CN106834479A - 肿瘤免疫治疗中微卫星不稳定状态分析体系 - Google Patents

肿瘤免疫治疗中微卫星不稳定状态分析体系 Download PDF

Info

Publication number
CN106834479A
CN106834479A CN201710102499.0A CN201710102499A CN106834479A CN 106834479 A CN106834479 A CN 106834479A CN 201710102499 A CN201710102499 A CN 201710102499A CN 106834479 A CN106834479 A CN 106834479A
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
bat
penta
sense primer
primers
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710102499.0A
Other languages
English (en)
Inventor
李强
张亚飞
朱爱思
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qiagen (suzhou) Translational Medicine Co Ltd
Original Assignee
Qiagen (suzhou) Translational Medicine Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qiagen (suzhou) Translational Medicine Co Ltd filed Critical Qiagen (suzhou) Translational Medicine Co Ltd
Priority to CN201710102499.0A priority Critical patent/CN106834479A/zh
Publication of CN106834479A publication Critical patent/CN106834479A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及的微卫星不稳定状态分析，可作为肿瘤免疫治疗(PD‑1/PD‑L1)的辅助诊断标志物，属于生物技术领域。本发明是基于荧光PCR平台检测人肿瘤细胞微卫星不稳定性，选取了5个文献和国际上报道较多的单核苷酸重复位点(NR‑21、NR‑24、BAT‑25、BAT‑26、MONO27)对微卫星不稳定状态进行分析。同时，选取了2个五核苷酸重复位点(Penta C和Penta D)作为样品的质控，主要用来检测样品的混淆和污染。本发明使用荧光标记的引物，同时扩增7个位点，相比其他产品，扩增条件简化，可在常用PCR设备上进行，结合毛细管电泳分析，信号更强，操作简单，经济实惠，能够短时间内检测出接受或即将接受肿瘤免疫治疗(PD‑1/PD‑L1)病人的微卫星不稳定状态，尽快的为临床治疗作出指导意义。

