CN103555843B - 结直肠癌微卫星不稳定性扩增体系及其检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种结直肠癌微卫星不稳定性扩增体系及其检测试剂盒，本发该扩增体系包括通用—特异嵌合引物对和通用引物的混合物，通用—特异嵌合引物对分别针对微卫星位点BAT25、BAT26、D2S123、D5S346和D17S250；通用引物是FluD5-Up，通用—特异嵌合引物对中的各个正向引物5’端设有FluD5-Up的序列，所述FluD5-Up为荧光标记引物；本发明的扩增体系及其检测试剂盒克服了不同引物需多种荧光标记的不足，在同一个PCR反应体系中检测5个微卫星基因位点，结果直观可靠，省时高效，可有效的对MSI基因位点进行检测分析。

Description

结直肠癌微卫星不稳定性扩增体系及其检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种PCR扩增体系，以及使用该扩增体系的检测产品，属于生物技术领域。
背景技术
结直肠癌在国内外发病率均逐渐升高，是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一，研究发现基因组的不稳定性在结直肠癌的发病机制中占重要的地位。基因组的不稳定性包括染色体不稳定性(chromosomal instability，CI)和微卫星不稳定性(microsatellite instability，MSI)。以往对于结直肠癌的发病研究表明，染色体不稳定（chromo⁃some instability）为结直肠癌发病的主要原因，染色体不稳定性指全部染色体数量的增加或减少速度加快。而近年的研究发现微卫星不稳定性为结直肠癌发病的另一重要机制。
微卫星又称短串联重复序列(Short tandem repeats,STRs)、简单重复顺序(Simple sequences repeats,SSRs)，由1～6个核苷酸组成，具有高度多态性，广泛存在于原核及真核生物基因组中，特别是以二核苷酸重复序列即(CA/GT)n最为常见，n为重复次数，通常为15～60次。微卫星从基因的结构分析，重复序列位于启动子、基因编码区、内含子区域或内含子与外显子的交界区。微卫星能自身特异性的结合蛋白质或直接编码蛋白质，有的则可能参与染色单体的折叠及端粒的形成等。微卫星通过改变DNA结构或通过与特异性蛋白质结合而发挥基因调控作用，是一类新的、多态信息容量高的分子标记。
微卫星不稳定性是指由于复制错误(replication error, RER)引起的简单重复序列的增加或丢失。其发生主要是参与配对错误修复的基因功能缺陷而产生一种缺陷蛋白质，因而不能正常的校正复制错误，从而引起微卫星DNA的改变，使其不能正常地发挥调控作用，导致细胞增殖及分化异常，促发恶性肿瘤形成。据文献报道，MSI与结直肠癌、胃癌、子宫内膜癌等肿瘤发生密切相关。大约15%的结直肠癌中存在MSI现象，其中典型的遗传性非息肉病性结直肠癌（hereditarynon-polyposis colorectal cancer，HNPCC）患者90%以上为MSI瘤。 MSI检测对结直肠癌患者其意义重大。与无MSI的结直肠癌相比，携带有MSI的结直肠癌其预后较好，并且二者药物反应也不一样。1997年Bethesda指导纲要推荐应用5个微卫星位点来进行结直肠癌的检测,即单碱基重复序列BAT-25和BAT-26、双碱基重复序列D2S123、D5S346和D17S250,并对MSI作出了定义。比较肿瘤和匹配的正常DNA,5个位点中有2个或2个以上位点有重复序列长度变化者为高度MSI(highfrequency MSI,MSI-H),若只有1个位点有长度变化者为低度MSI(lowfrequency MSI,MSI-L),无任何位点的变化称为微卫星稳定(microsatellite stable,MSS)。
在2011年关于结直肠癌筛查的NCCN Guidelines中，MSI已成为首要检测项目。①MSI检测可用于HNPCC的筛查。超过90%的HNPCC患者肿瘤组织表现MSI，MSI在HNPCC中已经成为的重要标志物；当高度怀疑HNPCC时，需检测MSI。②MSI-H的结直肠癌患者预后良好的标志物。MSI-H结肠癌患者生存期更长，较少复发，被认为是预后好的标志之一。③MSI检测可用于氟尿嘧啶类药物的辅助疗效预测。2009年ASCO会议报道，在接受5-FU辅助化疗的II期和III期结肠癌患者中，MSI是独立的预后因素。现有技术的微卫星不稳定性一般可通过如下2种方法检测：
