JP2004527245A - ヒトのガンに関係したマーカーとしての、メチル化が変化したｄｎａ配列 - Google Patents
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Abstract
メチル化が変化した新規な（１０３種類の）ＤＮＡ配列（“マーカー配列”）を開示する。これらＤＮＡ配列は、ガンにおいて、正常な組織とは異なる明確なメチル化パターンを有する。多くの場合、これらマーカー配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースには見られない新規な配列になっており、これらマーカー配列のいずれについても、ヒトのガン（例えば膀胱ガンや前立腺ガンなど）においてはそのメチル化パターンの特徴が以前は明らかになっていなかった。これら（１０３種類）の配列は、ヒトのガンを治療する際の診断用、予後予測用、治療用のマーカーとして、また、メチル化されたＣｐＧを含む核酸を検出するためのキットにおける試薬として有用である。
Description
【０００１】
関連する出願の相互参照
本出願は、２０００年１０月２７日に出願されたアメリカ合衆国特許出願シリアル番号第０９／６９９，２４３号の優先権を主張する。
【０００２】
発明の属する技術分野
本発明は、ガン患者において変化したメチル化パターン（高メチル化または低メチル化）を示す新規なヒトＤＮＡ配列に関する。メチル化状態が変化した新規なこれらＤＮＡ配列は、ヒトのガンの診断、予後予測、治療に用いるマーカーとして有用である。
【０００３】
発明の背景
腫瘍形成における初期の遺伝子変化を同定することが、分子レベルでのガン研究の中心的課題となっている。ガンに関連した遺伝子変化の性質とパターンが明らかになると、ガンの早期検出、診断、治療が可能になろう。脊椎動物におけるこのような遺伝子変化は、一般に、３つのカテゴリーのうちの１つに当てはまる。３つのカテゴリーとは、遺伝物質の取得または欠失；遺伝物質の突然変異；“ＣｐＧ島”内のＣｐＧジヌクレオチド中のシトシン残基のメチル化である。これらのうちでＤＮＡのメチル化だけが可逆的であり、メチル化状態の変化が遺伝子の発現（例えばＣｐＧ島がプロモータ領域またはその近傍に位置する遺伝子の転写開始）または遺伝子の安定性に影響を及ぼすことが知られている。
【０００４】
ＣｐＧ 島内での ＣｐＧ ジヌクレオチドのメチル化
ＤＮＡは、高等な真核生物では、ＣｐＧジヌクレオチド中のグアノシン残基に対して５’末端側に位置するシトシン残基でのみメチル化される。シトシン塩基のＣ−５位置がＤＮＡ（シトシン−５）メチルトランスフェラーゼという酵素によって変化してこのように共有結合すると、５−メチルシトシン（５−ｍＣｙｔ）の形成がもたらされ、この塩基が独自の性質を持つようになる（例えば自発的脱アミノ反応が起こりやすくなる）。酵素によるこのような変換は、脊椎動物において存在することが知られているＤＮＡの唯一の後成的変化であり、正常な胚発生にとって非常に重要である（Ｂｉｒｄ， Ａ．Ｐ．、Ｃｅｌｌ、第７０巻、５〜８ページ、１９９２年；ＬａｉｒｄとＪａｅｎｉｓｃｈ、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第３巻、１４８７〜１４９５ページ、１９９４年；Ｌｉ他、Ｃｅｌｌ、第６９巻、９１５〜９２６ページ、１９９２年）。
【０００５】
ＣｐＧジヌクレオチドに５−ｍＣｙｔが存在していることで、脊椎動物が進化していく間にゲノム中のこの配列が５分の１に減った（ＳｃｈｒｏｄｅｒｅｔとＧａｒｔｌｅｒ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第８９巻、９５７〜９６１ページ、１９９２年）。これは、おそらく５−ｍＣｙｔが自発的に脱アミノ反応してチミジンになったためであろう。しかしゲノムのいくつかの領域ではこのような減少は見られず、そのような領域は“ＣｐＧ島”と呼ばれている（Ｂｉｒｄ， Ａ．Ｐ．、Ｎａｔｕｒｅ、第３２１巻、２０９〜２１３ページ、１９８６年；Ｇａｒｄｉｎｅｒ−ＧａｒｄｅｎとＦｒｏｍｍｅｒ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、第１９６巻、２６１〜２８２ページ、１９８７年）。これらＣｐＧ島は、脊椎動物のゲノムのほんの約１％にしかならないが、それでもゲノムＣｐＧジヌクレオチドの総数の約１５％を占めている（ＡｎｔｅｑｕｅｒａとＢｉｒｄ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第９０巻、１１９９５〜１１９９９ページ、１９９３年）。ＣｐＧ島は、予想される（すなわち進化によって減少していない）頻度でＣｐＧを含んでおり（観測値／予測値の比＞０．６。なお観測値／予測値の比は、［ＣｐＧ部位の数／（Ｃ塩基の数×Ｇ塩基の数）］×各断片のバンド長として計算される）、ＧＣリッチであり（ＧＣ含量＞０．５。なおＧＣ含量は、（Ｃ塩基の数＋Ｇ塩基の数）／各断片のバンド長として計算される）、典型的な長さは約０．２〜約１ｋｂである。
【０００６】
ＣｐＧ 島内でのメチル化が、遺伝子の発現に影響を及ぼす
ＣｐＧ島は、多数のハウスキーピング遺伝子と組織特異的遺伝子の上流に位置するが、遺伝子コード領域まで延びていることもある（ＣｒｏｓｓとＢｉｒｄ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、第５巻、３０９〜３１４ページ、１９９５年；Ｌａｒｓｅｎ他、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、第１３巻、１０９５〜１１０７ページ、１９９２年）。体細胞組織のＣｐＧ島にあるシトシンのメチル化は、遺伝子の発現に影響を及ぼすと考えられている。メチル化は遺伝子の活性と逆相関することがわかっており、さまざまなメカニズムによって遺伝子の発現を低下させる可能性がある。そうしたメカニズムとしては、転写開始の抑制（Ｂｉｒｄ， Ａ．Ｐ．、Ｎａｔｕｒｅ、第３２１巻、２０９〜２１３ページ、１９８６年；Ｄｅｌｇａｄｏ他、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、第１７巻、２４２６〜２４３５ページ、１９９８年）、局所的クロマチン構造の破壊（ＣｏｕｎｔｓとＧｏｏｄｍａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、第１１巻、１８５〜１８８ページ、１９９４年；Ａｎｔｅｑｕｅｒａ他、Ｃｅｌｌ、第６２巻、５０３〜５１４ページ、１９９０年）、メチル化した配列と特異的に相互作用するタンパク質の補充による転写因子の結合の直接的または間接的な阻止（Ｂｉｒｄ， Ａ．Ｐ．、Ｃｅｌｌ、第７０巻、５〜８ページ、１９９２年；ＣｏｕｎｔｓとＧｏｏｄｍａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、第１１巻、１８５〜１８８ページ、１９９４年；Ｃｅｄａｒ， Ｈ．、Ｃｅｌｌ、第５３巻、３〜４ページ、１９８８年）などが挙げられる。多数の研究によってＣｐＧ島のメチル化が遺伝子の発現に及ぼす効果が明らかにされている（例えばＣＤＫＮ２Ａ／ｐ１６遺伝子；Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｚｕｌｕｅｔａ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第５５巻、４５３１〜４５３５ページ、１９９５年）が、常染色体遺伝子上のほとんどのＣｐＧ島は生殖系列ではメチル化されないままであり、これらＣｐＧ島のメチル化は、一般に遺伝子の発現とは独立である。組織特異的遺伝子は、一般に、それぞれの標的器官においてはメチル化されないが、生殖系列と非発現成熟組織ではメチル化される。他方、構成的に発現しているハウスキーピング遺伝子のＣｐＧ島は、生殖系列と体細胞組織では通常はメチル化されない。
【０００７】
ＣｐＧ 島内でのメチル化が、ガンに関係する遺伝子の発現に影響を及ぼす
一連の研究からのデータによると、ガン細胞には、非ガン細胞と比べて変化したメチル化が存在している。これらの研究は、ゲノム・レベル全体でＤＮＡのメチル化が変化するだけでなく、メチル基の分布も変化することを示している。例えば、ある細胞内のガン抑制遺伝子またはガン遺伝子に付随するＣｐＧ島の異常なメチル化により、変化した遺伝子発現が起こる可能性がある。このように変化した遺伝子発現により、選択的に有利に増殖する細胞集団が生まれ、これらの細胞の選択によりその生物に対する害がもたらされる可能性がある（すなわちガン）。
【０００８】
不十分な相関データ
残念なことに、正常な細胞に対してガン細胞のＣｐＧ島内ではＣｐＧジヌクレオチドには変化したメチル化が存在していること、あるいは特別な場合にこのようなメチル化の変化によって遺伝子の発現（またはクロマチンの構造または安定性）の変化がもたらされることがわかっただけでは、この知見を効果的な診断、予後予測、治療に応用するには不十分である。というのも、限られた数のＣｐＧ島についてしか特徴が明らかにされておらず、したがって、多数あるＣｐＧ島のうちのどの特定のＣｐＧ島が実際にガンまたはその原因と関係するか、あるいは有意な相関を示すかについての知識が足りないからである。しかも、特定のガンには、ＣｐＧ島と見なされる配列構成を有する可能性があるＤＮＡ配列を含め、メチル化が変化した複数のＤＮＡ配列が関与した複雑なメチル化パターンが存在していることがある。
【０００９】
したがって、メチル化が変化した特定のＤＮＡ配列を同定してその特徴を明らかにし、そのＤＮＡ配列をガンと関連づけ、診断、予後予測、治療に応用できるようにすることが、当業界で必要とされている。
【００１０】
発明の概要
本発明により、ガンの診断法または予後予測法であって：検体組織から組織サンプルを取得し；その組織サンプルに由来するＤＮＡに対してメチル化アッセイを行なうことにより、そのＤＮＡのＤＮＡ配列中のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を明らかにし（ただしこのＤＮＡ配列は、配列番号１〜１０３の配列、配列番号１〜１０３の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する配列、配列番号１〜１０３の配列と関係したＣｐＧ島配列、配列番号１〜１０３の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する配列と関係したＣｐＧ島配列、およびこれらの組み合わせからなるグループの中から選択した配列であり、特定の配列番号の配列と関係したＣｐＧ島配列は、その特定の配列番号の少なくとも１つのヌクレオチドを含んでいて、ＣｐＧジヌクレオチドの頻度が観測値／予測値の比＞０．６に対応することと、ＧＣ含量＞０．５であることの両方の条件を満たす連続したゲノムＤＮＡ配列である）；診断または予後予測を、上記ＤＮＡ配列中のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を利用して行なう操作：を含む診断法または予後予測法が提供される。ＤＮＡ配列は、配列番号１〜１０３の配列と関係したＣｐＧ島配列、配列番号１〜１０３の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する配列と関係したＣｐＧ島配列、およびこれらの組み合わせからなるグループの中から選択した配列であることが好ましい。ＤＮＡ配列は、配列番号２、４、６、７、９〜１６、１９、２０、２２〜３３、３５〜４３、４８、５１〜５５、５９、６０、６４、７１、７６、７８〜８１、８４、８７〜９０の配列と関係したＣｐＧ島配列、およびこれらの組み合わせからなるグループの中から選択した配列であることが好ましい。メチル化アッセイの方法は、メチライト、ＭＳ−ＳｎｕＰＥ（メチル化感受性単一ヌクレオチド・プライマー伸長）、ＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）、ＭＣＡ（メチル化されたＣｐＧ島の増幅）、ＣＯＢＲＡ（亜硫酸水素塩と制限酵素を組み合わせた分析）、およびこれらの組み合わせからなるグループの中から選択することが好ましい。ＤＮＡ配列中のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態は、高メチル化、低メチル化、正常メチル化のいずれかであることが好ましい。ガンは、膀胱ガン、前立腺ガン、結腸ガン、肺ガン、腎臓ガン、白血病、乳ガン、子宮ガン、星状膠細胞腫、グリオブラストーマ、神経芽細胞腫からなるグループの中から選択することが好ましい。ガンは、膀胱ガンまたは前立腺ガンであることが好ましい。
