CN113278611A - 捕获测序探针及其用途 - Google Patents

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CN113278611A CN202110248180.5A CN202110248180A CN113278611A CN 113278611 A CN113278611 A CN 113278611A CN 202110248180 A CN202110248180 A CN 202110248180A CN 113278611 A CN113278611 A CN 113278611A
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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体公开了捕获测序探针及其用途。捕获测序探针，包含至少一个选自以下的核苷酸序列：SEQIDNO：1～2909。捕获测序探针在直肠癌基因测序中的方法，包括以下步骤，提取DNA双链核酸；将DNA双链核酸变性处理得到DNA单链，使用所述的捕获探针捕获所述的DNA单链；将捕获的DNA单链进行上机测序，得到肿瘤组织中的核酸序列。试剂盒，包含所述的捕获测序探针。试剂盒在捕获结直肠癌个体化用药相关基因组靶序列中的应用。本发明捕获探针高效、完整地捕获结直肠癌基因组关键区域，显著提高了测序深度，大幅降低检测成本和测序数据量，缩短了单样本分析时间，满足个性化的用户需求。

Description

捕获测序探针及其用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及捕获测序探针及其用途。
背景技术
目前临床上对如结直肠癌病人“同病同治”，治疗方案相同(基于有限数目的化疗药物和靶向药物)但疗效因人而异，相当部分病人甚至无效(即肿瘤耐药)。这种现象源于结直肠癌的高度异质性——不同病人癌细胞的基因组突变和基因表达谱等分子特征不同。这意味着要取得最好的疗效需个体化治疗，即“同病不同治”。
肿瘤的高度异质性是病人对相同治疗反映各异的重要原因。不同的病人携带不同的基因变异，这些基因变异可导致药物靶点无效；更严重的是各种新突变和基因异常表达可不断累积，原本有效的治疗药物可在治疗一段时间后失效。肿瘤异质性导致“同病同治”疗效低下，许多治疗方案仅对小部分患者有效。例如，KRAS基因突变导致对西妥昔单抗(EGFR单克隆抗体)耐药，治疗失败；而NRAS基因突变型病人接受西妥昔单抗联合化疗后，总生存期不增加反而明显缩短。因缺乏对病人基因组个体特异性的全面了解，这些治疗方案不仅治疗效率不高，且可能使病人承受毫无必要的化疗毒副作用。因此，要提高结直肠癌治疗疗效，就必须对结直肠癌病人进行个体化治疗。
近年的研究表明，结直肠癌是一类多基因病，其发展过程复杂，临床表现多样，涉及到多个基因的变化，其发生与某些原癌基因的激活和抗癌基因的失活有关。结直肠癌病人基因组的异质性决定了每个病人对药物的不同反应性。基因组异质性指的是每个病人基因组的突变基因类型和数目、基因(或染色体片段)拷贝数变异、融合基因类型和基因表达水平等不完全相同。这些性质的不同导致“同治不同效”。要精确找到病人对哪种药物可能敏感，首先要了解病人基因组的各类信息，尤其是基因突变和表达异常；之后通过测序技术和生物信息学分析，推测关键靶标基因，选择所对应的药物，用于病人临床治疗。
虽然上述的病人基因组各类信息可通过高通量二代基因组测序技术获取，但高通量测序技术直接对结直肠癌患者全基因组或转录组进行“非定向”的检测，这种无选择性的全面测序带有一定的盲目性，存在费用高、数据分析复杂、周期长等问题，不便临床开展；从医学经济学角度看，现阶段也不完全适合我国国情。多基因捕获测序技术是定向、精准检测肿瘤个体化治疗相关基因较为理想的选择。
基于测序试剂国产化发展趋势和基因检测更加个性化的用户需求，开发一种性能稳定，肿瘤样品覆盖深度广，突变频率检出灵敏等优点的探针用于结直肠癌个体化用药具有重要意义。
发明内容
针对上述问题，本发明涉及捕获测序探针及其用途，主要解决现有高通量测序的捕获基因组靶序列的方法不能针对性地筛选基因突变负荷的多个关键区域，针对性地设计高效液相靶基因捕获探针和配套的文库构建试剂盒，导致其测序数据量大，单样本分析时间长，不能很好满足个性化的用户需求等问题。
