CN101200729A - 一种与肿瘤易感性相关的单核苷酸多态性位点及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种与肿瘤易感性相关的单核苷酸多态性位点及其应用，属生命科学技术领域。本发明的易感基因通过NCBI数据库，按常规方法获得，该易感基因是序列长度为41878bp的端粒酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)基因；所研究的单核苷酸多态性是rs2736098，rs2736098位于2号外显子；rs2736098碱基为G突变为A。该易感基因作为在判定肿瘤的易感人群的方法中的应用。当rs2736098碱基为A个体肿瘤易感性高、rs2736098碱基为G的个体为不易发肿瘤。本发明的TERT基因上的该SNP位点对研究肿瘤易感性及建立基因诊断方法，指导肿瘤预防、开发新型治疗肿瘤的药物具有重要作用。
Description
【技术领域】：本发明涉及一个与肿瘤易感性相关的单核苷酸多态性位点及其应用，属于生命科学技术领域。
【背景技术】：肿瘤的发生涉及环境、遗传、生活饮食习惯等多种因素，具体到正常细胞转化为癌细胞的过程，又与癌基因的激活、抑癌基因的失活、细胞凋亡、细胞周期、信号转导、DNA修复关键基因的突变有关。随着各种分子生物学技术的成熟，研究人员已发现了大量与肿瘤发生发展相关的基因。基因在决定个体表型方面起着决定性作用，通过赋予个体对疾病的易感性或抵抗力，以及影响机体与环境因素的相互作用，基因对疾病的发生起着间接或直接作用。
最近大量的研究表明细胞端粒酶激活是多数恶性肿瘤发生的先决条件。端粒酶在恶性肿瘤组织及相关脱落细胞中检出率很高，由于端粒缩短和端粒酶无活性，体细胞通常逐渐衰老死亡。仅有极少数细胞偶然通过激活端粒酶而逃避程序性老化，其生存延长可能给另外的基因损伤的积累提供机会，导致进行性肿瘤性发展[2]。在大多数癌细胞系和肿瘤细胞中端粒酶均有高水平表达[3]。表明端粒酶的激活表达与细胞的无限增殖有密切关系，通过解除细胞衰老过程中的增生受限，端粒酶的重新活化可能是体细胞向肿瘤转化的关键步骤。
机体对各种慢性损伤的抗争能力是有明显个体差异的。造成差异的遗传物质基础之一就是广泛存在于基因中的SNPs。SNPs的存在并不直接造成细胞的癌变及肿瘤的发生，但可能会赋予个体对某种特殊的环境因素易感。例如p53基因是重要的细胞周期、凋亡调节基因，在某些关键位点的突变可以直接造成细胞增殖的异常。而在p53基因非热点区，如72位密码子的点突变(C→G)会造成编码氨基酸的改变(Pro→Arg)。这种多态性在自然人群中有一定的分布，并不直接造成细胞的癌变。
因此在本发明中选择TERT基因作为所研究的基因。同时选择TERT基因上的SNP位点为所研究的方向。
【发明内容】：本发明的目的是通过对端粒酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)基因上的单核苷酸多态性位点rs2736098遗传特异性的研究，提出一个可作为在判定肿瘤易感人群的方法中应用的易感SNP位点，以利于指导肿瘤的预防和治疗。
本发明所述的与肿瘤易感性相关的TERT基因序列，其核苷酸序列如序列表所示，且第428位为A。
所述的与肿瘤易感性相关的TERT基因上的单核苷酸多态性位点，通过NCBI数据库，按常规方法获得，该基因是序列长度为41878bp的TERT基因；该基因的一单核苷酸多态性是rs2736098，rs2736098位于2号外显子；rs2736098碱基为G突变为A；rs2736098的SNP序列，为：
CCATCCGTGGGCCGCCAGCACCACGC[A/G]GGCCCCCCATCCACATCGCGGCCAC。
获得rs2736098SNP序列的具体步骤如下：
通过http://www.cnbi.nlm.gov/snp数据库，在TERT基因上选择单核苷酸多态性rs2736098；依据相应的碱基序列合成引物5′-CGAAGAAGCCACCTCTTTGGA-3′和5′-AAGTGCTTGGTCTCGGCGTAC-3′；PCR反应体系25μl：2.5μl 10×TaqBuffer，2μl 2.5mM dNTP，1μl10mM Primer，1μl Template DNA，0.2uTaq，用ddH2O补足25μl；PCR反应条件：94℃ 8min；94℃40sec，57℃ 30sec，72℃ 1min，35个循环；72℃ 10min；扩增产物为168bp，用2％的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色检测(见图1)。
所述的与肿瘤易感性相关的TERT基因序列的应用，通过提取受试者基因组DNA进行单核苷酸多态性rs2736098的基因分型，其中rs2736098碱基为A的个体为肿瘤的易感人群。
本发明的优点和积极效果：
本发明的研究结果表明TERT基因是肿瘤相关的易感基因，rs2736098碱基为A的个体肿瘤易感性高，该单核苷酸多态性位点可作为在判定肿瘤的易感人群的方法。
【附图说明】：
图1是显示多态性位点rs2736098的序列扩增图，其中，M为DNA分子量标准，1为PCR产物。
【具体实施方式】：
实施例1.
