CN106399553A - 一种基于多重pcr的人线粒体全基因组高通量测序方法 - Google Patents
一种基于多重pcr的人线粒体全基因组高通量测序方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种用于人类线粒体全基因组测序的引物集，以及利用所述引物集的测序方法。本发明还提供了包含所述引物集的扩增体系和试剂盒。本发明的测序方法简单、快捷，对样本质量要求不高，测序结果准确可靠，可以实现对线粒体全基因组的深度测序，用于线粒体中低频突变的检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域，更具体地涉及人线粒体全基因组高通量测序方法。
背景技术
线粒体是真核细胞中重要的细胞器，在一些生物进程中有着至关重要的作用，例如氧化应激、代谢、炎症、自噬和凋亡等。尽管线粒体中大多数蛋白质都是由核DNA编码的，但是线粒体DNA(mtDNA)编码的蛋白质也发挥着至关重要的作用。
在人类的每一个细胞中，有1000到10000个线粒体存在；在每一个线粒体中又有2-10个线粒体DNA(mtDNA)拷贝。人的线粒体DNA是一个双链闭合环状DNA，全长16569bp。它含有编码区和非编码区，其中编码区编码13个蛋白质、22个tRNA和2个rRNA，非编码区有一个复制起始区和一些转录调节因子。
线粒体DNA有许多特点，例如多拷贝，没有内含子，母系遗传，进化率高，高度异质性，没有基因重组等等。线粒体DNA常用于研究遗传进化，也用来辅助法医学鉴定。线粒体功能异常会导致一系列疾病，例如帕金森综合症、糖尿病、阿尔兹海默综合征，也有一些研究发现线粒体DNA突变和一些癌症相关。
到目前为止，已有不少方法可以用来对线粒体DNA进行测序。传统的富集线粒体DNA的方法是氯化铯密度梯度离心法，该方法可以获得比较纯的线粒体DNA，但该方法费时费力，所需的样本量非常大，且对样本的要求较高。还有其他一些方法比如杂交捕获、长片段PCR，杂交捕获富集线粒体DNA的方法价格昂贵，操作繁琐，而长片段PCR方法操作简单，但对样本完整性要求比较高。同时也有一些利用多重PCR进行线粒体测序的方法，但已有的方法在较高的且各位点较均一的测序深度下，不能保证线粒体全覆盖。例如LakshmiChaitanya,etc建立的一种利用多重PCR对线粒体DNA进行测序的方法，他们仅在50×的时候能获得100％mtDNA覆盖率。
为了检测线粒体中的低频突变，需要进行深度测序，即在保证序列覆盖度的同时，增加测序深度。因此，本领域迫切需要开发能够深度测序的线粒体DNA测序方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速、简单、经济的线粒体DNA测序方法。该方法是以多重PCR为基础，富集扩增线粒体DNA，然后对其进行二代测序。
在本发明的第一方面，提供了一种用于线粒体全基因组测序的引物集，所述引物集包括引物子集p1，引物子集p2，引物子集p3和引物子集p4，其中所述各引物子集中含有的引物是不同的，并且所述4个引物子集的全部扩增产物完全覆盖线粒体DNA；
并且，所述的引物子集p4包括序列如SEQ ID NO.:1-8所示的引物。
在另一优选例中，所述线粒体为人线粒体。
在另一优选例中，所述的引物子集p1，引物子集p2和引物子集p3中的每一个引物子集各自地包括20-70个引物，较佳地30-60个引物。
在另一优选例中，引物子集p1的扩增产物互不重叠(任二个扩增产物互不重叠)。
在另一优选例中，引物子集p2的扩增产物互不重叠。
在另一优选例中，引物子集p3的扩增产物互不重叠。
在另一优选例中，所述引物集的扩增产物之间有重叠区域。
在另一优选例中，用某一引物子集产生的任一个扩增产物与其他子集的一个或多个扩增产物存在重叠区。
在另一优选例中，用引物子集p1产生的任一个扩增产物与其他子集(即引物子集p2，引物子集p3和引物子集p4)的一个或多个扩增产物存在重叠区。
在另一优选例中，用引物子集p2产生的任一个扩增产物与其他子集(即引物子集p1，引物子集p3和引物子集p4)的一个或多个扩增产物存在重叠区。
在另一优选例中，用引物子集p3产生的任一个扩增产物与其他子集(即引物子集p2，引物子集p1和引物子集p4)的一个或多个扩增产物存在重叠区。
在另一优选例中，用引物子集p4产生的任一个扩增产物与其他子集(即引物子集p2，引物子集p3和引物子集p1)的一个或多个扩增产物存在重叠区。
在另一优选例中，所述引物子集p1、引物子集p2和引物子集p3的扩增产物覆盖引物子集p4的扩增产物未覆盖的区域。
在另一优选例中，所述引物集中包含的引物所对应的扩增产物的长度为200-400bp。
在另一优选例中，所述的引物子集p1包括序列如SEQ ID NO.:9-52所示的引物。
在另一优选例中，所述的引物子集p2包括序列如SEQ ID NO.:53-98所示的引物。
在另一优选例中，所述的引物子集p3包括序列如SEQ ID NO.:99-146所示的引物。
在另一优选例中，所述的引物集用于人线粒体全基因组高通量测序。
在另一优选例中，所述的引物集用于亚洲人群的线粒体全基因组高通量测序。
在另一优选例中，所述的测序为深度测序。
在另一优选例中，所述的深度测序是指测序深度≥1000倍，较佳地≥3000倍，更佳地≥6000倍。
在本发明的第二方面，提供了一种PCR扩增体系，所述的扩增体系包括：用于扩增的缓冲体系以及本发明第一方面所述的引物集；
其中，所述缓冲体系包括第一缓冲体系、第二缓冲体系、第三缓冲体系、第四缓冲体系；
所述的引物集包括引物子集p1、引物子集p2、引物子集p3和引物子集p4；
并且引物子集p1位于所述第一缓冲体系中，引物子集p2位于所述第二缓冲体系中,引物子集p3位于所述第三缓冲体系中,而引物子集p4位于所述第四缓冲体系中。