Description

肿瘤免疫治疗中微卫星不稳定状态分析体系
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及肿瘤免疫治疗或疾病诊断治疗中生物标志物的分析体系，可以为相关疾病治疗或诊断提供指导。
背景技术
微卫星(Microsatellite)又称短串联重复序列(Short tandem repeats，STRs)、简单重复顺序，由1～6个核苷酸组成，具有高度多态性，广泛存在于原核及真核生物基因组中，微卫星不稳定性(microsatellite instability，MSI)是指由于复制错误(replicationerrors，RER)引起的微卫星DNA长度发生改变。其发生主要是参与配对错误修复(mismatchrepair，MMR)的基因功能缺陷而产生一种缺陷蛋白质，因而不能正常的校正复制错误，从而引起微卫星DNA的改变，使其不能正常地发挥调控作用，导致细胞增殖及分化异常，促发恶性肿瘤形成。
肿瘤免疫治疗是近年来肿瘤治疗中最令人兴奋的发展，特别是PD-1/PD-L1免疫疗法已成为当今热门话题。肿瘤微环境中高水平的PD-L1表达预示着免疫疗法的病人能够有更好的临床反应。在评估PD-1阻断疗法反应中，虽然肿瘤细胞或肿瘤浸润的免疫细胞表面表达PD-1的配体(PD-L1或PD-L2)是一个重要的，但不是决定性的生物标志物。最近的一个II期研究鉴定到首个肿瘤免疫治疗基因组标志物-错配修复缺陷(MMR，即MSI)，研究发现具有微卫星不稳定性的病人对于抗PD-1免疫疗法表现出更大的肿瘤收缩和更长时间的生存。更多的研究表明，高浸润Th1/CTL的肿瘤往往都存在错配修复缺陷导致微卫星不稳定性(MSI)，最重要的是，具有MSI表型的肿瘤中会显著的上调免疫抑制蛋白的表达，包括PD-1和PD-L1。在MSI结直肠癌中，PD-L1的表达似乎不在肿瘤细胞上，而是在肿瘤浸润的淋巴细胞和/或骨髓细胞上。目前已有临床实验表明，应用MSI状态可作为对PD-1治疗反应的预测性生物标志物，MSI可作为对免疫相关的客观缓解率做出预测的重要因子。
微卫星不稳定性(MSI)最开始主要在结直肠癌中进行研究，结直肠癌是世界范围内的第三大癌症，结直肠癌是一种遗传异质性的疾病，肿瘤临床病理特征相同的患者却对治疗有截然不同的反应和生存率。大约15％的结直肠癌存在染色体组不稳定，而染色体组不稳定，是由于不同程度的微卫星不稳定造成的。其中3％左右为家族遗传性(Lynch综合征)，又称为遗传性非息肉病性结直肠癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer，HNPCC)，患Lynch综合征的人一生中患结直肠癌的可能性最高可接80％，而且其结直肠癌发病年龄提早，平均诊断年龄约45岁。另外12％为散发性。与Lynch综合征不同的是，多数散发性MSI结直肠癌并不是由错配修复基因体细胞突变导致的，而是因MLHI基因启动子甲基化导致MLHI基因发生表观遗传学沉默所致。虽然MSI作为在结直肠癌中治疗的预测标志物还存在许多争议，但是有许多研究已经表明，III期的结直肠癌病人中，携带MSI的病人预后效果要好于无MSI的病人。所以，对结直肠癌病人中MSI状态进行分析具有重要的临床指导意义。
目前，通过PCR和免疫组织化学染色(免疫组化)检测可以定量分析微卫星的稳定程度。MSI的错配修复系统中的核心是由两个异二聚体组成，分别是MSH2/MSH6(MSH2也可能和MSH3形成异二聚体)和MLH1/PMS2。病人在这些组分中出现任何一个蛋白的表达缺陷，都会提示微卫星不稳定。肿瘤细胞出现一种或几种错配修复蛋白核表达的丢失，则提示肿瘤为MSI-H。目前，通过免疫组化方法检测4种主要的错配修复蛋白MLHI、MSH2、MSH6、PMS2均已有稳定的商品化抗体，但受组织固定、染色条件、抗体克隆号不同等因素的影响，可能会出现假阳性或假阴性结果。且免疫组化方法比较费时，成本昂贵。因此，通过PCR方法检测微卫星不稳定状态显得十分简便，PCR检测MSI的原理是通过PCR方法扩增特定的微卫星序列，通过比较肿瘤组织与正常组织微卫星序列长度的差异判断是否存在MSI现象。在过去的二十多年中，有关MSI状态诊断的相关指南也一直在变化，1997年Bethesda指南推荐检测五个微卫星位点：两个单核苷酸位点(BAT-25和BAT-26)和3个双核苷酸位点(D2S123、D5S346和D17S250)，然后在肿瘤组织和正常组织中通过荧光多重PCR扩增这些区域，并且通过毛细管电泳分析扩增产物大小。如果存在2个及以上标记位点发生片段大小的位移，则发生了标记位点不稳定，定义为高不稳定型(MSI-H)肿瘤，存在1个标记位点不稳定的称为低不稳定型(MSI-L)肿瘤，没有标记位点不稳定的称为稳定型(MSS)肿瘤。后来，随着越来越多的研究报道，使用3个双核苷酸位点来评估MSI状态存在一定的局限性，表现出较低的特异性和灵敏度。因此，目前广泛使用的是单核苷酸位点检测MSI，Promega公司已开发出替代Bethesdapanel的MSI位点检测，包括五个单核苷酸位点(NR-21、NR-24、BAT-25、BAT-26和MONO-27)，用于替代双核苷酸位点检测，表现出更高的灵敏度和准确性，目前已被许多研究引用和认可。
