CN114787385A - 用于检测核酸修饰的方法和系统 - Google Patents

Abstract

本公开的方面涉及用于修饰和检测甲基化核苷酸的方法。实施方案涉及RNA甲基化的检测。公开用于全转录组检测mRNA中的N⁶‑甲基腺苷的方法和组合物。在一些情况下，描述修饰甲基化含氮碱基的方法。还公开可用于RNA甲基化检测的酶和其他分子。

Description

用于检测核酸修饰的方法和系统

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年10月10日提交的美国临时专利申请第62/913475号的优先权权益，将其全部内容通过引用并入本文。

政府权利声明

本发明是在美国国立卫生研究院授予的HG008935政府支持下完成的。美国政府对本发明享有一定的权利。

背景技术

I.发明领域

本发明一般地涉及分子生物学领域。某些方面涉及用于检测甲基化核酸分子的方法和组合物。

II.背景

核酸具有广泛的化学修饰。许多这些修饰用于对各种细胞和生物过程施加重要影响。RNA修饰最近已成为基因表达程序的关键转录后调节因子。它们影响多种真核生物过程，并且许多这些修饰的正确沉积是正常发育所必需的¹。RNA修饰是调节RNA代谢的组成部分。最丰富的内部mRNA修饰是N⁶-甲基腺苷(m⁶A)，它几乎影响RNA代谢的所有方面，包括剪接、翻译和降解²。然而，m⁶A在不同发育过程和生物学背景中的机制作用仍然难以捉摸。

需要新的工具可描述m⁶A在核苷酸分辨率下的转录组范围分布及每个修饰位点的关键修饰比例信息，以理解修饰的转录物和位点的生物学相关性和影响。本文认识到需要用于检测核酸修饰的准确、高通量的方法和组合物，包括RNA修饰例如N⁶-甲基腺苷。

发明内容

本公开满足本领域对用于检测核酸修饰例如N⁶-甲基腺苷的方法和组合物的需要。因此，本公开的某些方面涉及用于检测mRNA中的N⁶-甲基腺苷的方法。实施方案涉及用于修饰在氮原子处甲基化的含氮碱基的方法。例如，某些实施方案涉及使用二甲基转移酶将官能团连接至腺苷碱基上的甲基化氮的方法。可用于所公开方法的示例性组合物包括S-腺苷-1-甲硫氨酸(SAM)类似物。其他实施方案涉及用于N⁶-甲基腺苷检测的天然或工程酶。

在一些实施方案中，本文公开用于检测甲基化核苷酸的方法、用于分析甲基化核苷酸的方法、用于分析核酸分子的方法、用于分析信使核糖核酸分子的方法、用于分析脱氧核糖核酸分子的方法、用于修饰含氮碱基的方法、用于修饰甲基化含氮碱基的方法、用于将官能团连接至甲基化核苷酸的方法、用于转录组分析的方法、用于分析转录组的RNA甲基化的方法、用于将核苷酸识别为甲基化的方法、用于将腺苷识别为在N⁶氮原子处甲基化的方法、用于甲基化组分析的方法、用于检测个体中与核酸甲基化相关病症的方法、用于产生工程化酶的方法和用于甲基转移酶定向进化的方法。预想可以从本公开的实施方案中排除这些实施方案中的任意一个或多于一个。

本公开的方法可以包括以下步骤中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个或多于15个，其可以以任意顺序执行并且在任意特定的方法实施方案中重复：获得核酸分子；从生物样品中获得核酸分子；从对象获得含有核酸的生物样品；分离核酸分子；纯化核酸分子；获得含有待修饰核酸的阵列或微阵列；使核酸分子变性；剪切或切割核酸分子；杂交核酸分子；使核酸片段化；将核酸分子与酶一起孵育；将核酸分子与连接酶一起孵育；将核酸分子与核酸酶一起孵育；将核酸与甲基转移酶一起孵育；将核酸分子与双原子卤素分子一起孵育；将核酸分子与I₂一起孵育，将核酸分子与限制性内切酶一起孵育；将一个或多于一个官能团连接至核酸；将一个或多于一个官能团连接至甲基化核苷酸；将一个或多于一个官能团连接至在氮原子处甲基化的含氮碱基；对RNA分子进行逆转录；扩增核酸分子，对核酸分子进行测序，基于序列识别核酸分子中的甲基化核苷酸；从RNA分子产生互补核酸分子。预想这些步骤中的任意一个或多于一个可以排除在本公开的方法之外。

预期一些实施方案将涉及在体外完成的步骤，例如由人或者控制或使用机器执行一个或多于一个步骤的人进行。

在其他方法中，可能存在的步骤包括但不限于，获得关于核酸样品中一种或多于一种腺苷修饰的信息(定性和/或定量)；安排确定、识别和/或映射核酸样品中的腺苷修饰的测定；报告关于核酸样品中一种或多于一种腺苷修饰的信息(定性和/或定量)；将此信息与对照或比较样品中不同腺苷修饰的信息进行比较。除非另有说明，否则样品上下文中的术语“确定”、“分析”、“测定”和“评价”是指将此样品化学或物理转化，以收集关于样品的定性和/或定量数据。此外，术语“映射”意指识别特定核苷酸在核酸序列内的位置。

本公开的组合物或试剂盒可以包括以下中的一种或多于一种：核酸、天然酶、工程化酶、聚合酶、连接酶、逆转录酶、甲基转移酶、二甲基转移酶、RNA去甲基酶、S-腺苷-l-甲硫氨酸类似物、引物和脱氧核苷三磷酸(dNTP)。任意一种或多于一种组分可以从本公开的组合物或试剂盒中排除。

如本文所用，“S-腺苷-1-甲硫氨酸类似物”或“SAM类似物”描述衍生自或产生自S-腺苷-1-甲硫氨酸的分子，例如通过去除、添加或置换一个或多于一个化学部分衍生或产生，或者是S-腺苷-l-甲硫氨酸的化学或结构类似物的分子。SAM类似物可以是除了一个或多于一个化学部分之外在结构上与S-腺苷-1-甲硫氨酸相同的分子。例如，SAM类似物可以在结构上与S-腺苷-l-甲硫氨酸相同，但对于与硫原子连接的甲基，其反而是不同的化学部分(例如，诸如烯丙基的官能团)。本文描述各种SAM衍生物，包括例如烯丙基-SAM。

在一些实施方案中，通过所公开的方法分析或修饰的核酸分子可以是DNA、RNA或两者的组合。核酸可以是重组的、基因组的或合成的。在另外的实施方案中，方法涉及分离和/或纯化的核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子是片段化的。在一些实施方案中，核酸分子是天然片段。例如，天然片段是指作为片段存在于自然界中的核酸分子，例如无细胞DNA和无细胞RNA。在一些实施方案中，核酸可以是从细胞或生物样品中分离的。某些实施方案涉及从真核、哺乳动物或人类细胞中分离核酸。在一些情况下，核酸与非核酸分开或分离。在一些实施方案中，核酸分子是真核的；在一些情况下，核酸是哺乳动物的，可能是人类的。在这些实施方案中，核酸分子分离自人类细胞和/或具有将其识别为人类的序列。在特定实施方案中，预想核酸分子不是原核核酸，例如细菌核酸分子。在一些情况下，通过本领域技术人员已知的任意技术分离核酸，包括但不限于使用凝胶、柱、基质或过滤器来分离核酸。在一些实施方案中，凝胶是聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶。

在一些实施方案中，本文公开用于检测核酸分子的甲基化核苷酸的方法，其包括(a)在足以将官能团连接至甲基化核苷酸的条件下，将核酸分子与甲基转移酶和包含官能团的S-腺苷-1-甲硫氨酸(SAM)类似物一起孵育；(b)使核酸分子经受足以产生互补核酸分子的条件，该互补核酸分子包含在对应于甲基化核苷酸的残基处的突变；和(c)对互补核酸分子进行测序。在一些实施方案中，甲基化核苷酸是甲基化腺苷。

在一些实施方案中，本文公开用于修饰在氮原子处甲基化的含氮碱基的方法，其包括：(a)提供甲基转移酶和包含官能团的S-腺苷-l-甲硫氨酸(SAM)类似物；和(b)使甲基转移酶和SAM类似物经受足以将官能团连接至氮原子的条件。在一些实施方案中，含氮碱基是核苷的含氮碱基。在一些实施方案中，含氮碱基是核苷酸的含氮碱基。在一些实施方案中，核苷酸是核糖核酸(RNA)的核苷酸。在一些实施方案中，核苷酸是甲基化腺苷。在一些实施方案中，核苷酸是N⁶-甲基腺苷。

在一些实施方案中，本文公开用于检测核糖核酸中甲基化核苷酸的方法，其包括：(a)将官能团连接至核苷酸上的氮原子；(b)从核糖核酸产生互补核酸，所述互补核酸包含在对应于核苷酸的残基处的突变；和(c)对互补核酸进行测序。在一些实施方案中，核苷酸是甲基化腺苷。在一些实施方案中，核苷酸是N⁶-甲基腺苷。在一些实施方案中，(a)包括提供包含官能团的S-腺苷-1-甲硫氨酸(SAM)类似物。

在一些实施方案中，官能团具有至少两个碳。在一些实施方案中，官能团是具有至少两个碳的烷基或具有至少两个碳的烯基。在一些实施方案中，官能团不是甲基基团。在一些实施方案中，官能团是烯丙基基团。在一些实施方案中，官能团与SAM类似物的硫原子连接。在一些实施方案中，SAM类似物具有式：

其中R包含官能团。在一些实施方案中，SAM类似物具有式：

在一些实施方案中，在适当条件下，相对于未甲基化核苷酸，甲基转移酶能够优先将官能团连接至甲基化核苷酸。在一些实施方案中，甲基转移酶是RNA甲基转移酶。在一些实施方案中，RNA甲基转移酶是二甲基转移酶。在一些实施方案中，二甲基转移酶是Dim1/KsgA二甲基转移酶。在一些实施方案中，二甲基转移酶是Dim1或KsgA。在一些实施方案中，二甲基转移酶是HsDim1、ScDim1或MjDim1。在一些实施方案中，二甲基转移酶是MjDim1。

在一些实施方案中，方法还包括将核酸分子或含氮碱基与双原子卤素分子一起孵育。在一些实施方案中，将核酸分子或含氮碱基与双原子卤素分子一起孵育是将来自双原子卤素分子的卤素原子连接至核酸分子或含氮碱基。在一些实施方案中，双原子卤素分子是碘(I₂)。

在一些实施方案中，方法还包括用逆转录酶(RT)使核酸分子进行逆转录反应以产生互补核酸分子。在一些实施方案中，互补核酸分子是cDNA分子。在一些实施方案中，RT是任意适合进行逆转录的RT。在一些实施方案中，RT是HIV RT或其变体、M-MuLV RT或其变体、AMV RT或其变体、Bst聚合酶(例如，Bst、Bst 2.0或Bst 3.0)或其变体或Klentaq聚合酶或其变体。在一些实施方案中，RT是HIV RT。在一些实施方案中，RT是Bst聚合酶或其功能片段。在一些实施方案中，RT是Bst 2.0DNA聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶是Klentaq聚合酶或其功能片段。

在一些实施方案中，测序包括下一代测序。在一些实施方案中，测序包括纳米孔测序。在一些实施方案中，甲基化核苷酸是甲基化腺苷，互补核酸上的相应残基不包括腺嘌呤。在一些实施方案中，甲基化核苷酸是甲基化腺苷，互补核酸上的相应残基包括鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶。在一些实施方案中，方法还包括将互补核酸中的突变识别为对应于甲基化核苷酸。在一些实施方案中，核酸分子是核糖核酸(RNA)分子。在一些实施方案中，核糖核酸分子是信使RNA(mRNA)。

在一些实施方案中，方法还包括向mRNA分子提供寡聚脱氧胸苷引物以产生双链区。在一些实施方案中，方法还包括提供核酸酶并且使mRNA经受足以用核酸酶消化双链区的条件。在一些实施方案中，核酸酶是RNA酶H。在一些实施方案中，核酸分子是较长核酸的片段。在一些实施方案中，片段的长度为100个至200个核苷酸。在一些实施方案中，核酸分子是从对象样品中分离的。在一些实施方案中，核酸分子是从活检样品中分离的。在一些实施方案中，样品是液体样品。在一些实施方案中，核酸分子来自囊泡。在一些实施方案中，囊泡是外泌体。在一些实施方案中，核酸分子是无细胞核酸分子。在一些实施方案中，无细胞核酸分子是无细胞RNA(cfRNA)分子。

在一些实施方案中，本文公开用于分析包含N⁶-甲基腺苷的甲基化信使核糖核酸(mRNA)分子的方法，方法包括(a)将mRNA分子片段化以产生包含N⁶-甲基腺苷的片段；(b)在足以将烯丙基基团连接至片段中的N⁶-甲基腺苷的条件下提供甲基转移酶和包含烯丙基的S-腺苷-1-甲硫氨酸(SAM)类似物；(c)在足以产生包含对应于N⁶-甲基腺苷的残基的cDNA分子的条件下将片段与逆转录酶一起孵育，其中残基包括鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶；(d)对cDNA分子进行测序；和(e)使用序列识别mRNA分子中N⁶-甲基腺苷的位置。在一些实施方案中，方法还包括在(a)之前，在足以使寡聚脱氧胸苷引物与mRNA分子的互补区域杂交的条件下，将mRNA分子与寡聚脱氧胸苷引物一起孵育，从而产生双链区。在一些实施方案中，方法还包括在足以消化双链区的条件下提供核酸酶。在一些实施方案中，核酸酶是RNA酶H。在一些实施方案中，SAM类似物具有式：

在一些实施方案中，在适当条件下，相对于未甲基化核苷酸，甲基转移酶能够优先将官能团连接至甲基化核苷酸。在一些实施方案中，甲基转移酶是RNA甲基转移酶。在一些实施方案中，RNA甲基转移酶是二甲基转移酶。在一些实施方案中，二甲基转移酶是Dim1/KsgA二甲基转移酶。在一些实施方案中，二甲基转移酶是Dim1或KsgA。在一些实施方案中，二甲基转移酶是HsDim1、ScDim1或MjDim1。在一些实施方案中，二甲基转移酶是MjDim1。在一些实施方案中，方法还包括在(d)之后，将mRNA分子与双原子卤素分子一起孵育。在一些实施方案中，将mRNA分子与双原子卤素分子一起孵育是将来自双原子卤素分子的卤素原子连接至核苷酸。在一些实施方案中，双原子卤素分子是碘(I₂)。在一些实施方案中，逆转录酶(RT)是任意适合进行逆转录的RT。在一些实施方案中，RT是HIV RT或其变体、M-MuLV RT或其变体、AMV RT或其变体、Bst聚合酶(例如，Bst、Bst 2.0或Bst 3.0)或其变体或Klentaq聚合酶或其变体。在一些实施方案中，RT是HIV RT。在一些实施方案中，RT是Bst聚合酶或其功能片段。在一些实施方案中，RT是Bst 2.0DNA聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶是Klentaq聚合酶或其功能片段。在一些实施方案中，mRNA片段的长度为100个至200个核苷酸。在一些实施方案中，mRNA分子是从对象样品中分离的。在一些实施方案中，mRNA分子是从活检样品中分离的。在一些实施方案中，样品是液体样品。在一些实施方案中，mRNA分子是从囊泡中分离的。在一些实施方案中，囊泡是外泌体。在一些实施方案中，mRNA分子是无细胞核糖核酸(cfRNA)分子。