通过提取受试者基因组DNA进行单核苷酸多态性rs2736098的基因分型，其中rs2736098碱基为A的个体为肿瘤的易感人群。具体作法是：
1.基因组DNA的提取
受试者均由外周静脉抽取血2-3ml，采用酚氯仿法提取其基因组DNA，-70℃保存。
2.PCR扩增目的片断
用以下引物5′-CGAAGAAGCCACCTCTTTGGA-3′和′-AAGTGCTTGGTCTCGGCGTAC-3′。PCR反应体系(25μl)：2.5μl 10×TaqBuffer，2μl 2.5mM dNTP，1μl 10mM Primer，1μl Template DNA，0.2uTaq，用ddH2O补足25μl。PCR反应条件：94℃8min；94℃40sec，57℃30sec，72℃1min(35个循环)；72℃10min。扩增产物为168bp，用2％的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色检测(见图1)。
3.基因分型
采用点杂交的方法进行基因分型。具体方法如下：将合成的寡核酸探针配成相同浓度点在尼龙膜上，经过紫外3min使样品与膜牢固结合，放在4℃备用。杂交袋(内含芯片一张)加300μl杂交液(注意不要碰到膜，将气泡赶走)然后将杂交袋用封口机封好，在45℃条件下杂交30min。取PCR产物5-10μl，在100℃水浴中变性5min，立即冰浴5min。将预杂交袋从杂交箱中取出，将杂交袋剪一斜口，轻轻倒出预杂交液，再将300μl杂交液与变性探针一起加到杂交袋中，赶走气泡将杂交袋封好，放到杂交箱中，45℃杂交过夜。将杂交袋中的芯片取出，室温下用2×SSC/0.1％SDS洗两次，每次2min。然后用0.2×SSC/0.1％SDS，42℃下洗两次，每次3min。TNT溶液洗5min。将芯片平放入干净的塑料袋中，加入10×封闭液20μl，TN180μl，混匀，37℃30min。塑料袋中的封闭液，然后加入新的10×封闭液20μl、TN180μl、POD抗体0.3μl，轻轻混匀，37℃ 30min。将芯片从袋中取出，TNT漂洗3次，每次3min。将膜放入干净塑料袋中，取DAB显色液6μl，DAB稀释液6μl、双蒸水288μl，混匀后，立即加入袋中，待显色达到理想程度后(一般显色10分钟左右)，用1×PBS终止反应。
4.结果判定
rs2736098碱基为A的个体为肿瘤易感人群。rs2736098碱基为G的个体为肿瘤非易感人群。
实施例2、易感基因的应用
本研究以33例肿瘤患者为研究组，以33例非肿瘤患者为对照组。研究组和对照组的受试者均由外周静脉抽血2-3ml，采用酚氯仿法提取基因组DNA，-70℃保存。
病例-对照组研究结果显示对照组(33人)和研究组(33人)中rs2736098位点基因型AA、GG+AG分别为0、1.000和0.152、0.848(表2)；TERT基因rs2736098碱基为A的个体肿瘤易感性高。
表2基因型分布与等位基因频率
| 对照组 | 研究组 | P | ||
| n基因型等位基因 | AAAG+GGAG | 330(0)33(1.000)0.250.75 | 335(0.152)28(0.848)0.3630.637 | 0.030.01 |
根据本发明由TERT基因碱基突变特异性判定肿瘤的易感人群的方法，可对未表现肿瘤临床症状的人群进行这种方法的筛查rs2736098碱基为A的个体为肿瘤易感人群。对肿瘤易感人群在日常生活中应尽量减少诱发因素，可降低肿瘤的发病率。
根据本发明，可根据患者的基因型决定使用合适的抗肿瘤药物或者采用如基因敲除等基因工程方法进行有针对性的基因治疗。TERT基因的碱基突变，可能造成蛋白质表达及功能异常。
序列表
<110>南开大学
<120>一种与肿瘤易感性相关的单核苷酸多态性位点及其应用
<130>
<160>1
<170>PatentIn version3.1
<210>1
<211>850
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>1
<222>(1)..(850)
<400>1
cggacggggg tctgtgtcct cctcctcggg ggccgccaca gagccctggg gcttctcccg 60
