CN113564162A - 同源重组修复基因捕获探针组、试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于捕获同源重组修复基因的探针组,该探针组捕获的基因组区域主要包括ATM、BARD1、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDK12、CHEK1、CHEK2、FANCA、FANCL、PALB2、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD54L这15个前列腺癌相关的同源重组修复基因的全编码区和外显子‑内含子连接区。本发明还公开了同源重组修复基因的高通量测序方法、突变检测方法及试剂盒。本发明通过设计前列腺癌基因集panel进行杂交捕获和高通量测序,可一次性平行检测15个HRR相关基因的多种变异形式,不仅可检测突变类型全,而且准确性和测序覆盖深度高,均一性好。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测领域,特别是涉及同源重组修复(HRR)基因的检测,更具体地说,是涉及前列腺癌同源重组修复基因突变的检测方法,以及用于该检测方法的杂交捕获探针组和试剂盒。
背景技术
高通量测序(Next Generation Sequencing,NGS)技术,又名下一代测序技术或二代测序技术,一次可以检测大量靶基因及其变异位点,检测灵敏度和特异性高,兼具定性和定量检测,且检测所需组织样本更少,速度更快,成本更低。NGS,尤其是基于杂交捕获或靶向扩增技术的NGS,集多种优势,让研究者们更易于实现他们的目标。
基因Panel(将若干基因对应的探针设计在一起以捕获目标DNA并用于后续的基因测序)可以帮助临床医生对癌症患者进行分型,并可帮助制定合理的治疗方案。与其他的检测相比,基于NGS的基因panel检测可以在较短的周期内一次性检测多个基因,价格也相对合理,肿瘤专家可以根据每个患者肿瘤的DNA测序结果制定靶向治疗方案。近年来,随着肿瘤基因靶向药物与免疫治疗的广泛运用,通过对多种基因进行平行测序,可以为临床医生提供有意义的多种关键信息,制定更适用的治疗方案。
细胞在正常的代谢过程中由于各种因素的影响会导致DNA损伤,然后触发DNA的保护机制对损伤DNA进行修复。同源重组修复(homologous recombination repair,HRR)是DNA损伤修复的核心方式之一,是维持基因组完整性、确保遗传信息高保真传递的一种DNA修复机制。HRR是一条涉及到多个步骤的复杂的信号通路,其中关键蛋白为BRCA1和BRCA2。如果BRCA基因出现突变导致BRCA1和BRCA2蛋白失去功能,就会引起HRR功能异常(Homologous Recombination Deficiency,HRD)。另外,其它HRR相关基因,如PALB2、CDK12、RAD51、CHEK2、ATM等发生突变,或BRCA1基因启动子发生甲基化以及其他暂未明确的原因,都会引起HRD,导致基因组不稳定。HRR通路紊乱是多种类型癌症的基础,其复杂的过程涉及多种基因,在多种肿瘤中发挥并扮演重要的角色,HRR能力强弱可能是体细胞突变及相应的多种类型肿瘤的主要诱因,如BRCA1/2与乳腺癌、卵巢癌,RAD54与非霍奇金淋巴瘤,RECQL4与骨肉瘤和皮肤癌。
I型多聚ADP-核糖聚合酶(PARP-1)是一种在DNA损伤修复和细胞凋亡中都发挥重要作用的修饰酶。BRCA1基因和BRCA2基因发生突变的肿瘤细胞往往依赖PARP-1完成对DNA损伤的修复。因此,PARP抑制剂能够通过抑制PARP-1的功能来抑制肿瘤细胞DNA的损伤修复。奥拉帕利作为一种非常重要的PARP抑制剂,被美国食品药品管理局(FDA)在2018年批准用于存在有害或疑似有害生殖系或体细胞BRCA突变(gBRCAm或sBRCAm)晚期上皮性卵巢癌、输卵管癌或原发性腹膜癌成人患者(其在接受一线铂类化疗后达到完全或部分缓解后的一线维持治疗),在2019年批准用于胚系突变转移性胰腺癌患者的维持治疗。在2020年,奥拉帕利又被批准用于治疗存在同源重组修复(HRR)基因突变的转移性去势抵抗性前列腺癌(mCRPC)。本项批准基于奥拉帕利Ⅲ期PROfound临床试验的结果。在PROfound试验中,对于存在BRCA或ATM突变的男性患者,与医生选择的恩杂鲁胺或阿比特龙相比,奥拉帕利可延长患者中位影像学无进展生存期一倍以上,是目前研究证实唯一可延长患者总生存期的PARP抑制剂。这些结果凸显了基因组检测对帮助该疾病男性患者确定治疗方案的重要性。奥拉帕利本次获批的适应症是治疗既往经新型内分泌药物治疗后,存在有害或疑似有害胚系或体系HRR基因突变的mCRPC患者。患者需事先接受FDA批准的试剂盒进行基因检测,HRR基因突变阳性的患者可以使用奥拉帕利治疗。目前,奥拉帕利正在欧盟和其他司法管辖区接受监管审批,以用于治疗HRR基因突变的mCRPC患者。
HRR是一条涉及到多个步骤的复杂的信号通路,涉及的基因已知的就已多达数十个。HRR基因的突变类型包括点突变、插入/缺失、DNA拷贝数变异和大片段重排等,其突变的检测存在一定难度,因此,建立准确、可靠、灵敏的检测方法具有十分重要的意义。
目前华大基因开发的基于二代测序的BRCA1/2基因突变检测试剂盒(联合探针锚定聚合测序法),可用于对临床确诊为卵巢癌及乳腺癌患者的BRCA1/2基因外显子区以及邻近内含子区的胚系变异进行定性检测。
艾德生物开发了人类BRCA1基因和BRCA2基因突变检测试剂盒(可逆末端终止测序法),经国家药品监督管理局(NMPA)批准,可用于PARP抑制剂奥拉帕利片的相关用药指导。该试剂盒定性检测BRCA1/BRCA2基因全的编码区及外显子-内含子连接区、UTR区和启动子区的点突变和插入缺失,但不包括大片段缺失和拷贝数变异。
上述两个试剂盒主要涉及BRCA1、BRCA2基因外显子区域以及邻近内含子区域,而且仅检测目标区域内BRCA的胚系突变,没有考虑BRCA1、BRCA2的内含子区域和通路上的其它基因,并且没有包含体系突变和全部的突变类型。
已有大量的研究表明,发生在内含子区域的大片段的重排对BRCA1、BRCA2的正常生物功能会产生影响,基因捕获区域的增加,会提高检测的准确性。另外,研究证实,HRR通路上的其它基因也扮演重要的角色,ATM基因蛋白已经成为PARP抑制剂的靶点之一;RAD51产生的蛋白与单链和双链DNA结合,催化同源DNA间的识别和链交换,在同源重组修复过程中发挥重要功能;RAD51 foci无法形成是同源重组修复通路失效细胞的特征之一。每一个HRR通路上的基因的失效都有可能导致基因组不稳定的发生。
然而目前市面上的HRR基因二代测序产品,普遍存在以下问题:
1)涉及基因少,包含的目标区域不完整,影响科研探索,对新靶点的发现功能有限;
2)检测的突变类型单一,不涉及大片段重排和拷贝数变异的检测,且不包含体系突变,影响检测的阳性;
3)不涉及样本污染质控,缺乏重要的质控指标。
因此,在同源重组修复基因检测领域,迫切需要更具针对性的基因panel。如果panel的基因选取不当,或者基因位点或区域选取不当,错失重要位点的信息,对患者就不能起到针对性的检查,不仅增加患者的成本,而且没有指导作用。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一种用于捕获同源重组修复基因的探针组,该探针组的基因覆盖度广,可检测的HRR基因突变类型全。
为解决上述技术问题,本发明的用于捕获同源重组修复基因的探针组,设计的捕获基因组区域主要包括表1中的15个同源重组修复基因(ATM、BARD1、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDK12、CHEK1、CHEK2、FANCA、FANCL、PALB2、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD54L)的全编码区和外显子-内含子连接区。
较佳的,为了检测HRR基因的融合突变,所述探针组设计的捕获基因组区域还可以进一步包括与大片段重排相关的基因的内含子区区域,优选为表2中的7个基因(ATM、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDK12、RAD51D以及RAD51B的伴侣基因HMGA2)的16个内含子区区域。
较佳的,为了检测HRR基因的拷贝数变异(CNV),所述探针组设计的捕获基因组区域还可以进一步包括上述15个HRR基因中高频发生纯合缺失的基因的骨架SNPs点。所述高频发生纯合缺失的基因优选为ATM、BRCA1、BRCA2、CDK12、CHEK1、CHEK2、RAD51C基因。所述骨架SNPs点优选为表3中的275个骨架SNPs位点,捕获这些骨架SNPs位点的探针序列如SEQ IDNO:1~275所示。
较佳的,为了实现单样本的样本污染判断或两个样本是否配对的判断,所述探针组设计的捕获基因组区域还可以进一步增加SNPs质控位点。所述SNPs质控位点优选为表4中的56个SNPs质控位点,捕获这些SNPs质控位点的探针序列如SEQ ID NO:276~331所示。
设计探针组时,上述可选的捕获基因组区域(与大片段重排相关的基因的内含子区区域、高频发生纯合缺失的基因的骨架SNPs点、SNPs质控位点),可以选择其中的一种,也可以选择其中的两种,或者全部选择。
本发明要解决的技术问题之二是提供一种包含有上述探针组的试剂盒。
所述试剂盒还可以一步包含有相应的杂交捕获试剂、高通量测序试剂、同源重组修复基因突变检测试剂。
本发明要解决的技术问题之三是提供上述探针组的设计方法,该方法包括如下步骤:
1)选择表1中的15个同源重组修复基因的全编码区和外显子-内含子连接区作为探针设计的基因目标区域;
2)根据步骤1)选择的基因目标区域设计探针组的序列;
3)将步骤2)设计好的探针进行blast和repeatmask,去除同源性较高和捕获区域重复的探针;
4)统计经步骤3)过滤后所得探针序列的GC含量,去除GC含量少于20%的探针;
5)统计探针设计未覆盖区域、同源性较高和捕获区域重复的探针区域,以及GC含量少于20%的探针区域,将这些区域分别延伸20bp,按照长度120bp、步长90bp的规则进行划分,将划分的区域进行blast、repeatmask及GC含量统计,去除同源性较高、捕获区域重复和GC含量少于20%的探针;
6)将去除的区域按照上述步骤5)再进行设计,将无法覆盖或是覆盖不好的区域进行遍历叠瓦设计,最大限度地覆盖目标区域。
较佳的,步骤1)还可以进一步增加以下3种基因组区域中的一种或多种作为探针设计的基因目标区域:与大片段重排相关的基因的内含子区区域(优选表2中的7个基因的16个内含子区区域)、高频发生纯合缺失的基因(优选ATM、BRCA1、BRCA2、CDK12、CHEK1、CHEK2、RAD51C)的骨架SNPs点(优选表3中的275个骨架SNPs点)、SNPs质控位点(优选表4中的56个SNPs质控位点)。
本发明要解决的技术问题之四是提供一种同源重组修复基因的高通量测序方法,该方法包括如下步骤:
1)DNA样本制备;
2)用上述探针组杂交捕获同源重组修复基因,并进行富集;
3)进行高通量测序,并拆分测序数据,定义Q30≥85%的数据为合格下机数据;
4)对合格下机数据进行预处理,去除建库过程中引入的接头序列、引物和低质量碱基片段;
5)将碱基序列比对至人类参考基因组,并进行排序和序列比对优化,对比对后的数据去重,进行局部重比对和碱基质量矫正。
较佳的,为了进一步对测序数据进行质控,以避免因样本污染或不配对而导致后续的检测结果不准确,在步骤5)之后,还可以进一步增加如下样本质控步骤:
6)计算56个SNPs位点水平A、C、G、T的频率,当SNP的突变频率在40%~60%时,认为该位点为杂合突变基因型;当SNP的突变频率为100%时,认为该位点为纯合突变基因型;当SNP的突变频率为0时,认为该位点为野生型;当SN位点的突变频率≥85%且<100%时,则认为此位点为可能的污染位点;统计野生型、纯合突变基因型、杂合突变基因型和可能的污染位点个数;若野生型和纯合突变基因型的位点个数和≤10,则判定样本存在污染;若野生型和纯合突变基因型的位点个数和﹥10,则根据可能的污染位点和突变频率的平均值,计算样本的可能污染频率,给出污染频率结果;
7)统计每个样本的Q30碱基占比、序列比对至参考基因组比例、目标区域的平均测序深度、捕获效率、捕获均一性、1×覆盖度、污染频率、插入片段长度,判定数据质控是否通过;如果Q30碱基占比≥85%,序列比对至参考基因组比例≥95%,平均有效测序深度≥500×,捕获效率≥20%,捕获均一性≥90%,1×覆盖度≥98%,污染频率<1%、插入片段长度在100~250bp之间,则样本数据质控通过;否则判定样本数据质控不通过,需要重新实验。
本发明要解决的技术问题之五是提供一种基于上述高通量测序方法的同源重组修复基因突变检测方法,该HRR基因突变检测方法使用高通量测序方法获得样本测序数据,可以平行进行单核苷酸位点变异和小片段插入缺失的检测、大片段重排的检测、拷贝数变异的检测中的一种或多种检测。
进一步的,根据突变检测结果,可以进行变异解读,所述变异解读步骤包括:
在已知的最大截短位点之前的无义和移码变异,判定为可能致病变异/致病变异;
在外显子上、下游第一或第二个碱基的变异以及经mRNA水平的实验证明影响剪接的剪接位点变异,排除经预测或已明确的可产生可能恢复基因功能的自发框内RNA异构体变异,判定为可能致病变异/致病变异;
经过人群数据库、变异位点信息、文献人群数据、功能研究数据、共分离数据、等位基因数据、表型数据和计算机预测数据等证据累加后的错义和非移码变异,判定为可能致病变异/致病变异;
造成密码子丢失的起始密码子变异,排除意义未明变异和有证据显示或预测存在其他可替代性起始密码子且能产生功能蛋白的变异,判定为可能致病变异/致病变异;
覆盖范围内破坏蛋白功能的基因大片段重排,判定为可能致病变异/致病变异;
编码区纯合拷贝数缺失,判定为可能致病变异/致病变异;
对判定为可能致病变异/致病变异的变异,再根据靶向治疗的敏感性、耐药性预测、对疾病诊断或预后的影响,将变异分为临床意义明确的变异(Ⅰ类)、有潜在临床意义的变异(Ⅱ类)、临床意义未明的变异(Ⅲ类)和良性或可能良性的变异(Ⅳ类)。
本发明要解决的技术问题之六是提供上述探针组和试剂盒的用途,所述探针组和试剂盒可用于同源重组修复基因的高通量测序和突变检测、前列腺癌的风险评估、前列腺癌的辅助诊断和辅助治疗等。
本发明设计了一种新的前列腺癌基因集panel,该基因集panel包含了前列腺癌同源重组通路基因,基因覆盖度广,可检测突变类型全,准确性高,可适用于前列腺癌的风险评估,以及前列腺癌的发生、发展的各个阶段。与现有的前列腺癌相关基因检测技术相比,本发明的前列腺癌HRR基因panel及检测方法,具有以下优点和有益效果:
1.针对基因复杂区域和易发生大片段重排基因的内含子区域进行探针覆盖设计,避免了重要区域和大片段重排等突变类型的遗漏,确保了检测结果的准确性;
2.增加了骨架(backbone)的SNPs点,针对7个高频拷贝数变异的基因,为相关基因拷贝数变异进行纯合或杂合的注释;
3.设计了56个SNPs质控位点,用于单样本中混入人源污染评估,增加了质控参数,确保了结果的可靠性;
4.利用本发明的panel杂交捕获前列腺癌HRR基因进行NGS测序,可一次性平行检测15个前列腺癌HRR相关基因的体系和胚系的变异(包括点突变、插入/缺失、DNA拷贝数变异-扩增/纯合缺失和大片段重排等),且各个区域的测序覆盖深度足够高,均一性好;
5.本发明的前列腺癌基因集panel的可移植性强,适用于多种高通量测序仪器或新开发的检测平台,特别是MGISEQ平台;
6.本发明的变异解读方法,通过结合HRR基因解读的特殊性和临床应用现状,同时对HRR基因的体细胞及胚系变异进行解读,指导临床治疗决策,如此不仅保证了变异解读的自动化和准确性,而且减少了人工,提高了效率。按照本发明的变异解读规则构建的HRR解读数据库,是目前国内最大的HRR解读数据库。
附图说明
图1是内含子序列覆盖情况图;
图2是本发明的测序数据处理流程示意图;
图3是本发明的变异解读规则示意图;
图4是本发明实施例7不同GC含量区域的覆盖度。
具体实施方式
为对本发明的技术内容、特点与功效有更具体的了解,现结合附图及具体实施例,对本发明的技术方案做进一步详细的说明。
实施例1 制备杂交捕获探针
1.探针设计目标区域的选择
《NCCN指南》推荐HRR基因(ATM、BRCA1、BRCA2、BARD1、BRIP1、CDK12、CHEK1、CHEK2、FANCL、PALB2、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD54L)突变的去势抵抗性前列腺癌(CRPC)患者接受奥拉帕利治疗。
2020版《中国前列腺癌患者基因检测专家共识》(2020版)推荐所有mCRPC患者进行至少包含HRR基因胚系及体系变异的检测。
基于同源重组修复(HRR)通路在前列腺癌发生、发展中的重要作用,以及TOPARP-A、TRITON2、TOPARP-B临床试验,尤其是PROfound临床实验的有效性数据和HRR通路基因在前列腺癌中的突变频率,本发明选择以下15个基因为与前列腺癌相关的同源重组修复(HRR)基因:ATM、BARD1、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDK12、CHEK1、CHEK2、FANCA、FANCL、PALB2、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD54L,通过NCBI office name、HGNC approved OfficialSymbol系统确定标准基因名,获得前列腺癌HRR检测的基因集合(Panel)。
选择上述15个同源重组修复基因的全编码区和外显子-内含子连接区,参见表1所示。
从上述15个HRR基因中选择大片段重排相关的7个基因(ATM、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDK12、RAD51D以及RAD51B的伴侣基因HMGA2)的16个内含子区区域,参见表2所示。
为了实现同源重组修复基因纯合缺失的注释,从上述15个HRR基因中选取7个高频发生纯合缺失的基因(ATM、BRCA1、BRCA2、CDK12、CHEK1、CHEK2、RAD51C),从1000Genomes基因组数据库中筛选人群频率(AF)为5%~ 95%的SNPs,去除在不同人群中偏离较大的位点,优先选择在中国人群中高MAF值和相应高杂合率的SNPs,获得275个骨架SNPs点,参见表3所示,这些位点多为杂合突变位点。
为了实现单样本的样本污染判断或两个样本是否配对的判断,增加56个SNPs质控位点,参见表4所示。这些位点的野生型和纯合子比例在1/2~2/3之间,可以有效进行身份鉴定和样本污染判断。
将表1的基因目标区域两端延伸,默认长度为20bp。合并表1~表4的全部选择区域后去冗余,最终形成探针组设计的基因目标区域。
2.探针的设计合成
探针设计按照如下步骤进行:
1)将目标区域提交至探针设计官网,进行捕获探针设计,得到探针序列;
2)将设计好的探针进行blast和repeatmask,去除同源性较高和重复区域的探针;
3)统计经上述步骤2)过滤后的探针序列的GC含量,去除GC含量少于20%的探针;
4)统计探针设计未覆盖区域、同源性较高和重复区域的探针区域和低GC探针区域,将这些区域分别延伸20bp,按照长度120bp、步长90bp的规则进行划分,将划分的区域进行blast、repeatmask以及GC含量统计,去除同源性较高、重复区域和GC含量少于20%的探针;
5)将去除的区域按照上述步骤4)再进行设计,将无法覆盖或是覆盖不好的区域进行遍历叠瓦设计,最大限度地覆盖目标区域。
最终设计得到共1893条探针,表1目标区域的覆盖度是99.8%,表2目标区域的覆盖度是58%,全编码区域覆盖度提高了6.8%,内含子区域覆盖度提高了17%(由图1也可以看出覆盖的均一性很好),保证了捕获的全面性和结果的准确性。部分探针的序列如序列表中SEQ ID NO:1~331所示,其中,SEQ ID NO:1~275为捕获骨架SNPs点的探针的序列,SEQ IDNO:276~331为捕获SNPs质控位点的探针的序列。
设计完成的探针组交由合规的探针合成公司按照单条DNA探针合成并质控方法,合成特异性DNA探针,并配套相应的杂交捕获试剂。
实施例2 NGS高通量测序
1.DNA样本制备
组织样本的切片经病理检测后,如肿瘤细胞含量大于20%,则切片可直接用于DNA抽提;如果肿瘤细胞含量小于20%,则需要经过富集后再进行DNA抽提。FFPE样本先经病理检测确认肿瘤细胞含量在20%以上,然后使用QIAGEN QIAamp DNA FFPE Tissue Kit进行抽提,将FFPE样本进行脱蜡、蛋白酶K消化、高温逆转交联,最后通过硅胶膜离心柱纯化出DNA。DNA使用Qubit定量,总量在100ng以上的样本继续实验,并用毛细管电泳确认降解程度。
本实施例采用的是肿瘤FFPE样本,提取样本DNA后,进行酶切打断。打断结束后,取1µl,qsep100检测片段分布,主峰在150~200bp。DNA起始量要求100ng。
2.预杂交文库制备
酶切打断后的DNA,使用KAPA HyperPrep Kit 试剂盒进行建库。
首先,对DNA进行末端修复。末端修复反应体系包括:打断后DNA 50µl、末端修复加A缓冲液7µl、末端修复加A酶混合物3µl,总体积60µl。末端修复反应条件为65℃ 30min。
末端修复结束后,进行接头连接反应。连接反应条件为20℃ 15min。连接反应体系包括:末端修复产物60µl、无核酸酶水5µl、连接缓冲液30µl、DNA连接酶10µl、MGI UDI接头5µl,总体积110µl。
接头连接反应结束后,加入0.8x纯化磁珠进行纯化。纯化产物配制PCR扩增反应体系,在PCR仪上进行PCR扩增反应,制备预杂交文库。PCR扩增反应体系和反应程序分别参见表5和表6。扩增反应结束后使用1x纯化磁珠纯化PCR反应产物,得到总量500ng以上的预杂交文库。
3.探针杂交捕获及目标基因富集
在0.2ml低吸附离心管中加入表7所示试剂,47℃抽干,抽干后的样品可以继续杂交或者室温放置过夜。
将表8所示试剂加入到抽干的离心管中,室温放置5~10min,置于PCR仪上95℃30s,65℃杂交孵育4~16小时,热盖温度设为100℃。
利用生物素-链霉亲和素的亲和反应,用带有链霉亲和素的磁珠捕获探针和目的片段,并用清洗液将非特异性结合的DNA片段洗去。然后配制表9所示反应体系,吸打混匀,保证磁珠均匀分散在溶液中,按照表10所示反应程序,在PCR仪上进行PCR扩增反应,富集目标基因,然后使用1.5X纯化磁珠再次进行纯化,得到捕获文库。捕获文库的平均片段大小应该在300~500bp左右,总量应该大于110 ng,质检合格后进行下一步上机测序操作。
4.文库测序和数据拆分
捕获文库定量稀释并混合后,在MGISEQ-2000高通量测序仪上进行双端测序。测序结束后,根据样本的barcode信息,用splitBarcode v2.0.0软件进行数据拆分。拆分后,原始fastq数据,Q30≥85%时,定义为合格下机数据。
5.数据预处理
对于质控合格的下机数据,使用数据预处理软件(fastp)去除建库过程中引入的接头序列、引物以及低质量碱基片段。
6.数据比对