实施方案还涉及可以在合适容器中可用于实现所公开的方法的试剂盒。本公开的实施方案涉及试剂盒，其包含(a)包含官能团的SAM类似物和(b)二甲基转移酶。在一些实施方案中，在适当条件下，相对于未甲基化核苷酸，甲基转移酶能够优先将官能团连接至甲基化核苷酸。在一些实施方案中，甲基转移酶是RNA甲基转移酶。在一些实施方案中，RNA甲基转移酶是二甲基转移酶。在一些实施方案中，二甲基转移酶是Dim1/KsgA二甲基转移酶。在一些实施方案中，二甲基转移酶是Dim1或KsgA。在一些实施方案中，二甲基转移酶是HsDim1、ScDim1或MjDim1。在一些实施方案中，二甲基转移酶是MjDim1。在一些实施方案中，官能团具有至少两个碳。在一些实施方案中，所述官能团是具有至少两个碳的烷基或具有至少两个碳的烯基。在一些实施方案中，所述官能团不是甲基。在一些实施方案中，所述官能团是烯丙基基团。在一些实施方案中，官能团与SAM类似物的硫原子连接。在一些实施方案中，SAM类似物具有式：

其中R包含官能团。在一些实施方案中，SAM类似物具有式：

在一些实施方案中，本公开的试剂盒还包含寡聚脱氧胸苷引物。在一些实施方案中，试剂盒包含核酸酶。在一些实施方案中，核酸酶是RNA酶H。在一些实施方案中，试剂盒包含逆转录酶(RT)。在一些实施方案中，RT是任意适合进行逆转录的RT。在一些实施方案中，RT是HIV RT或其变体、M-MuLV RT或其变体、AMV RT或其变体、Bst聚合酶(例如，Bst、Bst2.0或Bst 3.0)或其变体或Klentaq聚合酶或其变体。在一些实施方案中，RT是HIV RT。在一些实施方案中，RT是Bst聚合酶或其功能片段。在一些实施方案中，RT是Bst 2.0DNA聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶是Klentaq聚合酶或其功能片段。在一些实施方案中，试剂盒还包含RNA去甲基化酶。在一些实施方案中，RNA去甲基化酶是脂肪量和肥胖相关蛋白(FTO)。在一些实施方案中，试剂盒还包含锰盐。在一些实施方案中，试剂盒还包含一种或多于一种dNTP。在一些实施方案中，试剂盒还包含无核酸酶水。

整个本申请中，术语“约”用于表示值包括测量或定量方法的固有误差变化。

当与术语“包含”结合使用时，不使用数量词可意指“一个/一种”，但它也与“一个或多于一个/一种或多于一种”、“至少一个/至少一种”和“一个或多于一个/一种或多于一种”的含义相一致。

短语“和/或”的意思是“和”或“或”。为了说明，A、B和/或C包括：单独的A、单独的B、单独的C、A和B的组合、A和C的组合、B和C的组合或A、B和C的组合。换句话说，“和/或”作为包容性的或。

措辞“包含(comprising)”、“具有(having)”、“包括(including)”或“含有(containing)”是包容性的或开放式的，并且不排除另外、未列举的要素或方法步骤。

组合物及其使用方法可以“包括整个说明书中公开的任意成分或步骤”、“基本上由整个说明书中公开的任意成分或步骤组成”或“由整个说明书中公开的任意成分或步骤组成”。“基本上由任意公开的成分或步骤组成”的组合物和方法将权利要求的范围限制在不实质影响要求保护的发明的基本和新颖特征的特定材料或步骤。

具体地预想，关于本发明的一个实施方案所讨论的任意限制可以适用于本发明的任意其他实施方案。此外，本发明的任意组合物可用于本发明的任意方法，并且本发明的任意方法可用于生产或利用本发明的任意组合物。实施例中阐述的实施方案的方面也是可以在不同实施例中的其他地方或本申请中的其他地方例如在发明内容、具体实施方式、权利要求和附图说明中讨论的实施方案的上下文中实施的实施方案。

本发明的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。然而，应该理解的是，详细描述和具体实施例虽然指示本发明的具体实施方案，但仅以说明的方式给出，因为在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说从该详细描述中将变得明显。

附图说明

以下附图构成本说明书的一部分并且包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一幅或多于一幅并且结合本文呈现的特定实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。

图1A显示m⁶A转化为烯丙基-m⁶A和桥亚乙基腺嘌呤m⁶A以及在相应残基处产生突变的示意图。图1B显示含m⁶A的12聚体模板RNA的基于MALDI的质谱表征。图1C显示不包含任意m⁶A的12聚体模板RNA的基于MALDI的质谱表征。图1D显示Mjdim1催化的含有am⁶A和含有a⁶A的探针的稳态动力学。

图2显示示例m⁶A-sac-seq过程的示意图。

图3A至图3F显示实施例2中描述的实验结果，包括突变率(图3A)和与m⁶A数量的相关性(图3B)、Mjdim1序列选择性(图3C)、不同m⁶A共有基序的突变率(图3D)以及含有am⁶A与a⁶A的探针的错配比例(图3E和3F)。

图4显示概述用于m⁶A-sac-seq分析的生物信息学工作流程的流程图。

图5A至图5D显示实施例3中描述的实验结果，包括识别的m⁶A位点(图5A)、元基因图谱(图5B)、m⁶A富集(图5C)和m⁶A分布(图5D)的概述。

图6A和6B显示使用SELECT方法的m⁶A-sac-seq验证的结果。图6A显示每个靶标的Ct值的实时荧光扩增曲线和条形图。图6B显示每个靶标的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)结果。

图7A至图7C显示实施例4中描述的实验结果。图7A显示用

Gold核酸凝胶染料染色的DNA凝胶，证明野生型Klentaq酶在逆转录含有am⁶A的模板和含有a⁶A的模板中的通读效率。图7B显示从含有am⁶A的模板和含有a⁶A的模板获得的cDNA的碱基组成结果。图7C显示用含有或不含有Mn²⁺的野生型Klentaq酶逆转录后获得的cDNA的

Gold核酸凝胶染料染色的DNA凝胶。

图8显示使用Broccoli选择平台定向进化Klentaq酶的过程的示意图。

图9显示使用修饰的Klentaq酶的示例m⁶A-sac-seq方法的示意图。

图10A和图10B显示实施例7中描述的实验结果。图10A显示用

Gold核酸凝胶染料染色的DNA凝胶，证明Bst 2.0酶的通读效率。图10B显示从环化的含有am⁶A的模板和含有a⁶A的模板获得的cDNA的碱基组成结果。

图11显示使用Bst酶的示例m⁶A-sac-seq方法的示意图。

图12A至图12C显示实施例8中描述的实验结果。图12A显示DRACH基序的选定突变率。通过m⁶A-SAC-seq分析具有100％预甲基化NNm⁶ANN的53聚体RNA探针。图12B显示突变率与m⁶A比例的相关性。使用在GGACU基序上具有0％至100％预甲基化水平的一组53聚体。线代表线性回归。十字标记代表数据点。图12C显示所有可能的NNm⁶ANN基序的突变模式。每个垂直条代表一个基序。条形的高度分别代表突变率(0％至100％)。“m⁶A探针”是含有NNm⁶ANN的RNA探针；“FTO处理”是用FTO处理以去除大部分m⁶A的m⁶A探针；“am⁶A探针”是在含有NNam⁶ANN的RNA探针中将烯丙基基团合成安装至m⁶A上的探针。

图13显示表明在从模板RNA分子的逆转录获得的cDNA分子中产生突变的示意图。

具体实施方式

本公开的方面涉及称为m⁶A选择性烯丙基化学标记和测序或m⁶A-sac-seq(也称为“m⁶a-SAC-seq”)的方法，利用该方法可以在全转录组水平上识别和量化核糖核酸甲基化。

I.含氮碱基修饰

在某些实施方案中，方法涉及一种或多于一种含氮碱基的修饰。“含氮碱基”描述可以与糖部分结合以形成核苷或核苷酸并且可以并入多聚核苷酸中的分子。含氮碱基可以是天然、修饰或合成的。可以使用本公开的方法修饰的示例含氮碱基包括腺嘌呤(“A”)、鸟嘌呤(“G”)、胸腺嘧啶(“T”)、胞嘧啶(“C”)、尿嘧啶(“U”)及其变体。在一些实施方案中，含氮碱基是腺苷。在一些实施方案中，含氮碱基在氮原子上甲基化。含氮碱基可以是核苷、核苷酸和/或核酸(例如，核糖核酸、脱氧核糖核酸等)的组分。在一些实施方案中，含氮碱基是N⁶-甲基腺苷的组分。公开的方法可以包括每个核酸分子修饰1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或多于20个含氮碱基或可从其中衍生的任意范围。

修饰可以包括添加一个或多于一个官能团。在一些情况下，含氮碱基修饰包括将官能团连接至含氮碱基的氮原子。在一些实施方案中，氮原子是甲基化氮原子(例如，甲基化腺苷的甲基化N⁶原子)。含氮碱基修饰可以修饰核酸的核苷酸，例如核糖核酸，使得核酸的扩增和/或逆转录导致产生对应于该核苷酸的突变。

含氮碱基的修饰可以包括官能团与甲基化氮原子的连接。例如，在一些实施方案中，官能团与甲基化腺苷的甲基化N⁶原子连接。在一些实施方案中，官能团不是甲基基团。在一些实施方案中，官能团具有至少两个碳原子。在一些实施方案中，官能团是烷基基团。在一些实施方案中，官能团是烯基基团。在一些实施方案中，官能团包含炔。在一些实施方案中，官能团是烯丙基基团。官能团可以从S-腺苷-l-甲硫氨酸(SAM)类似物转移至含氮碱基。示例SAM类似物在本文别处描述并且包括例如烯丙基-SAM。

A.甲基化腺苷的修饰

本公开的方面涉及甲基化腺苷的修饰。在一些实施方案中，本文公开用于修饰N⁶-甲基腺苷的方法。N⁶-甲基腺苷修饰可用于检测或鉴定核酸(例如，mRNA)中的N⁶-甲基腺苷。

在一些实施方案中，N⁶-甲基腺苷的修饰包括在足以将官能团连接至N⁶-甲基腺苷的甲基化氮的条件下，将N⁶-甲基腺苷与甲基转移酶和包含官能团的SAM类似物一起孵育。本文提供示例性官能团并且包括例如烯丙基基团。本文提供示例性甲基转移酶并且包括例如二甲基转移酶，例如Dim1/KsgA二甲基转移酶。在一些实施方案中，甲基转移酶是MjDim1。在一些实施方案中，相对于未甲基化氮原子，用于修饰甲基化腺苷的甲基转移酶优先将官能团连接至甲基化氮原子。

N⁶-甲基腺苷的修饰还可以包括在连接官能团之后将经修饰的N⁶-甲基腺苷与双原子卤素分子一起孵育。在一些实施方案中，双原子卤素分子是氯(Cl₂)、溴(Br₂)或碘(I₂)。在一些实施方案中，修饰的N⁶-甲基腺苷与I₂一起孵育，从而进一步修饰官能团。例如，在官能团包含烯烃的情况下，与I₂一起孵育可使官能团环化和/或将碘连接至N⁶-甲基腺苷。图1A显示用于修饰N⁶-甲基腺苷的本公开的示例性反应。

B.甲基转移酶

本公开的实施方案包括甲基转移酶。甲基转移酶可用于本公开的方法，包括用于修饰含氮碱基的方法、用于修饰甲基化腺苷的方法和用于检测甲基化核苷酸的方法。在一些实施方案中，甲基转移酶描述属于酶学委员会(EC)分类EC 2.1.1的酶。在一些实施方案中，甲基转移酶描述能够促进甲基基团或其他官能团从S-腺苷甲硫氨酸(SAM)或其衍生物或类似物转移至含氮碱基、核苷和/或核苷酸的酶。甲基转移酶可以是天然或工程化的。甲基转移酶可以是DNA甲基转移酶或RNA甲基转移酶。甲基转移酶可以是二甲基转移酶，能够转移两个甲基或官能团。示例性二甲基转移酶包括Dim1/KsgA二甲基转移酶，例如Dim1(EC2.1.1.183，例如HsDim1、ScDim1或MjDim1)或KsgA(EC 2.1.1.182)。

可用于本发明方法(例如用于甲基化核苷酸检测的方法)的甲基转移酶包括那些优选甲基化含氮碱基而不是未甲基化含氮碱基的酶。这种优选可以基于反应中使用的官能团(例如甲基、烯丙基等)来确定。例如，如本文所公开的，当从SAM类似物转移烯丙基基团时，与未甲基化腺苷相比，二甲基转移酶MjDim1显示出优选甲基化N⁶-甲基腺苷。因此，本公开的方法包括相对于未甲基化腺苷，使包含N⁶-甲基腺苷的核酸(例如，mRNA)经受足以使诸如烯丙基基团的官能团优先连接至N⁶-甲基腺苷的条件。

C.S-腺苷-l-甲硫氨酸及类似物

本公开的方面涉及S-腺苷-1-甲硫氨酸(SAM)及其类似物。在一些实施方案中，本文公开包含一个或多于一个官能团的SAM类似物。SAM类似物可以包含不是甲基基团的官能团来代替天然SAM中发现的甲基。官能团描述可以连接至SAM分子以产生类似物的任意化学部分。可用于公开的方法和组合物中的官能团包括具有至少两个碳原子的化学部分。示例性官能团包括具有至少两个碳的烷基和烯基。在一些实施方案中，官能团不是甲基基团。在一些实施方案中，官能团包括烯烃。在一些实施方案中，官能团是烯丙基基团。SAM类似物可用于使用甲基转移酶将官能团连接至含氮碱基。在一个实施方案中，SAM类似物具有下式：

SAM类似物可用于本发明的甲基转移酶反应。例如，包含官能团的SAM类似物可以与甲基转移酶一起在足以将官能团连接至甲基化含氮碱基(例如，N⁶-甲基腺苷)的条件下提供。本公开的SAM类似物可以作为用于检测RNA甲基化的组合物或试剂盒的一部分提供。