为了解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
捕获测序探针，包含至少一个选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO：1～2909。
在一些实施例中，其Tm值为62～76℃。
在一些实施例中，其工作浓度为10ng/μL～90ng/μL，优选为25ng/μL。
在一些实施例中，捕获测序探针能覆盖目标基因组80～300Kb的区域，优选为100～180Kb区域。
在一些实施例中，所述的捕获测序探针在结直肠癌基因测序中作为捕获探针的应用。
在一些实施例中，其中，所述应用为捕获测序探针在结直肠癌基因突变高通量测序中作为捕获探针的应用。
捕获测序探针在直肠癌基因测序中的方法，包括以下步骤，
提取DNA双链核酸；
将DNA双链核酸变性处理得到DNA单链，使用所述的捕获探针捕获所述的DNA单链；
将捕获的DNA单链进行上机测序，得到肿瘤组织中的核酸序列。
在一些实施例中，还包括以下步骤，
将所得核酸序列去除干扰信息及背景信号，与人类全基因组标准序列HG19数据对比，确定组织样本测定区域中的变异位点及数目。
在一些实施例中，提取DNA双链核酸后进行片段化处理，得到片段长度为100-1000bp，优选的，片段长度为100-500bp，更优选的，片段长度为200-300bp。
在一些实施例中，所述样本测定区域为80～300Kb，优选为100～180Kb，更优选为160.3Kb。
试剂盒，包含所述的捕获测序探针。
试剂盒，还包含末端修复酶、末端修复反应缓冲液、DNA连接酶、连接反应缓冲液、含分子标签的接头、文库扩增引物、PCR预混液、接头封闭剂、DNA封闭剂、杂交缓冲液、杂交增强剂、磁珠洗液、杂交洗液、捕获文库PCR引物、质控品、核酸纯化磁珠和链霉亲合素磁珠中的一种或多种试剂。
试剂盒在捕获结直肠癌个体化用药相关基因组靶序列中的应用。
直肠癌个体化用药相应基因位点在制备直肠癌检测、诊断、治疗或预后产品中的应用，所述基因位点包含下述一个或多个
AKT1：Chromosome 14,NC_000014.9(104769349..104795748)；
ALK：Chromosome 2,NC_000002.12(29190992..29921589)；
BAP1：Chromosome 3,NC_000003.12(52401004..52410030)；
BRAF：Chromosome 7,NC_000007.14(140713328..140924929)；
BRCA1：Chromosome 17,NC_000017.11(43044295..43125364)；
CSF1R：Chromosome 5,NC_000005.10(150053295..150113365)；
EGFR：Chromosome 7,NC_000007.14(55019017..55211628)；
ERBB2：Chromosome 17,NC_000017.11(39688094..39728660)；
ERBB4：Chromosome 2,NC_000002.12(211375717..212538802)；
HRAS：Chromosome 11,NC_000011.10(532242..535576)；
KIT：Chromosome 5,NC_000071.7(75735647..75817382)；
KRAS：Chromosome 12,NC_000012.12(25205246..25250929)；
MTOR：Chromosome 1,NC_000001.11(11106535..11273497)；
NRAS：Chromosome 1,NC_000001.11(114704469..114716771)；
PDGDRB：Chromosome 5,NC_000005.10(150113839..150155845)；
PDGFRA：Chromosome 4,NC_000004.12(54229127..54298245)；
PIK3CA：Chromosome 3,NC_000003.12(179148114..179240093)；
PTEN：Chromosome 10,NC_000010.11(87863625..87971930)；
SMAD4：Chromosome 18,NC_000018.10(51030213..51085042)；
TP53：Chromosome 17,NC_000017.11(7668421..7687490)；