使用序列比对软件(基于BWA v0.7.17-r1188和GATK v3.7 软件)将质控后fastq文件中的碱基序列比对至hg19 (GRCh37)人类参考基因组上生成bam文件,并根据基因组坐标对bam文件进行排序,然后对基因组复杂区域进行序列比对优化。使用sambamba对比对后的bam文件进行去重。去重后的bam文件进行重比对和碱基质量矫正后,用GTAK3.7进行处理,得到最终的bam文件。
7.数据质控
使用samtools软件的mpileup命令对bam文件进行运算处理,得到*mpileup文件,根据mpileup文件,计算56个SNPs位点水平A、C、G、T的频率。当SNP的突变频率在40%~60%时,认为该位点为杂合突变基因型;当SNP的突变频率为100%时,认为该位点为纯合突变基因型;当SNP的突变频率为0时,认为该位点为野生型;当SN位点的突变频率≥85%且<100%时,则判断此位点为可能的污染位点。统计野生型、纯合突变基因型、杂合突变基因型和可能的污染位点个数。若野生型和纯合突变基因型的个数和≤10,则判定样本存在污染,给与警告;若野生型和纯合突变基因型的个数和﹥10,则根据可能的污染位点和突变频率的平均值,计算样本的可能污染频率,给出污染频率结果。
根据上述数据处理和比对的结果,统计每个样本的Q30碱基占比、序列比对至参考基因组比例、目标区域的平均测序深度、捕获效率、捕获均一性、1×覆盖度、污染频率、插入片段长度等参数。如果Q30碱基占比≥85%,序列比对至参考基因组比例≥95%,平均有效测序深度≥500×,捕获效率≥20%,捕获均一性≥90%,1×覆盖度≥98%,污染频率<1%、插入片段长度在100~250bp之间,则样本数据质控通过。如数据质控不通过,则判定实验失败,需要重新实验。
实施例3 SNV/INDEL突变检测
采用实施例1制备的探针,按照实施例2的方法,获得质控通过的测序数据,用vardict进行单核苷酸位点变异(SNV)和小片段插入缺失(INDEL)的检测,然后使用vep、CAVA和annovar对检出突变进行注释并过滤。
SNP/INDEL的检测限(LOD)的确定方法:采用购买的标准细胞系样本22RV1和NA12878,按照表11所示的比例进行混合稀释,得到突变频率在0.75%、1.5%、3%、5%和8%的突变位点,其中包含SNV突变34个,INDEL突变5个。采用实施例1制备的探针,按照实施例2的方法,获得质控通过的测序数据,用vardict进行单核苷酸位点变异(SNV)和小片段插入缺失(INDEL)的检测,然后使用vep、CAVA和annovar对检出突变进行注释并过滤。重复五次实验。结果如表12所示,突变频率在5%的突变位点,SNP/INDEL均检出阳性;突变频率在3%的突变位点,SNP/INDEL有7次未检出;突变频率在1.5%和0.75%的突变位点,SNP/INDEL全部未检出。因此,FFPE样本的SNP/INDEL突变检测的检测限为5%突变频率。
实施例4 融合突变检测
1.融合阳性判断值(cutoff)的确定
从申请人公司内已经过商检的样本中挑选10例阴性样本和4例融合阳性样本,采用实施例1制备的探针,按照实施例2的方法,获得质控通过的测序数据,用manta进行大片段重排的检测,检测结果如表13所示,4例融合阳性样本的DNA分子数均≥3,突变频率均≥0.5%,灵敏度100%,特异性100%。因此,将DNA分子数≥3且突变频率≥0.5%作为融合的cutoff值。
2.融合突变检测
合成3个分别带有BRCA1-ZNF655、CDK12-PLXDC1、RAD51B-HMGA2基因重排断点序列的质粒,按摩尔比1:1和1:9,分别与人gDNA混合,构建6个基因重排质控品,用实施例1制备的探针,按照实施例2的方法,获得质控通过的测序数据,用manta进行大片段重排的检测,结果如表14所示,所有样本均能正常检出,且突变频率符合预期。
实施例5 CNV突变检测
1.CNV阳性检测阈值的确定
从公司内已经过商检的样本中筛选出经多个软件方法检测证实存在HRR基因CNV(拷贝数变异)的样本74例。利用这些样本,采用实施例1制备的探针,按照实施例2的方法,获得质控通过的测序数据,使用cnvkit软件计算CNV。拷贝数缺失突变判断阈值分为0.8、0.6和0.4三个梯度,扩增突变判断阈值分为1.2、1.5和2.0三个梯度,通过变换这些阈值,计算本发明的CNV检测的灵敏度、阳性预测值和特异性,计算结果参见表15~16。考虑尽量减少假阳性,阈值选择以0.6和1.5最优,在此前提下,比较灵敏度和阳性预测值,确定检测阈值为0.6和1.5。当拷贝数筛选阈值为0.6和1.5时,灵敏度达到95%,特异性达到100%。
2.CNV检测限的确定
选取2例临床样本RD-CNV-1、RD-CNV-2,样本肿瘤纯度均为60%,每个样本用正常对照样本DNA进行稀释,得到肿瘤纯度30%、20%和10%三个梯度水平的样本。利用这些样本,采用实施例1制备的探针,按照实施例2的方法,获得质控通过的测序数据,使用cnvkit软件计算CNV,结果参见表17所示。
在肿瘤纯度≥30%时,CNV均能检出;当肿瘤纯度<30%,扩增可以稳定检出,缺失无法检出,因此,本发明CNV的检测限要求为肿瘤纯度不小于30%。
3.CNV纯合杂合注释
选择1例已验证RAD51B纯合缺失的标准品和2例申请人公司内的BRCA2纯合缺失样本,用实施例1的探针,按照实施例2的方法,获得质控通过的测序数据,使用cnvkit软件计算CNV。
由于杂合缺失样本缺失,因此利用模拟软件,模拟BRCA2杂合缺失样本,获得模拟的测序数据,再使用cnvkit软件计算CNV,得到BRCA2杂合缺失的数据。
纯合杂合注释分析方法:利用NCBI Assembly的GRCh37.p13得到基因的外显子区域,利用bedtools软件的intersect进行拷贝数区域基因注释,完成变异区域的外显子注释。如果CNV变异区域覆盖基因的80%以上的外显子区域,则定义为是整个基因区域的覆盖,获得每个基因的注释拷贝数结果,按照检测基因列表和阈值为0.6和1.5的拷贝比值进行变异区域的筛选,根据TCN(肿瘤总拷贝数)和BCN(次等位基因拷贝数)进行纯合、杂合注释。针对常染色体的变异区域,如果TCN和BCN均为0,则表示该突变为纯合缺失(DELL);如果TCN为1,并且BCN为0,则认为该突变为杂合缺失(HEMIZYG);如果TCN大于2,并且BCN大于1,则认为该突变为拷贝数扩增(DUP);如果TCN大于1,并且BCN等于0,则认为该突变为杂合性缺失拷贝数扩增(DUP-LOH)。
注释结果如表18所示,表中,BAF是归一化后的次等位基因频率。由表18可见,4例样本(其中1例为模拟样本)的纯合、杂合注释结果均与其实际CNV突变类型相符,验证了本发明的CNV突变检测方法的准确性。
实施例6 多类型突变检测及变异解读
随机选取申请人公司内33例前列腺癌样本,利用实施例1的探针和实施例2~5的方法,检测这些样本在HRR通路上不同类型的突变(胚系、体系、扩增和融合变异),并根据各项突变检测结果,以及ACMG等胚系变异解读指南以及ASCO肿瘤变异解读指南预设的变异数据库,对变异按照以下步骤进行分级(参见图3):
1)无义和移码变异:此类截短变异如果在已知的最大截短位点之前,判定为P/LP(可能致病变异/致病变异);
2)剪接位点变异:在外显子上、下游第一或第二个碱基的变异(但排除经预测或已明确的可产生可能恢复基因功能的自发框内RNA异构体变异)以及经mRNA水平的实验证明影响剪接的变异,判定为P/LP;
3)错义和非移码变异:经过人群数据库、变异位点信息、文献人群数据、功能研究数据、共分离数据、等位基因数据、表型数据和计算机预测数据等证据累加后,判定为P/LP;
4)起始密码子变异:造成密码子丢失的起始密码子变异(排除意义未明变异及有证据显示或预测存在其他可替代性起始密码子且能产生功能蛋白的变异),判定为P/LP;
5)大片段重排:覆盖范围内破坏蛋白功能的基因重排,判定为P/LP;
6)拷贝数变异:基因纯合拷贝数缺失,判定为P/LP;
7)上述判定为P/LP的变异,再根据靶向治疗的敏感性、耐药性预测、对疾病诊断或预后的影响,将变异分为临床意义明确的变异(Ⅰ类)、有潜在临床意义的变异(Ⅱ类)、临床意义未明的变异(Ⅲ类)和良性或可能良性的变异(Ⅳ类)。
33例样本的突变检测及变异解读结果参见表19~21。
实施例7 覆盖度和均一性验证
使用实施例1的特异性DNA探针,按照实施例2步骤1~6的方法,对26例临床样本进行实验和分析,测序QC如表22所示,不同GC含量区域的覆盖度如图4所示。由表22可见,所有样本有效深度都在1000X以上,基因的覆盖度和均一性都较好。由图4可见,高AT区域覆盖较好。
实施例8 样本污染检测
由于污染的临床样本较少,因此本实施例采用两样本混合,模拟样本污染的方法。
选取两个细胞株样本HG00556和HG00119样本,将样本HG00119的测序深度均随机抽取到495X、490X、475X和400X,然后把样本HG00556的测序深度分别随机抽取到5X、10X、25X、50X、100X,分别与上述随机抽取后的HG00119的样本混合在一起,模拟测序深度500X,污染比例1%、2%、5%、10%、20%的情况。
利用实施例1的探针,按照实施例2的方法,对上述5个混合样本进行样本污染检测,获得如表23所示的结果。由表23可见,各样本检出污染比例与实际模拟的污染比例吻合,证实了利用本发明实施例1筛选的56个SNPs质控位点,按照实施例2的方法,可以灵敏地检测出样本污染,并且可以根据野生型和纯合子污染的比例,通过计算可能的污染位点个数和突变频率平均值,预估样本污染的比例。
上述实施例仅为本发明的可行或较佳实施例而已,是用来说明本发明的,并非用以限制本发明申请专利的范围,因此,凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰,均应属于本发明专利涵盖的范围。
序列表
<110> 上海仁东医学检验所有限公司
苏州仁东生物工程有限公司
<120> 同源重组修复基因捕获探针组、试剂盒及其应用
<130> PDYS-LHJ-NP-21-100978
<160> 331
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atccttatct tttcgtttga accttgagtg gaacctagat attctggatt aatgtataaa 60
tgaagttcat ctttatatgg tgacactcat actctagttg actacctaat agttcctctg 120
<210> 2
<211> 119
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caatctgtaa tctatagcag agtaaagcgg aagttgtaat agtgttgggg gatgggggaa 60
gtcagaagaa ccaccagtga atataaaagg agaagagaat cagagccatc tgctaataa 119
<210> 3
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tactcctatt gttatgtgtt aaataagaac cttaatacca gttgagatgg aagtggtaga 60
caaagcttac tagctctgat aacctcctac ttatcagctc caaagcatgt tttaagcctt 120
<210> 4
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctaatccaga atatattcat atttacatga gttgtgttct gctcatagtt atggcaataa 60
atatattcaa ttttaagatt gtcagtatgg aaaaatggca tttctgctgt gacgtaaata 120
<210> 5
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaatgctatt ataggactta gaactaattt tgctttccaa ggtaaatatt ctccttgtaa 60
tcttatgtta ttctaataaa ttcattcttc ataaagagtg ccaaaaaact tgggatcatt 120
<210> 6
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttattatgta gcttttgaat aaagtcatga ataatatatc aggtgcctga tatcagagcc 60
ggaattacag ttgaaaaata ccatctccat cgtcaaggag ttgacagtgg cagaagaaaa 120
<210> 7
<211> 119
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttcagtaggt atacaaaaca atgacaccta aactcaacca tgatttaagt agaaagggag 60
aaaaccaaga gagggaagta ccataaaagt gaaagcaggc agggtgcagt ggctcacgc 119
<210> 8
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgtacagaac ccagtgattc attagatgtg tagagtgtgt gctagggagg aatctggtgt 60
tgtttcctgt ttatagctgg gaggtactga gagaccacaa aggaaggaag ttatggtcag 120
<210> 9
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tctgggtttg agaataagtg aaagtaggat ttgacattaa caagatgatt ttaagtcagg 60
tgtcaaagtc ttctaataca cgaactctaa aagtttagaa gctttttttt ttcatggaaa 120
<210> 10
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttcccctgag aataaatgcc ttctcagcta atttcttagg agtcatttgt agcctttacg 60
ttactctgaa cacaagatag gctgtgtctg taacagggcc ctcaacaagc ctagagacag 120
<210> 11
<211> 119
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ttcttcctac ctgtctaact taactaaagc gcttctaatt tctgtgctca agctacactg 60
tcaattattc agtttctcaa acctagtggt ttccattttt ttaaattgac ttttatctt 119
<210> 12
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ccaaggctat tcagtgtgcg aggtaatcta atctcttttt cttttgtttt gtattgaaat 60
acttttgatc ttgcaagacc atgttttaga ctcagtaact aaaaattcta ccttaaaata 120
<210> 13
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ccatcatccg aaaggagcca aaacccaaga aaaaggtata aaggaaatgt ttactgtttt 60
gaatttgctt cttcattcaa acatagaagt ctaagtataa aattagtgtt ctttaggagg 120
<210> 14
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atgactgaaa tggtgagaag tctgaataat atgtcatttt tacactagtt gaaggaactc 60
gtaatatttt tctcttaggc cagaaaaagg catacggaga acttggtcct catatgaaag 120
<210> 15
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gtaatttcac tctgtcaaat attttcttaa tatttcttaa aatttcttaa atttaaaaac 60
ttgaatccct ttgaaagtaa aggtttttgc tttactttta gatttcttag tgcttttagt 120
<210> 16
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ccagagaggt taagcaactt ctgtagggac agagatttat agattatagt caaactcgtg 60
atcagtgctc ttttgattac catgttgatg gaatgtttaa gtgtaagtga cttctgggga 120
<210> 17
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
attaatgtaa aggaaaaaca gttttttggg tttctttgtt ttcctgtttt agaggaatcg 60
tttggtgact aaagagcaag gatgtacaag ataactcaga aataaaatat tgctaaatat 120
<210> 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
aggtgaggaa acgaggaaga caaaacagga tgtaagcact aggataaagg aatggagtcc 60
ctcgtccact taacctttcc acagattggt aattggaacc aaatgattgg agagcagacc 120
<210> 19
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
atgcttaaca tttatatctg gtgtttttaa aaatactttc tgaatttgcc tttgagattg 60
taacttgtat tttttctcta tctattagta aaatttgcta ctgaataatg acatttgata 120
<210> 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gccctaatag taaactattt atctacattc cattcaagat agagaaaaca ctgtctgcca 60
agaataattg tttttatttc tttgttgctt ggttctttgt ttgtcttaat tgcagaagag 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ttttataagc tatctgctgt tatactttat ttatttagca gtgcatggta ttctattgtg 60
tggtgatagt gaatagtata tatgtatatg aaagcttatc tgctcttttt tttttttttt 120
<210> 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
taattagaac ctctgatcac agtaaattgt aggctgagtc attggtggaa tccctggtca 60
tgtttcccac ccttggtgaa aatgcacgtc aatcccttag agtgagaaga caagtttggt 120
<210> 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ttcaaccact ggtctattat ccccaagcat tattttggga gagtggagac ttacagtttc 60
agaatcttgc tcaagctctt aactgcaaca gtggtaataa tgatcattta ttgaattcc 119
<210> 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gtgagccact gcacccggcc tatgtttata tactttttaa agtaaatgat ttgtggataa 60
acctgatttt tttccctcct accatcttag tatctaatgc ttttaaagga gcttcctgga 120
<210> 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tgttcacttt aaagttataa aataactgat gtgttctgtt aagcttataa agttgaactt 60
tttttttttt tttaccacag caatgtgtgt tctttgtatc gtcgtgacca agatgtttgt 120
<210> 26
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gcatattcca cataatgaca aataagttta gcacagaaag acatattgga agtaacttac 60
aataaccttt cagtgagttt tctgagtgct tttatcagaa tgattattta actttggaaa 120
<210> 27
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acatgatgct tcaaaaacat caaagctgaa aatcatttga gtaactttaa aatgtaagca 60
atcaataata aaagattact atattgttca gcagtcacat aaagtattaa aactaatatt 120
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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attttaaaaa tccttttata tgtgatctga ttaaaagcta attaagggaa caggtgacaa 60
tgggaagaaa tggattgagg agaagaatct cacacaaaat caaatcattg tggtgtttac 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctttggagta agccagccta taatcagtta gccttttacc tctcagtata agacttgttc 60
ggtgtttctt aaaagtatac aaatacatta cctaataatc ataagtgtta tgtattgttt 120
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acttctatta gatttagaaa cttaatgtaa aactttattt tgctaacttt aactctgtag 60