1）PCR法：选定特异的引物，以自身正常组织作对照，在体外对微卫星位点进行PCR扩增，扩增后的产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳，经各种显示系统（放射自显影、银染等）分析有无迁移率的改变。
2）基因检测，即对相关的DNA直接进行测序。但因进行基因检测价格昂贵，所需试验条件较高，在临床应用尚未普及。
PCR法已成为目前常用检测方法并已被证明是最有效的初筛手段。但普通PCR分管检测五个微卫星基因，产物做凝胶电泳的方法，存在操作繁琐、成本高等诸多缺陷。
中国专利201110152226.X公开了一种肿瘤细胞微卫星不稳定状态的复合扩增体系及检测试剂盒，选取了8个准单态性单核苷酸重复位点（NR-21、NR-22、NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26、MONO-27、CAT-25）对MSI进行PCR多重扩增检测，为有效区分采用了3种荧光标记物。而进行多种荧光标记在成本控制及操作性等方面存在诸多的不足，加入性别决定位点对于防止实验操作员混淆样本方面的作用也是非常的有限。
鉴于上述情况，提供一种改良的、便捷的、高灵敏度MSI检测产品势在必行。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种具有特定核苷酸序列的通用—特异嵌合引物组合，可以有效地减弱引物间的竞争与干扰因素，检测结果准确性和灵敏度高的结直肠癌微卫星不稳定性扩增体系及其检测试剂盒，该扩增体系可以实现在一个PCR体系内采用单荧光标记一次检测5个微卫星位点。
本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种结直肠癌微卫星不稳定性扩增体系，包括通用—特异嵌合引物对和通用引物的混合物；
所述通用—特异嵌合引物对分别针对微卫星位点BAT25、BAT26、D2S123、D5S346和D17S250；所述通用—特异嵌合引物对中的正向引物是Up-BAT25、Up-BAT26、Up-D2S123、Up-D5S346和Up-D17S250，相应的反向引物是BAT25-R、BAT26-R、D2S123-R、D5S346-R和D17S250-R；
所述通用引物是FluD5-Up，所述通用—特异嵌合引物对中的各个正向引物5’端设有FluD5-Up的序列，所述FluD5-Up为荧光标记引物；
所述通用—特异嵌合引物对和通用引物的核苷酸序列如下：
Prime Name Prime Sequences（5’-3’）
Up-BAT25 GCCGTCGAACTGTCACCTCGGCTTTCCTCGCCTCCAAG
BAT25-R CACTTCAAAATGACATTCTGCA
Up-BAT26 GCCGTCGAACTGTCACCTCGGACAGTTTGAACTGACTAC
BAT26-R CGCTAGTTATCTAATCCAAG
Up-D2S123 GCCGTCGAACTGTCACCTCCATTGCTGGAAGTTCTGGCC
D2S123-R GACTAACCGTCCCATAGGTGG
Up-D5S346 GCCGTCGAACTGTCACCTCGGCATATGAATACCAGGATAGC
D5S346-R GCAGAGTATCAATCTTGTACC
Up-D17S250 GCCGTCGAACTGTCACCTCGATTTACTGTGGATTGGTAAGTC
D17S250-R CAGGCATGAGCCACTCAGCTGGC
FluD5-Up GCCGTCGAACTGTCACCTC。
上述技术方案的一种优选是：上述引物FluD5-Up的浓度是0.1µM～0.25µM。
一种上述技术方案的进一步优选是：上述引物Up-BAT25的浓度与引物FluD5-Up的浓度的比值为1∶25至1∶15；所述引物Up-BAT26、Up-D2S123和Up-D5S346的浓度与引物FluD5-Up的浓度的比值为1∶50至1∶30；所述引物Up-D17S250的浓度与引物FluD5-Up的浓度的比值为1∶5至1∶3；所述引物BAT25-R、BAT26-R、D2S123-R、D5S346-R和D17S250-R的浓度与引物FluD5-Up的浓度的比值为10∶9至5∶3。
