CN113278700B - 一种用于乳腺癌分型及预后预测的引物组及试剂盒 - Google Patents

一种用于乳腺癌分型及预后预测的引物组及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于乳腺癌分型及预后预测的引物组及试剂盒，属于生物医学检测领域，该引物组包括基因ESR1、PGR、ERBB2及管家基因ACTB、RPLPO和TFRC的6对引物，引物组的序列如序列表SEQ ID NO:1‑12所示。本发明提供的一种用于乳腺癌分型及预后预测的引物组及试剂盒具有操作简便、快速高效，对乳腺癌分型及预后的判断的可重复性高、实用性高、易于标准化的优点。

Description

一种用于乳腺癌分型及预后预测的引物组及试剂盒
技术领域
本发明属于生物医学检测领域，具体涉及一种用于乳腺癌分型及预后预测的引物组及试剂盒。
背景技术
乳腺癌是女性中最常见的癌症，也是导致癌症死亡的主要原因。2016年，约有170万例乳腺癌病例。ER(雌激素受体)，PR(孕激素受体)和HER2(人类表皮生长因子受体2)代表了肿瘤增长和乳腺癌细胞增殖的关键途径。最近，基于这三种蛋白质分子的生物学复杂性，建立了乳腺癌的分子分型，包括管腔型(ER/PR阳性，HER2阴性)，HER2型(任何ER，任何PR，HER2阳性)，三阴性型(ER、PR和HER2均阴性)。
切除肿瘤的手术通常是乳腺癌的第一线治疗方法。为了降低复发风险，患者可以考虑辅助治疗，包括分别针对管腔型和HER2型的患者的激素治疗和HER2靶向治疗。因此，正确识别不同亚型对于乳腺癌的治疗至关重要。传统上，肿瘤学家通过免疫组化(IHC)来评估肿瘤细胞的蛋白水平来鉴定这一重要的临床病理信息。尽管IHC相对容易进行，但可能是由于在采样过程中以及对染色水平评分的人工解释中方法的主观性，IHC方法存在重现性问题。因此，分子分型可能会被错误地识别，尤其是在小批量实验室中。
另外，最近有报道称，基因组检测可以确定乳腺癌中ER(ESR1)，PR(PGR)和HER2(ERBB2)的状态。与IHC测定的蛋白质水平相比，基因表达(mRNA)水平由基因组方法测定，包括荧光定量逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)法。由于采样过程更均质，无需人工干预即可通过仪器进行自动定量，使得该方法客观性增强，提高了基因组方法的可重复性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于乳腺癌分型及预后预测的引物组及试剂盒，使用该引物组能够简便高效、灵敏、快速的检测乳腺癌分型及预后基因ESR1、PGR、ERR2的水平，准确判定预后基因状态，对于乳腺癌分型及预后的判断更具可重复性，并且更易于标准化，实用性高，能够更好为乳腺癌精准个体化治疗方案提供重要临床依据。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
提供一种用于乳腺癌分型及预后预测的引物组，上述引物组包括预后基因和管家基因的6对引物，引物组的序列如序列表SEQ ID NO:1-12所示。
在一些实施方式中，上述预后基因包括ESR1，PGR，ERBB2。
在一些实施方式中，上述管家基因包括ACTB，RPLPO和TFRC。
在一些实施方式中，上述基因ESR1的引物对由引物ESR1-F和引物ESR1-R组成，上述引物ESR1-F的序列为SEQ ID NO.1，上述引物ESR1-R的序列为SEQ ID NO.2；
上述基因PGR的引物对由引物PGR-F和引物PGR-R组成，上述引物PGR-F的序列为SEQ ID NO.3，上述引物PGR-R的序列为SEQ ID NO.4；
上述基因ERBB2的引物对由引物ERBB2-F和引物ERBB2-R组成，上述引物ERBB2-F的序列为SEQ ID NO.5，上述引物ERBB2-R的序列为SEQ ID NO.6；
上述基因ACTB的引物对Ⅳ由引物ACTB-F和引物ACTB-R组成，上述引物ACTB-F的序列为SEQ ID NO.7，上述引物ACTB-R的序列为SEQ ID NO.8；
上述基因RPLPO的引物对由引物RPLPO-F和引物RPLPO-R组成，上述引物RPLPO-F的序列为SEQ ID NO.9，上述引物RPLPO-R的序列为SEQ ID NO.10；
上述基因TFRC的引物对由引物TFRC-F和引物TFRC-R组成，上述引物TFRC-F的序列为SEQ ID NO.11，上述引物TFRC-R的序列为SEQ ID NO.12。
提供一种用于乳腺癌分型及预后预测的试剂盒，上述试剂盒包括上述的引物组、PCR反应缓冲液、RNA提取试剂。