ggcacagaca ccggctgctg gggtgaccgc agctcgcagc gggcagtgcg tcttgaggag 120
caccccgtag gggcactgcg cgtggttccc aagcagctcc agaaacaggg gccgcatttg 180
ccagtagcgc tggggcaggc ggggcaacct gcggggagtc cctggcatcc agggcctgga 240
acccagaaag atggtctcca cgagcctccg agcgccagtc aggctgggcc tcagagagct 300
gagtaggaag gagggccgca gctgctcctt gtcgcctgag gagtagagga agtgcttggt 360
ctcggcgtac accgggggac aaggcgtgtc ccagggacgt ggtggccgcg atgtggatgg 420
ggggcccgcg tggtgctggc ggcccacgga tgggtgggag tggcgcgtgc cagagagcgc 480
accctccaaa gaggtggctt cttcggcggg tctggcaggt gacaccacac agaaaccacg 540
gccactcggt ccacgcgtcc tgcccgggtg ggcccaggac ccctgcccaa cgggcgtccg 600
ctccggctca ggggcagcgc cacgcctggg cctcttgggc aacggcagac ttcggctggc 660
actgcccccg cgcctcctcg cacccggggc tggcaggccc agggggaccc cggcctccct 720
gacgctatgg ttccaggccc gttcgcatcc cagacgcctt cggggtccac tagcgtgtgg 780
cgggggccgg ggcctgagtg gcagcgccga gctggtacag cggcggcccg cacacctggt 840
aggcgcagct 850
Claims (4)
1.一种与肿瘤易感性相关的端粒酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)基因部分序列，其核苷酸序列如序列表所示，且第428位为A。
2.根据权利要求1所述的与肿瘤易感性相关的TERT基因序列，其特征在于，所述的与肿瘤易感性相关的TERT基因上的单核苷酸多态性位点，通过NCBI数据库，按常规方法获得，该基因是序列长度为41878bp的TERT基因；该基因的一单核苷酸多态性是rs2736098，rs2736098位于2号外显子；rs2736098碱基为G突变为A；rs2736098的SNP序列为：
CCATCCGTGGGCCGCCAGCACCACGC[A/G]GGCCCCCCATCCACATCGCGGCCAC。
3.根据权利要求2所述的与肿瘤易感性相关的TERT基因序列，其特征在于，获得rs2736098SNP序列的具体步骤如下：
通过http://www.ncbi.nlm.gov/snp数据库，在TERT基因上选择单核苷酸多态性rs2736098；依据相应的碱基序列合成引物CGAAGAAGCCACCTCTTTGGA和AAGTGCTTGGTCTCGGCGTAC；PCR反应体系25μl：2.5μl 10×TaqBuffer，2μl 2.5mM dNTP，1μl 10mM Primer，1μl Template DNA，0.2uTaq，用ddH2O补足25μl；PCR反应条件：94℃ 8min；94℃ 40sec，57℃ 30sec，72℃ 1min，35个循环；72℃ 10min；扩增产物为168bp，用2％的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色检测。
4.一种权利要求1所述的与肿瘤易感性相关的TERT基因序列的应用，其特征在于，通过提取受试者基因组DNA进行单核苷酸多态性rs2736098的基因分型，其中rs2736098碱基为A的个体为肿瘤的易感人群。
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