CN105420393A - 检测brca1基因表达的引物、探针及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了检测BRCA1基因表达的引物、探针及试剂盒，该BRCA1基因上下游引物核苷酸序列如SEQ？ID？NO:1～2所示，BRCA1基因Taqman荧光探针核苷酸序列如SEQ？ID？NO:3所示。本发明还公开了由上述引物及探针组成的检测试剂盒，及该试剂盒的使用方法。能检测新鲜冰冻组织、石蜡包埋样本等多种不同形态的样品，均具有较高的灵敏度及特异性，应用范围广、特异性高，试剂盒中使用预混premix，可一步加样，无需将样本与酶混合，操作简便，判定方法更加科学合理，减少实验过程造成的误差，准确度好，本发明的试剂盒检测速度快，2小时内即可获得检测结果。

Description

检测BRCA1基因表达的引物、探针及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术及临床分子诊断技术领域，特别是涉及一种用荧光定量PCR方法快速高效地检测人类BRCA1基因mRNA表达水平的引物、探针及试剂盒。
背景技术
乳腺癌是全球第二大常见恶性肿瘤，在女性恶性肿瘤中居首位。且发生率呈直线上升趋势。5～10％的乳腺癌是因为携带高外显率的乳腺癌易感基因突变所致。其中最常见的易感基因是BRCA1基因。
BRCA1(breastcancelsusceptibilitygene1)基因定位于17q21，约81kb，含有23个外显子。BRCA1作为一种抑癌基因，呈常染色体显性遗传，其表达的蛋白含1863个氨基酸，具有重要的生物学活性，参与细胞周期调控、DNA损伤修复、基因的转录调节，细胞凋亡和泛素化等，当BRCA1基因的表达出现问题时，会导致DNA修复功能障碍、细胞代谢和增殖，最终导致肿瘤的发生。
新辅助化疗是重要的乳腺癌综合治疗手段之一，其中铂类化合物和微管类化疗药以其抗癌谱广、作用强等特点成为最常使用的肿瘤化疗药物。然而铂类化合物和微管类化疗药的疗效存在显著的个体差异。这种差异与乳腺癌组织中BRCA1基因mRNA表达水平密切相关，在乳腺癌细胞株中BRCA1mRNA的表达水平低可增加对铂类药物的敏感性，但对微管药物耐药；而BRCA1的过表达则使损伤的DNA迅速修复，导致瘤细胞对铂类药物耐药，同时却对微管类化疗药敏感。因此研究BRCA1基因的表达水平对铂类化疗药物及抗微管类药物的指导用药具有重大的临床意义。
用于检测BRCA1表达的方法包括蛋白水平的免疫组化和荧光定量PCR法等。其中免疫组化法实验过程较为繁琐，需要的试剂种类繁多，周期长，试验结果主观性高；荧光定量PCR中SYBRGreenⅠ法特异性差，而双探针杂交法成本价格较高。上述现有技术的缺陷均限制了BRCA1表达检测的适用范围。
发明内容
为了解决现有技术中的上述问题，本发明采用实时荧光定量PCR技术结合Taqman探针法用于检测BRCA1基因的表达水平。具体地，本发明提供了检测BRCA1基因表达的引物和探针，包括该探针的检测试剂盒，还提供了该检测试剂盒的使用方法。
本发明提供的检测BRCA1基因表达的引物和探针，包括：
BRCA1基因上游引物：核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，
BRCA1基因下游引物：核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，
BRCA1基因Taqman荧光探针：核苷酸序列如SEQIDNO:3所示，序列5’端标记荧光报告基团，3’端标记淬灭基团。
优选地，上述检测BRCA1基因表达的引物和探针，BRCA1Taqman荧光探针核苷酸序列5’端的荧光报告基团为FAM，3’端的淬灭基团为MGB。
本发明提供的一种检测BRCA1基因表达的试剂盒，包括以上任一所述的检测BRCA1基因表达的引物和探针。
优选地，上述检测BRCA1基因表达的试剂盒，还包括用于检测内参基因B2M表达的引物和探针：
B2M基因上游引物：核苷酸序列如SEQIDNO:4所示，
B2M基因下游引物：核苷酸序列如SEQIDNO:5所示，
B2M基因Taqman荧光探针：核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。当然地，该Taqman探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