aagaaaaatt tgaaaatgga gaggtttgaa acaactaaaa agtaatgttt aggtatcagg 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caagggtcaa ctgcatttat gttagttgat tatgcagaag aaataaatat aaattcaagt 60
ctccattttt atttgtttat tgttttgttt tttctttttg ctaagggtgc tactgaacaa 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caacccatga atttttttgg ttatgtcgtg ttgtctccct ctgattggct tttaactaag 60
tagaaatgtt ttaaattaga aataatccaa aaaaccattt gaataatttt cttctgccat 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
acctattcag aactggttgt aagtctgcag tctgaaggga aatggtgagc agaggactcc 60
tttcccaaag acagctggaa cagaaatagg cactccagag gttatggaat ttgagagaga 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
aaaattgaag aattggatta agggggcctt gtttggctga ttttcatact ttttcctctt 60
agtctacagg ttggctgcat agaagaaaaa ggtagagtta tttataatct tgtaaatctt 120
<210> 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtactttcac atatgtaatt tcatgctgtc taaataagtg ttgattgcca tgtcttaaag 60
tactgctttt acagtactgg catagagctt tgattctgat ctgaagtaat actgaggctc 120
<210> 36
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
tttgtaatca attacagagc acttggtact tttgatagtt ttatctactg tgctgaagta 60
gagaggtagt caaaactagg gatagcagtt cgcaacgtta tggtggtatt tgagttacta 120
<210> 37
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
tgatagtctg tatttgactc tatgtaaata taaaaacata tttaagtatg ttaagatgta 60
aagttatact actaaagaga aatttaagca tttccttcca gttgagtatg ctataacaat 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
taattttttt cttttattaa gttttatttc acaggcttaa ccaatacgtg ttaaaagcaa 60
gttacatttt ctcttttagg aaattaacca ttttctctca gtaagtgttt atgatgcact 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
accattcaag tcctttccta cagccatttg aggggaaacc taatgtaaaa taagaagcca 60
acatcatctc tagtttaggt gtttagattt agtgaccacg ggatggagaa atcacctggt 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
gaagctctcg tgatggtttt tgtttctaat tagaaaaata ggaataagta gtgtttcaca 60
gattctacta tctttcttca acagccttaa cttctcatta ggagcctaat atctacagta 120
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<211> 119
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
ttgaactgtg tgtttaagat tatggaattt gtgtgatacc tcaacaaaaa ttttaacagt 60
tttaaggttg attctctctc tctttttttt tttttctttt gtcacccagg ctagagtgc 119
<210> 42
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
cactcggcct taaggttaat tcttgaagta cagaaaaaca gcattatagt tttgaaatta 60
gaaaatttca gttttatgta tgatctctta cctatgactc tactgaaata gaatttctat 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
cgagcattaa atgtttcatt catttcatag taattcgaaa ttggtttttc tgaaacagat 60
gcacagaaat attagtgtga cttcaactta agaatactag gaagcaggta caagtttttt 120
<210> 44
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
ggggcagcaa tcagcatagc ttttttattt ttgaggatat agtacaattt atctcaacga 60
agagtaaagg tacataccaa atgaaacaaa gtttgtactc ttccatcaaa tgtgtaatct 120
<210> 45
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
tctgttacta acgcttttca actctgaaat tgtatttaaa gtggtgatat aatttcattt 60
gtaagcaata ttctgtttca ttatggtaat ggcctagact ggaaataaac agttacagtg 120
<210> 46
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
taaactatct aaaatgtatc tcttatcttt aattgggaaa atacaggtat aagtgattta 60
agcatttaaa actttaatat gtaatttaca gtactattaa aaacaatttt tattacatag 120
<210> 47
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
aaatatccaa aattataatc caaaatggct ataatgtgac tgatttattt ctgtgactaa 60
ttaagtttca tttctttatc tacctatatt tctagtgaat ttaattcgct ttcctctgac 120
<210> 48
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
tttttaaagc ggttataccc atttgtgtac agaaatgtag ttgataagga agtggatcgg 60
taggaagcct tatatttgaa gaagggtgcc aaagtataac tgttcctagt ttagttaaaa 120
<210> 49
<211> 119
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
tttttatctg ctctttctca ggtgctttat tttttaatat gctgttctcc ctctgaacta 60
tgttctgaac attttaaaac ctctcctgtt taaaaattcc ctttctcaca aagacaaaa 119
<210> 50
<211> 119
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
ttgtgctatt tttcaaagaa aaatccacga cctttattct taccaaattg agttttcaag 60
agtcagactt tgtaggactg tattttctaa tgtacagttt ttttgttttt ttttccaga 119
<210> 51
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
aaagttaact actaatagtc tactgttgac cagaagccct accgatgata taaacaacac 60
aattttgtat atgtattata tactgtattc ttaaataaag tagcttgaga aaagaaaatg 120
<210> 52
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
gtagactagt tgtacattta ttttatgcat tcatgacata acttttaaaa aatttttcag 60
tagttctaaa ctgtgtggtt tgtgaatttt ttcaaattgt ggcaaacctc caaaaagttt 120
<210> 53
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
cagtatgttg gtggatattt acacagccag ataaactcta gagataagac tagaacttat 60
ctgtttttca gaggattagg ctaaacattc agggatactc ctgaagcaga gggatgcaaa 120
<210> 54
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
tatatataaa aaaatatata gtagatgttg caagctatag atagccctaa atccttcagt 60
aagatagcaa taagcagtta atgcacctag gcttgaattt tactctctta ttccattagg 120
<210> 55
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
caagctgttt ctatccaagg gccttagatg tatcttctcc ttttccccca gttaccatgc 60
gggtggcttc ttttcattcg gaccctagtt aaataataat gtatcttcag agaggccttt 120
<210> 56
<211> 119
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
attcataagt acattggcag tacttactgc cagaaatcaa gaaatttttc ctctgaatga 60
aagattatcc tgctgaaaag agtacagaat tctttaagaa acagtgaata gaatggtag 119
<210> 57
<211> 119
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
ctggctgttt ctttggtaga gaaataggaa gaagagaagc agagggaagg ttggatgaac 60
tggtgcacaa atgcttatgc tctcagatta cattccattc atatacatca accaaaaca 119
<210> 58
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
cagttatttg ggaaggatac tattcatata aactaattgt gcaatatgcc ttttctgttc 60
ctttaataat gttggtaaat gaaacctttg ccagatgcca gcttttcctt cactggattg 120
<210> 59
<211> 119
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
gaaagagtga cttggtcttt ttatctgata tagttttgag ctctaaaggt cggcttaact 60
atatatagat tatcttggtc ttttgggttc ttttcggttt ttgttttttg ttttttttt 119
<210> 60
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
ttaaattctt attacttgaa aacgaatggg acttcacata ttgtttctct aagcaaacaa 60
aaagtattga catgtctttt agttgcattt aatggtaatg tgacaggagt atgttatcta 120
<210> 61
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
ataatttctc agtattatat ttcctttgcc caagccctaa aatactcaaa agcttctcct 60
gctttctttt ccattgcctt ctgttctaca cctcccatct ttcttatgaa ggtctataga 120
<210> 62
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
tttcattttg cagtttagtg cttagtatct agttacttga tttgaaatgt agctgtatca 60
tgtggattaa ctgctgtttt tctagctata tcagctaggt gatttcgctg aatgtttcct 120
<210> 63
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
aaaaagccaa cccattcctt tctgtatcaa tctctcaaca aaaaataagg gtttgattcc 60
ccctccccgc cccagagcta gatattgata gagagtaatc aatgtaaaag agactttaga 120
<210> 64
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
ccctcagaaa ggcctccgac catgttgcca ttacccactt tctctctttt ttaaacttaa 60
gttttgttct cttatactta ttatctaata ttatgaaatg tttattagga tatatgttcc 120
<210> 65
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
attgttcatt ttattgtgct ttctgtgaca tgttttttaa aatgtgtgat aagtgctata 60
ggtgttgtga tggaagtctg tacagggcac acagggtaca gtgtaggtat ggaggaggaa 120
<210> 66
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
gagttttgta aatgagttgt ttttccaggc agaaggagca tataagcaaa ggagaggaga 60
catgagcagg aaaagacaac ataagcatag gcttagtgtt tgaggaagaa aagatgagat 120
<210> 67
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
aaccaaccca tcttcattat taaatcatat gtttcttgtt catcctgatt cttagtgtct 60
acctttttat aacttatgca gaagagaatt ctcctacttc aataaataat aaaaagacag 120
<210> 68
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
taattatttt tgttcttttg catataacct ctaaatatca tcacctagtg attaatactt 60
tttaatagaa ttttgttttc agaatagaaa ccatgagata tatttaaata ttttgtgtac 120
<210> 69
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
ggtcatcatg gaatgttgtt tgcctaccaa gatattacaa atataagaga cagataaatt 60
gaagcagtaa atattgggtt tttttgtttt cagcataaac agttgtccta gaagaaacag 120
<210> 70
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
aagtgatgaa tttagttttg ctcattattt tgaagtatta atggaatttc taggtggaat 60
agacagttta atatataaga aagaaagaat atatagcttc tatgtatata tatagacagt 120
<210> 71
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
actaggtgat aatttttaga ggttatatgc aaaagaacaa aaataattaa aggaaataag 60
ttatcacagg tttcattatt ttccaaagaa attctcagaa aataatatat tgagaggaga 120
<210> 72
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
atagaaagca tgctcatttg ctaagaattg gagggatggt aactggcctt aaaagaacaa 60
ataaaattct aaaatttacc atggaaatga gaccaagacc tgactagaaa gggataaata 120
<210> 73
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
tagagctaga aggtggggat ctcaacagag gagccagact ttatctgaga atgaaaggag 60
agtggtctgg aagatgcaaa ttagaggtag gagtatgcca acctgagtcc attcaggtcg 120
<210> 74
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
cctagcagta acaaggtggt gactcccaaa ggcattaaag gcagaagttt aaggaagatc 60
ctgagtctcg taataactaa aaggtgtagg tgtcaattga aaatcattag gcatacctgg 120
<210> 75
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
atgtagatta ttaagcatag gctcagcata ctacacatga gagtatacag ataaagatac 60
gttgacaaca ttggtgtgta acaaaatccg tatttataat gtgtttgact ctagatgctg 120
<210> 76
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
ctcagctttt cttcctttaa cctgatttat gttggactgg ctgcatgtta gtattacttt 60
tactgcattt aaaaaacatt gatgctgatc aaattcaaac caggtttcta gagatggggc 120
<210> 77
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
tgttcataca tgttgtcatt tgttacagtt tgccattggt tctgcagtaa gaataaatga 60
taagaaaata agcatgatgt gtaacatttt aaaaaaataa tacatggtaa catggatgcc 120
<210> 78
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
ttcttctctt agatttcatt gaggcacagt cactatttct gaactgatct ccccgcttcc 60
taagcccctc cttcagagca ctttaacctg ggtgtatttc ccttttcttt tcagtgtatt 120
<210> 79
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
gtttctccac agtatttaat ggtcctggag gacactcaaa acagcattaa aaaatagaga 60
gattttggtt ctgctaatct agtacgtgtc ctgaaactaa atctgctaaa ggcattttat 120
<210> 80
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
ttctgtgttt ataaatacca gagcagttag ctgttctgaa ctgccaatat cagaaattcc 60
tcatgaactc actttctaaa atttacgacc taaagctact tgctctagcc atgtcagttg 120
<210> 81
