CN106319062B - 一种用于甲状腺癌辅助诊断或疗效预测的微创试剂盒 - Google Patents

一种用于甲状腺癌辅助诊断或疗效预测的微创试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于甲状腺癌辅助诊断或疗效预测的微创试剂盒，包括实时荧光定量PCR试剂，所述实时荧光定量PCR试剂中包含用于检测lncRNA‑NR_001434的特异性引物，所述LncRNA‑NR_001434对应的cDNA序列为如SEQ ID NO:1所示序列。本发明所述试剂盒通过检测甲状腺组织中LncRNA NR_001434的表达水平，对甲状腺癌高危人群(如职业暴露电离辐射人群)的甲状腺癌筛查、早期诊断或者甲状腺癌患者的预后都具有相当准确的结果。本发明为甲状腺癌的辅助诊断和预后提供了强有力的分子生物学工具，具有深远的临床意义和推广性。

Description

一种用于甲状腺癌辅助诊断或疗效预测的微创试剂盒
技术领域
本发明涉及医学诊断试剂盒领域，具体涉及一种用于甲状腺癌辅助诊断或疗效预测的微创试剂盒。
背景技术
甲状腺癌(Thyroid Carcinoma，TC)是人类内分泌系统最常见的恶性肿瘤，约占所有内分泌肿瘤的94.5％和全身恶性肿瘤发病总数的3％。近年来TC的发病率以每年4％的增幅迅猛上升。2012年，美国约有43000多名女性和13000多名男性确诊为TC，TC发病率升高了3倍，已从20年前的第13位，上升至2010年女性恶性肿瘤发病率的第5位。据美国国家癌症研究所(National Cancer Institute)的数据统计，2009年，全球TC的发病率约为14.4/10万，根据2009-2011年的流行病学统计数据计算，约有1.1％的男性和女性会在一生中的某个阶段被诊断患有TC。在亚洲，韩国学者调查发现，TC成为韩国女性恶性肿瘤发病之首，发病率已超过乳腺癌。近年来，我国TC的发病率呈明显上升趋势，22年期间中国TC发病率增长了2.36倍，平均年增幅5.92％。TC不仅是对患者的身心伤害，患者家庭的精神和经济负担，也给国家和社会带来巨大的劳动力和经济的损失。TC是目前上升最快的常见肿瘤，世界各国高度重视，寻找新的候选标志物、研究TC形成、发展的调控机制以期达到提高TC的早期干预、早期治疗水平是我国乃至世界迫切的需求。
长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)，它是一类能在多种生物学过程中发挥调控作用的大分子ncRNA。其分布广泛，长度一般多于200个碱基，由于缺少有效开放阅读框(ORF)而无或很少有编码蛋白的能力。作为分子生物学中的一个全新领域，lncRNA是以RNA的形式在多个层面上发挥调控基因表达的作用，主要是从三个层面，分别是表观遗传调控、转录调控以及转录后调控。作为哺乳动物转录组的重要组成部分，lncRNA的功能目前还有待于深入研究。起初lncRNA被认为是RNA聚合酶Ⅱ转录的副产物，是基因组转录的“噪音”，不具有生物功能。但近年来的研究结果显示，越来越多的证据表明lncRNA在细胞正常生理活性中的重要作用以及参与到多种肿瘤和其他疾病的发生发展。lncRNA的作用机制主要有以下八点：(1)在编码蛋白基因的上游启动子区(橘色)转录，从而干扰邻近蛋白编码基因(蓝色)的表达(如酵母SER3基因)；(2)抑制RNA聚合酶Ⅱ，或介导染色质重构和组蛋白修饰，而影响基因(蓝色)表达；(3)lncRNA(紫色)与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，干扰mRNA的剪切，进而产生不同的剪切形式；(4)lncRNA(紫色)与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，在Dicer酶作用下产生内源性的siRNA，调控基因的表达水平；(5)lncRNA(绿色)结合在特定蛋白质上调节相应蛋白的活性；(6)作为结构组分与蛋白质形成核酸蛋白质复合体；(7)结合在特定蛋白上从而改变该蛋白的胞质定位；(8)可作为小分子RNA(如miRNA)的前体分子。