在本发明的第三方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括一个或多个容器，和位于所述容器中的本发明第一方面所述的引物集。
在另一优选例中，所述的试剂盒用于人线粒体全基因组高通量测序。
在另一优选例中，所述的测序为深度测序。
在另一优选例中，所述的试剂盒中包括第一容器，和位于所述第一容器中的引物子集p1。
在另一优选例中，所述的试剂盒中包括第二容器，和位于所述第二容器中的引物子集p2。
在另一优选例中，所述的试剂盒中包括第三容器，和位于所述第三容器中的引物子集p3。
在另一优选例中，所述的试剂盒中包括第四容器，和位于所述第四容器中的引物子集p4。
在另一优选例中，所述的引物子集p1中，序列如SEQ ID NO.:9、10所示的引物的浓度C1与序列如SEQ ID NO.:11-52所示的引物的浓度C2之比C1/C2为1.5。
在另一优选例中，所述的引物子集p2中，序列如SEQ ID NO.:53、54、67-70、75-82、87、88、95、96所示的引物的浓度C3与序列如SEQ ID NO.:55-66、71-74、83-86、89-94、97、98所示的引物的浓度C4之比C3/C4为1.5。
在另一优选例中，所述的引物子集p3中，序列如SEQ ID NO.:103、104、115-120、123-126、131-134、137、138、141、142所示的引物的浓度C5与序列如SEQ ID NO.:99-102、105-114、121、122、127-130、135、136、139、140、143-146所示的引物的浓度C6之比C5/C6为1.5。
在另一优选例中，所述的浓度C1、C3、C5为40nM。
在另一优选例中，所述的引物子集p4中引物的浓度为50nM。
在另一优选例中，所述的试剂盒还含有用于扩增的试剂。
在另一优选例中，所述用于扩增的试剂包括缓冲剂、dNTP、和扩增酶。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括使用说明书。
在本发明的第四方面，提供了一种人线粒体全基因组高通量测序的方法，所述方法包括步骤：
(a)提供一待测的基因组DNA样品；
(b)利用本发明第一方面所述的引物集，对待测的基因组DNA样品进行PCR扩增，从而获得含扩增产物的混合物；
(c)对得到的扩增产物进行测序分析，从而完成人线粒体全基因组高通量测序。
在另一优选例中，在步骤(b)中，分别利用引物子集p1，引物子集p2，引物子集p3和引物子集p4，对待测的基因组DNA样品进行PCR扩增，分别获得第一扩增产物，第二扩增产物，第三扩增产物，第四扩增产物。
在另一优选例中，在步骤(b)中，将第一扩增产物，第二扩增产物，第三扩增产物，第四扩增产物等体积混合，从而获得所述的扩增产物的总混合物。
在另一优选例中，所述的PCR为多重PCR。
在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗性方法。
在另一优选例中，所述的方法是体外方法。
在另一优选例中，在步骤(a)中，所述的待测DNA样品提取自选自下组的样本：血液、毛发、和唾液。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了本发明人线粒体测序方法的引物分布情况。
图2显示了每一个样本测序得到的碱基数。
图3显示了每一个扩增子的平均测序深度。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现一种特异性扩增人线粒体的引物集，以及利用所述引物集的测序方法。实验表明，利用本发明的引物集进行测序，在测序深度为6000×时，只有两样样本的序列覆盖度为99.9％，其余均为100％。本发明的方法简单、快捷，对样本质量要求不高，测序结果准确可靠，可以实现对线粒体全基因组的深度测序，用于线粒体中低频突变的检测。
本发明的方法
本发明提供了一种基于多重PCR的人类线粒体全基因组高通量测序方法，本发明共设计了73对PCR引物，PCR扩增产物长度大多为250bp左右，相邻引物的扩增产物之间都有重叠区域，确保所有的扩增产物能够完全覆盖线粒体DNA(见图1)。本发明的方法将73对PCR引物分成四组，详见图1，其中蓝色为第一组引物(Set1，SEQ ID NO.:9-52)，粉色为第二组引物(Set2，SEQ ID NO.:53-98)，绿色为第三组引物(Set3，SEQ ID NO.:99-146)，橙色为第四组引物(Set4，SEQ ID NO.:1-8)，并适当调整每对引物的浓度，以保证个样本的测序深度基本一致。具体引物信息见表1.
表1PCR引物信息
本发明采用73对引物对线粒体DNA进行多重PCR扩增建库，然后用illumina HiSeqX 10仪器进行上机测序。整个建库过程简单、快捷，对样本质量要求不高，且所需的样本量较少，得到的测序结果准确可靠。本发明的方法可以保证序列覆盖度的同时，增加测序深度，进行深度测序，用于线粒体中低频突变的检测。
线粒体突变
线粒体是细胞中提供能量的重要细胞器，在生物体能量转换和新陈代谢中处于核心地位。人体细胞中线粒体DNA(脱氧核糖核酸)的突变或缺失会引起氧化磷酸化和能量供应的异常，并进而引起近150种人类疾病的发生，比如心血管疾病、糖尿病、耳聋、肿瘤、神经退行性疾病及衰老等。
线粒体DNA的变异包括大片段的插入或缺失，小片段的插入或缺失，点突变。这些变异既可以出现在编码区，也可以出现在非编码区。体内活性氧(ROS,reactive oxygenspecies)的异常增多是引起线粒体DNA碱基变异或点突变的主要原因。线粒体DNA上的某些区域由于受到活性氧引起的自由基的持续攻击，产生点突变的频率明显高于其它区域，则称之为突变热点。比如亮氨酸转运RNA基因的点突变就是线粒体DNA的一个病原学突变热点。研究表明，一些编码基因的点突变与某些特定的疾病有明显的相关性。比如，在色素性视网膜炎、一些神经疾病和Leigh综合征中，均检测到ATP合成酶中的亚基6上的点突变。并且，这些疾病的严重程度与该基因的点突变频率密切相关。疾病发生早期线粒体DNA的低频突变已经发生，但目前尚无有效的高通量检测方法。