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
atgggaattg gaattgagca attgggagga ggcgctgccg caggcgtttt ctgccccata 60
ccgctcccta tatcctcttc ctctcttccc cagaccccca cctctccctc ctccttcccc 120
<210> 82
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
aatcgcatct accccatagg agcttaggac agtcagttac acaagcacat atagtatggg 60
attaatgctc ttaaaagtat atgagtagaa catgtatata tgtgatgtgg cttagaatta 120
<210> 83
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
atagaggtaa aatcgttttg gatgagtcat gtttaatctt tggaagtttt agaagaaatg 60
gaattctgta atgttaaaac tcttttcctt tttagagttc aacttgctgt gaatagagta 120
<210> 84
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
gggggaattt caaggttact aaataaatca gggttagtat aagaggaagc agaggctttg 60
aagtcatggc ttgcattctt gatttggata ttggttttct ctttataatt tttctgtgat 120
<210> 85
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
gacatttaag ttgtttctaa cttataaaat aggacagtga tggcttctat caatttgtgt 60
aaaaggccaa tataaaaatt gcgtcatgct ataatatttt ttatgctata atatttttta 120
<210> 86
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
ggcatagtgt ctgtcactaa gttacagtag atattcacta aacataagtt aagtcctgcc 60
tgcagttttt gtgtgttgaa gatgggaagt tagggtggaa gttgggtctt ctgatatttt 120
<210> 87
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
gactataatt gtaggtctac atcgttggtt taaaggctgt gataatattc tgccatgtgg 60
atatgcctta ctttactctt ttaatcactt tgttggagat ttttctaaat tttcacagat 120
<210> 88
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
ctttactctt ttaatcactt tgttggagat ttttctaaat tttcacagat acaaaagaga 60
tataagtatc tgtgtaactt aatcatgaca cataccctta aattgttcat tgaaatcccc 120
<210> 89
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
tctttctctt ccccaggaat aatatttaga cataagtagg ctaacagaaa atgtgtttct 60
tacctcaagc cataggcttc tctaacatga ttctttcgtg aatgttgtcg taatgtttgt 120
<210> 90
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
gaagcggtag gtgttttctt tcccataccc tcatgtcctt tgatctggac atggtacagg 60
tgtcctcctt attcttcatt gtcactttct cccatcttcc tttatgtctc tcccctctaa 120
<210> 91
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
gaacttaggc aagctcccac caccatctcc tccatactaa ctgcctctat gctcatgtat 60
tctctttcat cctgtattgc tgtagataaa ttgctctgga tgtaagccag gtctttctct 120
<210> 92
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
tccttttcaa agtctttccc atgttggtta atggcaactg cattattctt attatgcaga 60
tcagaaactt tggaatcatc cttcattttt ctcattctct tttacttcac atccagtaca 120
<210> 93
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
ccagagcaca agtagagaga tgaacatttg atgggagaat ggaagggatg aaaagatgta 60
taataataca aataacttag ctttggtagg gataagttga tgtagtttct gtctaatggc 120
<210> 94
<211> 119
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
ttttatttta aaaagttcta gtcctttagc caggtctgtt gtcttcatag aacattgttc 60
tgttacccat aaaagatgcc attaagactg tggcctgggc cgggcgcagt ggctcacgc 119
<210> 95
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
tcttaaagtc cttttttaat gtgtaaatct tagatatata acttttaaat cacatgtatt 60
cttttttggt caaggaagaa agagaggagg gaggccttca tgcaaaataa ttttaagtca 120
<210> 96
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
atggaagaaa agttgtatga atcaggtgtg tttcattgat tttcattata ccttttcctg 60
aagaagaatt taaatatttg agtaaaagct atcattagta tattttttaa atataggctg 120
<210> 97
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
tcatttaact ttttgagaaa ctgtgaaatg atttttccaa agcacctgta ccattttacg 60
ttcccatcag taatgtaaga gggttccaat ttctctacaa ccttgccaac acttactgcc 120
<210> 98
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
atttccttaa attctgtata ccaaaaacaa aaaatctgca gagtgttctg tatttgtgtt 60
ggggcacacc tgcaatactc aaccaagaag tttacaacgt tgcttcagcc ttcgctatct 120
<210> 99
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
acatccttac tcccatattt ggagtcttgg cactgtctgt tagctgagtc ttttctttct 60
gcatcattca gctaggctga gcgtctttcc atgccatagg aacgttctaa aagactgaaa 120
<210> 100
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
atttcgaagc attttaatat ttttcttaat ttatgtcttt taataaaaat tatgatttgt 60
tacaaatatt tcattataat ttaatgaacc tttaccagtt ataataattc tgtgattgct 120
<210> 101
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
taaaatttac tacctgaaga taacagttca aattttgatg gaaaaatcaa cctatgcttg 60
tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgta atgtgtacag tgtgtgtggt tgttgagata 120
<210> 102
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
ctaaagtgat tgtacagatt agtgtttcca taggagaaaa gtgtacagtt actggaaaaa 60
cagtttggaa tgatctaaag cataagaatg ttcatagcaa cagaatgtat ttctagtatt 120
<210> 103
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
atagattttg atgtatgtca tgtttccatt ttcatttgtt ttaagaaatt tttaatttta 60
cttctaattt tttttttctt tttacttatt ggtctttcag aagcacattg tttaattttc 120
<210> 104
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
ttggtttata tggaaatgtg ttaccttcgc ttttgaaggg ttattatctt ggagataaca 60
ttctgctgac agtattttcc cttcattact tcgaagtatc tcctcttgtt ttctgctctc 120
<210> 105
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
ggctttttgc cagcctgtga tgcatggatt gagaagtacc ctccagcata agctcacaaa 60
tctctctttt tagtggtgac ttctcttcag ttcctttgga ggagctttca aatctttttt 120
<210> 106
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
aaaatgattt aagcattatg aactgctgca atatatagca aataaggaat cattatacta 60
ttatcattat gttagtagtg gactactgaa gactagaaac tctcaagagc caaagaagag 120
<210> 107
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
cttctctttc tcttctattt gcttcctctg ggaacttgcc ccccatcagt tgcccactcc 60
tttcttatat tgtcagtccg tttctatgga ctcctttttt ggtttacaag gatgctcagg 120
<210> 108
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
aaatgacatt tctagtgagg aagaagaaaa actacaagag gagtcaggca gtgtggttcc 60
tgggatggaa ataaccagta tcccttattt tagggatgag gaactgagag taagggtaaa 120
<210> 109
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
agattttcgc caagcaaatt cgagccccgc cccttccctg ggtctccatt tcccgcctcc 60
ggcccggcct ttgggctccg ccttcagctc aagacttaac ttccctccca gctgtcccag 120
<210> 110
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
ggcacgctgt atttgcctta cttaagcccc tggtaattgc tgtattccga agacatgctg 60
atgggaatta ccaggcggcg ttggtctcta actggagccc tctgtcccca ctagccacgc 120
<210> 111
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
tatacaaagt ttccaaatat tgataaattg cattaaacta ttttaaaaat ctcattcatt 60
aataccacca tggatgtcag aaaagtcttt taagattggg tagaaatgag ccactggaaa 120
<210> 112
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
tatgccaaaa aaacctagga cttgttttga tgttaattaa actaaactat atttctgcaa 60
gctatcacag aggacagaga ttattttacc gatatactat aagtatcatg atttggaagg 120
<210> 113
<211> 119
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
acatgcaaat ttcatcatgc tacttattgt gtcaaacctt agatcacctc cctttgtcct 60
tatagcaaaa tctaaacttg atatggcttt caagttcctt tgtgatcagg cccctgatt 119
<210> 114
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
gaaagatata cctaaggtca aatggttaat tctttaatca taacctgcta gaattgatct 60
ataaccaagg aaggatagta aggaattaat aaggccactc tcaactcact gcaaaggagt 120
<210> 115
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
agttgttgtt cttgtgatgt tgaattggct ggttttctgt atattctgtg attttttaag 60
taacaaaaat aacagtggtg aaaagcagta agtcagtcct tgaattatca atttaaaata 120
<210> 116
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
agatttactt tttaaaatgt aatataaaat atctaaaagt agtattccaa caatttatat 60
gaatgagaat cttcttttaa aaataagata aactagtttt tgccagtttt ttaaaataac 120
<210> 117
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
tagtaactga caataatttt attctattaa gtgtagattg gaataaatac aaatacattt 60
agtggtagtc cagtggtgtc aagcattatg ttttagtacg atgtgattaa cgtagaatag 120
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<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
tgctgtaagt aaatatgaca ttgattagac tgttgaaatt gctaacaatt ttggaatgcc 60
ttgttaaatt atttatctta catttttaat ttcctaatct gtaatttatc taagcctttg 120
<210> 119
<211> 119
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
ttgtttaggt ctttaattac cagtgtttag aatcaggtca ctcaaacatg gtagataagt 60
ttgcatagtt tgtgtatatc catcactctt gagacagttt tattttaagt tccggggta 119
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<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
aggcatgagc cactgtgccc aaacactacc tttttaactt agtgaaaaat atttagtgaa 60
tgtgattgat ggtactttaa ttttgtcact ttgtgttttt atgtttaggt ttattgcatt 120
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<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
ggggagtatg gtttgatata cagatacaca gattcagtat tcgtatacag atttgatatc 60
ttggtataca gattcgatat ctctgaatct gtataccaag aaatcatgtt ttaagggtct 120
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<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
gcctctgtag aatttttaaa taagaattgt ttctattact agtactttaa tgtaatttga 60
taattgtaaa aagcctctta actctaattc aaggacctac ataataaatt actccttcag 120
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<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 123
tagaaagctg tcaagcttac agagccagat acaagcttcc caaaaattct gattttcatc 60
taaaagcttg aatttttccc cggcaataag tattgtcact tatttttctt gtaggtgaca 120
<210> 124
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
atataccaac agtacaaata tcaacagtga aaaggacata cataacattt tactaataag 60
acagttttga cagcttggat tccctaaaat ggttgtagat acctaacagg attccactga 120
<210> 125
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 125
ttcacccacc tcttgcttac tataggtaat cttttttagt gttttttttt caggattctg 60
tttaataaaa ataagcaaat acatgtatat actcattacc ctttcttact caaaagatac 120
<210> 126
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 126
ccaatttcca actagtggac ttattgaaga tttaattagg ttccagttac atactgagaa 60
tgaacaatat ctaaagctta gcttttaaac cttcataaga ctaaatttta aatttggtat 120
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<211> 119
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 127
tgacagcttt gtaaagtaga cagattttat tctaatttta tggatgaagt actaaggttg 60
agaggaatta aggaaattgc tccgaatcag ttaacaaaaa gattgcagat attaaaaat 119
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 128
agaaagctaa aacctgacac tagagcaaac agagatgctt tcccctaaaa aacctgaaaa 60
agattcaaat tggcagcaac aggtacttct gaaggtgaag tagaaaatag gaagattagt 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 129
gggaatatgc ctgacccaat agaaaagacc aaaaaatact gacagttgag gatactcaga 60
