CN107881232A - 探针组合物及基于ngs方法检测肺癌和结直肠癌基因的应用 - Google Patents

探针组合物及基于ngs方法检测肺癌和结直肠癌基因的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107881232A
CN107881232A CN201711017972.1A CN201711017972A CN107881232A CN 107881232 A CN107881232 A CN 107881232A CN 201711017972 A CN201711017972 A CN 201711017972A CN 107881232 A CN107881232 A CN 107881232A
Authority
CN
China
Prior art keywords
room temperature
magnetic frame
pipe
pcr
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201711017972.1A
Other languages
English (en)
Inventor
徐小红
曹建军
赵国栋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Ren Dong Medical Laboratory Ltd
Original Assignee
Shanghai Ren Dong Medical Laboratory Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Ren Dong Medical Laboratory Ltd filed Critical Shanghai Ren Dong Medical Laboratory Ltd
Priority to CN201711017972.1A priority Critical patent/CN107881232A/zh
Publication of CN107881232A publication Critical patent/CN107881232A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)

Abstract

一种探针组合物，其包括DNA序列为SEQ ID No 1～SEQ ID No 618组成的探针。本发明的提供探针组合物可以用于肺癌和结直肠癌病人精准治疗的分子诊断技术，支持液体活检，灵敏度达0.1％。