【００１１】
本発明によりさらに、メチル化されたＣｐＧを含む核酸を検出するのに有効で、１つ以上の容器を含む保持手段を含んで成るキットであって、配列番号１〜１０３の配列と、配列番号１〜１０３の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する配列とからなるグループの中から選択した配列の任意の領域とハイブリダイズするプローブまたはプライマーを含む容器と；メチル化されたＣｐＧを含む核酸の検出を、このプローブまたはプライマーに基づいて行なうのに必要な付加的な標準メチル化アッセイ用試薬とを備えるキットが提供される。付加的な標準メチル化アッセイ用試薬は、メチライト、ＭＳ−ＳＮｕＰＥ、ＭＳＰ ＭＣＡ、ＣＯＢＲＡ、およびこれらの組み合わせからなるグループの中から選択したメチル化アッセイを実行するための標準試薬であることが好ましい。プローブまたはプライマーは、配列番号１〜１０３の配列と、配列番号１〜１０３の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する配列とからなるグループの中から選択した配列中の少なくとも約１２〜１５個のヌクレオチドを含んで成ることが好ましい。
【００１２】
本発明によりさらに、配列番号１、配列番号５、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１８、配列番号２４、配列番号２５、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４２、配列番号４４、配列番号５１、配列番号５２、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７４、配列番号７６、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８６、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９７、配列番号１００からなるグループの中から選択したメチル化されたポリヌクレオチド配列またはメチル化されていないポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子が提供される。核酸はメチル化されていることが好ましい。核酸はメチル化されていないことが好ましい。
【００１３】
発明の詳細な説明
定義：
“ＧＣ含量”とは、特定のＤＮＡ配列中の［（Ｃ塩基の数＋Ｇ塩基の数）／各断片のバンド長］を意味する。
【００１４】
“観測値／予測値の比”（“Ｏ／Ｅ比”）とは、特定のＤＮＡ配列内のＣｐＧジヌクレオチドの頻度を意味し、［ＣｐＧ部位の数／（Ｃ塩基の数×Ｇ塩基の数）］×各断片のバンド長に対応する。
【００１５】
“ＣｐＧ島”とは、（１）ＣｐＧジヌクレオチドの頻度が“観測値／予測値の比”＞０．６に対応することと、（２）“ＧＣ含量”＞０．５であることの両方の条件を満たすゲノムＤＮＡの連続領域を意味する。ＣｐＧ島は、一般に、長さが約０．２〜約１ｋｂであるが、必ずしもそうなっているとは限らない。本発明の特定の配列番号の配列に関係するＣｐＧ島配列は、この特定の配列番号の配列の少なくとも１つ以上のヌクレオチドを含んでいて、ＣｐＧジヌクレオチドの頻度が観測値／予測値の比＞０．６に対応することと、ＧＣ含量＞０．５であることの両方の条件を満たすゲノムＤＮＡの連続配列である。
【００１６】
“メチル化状態”とは、ＤＮＡ配列内の１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドに５−メチルシトシン（“５−ｍＣｙｔ”）が存在しているか不在であるかを意味する。
【００１７】
“高メチル化”とは、テストするＤＮＡサンプルのＤＮＡ配列中の１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドに存在する５−ｍＣｙｔの量が、正常な対照用ＤＮＡサンプル中の対応するＣｐＧジヌクレオチドに見られる５−ｍＣｙｔの量と比べて増加していること、に対応するメチル化状態を意味する。
【００１８】
“低メチル化”とは、テストするＤＮＡサンプルのＤＮＡ配列中の１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドに存在する５−ｍＣｙｔの量が、正常な対照用ＤＮＡサンプル中の対応するＣｐＧジヌクレオチドに見られる５−ｍＣｙｔの量と比べて減少していること、に対応するメチル化状態を意味する。
【００１９】
“メチル化アッセイ”とは、ＤＮＡ配列中のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を明らかにする任意のアッセイを意味する。
【００２０】
“ＭＳ．ＡＰ−ＰＣＲ”（メチル化感受性アービトラリー・プライムド・ポリメラーゼ連鎖反応）とは、ＣｐＧジヌクレオチドを含んでいる可能性が最も大きい領域に焦点を合わせ、ＣＧリッチなプライマーを用いてゲノムの全体走査を行なうことを可能にする公知の技術であり、Ｇｏｎｚａｌｇｏ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第５７巻、５９４〜５９９ページ、１９９７年に記載されている。
【００２１】
“メチライト”とは、Ｅａｄｓ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第５９巻、２３０２〜２３０６ページ、１９９９年に記載されている、蛍光に基づいた公知のリアルタイムＰＣＲ法を意味する。
【００２２】
“Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ”（メチル化感受性単一ヌクレオチド・プライマー伸長）とは、ＧｏｎｚａｌｇｏとＪｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２５巻、２５２９〜２５３１ページ、１９９７年に記載されている公知のアッセイを意味する。
【００２３】
“ＭＳＰ”（メチル化特異的ＰＣＲ）とは、Ｈｅｒｍａｎ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第９３巻、９８２１〜９８２６ページ、１９９６年とアメリカ合衆国特許第５，７８６，１４６号に記載されている公知のメチル化アッセイを意味する。
【００２４】
“ＣＯＢＲＡ”（亜硫酸水素塩と制限酵素を組み合わせた分析）とは、ＸｉｏｎｇとＬａｉｒｄ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２５巻、２５３２〜２５３４ページ、１９９７年に記載されている公知のメチル化アッセイを意味する。
【００２５】
“ＭＣＡ”（メチル化されたＣｐＧ島の増幅）とは、Ｔｏｙｏｔａ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、２３０７〜２３１２、第５９巻、１９９９年と、ＷＯ ００／２６４０１Ａ１に記載されているメチル化アッセイを意味する。
【００２６】
概要
本発明により、正常な組織と比べた場合、ガンにおいて明らかなメチル化パターンを有する１０３個のＤＮＡ配列（すなわち“マーカー配列”）が提供される。メチル化が変化したこれらＤＮＡ配列は、膀胱ガンの患者と前立腺ガンの患者から単離した１０３個のＤＮＡ断片に対応しており、多くの場合にＧｅｎＢａｎｋデータベースには見られない新規な配列になっている。ここに示した配列のどれについても、ヒトのガン（例えば膀胱ガンや前立腺ガンが挙げられるが、それだけに限定されない）においてそのメチル化パターンの特徴が以前に明らかにされたことはないことに注意されたい。このメチル化パターンが重要なのは、変化した断片がヒトのガンの予後予測用、診断用、治療用のマーカーとしての可能性を有するからである。
【００２７】
ゲノムＤＮＡ中でメチル化が変化したマーカー配列の同定
ＭＳ．ＡＰ−ＰＣＲ法を用いて膀胱ガンまたは前立腺ガンの患者のゲノムを走査し、正常な人と比べてＤＮＡのメチル化が変化しているかどうかを調べた。というのも、このパターンは非常によく保存されていることが知られているからである。合計で１０３個のＤＮＡ配列（メチル化が変化したＤＮＡ配列；“マーカー配列”）を単離し、ガンが正常な組織と比べてはっきりと異なるメチル化パターンを有することを明らかにした。
【００２８】
ゲノムＤＮＡ中のマーカー配列の同定方法。ガン細胞中で変化したメチル化部位を同定するのに用いられてきた公知のゲノム走査法が多数ある。例えば１つの方法は、制限ランドマーク・ゲノム走査（Ｋａｗａｉ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第１４巻、７４２１〜７４２７ページ、１９９４年）を含んでおり、別の方法は、ＭＣＡ（メチル化されたＣｐＧ島の増幅；Ｔｏｙｏｔａ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、２３０７〜２３１２、１９９９年）を含んでおり、さらに別の方法は、ＭＳ．ＡＰ−ＰＣＲ（メチル化感受性アービトラリー・プライムド・ポリメラーゼ連鎖反応；Ｇｏｎｚａｌｇｏ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５７巻、５９４〜５９９ページ、１９９７年）を含んでいる。この最後の方法を利用すると、ＣｐＧジヌクレオチドを含んでいる可能性が最も大きい領域に焦点を合わせ、ＣＧリッチなプライマーを用いてゲノムの全体走査を行なうことが可能になる。本発明で利用するＭＳ．ＡＰ−ＰＣＲ法は、ゲノムＤＮＡの変化したメチル化パターンをスクリーニング（走査）してその変化に関係した特別な配列を単離する上で、迅速且つ効率的な方法である。
【００２９】
簡単に説明するならば、標準的な従来法を用い、膀胱ガンまたは前立腺ガンの患者の組織に由来するゲノムＤＮＡを調製した。シトシンのメチル化に対する感度の異なる認識部位を持つ複数の制限酵素（例えばＨｐａＩＩ）を用いてこれらゲノムＤＮＡを消化させた後、ＧＣリッチなプライマーを用いてアービトラリー・プライムド−ＰＣＲによる増幅を行なった。メチル化の程度が異なる断片群（例えば高メチル化または低メチル化。メチル化に関する制限酵素の感度、またはＤＮＡ配列分析、またはＭｓ−ＳＮｕＰＥ分析に基づく；ＧｏｎｚａｌｇｏとＪｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２５巻、２５２９〜２５３１ページ、１９９７年）をクローニングし、高分解能ポリアクリルアミド・ゲル上でそのＰＣＲ産物を分離させた後にシークエンシングした。クローニングした断片をサザン・ブロット分析のプローブとして用い、組織内のこれら領域のメチル化の違いを確認した。ＤＮＡクローニング、シークエンシング、ＰＣＲ、高分解能ポリアクリルアミド・ゲルによる分離、サザン・ブロット分析は、当業者には周知である。
【００３０】
