CN108070658B - 检测msi的非诊断方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开检测MSI的非诊断方法。从血液分离血浆和白细胞，并提取血浆中的ctDNA，和白细胞中的gDNA；分别以ctDNA和gDNA为模板建立测序文库和标准文库并测序；在测序文库和标准文库中分别确定各位点中重复单元的序列，并分别统计各序列长度，计算各序列长度的相对频率分布，去除序列长度等于300bp及测序文库与标准文库共有的序列长度的相对频率，以各位点在测序文库和标准文库中的相对频率绘制分布曲线，根据两条曲线是否趋势一致判断是否存在MSI。本发明的方法能够有效检测血液中肿瘤细胞的微卫星不稳定状态，而不依赖于肿瘤组织，从而减轻患者取样时的痛苦，检测方便快捷。

Description

检测MSI的非诊断方法
技术领域
本发明通常涉及基因检测领域，特别地涉及微卫星重复序列长度改变的检测方法。
背景技术
微卫星(MS)为广泛分布于原核及有核细胞生物且由1-6个核苷酸组成的，具有高度多态性的简单串联重复序列。尽管MS在个体之间存在高度的多态性，但在个体内部保持一定的遗传稳定性(孟德尔共显性遗传)，因此，MS是重要的一类遗传标记，可以用于遗传性疾病的连锁分析和基因诊断。位于编码区的MS易于出现复制滑脱(比一般编码区中其他基因的发生概率高10～100倍)，当突变、缺失或者表观沉默导致错配修复(MMR)基因失去功能，从而不能修复DNA复制过程中滑动链与互补碱基出现的错配，导致一个或几个重复的碱基插入或缺失，进而产生MSI表型。
目前临床主要采用多重荧光PCR结合毛细管电泳进行MSI检测，通过扩增正常组织和肿瘤组织DNA，将等位基因谱进行比较分析，如果肿瘤样本DNA的等位基因出现异常的分型，表明存在微卫星不稳定，但是该技术存在的问题如下：(1)检测时要求必须同时制备肿瘤组织或正常组织(如，癌旁组织)，虽然检测结果准确，但是肿瘤组织需要手术或者活检取材，给患者创伤较大，如果部分患者因身体或其它原因无法进行手术或穿刺，这就造成患者无法完成检测。(2)肿瘤具有异质性，如果取材不当，可能导致检测假阴性。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种检测MSI的非诊断方法，可以不依赖于肿瘤组织，只抽取患者血液即可完成检测。具体地，本发明包括以下内容。
一种检测MSI的非诊断方法，其包括以下步骤：
(1)样品制备步骤：从血液分离血浆和白细胞，并提取血浆中的ctDNA作为待检测样品，和白细胞中的gDNA作为标准样品，其中ctDNA经过agilent 2100生物分析仪检测，确保其中gDNA含量低于ctDNA的1/3。
(2)文库构建步骤：以所述ctDNA为模板建立测序文库，同时以所述gDNA为模板建立标准文库，其中各文库建立时用于PCR扩增的引物组由SEQ ID NO:1-14组成；
(3)文库测序步骤：以相同的方法分别对测序文库和标准文库进行测序；
(4)测序结果的分析步骤，其中包括在测序文库和标准文库中分别确定各位点中重复单元的序列，并分别统计各序列长度，计算各序列长度的相对频率分布，去除序列长度等于300bp及测序文库与标准文库共有的序列长度的相对频率，以各位点在测序文库和标准文库中的相对频率绘制分布曲线，并根据两条曲线是否趋势一致判断是否存在MSI。
根据本发明的方法，优选地，在样品制备步骤中，使用基于生物芯片的技术进行片段分析来确保gDNA的含量低于所述ctDNA的1/3。
根据本发明的方法，优选地，所述引物组包括位点引物和性别引物。
根据本发明的方法，优选地，文库构建包括使用SEQ ID NO:1-14组成的引物组进行多重PCR扩增，纯化扩增产物，并将纯化产物使用非PCR(PCR-Free)方式(包括末端修复、加A和接头连接)进行文库构建。
