CN104404128B - 一种tert基因组合突变位点的检测试剂盒 - Google Patents

一种tert基因组合突变位点的检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子诊断领域，提供了一种TERT基因组合突变位点的检测试剂盒，其包含能分别扩增出含TERT基因多态性位点RS34094720、RS61748181、RS121918661、RS121918662、RS121918663、RS121918664的片段的引物对和对扩增产物测序所用的测序引物。本发明还提供了使用该试剂盒非诊断检测TERT基因组合突变位点的方法。

Description

一种TERT基因组合突变位点的检测试剂盒
发明领域
本发明涉及分子诊断领域，具体的说，本发明涉及检测TERT基因组合突变位点的试剂盒。
背景技术
人端粒酶是一种核糖核蛋白复合物,由人端粒酶逆转录酶(hTERT)、人端粒酶RNA组分(hTR)以及人端粒酶相关蛋白(hTEP1等)组成。端粒酶以hTERC为模板，在hTERT催化作用下逆转录合成端粒DNA。近年来多项研究发现，编码端粒酶复合体的相关基因突变，使端粒酶功能障碍、端粒缩短，细胞衰老、基因组不稳定性增加，进而出现骨髓衰竭综合征，如Neal S.Young对124例获得性再障骨髓衰竭综合征患者的TERT基因的16个外显子进行了筛查，在7例患者中发现5个TERT突变（Blood2003；102:916-918），而Juan Liang在日本的儿童获得性再障骨髓衰竭综合征患者中发现了2个新的TERT突变（Hematologica2006；91:656-658），此外TERT的突变对骨髓衰竭综合征患者治疗效果有一定影响（Blood2011117（21）：5607-11和中国博士论文全文数据库：中国北方骨髓衰竭综合征端粒酶基因突变和专利长度变化的研究刘博中国协和医科大学）。因此，检测TERT突变位点对骨髓衰竭综合征的筛查、指导临床治疗、科学研究有着重要的意义。
检测多态性位点处的突变可以使用PCR+RFLP法，这种检测方法针对检测位点选择特异性的限制性内切酶进行酶切，然后对酶切产物电泳，通过是否被限制性内切酶切开而判断是否存在突变位点。这种方法的最大缺点是必须有可以特异性识别突变位点的限制性内切酶，且其他位点最好不能有被该限制性内切酶识别的序列，否则可能造成结果判断复杂。
PCR+测序的方法能直接得到多态性位点及其邻近序列的核酸序列，操作简单（测序可交由测序公司完成），结果可靠（可以通过邻近序列判断是否特异性扩增出了所需片段）。但同时检测多个多态性位点时，针对每个位点的引物所用PCR反应条件不同，每份样品的每个位点都要单独设置反应条件，造成工作量/仪器/时间的较大浪费。
发明内容
针对上述问题，发明人分析了TERT基因多态性位点RS34094720、RS61748181、RS121918661、RS121918662、RS121918663和RS121918664及其邻近序列，设计了大量引物，经过对每对引物反应条件的优化和比较，从中筛选到了特异性强、灵敏度高、且PCR反应条件近似的5对引物，组成了本发明的试剂盒。该试剂盒一次扩增过程可以同时检测血液、组织、细胞等多种样本中6个TERT位点的突变情况。为了确保检测的准确性，发明人还在试剂盒中加入了突变的阴性质控品与阳性质控品，在检测样本时同时检测两种质控品，以监控检测过程的有效性。本发明还在此基础上提供了非诊断检测TERT基因多态性位点RS34094720、RS61748181、RS121918661、RS121918662、RS121918663、RS121918664突变的方法。
一方面，本发明提供了一种TERT基因组合突变位点的检测试剂盒，其包含引物对，所述引物对能扩增出含选自TERT基因多态性位点RS34094720、RS61748181、RS121918661、RS121918662、RS121918663、RS121918664中的一个或多个位点的片段。
进一步的，该试剂盒包含扩增RS34094720的引物对F1/R1、扩增RS61748181和RS121918661的引物对F2/R2、扩增RS121918662的引物对F3/R3、扩增RS121918663的引物对F4/R4、以及扩增RS121918664的引物对F5/R5，5对引物序列分别为：
F1：5'-CGGCCCTCCTTCCTACTCAG-3'（SEQ ID NO：1）；
R1：5'-CCGCACGCTCATCTTCCAC-3'（SEQ ID NO：2）；
F2：5'-AACACGGTGACCGACGCA-3'（SEQ ID NO：3）；
R2：5'-AAGTGCTTGGTCTCGGCGTA-3'（SEQ ID NO：4）；