結果。走査を行なった患者のゲノムＤＮＡから高メチル化（正常状態と比べてメチル化のレベルが増加）または低メチル化（正常状態と比べてメチル化のレベルが減少）を受けたＤＮＡ断片を合計で５００個単離した。これら断片のうちで合計１７８個をシークエンシングしたところ、そのうちの１０３個は、メチル化パターンが以前に明らかになっていないＤＮＡ遺伝子座に対応するという意味で新規であった。対応する配列を［配列番号１〜１０３］として示してある。この中のいくつかの配列に関しては、文字“ｎ”はヌクレオチド塩基が決定されていないことを意味する。
【００３１】
ＭＳ．ＡＰ−ＰＣＲによって同定された新規なマーカー配列。表Ｉは、ＭＳ．ＡＰ−ＰＣＲによって同定された１０３個のＤＮＡ断片に対応するメチル化パターンと、それに対応する配列データをまとめたものである。合計で１０３個の断片について、正常組織と比べて高メチル化である（メチル化の獲得；高メチル化パターンを有する）か、あるいは低メチル化である（メチル化の欠失；低メチル化パターンを有する）かを同定した後にシークエンシングした。それぞれのカテゴリーの断片について、（（Ｃ塩基の数＋Ｇ塩基の数）／各断片のバンド幅として計算される）“平均ＧＣ含量”と、（［ＣｐＧ部位の数／（Ｃ塩基の数×Ｇ塩基の数）］×各断片のバンド幅として計算される）観測値／予測値の比（“Ｏ／Ｅ比”）の平均値を示してある。さらに、ＣｐＧ島と見なされる断片の割合も掲載してある。これは、それぞれのカテゴリーにおいて、“ＧＣ含量”＞０．５かつ“Ｏ／Ｅ比”＞０．６という条件を満たす配列組成を有するすべての断片の割合に対応する。
【００３２】
以上より、ＭＳ．ＡＰ−ＰＣＲによって同定されたこれら１０３個の断片のうち、６０個が高メチル化だった（表Ｉ、上の行；表ＩＩ、［配列番号１〜６０］）のに対し、４３個は低メチル化だった（表Ｉ、下の行；表ＩＩ、［配列番号６１〜１０３］）。さらに、１０３個の断片のうちで５５個（メチル化が過剰だった４３個と過少だった１２個）がＣｐＧ島に対応している（すなわち、ＧＣ含量＞０．５かつ観測値／予測値の比＞０．６という条件を満たす）のに対し、残りの４８個（メチル化が過剰だった１７個と過少だった３１個）の断片はＣｐＧ島の条件に合致しない（表ＩＩを参照のこと）。
【表１】
【００３３】
表ＩＩは、ＭＳ．ＡＰ−ＰＣＲによって同定された１０３個のＤＮＡ断片に対応する個々の配列（［配列番号１〜１０３］）についてのメチル化パターンと配列データをまとめたものである。これら１０３個の断片についてのデータは、高メチル化（［配列番号１〜６０］）または低メチル化（［配列番号６１〜１０３］）に分けた。表ＩＩには、それぞれの配列について、対応する“断片の名称”、（塩基対；“ｂｐ”で表わした）断片の“サイズ”、“ＧＣ含量”、“観測値／予測値の比”（“Ｏ／Ｅ比”）、“説明”（すなわち、ＣｐＧ島の条件を満たしているかどうか）、“発明者のイニシャル”（ＩＤＣＭ＝Ｉｓａｂｅｌ Ｄ．Ｃ． Ｍａｒｋｌ、ＪＣ＝Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｃｈｅｎｇ、ＧＬ＝Ｇａｎｇｎｉｎｇ Ｌｉａｎｇ、ＨＦ＝Ｈｕａｌｉｎ Ｆｕ、ＹＴ＝Ｙｏｓｈｉｔａｋａ Ｔｏｍｉｇａｈａｒａ）、“ガンの出所”、ＧｅｎＢａｎｋデータベースの“染色体との一致”も記載されている。ダッシュ（“−”）は、ＧｅｎＢａｎｋの染色体との一致が存在しないか、低得点の部分的一致しか存在しないことを意味する。“ＧＣ含量”と“Ｏ／Ｅ比”の平均、ならびにＣｐＧ島である断片の割合が、高メチル化のカテゴリーと低メチル化のカテゴリーの最後の項の後に掲載してある。
【００３４】
したがって本発明により、ガンの予後予測、診断、治療への応用において有用な１０３個のＤＮＡ断片とそれに対応するマーカー配列（すなわち、メチル化が変化したＤＮＡ配列）が提供される。
【００３５】
さらに、１０３個の配列のうちの少なくとも５５個は、（ＧＣ含量とＯ／Ｅ比に基づく）ＣｐＧ島に対応している。その５５個とは、［配列番号２、４、６、７、９〜１６、１９、２０、２２〜３３、３５〜４３、４８、５１〜５５、５９、６０、６４、７１、７６、７８〜８１、８４、８７〜９０］である。したがって、所定のＣｐＧ島の一部におけるメチル化状態が一般にその島全体を代表しているという事実に基づくと、本発明にはさらに、［配列番号２、４、６、７、９〜１６、１９、２０、２２〜３３、３５〜４３、４８、５１〜５５、５９、６０、６４、７１、７６、７８〜８１、８４、８７〜９０］と関係した５５個のＣｐＧ島をガンの予後予測、診断、治療に応用するという新規な利用法も含まれることになる。ただし、特定の配列番号の配列に関係したＣｐＧ島配列は、この特定の配列番号の配列の少なくとも１つのヌクレオチドを含んでいて、ＣｐＧジヌクレオチドの頻度が観測値／予測値の比＞０．６に対応することと、ＧＣ含量＞０．５であることの両方の条件を満たしているゲノムＤＮＡの連続配列である。
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【００３６】
ガンの診断法および予後予測法。本発明により、メチル化が変化した上記の１０３個のＤＮＡ配列のうちの１つ以上の配列についてのメチル化状態を明らかにすることに基づいたガンの診断法および予後予測法が提供される。一般に、このような方法には、検体組織から組織サンプルを取得し、その組織サンプルに由来するＤＮＡについてメチル化アッセイを行ない、その結果に基づいて診断または予後予測を行なう操作が含まれる。
【００３７】
メチル化アッセイは、ＤＮＡサンプルのあるＤＮＡ配列中の１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を明らかにするのに用いられる。本発明によれば、可能なメチル化状態としては、正常状態（すなわちガンでない対照状態）と比べてメチル化が過剰な状態と過少な状態が挙げられる。高メチル化および低メチル化とは、検体サンプルのあるＤＮＡ配列中の１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドに存在している５−メチルシトシン（“５−ｍＣｙｔ”）が、正常な対照ＤＮＡサンプル中の対応するＣｐＧジヌクレオチドに見られる５−ｍＣｙｔの量と比較してそれぞれ増加しているか減少しているかに対応するメチル化のことを意味する。
【００３８】
診断または予後予測は、ガンでない正常な組織から得られた対照データと比較することでサンプルＤＮＡ配列において明らかになったメチル化状態を少なくとも判断材料の一部として利用して行なう。
【００３９】
メチル化アッセイの方法。メチル化アッセイのさまざまな方法が従来技術で知られており、本発明と合わせて利用することができる。これらアッセイにより、あるＤＮＡ配列中の１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチド（すなわちＣｐＧ島）のメチル化状態を明らかにすることができる。このようなアッセイとしては、亜硫酸水素塩で処理したＤＮＡのＤＮＡシークエンシング、（配列特異的増幅のための）ＰＣＲ、サザン・ブロット分析、メチル化感受性制限酵素の利用などが特に挙げられる。
【００４０】
例えば、亜硫酸水素塩での処理を行なうことによってゲノム・シークエンシングが簡単化され、ＤＮＡのメチル化パターンと５−メチルシトシンの分布を解析しやすくなった（Ｆｒｏｍｍｅｒ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第８９巻、１８２７〜１８３１ページ、１９９２年）。さらに、亜硫酸水素塩で変換したＤＮＡから増幅したＰＣＲ産物を制限酵素で消化させる方法を利用する。それは、例えばＳａｄｒｉとＨｏｒｎｓｂｙが報告している方法（Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２４巻、５０５８〜５０５９ページ、１９９６年）、またはＣＯＢＲＡ（亜硫酸水素塩と制限酵素を組み合わせた分析）（ＸｉｏｎｇとＬａｉｒｄ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２５巻、２５３２〜２５３４ページ、１９９７年）である。
【００４１】
ＣＯＢＲＡ。ＣＯＢＲＡ分析は、少量のゲノムＤＮＡに含まれる特定の遺伝子座におけるＤＮＡのメチル化レベルを明らかにするのに有効な定量的メチル化アッセイである（ＸｉｏｎｇとＬａｉｒｄ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２５巻、２５３２〜２５３４ページ、１９９７年）。簡単に説明するならば、制限酵素による消化を利用して、亜硫酸水素ナトリウムで処理したＤＮＡのＰＣＲ産物におけるメチル化に依存した配列の違いを明らかにする。メチル化に依存した配列の違いは、Ｆｒｏｍｍｅｒら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第８９巻、１８２７〜１８３１ページ、１９９２年）が報告している方法に従って標準的な亜硫酸水素塩処理を行なうことにより、初めてゲノムＤＮＡに導入されている。次に、挿入されたＣｐＧ島に対して特異的なプライマーを用い、亜硫酸水素塩で変換したＤＮＡをＰＣＲで増幅した後、制限エンドヌクレアーゼにより消化させ、ゲル電気泳動を行ない、標識した特異的なハイブリダイゼーション・プローブを用いて検出を行なう。元のＤＮＡサンプルにおけるメチル化レベルは、消化されたＰＣＲ産物と消化されないＰＣＲ産物の相対量に基づき、線形的な定量関係として幅広いＤＮＡのメチル化レベルの中に位置づけられる。さらに、この方法は、顕微解剖してパラフィンに埋め込んだ組織サンプルから得られたＤＮＡに適用することができる。（例えばＣＯＢＲＡに基づいた典型的なキットに見られるような）ＣＯＢＲＡ分析用の典型的な試薬としては、特定の遺伝子に対するＰＣＲプライマー（またはメチル化が変化したＤＮＡ配列またはＣｐＧ島）；制限酵素と適切な緩衝液；遺伝子ハイブリダイゼーション・オリゴ；対照ハイブリダイゼーション・オリゴ；オリゴ・プローブ用のキナーゼ標識キット；放射性ヌクレオチドなどが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。さらに、亜硫酸水素塩変換試薬としては、ＤＮＡ変性緩衝液；スルホン化緩衝液；ＤＮＡ復元用の試薬またはキット（例えば沈殿、限外濾過、アフィニティ・カラム）；脱スルホン化緩衝液；ＤＮＡ復元成分などが挙げられる。
【００４２】
“メチライト”（蛍光に基づいたリアルタイムＰＣＲ法）（Ｅａｄｓ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、２３０２〜２３０６ページ、１９９９年）、Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ（メチル化感受性単一ヌクレオチド・プライマー伸長）反応（ＧｏｎｚａｌｇｏとＪｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２５巻、２５２９〜２５３１ページ、１９９７年）、メチル化特異的ＰＣＲ（“ＭＳＰ”；Ｈｅｒｍａｎ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第９３巻、９８２１〜９８２６ページ、１９９６年とアメリカ合衆国特許第５，７８６，１４６号）、メチル化されたＣｐＧ島の増幅（“ＭＣＡ”；Ｔｏｙｏｔａ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、２３０７〜２３１２、第５９巻、１９９９年）などのアッセイは、単独で利用したり、これらの方法のうちの別の方法と組み合わせて使用したりすることが好ましい。
【００４３】