NRAS：Chromosome 1,NC_000001.11(114704469..114716771)；
APC：Chromosome 5,NC_000005.10(112707498..112846239)；
NTRK1：Chromosome 1,NC_000001.11(156815750..156881850)；
NTRK3：Chromosome 15,NC_000015.10(87859749..88256796)；
HER2：Chromosome 17,NC_000017.11(39688094..39728660)。
所述产品为生物制剂，其包括捕获测序探针，或
所述产品为试剂盒，其包括所述生物制剂。
本发明的有益效果是：
1.捕获探针高效、完整地捕获结直肠癌基因组关键区域，显著提高了测序深度，大幅降低检测成本和测序数据量，缩短了单样本分析时间，满足个性化的用户需求；
2.捕获结直肠癌基因组的基因组目标区域的编码外显子区域及外显子内含子交接区域，减少非特异性捕获，同时杂交温度均一。
附图说明
图1是一种用于结直肠癌个体化用药相关基因突变高通量测序的捕获基因组靶序列的方法流程图；
图2是结直肠癌个体化用药相关基因突变高通量测序的捕获基因组靶序列的方法性能测试结果。
具体实施方式
下面对本发明作进一步说明：
本发明提供了一种捕获结直肠癌个体化用药相关基因组靶序列的捕获探针，捕获探针包含至少一个选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO：1～2909。
在本发明中，一种方式，捕获探针是多条探针的混合物，多条探针分别捕获人基因组不同的目标区域，优选为捕获人基因组目标区域的编码外显子区域及外显子内含子交接区域。捕获探针覆盖基因组80～300Kb的区域，优选为100～180Kb区域。
在本发明中，一种方式，捕获探针的多条探针是按相同比例混合在一起，优选SEQID NO：1～2909中至少一探针，捕获探针的Tm值为62～76℃，且每条探针上具有标记，优选为生物素标记，捕获探针的浓度为10ng/μL～90ng/μL，优选为25ng/μL。
同样的包含与前述2909条核苷酸性质相近，且具有相同功能的也应当等同的落入本发明范围中。
本发明根据结直肠癌个体化用药相关基因组突变的多个关键区域，针对性的设计合成捕获探针，捕获探针完整捕获结直肠癌患者基因组目标区域，减少非特异性捕获，显著提高了测序深度，大幅降低检测成本和测序数据量，缩短了单样本分析时间。
另外，本发明还提供一种捕获结直肠癌个体化用药相关基因组靶序列的试剂盒，其中，试剂盒包含上述捕获探针以及选自末端修复酶、末端修复反应缓冲液、DNA连接酶、连接反应缓冲液、含分子标签的接头、文库扩增引物、PCR预混液、接头封闭剂、DNA封闭剂、杂交缓冲液、杂交增强剂、磁珠洗液、杂交洗液、捕获文库PCR引物、质控品、核酸纯化磁珠和链霉亲合素磁珠的一种或多种试剂。
如图2中，序列比对率可达99.63％以上，序列捕获率达79％以上，目标区域大小为160.3Kb，实际覆盖大小约为160.3Kb，覆盖率达到100％。表明采用本发明捕获探针进行捕获结直肠癌个体化用药相关基因突变的目标区域，可对目标区域进行有效、完整地捕获，从而确保后续高通量测序可完整地检出样本所含的相关突变。
一种捕获结直肠癌个体化用药相关基因组靶序列的方法，其包含下述步骤：
(1)提取组织样本中的基因组DNA双链核酸；
(2)将步骤(1)的所述DNA双链核酸变性处理得到DNA单链，使用权利要求1-5任一项所述的捕获探针捕获所述的DNA单链；
(3)将步骤(2)所捕获的DNA单链进行上机测序，得到组织样本中的核酸序列；
(4)将步骤(3)所得到的核酸序列进行自动化处理，去除干扰信息及背景信号，比对公共数据网站NCBI提供的人类全基因组标准序列HG19(Human Genome 19)，确定组织样本测定区域中的变异位点及数目。
本发明中，在步骤(1)中，在提取基因组DNA双链核酸后进行片段化处理，得到片段长度为100-1000bp，优选的，片段长度为100-500bp，更优选的，片段长度为200-300bp。
本发明中，在步骤(3)中，样本的测定区域为80～300Kb，优选为100～180Kb，更优选为160.3Kb。
直肠癌个体化用药相应基因位点在制备直肠癌检测、诊断、治疗或预后产品中的应用，所述基因位点包含下述一个或多个