II.样品制备

在某些方面，方法涉及从对象获得样品。本文提供的获得方法可包括活检方法，例如细针抽吸、芯针活检、真空辅助活检、切取活检、切除活检、穿孔活检、刮取活检、液体活检或皮肤活检。在某些实施方案中，样品通过前面提到的任意活检方法从食道组织的活检中获得。在其他实施方案中，样品可以从本文提供的任意组织获得，包括但不限于来自血清、胆囊、粘膜、皮肤、心脏、肺、乳房、胰腺、血液、肝脏、肌肉、肾脏、平滑肌、膀胱、结肠、肠、脑、前列腺、食道或甲状腺组织的非癌性或癌性组织和非癌性或癌性组织。或者，样品可以从任意其他来源获得，包括但不限于血液、汗液、毛囊、颊组织、眼泪、月经、粪便或唾液。在本发明方法的某些方面，任意医疗专业人员，例如医生、护士或医疗技术人员，都可以获得用于测试的生物样品。此外，无需医疗专业人员的帮助即可获得生物样品。

生物样品可以包括但不限于组织、细胞或来自细胞或源自对象细胞的生物材料。在一些实施方案中，生物样品包含细胞外囊泡，例如外泌体。生物样品可以是异质或均质的细胞或组织群体。生物样品可以是无细胞样品。可以使用本领域已知的能够提供适用于本文所述分析方法的样品的任意方法获得生物样品。样品可以通过非侵入性方法获得，包括但不限于：皮肤或子宫颈的刮擦、脸颊的拭子、唾液收集、脑脊液收集、尿液收集、粪便收集、月经、眼泪或精液的收集。

样品可以通过本领域已知的方法获得。在某些实施方案中，样品通过活检获得。在其他实施方案中，样品通过擦拭、内窥镜检查、刮擦、采血或本领域已知的任意其他方法获得。在一些情况下，可以使用本方法的试剂盒的组件来获得、储存或运输样品。在一些情况下，可以通过本文描述的方法获得多个样品，例如多个食道样品用于诊断。在其他情况下，可以获得多个样品，例如来自一种组织类型(例如食道)的一个或多于一个样品和来自另一种样品(例如血清)的一个或多于一个样品，用于通过该方法进行诊断。在一些情况下，可以在相同或不同时间获得多个样品，例如来自一种组织类型(例如食道)的一个或多于一个样品和来自另一种样品(例如血清)的一个或多于一个样品。可以在不同时间获得的样品通过不同方法进行存储和/或分析。例如，可以通过常规染色方法或任意其他细胞学分析方法获得和分析样品。

在一些实施方案中，生物样品可以由医师、护士或其他医疗专业人员例如医疗技术人员、内分泌学家、细胞学家、抽血医师、放射科医师或肺科医师获得。医疗专业人员可以指示对样品进行的适当测试或测定。在某些方面，分子谱分析企业可以咨询最适合指示哪些测定或测试。在本发明方法的其他方面，患者或对象可以在没有医学专业人员帮助的情况下获得用于测试的生物样品，例如获得全血样品、尿液样品、粪便样品、口腔样品或唾液样品。

在其他情况下，样品通过侵入性程序获得，包括但不限于：活检、针抽吸、内窥镜检查或采血。针抽吸的方法还可以包括细针抽吸、芯针活检、真空辅助活检或粗针吸取芯组织活检。在一些实施方案中，可以通过本文的方法获得多个样品以确保足够量的生物材料。

用于获得生物样品的一般方法也是本领域已知的。诸如Ramzy、Ibrahim ClinicalCytopathology and Aspiration Biopsy 2001的出版物描述了活检和细胞学方法的一般方法，该出版物通过引用整体并入本文。在一个实施方案中，样品是食道或疑似食道肿瘤或赘生物的细针抽吸物。在一些情况下，细针抽吸取样程序可以通过使用超声、X射线或其他成像装置来引导。

在本方法的一些实施方案中，分子谱分析企业可以直接从对象、从医学专业人员、从第三方或从分子谱分析企业或第三方提供的试剂盒获得生物样品。在一些情况下，在对象、医学专业人员或第三方获取生物样品并且将其发送至分子谱分析企业后，生物样品可由分子谱分析企业获得。在一些情况下，分子谱分析企业可以提供合适的容器和赋形剂，用于将生物样品储存和运输至分子谱分析企业。

在本文描述的方法的一些实施方案中，医疗专业人员不需要参与初始诊断或样品采集。个体也可以通过使用非处方药(OTC)试剂盒来获取样品。OTC试剂盒可包含用于获得如本文描述的所述样品的装置、用于储存所述样品以供检查的装置以及正确使用试剂盒的说明。在一些情况下，分子谱分析服务包含在购买试剂盒的价格中。在其他情况下，分子谱分析服务单独收费。适合分子谱分析业务使用的样品可以是包含待测试个体的组织、细胞、核酸、基因、基因片段、表达产物、基因表达产物或基因表达产物片段的任意材料。提供用于确定样品适用性和/或充分性的方法。

在一些实施方案中，对象可以转诊给专家，例如肿瘤科医生、外科医生或内分泌科医生。专家同样可以获得用于测试的生物样品或将个体转介到测试中心或实验室以提交生物样品。在某些情况下，医疗专业人员可以将对象转介到测试中心或实验室以提交生物样品。在其他情况下，对象可以提供样品。在某些情况下，分子分析企业可以获得样品。

III.测定方法

A.甲基化RNA的检测

方法的方面包括测定核酸以确定核酸的表达水平和/或甲基化水平。在一些实施方案中，本公开的方法包括检测RNA甲基化。本公开的实施方案包括每个RNA分子检测一个或多于一个甲基化核苷酸，例如至少、至多或恰好1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个甲基化核苷酸(或其中可推导的任意范围)。可以使用本公开的方法检测的甲基化核苷酸包括甲基化腺苷(例如，N⁶-甲基腺苷)。在一些实施方案中，本文公开检测来自生物样品的RNA中的N⁶-甲基腺苷(m⁶A)的方法。

在一些实施方案中，用于检测RNA分子中的m⁶A的方法包括将RNA分子与甲基转移酶和包含官能团的S-腺苷-l-甲硫氨酸(SAM)类似物在足以将官能团连接至m⁶A的条件下孵育，从而产生修饰的m⁶A。连接官能团的充分条件包括充分的缓冲条件、盐条件、温度条件等，其允许甲基转移酶将官能团从SAM类似物转移至m⁶A。足以用于酶促反应包括甲基转移酶反应的条件是已知的或可以由本领域技术人员容易地通过实验确定。在一个实施方案中，烯丙基基团连接至m⁶A，从而产生烯丙基-m⁶A。

在一些实施方案中，m⁶A还可以通过用双原子卤素分子处理来修饰。双原子卤素分子可以是例如氯(Cl₂)、溴(Br₂)或碘(I₂)。在一些实施方案中，双原子卤素分子是碘(I₂)。在一些实施方案中，用双原子卤素分子处理用于将来自双原子卤素分子的卤素原子连接至包含烯烃的官能团。在一些实施方案中，方法包括将烯丙基-m⁶A与I₂一起孵育以产生桥亚乙基腺嘌呤m⁶A(参见图1A)。

在连接官能团和在一些情况下的附加反应(例如，用双原子卤素分子处理)后，RNA分子可以经受足以产生互补核酸分子的条件。条件包括例如逆转录条件，其可以包括提供逆转录酶和足以对RNA分子进行逆转录以产生互补DNA(cDNA)分子的条件。逆转录酶(RT)可以描述具有EC分类EC 2.7.7.49的酶。在一些实施方案中，RT是HIV RT或其变体、M-MuLV RT或其变体、AMV RT或其变体、Bst聚合酶(例如，Bst、Bst 2.0或Bst 3.0)或其变体或Klentaq聚合酶或其变体。在一些实施方案中，RT是HIV RT。在一些实施方案中，RT是Bst聚合酶或其功能片段。在一些实施方案中，RT是Bst 2.0DNA聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶是Klentaq聚合酶或其功能片段。在一些实施方案中，RT是相对于未甲基化腺苷优先甲基化腺苷的RT。从包含m⁶A的RNA分子逆转录获得的cDNA分子可以包含在对应于来自RNA分子的m⁶A的cDNA分子中的残基处的突变。

源自模板核酸分子的核酸分子(例如，cDNA分子)中残基的突变描述与模板核酸分子中相应残基处的核苷酸不同的核苷酸。例如，在模板mRNA分子在残基处具有“A”核苷酸(或其变体)的情况下，由mRNA分子产生的cDNA分子中的突变描述了除“A”之外的核苷酸(或其变体)在相应残基处的存在(例如，“G”、“T”或“C”核苷酸的存在)。在一个实例中，如图13所示，模板mRNA分子具有序列5'-GTm⁶AGG-3'，由mRNA分子产生的cDNA分子具有相应序列5'-GTCGG-3'。在本实例中，cDNA分子在第三位置(即“C”核苷酸处)具有突变。突变对应于并且可用于识别模板mRNA序列中m⁶A的存在和位置。例如，通过将cDNA序列与包含mRNA分子序列的参考数据库进行比较，在第三位置处的“C”核苷酸可基于与参考数据库中位置的差异(即基于在cDNA序列中存在“C”核苷酸而不是参考数据库中的“A”核苷酸)识别为突变，由此将模板mRNA分子识别为在第三位置处包含m⁶A。

RNA分子的m⁶A上存在官能团可诱导cDNA分子上产生突变。在一些实施方案中，需要通过用双原子卤素分子处理来修饰与m⁶A连接的官能团，以产生具有足够大小的修饰的m⁶A，从而在通过RNA分子逆转录获得的相应cDNA分子中诱导突变的产生。在一些实施方案中，不需要通过用双原子卤素分子处理修饰官能团来诱导突变的产生。

产生后，可以对核酸分子(例如，cDNA分子)进行测序。示例测序方法在本文的其他地方描述。测序可以包括互补核酸分子的扩增(例如，通过PCR或其他扩增方法)。在一些实施方案中，测序产生对应于核酸分子的序列。序列可以包含对应于RNA分子中甲基化核苷酸的突变。可以将包含突变的序列与源自未修饰的RNA分子的模板或对照序列进行比较。未修饰的RNA分子可以来自与经修饰的RNA分子相同的样品或不同的样品。可以将该序列与对照序列进行比较以识别突变并且将突变与m⁶A相关联。

在包括分析包含m⁶A的mRNA分子的实施方案中，在将官能团连接至m⁶A之前，可以在足以使引物与mRNA退火的条件下将寡聚脱氧胸苷引物提供给mRNA分子，由此产生双链区。寡聚脱氧胸苷引物描述包含能够与mRNA的多腺苷酸化区域杂交的多聚脱氧胸苷区域的寡核苷酸引物。寡聚脱氧胸苷引物可以是单链的。在产生双链区之后，可以在足以消化双链区的条件下提供核酸酶。核酸酶可以是DNA核酸酶。核酸酶可以是当与DNA杂交时能够特异性消化RNA区域的核酸酶。核酸酶可以是RNA酶H。

在一些实施方案中，RNA获自样品，例如来自对象的生物样品。在一些实施方案中，在没有任意修饰处理的情况下对一部分RNA进行测序。该部分可以用作模板或对照，用于与通过公开的方法修饰的RNA进行比较。这样的模板或对照可以使其能够去除未甲基化核苷酸修饰导致的“假阳性”结果。

可以使用本公开的组合物和方法修饰和/或分析的甲基化RNA的实例包括信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、长非编码RNA(lncRNA)、短非编码RNA(sncRNA)、微RNA(miRNA)、小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、小干扰RNA(siRNA)和短发夹RNA(shRNA)。RNA可以是无细胞RNA(cfRNA)。

在一些实施方案中，甲基化RNA可以在体外进行修饰和分析。在一些实施方案中，甲基化RNA可以在原位(例如，在组织样品中)进行修饰和分析。例如，可以修饰包含甲基化腺苷(例如，m⁶A)的甲基化RNA并且进行原位逆转录，由此产生在对应于甲基化腺苷的残基处包含突变的cDNA分子。然后可以使用核酸探针(例如，荧光原位杂交(FISH)探针)检测cDNA，该探针设计为与包含突变的cDNA结合，但不与不包含突变的cDNA结合，由此识别甲基化RNA在组织样品中的位置。

B.甲基化DNA的检测

方法的方面包括测定核酸以确定核酸的表达水平和/或甲基化水平。在一些实施方案中，本公开的方法包括检测DNA甲基化。在一些实施方案中，检测DNA甲基化包括检测甲基化胞嘧啶(例如5-mC)。在一些实施方案中，检测DNA甲基化包括检测甲基化腺苷(例如m⁶A)。用于检测甲基化DNA的某些测定是本领域已知的。本文描述示例性方法。可以单独或组合使用一种或多于一种用于检测甲基化DNA的所述方法。

1.HPLC-UV

由Kuo及其同事于1980年开发的HPLC-UV(高效液相色谱-紫外)技术(在Kuo K.C.等人，Nucleic Acids Res.1980；8:4763–4776中进一步描述，其通过引用并入本文)可用于量化水解DNA样品中存在的脱氧胞苷(dC)和甲基化胞嘧啶(5mC)的量。方法包括将DNA水解为其组成核苷碱基，通过色谱分离5mC和dC碱基，然后测量级分。然后，可以计算每个样品的5mC/dC比率，这可以在实验样品和对照样品之间进行比较。

2.LC-MS/MS

液相色谱与串联质谱联用(LC-MS/MS)是高灵敏度的HPLC-UV方法，其需要的水解DNA样品量要少得多。在其中约2％至5％的全部胞嘧啶残基进行甲基化的哺乳动物DNA的情况下，LC-MS/MS已验证用于检测范围为0.05％至10％的甲基化水平，并且可以可信地检测样品之间小至总胞嘧啶残基的约0.25％的差异，其对应于全局DNA甲基化的约5％差异。该程序通常需要50ng至100ng的DNA样品，尽管已成功分析更少量(低至5ng)的样品。这种方法的另一个主要益处是它不会受到劣质DNA(例如，来自FFPE样品的DNA)的不利影响。

3.基于ELISA的方法

有几种商购可得试剂盒，均基于酶联免疫吸附测定(ELISA)，能够快速评估DNA甲基化状态。这些测定包括全球DNA甲基化ELISA，可得自Cell Biolabs；印记甲基化DNA定量试剂盒(夹心ELISA)，可得自Sigma-Aldrich；EpiSeeker甲基化DNA定量试剂盒，可得自abcam；全局DNA甲基化测定—LINE-1，可得自Active Motif；5-mC DNA ELISA试剂盒，可得自Zymo Research；MethylFlash甲基化DNA5-mC定量试剂盒和MethylFlash甲基化DNA5-mC定量试剂盒，可得自Epigentek。这些试剂盒可以通过制造商提供的说明使用，或可以根据应用在必要时进行修改或组合。例如，设计用于使用抗5mC抗体检测5-mC的试剂盒可以通过将抗5mC抗体替换为抗m⁶A抗体用于检测甲基化腺苷进行修改。

简而言之，在ELISA板上捕获DNA样品，并且通过以下连续孵育步骤检测甲基化核苷酸(例如胞嘧啶和/或腺苷)：(1)针对甲基化核苷酸产生的一抗(例如5-mC、m⁶A)；(2)标记的二抗；和然后(3)比色/荧光检测试剂。