メチライト。メチライト・アッセイは、蛍光に基づいたリアルタイムＰＣＲ（タックマン（登録商標））技術を利用したハイスループットの定量的メチル化アッセイであり、ＰＣＲステップの後に操作を行なう必要がない（Ｅａｄｓ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、２３０２〜２３０６ページ、１９９９年）。簡単に説明するならば、メチライト法では、ゲノムＤＮＡが混合したサンプルを、標準的な方法に従って亜硫酸水素ナトリウムを用いた反応により、メチル化に依存した配列の違いを有する混合プールに変換する（亜硫酸水素塩法により、メチル化されていないシトシン残基がウラシルに変換される）。次に、蛍光に基づいたＰＣＲを行なう。そのとき行なわせるのは、（既知のＣｐＧメチル化部位と重なっていないプライマーを用いた）“バイアスのない”ＰＣＲ反応、または（既知のＣｐＧジヌクレオチドと重なったＰＣＲプライマーを用いた）“バイアスのある”反応である。配列の識別は、増幅プロセスのレベル、または蛍光検出プロセスのレベル、またはその両方で行なうことができる。
【００４４】
メチライト・アッセイは、ゲノムＤＮＡサンプル中のメチル化パターンを定量的に調べる方法として利用することができる。このとき、配列の識別は、プローブのハイブリダイゼーションのレベルで起こる。この定量法では、ＰＣＲ反応により、想定される特定のメチル化部位と重なる蛍光プローブの存在下でバイアスのない増幅が行なわれる。入れたＤＮＡの量に対するバイアスのない対照となるのは、プライマーとプローブのどちらもどのＣｐＧジヌクレオチドとも重なっていない反応である。別の方法として、既知のメチル化部位を“カバー”していない対照オリゴヌクレオチド（“ＭＳＰ”法の蛍光に基づいたバージョン）、または潜在的なメチル化部位をカバーしているオリゴヌクレオチドのいずれかを用いてバイアスのあるＰＣＲプールを調べることにより、ゲノムのメチル化を定性的に知ることができる。
【００４５】
メチライト法は、“タックマン（登録商標）”プローブと合わせて増幅プロセスで利用することができる。例えば、二本鎖ゲノムＤＮＡを亜硫酸水素ナトリウムで処理し、タックマン（登録商標）プローブを用いて２通りあるＰＣＲ反応のうちの一方を行なう。そのとき、例えば、バイアスのあるプライマーとタックマン（登録商標）プローブ、またはバイアスのないプライマーとタックマン（登録商標）プローブが使用される。タックマン（登録商標）プローブは、蛍光“レポーター”分子と蛍光“クエンチャー”分子で二重に標識されており、ＧＣ含量が比較的多い領域に対して特異的になるように設計されているため、ＰＣＲサイクルにおいて順プライマーまたは逆プライマーよりも約１０℃高い温度で融ける。するとＰＣＲのアニーリング／伸長ステップにおいてタックマン（登録商標）プローブが十分にハイブリダイズしたままにすることができる。タック・ポリメラーゼという酵素によってＰＣＲを行なっている間に新しい鎖が合成されていくにつれ、その鎖は最終的にアニールされたタックマン（登録商標）プローブに到達する。タック・ポリメラーゼの５’→３’エンドヌクレアーゼ活性によりタックマン（登録商標）プローブが消化され、このプローブから蛍光レポーター分子が放出される。すると、リアルタイム蛍光検出システムを用い、クエンチ状態が解かれた信号を定量的に検出することができる。
【００４６】
（例えばメチライトに基づいた典型的なキットに見られるような）メチライト分析用の典型的な試薬としては、特定の遺伝子に対するＰＣＲプライマー（またはメチル化が変化したＤＮＡ配列またはＣｐＧ島）；タックマン（登録商標）プローブ；最適化されたＯＣＲ緩衝液とデオキシヌクレオチド；タック・ポリメラーゼなどが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。
【００４７】
Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ。Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ法は、ＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理した後に単一ヌクレオチド・プライマー伸長を行なうことに基づき、特定のＣｐＧ部位におけるメチル化の違いを定量的に評価する方法である（ＧｏｎｚａｌｇｏとＪｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２５巻、２５２９〜２５３１ページ、１９９７年）。簡単に説明するならば、ゲノムＤＮＡを亜硫酸水素ナトリウムと反応させてメチル化していないシトシンをウラシルに変換する一方で、５−メチルシトシンは変化しないままにしておく。次に、亜硫酸水素塩で変換したＤＮＡに対して特異的なＰＣＲプライマーを用いて望む標的配列を増幅し、得られた産物を単離し、注目のＣｐＧ部位におけるメチル化を分析するための鋳型として用いる。少量のＤＮＡでも分析することができ（例えば、顕微解剖した病変切片）、しかもＣｐＧ部位におけるメチル化状態を明らかにするのに制限酵素を使用せずにすむ。（例えばＭｓ−ＳＮｕＰＥに基づいた典型的なキットに見られるような）Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ分析用の典型的な試薬としては、特定の遺伝子に対するＰＣＲプライマー（またはメチル化が変化したＤＮＡ配列またはＣｐＧ島）；最適化されたＰＣＲ緩衝液とデオキシヌクレオチド；ゲル抽出キット；正の調節用プライマー；特定の遺伝子に対するＭｓ−ＳＮｕＰＥプライマー；（Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ反応用の）反応緩衝液；放射性ヌクレオチドなどが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。さらに、亜硫酸水素塩変換試薬としては、ＤＮＡ変性緩衝液；スルホン化緩衝液；ＤＮＡ復元用の試薬またはキット（例えば沈殿、限外濾過、アフィニティ・カラム）；脱スルホン化緩衝液；ＤＮＡ復元成分などが挙げられる。
【００４８】
ＭＳＰ。ＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）により、メチル化感受性制限酵素を使用せずに、ＣｐＧ島内のほとんどすべてのＣｐＧ部位のメチル化状態を評価することができる（Ｈｅｒｍａｎ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第９３巻、９８２１〜９８２６ページ、１９９６年；アメリカ合衆国特許第５，７８６，１４６号）。簡単に説明するならば、亜硫酸水素ナトリウムを用い、メチル化されたシトシンは除いてメチル化されていないすべてのシトシンをウラシルに変換することによってＤＮＡを変化させた後、メチル化されていないＤＮＡではなくメチル化されたＤＮＡに対して特異的なプライマーを用い、その変化したＤＮＡを増幅する。ＭＳＰではほんの少量のＤＮＡしか必要とせず、ＭＳＰは、所定のＣｐＧ島遺伝子座の０．１％メチル化された対立遺伝子に対して感受性があり、パラフィンに埋め込んだサンプルから抽出したＤＮＡに対してＭＳＰを実行することができる。（例えばＭＳＰに基づいた典型的なキットに見られるような）ＭＳＰ分析用の典型的な試薬としては、特定の遺伝子に対するメチル化されたＰＣＲプライマーと、特定の遺伝子に対するメチル化されていないＰＣＲプライマー（またはメチル化が変化したＤＮＡ配列またはＣｐＧ島）；最適化されたＰＣＲ緩衝液とデオキシヌクレオチド；特異的なプローブなどが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。
【００４９】
ＭＣＡ。ＭＣＡ法は、ゲノムＤＮＡ中の変化したメチル化パターンをスクリーニングし、その変化に関係した特定の配列を単離するのに用いることができる方法である（Ｔｏｙｏｔａ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、２３０７〜２３１２、第５９巻、１９９９年）。簡単に説明するならば、シトシンのメチル化に対する感度の異なる認識部位を持つ複数の制限酵素を用いて原発性腫瘍、細胞系、正常組織に由来するゲノムＤＮＡを消化させた後、アービトラリー・プライムド−ＰＣＲによる増幅を行なった。メチル化の程度が異なる断片群をクローニングし、高分解能ポリアクリルアミド・ゲル上でＰＣＲ産物を分離させた後にシークエンシングした。次に、クローニングした断片をサザン・ブロット分析のプローブとして用い、これら領域のメチル化の違いを確認した。（例えばＭＣＡに基づいた典型的なキットに見られるような）ＭＣＡ分析用の典型的な試薬としては、ゲノムＤＮＡの任意領域の合成を開始するためのＰＣＲプライマー；ＰＣＲ緩衝液とヌクレオチド、制限酵素と適切な緩衝液；遺伝子ハイブリダイゼーション用のオリゴまたはプローブ；対照ハイブリダイゼーション用のオリゴまたはプローブなどが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。
【００５０】
メチル化されたＣｐＧを含む核酸を検出するためのキット。公知の１つ以上のメチル化アッセイ（上記のものを含む）を実行するのに必要な試薬を、配列番号１〜１０３の配列またはその一部を含むプライマーまたはプローブと組み合わせ、ＣｐＧを含む核酸のメチル化状態を明らかにする。例えば、メチライト、Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ、ＭＣＡ、ＣＯＢＲＡ、ＭＳＰというメチル化アッセイを単独で、あるいは組み合わせ、配列番号１〜１０３の配列またはその一部を含むプライマーまたはプローブとともに使用すると、配列番号１〜１０３に対応するゲノム配列、または配列番号１〜１０３の配列に関係したＣｐＧ島配列に対応するゲノム配列に含まれるＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を明らかにすることができよう。ただし、特定の配列番号の配列に関係したＣｐＧ島配列は、この特定の配列番号の配列の少なくとも１つのヌクレオチドを含んでいて、ＣｐＧジヌクレオチドの頻度が観測値／予測値の比＞０．６に対応することと、ＧＣ含量＞０．５であることの両方の条件を満たす連続したゲノムＤＮＡ配列である。
関連する出願の相互参照
本出願は、２０００年１０月２７日に出願されたアメリカ合衆国特許出願シリアル番号第０９／６９９，２４３号の優先権を主張する。
【０００２】
発明の属する技術分野
本発明は、ガン患者において変化したメチル化パターン（高メチル化または低メチル化）を示す新規なヒトＤＮＡ配列に関する。メチル化状態が変化した新規なこれらＤＮＡ配列は、ヒトのガンの診断、予後予測、治療に用いるマーカーとして有用である。
【０００３】
発明の背景
腫瘍形成における初期の遺伝子変化を同定することが、分子レベルでのガン研究の中心的課題となっている。ガンに関連した遺伝子変化の性質とパターンが明らかになると、ガンの早期検出、診断、治療が可能になろう。脊椎動物におけるこのような遺伝子変化は、一般に、３つのカテゴリーのうちの１つに当てはまる。３つのカテゴリーとは、遺伝物質の取得または欠失；遺伝物質の突然変異；“ＣｐＧ島”内のＣｐＧジヌクレオチド中のシトシン残基のメチル化である。これらのうちでＤＮＡのメチル化だけが可逆的であり、メチル化状態の変化が遺伝子の発現（例えばＣｐＧ島がプロモータ領域またはその近傍に位置する遺伝子の転写開始）または遺伝子の安定性に影響を及ぼすことが知られている。
【０００４】
ＣｐＧ 島内での ＣｐＧ ジヌクレオチドのメチル化
ＤＮＡは、高等な真核生物では、ＣｐＧジヌクレオチド中のグアノシン残基に対して５’末端側に位置するシトシン残基でのみメチル化される。シトシン塩基のＣ−５位置がＤＮＡ（シトシン−５）メチルトランスフェラーゼという酵素によって変化してこのように共有結合すると、５−メチルシトシン（５−ｍＣｙｔ）の形成がもたらされ、この塩基が独自の性質を持つようになる（例えば自発的脱アミノ反応が起こりやすくなる）。酵素によるこのような変換は、脊椎動物において存在することが知られているＤＮＡの唯一の後成的変化であり、正常な胚発生にとって非常に重要である（Ｂｉｒｄ， Ａ．Ｐ．、Ｃｅｌｌ、第７０巻、５〜８ページ、１９９２年；ＬａｉｒｄとＪａｅｎｉｓｃｈ、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第３巻、１４８７〜１４９５ページ、１９９４年；Ｌｉ他、Ｃｅｌｌ、第６９巻、９１５〜９２６ページ、１９９２年）。