一种上述技术方案的更进一步优选是：上述引物FluD5-Up的浓度是0.2µM，引物Up-BAT25 0.01µM、Up-BAT26、Up-D2S123和Up-D5S346的浓度都是0.005µM， 引物Up-D17S25 0的浓度是0.05µM， 引物BAT25-R、BAT26-R、D2S123-R、D5S346-R和D17S250-R的浓度都是0.25µM。
上述FluD5-Up的荧光标记为Cy5、Cy3或FAM。优选FluD5-Up的荧光标记为Cy5。
上述扩增体系的总体积为10µl～20µl。
上述扩增体系还包括PCR缓冲液、1.5mM～2mM的Mg2+、0.2 mM 的dNTP、0.4U～0.6U的热启动酶和10 ng～200ng的DNA模板。
本发明为解决上述技术问题提出的另一种技术方案是：一种采用上述扩增体系的结直肠癌微卫星不稳定性检测试剂盒。
本发明的积极效果在于：
1）本发明的结直肠癌微卫星不稳定性扩增体系将微卫星标记、荧光多重PCR及毛细管电泳技术融合于一体，克服了现有技术普通PCR只能在一个反应体系内检测一个微卫星基因位点的不足，实现了在一个PCR体系内同时检测5个MSI基因位点，节约了成本，提高了效率。由于采用了特定的通用—特异嵌合引物，并且应用非生物源性通用引物做单荧光标记，避免了普通多重PCR需进行引物多种荧光标记的繁琐，既减弱了引物间的竞争与干扰因素，又节约了费用。
2）多重PCR产物经过毛细管电泳后获得产物片段数据、荧光峰值及图谱，再比较肿瘤组织和对照产物片段大小、标记荧光强弱及峰型变化，进行微卫星不稳定性判断，在本发明的扩增体系中通用-特异嵌合引物对中的正向引物和反向引物的浓度会直接影响多重PCR的结果，尤为重要。本发明的扩增体系在配制时，使得正向引物Up-BAT25、Up-BAT26、Up-D2S123、Up-D5S346、Up-D17S250的浓度低于通用引物FluD5-Up浓度，反向引物BAT25-R、BAT26-R、D2S123-R、D5S346-R、D17S250-R的浓度高于FluD5-Up的浓度，并且各个引物的浓度控制在适宜的范围内，尤其对正向引物Up-BAT25和Up-D17S250的浓度进行了严格的控制，从而更加有效地减弱了引物间的竞争与干扰因素，使得多重PCR的结果更加可靠。
3）本发明试剂盒的片段分析应用的毛细管电泳片段分析技术不同于传统凝胶电泳分析模式，使PCR结果分析更直观、简洁、可靠，易于识别判断，更有利于标准化操作。
4）本发明结构简单、操作便捷、使用条件模式化，便于大规模推广应用。
附图说明
图1是本发明的检测试剂盒的多重PCR反应原理示意图；
图2是实施例1的检测试剂盒检测样本1的血样的分型图谱；
图3是实施例1的检测试剂盒检测样本1的肿瘤组织DNA的分型图谱；
图4是实施例1的检测试剂盒检测样本1的血样和肿瘤组织DNA叠加的分型图谱；
图5是实施例1的检测试剂盒检测样本2的血样的分型图谱；
图6是实施例1的检测试剂盒检测样本2的肿瘤组织DNA的分型图谱；
图7是实施例1的检测试剂盒检测样本2的血样和肿瘤组织DNA叠加的分型图谱。
具体实施方式
实施例1
本实施例的结直肠癌微卫星不稳定性检测试剂盒至少由固定在纸质包装盒内的六只装有相应试剂的试管组成，六只试管分别是扩增缓冲液试管、Mg2+试管、dNTP试管、热启动酶试管、引物混合物试管和超纯水试管。上述试管在包装盒内的排列放置的顺序没有特别要求，只要清楚标示即可。
本实施例的检测试剂盒的开发原理及使用方法为：
A.MSI基因位点引物设计、合成及筛选：
根据Bethesda标准微卫星位点，包含BAT25、BAT26、D2S123、D5S346、D17S250五个基因，设计其多态性微卫星标记引物。
设计引物使用Oligo7.0软件进行性能评价，首先使各引物Tm值达到温差不大于2℃的数值区间，其次引物之间不产生任何二级结构，最后应用BLAST确定引物不与其它基因组发生交叉反应。共设计十五对引物进行筛选。
合成上述十五对引物，用结直肠癌者的DNA样本筛选：
使用DNA裂解液和蛋白酶K提取2例待测试者的肿瘤组织和血样DNA，获得样本浓度区间为10 ng/µl ～200ng/µl,高浓度样本用水稀释至100ng/µl。