在2015年，国际肿瘤综合网(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)和美国临床肿瘤学会(American Society of Clinical Oncology，ASCO)都更新了结直肠癌相关的指南，指南规定所有的结直肠癌病人都应该进行肿瘤DNA错配修复(MMR)缺陷状态的检测，可以通过免疫组化检测MMR蛋白或者通过PCR技术进行MSI检测。并且具有MSI-H表型的II期结直肠病人可能会有更好的预后。因此，MSI检测作为一个基因水平的生物标志物，对于疾病的诊断和预后的判断具有重要的指导意义。
表1.MSI-H在各肿瘤中的发生频率
目前报道的MSI-H不止在结直肠癌中，在其他一些肿瘤中也发现MSI的不稳定状态，如表1所示，子宫内膜癌、胃癌、食管癌和皮脂肿瘤中都报道具有MSI，与没有MSI的病人相比，MSI病人的肿瘤表现出更高水平的淋巴细胞浸润。具有MSI-H表型的肿瘤，往往会导致基因突变的增加，而基因突变的增加会使免疫系统识别和摧毁肿瘤的能力加强，因此使用肿瘤免疫抑制剂疗法(如PD-1/PD-L1抑制剂)对MSI-H的肿瘤可能具有更好的疗效。由于MSI-H广泛的出现在各种肿瘤中，检测微卫星不稳定能够为更多的患者接受肿瘤免疫治疗提供帮助和指导意见。
发明内容
由于MSI检测在肿瘤免疫治疗和结直肠癌治疗中起到越来越重要的指导作用，本发明基于目前的需要，提供了一种基于荧光PCR的方法来检测人肿瘤细胞中基因微卫星不稳定状态。通过对病人肿瘤样本和正常组织进行MSI检测，比较不同并得出最终结果。本发明更为准确、灵敏，操作简单，所需时间短(5小时)，结果便于分析。可大规模检测分析临床样本，更快更准确的提供检测报告。
本发明根据目前国际上和文献报道的使用比较广泛的MSI位点，选取了5个单核苷酸位点NR-21、NR-24、BAT-25、BAT-26和MONO-27。
另外，本发明所述的扩增体系还包含2个五核苷酸位点Penta C和Penta D。
本发明选取的单核苷酸位点检测肿瘤样本和正常样本时，具有高灵敏性和准确性，用来确定肿瘤细胞的MSI状态。而五核苷酸位点(Penta C和Penta D)由于在不同人中具有多态性，而在同一个人中具有特异性和唯一性，因此用来检测潜在的样本混合或样本污染，确保配对的肿瘤样本和正常样本来自于同一个人。
本发明所述的7个扩增位点，分为三组组合：第一组：NR-21、BAT-25、MONO-27；第二组：NR-24、Penta C；第三组：BAT-26、Penta D。
三组组合分别标记为三种不同的荧光：第一组NR-21、BAT-25、MONO-27标记JOE；第二组NR-24、Penta C标记TAM；第三组BAT-26、Penta D标记FAM。
所述7个位点各由一对引物扩增，荧光素标记在每对引物的上游引物的5’末端。
所述7个扩增引物对分别为：
NR-21引物：
上游引物：GGAGTCGCTGGCACAGTTCTAT，
下游引物：CTTTCTGGTCACTCGCGTTTAC；
NR-24引物：
上游引物：CCCCATTGCTGAATTTTACCTC，
下游引物：GAGATTGTGCCATTGCATTCC；
BAT-25引物：
上游引物：CTCGCCTCCAAGAATGTAAGTG，
下游引物：GACATTCTGCATTTTAACTATGGCTC；
BAT-26引物：
上游引物：GAAATTGGATATTGCAGCAGTCAG，
下游引物：GCTCCTTTATAAGCTTCTTCAGTATATGTC；
MONO-27引物：
上游引物：GCAGGGAAATGGTGGGAACC，
下游引物：AGGGTGGATCAAATTTCACTTGG；
Penta C引物：
上游引物：GAGCTGGAGGTrGCATTCAG，
下游引物：TGAGCTACAATGGTTATCACCTG；
Penta D引物：
上游引物：GGAAGGTCGAAGCTGAAGTGAG，
下游引物：TTGCCTAACCTATGGTCATAACG。
所述扩增体系的总体积为10μl，其中缓冲液1μl，MgCl2 0.6μl，dNTPs 0.3μl，10×引物混合物1.0μl，热启动Taq酶0.2μl，单链结合蛋白SSB 0.08μl，模板2μl，去离子水4.82μl。
所述的10×引物混合物中的引物浓度分别为2μM的NR-21、2μM的NR-24、2μM的BAT-25、2μM的BAT-26、2μM的MONO-27、2μM的Penta C和2μM的Penta D。
所述扩增体系的扩增条件为：95℃热启动，15分钟；94℃变性，30秒；61.3℃退火，30秒；72℃延伸，30秒；扩增30个循环；60℃终延伸，30分钟。
目前，我们的MSI检测系统能够在一管中同时扩增7个位点，具有较高的特异性和灵敏性，扩增条件相比Promega公司的变温扩增条件更加简单，扩增体系相比其他公司，更节省，而且信号比其他专利更强，易操作。
本发明的整个方法过程：
1.引物组合的设计
我们首先选取目前国际上常用的分析肿瘤细胞微卫星不稳定状态的5个单核苷酸位点，包括NR-21、NR-24、BAT-25、BAT-26、MONO-27，另外还包括2个五核苷酸位点Penta C和Penta D，我们参照文献报道的这7个位点所在基因的GeneBank序列号，如表2所示，然后从NCBI核酸数据库找到各位点所对应的基因序列，各位点所在基因的部分序列见序列表。
表2.MSI分析位点信息
用于扩增NR-21位点的正向引物是由位于序列1中220-241位22个连续碱基构成的引物，反向引物是由位于序列1中313-334位的互补序列的22个连续碱基构成的引物。