全局DNA甲基化测定——LINE-1专门确定LINE-1(长散在核元件-1)逆转录转座子的甲基化水平，其中约17％的人类基因组由该转座子组成。这些已良好地确定为全局DNA甲基化的替代物。简而言之，片段化DNA与生物素化LINE-1探针进行杂交，然后将其固定在链霉亲和素包被的板上。在洗涤和封闭步骤之后，使用对一种或多于一种感兴趣的甲基化核苷酸特异的抗体(例如，抗5mC抗体、抗m⁶A抗体等)、HRP-偶联二抗和化学发光检测试剂对甲基化核苷酸(例如，胞嘧啶和/或腺苷)进行定量。根据从具有已知LINE-1甲基化水平的标准生成的标准曲线对样品进行量化。制造商声称该测定可以检测到低至0.5％的DNA甲基化水平。因此，通过分析基因组的一部分，可以实现更好的量化准确度。

4.LINE-1焦磷酸测序

LINE-1甲基化水平也可以通过另一种方法评估，该方法涉及DNA的亚硫酸氢盐转化，然后PCR扩增LINE-1保守序列以检测甲基化胞嘧啶。然后通过焦磷酸测序对扩增片段的甲基化状态进行量化，其能够分析DNA样品之间小至约5％的差异。方法特别适用于癌症样品的高通量分析，其中低甲基化通常与不良预后有关。这种方法特别适用于人类DNA，但也有适用于大鼠和小鼠基因组的版本。

5.AFLP和RFLP

差异甲基化片段的检测可以通过常规的基于PCR的扩增片段长度多态性(AFLP)、限制性片段长度多态性(RFLP)或结合使用两者的协议来实现。

6.亚硫酸氢盐测序

在一些实施方案中，方法包括使用亚硫酸氢盐测序来检测甲基化胞嘧啶(例如，5-mC)。DNA的亚硫酸氢盐处理介导胞嘧啶脱氨为尿嘧啶，这些转化的残基将读取为胸腺嘧啶，这由PCR扩增和随后的测序分析确定。然而，5mC残基对这种转换具有抗性，因此仍会读取为胞嘧啶。因此，将未经处理的DNA样品的Sanger测序读取与亚硫酸氢盐处理后的相同样品进行比较，能够检测甲基化胞嘧啶。随着下一代测序(NGS)技术的出现，这种方法可以扩展到整个基因组的DNA甲基化分析。为了确保非甲基化胞嘧啶完全转化，可加入对照以进行亚硫酸氢盐反应。

全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS)类似于全基因组测序，除了亚硫酸氢盐转化的额外步骤。对基因组中富含5mC的部分进行测序不仅是成本较低的方法，而且还可以增加测序覆盖率，因此提高揭示差异甲基化区域的精度。可以使用任意现有的NGS平台进行测序；Illumina和Life Technologies两者都提供用于这种分析的试剂盒。

亚硫酸氢盐测序方法包括简并代表性亚硫酸氢盐测序(RRBS)，其中仅对基因组的一部分进行测序。在RRBS中，富含CpG的区域的富集是通过在识别CCGG位点的MspI消化后分离短片段来实现的(并且它切割甲基化和非甲基化位点)。它确保分离人类基因组中约85％的CpG岛。然后，进行与WGBS相同的亚硫酸氢盐转化和文库制备。RRBS程序通常需要约100ng至1μg DNA。

7.排除亚硫酸氢盐转化的方法

在一些方面，无需亚硫酸氢盐转化直接检测经修饰碱基可用于检测甲基化。Pacific Biosciences开发了一种通过监测单分子测序过程中聚合酶动力学直接检测甲基化碱基的方法，并且提供用于这种测序的商业产品(在Flusberg B.A.等人，Nat.Methods.2010；7:461–465中进一步描述，其通过引用并入本文)。其他方法包括单分子实时测序技术(SMRT)和纳米孔测序，每一种都能够直接检测经修饰的碱基(例如，描述于Laszlo A.H.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2013，Schreiber J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2013，和Peng N.等人，Bioinformatics.2019中，其通过引用并入本文)。在一些实施方案中，纳米孔测序用于直接对含有甲基化腺苷的RNA进行测序，而无需逆转录。

8.阵列或珠杂交

通常通过免疫沉淀获得的基因组甲基化DNA片段可用于与微阵列杂交。目前可用的这种阵列示例包括：人CpG岛微阵列试剂盒(Agilent)、基因芯片人类启动子1.0R阵列和基因芯片人类贴片2.0R阵列组(Affymetrix)。

使用亚硫酸氢盐转化的DNA搜索差异甲基化区域可以使用不同技术来完成。其中一些比其他更容易执行和分析，因为仅使用一部分基因组。DNA甲基化最显著的功能效应发生在基因启动子区域、增强子调节元件和3'非翻译区(3'UTR)中。可以使用针对这些特定区域的测定，例如由Illumina提供的Infinium人甲基化450珠芯片阵列。阵列可用于检测基因的甲基化状态，包括miRNA启动子、5'UTR、3'UTR、编码区(每个基因约17个CpG)和岛岸(CpG岛上游约2kb的区域)。

简而言之，亚硫酸氢盐处理的基因组DNA与测定寡核苷酸混合，其中一种与尿嘧啶(从原始未甲基化的胞嘧啶转化而来)互补，另一种与甲基化(因此免受转化)位点的胞嘧啶互补。杂交后，引物延伸并且连接到基因座特异性寡核苷酸上，以创建通用PCR的模板。最后，标记的PCR引物用于产生固定在条形码珠上的可检测产物，并且测量信号。每个基因座(单个CpG)的两种类型的珠之间的比率是其甲基化水平的指标。

可以购买利用甲基化特异性引物延伸进行验证研究的试剂盒。在来自Illumina的VeraCode甲基化测定中，使用GoldenGate甲基化测定分析96个或384个用户指定的CpG基因座。与BeadChip测定不同，VeraCode测定需要BeadXpress阅读器进行扫描。

9.甲基敏感切割计数：核酸内切酶消化后测序

作为对大量甲基化(或未甲基化)DNA进行测序的替代方法，可以从这些区域生成片段，并且在测序后将它们映射回基因组。此外，NGS的覆盖范围足以量化特定基因座的甲基化水平。基因表达系列分析(SAGE)技术已适用于该目的，并且称为甲基化特异性数字核型分析以及称为甲基敏感切割计数(MSCC)的类似技术。

总之，在所有这些方法中，甲基化敏感的内切核酸酶例如HpaII用于在未甲基化位点对基因组DNA进行初始消化，然后进行衔接子连接，其包含另一个消化酶的位点，该位点在其识别位点之外被切割，例如EcoP15I或MmeI。通过这些方式，生成位于原始HpaII位点附近的小片段。然后，进行NGS和基因组映射。每个HpaII位点的读取次数与其甲基化水平相关。

最近，已发现许多使用甲基化DNA作为底物的限制性内切酶(甲基化依赖性核酸内切酶)。其中大部分是由SibEnzyme发现并且市售的：BisI、BlsI、GlaI、GluI、KroI、MteI、PcsI、PkrI。这些酶仅切割甲基化位点的独特能力已用于实现甲基化DNA选择性扩增的方法。可从New England Biolabs获得的三种甲基化依赖性内切核酸酶(FspEI、MspJI和LpnPI)是IIS型酶，它们在识别位点外部切割，因此能够在包含CpG的完全甲基化识别位点周围生成32bp的片段。这些短片段可以是序列并且与参考基因组对齐。每个特定的32bp片段获得的读取次数可以是其甲基化水平的指标。类似地，短片段可以从甲基化CpG岛与大肠杆菌的甲基特异性核酸内切酶McrBC产生，该酶在(G/A)mC的两个半位点之间切割DNA，这两个半位点之间的距离为50bp至3000bp。这是一种非常有用的分离甲基化CpG岛的工具，可以再次与NGS结合使用。由于不含亚硫酸氢盐，这三种方法在快速全基因组甲基化组分析方面具有巨大潜力。

C.测序

本公开的方面包括核酸测序。核酸测序可用于检测和分析样品中的一种或多于一种核酸。在一些实施方案中，所公开的方法包括对样品中的核酸进行测序以检测一个或多于一个基因突变或异常(例如，插入、缺失、移码突变、单核苷酸多态性(SNP)、染色体异常(例如，倒位、置换、拷贝数变化)等)。在一些实施方案中，所公开的方法包括对样品中的核酸进行测序以检测甲基化(例如，DNA甲基化、RNA甲基化)。测序可以包括全基因组测序和/或靶向测序。在一些实施方案中，本公开的方法包括测序方法。示例性测序方法包括以下描述的那些。

1.大规模并行签名测序(MPSS)。

1990年代，Lynx Therapeutics开发第一个下一代测序技术，即大规模并行签名测序(或MPSS)。MPSS是基于珠的方法，其使用复杂的衔接子连接方法，然后是衔接子解码，以四个核苷酸的增量读取序列。这种方法使其容易受到序列特异性偏倚或特异性序列丢失的影响。因为技术非常复杂，MPSS只能由Lynx Therapeutics“内部”进行，没有DNA测序仪市售至独立实验室。Lynx Therapeutics于2004年与Solexa(后来被Illumina收购)合并，导致合成测序的发展，这是从Manteia Predictive Medicine获得的更简单方法，其使得MPSS淘汰。然而，MPSS输出的基本属性是后来“下一代”数据类型的典型特征，包括数十万个短DNA序列。在MPSS的情况下，这些通常用于对cDNA进行测序以测量基因表达水平。事实上，强大的Illumina HiSeq2000、HiSeq2500和MiSeq系统均基于MPSS。

2.聚合酶克隆(Polony)测序。

聚合酶克隆测序方法是在哈佛大学George M.Church实验室开发的，是首批下一代测序系统之一，并且于2005年用于对全基因组进行测序。它将体外配对标签文库与乳液PCR、自动显微镜和基于连接的测序化学相结合以>99.9999％的准确度对大肠杆菌基因组进行测序，成本为Sanger测序的约1/9。该技术授权给Agencourt Biosciences，随后衍生为Agencourt Personal Genomics，最终并入应用生物系统SOLiD平台。

3.454焦磷酸测序。

焦磷酸测序的并行版本由454Life Sciences开发。该方法在油溶液中扩增水滴内的DNA(乳液PCR)，每个液滴都包含单个DNA模板，该模板附着至单个涂有引物的珠，然后形成一个克隆菌落。测序仪包含许多皮升体积的孔，每个孔都包含单个珠和测序酶。焦磷酸测序使用荧光素酶产生光以检测添加到新生DNA中的单个核苷酸，并且组合数据用于生成序列读取。与一端的Sanger测序和另一端的Solexa和SOLiD相比，该技术提供中等的读取长度和每个碱基的价格。

4.Illumina(Solexa)测序。

Solexa开发基于可逆染料终止剂技术和工程聚合酶的测序方法，这是它内部开发的。终止化学是在Solexa内部开发的，Solexa系统的概念是由剑桥大学化学系的Balasubramanian和Klennerman发明的。2004年，Solexa收购Manteia PredictiveMedicine公司，以获得基于“DNA簇”的大规模并行测序技术，该技术涉及表面上DNA的克隆扩增。

在这种方法中，首先将DNA分子和引物附着在载玻片上，然后用聚合酶进行扩增，使得形成局部克隆DNA菌落，后来被称为“DNA簇”。为了确定序列，添加四种类型的可逆终止碱基(RT-碱基)并且洗去未并入的核苷酸。照相机拍摄荧光标记的核苷酸的图像，然后将染料与末端3'阻断剂一起从DNA中化学去除，从而开始下一个循环。与焦磷酸测序不同，DNA链一次延伸一个核苷酸，并且可以延迟执行图像采集，从而允许通过从单个相机拍摄的连续图像捕获非常大的DNA群体阵列。

将酶促反应和图像捕获解耦可实现最佳通量和理论上无限的测序容量。因此，在最佳配置下，最终可达到的仪器通量仅由如下决定：相机的模拟-数字转换速度，乘以相机的数量，再除以最佳可视化它们所需的每个DNA菌落的像素数(大约10像素/菌落)。2012年，随着相机以超过10MHz的A/D转换率和可用的光学、流体学和酶学技术运行，通量可以达到100万个核苷酸/秒的倍数，大致相当于一个人类基因组当量，每台仪器每小时1x覆盖率，每台仪器(配备单台相机)每天对一个人类基因组进行重新测序(大约30x)。

5.SOLiD测序。

Applied Biosystems的SOLiD技术采用连接测序。此处，所有可能的固定长度的寡核苷酸池根据测序位置进行标记。寡核苷酸退火并且连接；DNA连接酶对匹配序列的优先连接产生此位置核苷酸的信号信息。在测序之前，通过乳液PCR扩增DNA。将得到的珠(每个都包含单拷贝的相同DNA分子)沉积在载玻片上。结果是序列的数量和长度与Illumina测序相当。据报道，这种通过连接方法进行的测序在测序回文序列方面存在一些问题。

6.Ion Torrent半导体测序。

Ion Torrent Systems Inc.开发基于使用标准测序化学的系统，但使用了基于半导体的新型检测系统。这种测序方法是基于对DNA聚合过程中释放的氢离子的检测，这与其他测序系统中使用的光学方法相反。含有要测序的模板DNA链的微孔充满单一类型的核苷酸。如果引入的核苷酸与前导模板核苷酸互补，则将其并入生长的互补链中。这导致释放氢离子，触发超灵敏离子传感器，其表明已发生反应。如果模板序列中存在均聚物重复，则多个核苷酸将并入单个循环中。这产生相应数量的释放氢和成比例地更高的电子信号。

7.DNA纳米球测序。

DNA纳米球测序是一种高通量测序技术，用于确定生物体的整个基因组序列。该方法使用滚环复制将基因组DNA的小片段扩增成DNA纳米球。然后使用通过连接进行的非链式测序来确定核苷酸序列。与其他下一代测序平台相比，这种DNA测序方法允许每次运行对大量DNA纳米球进行测序，并且试剂成本低。然而，从每个DNA纳米球中只能确定DNA的短序列，这使得将短读取映射到参考基因组变得困难。该技术已用于多个基因组测序项目。

8.Heliscope单分子测序。

Heliscope测序是Helicos Biosciences开发的单分子测序方法。它使用添加多聚腺苷酸尾衔接子的DNA片段，这些衔接子连接至流通池表面。接下来的步骤涉及基于延伸的测序，使用荧光标记的核苷酸(一次一种核苷酸类型，与Sanger方法一样)循环洗涤流动池。读取由Heliscope测序仪执行。读取很短，每次运行至多55个碱基，但最近的改进允许更准确地读取具有一种类型核苷酸的片段。该测序方法和设备用于对M13噬菌体的基因组进行测序。

