CN102230004A - 肿瘤细胞微卫星不稳定状态的复合扩增体系及检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及肿瘤细胞微卫星不稳定状态的复合扩增体系及检测试剂盒，属于生物技术领域。本发明选取8个具有高度灵敏性及特异性的准单态性单核苷酸重复位点(NR-21、NR-22、NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26、MONO-27、CAT-25)对MSI进行检测。同时，我们加入1个性别位点(AMEL)，建立9个位点的多重复合扩增体系，结果更为准确。增加了性别决定位点AMEL，一定程度上可防止实验操作员混淆样本而得出错误结果。本发明操作简单、便于大规模推广，这种方法随着试剂盒开发成功可以批量生产，使用条件可以模式化，全部过程都有自动化设备，不再依赖于人的操作经验，整个检测时间需要6小时左右。

Description

肿瘤细胞微卫星不稳定状态的复合扩增体系及检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及病症诊断的复合扩增体系及检测试剂盒，特别是涉及肿瘤细胞微卫星不稳定状态的复合扩增体系和检测试剂盒，可以快速预测肿瘤的发生。

背景技术

结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是一种发生于结肠或直肠部位的常见恶性肿瘤，近20多年来，世界上多数国家结直肠癌(主要是结肠癌)发病率呈上升趋势。中国结直肠癌发病率上升趋势也十分明显。中国的发病年龄多在40-60岁，高峰在50岁左右，但30岁以下的结直肠癌患者并不少见。本病在中国的一个重要特点是：结直肠癌的中位发病年龄在中国比欧美提前约十年，且青年患者比欧美多见。因此对于这一疾病的早期诊断和用药指导具有重要意义。

近年来的大量研究表明，肿瘤发生与错配修复系统密切相关，尤其是在结直肠癌、胃癌、子宫内膜癌等。由于错配修复(mismatch repair，MMR)基因的突变及功能异常，使基因组的复制错误不能得以及时修复，复制错误频率发生不断积累，从而使细胞基因组DNA序列发生改变，或造成某些抑癌基因失活或癌基因激活而导致细胞的异常转化和恶性增生。检测错配修复系统成为诊断这类肿瘤的方法之一。

之前临床上用于结直肠癌错配修复系统的检测方法主要有以下2种：

1.错配修复基因的突变检测，主要检测几种与错配修复高度相关的基因如hMSH2、hMLH1、hMLH6、PMS2等，先提取DNA后进行PCR扩增，最后对PCR产物进行测序，此方法操作繁琐(需检测好几种基因)，检测周期长，且检测费用高。

2.免疫组化(IHC)，由于MMR的改变，其蛋白产物会发生相应改变，故可以使用免疫组化(IHC)的方法来检测MMR蛋白产物，目前主要检测hMSH2和hMLH1基因的蛋白产物。这种方法容易忽略错义突变和截断突变；另外，由于在肿瘤组织中存在染色不均一的现象，其灵敏性也受到一定的影响。

以上两种方法由于存在种种缺陷，没有得到广泛的应用，需要一种新的易于操作、成本低、准确性高的方法。

近年来发现，错配修复(mismatch repair，MMR)基因的突变及功能异常，使基因组的复制错误不能得以及时修复，复制错误频率发生不断积累，往往会引起肿瘤发生，同时也会引起基因组微卫星DNA序列发生改变。也就是说，错配修复系统失灵导致肿瘤发生的同时，也会在基因组的STR序列上造成影响，因此可以通过检测STR序列来分析错配修复系统的情况，进而指示肿瘤的发生情况。

微卫星为广泛分布于原核及有核细胞生物组的、由1-6个核苷酸组成的、具有高度多态性的简单串联重复序列。通常情况下，体细胞中小卫星DNA基因的突变频率为5×10^-2，而微卫星的DNA的突变频率为10^-5-10^-7。因此，微卫星DNA的稳定性可作为衡量细胞基因组整体稳定性的良好标记，并广泛用于肿瘤、高血压病、糖尿病和精神分裂症的全基因组扫描研究。