【０００５】
ＣｐＧジヌクレオチドに５−ｍＣｙｔが存在していることで、脊椎動物が進化していく間にゲノム中のこの配列が５分の１に減った（ＳｃｈｒｏｄｅｒｅｔとＧａｒｔｌｅｒ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第８９巻、９５７〜９６１ページ、１９９２年）。これは、おそらく５−ｍＣｙｔが自発的に脱アミノ反応してチミジンになったためであろう。しかしゲノムのいくつかの領域ではこのような減少は見られず、そのような領域は“ＣｐＧ島”と呼ばれている（Ｂｉｒｄ， Ａ．Ｐ．、Ｎａｔｕｒｅ、第３２１巻、２０９〜２１３ページ、１９８６年；Ｇａｒｄｉｎｅｒ−ＧａｒｄｅｎとＦｒｏｍｍｅｒ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、第１９６巻、２６１〜２８２ページ、１９８７年）。これらＣｐＧ島は、脊椎動物のゲノムのほんの約１％にしかならないが、それでもゲノムＣｐＧジヌクレオチドの総数の約１５％を占めている（ＡｎｔｅｑｕｅｒａとＢｉｒｄ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第９０巻、１１９９５〜１１９９９ページ、１９９３年）。ＣｐＧ島は、予想される（すなわち進化によって減少していない）頻度でＣｐＧを含んでおり（観測値／予測値の比＞０．６。なお観測値／予測値の比は、［ＣｐＧ部位の数／（Ｃ塩基の数×Ｇ塩基の数）］×各断片のバンド長として計算される）、ＧＣリッチであり（ＧＣ含量＞０．５。なおＧＣ含量は、（Ｃ塩基の数＋Ｇ塩基の数）／各断片のバンド長として計算される）、典型的な長さは約０．２〜約１ｋｂである。
【０００６】
ＣｐＧ 島内でのメチル化が、遺伝子の発現に影響を及ぼす
ＣｐＧ島は、多数のハウスキーピング遺伝子と組織特異的遺伝子の上流に位置するが、遺伝子コード領域まで延びていることもある（ＣｒｏｓｓとＢｉｒｄ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、第５巻、３０９〜３１４ページ、１９９５年；Ｌａｒｓｅｎ他、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、第１３巻、１０９５〜１１０７ページ、１９９２年）。体細胞組織のＣｐＧ島にあるシトシンのメチル化は、遺伝子の発現に影響を及ぼすと考えられている。メチル化は遺伝子の活性と逆相関することがわかっており、さまざまなメカニズムによって遺伝子の発現を低下させる可能性がある。そうしたメカニズムとしては、転写開始の抑制（Ｂｉｒｄ， Ａ．Ｐ．、Ｎａｔｕｒｅ、第３２１巻、２０９〜２１３ページ、１９８６年；Ｄｅｌｇａｄｏ他、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、第１７巻、２４２６〜２４３５ページ、１９９８年）、局所的クロマチン構造の破壊（ＣｏｕｎｔｓとＧｏｏｄｍａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、第１１巻、１８５〜１８８ページ、１９９４年；Ａｎｔｅｑｕｅｒａ他、Ｃｅｌｌ、第６２巻、５０３〜５１４ページ、１９９０年）、メチル化した配列と特異的に相互作用するタンパク質の補充による転写因子の結合の直接的または間接的な阻止（Ｂｉｒｄ， Ａ．Ｐ．、Ｃｅｌｌ、第７０巻、５〜８ページ、１９９２年；ＣｏｕｎｔｓとＧｏｏｄｍａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、第１１巻、１８５〜１８８ページ、１９９４年；Ｃｅｄａｒ， Ｈ．、Ｃｅｌｌ、第５３巻、３〜４ページ、１９８８年）などが挙げられる。多数の研究によってＣｐＧ島のメチル化が遺伝子の発現に及ぼす効果が明らかにされている（例えばＣＤＫＮ２Ａ／ｐ１６遺伝子；Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｚｕｌｕｅｔａ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第５５巻、４５３１〜４５３５ページ、１９９５年）が、常染色体遺伝子上のほとんどのＣｐＧ島は生殖系列ではメチル化されないままであり、これらＣｐＧ島のメチル化は、一般に遺伝子の発現とは独立である。組織特異的遺伝子は、一般に、それぞれの標的器官においてはメチル化されないが、生殖系列と非発現成熟組織ではメチル化される。他方、構成的に発現しているハウスキーピング遺伝子のＣｐＧ島は、生殖系列と体細胞組織では通常はメチル化されない。
【０００７】
ＣｐＧ 島内でのメチル化が、ガンに関係する遺伝子の発現に影響を及ぼす
一連の研究からのデータによると、ガン細胞には、非ガン細胞と比べて変化したメチル化が存在している。これらの研究は、ゲノム・レベル全体でＤＮＡのメチル化が変化するだけでなく、メチル基の分布も変化することを示している。例えば、ある細胞内のガン抑制遺伝子またはガン遺伝子に付随するＣｐＧ島の異常なメチル化により、変化した遺伝子発現が起こる可能性がある。このように変化した遺伝子発現により、選択的に有利に増殖する細胞集団が生まれ、これらの細胞の選択によりその生物に対する害がもたらされる可能性がある（すなわちガン）。
【０００８】
不十分な相関データ
残念なことに、正常な細胞に対してガン細胞のＣｐＧ島内ではＣｐＧジヌクレオチドには変化したメチル化が存在していること、あるいは特別な場合にこのようなメチル化の変化によって遺伝子の発現（またはクロマチンの構造または安定性）の変化がもたらされることがわかっただけでは、この知見を効果的な診断、予後予測、治療に応用するには不十分である。というのも、限られた数のＣｐＧ島についてしか特徴が明らかにされておらず、したがって、多数あるＣｐＧ島のうちのどの特定のＣｐＧ島が実際にガンまたはその原因と関係するか、あるいは有意な相関を示すかについての知識が足りないからである。しかも、特定のガンには、ＣｐＧ島と見なされる配列構成を有する可能性があるＤＮＡ配列を含め、メチル化が変化した複数のＤＮＡ配列が関与した複雑なメチル化パターンが存在していることがある。
【０００９】
したがって、メチル化が変化した特定のＤＮＡ配列を同定してその特徴を明らかにし、そのＤＮＡ配列をガンと関連づけ、診断、予後予測、治療に応用できるようにすることが、当業界で必要とされている。
【００１０】
発明の概要
本発明により、ガンの診断法または予後予測法であって：検体組織から組織サンプルを取得し；その組織サンプルに由来するＤＮＡに対してメチル化アッセイを行なうことにより、そのＤＮＡのＤＮＡ配列中のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を明らかにし（ただしこのＤＮＡ配列は、配列番号１〜１０３の配列、配列番号１〜１０３の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する配列、配列番号１〜１０３の配列と関係したＣｐＧ島配列、配列番号１〜１０３の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する配列と関係したＣｐＧ島配列、およびこれらの組み合わせからなるグループの中から選択した配列であり、特定の配列番号の配列と関係したＣｐＧ島配列は、その特定の配列番号の少なくとも１つのヌクレオチドを含んでいて、ＣｐＧジヌクレオチドの頻度が観測値／予測値の比＞０．６に対応することと、ＧＣ含量＞０．５であることの両方の条件を満たす連続したゲノムＤＮＡ配列である）；診断または予後予測を、上記ＤＮＡ配列中のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を利用して行なう操作：を含む診断法または予後予測法が提供される。ＤＮＡ配列は、配列番号１〜１０３の配列と関係したＣｐＧ島配列、配列番号１〜１０３の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する配列と関係したＣｐＧ島配列、およびこれらの組み合わせからなるグループの中から選択した配列であることが好ましい。ＤＮＡ配列は、配列番号２、４、６、７、９〜１６、１９、２０、２２〜３３、３５〜４３、４８、５１〜５５、５９、６０、６４、７１、７６、７８〜８１、８４、８７〜９０の配列と関係したＣｐＧ島配列、およびこれらの組み合わせからなるグループの中から選択した配列であることが好ましい。メチル化アッセイの方法は、メチライト、ＭＳ−ＳｎｕＰＥ（メチル化感受性単一ヌクレオチド・プライマー伸長）、ＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）、ＭＣＡ（メチル化されたＣｐＧ島の増幅）、ＣＯＢＲＡ（亜硫酸水素塩と制限酵素を組み合わせた分析）、およびこれらの組み合わせからなるグループの中から選択することが好ましい。ＤＮＡ配列中のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態は、高メチル化、低メチル化、正常メチル化のいずれかであることが好ましい。ガンは、膀胱ガン、前立腺ガン、結腸ガン、肺ガン、腎臓ガン、白血病、乳ガン、子宮ガン、星状膠細胞腫、グリオブラストーマ、神経芽細胞腫からなるグループの中から選択することが好ましい。ガンは、膀胱ガンまたは前立腺ガンであることが好ましい。
【００１１】
本発明によりさらに、メチル化されたＣｐＧを含む核酸を検出するのに有効で、１つ以上の容器を含む保持手段を含んで成るキットであって、配列番号１〜１０３の配列と、配列番号１〜１０３の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する配列とからなるグループの中から選択した配列の任意の領域とハイブリダイズするプローブまたはプライマーを含む容器と；メチル化されたＣｐＧを含む核酸の検出を、このプローブまたはプライマーに基づいて行なうのに必要な付加的な標準メチル化アッセイ用試薬とを備えるキットが提供される。付加的な標準メチル化アッセイ用試薬は、メチライト、ＭＳ−ＳＮｕＰＥ、ＭＳＰ ＭＣＡ、ＣＯＢＲＡ、およびこれらの組み合わせからなるグループの中から選択したメチル化アッセイを実行するための標準試薬であることが好ましい。プローブまたはプライマーは、配列番号１〜１０３の配列と、配列番号１〜１０３の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する配列とからなるグループの中から選択した配列中の少なくとも約１２〜１５個のヌクレオチドを含んで成ることが好ましい。
【００１２】
本発明によりさらに、配列番号１、配列番号５、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１８、配列番号２４、配列番号２５、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４２、配列番号４４、配列番号５１、配列番号５２、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７４、配列番号７６、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８６、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９７、配列番号１００からなるグループの中から選択したメチル化されたポリヌクレオチド配列またはメチル化されていないポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子が提供される。核酸はメチル化されていることが好ましい。核酸はメチル化されていないことが好ましい。
【００１３】
発明の詳細な説明