选择内参基因是为了校正实验中出现的误差，确保实验结果的正确性。通过实验验证以及软件GeNorm和NormFinder分析发现，B2M较GAPDH及GUSB等为内参的肿瘤和正常组内及组间的表达差异最小。
优选地，上述检测BRCA1基因表达的试剂盒，还包括第一链cDNA合成试剂，荧光定量PCR检测反应液，阳性对照品及阴性对照品；其中阳性对照品为BRCA1基因标准品和B2M基因标准品，阴性对照为DEPC水。其中，BRCA1标准品可以为含有梯度浓度BRCA1基因组质粒DNA的溶液，B2M标准品可以为含有梯度浓度B2M基因组质粒DNA的溶液。
优选地，上述检测BRCA1基因表达的试剂盒，所述第一链cDNA合成试剂包括：反转录酶1～5U、反转录10×RTBuffer适量、dNTPs1～2mM、BRCA1基因反转录引物对1～10pM、内参基因B2M反转录引物对1～10pM，DEPC水适量。
优选地，上述检测BRCA1基因表达的试剂盒，所述荧光定量PCR检测反应液包括：Premix、BRCA1基因上下游引物对1～10pM、BRCA1基因Taqman荧光探针1～10pM、B2M基因上下游引物对1～10pM、B2M基因Taqman荧光探针1～10pM、DEPC水适量；Premix可以促使BRCA1基因和B2M基因的扩增效率都可以达到相近100％。所述Premix包括DNA聚合酶1～2U、2.0～5.0mMMgCl2、0.2～0.8mMdNTPs、10×Buffer、RNaseH。所述Buffer为用于荧光定量PCR反应的缓冲液，现有常规试剂，可以直接购买市售商品或者自行配制。
本发明提供的以上任一所述的检测BRCA1基因表达的试剂盒的使用方法，其包括的步骤如下：
(1)以乳腺癌组织和癌旁正常组织为待检样品，提取待检样品中的RNA，反转录成样品cDNA；
(2)荧光定量PCR：以样品cDNA作为模板，用检测BRCA1基因表达的引物和探针、检测内参基因B2M表达的引物和探针进行荧光定量PCR反应；BRCA1基因标准品与B2M基因标准品及阴性对照品也与样品cDNA同时上机进行相同的操作；同一PCR反应绘制两种标准品的标准曲线；
(3)数据采集和分析：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，分析标准曲线的R2在0.99以上，BRCA1基因和B2M基因扩增效率应在94～100％范围，再根据荧光定量PCR仪器给出的Ct值，按照以下公式进行计算：
△Ct(乳腺癌组织)＝Ct(乳腺癌组织BRCA1基因)-Ct(乳腺癌组织B2M基因)；
△Ct(癌旁正常组织)＝Ct(癌旁正常组织BRCA1基因)-Ct(癌旁正常组织B2M基因)；
△△Ct＝△Ct(乳腺癌组织)-△Ct(癌旁正常组织)
相对表达率＝2-△△Ct；相对表达率＞1判断为乳腺癌BRCA1基因高表达；相对表达率≤1判断为乳腺癌BRCA1基因低表达。
优选地，上述检测BRCA1基因表达的试剂盒的使用方法中，步骤(1)中反转录程序为：50℃，30min；95℃，5min；5℃，5min1个循环。
优选地，上述检测BRCA1基因表达的试剂盒的使用方法中，步骤(2)中荧光定量PCR反应程序为：95℃预变性2min；95℃15s，60℃30s40个循环，当荧光基团选择FAM时在60℃30s时采集荧光信号。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.应用范围广：本发明的引物、探针及由其构成的试剂盒，能检测新鲜冰冻组织、石蜡包埋样本、血液等多种不同形态的样品，均具有较高的灵敏度及特异性，应用范围广。
2.操作简便：本发明的试剂盒中使用预混酶Premix，可一步加样，无需将样本与酶混合，操作简便同时也降低了污染可能性。
3.灵敏度高：本发明可对1ng的样本进行有限扩增，检测结果可信。
4.特异性高：本发明提供的BRCA1基因的上下游引物均为特异性引物，使用Taqman探针法进行定量。靶序列由引物和探针双重控制，具有很高的特异性。
5.准确度好：以正常组织作为定量媒介，同步PCR反应过程，在同等实验条件下的测量实现Ct值相互比较，可以减少实验过程造成的误差，实现荧光定量PCR检测BRCA1基因的mRNA水平检测。
6.快速：本发明的试剂盒检测速度快，可在2小时内完成。
附图说明
图1是阳性对照品B2M基因荧光定量PCR扩增结果标准曲线图；
图2是阳性对照品BRCA1基因荧光定量PCR扩增结果标准曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1：本发明试剂盒的制备
本发明试剂盒组成如下：
(1)第一链cDNA合成体系的配制见表1.