用于扩增NR-24位点的正向引物是由位于序列2中181-202位22个连续碱基构成的引物，反向引物是由位于序列2中299-319位的互补序列的21个连续碱基构成的引物。
用于扩增BAT-25位点的正向引物是由位于序列3中188-209位22个连续碱基构成的引物，反向引物是由位于序列3中292-316位的互补序列的25个连续碱基构成的引物。
用于扩增BAT-26位点的正向引物是由位于序列4中151-174位24个连续碱基构成的引物，反向引物是由位于序列4中260-289位的互补序列的30个连续碱基构成的引物。
用于扩增MONO-27位点的正向引物是由位于序列5中124-143位20个连续碱基构成的引物，反向引物是由位于序列5中280-302位的互补序列的23个连续碱基构成的引物。
用于扩增Penta C位点的正向引物是由位于序列6中166-185位20个连续碱基构成的引物，反向引物是由位于序列6中361-383位的互补序列的23个连续碱基构成的引物。
用于扩增Penta D位点的正向引物是由位于序列7中153-174位22个连续碱基构成的引物，反向引物是由位于序列7中348-370位的互补序列的23个连续碱基构成的引物。
引物设计原则：本发明中用于检测MSI的7对引物是由Primer3、MPprimer和NCBIBlast软件设计完成。多重PCR成功的先决条件是最佳的设计引物对，多重PCR引物长度在20-30个核苷酸之间，多重PCR引物的GC含量在40％-60％之间。多重PCR各引物的Tm值≥60℃，本发明将各引物的Tm值尽量控制在相同的水平，保证所有引物对能在同一退火温度下扩增，相比Promega公司专利中的多个退火温度，更加的容易实现。设计完成后将各引物对用NCBIBlast软件进行比对，确保各引物在合适范围内能够比对到比较单一的结果。各对引物的扩增产物大小至少相差10bp以上。另外，所有设计的引物用AutoDimer软件分析引物二聚体和不同引物之间的相互作用情况，确保特异性和防止二聚体的出现。
引物设计并合成好之后，首先进行单重PCR引物验证。先用K562、MOLT-4等细胞系DNA，再用结直肠癌病人DNA分别进行验证，分别用7对引物进行单重扩增，扩增完成后将扩增产物进行2.5％琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果，对PCR的体系和扩增条件作出调整。最终保证在同一扩增体系和同一扩增条件下，7对引物都能获得单一特异性条带。
单重PCR荧光标记引物验证，将上一步验证好的7对引物进行荧光标记，分成三组。第一组NR-21、BAT-25、MONO-27标记JOE；第二组NR-24、Penta C标记TAM；第三组BAT-26、Penta D标记FAM。然后按照上一步的体系和扩增条件进行单重扩增，扩增完成后将扩增产物进行2.5％琼脂糖凝胶电泳，分析各位点条带的单一性和条带亮度，确保加上荧光后对扩增特异性不会产生影响，否则重新设计引物。然后，将单重的扩增产物进行毛细管电泳检测，根据毛细管电泳检测结果进一步分析各对引物的扩增效率和特异性。
然后进行3重或2重PCR验证，将同一荧光素标记的3对或2对引物混合在一起扩增，扩增产物首先进行2.5％琼脂糖凝胶电泳，分析3重或2重PCR扩增产物的特异性，确保无非特异性条带产生。然后，3重或2重PCR的扩增产物进行毛细管电泳检测，根据毛细管电泳检测结果进一步分析各对引物的扩增效率和特异性。
然后进行5重PCR验证，JOE标记的三个位点NR-21、BAT-25、MONO-27的引物和TAM标记的两个位点NR-24、Penta C的引物标记混合到一管；JOE标记的三个位点NR-21、BAT-25、MONO-27的引物和FAM标记的两个位点BAT-26、Penta D的引物混合到一管。对这两种5重PCR进行扩增，扩增产物首先进行2.5％琼脂糖凝胶电泳，分析5重PCR扩增产物的特异性，确保无非特异性条带产生。然后，5重PCR的扩增产物进行毛细管电泳检测，根据毛细管电泳检测结果进一步分析各对引物的扩增效率和特异性。
最后进行7重PCR验证，根据5重PCR扩增的毛细管电泳结果确定各引物对的加入量，将7对引物混合到一管中扩增，扩增产物首先进行2.5％琼脂糖凝胶电泳，分析7重PCR扩增产物的特异性，确保无非特异性条带产生。然后，7重PCR的扩增产物进行毛细管电泳检测，根据毛细管电泳检测结果进一步分析各对引物的扩增效率和特异性，调整各自的浓度，尽量保证各位点的扩增产物信号一致。
2.扩增体系和扩增条件
2.1 Taq酶和缓冲液
多重PCR扩增体系中一般选择热启动的Taq酶，保证了极高的特异性。我们测试过多家公司的热启动Taq酶都能满足要求，如天根的多重PCR扩增试剂盒，不仅包含性能最好的热启动耐热聚合酶，还含有专门为多重PCR设计的缓冲液，很好的保证了扩增的特异性和效率。另外，Thermo的AmpliTaq Gold DNA Polymerase和NEB的HotStart taq DNApolymerase，以及各自配套的缓冲液都能满足需要。
2.2 Mg2+浓度
本发明中所使用的Mg2+浓度为3.0mM，能够显著去除非特异性扩增产物的产生。
2.3 dNTPs浓度
本发明中所使用的dNTPs为高纯度的，终浓度为200μM，可进一步保证扩增的特异性。
2.4其他添加剂
本发明除了使用与相应热启动Taq酶配套的缓冲液之外，还加入了单链结合蛋白SSB，能够显著的降低非特异性扩增和增强扩增效果。
2.5扩增体积