以上述2例待测DNA样品先进行单重扩增筛选，再进行多重扩增筛选出5对引物作为PCR体系组合引物，正向引物（STR-F）分别命名为Up-BAT25、Up-BAT26、Up-D2S123、Up-D5S346和Up-D17S250；相应的反向引物（STR-R）分别命名为BAT25-R、BAT26-R、D2S123-R、D5S346-R和D17S250-R。
设计3条通用引物，使其序列不与上述十条特异性引物发生二级结构，且其Tm值略低于特异性引物Tm值，以使特异性引物在多重PCR体系中首先充分扩增。
通用引物5’端做荧光素标记，分别使用FAM、CY3或CY5报告基团作标记，结果均可，此通用引物命名为FluD5-Up。
B.进行MSI多重PCR-CE体系的构建：
本实施例的检测试剂盒采用的PCR反应体系为多重PCR反应体系，即5对微卫星基因位点特异引物和荧光标记通用引物放在同一个PCR管内进行PCR扩增。采用10µl～20µl反应体系均可较好进行复合扩增。在考虑成本因素及经过PCR实验反复调整和优化后，优选的多重PCR反应体系总体积为10µl，包括10ng～200ng基因组DNA、PCR缓冲液、2mM的Mg2+、0.2mM的dNTP、0.5U的热启动酶，以及引物BAT25-R、BAT26-R、D2S123-R、D5S346-R、D17S250-R各0.25µM，FluD5-Up 0.2µM，Up-BAT25 0.01µM，Up-BAT26、Up-D2S123、Up-D5S346各0.005µM、Up D17S250 0.05µM。
通用—特异嵌合引物对中的STR-F浓度为通用引物FluD5-Up的浓度的数分之一。通用—特异嵌合引物对（STR-F和STR-R）在热启动酶作用下首先对MSI基因进行5～10个循环的扩增，产生5’端带有Up的互补片段；之后FluD5-Up和STR-R引物在热启动酶作用下对PCR扩增得到的带有Up的产物再进行后续35～40个循环的扩增，产生5’端带有Cy5标记的互补MSI基因片段。上述PCR反应的原理如图1所示。
本实施例的检测试剂盒优选的PCR反应条件为：95℃预热5分钟；然后94℃变性10秒，54℃退火10秒，72℃延伸30秒，共40个循环；最后72℃延伸5分钟，4℃保温。
经上述步骤所得的PCR产物进行毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE)。利用多重荧光PCR结合毛细管电泳技术检测微卫星，具有高效、稳定、灵敏度高、分析结果可靠等优点。每个样本CE体系总体积为20µl，包括上述PCR产物1µl～5ul、DNA-Size 标准液0.2µl ～0.5µl，及Sample Loading Solution和石蜡油，电泳所得荧光图谱进行片段分析。
C.结直肠癌细胞MSI基因片段分析判断：
根据毛细管电泳图谱中的基因片段大小和荧光峰值峰形比较，若肿瘤组织较全血样本出现某一基因条带移位或获得额外的带型即判断为某一基因不稳定性改变。判断的标准采用国际癌症学会推荐制定的MSl分级指导方案：检测分析MSI状态5个微卫星位点中，2个或2个以上位点不稳定判定为高度微卫星不稳定（MSI-H），1个位点不稳定判定为低度微卫星不稳定（MSI-L），无位点不稳定判定为微卫星稳定（MSS）。
本实施例的检测试剂盒的使用步骤是：先进行结直肠癌者肿瘤组织和对照的DNA提取；再采用多重扩增体系进行扩增和检测；最后进行多重产物的分析判断。
以下是采用本实施例的检测试剂盒对两例结直肠癌者检测MSI状态的具体实施情况：
1、全血和肿瘤组织石蜡切片DNA提取：
分别提取两例待测样本的全血DNA和肿瘤组织DNA，命名为样本1和2。
取样本1或2全血400µl，加入1ml双蒸水，混匀后离心5分钟，弃去上层液1ml，加入400µl裂解液和20µl蛋白酶K，70度金属浴10分钟，过离心柱，500µl清洗液先后清洗两次后，加入50µl洗脱液离心洗脱，测样本DNA浓度值。调整DNA浓度至50ng/µl。
取样本1或2的肿瘤组织石蜡切片5片，刮片入1.5ml离心管，加1ml二甲苯脱蜡，1ml乙醇清洗两次后，加400µl裂解液和20µl蛋白酶K，60度金属浴16小时，过离心柱，500µl清洗液先后清洗两次后，加入50µl洗脱液离心洗脱，测样本DNA浓度值，调整DNA浓度至50ng/µl。
2、多重PCR-CE方法检测MSI，具体操作步骤如下：