线粒体基因组与核基因组在遗传上的重要不同是：在一个细胞中，核基因组只有两个拷贝，一个来自父亲，一个来自母亲；而线粒体基因组几乎完全来自母亲，并且有上千个拷贝(通常一个细胞有1000-2000个线粒体，一个线粒体有2-10个线粒体DNA拷贝)。这种拷贝数的不同也导致了在DNA突变检测上的策略不同。对于基因组上某一位置的点突变只可能出现三种情况：均无突变，有一个拷贝发生突变，或者两个拷贝均发生突变。而对于线粒体DNA来说，情况就要复杂的多，从一个线粒体DNA发生突变，到上千个线粒体DNA均发生突变，其中的突变频率可以是0.1％～100％中的任何一个比例。而要精确检测到这种突变频率的变化，特别是低频率(0.1％～10％)的点突变，用传统的桑格测序(Sangersequencing)是无法进行精确测定的。
从理论上讲，要检测较低频率的突变，比如说0.4％，则至少需要250倍的测序深度，加上每个点突变至少被检测到两次的标准以提高准确性，则至少需要500倍的测序深度，如果需要进一步提高准确性，则需进一步提高测序深度。
本发明的测序方法可以在测序深度设为6000×时，保持极好的序列覆盖度，使得检测线粒体DNA的低频突变成为可能。
二代测序技术
下一代测序技术(Next Generation Sequencing,NGS，也可称为“二代测序技术”)是近年来新发展的一项基因测序技术，核心特征是大规模平行测序，可同时对成千上万条短核苷酸片段进行平行测序。目前下一代测序技术主要应用于全基因组测序，全外显子测序，全转录组测序和针对特定基因的靶向测序。前三者多用于科学研究，后者多用于临床分子诊断。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明的方法可以进行深度测序，用于线粒体中低频突变的检测。
(b)本发明的方法操作简单，实验结果可靠，灵敏度高。
(c)本发明的方法需要的样本量较少，且对样本质量要求较低，可用于降解DNA的测序。
(d)本发明的方法所设计的引物是根据亚洲人的序列进行修改过的，所以该方法可以特异性的对亚洲人群进行线粒体基因组测序。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
通用方法
PCR反应体系：总体积6μL，其中Robust HotStartReadyMiX3μL，DNA模板1μL(至少10ngDNA)，引物2μL(每对引物在体系中的终浓度为50-70nM，见表1)。
扩增条件：95℃预变性2分钟，95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，45个循环后，72℃延伸5分，最后4℃终止反应。
用酶切方法纯化PCR产物，纯化后的PCR产物混合，然后连接后续二代测序平台所需的接头，将连有不同接头的样本等量混合。混合后的样本用磁珠纯化，并进行割胶回收。
文库质检合格后，用illumina HiSeq X 10仪器进行上机测序。每个样本产生约300M的数据量。
将测序得到的数据与人类线粒体参考序列(修正后的剑桥序列NC_012920.1)进行比对，即可得到样本线粒体的信息。
实施例1
人线粒体全基因组测序
1、人类全基因组DNA提取：随机选取96例正常人血液样本，用QIAamp DNA MiniKit(Qiagen,Germany)试剂盒提取DNA。
2、引物设计：共设计了73对PCR引物，PCR扩增产物长度大多为250bp左右，相邻引物的扩增产物之间都有重叠区域，确保所有的扩增产物能够完全覆盖线粒体DNA。将73对PCR引物优化改进后，分成四组Set1、Set2、Set3、Set4，进行多重PCR扩增。(见表1)
3、扩增：
PCR反应体系：总体积6μL，其中KAPA2GTM Robust HotStartReadyMiX(KAPABIOSYSTEMS,USA)3μL，DNA模板1μL(至少10ngDNA)，引物2μL(每对引物在体系中的终浓度为50-70nM，见表1)。
扩增条件：95℃预变性2分钟，95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，45个循环后，72℃延伸5分，最后4℃终止反应。
4、将同一模板的四组扩增产物等量混合，用ExonucleaseⅠ,E.coli(New EnglandBiolabs,USA)和Shrimp Alkaline Phosphatase，SAP(Affymetrix,USA)进行处理，将剩余的单链引物、外来的单链DNA以及残留的dNTPs除去。
5、将(4)中处理好的产物稀释100倍，连接后续二代测序平台所需的接头，将连有不同接头的样本等量混合。
6、用磁珠AgencourtAMPureXP(Beckman Coulter,USA)纯化(5)中产物。
7、磁珠纯化后的产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN,Germany)试剂盒，切胶回收300bp-500bp处条带。
8、检测上述构建的文库片段大小及浓度，文库质检合格后，用illumina HiSeq X10仪器进行上机测序，每个样本产生约300M的数据量。
9、测序结果分析：96个样本共得到28.2GB的数据，所有样本测到的碱基数约为154.39Mbp—574.24Mbp，平均值为304.16Mbp。每个样本的碱基数如图2所示。将测序得到的文件根据接头进行分类，平均每个样本测到的总reads为2.11×106，然后将测到的序列与人类线粒体参考序列(修正后的剑桥序列NC_012920.1)进行比对。比对结果发现，能够匹配到线粒体参考序列上的reads数为2.09×106(99.19％)。当测序深度设为100×时，所有样本的序列覆盖度都达到了100％；当测序深度设为6000×时，只有两样样本的序列覆盖度为99.9％，其余仍为100％(见表2)。其中，每个扩增子的平均测序深度约为5,806×—62,910×，大多数扩增子的测序深度为20,000×，每个扩增子的平均测序深度如图3所示。
