CN106480201A - 乳腺癌转移评估试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乳腺癌转移评估试剂盒,包括BIRC5、DHCR7、UBE2C、AZGP1、IL6ST、MGP、RBBP8、STC2、CALM2、OAZ1和RPL37A共计11个目的基因的特异荧光定量PCR检测引物对,优选还包括11个目的基因的Taqman探针。通过11个目的基因表达水平的检测,进一步结合乳腺癌患者的病理信息如淋巴结状态和肿瘤大小,可以评估乳腺癌患者10年内出现的复发以及远端转移的风险,有利于患者采取相应的治疗措施,避免过度治疗。该试剂盒操作简便、易于判读,对仪器的要求不高,并且整个PCR过程采用全封闭形式,避免了交叉污染的可能,使结果更加精准。
Description
技术领域
本发明涉及乳腺癌诊断技术领域,特别是一种乳腺癌转移评估试剂盒,用于乳腺癌复发风险评估以及远端转移情况评估。
背景技术
在中国,癌症的健康负担逐年增长,每年超过160万人诊断为癌症,120万因癌症而死亡。与其他大多数国家一样,乳腺癌也成为了中国女性最常见的癌症;每年中国乳腺癌新发数量和死亡数量分别占全世界的12.2%和9.6%。肿瘤专家指出,近年来我国癌症发病呈明显上升趋势,但得到规范治疗的患者却不足一半。ER+/HER2-乳腺癌是乳腺癌的一种亚型,约占全部乳腺癌的2/3,每年约有33000女性被诊断出患有此种类型的乳腺癌。治疗ER+/HER2-乳腺癌通常需要先手术再内分泌治疗,若怀疑存在远处转移也可能需要进行化疗,因为若是存在远处转移意味着疾病可能无法被治愈。2013年,英国批准了OncoType DX基因检测来帮助存在转移的乳腺癌患者评估是否需要进行化疗,随后ASCO和NCCN也将其纳入相关指南。这是一类以多基因表达检测为基础的风险模型,可用于评价ER+/HER2-乳腺癌患者术后复发转移风险,帮助临床决策。
2012年圣安东尼奥乳腺癌会议中,有关EndoPredict及远端转移的新数据被发布。结果表明低风险人群5年复发转移约3%,而6-10年约2%。因此该手段不仅可以区分不必要化疗人群,也可以充分进行五年的抗激素治疗而减少不必要的过多治疗。Endopredict能够识别出不需化疗的远处复发低风险患者,因为Endopredict结合淋巴结情况及肿瘤大小等参数,故相比Oncotype DX提供了更精确的预后信息,并且Oncotype DX检测需要运送到专业实验室分析,而Endopredict在普通实验室就可以进行分析,缩短相应的检测时间。有研究结果表明,在预测ER+/HER2-乳腺癌复发低风险方面,EndoPredict比21基因Oncotype DX检测更为精准,从而可以免除此类患者的术后化疗。
发明内容
本发明的目的在于提高乳腺癌转移评估准确率,为乳腺癌患者10年远端转移及复发情况提供更加可靠的诊断试剂。
本发明的发明思路是基于Endopredict原理,利用PCR-荧光定量PCR法,通过设计筛选特异性强、扩增效率高的扩增引物,分别检测11个目标基因的表达量,通过表达量的差异计算评分,达到准确判断乳腺癌远端转移及复发情况。
本发明提供的乳腺癌转移评估试剂盒,包括BIRC5、DHCR7、UBE2C、AZGP1、IL6ST、MGP、RBBP8、STC2、CALM2、OAZ1和RPL37A共计11个目的基因的特异荧光定量PCR检测引物对,用于检测11个目的基因的表达量,其核苷酸序列如下所示:
BIRC5的检测引物对:
F:CCACTGCCCCACTGA(SEQ ID NO:1),
R:AGGAAAGCGCAACCGG(SEQ ID NO:2);
DHCR7的检测引物对:
F:CTCTGCTTCCCGAT(SEQ ID NO:3),
R:CATAGGGCAAGCAGAAA(SEQ ID NO:4);
UBE2C的检测引物对:
F:AGTTCCTGTCTCTCTGCCA(SEQ ID NO:5),
R:GCTGTAGCCTTTTGCC(SEQ ID NO:6);
AZGP1的检测引物对:
F:CTGGACCGGCAAGA(SEQ ID NO:7),
R:TAGGCCAGGCACTTCAG(SEQ ID NO:8);
IL6ST的检测引物对:
F:GTGACTTTCAAGGGAACTTA(SEQ ID NO:9),
R:CCTTTGGAAGGTGGAGCT(SEQ ID NO:10);
MGP的检测引物对:
F:ATTAACAGGAGAAATGCAA(SEQ ID NO:11),
R:GAGCTCGTGGACAGGCT(SEQ ID NO:12);
RBBP8的检测引物对:
F:AGCAGAGGTTTTCTAAATA(SEQ ID NO:13),