tgaaacagta tagccagtca ccagaccagg aagttaactg ttgacatgca cagagcttcc 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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actatgaaac atagtcacca aagtacaaaa tccatagcag aaaggaacct agaggaaatc 60
gactatgaaa acttcataaa aacctactaa tattctcagg taagaaaaga aaaaatggcc 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaataatgg aagaatcatg aaagttccca gaatacagaa taaaatgaaa aaaggtatga 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttataatgta atataaattc tagaatagat gtaaaaagtg atctaagaac atagaaaaat 60
tatcagctaa tcacatgact gctcaatggg aaaagtactt cagacagaat gtaaagaatg 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaataagatt ggtgttttag aagtatacca aagcaaaact gttgcaagga gattagtaaa 60
tacaggtctt aacctagcag aggaggtaga gggtagagaa tgattgagat agaaattcag 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctagcagagg aggtagaggg tagagaatga ttgagataga aattcagtag atttggccag 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtaggaacaa ccctaggaga aaaatcgggc atgaggataa aggatatttt cattgttagg 60
tgataattta agcaatggaa atgactcaca ttagcaaggg aaagtgtcta aggaagacat 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 139
cctttaggta ttgtatgaca atttgtgtga tgaatttttg cctttcagtt agatatttcc 60
gttgttaaat aatgtcctga tggttttccc cctttggtgg tggtaatttt aaagcccttt 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tattattttc tcgtactaaa tagactgcat aaggtagaag ttaagaatga ttgccctgta 60
gtctaagtgg aaatgtggag gctttcgtta gttttttctg ataattcagc aaatctctat 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccaaatgaag atggaatttt agggaataga aaatgaccag ctgtggaagc tgcttctaat 60
aggtaaagta agatgaggac tgagattggc cgctggattt agcactgcag aagacattac 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aatagttgta gttgttgaat tcagtatcat cctatgtggt ttttatgata atattctact 60
tttatttgtt cagggctctg tgtgacactc caggtgtgga tccaaagctt atttctagaa 120
<210> 143
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaattaccga taatattgta cattcagatt cacttaagag gtaaccttgc agagaattta 60
cttctgtggt attctggatc actctaaaga gaatgtttta taaattaaac atttttaagg 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 144
tctcttaatt ttctgtgtcc ttacacagga gctataaaaa tcctgcccaa tatgttaaaa 60
tttctccatt ggttccattt ctgtttcttg gagaacccct ggacctcttc atatgcttac 120
<210> 145
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 145
caattagagc ataatcatac caagaaagta tttcaagtaa cttaaaaaat gttttatgtc 60
cctagtggta tataccccaa gaacaacaat agcaacaaca actataaaat gaaacaaaat 120
<210> 146
<211> 119
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 146
agagctgagc agagtaagga aattaatagg gagactcatt gtcagtgtaa gaattttatt 60
tcagtttgtt gtttgttgtt tgttttttgt ttttttgttt tttttttggt tttttttgt 119
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<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttcgatgaat atttgctttt tgtattagcc ataatcattc tcaggctgct ttgtcattta 60
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<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttttgcattt ttgtcatggt agttattagc tttcatgtgt tattatgcct ggaactagga 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcctcatgat ttatatagat gtaacatgtt ctataggaca tgtaatttac atgtcctata 60
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<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tttctgggat tttcagtgat gtgccagacg agtgtggtgg tatgttttca actatatacc 60
gagtagagga tgggagggtt ctagaatttt atatattaat taaatttggt ttaaaatgca 120
<210> 151
<211> 119
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 151
gaaatgtttc cgaagcacta aactgttaga agtagcatag gctttagaat cgtggcactc 60
tcattttatt agcaaagtaa atgacaataa aatagctggc caggcgcggt ggctcacgc 119
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<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 152
ctcaaaataa tgagcattca gatattagcc atctgtaatg tagttggtga tgattatgat 60
tattagagta catttataat tggaggatca tttttgccgt agggaaatag aattattaat 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 153
ttaaccacac ccttaagatg agctctaatt ttgttgtatt tgtcctgttt aaagccatct 60
agttacaata gatggaactt ttttgttctg attgcttttt attccaatat cttaaatggt 120
<210> 154
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 154
gctttaacac cgtggaggag cactttcagt ggactgaagt ggggcaaagg aaatggaggg 60
aaaggaggaa tgatagtgaa tataggcatt tcaaggattt ttgctttaag agaagaagag 120
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<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 155
gcaaagaatt tgggggtata tgcaaaagga ggatttaaat aattgacctt ggacacaatg 60
cagagcaaag aagagacatt agaagacgtg gatcaatgaa caggagataa gaaaagctga 120
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<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agagggagtg aactgggcag atcaaaggta ggtggttgaa gaaggaggta cttcaaattg 60
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<210> 157
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 157
tgcaacaaga tggcaatgag agcacctgca ggaaagggtg acggtagtgg agatcttact 60
gagttccaga ggccccattg aaaggattcg aggagatgaa gaggtaggag gagatggtgc 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aggtgtatat atttatgggg gagcctgtgc ttgttatggg gactgacaca gatcagctct 60
tggccccaag gcaaggtgtg tgggagaaga aaaagtgagg aggcctagat gtcagaggag 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cagacttacc tggacaaggt agagaacatt tgcaagaagt tttcaagtcc tttctgtcac 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caagcagcct agagggcaga acagagaaaa ggtagacaaa atgataagat cacctgtatt 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atctaatgct ttgttactgt attacagaaa cactgtgata tataatgagt taattaaacg 60
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caccatggca tccactccag gtggaatcgg tgacagtggt tttataaatt gctaagtcct 60
ttattgtttc agtgacattt tctaaaagga attaaaagct ttgaagaatt ctatgcaagt 120
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aagactacca ctgaagtgat gatgtgtctt tctcagtaca tcatatcaag gggttaatga 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 164
aacaatgatt actgtggtat ttgcctaatt atgatttttc tccctttctt tccttctaca 60
ttaattggaa ttctataagg aaaagctgtg ccctttccac caatgtattt atttggttat 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaatcgtcc tcactctttt tttacagcta cgtggtacac cattgtttgg atgtaccaca 60
gtttatccaa ctctatcctg tatatgagct aataaaagtt gcttccaata ttttataatt 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 166
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tttggaaaac ctgagctttc gccaaattca gctattttga tttgctttta ttattagcat 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 167
ttcgccaaat tcagctattt tgatttgctt ttattattag catataccaa aataaatagg 60
catattagag tttcctttct tgcatcttaa aattcatcta acacatctat aataacattc 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 168
taatcatata ttaattgccc atgaacctca ggagatgggg gaatggggaa atgacagcaa 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atcttccagc ttcaatccag atcatatgac agcttgctga ttaaactaga tgacagagaa 60
gatctctttc cttcagatac acatactttt tctctgttcc cctctcccta tcagctagat 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 171
taaaaggagt ttcagtaaga agtgcttctt tctagtgatt ccttttggat tcttaggtaa 60
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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catgagccac catgcccggc gaaacaacct aattttaaaa gactgaaaat gctttggcag 60
aaatgcagtg tctttgcatc cgctagatta gcaatgatta atagttgagt ggaacctaac 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 173
ataatgctaa ttttgattaa aattttaaaa aaatcgagtt ttcccttaaa tttttgttga 60
aaatattaat acctatagaa aaattaaaag aataataggc tgtatgcagt gactcatgc 119
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 174
ctttaatttt aatgagtcct ctgtatattg agaactgaaa tgattatgaa gcatgaatct 60
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 177
tatatttttt acagggaaag cattctaaaa tactatttct tttttccaag atttttgcac 60
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<400> 178
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 179
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 181
gcgagccacc acgcctggcc aattatatga tttttattct ttacacttgt gttcagctct 60
ctaggtagag cagaaaagac agattttcta atgatccaga attagggact tagggattag 120
<210> 182
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 182
ttaatccaaa gtagtcaata agtagttgtt gggttttgca ttgcccaccc cctccaataa 60
ataaatagtt ttaaaataga ttcccaacat ctcgtcttgc agttttcaaa aatattcctt 120
<210> 183
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 183
gtgtgagcca ccatgcccag actgttggcc ctcttaagtc tttctcaatc tagagcaaat 60
catttctttt ttttcccaac aataagtatt taatctagca cgttctaggt actgttgttt 120
<210> 184
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 184
ctgtttggct gaactcaggt ctaaataata tagaaaaggt aggataaaag ttaattcttt 60
cattttatat aacggttttc aaaataatga agtagtttcc tagtatcctt caaagatgac 120
<210> 185
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 185
tgttctttaa ttttgagcaa ccttgtaaaa ttgtctttag ttatttcctt aattacaatg 60
gcatgataga aaaagactct tgactccctt tctctgatca tagagtgtcc ttaataggtg 120
<210> 186
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 186
tcttatgtcc aagtaagttt ctctttactc agtcaggttt accatatatt ttgtcatagg 60
ctatacatat aaagaagttt tatttcacct aatttttaga tcttactttg catatttttt 120
<210> 187
<211> 119
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 187
tttttagatc ttactttgca tattttttat tagctcttca tataaaagca taccattttg 60
gggatggctc ttccattcat agctcagatg agattaaatt tattcagcaa acatttatt 119
<210> 188
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 188
gtagttaatg ttgtcccagt ttatcatggc aacacagtgt aggaaaacat tttagtttcg 60
aacagtatat gagttttatc atagcccttt tgtaattttc tcttctgaag gctttagaca 120
<210> 189
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 189
aatagaaaac cattttattt tgaacaatat ataaattttc tcatagcctt cttgatcttt 60
ccatgagaaa aagagaatgg aattgttggc ttcatgggtt ttgtttgttt gttttttaaa 120
<210> 190
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 190
atgagctact gtgcccggcc cagcatttct taaatcctgt gtgggagcaa atctgcttgc 60
ttgtgttagc caacctccag cttgctttct ttggttttac atggaaattc aaagactttt 120
<210> 191
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 191
tcctcattat ggtgagaagg agattaacca agtttcgtac atatggtcca gaaagtctac 60
aatagatcat tttcctttcc tgaaatatgt acggaacact gtatctcaat tagatgtgtg 120
<210> 192
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 192
gcgaaagcat aaagagtaac aaaatgtgtc atgacatttt gaggcatgaa aaaatgagac 60