Description

探针组合物及基于NGS方法检测肺癌和结直肠癌基因的应用
技术领域
本发明涉及一种癌症基因检测组合物，尤其涉及一种DNA序列的探针组合物，以及在基于NGS方法检测肺癌和结直肠癌基因的应用。
背景技术
高通量测序技术一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定高通量(NextGeneration Sequencing，NGS)又名下一代测序技术，足见其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(Deep Sequencing)。Illumina平台是现在主流的二代测序平台，市场占有率在90％以上。
与早期基因检测技术对比：荧光原位杂交(FISH)虽不失高灵敏度但操作难度较大；传统聚合酶链式反应(PCR)在操作简便性和快速性上颇具优势，但是技术原理限制了其只能检测一个或几个基因；基因芯片技术虽然可以检测大量基因，但只能检测已知基因，假阳性率高，准确性不足；NGS则具有通量高、准确度高、成本可接受的优点，既可以一次性检测大量基因(包括已知和未知基因)，准确率又高于基因芯片，同时测序成本又相对不高。从长远来看，随着测序成本的持续下降和测序流程的逐步优化，基因测序对基因芯片等其他基因检测技术的替代将成为大势所趋；但当前各技术分支根据不同的临床需求和自身优势仍具有特定的细分市场。
目标序列捕获测序是将感兴趣的基因组区域通过捕获试剂盒进行富集后再进行测序的研究策略，根据不同的应用，利用较少的数据量就可以得到超高的灵敏度和准确度，可以快速筛选到变异位点。现在主流的靶向技术，主要是基于多重PCR技术或者探针杂交捕获技术。
液体活检(Liquid Biopsy)与传统的组织活检相比有着迅速、便捷、损伤性小等众多优点。临床医生可以用它来监测肿瘤对治疗的反应，预测肿瘤复发。从长远角度来看，液体活检还能够帮助医生在患者未出现任何症状的时候发现最初期的肿瘤。从血液中游离的DNA片段中取得的基因组信息甚至可以指出体内肿瘤发源的部位。
近年肿瘤的液态活检技术受到产业和资本的重视，该技术是在外周血中寻找脱落或凋亡释放的循环肿瘤DNA(ctDNA)或循环肿瘤细胞(CTC)或外泌体(exosome)进行基因测序，目标是开发一种“泛癌症”的筛查诊断技术。与传统的肿瘤组织取样相比，液态活检技术的主要优点包括：无创取样(血液检测)、克服肿瘤异质性(反映患者肿瘤细胞整体的基因变异信息)、实时监测分析(如ctDNA的浓度与肿瘤的进展高度相关)；该技术可以实现的重要功能包括：肿瘤早诊、辅助分期、预后评估、复发监测、用药指导等。液态活检技术其实并不算新贵，其与NIPT原理一样是基于检测外周血中游离的cfDNA(如孕妇外周血中游离的胎儿DNA、个体血液中游离的ctDNA)，或者检测外周血中游离的胎儿细胞/肿瘤细胞CTC。该项技术同样是建立在NGS技术突破的基础之上，可以实现对痕量DNA进行高精确度、高灵敏度的检测，从而达到相应的检测目的。
肿瘤患者的基因分型直接影响肿瘤治疗效果。由于患者遗传基因的差异，可能会导致不同患者对同一药物产生不同、甚至截然相反的治疗效果。以靶向药物为例，通常其只作用于携带特定基因突变的肿瘤细胞，而对不携带特定基因突变的肿瘤患者，其疗效甚至不如化疗。而化疗药物也会因某些基因的遗传差异导致不同患者的代谢能力不同，进而引起化疗药物毒副作用或药物敏感性的不同。因此，在用药前进行肿瘤药物相关基因的检测，可以全面、准确地解读药物与基因的关系，依据患者基因水平上的个体差异，辅助选择适宜的治疗药物，制定个体化的治疗方案，延长患者生存时间，提高生存质量。美国临床肿瘤年会发布的研究结果表明，80％多的医生在肿瘤基因测试后改变了原来的治疗方式。而另一项研究也证明，接受测试的卵巢癌病人死亡率比其他患者低36％。
二代测序技术的出现为肿瘤的易感基因检测、伴随诊断、个性化用药等提供了更佳的技术支撑和选择，尤其是基于NGS的癌症panel检测使得该领域检测可以更加快速和低廉，达到了同时检测若干个基因和变位点的目的。
目前Illumina和Life Tech两大巨头均已经利用自身的NGS平台推出了癌症panel检测，其中Illumina的TruSeq Amplicon Cancer Panel可以检测48个基因、Thermo FisherScientific(赛默飞)的Ion AmpliSeq Panels可以检测50个基因，国内的华大基因也推出了基于NGS的TumorCare Cancer Panel，该检测基于NimbleGen探针杂交捕获测序技术，包含1053个肿瘤相关基因，其中176个基因是有明确用药解读的基因，255个基因是在COSMIC数据库中反复出现的基因，622个基因是在癌症重要通路中出现的基因。
这些产品都是针对肿瘤组织样本，无法满足液体活检领域的灵敏度要求。
Thermo Fisher Scientific(赛默飞)公司发布了一款仅限于研究使用的液体活检检测产品——Oncomine Lung cfDNA Assay，该产品基于标签测序(tag sequencing)技术开发，在Thermo的Ion S5系统上运行，但并不使用AmpliSeq试剂进行靶向扩增。新方法依赖于分子标记和一个两步扩增过程，以确保检测极限达到0.1％。该检测试剂盒可以分析与肺癌相关的11个基因中的150个热点SNVs和indels，从DNA提取到出结果的工作周期为3天。