本发明首先采用了10μl体系进行扩增，使用了更少量的引物和酶，节约成本，同时能够得到较理想的扩增产物。另外，扩大到20μl体系仍然能够得到预期的效果。
2.6扩增条件
本发明首先进行了退火温度的调整，从55℃到63℃之间都进行了尝试，发现在61.3℃和62.7℃之间能够得到扩增灵敏度和特异性较好的结果，PCR反应中最后的延伸步骤采用60℃，30min能够很好的消除非特异性峰，表3所示本发明最终确定的扩增条件。
表3.MSI分析检测扩增条件
本发明的优势和创新点：
本发明主要用于肿瘤免疫治疗(PD-1/PD-L1)中病人的伴随诊断，主要用来检测肿瘤细胞微卫星不稳定，进一步对治疗和预后提供建议。本发明选取的五个MSI位点(NR-21、NR-24、BAT-25、BAT-26和MONO27)具有最高的灵敏度和特异性，是目前国际上用得比较广泛的位点，用于检测微卫星不稳定状态比较准确可靠。另外，通过比较病人肿瘤细胞和正常细胞的这五个位点的变化，能够区分出不同类型的MSI状态，比如5个位点中有2个及以上位点发生变化，则定义为MSI-H(微卫星高不稳定状态)，只有1个位点变化的定义为MSI-L(微卫星低不稳定状态)，没有任何位点发生变化的定义为MSS(微卫星稳定状态)。
除了上述的5个MSI检测位点，我们还加入了2个五核苷酸位点(Penta C和PentaD)。选取这两个五核苷酸重复序列，是因为这两个位点在人群中具有高水平的多态性和低程度的微卫星不稳定性，能够唯一的识别样本是否来自于同一个病人，防止样品污染，作为有效的样本质控。
本发明所用的扩增体系简单，节省原料，成本较低，且整个扩增流程所需时间仅5个小时左右，方便操作。
附图说明
图1采用本发明检测的结直肠癌(CRC)病人肿瘤组织MSI状态的分型图谱
图2采用本发明检测的结直肠癌(CRC)病人正常组织MSI状态的分型图谱
具体实施方式
案例1
我们选取了一例结直肠癌病人，采用本发明，对其肿瘤细胞微卫星不稳定状态进行检测。同时使用Promega公司的MSI Analysis System，Version 1.2作为对照，以下是具体操作步骤。
1.FFPE样本DNA提取
使用QIAGEN公司的QIAamp DNA FFPE Tissue Kit分别对结直肠癌病人的肿瘤和癌旁FFPE样本进行DNA提取。然后使用Nanodrop进行DNA浓度和质量检测，FFPE样本提取的DNA最好用Qubit重新定量，最后稀释成1ng/μl浓度。
2.PCR扩增
2.1 10×MSI引物混合液准备
首先将荧光标记的7对引物使用TE Buffer溶解成100μM母液，然后按表4的要求配置成10×MSI引物混合液：
所述7个扩增引物对分别为：
NR-21引物：
上游引物：GGAGTCGCTGGCACAGTTCTAT，
下游引物：CTTTCTGGTCACTCGCGTTTAC；
NR-24引物：
上游引物：CCCCATTGCTGAATTTTACCTC，
下游引物：GAGATTGTGCCATTGCATTCC；
BAT-25引物：
上游引物：CTCGCCTCCAAGAATGTAAGTG，
下游引物：GACATTCTGCATTTTAACTATGGCTC；
BAT-26引物：
上游引物：GAAATTGGATATTGCAGCAGTCAG，
下游引物：GCTCCTTTATAAGCTTCTTCAGTATATGTC；
MONO-27引物：
上游引物：GCAGGGAAATGGTGGGAACC，
下游引物：AGGGTGGATCAAATTTCACTTGG；
Penta C引物：
上游引物：GAGCTGGAGGTTGCATTCAG，
下游引物：TGAGCTACAATGGTTATCACCTG；
Penta D引物：
上游引物：GGAAGGTCGAAGCTGAAGTGAG，
下游引物：TTGCCTAACCTATGGTCATAACG。
表4.各引物的配比
引物比例 10×MSI引物混合液浓度(μM)
NR-21 1.0 2
BAT-25 1.0 2
MONO-27 1.0 2
BAT-26 1.0 2
Penta D 1.0 2
NR-24 1.0 2
Penta C 1.0 2
1.1扩增体系准备
按照下表所示的扩增体系配置
表5.MSI分析扩增体系
组分 体积 终浓度
1.0μl
0.6μl 3mM
dNTPs(2.5mM each) 0.3μl 200μM
10X MSI引物混合物 1.0μl 0.2μM
热启动DNA聚合酶 0.2μl 0.1U/μl
单链结合蛋白SSB 0.08μl 0.08μl 4ng/μl
DNA模板(1ng/μl) 2.0μl 0.2ng/μl
ddH2O 4.82μl
总体积 10μl
1.2扩增条件
扩增好的产物避光4℃保存。
2.琼脂糖凝胶电泳
将扩增好的产物，进行110V的2.5％琼脂糖凝胶电泳，检测扩增效率和特异性。
3.毛细管电泳检测
按照毛细管电泳机器的上样说明，在合适的毛细管电泳检测机器上进行检测，得出图谱结果。
见附图1、2
4.结果解读和说明
MSI分析结果显示，结直肠癌病人肿瘤组织中的五个微卫星位点(NR-21、NR-24、BAT-25、BAT-26和MONO-27)与正常组织相比，均发生了改变，而2个五核苷酸位点Penta C和Penta D均未发生改变，说明肿瘤组织和正常组织来自于同一个人，未发生样品污染，因此我们定义该病人的表型为微卫星高不稳定状态(MSI-H)。另外，对该结直肠癌病人肿瘤组织进行PD-L1免疫组织化学染色显示有较多的肿瘤浸润淋巴细胞染色，说明该病人的微卫星状态(MSI-H)和PD-L1相关的免疫抑制存在一定的关联。