AKT1：Chromosome14,NC_000014.9(104769349..104795748,complement)
ALK：Chromosome 2,NC_000002.12(29190992..29921589,complement)
BAP1：Chromosome 3,NC_000003.12(52401004..52410030,complement)
BRAF：Chromosome7,NC_000007.14(140713328..140924929,complement)
BRCA1：Chromosome17,NC_000017.11(43044295..43125364,complement)
CSF1R：Chromosome5,NC_000005.10(150053295..150113365,complement)
EGFR：Chromosome 7,NC_000007.14(55019017..55211628)
ERBB2：Chromosome 17,NC_000017.11(39688094..39728660)
ERBB4：Chromosome2,NC_000002.12(211375717..212538802,complement)
HRAS：Chromosome 11,NC_000011.10(532242..535576,complement)
KIT：Chromosome 5,NC_000071.7(75735647..75817382)
KRAS：Chromosome 12,NC_000012.12(25205246..25250929,complement)
MTOR：Chromosome 1,NC_000001.11(11106535..11273497,complement)
NRAS：Chromosome1,NC_000001.11(114704469..114716771,complement)
PDGDRB：Chromosome5,NC_000005.10(150113839..150155845,complement)
PDGFRA：Chromosome 4,NC_000004.12(54229127..54298245)
PIK3CA：Chromosome 3,NC_000003.12(179148114..179240093)
PTEN：Chromosome 10,NC_000010.11(87863625..87971930)
SMAD4：Chromosome 18,NC_000018.10(51030213..51085042)
TP53：Chromosome 17,NC_000017.11(7668421..7687490,complement)
NRAS：Chromosome1,NC_000001.11(114704469..114716771,complement)
APC：Chromosome 5,NC_000005.10(112707498..112846239)
NTRK1：Chromosome 1,NC_000001.11(156815750..156881850)
NTRK3：Chromosome15,NC_000015.10(87859749..88256796,complement)
HER2：Chromosome 17,NC_000017.11(39688094..39728660)。
所述产品为生物制剂，其包括捕获测序探针，和/或
所述产品为试剂盒，其包括所述生物制剂。
该技术使用“扩增子”法、杂交捕获法等技术特异性捕获与肿瘤生物学行为和药物疗效相关的基因，再使用高通量测序检测。这种技术可对基因组的关键区域进行深度和精准测序，不仅可缩短周期，降低测序成本，也提高测序准确度。其中，利用分子探针的杂交捕获法能避免传统“扩增子”法的扩增错误、不同片段扩增效率不一、难以检测基因拷贝数变异等问题，并且适用于基因组DNA已严重降解的石蜡包埋样本。
下面对本发明所用的原料及设备的生产厂家，以及产品分析使用的设备和分析方法进行说明如下，其中所述的化学物质没有标明的均为常规试剂的化学纯级别。其中，实施例所用到的实验设备的信息如表1所示
Figure BDA0002964919060000081
实施例一
用于结直肠癌个体化用药相关基因突变高通量捕获测序的检测质控品的制备：
(1)从ATCC购买获得两株常用的可稳定传代人结直肠癌细胞系HCT-116和HCT-15；