在国内肺癌液体活检领域，广州燃石的朗克TM-血液版针对晚期非小细胞肺癌患者，以外周血ctDNA为检测样本，基于先进的靶向捕获+二代测序技术，可一次性检测NCCN指南推荐的8项基因，覆盖了FDA与cFDA获批的所有非小细胞肺癌的靶向药物，可为临床中一线无法取得足够组织样本的非小细胞肺癌患者制定个性化治疗方案提供精准且全面的参考信息。在ctDNA层面一次性平行检测出突变、融合、拷贝数扩增以及插入缺失，大于10000X的超高测序深度，可准确检测低至0.2％的超低丰度变异，突破既往监测方法的局限。
此外，液体活检技术方法还有数字PCR，ArmsPCR等，灵敏度高，成本较低，缺点是只可以检测少数的已知位点。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种探针组合物，可以用于肺癌和结直肠癌病人精准治疗的分子诊断技术，支持液体活检，灵敏度达0.1％。
本发明的另一个目的在于提供一种探针组合物在基于NGS方法的肺癌和结直肠癌基因检测中的应用。
一种探针组合物，其包括DNA序列为SEQ ID No 1～SEQ ID No 618组成的探针。
一种包括DNA序列为SEQ ID No 1～SEQ ID No 618探针的组合在基于NGS方法的肺癌和结直肠癌基因检测中的应用。
一种试剂盒，包括DNA序列为SEQ ID No 1～SEQ ID No 618，用于肺癌和结直肠癌基因检测。
采用Swift公司的建库试剂盒，用gDNA做对照同时建库杂交。
一种基于NGS方法的肺癌和结直肠癌基因检测的方法，包括：
样品采集，提取样品中DNA，分子标签建库，与Panel杂交，并进行NGS测序，针对测序后的数据进行分析，判断样本的基因型。
Panel包括SEQ ID No 1～SEQ ID No 618。
本发明提供的检测方法取得的有益效果：
1.灵敏度足够高(0.1％)，对于无法获得组织的病人群体也可以有机会获得基因检测(液体活检)；
2.可以同时检测已知或者未知的突变，覆盖所有可能的突变类型；
3.对于企业来讲，可用于一个panel解决肺癌或者结直肠癌患者的检测需求，解决探针合成成本问题；临床交付上的凑样问题；减少实验员工作的复杂问题
4.降低成本，可一次性检测足够多的位点，造福广大患者；
5.本发明提供的panel设计时加入了临床实验期的药物靶点，既体现了前瞻性，为将来产品升级做准备，又给现有患者提高了更多的可能性。
具体实施方式
以下详细描述本发明的技术方案。本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
本实施例中，panel的设计选择了15个肺癌相关的基因，如：EGFR、ALK、KRAS、BRAF、ROS1、RET、ERBB2、MET，AKT1、NRAS、PIK3CA、PTEN、DDR2、MAP2K1(MEK1)和FGFR1，还选择了12个结直肠癌的相关基因，如：EGFR、KRAS、BRAF、ERBB2、MET、AKT1、NRAS、PIK3CA、PTEN、MAP2K1(MEK1)、FGFR1和SMAD4。
本发明建库杂交捕获流程采用的验证方法如下：
1.1gDNA打断及纯化：
1.1.1.按照qubit浓度取500ng，加水补至100μl，加入covaris 130μl打断管中，设置程序：50W，20％，200cycles，330s.打断结束后取1μl，qsep100检测片段分布，主峰150～200bp。
1.1.2.将打断产物转移到新的1.5ml离心管中，加入1.4倍体积的AMPure beads，充分涡旋混匀，室温孵育5min.
1.1.3.离心管放置在磁力架上，等待3-5min直到管内溶液完全澄清，小心移除上清。
1.1.4.保持离心管在磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇，室温孵育30sec。
1.1.5.小心吸取并丢掉乙醇，不要碰到磁珠。.
1.1.6.重复步骤7.1.3-7.1.4一次(总共两次清洗)。
1.1.7.将离心管从磁力架上取下，离心后置于磁力架上将剩余的乙醇吸取干净，室温下开盖将磁珠晾干，勿过干。
1.1.8.加入52.5μl水到离心管中，充分涡旋重悬磁珠，室温下放置2min。
1.1.9.置于磁力架上，待上清澄清后(约2min)取50μl至200μl PCR管中。
1.1.10.取1μl用dsDNA HS Assay Kit定量。
1.2.Repair I及纯化：
1.2.1.取100ng打断纯化后的gDNA或10-50ng cfDNA至PCR管中，用low TE补至40μl，加入以下试剂，涡旋混匀。
组分 体积
gDNA/cfDNA 40μl
Low EDTA TE 13μl
Buffer W1 6μl
Enzyme W2 1μl
总体积 60μl
1.2.2.设置以下程序在PCR仪上进行反应：
1.2.3.AMPure beads纯化：