Claims (7)

1.作为用于肿瘤免疫治疗(PD-1/PD-L1)的辅助诊断标志物检测的微卫星不稳定状态分析体系，该体系所用的扩增引物组合能够同时扩增单核苷酸重复位点(NR-21、NR-24、BAT-25、BAT-26、MONO27)和五核苷酸重复位点(Penta C和Penta D)，所述的每一个位点均由一对引物扩增，这7个扩增引物对分别为：
NR-21引物：
上游引物：GGAGTCGCTGGCACAGTTCTAT，
下游引物：CTTTCTGGTCACTCGCGTTTAC；
NR-24引物：
上游引物：CCCCATTGCTGAATTTTACCTC，
下游引物：GAGATTGTGCCATTGCATTCC；
BAT-25引物：
上游引物：CTCGCCTCCAAGAATGTAAGTG，
下游引物：GACATTCTGCATTTTAACTATGGCTC；
BAT-26引物：
上游引物：GAAATTGGATATTGCAGCAGTCAG，
下游引物：GCTCCTTTATAAGCTTCTTCAGTATATGTC；
MONO-27引物：
上游引物：GCAGGGAAATGGTGGGAACC，
下游引物：AGGGTGGATCAAATTTCACTTGG；
Penta C引物：
上游引物：GAGCTGGAGGTTGCATTCAG，
下游引物：TGAGCTACAATGGTTATCACCTG；
Penta D引物：
上游引物：GGAAGGTCGAAGCTGAAGTGAG，
下游引物：TTGCCTAACCTATGGTCATAACG。
2.根据权利要求1所述的扩增引物组合，所述扩增引物的扩增位点分别由三种不同的荧光染料标记，三组组合分别为：第一组：NR-21、BAT-25、MONO-27；第二组：NR-24、Penta C；第三组：BAT-26、Penta D。
3.根据权利要求1和2所述的扩增引物组合，三组组合分别标记JOE、TAM、FAM。
4.根据权利要求3所述的扩增引物标记，所述的第一组NR-21、BAT-25、MONO-27每个位点都标记JOE；所述的第二组NR-24、Penta C每个位点都标记TAM；所述的第三组BAT-26、Penta D每个位点都标记FAM。
5.根据权利要求4所述的扩增引物组合物，所述的每个位点的引物对中，上游引物的5′-OH末端标记荧光，下游引物不标记。
6.根据权利要求5所述的扩增体系，所述扩增体系的总体积为10μl，其中缓冲液1μl，MgCl20.4μl，dNTPs 0.8μl，10×引物混合物1.0μl，热启动Taq酶0.2μl，SSB 0.08μl，模板2μl，去离子水4.52μl。
7.根据权利要求6所述的扩增体系，10×引物混合物中的引物浓度分别为2μM的NR-21、2μM的NR-24、2μM的BAT-25、2μM的BAT-26、2μM的MONO-27、2μM的Penta C和2μM的Penta D。
CN201710102499.0A 2017-02-16 2017-02-16 肿瘤免疫治疗中微卫星不稳定状态分析体系 Pending CN106834479A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710102499.0A CN106834479A (zh) 2017-02-16 2017-02-16 肿瘤免疫治疗中微卫星不稳定状态分析体系