A.每个反应体系中加入10×PCR缓冲液1µl、100mM Mg2+0.2µl、2.5mM dNTP 0.8µl、5U热启动酶0.1µl、引物混合物（包括25uM BAT25-R、BAT26-R、D2S123-R、D5S346-R、D17S250-R各0.1µl、25µM FluD5-Up 0.08µl、25µM Up-BAT25 0.004µl，25µM Up-BAT26、Up-D2S123、Up-D5S346-R各0.002µl、25µM Up-D17S250 0.02µl），上述抽提得到的DNA模板2µl，补水至10µl。
所采用引物的序列如下（5’- 3’）：
BAT25引物
Up-BAT25：GCCGTCGAACTGTCACCTCGGCTTTCCTCGCCTCCAAG
BAT25-R：CACTTCAAAATGACATTCTGCA
BAT26引物
Up-BAT26：GCCGTCGAACTGTCACCTCGGACAGTTTGAACTGACTAC
BAT26-R：CGCTAGTTATCTAATCCAAG
D2S123引物
Up-D2S123：GCCGTCGAACTGTCACCTCCATTGCTGGAAGTTCTGGCC
D2S123-R：GACTAACCGTCCCATAGGTGG
D5S346引物
Up-D5S346：GCCGTCGAACTGTCACCTCGGCATATGAATACCAGGATAGC
D5S346-R：GCAGAGTATCAATCTTGTACC
D17S250引物
Up-D17S250：GCCGTCGAACTGTCACCTCGATTTACTGTGGATTGGTAAGTC
D17S250-R：CAGGCATGAGCCACTCAGCTGGC
通用引物FluD5-Up的序列为： GCCGTCGAACTGTCACCTC。
通用引物FluD5-Up的5’端带有荧光标记。
B.将PCR反应管置于扩增仪上，运行的PCR反应程序为：95℃预热5分钟；然后94℃变性10秒，54℃退火10秒，72℃延伸30秒，共40个循环；最后72℃延伸5分钟。4℃保存。
C.所得PCR产物置于Beckman GenomelabTM GeXP遗传分析仪上，按仪器使用说明进行毛细管电泳，每个CE体系总体积为20 µl，包括上述PCR产物1 µl、DNA-Size标准液0.5 µl、Sample Loading Solution 18.5µl。CE所得荧光图谱进行基因片段分析。
3、散发性结直肠癌MSI基因片段分析：
将上述样本1或2的全血和肿瘤组织样本CE图谱进行基因片段分析，根据图谱中标示的基因片段大小和荧光峰值峰形作同步比较，如图2至图7所示，横坐标为基因片段碱基数值，纵坐标为荧光数值，横坐标从左到右的基因片段顺序依次为针对微卫星位点D2S123、BAT26、BAT-25、D17S250、D5S346的扩增片段，其中图2和图5为全血样本基因片段分析图，图3和图6为肿瘤组织样本片段分析图，图4和图7为叠加后的比较图。其中样本1均未出现基因片段的移位现象，故判定为微卫星稳定（MSS）；样本2肿瘤组织样本D17S250和D5S346基因片段相比血样均出现条带移位现象，故此被检测者为高度微卫星不稳定（MSI-H）。
对样本1和2的血样和肿瘤组织样本，分别采用：（1）BAT25引物+通用引物；（2）BAT26引物+通用引物；（3）D2S123引物+通用引物；（4）D5S346引物+通用引物；（5）D17S250引物+通用引物，进行单重PCR扩增后采用毛细管电泳分析，判定结果与上述多重PCR结果一致。
实施例2
本实施例的结直肠癌微卫星不稳定性检测试剂盒的其余部分与实施例1相同，不同之处在于：通用—特异嵌合引物对中的正向引物和反向引物的浓度不同。
实施例3
本实施例的结直肠癌微卫星不稳定性检测试剂盒的其余部分与实施例1相同，不同之处在于：通用—特异嵌合引物对中的正向引物和反向引物的浓度不同。
对比例1至3
对比例1至3的检测试剂盒的其余部分与实施例1相同，不同之处在于：通用—特异嵌合引物对中的正向引物和反向引物的浓度不同。
实施例1至3以及对比例1至3的检测试剂盒中的正向引物和反向引物的浓度如表1所示：
表1 引物浓度表
实施例2和3的检测试剂盒的检测结果与实施例1的检测结果相一致，对比例1至3的检测试剂盒的检测结果与实施例1的检测结果有所偏差，如表2所示，由此可知，扩增体系在配制时，使得正向引物Up-BAT25、Up-BAT26、Up-D2S123、Up-D5S346、Up-D17S250的浓度必须低于通用引物FluD5-Up浓度，否则会使荧光信号太弱；反向引物BAT25-R、BAT26-R、D2S123-R、D5S346-R、D17S250-R的浓度必须高于FluD5-Up的浓度，以使PCR反应充分；且各个引物的浓度应控制在适宜的范围内，尤其对正向引物Up-BAT25和Up-D17S250的浓度必须进行严格控制，否则会导致引物间的干扰，在某些组织样本浓度偏低的情况下，更易使某些位点的扩增效率太低而无法辨识，导致无法判定MSI结果。