近年来的大量研究表明：错配修复(mismatch repair，MMR)基因的突变及功能异常，使基因组的复制错误不能得以及时修复，复制错误频率发生不断积累，造成某些抑癌基因失活或癌基因激活而导致细胞的异常转化和恶性增生。同时使细胞基因组微卫星DNA序列发生改变，这就成为微卫星不稳定(Microsatallite Instability，MSI)。

微卫星不稳定(Microsatallite Instability，MSI)表现于同一微卫星位点在不同个体之间以及同一个体的正常组织与某些异常组织之间，微卫星位点的重复单位的数目不同。MSI的产生原因可能是DNA复制过程中的“链滑”(strand slippage)现象。DNA复制过程中，当复制复合物复制一个重复单位(repeat unit)后，子链与模板链分离，然后与下一个或下几个重复单位重新结合，使一个或几个重复单位形成”环凸”(looped out)区域。正常情况下该结构可被错配修复系统(mismatch repair system)所校正，但校正系统失常时，子链DNA如继续延伸即可引起突变。这就引起微卫星不稳定，基因型发生变化。

据文献报道，大约15％的结直肠癌中存在MSI现象，其中3％与Lynch综合症(或HNPCC)有关，而大约90％的HNPCC患者中存在MSI，其余12％为散发性，携带有MSI的结直肠癌表现出不同的特征，如好发于近段结肠、淋巴细胞侵入、低度分化、呈黏液细胞或印戒细胞状。与无MSI的结直肠癌相比，携带有MSI的结直肠癌其预后较好，并且二者药物反应也不一样。故此，MSI检测对结直肠癌患者其意义重大。

1997年12月，美国国家肿瘤研究所(National Cancer Institute，NCI)举办了一个针对肿瘤的微卫星不稳定及复制错误表型检测的国际专题会议，在这次会议中，制定了MSI检测的统一标准(即Bethesda Guidelines)。Bethesda Guidelines确定了一个用来检测MSI的参考Panel(即NCI Panel)，它包含2个单核苷酸重复的位点(BAT-25、BAT-26)和3个2核苷酸重复的位点(D2S123、D5S346、D17S250)。应用NCI Panel检测肿瘤MSI状态时，5个STR位点如果检测出2个或2个以上的位点有MSI，则为MSI-H(高度微卫星不稳定)，MSI-H肿瘤表现出特有的临床及病理学表型，若只检测出1个位点有MSI则为MSI-L(低度微卫星不稳定)，MSI-L与MSS(微卫星稳定)的区分只有在选用更多位点来进行检测时才能实现，不过MSI-L与MSS的肿瘤表型似乎一致。

然而到2002年，NCI在第二次专题会议上，针对之前采纳的NCI Panel来检测MSI问题出现了争议，争议的焦点在于：由于NCI Panel使用了3个2核苷酸重复的位点，导致应用NCI Panel来评估肿瘤微卫星不稳定状态时存在一定的局限性，其一，2核苷酸重复的位点在检测存在错配修复缺陷的肿瘤时表现出较低的特异性和灵敏度；其二，由于2核苷酸重复位点具有高多态性的特征，故检测时必须用与肿瘤组织相匹配的正常组织来作比较才能得出结果，会议建议专用单核苷酸重复位点来检测MSI以提高检测的灵敏度。

在2011年关于结直肠癌筛查的国际肿瘤综合网(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)指南中，MSI已被列入必要检测项目(参见NCCN Guidelines^TM Version 2.2011UpdatesColorectal Cancer Screening)。

查找高度灵敏性及特异性的用来检测MSI的准单态性位点是建立MSI检测体系的必需工作，已成为近年来研究MSI检测领域的热点，但是这一工作并不轻松，到目前为止仅有Promega公司的一款产品能够一次性检测5个，开发更多位点和更好灵敏度的MSI检测系统势在必行。