在一些实施方式中，上述试剂盒的RNA提取样本为福尔马林固定-石蜡包埋(FFPE)乳腺癌病理组织。
提供一种用于乳腺癌分型及预后预测的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
1)提取待测样本的RNA；
2)第一链cDNA的合成；
3)荧光定量PCR反应：分别对基因ESR1、PGR、ERBB2、ACTB、RPLPO、TFRC进行荧光定量PCR反应。
在一些实施方式中，上述基因ESR1进行荧光定量PCR反应的引物对由引物ESR1-F和引物ESR1-R组成，上述引物ESR1-F的序列为SEQ ID NO.1，上述引物ESR1-R的序列为SEQID NO.2；
上述基因PGR进行荧光定量PCR反应的引物对由引物PGR-F和引物PGR-R组成，上述引物PGR-F的序列为SEQ ID NO.3，上述引物PGR-R的序列为SEQ ID NO.4；
上述基因ERBB2进行荧光定量PCR反应的引物对由引物ERBB2-F和引物ERBB2-R组成，上述引物ERBB2-F的序列为SEQ ID NO.5，上述引物ERBB2-R的序列为SEQ ID NO.6；
上述基因ACTB进行荧光定量PCR反应的引物对由引物ACTB-F和引物ACTB-R组成，上述引物ACTB-F的序列为SEQ ID NO.7，上述引物ACTB-R的序列为SEQ ID NO.8；
上述基因RPLPO进行荧光定量PCR反应的引物对由引物RPLPO-F和引物RPLPO-R组成，上述引物RPLPO-F的序列为SEQ ID NO.9，上述引物RPLPO-R的序列为SEQ ID NO.10；
上述基因TFRC进行荧光定量PCR反应的引物对由引物TFRC-F和引物TFRC-R组成，上述引物TFRC-F的序列为SEQ ID NO.11，上述引物TFRC-R的序列为SEQ ID NO.12。
在一些实施方式中，上述待测样本为FFPE乳腺癌病理组织。
在一些实施方式中，上述步骤1)具体包括：
a、FFPE乳腺癌病理组织的切片及脱蜡；
b、RNA提取：脱蜡处理后的组织块浸没在蛋白酶K消化液中，匀浆后，50-60℃孵育1-2h，后加入水饱和酚、氯仿、异戊醇进行抽提，再用75-78v/v％乙醇沉淀，自然干燥5-10min，加入去RNA酶水溶解RNA。
在一些实施方式中，上述步骤a具体包含：切片：用切片刀将FFPE乳腺癌病理组织(以下简称FFPE组织)切成5-10μm厚切片；脱蜡：用分析纯二甲苯浸没组织切片，涡旋加热使组织溶解，待5-10min溶液透明澄清后离心弃去上清液；脱二甲苯：加入无水乙醇，涡旋振荡充分溶解后，离心去上清，重复1-2次；干燥：组织沉淀物经自然干燥蒸发残留的乙醇。
在一些实施方式中，上述步骤b中水饱和酚、氯仿、异戊醇的体积比为23-25:22-24:1。
在一些实施方式中，上述步骤b中蛋白酶K消化液每毫升包括195-205mmol/LTris-HCl，195-205mmol/L NaCl，1.3-1.6mmol/L MgCl2，1.8-2.1％(g/mL)SDS，蛋白酶K750-850μg，pH7.5-7.6。
提供一种用于乳腺癌分型及预后的基因的评价系统，该评价系统对乳腺癌患者的三种预后基因ESR1，PGR，ERBB2进行荧光定量RT-PCR测定的荧光值，使用管家基因ACTB，RPLPO和TFRC进行归一化之后，通过使用专有算法分别获得基因ESR1，PGR，ERBB2的比率，以比率的log2值获得的分数建立模型；以IHC结果为金标准，分别对上述三种预后基因中每一种预后基因的荧光定量RT-PCR检测进行受试者工作特征曲线(ROC)分析；分别测试三种预后基因获得的分数，通过相应的曲线下最高面积(AUC)-受试者工作特征曲线(ROC)获得的临界值，判定基因ESR1，PGR和ERBB2的状态，将样本病例进行乳腺癌分子分型，用于判断预后。
在一些实施方式中，上述荧光定量RT-PCR过程所使用的预后基因ESR1，PGR，ERBB2及管家基因ACTB，RPLPO和TFRC的引物的序列如序列表SEQ ID NO:1-12所示。
在一些实施方式中，上述专有算法的公式为：ΔCt＝25–Ct(预后基因)+[Ct(ACTB)+Ct(RPLP0)+Ct(TFRC)]/3。
在一些实施方式中，上述荧光定量RT-PCR的步骤包括：取待测标本进行RNA抽提；第一链cDNA的合成；荧光定量PCR反应。
在一些实施方式中，上述待测标本为FFPE组织。
在一些实施方式中，上述待测标本进行RNA抽提的步骤具体包含：