根据本发明的方法，优选地，文库构建包括在引物上添加文库接头。优选地，在各位点的正向引物的5’端添加SEQ ID NO:15所示的序列，并在各位点的反向引物5’端添加SEQ ID NO:16所示的序列。优选地，进一步包括以ctDNA或gDNA为模板，使用添加文库接头的引物进行杂交和目标区域连接，生成杂交链；然后以此杂交链为模板进行PCR扩增。优选地此处PCR扩增时所使用的引物为SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示的序列。
根据本发明的方法，优选地，在文库测序步骤中使用高通量测序技术分别对测序文库和标准文库进行测序。
根据本发明的方法，优选地，在测序结果的分析步骤中，如果各位点在测序文库和标准文库的序列长度的相对频率分布曲线一致，则计数为0，否则计数为1。优选地，统计各位点的总分数值x，即，x＝位点1的计数+位点2的计数+位点3的计数……+位点n的计数。当x＝0时，为稳定型，当x＝1时为低频不稳定型，当x>1时为高频不稳定型。
本发明的方法能够有效富集血液中含量极低的ctDNA，并有效排除背景噪音的影响，可以有效检测血液中肿瘤细胞的卫星不稳定状态，而不依赖于肿瘤组织，从而减轻患者取样时的痛苦，检测方便、快捷。
附图说明
图1.BAT-25基因Marker的长度相对频率分布；
图2.BAT-26基因Marker的长度相对频率分布；
图3.MONO-27基因Marker的长度相对频率分布；
图4.NR-21基因Marker的长度相对频率分布；
图5.NR-24基因Marker的长度相对频率分布；
图6.NR-27基因Marker的长度相对频率分布。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。关于本文中所使用的“和/或”，包括所述事物的任一或全部组合。
本发明的MSI是指微卫星不稳定，其以DNA微卫星重复序列长度改变为特征，是基因组不稳定的一种类型，可导致多种肿瘤，例如结直肠癌。
本发明的一方面，针对现有MSI检测方法存在的问题，特别是针对目前取样时需要手术或者活检取材，给患者带来畏惧和伤害的问题，通过使用容易获取的血液代替传统的肿瘤组织作为样品可以很好的实现MSI的检测。
本发明的另一方面，通过整体优化检测的各具体步骤，并通过这些步骤的组合能够以高灵敏度和准确性来检测血液中极低含量样品中的细微碱基变化，并基于这些碱基变化来准确地进行MSI表型的判断。
具体地，本发明的MSI检测方法包括样品制备步骤、文库构建步骤、文库测序步骤和测序结果的分析步骤。下面详细说明各步骤。
样品制备步骤：
本发明首次使用容易获取的血液作为检测MSI的样品。已知ctDNA是肿瘤患者血液中游离的来自肿瘤的DNA，其带有肿瘤的特征。通过ctDNA的检测可以检测肿瘤相关的某些特异性突变的信息，进而了解肿瘤的特征，但是并非所有的肿瘤相关的特异性突变均体现于ctDNA中。这是因为肿瘤细胞死亡破裂时基因组DNA会受到破坏，在释放的过程中存在片段化，所以血液中的ctDNA并非完全真实的反应肿瘤基因组的信息。目前我们未发现现有技术中来自血液的ctDNA包含了MSI信息的文献记载。
本发明的样品制备首先需要从血液中分离血浆，并从血浆中提取ctDNA作为待检测样品。可使用本领域已知的任何手段进行提取，例如使用市售试剂盒进行提取。需要说明的是，与本领域的常规提取方法不同，本发明的样品制备还包括确保提取的gDNA的含量低于ctDNA的1/3的步骤。本发明发现当gDNA的含量过高，特别是为ctDNA的1/3以上时，对本发明的后续检测产生影响，而当gDNA的含量低于ctDNA的1/3时，则不会对本发明的后续检测产生实质影响。在某些实施方案中，gDNA的含量远远低于ctDNA的含量，例如为ctDNA含量的1/5，并且gDNA的含量为20ppm以下，优选15ppm以下。当gDNA的含量低于ctDNA的1/3，但gDNA的含量过高，例如100ppm以上时，在后续操作时仍会产生大量噪音，会影响MSI结果的判断。本发明人发现通过控制gDNA的含量低于ctDNA的1/3，可以克服例如通过分离的血浆颜色与比色卡比对来判断有无gDNA污染等方法中存在的检测结果不准的问题。
在示例性实施方案中，使用Agilent 2100系统确保gDNA含量低于ctDNA的1/3。具体地，使用Agilent 2100系统进行片段分析，在得到的图谱中当1000bp以后(右侧)的主峰高度低于167±5bp处的主峰高度的1/3时，判断为gDNA含量低于ctDNA含量的1/3。