目前研究成果所展现出的lncRNA已有的分子生物学功能为全世界打开了一扇通往神秘生物科学领域的窗户。我们渴求了解TC发生、发展的lncRNA的具体调节功能。本发明通过lncRNA芯片技术寻找在甲状腺癌组织中异常表达的lncRNA，以期为甲状腺癌的诊断、预后判断发掘新的生物标志物，以及为甲状腺癌的治疗提供突破点。
发明内容
本发明的目的是提供一种在甲状腺癌组织中表达显著上调的长链非编码RNA及其应用。本发明提供的长链非编码RNA lncRNA-NR_001434核苷酸序列，是与人类甲状腺癌发生密切相关的长链非编码RNA。
因此，本发明首先提供一种用于甲状腺癌辅助诊断或疗效预测的微创试剂盒，包括实时荧光定量PCR试剂，所述实时荧光定量PCR试剂中包含用于检测lncRNA-NR_001434的特异性引物，所述LncRNA-NR_001434对应的cDNA序列为如SEQ ID NO:1所示序列。
在一种具体的实施方式中，所述试剂盒包括用于从甲状腺组织中提取总RNA的RNA提取试剂、用于以总RNA为模板将LncRNA-NR_001434逆转录为cDNA所用的逆转录试剂、以及将所述cDNA实时荧光定量PCR所用的实时荧光定量PCR试剂。
本发明所述试剂盒用于甲状腺癌辅助诊断时，一般用于对职业暴露电离辐射群体(如医院放射科工作人员和核电站工作人员)进行普遍筛查，职业暴露电离辐射使得这样的人群比较容易患甲状腺癌，本发明所述试剂盒可以对其进行普遍筛查，检测时只需取待检测人员少量的甲状腺组织，创性小。
在一种具体的实施方式中，所述RNA提取试剂包括RNA稳定溶液、Trizol试剂、三氯甲烷、异丙醇和无酶水，所述逆转录试剂包括逆转录缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、RNA酶抑制剂以及MMLV逆转录酶，所述实时荧光定量PCR试剂包括所述特异性引物、U6snRNA内参特异性PCR引物、实时荧光定量SYBR染料和无酶水；所述U6snRNA内参特异性PCR引物的正向引物为5′-AAGCACGGACTGAACGAGAG-3′，反向引物为5′-TGCTGTTCATACCCGCAGAG-3′。
在一种具体的实施方式中，所述逆转录试剂中还包括LncRNA NR_001434逆转录所用的随机引物。
在一种具体的实施方式中，所述特异性引物包括正向引物和反向引物，其中LncRNA-NR_001434正向引物为：5′-TTGACCCTTCCAGCTTCC-3′，LncRNA-NR_001434反向引物为：5′-CCATCCGCACATCACAAT-3′。
本发明还提供一种长链非编码RNA在用于甲状腺癌辅助诊断或疗效预测中的应用。在一种具体的实施方式中，所述长链非编码RNA为LncRNA-NR_001434。
本发明还提供一种用于甲状腺癌的诊断或预后判断的生物标志物，所述生物标志物为LncRNA NR_001434，所述生物标志物的cDNA序列为如SEQ ID NO:1所示序列。
本发明所述试剂盒通过检测甲状腺组织中LncRNA NR_001434的表达水平，对甲状腺癌高危人群(如职业暴露电离辐射人群)的甲状腺癌筛查、早期诊断或者甲状腺癌患者的预后都具有相当准确的结果。本发明为甲状腺癌的辅助诊断和预后提供了强有力的分子生物学工具，具有深远的临床意义和推广性。
附图说明
图1为抽提的总RNA电泳图，
图2为核心质控标准B2Oligo强阳性杂交芯片扫描图。
图3为参考质控标准示意图。
图4为芯片平均信号值与背景平均信号值示意图。
图5为检出率示意图。
图6为芯片原始结果图。
图7为芯片数据分析结果图，即lncRNA的表达谱。
图8为在甲状腺癌组织和癌旁组织中lncRNA-NR_001434的相对表达量。