实施例1至3通过优化引物浓度使各位点扩增片段的峰型之间达到了平衡。若不同组织基因扩增效率相当，可以将电泳图叠加在一起以便分析，如图4和图7；若其中某一组织扩增效率较低，可以相应放大若干倍数以便分析，放大倍数以目的片段清晰可辨识为标准。
表2 检测结果表
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims (6)

1.一种结直肠癌微卫星不稳定性扩增体系，其特征在于：包括通用—特异嵌合引物对和通用引物的混合物；
所述通用—特异嵌合引物对分别针对微卫星位点BAT25、BAT26、D2S123、D5S346和D17S250；所述通用—特异嵌合引物对中的正向引物是Up-BAT25、Up-BAT26、Up-D2S123、Up-D5S346和Up-D17S250，相应的反向引物是BAT25-R、BAT26-R、D2S123-R、D5S346-R和D17S250-R；
所述通用引物是FluD5-Up，所述FluD5-Up为荧光标记引物；
所述通用—特异嵌合引物对和通用引物的核苷酸序列如下：
Prime Name Prime Sequences（5’-3’）
Up-BAT25 GCCGTCGAACTGTCACCTCGGCTTTCCTCGCCTCCAAG
BAT25-R CACTTCAAAATGACATTCTGCA
Up-BAT26 GCCGTCGAACTGTCACCTCGGACAGTTTGAACTGACTAC
BAT26-R CGCTAGTTATCTAATCCAAG
Up-D2S123 GCCGTCGAACTGTCACCTCCATTGCTGGAAGTTCTGGCC
D2S123-R GACTAACCGTCCCATAGGTGG
Up-D5S346 GCCGTCGAACTGTCACCTCGGCATATGAATACCAGGATAGC
D5S346-R GCAGAGTATCAATCTTGTACC
Up-D17S250 GCCGTCGAACTGTCACCTCGATTTACTGTGGATTGGTAAGTC
D17S250-R CAGGCATGAGCCACTCAGCTGGC
FluD5-Up GCCGTCGAACTGTCACCTC；
所述引物FluD5-Up的浓度是0.1µM～0.25µM；
所述引物Up-BAT25的浓度与引物FluD5-Up的浓度的比值为1∶25至1∶15；所述引物Up-BAT26、Up-D2S123和Up-D5S346的浓度与引物FluD5-Up的浓度的比值为1∶50至1∶30；所述引物Up-D17S250的浓度与引物FluD5-Up的浓度的比值为1∶5至1∶3；所述引物BAT25-R、BAT26-R、D2S123-R、D5S346-R和D17S250-R的浓度与引物FluD5-Up的浓度的比值为10∶9至5∶3。
2.根据权利要求1所述的结直肠癌微卫星不稳定性扩增体系，其特征在于：所述引物FluD5-Up的浓度是0.2µM，引物Up-BAT25 0.01µM、Up-BAT26、Up-D2S123和Up-D5S346的浓度都是0.005µM， 引物Up-D17S25 0的浓度是0.05µM， 引物BAT25-R、BAT26-R、D2S123-R、D5S346-R和D17S250-R的浓度都是0.25µM。
3.根据权利要求1或2所述的结直肠癌微卫星不稳定性扩增体系，其特征在于：所述FluD5-Up的荧光标记为Cy5、Cy3或FAM。
4.根据权利要求1或2所述的结直肠癌微卫星不稳定性扩增体系，其特征在于：所述扩增体系的总体积为10µl～20µl。
5.根据权利要求1或2所述的结直肠癌微卫星不稳定性扩增体系，其特征在于：还包括PCR缓冲液、1.5mM～2mM的Mg2+、0.2 mM 的dNTP、0.4U～0.6U的热启动酶和10 ng～200ng的DNA模板。
6.一种采用如权利要求1所述的扩增体系的结直肠癌微卫星不稳定性检测试剂盒。
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