FFPE组织的切片及脱蜡：用切片刀将FFPE组织切成5-10μm厚切片；脱蜡：用分析纯二甲苯浸没组织切片，涡旋加热使组织溶解，待5-10min溶液透明澄清后离心弃去上清液；脱二甲苯：加入无水乙醇，涡旋振荡充分溶解后，离心去上清，重复1-2次；干燥：组织沉淀物经自然干燥蒸发残留的乙醇；
RNA提取：脱蜡处理后的组织块浸没在蛋白酶K消化液中，匀浆后，50-60℃孵育1-2h，后加入水饱和酚、氯仿、异戊醇进行抽提，优选地，水饱和酚、氯仿、异戊醇的体积比为23-25:22-24:1，再用75-78v/v％乙醇沉淀，自然干燥5-10min，加入去RNA酶水溶解RNA。
在一些实施方式中，上述蛋白酶K消化液每毫升包括195-205mmol/L Tris-HCl，195-205mmol/L NaCl，1.3-1.6mmol/L MgCl2，1.8-2.1％(g/mL)SDS，蛋白酶K 750-850μg，pH7.5-7.6。
在一些实施方式中，上述乳腺癌分子分型分为3种亚型，包括管腔型(ER/PR阳性，HER2阴性)，HER2型(任何ER，任何PR，HER2阳性)，三阴性型(ER、PR和HER2均阴性)。
本发明的有益效果为：
本发明通过提供用于乳腺癌分型及预后预测的引物组，能够简便、准确、快速检测ESR1，PGR，ERBB2基因的mRNA的表达量，进而能够准确判定基因ESR1，PGR，ERBB2的状态，对乳腺癌进行分子分型，从而对中国人群的乳腺癌患者在手术后5年内复发和不复发的情况进行准确预后和分类，对于预后的判断与临床诊断的金标准免疫组化进行对比，与免疫组化准确性相当；同时常规的免疫组化由于选择检查区域和评估染色水平比较主观，从而导致不同病理学家和实验室之间的错误识别或低重复性，通过IHC方法进行亚型分析可能会容易出错，荧光定量RT-PCR法利用整个肿瘤组织进行检测，并通过自动化仪器测量反应水平，方法较为客观，对于预后的判断更具可重复性，并且更易于标准化，能够更好为乳腺癌精准个体化治疗方案提供重要临床依据。
因此，本发明是一种操作简便、快速高效，对乳腺癌分型及预后的判断的可重复性高、实用性高、易于标准化的用于乳腺癌分型及预后预测的引物组及试剂盒。
附图说明
图1A为本发明实施例2中训练集(n＝112)中ESR1的RT-PCR得分分布；图1B为本发明实施例2中ESR1的RT-PCR分数与IHC方法判定的ER状态之间的散点图；
图2A为本发明实施例2中训练集(n＝112)中PGR的RT-PCR得分分布；图2B为本发明实施例2中训练集(n＝112)中PGR的RT-PCR分数与IHC方法判定的PR状态之间的散点图；
图3A为本发明实施例2中训练集(n＝112)中ERBB2的RT-PCR得分分布；图3B为本发明实施例2中训练集(n＝112)中ERBB2的RT-PCR分数与IHC方法判定的HER2状态之间的散点图；
图4为本发明实施例2中不同基因表达的分数与基于IHC判定的阳性及阴性病例，其中，A为ESR1基因，B为PGR基因，C为ERBB2基因；
图5为本发明实施例2中基于IHC进行分子分型的亚型中，乳腺癌患者的预估RFS的Kaplan-Meier曲线；
图6为本发明实施例2中基于mRNA进行分子分型的亚型中，乳腺癌患者的预估RFS的Kaplan-Meier曲线；
图7为本发明试验例1中RNA纯度的测定结果；
图8为本发明试验例1中RNA浓度的测定结果；
图9为本发明试验例1中RNA的电泳图；
图10为本发明试验例1中基因ESR1、PGR、ERBB2、ACTB、RPLPO和TFR RT-PCR的扩增效率的测定结果。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：
实施例1：
本实施例提供乳腺癌分型及预后基因的荧光定量RT-PCR检测方法。
1.1 乳腺癌分型及预后基因的荧光定量RT-PCR检测所用引物包括三种乳腺癌分型及预后基因及三种管家基因的荧光定量RT-PCR引物，三种乳腺癌分型及预后基因包括基因ESR1、PGR、ERBB2，三种管家基因包括基因ACTB、RPLPO和TFRC，ESR1、PGR、ERBB2和管家基因的引物序列见表1。
表1.ESR1、PGR、ERBB2和管家基因的引物序列
Figure BDA0003101306320000061
1.2 取待测标本进行RNA抽提：
1.2.1 FFPE乳腺癌病理组织的切片及脱蜡：用切片刀将待测FFPE乳腺癌病理组织切成5-10μm厚切片；脱蜡：用分析纯二甲苯浸没组织切片，涡旋加热使组织溶解，待5-10min溶液透明澄清后离心弃去上清液；脱二甲苯：加入无水乙醇，涡旋振荡充分溶解后，离心去上清，重复1-2次；干燥：组织沉淀物经自然干燥蒸发残留的乙醇；