(2)采用胎牛血清培养基(由Thermo Fisher公司提供)培养这两株人肿瘤细胞系，培养条件：37℃恒温，5％CO2，湿度50％；培养至细胞密度达培养皿面积80-90％时传代，在细胞生长对数期收集，800-1000r/min的速度离心取沉淀，分别抽提每个细胞系的基因组DNA，并过柱纯化、洗脱；
(3)将纯化后的每个细胞系的基因组DNA分别用Tris-EDTA buffer solution缓冲液稀释至100±5ng/μL，外观为透明液体，无肉眼可见杂质，纯度为1.9＞OD260/280＞1.7，得到质控品原料DNA；
(4)用WES测序法对每个细胞系的基因组DNA进行测序，确认杂合和纯合变异位点；
(5)将两种细胞系HCT-116、HCT-15的质控品原料DNA按照1:1的体积比进行均匀混合分装作为质控品，模拟组织样本DNA，-20℃保存。
实施例二
捕获探针设计：选取结直肠癌个体化用药相关基因组突变关键区域，根据关键区域设计并合成多条捕获探针，所述关键区域部分示例如表2所示；所述捕获探针设计序列示例如SEQ ID NO:1～2909所示；所述捕获探针长度为100bp，所述捕获探针首尾相接，覆盖各个目标区域外显子区及外显子内含子交接区域；所有探针均具有生物素标记，所述捕获探针为2909条探针混合物，所述捕获探针的设计方法为：
(1)根据公共数据网站NCBI提供的人类全基因组标准序列HG19确定各个目标区域的外显子区域及外显子内含子交接区域；
(2)以各个区域内的外显子区域及外显子内含子交接区域首个外显子为起始，根据标准序列HG19设计捕获探针，探针长度为100bp(如有外显子或至其末端不足100bp情况，则延伸至外显子内含子交接区，保证探针长度为100bp)，则区域确定则探针设计具有唯一性；
(3)将设计探针进行合成，同时以生物素进行标记。
表2部分探针关键区域示例
Figure BDA0002964919060000091
Figure BDA0002964919060000101
实施例三
结直肠癌个体化用药相关基因组突变捕获测序探针试剂盒的制备
(1)设计并合成实施例二所示目标区域的捕获探针；
(2)将设计捕获探针按相同质量混合在一起，并将混合物稀释为工作浓度25ng/μL，-20℃保存；
(3)将捕获探针混合物和实施例一中获得的质控品分别分装；
(4)准备说明书、外包装，组装封口；
(5)其中捕获探针混合物的用量为6μL/3反应，12μL/6反应，24μL/12反应，48μL/24反应；质控品的用量为30ng～50ng/反应。
实施例四
结直肠癌个体化用药相关基因组突变捕获测序检测试剂盒的制备：
(1)设计并合成实施例二所示目标区域的捕获探针；
(2)将设计捕获探针按相同质量混合在一起，并将混合物稀释为工作浓度25ng/μL，-20℃保存；
(3)将捕获探针混合物、实施例一中获得的质控品、末端修复酶、末端修复反应缓冲液、DNA连接酶、连接反应缓冲液、含分子标签的接头、文库扩增引物、PCR预混液、接头封闭剂、DNA封闭剂、杂交缓冲液、杂交增强剂、磁珠洗液、杂交洗液、捕获文库PCR引物、质控品、核酸纯化磁珠和链霉亲合素磁珠分别分装；
(4)准备说明书、外包装，组装封口；
(5)其中捕获探针混合物的用量为6μL/3反应，12μL/6反应，24μL/12反应，48μL/24反应；质控品的用量为30ng～50ng/反应。
实施例五
结直肠癌个体化用药相关基因组突变捕获测序检测：
本实施例中测序所使用的仪器为NextSeq CN500。
采用以下方法分别以本发明实施例二捕获探针对样本进行基因突变检测。质控品的制备方法同实施例一。
1.样本的提取及片段化：从2例人组织样本中使用核酸提取或纯化试剂(德国QIAGEN公司)提取基因组DNA，质控品直接使用，无需提取，分别取600ng的每个人基因组样品和质控品，不足50μL的用无核酸酶水补齐至50μL，进行离心，然后将溶液全部转移到微管中，在Covaris S2仪器(购自美国Covaris公司)上进行片段化，得到200-300bp的DNA双链核酸片段的混合物，并取5μL片段化的样品进行琼脂糖凝胶电泳；质控品按照与样品相同的方法进行操作。
2.基因文库构建
(1)末端修复和接头连接：在0.2ml PCR反应管中，加入纯化后400ng双链核酸片段样本，用无核酸酶水补齐至50μL，然后分别加入3μL末端修复酶混合物(含5～40U/μL末端修复酶的溶液)和7μL末端修复反应缓冲液，离心后在20℃下保温30min，随后在65℃下保温30min，进行末端修复；离心后分别加入2μL接头(含index标签)、10μL DNA连接酶、30μL连接反应缓冲液及8μL无核酸酶水进行接头连接；