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710102499.0A CN106834479A (zh) 2017-02-16 2017-02-16 肿瘤免疫治疗中微卫星不稳定状态分析体系

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106834479A true CN106834479A (zh) 2017-06-13

Family

ID=59134132

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710102499.0A Pending CN106834479A (zh) 2017-02-16 2017-02-16 肿瘤免疫治疗中微卫星不稳定状态分析体系

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106834479A (zh)

Cited By (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107217103A (zh) * 2017-07-14 2017-09-29 常州桐树生物科技有限公司 检测微卫星不稳定性的多重荧光pcr扩增试剂及试剂盒
CN107488739A (zh) * 2017-10-17 2017-12-19 生工生物工程（上海）股份有限公司 一种微卫星不稳定检测的核酸组合、试剂盒和方法
CN107937396A (zh) * 2017-12-29 2018-04-20 北京莲和医学检验所有限公司 引物组、试剂盒以及同时检测单态性单核苷酸重复位点微卫星不稳定的方法
CN108220405A (zh) * 2018-02-06 2018-06-29 上海汇真生物科技有限公司 微卫星稳定性状态检测的方法及试剂盒
CN108315426A (zh) * 2018-04-12 2018-07-24 北京信诺佰世医学检验所有限公司 微卫星序列稳定性检测的标志物组合、引物组和试剂盒
CN108374046A (zh) * 2018-02-08 2018-08-07 北京阅微基因技术有限公司 肿瘤细胞微卫星不稳定状态检测体系
CN108753965A (zh) * 2018-06-07 2018-11-06 凯杰（苏州）转化医学研究有限公司 一种微卫星不稳定状态的复合扩增检测体系及其应用
CN108866188A (zh) * 2018-07-12 2018-11-23 吉林大学 一种消化道恶性肿瘤易感性预测试剂盒及系统
CN110232949A (zh) * 2019-05-09 2019-09-13 西安交通大学 考虑肿瘤纯度因素的基因组微卫星广域长度分布估计方法
CN110305958A (zh) * 2018-11-23 2019-10-08 郑州海普生物医药科技有限公司 一种msi检测方法
CN111670254A (zh) * 2018-02-20 2020-09-15 豪夫迈·罗氏有限公司 微卫星不稳定性的改进检测
CN111763739A (zh) * 2020-08-11 2020-10-13 郑州科蒂亚生物技术有限公司 一种肿瘤微卫星不稳定检测引物及其应用和试剂盒
JP2020530763A (ja) * 2017-07-12 2020-10-29 アンスティテュート キュリー マイクロサテライト配列中の突然変異を検出する方法
CN112037859A (zh) * 2020-09-02 2020-12-04 迈杰转化医学研究(苏州)有限公司 一种微卫星不稳定性的分析方法和分析装置
CN112239788A (zh) * 2020-10-21 2021-01-19 北京阅微基因技术股份有限公司 提高肿瘤细胞微卫星不稳定状态检测灵敏度的前处理体系
CN112687333A (zh) * 2020-12-24 2021-04-20 北京吉因加医学检验实验室有限公司 一种泛癌种的单样本微卫星不稳定性的分析方法和装置
WO2021092299A1 (en) * 2019-11-08 2021-05-14 Life Technologies Corporation Systems and assays for assessing microsatellite instability
CN112930569A (zh) * 2018-08-31 2021-06-08 夸登特健康公司 无细胞dna中的微卫星不稳定性检测
CN113891943A (zh) * 2019-05-15 2022-01-04 巴奥特生物科技有限公司 通过毛细管电泳(ce)dna图谱对微卫星进行的比较分析

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102230004A (zh) * 2011-06-08 2011-11-02 北京阅微基因技术有限公司 肿瘤细胞微卫星不稳定状态的复合扩增体系及检测试剂盒
WO2016077553A1 (en) * 2014-11-13 2016-05-19 The Johns Hopkins University Checkpoint blockade and microsatellite instability

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102230004A (zh) * 2011-06-08 2011-11-02 北京阅微基因技术有限公司 肿瘤细胞微卫星不稳定状态的复合扩增体系及检测试剂盒
WO2016077553A1 (en) * 2014-11-13 2016-05-19 The Johns Hopkins University Checkpoint blockade and microsatellite instability

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BACHER JW ET AL.: "Development of a fluorescent multiplex assay for detection of MSI-High tumors", 《DISEASE MARKERS》 *
DUDLEY JC ET AL.: "Microsatellite Instability as a Biomarker for PD-1 Blockade", 《CLINICAL CANCER RESEARCH》 *
谭贵良 等: "《现代分子生物学及组学技术在食品安全检测中的应用》", 30 June 2014, 中山大学出版社 *