R:AAGTCGTCTTTGGACAGG(SEQ ID NO:14);
STC2的检测引物对:
F:TTGACAAATTTCCCTTAGGA(SEQ ID NO:15),
R:CAGGACGCAGCTTTACCA(SEQ ID NO:16);
CALM2的检测引物对:
F:CGAGCTGAGTGGTTGT(SEQ ID NO:17),
R:GTCAGTTGGTCAGCCATG(SEQ ID NO:18);
OAZ1的检测引物对:
F:GAGCCGACCATGTCTTCA(SEQ ID NO:19),
R:AGCCCAAAAAGCTGAAG(SEQ ID NO:20);
RPL37A的检测引物对:
F:GTTCCTGCATGAAGAC(SEQ ID NO:21),
R:ACAGCGGAAGTGGTATTGTA(SEQ ID NO:22)。
上述试剂盒,11对引物主要用于检测乳腺癌患者特别是其肿瘤组织中11个基因的表达情况,这11个基因包括8个肿瘤相关基因和3个内参基因,其中8个肿瘤相关基因包括:3个增殖相关基因(BIRC5、DHCR7、UBE2C)和5个ER信号/分化相关基因(AZGP1、IL6ST、MGP、RBBP8、STC2)。3个内参基因是CALM2、OAZ1、RPL37A。
优选地,上述乳腺癌转移评估试剂盒,还包括11个目的基因的检测探针,探针核苷酸序列的5’端标记荧光报告基团,3’端标记荧光淬灭基团,探针的核苷酸序列如下:
BIRC5探针:CCAGACTTGGCCCAGTGTT(SEQ ID NO:23);
DHCR7探针:AGCGCCCACCCTCTCG(SEQ ID NO:24);
UBE2C探针:CGGATGGCTTCCCAAA(SEQ ID NO:25);
AZGP1探针:CAGCCACCAGGCCCC(SEQ ID NO:26);
IL6ST探针:GCCTTTATGGATTCAGGGC(SEQ ID NO:27);
MGP探针:TTCATATCCCCTCAGCAGAG(SEQ ID NO:28);
RBBP8探针:CGATTCCGCTACATTCCACCC(SEQ ID NO:29);
STC2探针:CACCTTGACCCTCAGCC(SEQ ID NO:30);
CALM2探针:GCGTCTCGGAAACCGGTA(SEQ ID NO:31);
OAZ1探针:TTCCACAAGAACCGCGAG(SEQ ID NO:32);
RPL37A探针:CTGGCGGTGCCTGGA(SEQ ID NO:33)。
上述设计筛选出最佳的11条探针序列,特异性和灵敏度都非常好,结合探针法对上述11个目的基因表达量进行检测,能够进一步提高检测的特异性及灵敏度。
优选地,上述乳腺癌转移评估试剂盒,所述荧光报告基团为FAM,所述荧光淬灭基团为BHQ1。
优选地,上述乳腺癌转移评估试剂盒,以乳腺癌患者组织中mRNA为检测对象。提取mRNA的试剂可以采用QIAGEN公司的产品FFPEKit。
优选地,上述乳腺癌转移评估试剂盒,所述试剂盒结合乳腺癌患者淋巴结状态和肿瘤大小使用,可以通过多种参数得出EPclin评分,更加准确地判断乳腺癌患者10年远端转移以及复发情况。
优选地,以上任一所述的乳腺癌转移评估试剂盒,还包括PCR反应液,所述PCR反应液包括DNA聚合酶、反转录酶、dNTPs、和Mg2+。通过在反应液中添加DNA聚合酶和反转录酶及相应其他化学成分,使得反转录和DNA扩增一步完成,整个PCR过程可以采用全封闭形式,避免了交叉污染的可能,使结果更加精准。
优选地,上述乳腺癌转移评估试剂盒,其特征在于,还包括UDG酶。加入UDG酶,能够提高PCR准确率,进而提高评估结果的准确率。
本发明提供的乳腺癌转移评估试剂盒,具有如下有益效果:
本发明提供了高特异性和灵敏度的11个目标基因表达检测引物,对乳腺癌相关基因:3个增殖相关基因(BIRC5、DHCR7、UBE2C)和5个ER信号/分化相关基因(AZGP1、IL6ST、MGP、RBBP8、STC2)以及3个内参基因(CALM2、OAZ1、RPL37A)进行表达水平的检测,进而确定出更加适合中国地区检测乳腺癌患者10年内出现的复发以及远端转移的风险评估试剂盒。在分子水平上检测相关肿瘤基因的表达量的同时,进一步通过结合乳腺癌患者的病理信息如淋巴结状态和肿瘤大小来更为精准的评估患者的复发以及远端转移的风险,有利于患者采取相应的治疗措施,避免过度治疗。
本发明试剂盒主要采用Taqman探针检测的手段,设计的探针具有高识别灵敏度以及与序列特异性结合的特性,进而实现目的基因精准有效的检测。本发明的试剂盒,操作简便、易于判读,对仪器的要求不高,并且整个PCR过程采用全封闭形式,避免了交叉污染的可能,使结果更加精准。