atttaaaatg aaatttcatt ttttggatat tgtaagttgc tgttgccagt tgaagaaggc 120
<210> 193
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 193
agctcaggtg ctgttgatac cctcttaaaa atctcttaac attttttttc ccccacatca 60
atggccttgg tttcagttat tctgtaacct agtctacagg agaacatagc accaagtaat 120
<210> 194
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 194
cacaaccata gctagtgatg catcttgaac cacacatctt gaactgtgtg tggtggccaa 60
ctagtcctag cacttggaaa tctgacttcc aaacaaacca ttatcagact atacttcttt 120
<210> 195
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 195
acatttcttt tcccaaaaat aatagtgtat aagaacaatt cctttaaatc tgtttctgat 60
agaagcaatt gaatggaccc cagatcagga agtgcgtgta ttataaagaa aaaaaaggaa 120
<210> 196
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 196
cccagatcag gaagtgcgtg tattataaag aaaaaaaagg aaaatgggga taagttatac 60
gttaatctca catgaccata gcgtgcaatt tattagaggg aaaagcagtt taagttcttt 120
<210> 197
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 197
gtgaaccacc acacccagcc aaaagtccat acttttaagg attgacaaca ttgatacttt 60
agatcataac aatatgattt ataattcata tttttaattc ctttaagaag tattaggctt 120
<210> 198
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 198
aatttgacct caagtgttag ttctgttgaa acataattag gctatttaca taaaaggcac 60
agtttgaata caaaaaaatg gcatagctgg aagaatgtaa gtttagatta tctcactttt 120
<210> 199
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 199
tactgtaaat gtcaagagat gggaagataa ttcatccagt caaaaaaata catgttatcc 60
tggttagaga ctcagcaggg aaaggctaca tgctgagctg gaatccatat actcagggga 120
<210> 200
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 200
aaaagaaaaa aaaaaagaaa tgttcaccga gaatcttccc ctgctctggg cccgtccgtg 60
gtgggccagc tgctgtgctt tcttctatgt aagtaaatta agatggttta ggaagaggag 120
<210> 201
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 201
acctgatgat ttctgctgct acttcccagg gacaagcagt ccaatgtcca gaacactact 60
ggatttcaga agatcttctt gaagtgcata tgtagttgac ctgcactcta caggcattct 120
<210> 202
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 202
actcaaagtt attggctgaa gtttgatgtt tatccagact tggtacctca agtactcact 60
atgaccccat caacagaggg gtctatgttg attttaggtg tacatgctcc ttgtctcctc 120
<210> 203
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 203
aaaaagaaat ttgaagtttc acctctacat atacatttct cttccagaga aaaatactat 60
ggtgacattt agtattttca gaatgtcatt actttgacca catactttcc atcattgcta 120
<210> 204
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 204
catattccct accatgcctt cttcatctaa tttaatatta ctaacaagat ctattgttca 60
agccaaaacc caagtgtcac tccttcaatt tctctttacc ttatcctcca aatttaatcc 120
<210> 205
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 205
tgttgtcaca gaagttctca gatggctgtt ctgaaattat tcctcctcct acactctatc 60
ttatttactt ctcactgttc tcagtatcat aaagtgcaac atctttttga agcaatctga 120
<210> 206
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 206
acaattaaag accttttggt aactcagact cagcatcagc aaaaacctta ggtgttaaac 60
gttaggtgta aaaatgcaat tctgaggtgt taaagggagg aggggagaaa tagtattata 120
<210> 207
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 207
tatggatatt tggaagtcta ggggaggctg atatgaagtt aagaccagag gaaatatctg 60
tccactccct cttctcaaca cccatcttct agacgccaag gctagctata gatctccatt 120
<210> 208
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 208
tctgctttct ggagccccat gagtgagtct taatcctgtt ccagataaca gttctcttcc 60
gggtaacggt tcttcagata cttgaagaca gtgtcttatt tccttaaatc ttctcatttc 120
<210> 209
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 209
tataggacaa atgatctgtc tcctcccttt tttgcttttt catatgttaa gactatctcg 60
gagctgttat cagacttttt tcctgaaaaa ctctcaacaa tactcaaact aggtgttaca 120
<210> 210
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 210
tgcgagccac cgcgtccagc tgcctcactt gttgttttag gacttaggct ccacctcacc 60
agtgtagtcc cagcaggtag ataggagtta atagttgact atctcagctc accaccctcc 120
<210> 211
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 211
atgcgccacc gtgcctcgcc tcatgtggtt ttatgcagca gatgcaaggt attctgtaaa 60
ggttcttggt atacctgttt tcataacaac atgagtagtc tcttcagtaa ttagattagt 120
<210> 212
<211> 119
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 212
tgttttctgg caaacttgta cacgagcatc tgaaattaaa tcaaatattc cattatcatg 60
agttacctct agcacacagc tcagaatact agttattcca ccatggcata tgtttacct 119
<210> 213
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 213
aattcccatt tctggcatta aggacccaag gtgatgccaa aatcctaata gcaagggata 60
ttgcagggca gaagtggcag ggcattctta caagccagga tgaaaacaaa cactagagaa 120
<210> 214
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 214
gaaaattcca attcgaaagt cctatatcat acccaaagta tagcttttcc actaatattt 60
aataattatt ttctcaagta aatatacata aaataatcca cactatagct ttatctagat 120
<210> 215
<211> 119
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 215
aaaaacttgc tttgggattt gactcatttt ctaataaagg actggcctaa aactttattc 60
tttggccttt ggactcttgt ctaacagttg aaataaaata tatgtgtgta tatatatat 119
<210> 216
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 216
gaaagataaa tggaaggaga aaaccatcgc caccaattgt gaaaggacaa atcatacttg 60
ctgggcagcc aaagcataaa tgaaacagct catgtcagag agatcagaaa tgactggcaa 120
<210> 217
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 217
cataaatgaa acagctcatg tcagagagat cagaaatgac tggcaaaaaa gagcccgcaa 60
gacagcctag aagtctggat tcatgttgcc tgccaatatg tcagggttga catataacat 120
<210> 218
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 218
catgcctggc caaggcggaa atatttaata agtaaaaaca aatagttaaa aattgcaaaa 60
gtcttctatt cattaaaaag tcactgatga ctgtaattca ttttgagctt ttattagaaa 120
<210> 219
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 219
acaaaacaaa acaaaaaaaa tgaaaggcag agggaaggct cagatacaaa cacagctatt 60
aaaaagtcat tcctcctttt ggccagaacc accatctttc agtaatttgc caaaatgacg 120
<210> 220
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 220
aagaaaagtc attctatcac cagaacattt agcatataaa ttcctcttct tactacaatg 60
ggcctcatgc aatgaagcaa ataagataac ttgttagaag ttaacaactc aatagaacct 120
<210> 221
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 221
gtccctctga ctggtatatt agttgtgagc agggacaaga accaaggctc cataattacc 60
catgtgctga gcaaggatca taaaatgttg gagctaggtc cttactcttc agaaggagat 120
<210> 222
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 222
aataatgagt tctttttgct tatgggctcc tgttgtttat tggtccattt caaagaagag 60
tgtgctaagt ccaagtattt gataaacaaa gaatttaggt atgtaaggag ttttccaaaa 120
<210> 223
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 223
tatttaatga gttaaaacta tttctaatgt tcctactact acataataag cctaatccag 60
atacaagctg aagtcttagc acaaatagtg gctttatcat gctagttttg tcgacatgtt 120
<210> 224
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 224
tccatctcaa aaaaaaaaat taggagaaag agcctggttc tatgatgaag atgatattca 60
tttttagacg ttgtgataca gaatgttttt tctagactat tctgccttta gtacataaac 120
<210> 225
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 225
acataaacat ttcatattac attatcaaat ggtcatatat atggtaaagc ttttatttat 60
ttcataggtg accaaattat tggccttgac cattaggtcc agaaagtaaa attgtgtact 120
<210> 226
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 226
atattcttaa aatggagcta tgcagagtcc cttgaatcat cctgctgtgg ctcctttttc 60
tcacctctct tgatacagta agtgccgtca tgtttttgct ataggggaaa tgatgtgttt 120
<210> 227
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 227
atgagttcca tcaaggtgct tacagtctaa tttaaggaga caatgaacca caaacaattg 60
tgccattaat tcaaagagat gatgtcagca aacctaagaa tgtgggatac atactactga 120
<210> 228
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 228
caggactgga tttactttca tgtcacacaa aatgattaaa ttccttgctt tgggacacct 60
ggatttgctt ttataaaatg aaaccagaag taagtccacc agtaattagg atgttaaagc 120
<210> 229
<211> 119
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 229
tgggagctca aaagatggct atccttttta attataaata tattctaaaa gaaaatccaa 60
tttgagagcc cagtttgaat tctgagctca gcagctcttt tttttttttt tttggaggt 119
<210> 230
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 230
ctcttttgct ccctttttaa agtaagattc ttcaaggtgg gaactgcgtc ttttacattt 60
tttataactc accatagggc tcataaaatt cacttcccaa agctgcctac cacaaataca 120
<210> 231
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 231
agttggacac tgagactggt ttcctgctaa acagtatggt aaagaacagt caagcaattg 60
ttggccagtt ctgtgctttt cctcctgaag agaaacttga caccatggac aaaataaatt 120
<210> 232
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 232
catgagccat ggcacccagc tgaagtaatt tccaaatgct taaaaatatc agtgacctta 60
tggctatttt agataagcat cacagagcag ataaagctcc aaagcaagga agggcctata 120
<210> 233
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 233
agcaacagta gaaaacctct ataatcaata catcattgac atctgtataa accgtgtgat 60
ggcagtgatt tagtaacttt ttgtcattca tttaagccta ccaaatgcct aaaattatct 120
<210> 234
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 234
aaaaaaaaaa gaaaaggaaa cacaatcaaa aatataaaaa caagattaac agacaatggg 60
ggcacggcga tacagcccta ctttacataa gtctgcaagt ttttacacta gaagcattag 120
<210> 235
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 235
aaggtcaagg agacttgggt ccttcttcgc cgatatagat gcttcaagta ccatattgca 60
ctcaacaaaa caatgactct atagtttgga agatgaggct gtcaaaaagc tacctccact 120
<210> 236
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 236
acacacacat atatctttat gactggttct ttcctgacta tcacaatcct gactatcaca 60
agcttgaaac caagcttctc actcttctcc agttgccaac tctaatcctc tcaatctcaa 120
<210> 237
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 237
tattatctct gcctataagc ctataatttc cttcttccac aagttctcaa agcaactata 60
ttcataactt aatctctctt tttttgttaa gagacagggt cagccaggcg cggtggctta 120
<210> 238
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 238
tttggcctaa atagaaactg gtatcaggtc ctttcctgtc ttcacaatga ttacaaagcg 60
ggcaaacact gacccttaga agggggaatg cataaggata tgcagaaatg aacagaaagg 120
<210> 239
<211> 119
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 239
tgcacatctc atctttaagc tccataaaga caaaattttc tgcttatatt tcttttgaat 60
tccttcctag aacttttttt tgtttactgt aaatgccttt ttaacttaat atggaaaat 119
<210> 240
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 240
ataagccacc gccctcggcc tcatccatga ttttattttg ccatttcaag tgatggagct 60
tgttttagag ctggaagaaa agccaaaatg ccagttaatc taaactagat tcctgcccca 120
<210> 241
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 241
acaacttcat tttatcattt taaaataaag taaatttaag atttggaagg ttttagaata 60
atacaaacca aagaactaat gacaacgtcc tttattttta aagattctag aagttgcttt 120