发明内容

针对上述领域中的不足和需求，本发明提供一种肿瘤细胞微卫星不稳定状态的扩增体系和检测试剂盒，在评估肿瘤MSI状态时，其结果比5位点更为准确，操作简单、便于大规模推广，这种方法随着试剂盒开发成功可以批量生产，使用条件可以模式化，全部过程都有自动化设备，不再依赖于人的操作经验，可以实现自动化，所需时间短，整个检测时间需要6小时左右。

肿瘤细胞微卫星不稳定状态的扩增体系，所述扩增体系中同时扩增准单态性单核苷酸重复位点NR-21、NR-22、NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26、MONO-27和CAT-25。

所述扩增体系中还包括性别位点AMEL。

所述扩增体系中的被扩增位点，分别由三种不同颜色的荧光素标记，三组组合分别为：第一组NR-21、NR-22、BAT-26；第二组：NR-27、BAT-25、CAT-25；第三组：AMEL、NR-24、MONO-27。

所述三组中可以分别标记为FAM或荧光素、HEX或JOE，TMR或VIC。

所述NR-21、NR-22、BAT-26组为FAM或荧光素，所述NR-27、BAT-25、CAT-25组为HEX或JOE；所述AMEL、NR-24、MONO-27组为TMR或VIC。

所述位点由一对引物扩增，其中一个引物的5’末端带有荧光标记。

所述引物分别为：

NR-21引物：

引物1：GAGTCGCTGGCACAGTTCTA，

引物2：CTGGTCACTCGCGTTTACAA；

NR-22引物：

引物1：GGATAATCGAGGCTTGTCAAG，

引物2：GCCCAAGACAAAACTTCCAG；

NR-24引物：

引物1：GTGTCTTGCTGAATTTTACCTCCTGAC，

引物2：ATTGTGCCATTGCATTCCAA；

NR-27引物：

引物1：AACCATGCTTGCAAACCACT，

引物2：CGATAATACTAGCAATGACC；

BAT-25引物：

引物1：CTCGCCTCCAAGAATGTAAGT，

引物2：TCTGCATTTTAACTATGGCTC；

BAT-26引物：

引物1：CTGCGGTAATCAAGTTTTTAG，

引物2：AACCATTCAACATTTTTAACCC；

MONO-27引物：

引物1：GAAATGGTGGGAACCCAG，

引物2：GGTGGATCAAATTTCACTTGG；

CAT-25引物：

引物1：TTCAACCTAGAAACCTTTATCCC，

引物2：AGCTTGCAGTGAGCTGAGATCG；

AMEL引物：

引物1：CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAG，

引物2：ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG。

一种试剂盒，包括一扩增体系，其特征在于包括NR-21、NR-22、NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26、MONO-27、CAT-25的上述8对引物的混合物。

所述引物的混合物中还包括性别位点AMEL的引物。

所述扩增体系的总体积为10μl，其中缓冲液1μl，dNTP0.5μl，引物混合物2.0μl，Taq酶0.1μl，去离子水5.4μl，加入模板量为1μl。

所述引物混合物中的引物浓度分别为4μM的NR-21、10μM的NR-22、5μM的NR-24、8μM的NR-27、7μM的BAT-25、5μM的BAT-26、4μM的MONO-27、3μM的CAT-25和3μM的AMEL。

所述扩增体系的扩增条件为：94℃变性，5-10min；59-62℃退火，30-60s；70-72℃延伸，30-60s；60℃最后延伸，30-60min。

我们经过数年的不断努力，目前已筛选出一些可以用来检测MSI的准单态性位点，如NR-21、NR-22、NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26、SEC63、CAT25等。本发明选取其中8个具有高度灵敏性及特异性的准单态性单核苷酸重复位点(NR-21、NR-22、NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26、MONO-27、CAT-25)对MSI进行检测。同时，我们加入1个性别位点(AMEL)，建立9个位点的多重复合扩增体系。选择AMEL位点是为了防止操作者在实验过程中出现混淆样本的可能。