定義：
“ＧＣ含量”とは、特定のＤＮＡ配列中の［（Ｃ塩基の数＋Ｇ塩基の数）／各断片のバンド長］を意味する。
【００１４】
“観測値／予測値の比”（“Ｏ／Ｅ比”）とは、特定のＤＮＡ配列内のＣｐＧジヌクレオチドの頻度を意味し、［ＣｐＧ部位の数／（Ｃ塩基の数×Ｇ塩基の数）］×各断片のバンド長に対応する。
【００１５】
“ＣｐＧ島”とは、（１）ＣｐＧジヌクレオチドの頻度が“観測値／予測値の比”＞０．６に対応することと、（２）“ＧＣ含量”＞０．５であることの両方の条件を満たすゲノムＤＮＡの連続領域を意味する。ＣｐＧ島は、一般に、長さが約０．２〜約１ｋｂであるが、必ずしもそうなっているとは限らない。本発明の特定の配列番号の配列に関係するＣｐＧ島配列は、この特定の配列番号の配列の少なくとも１つ以上のヌクレオチドを含んでいて、ＣｐＧジヌクレオチドの頻度が観測値／予測値の比＞０．６に対応することと、ＧＣ含量＞０．５であることの両方の条件を満たすゲノムＤＮＡの連続配列である。
【００１６】
“メチル化状態”とは、ＤＮＡ配列内の１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドに５−メチルシトシン（“５−ｍＣｙｔ”）が存在しているか不在であるかを意味する。
【００１７】
“高メチル化”とは、テストするＤＮＡサンプルのＤＮＡ配列中の１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドに存在する５−ｍＣｙｔの量が、正常な対照用ＤＮＡサンプル中の対応するＣｐＧジヌクレオチドに見られる５−ｍＣｙｔの量と比べて増加していること、に対応するメチル化状態を意味する。
【００１８】
“低メチル化”とは、テストするＤＮＡサンプルのＤＮＡ配列中の１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドに存在する５−ｍＣｙｔの量が、正常な対照用ＤＮＡサンプル中の対応するＣｐＧジヌクレオチドに見られる５−ｍＣｙｔの量と比べて減少していること、に対応するメチル化状態を意味する。
【００１９】
“メチル化アッセイ”とは、ＤＮＡ配列中のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を明らかにする任意のアッセイを意味する。
【００２０】
“ＭＳ．ＡＰ−ＰＣＲ”（メチル化感受性アービトラリー・プライムド・ポリメラーゼ連鎖反応）とは、ＣｐＧジヌクレオチドを含んでいる可能性が最も大きい領域に焦点を合わせ、ＣＧリッチなプライマーを用いてゲノムの全体走査を行なうことを可能にする公知の技術であり、Ｇｏｎｚａｌｇｏ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第５７巻、５９４〜５９９ページ、１９９７年に記載されている。
【００２１】
“メチライト”とは、Ｅａｄｓ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第５９巻、２３０２〜２３０６ページ、１９９９年に記載されている、蛍光に基づいた公知のリアルタイムＰＣＲ法を意味する。
【００２２】
“Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ”（メチル化感受性単一ヌクレオチド・プライマー伸長）とは、ＧｏｎｚａｌｇｏとＪｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２５巻、２５２９〜２５３１ページ、１９９７年に記載されている公知のアッセイを意味する。
【００２３】
“ＭＳＰ”（メチル化特異的ＰＣＲ）とは、Ｈｅｒｍａｎ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第９３巻、９８２１〜９８２６ページ、１９９６年とアメリカ合衆国特許第５，７８６，１４６号に記載されている公知のメチル化アッセイを意味する。
【００２４】
“ＣＯＢＲＡ”（亜硫酸水素塩と制限酵素を組み合わせた分析）とは、ＸｉｏｎｇとＬａｉｒｄ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２５巻、２５３２〜２５３４ページ、１９９７年に記載されている公知のメチル化アッセイを意味する。
【００２５】
“ＭＣＡ”（メチル化されたＣｐＧ島の増幅）とは、Ｔｏｙｏｔａ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、２３０７〜２３１２、第５９巻、１９９９年と、ＷＯ ００／２６４０１Ａ１に記載されているメチル化アッセイを意味する。
【００２６】
概要
本発明により、正常な組織と比べた場合、ガンにおいて明らかなメチル化パターンを有する１０３個のＤＮＡ配列（すなわち“マーカー配列”）が提供される。メチル化が変化したこれらＤＮＡ配列は、膀胱ガンの患者と前立腺ガンの患者から単離した１０３個のＤＮＡ断片に対応しており、多くの場合にＧｅｎＢａｎｋデータベースには見られない新規な配列になっている。ここに示した配列のどれについても、ヒトのガン（例えば膀胱ガンや前立腺ガンが挙げられるが、それだけに限定されない）においてそのメチル化パターンの特徴が以前に明らかにされたことはないことに注意されたい。このメチル化パターンが重要なのは、変化した断片がヒトのガンの予後予測用、診断用、治療用のマーカーとしての可能性を有するからである。
【００２７】
ゲノムＤＮＡ中でメチル化が変化したマーカー配列の同定
ＭＳ．ＡＰ−ＰＣＲ法を用いて膀胱ガンまたは前立腺ガンの患者のゲノムを走査し、正常な人と比べてＤＮＡのメチル化が変化しているかどうかを調べた。というのも、このパターンは非常によく保存されていることが知られているからである。合計で１０３個のＤＮＡ配列（メチル化が変化したＤＮＡ配列；“マーカー配列”）を単離し、ガンが正常な組織と比べてはっきりと異なるメチル化パターンを有することを明らかにした。
【００２８】
ゲノムＤＮＡ中のマーカー配列の同定方法。ガン細胞中で変化したメチル化部位を同定するのに用いられてきた公知のゲノム走査法が多数ある。例えば１つの方法は、制限ランドマーク・ゲノム走査（Ｋａｗａｉ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第１４巻、７４２１〜７４２７ページ、１９９４年）を含んでおり、別の方法は、ＭＣＡ（メチル化されたＣｐＧ島の増幅；Ｔｏｙｏｔａ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、２３０７〜２３１２、１９９９年）を含んでおり、さらに別の方法は、ＭＳ．ＡＰ−ＰＣＲ（メチル化感受性アービトラリー・プライムド・ポリメラーゼ連鎖反応；Ｇｏｎｚａｌｇｏ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５７巻、５９４〜５９９ページ、１９９７年）を含んでいる。この最後の方法を利用すると、ＣｐＧジヌクレオチドを含んでいる可能性が最も大きい領域に焦点を合わせ、ＣＧリッチなプライマーを用いてゲノムの全体走査を行なうことが可能になる。本発明で利用するＭＳ．ＡＰ−ＰＣＲ法は、ゲノムＤＮＡの変化したメチル化パターンをスクリーニング（走査）してその変化に関係した特別な配列を単離する上で、迅速且つ効率的な方法である。
【００２９】
簡単に説明するならば、標準的な従来法を用い、膀胱ガンまたは前立腺ガンの患者の組織に由来するゲノムＤＮＡを調製した。シトシンのメチル化に対する感度の異なる認識部位を持つ複数の制限酵素（例えばＨｐａＩＩ）を用いてこれらゲノムＤＮＡを消化させた後、ＧＣリッチなプライマーを用いてアービトラリー・プライムド−ＰＣＲによる増幅を行なった。メチル化の程度が異なる断片群（例えば高メチル化または低メチル化。メチル化に関する制限酵素の感度、またはＤＮＡ配列分析、またはＭｓ−ＳＮｕＰＥ分析に基づく；ＧｏｎｚａｌｇｏとＪｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２５巻、２５２９〜２５３１ページ、１９９７年）をクローニングし、高分解能ポリアクリルアミド・ゲル上でそのＰＣＲ産物を分離させた後にシークエンシングした。クローニングした断片をサザン・ブロット分析のプローブとして用い、組織内のこれら領域のメチル化の違いを確認した。ＤＮＡクローニング、シークエンシング、ＰＣＲ、高分解能ポリアクリルアミド・ゲルによる分離、サザン・ブロット分析は、当業者には周知である。
【００３０】
結果。走査を行なった患者のゲノムＤＮＡから高メチル化（正常状態と比べてメチル化のレベルが増加）または低メチル化（正常状態と比べてメチル化のレベルが減少）を受けたＤＮＡ断片を合計で５００個単離した。これら断片のうちで合計１７８個をシークエンシングしたところ、そのうちの１０３個は、メチル化パターンが以前に明らかになっていないＤＮＡ遺伝子座に対応するという意味で新規であった。対応する配列を［配列番号１〜１０３］として示してある。この中のいくつかの配列に関しては、文字“ｎ”はヌクレオチド塩基が決定されていないことを意味する。
【００３１】
ＭＳ．ＡＰ−ＰＣＲによって同定された新規なマーカー配列。表Ｉは、ＭＳ．ＡＰ−ＰＣＲによって同定された１０３個のＤＮＡ断片に対応するメチル化パターンと、それに対応する配列データをまとめたものである。合計で１０３個の断片について、正常組織と比べて高メチル化である（メチル化の獲得；高メチル化パターンを有する）か、あるいは低メチル化である（メチル化の欠失；低メチル化パターンを有する）かを同定した後にシークエンシングした。それぞれのカテゴリーの断片について、（（Ｃ塩基の数＋Ｇ塩基の数）／各断片のバンド幅として計算される）“平均ＧＣ含量”と、（［ＣｐＧ部位の数／（Ｃ塩基の数×Ｇ塩基の数）］×各断片のバンド幅として計算される）観測値／予測値の比（“Ｏ／Ｅ比”）の平均値を示してある。さらに、ＣｐＧ島と見なされる断片の割合も掲載してある。これは、それぞれのカテゴリーにおいて、“ＧＣ含量”＞０．５かつ“Ｏ／Ｅ比”＞０．６という条件を満たす配列組成を有するすべての断片の割合に対応する。
【００３２】
以上より、ＭＳ．ＡＰ−ＰＣＲによって同定されたこれら１０３個の断片のうち、６０個が高メチル化だった（表Ｉ、上の行；表ＩＩ、［配列番号１〜６０］）のに対し、４３個は低メチル化だった（表Ｉ、下の行；表ＩＩ、［配列番号６１〜１０３］）。さらに、１０３個の断片のうちで５５個（メチル化が過剰だった４３個と過少だった１２個）がＣｐＧ島に対応している（すなわち、ＧＣ含量＞０．５かつ観測値／予測値の比＞０．６という条件を満たす）のに対し、残りの４８個（メチル化が過剰だった１７個と過少だった３１個）の断片はＣｐＧ島の条件に合致しない（表ＩＩを参照のこと）。
【表１】
表ＩＩは、ＭＳ．ＡＰ−ＰＣＲによって同定された１０３個のＤＮＡ断片に対応する個々の配列（［配列番号１〜１０３］）についてのメチル化パターンと配列データをまとめたものである。これら１０３個の断片についてのデータは、高メチル化（［配列番号１〜６０］）または低メチル化（［配列番号６１〜１０３］）に分けた。表ＩＩには、それぞれの配列について、対応する“断片の名称”、（塩基対；“ｂｐ”で表わした）断片の“サイズ”、“ＧＣ含量”、“観測値／予測値の比”（“Ｏ／Ｅ比”）、“説明”（すなわち、ＣｐＧ島の条件を満たしているかどうか）、“発明者のイニシャル”（ＩＤＣＭ＝Ｉｓａｂｅｌ Ｄ．Ｃ． Ｍａｒｋｌ、ＪＣ＝Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｃｈｅｎｇ、ＧＬ＝Ｇａｎｇｎｉｎｇ Ｌｉａｎｇ、ＨＦ＝Ｈｕａｌｉｎ Ｆｕ、ＹＴ＝Ｙｏｓｈｉｔａｋａ Ｔｏｍｉｇａｈａｒａ）、“ガンの出所”、ＧｅｎＢａｎｋデータベースの“染色体との一致”も記載されている。ダッシュ（“−”）は、ＧｅｎＢａｎｋの染色体との一致が存在しないか、低得点の部分的一致しか存在しないことを意味する。“ＧＣ含量”と“Ｏ／Ｅ比”の平均、ならびにＣｐＧ島である断片の割合が、高メチル化のカテゴリーと低メチル化のカテゴリーの最後の項の後に掲載してある。