附图说明
图1为实施例1的试剂盒检测11个目的基因的PCR扩增结果图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案,下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
配制PCR扩增MIX,具体成分如下表1:
表1 PCR扩增MIX组分及用量
组分 | 一人份加入量(μL) |
DNA聚合酶 | 0.25 |
反转录酶 | 0.25 |
dNTPs | 2 |
Mg2+ | 3~3.5 |
10×DNA聚合酶buffer | 2.5 |
5×反转录酶buffer | 5 |
UDG酶 | 0.1 |
dUTP | 0.01 |
按照SEQ ID NO.1~33制备引物和探针核苷酸序列,并且在每条探针的核苷酸序列5’端标记荧光报告基团FAM,3’端标记荧光淬灭基团BHQ1,配制PCR扩增反应体系,如下表2:
表2、引物探针混合液
表1和表2的试剂分别装在三个试剂管中,组成乳腺癌转移评估试剂盒,可以直接对提取完成的样本进行检测,使检测步骤更为简便。
具体步骤如下:
1)提取乳腺癌患者组织切片(5~10片,厚度5μm左右),采用QIAGEN公司FFPEKit试剂盒提取组织中的mRNA;
2)将提取之后的mRNA进行浓度测定,并将浓度稀释至50ng/μL进行后续的PCR反应过程;
3)反应体系的成分组成:将上述表1和表2的试剂混合,然后加入提取的mRNA,组成PCR扩增反应体系,具体包括dNTPs、Mg2+、DNA聚合酶buffer、反转录buffer、11个基因的引物和探针、DNA聚合酶、反转录酶、UDG酶、dUTP、纯化水,以及mRNA模板。
4)PCR扩增程序如下:
第一扩增阶段:37℃UDG酶反应2min;
第二扩增阶段:50℃反转录20min;
第三扩增阶段:95℃预变性3min;
第四扩增阶段:94℃变性15s,60℃退火延伸35s,45个循环;
信号收集,第四阶段60℃收集FAM信号。
5)结果分析
根据PCR反应结束后,得到的各个基因的Ct值,联合患者相关的病理信息(淋巴结状态、肿瘤大小),得出患者复发以及远端转移的风险评估EPclin。EPclin值<3.3提示复发风险低,EPclin值≥3.3提示复发风险高。
EndoPredict(EPclin)是一种乳腺癌风险预测手段,通过整合8个基因特征(EP评分)以及肿瘤大小和淋巴结状态得出综合预后信息,预测ER+/HER2-乳腺癌患者未来10年远处转移风险。来自英国、德国和奥地利的研究团队分析了风险检测EndoPredict(EPclin),为ER+/HER2-乳腺癌患者提供的10年远处转移风险预后信息(研究结果在线发表于Journalof the National Cancer Institute杂志)。
6)成品试剂盒的性能验证
利用配制完成的成品试剂盒进行产品精密度、稳定性的检测,根据上述设置的条件进行产品性能验证,使用上述提取的样本,根据评分标准计算得出EPclin值。EPclin值<3.3提示复发风险低,EPclin值≥3.3提示复发风险高。成品试剂盒验证结果:产品精密度和产品稳定性检测Ct值的变异系数(CV,100%)≤5%,均满足实验要求。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司
<120> 乳腺癌转移评估试剂盒
<130> P20160145
<160> 33
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aggaaagcgc aaccgg 16
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<400> 3
ctctgcttcc cgat 14
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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agttcctgtc tctctgcca 19
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gctgtagcct tttgcc 16
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gtgactttca agggaactta 20
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<212> DNA