本发明的整个方法过程：

1、引物组合的设计

首先，我们选择的具有高度灵敏性及特异性的准单态性位点，选择的位点包括NR-21、NR-22、NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26、MONO-27、CAT-25，以及性别位点AMEL，根据候选的位点所在基因的GeneBank序列号从NCBI核酸数据库下载基因序列，各位点所在基因的部分序列见序列表。

用于扩增NR-21的引物对是由位于序列1中45～123位18～25个连续碱基构成的引物，和与序列1中143～180位的互补序列的18～25个连续碱基构成的引物的组合。

用于扩增NR-22的引物对是由位于序列2中100～180位18～25个连续碱基构成的引物，和与序列2中230～300位的互补序列的18～25个连续碱基构成的引物的组合。

用于扩增NR-24的引物对是由位于序列3中33～120位18～25个连续碱基再加上一尾巴序列构成的引物，和与序列3中147～207位的互补序列的18～25个连续碱基构成的引物的组合。

用于扩增NR-27位点的引物对是由位于序列4中56～118位18～25个连续碱基构成的引物，和与序列4中127～197位的互补序列的18～25个连续碱基构成的引物的组合。

用于扩增BAT-25的引物对是由位于序列5中39～153位18～25个连续碱基构成的引物，和与序列5中199～260位的互补序列的18～25个连续碱基构成的引物的组合。

用于扩增BAT-26的引物对是由位于序列6中61～180位18～25个连续碱基构成的引物，和与序列6中226～285位的互补序列的18～25个连续碱基构成的引物的组合。

用于扩增MONO-27的引物对是由位于序列7中64～150位18～25个连续碱基构成的引物，和与序列7中204～290位的互补序列的18～25个连续碱基构成的引物的组合。

用于扩增CAT-25的引物对是由位于序列8中120～180位18～25个连续碱基构成的引物，和与序列8中240～300位的互补序列的18～25个连续碱基构成的引物的组合。

用于扩增AMEL的引物对是由位于序列9中200-260位18～25个连续碱基构成的引物，和与序列9中270-340位的互补序列的18～25个连续碱基构成的引物的组合。

以上引物由Primer3、Primer Premier 5和NCBIBlast等软件设计而成。设计引物时应尽量确保各引物的Tm值在(60+2)℃的范围内，扩增效率类似并确保各对引物的扩增产物大小相差15bp以上。设计完成后，用AutoDimer等软件分析引物二聚体和不同引物之间的相互作用，如果有相互作用可产生非特异产物或者二聚体的需要重新设计，直至得到符合要求的引物序列。

选用任一人源DNA模板，分别用9对引物进行单重扩增，将扩增产物置于1.5～2.0％的琼脂糖凝胶上电泳，根据电泳结果来调整PCR体系及扩增条件以得到9对引物共同的扩增条件。最终要达成的效果是：在相同体系及扩增条件下，所有的引物对均能出现明亮且较单一的目的条带。如果有引物满足不了上述条件，则重新设计引物。

然后，将满足要求的9对引物，分为三组进行荧光标记。每组采用一种荧光素，分别可以是FAM或荧光素、HEX或JOE，TMR或VIC。获得荧光标记引物后，用与之相配对的非荧光引物组合后分别进行单重扩增，将扩增产物置于3730xl遗传分析仪上进行毛细管电泳，根据毛细管电泳检测的结果来评估每对引物的扩增效率。

其后，将同一荧光素标记的3对引物混合置于同一管中扩增，将扩增产物置于3730xl遗传分析仪上进行毛细管电泳，根据毛细管电泳检测的结果来确定每对引物的扩增效率以及此3对引物的混合扩增是否引起非特异扩增。

最后，根据单重扩增及组合扩增的毛细管电泳结果来初步确定各引物对的加入量，将9对引物混合置于同一管中扩增，再根据复合扩增的电泳结果来调整各自的浓度，使各引物对的扩增效率(反应在电泳结果的峰高上)基本一致为准。最终确定的9对引物序列分别见序列表。