F3：5'-TGTTCAGCGTGCTCAACTACGA-3'（SEQ ID NO：5）；
R3：5'-AGCCGTTGCGGTTCCTTCT-3'（SEQ ID NO：6）；
F4：5'-CGTCCTGATCGGAAGAAACAAG-3'（SEQ ID NO：7）；
R4：5'-CGAGCAAGTGCTAACAGGCAT-3'（SEQ ID NO：8）；
F5：5'-CTGTGCCACCAAGCATTCC-3'（SEQ ID NO：9）；
R5：5'-GGATGGTCTTGAAGTCTGAGGG-3'（SEQ ID NO：10）。
进一步的，该试剂盒还包括5条测序引物，其序列分别为：
RS34094720的测序引物F1：5'-CGGCCCTCCTTCCTACTCAG-3'（SEQ ID NO：1）；
RS61748181和RS121918661的测序引物F2：5'-AACACGGTGACCGACGCA-3'（SEQ IDNO：3）；
RS121918662的测序引物F3：5'-TGTTCAGCGTGCTCAACTACGA-3'（SEQ ID NO：5）
RS121918663的测序引物F4：5'-CGTCCTGATCGGAAGAAACAAG-3'（SEQ ID NO：7）；
RS121918664的测序引物R5：5'-GGATGGTCTTGAAGTCTGAGGG-3'（SEQ ID NO：10）。
进一步的，试剂盒中的5对引物PCR扩增时的反应条件同为：
94℃3分钟，1个循环；94℃30秒，63℃30秒，72℃50秒，30个循环；72℃5分钟，1个循环。
进一步的，还包括了阳性质控品和阴性质控品，阳性质控品由包含有上述5个位点的突变序列的质粒组成。阴性质控品由包含有上述5个位点的非突变序列的质粒组成。
另一方面，本发明提供了非诊断检测选自TERT基因多态性位点RS34094720、RS61748181、RS121918661、RS121918662、RS121918663和RS121918664中的一个或多个位点的突变的方法，步骤包括提取基因组DNA、使用引物对PCR扩增出包含位点的片段、对扩增产物测序。
其中非诊断检测方法可以是用于科研用途的方法，例如可以非诊断的检测来自各保藏机构的细胞株样本，或者医疗机构所收集的研究用细胞/血液样本，这些样本的样本主体已经去世/治愈/去向不明，所以显然检测其突变并不是为了检测样本主体的健康状态而是为了科研。
进一步的，该方法使用上述引物F1/R1、F2/R2、F3/R3、F4/R4和F5/R5在相同PCR条件下分别扩增出包含RS34094720、RS61748181、RS121918661、RS121918662、RS121918663和RS121918664的片段。
进一步的，该方法使用上述测序引物F1、F2、F3、F4和R5对扩增产物测序。
在另一个方面，本发明提供了引物组
F1：5'-CGGCCCTCCTTCCTACTCAG-3'（SEQ ID NO：1）；
R1：5'-CCGCACGCTCATCTTCCAC-3'（SEQ ID NO：2）；
F2：5'-AACACGGTGACCGACGCA-3'（SEQ ID NO：3）；
R2：5'-AAGTGCTTGGTCTCGGCGTA-3'（SEQ ID NO：4）；
F3：5'-TGTTCAGCGTGCTCAACTACGA-3'（SEQ ID NO：5）；
R3：5'-AGCCGTTGCGGTTCCTTCT-3'（SEQ ID NO：6）；
F4：5'-CGTCCTGATCGGAAGAAACAAG-3'（SEQ ID NO：7）；
R4：5'-CGAGCAAGTGCTAACAGGCAT-3'（SEQ ID NO：8）；
F5：5'-CTGTGCCACCAAGCATTCC-3'（SEQ ID NO：9）；
R5：5'-GGATGGTCTTGAAGTCTGAGGG-3'（SEQ ID NO：10），
在制备检测TERT基因组合突变位点的试剂中的应用。
本发明的试剂盒可以使用相同的PCR反应条件检测6个TERT基因关键突变位点，一方面可以对样本的关键突变位点进行全面的检测；另一方面，相同PCR反应条件大大减少了实验的工作量，一台96孔板仪器、一次PCR反应的时间可以扩增19个样本，每个样本可检测6个突变位点，即总共可检测114个突变位点，相比PCR反应条件不同的引物组，可将时间/仪器/人力的消耗减少至1/6。
附图简述
图1为使用本发明的试剂盒中的测序引物对RS34094720测序的示例图。
图2为使用本发明的试剂盒中的测序引物对RS61748181测序的示例图。
图3为使用本发明的试剂盒中的测序引物对RS121918661测序的示例图。
图4为使用本发明的试剂盒中的测序引物对RS121918662测序的示例图。
