶0.125ul，20uM特异性引物对，每条引物各0.25ul，ddH2O19.175ul；
2)PCR产物纯化体系：1U/ul SAP酶0.75ul，10U/ul ExoI酶0.375ul，ddH2O3.875ul；
3)测序反应体系：25％BigDye mix1ul，3.2uM DNA测序引物1ul，125mM EDTA溶液1ul，100％乙醇溶液15ul，70％乙醇溶液30ul，HIDI溶液8ul，ddH2O2ul；
本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20℃。
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