2.扩增体系及条件的建立

2.1Taq酶的选择

Taq酶是扩增体系的重要组分，多种Taq酶都满足本发明的需要，如Takara公司的rTaq和HS Taq、KAPA公司的HiFi Taq、Roche公司的AmpliTaq Gold酶等均能得到较好的扩增效率和特异性，采用热启动Taq酶比非热启动的酶其扩增效率和特异性均要好。

2.2Mg2+浓度的选择

我们摸索了在不同Mg2+浓度梯度下复合扩增，其中在1.0-2.0mM的浓度范围内均能得到较好的扩增。

2.3反应体积的选择

我们分别采用了20ul和10ul体系进行了复合扩增，结果显示：10ul的体系与20ul的体系效果基本相当。

2.4反应程序的优化

退火及延伸温度：我们摸索了退火温度从55℃到61℃之间各温度下的扩增情况，结果显示在59-61℃范围内均能得到较好结果。

我们摸索了在以下变性、退火及延伸温度下各时间范围内(见表1)的扩增可以得到较好的结果：

表1温度与时间

温度	时间
		94℃(变性)	5-10min
59-62℃(退火)	30-60s
		70-72℃(延伸)	30-60s
60℃(最后延伸)	30-60min

本发明的优势在于：

1.结果更为准确，由于选用了8个准单态性位点，在评估肿瘤MSI状态时，其结果比5位点更为准确，因为根据Besthesta guideline：当所有检测的位点中超过20％的位点存在MSI其肿瘤状态判定为MSI-H，至少1个位点但少于20％的位点存在MSI时则为MSI-L或MSS，采用8位点检测结果为MSI-H的样本当采用5位点检测时则可能为MSI-L。另外，NR-27位点用于检测MSI的准确度接近100％，并且它在汉族人群中的变异低于1％。再者，CAT-25位点用来检测MSI-H的灵敏度高达100％。所以NR-27、CAT-25与其它位点的联合使用将会大大提高MSI检测的灵敏度及准确度。

2.增加了性别决定位点AMEL，一定程度上可防止实验操作员混淆样本而得出错误结果，比如患者为男性，而检测出来的性别位点结果却为女性，提示操作者在实验过程中很有可能取错了样本或错误标记。

3.操作简单、便于大规模推广，这种方法随着试剂盒开发成功可以批量生产，使用条件可以模式化，全部过程都有自动化设备，不再依赖于人的操作经验，可以实现自动化。

4.所需时间短，整个检测时间需要6小时左右。

附图说明

图1采用本发明检测正常组织得到的分型图谱

图2采用本发明检测正常肿瘤组织得到的分型图谱

图3采用Promega试剂盒检测同一个来源的正常组织和肿瘤组织得到的分型图谱

具体实施方式

实施例1

以下是我们采用本发明对一例结直肠癌患者检测的具体实施情况。样本同时采用Promega公司的MSI Analysis Systemv1.2试剂盒作为对照，操作方法按照配套的操作指南(TM255)进行。