9.单分子实时(SMRT)测序

SMRT测序是基于边合成边测序的方法。DNA是在零模波导(ZMW)中合成的，其为小井状容器，捕获工具位于井底。使用未修饰的聚合酶(连接至ZMW底部)和在溶液中自由流动的荧光标记核苷酸进行测序。孔的构造方式是仅检测孔底部发生的荧光。荧光标记在核苷酸并入DNA链时与核苷酸分离，留下未修饰的DNA链。根据SMRT技术开发商PacificBiosciences，这种方法允许检测核苷酸修饰(例如胞嘧啶甲基化)。这通过观察聚合酶动力学而发生。这种方法允许读取20000个或多于20000个核苷酸，平均读取长度为5kb。

10.纳米孔测序。

纳米孔测序基于核酸通过纳米孔例如蛋白质时产生的离子电流的变化。核酸通过膜中的纳米孔，通过膜的电流的每一次变化都进行测量并且与特定核苷酸相关联。在一些实施方案中，纳米孔测序是使用Oxford Nanopore Technologies开发的测序系统进行的。纳米孔测序描述于例如Wang Y.等人，Front.Genet.,2015和Jain,M.等人，Genome Biol.,2016中，其各自通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，纳米孔测序用于直接对含有甲基化腺苷的RNA进行测序，而无需逆转录。

D.其他测定方法

在一些实施方案中，方法包括使用对靶基因组区域特异的至少一对引物扩增和/或测序一个或多于一个靶基因组区域。在某些实施方案中，引物是七聚体。在其他实施方案中，将酶例如引物酶或引物酶/聚合酶组合酶添加至扩增步骤以合成引物。

在一些实施方案中，阵列可用于检测本公开的核酸。阵列包含固体支持物，其中核酸探针连接至支持物。阵列通常包含多个不同的核酸探针，这些探针在不同的已知位置与底物表面偶联。这些阵列，也描述为“微阵列”或通俗地称为“芯片”，通常已在本领域中进行了描述，例如美国专利第5143854、5445934、5744305、5677195、6040193、5424186号和Fodor等人，1991年)，为了所有目的，其各自都通过引用整体并入。使用机械合成方法合成这些阵列的技术描述于例如美国专利第5384261号，出于所有目的，其通过引用整体并入本文。尽管在某些方面使用了平面阵列表面，但该阵列可以制造在几乎任意形状的表面上，或者甚至是多个表面上。阵列可以是珠、凝胶、聚合物表面、纤维例如光纤、玻璃或任意其他合适的基材上的核酸，参见美国专利第5770358、5789162、5708153、6040193和5800992号，出于所有目的，将其整体并入本文。

除了使用阵列和微阵列之外，预期可以采用多种不同的测定来分析核酸。此类测定包括但不限于核酸扩增、聚合酶链式反应(PCR)、定量PCR、RT-PCR、原位杂交、数字PCR、ddPCR(数字微滴PCR，也称为微滴数字PCR)、nCounter(nanoString)、BEAMing(珠、乳液、扩增和池)(Inostics)、ARMS(扩增阻碍突变系统)、RNA-Seq、TAm-Seg(标记扩增深度测序)、PAP(焦磷酸水解激活的聚合酶反应)、下一代RNA测序、Northern杂交、杂交保护测定(HPA)(GenProbe)、分支DNA(bDNA)测定(Chiron)、滚环扩增(RCA)、单分子杂交检测(USGenomics)、入侵者测定(ThirdWave Technologies)和/或桥连接测定(Bridge LitigationAssay)(Genaco)。

可以制备扩增引物或杂交探针以与本文所述的基因组区域、生物标志物、探针或寡核苷酸互补。如本文所用，术语“引物”或“探针”意在涵盖能够在依赖模板的过程中引发新生核酸合成和/或与本公开的多聚核苷酸的单链或其部分配对的任意核酸。通常，引物是长度为十至二十和/或三十个核酸的寡核苷酸，但可以使用更长的序列。引物可以双链和/或单链形式提供。

使用长度为13个至100个核苷酸，特别是长度为17个至100个核苷酸，或在某些方面长度达至1kb至2kb或多于2kb的探针或引物，允许形成既稳定又可选择的双链体分子。在长度大于20个碱基的连续片段上具有互补序列的分子可用于增加获得的杂交分子的稳定性和/或选择性。可以设计用于杂交的核酸分子，其具有一个或多于一个20个至30个核苷酸或者在需要时甚至长于30个核苷酸的互补序列。这样的片段可以容易地制备，例如，通过化学方法直接合成片段或通过将选择的序列引入重组载体中用于重组生产。

在一个实施方案中，每个探针/引物包含至少15个核苷酸。例如，每个探针可以包含至少或至多20个、25个、50个、75个、100个、125个、150个、175个、200个、225个、250个、275个、300个、325个、350个、400个或多于400个核苷酸(或其中可推导的任意范围)。它们可以具有这些长度并且具有与本文描述的基因相同或互补的序列。特别地，每个探针/引物具有相对高的序列复杂性并且没有任意不明确的残基(未确定的“n”残基)。探针/引物可以在严格或高度严格的条件下与靶基因、包括其RNA转录物杂交。预想探针或引物可具有肌苷或其他设计的实施方案，以适应对多于一种人类序列的特定核酸或目标(例如，核酸生物标志物)的识别。

对于需要高选择性的应用，通常希望采用相对高的严格条件来形成杂合体。例如，相对低盐和/或高温条件，例如在约50℃至约70℃的温度下由约0.02M至约0.10M NaCl提供的。这种高度严格的条件几乎不能容忍探针或引物与模板或靶链之间的错配，如果有的话，并且会特别适用于分离特定基因或检测特定mRNA转录物。通常可以理解，通过添加越来越多的甲酰胺可以使条件变得更加严格。

在一个实施方案中，定量RT-PCR(例如TaqMan、ABI)用于检测和比较样品中核酸的水平或丰度。PCR过程线性部分中的靶标DNA浓度与PCR开始前靶标的起始浓度成比例。通过确定已完成相同循环数并且在其线性范围内的PCR反应中靶标DNA的PCR产物浓度，可以确定原始DNA混合物中特定靶标序列的相对浓度。PCR产物的浓度和起始材料中的相对丰度之间的这种直接比例关系在PCR反应的线性范围部分是正确的。曲线平台部分中靶标DNA的最终浓度取决于反应混合物中可用的试剂，并且与靶标DNA的原始浓度无关。因此，当PCR反应在其曲线的线性部分时，可以对扩增的PCR产物进行取样和定量。此外，可扩增DNA的相对浓度可以归一化为一些独立的标准/对照，这可能基于内部存在的DNA种类或外部引入的DNA种类。特定DNA种类的丰度也可以相对于样品中所有DNA种类的平均丰度来确定。

在一个实施方案中，PCR扩增利用一种或多于一种内部PCR标准。内标可以是细胞中丰富的管家基因，或者可以具体是GAPDH、GUSB和β-2微球蛋白。这些标准可用于归一化表达水平，以便可以直接比较不同基因产物的表达水平。本领域普通技术人员会知道如何使用内标来归一化表达水平。

一些样品固有的问题是它们的数量和/或质量可变。如果RT-PCR作为具有内标的相对定量RT-PCR进行，则可以克服此问题，其中内标是与靶标DNA片段相似或更大的可扩增DNA片段，其中代表内标的DNA丰度比代表靶标核酸区域的DNA高约5倍至100倍。

在另一个实施方案中，相对定量RT-PCR使用外部标准协议。在该协议下，PCR产物在其扩增曲线的线性部分进行采样。对于每个靶标DNA片段，可以根据经验确定最适合采样的PCR循环数。此外，从各种样品中分离的核酸可以归一化为等浓度的可扩增DNA。

核酸阵列可包含至少1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、15种、20种、25种、30种、35种、40种、45种、50种、60种、70种、80种、90种、100种、150种、200种、250种或多于250种不同的多聚核苷酸探针，其可以与不同和/或相同的生物标志物杂交。同一基因的多个探针可用于单个核酸阵列。其他疾病基因的探针也可以包含在核酸阵列中。阵列上的探针密度可以在任意范围内。在一些实施方案中，密度可以是或可以是至少50个、100个、200个、300个、400个、500个或多500于个探针/cm²(或其中可推导的任意范围)。

具体考虑的是基于芯片的核酸技术，例如Hacia等人(1996)和Shoemaker等人(1996)描述的那些。简而言之，这些技术涉及用于快速准确地分析大量基因的定量方法。通过用寡核苷酸标记基因或使用固定探针阵列，可以使用芯片技术将靶分子分离为高密度阵列，并在杂交的基础上筛选这些分子(也参见Pease等人，1994；和Fodor等人，1991)。预想在诊断、预后和治疗方法方面，该技术可以与评估一种或多于一种癌症生物标志物表达水平结合使用。

某些实施方案可涉及使用阵列或从阵列生成的数据。数据可容易获得。此外，可以准备阵列以生成随后可用于相关性研究的数据。

IV.使用方法

A.临床和诊断应用

本公开的方法可用于评估核酸(例如，DNA、RNA)以用于临床和/或诊断目的。某些实施方案涉及用于评估包含RNA分子的样品的方法。可以使用所公开的方法和组合物分析的示例性RNA分子包括信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、长非编码RNA(lncRNA)、短非编码RNA(sncRNA)、微RNA(miRNA)、小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、小干扰RNA(siRNA)和短发夹RNA(shRNA)。评估可以是特定腺苷修饰的检测或确定或特定修饰的差异检测或确定。

在一些实施方案中，本公开的方法可用于发现疾病或病症的新生物标志物。在一些实施方案中，本公开的方法可以对来自患者的样品执行以提供对患者的某种疾病或病症的预后。在一些实施方案中，可以对来自患者的样品执行本公开的方法以预测患者对特定疗法的反应。在一些实施方案中，疾病包括癌症。例如，癌症可以是胰腺癌、结肠癌、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、儿童小脑或脑基底细胞癌、胆管癌、肝外膀胱癌、骨癌、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、脑干胶质瘤、脑肿瘤、小脑星形细胞瘤脑瘤、脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤脑瘤、室管膜瘤脑瘤、髓母细胞瘤脑瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤脑瘤、视觉通路和下丘脑胶质瘤、乳腺癌、淋巴癌、支气管腺瘤/类癌、气管癌、伯基特淋巴瘤、类癌瘤、儿童类癌、不明原发性胃肠癌、中枢神经系统淋巴瘤、原发性小脑星形细胞瘤、儿童脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、儿童宫颈癌、儿童癌症、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、慢性骨髓增生性疾病、皮肤T细胞淋巴瘤、促纤维增生性小圆细胞瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤文氏肉瘤、儿童性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、眼癌、眼内黑色素瘤眼癌症、视网膜母细胞瘤、胆囊癌、胃(胃部)癌、胃肠道类癌、胃肠道间质瘤(GIST)、生殖细胞肿瘤：颅外、性腺外或卵巢、妊娠滋养细胞肿瘤、脑干胶质瘤、神经胶质瘤、儿童脑星形细胞瘤、儿童视觉通路和下丘脑神经胶质瘤、胃类癌、毛细胞白血病、头颈癌、心癌、肝细胞性(肝)癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、下丘脑和视觉通路胶质瘤、儿童眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、卡波西肉瘤、肾癌(肾细胞癌)、喉癌、白血病、急性淋巴细胞性(也称为急性淋巴细胞白血病)白血病、急性髓性(也称为急性髓性白血病)白血病、慢性淋巴细胞性(也称为慢性淋巴细胞白血病)白血病、慢性粒细胞性(也称为慢性粒细胞白血病)白血病、毛细胞唇癌和口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌(原发性)、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金(除霍奇金淋巴瘤外的所有淋巴瘤的旧分类)淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、骨恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤、儿童髓母细胞瘤、黑色素瘤、眼内(眼)黑色素瘤、默克尔细胞癌、成人恶性间皮瘤、儿童间皮瘤、转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌肿瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、蕈样肉芽肿、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、慢性髓性白血病、成人急性髓性白血病、儿童急性髓性白血病、多发性骨髓瘤、慢性骨髓增生性疾病、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口癌、口咽癌、骨肉瘤/恶性肿瘤、骨纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌(表面上皮-间质瘤)、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤、胰腺癌、胰岛细胞性鼻窦与鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤、儿童垂体腺瘤、浆细胞瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌症、直肠癌、肾细胞癌(肾癌)、肾盂和输尿管移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、儿童唾液腺癌肉瘤、尤文家族肿瘤、卡波西肉瘤、软组织肉瘤、子宫塞萨里综合征肉瘤、皮肤癌(非黑色素瘤)、皮肤癌(黑色素瘤)、皮肤癌、默克尔细胞小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、隐匿原发性颈部鳞状癌、转移性胃癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、儿童T细胞淋巴瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤、儿童胸腺瘤、胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、子宫内膜子宫肉瘤、阴道癌症、视觉通路和下丘脑胶质瘤、儿童外阴癌和肾母细胞瘤(肾癌)。

在一些实施方案中，癌症包括卵巢癌、前列腺癌、结肠癌或肺癌。在一些实施方案中，该方法用于通过使用本公开的方法评估无细胞核酸(例如，无细胞RNA)来确定卵巢癌、前列腺癌、结肠癌或肺癌的新生物标志物。在一些实施方案中，本公开的方法可用于从怀孕女性分离的胎儿RNA。在一些实施方案中，本公开的方法可用于使用从怀孕女性中分离的胎儿RNA进行产前诊断。在一些实施方案中，本公开的方法可用于评估受精胚胎，例如受精卵或胚泡，以确定胚胎质量或特定疾病标志物的存在或不存在。

V.检测遗传标志

特定实施方案涉及检测个体的遗传标志的方法。在一些实施方案中，检测遗传标志的方法可包括例如，选择性寡核苷酸探针、阵列、等位基因特异性杂交、分子信标、限制性片段长度多态性分析、酶链反应、瓣内切酶分析、引物延伸、5'-核酸酶分析、寡核苷酸连接测定、单链构象多态性分析、温度梯度凝胶电泳、变性高效液相色谱、高分辨率熔解、DNA错配结合蛋白分析、surveyor核酸酶测定、测序或其组合。用于检测遗传标志的方法可以包括例如荧光原位杂交、比较基因组杂交、阵列、聚合酶链式反应、测序或其组合。遗传标志的检测可以涉及使用特定方法来检测遗传标志的一种特征并且另外使用相同方法或不同方法来检测遗传标志的不同特征。可以使用多种不同方法独立地或组合地检测相同特征或多种特征。

A.单核苷酸多态性(SNP)检测

本公开的特定实施方案涉及检测个体中的SNP的方法。例如，可以采用任意已知的用于检测SNP的通用方法来检测本公开中的特定SNP。这种方法包括但不限于选择性寡核苷酸探针、阵列、等位基因特异性杂交、分子信标、限制性片段长度多态性分析、酶链反应、瓣内切核酸酶分析、引物延伸、5'-核酸酶分析、寡核苷酸连接测定、单链构象多态性分析、温度梯度凝胶电泳、变性高效液相色谱、高分辨率熔解、DNA错配结合蛋白分析、surveyor核酸酶测定、测序或其组合。