表1
(2)荧光定量PCR反应液配制见表2。
表2
试剂 用量
Premix(自配) 1.5μL
BRCA1基因上下游引物对、B2M基因上下游引物对 每对各1～10pM
BRCA1基因Taqman荧光探针、B2M基因Taqman荧光探针 每条各1～10pM
补DEPC水至 20μL
注：Premix主要成分：DNA聚合酶1～2U、2.0～5.0mMMgCl2、0.2～0.8mMdNTPs、10×Buffer、RNaseH(核糖核酸酶H)。Premix是为了适应BRCA1及B2M引物探针特定自行配制的预混液，可以快速准确地对目的基因进行检测定量；Premix制剂是PCR反应液的混合试剂，操作方便简单避免了PCR操作中混酶过程也相应减少了PCR污染几率；Premix制剂中DNA聚合酶使用了热启动PCR酶可以抑制在低温条件下PCR反应产生的非特异性扩增，再与配套buffer系统相结合，具有高扩增效率，高扩增灵敏度特点；Premix制剂还添加了耐热性的RNaseH,可以最大限度抑制以cDNA作为模板进行PCR反应时，由于cDNA中残存的mRNA对PCR反应造成阻碍。
(3)阳性对照品及阴性对照品：以DEPC水为阴性对照品；BRCA1基因标准品为BRCA1基因的不同浓度质粒DNA溶液：3×105拷贝/微升、6×104拷贝/微升、1.2×104拷贝/微升、2.4×103拷贝/微升、4.8×102拷贝/微升；B2M基因标准品为B2M基因的不同浓度质粒DNA溶液：3×105拷贝/微升、6×104拷贝/微升、1.2×104拷贝/微升、2.4×103拷贝/微升、4.8×102拷贝/微升。
实施例2：用实施例1中制备的试剂盒检测BRCA1mRNA的表达量
本实施例是从我公司60例临床乳腺癌患者的石蜡包埋组织切片中提取RNA，并对其进行定量，作为PCR检测的模板。具体操作步骤参考QIAGENRNeasyFFPEKit石蜡包埋组织RNA抽提试剂盒说明书提取试剂盒，提取样本RNA。提取的RNA经紫外分光光度计算其纯度与浓度定量，用0.1％DEPC水将抽提的RNA稀释至相同浓度，浓度范围10ng/μL。
检测方法如下：
1)根据第一链cDNA合成体系，将RNA反转录为cDNA。第一链反转录程序为：50℃，30min；95℃，5min；5℃，5min1个循环。
2)将60例乳腺癌组织及癌旁正常组织的cDNA10倍稀释置于冰上待用。
3)从试剂盒里面取出BRCA1不同浓度标准品(分别为3×105拷贝/微升、6×104拷贝/微升、1.2×104拷贝/微升、2.4×103拷贝/微升、4.8×102拷贝/微升)，以及B2M不同浓度标准品(3×105拷贝/微升、6×104拷贝/微升、1.2×104拷贝/微升、2.4×103拷贝/微升、4.8×102拷贝/微升)及阴性对照品，震荡离心均匀，置于冰上待用。
4)将标准品、乳腺癌样本cDNA、癌旁正常组织cDNA、阴性对照品分别加入表2所示的荧光定量PCR反应液，反应体系均5μL/孔。
5)荧光定量PCR反应程序：95℃预变性2min；95℃15s，60℃30s40个循环，荧光信号FAM于60℃30s时采集。
6)结果分析：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，分析标准曲线的R2在0.99以上，目的基因和内参基因扩增效率应在94～100％范围，再根据荧光定量PCR仪器给出的Ct值：
△Ct(乳腺癌组织)＝Ct(待检乳腺癌组织样品的BRCA1基因)-Ct(待检乳腺癌组织样品的B2M基因)；
△Ct(癌旁正常组织)＝Ct(待检癌旁正常组织样品的BRCA1基因)-Ct(待检癌旁正常组织样品的B2M基因)；
△△Ct＝△Ct(乳腺癌组织)-△Ct(癌旁正常组织)
相对表达率＝2-△△Ct；相对表达率＞1判断为乳腺癌BRCA1基因高表达；相对表达率≤1判断为乳腺癌BRCA1基因低表达；
60腺癌病例的BRCA1的相对表达量数据结果如下表4：
表4
同时将此60例乳腺癌病样本采用免疫组织化学方法检测，将二者的检测能力进行比较(表5)。从敏感性、特异性及灵敏度上分析，本试剂盒更为精确，符合目前临床诊疗使用要求，并为临床肿瘤的化疗和预后提供了一种快速准确的基因诊断技术。
表5
其中：
特异性：95％；
灵敏度：100％；
阳性预测值：阳性预测值达到97.6％；
阴性预测值：阴性预测值达到100％；
重复性好：多次重复结果一致；
操作简便：一步加样，无需将样本与酶混合，临床样本检测仅需2小时。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
SEQUENCELISTING
<110>武汉海吉力生物科技有限公司
<120>检测BRCA1基因表达的引物、探针及试剂盒
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Claims (10)