1.DNA提取

采用组织DNA提取试剂盒(天根生化)分别对患者的癌组织及正常组织进行DNA提取，操作步骤依照说明书，DNA提取完毕用紫外分光光度计定量，并稀释成2ng/ul。

2.PCR

2.1反应体系：

将AMEL位点和8个准单态性STR位点的共9对引物分别溶解并配成浓度为10uM的工作液，然后后按表2体积比配成引物混合液(Primer mix)：

NR-21引物：

引物1：GAGTCGCTGGCACAGTTCTA，

引物2：CTGGTCACTCGCGTTTACAA；

NR-22引物：

引物1：GGATAATCGAGGCTTGTCAAG，

引物2：GCCCAAGACAAAACTTCCAG；

NR-24引物：

引物1：GTGTCTTGCTGAATTTTACCTCCTGAC，

引物2：ATTGTGCCATTGCATTCCAA；

NR-27引物：

引物1：AACCATGCTTGCAAACCACT，

引物2：CGATAATACTAGCAATGACC；

BAT-25引物：

引物1：CTCGCCTCCAAGAATGTAAGT，

引物2：TCTGCATTTTAACTATGGCTC；

BAT-26引物：

引物1：CTGCGGTAATCAAGTTTTTAG，

引物2：AACCATTCAACATTTTTAACCC；

MONO-27引物：

引物1：GAAATGGTGGGAACCCAG，

引物2：GGTGGATCAAATTTCACTTGG；

CAT-25引物：

引物1：TTCAACCTAGAAACCTTTATCCC，

引物2：AGCTTGCAGTGAGCTGAGATCG；

AMEL引物：

引物1：CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAG，

引物2：ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG。

表2各引物体积比

Primer	Volume
		NR-21	4
BAT-26	8
		NR-27	5
BAT-25	4
		NR-24	9
MONO-27	5
		NR-22	4
CAT-25	8
		AMEL	3

将各反应试剂(Buffer、Primer Mix、dNTP等)振荡混合后按表3体积比(模板除外)配成PCR反应混合液，分装9ul于PCR反应管中，最后往各反应管加入1ul模板，离心后进入下一步。

表3PCR体系

2.2PCR反应程序：

将PCR反应管置于扩增仪上，设计并运行如下程序：

第1步：95℃变性5分钟，第2步：94℃变性30秒，第3步60℃退火50秒，第4步：70℃延伸1分钟，重复2至4步30次，最后60℃延伸30分钟。运行结束置于冰箱4℃保存。

3.毛细管电泳检测

3.1取上一步得到的PCR扩增产物1μl点样于1.5-2.0％琼脂糖凝胶上，电泳20min后观察结果，若在70-200bp处出现明亮的阶梯条带则可上机检测。

3.2根据电泳胶图上的样品的条带亮度，确定样品稀释倍数，按稀释倍数将扩增产物稀释待用。将内标(ROX500)和甲酰胺按比例15：1000混合，取9μl混合物加到96孔板里，再加入稀释过的样品1μl，混合静置数分钟，写上板号，离心后放入ABI 3130XL测序仪上，准备检测。

3.3打开ABI 3130XL测序仪数据采集软件，编辑上机检测的板标，导入检测程序。

3.4点击运行，即开始检测。

3.5检测完毕后，将数据拷贝至光盘。

4.数据分析

4.1导入原始数据，在主页面的File菜单选择Add sample to project，找到样品文件，选中文件夹，点击add to list，点击add，样品文件即显示在Project窗口；

4.2选择分析参数。定义analysis method、panel和size standard。浏览样本电泳的原始数据，任性一样本文件名，在“sample”菜单下选择“raw data”。移动追踪线，使光标停在引物峰右侧(第一个红色的内标峰之前)，以此时窗口左下角X轴上显示的数值作为analysis method分析参数中的起始点；

4.3点击绿色分析按钮，出现save project对话框，命名后保存，软件即开始处理数据，分析完成后左下角显示analysis completed。

4.4采用GeneMapper软件分析得到的数据并生成图谱，见图1，2和3。

5.结果判读

从图1和图3中的上部图示看，正常组织采用本发明得到的图谱和采用Promega得到的图谱均没有出现MSI现象，从图2和图3中的下部图示可以看到，结肠癌组织样本采用本发明得到的结果在8个位点上都出现MSI现象，采用Promega得到的图谱5个位点都出现MSI现象。两种结果都判定该肿瘤样本是MSI-H型。

Claims (10)

1.肿瘤细胞微卫星不稳定状态的扩增体系，所述扩增体系中同时扩增准单态性单核苷酸重复位点NR-21、NR-22、NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26、MONO-27和CAT-25。

2.根据权利要求1所述的扩增体系，所述扩增体系中还包括性别位点AMEL。

3.根据权利要求2所述的扩增体系，所述扩增体系中的被扩增位点，分别由三种不同颜色的荧光素标记，三组组合分别为：第一组NR-21、NR-22、BAT-26；第二组：NR-27、BAT-25、CAT-25；第三组：AMEL、NR-24、MONO-27。