(2)纯化：将接头连接的产物进行离心后，转移到1.5ml的离心管中，加入52μL核酸纯化磁珠，进行离心，吸弃上清，保持离心管在磁力架上，随后加入300μL 75％乙醇，静置1min后吸弃上清，重复洗涤一次，37℃干燥磁珠，时间约为1～3min，加36μL已恢复至室温的无核酸酶水混匀，进行离心，室温静置，取上清液20μL至0.2ml的PCR反应管中备用。
3.基因文库扩增与纯化
向装有20μL上清的0.2ml的PCR反应管中分别加入25uL 2×PCR预混液(含有1～50U/μL Taq DNA聚合酶扩增反应液)和5μL扩增引物；
在PCR仪中按下述程序进行扩增：68℃，2min；98℃，2min；98℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，共扩增10个循环；最终72℃延伸5min，在4℃下保存备用；
将扩增的产物全部转移到1.5ml离心管中，然后加入45μL核酸纯化磁珠，离心吸弃上清，加入300μL 75％乙醇，静置30s后吸弃上清，重复洗涤一次，37℃干燥磁珠，时间约为1～3min，加36μL已恢复至室温的无核酸酶水混匀，进行离心，室温静置，取上清液20μL至0.2ml的PCR反应管中备用；将纯化后的预文库使用
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dsDNA HS Assay Kit(Life公司生产)进行浓度测定。
4.基因文库捕获
(1)杂交：每8个文库混合在一个样品池中进行杂交捕获，最后不足8个的混合在一个样品池中进行杂交捕获，将文库按量混合于1.5mL Eppendorf离心管中成为一个样品池，血液样本用量不低于125ng，样品池总量不超过1μg。向样品池中加入2μL接头封闭剂和5μLDNA封闭剂，震荡混匀，短暂离心后冷冻真空抽干。加入8.5μL杂交缓冲液(2×)(含有0.1M～20M的NaCl、NaH2PO4成分的溶液)、2.7μL杂交增强剂(含有0.1M～20M的NaCl、聚蔗糖成分的溶液)和3.8μL无核酸酶水，震荡混匀，短暂离心后，室温静置5min重溶，将重溶后的液体全部转移到0.2ml的PCR反应管中，95℃下保温10分钟取出PCR反应管，短暂离心后加入实施例二中获得的捕获探针混合物，震荡混匀3～5s，短暂离心后在65℃保温4h，热盖温度为75℃；
其中，所述探针混合物的浓度为25ng/μL；
其中，实施例二中的探针混合物的序列如SEQ ID NO:1～2909所示；
(2)富集：将链霉亲和素磁珠洗涤后加入1倍体积磁珠洗液(含有0.1M～25M的NaCl、Tris成分的溶液)，振荡重悬后按每管100μL分装到不同的0.2ml的PCR反应管中；将(1)中的PCR反应管取出，短暂离心后将将全部杂交产物转移至含有链霉亲和素磁珠的PCR反应管中，充分悬浮后于PCR仪上65℃孵育45min，期间每隔12min吸打混匀一次。孵育结束后，每管加入100μL 65℃预热的1×洗液1(含有0.1M～25M的NaCl、SDS成分的溶液)，将全部悬液转移至1.5mL AxyGen离心管中，震荡混匀，短暂离心后转移至磁力架上静置20s，吸弃上清。然后加入200μl 65℃预热的1×杂交洗液(含有0.1M～25M的NaCl、SDS、Na2HPO4成分的溶液)震荡混匀，短暂离心后65℃孵育5min，转移至磁力架上静置20s，吸弃上清。重复本步骤一次。并用磁珠洗液充分洗脱后加入18μL无核酸酶水，震荡后转移至0.2ml的PCR反应管中；
5.捕获文库扩增与纯化
(1)捕获文库扩增：向上述PCR反应管中分别加入25μL 2×PCR预混液和捕获文库PCR引物各2.5μL，混匀离心后，按下述程序进行PCR扩增：98℃，2min；98℃变性20s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共扩增14个循环，最终72℃,5min，在4℃下保存备用，热盖105℃；
(2)纯化：将PCR反应管离心后，将产物全部转移至离心管中，加入75μL核酸纯化磁珠，静置10min后短暂离心，转移至磁力架上静置1min，吸弃上清。再加入300μL 75％乙醇，静置30s后吸弃上清，重复洗涤一次，开盖晾干至无液滴残留。加36μL已恢复至室温的无核酸酶水混匀，进行离心，室温静置5min，取上清液20μL至0.2ml的PCR反应管中备用；将纯化后的预文库使用