1.2.3.1.磁珠涡旋混匀，取108μl加入上述反应后的PCR管中，充分涡旋混匀，室温孵育5min。
1.2.3.2.将PCR管放置在磁力架上，等待3-5min直到管内溶液完全澄清，小心移除上清。
1.2.3.3.保持PCR管在磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇，室温孵育30sec。
1.2.3.4.小心吸取并丢掉乙醇，不要碰到磁珠。
1.2.3.5.重复步骤7.2.3.3和7.2.3.4一次(总共两次清洗)。
1.2.3.6.将PCR管从磁力架上取下，离心后置于磁力架上将剩余的乙醇吸取干净，室温下开盖将磁珠晾干，勿过干。
1.3.Repair II：
1.3.1.配制以下试剂，涡旋混匀并短暂离心后加入7.2.3晾干磁珠中，吸打混匀：
组分 体积
Low EDTA TE 30μl
Buffer G1 5μl
Reagent G2 13μl
Enzyme G3 1μl
Enzyme G4 1μl
总体积 50μl
1.3.2.设置以下程序在PCR仪上进行反应：
温度 时间
20℃ 20min
4℃ ∞
1.3.3.AMPure beads纯化：
1.3.3.1.加82.5μl PEG/NaCl到上述反应后的PCR管中，充分涡旋混匀，室温孵育5min。
1.3.3.2.将PCR管放置在磁力架上，等待3-5min直到管内溶液完全澄清，小心移除上清。
1.3.3.3.保持PCR管在磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇，室温孵育30sec。
1.3.3.4.小心吸取并丢掉乙醇，不要碰到磁珠。
1.3.3.5.重复步骤7.3.3.3和7.3.3.4一次(总共两次清洗)。
1.3.3.6.将PCR管从磁力架上取下，离心后置于磁力架上将剩余的乙醇吸取干净，室温下开盖将磁珠晾干，勿过干。
1.4.接头连接I：
1.4.1.配制以下试剂，涡旋混匀并短暂离心后加入7.3.3晾干磁珠中，加入5μl相应index试剂Reagent Y2，吸打混匀：
组分 体积
Low EDTA TE 20μl
Buffer Y1 3μl
Enzyme Y3 2μl
总体积 25μl
1.4.2.设置以下程序在PCR仪上进行反应：
温度 时间
25℃ 15min
4℃ ∞
1.4.3.AMPure beads纯化：
1.4.3.1.加49.5μl PEG/NaCl到上述反应后的PCR管中，充分涡旋混匀，室温孵育5min。
1.4.3.2.将PCR管放置在磁力架上，等待3-5min直到管内溶液完全澄清，小心移除上清。
1.4.3.3.保持PCR管在磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇，室温孵育30sec。
1.4.3.4.小心吸取并丢掉乙醇，不要碰到磁珠。
1.4.3.5.重复步骤7.4.3.3-7.4.3.4一次(总共两次清洗)。
1.4.3.6.将PCR管从磁力架上取下，离心后置于磁力架上将剩余的乙醇吸取干净，室温下开盖将磁珠晾干，勿过干。
1.5.接头连接II：
1.5.1.配制以下试剂，涡旋混匀并短暂离心后加入7.4.3晾干磁珠中，吸打混匀：
组分 体积
Low EDTA TE 30μl
Buffer B1 5μl
Reagent B2/B2-MID 2μl
Reagent B3 9μl
Enzyme B4 1μl
Enzyme B5 2μl
Enzyme B6 1μl
总体积 50μl
1.5.2.设置以下程序在PCR仪上进行反应：
温度 时间
40℃ 10min
25℃ ∞
1.5.3.AMPure beads纯化(非MID接头)：
1.5.3.1.加82.5μl PEG/NaCl到上述反应后的PCR管中，充分涡旋混匀，室温孵育5min。
1.5.3.2.将PCR管放置在磁力架上，等待3-5min直到管内溶液完全澄清，小心移除上清。
1.5.3.3.保持PCR管在磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇，室温孵育30sec。
1.5.3.4.小心吸取并丢掉乙醇，不要碰到磁珠。
1.5.3.5.重复步骤7.5.3.3和7.5.3.4一次(总共两次清洗)。
1.5.3.6.将PCR管从磁力架上取下，离心后置于磁力架上将剩余的乙醇吸取干净，室温下开盖将磁珠晾干，勿过干。
1.5.3.7.加入22.5μl low TE到离心管中，充分涡旋重悬磁珠，室温下放置2min.
1.5.3.8.置于磁力架上，待上清澄清后(约2min)取20μl至新的PCR管中。
1.5.4.AMPure beads纯化(MID接头)：
1.5.4.1.加60μl PEG/NaCl到上述反应后的PCR管中，充分涡旋混匀，室温孵育5min。
1.5.4.2.将PCR管放置在磁力架上，等待3-5min直到管内溶液完全澄清，小心移除上清。
1.5.4.3.保持PCR管在磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇，室温孵育30sec。