4.根据权利要求3所述的扩增体系，所述三组中可以分别标记为FAM或荧光素、HEX或JOE，TMR或VIC。

5.根据权利要求4所述的扩增体系，所述NR-21、NR-22、BAT-26组为FAM或荧光素，所述NR-27、BAT-25、CAT-25组为HEX或JOE；所述AMEL、NR-24、MONO-27组为TMR或VIC。

6.根据权利要求5所述的扩增体系，所述位点由一对引物扩增，其中一个引物的5’末端带有荧光素标记。

7.根据权利要求6所述的扩增体系，所述引物分别为：

NR-21引物：

引物1：GAGTCGCTGGCACAGTTCTA，

引物2：CTGGTCACTCGCGTTTACAA；

NR-22引物：

引物1：GGATAATCGAGGCTTGTCAAG，

引物2：GCCCAAGACAAAACTTCCAG；

NR-24引物：

引物1：GTGTCTTGCTGAATTTTACCTCCTGAC，

引物2：ATTGTGCCATTGCATTCCAA；

NR-27引物：

引物1：AACCATGCTTGCAAACCACT，

引物2：CGATAATACTAGCAATGACC；

BAT-25引物：

引物1：CTCGCCTCCAAGAATGTAAGT，

引物2：TCTGCATTTTAACTATGGCTC；

BAT-26引物：

引物1：CTGCGGTAATCAAGTTTTTAG，

引物2：AACCATTCAACATTTTTAACCC；

MONO-27引物：

引物1：GAAATGGTGGGAACCCAG，

引物2：GGTGGATCAAATTTCACTTGG；

CAT-25引物：

引物1：TTCAACCTAGAAACCTTTATCCC，

引物2：AGCTTGCAGTGAGCTGAGATCG；

AMEL引物：

引物1：CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAG，

引物2：ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG。

8.一种试剂盒，包括一扩增体系，其特征在于：所述扩增体系中包括NR-21、NR-22、NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26、MONO-27、CAT-25的引物的混合物，其引物分别为：

NR-21引物：

引物1：GAGTCGCTGGCACAGTTCTA，

引物2：CTGGTCACTCGCGTTTACAA；

NR-22引物：

引物1：GGATAATCGAGGCTTGTCAAG，

引物2：GCCCAAGACAAAACTTCCAG；

NR-24引物：

引物1：GTGTCTTGCTGAATTTTACCTCCTGAC，

引物2：ATTGTGCCATTGCATTCCAA；

NR-27引物：

引物1：AACCATGCTTGCAAACCACT，

引物2：CGATAATACTAGCAATGACC；

BAT-25引物：

引物1：CTCGCCTCCAAGAATGTAAGT，

引物2：TCTGCATTTTAACTATGGCTC；

BAT-26引物：

引物1：CTGCGGTAATCAAGTTTTTAG，

引物2：AACCATTCAACATTTTTAACCC；

MONO-27引物：

引物1：GAAATGGTGGGAACCCAG，

引物2：GGTGGATCAAATTTCACTTGG；

CAT-25引物：

引物1：TTCAACCTAGAAACCTTTATCCC，

引物2：AGCTTGCAGTGAGCTGAGATCG。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，所述引物的混合物中还包括性别位点AMEL的引物，AMEL引物为：

引物1：CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAG，

引物2：ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，所述扩增体系的总体积为10μl，其中缓冲液1μl，dNTP0.5μl，引物混合物2.0μl，Taq酶0.μl，去离子水5.4μl，加入模板量为1μl，所述引物混合物中的引物浓度分别为4μM的NR-21、10μM的NR-22、5μM的NR-24、8μM的NR-27、7μM的BAT-25、5μM的BAT-26、4μM的MONO-27、3μM的CAT-25和3μM的AMEL。

Images