图9a为甲状腺癌组织中lncRNA-NR_001434低表达组和高表达组的术后总生存时间和累积生存率关系图，图9b为甲状腺癌组织中lncRNA-NR_001434低表达组和高表达组的术后无瘤生存时间和累积生存率关系图。
图10为受试者工作特征曲线ROC分析结果图。
具体实施方式
本发明的临床组织标本均来自2013年11月至2015年6月于中南大学附属肿瘤医院核素治疗的甲状腺癌患者，每对标本包含手术切除的甲状腺癌组织和配对的癌旁组织。所有标本的使用均由患者或其委托人签署知情同意书，得到了中南大学附属肿瘤医院伦理委员会批准。
本发明中，所述随机引物是指在对模板顺序不清楚的情况下，通过随意设计或选择一个非特异性引物，引物的一部分特别是3’端有3-4个以上碱基与模板互补复性，可使引物延伸。
一.LncRNA基因序列
本发明所述LncRNA基因即LncRNA NR_001434序列对应的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
手术中切除甲状腺癌和癌旁组织样本，基因表达谱芯片检测发现大量lncRNA差异性表达，其中LncRNA NR_001434在癌组织中低表达，为了进一步验证芯片检测结果，在甲状腺癌和癌旁组织样本抽提RNA后逆转录，通过实时荧光定量PCR检测lncRNA-NR_001434在60对甲状腺癌、癌旁组织中的表达量，结果表明其在甲状腺癌组织中表达量明显低于癌旁组织，提示其可能具有抑制甲状腺癌发生发展的作用，这在国内外尚属首次报道。进一步研究发现甲状腺癌组织中lncRNA-NR_001434较低表达的患者中，他们的肿瘤包膜更不完整，血甲胎蛋白值更高，这些提示我们lncRNA-NR_001434可能参与调控甲状腺癌细胞分化，这为我们下一步揭示lncRNA-NR_001434对甲状腺癌细胞的具体调控功能及机制打下基础。分析预后结果显示甲状腺癌组织中lncRNA-NR_001434表达水平与甲状腺癌患者术后预后(疗效预测)明显相关，这提示我们可以用lncRNA-NR_001434预测甲状腺癌患者术后预后情况。在临床工作中我们将lncRNA-NR_001434制备成试剂盒，在职业暴露电离辐射的甲状腺癌患者手术后，检测组织标本中lncRNA-NR_001434的表达含量，对lncRNA-NR_001434低表达的患者进行定期检查，定期随访，监测甲状腺癌复发的情况。必要时予加强术后辅助治疗。本发明为甲状腺癌的辅助诊断和预后提供了强有力的分子生物学工具，具有深远的临床意义和推广性。
二.LncRNA及基因表达谱芯片检测
基因芯片规格：Affymetrix GeneChip Human Transcriptome Array 2.0
1.样本RNA抽提
2.样本RNA质量检测，总RNA>1ug，
上样于1％琼脂糖凝胶孔中，120V电压5分钟。
紫外透射光下观察并拍照，相关说明如下：
图1为抽提的总RNA电泳图。从图1可见，28S和18S核糖体RNA条带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种类型)，在加样孔位于图片上方的看图模式下，上面一条带(28S)的密度大约是下面一条带(18S)的2倍。下方还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖体RNA等)组成。在28S和18S核糖体带之间一般可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，此时最好需要对总RNA进行纯化。RNA的降解则表现为核糖体RNA带的弥散。3.cDNA合成
4.正义链cDNA片段化
5.生物素标记
6.芯片杂交
7.芯片洗脱
8.芯片扫描
9.检测信号值过滤去除低于背景的弱信号值
10结果
在上述步骤和过程中，图2为核心质控标准B2Oligo强阳性杂交芯片扫描图。从所有芯片扫描图上都可以看到如图2所示的芯片阵列名以及角落的黑白棋盘状图案，表示B2Oligo强阳性杂交质控合格。图3为参考质控标准示意图。从图3中可见，杂交探针结果为BioB＜Bio C＜Bio D＜Cre，表示杂交质控合格。图4为芯片平均信号值与背景平均信号值示意图。从图4可见，部分芯片的信号值低于背景值，这可能是由于背景探针和完美匹配的探针之间GC含量有很大的不同。图5为检出率示意图。从图5可见，检出率大于30％，说明检出率正常。图6为芯片原始结果图。图7为芯片数据分析结果图，即lncRNA的表达谱。从图7的彩色图片可知，通过聚类分析不同LncRNA的表达情况，红色的显示高表达的LncRNA，绿色的部分显示的是低表达的LncRNA。本发明中涉及的lncRNA-NR_001434通过聚类分析显示是低表达的lncRNA。
三、荧光实时定量PCR
材料和方法：
1.总RNA抽提及反转录
按产品说明书所述，使用Takara公司的Trizol抽提组织样本的总RNA并用NanoDrop2000超微量分光光度计测定其浓度、纯度。吸取1μg的RNA，按照RNA反转录试剂M-MLV Reverse Transcriptase Kit说明书所述加入各试剂，使用VeritiTM96孔热循环仪进行反转录。反应参数：65℃5min；37℃2min；25℃10min，37℃50min，70℃15min。
2.实时荧光定量PCR检测lncRNA-NR_001434的表达
根据GenBank中lncRNA-NR_001434、β-Actin的碱基序列，应用Primer Premier5.0软件设计引物。qRT-PCR的反应体系为20μL，包括2×SYBR Green mix 10μL，ddH2O 8μL，20×相应引物1μL，cDNA 1μL。使用StepOnePlusTM实时荧光定量PCR系统进行实时荧光定量PCR，反应参数：95℃10min；95℃15s，60℃15s，72℃20s，共40个循环。结果用2-△△Ct法分析计算。
3.结果
图8为在甲状腺癌组织和癌旁组织中lncRNA-NR_001434的相对表达量。从图8可见，与甲状腺癌旁组织相比，lncRNA-NR_001434在甲状腺癌组织中表达下调(P<0.001)，这说明lncRNA-NR_001434可能是甲状腺癌发生发展的重要调控因子，可能具有抑制甲状腺癌发生发展的作用。这在国内外尚属首次报道。
四、lncRNA-NR_001434在甲状腺癌中的表达与临床病理指标的相关性
以lncRNA-NR_001434在60例甲状腺癌组织中的相对表达量(2-△△Ct)的中位值为界，将lncRNA-NR_001434的在甲状腺癌组织中表达量分为低表达(n＝29例)、高表达(n＝31例)、lncRNA-NR_001434的表达水平与甲状腺癌分化分级(P＝0.022)、肿瘤包膜完整与否(P＝0.005)、肿瘤直径明显相关。与性别、年龄、有无子灶无关。
五、lncRNA-NR_001434在甲状腺癌组织中的表达与甲状腺癌患者术后无瘤生存期及总体生存期的关系
分别绘制lncRNA-NR_001434低表达组和高表达组的Kaplan-Meier曲线并进行Log-rank检验，结果显示甲状腺癌组织中lncRNA-NR_001434低表达患者甲状腺癌切除术后预后明显较差，表现为术后无瘤生存期(P＝0.0025)及总体生存期(P＝0.0011)均显著缩短。图9a为甲状腺癌组织中lncRNA-NR_001434低表达组和高表达组的术后总生存时间和累积生存率关系图，图9b为甲状腺癌组织中lncRNA-NR_001434低表达组和高表达组的术后无瘤生存时间和累积生存率关系图。
六、职业暴露电离辐射甲状腺癌患者术后复发、生存的单因素分析
职业暴露电离辐射甲状腺癌患者术后复发、生存的单因素分析，结果如表1。
表1 甲状腺癌患者术后预后的单因素分析
Figure BDA0001112990860000071
将单因素分析中有统计学意义的指标：lncRNA-NR_001434、肿瘤直径(厘米)、完整包膜、血甲胎蛋白纳入进行多因素COX回归分析，结果如表2。从表2可见，甲状腺癌组织lncRNA-NR_001434低表达、肿瘤直径＞3cm、无完整包膜是影响甲状腺癌患者术后无瘤生存期的独立危险因素，甲状腺癌组织lncRNA-NR_001434低表达、肿瘤直径＞3cm、血AFP＞20μg/L是影响甲状腺癌患者术后总体生存期的独立危险因素。
表2 甲状腺癌患者术后预后的多因素分析
Figure BDA0001112990860000072
七、受试者工作特征曲线(ROC)分析结果。
图10为受试者工作特征曲线ROC分析结果图。图10中，纵坐标为灵敏度，横坐标为假阳性率(1-特异度))。ROC曲线越靠近左上角，试验的准确性就越高。最靠近左上角的ROC曲线的点是错误最少的最好阈值，其假阳性和假阴性的总数最少。图10结果显示本次实验检测显示lncRNA-NR_001434的表达，其灵敏度可达到76％，假阳性率为0.1。ROC曲线下的面积值在1.0和0.5之间。曲线下面积越接近于1，说明诊断效果越好。本实验曲线下面积接近1，说明lncRNA-NR_001434的表达的实验可用于区分甲状腺癌和癌旁组织，从而可以用于甲状腺癌的辅助诊断，具有较高的灵敏度和特异性。
综上所述，本发明所述试剂盒通过检测甲状腺组织中LncRNA NR_001434的表达水平，对甲状腺癌高危人群(如职业暴露电离辐射人群)的甲状腺癌筛查、早期诊断或者甲状腺癌患者的预后都具有相当准确的结果。本发明中，先在甲状腺癌患者甲状腺癌组织中提取RNA，逆转录并进行实时荧光定量分析发现LncRNA NR_001434表达水平下调。本发明所述试剂盒利用甲状腺癌组织来源的LncRNA NR_001434对甲状腺癌早期诊断的特异性可达85.7％，灵敏度达到76％。通过检测职业暴露电离辐射甲状腺癌患者甲状腺癌组织中LncRNA NR_001434的表达水平，从而对患者的预后做出早期、快速的诊断。
也就是说，本发明提供一种用于甲状腺癌辅助诊断或疗效预测的试剂盒。所述试剂盒在用于对高危群体进行甲状腺癌筛查时，用微创法进行甲状腺组织低剂量活检，若发现某待测者的甲状腺组织中LncRNA NR_001434的表达水平明显较低，则说明该待测者患甲状腺癌的风险高。则可建议该待测者进一步确诊(如取大量组织做病理切片)是否已经罹患甲状腺癌。尽早发现甲状腺癌的存在，就可以早干预早治疗，起到更好的效果。而使用所述试剂盒对手术后的甲状腺癌患者做预后判断时，若发现某患者的甲状腺癌组织中LncRNANR_001434的表达水平明显较低，则说明该患者的预后生存率情况较差。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure IDA0001112990930000011
Figure IDA0001112990930000021
Figure IDA0001112990930000031

Claims (1)

1.一种检测长链非编码RNA的试剂在制备用于甲状腺癌辅助诊断或疗效预测的微创试剂盒中的应用，其特征在于，所述长链非编码RNA为LncRNA-NR_001434，且对应的cDNA序列为如SEQ ID NO:1所示序列；所述微创试剂盒包括：
RNA提取试剂，包括RNA稳定溶液、Trizol试剂、三氯甲烷、异丙醇和无酶水，用于从甲状腺组织中提取总RNA；
逆转录试剂，包括逆转录缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶以及用于LncRNA NR_001434逆转录的随机引物，用于以总RNA为模板将LncRNA-NR_001434逆转录为cDNA；
实时荧光定量PCR试剂，包括用于检测LncRNA-NR_001434的特异性引物，U6snRNA内参特异性PCR引物、实时荧光定量SYBR染料和无酶水，用于实现cDNA的实时荧光定量PCR。
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