1.5.4.4.小心吸取并丢掉乙醇，不要碰到磁珠。
1.5.4.5.重复步骤1.5.4.3和1.5.4.4一次(总共两次清洗)。
1.5.4.6.将PCR管从磁力架上取下，离心后置于磁力架上将剩余的乙醇吸取干净，室温下开盖将磁珠晾干，勿过干。
1.5.4.7.加入50μl low TE到离心管中，充分涡旋重悬磁珠，室温下放置2min。
1.5.4.8.加60μl PEG/NaCl到上述反应后的PCR管中，充分涡旋混匀，室温孵育5min。
1.5.4.9.将PCR管放置在磁力架上，等待3-5min直到管内溶液完全澄清，小心移除上清。
1.5.4.10.保持PCR管在磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇，室温孵育30sec。
1.5.4.11.小心吸取并丢掉乙醇，不要碰到磁珠。
1.5.4.12.重复步骤7.5.4.10和7.5.4.11一次(总共两次清洗)。
1.5.4.13.将PCR管从磁力架上取下，离心后置于磁力架上将剩余的乙醇吸取干净，室温下开盖将磁珠晾干，勿过干。
1.5.4.14.加入22.5μl low TE到离心管中，充分涡旋重悬磁珠，室温下放置2min。
1.5.4.15.置于磁力架上，待上清澄清后(约2min)取20μl至新的PCR管中。
1.6.文库扩增
1.6.1.配制以下反应体系，涡旋混匀并短暂离心：
组分 体积
2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix 25μl
Reagent R1 5μl
接头连接纯化产物 20μl
总体积 50μl
1.6.2.设置以下程序在PCR仪上进行反应：
1.6.3.AMPure beads纯化：
1.6.3.1.加90μl涡旋混匀的磁珠到上述反应后的PCR管中，充分涡旋混匀，室温孵育5min。
1.6.3.2.将PCR管放置在磁力架上，等待3-5min直到管内溶液完全澄清，小心移除上清。
1.6.3.3.保持PCR管在磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇，室温孵育至少30sec.
1.6.3.4.小心吸取并丢掉乙醇，不要碰到磁珠。
1.6.3.5.重复步骤7.6.3.3和7.6.3.4一次(总共两次清洗)。
1.6.3.6.将PCR管从磁力架上取下，离心后置于磁力架上将剩余的乙醇吸取干净，室温下开盖将磁珠晾干，勿过干。
1.6.3.7.加入25μl low TE到离心管中，充分涡旋重悬磁珠，室温下放置2min。
1.6.3.8.置于磁力架上，待上清澄清后(约2min)取23μl至新的PCR管中。
1.7.文库QC
1.7.1.Qubit定量
取1μl用dsDNA HS Assay Kit定量。
1.7.2.Qsep100片段分析：
取1μl稀释到0.1-1ng/μl，MB1-MA2为marker检测片段大小分布。
1.7.3.文库置于-20℃保存或进行7.8文库杂交。
1.8.文库杂交
1.8.1.在1.5ml低吸附离心管中加入以下试剂，45℃抽干，抽干后的样品可以继续杂交或者室温放置过夜。
组分 量
混合文库 500ng
Cot-1 DNA 5μg
xGen Universal Blockers-TS Mix 2μl
1.8.2.探针杂交
1.8.2.1.加入以下试剂到抽干的离心管中，室温放置5-10min，吸打混匀后转到0.2ml PCR管中：
组分 体积
2×Hybridization Buffer 8.5μl
Hybridization Buffer Enhancer 2.7μl
H2O 1.8μl
1.8.2.2.置于PCR仪上，95℃10min，结束后立即从PCR仪上取下并马上加入4μl探针，涡旋并离心，置于PCR仪上65℃杂交过夜，热盖温度设为75℃。
1.9.试剂和磁珠准备：
1.9.1.试剂准备：按照下表(1个样品)将试剂稀释到1x工作液，可于室温放置最多4周。
试剂原液 试剂体积 稀释到1×所用H2O体积
2×Bead Wash Buffer 250μl 250μl
10×Wash I Buffer 30μl 270μl
10×Wash II Buffer 20μl 180μl
10×WashIIIBuffer 20μl 180μl
10×Stringent Wash Buffer 40μl 360μl
1×Wash I Buffer分装出100μl，和1×Stringent Wash Buffer用前于65℃heatblock上至少放置2小时。
1.9.2.磁珠准备：
1.9.2.1.M270磁珠从4℃冰箱取出，室温平衡30min。
1.9.2.2.涡旋混匀后取100μl/capture到1.5ml低吸附离心管中(一管最多可以洗600μl)，置于磁力架上，直到管内溶液完全澄清，小心移除上清。
1.9.2.3.加入200μl 1×Bead Wash Buffer，吸打混匀，置于磁力架上，直到管内溶液完全澄清，小心移除上清；重复一次，共两次清洗。
1.9.2.4.加入100μl/capture 1×Bead Wash Buffer，吸打混匀后分100μl/capture到0.2ml PCR管中，置于磁力架上，直到管内溶液完全澄清，小心移除上清，立即进行。