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dsDNA HS Assay Kit(Life公司生产)和Agilent HighSensitivity DNA Kit(安捷伦公司生产)进行浓度和片段长度测定。
6.测序结果与分析
(1)测序：将上述所得到的扩增产物按照测序仪器及配套试剂使用说明进行上机测序，平均有效覆盖深度：≥500×；
(2)数据处理与分析：
获得原始测序数据后，将测序获得的序列信息数据使用BWA软件运行分析比对，比对后的数据含有样本中包含的所有变异信息及背景信号。
1)数据预处理：使用Illumina Sequencing Analysis Viewerv2.4.5软件分析每批次数据测序质量Q30碱基占比，如批次数据Q30碱基占比≥75％则质控通过；如批次数据Q30碱基占比<75％，则质控不通过。然后使用Illumina公司的bcl2fastq v2.19软件将测序生成的bcl文件转化成样本对应的fastq文件。使用分析系统的数据预处理模块(基于Trimmomatic-0.36软件)去除建库过程中引入的接头序列以及低质量碱基片段(尾部8个碱基平均质量小于20的部分片段以及长度小于50bp的短片段)；
2)数据比对：使用分析系统的序列比对模块(基于bwa v0.7.10和GATK v3.2-2软件)将fastq文件中的碱基序列比对至HG19(GRCh37)人类参考基因组上生成bam文件，并根据基因组坐标对bam文件进行排序，然后对基因组复杂区域进行序列比对优化；
3)数据质控：使用分析系统的数据质控模块计算每个样本的Q30碱基占比、序列比对至参考基因组比例、建库复杂度、目标区域的中位测序深度等参数。如果Q30碱基占比≥80％，序列比对至参考基因组比例≥90％，建库复杂度≥20％，中位测序深度≥500×，则样本数据质控通过；否则样本数据质控不通过。如数据质控不通过，则实验失败，要重新实验；
4)突变分析：使用分析系统的变异鉴定模块(基于varscan v2.3.9软件)分析样本中的点突变和插入缺失突变，使用分析系统的融合分析模块(基于factera v1.4软件)分析样本中的重排(融合)，分析参数设置要求位点覆盖深度≥100×，序列比对质量≥60,碱基质量≥30；
5)突变注释：使用分析系统的注释模块(基于ANNOVARv20150617软件和snpEffv4.2软件)对鉴定出的点突变、插入缺失和基因重排(融合)进行HGVS格式和COSMIC数据库(v69)注释；
6)阳性判断标准：经过以上1-5步分析流程处理后，符合质量指标要求的突变结果进行阴/阳性判断。如突变的双端支持(即正向和反向序列支持)的独特(即去除PCR重复)DNA片段≥2时，判断为阳性；反之，则判断为阴性；
7)根据以上生物信息学分析，进行数据统计和数学建模，结合药物库数据(包括已上市药物、临床试验药物及商业化药物库)中不同药物靶点对应的药物，进而预测出有效治疗药物。
本发明通过筛选基因突变负荷多个关键区域，针对性地设计高效液相靶基因捕获探针和配套的文库构建试剂盒，将大幅降低检测成本和测序数据量，缩短了单样本分析时间，满足个性化的用户需求，适用于结直肠癌高风险人群的筛查和精准医疗。
本领域的技术人员可以明确，在不脱离本发明的总体精神以及构思的情形下，可以做出对于以上实施例的各种变型。其均落入本发明的保护范围之内。本发明的保护方案以本发明所附的权利要求书为准。
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Claims (15)

1.捕获测序探针，其特征在于：包含至少一个选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO：1～2909。
2.根据权利要求1所述的捕获测序探针，其特征在于：所述捕获测序探针为结直肠癌基因测序的捕获测序探针，其Tm值为62～76℃。
3.根据权利要求1所述的捕获测序探针，其特征在于：所述捕获测序探针为结直肠癌个体化用药相关基因突变测序的捕获测序探针，其工作浓度为10ng/μL～90ng/μL，优选为25ng/μL；
捕获测序探针能覆盖目标基因组80～300Kb的区域，优选为100～180Kb区域。