本发明的样品制备还包括从血液中提取白细胞，并从白细胞提取gDNA作为标准样品。与现有技术的常规做法不同，本发明通过使用白细胞提取的gDNA作为标准样品，避免通过手术或者活检取材获得正常组织，并从中提取gDNA，减少了患者痛苦。并且发明人发现通过使用相同血液来源的白细胞的gDNA能够确保标准样品的准确性。
文库构建步骤：
本发明的文库构建包含建立测序文库和标准文库。优选地采用相同的方法来建立两种文库。具体地，在构建文库时除了使用不同的模板之外，其他步骤均相同。
本发明的文库构建包括准单态性单核苷酸重复位点的选取、引物的设计和核酸扩增。
本发明创造性选取了6种不同位点进行组合，达到了意料不到的效果。其中所述6种不同位点分别为NR-21、NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26和MONO-27。优选地，为了防止样品混淆，还可加入1个性别位点AMEL，从而可与核酸扩增的其他物质组成多重复合扩增体系。需要说明的是，本领域内已知，针对MSI的重复位点有许多，并且也有使用多各不同位点组合的报道，但是现有位点或不同位点的组合均是针对正常组织或肿瘤组织来源的样品，对于极低含量的样品，这些单独的位点或位点的组合(例如，四位点的组合)并不适用。
为了能够针对极低含量的模板进行扩增，本发明对引物进行了重新设计，以增强引物与低浓度模板结合的灵敏性和特异性。具体地，本发明的引物组由SEQ ID NO:1-12组成，优选地由SEQ ID NO:1-14组成。这些引物的组合能够很好的适用于低含量ctDNA样品的扩增，并且扩增结果能很好的反映MSI的信息。
本发明的核酸扩增可采用本领域内通常使用的方法，例如各种类型的PCR方法。
在某些实施方案中，本发明的文库构建方法包括使用本发明的引物组以提取的ctDNA或gDNA为模板进行多重PCR扩增，纯化扩增产物，纯化产物使用PCR-Free方式(包括末端修复、加A和adapter连接)进行测序文库构建。
在某些实施方案中，本发明的文库构建方法包括在本发明的引物组上加上文库接头序列。具体地，在所有正向位点引物的5’端加上TGTGCTGCGAGAAGGCTAGA(SEQ ID NO:15)；在所有反向位点引物的5’端加上CTGCACACGAGAAGGCTAGA(SEQ ID NO:16)。以ctDNA或gDNA为模板，使用加文库接头序列的引物组进行杂交和目标区域连接，生成新的杂交链；然后以此杂交链为模板进行PCR扩增。此时扩增所使用的引物为AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(该引物3’序列与各位点引物1的5’序列互补，SEQ IDNO:17)和CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(该引物3’序列与各位点引物2的5’序列互补，SEQ ID NO:18)，其中NNNNNNN代表Index序列，用于区分不同样本。扩增完成后经纯化，即完成测序文库构建。
文库测序步骤：
本发明的文库测序可使用任何可用技术。例如，下一代测序、微阵列分析、高通量测序等等，优选下一代测序。根据本发明优选以相同的方法分别对测序文库和标准文库进行测序。
测序结果的分析步骤：
为了能够使测序结果准确的与MSI的信息相对应，从而判断检测MSI的结果，测序结果的分析方法至关重要。本发明独创性的分析方法能够完美地判断样品中是否存在MSI，并且对于MSI还可细分为低频不稳定型和高频不稳定型。具体地，本发明的分析方法包括在测序文库和标准文库中分别确定各位点中重复单元的序列，并分别统计各序列长度，计算各序列长度的相对频率分布，去除序列长度等于300bp及测序文库与标准文库共有的序列长度的相对频率，以各位点在测序文库和标准文库中的相对频率绘制分布曲线，并根据两条曲线是否趋势一致判断是否存在MSI。