在本公开的一些实施方案中，用于检测SNP的方法包括对来自个体的核酸材料进行测序和/或使用选择性寡核苷酸探针。对来自个体的核酸材料进行测序可以涉及以例如基因组DNA、从RNA逆转录的互补DNA或RNA的形式从个体获得核酸材料。可以采用任意标准测序技术，包括Sanger测序、链延伸测序、Maxam-Gilbert测序、鸟枪法测序、桥式PCR测序、用于测序的高通量方法、下一代测序、RNA测序或它们的组合。在对来自个体的核酸进行测序之后，可以利用任意数据处理软件或技术来确定个体中存在于特定SNP处的特定核苷酸。

在一些实施方案中，通过选择性寡核苷酸探针检测特定SNP处的核苷酸。探针可用于来自个体的核酸材料，包括例如基因组DNA、从RNA逆转录的互补DNA或RNA。基于SNP上存在的特定核苷酸，选择性寡核苷酸探针优先结合互补链。例如，一种选择性寡核苷酸探针与互补链结合，该互补链在编码链上的SNP处具有A核苷酸，但在编码链上的SNP处不具有G核苷酸，而不同的选择性寡核苷酸探针与互补链结合，该互补链在编码链上的SNP处具有G核苷酸，但在编码链上的SNP处不具有A核苷酸。类似的方法可用于设计选择性结合编码链的探针，该编码链在SNP处具有C或T核苷酸但不是两者兼有。因此，确定一种选择性寡核苷酸探针与另一种选择性寡核苷酸探针的结合的任意方法都可以用于确定存在于SNP处的核苷酸。

一种用于使用寡核苷酸探针检测SNP的方法包括通过分光光度计和/或凝胶电泳测定分析核酸材料的质量和测量其数量的步骤；将核酸材料加工成具有至少一种选择性寡核苷酸探针、PCR引物和具有执行定量PCR(qPCR)所需组分的混合物的反应混合物，该混合物可以包括聚合酶、脱氧核苷酸和用于反应的合适缓冲液；循环处理过的反应混合物，同时监测反应。在该方法的一个实施方案中，用于qPCR的聚合酶将遇到与被扩增的链结合的选择性寡核苷酸探针，并且利用核酸内切酶活性来降解选择性寡核苷酸探针。检测降解的探针确定探针是否与扩增链结合。

确定选择性寡核苷酸探针与特定核苷酸结合的另一种方法包括使用选择性寡核苷酸探针作为PCR引物，其中选择性寡核苷酸探针优先结合SNP位置处的特定核苷酸。在一些实施方案中，探针通常设计为使探针的3'端与SNP配对。因此，如果探针具有正确的互补碱基以与SNP处的特定核苷酸配对，则探针将在PCR的扩增步骤期间延伸。例如，如果探针的3'位置处有T核苷酸，而SNP位置处有A核苷酸，则探针将与SNP结合并且在PCR的扩增步骤中延伸。然而，如果使用相同的探针(在3'端有T)并且SNP位置处有G核苷酸，则探针将不会完全结合并且不会在PCR的扩增步骤中延伸。

在一些实施方案中，SNP位置不在PCR引物的末端，而是位于PCR引物内。PCR引物应该具有足够的长度和同源性，因为PCR引物可以选择性地结合一种变体，例如具有A核苷酸的SNP，但不结合另一种变体，例如具有G核苷酸的SNP。PCR引物还可以设计为选择性地特别结合具有G核苷酸的SNP，但不结合具有A、C或T核苷酸的变体。类似地，PCR引物可以设计为与具有C或T核苷酸但不同时具有C或T核苷酸的SNP结合，然后其不与分别具有G、A或T核苷酸或G、A或C核苷酸的变体结合。在特定实施方案中，PCR引物长度为至少或不超过10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个或多于75个的核苷酸与模板序列具有100％同源性，但SNP位置可能存在非同源性。经过几轮扩增后，如果PCR引物产生预期的条带大小，则可以确定SNP具有A核苷酸而不是G核苷酸。

B.拷贝数变异检测

本公开的特定实施方案涉及检测特定等位基因的拷贝数变异(CNV)的方法。可以利用任意已知的检测CNV的方法来检测CNV。这种方法包括例如荧光原位杂交、比较基因组杂交、阵列、聚合酶链式反应、测序或其组合。在一些实施方案中，使用阵列检测CNV，其中该阵列能够检测整个X染色体和/或miR-362的所有靶标上的CNV。可以使用来自Agilent、Illumina或Affymetrix的阵列平台，或者可以设计定制阵列。可以如何使用阵列的一个实例包括的方法包括以下一个或多于一个步骤：以合适的方式从疑似患有CNV的个体中分离核酸材料，并且至少在某些情况下从不具有CNV的个体或参考基因组中分离核酸材料；通过片段化处理核酸材料，用例如荧光标记物标记核酸，以及纯化片段化和标记的核酸材料；使核酸材料与阵列杂交足够长的时间，例如至少24小时；杂交后清洗阵列；使用阵列扫描仪扫描阵列；并且使用合适的软件分析阵列。该软件可用于将来自疑似患有CNV的个体的核酸材料与已知不具有CNV或参考基因组的个体的核酸材料进行比较。

在一些实施方案中，CNV的检测是通过聚合酶链式反应(PCR)实现的。PCR引物可用于在CNV处或其附近扩增核酸，其中与来自参考基因组的PCR产物相比，具有CNV的个体将产生可测量的更高水平的PCR产物。例如，PCR产物量的检测可以通过定量PCR(qPCR)来测量或通过凝胶电泳来测量。使用凝胶电泳进行定量包括将所得PCR产物与已知大小的核酸标准一起经受琼脂糖凝胶上的电流，并且测量所得条带的大小和强度。所得条带的大小可以与已知标准进行比较以确定所得条带的大小。在一些实施方案中，使用与用于检测CNV相同的引物，CNV的扩增将产生比从参考基因组或没有检测到CNV的个体进行扩增的条带更大尺寸的条带。CNV扩增产生的条带可能是参考基因组产生的条带或没有检测到CNV的个体产生的条带的近两倍、两倍或大于两倍。在一些实施方案中，可以使用核酸测序来检测CNV。可以使用的测序技术包括但不限于全基因组测序、全外显子组测序和/或靶向测序。

C.DNA测序

在一些实施方案中，DNA可以通过测序进行分析。可以通过本领域已知的任意方法制备DNA用于测序，例如文库制备、杂交捕获、样品质量控制、基于利用产物的连接的文库制备或其组合。可以为任意测序技术制备DNA。在一些实施方案中，可以通过对一个或多于一个高度多态性SNP进行基因分型来生成每个样品的独特基因读取。在一些实施方案中，可以进行测序，例如76个碱基对、双末端测序，以大于20x、25x、30x、35x、40x、45x、50x或大于50x的覆盖率来覆盖大约70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或大于99％的百分比的靶标。在某些实施方案中，突变、SNP、插入缺失、拷贝数改变(体细胞和/或种系)或其他遗传差异可以使用至少一种生物信息学工具，包括VarScan2、任意R包(包括CopywriteR)和/或Annovar进行识别。

D.RNA测序

在一些实施方案中，RNA可以通过测序进行分析。可以通过本领域已知的任意方法制备RNA用于测序，例如多聚腺苷酸选择、cDNA合成、链或非链文库制备或其组合。可以为任意类型的RNA测序技术制备RNA，包括链特异性RNA测序。在一些实施方案中，可以执行测序以产生大约10M、15M、20M、25M、30M、35M、40M或多于40M的读取，包括配对读取。可以以大约50bp、55bp、60bp、65bp、70bp、75bp、80bp、85bp、90bp、95bp、100bp、105bp、110bp或长于110bp的读取长度进行测序。在一些实施方案中，原始测序数据可以转换为估计的读取计数(RSEM)、每百万映射读取每千个碱基的转录物的片段数(FPKM)和/或每百万映射读取每千个碱基的转录物的读取(RPKM)。在一些实施方案中，一个或多于一个生物信息学工具可用于推断基质含量、免疫浸润和/或肿瘤免疫细胞谱，例如通过使用上四分位标准化RSEM数据。

E.蛋白质组学

在一些实施方案中，蛋白质可以通过质谱分析。可以使用本领域已知的任意方法制备蛋白质用于质谱分析。蛋白质，包括本文涵盖的任意分离的蛋白质，可以用DTT处理，然后用碘乙酰胺处理。蛋白质可以与至少一种肽酶一起孵育，包括内肽酶、蛋白水解酶、蛋白酶或任意切割蛋白质的酶。在一些实施方案中，蛋白质与内肽酶、LysC和/或胰蛋白酶一起孵育。蛋白质可以与一种或多于一种蛋白质裂解酶以任意比率孵育，包括μg酶与μg蛋白质的比率为约1:1000、1:100、1:90、1:80、1:70、1:60、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:1或介于其中任意两者之间的范围。在一些实施方案中，可以纯化切割的蛋白质，例如通过柱纯化。在某些实施方案中，纯化的肽可以速冻和/或干燥，例如在真空下干燥。在一些实施方案中，纯化的肽可以分级分离，例如通过反相色谱法或碱性反相色谱法。可以组合级分以实施本公开的方法。在一些实施方案中，一个或多于一个级分，包括合并的级分，进行磷酸肽富集，包括通过亲和层析和/或结合、离子交换层析、化学衍生化、免疫沉淀、共沉淀或其组合进行的磷富集。一个或多于一个级分的全部或一部分，包括合并的级分和/或富含磷的级分，可以进行质谱分析。在一些实施方案中，可以使用至少一种相关的生物信息学工具对原始质谱数据进行处理和归一化。

VI.试剂盒

本发明另外提供用于执行本公开的方法的试剂盒。试剂盒的内容物可以包括在整个公开中描述的一种或多于一种试剂和/或本领域已知的用于执行在整个公开中描述的一个或多于一个步骤的一种或多于一种试剂。例如，试剂盒可以包括以下的一种或多于一种：S-腺苷-1-甲硫氨酸(SAM)类似物、甲基转移酶(例如，MjDim1)、逆转录酶(例如，HIV逆转录酶、M-MuLV逆转录酶、Klentaq聚合酶、Bst聚合酶(例如Bst 2.0聚合酶、Bst 3.0聚合酶)等)、去甲基化酶、核酸酶(例如RNA酶H)、无核酸酶水、一种或多于一种引物、SPRI珠、磁珠、DNA聚合酶、taq聚合酶、dNTP、DNA聚合酶缓冲液、逆转录酶缓冲液、二价阳离子、单价阳离子、RNA聚合酶、DTT、氧化还原试剂、Mg²⁺、K⁺、Mn²⁺、衔接子、蛋白酶和/或NTP。

试剂盒可以包括用于修饰甲基化含氮碱基的一种或多于一种试剂，例如去甲基化酶、SAM类似物等。

一种或多于一种试剂优选以适合库存储存的固体形式或液体缓冲液供应，随后在执行使用试剂的方法时添加到反应介质中。提供合适的包装。试剂盒可以任选地提供在该过程中有用的附加组分。这些任选组分包括缓冲液、捕获试剂、显影试剂、标记、反应表面、检测工具、对照样品、说明和解释信息。

每个试剂盒还可包括用于扩增核酸、或测序核酸或如本文所述的本公开的其他应用的附加组分。试剂盒可以任选地提供在该过程中有用的附加组分。这些任选组分包括缓冲液、捕获试剂、显影试剂、标记、反应表面、检测工具、对照样品、说明和解释信息。

实施例

包括以下实施例以展示本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解，以下实施例中公开的技术代表发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术，因此可以认为构成其实践的优选模式。然而，本领域技术人员应该根据本公开内容理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方案进行许多改变并且仍然获得同样或相似的结果。

实施例1–m⁶A标记

与位于核碱基的Watson-Crick面并且影响逆转录的N¹-甲基腺苷(m¹A)不同，N⁶-甲基腺苷(m⁶A)在逆转录后会丢失其所有修饰信息。m⁶A和A之间的化学相似性使得区分两者具有挑战性，并且m⁶A上甲基基团的惰性特性排除了基于化学的选择性标记。Dim1/KsgA二甲基转移酶家族可以将四个甲基基团从S-腺苷-l-甲硫氨酸(SAM)转移到小亚基rRNA的两个腺苷上³。根据生物化学研究，詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcus jannaschii)同源物Mjdim1是三种测试酶中最有效的二甲基转移酶，并且在将m⁶A转化为m⁶ ₂A方面显示出高度进行性动力学⁴。为了开发检测m⁶A的方法和组合物，SAM的甲基被烯丙基替代，由此产生类似的烯丙基-SAM⁵。

用烯丙基-SAM置换SAM辅因子使Mjdim1酶对m⁶A比未修饰的腺苷具有明显底物偏好。图1B显示用Mjdim1和烯丙基-SAM处理的所示含m⁶A的12聚体模板RNA的基于基质辅助激光解吸/电离(MALDI)的质谱表征。额外的分子量代表烯丙基。图1C显示所示12聚体模板RNA的基于MALDI的质谱表征，其中不包含任意m⁶A。该数据表明没有额外的分子量，表明没有产生新产物。

烯丙基修饰的m⁶A(am⁶A)可通过I₂化学转化为N¹、N⁶-桥亚乙基腺嘌呤(也称为桥亚乙基腺嘌呤-m⁶A或EA)⁶。在逆转录后，可以在对应于EA的残基处产生突变。图1A显示转换和突变产生过程的示意图。该过程后，对m⁶A进行化学标记并且表示为整个转录组水平的突变，而未修饰腺苷位点的“非特异性”修饰仍然低。图1D显示Mjdim1催化的am⁶A和a⁶A修饰对Maldi_Probe_m⁶A和Maldi_Probe_A的Michaelis-Menten稳态动力学。K_m相似，而酶对m⁶A的K_cat是未修饰腺苷的10倍。

实施例2–用m⁶A-sac-seq检测N⁶-甲基腺苷

实施例1中描述的通用方法命名为m⁶A选择性烯丙基化学标记和测序，或m⁶A-sac-seq。m⁶A-sac-seq过程的示例过程在图2中显示并且为如下：

i)纯化的RNA与寡聚脱氧胸苷退火，用RNA酶H消化以去除多聚腺苷酸尾，然后片段化成长度为约150bp的多聚核苷酸片段。

ii)一部分RNA进行文库构建，无需额外处理为参考输入组。

iii)作为实验组，在优化的条件下，用重组MjDim1酶和烯丙基-SAM辅因子对一部分RNA进行酶标记。

iv)用FTO处理一部分RNA样品以擦除m⁶A位点，然后进行酶标记，这认为是背景噪声组。

v)将I₂添加到回收的RNA中以诱导环化和形成桥亚乙基腺嘌呤-m⁶A同源物。cDNA是用逆转录酶(例如HIV逆转录酶)合成的，am⁶A位点信息是从桥亚乙基腺嘌呤-m⁶A诱导的突变中推断出的。比较处理的RNA与参考输入组和背景噪声组的结果用于准确识别转录组中的m⁶A位点。