图5为使用本发明的试剂盒中的测序引物对RS121918663测序的示例图。
图6为使用本发明的试剂盒中的测序引物对RS121918664测序的示例图。
图7为使用本发明的五对引物扩增出的片段的电泳图。
具体实施方式
试剂盒的组成
一个本发明的试剂盒包括1管PCR buffer，5管不同标记的引物混合液，1管阳性质控品，1管阴性质控品，5管不同标记的测序引物。其中，PCR buffer为市售的成品，由Taq酶、dNTP、Mg2+等构成。5管引物混合液分别为：①F1+R1；②F2+R2；③F3+R3；④F4+R4；⑤F5+R5。阳性质控品由包含有上述5个位点的突变序列的质粒组成。阴性质控品由包含有上述5个位点的非突变序列的质粒组成。5管测序引物分别为：①F1；②F2；③F3；④F4；⑤R5。
检测过程
使用者可用市售的DNA提取试剂提取待检测样本中基因组DNA（gDNA），放于4～8℃待用（或放于-20℃暂存）。
按照需要检测样本数配置相应数量的PCR反应体系1-5，每份体系包括：PCRbuffer44ul，①-⑤的引物混合液4ul，混匀后分装入PCR反应管中。
PCR反应前，在每个反应管中加入提取的gDNA2ul。每批反应必须同时设置5个阳性质控管1-5、5个阴性质控管1-5和1个阴性对照，每管分别加入阳性质控品2ul，阴性质控品2ul，灭菌单蒸水2ul。
反应条件：94℃3分钟，1个循环;94℃30秒，63℃30秒，72℃50秒，30个循环；72℃5分钟，1个循环。反应结束后，每管PCR产物取3ul，用1%琼脂糖凝胶电泳检测。
检测结果需满足：阳性质控管1与阴性质控管1电泳条带在522bp左右，阳性质控管2与阴性质控管2电泳条带在620bp左右，阳性质控管3与阴性质控管3电泳条带在426bp左右，阳性质控管4与阴性质控管4电泳条带在736bp左右，阳性质控管5与阴性质控管5电泳条带在711bp左右，阴性对照管无肉眼可见条带。反应管1电泳条带在522bp左右，反应管2电泳条带在620bp左右，反应管3电泳条带在426bp左右，反应管4电泳条带在736bp左右，反应管5电泳条带在711bp左右，目的条带明亮、清晰，且无其他非特异条带。将满足条件的PCR产物及测序引物送测序公司测序。
以上述方法对50份来自志愿者的血液样本和来自保藏机构的血液样本进行了实际检测，结果证明，本发明的扩增引物完全可以在相同的PCR条件的特异性的扩增出含RS34094720、RS61748181、RS121918661、RS121918662、RS121918663和RS121918664的预期片段，使用本发明的测序引物也可以完成对扩增出的片段的测序。各样品的测序结果得到的序列均包含了RS34094720、RS61748181、RS121918661、RS121918662、RS121918663和RS121918664位点及其邻近序列，50份样品的检测均获得了成功。
其中检测出RS34094720T型2份，C型48份；RS61748181G型45份，A型5份；RS121918661G型0份，A型50份；、RS121918662G型3份，A型47份；、RS121918663A型6份，G型44份；RS121918664G型1份，A型49份。

Claims (6)

1.一种用于骨髓衰竭综合征诊断的TERT基因组合突变位点检测试剂盒，
其包含扩增RS34094720的引物对F1/R1、扩增RS61748181和RS121918661的引物对F2/R2、扩增RS121918662的引物对F3/R3、扩增RS121918663的引物对F4/R4、以及扩增RS121918664的引物对F5/R5，5对引物序列分别为：
F1：5'-CGGCCCTCCTTCCTACTCAG-3'(SEQ ID NO：1)；
R1：5'-CCGCACGCTCATCTTCCAC-3'(SEQ ID NO：2)；
F2：5'-AACACGGTGACCGACGCA-3'(SEQ ID NO：3)；
R2：5'-AAGTGCTTGGTCTCGGCGTA-3'(SEQ ID NO：4)；
F3：5'-TGTTCAGCGTGCTCAACTACGA-3'(SEQ ID NO：5)；
R3：5'-AGCCGTTGCGGTTCCTTCT-3'(SEQ ID NO：6)；
F4：5'-CGTCCTGATCGGAAGAAACAAG-3'(SEQ ID NO：7)；
R4：5'-CGAGCAAGTGCTAACAGGCAT-3'(SEQ ID NO：8)；
F5：5'-CTGTGCCACCAAGCATTCC-3'(SEQ ID NO：9)；
R5：5'-GGATGGTCTTGAAGTCTGAGGG-3'(SEQ ID NO：10)；