在某些实施方案中，本发明的测序结果的分析步骤包括如果各位点在测序文库和标准文库的序列长度的相对频率分布曲线一致，则计数为0，否则计数为1。优选地，统计各位点的总分数值x，即，x＝位点1的计数+位点2的计数+位点3的计数……+位点n的计数。当x＝0时，为稳定型，当x＝1时为低频不稳定型，当x>1时为高频不稳定型。
在某些实施方案中，以血液的曲线峰值前后各200bp作为判断窗口，观察窗口内分布曲线是否趋势一致，且若有明显差异则计数为1，若无明显差异或分布趋势大体一致或绘制分布曲线的序列长度不在窗口范围内，则计数为0。
实施例
以下对一例结直肠癌MSI-H患者(编号345)进行MSI的检测。该患者提供了癌组织样本和血液样本，其中癌组织提取的gDNA和血液白细胞提取的gDNA使用阅微基因的肿瘤细胞微卫星不稳定性检测试剂盒检测，结果显示癌组织为MSI-H。
1.样品制备
血浆分离：将该患者提供的血液使用高速离心机分离血浆。
DNA提取和质检：
ctDNA使用Qiagen的QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit提取，提取完成后使用Qubit定量，并使用Agilent 2100系统进行片段分析，确保gDNA含量低于ctDNA的1/3。
2.目标区域富集和测序文库构建
(1)将AMEL位点和6个准单态性STR位点的共7对引物按照一定比例配成混合液(Primer Mix)，每条引物终浓度在600nM-1800nM之间。
(2)按照以下反应体系配制PCR反应液
Figure BDA0001505385770000081
Figure BDA0001505385770000091
(3)将PCR反应管置于扩增仪上，运行如下程序：
第1步：95℃变性5分钟，第2步：94℃变性30秒，第3步60℃退火50秒，第4步：70延℃伸1分钟，重复2至4步30次，最后60延℃伸30分钟。
向PCR产物中加入36μl Agencourt AMPure XP磁珠，震荡混匀，孵育5分钟，放在磁力架上静置1分钟，去上清，用75％乙醇漂洗两次，晾干磁珠，用50μl水洗脱DNA。
洗脱后的DNA使用诺唯赞公司VAHTSTM PCR-Free DNALibrary PrepKit ForIllumina(ND602-01/02)试剂盒进行测序文库构建，操作按照说明书进行。
3.文库质检和上机
文库完成后使用Qubit定量，在Illumina Miseq上进行PE300测序，每个样本数据量200M。具体方法参见使用说明书。
4.测序结果分析
将345样本文库进行Miseq PE*300测序，得到该样本的原始的测序数据Raw data；
将原始数据去除测序接头序列adapter及低质量序列，得到后续分析用的Cleandata；
将clean data比对到人类基因组序列(Hg19)，得到比对后的sam文件
将sam文件进行排序处理，得到后续分析用到的bam文件；
根据相应的6个基因marker的目标区域位置将相应的比对结果从bam文件中提取出来；
筛选出相应的6个基因marker中重复单元(最小10bp)的序列；
分别统计相应的6个基因marker的筛选序列的长度，并计算各个序列长度的相对频率分布；
去除掉序列长度等于测序读长(300bp)及血液与血浆共有的序列长度的相对频率结果；
将相应的6个基因marker在H中得到的血液与血浆的序列长度的相对频率绘制分布曲线，观察分布曲线是否趋势一致；若有明显差异则计数为1，若无明显差异或分布趋势大体一致则计数为0。结果如图1-6所示。
由图1-6可知，有明显差异分布的marker分别为BAT-25、MONO-27、NR-21、NR-27，则分别计数为1，无明显差异分布的marker分别为BAT-26、NR24，则分别计数为0；故345样本的总计分数为4，则判定为高频不稳定型(MSI-H)，与阅微基因的肿瘤细胞微卫星不稳定性检测试剂盒检测结果一致。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
Figure BDA0001505385770000111
Figure BDA0001505385770000121