【００３４】
したがって本発明により、ガンの予後予測、診断、治療への応用において有用な１０３個のＤＮＡ断片とそれに対応するマーカー配列（すなわち、メチル化が変化したＤＮＡ配列）が提供される。
【００３５】
さらに、１０３個の配列のうちの少なくとも５５個は、（ＧＣ含量とＯ／Ｅ比に基づく）ＣｐＧ島に対応している。その５５個とは、［配列番号２、４、６、７、９〜１６、１９、２０、２２〜３３、３５〜４３、４８、５１〜５５、５９、６０、６４、７１、７６、７８〜８１、８４、８７〜９０］である。したがって、所定のＣｐＧ島の一部におけるメチル化状態が一般にその島全体を代表しているという事実に基づくと、本発明にはさらに、［配列番号２、４、６、７、９〜１６、１９、２０、２２〜３３、３５〜４３、４８、５１〜５５、５９、６０、６４、７１、７６、７８〜８１、８４、８７〜９０］と関係した５５個のＣｐＧ島をガンの予後予測、診断、治療に応用するという新規な利用法も含まれることになる。ただし、特定の配列番号の配列に関係したＣｐＧ島配列は、この特定の配列番号の配列の少なくとも１つのヌクレオチドを含んでいて、ＣｐＧジヌクレオチドの頻度が観測値／予測値の比＞０．６に対応することと、ＧＣ含量＞０．５であることの両方の条件を満たしているゲノムＤＮＡの連続配列である。
【表２】
ガンの診断法および予後予測法。本発明により、メチル化が変化した上記の１０３個のＤＮＡ配列のうちの１つ以上の配列についてのメチル化状態を明らかにすることに基づいたガンの診断法および予後予測法が提供される。一般に、このような方法には、検体組織から組織サンプルを取得し、その組織サンプルに由来するＤＮＡについてメチル化アッセイを行ない、その結果に基づいて診断または予後予測を行なう操作が含まれる。
【００３７】
メチル化アッセイは、ＤＮＡサンプルのあるＤＮＡ配列中の１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を明らかにするのに用いられる。本発明によれば、可能なメチル化状態としては、正常状態（すなわちガンでない対照状態）と比べてメチル化が過剰な状態と過少な状態が挙げられる。高メチル化および低メチル化とは、検体サンプルのあるＤＮＡ配列中の１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドに存在している５−メチルシトシン（“５−ｍＣｙｔ”）が、正常な対照ＤＮＡサンプル中の対応するＣｐＧジヌクレオチドに見られる５−ｍＣｙｔの量と比較してそれぞれ増加しているか減少しているかに対応するメチル化のことを意味する。
【００３８】
診断または予後予測は、ガンでない正常な組織から得られた対照データと比較することでサンプルＤＮＡ配列において明らかになったメチル化状態を少なくとも判断材料の一部として利用して行なう。
【００３９】
メチル化アッセイの方法。メチル化アッセイのさまざまな方法が従来技術で知られており、本発明と合わせて利用することができる。これらアッセイにより、あるＤＮＡ配列中の１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチド（すなわちＣｐＧ島）のメチル化状態を明らかにすることができる。このようなアッセイとしては、亜硫酸水素塩で処理したＤＮＡのＤＮＡシークエンシング、（配列特異的増幅のための）ＰＣＲ、サザン・ブロット分析、メチル化感受性制限酵素の利用などが特に挙げられる。
【００４０】
例えば、亜硫酸水素塩での処理を行なうことによってゲノム・シークエンシングが簡単化され、ＤＮＡのメチル化パターンと５−メチルシトシンの分布を解析しやすくなった（Ｆｒｏｍｍｅｒ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第８９巻、１８２７〜１８３１ページ、１９９２年）。さらに、亜硫酸水素塩で変換したＤＮＡから増幅したＰＣＲ産物を制限酵素で消化させる方法を利用する。それは、例えばＳａｄｒｉとＨｏｒｎｓｂｙが報告している方法（Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２４巻、５０５８〜５０５９ページ、１９９６年）、またはＣＯＢＲＡ（亜硫酸水素塩と制限酵素を組み合わせた分析）（ＸｉｏｎｇとＬａｉｒｄ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２５巻、２５３２〜２５３４ページ、１９９７年）である。
【００４１】
ＣＯＢＲＡ。ＣＯＢＲＡ分析は、少量のゲノムＤＮＡに含まれる特定の遺伝子座におけるＤＮＡのメチル化レベルを明らかにするのに有効な定量的メチル化アッセイである（ＸｉｏｎｇとＬａｉｒｄ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２５巻、２５３２〜２５３４ページ、１９９７年）。簡単に説明するならば、制限酵素による消化を利用して、亜硫酸水素ナトリウムで処理したＤＮＡのＰＣＲ産物におけるメチル化に依存した配列の違いを明らかにする。メチル化に依存した配列の違いは、Ｆｒｏｍｍｅｒら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第８９巻、１８２７〜１８３１ページ、１９９２年）が報告している方法に従って標準的な亜硫酸水素塩処理を行なうことにより、初めてゲノムＤＮＡに導入されている。次に、挿入されたＣｐＧ島に対して特異的なプライマーを用い、亜硫酸水素塩で変換したＤＮＡをＰＣＲで増幅した後、制限エンドヌクレアーゼにより消化させ、ゲル電気泳動を行ない、標識した特異的なハイブリダイゼーション・プローブを用いて検出を行なう。元のＤＮＡサンプルにおけるメチル化レベルは、消化されたＰＣＲ産物と消化されないＰＣＲ産物の相対量に基づき、線形的な定量関係として幅広いＤＮＡのメチル化レベルの中に位置づけられる。さらに、この方法は、顕微解剖してパラフィンに埋め込んだ組織サンプルから得られたＤＮＡに適用することができる。（例えばＣＯＢＲＡに基づいた典型的なキットに見られるような）ＣＯＢＲＡ分析用の典型的な試薬としては、特定の遺伝子に対するＰＣＲプライマー（またはメチル化が変化したＤＮＡ配列またはＣｐＧ島）；制限酵素と適切な緩衝液；遺伝子ハイブリダイゼーション・オリゴ；対照ハイブリダイゼーション・オリゴ；オリゴ・プローブ用のキナーゼ標識キット；放射性ヌクレオチドなどが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。さらに、亜硫酸水素塩変換試薬としては、ＤＮＡ変性緩衝液；スルホン化緩衝液；ＤＮＡ復元用の試薬またはキット（例えば沈殿、限外濾過、アフィニティ・カラム）；脱スルホン化緩衝液；ＤＮＡ復元成分などが挙げられる。
【００４２】
“メチライト”（蛍光に基づいたリアルタイムＰＣＲ法）（Ｅａｄｓ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、２３０２〜２３０６ページ、１９９９年）、Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ（メチル化感受性単一ヌクレオチド・プライマー伸長）反応（ＧｏｎｚａｌｇｏとＪｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２５巻、２５２９〜２５３１ページ、１９９７年）、メチル化特異的ＰＣＲ（“ＭＳＰ”；Ｈｅｒｍａｎ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第９３巻、９８２１〜９８２６ページ、１９９６年とアメリカ合衆国特許第５，７８６，１４６号）、メチル化されたＣｐＧ島の増幅（“ＭＣＡ”；Ｔｏｙｏｔａ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、２３０７〜２３１２、第５９巻、１９９９年）などのアッセイは、単独で利用したり、これらの方法のうちの別の方法と組み合わせて使用したりすることが好ましい。
【００４３】
メチライト。メチライト・アッセイは、蛍光に基づいたリアルタイムＰＣＲ（タックマン（登録商標））技術を利用したハイスループットの定量的メチル化アッセイであり、ＰＣＲステップの後に操作を行なう必要がない（Ｅａｄｓ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、２３０２〜２３０６ページ、１９９９年）。簡単に説明するならば、メチライト法では、ゲノムＤＮＡが混合したサンプルを、標準的な方法に従って亜硫酸水素ナトリウムを用いた反応により、メチル化に依存した配列の違いを有する混合プールに変換する（亜硫酸水素塩法により、メチル化されていないシトシン残基がウラシルに変換される）。次に、蛍光に基づいたＰＣＲを行なう。そのとき行なわせるのは、（既知のＣｐＧメチル化部位と重なっていないプライマーを用いた）“バイアスのない”ＰＣＲ反応、または（既知のＣｐＧジヌクレオチドと重なったＰＣＲプライマーを用いた）“バイアスのある”反応である。配列の識別は、増幅プロセスのレベル、または蛍光検出プロセスのレベル、またはその両方で行なうことができる。
【００４４】
メチライト・アッセイは、ゲノムＤＮＡサンプル中のメチル化パターンを定量的に調べる方法として利用することができる。このとき、配列の識別は、プローブのハイブリダイゼーションのレベルで起こる。この定量法では、ＰＣＲ反応により、想定される特定のメチル化部位と重なる蛍光プローブの存在下でバイアスのない増幅が行なわれる。入れたＤＮＡの量に対するバイアスのない対照となるのは、プライマーとプローブのどちらもどのＣｐＧジヌクレオチドとも重なっていない反応である。別の方法として、既知のメチル化部位を“カバー”していない対照オリゴヌクレオチド（“ＭＳＰ”法の蛍光に基づいたバージョン）、または潜在的なメチル化部位をカバーしているオリゴヌクレオチドのいずれかを用いてバイアスのあるＰＣＲプールを調べることにより、ゲノムのメチル化を定性的に知ることができる。
【００４５】
メチライト法は、“タックマン（登録商標）”プローブと合わせて増幅プロセスで利用することができる。例えば、二本鎖ゲノムＤＮＡを亜硫酸水素ナトリウムで処理し、タックマン（登録商標）プローブを用いて２通りあるＰＣＲ反応のうちの一方を行なう。そのとき、例えば、バイアスのあるプライマーとタックマン（登録商標）プローブ、またはバイアスのないプライマーとタックマン（登録商標）プローブが使用される。タックマン（登録商標）プローブは、蛍光“レポーター”分子と蛍光“クエンチャー”分子で二重に標識されており、ＧＣ含量が比較的多い領域に対して特異的になるように設計されているため、ＰＣＲサイクルにおいて順プライマーまたは逆プライマーよりも約１０℃高い温度で融ける。するとＰＣＲのアニーリング／伸長ステップにおいてタックマン（登録商標）プローブが十分にハイブリダイズしたままにすることができる。タック・ポリメラーゼという酵素によってＰＣＲを行なっている間に新しい鎖が合成されていくにつれ、その鎖は最終的にアニールされたタックマン（登録商標）プローブに到達する。タック・ポリメラーゼの５’→３’エンドヌクレアーゼ活性によりタックマン（登録商標）プローブが消化され、このプローブから蛍光レポーター分子が放出される。すると、リアルタイム蛍光検出システムを用い、クエンチ状態が解かれた信号を定量的に検出することができる。
【００４６】
（例えばメチライトに基づいた典型的なキットに見られるような）メチライト分析用の典型的な試薬としては、特定の遺伝子に対するＰＣＲプライマー（またはメチル化が変化したＤＮＡ配列またはＣｐＧ島）；タックマン（登録商標）プローブ；最適化されたＯＣＲ緩衝液とデオキシヌクレオチド；タック・ポリメラーゼなどが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。
【００４７】
Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ。Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ法は、ＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理した後に単一ヌクレオチド・プライマー伸長を行なうことに基づき、特定のＣｐＧ部位におけるメチル化の違いを定量的に評価する方法である（ＧｏｎｚａｌｇｏとＪｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２５巻、２５２９〜２５３１ページ、１９９７年）。簡単に説明するならば、ゲノムＤＮＡを亜硫酸水素ナトリウムと反応させてメチル化していないシトシンをウラシルに変換する一方で、５−メチルシトシンは変化しないままにしておく。次に、亜硫酸水素塩で変換したＤＮＡに対して特異的なＰＣＲプライマーを用いて望む標的配列を増幅し、得られた産物を単離し、注目のＣｐＧ部位におけるメチル化を分析するための鋳型として用いる。少量のＤＮＡでも分析することができ（例えば、顕微解剖した病変切片）、しかもＣｐＧ部位におけるメチル化状態を明らかにするのに制限酵素を使用せずにすむ。（例えばＭｓ−ＳＮｕＰＥに基づいた典型的なキットに見られるような）Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ分析用の典型的な試薬としては、特定の遺伝子に対するＰＣＲプライマー（またはメチル化が変化したＤＮＡ配列またはＣｐＧ島）；最適化されたＰＣＲ緩衝液とデオキシヌクレオチド；ゲル抽出キット；正の調節用プライマー；特定の遺伝子に対するＭｓ−ＳＮｕＰＥプライマー；（Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ反応用の）反応緩衝液；放射性ヌクレオチドなどが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。さらに、亜硫酸水素塩変換試薬としては、ＤＮＡ変性緩衝液；スルホン化緩衝液；ＤＮＡ復元用の試薬またはキット（例えば沈殿、限外濾過、アフィニティ・カラム）；脱スルホン化緩衝液；ＤＮＡ復元成分などが挙げられる。
【００４８】
ＭＳＰ。ＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）により、メチル化感受性制限酵素を使用せずに、ＣｐＧ島内のほとんどすべてのＣｐＧ部位のメチル化状態を評価することができる（Ｈｅｒｍａｎ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第９３巻、９８２１〜９８２６ページ、１９９６年；アメリカ合衆国特許第５，７８６，１４６号）。簡単に説明するならば、亜硫酸水素ナトリウムを用い、メチル化されたシトシンは除いてメチル化されていないすべてのシトシンをウラシルに変換することによってＤＮＡを変化させた後、メチル化されていないＤＮＡではなくメチル化されたＤＮＡに対して特異的なプライマーを用い、その変化したＤＮＡを増幅する。ＭＳＰではほんの少量のＤＮＡしか必要とせず、ＭＳＰは、所定のＣｐＧ島遺伝子座の０．１％メチル化された対立遺伝子に対して感受性があり、パラフィンに埋め込んだサンプルから抽出したＤＮＡに対してＭＳＰを実行することができる。（例えばＭＳＰに基づいた典型的なキットに見られるような）ＭＳＰ分析用の典型的な試薬としては、特定の遺伝子に対するメチル化されたＰＣＲプライマーと、特定の遺伝子に対するメチル化されていないＰＣＲプライマー（またはメチル化が変化したＤＮＡ配列またはＣｐＧ島）；最適化されたＰＣＲ緩衝液とデオキシヌクレオチド；特異的なプローブなどが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。
【００４９】
ＭＣＡ。ＭＣＡ法は、ゲノムＤＮＡ中の変化したメチル化パターンをスクリーニングし、その変化に関係した特定の配列を単離するのに用いることができる方法である（Ｔｏｙｏｔａ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５９巻、２３０７〜２３１２、第５９巻、１９９９年）。簡単に説明するならば、シトシンのメチル化に対する感度の異なる認識部位を持つ複数の制限酵素を用いて原発性腫瘍、細胞系、正常組織に由来するゲノムＤＮＡを消化させた後、アービトラリー・プライムド−ＰＣＲによる増幅を行なった。メチル化の程度が異なる断片群をクローニングし、高分解能ポリアクリルアミド・ゲル上でＰＣＲ産物を分離させた後にシークエンシングした。次に、クローニングした断片をサザン・ブロット分析のプローブとして用い、これら領域のメチル化の違いを確認した。（例えばＭＣＡに基づいた典型的なキットに見られるような）ＭＣＡ分析用の典型的な試薬としては、ゲノムＤＮＡの任意領域の合成を開始するためのＰＣＲプライマー；ＰＣＲ緩衝液とヌクレオチド、制限酵素と適切な緩衝液；遺伝子ハイブリダイゼーション用のオリゴまたはプローブ；対照ハイブリダイゼーション用のオリゴまたはプローブなどが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。
【００５０】
メチル化されたＣｐＧを含む核酸を検出するためのキット。公知の１つ以上のメチル化アッセイ（上記のものを含む）を実行するのに必要な試薬を、配列番号１〜１０３の配列またはその一部を含むプライマーまたはプローブと組み合わせ、ＣｐＧを含む核酸のメチル化状態を明らかにする。例えば、メチライト、Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ、ＭＣＡ、ＣＯＢＲＡ、ＭＳＰというメチル化アッセイを単独で、あるいは組み合わせ、配列番号１〜１０３の配列またはその一部を含むプライマーまたはプローブとともに使用すると、配列番号１〜１０３に対応するゲノム配列、または配列番号１〜１０３の配列に関係したＣｐＧ島配列に対応するゲノム配列に含まれるＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を明らかにすることができよう。ただし、特定の配列番号の配列に関係したＣｐＧ島配列は、この特定の配列番号の配列の少なくとも１つのヌクレオチドを含んでいて、ＣｐＧジヌクレオチドの頻度が観測値／予測値の比＞０．６に対応することと、ＧＣ含量＞０．５であることの両方の条件を満たす連続したゲノムＤＮＡ配列である。
Claims (12)
- ガンの診断法または予後予測法であって：
（ａ）検体組織から組織サンプルを取得し；
（ｂ）その組織サンプルに由来するＤＮＡに対してメチル化アッセイを行なうことにより、そのＤＮＡのＤＮＡ配列中のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を明らかにし（ただしこのＤＮＡ配列は、配列番号１〜１０３の配列、配列番号１〜１０３の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する配列、配列番号１〜１０３の配列と関係したＣｐＧ島配列、配列番号１〜１０３の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する配列と関係したＣｐＧ島配列、およびこれらの組み合わせからなるグループの中から選択した配列であり、特定の配列番号の配列と関係したＣｐＧ島配列は、その特定の配列番号の少なくとも１つのヌクレオチドを含んでいて、ＣｐＧジヌクレオチドの頻度が観測値／予測値の比＞０．６に対応することと、ＧＣ含量＞０．５であることの両方の条件を満たす連続したゲノムＤＮＡ配列である）；そして
（ｃ）診断または予後予測を、上記ＤＮＡ配列中のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を少なくとも判断材料の一部として利用して行なう；ことを含む、診断法または予後予測法。 - 上記ＤＮＡ配列が、配列番号１〜１０３の配列と関係したＣｐＧ島配列、配列番号１〜１０３の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する配列と関係したＣｐＧ島配列、およびこれらの組み合わせからなるグループの中から選択した配列である、請求項１に記載の診断法または予後予測法。
- 上記ＤＮＡ配列が、配列番号２、４、６、７、９〜１６、１９、２０、２２〜３３、３５〜４３、４８、５１〜５５、５９、６０、６４、７１、７６、７８〜８１、８４、８７〜９０の配列と関係したＣｐＧ島配列、およびこれらの組み合わせからなるグループの中から選択した配列である、請求項２に記載の診断法または予後予測法。
- メチル化アッセイの方法を、メチライト、ＭＳ−ＳＮｕＰＥ、ＭＳＰ、ＭＣＡ、ＣＯＢＲＡ、およびこれらの組み合わせからなるグループの中から選択する、請求項１に記載の診断法または予後予測法。
- 上記ＤＮＡ配列中のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態が、高メチル化、低メチル化、正常メチル化のいずれかである、請求項１に記載の診断法または予後予測法。
- 上記ガンを、膀胱ガン、前立腺ガン、結腸ガン、肺ガン、腎臓ガン、白血病、乳ガン、子宮ガン、星状膠細胞腫、グリオブラストーマ、神経芽細胞腫からなるグループの中から選択する、請求項１に記載の診断法または予後予測法。
- メチル化されたＣｐＧを含む核酸を検出するのに有効で、１つ以上の容器を含む保持手段を有するキットであって：
（ａ）配列番号１〜１０３の配列と、配列番号１〜１０３の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する配列とからなるグループの中から選択した配列の任意の領域とハイブリダイズするプローブまたはプライマーを含む容器と；
（ｂ）メチル化されたＣｐＧを含む核酸の検出を、少なくとも一部はこのプローブまたはプライマーに基づいて行なうのに必要な付加的な標準メチル化アッセイ用試薬：
とを備えるキット。 - 付加的な上記標準メチル化アッセイ用試薬が、メチライト、ＭＳ−ＳＮｕＰＥ、ＭＳＰ ＭＣＡ、ＣＯＢＲＡ、およびこれらの組み合わせからなるグループの中から選択したメチル化アッセイを実行するための標準試薬である、請求項７に記載のキット。
- 上記のプローブまたはプライマーが、配列番号１〜１０３の配列と、配列番号１〜１０３の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する配列とからなるグループの中から選択した配列中の少なくとも約１２〜１５個のヌクレオチドを含む、請求項７に記載のキット。
- 配列番号１、配列番号５、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１８、配列番号２４、配列番号２５、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４２、配列番号４４、配列番号５１、配列番号５２、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７４、配列番号７６、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８６、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９７、配列番号１００からなるグループの中から選択したメチル化されたポリヌクレオチド配列またはメチル化されていないポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
- メチル化されている請求項１０に記載の核酸。
- メチル化されていない請求項１０に記載の核酸。
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