上述试剂盒中的5对引物PCR扩增时的反应条件同为：94℃3分钟，1个循环；94℃30秒，63℃30秒，72℃50秒，30个循环；72℃5分钟，1个循环。
2.权利要求1所述的试剂盒，还包括5条测序引物，其序列分别为：
RS34094720的测序引物F1：5'-CGGCCCTCCTTCCTACTCAG-3'(SEQ ID NO：1)；
RS61748181和RS121918661的测序引物F2：5'-AACACGGTGACCGACGCA-3'(SEQ ID NO：3)；
RS121918662的测序引物F3：5'-TGTTCAGCGTGCTCAACTACGA-3'(SEQ ID NO：5)
RS121918663的测序引物F4：5'-CGTCCTGATCGGAAGAAACAAG-3'(SEQ ID NO：7)；
RS121918664的测序引物R5：5'-GGATGGTCTTGAAGTCTGAGGG-3'(SEQ ID NO：10)。
3.非诊断检测TERT基因多态性位点RS34094720、RS61748181、RS121918661、RS121918662、RS121918663和RS121918664位点的突变的方法，步骤包括提取基因组DNA、使用引物对PCR扩增出包含位点的片段、和对扩增产物测序，其中使用引物对PCR扩增出包含位点的片段所使用的引物对为：
F1：5'-CGGCCCTCCTTCCTACTCAG-3'(SEQ ID NO：1)；
R1：5'-CCGCACGCTCATCTTCCAC-3'(SEQ ID NO：2)；
F2：5'-AACACGGTGACCGACGCA-3'(SEQ ID NO：3)；
R2：5'-AAGTGCTTGGTCTCGGCGTA-3'(SEQ ID NO：4)；
F3：5'-TGTTCAGCGTGCTCAACTACGA-3'(SEQ ID NO：5)；
R3：5'-AGCCGTTGCGGTTCCTTCT-3'(SEQ ID NO：6)；
F4：5'-CGTCCTGATCGGAAGAAACAAG-3'(SEQ ID NO：7)；
R4：5'-CGAGCAAGTGCTAACAGGCAT-3'(SEQ ID NO：8)；
F5：5'-CTGTGCCACCAAGCATTCC-3'(SEQ ID NO：9)；
R5：5'-GGATGGTCTTGAAGTCTGAGGG-3'(SEQ ID NO：10)。
4.权利要求3的方法，其中5对引物PCR扩增时的反应条件同为：94℃3分钟，1个循环；94℃30秒，63℃30秒，72℃50秒，30个循环；72℃5分钟，1个循环。
5.权利要求4的方法，其中对扩增产物测序所使用的测序引物为：
RS34094720的测序引物F1：5'-CGGCCCTCCTTCCTACTCAG-3'(SEQ ID NO：1)；
RS61748181和RS121918661的测序引物F2：5'-AACACGGTGACCGACGCA-3'(SEQ ID NO：3)；
RS121918662的测序引物F3：5'-TGTTCAGCGTGCTCAACTACGA-3'(SEQ ID NO：5)
RS121918663的测序引物F4：5'-CGTCCTGATCGGAAGAAACAAG-3'(SEQ ID NO：7)；
RS121918664的测序引物R5：5'-GGATGGTCTTGAAGTCTGAGGG-3'(SEQ ID NO：10)。
6.引物组在制备检测TERT基因基因多态性位点RS34094720、RS61748181、RS121918661、RS121918662、RS121918663和RS121918664突变以诊断骨髓衰竭综合征的试剂中的应用，所述引物组为：
F1：5'-CGGCCCTCCTTCCTACTCAG-3'(SEQ ID NO：1)；
R1：5'-CCGCACGCTCATCTTCCAC-3'(SEQ ID NO：2)；
F2：5'-AACACGGTGACCGACGCA-3'(SEQ ID NO：3)；
R2：5'-AAGTGCTTGGTCTCGGCGTA-3'(SEQ ID NO：4)；
F3：5'-TGTTCAGCGTGCTCAACTACGA-3'(SEQ ID NO：5)；
R3：5'-AGCCGTTGCGGTTCCTTCT-3'(SEQ ID NO：6)；
F4：5'-CGTCCTGATCGGAAGAAACAAG-3'(SEQ ID NO：7)；
R4：5'-CGAGCAAGTGCTAACAGGCAT-3'(SEQ ID NO：8)；
F5：5'-CTGTGCCACCAAGCATTCC-3'(SEQ ID NO：9)；
R5：5'-GGATGGTCTTGAAGTCTGAGGG-3'(SEQ ID NO：10)。
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