表2
对比实验
对比实验的实验方法与实施例1基本相同，区别在于对比试验将表1中包含的73对引物分成了三组，其中，第一组包括序列如SEQ ID NO.:1、2、7-52所示的引物，第二组包括序列如SEQ ID NO.:3、4、53-98所示的引物，第三组包括序列如SEQ ID NO.:5、6、99-146所示的引物。
测序结果发现序列如SEQ ID NO.:1-8所示的引物对应的片段没有扩增成功。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海添音生物科技有限公司
<120> 一种基于多重PCR的人线粒体全基因组高通量测序方法
<130> P2016-1390
<160> 146
<170> PatentIn version 3.5
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tacggtagca gagacttggt ctggacctgt gggtttgtta ggtact 46
<210> 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
acactgacga catggttcta caccaacctc ctactcctca ttgt 44
<210> 20
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tacggtagca gagacttggt ctaggcctag gttgaggttg ac 42
<210> 21
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
acactgacga catggttcta cacgaacccc cttcgacctt g 41
<210> 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tacggtagca gagacttggt ctaggaggtg tatgagttgg tcg 43
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<211> 44
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
acactgacga catggttcta caacctctac ttctacctac gcct 44
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<211> 43
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tacggtagca gagacttggt cttggctgat ttgcgttcag ttg 43
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<211> 42
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acactgacga catggttcta cacctcctta ttcgagccga gc 42
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<400> 97
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<400> 98
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 101
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
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<210> 102
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
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<210> 106
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
acactgacga catggttcta caaaggttcg tttgttcaac gatt 44
<210> 108
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
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<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
acactgacga catggttcta cacctttaac ctctccaccc ttatca 46
<210> 110
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
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<210> 111
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
acactgacga catggttcta cacgattccg ctacgaccaa ct 42