1.10.捕获和清洗
1.10.1.转移PCR仪上的杂交产物到上一步的磁珠中，吸打10次混匀，置于PCR仪上65℃45min(热盖温度设为75℃).每隔12min涡旋3sec以重悬磁珠。
1.10.2.加100μl 65℃预热的1×Wash I Buffer到上述PCR管中，涡旋并离心，转移到1.5ml低吸附离心管中，涡旋，置于磁力架上直到管内溶液完全澄清，小心移除上清。
1.10.3.加200μl 65℃预热的1×Stringent Wash Buffer，吸打混匀不要有气泡，65℃ heat block上放置5min，置于磁力架上直到管内溶液完全澄清，小心移除上清。
1.10.4.重复7.10.3一次。
1.10.5.加200μl室温1×Wash I Buffer，涡旋2min，置于磁力架上直到管内溶液完全澄清，小心移除上清。
1.10.6.加200μl室温1×Wash II Buffer，涡旋1min，置于磁力架上直到管内溶液完全澄清，小心移除上清。
1.10.7.加200μl室温1×WashIIIBuffer，涡旋30sec，置于磁力架上直到管内溶液完全澄清，小心移除上清。
1.10.8.将离心管从磁力架上取下，加入20μl H2O，吸打混匀。
1.11.文库PCR富集
1.11.1.配制以下反应体系，吸打混匀，保证磁珠均匀分散在溶液中：
组分 体积
2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix 25μl
10μM Illumina P5 primer 2.5μl
10μM Illumina P7 primer 2.5μl
含有捕获DNA的磁珠 20μl
总体积 50μl
1.11.2.设置以下程序在PCR仪上进行反应：
1.11.3.AMPure beads纯化：
1.11.3.1.加75μlAMPurebeads到上述反应后的PCR管中，充分涡旋混匀，室温孵育5min。
1.11.3.2.将PCR管放置在磁力架上，等待3-5min直到管内溶液完全澄清，小心移除上清。
1.11.3.3.保持PCR管在磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇，室温孵育30sec。
1.11.3.4.小心吸取并丢掉乙醇，不要碰到磁珠。
1.11.3.5.重复7.11.3.3和7.11.3.4一次(总共两次清洗)。
1.11.3.6.将PCR管从磁力架上取下，离心后置于磁力架上将剩余的乙醇吸取干净，室温下开盖将磁珠晾干，勿过干。
1.11.3.7.加入25μl low TE到离心管中，充分涡旋重悬磁珠，室温下放置2min。
1.11.3.8.置于磁力架上，待上清澄清后(约2min)取23μl至新的离心管中。
1.12.文库QC
1.12.1.Qubit定量
取1μl用dsDNA HS Assay Kit定量。
1.12.2.Qsep100片段分析：
取1μl稀释到0.1-1ng/μl，MB1-MA2为marker检测片段大小分布。
1.12.3.文库置于-20℃保存
一例肺腺癌患者，手术后七年，无法手术获得组织；采用本发明的SEQ ID No 1～SEQ ID No 618共计618条探针序列组成的Panel进行检测：
1.采集外周血进行ctDNA液体活检，ctDNA总量40ng；
2.建库，测序，Panel兼容多个测序平台，包括illumina、iontorrent、华大BGISEQ等；本实施例使用于Illumina平台测序。
3.分析：得到如下数据结果：
Gene.refGene Ref Alt ExonicFunc.refGene T_freq
NRAS A G nonsynonymous SNV 0.22％
PIK3CA C T stopgain 0.29％
EGFR GGAATTAAGAGAAGC - nonframeshift deletion 1.03％
EGFR G T nonsynonymous SNV 0.26％
FGFR1 C T nonsynonymous SNV 0.47％
PTEN G T nonsynonymous SNV 9.04％
PTEN G T nonsynonymous SNV 3.15％
PTEN C A nonsynonymous SNV 7.78％
PTEN C A nonsynonymous SNV 10.42％
PTEN C A nonsynonymous SNV 6.74％
AKT1 CTC - nonframeshift deletion 0.86％
该样本共检测出11个非同义突变，其中检测到的EGFR p.745_750del突变为肿瘤发生驱动突变，突变丰度1.03％，该突变属于EGFR基因19号外显子缺失，可导致EGFR通路过度激活，与肿瘤对酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)治疗敏感性有重要关系。提示患者对厄洛替尼、吉非替尼和阿法替尼等EGFR-TKI类药物敏感，患者可以选择这一类药物进行治疗。