Cited By (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020530763A (ja) * 2017-07-12 2020-10-29 アンスティテュート キュリー マイクロサテライト配列中の突然変異を検出する方法
CN107217103A (zh) * 2017-07-14 2017-09-29 常州桐树生物科技有限公司 检测微卫星不稳定性的多重荧光pcr扩增试剂及试剂盒
CN107217103B (zh) * 2017-07-14 2018-12-04 常州桐树生物科技有限公司 检测微卫星不稳定性的多重荧光pcr扩增试剂及试剂盒
CN107488739A (zh) * 2017-10-17 2017-12-19 生工生物工程（上海）股份有限公司 一种微卫星不稳定检测的核酸组合、试剂盒和方法
CN107937396A (zh) * 2017-12-29 2018-04-20 北京莲和医学检验所有限公司 引物组、试剂盒以及同时检测单态性单核苷酸重复位点微卫星不稳定的方法
CN108220405A (zh) * 2018-02-06 2018-06-29 上海汇真生物科技有限公司 微卫星稳定性状态检测的方法及试剂盒
CN108374046A (zh) * 2018-02-08 2018-08-07 北京阅微基因技术有限公司 肿瘤细胞微卫星不稳定状态检测体系
CN108374046B (zh) * 2018-02-08 2021-09-14 北京阅微基因技术股份有限公司 肿瘤细胞微卫星不稳定状态检测体系
CN111670254A (zh) * 2018-02-20 2020-09-15 豪夫迈·罗氏有限公司 微卫星不稳定性的改进检测
CN108315426A (zh) * 2018-04-12 2018-07-24 北京信诺佰世医学检验所有限公司 微卫星序列稳定性检测的标志物组合、引物组和试剂盒
CN108753965A (zh) * 2018-06-07 2018-11-06 凯杰（苏州）转化医学研究有限公司 一种微卫星不稳定状态的复合扩增检测体系及其应用
CN108753965B (zh) * 2018-06-07 2022-06-17 迈杰转化医学研究(苏州)有限公司 一种微卫星不稳定状态的复合扩增检测体系及其应用
CN108866188B (zh) * 2018-07-12 2022-03-01 吉林大学 一种消化道恶性肿瘤易感性预测试剂盒及系统
CN108866188A (zh) * 2018-07-12 2018-11-23 吉林大学 一种消化道恶性肿瘤易感性预测试剂盒及系统
CN112930569A (zh) * 2018-08-31 2021-06-08 夸登特健康公司 无细胞dna中的微卫星不稳定性检测
CN110305958A (zh) * 2018-11-23 2019-10-08 郑州海普生物医药科技有限公司 一种msi检测方法
CN110232949B (zh) * 2019-05-09 2021-08-13 西安交通大学 考虑肿瘤纯度因素的基因组微卫星广域长度分布估计方法
CN110232949A (zh) * 2019-05-09 2019-09-13 西安交通大学 考虑肿瘤纯度因素的基因组微卫星广域长度分布估计方法
CN113891943A (zh) * 2019-05-15 2022-01-04 巴奥特生物科技有限公司 通过毛细管电泳(ce)dna图谱对微卫星进行的比较分析
WO2021092299A1 (en) * 2019-11-08 2021-05-14 Life Technologies Corporation Systems and assays for assessing microsatellite instability
CN111763739A (zh) * 2020-08-11 2020-10-13 郑州科蒂亚生物技术有限公司 一种肿瘤微卫星不稳定检测引物及其应用和试剂盒
CN112037859A (zh) * 2020-09-02 2020-12-04 迈杰转化医学研究(苏州)有限公司 一种微卫星不稳定性的分析方法和分析装置
CN112037859B (zh) * 2020-09-02 2023-12-19 迈杰转化医学研究(苏州)有限公司 一种微卫星不稳定性的分析方法和分析装置
CN112239788A (zh) * 2020-10-21 2021-01-19 北京阅微基因技术股份有限公司 提高肿瘤细胞微卫星不稳定状态检测灵敏度的前处理体系
CN112687333A (zh) * 2020-12-24 2021-04-20 北京吉因加医学检验实验室有限公司 一种泛癌种的单样本微卫星不稳定性的分析方法和装置
CN112687333B (zh) * 2020-12-24 2021-11-23 北京吉因加医学检验实验室有限公司 一种泛癌种的单样本微卫星不稳定性的分析方法和装置

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106834479A (zh) 肿瘤免疫治疗中微卫星不稳定状态分析体系
Forshew et al. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA
Van Doorn et al. Epigenetic profiling of cutaneous T-cell lymphoma: promoter hypermethylation of multiple tumor suppressor genes including BCL7a, PTPRG, and p73
Dufort et al. Pyrosequencing, a method approved to detect the two major EGFR mutations for anti EGFR therapy in NSCLC
CN106520931A (zh) Egfr基因突变检测引物探针及其试剂盒
CN103555843B (zh) 结直肠癌微卫星不稳定性扩增体系及其检测试剂盒
CN101092644B (zh) 非小细胞肺癌疗效相关的egfr基因突变的快速检测
EP2218794A1 (en) Detection of instability in regions of genomic DNA containing simple tandem repeats
US20030068620A1 (en) Methods and compositions for detecting cancers associated with methylation of hMLH1 promoter DNA
JP2024020392A (ja) 特定の遺伝子のｃｐｇメチル化変化を利用した肝癌診断用組成物およびその使用
CN101875971A (zh) Braf基因突变的快速检测
Rao et al. Identification of plasma exosomes long non-coding RNA HAGLR and circulating tumor cells as potential prognosis biomarkers in non-small cell lung cancer
CN101107367A (zh) 癌症标记物和检测方法
CN107513577A (zh) 一种高效检测egfrt790m突变体的方法以及用于检测的探针和试剂盒
Wang et al. Universal and highly accurate detection of circulating tumor DNA mutation in non-small cell lung cancer based on CRISPR/Cas12a system
Wei et al. Detection of BRAFV600E mutation of thyroid cancer in circulating tumor DNA by an electrochemical-enrichment assisted ARMS-qPCR assay
Araki et al. Usefulness of peptide nucleic acid (PNA)-clamp smart amplification process version 2 (SmartAmp2) for clinical diagnosis of KRAS codon12 mutations in lung adenocarcinoma: Comparison of PNA-clamp SmartAmp2 and PCR-related methods
CN108441558A (zh) 肿瘤细胞微卫星不稳定性的复合扩增体系及检测试剂盒
WO2019084998A1 (zh) 一种kras、nras、braf基因突变检测试剂盒
WO2008143896A1 (en) Methylation markers for prostate cancer and methods of use
JP2020019738A (ja) がんの診断のためのプローブ／プライマーライブラリー
US20090297506A1 (en) Classification of cancer
CN107937396A (zh) 引物组、试剂盒以及同时检测单态性单核苷酸重复位点微卫星不稳定的方法
CN112831550A (zh) Tert基因启动子突变实时荧光定量pcr检测试剂及方法
Ahmed Development of novel diagnostic and prognostic molecular markers for sporadic colon cancer

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170613