1.检测BRCA1基因表达的引物和探针，其特征在于，
BRCA1基因上游引物：核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，
BRCA1基因下游引物：核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，
BRCA1基因Taqman荧光探针：核苷酸序列如SEQIDNO:3所示，序列5’端标记荧光报告基团，3’端标记淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的检测BRCA1基因表达的引物和探针，其特征在于，BRCA1Taqman荧光探针核苷酸序列5’端的荧光报告基团为FAM，3’端的淬灭基团为MGB。
3.一种检测BRCA1基因表达的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的检测BRCA1基因表达的引物和探针。
4.根据权利要求3所述的检测BRCA1基因表达的试剂盒，其特征在于，还包括用于检测内参基因B2M表达的引物和探针：
B2M基因上游引物：核苷酸序列如SEQIDNO:4所示，
B2M基因下游引物：核苷酸序列如SEQIDNO:5所示，
B2M基因Taqman荧光探针：核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。
5.根据权利要求4所述的检测BRCA1基因表达的试剂盒，其特征在于，还包括第一链cDNA合成试剂，荧光定量PCR检测反应液，阳性对照品及阴性对照品；其中阳性对照品为梯度浓度的BRCA1基因标准品和梯度浓度的B2M基因标准品，阴性对照为DEPC水。
6.根据权利要求5所述的检测BRCA1基因表达的试剂盒，其特征在于，所述第一链cDNA合成试剂包括：反转录酶1～5U、反转录10×RTBuffer适量、dNTPs1～2mM、BRCA1基因反转录引物对1～10pM、内参基因B2M反转录引物对1～10pM，DEPC水适量。
7.根据权利要求5所述的检测BRCA1基因表达的试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR检测反应液包括：Premix、BRCA1基因上下游引物对1～10pM、BRCA1基因Taqman荧光探针1～10pM、B2M基因上下游引物对1～10pM、B2M基因Taqman荧光探针1～10pM、DEPC水适量；所述Premix包括DNA聚合酶1～2U、2.0～5.0mMMgCl2、0.2～0.8mMdNTPs、10×Buffer和RNaseH。
8.权利要求5～7任一所述的检测BRCA1基因表达的试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤如下：
(1)以乳腺癌组织和癌旁正常组织为待检样品，提取待检样品中的RNA，反转录成样品cDNA；
(2)荧光定量PCR：以样品cDNA作为模板，用检测BRCA1基因表达的引物和探针、检测内参基因B2M表达的引物和探针进行荧光定量PCR反应；BRCA1基因标准品与B2M基因标准品及阴性对照品也与样品cDNA同时上机进行相同的操作；同一PCR反应绘制两种标准品的标准曲线；
(3)数据采集和分析：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，分析标准曲线的R2在0.99以上，BRCA1基因和B2M基因扩增效率应在94～100％范围，再根据荧光定量PCR仪器给出的Ct值，按照以下公式进行计算：
△Ct(乳腺癌组织)＝Ct(乳腺癌组织BRCA1基因)-Ct(乳腺癌组织B2M基因)；
△Ct(癌旁正常组织)＝Ct(癌旁正常组织BRCA1基因)-Ct(癌旁正常组织B2M基因)；
△△Ct＝△Ct(乳腺癌组织)-△Ct(癌旁正常组织)
相对表达率＝2-△△Ct；相对表达率＞1判断为乳腺癌BRCA1基因高表达；相对表达率≤1判断为乳腺癌BRCA1基因低表达。
9.根据权利要求8所述的检测BRCA1基因表达的试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤(1)中反转录程序为：50℃，30min；95℃，5min；5℃，5min1个循环。
10.根据权利要求8所述的检测BRCA1基因表达的试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤(2)中荧光定量PCR反应程序为：95℃预变性2min；95℃15s，60℃30s40个循环，当荧光基团选择FAM时在60℃30s时采集荧光信号。
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