<210> 112
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
tacggtagca gagacttggt ctggtatggg cccgatagct ta 42
<210> 113
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
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<210> 114
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
tacggtagca gagacttggt ctttttgtca tgtgagaaga agcag 45
<210> 115
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
acactgacga catggttcta cataaactcc agcaccacga cc 42
<210> 116
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
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<211> 42
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
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<210> 119
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
acactgacga catggttcta cacacagcag ttctacttct cct 43
<210> 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
tacggtagca gagacttggt cttgtgctca cacgataaac cct 43
<210> 121
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
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<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
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<210> 123
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 123
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<211> 42
<212> DNA
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 125
acactgacga catggttcta cacaaccgac taatcaccac cca 43
<210> 126
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 126
tacggtagca gagacttggt ctgggtgtag gtgtgccttg tg 42
<210> 127
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 127
acactgacga catggttcta caccactcca taacgctcct ca 42
<210> 128
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 128
tacggtagca gagacttggt ctgatttagc ggggtgatgc ct 42
<210> 129
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 129
acactgacga catggttcta caccaatgct aaaactaatc gtccca 46
<210> 130
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 130
tacggtagca gagacttggt cttggttcac tggataagtg gcg 43
<210> 131
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 131
acactgacga catggttcta cacccatcgc tgggtcaata gt 42
<210> 132
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 132
tacggtagca gagacttggt ctgtaagtcc gtgggcgatt at 42
<210> 133
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 133
acactgacga catggttcta cacaacagag gcttacgacc cc 42
<210> 134
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 134
tacggtagca gagacttggt ctactgataa taaaggtgga tgcgac 46
<210> 135
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 135