Figure BDA0001505385770000131
Figure BDA0001505385770000141
Figure BDA0001505385770000151
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<213> 人工序列
<400> 17
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca ctctttccct acacgacgct cttccgatct 60
<210> 18
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> index
<222> (25)..(31)
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(31)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 18
caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn ngtgactgga gttcagacgt gtgctcttcc 60
gatct 65

Claims (10)

1.一种检测MSI的非诊断方法，其包括以下步骤：
(1)样品制备步骤：从血液分离血浆和白细胞，并提取血浆中的ctDNA作为待检测样品，和白细胞中的gDNA作为标准样品；其中所述gDNA的含量低于所述ctDNA的1/3；
(2)文库构建步骤：以所述ctDNA为模板建立测序文库，同时以所述gDNA为模板建立标准文库，其中各文库建立时用于PCR扩增的引物组由SEQ ID NO:1-14组成；
(3)文库测序步骤：以相同的方法分别对所述测序文库和所述标准文库进行测序；
(4)测序结果的分析步骤，其中包括在所述测序文库和所述标准文库中分别确定各位点中重复单元的序列，并分别统计各序列长度，计算各序列长度的相对频率分布，去除序列长度等于300bp及所述测序文库与所述标准文库共有的序列长度的相对频率，以各位点在所述测序文库和所述标准文库中的相对频率绘制分布曲线，并根据两条曲线是否趋势一致判断是否存在MSI。
2.根据权利要求1所述的非诊断性方法，其中在所述样品制备步骤中，使用生物芯片进行片段分析来确保所述gDNA的含量低于所述ctDNA的1/3。
3.根据权利要求1所述的非诊断性方法，其中所述引物组包括位点引物和性别引物。
4.根据权利要求1所述的非诊断性方法，其中所述文库构建步骤包括使用SEQ ID NO:1-14组成的引物组进行多重PCR扩增，得到扩增产物，纯化所述扩增产物，得到纯化产物，并使用非PCR方式利用所述纯化产物进行文库构建。
5.根据权利要求1所述的非诊断性方法，其中所述文库构建步骤包括在引物末端添加文库接头。
6.根据权利要求5所述的非诊断性方法，其中在各位点的正向引物的5’端添加SEQ IDNO:15所示的序列，并在各位点的反向引物5’端添加SEQ ID NO:16所示的序列。
7.根据权利要求6所述的非诊断性方法，其中进一步包括以ctDNA或gDNA为模板，使用添加文库接头的引物进行杂交和目标区域连接，生成杂交链；然后以所述杂交链为模板进行PCR扩增。
8.根据权利要求7所述的非诊断性方法，其中所述文库构建步骤中的PCR扩增时所使用的引物序列如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示。
9.根据权利要求1所述的非诊断性方法，其中在所述文库测序步骤中使用高通量测序技术分别对测序文库和标准文库进行测序。
10.根据权利要求1所述的非诊断性方法，其中在所述测序结果的分析步骤中，如果各位点在测序文库和标准文库的序列长度的相对频率分布曲线一致，则计数为0，否则计数为1；统计各位点的分数值之和x；当x＝0时，为稳定型，当x＝1时为低频不稳定型，当x>1时为高频不稳定型。
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