为了识别错误插入模式，m⁶A-sac-seq使用含有NNm⁶ANN的探针进行。图3C显示Mjdim1的序列选择性。图3D显示所示m⁶A共有基序(DRACH基序，其中D＝A、G或U；R＝嘌呤；和H＝A、C或U)的突变率，证明该方法能够恢复几乎所有典型m⁶A基序。含有Gm⁶AC的基序趋于表现出较高的突变率(≥30％)，而含有Am⁶AC的基序的突变率相对较低，但仍然显著(5％-10％)。

Hela mRNA与梯度的m⁶A修饰的标定探针(0％、25％、50％、100％41bp RNA探针)混合并且进行m⁶A-sac-seq，然后进行深度测序。与相邻的未修饰A/C/U/G位点相比，标定探针中的m⁶A位点确实显示出显著的突变率(图3A)。突变率与m⁶A的量线性相关(R²＝0.97)(图3B)，证明该方法的定量能力。有趣的是，与a⁶A相比，am⁶A的突变率更高。因此，即使在未修饰的腺苷被烯丙基修饰(即非特异性修饰)的情况下，与am⁶A相比，所得a⁶A产生的突变为约10分之一(图3E和3F)。图3E显示使用HIV RT酶由含有GGam⁶ACU或GGa⁶ACU基序的循环验证探针诱导的错配比例。图3F显示使用HIV RT酶由含有NNam⁶ANN或NNa⁶ANN基序的循环验证探针诱导的错配比例；NNam⁶ANN代表特定的m⁶A标记产物，而NNa⁶ANN代表A修饰的非特定副产物。

实施例3–m⁶A转录组映射和验证

m⁶A-sac-seq方法用于映射Hela和HEK细胞转录组中的m⁶A位点。图4显示概述m⁶A量化所遵循的生物信息学工作流程的流程图。识别了约2000个高度可信和冗余的m⁶A位点。所识别位点的概览示于图5A。图5B显示描述终止密码子周围窗口中序列覆盖的元基因谱；饼图表示六个非重叠转录片段的各个片段中Hela m⁶A位点的比例。该数据表明m⁶A位点是规律分布的，在终止密码子附近富集⁷。图5C显示m⁶A位点在MeRIP峰的高倍富集中富集。图5D显示m⁶A在六个非重叠转录片段的各个片段中的分布：3'UTR、CDS、基因间、内含子、ncRNA和5'UTR(在每个图表部分中从左到右显示)。

使用SELECT方法选择并且验证一个m⁶A阴性位点和四个m⁶A阳性位点⁸。两种方法获得的结果是一致的(图6A和6B)，证明m⁶A-sac-seq方法的准确性。

实施例4–Klentaq酶在m⁶A位点产生突变

野生型Klentaq用于使用含有am⁶A的模板和含有a⁶A的模板诱导逆转录。图7A显示野生型Klentaq酶的通读效率仅为约10％。图7B显示am⁶A在逆转录期间用野生型Klentaq酶诱导约50％的错误插入(即突变)，而a⁶A给出接近背景突变水平。提供Mn²⁺并且进行模板的逆转录。图7C显示添加Mn²⁺将通读效率提高至约90％。

实施例5–Klentaq酶定向进化

野生型Klentaq经受如图8中概述的定向进化。RNA核酸适配体Broccoli结合DFHB1并激活DFHB1的荧光并且显示出强烈的绿色荧光，通过用am⁶A替换它们而在多个位点工程化改造。只有当Klentaq变体在最佳逆转录缓冲液条件下诱导错误插入时，这种工程化的Broccoli才结合DFHB 1T并且发出绿色荧光。

实施例6–使用修饰的Klentaq酶用m⁶A-sac-seq检测N⁶-甲基腺苷

使用修饰的Klentaq酶的另一个实例m⁶A-sac-seq方法的概述显示在图9中并且执行如下：

i)纯化的RNA与寡聚脱氧胸苷退火，用RNA酶H消化以去除多聚腺苷酸尾，然后片段化成长度为约150bp的多聚核苷酸片段。

ii)片段化的RNA样品平均分为2部分：参考输入组和实验组。参考输入组通过文库构建处理，而无需额外处理。

iii)实验组中的RNA在优化条件下通过重组MjDim1和烯丙基-SAM辅因子进行烯丙基标记。

iv)使用进化的Klentaq酶合成cDNA，该酶直接将am⁶A位点读取为突变，a⁶A位点给出接近背景的突变率。

v)将处理后的RNA与参考输入的结果进行比较，确定转录组中的m⁶A位点。具有梯度m⁶A水平的校准探针用于识别每个修饰位点的修饰比例信息。

实施例7–使用Bst酶用m⁶A-sac-seq检测N⁶-甲基腺苷

Bst 2.0酶用于使用含有环化am⁶A(桥亚乙基腺嘌呤-m⁶A)的模板和含有环化a⁶A(N¹,N⁶-桥亚乙基腺嘌呤)的模板诱导逆转录。图10A显示Bst 2.0酶的通读效率为约100％。图10B显示环化的am⁶A在逆转录期间诱导约80％的与Bst2.0酶的错误插入(即突变)，而环化的a⁶A接近背景突变水平。

使用Bst酶(例如，Bst 2.0或Bst 3.0)的另一个示例性m⁶A-sac-seq方法的概述显示在图11中并且执行如下：

i)纯化的RNA与寡聚脱氧胸苷退火，用RNA酶H消化以去除多聚腺苷酸尾，然后片段化为约150个核苷酸。

ii)片段化的RNA样品平均分为2个部分：参考输入组和实验组。参考输入组将通过文库构建处理，而无需额外处理。

iii)实验组中的RNA将在优化条件下，通过重组MjDim1和烯丙基-SAM辅因子进行烯丙基标记，然后进行I₂诱导环化。

iv)使用Bst酶合成cDNA，该酶直接将am⁶A位点读取为突变，a⁶A位点给出接近背景的突变率。

v)将处理后的RNA与参考输入的结果进行比较，确定转录组中的m⁶A位点。使用具有梯度m⁶A水平的校准探针可以产生在每个修饰位点处的修饰比例信息。

实施例8–Bst 2.0在m⁶A位点上特异性诱导突变并且区分甲基化和非甲基化位点

结果

为了使用Bst 2.0评估对N⁶-烯丙基N⁶-甲基腺苷(am⁶A)的突变影响，对具有NNm⁶ANN或NNam⁶ANN基序的合成RNA探针进行m⁶A-sac-seq实验计划和随后的高通量测序。N代表均匀分布的随机核苷酸，因此在每组探针中包括256个不同基序。对于NNm⁶ANN探针，使用预先混合的、独特的条形码探针，这些探针分别含有0％、25％、50％、75％和100％修饰水平的m⁶A。使用Mjdim1对这些探针进行烯丙基转移，如标准m6A-sac-seq(在实施例2中描述)中那样，I₂诱导环化，然后使用BST 2.0进行逆转录。中间有化学合成的烯丙基化m⁶A(am⁶A)的NNam⁶ANN探针用作未经Mjdim1处理的对照。为了进一步评估由Mjdim1对未甲基化A的非特异性活性产生的来自N⁶-烯丙基腺苷(a⁶A)的背景突变，在Mjdim1处理和环化作为对照之前，如实施例2中所述，一半的NNm⁶ANN探针通过FTO去甲基化。

当使用具有100％m⁶A修饰水平的探针时，可以在4个DRACH m⁶A共有基序包括最丰富的AGACU/GGACU上实现高于50％的突变率，同时具有最小的背景(小于5％)(图12A)。GGACU基序突变在具有不同m⁶A比例的探针上的线性回归显示出中等线性，具有持续低的背景突变(图12B)。此外，对通过FTO去甲基化和不去甲基化的NNm⁶ANN探针进行Mjdim1处理、I₂诱导环化，然后使用BST 2.0进行逆转录。没有去甲基化的所有256个基序显示出显著的突变，而对于具有通过FTO去甲基化的m⁶A的相同探针观察到非常低的突变(图12C)。最后，已经在m⁶A上以100％水平含有烯丙基的预烯丙基化am⁶A探针在所有基序中产生高突变率，并且在所有DRACH基序上产生>25％的突变，表明Bst 2.0酶在所有序列环境中均有效。

这些结果表明，Bst 2.0能够产生与标准m⁶A-sac-seq程序中HIV RT产生的突变率相当的突变率(例如，如实施例2中所述)。最重要的是，这种酶在未甲基化A位点上产生非常低的突变，消除背景突变。使用Bst 2.0可以消除在m⁶A-sac-seq中使用去甲基化控制(例如FTO处理)的需要。

方法

通过将固定在20μL Dynabeads MyOne链霉亲和素C1(ThermoFisher)上的50ng生物素化RNA与1μL 2μM序列特异性引物混合，在珠上进行Bst逆转录。在65℃变性2分钟后，加入4.5μL 10x等温扩增缓冲液(NEB)、4.5μL 10mM dNTP(ThermoFisher)、2.7μL 100mMMgSO₄(NEB)、1.1μL RNaseOUT(ThermoFisher)，7.2μL 50％PEG 4000(Rigaku)和5μL 120U/μL Bst 2.0(M0537M,NEB)。充分混合后，将反应在37℃下孵育3小时。然后用50μL 10mMTris-HCl pH 7.5冲洗珠，并且重新悬浮在17μL的无RNA酶的水中。添加2μL 10x RNA酶H缓冲液(NEB)和1μL RNA酶H(NEB)后，将反应在37℃下进一步孵育20分钟。通过在1x PBS、50μL结合/洗涤缓冲液(10mM Tris-HCl pH 7.5、1mM EDTA、2M NaCl)中依次用50μL 0.1％(体积/体积)吐温20、两次使用50μL 10mM Tris-HCl pH 7.5冲洗珠来纯化产物cDNA。通过在95℃下将珠在50μL无RNA酶的水中煮沸10分钟来释放RNA。所得cDNA可用于下游NGS文库构建。

使用的探针如下：

0％NNm6ANN探针-

UAUCUGUCUCGACGUNN(m⁶A)NNGGCCUUUGCAACUAGAAUUACACCAUAAUUGCU；

25％NNm⁶ANN探针-

UAUCUGUCUCGACGUNN(m⁶A)NNGGCAUUCAAGCCUAGAAUUACACCAUAAUUGCU；

50％NNm6ANN探针-

UAUCUGUCUCGACGUNN(m⁶A)NNGGCGAGGUGAUCUAGAAUUACACCAUAAUUGCU；

75％NNm⁶ANN探针-

UAUCUGUCUCGACGUNN(m6A)NNGGCUUCAACAACUAGAAUUACACCAUAAUUGCU；

100％NNm⁶ANN探针-

UAUCUGUCUCGACGUNN(m⁶A)NNGGCGAUGGUUUCUAGAAUUACACCAUAAUUGCU。

所有(m⁶A)位点都可置换为A，然后两者可以以所需的修饰比例混合。

NNam⁶ANN探针：UCGACGUNN(am⁶A)NNGGCATTGCT。

***

根据本公开，无需过度实验即可制作和执行本文公开和要求保护的所有方法。尽管本发明的组合物和方法已根据优选实施方案进行描述，但对于本领域技术人员来说，显然可以对本文所述方法和方法的步骤或步骤顺序施加变化而不脱离本发明的概念、精神和范围。更具体地，很明显，某些化学和生理相关的试剂可以替代本文所述的试剂，同时将获得相同或相似的结果。对本领域技术人员而言明显的所有这些类似的替代和修改都认为在所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念之内。

参考文献

以下参考文献，在它们提供示例性程序或对本文阐述内容补充的其他细节的范围内，具体通过引用并入本文。

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Claims (166)

1.一种用于检测核酸分子的甲基化核苷酸的方法，包括：

(a)在足以将官能团连接至甲基化核苷酸的条件下，将核酸分子与甲基转移酶和包含官能团的S-腺苷-l-甲硫氨酸(SAM)类似物一起孵育；

(b)使核酸分子经受足以产生互补核酸分子的条件，所述互补核酸分子包含在对应于甲基化核苷酸的残基处的突变；和

(c)对互补核酸分子进行测序。

2.根据权利要求1所述的方法，其中甲基化核苷酸是甲基化腺苷。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述甲基化核苷酸是N⁶-甲基腺苷。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中官能团与SAM类似物的硫原子连接。

5.根据权利要求4所述的方法，其中SAM类似物具有式：

其中R包含官能团。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中官能团不是甲基。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中官能团具有至少两个碳原子。

8.根据权利要求7所述的方法，其中官能团是具有至少两个碳的烷基或具有至少两个碳的烯基。

9.根据权利要求8所述的方法，其中官能团是烯丙基基团。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述SAM类似物具有式：

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中在适当条件下，相对于未甲基化核苷酸，甲基转移酶能够优先将官能团连接至甲基化核苷酸。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中甲基转移酶是RNA甲基转移酶。

13.根据权利要求12所述的方法，其中RNA甲基转移酶是二甲基转移酶。

14.根据权利要求13所述的方法，其中二甲基转移酶是Dim1/KsgA二甲基转移酶。

15.根据权利要求14所述的方法，其中二甲基转移酶是Dim1或KsgA。

16.根据权利要求15所述的方法，其中二甲基转移酶是HsDim1、ScDim1或MjDim1。

17.根据权利要求16所述的方法，其中二甲基转移酶是MjDim1。

18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，还包括将核酸分子与双原子卤素分子一起孵育。

19.根据权利要求18所述的方法，其中将核酸分子与双原子卤素分子一起孵育是将来自双原子卤素分子的卤素原子连接至核苷酸。

20.根据权利要求19所述的方法，其中双原子卤素分子是碘(I₂)。

21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中(b)包括使核酸分子与逆转录酶(RT)进行逆转录反应以产生互补核酸分子。

22.根据权利要求21所述的方法，其中互补核酸分子是cDNA分子。

23.根据权利要求21或22所述的方法，其中RT是HIV RT或其变体、M-MuLV RT或其变体、AMV RT或其变体、Klentaq聚合酶或其变体或Bst聚合酶或其变体。

24.根据权利要求23所述的方法，其中RT是Bst聚合酶或其变体。

25.根据权利要求24所述的方法，其中RT是Bst 2.0DNA聚合酶。

26.根据权利要求23所述的方法，其中RT是Klentaq聚合酶或其变体。

27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中测序包括下一代测序。

28.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中测序包括单分子测序。

29.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中测序包括纳米孔测序。

30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中甲基化核苷酸是甲基化腺苷，并且其中残基不包括腺嘌呤。

31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中甲基化核苷酸是甲基化腺苷，并且其中残基包括鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶。