<210> 242
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 242
agattctaga agttgctttt tgtaattaga caacataaat tctgaatttt ttcacatatt 60
gctgccaacc ccttgggtct tttcctttct ccaagaaaga gaaagctaca gaggagtgac 120
<210> 243
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 243
tgcccccctc cccagggttc acaacgcctt acgcctctca ggttccgccc ctaccccccg 60
tcaaagaata cccatctgtc agcttcggaa atccactctc ccacgccagt accccagagc 120
<210> 244
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 244
ataaataaaa taaaataaaa tatccttaat cttggtttta taggcatgcc ctccccgaat 60
ccagttgatt tacatatagt cgattggttc acattatatc tggagtcatg aagagttaga 120
<210> 245
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 245
ctttgtttta tttatttttt ggatgtgcgg tctttattct ttccaataaa agttttaaaa 60
aaaatgcttt tcataagatt tcctttaaat gagtatattt cctttaaatg agtgtagtca 120
<210> 246
<211> 119
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 246
aggcaggcat taaaacacta gttgtatatg tttataaata attttacata gcctaatatg 60
taaggaaaca gtggaaaaat gtgaaaataa tagatcaggt cgggtgtggt ggttcatgc 119
<210> 247
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 247
aactgtttat agtaattttg ctataatttg tcatctttca gttaaagaat tttgttatcc 60
aaaggagaac attttgttat taaaaagcat tgtttttcta caattgccaa tacatccaaa 120
<210> 248
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 248
ctgtctcctc tttcattttt actataagtg gtctaggaga aaccaagcca cttcctctac 60
actttgctta gaaatctcct gagataaata gccaatttca tttctcacaa gttttacctt 120
<210> 249
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 249
cacaaataca cacatttgtc tgggagtaag atgtaaggtc aaactgctta acttgatttc 60
tttgtcttta ccttaattag agagacctta gcacatacct gtaatacatc ataagtaaat 120
<210> 250
<211> 119
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 250
tcattactca gagattgtgt aaatattgtt gtctggtgta aatatttttg cagacttcat 60
gcatatacaa acttacgttt tagaaaatga ggtcataggc caggtgtggt ggctcacgc 119
<210> 251
<211> 119
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 251
tttttttcca tgtacactac ttataagtct gctttacact aacagctgca tagtattttg 60
ctgtatgact gtagcatagg ttttttttgt atttgtattt gtttttgggt tttcttttt 119
<210> 252
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 252
atgccatttt ctaaagctct tcgaaataat ttattagcca tgtagaagga ggtgagtact 60
ctgtgttcct ggaagagatt gaaaaaaaaa agaataaaat caggacaaaa ggaaaattgt 120
<210> 253
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 253
ggaagagatt gaaaaaaaaa agaataaaat caggacaaaa ggaaaattgt tgaggttacc 60
tttaaaatta atttatttgg aacatacgat ggtttctctt atttgcttag tatatttctt 120
<210> 254
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 254
ttgctgtata ctagagtcac aaaaggagtt attttctcgg caccaaacct tattgtaaag 60
atttggcaac agttctccag ctgtcttttg aacatattgc ttatactttc ccagttttag 120
<210> 255
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 255
tttagtgagt gcttgcttgt gctaggtatt ttactaggca ctttaaatat aacatttcag 60
ataatctttt caataattat ttgcagaatg tatacctatt attattaaaa gaaaaccaag 120
<210> 256
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 256
gtttttgttt atatttgttg ctgttacagt acttgaatat agttaataag agcttagaaa 60
tttatttctc agctactttt agctttcagt tttatattaa ttgtataaga cataataaaa 120
<210> 257
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 257
aaatggtgtg aaactaacaa tagaaaataa gaacagaatt gacaggagaa aacaccatgg 60
aatttgggaa gaaactccca ccacagcaca tacacatttt agcataccac aaattcttaa 120
<210> 258
<211> 119
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 258
caacttaacc tatgtcctct gtaatcttac aaaaagctta ttatctttat cacagacact 60
tcaggattct aattagttct acatggttct tagaccccag tgtctcaaac ttggctgcg 119
<210> 259
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 259
acccctcctc tctctctaag cacaaaggtc acttgtacac aacagagctc aataaatgct 60
cattcgaatc tggataagag cagtatcacc tgatctctaa aataattggt aacagtgaaa 120
<210> 260
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 260
taataaacaa ctcttcacac agcagaaatg taaggtgtca atttcaataa aaattcaaat 60
gggtaacaga aaatgttttg agaacatacc aaataaacac aaaaattcca ccaaaatgat 120
<210> 261
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 261
tgcagcgaac aggatgctgc acctgaaggg aaacacctag ttctgagcca tgggggacca 60
acccatctgt cacaatcatc acaacttgca gctctgccct caaacctgcc cagctcccac 120
<210> 262
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 262
atcaggggag aaggcagaca gaatctagcc aactcctcag tgagaacatg caagaaattt 60
tccaccccac catgatggtg agagactagt tcatatttca tatgcaagga tgctacctgg 120
<210> 263
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 263
taaataaata aacaaataaa ggagaacaaa aagaaaagac acatatagaa aaggaacgga 60
gagaaggaaa aagggaactg cttggttctg gttggcttca taatgggcag tgccagtacc 120
<210> 264
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 264
agggtctctc taccaggaat cagaagctac taacccacac cttccactta ggtcatactg 60
ggaaagcagt tcagggaatt aacgatctct gtcactctcc aagtgtgttg tctgcactga 120
<210> 265
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 265
aaaaaaaaaa aacaaacaaa aaaaatgcca gaataagatc atcattagct ggacaggaga 60
gagatcttgc cttgagttta atgccattgc ctaatgagct tatgccttca tgggcactta 120
<210> 266
<211> 119
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 266
attttggggt aaaactcttc ccagctaaat gacagctagg catgtgtgtg aatgtacaca 60
taagttaaag aacccaggtt aatattagct ttatttattc ttttaatttt tcttgtttt 119
<210> 267
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 267
tgggctacac cctccacaag caaagaggag atagaattac atatttatgt aaaatgaact 60
tcagctaaga aacccagatg tttaatttta agagcctgcc tcttcctgta agccgctaaa 120
<210> 268
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 268
atatcaatca attacactaa tataaaatgc ccatgcagat ttacaacagg cccagaatca 60
aaaagcaatc catcagtctg agcctagaaa aaatggtcta ggcaagtaaa tatcccaatg 120
<210> 269
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 269
gacccttgag tttctcagat ctcaggtgac aggttttgac ctccctagaa taacctaagg 60
atccagtctc tggcacaaat ctgagccacc tgagtatatt tcattcaggc tggtacacaa 120
<210> 270
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 270
tataaaatgc tacctgatga ggctgataaa catctccact tgtgcacgat aaccttgtag 60
tatttacaaa ggtagaagct ctaaagtgag cctcttacag aagcactcac agcctagtac 120
<210> 271
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 271
aggcacaaga cttaaaatta aaaagtaaat gatgggccta ttacaacagc aaaagaaaag 60
aaaaaaaaaa aaacagggca aacatgctct ccaaaaatta aaagtcctaa cagcccagac 120
<210> 272
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 272
aaatgtcact ggtacccctt ttcccccagg cttgctccta aagtgaaaca cacctgttcg 60
ttcaatctat attccctgac acctaaggac ccagtgactt aatgaggcag aacacaaagg 120
<210> 273
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 273
ccaaagaaca gaaaacaaac caagactctg ataacagaac caccagtaaa atcaaagtaa 60
catccactgc tgacctaatc ggattaacaa aaaaaaggga gggagaggag ggcattctct 120
<210> 274
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 274
cagtaaaatc aaagtaacat ccactgctga cctaatcgga ttaacaaaaa aaagggaggg 60
agaggagggc attctcttcc tccccaaact caggctacta ctctaggaga acataggaaa 120
<210> 275
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 275
aagtgaagtg acgcatgtaa tactcccccc acccacccat gcttgctatc tgggagctat 60
tgctattgga aagccatgca gagaagtgag tgaaaaacca aagtgagggc agcaaaactc 120
<210> 276
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 276
agcagacaac tggtggatct gtacaaggtg ctggagagca ggggctccga cccaaagccc 60
gaaaacccag cctgtccctg gacggtgctc ccagcaggtg accttcccac ccatgatggc 120
<210> 277
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 277
acagtggaag gcttctctgt ggacagagac tgaagggtgt ggaggtatcg aagctgaacg 60
gcagcagggg tgcctgacag aatctcagct gccatcctca gggactcaga agcagccttt 120
<210> 278
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 278
ttagtgaaac ctgaattcat tctttttttt ttaggccttc cttgtaaatc tccacctgag 60
atttctcatg gtgttgtagc tcacatgtca gacagttatc agtatggaga agaagttacg 120
<210> 279
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 279
attttaaact aaggggaacc actaatggca tgtatccttt cctttcagat gataatttat 60
tgtgatgtta gagaattcaa ggttgcagta aatggcgtac acagcctgga gtacaaacac 120
<210> 280
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 280
gtggcggctg tttcatcttt atcatcaggt cttacattca catcttttcg accgtgctcg 60
ggtttccaag aggagcagac agaacaaagg ccttttccac ctgcatccct cacatcctgg 120
<210> 281
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 281
aaaggggcag cactgatcac tgctgtggcc aagaggttac agcaggcaca gaaggagaac 60
taggaacccc tgggattgga cctgatgcat cttggatact gaacagcttt tcctctggca 120
<210> 282
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 282
aacagaggat actactggag tggaggagtg gaagcagccc agcaggccca ctggtagccg 60
tgagtgtgag gatagcttat cggtagcggc aggccaaagc attgacattc ttgaccacat 120
<210> 283
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 283
ttgtatgtta ttccaggggg gaagaggaat ccctgttggg cagcagcagc tgctgccaga 60
gtccgctggt catgtggaaa aattgggatc atgagcggag gcatgtgacc ctgaacctgc 120
<210> 284
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 284
cttagtctac aacaggcctt ttctgaactt agacgtgccc aaatgacaga aggacccaac 60
acagcacctc caaactttag tcatacagga ccaacatttc cagtagtacc tcctttctta 120
<210> 285
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 285
tatactgagt aatttaaaac tctcaccctt ctttcatctt atctgcctta gatttctcac 60
gtacatccaa cttctcttgc tctcccataa aagcctgctt gcccgttttc ctgtcccctt 120
<210> 286
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 286
accagcccta tgagagaagt ggacttcgac acctttttta cgtcatccaa gatggtcaca 60
ctggactcca tatactttca gcctggctcc cgggtacagt gcgcagctcg tgctgtgaac 120
<210> 287
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 287
ttcttgcagg gaagccgagg cctggatggc tatcaagggc ctgatggacc ccggggaccc 60
aaggtgagcc cgtttctcat gtctttgcca cttatggtgt ctcgcccacc ctggctggcc 120
<210> 288
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 288
gatggatgtc gcaggatgag tgctctggca gaggcaagcc ccacaattcc gccaccaacg 60
atgactatat caaatgagct tcaaaagaaa gtcatcttta aagtaattca tatttacagt 120
<210> 289
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 289
acattgtcca agcatgactt cagattcttt tccacttctt tttggactga gaacgcaaca 60
ttttgtagca ctctggacgt tttgcttgga cctgatccag gttgtggtat ctgtaggacg 120
<210> 290
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 290
tctccaccgt gtgctcgctg gtgagccgga tagcgttcct ccgctcccgc cagtcccgcg 60
aaggcctgcc ccacgtcggc ttcttctttt ctagaaaatg atggaaacat ttgtgcggtc 120