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cctttggaag gtggagct 18
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
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attaacagga gaaatgcaa 19
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<213> 人工序列
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<400> 28
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<212> DNA
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<400> 29
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
ctggcggtgc ctgga 15
Claims (7)
1.乳腺癌转移评估试剂盒,其特征在于,包括BIRC5、DHCR7、UBE2C、AZGP1、IL6ST、MGP、RBBP8、STC2、CALM2、OAZ1和RPL37A共计11个目的基因的特异荧光定量PCR检测引物对,用于检测11个目的基因的表达量,其核苷酸序列如下所示:
BIRC5的检测引物对:
F:CCACTGCCCCACTGA,
R:AGGAAAGCGCAACCGG;
DHCR7的检测引物对:
F:CTCTGCTTCCCGAT,
R:CATAGGGCAAGCAGAAA;
UBE2C的检测引物对:
F:AGTTCCTGTCTCTCTGCCA,
R:GCTGTAGCCTTTTGCC;
AZGP1的检测引物对:
F:CTGGACCGGCAAGA,
R:TAGGCCAGGCACTTCAG;
IL6ST的检测引物对:
F:GTGACTTTCAAGGGAACTTA,
R:CCTTTGGAAGGTGGAGCT;
MGP的检测引物对:
F:ATTAACAGGAGAAATGCAA,
R:GAGCTCGTGGACAGGCT;
RBBP8的检测引物对:
F:AGCAGAGGTTTTCTAAATA,
R:AAGTCGTCTTTGGACAGG;
STC2的检测引物对:
F:TTGACAAATTTCCCTTAGGA,
R:CAGGACGCAGCTTTACCA;
CALM2的检测引物对:
F:CGAGCTGAGTGGTTGT,
R:GTCAGTTGGTCAGCCATG;
OAZ1的检测引物对:
F:GAGCCGACCATGTCTTCA,
R:AGCCCAAAAAGCTGAAG;
RPL37A的检测引物对:
F:GTTCCTGCATGAAGAC,
R:ACAGCGGAAGTGGTATTGTA。
2.根据权利要求1所述的乳腺癌转移评估试剂盒,其特征在于,还包括11个目的基因的检测探针,探针核苷酸序列的5’端标记荧光报告基团,3’端标记荧光淬灭基团,探针的核苷酸序列如下:
BIRC5探针:CCAGACTTGGCCCAGTGTT;
DHCR7探针:AGCGCCCACCCTCTCG;
UBE2C探针:CGGATGGCTTCCCAAA;
AZGP1探针:CAGCCACCAGGCCCC;
IL6ST探针:GCCTTTATGGATTCAGGGC;
MGP探针:TTCATATCCCCTCAGCAGAG;
RBBP8探针:CGATTCCGCTACATTCCACCC;
STC2探针:CACCTTGACCCTCAGCC;
CALM2探针:GCGTCTCGGAAACCGGTA;
OAZ1探针:TTCCACAAGAACCGCGAG;
RPL37A探针:CTGGCGGTGCCTGGA。
3.根据权利要求2所述的乳腺癌转移评估试剂盒,其特征在于,所述荧光报告基团为FAM,所述荧光淬灭基团为BHQ1。
4.根据权利要求1所述的乳腺癌转移评估试剂盒,其特征在于,以乳腺癌患者组织中mRNA为检测对象。
5.根据权利要求1所述的乳腺癌转移评估试剂盒,其特征在于,所述试剂盒结合乳腺癌患者淋巴结状态和肿瘤大小使用。
6.根据权利要求1~5任一所述的乳腺癌转移评估试剂盒,其特征在于,还包括PCR反应液,所述PCR反应液包括DNA聚合酶、反转录酶、dNTPs、dUTP和Mg2+。
7.根据权利要求6所述的乳腺癌转移评估试剂盒,其特征在于,还包括UDG酶。
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