32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，还包括将另外的核酸分子中的突变鉴定为对应于甲基化核苷酸。

33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中核酸分子是核糖核酸分子。

34.根据权利要求33所述的方法，其中核糖核酸分子是信使RNA(mRNA)分子。

35.根据权利要求34所述的方法，还包括在(a)之前，向mRNA分子提供寡聚脱氧胸苷引物以产生双链区。

36.根据权利要求35所述的方法，还包括提供核酸酶并且使mRNA经受足以用核酸酶消化双链区的条件。

37.根据权利要求36所述的方法，其中核酸酶是RNA酶H。

38.根据权利要求1-37中任一项所述的方法，其中核酸分子是较长核酸的片段。

39.根据权利要求38所述的方法，其中片段的长度为100个至200个核苷酸。

40.根据权利要求1-39中任一项所述的方法，其中核酸分子是从对象样品中分离出来的。

41.根据权利要求40所述的方法，其中核酸分子是从活检样品中分离出来的。

42.根据权利要求40或41所述的方法，其中样品是液体样品。

43.根据权利要求1-42中任一项所述的方法，其中核酸分子是从囊泡中分离出来的。

44.根据权利要求43所述的方法，其中囊泡是外泌体。

45.根据权利要求1-42中任一项所述的方法，其中核酸分子是无细胞核酸分子。

46.根据权利要求45所述的方法，其中无细胞核酸分子是无细胞RNA(cfRNA)分子。

47.一种试剂盒，其包含：

(a)包含官能团的S-腺苷-l-甲硫氨酸(SAM)类似物；和

(b)二甲基转移酶。

48.根据权利要求47所述的试剂盒，其中在适当条件下，相对于未甲基化核苷酸，二甲基转移酶能够优先将官能团连接至甲基化核苷酸。

49.根据权利要求47或48所述的试剂盒，其中二甲基转移酶是RNA甲基转移酶。

50.根据权利要求49所述的试剂盒，其中二甲基转移酶是Dim1/KsgA二甲基转移酶。

51.根据权利要求50所述的试剂盒，其中二甲基转移酶是Dim1或KsgA。

52.根据权利要求51所述的试剂盒，其中二甲基转移酶是HsDim1、ScDim1或MjDim1。

53.根据权利要求52所述的试剂盒，其中二甲基转移酶是MjDim1。

54.根据权利要求47-53中任一项所述的试剂盒，其中官能团与SAM类似物的硫原子连接。

55.根据权利要求54所述的试剂盒，其中SAM类似物具有式：

其中R包含官能团。

56.根据权利要求47-55中任一项所述的试剂盒，其中官能团不是甲基基团。

57.根据权利要求47-56中任一项所述的试剂盒，其中官能团具有至少两个碳原子。

58.根据权利要求57所述的试剂盒，其中官能团是具有至少两个碳的烷基或具有至少两个碳的烯基。

59.根据权利要求58所述的试剂盒，其中官能团是烯丙基基团。

60.根据权利要求59所述的试剂盒，其中SAM类似物具有式：

61.根据权利要求47-60中任一项所述的试剂盒，还包含寡聚脱氧胸苷引物。

62.根据权利要求47-61中任一项所述的试剂盒，还包含核酸酶。

63.根据权利要求62所述的试剂盒，其中核酸酶是RNA酶H。

64.根据权利要求47-63中任一项所述的试剂盒，还包含逆转录酶(RT)。

65.根据权利要求64所述的试剂盒，其中RT是HIV RT或其变体、M-MuLV RT或其变体、AMV RT或其变体、Bst聚合酶或其变体或Klentaq聚合酶或其变体。

66.根据权利要求65所述的试剂盒，其中RT是Bst聚合酶或其变体。

67.根据权利要求66所述的试剂盒，其中RT是Bst 2.0DNA聚合酶。

68.根据权利要求65所述的试剂盒，其中RT是Klentaq聚合酶或其变体。

69.根据权利要求47-68中任一项所述的试剂盒，还包含RNA去甲基化酶。

70.根据权利要求69所述的试剂盒，其中RNA去甲基化酶是脂肪量和肥胖相关蛋白(FTO)。

71.根据权利要求47-70中任一项所述的试剂盒，还包含锰盐。

72.根据权利要求47-71中任一项所述的试剂盒，还包含dNTP。

73.根据权利要求47-72中任一项所述的试剂盒，还包含无核酸酶水。

74.一种用于分析包含N⁶-甲基腺苷的甲基化信使核糖核酸(mRNA)分子的方法，所述方法包括：

(a)将mRNA分子片段化以产生包含N⁶-甲基腺苷的片段；

(b)在足以将烯丙基基团连接至片段中的N⁶-甲基腺苷的条件下，提供甲基转移酶和包含烯丙基基团的S-腺苷-1-甲硫氨酸(SAM)类似物；

(c)在足以产生包含对应于N⁶-甲基腺苷的残基的cDNA分子的条件下将片段与逆转录酶一起孵育，其中残基包括鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶；

(d)对cDNA分子进行测序以产生序列；和

(e)使用序列识别mRNA分子中N⁶-甲基腺苷的位置。

75.根据权利要求74所述的方法，还包括在(a)之前，在足以使寡聚脱氧胸苷引物与mRNA分子区域杂交的条件下，将mRNA分子与寡聚脱氧胸苷引物一起孵育，从而产生双链区。

76.根据权利要求75所述的方法，还包括在足以消化双链区的条件下提供核酸酶。

77.根据权利要求76所述的方法，其中核酸酶是RNA酶H。

78.根据权利要求74-77中任一项所述的方法，其中SAM类似物具有式：

79.根据权利要求74-78中任一项所述的方法，其中甲基转移酶是RNA甲基转移酶。

80.根据权利要求79所述的方法，其中RNA甲基转移酶是二甲基转移酶。

81.根据权利要求80所述的方法，其中二甲基转移酶是Dim1/KsgA二甲基转移酶。

82.根据权利要求81所述的方法，其中二甲基转移酶是Dim1或KsgA。

83.根据权利要求82所述的方法，其中二甲基转移酶是HsDim1、ScDim1或MjDim1。

84.根据权利要求83所述的方法，其中二甲基转移酶是MjDim1。

85.根据权利要求74-84中任一项所述的方法，还包括在(b)之后，将mRNA分子与双原子卤素分子一起孵育。

86.根据权利要求85所述的方法，其中将mRNA分子与双原子卤素分子一起孵育将来自双原子卤素分子的卤素原子连接至核苷酸。

87.根据权利要求85或86所述的方法，其中双原子卤素分子是碘(I₂)。

88.根据权利要求74-87中任一项所述的方法，其中逆转录酶(RT)是HIV RT或其变体、M-MuLV RT或其变体、AMV RT或其变体、Bst聚合酶或其变体或Klentaq聚合酶或其变体。

89.根据权利要求88所述的方法，其中RT是Bst聚合酶或其变体。

90.根据权利要求89所述的方法，其中RT是Bst 2.0DNA聚合酶。

91.根据权利要求88所述的方法，其中RT是Klentaq聚合酶或其变体。

92.根据权利要求74-91中任一项所述的方法，其中片段的长度为100个至200个核苷酸。

93.根据权利要求74-92中任一项所述的方法，其中mRNA分子是从对象样品中分离出来的。

94.根据权利要求93所述的方法，其中mRNA分子是从活检样品中分离出来的。

95.根据权利要求93或94所述的方法，其中样品是液体样品。

96.根据权利要求74-95中任一项所述的方法，其中mRNA分子是从囊泡中分离出来的。

97.根据权利要求96所述的方法，其中囊泡是外泌体。

98.根据权利要求74-84中任一项所述的方法，其中mRNA分子是无细胞核糖核酸(cfRNA)分子。

99.一种用于修饰在氮原子处甲基化的含氮碱基的方法，包括：

(a)提供甲基转移酶和包含官能团的S-腺苷-l-甲硫氨酸(SAM)类似物；和

(b)使甲基转移酶和SAM类似物经受足以将官能团连接至氮原子的条件。

100.根据权利要求99所述的方法，其中含氮碱基是核苷的含氮碱基。

101.根据权利要求100所述的方法，其中含氮碱基是核苷酸的含氮碱基。

102.根据权利要求101所述的方法，其中核苷酸是核糖核酸(RNA)的核苷酸。

103.根据权利要求102所述的方法，其中核苷酸是甲基化腺苷。

104.根据权利要求103所述的方法，其中核苷酸是N⁶-甲基腺苷。

105.根据权利要求99-104中任一项所述的方法，还包括将含氮碱基与双原子卤素分子一起孵育。

106.根据权利要求105所述的方法，其中双原子卤素分子是碘(I₂)。

107.根据权利要求99-106中任一项所述的方法，其中在适当条件下，相对于未甲基化核苷酸，甲基转移酶能够优先将官能团连接至甲基化核苷酸。

108.根据权利要求99-107中任一项所述的方法，其中甲基转移酶是RNA甲基转移酶。

109.根据权利要求108所述的方法，其中RNA甲基转移酶是二甲基转移酶。

110.根据权利要求109所述的方法，其中二甲基转移酶是Dim1/KsgA二甲基转移酶。

111.根据权利要求110所述的方法，其中二甲基转移酶是Dim1或KsgA。

112.根据权利要求111所述的方法，其中二甲基转移酶是HsDim1、ScDim1或MjDim1。

113.根据权利要求112所述的方法，其中二甲基转移酶是MjDim1。

114.根据权利要求99-113中任一项所述的方法，其中官能团与SAM类似物的硫原子连接。

115.根据权利要求114所述的方法，其中SAM类似物具有式：

其中R包含官能团。

116.根据权利要求99-115中任一项所述的方法，其中官能团不是甲基基团。

117.根据权利要求99-116中任一项所述的方法，其中官能团具有至少两个碳原子。

118.根据权利要求117所述的方法，其中官能团是具有至少两个碳的烷基或具有至少两个碳的烯基。

119.根据权利要求118所述的方法，其中官能团是烯丙基基团。

120.根据权利要求119所述的方法，其中SAM类似物具有式：

121.一种用于检测核糖核酸中甲基化核苷酸的方法，包括：

(a)将官能团连接至核苷酸上的氮原子；

(b)从核糖核酸产生互补核酸，所述互补核酸包含在对应于核苷酸的残基处的突变；和

(c)对互补核酸进行测序。

122.根据权利要求121所述的方法，其中核苷酸是甲基化腺苷。

123.根据权利要求122所述的方法，其中核苷酸是N⁶-甲基腺苷。

124.根据权利要求121-123中任一项所述的方法，其中(a)包括提供包含官能团的S-腺苷-1-甲硫氨酸(SAM)类似物。

125.根据权利要求124所述的方法，其中官能团与SAM类似物的硫原子连接。

126.根据权利要求125所述的方法，其中SAM类似物具有式：

其中R包含官能团。

127.根据权利要求121-126中任一项所述的方法，其中官能团不是甲基基团。

128.根据权利要求121-127中任一项所述的方法，其中官能团具有至少两个碳原子。

129.根据权利要求128所述的方法，其中官能团是具有至少两个碳的烷基或具有至少两个碳的烯基。

130.根据权利要求129所述的方法，其中官能团是烯丙基基团。

131.根据权利要求130所述的方法，其中SAM类似物具有式：

132.根据权利要求121-131中任一项所述的方法，其中(a)包括用甲基转移酶连接官能团。

133.根据权利要求132所述的方法，其中在适当条件下，相对于未甲基化核苷酸，甲基转移酶能够优先将官能团连接至甲基化核苷酸。

134.根据权利要求132或133所述的方法，其中甲基转移酶是RNA甲基转移酶。

135.根据权利要求134所述的方法，其中RNA甲基转移酶是二甲基转移酶。

136.根据权利要求135所述的方法，其中二甲基转移酶是Dim1/KsgA二甲基转移酶。

137.根据权利要求136所述的方法，其中二甲基转移酶是Dim1或KsgA。

138.根据权利要求137所述的方法，其中二甲基转移酶是HsDim1、ScDim1或MjDim1。

139.根据权利要求138所述的方法，其中二甲基转移酶是MjDim1。

140.根据权利要求121-139中任一项所述的方法，其还包括将核糖核酸与双原子卤素分子一起孵育。

141.根据权利要求140所述的方法，其中将核糖核酸与双原子卤素分子一起孵育是将来自双原子卤素分子的卤素原子连接至核苷酸。

142.根据权利要求141所述的方法，其中双原子卤素分子是碘(I₂)。

143.根据权利要求121-142中任一项所述的方法，其中(b)包括用逆转录酶(RT)进行逆转录反应。

144.根据权利要求143所述的方法，其中RT是HIV RT或其变体、M-MuLV RT或其变体、AMV RT或其变体、Bst聚合酶或其变体或Klentaq聚合酶或其变体。

145.根据权利要求144所述的方法，其中RT是Bst聚合酶或其变体。

146.根据权利要求145所述的方法，其中RT是Bst 2.0DNA聚合酶。

147.根据权利要求144所述的方法，其中RT是Klentaq聚合酶或其变体。

148.根据权利要求121-147中任一项所述的方法，其中测序包括下一代测序。

149.根据权利要求121-147中任一项所述的方法，其中测序包括单分子测序。

150.根据权利要求121-147中任一项所述的方法，其中测序包括纳米孔测序。

151.根据权利要求121-150中任一项所述的方法，其中核苷酸是腺苷，并且其中残基不包括腺嘌呤。

152.根据权利要求121-150中任一项所述的方法，其中核苷酸是腺苷，并且其中残基包括鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶。

153.根据权利要求121-152中任一项所述的方法，还包括将互补核酸中的突变识别为对应于核糖核酸中的核苷酸。

154.根据权利要求121-153中任一项所述的方法，其中核糖核酸是信使RNA(mRNA)。

155.根据权利要求154所述的方法，还包括在(a)之前，将寡聚脱氧胸苷引物与mRNA退火以产生双链区。

156.根据权利要求155所述的方法，还包括用核酸酶消化双链区。

157.根据权利要求156所述的方法，其中核酸酶是RNA酶H。

158.根据权利要求121-157中任一项所述的方法，还包括在(a)之前，从核糖核酸产生互补脱氧核糖核酸(cDNA)并且对cDNA测序。

159.根据权利要求121-158中任一项所述的方法，其中核糖核酸是较长核糖核酸的片段。

160.根据权利要求159所述的方法，其中片段的长度为100个至200个核苷酸。

161.根据权利要求121-160中任一项所述的方法，其中核糖核酸是从对象样品中分离出来的。

162.根据权利要求161所述的方法，其中核糖核酸是从活检样品中分离出来的。

163.根据权利要求161或162所述的方法，其中样品是液体样品。

164.根据权利要求121-163中任一项所述的方法，其中核酸分子是从囊泡中分离出来的。

165.根据权利要求164所述的方法，其中囊泡是外泌体。

166.根据权利要求121-163中任一项所述的方法，其中核糖核酸是无细胞核糖核酸(cfRNA)。

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