acactgacga catggttcta cacgatatcg gtttcatcct cgcct 45
<210> 136
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 136
tacggtagca gagacttggt ctctattttc tgctaggggg tggaa 45
<210> 137
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 137
acactgacga catggttcta caaacaggtc aacctcgctt cc 42
<210> 138
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 138
tacggtagca gagacttggt ctagaaataa aatgtgcata gtgggga 47
<210> 139
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 139
acactgacga catggttcta caccctgacc cctctccttc at 42
<210> 140
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 140
tacggtagca gagacttggt ctggtgtggt cgggtgtgtt at 42
<210> 141
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 141
acactgacga catggttcta cacctcttcc tacacatcgg gc 42
<210> 142
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 142
tacggtagca gagacttggt ctaagaatcg tgtgagggtg gg 42
<210> 143
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 143
acactgacga catggttcta caatttcgcc cactaagcca atc 43
<210> 144
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 144
tacggtagca gagacttggt ctgggtgcta atggtggagt taaag 45
<210> 145
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 145
acactgacga catggttcta cagagtgcta ctctcctcgc tc 42
<210> 146
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 146
tacggtagca gagacttggt ctagatactg cgacataggg tgc 43
Claims (10)
1.一种用于线粒体全基因组测序的引物集，其特征在于，所述引物集包括引物子集p1，引物子集p2，引物子集p3和引物子集p4，其中所述各引物子集中含有的引物是不同的，并且所述4个引物子集的全部扩增产物完全覆盖线粒体DNA；
并且，所述的引物子集p4包括序列如SEQ ID NO.:1-8所示的引物。
2.如权利要求1所述的引物集，其特征在于，所述的线粒体为人线粒体。
3.如权利要求1所述的引物集，其特征在于，所述的引物子集p1，引物子集p2和引物子集p3中的每一个引物子集各自地包括20-70个引物，较佳地30-60个引物。
4.如权利要求1所述的引物集，其特征在于，用某一引物子集产生的任一个扩增产物与其他子集的一个或多个扩增产物存在重叠区。
5.如权利要求1所述的引物集，其特征在于，所述的测序为深度测序。
6.如权利要求5所述的引物集，其特征在于，所述的深度测序是指测序深度≥1000倍，较佳地≥3000倍，更佳地≥6000倍。
7.一种PCR扩增体系，其特征在于，所述的扩增体系包括：用于扩增的缓冲体系以及权利要求1所述的引物集；
其中，所述缓冲体系包括第一缓冲体系、第二缓冲体系、第三缓冲体系、第四缓冲体系；
所述的引物集包括引物子集p1、引物子集p2、引物子集p3和引物子集p4；
并且引物子集p1位于所述第一缓冲体系中，引物子集p2位于所述第二缓冲体系中,引物子集p3位于所述第三缓冲体系中,而引物子集p4位于所述第四缓冲体系中。
8.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括一个或多个容器，和位于所述容器中的权利要求1所述的引物集。
9.一种人线粒体全基因组高通量测序的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(a)提供一待测的基因组DNA样品；
(b)利用权利要求1所述的引物集，对待测的基因组DNA样品进行PCR扩增，从而获得含扩增产物的混合物；
(c)对得到的扩增产物进行测序分析，从而完成人线粒体全基因组高通量测序。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的方法是非诊断和非治疗性方法。
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- 2016-11-09 CN CN201610985447.8A patent/CN106399553B/zh active Active
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