4.权利要求1-3任一所述的捕获测序探针作为癌基因测序捕获探针的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述应用为捕获测序探针在结直肠癌个体化用药相关基因基因测序中作为捕获探针的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其中，所述应用为捕获测序探针在结直肠癌基因突变高通量测序中作为捕获探针的应用。
7.捕获测序探针在直肠癌基因测序中的应用方法，其特征在于：包括以下步骤，
提取DNA双链核酸；
将DNA双链核酸变性处理得到DNA单链，使用权利要求1-3任一所述的捕获测序探针捕获所述的DNA单链；
将捕获的DNA单链进行上机测序，得到肿瘤组织中的核酸序列。
8.根据权利要求7所述捕获测序探针在直肠癌基因测序中的方法，其特征在于：还包括以下步骤，
将所得核酸序列去除干扰信息及背景信号，与人类全基因组标准序列数据对比，确定组织样本测定区域中的变异位点及数目。
9.根据权利要求8所述捕获测序探针在直肠癌基因测序中的方法，其特征在于：提取肿瘤组织DNA双链核酸后进行片段化处理，得到片段长度为100-1000bp，优选的，片段长度为100-500bp，更优选的，片段长度为200-300bp；
所述样本测定区域为80～300Kb，优选为100～180Kb，更优选为160.3Kb。
10.试剂盒，其特征在于：包含权利要求1-3任一所述的捕获测序探针。
11.试剂盒，其特征在于：还包含末端修复酶、末端修复反应缓冲液、DNA连接酶、连接反应缓冲液、含分子标签的接头、文库扩增引物、PCR预混液、接头封闭剂、DNA封闭剂、杂交缓冲液、杂交增强剂、磁珠洗液、杂交洗液、捕获文库PCR引物、质控品、核酸纯化磁珠和链霉亲合素磁珠中的一种或多种试剂。
12.权利要求10-11任一所述的试剂盒在捕获癌基因组靶序列中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于：所述应用为在捕获结直肠癌基因组靶序列中的应用，优选为在捕获结直肠癌个体化用药相关基因组靶序列中的应用。
14.直肠癌个体化用药相应基因位点在制备直肠癌检测、诊断、治疗或预后产品中的应用，所述基因位点包含下述一个或多个
AKT1：Chromosome 14,NC_000014.9；
ALK：Chromosome 2,NC_000002.12；
BAP1：Chromosome 3,NC_000003.12；
BRAF：Chromosome 7,NC_000007.14；
BRCA1：Chromosome 17,NC_000017.11；
CSF1R：Chromosome 5,NC_000005.10；
EGFR：Chromosome 7,NC_000007.14；
ERBB2：Chromosome 17,NC_000017.11；
ERBB4：Chromosome 2,NC_000002.12；
HRAS：Chromosome 11,NC_000011.10；
KIT：Chromosome 5,NC_000071.7；
KRAS：Chromosome 12,NC_000012.12；
MTOR：Chromosome 1,NC_000001.11；
NRAS：Chromosome 1,NC_000001.11；
PDGDRB：Chromosome 5,NC_000005.10；
PDGFRA：Chromosome 4,NC_000004.12；
PIK3CA：Chromosome 3,NC_000003.12；
PTEN：Chromosome 10,NC_000010.11；
SMAD4：Chromosome 18,NC_000018.10；
TP53：Chromosome 17,NC_000017.11；
NRAS：Chromosome 1,NC_000001.11；
APC：Chromosome 5,NC_000005.10；
NTRK1：Chromosome 1,NC_000001.11；
NTRK3：Chromosome 15,NC_000015.10；
HER2：Chromosome 17,NC_000017.11。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于：所述产品为生物制剂，其包括捕获测序探针，或
所述产品为试剂盒，其包括所述生物制剂。
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