Claims (4)

1.一种探针组合物，其包括DNA序列为SEQ ID No 1～SEQ ID No 618组成的探针。
2.一种包括权利要求1所述的探针组合物在基于NGS方法的肺癌和结直肠癌基因检测中的应用。
3.一种试剂盒，包括SEQ ID No 1～SEQ ID No 618。
4.根据权利要求3所述的试剂盒在肺癌和结直肠癌基因检测中的应用。
CN201711017972.1A 2017-10-26 2017-10-26 探针组合物及基于ngs方法检测肺癌和结直肠癌基因的应用 Pending CN107881232A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711017972.1A CN107881232A (zh) 2017-10-26 2017-10-26 探针组合物及基于ngs方法检测肺癌和结直肠癌基因的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711017972.1A CN107881232A (zh) 2017-10-26 2017-10-26 探针组合物及基于ngs方法检测肺癌和结直肠癌基因的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107881232A true CN107881232A (zh) 2018-04-06

Family

ID=61782490

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711017972.1A Pending CN107881232A (zh) 2017-10-26 2017-10-26 探针组合物及基于ngs方法检测肺癌和结直肠癌基因的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107881232A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110791500A (zh) * 2019-11-25 2020-02-14 基恩生物科技(大连)有限公司 一种基于ngs方法检测肺癌突变基因的探针组合物及试剂盒
CN112435711A (zh) * 2020-11-11 2021-03-02 赛福解码(北京)基因科技有限公司 一种改善小panel数据中大型cnv检测效果的方法
WO2021142153A1 (en) * 2020-01-08 2021-07-15 Plexbio Co., Ltd. Image differentiated multiplex assays for detection of dna mutations in lung cancer
CN113278611A (zh) * 2021-03-07 2021-08-20 华中科技大学同济医学院附属协和医院 捕获测序探针及其用途

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104293938A (zh) * 2014-09-30 2015-01-21 天津华大基因科技有限公司 构建测序文库的方法及其应用
CN105063208A (zh) * 2015-08-10 2015-11-18 北京吉因加科技有限公司 一种血浆中游离的目标dna低频突变富集测序方法
CN105102635A (zh) * 2013-03-15 2015-11-25 生命技术公司 肺癌的分类和可行性指数