1.2.2 RNA提取：脱蜡处理后的组织块浸没在蛋白酶K消化液中，匀浆后，50-60℃孵育1-2h，后加入水饱和酚、氯仿、异戊醇进行抽提，优选地，水饱和酚、氯仿、异戊醇的体积比为23-25:22-24:1，再用75-78v/v％乙醇沉淀，自然干燥5-10min，加入去RNA酶水溶解RNA；
1.3 第一链cDNA的合成：对上述提取的RNA进行逆转录，合成cDNA；
1.4 荧光定量PCR反应：以上述cDNA为模板，分别对基因ESR1、PGR、ERBB2、ACTB、RPLPO、TFRC进行荧光定量PCR反应，预后基因ESR1、PGR、ERBB2和管家基因的引物序列见表1。
优选地，上述蛋白酶K消化液每毫升包括195-205mmol/L Tris-HCl，195-205mmol/L NaCl，1.3-1.6mmol/L MgCl2，1.8-2.1％(g/mL)SDS，蛋白酶K 750-850μg，pH7.5-7.6。更为优选地，上述蛋白酶K消化液中还包括0.45-0.63mmol/L新甲基橙皮苷二氢查耳酮和7.5-12.8mmol/L吡哆醇。适当地增加蛋白酶K浓度和延长消化时间将有利于组织消化和RNA的释放，然而，随着蛋白酶K浓度的升高，数量虽然增多，但质量反而有所下降，PCR扩增成功率也下降。提取RNA时加入新甲基橙皮苷二氢查耳酮和吡哆醇有利于组织的充分消化，有利于将RNA从与蛋白的交联中释放出来，提高RNA的纯度、产量及质量，进而提高RT-PCR的扩增效率，具有降低成本、操作简便、高效的优点。
实施例2：
本实施例以中国乳腺癌人群为研究对象，以乳腺癌病理组织为样本，利用实施例1提供的引物组，进行中国人群乳腺癌分型及预后预测。
其中，以下试验中所用的试剂如未特别说明，则为商业化试剂。
2.1 样本收集和临床信息采集：
这项研究纳入了2005年至2016年之间接受治疗的原发性可手术乳腺癌患者。已有的样本病例分为三组，一组为训练集(n＝112)，一组为测试集(n＝56)，一组为验证集(n＝269)。符合这项研究条件的患者包括(1)浸润性乳腺癌；(2)曾接受过包括乳房切除术或保乳手术(BCS)在内的手术作为第一治疗；(3)每个参与中心的IHC和/或FISH确认ER，PR和HER2的状态；(4)用FFPE乳腺癌病理组织(简称FFPE组织)进行RT-PCR检测，N3或M1阶段的患者被排除在外。
2.2 乳腺癌分型及预后基因的荧光定量RT-PCR(在本实施例中简称为RT-PCR)反应：
2.2.1 取待测标本进行RNA抽提：
2.2.1.1 每毫升蛋白酶K消化液的配制：200mmol/L Tris-HCl，200mmol/L NaCl，1.5mmol/LMgCl2，2.0％(g/mL)SDS，蛋白酶K 800μg(Merck公司)，pH7.5。
2.2.1.2 FFPE组织的切片及脱蜡：用切片刀将FFPE组织切成8μm厚切片；脱蜡：用分析纯二甲苯浸没组织切片，涡旋加热使组织溶解，待10min溶液透明澄清后离心弃去上清液；脱二甲苯：加入无水乙醇，涡旋振荡充分溶解后，离心去上清，重复1次；干燥：组织沉淀物经自然干燥蒸发残留的乙醇；
2.2.1.3 RNA提取：脱蜡处理后的组织块浸没在蛋白酶K消化液中，匀浆后，55℃孵育1.5h，后加入水饱和酚、氯仿、异戊醇进行抽提，水饱和酚、氯仿、异戊醇的体积比为25:24:1，再用75v/v％乙醇沉淀，自然干燥8min，加入去RNA酶水200μL溶解RNA，置于-80℃保存；
2.2.1.4 第一链cDNA的合成：对提取的RNA使用Nanodrop分光光度计(AgilentRNA 6000Nano kit，Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)通过OD测定浓度后使用。取2μg RNA，使用RT2First Strand(Qiagen，Valencia，CA，美国)进行RNA的逆转录，合成第一链cDNA，RT反应在42℃下进行15分钟，然后在95℃下终止反应5分钟。
2.2.1.5 荧光定量PCR反应：以2.2.1.4合成的cDNA为模板，ESR1，PGR，ERBB2和管家基因的引物序列见表1，使用RT2SYBR Green ROX qPCR MM试剂盒(Qiagen，Valencia，CA，美国)进行荧光定量PCR反应，使用标准模式在ABI 7500Fast仪器(美国加利福尼亚州，赛默飞世尔)上进行PCR，在95℃持续15秒，在60℃持续45秒，进行40个循环。
2.3 数据校正及处理：
预后基因ESR1，PGR，ERBB2通过RT-PCR测定得到的荧光值，在使用管家基因(基因ACTB，RPLPO和TFR)进行归一化之后，通过使用专有算法获得了基因ESR1，PGR，ERBB2中每个基因的比率：
ΔCt＝25–Ct(预后基因)+[Ct(ACTB)+Ct(RPLP0)+Ct(TFRC)]/3
为了减少分布的偏斜，以比率的log2值获得的分数建模。以IHC结果为金标准，分别对上述三种预后基因的每一种基因的RT-PCR检测进行受试者工作特征曲线ROC曲线分析；分别测试三种预后基因获得的分数，通过相应的曲线下最高面积(AUC)-受试者工作特征曲线(ROC)曲线获得的临界值，判定基因ESR1，PGR和ERBB2的状态，将样本病例分为管腔型(ER/PR阳性，HER2阴性)，HER2型(任何ER，任何PR，HER2阳性)，三阴性型(ER、PR和HER2均阴性)三种不同的亚型，用于判断预后。
2.4 统计学分析
通过叠加频率直方图分析IHC和RT-PCR方法之间的一致性，并通过Kappa统计分析一致性比率。通过执行Kaplan-Meier分析来评估这两种方法的临床表现，以针对这两种方法判定的三种不同亚型的随访时间来衡量无复发生存率(RFS)。对既往无复发记录的死亡病例进行审查。通过Cox回归，针对年龄，肿瘤分期，肿瘤分级，N期和淋巴管浸润(LVI)等各种临床因素进行单因素生存分析和多因素生存分析。所有分析均使用R-3.6.3软件进行，p值<0.05被认为具有统计学意义。
2.5 结果
2.5.1 判定ER(ESR1)，PR(PGR)和HER2(ERBB2)的状态
IHC/FISH测试的ER，PR和HER2结果是从各参与医院的病历表中获得的。在训练和测试数据集中提供了通过RT-PCR方法确定ESR1，PGR和ERBB2阳性的临界值。
2.5.2 ESR1，PGR和ERBB2的RT-PCR检测的训练集和测试集
总共168名患者参加了训练集(n＝112)和测试集(n＝56)。纳入标准为：(1)在2005年至2009年之间进行了原发手术，(2)病理报告为I-III期的浸润性癌，(3)病理报告中提供了ER，PR，HER2的状态，(4)存在了肿瘤块，(5)签署基因表达研究同意书。患有双侧乳腺癌的患者被排除在外。患者的特征示于表2。
表2.训练和测试集的基准信息(DR：远处转移；FU：随访；H/T：激素治疗)
Figure BDA0003101306320000091
Figure BDA0003101306320000101
分别对三种预后基因中的每一种基因的RT-PCR检测进行曲线下最高面积(AUC)的ROC曲线分析，判定RT-PCR检测方法的ESR1，PGR和ERBB2的临界值。表3列出了这3个基因的临界值。
表3.ESR1，PGR和ERBB2基因的mRNA表达水平的临界值
Cutoff ESR1 PGR ERBB2
Negative <40 <39 <54
Positive ≥40 ≥39 ≥54
2.5.2.1 ESR1检测的训练集
训练集(n＝112)中ESR1的RT-PCR得分分布如图1A所示，通过ROC曲线分析，在RT-PCR检测方法中ESR1的临界值判定为40(见表3)。训练集(n＝112)中ESR1的RT-PCR分数与IHC方法判定的ER状态之间的散点图如图1B所示，在将临界值设置为40的情况下，与IHC判定的相应的ER状态相比，Kappa值被判定为0.80。训练集中RT-PCR方法判定的ESR1状态和IHC方法判定的ER状态之间的比较见表4，由表4可知，两种方法的阴性患者一致性(96.3％)和阳性患者一致性(90.6％)很高。测试集中RT-PCR方法判定的ESR1状态和IHC方法判定的ER状态之间的比较见表5，由表5可知，测试集中的RT-PCR方法判定的ESR1状态和IHC方法判定的ER状态之间的一致性也很高(n＝56)，在独立的测试集中，ESR1的临界值(负值<40，正值≥40)是可重现的。由表4，表5可知，训练集中的一致性为92.0％，测试集中的一致性为85.7％。
表4.训练集中RT-PCR方法判定的ESR1状态和IHC方法确定的ER状态之间的比较(n＝112)
Figure BDA0003101306320000102
表5.测试集中RT-PCR方法判定的ESR1状态和IHC方法判定的ER状态之间的比较(n＝56)
Figure BDA0003101306320000103
Figure BDA0003101306320000111
2.5.2.2 PGR检测的训练集
类似地，训练集(n＝112)中PGR的RT-PCR得分分布如图2A所示。通过ROC曲线分析，在RT-PCR检测方法中PGR的临界值判定为39(见表3)。训练集(n＝112)中PGR的RT-PCR分数与IHC方法判定的PR状态之间的散点图如图2B所示，在临界值设置为39的情况下，与IHC方法判定的相应的PR状态相比，Kappa值被判定为0.52。训练集中RT-PCR方法判定的PGR状态和IHC方法判定的PR状态之间的比较见表6，测试集中RT-PCR方法判定的PGR状态和IHC方法判定的PR状态之间的比较见表7。由表6，表7可知，在训练集中一致性为75.9％，而测试集中一致性为80.4％。
表6.训练集中RT-PCR方法判定的PGR状态和IHC方法判定的PR状态之间的比较(n＝112)
Figure BDA0003101306320000112
表7.测试集中RT-PCR方法判定的PGR状态和IHC方法判定的PR状态之间的比较(n＝56)
Figure BDA0003101306320000113
2.5.2.3 ERBB2检测的训练集
训练集(n＝112)中ERBB2的RT-PCR得分分布如图3A所示。通过ROC曲线分析，在RT-PCR检测方法中ERBB2的临界值判定为54(见表3)。训练集(n＝112)中ERBB2的RT-PCR分数与IHC方法判定的HER2状态之间的散点图如图3B所示，在临界值设置为54的情况下，与IHC方法判定的相应的HER2状态相比，Kappa值被判定为0.71。训练集中RT-PCR方法判定的ERBB2状态和IHC方法判定的HER2状态之间的比较见表8，测试集中RT-PCR方法判定的ERBB2状态和IHC方法判定的HER2状态之间的比较见表9。由表8，表9可知，在训练集中一致性为86.6％，而测试集中一致性为100％。
表8.训练集中RT-PCR方法判定的ERBB2状态和IHC方法判定的HER2状态之间的比较(n＝112)
Figure BDA0003101306320000121
表9.测试集中RT-PCR方法判定的ERBB2状态和IHC方法判定的HER2状态之间的比较(n＝56)
Figure BDA0003101306320000122
2.5.3 验证集队列的基准信息
验证集研究总共包括269名可手术的乳腺癌患者，具体信息见表10。中位随访时间为48.3个月(四分位间距(IQR)，27.4-72.5)。根据人口统计资料，年龄在40岁或以上的238名(88.5％)患者和年龄在40岁以下的31例(11.5％)。此外，根据IHC方法，有242例(90.0％)的ER阳性患者和27例(10.0％)的ER阴性患者；PR阳性的患者为224名(83.3％)，PR阴性的患者为45名(16.7％)；有22例(8.2％)患者的HER2阳性和247例(91.8％)患者的HER2阴性。共有146例(54.3％)患者表现出缺乏或局部LVI，而123例(45.7％)患者表现出明显的LVI。关于肿瘤分期，大多数患者处于T1期(135例，50.2％)和T2期(124例，46.1％)疾病，T3期有10例(3.7％)。多数(160例或59.5％)位于N0，N1疾病为97例(36.1％)，N2疾病为12例(4.3％)。大多数患者的肿瘤为I级(77或25.8％)或II级(184或61.5％)，而III级只有38(12.7％)。
表10.验证集的基准信息
Figure BDA0003101306320000123
Figure BDA0003101306320000131
2.5.4 断点的判定以及在验证集中IHC和RT-PCR方法之间的相关性
通过使用曲线下最大面积(AUC)-ROC曲线分析训练集(n＝112)和测试集(n＝56)获得ESR1，PGR和ERBB2基因检测的断点分别为40、39和54。不同基因表达的分数与基于IHC判定的阳性及阴性病例见图4，其中，A为ESR1基因，B为PGR基因，C为ERBB2基因。基于mRNA和基于IHC的检测结果的一致性见表11，基于mRNA和基于IHC的乳腺癌分子分型的一致性见表12。由表11可知，两种方法检测结果的一致率分别为：ER(ESR1)的一致率为95.0％(Kappa＝0.7413)，PR(PGR)的一致率91.0％(Kappa＝0.6678)和HER2(ERBB2)一致率的93.6％(Kappa＝0.5927)。由表12可知，乳腺癌分子分型的管腔型，HER2型和三阴性型的Kappa统计值为0.6649。总体而言，结果表明，这两种方法在乳腺癌分子分型方面具有相对较高的一致性。
表11.基于mRNA和基于IHC的检测结果的一致性
Figure BDA0003101306320000132
Figure BDA0003101306320000141
表12.基于mRNA和基于IHC的乳腺癌分子分型的一致性
Figure BDA0003101306320000142
2.5.5 验证集的Kaplan-Meier生存分析
基于IHC进行分子分型的亚型中，乳腺癌患者的预估RFS的Kaplan-Meier曲线见图5，基于mRNA进行分子分型的亚型中，乳腺癌患者的预估RFS的Kaplan-Meier曲线见图6。由图5和图6可知，通过Kaplan-Meier分析，通过IHC(p＝0.019)和RT-PCR(p＝0.016)方法进行分子分型的三种亚型之间的生存概率差异均显着不同。基于IHC和基于mRNA进行分子分型的亚型之中的RFS见表13。由表13可看出，根据IHC方法判定的管腔型，HER2型和三阴性型的5年RFS分别为0.833(95％CI，0.780-0.890)，0.739(0.580-0.942)和0.484(0.294-0.795)。而通过RT-PCR方法判定的管腔型，HER2型和三阴性型的5年RFS分别为0.843(95％CI，0.791-0.899)，0.663(0.496-0.886)和0.544(0.360-0.821)。
表13.基于IHC和基于mRNA进行分子分型的亚型之中的RFS
Patient Number Event Number 5-year RFS(％) Pvalue
IHC-subtype 0.001
Luminal 229 36 83.3(78.0,89.0)
HER2 22 6 73.9(58.0,94.2)
TNBC 18 8 48.4(29.4,79.5)
mRNA-subtype 0.001
Luminal 227 34 84.3(79.1,89.9)
HER2 23 7 66.3(49.6,88.6)
TNBC 19 8 54.4(36.0,82.1)
2.5.6 验证集的单因素和多因素分析
单因素和多因素分析见表14。Cox比例风险模型对任何肿瘤复发的单因素分析显示，无论是IHC还是RT-PCR方法，分子亚型都可能是预后因素，尤其是对于三阴性型。通过RT-PCR方法进行分子分型，HER2型和三阴性型与风险比为1的管腔型相比，风险比分别为1.93(95％CI,0.90-4.14)和2.53(95％CI,1.22-5.23)。相比之下，通过IHC方法进行分子分型，HER2型和三阴性型与风险比为1的管腔型相比，风险比分别为1.41(95％CI,0.60-3.33)和2.71(95％CI,1.31-5.61)。
在多因素分析中，无论是IHC还是RT-PCR方法，分子亚型与单因素分析保留了相同的趋势。通过RT-PCR方法进行分子分型，HER2型和三阴性型的风险比与的管腔型为1的风险比相比，分别为1.97(95％CI,0.87-4.46)和2.43(95％CI,1.11-5.32)。通过IHC方法进行分子分型，HER2型和三阴性型与风险比为1的管腔型相比，风险比分别为1.54(95％CI,0.63-3.77)和4.05(95％CI,1.70-9.63)。
表14.单变量和多变量分析
Figure BDA0003101306320000151
Figure BDA0003101306320000161
实施例3：
2.2.1.1 每毫升蛋白酶K消化液的配制：200mmol/L Tris-HCl，200mmol/L NaCl，1.5mmol/LMgCl2，2.0％(g/mL)SDS，蛋白酶K 800μg(Merck公司)，0.53mmol/L新甲基橙皮苷二氢查耳酮，9.5mmol/L吡哆醇，pH7.5。其余部分和实施例2完全一致。
实施例4：
2.2.1.1 每毫升蛋白酶K消化液的配制：200mmol/L Tris-HCl，200mmol/L NaCl，1.5mmol/LMgCl2，2.0％(g/mL)SDS，蛋白酶K 800μg(Merck公司)，0.53mmol/L新甲基橙皮苷二氢查耳酮，pH7.5。其余部分和实施例2完全一致。
实施例5：
2.2.1.1 每毫升蛋白酶K消化液的配制：200mmol/L Tris-HCl，200mmol/L NaCl，1.5mmol/LMgCl2，2.0％(g/mL)SDS，蛋白酶K 800μg(Merck公司)，9.5mmol/L吡哆醇，pH7.5。其余部分和实施例2完全一致。
试验例1：
RNA的浓度和纯度检测：取上述提取的RNA使用分光光度计检测A260/A280、A260/A230的比值及核酸的浓度。A260/A280、A260/A230的比值作为核酸纯度的指标。RNA纯度的测定结果见图7。RNA浓度的测定结果见图8。
RNA的完整性检测：取5μL上述提取的RNA进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，以判断核酸的完整性。RNA的电泳图见图9。
RT-PCR扩增效率的检测：采用标准曲线法计算上述实施例2-5中基因ESR1，PGR，ERBB2及管家基因ACTB，RPLPO和TFR RT-PCR反应的扩增效率。基因ESR1、PGR、ERBB2、ACTB、RPLPO和TFR RT-PCR的扩增效率的测定结果见图10。
由图7可以看出，实施例3提取的RNA的A260/A280明显大于实施例2、实施例4、实施例5，且A260/A230与实施例2、实施例4、实施例5无明显差别；由图8可以看出，实施例3提取的RNA的浓度明显大于实施例2、实施例4、实施例5；由图9可以看出，与实施例2、实施例4、实施例5相比，实施例3提取的RNA电泳后出现较为清晰完整的28S和18S条带，且28S条带的亮度明显高于18S；由图10可以看出，实施例3中基因ESR1、PGR、ERBB2、ACTB、RPLPO和TFR RT-PCR的扩增效率明显大于实施例2、实施例4、实施例5，更为接近理论数值，这说明，RNA提取过程中新甲基橙皮苷二氢查耳酮和吡哆醇的加入有利于组织的充分消化，有利于将RNA从与蛋白的交联中释放出来，提高RNA的纯度、产量及质量，进而提高RT-PCR的扩增效率，具有降低成本、操作简便、高效的优点。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。
序列表
<110> 浙江省肿瘤医院
<120> 一种用于乳腺癌分型及预后预测的引物组及试剂盒
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cacagagagg tcattggtta tagag 25
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcacctgtga gagaacagaa ac 22
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gagtgggaaa gacatttgag agta 24
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caggcataca cagatgaaag ga 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agactgtccc tgaaacctag ta 22
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acaaagcctg gatactgaca c 21
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccaatctcat cttgttttct gcg 23
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aatgcttcta ggcggactat g 21
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cttgtctgtg gagacggatt ac 22
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccacaaaggc agatggatca 20
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gtacgtgcta acaggctcaa ta 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cgagaagaca tctcaagacc ag 22

Claims (1)

1.一种用于乳腺癌分型及预后预测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括引物组、PCR反应缓冲液、RNA提取试剂；
所述RNA提取试剂包括蛋白酶K消化液；
所述蛋白酶K消化液由以下组分组成：200mmol/L Tris-HCl，200mmol/L NaCl，1.5mmol/L MgCl2，2.0% SDS，800μg/mL蛋白酶K，0.53 mmol/L新甲基橙皮苷二氢查耳酮和9.5mmol/L吡哆醇，pH 7.5；
所述引物组包括预后基因和管家基因的6对引物，引物组的序列如序列表SEQ ID NO:1-12所示，所述预后基因包括ESR1，PGR，ERBB2，所述管家基因包括ACTB，RPLPO和TFRC；所述试剂盒的RNA提取样本为FFPE乳腺癌病理组织。
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