<210> 291
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 291
cacaggtcgt cttcccgtga cgcccagatc tgtcctgcag gatggagcca gcaccctcag 60
aggttcgact cgccgtccgg gaagccattc atgccctctc gtcttcggag gatggcggcc 120
<210> 292
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 292
tgggcagggt gcagagtcac gcactcctct tgagaaaaat acacagccag atcctcaaag 60
agtattggtc cctgaaacac aagagcctgt gtcagcacaa gagggtggag ggtcagcccc 120
<210> 293
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 293
ccacgccctg tgttgtcagg ccggccacca tcagccagtg ccacagtgat ggtccgagcg 60
tggtcagcca gcacccggta ggccatgtca atcccatcgg catcctcagc accaactttc 120
<210> 294
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 294
gtggcatgca tcaagcacat cgtggactgc atccgggcag agctacagag cattgaagag 60
ggtgtgcaag ggcaacagga tgccctcaac agtgccaagc tgcactcagt tcttttcatg 120
<210> 295
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 295
aaagtcctcg ttgttcctct gggatgcaac atgagagagc agcacactga ggctttatgg 60
gttgccctgc cacaagtgaa caggtcccag catgaaagca gggacaagaa aattgagctc 120
<210> 296
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 296
tttgaccatc ctcatatccc agtggccagt cttcctccct tcctgtctcc ctctctttca 60
ttgacatggg gaatctcata cctactttca tcagcatcta taacatttta gtgcatttct 120
<210> 297
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 297
attacaattt ccttcttatt ctactttgga cataaaggac tgatatccac tgaatctgtc 60
tactaaggta tgtctaaaag cataagcaga cagggttcct aaccaaagag gctccaggag 120
<210> 298
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 298
ggctgttttt aaagtgtgcc ccaaacataa tcccggacta ttccttacct tcaagagatg 60
ggtcatcatc atagattggt tttgctgaac cagaaaagaa gagttcgata ttcttctcga 120
<210> 299
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 299
tgactggaat gggagaagtg gattttctga catttgatcc tatagctaaa atggcaaaaa 60
ctgttaagta cgatgtacaa gctgtagcta tcattgtggt ggtattgaaa ctgctctttc 120
<210> 300
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 300
gctgatattt tagcttttgc ataacttggg gtgtaagaga aggctcttcc aagagctgtt 60
gcactcagta caactgcaga gatcaccctg taaccagaca gacacacagg aagagagcag 120
<210> 301
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 301
gggctcccag ggtctcctct ctcccctttt agcccaggta ttcccactgg accaggtggc 60
cccacatcat gcaaacctta atggggaaaa cagaattaat actatatctt ctcttttctt 120
<210> 302
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 302
gcgatcagga aggaggccgt ttgataattc atccgtggtt tcaaggggtg aacgatggcg 60
agatatctgg tgggggaggg aagccaacag tagtaatgat gaatacgtgg aaacgttagt 120
<210> 303
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 303
ccgtaaagca agagtaactt actgatctgt tctactaact tgagcatcac tcctccaaca 60
tgaaggtctc cagatactct cagtgtgacg tctttctgct gctcttcatt gggatggtca 120
<210> 304
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 304
tcaaagtcca cctcgttgac cgaggcgttc ttctccaaca gcagccgtgt gctagactcg 60
tccccgttct gggctgcaaa gtggagggct gtccactggt cctcatcctt ggcgttgaca 120
<210> 305
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 305
tctgattcag aagctcgtca ggtgggtcgg aaagtgacgt cgccttcgtc ttcatcctct 60
tccagctcct ctgattctga atctgatgat gaggctgacg tttcagaggt cactcctcga 120
<210> 306
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 306
ctgcccaggc ttccgaggat gccccagcca ttccccagct agacagaata ccaccccttg 60
tacagagcac ctaggcctcg aggcccctcc tcctgaacaa ggcttggttc tccttcaggc 120
<210> 307
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 307
ctgtttggca tgaacttgtt cattacaggt acattcactt aacaggctct ctttccaccc 60
ttgtagaaat acaaaaataa gacttaatac agacgatggc atgggcttag taactacccc 120
<210> 308
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 308
aggtatgtaa cccacctcag ggtgggaatt ctttgcatgg gatcgttcaa agttctgaga 60
aaagcccaat gtaggtcaga cacgactgct ccttggactg gggaagactt tccttggttg 120
<210> 309
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 309
cagcttctag gggtgttcat ttggtttggt gttgatccac ccaacatcat catagactat 60
gatgaacaca agacaatgaa ccctgagcaa gccagagggg ttctcaagtg tgacattaca 120
<210> 310
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 310
tgaatgtgct gttctaccag atttttcttg taggcaacaa tcacagggcg gccaaatgtg 60
tccagatagg tgtagtgcag ctcatctggg gcacggctga tttcataggg actatcaatt 120
<210> 311
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 311
ctttttcttc tttttcttgt ctatttacat gcccttgcat gaaacccctc ttaaactggg 60
atctgtgttc tttttgttct ggaacatacc taaaataaaa acattcttga atatcttcac 120
<210> 312
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 312
cacttcttgc tgcttgtgct catttcacag atggaagctt tctggaaaca gatggcaaat 60
atccagcact ttcttgtgga ccagtttaag tgttccagct ccaaagcccg acagctgatg 120
<210> 313
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 313
aacaatataa tctggcattt aactgccttt ataattaatg aaccttactt aaatcccaat 60
tgtcgacaaa ccacgtatgt attcagctca gtccagccat catcacagac agttccccac 120
<210> 314
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 314
atattttgtt tttgtaagtt tccacatgta tttttcttac cttcatgttg aagcaatatc 60
ctttccacca tactgctaga cgtagctaca tctataggtc gcagaagctc tgtatttttg 120
<210> 315
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 315
ttgcagcaca ctgctgcctc accattgtca tcgcacgatt cggactggaa ggagctcaga 60
gactgcactt cagacaggct ttcccgggca ctgtatggct gggaaggctt ttcctctaga 120
<210> 316
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 316
agtgtattgt gcaggctgaa aggggcgact ttgacagcag taccactgtg ggtttcagaa 60
tcatattcta caggtgagga agcgagcaga gacgtggacg cctgggtctt ttccctagag 120
<210> 317
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 317
tatggggcag aaataagggg cttttccaca ggttttcctt tggaggaaga tttcagtggt 60
gactttagag aatactcaac agtgtctcat cccatagcaa aagaagaaac ggtaatgatg 120
<210> 318
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 318
cgcctctctg tgcacgtgaa gaccaatgag acggcctgca accaaacagc cgtcatcaag 60
cccctcacta aaagttacca aggctctggc aagagcctga ccttttcaga taccagcacc 120
<210> 319
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 319
accctgtgct tggacccagg tcgtacgatc atcttcacaa cccaccacct ggatgaagct 60
gaagcgctga gtgaccgcgt ggccgtcctc cagcatggga ggctcaggtg ctgcggtcct 120
<210> 320
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 320
atatccaggg gttctcctat gtcttttgaa gattctagtc gaatcatccc actcttttat 60
ctttttagct ccttgtttag tcattcacta atttccatac atgataacga attcttcggt 120
<210> 321
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 321
gagaagttgc agccgcctct ttggagtcgg agtgtgtctt acctcggccc tggtcacgac 60
tatgcgaatc aacgtctcct catcggtccc cgcacccttc atcgacttgt acagacgttc 120
<210> 322
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 322
gggactgcgt tccaggcaca ggccacgctg aatatggcat cgttcatgtt gtagcgggca 60
tgggggccct gcagggggac cggagggtta atgaagttcc tcatgaaatc tctccgaatg 120
<210> 323
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 323
ccttctactg tgttcttata ggcaaagatg ctggaaggag atctggtttc aaagatgcta 60
cgagctgttc tgcagtctca taagaatgga gtagcattac cccggctcca aggagagtac 120
<210> 324
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 324
tgcttgacct tcactccctt ggtgaaggtc cgcttcttga ggacaaagtc atagttggcg 60
gtagagttca tggcatagaa gacgttggcg ttttcaggga tcttcagctc tggtggggag 120
<210> 325
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 325
atagctagtc tttgaacaga gtaggtgctc cagaatattc taagtgaagg agagaaagat 60
ttcaaatgtt tgtaagcatg gaagagtaag gcaatgatgg agctactagc aaaggcaaag 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 326
tctccaggtt ctgacgacgg gaacctcggc tctgtgtaca tttatgtgct cctaatcgtg 60
ggaacccttg tctgtggcat cgtcctcggc ttcctcttta aaaggtaacc tgtgaaacac 120
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<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 327
atctctgagt ttcgcattct gggattctct agagccatct tgcgcctctg atcgcgagac 60
cacacgatga atgcgttcat gggtcgcttc actctatcct ggacgttgcc tttactgttt 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 328
ggcttccgaa gaccttcaga aaagaaccag cacataatga gacaccataa agaagttggt 60
ctgccctaac agtgtgtcta caagcttgta aagatgttgg ccttgaagca gaaaattcat 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acttgagaaa ccactttatt tgggatgaag aatccaccca ctattcttta cagagcccag 60
gggactgcta atgcaaacag tgatcaaaat tagtaaagag aaaaattacc tcatagctga 120
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtctaattta tttttctggt tactctcaga aataatttca gaaatgagtg tgacatcttt 60
ccctgctgac tgaaaccact aactttccac acaagggtaa tatatatata ggacattaca 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 331
taaaactttc aggaccctga aatacagaac tgcaaagaaa cggcctaaga tggttgaatg 60
ctctttattt ttctttaatt tagacatgtt caaacgttca atgtcttaca tacttagtta 120
Claims (9)
2.试剂盒,其特征在于,包括权利要求1所述的探针组。
3.权利要求1所述探针组的设计方法,其特征在于,步骤包括:
1)选择表1中的15个同源重组修复基因的全编码区和外显子-内含子连接区、表2中的与大片段重排相关的7个基因的16个内含子区、表3中的高频发生纯合缺失的ATM、BRCA1、BRCA2、CDK12、CHEK1、CHEK2、RAD51C基因的275个骨架SNPs位点以及表4中的56个SNPs位点作为探针设计的基因目标区域;
2)根据步骤1)选择的基因目标区域设计探针组的序列;
3)将步骤2)设计好的探针进行blast和repeatmask,去除同源性较高和捕获区域重复的探针;
4)统计经步骤3)过滤后所得探针序列的GC含量,去除GC含量少于20%的探针;
5)统计探针设计未覆盖区域、同源性较高和捕获区域重复的探针区域,以及GC含量少于20%的探针区域,将这些区域分别延伸20bp,按照长度120bp、步长90bp的规则进行划分,将划分的区域进行blast、repeatmask及GC含量统计,去除同源性较高、捕获区域重复和GC含量少于20%的探针;
6)将去除的区域按照上述步骤5)再进行设计,将无法覆盖或是覆盖不好的区域进行遍历叠瓦设计,最大限度地覆盖目标区域。
4.同源重组修复基因的高通量测序方法,其特征在于,步骤包括:
1)DNA样本制备;
2)用权利要求1所述的探针组杂交捕获同源重组修复基因,并进行富集;
3)进行高通量测序,并拆分测序数据,定义Q30≥85%的数据为合格下机数据;
4)对合格下机数据进行预处理,去除建库过程中引入的接头序列、引物和低质量碱基片段;
5)将碱基序列比对至人类参考基因组,并进行排序和序列比对优化,对比对后的数据去重,进行局部重比对和碱基质量矫正。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,还包括步骤:
6)计算56个SNPs位点水平A、C、G、T的频率,当SNP的突变频率在40%~60%时,认为该位点为杂合突变基因型;当SNP的突变频率为100%时,认为该位点为纯合突变基因型;当SNP的突变频率为0时,认为该位点为野生型;当SN位点的突变频率≥85%且<100%时,则认为此位点为可能的污染位点;统计野生型、纯合突变基因型、杂合突变基因型和可能的污染位点个数;若野生型和纯合突变基因型的位点个数和≤10,则判定样本存在污染;若野生型和纯合突变基因型的位点个数和﹥10,则根据可能的污染位点及其突变频率的平均值,计算样本的可能污染频率,给出污染频率结果;
7)统计每个样本的Q30碱基占比、序列比对至参考基因组比例、目标区域的平均测序深度、捕获效率、捕获均一性、1×覆盖度、污染频率、插入片段长度,判定数据质控是否通过;如果Q30碱基占比≥85%,序列比对至参考基因组比例≥95%,平均有效测序深度≥500×,捕获效率≥20%,捕获均一性≥90%,1×覆盖度≥98%,污染频率<1%、插入片段长度在100~250bp之间,则样本数据质控通过;否则判定样本数据质控不通过,需要重新实验。
6.权利要求1所述探针组在制备同源重组修复基因突变检测试剂中的应用,所述应用非用于疾病的诊断和治疗目的,其特征在于,所述同源重组修复基因突变包括单核苷酸位点变异和小片段插入缺失、大片段重排、拷贝数变异中的一种或多种。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述同源重组修复基因的测序采用权利要求4或5所述的高通量测序方法。
8.权利要求1所述探针组在制备同源重组修复基因的高通量测序、前列腺癌的风险评估、前列腺癌的辅助诊断、前列腺癌的辅助治疗试剂中的应用,所述应用非用于疾病的诊断和治疗目的。
9.权利要求2所述试剂盒在制备同源重组修复基因的高通量测序、同源重组修复基因的突变检测、前列腺癌的风险评估、前列腺癌的辅助诊断、前列腺癌的辅助治疗试剂中的应用,所述应用非用于疾病的诊断和治疗目的。
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