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105102635A (zh) * 2013-03-15 2015-11-25 生命技术公司 肺癌的分类和可行性指数
CN104293938A (zh) * 2014-09-30 2015-01-21 天津华大基因科技有限公司 构建测序文库的方法及其应用
CN105063208A (zh) * 2015-08-10 2015-11-18 北京吉因加科技有限公司 一种血浆中游离的目标dna低频突变富集测序方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANNA MARIA RACHIGLIO等: "Limits and potential of targeted sequencing analysis of liquid biopsy in patients with lung and colon carcinoma", 《ONCOTARGET》 *
YONGQIAN SHU等: "Circulating Tumor DNA Mutation Profiling by Targeted Next Generation Sequencing Provides Guidance for Personalized Treatments in Multiple Cancer Types", 《SCIENTIFIC REPORTS》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110791500A (zh) * 2019-11-25 2020-02-14 基恩生物科技(大连)有限公司 一种基于ngs方法检测肺癌突变基因的探针组合物及试剂盒
CN110791500B (zh) * 2019-11-25 2023-10-03 基恩生物科技(大连)有限公司 一种基于ngs方法检测肺癌突变基因的探针组合物及试剂盒
WO2021142153A1 (en) * 2020-01-08 2021-07-15 Plexbio Co., Ltd. Image differentiated multiplex assays for detection of dna mutations in lung cancer
CN112435711A (zh) * 2020-11-11 2021-03-02 赛福解码(北京)基因科技有限公司 一种改善小panel数据中大型cnv检测效果的方法
CN113278611A (zh) * 2021-03-07 2021-08-20 华中科技大学同济医学院附属协和医院 捕获测序探针及其用途
CN113278611B (zh) * 2021-03-07 2022-11-25 华中科技大学同济医学院附属协和医院 捕获测序探针及其用途

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106047998B (zh) 一种肺癌基因的检测方法及应用
CN107475375B (zh) 一种用于与微卫星不稳定性相关微卫星位点进行杂交的dna探针库、检测方法和试剂盒
CN108753967A (zh) 一种用于肝癌检测的基因集及其panel检测设计方法
DK2582847T3 (en) METHODS AND MATERIALS TO ASSESS loss of heterozygosity
CN107475370A (zh) 用于肺癌诊断的基因群和试剂盒及诊断方法
CN113454219B (zh) 用于肝癌检测和诊断的甲基化标志物
EP3336197B1 (en) Epigenetic markers and related methods and means for the detection and management of ovarian cancer
CN108315416A (zh) 基于高通量测序技术确定肺癌基因突变位点的引物、试剂盒及方法
CN107881232A (zh) 探针组合物及基于ngs方法检测肺癌和结直肠癌基因的应用
CN104450885A (zh) 一种检测神经纤维瘤病相关基因突变的试剂盒
CN106757379B (zh) 肺癌多基因变异文库构建方法
CN105969857A (zh) 非小细胞肺癌靶向治疗基因检测方法
CN109988820A (zh) 一种用于乳腺癌多基因检测的文库构建方法及试剂盒
WO2021169875A1 (zh) 一种癌症基因甲基化检测系统和在该系统在中执行的癌症体外检测方法
CN106636404A (zh) 基于高通量测序检测人egfr基因变异的质控方法及试剂盒
CN107513578A (zh) 一种用于肺癌驱动基因及易感基因早筛的核酸质谱检测方法
CN109666745A (zh) 染色体1p/19q联合杂合性缺失的检测方法及试剂盒
CN106498079A (zh) 基于高通量测序检测人kras基因变异的质控方法及试剂盒
CN110791500B (zh) 一种基于ngs方法检测肺癌突变基因的探针组合物及试剂盒
CN106399304A (zh) 一种与乳腺癌相关的snp标记
EP4025713A1 (de) Verfahren und mittel zur diagnose von lungenkrebs
WO2021135072A1 (zh) 用于检测肺癌驱动性基因突变的探针及检测试剂盒
CN107974504A (zh) 基于ngs方法的肺癌和结直肠癌基因检测的方法
WO2023226939A1 (zh) 用于检测结直肠癌淋巴结转移的甲基化生物标记物及其应用
CN106916881A (zh) 试剂盒及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
DD01 Delivery of document by public notice

Addressee: Guo Ziqi

Document name: Notice of first office action

DD01 Delivery of document by public notice
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20180406

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication